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TW202525838A - 經遮蔽ｉｌ－２細胞介素及其使用方法 - Google Patents

經遮蔽ｉｌ－２細胞介素及其使用方法 Download PDF

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TW202525838A
TW202525838A TW113132945A TW113132945A TW202525838A TW 202525838 A TW202525838 A TW 202525838A TW 113132945 A TW113132945 A TW 113132945A TW 113132945 A TW113132945 A TW 113132945A TW 202525838 A TW202525838 A TW 202525838A
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amino acid
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派克 約翰遜
爾騰 愛瑞玫姿
德拉吉 托馬爾
班哲明 尼克森
庫爾特 詹金斯
卡爾 優禮 畢雅路卡
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美商艾希利歐發展股份有限公司
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Abstract

本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含減弱的介白素2 (IL-2)多肽、VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。在一些實施例中，IL-2多肽經工程改造以在目標位點處，諸如在腫瘤微環境中，藉由包括蛋白水解性可裂解連接子而被蛋白酶活化。VHH遮蔽部分阻斷、封閉、抑制(例如降低)或以其他方式阻止(例如遮蔽)細胞介素與其同源受體或蛋白質之活性或結合。可裂解連接子在目標位點處蛋白水解裂解後，IL-2多肽變得活化，使其能夠以增加的親和力結合至其同源受體或蛋白質。

Description

經遮蔽IL-2細胞介素及其使用方法
癌症在美國為第二主要死亡原因，其導致之死亡比後五種主要原因(慢性呼吸道疾病、中風、事故、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)及糖尿病)更多。儘管已取得巨大進步，尤其係利用靶向療法，但此領域仍有大量工作要做。免疫療法及該領域之分支，免疫腫瘤學正在為治療惡性病建立可行且振奮人心的治療選項。具體言之，現發現癌症之一個標誌為免疫逃避且已進行大量工作以鑑別目標及研發針對此等目標之療法，從而使免疫系統再活化以識別及治療癌症。
細胞介素療法係一種有效刺激免疫系統來誘導抗腫瘤細胞毒性之策略。詳言之，FDA已批准Proleukin (阿地白介素(aldesleukin)，介白素-2 (IL-2)之一種重組形式)用於治療轉移性腎細胞癌及黑色素瘤。不幸的是，向患者投與之細胞介素通常具有極短半衰期，藉此需要頻繁給藥。舉例而言，以商標名稱普留淨(Proleukin)出售的阿地白介素(aldesleukin)產品標籤指出，該藥物顯示在接受5分鐘靜脈內(IV)輸注之患者中具有85分鐘的半衰期。此外，投予高劑量之細胞介素可通過全身性免疫活化而引起有害健康的結果，諸如血管滲漏。此等發現說明需要研發有效靶向腫瘤而無與全身性免疫活化相關之副作用的IL-2多肽治療劑。
本發明尤其提供一種包含減弱的IL-2及VHH遮蔽部分之經遮蔽細胞介素。VHH遮蔽部分結合至IL-2細胞介素且抑制非所需靶標中細胞介素之生物活性。在所需靶標(例如腫瘤)中裂解後，遮蔽部分自細胞介素中釋放，從而活化IL-2多肽之功能。特定言之，本發明之包含減弱的IL-2或VHH遮蔽部分之經遮蔽細胞介素藉由以下表徵：(1)有效遮蔽效率，使得IL-2細胞介素之功能在非所需靶標中受到抑制；(2)藉由蛋白酶進行有效IL-2活化以釋放VHH遮蔽部分；(3)腫瘤中而非血漿中之選擇性IL-2活化；及(4)活體內功效(例如高腫瘤生長抑制)。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含減弱的IL-2多肽、包含僅重鏈抗體(VHH)之遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。
在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置R38處之突變。在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置F42處之突變。在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置K43處之突變。在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置Y45處之突變。在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置E62處之突變。在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置L72處之突變。在一些實施例中，與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置C125處之突變。
在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含F42E及C125A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含E62S及C125A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含F42A及C125A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含Y45R及C125A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含F42S、E62S及C125A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含F42K突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含F42A、Y45A、L72G及C125A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含E62R突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含Y45N突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含K43A突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含Y45A及E62S突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含R38G、Y45A及E62S突變。在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含C125A突變。
在一些實施例中，減弱的IL-2多肽包含SEQ ID NO: 4。
在一些實施例中，VHH特異性結合至IL-2多肽。
在一些實施例中，VHH包含：包含胺基酸序列GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之HCDR1、包含胺基酸序列AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之HCDR2及包含選自ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列之HCDR3。
在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少85%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少88%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少93%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少94%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 5至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，VHH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
在一些實施例中，VHH包含胺基酸延伸。在一些實施例中，延伸在VHH之N端。在一些實施例中，延伸在VHH之C端。
在一些實施例中，胺基延伸包含1個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含2個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含3個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含4個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含5個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含6個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含7個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含8個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含9個胺基酸。在一些實施例中，胺基延伸包含10個胺基酸。
在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基A。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基AS。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基AST。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基AAA。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基AH。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基GS。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基PP。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基PPP。在一些實施例中，胺基酸延伸為殘基GP。
在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少85%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少88%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少93%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少94%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH包含與SEQ ID NO: 12至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，VHH包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含抗原結合域。在一些實施例中，靶向部分包含Fab。在一些實施例中，靶向部分包含單鏈Fv (scFv)。在一些實施例中，靶向部分包含單域抗體(VHH)。在一些實施例中，靶向部分包含一或多個CDR。在一些實施例中，靶向部分包含可變重鏈(VH)。在一些實施例中，靶向部分包含可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，靶向部分包含Fab樣雙特異性抗體(bsFab)。在一些實施例中，靶向部分包含單域抗體連接之Fab (s-Fab)。在一些實施例中，靶向部分包含抗體。在一些實施例中，靶向部分包含抗原結合片段之組合。
在一些實施例中，靶向部分包含GYTFTNYY (SEQ ID NO: 172)之重鏈CDR1序列、INPSNGGT (SEQ ID NO: 173)之重鏈CDR2序列及ARRDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 174)之重鏈CDR3序列。在一些實施例中，靶向部分包含KGVSTSGYSY (SEQ ID NO: 177)之輕鏈CDR1序列、LAS (SEQ ID NO: 178)之輕鏈CDR2序列及QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 179)之輕鏈CDR3序列。
在一些實施例中，靶向部分包含GYTFTNYY (SEQ ID NO: 172)之重鏈CDR1序列、INPSNGGT (SEQ ID NO: 173)之重鏈CDR2序列、ARRDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 174)之重鏈CDR3序列、KGVSTSGYSY (SEQ ID NO: 177)之輕鏈CDR1序列、LAS (SEQ ID NO: 178)之輕鏈CDR2序列及QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 179)之輕鏈CDR3序列。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約80%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約82%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約85%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約88%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約89%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約90%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約91%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約92%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約93%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約94%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約95%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約96%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約97%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約98%一致性之重鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約99%一致性之重鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約80%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約82%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約85%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約88%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約89%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約90%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約91%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約92%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約93%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約94%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約95%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約96%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約97%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約98%一致性之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約99%一致性之輕鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約80%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約82%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約85%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約88%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約89%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約90%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約91%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約92%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約93%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約94%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約95%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約96%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約97%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約98%一致性之重鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約99%一致性之重鏈區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約80%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約82%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約85%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約88%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約89%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約90%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約91%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約92%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約93%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約94%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約95%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約96%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約97%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約98%一致性之輕鏈區。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約99%一致性之輕鏈區。
在一些實施例中，靶向部分包含SEQ ID NO: 169之重鏈可變區及SEQ ID NO: 175之輕鏈可變區。在一些實施例中，靶向部分包含SEQ ID NO: 170之重鏈區及SEQ ID NO: 176之輕鏈區。
在一些實施例中，載體部分包含PEG分子。在一些實施例中，載體部分包含白蛋白。在一些實施例中，載體部分包含白蛋白片段。在一些實施例中，載體部分包含抗體Fc域。在一些實施例中，載體部分包含抗體。在一些實施例中，載體部分包含抗原結合片段。
在一些實施例中，Fc域包含第一Fc多肽及第二Fc多肽。
在一些實施例中，第一Fc多肽透過第一連接子連接至IL-2多肽，且第二Fc多肽透過第二連接子連接至遮蔽部分，且其中第一或第二連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點，使得遮蔽部分自IL-2多肽釋放。
在一些實施例中，第一Fc多肽透過第一連接子連接至遮蔽部分，且第二Fc多肽透過第二連接子連接至IL-2多肽，且其中第一或第二連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點，使得遮蔽部分自IL-2多肽釋放。
在一些實施例中，第一連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，第二連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，第一Fc多肽包含Y349C、T366S、L368A及Y407V突變且第二Fc多肽包含S354C及T366W突變。在一些實施例中，第二Fc多肽包含Y349C、T366S、L368A及Y407V突變且第一Fc多肽包含S354C及T366W突變。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含有包含降低或消除與蛋白質A之結合的修飾的CH3域，且第二Fc多肽包含結合至蛋白質A之CH3域。在一些實施例中，第二Fc多肽包含有包含降低或消除與蛋白質A之結合的修飾的CH3域，且第一Fc多肽包含結合至蛋白質A之CH3域。
在一些實施例中，降低或消除與蛋白質A之結合之修飾係根據Kabat編號之H435R及Y436F。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含N297A突變。在一些實施例中，第二Fc多肽包含N297A突變。在一些實施例中，第一Fc多肽及第二Fc多肽各自包含N297A突變。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含IgG1 Fc域或其片段。在一些實施例中，第一Fc多肽包含IgG2 Fc域或其片段。在一些實施例中，第一Fc多肽包含IgG4 Fc域或其片段。在一些實施例中，第二Fc多肽包含IgG1 Fc域或其片段。在一些實施例中，第二Fc多肽包含IgG2 Fc域或其片段。在一些實施例中，第二Fc多肽包含IgG4 Fc域或其片段。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含I253A突變。在一些實施例中，第二Fc多肽包含I253A突變。在一些實施例中，第一Fc多肽及第二Fc多肽各自包含I253A突變。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變且第二Fc多肽包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變。
在一些實施例中，腫瘤相關蛋白酶裂解位點包含選自表3之序列。腫瘤相關蛋白酶裂解位點包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含：(a)減弱的介白素2 (IL-2)多肽，其包含F42E及C125A之胺基酸取代；(b) VHH遮蔽部分，其包含SEQ ID NO: 6之CDR1、SEQ ID NO: 7之CDR2及SEQ ID NO: 8之CDR3；(c) Fc域，其包含透過第一連接子連接至減弱的IL-2多肽之第一Fc多肽及透過第二連接子連接至VHH遮蔽部分之第二Fc多肽；及(d)抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含：(a)減弱的介白素2 (IL-2)多肽，其包含SEQ ID NO: 4；(b) VHH遮蔽部分，其包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 12；(c) Fc域，其包含透過第一連接子連接至減弱的IL-2多肽之SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽及透過第二連接子連接至VHH遮蔽部分之SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽；及(d)抗PD1靶向部分，其包含SEQ ID: 169及175。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽：(a)第一多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變重鏈、第一Fc多肽、不可裂解連接子及減弱的IL-2多肽，(b)第二多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變重鏈、第二Fc多肽、可裂解連接子及VHH遮蔽部分，及(c)第三多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變輕鏈。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 21，且第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 20。
在一些實施例中，抗PD-1靶向部分之可變重鏈包含SEQ ID NO: 172之hCDR1、SEQ ID NO: 173之hCDR2及SEQ ID NO: 174之hCDR3。在一些實施例中，抗PD1靶向部分之可變輕鏈包含SEQ ID NO: 177之lCDR1、SEQ ID NO: 178之lCDR2及SEQ ID NO: 178之lCDR3。在一些實施例中，抗PD-1靶向部分之可變重鏈包含SEQ ID NO: 172之hCDR1、SEQ ID NO: 173之hCDR2、SEQ ID NO: 174之hCDR3，且抗PD1靶向部分之可變輕鏈包含SEQ ID NO: 177之lCDR1、SEQ ID NO: 178之lCDR2、SEQ ID NO: 179之lCDR3。
在一些實施例中，抗PD-1靶向部分之可變重鏈包含 SEQ ID NO: 169。在一些實施例中，抗PD1靶向部分之可變輕鏈包含 SEQ ID NO: 175。在一些實施例中，抗PD-1靶向部分之可變重鏈包含 SEQ ID NO: 169，且抗PD1靶向部分之可變輕鏈包含 SEQ ID NO: 175。
在一些實施例中，可裂解連接子包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，可裂解連接子包含SPGGGGPMPYDLYHPSGGG (SEQ ID NO: 144)。
在一些實施例中，不可裂解連接子包含GGSSPPGGGSSGGGSGP (SEQ ID NO: 163)。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽：(a)第一多肽，其包含：(i)抗PD1靶向部分之可變重鏈，其包含SEQ ID NO: 169，(ii) SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽，(iii)不可裂解連接子，及(iv) SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2多肽，(b)第二多肽，其包含：(i)抗PD1靶向部分之可變重鏈，其包含SEQ ID NO: 169，(ii) SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽，(iii)可裂解連接子，其包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)，及(iv) SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，及(c)第三多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變輕鏈，該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 175之。
在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 191。在一些實施例中，第二多肽包含SEQ ID NO: 192。在一些實施例中，第三多肽包含SEQ ID NO: 176。在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 191，第二多肽包含SEQ ID NO: 192，且第三多肽包含SEQ ID NO: 176。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽：(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 191至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列，(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 193至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列，及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 176至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的。
在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少99%一致之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽：(a)第一多肽，其包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列，(b)第二多肽，其包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列，及(c)第三多肽，其包含SEQ ID NO: 176之胺基酸序列。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有大於未經遮蔽細胞介素之EC50的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少50倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少100倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少120倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少150倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少200倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少250倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少280倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少300倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少350倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少400倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少450倍的EC50。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有達到未經遮蔽細胞介素之EC50的至少500倍的EC50。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在MMP存在下具有大於或等於10 4M -1s -1之活體外裂解效率Kcat/Km。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在MMP存在下具有大於或等於5x10 4M -1s -1之活體外裂解效率Kcat/Km。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在MMP存在下具有大於或等於10 5M -1s -1之活體外裂解效率Kcat/Km。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在MMP存在下具有大於或等於5x10 5M -1s -1之活體外裂解效率Kcat/Km。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在MMP存在下具有大於或等於10 6M -1s -1之活體外裂解效率Kcat/Km。
在一些實施例中，至少3%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少5%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少10%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少15%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少20%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少25%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少30%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少35%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少40%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少45%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少50%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少55%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少60%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少65%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少70%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。在一些實施例中，至少75%之經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種核酸，其編碼本文所揭示之經遮蔽細胞介素。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種載體，其包含編碼本文所揭示之經遮蔽細胞介素之核酸。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種包含本文所述之載體的宿主細胞。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種產生本文所述之經遮蔽細胞介素之方法，其包含在產生經遮蔽細胞介素之條件下培養宿主細胞。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之經遮蔽細胞介素及醫藥學上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種套組，其包含本文所述之經遮蔽細胞介素。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種治療或預防個體之贅生性疾病之方法，該方法包含向個體投與有效量之本文所述之經遮蔽細胞介素或醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種治療或預防個體之發炎性或自體免疫性疾病之方法，該方法包含向個體投與有效量之本文所述之經遮蔽細胞介素或醫藥組合物。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之經遮蔽細胞介素，其用於藥物中。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之經遮蔽細胞介素，其用於治療贅生性疾病。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之經遮蔽細胞介素，其用於治療或預防發炎性疾病。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之經遮蔽細胞介素，其用於治療或預防自體免疫性疾病。
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2023年8月30日申請之美國臨時申請案第63/579,684號之優先權，該案之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表之引用併入
本說明書係指且包括在此提交之序列表(在2024年8月30日以命名為XTX_IL2_04WO1_SL.xml之XML檔案以電子方式提交)。.xml檔案於2024年8月28日生成，且大小為171,326位元組。序列表之全部內容以全文引用之方式併入本文中。 定義
為了使本發明可更易於理解，以下首先對某些術語進行定義。以下術語及其他術語之額外定義貫穿本說明書進行闡述。本文引用之描述本發明背景並提供關於其實踐之額外細節之出版物及其他參考材料通過引用併入本文中。
應當理解，本發明不限於特定組合物或生物系統，因而當然可變。亦應理解到，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且未旨在限制。
除非上下文中另有明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中使用的，單數形式「一」、「一者」、及「該」包括複數個參考對象。因此，例如，提及「IL-2多肽」可選地包括二或多種此類多肽之組合及其類似物。
如本文所使用之術語「約」意指本技術領域中熟習此項技術者易於知曉之各別值的常見誤差範圍。本文中提及「約」一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。
應當理解，本文所述之本發明態樣及實施例包括「包含態樣及實施例」、「由態樣及實施例組成」、及「基本上由態樣及實施例組成」。
如本文所用，術語「及/或」意指與此術語相關之項目中之任一者、該等項目之任何組合、或所有項目。舉例而言，片語「A、B、及/或C」旨在涵蓋以下實施例之每一者：A、B及C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A及B；A及C；B及C；A及B或C；B及A或C；C及A或B；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區之全長抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、雙功能抗體及單鏈分子)以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2及Fv)。術語「免疫球蛋白」(Ig)在本文中可與「抗體」互換使用。
術語「全長抗體」、「完整抗體」、或「全抗體」可互換使用以指代相對於抗體片段呈其實質上完整形式之抗體。具體而言，全抗體包括具有包括Fc區之重鏈及輕鏈的抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如，人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，諸如完整抗體之抗原結合區及/或可變區，及/或完整抗體之恆定區。抗體片段之實例包括抗體之Fc區、Fc區之一部分或包含Fc區之抗體之一部分。抗原結合抗體片段之實例包括域抗體(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995])；單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體、單鏈Fv (scFv)、單域抗體(VHH)、一或多個CDR、可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、Fab樣雙特異性抗體(bsFab)、單域抗體連接之Fab (s-Fab)及其組合。單重鏈抗體或單輕鏈抗體可經工程化，或在重鏈之情況下可自經工程化以產生單重鏈分子之駱駝、鯊魚、文庫或小鼠分離。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於判定胺基酸序列一致性百分比之目的，可以在此項技術內之各種方式達成比對，例如使用公開可獲得的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。舉例而言，既定胺基酸序列A相對於既定胺基酸序列B、與既定胺基酸序列B或針對既定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性百分比(其可替代地表述為相對於既定胺基酸序列B、與既定胺基酸序列B或針對既定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的既定胺基酸序列A)計算如下： 100 乘上分數X/Y 其中X為在A與B之該程式比對中序列評為一致匹配的胺基酸殘基之數目，且其中Y為B中胺基酸殘基之總數目。應當理解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列一致性百分比。
抗體「效應功能」意指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)的該等生物活性，且隨抗體同型而變。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；以及B細胞活化。
「減弱的IL-2」在本文中用於指包含一或多個減少但不消除與IL-2Rα之結合之突變的IL-2變異體。本發明人發現，「減弱的IL-2」可比「非α IL-2」更有效地擴增腫瘤特異性T細胞，且表現出比「偏向α之IL-2」對應物更低的調節T細胞活性。在一些實施例中，減弱的IL-2包含F42E及C125A之突變。
「非α IL-2」在本文中用於指包含消除與IL-2Rα之結合之一或多個突變的IL-2變異體。在一些實施例中，非α IL-2包含相對於野生型IL-2之R38A、F42A、Y45A、E62A及C125A之突變。
「α偏向性IL-2」在本文中用於指包含降低或消除與IL-2Rβγ之結合的一或多個突變之IL-2變異體。α偏向性IL-2對組成型表現IL-2α之細胞(例如調節性T細胞)具有「偏向性」親和力。
如本文所使用，「結合親和力」係指分子(例如細胞介素)之單一結合位點與其結合搭配物(例如細胞介素受體)之間的非共價相互作用之強度。在一些實施例中，結合蛋白(例如細胞介素)之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由本領域中已知之常用方法，包括本文所述之方法來量測。
編碼本文所述之細胞介素多肽的「經分離之」核酸分子為經鑑別且與至少一種在其產生環境中通常與其相關聯之污染性核酸分子分離的核酸分子。在一些實施例中，經分離之核酸不與所有與產生環境相關聯之組分相關聯。編碼本文之多肽及細胞介素多肽的經分離之核酸分子所呈形式不同於在自然界中發現的形式或環境。因此，經分離之核酸分子與細胞中天然存在的編碼本文中之多肽及細胞介素多肽之核酸不同。
術語「醫藥調配物」係指呈允許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受的毒性之其他組分之製劑。
如本文所使用，術語「治療」係指經設計以改變所治療之個體或細胞在臨床病理學之病程期間的天然病程的臨床介入。所需治療效應包括降低疾病發展之速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。舉例而言，若與病症(例如贅生性疾病)相關之一或多種症狀得以緩解或消除，則成功「治療」個體。舉例而言，若治療使得提高罹患疾病之個體之生活品質、降低治療疾病所需之其他藥物之劑量、降低疾病之復發率、減輕疾病之嚴重程度、延緩疾病之發展或進展及/或延長個體之存活期，則成功「治療」個體。
如本文所使用，「與……結合」或「與……組合」係指除一種治療形式以外亦投與另一種治療形式。因此，「與……結合」或「與……組合」係指在向個體投與一種治療模式之前、期間或之後投與另一種治療模式。
如本文中所使用，術語「預防」包括提供關於個體之疾病之發生或復發的防治。個體可能易患病症、對病症敏感、或處於罹患病症之風險，但尚未診斷患有病症。在一些實施例中，本文所述之靶向細胞介素用於延遲病症發展。
如本文中所使用，「具有罹患病症之風險」的個體可具有或不具有可偵測之疾病或疾病症狀，且在本文所述之治療方法之前可能已顯示或尚未顯示可偵測之疾病或疾病症狀。「處於風險」表示個體具有一或多種風險因素，其為與疾病之發展相關的可量測之參數，如本領域中已知。具有此等風險因素中之一或多者的個體比不具有此等風險因素中之一或多者的個體具有更高的產生病症之機率。
「有效量」係指在所需之劑量下及在所需之時間段內至少有效達成所要或所指示作用，包括治療或防治結果之量。
有效量可以一或多次投與提供。「治療有效量」為至少實現特定病症之可量測的改善所需之最小濃度。本文中之治療有效量可根據諸如以下之因素而變化：患者之疾病狀態、年齡、性別及體重，及抗體引發個體中之所需反應的能力。治療上有效量亦可為經靶向之細胞介素的治療上有益效果超過任何毒性或有害效果的量。「防治上有效量」意指在所需之劑量下及在所需時間段內有效達成所需之防治結果的量。通常但未必，由於個體在患病之前或在疾病早期階段使用預防劑量，所以預防有效量可小於治療有效量。
「慢性」投與係指與急性模式相反，以持續形式投與藥劑，以便長時間保持初始治療效果(活性)。「間歇」投與為在不中斷之情況下不連續進行，而實際上循環進行之治療。
如本文所用，「個體(subject)」或「個體(individual)」為哺乳動物。出於治療之目的，「哺乳動物」包括人類、馴養動物、及農畜，以及動物園、運動、或寵物動物，諸如狗、馬、兔、牛、豬、倉鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、貓等。在一些實施例中，個體或個體為人類。
胺基酸：如本文所用，術語「胺基酸」在其最廣泛意義上意指可併入多肽鏈中之任何化合物及/或物質。在一些實施例中，胺基酸具有通式結構H2N-C(H)(R)-COOH。在一些實施例中，胺基酸為天然存在之胺基酸。在一些實施例中，胺基酸為合成胺基酸；在一些實施例中，胺基酸為d-胺基酸；在一些實施例中，胺基酸為l-胺基酸。「標準胺基酸」意指通常發現於天然存在之肽中之二十種標準l-胺基酸中之任一者。「非標準胺基酸」意指除標準胺基酸以外的任何胺基酸，無論其以合成方式製備或從天然來源獲得。如本文所用，「合成胺基酸」涵蓋經化學修飾之胺基酸，包括(但不限於)鹽、胺基酸衍生物(諸如醯胺)、及/或取代基。胺基酸，包括肽中之羧基及/或胺基端胺基酸，可藉由甲基化、醯胺化、乙醯化、保護基、及/或以可改變肽之循環半衰期而不會不利地影響其等活性之其他化學基團進行的取代來修飾。胺基酸可參與在雙硫鍵中。胺基酸可包含一或多個轉譯後修飾，諸如與一或多個化學實體(例如，甲基、乙酸酯基、乙醯基、磷酸基、甲醯基部分、類異戊二烯基、硫酸酯基、聚乙二醇部分、脂質部分、碳水化合物部分、生物素部分等)結合。術語「胺基酸」可與「胺基酸殘基」互換使用，且可指游離之胺基酸及/或肽之胺基酸殘基。將從使用術語之上下文中顯見其意指游離之胺基酸或肽之殘基。
動物：如本文中所用，術語「動物」意指動物界的任何成員。在一些實施例中，「動物」意指處於任何發育階段的人類。在一些實施例中，「動物」意指處於任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、羊、牛、靈長類動物、及/或豬)。在一些實施例中，動物包括(但不限於)哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、昆蟲及/或蠕蟲。在一些實施例中，動物可為轉殖基因動物、基因工程化動物及/或殖株。
生物活性：如本文所用，片語「生物上活性」意指在生物系統中且特別是在生物體中具有活性之任何藥劑的特徵。舉例而言，當向生物體投予時對該生物體具有生物效應之藥劑視為具有生物上活性。
疾病：如本文所用，術語「疾病」為一種病理性病況，例如，可由症狀或其他確定因素辨識為與健康或正常狀態不同的因素。術語「疾病」包括疾病、症候群、病況、及傷害。疾病包括(但不限於)增生性、發炎性、免疫性、代謝性、感染性、及缺血性疾病。
遞送：如本文所用，術語「遞送」涵蓋局部及全身性遞送兩者。舉例而言，mRNA之遞送涵蓋mRNA遞送至標靶組織且編碼蛋白質表現且保留於標靶組織中(亦稱為「局部分佈」或「局部遞送」)之情形，以及將mRNA遞送至標靶組織且編碼蛋白質表現且分泌至患者循環系統(例如，血清)，且由其他組織全身性分佈及吸收(亦稱為「全身性分佈」或「全身性遞送」)之情形。
給藥間隔：如本文所用，在治療疾病之方法的上下文中，給藥間隔為以mRNA之有效劑量，在有需要之個體(哺乳動物)中投與治療性組合物(例如mRNA組合物)之頻率，使得與疾病相關之一或多種症狀減少；或至少在給藥間隔之時段內減少與疾病相關之一或多種生物標記。給藥頻率及給藥間隔在本發明中可互換使用。
表現：如本文所用，核酸序列之「表現」係指將mRNA轉譯成多肽，將多個多肽組裝成完整蛋白質(例如酶)及/或多肽或經完全組裝之蛋白質(例如酶)的轉譯後修飾。在本申請案中，術語「表現」及「生產」及文法等效物可互換使用。
有效劑量：如本文所用，有效劑量為當根據本發明之方法向有需求之個體(在此為哺乳動物個體)投予時有效引起個體中之預期結果(例如減少與疾病相關之症狀)的醫藥組合物中的mRNA劑量。
宿主細胞：如本文所用，術語「宿主細胞」為可為或曾為任何重組載體或經分離聚核苷酸之受體的個別細胞或細胞培養物，諸如用於工程化可裂解Fc域或本發明之經遮蔽細胞介素的載體或聚核苷酸。宿主細胞包括在體內或體外轉染或感染且具有本發明之重組載體或聚核苷酸的細胞。在一些情況下，宿主細胞為哺乳動物宿主細胞。
改善、增加、或減少：如本文所用，術語「改善」、「增加」、或「減少」，或者文法等效物，表明相對於諸如同一個體中在起始本文所述之治療前的量測值或者對照個體(或多個對照個體)中在不存在本文所述之治療情況下之量測值的基線量測值而言的值。「對照個體」係罹患與所治療個體相同之疾病形式，年齡與所治療個體大約相同之個體。
活體外：如本文所用，術語「活體外」係指在人工環境中，例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等，而非在多細胞生物體內發生的事件。
活體內：如本文所使用，術語「活體內」係指事件發生在諸如人類及非人類動物之多細胞生物體內。在基於細胞之系統之情形下，該術語可用於指事件發生在活細胞內(與例如活體外系統相反)。
部分 ：如本文所用，術語「部分」意指作為分子一部分的子結構。
患者：如本文所用，術語「患者」或「個體」係指為可經投與所提供組合物，例如用於實驗性、診斷性、防治性、美觀性及/或治療目的之任何生物。典型患者包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類及/或人類)。在一些實施例中，患者為人類。人類包括出生前及出生後的形式。
醫藥學上可接受：如本文所用，術語「醫藥上可接受」意指在合理醫學判斷範疇內適用於與人類及動物組織接觸而無過量毒性、刺激、過敏性反應或其他問題或併發症，與合理效益/風險比率相稱之物質。
醫藥上可接受之鹽：醫藥上可接受之鹽為本領域中所熟知。舉例而言，S.M. Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19中詳細描述了醫藥上可接受之鹽。本發明化合物之醫藥上可接受之鹽包括衍生自適合的無機酸及有機酸以及無機鹼及有機鹼之醫藥上可接受之鹽。醫藥上可接受之無毒性酸加成鹽的實例為胺基與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、及過氯酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、順丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、丁二酸、或丙二酸)形成之鹽，或藉由使用本領域中所用之其他方法(諸如離子交換)形成之鹽。其他醫藥上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽、及其類似鹽。衍生自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽、及N+(C1-4烷基)4鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、及其類似物。在適當時，其他醫藥學上可接受之鹽包括無毒銨、四級銨及使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根及芳基磺酸根之相對離子所形成之胺陽離子。其他醫藥學上可接受之鹽包括由胺的四級銨化形成的鹽，該四級銨化使用適當的親電試劑(例如，烷基鹵)進行，以形成四級銨化烷基化胺基鹽。
多肽：如本文所用，術語「多肽」、「肽」、及「蛋白質」在本文中可互換使用，以指胺基酸殘基之聚合物，例如 ，至少3、4、5、6、7、8、9、10、或更多胺基酸的聚合物。在整個本揭示中，使用胺基酸之標準三字母或單字母名稱。如本文所用，該等術語涵蓋任何長度之胺基酸鏈，包括全長蛋白質，其中該等胺基酸殘基係藉由共價肽鍵連接。
聚核苷酸：如本文所用 ，術語「聚核苷酸」係指長度至少5、6、7、8、9、或10個鹼基或鹼基對之核苷酸聚合形式，核糖核苷酸或去氧核苷酸或其任一類型的經修飾形式，且意欲包括DNA及/或RNA之單股及雙股形式。在整個本揭示中，該術語與「核酸分子」可互換使用。
個體：如本文所用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人類包括出生前及出生後的形式。在許多實施例中，個體為人類。個體可為患者，其意指呈現給醫療提供者以診斷或治療疾病之人類。術語「個體」在本文中可與「個體」或「患者」互換使用。個體可罹患或易患疾病或病症，但可能顯示或可能不顯示該疾病或病症之症狀。
實質上：如本文所用，術語「實質上」意指展現感興趣之特徵或性質之全部或接近全部範圍或程度的定性條件。生物學領域中之普通技術者應當理解，生物學及化學現象很少(若曾有)進行完全及/或繼續進行至完全或達成或避免絕對結果。因此，本文使用術語「實質上」以獲得許多生物學及化學現象中固有完整性之潛在缺乏。
標靶組織：如本文所用，術語「標靶組織」意指受待治療之疾病影響的任何組織。在一些實施例中，目標組織包括呈現疾病相關之病變、症狀或特徵的彼等組織。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」之治療劑意謂，當向罹患或易患疾病、病症及/或條件之個體投與時，足以治療、診斷、預防及/或延遲該疾病、病症及/或條件之症狀發作的量。一般熟習此項技術者應瞭解，通常透過包含至少一個單位劑量之給藥方案投與治療有效量。
治療：如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treatment)」或「治療(treating)」係指任何用於部分或完全緩解、改善、減輕、抑制、預防特定疾病、病狀及/或病症之一或多個症狀或特徵、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或降低其發病率之方法。可向未展現疾病之徵象及/或僅展現疾病之早期徵象的個體投與治療，以降低患上與該疾病相關之病變的風險。
載體 ：如本文所用，術語「載體」意指包含聚核苷酸之分子的巨分子或複合分子，其以體外或體內方式遞送至宿主細胞或生物體，通常藉由病毒或質體進行。
本發明之各種態樣在以下章節中詳細描述。章節之使用並不意欲限制本發明。各章節可適用於本發明之任何態樣。在本申請案中，除非另外陳述，否則「或」的使用意指「及/或」。 實施方式
本文所述之經遮蔽細胞介素構築體經工程化以最佳化遮蔽部分(例如抗IL-2 VHH)與細胞介素(例如IL-2多肽)之間的結合，以促進用於治療癌症之安全且有效的靶向治療。本發明尤其提供一種包含減弱的IL-2及VHH遮蔽部分之經遮蔽細胞介素。VHH遮蔽部分結合至IL-2細胞介素且抑制非所需靶標中細胞介素之生物活性。在所需靶標(例如腫瘤)中裂解後，遮蔽部分自細胞介素中釋放，從而活化IL-2多肽之功能。特定言之，本發明之包含減弱的IL-2或VHH遮蔽部分之經遮蔽細胞介素藉由以下表徵：(1)有效遮蔽效率，使得IL-2細胞介素之功能在非所需靶標中受到抑制；(2)藉由蛋白酶進行有效IL-2活化以釋放VHH遮蔽部分；(3)腫瘤中而非血漿中之選擇性IL-2活化；及(4)活體內功效(例如高腫瘤生長抑制)。 介白素2 (IL-2)
本文提供用於任何經遮蔽細胞介素或其裂解產物之IL-2多肽或其功能片段。IL-2藉由調節白血球之活性在細胞信號傳導中，尤其在免疫系統之細胞中發揮重要作用。適用於本發明之IL-2多肽可為任何IL-2多肽或其功能片段。在一些實施例中，IL-2多肽為天然存在之IL-2。在一些實施例中，IL-2多肽包含一或多個取代(例如IL-2突變蛋白或IL-2變異體)或截短的IL-2。在一些實施例中，IL-2為保留至少一種IL-2生物活性特性之多肽。在本申請案中，術語IL-2多肽及IL-2細胞介素可互換使用。
在真核細胞中，天然存在之IL-2多肽合成為153個胺基酸之前驅體多肽，其具有SEQ ID NO: 1。 MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT (SEQ ID NO: 1)
此隨後藉由移除胺基酸殘基1-20而加工為成熟IL-2。此產生由SEQ ID NO: 2中之133個胺基酸(胺基酸殘基21-153)組成之IL-2之成熟形式。在一些實施例中，IL-2多肽為天然存在之IL-2。
在一些實施例中，成熟IL-2多肽包含相對於SEQ ID NO: 2之位置125處之突變。在一些實施例中，突變包含產生SEQ ID NO: 3之C125A。 減弱的IL-2
本發明人發現，使用減弱的IL-2可比其他IL-2變異體(例如「非α IL-2」)更有效地擴增腫瘤特異性T細胞，且表現出比其他IL-2變異體(例如「偏向α之IL-2」)更低的調節T細胞活性。「減弱的IL-2」係指與野生型IL-2相比包含一或多個降低但不消除與IL-2Rα之結合之突變的IL-2變異體。「非α IL-2」係指包含消除與IL-2Rα之結合的一或多個突變的IL-2變異體，且「偏向α之IL-2」係指包含降低或消除與IL-2Rβγ之結合的一或多個突變的IL-2變異體。在一些實施例中，減弱的IL-2包含突變F42E。在一些實施例中，減弱的IL-2包含突變F42E及C125A。
在一些實施例中，胺基酸取代降低IL-2多肽或其功能片段對CD25 (IL-2Rα)之親和力。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含降低但不消除對IL-2Ra結合之親和力的突變(例如，減弱的IL-2)。
在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含相比於SEQ ID NO: 2之野生型IL-2之胺基酸序列具有一或多個胺基酸取代之胺基酸序列，該一或多個胺基酸取代降低IL-2多肽或其功能片段對IL-2Rα (CD25)之親和力。
在一些實施例中，與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列相比，IL-2細胞介素或其功能片段包含胺基酸序列取代C125A。
在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2之胺基酸序列具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約80%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約85%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約90%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約92%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約95%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約96%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約97%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約98%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含與SEQ ID NO: 2具有至少約99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
在一些實施例中，IL-2多肽包含相對於SEQ ID NO: 2之位置42處之取代。在一些實施例中，該取代為F42A。在一些實施例中，該取代為F42E。在一些實施例中，該取代為F42K。在一些實施例中，該取代為F42S。在一些實施例中，該取代為F42R。在一些實施例中，該取代為F42Q。在一些實施例中，該取代為F42Y。
在一些實施例中，IL-2多肽包含選自 表 1之序列。在一些實施例中，IL-2多肽包含SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，IL-2多肽包含SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，IL-2多肽包含SEQ ID NO: 4。 表 1.例示性IL-2多肽序列。
IL-2 變異體 序列
IL-2 WT APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT ( SEQ ID NO: 2)
IL-2 V1 (C125A) APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT ( SEQ ID NO: 3)
IL-2 V3 (F42E、C125A) APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTEKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT ( SEQ ID NO: 4)
IL-2多肽之「功能片段」包含全長細胞介素蛋白質之一部分，其保留或具有經修飾細胞介素受體結合能力(例如，與全長細胞介素蛋白質相比，活性在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%內)。細胞介素受體結合能力可展示在例如細胞介素與細胞介素同源受體或其組分(例如，雜三聚合受體複合物之一或多個鏈)結合的能力。
在一些實施例中，IL-2多肽或其功能片段為能夠結合至介白素-2受體、尤其IL-2Rα鏈之任何天然存在之介白素-2 (IL-2)蛋白或其經修飾變異體。在IL-2多肽結合之情形下，目標蛋白可為IL-2R (包含IL-2Rα、IL-2Rβ及IL-2Rγ鏈)、IL-2Rα鏈、IL-2Rβ鏈或IL-2Rα/β二聚複合物。 VHH遮蔽部分
本發明尤其提供可用作本文所述之經遮蔽或靶向IL-2細胞介素中之任一者中之遮蔽部分的新穎抗IL-2抗原結合片段(例如VHH)。VHH遮蔽部分與IL-2細胞介素結合，且抑制細胞介素之生物活性。裂解時，遮蔽部分自細胞介素中釋放，從而活化IL-2多肽之功能。特定言之，本發明之VHH遮蔽部分之特徵在於改良之結合動力學、有效的IL-2遮蔽效率(亦即，在非目標環境中抑制IL-2)，以及一旦自IL-2釋放便活化IL-2活性以促進腫瘤微環境中之抗腫瘤反應。本發明之VHH遮蔽部分有效地遮蔽或抑制IL2活性，使得經遮蔽IL2細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值係不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素之大於300倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於300倍。但一旦遮蔽部分自IL-2細胞介素分子裂解，IL-2功能便恢復。較佳地，在測試之癌症適應症中之至少一者中，腫瘤中裂解分子之%大於5%，且裂解分子之%低於血漿中之定量下限(LLOQ)。
在一些實施例中，本發明之抗IL-2 VHH具有改良之穩定性、可開發性及可製造性，以便大規模生產用於治療。在一些實施例中，本發明之抗IL-2 VHH具有降低的免疫原性(亦即，誘導最少的內毒素或與預先存在之抗藥物抗體之結合降低)。
在一些實施例中，抗IL-2 VHH以高親和力(例如≤5 nM)與野生型IL-2及非α IL-2結合。在一些實施例中，相對於對野生型IL-2或非α IL-2之結合親和力，抗IL-2 VHH對α偏向性IL-2之結合親和力較低(亦即，≥500 nM)。在一些實施例中，抗IL-2 VHH以介於1 pM至50 nM之間的KD與非α IL-2結合。
在一些實施例中，遮蔽部分係僅重鏈抗體(VHH)。在一些實施例中，遮蔽部分為本文所述之抗IL-2 VHH抗體。
VHH抗體(或奈米抗體)為僅重鏈抗體之抗原結合片段。VHH可來源於例如產生VHH抗體之生物體，諸如駱駝及鯊魚。在一些案例中，VHH可為重組VHH。VHH技術係基於來自缺乏輕鏈之駱駝之全功能性抗體。此等重鏈抗體含有單一可變域(V HH)及兩個恆定域(CH2及CH3)。VHH包含具有三個CDR及四個構架區(FR1至4)之單鏈多肽。如本文所用，「構架區」或「FR」係指可變域中位於CDR之間的區域。如本文所用，「互補決定區」或「CDR」係指在VHH中的可變區，其含有能夠特異性結合至抗原目標(例如細胞介素)之胺基酸序列。在本申請案中，VHH及sdAb可互換使用。
在一些實施例中，VHH包含三個CDR及四個構架區，稱為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些實施例中，VHH可在N端或C端處經截短，使得其僅包含部分FR1及/或FR4，或缺乏彼等構架區中之一或兩者，只要VHH實質上維持細胞介素結合及特異性即可。
在一些實施例中，VHH遮蔽部分藉由可裂解連接子連接至Fc域。在一些實施例中，VHH遮蔽部分藉由本文所述之可裂解連接子(例如包含 表 3中所述之裂解肽之連接子)連接至Fc域。在一些實施例中，VHH遮蔽部分藉由不可裂解連接子連接至Fc域。在一些實施例中VHH遮蔽部分本文所述之不可裂解連接子連接至Fc域。
在一些實施例中，VHH抗體結合至IL-2多肽。在一些實施例中，VHH抗體結合至野生型IL-2。在一些實施例中，VHH抗體結合至IL-2之變異體。在一些實施例中，VHH抗體結合至IL-2之工程化變異體。
在一些實施例中，VHH抗體包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS (SEQ ID NO: 5) – CDR加下劃線。
在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少85%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少87%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少93%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少94%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，VHH抗體包含與SEQ ID NO: 5至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，VHH抗體包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差1個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差2個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差3個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差4個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差5個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差6個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差7個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 6相差8個胺基酸之胺基酸序列的CDR1。
在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差1個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差2個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差3個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差4個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差5個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差6個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差7個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差8個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差9個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 7相差10個胺基酸之胺基酸序列的CDR2。
在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差1個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差8個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差3個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差4個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差5個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差6個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差7個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差8個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差9個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。在一些實施例中，VHH抗體包含具有與SEQ ID NO: 8相差10個胺基酸之胺基酸序列的CDR3。 VHH之胺基酸延伸
在一些實施例中，本發明之VHH遮蔽部分經進一步修飾。與未經修飾之分子相比，一些修飾提供了與預先存在之抗藥物抗體(ADA)結合之能力降低的經修飾分子。換言之，經修飾分子將以降低的親和力或親合力與預先存在之ADA結合。修飾可選自例如但不限於C端添加、延伸、缺失或標籤。額外修飾描述於WO2013024059A2中，該案之內容以引用之方式併入本文中。
另外，與不包含C端延伸、添加、缺失或標籤之未修飾分子相比，經修飾分子可具有增強的安全概況及更少的副作用。投與包含經修飾分子之醫藥組合物可引起免疫原性改善及功效增加。包含經修飾分子之組合物可有利地用於向可產生針對未修飾分子之自體抗體的個體重複給藥。
在一些實施例中，靶向經遮蔽細胞介素包含修飾。在一些實施例中，靶向經遮蔽細胞介素包含C端延伸。在一些實施例中，靶向經遮蔽細胞介素包含C端添加。在一些實施例中，靶向經遮蔽細胞介素包含C端缺失。在一些實施例中，靶向經遮蔽細胞介素包含C端標籤。
在一些實施例中，遮蔽部分包含修飾。在一些實施例中，遮蔽部分包含C端延伸。在一些實施例中，遮蔽部分包含C端添加。在一些實施例中，遮蔽部分包含C端缺失。在一些實施例中，遮蔽部分包含C端標籤。
在一些實施例中，VHH抗體包含修飾。在一些實施例中，VHH抗體包含C端延伸。在一些實施例中，VHH抗體包含C端添加。在一些實施例中，VHH抗體包含C端缺失。在一些實施例中，VHH抗體包含C端標籤。
在一些實施例中，C端延伸選自 表 2。在一些實施例中，C端延伸包含丙胺酸。在一些實施例中，C端延伸包含序列AS。在一些實施例中，C端延伸包含序列AST。在一些實施例中，C端延伸包含序列AAA。在一些實施例中，C端延伸包含序列AH。在一些實施例中，C端延伸包含序列GS。在一些實施例中，C端延伸包含序列PP。在一些實施例中，C端延伸包含序列PPP。在一些實施例中，C端延伸包含序列GP。在一些實施例中，C端修飾包含有包含序列GP之缺失及延伸。
在一些實施例中，C端延伸包含丙胺酸。在一些實施例中，C端延伸包含絲胺酸。在一些實施例中，C端延伸包含蘇胺酸。在一些實施例中，C端延伸包含組胺酸。在一些實施例中，C端延伸包含甘胺酸。在一些實施例中，C端延伸包含脯胺酸。
在一些實施例中，C端延伸包含多個丙胺酸殘基。在一些實施例中，C端延伸包含多個絲胺酸殘基。在一些實施例中，C端延伸包含多個蘇胺酸殘基。在一些實施例中，C端延伸包含多個組胺酸殘基。在一些實施例中，C端延伸包含多個甘胺酸殘基。在一些實施例中，C端延伸包含多個脯胺酸殘基。 表 2.具有延伸之例示性VHH抗體序列。延伸呈粗體。
VHH 延伸 序列
VHH1 無延伸 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS ( SEQ ID NO: 5)
VHH1-A A EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS A( SEQ ID NO: 9)
VHH1-AS AS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS AS( SEQ ID NO: 10)
VHH1-AST AST EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS AST( SEQ ID NO: 11)
VHH1-AAA AAA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS AAA( SEQ ID NO: 12)
VHH1-AH AH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS AH( SEQ ID NO: 13)
VHH1-GS GS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS GS( SEQ ID NO: 14)
VHH1-PP PP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS PP( SEQ ID NO: 15)
VHH1-PPP PPP EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS PPP( SEQ ID NO: 16)
VHH1-GP S119G, P EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVA AISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMY ASSWYEDETDYWGQGTQVTVS GP( SEQ ID NO: 17)
在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含SEQ ID NO: 17。
在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少85%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少87%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少90%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少92%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少93%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少94%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少95%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少96%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少97%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少98%一致之序列。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含額外突變。在一些實施例中，具有C端延伸之VHH抗體包含與SEQ ID NO: 12至少99%一致之序列。 其他遮蔽部分型式
在一些實施例中，本文所述之抗IL-2 VHH或其抗原結合片段(例如CDR序列)併入至抗IL-2抗原結合分子中。在一些實施例中，抗IL-2 VHH或其片段併入至選自以下之抗IL-2抗原結合分子中：Fab、單鏈Fv (scFv)、單域抗體(VHH)、一或多個CDR、可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、Fab樣雙特異性抗體(bsFab)、單域抗體連接之Fab (s-Fab)、抗體或其組合。
在一些實施例中，併有本文所述之抗IL-2 VHH序列之抗IL-2抗原結合分子可為完整抗體或其結合片段。在一些實施例中，衍生自抗體之結合片段包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2、scFv及單鏈抗體。在一些實施例中，抗IL-2抗原結合分子併有本文所述之抗IL-2 VHH序列或其抗原結合片段(例如CDR)。
在一些實施例中，衍生自抗IL-2 VHH序列之抗IL-2抗原結合分子用作經遮蔽細胞介素中之基於抗體之遮蔽部分。
在一些實施例中，基於抗IL-2抗體之遮蔽部分包含Fab、單域抗體(VHH)、一或多個CDR、可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、Fab樣雙特異性抗體(bsFab)、單域抗體連接之Fab (s-Fab)、抗體或其組合。在一些實施例中，基於抗IL-2抗體之遮蔽部分為scFv。在一些實施例中，基於抗IL-2抗體之遮蔽部分為Fab片段。在一些實施例中，基於抗IL-2抗體之遮蔽部分包含結合至IL-2之一或多個CDR (例如本文所述之CDR)。在一些實施例中，基於抗體之遮蔽部分包含結合至IL-2之可變重鏈(VH)。在一些實施例中，基於抗體之遮蔽部分包含結合至IL-2之可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，基於抗體之遮蔽部分包含結合至IL-2之Fab樣雙特異性抗體(bsFab)。在一些實施例中，基於抗體之遮蔽部分包含結合至IL-2之單域抗體連接之Fab (s-Fab)。在一些實施例中，基於抗體之遮蔽部分包含結合至IL-2之抗體或其片段。 載體部分
長的活體內半衰期對於治療性蛋白為重要的。不幸地，投與個體之細胞介素通常具有短半衰期，因為其通常藉由包括腎臟清除及內吞降解之機制自個體快速清除。因此，在本文所提供之經遮蔽細胞介素中，尤其出於延長細胞介素活體內半衰期之目的，載體部分連接至細胞介素或遮蔽部分。
在一些實施例中，載體部分為PEG分子、白蛋白、白蛋白片段及抗體Fc域，或抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，載體部分為Fc域。在一些實施例中，載體部分為PEG分子。在一些實施例中，載體部分為白蛋白。在一些實施例中，載體部分為白蛋白片段。在一些實施例中，載體部分為抗體或其抗原結合片段。 Fc 域
本文提供用於經遮蔽細胞介素或其裂解產物之Fc域。在一些實施例中，在本文所提供之經遮蔽細胞介素中，尤其出於延長細胞介素活體內半衰期之目的，Fc域連接至細胞介素或遮蔽部分。
如本文所用，術語「Fc域」意指來自免疫球蛋白之多肽或片段。Fc域可為任何抗體或其片段。Fc域衍生在動物(例如哺乳動物)中自天然發生或由本領域中已知之任何技術製造的抗體或其片段。在一些實施例中，Fc域為人類Fc域。
在一些實施例中，第一Fc多肽及第二Fc多肽透過連接子(諸如短型肽連接子)而連接。在一些實施例中，連接子為不可裂解的。
在一些實施例中，Fc域包含第一Fc多肽及第二Fc多肽。
能夠進行FcRn介導之再循環之Fc域或其片段可降低或以其他方式延遲靶向細胞介素自個體之清除，由此延長投與之靶向細胞介素之半衰期。在一些實施例中，Fc域或其片段為能夠進行FcRn介導之再循環之任何抗體或其片段，諸如能夠進行FcRn介導之再循環之任何重鏈多肽或其部分(例如Fc域或其片段)。
Fc域或其片段可為任何抗體或其片段。然而，在一些實施例中，第一Fc多肽或第二Fc多肽可不結合至FcRn受體，諸如輕鏈多肽。舉例而言，在一些實施例中，第一Fc多肽不直接與FcRn受體相互作用，但經靶向之細胞介素由於包含能夠與FcRn受體相互作用(諸如藉由包含重鏈多肽)的第二Fc多肽，因此經靶向之細胞介素仍具有延長的半衰期。本領域中公認的FcRn介導之再循環需要將FcRn受體與抗體或其片段之Fc區結合。舉例而言，研究已顯示，殘基I253、S254、H435、及Y436 (根據Kabat EU索引編號系統進行編號)對於人類Fc區與人類FcRn複合物之間的相互作用而言是重要的。參見，例如Firan, M.,等人, Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002；Shields, R.L., 等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。亦已檢查且報導了殘基248-259、301-317、376-382、及424-437 (根據Kabat EU索引編號系統進行編號)的各種突變體。Yeung, Y.A.等人, (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)。
在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或輕鏈多肽。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或輕鏈多肽之一部分。在一些實施例中，抗體或其片段包含Fc域或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含CH2及CH3域或其片段。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽之恆定域。在一些實施例中，抗體或其片段包含輕鏈多肽之恆定域。在一些實施例中，抗體或其片段包含重鏈多肽或其片段(例如，Fc域或其片段)。在一些實施例中，抗體或其片段包含輕鏈多肽。
在一些實施例中，第一及/或第二Fc域各自含有一或多個促進第一與第二Fc多肽之非共價結合的修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含IgG1 Fc域或其片段，其包括突變Y349C、T366S、L368A及Y407V以形成第一半衰期延長域中之『臼』，且第二Fc多肽包含IgG1 Fc域或其片段，其包括突變S354C及T366W以形成第二半衰期延長域中之『杵』。
在一些實施例中，第一及第二Fc多肽各自為IgG1、IgG2、或IgG4 Fc域或其片段。在一些實施例中，第一及第二Fc多肽各自為IgG1 Fc域或其片段。人類IgG1免疫球蛋白重鏈恆定γ1具有以下序列： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 18)
在一些實施例中，第一及第二Fc多肽來源於具有SEQ ID NO: 18之人類IgG1免疫球蛋白重鏈恆定γ 1之序列(『親本序列』)，使得第一及第二Fc多肽各自包含具有一或多個胺基酸修飾之SEQ ID NO: 18或其片段。
在一些實施例中，第一多肽及Fc多肽各自包含上文所示之SEQ ID NO: 18之部分，視情況具有一或多個胺基酸修飾，亦即： DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 19)
在一些實施例中，第一Fc多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列相比具有一或多個修飾，諸如一或多個胺基酸取代、添加或缺失的胺基酸序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含與SEQ ID NO: 19中之任一者之胺基酸序列相比具有一或多個修飾，諸如一或多個胺基酸取代、添加或缺失的胺基酸序列。一或多個修飾可為本文所述之任何修飾或改變，包括在一些實施例中，本文所揭示之促進多肽鏈之雜二聚化及/或遏制多肽鏈之均二聚化、改變效應功能或增強效應功能的任何修飾或改變。
在一些實施例中，Fc域或其片段包含一或多個改變效應功能之胺基酸取代。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG1 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N297A、N297G、N297Q、L234A、L235A、C220S、C226S、C229S、P238S、E233P、L234V、L234F、L235E、P331S、S267E、L328F、D265A及P329G，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG2 Fc域或其片段，且包含根據Kabat EU編號系統進行編號之以下胺基取代：V234A及G237A；H268Q、V309L、A330S、及A331S；及/或V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、及A330S。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG2 Fc域或其片段，且包含根據Kabat EU編號系統進行編號之一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：V234A、G237A、H268Q、V309L、A330S、A331S、P238S、H268A、及V309L。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG4 Fc域或其片段，且包含根據Kabat EU編號系統進行編號之以下胺基取代：L235A、G237A、及E318A；S228P、L234A、及L235A；H268Q、V309L、A330S、及P331S；及/或S228P及L235A。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG2 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：L235A、G237A、E318A、S228P、L234A、H268Q、V309L、A330S及P331S，根據Kabat EU編號系統編號。
在一些實施例中，Fc域或其片段包含一或多個增強效應功能之胺基酸取代。在一些實施例中，半衰期延長域為IgG1 Fc域或其片段且包含以下胺基酸取代：S298A、E333A及K334A；S239D及I332E；S239D、A330L及I332E；P247I及A339D或A339Q；D280H及K290S；D280H、K290S及S298D或S298V；F243L、R292P及Y300L；F243L、R292P、Y300L及P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L；G236A、S239D及I332E；K326A及E333A；K326W及E333S；K290E、S298G及T299A；K290E、S298G、T299A及K326E；K290N、S298G及T299A；K290N、S298G、T299A及K326E；K334V；L235S、S239D及K334V；K334V及Q331M、S239D、F243V、E294L或S298T；E233L、Q311M及K334V；L234I、Q311M及K334V；K334V及S298T、A330M或A330F；K334V、Q311M及A330M或A330F；K334V、S298T及A330M或A330F；K334V、S239D及A330M或S298T；L234Y、Y296W及K290Y、F243V或E294L；Y296W及L234Y或K290Y；S239D、A330S及I332E、V264I；F243L及V264I；L328M；I332E；L328M及I332E；V264I及I332E；S239E及I332E；S239Q及I332E；S239E；A330Y；I332D；L328I及I332E；L328Q及I332E；V264T；V240I；V266I；S239D；S239D及I332D；S239D及I332N；S239D及I332Q；S239E及I332D；S239E及I332N；S239E及I332Q；S239N及I332D；S239N及I332E；S239Q及I332D；A330Y及I332E；V264I、A330Y及I332E；A330L及I332E；V264I、A330L及I332E；L234E、L234Y或L234I；L235D、L235S、L235Y或L235I；S239T；V240M；V264Y；A330I；N325T；I332E及L328D、L328V、L328T或L328I；V264I、I332E及S239E或S239Q；S239E、V264I、A330Y及I332E；A330Y、I332E及S239D或S239N；A330L、I332E及S239D或S239N；V264I、S298A及I332E；S298A、I332E及S239D或S239N；S239D、V264I及I332E；S239D、V264I、S298A及I332E；S239D、V264I、A330L及I332E；S239D、I332E及A330I；P230A；P230A、E233D及I332E；E272Y；K274T、K274E、K274R、K274L或K274Y；F275W；N276L；Y278T；V302I；E318R；S324D、S324I或S324V；K326I或K326T；T335D、T335R或T335Y；V240I及V266I；S239D、A330Y、I332E及L234I；S239D、A330Y、I332E及L235D；S239D、A330Y、I332E及V240I；S239D、A330Y、I332E及V264T；及/或S239D、A330Y、I332E及K326E或K326T，根據Kabat EU編號系統編號。在一些實施例中，Fc域為IgG1 Fc域或其片段且包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R及T335Y。
在一些實施例中，Fc域包含一或多個增強半衰期延長域與FcRn之結合的胺基酸取代。在一些實施例中，一或多個胺基酸取代增加酸性pH下含Fc之多肽(例如重鏈多肽或Fc域或其片段)與FcRn之結合親和力。在一些實施例中，半衰期延長域包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：M428F；T250Q及M428F；M252Y、S254T及T256E；P257I及N434H；D376V及N434H；P257I及Q3111；N434A；N434W；M428F及N434S；V259I及V308F；M252Y、S254T及T256E；V259I、V308F及M428F；T307Q及N434A；T307Q及N434S；T307Q、E380A及N434A；V308P及N434A；N434H；及V308P。 臼包杵方法
促進兩個Fc多肽之雜二聚之一種策略為稱為「臼包杵」之方法。
在一些實施例中，靶向細胞介素包含第一Fc多肽及第二Fc多肽，其中之每一者包含CH3域。在一些實施例中，Fc多肽包含CH3域，其為重鏈多肽或其片段(例如Fc域或其片段)。兩條Fc多肽之CH3域可藉由「臼包杵」技術而改變，其詳細描述於以下之若干實例中：例如WO 1996/027011；Ridgway, J.B.等人, Protein Eng. (1996) 9(7): 617-621；Merchant, A.M.,等人, Nat. Biotechnol. (1998) 16(7): 677-681. 亦參見Klein等人, (2012), MAbs, 4(6): 653-663。使用臼包杵方法，兩個CH3域之相互作用表面經改變以增加含有兩個經改變之CH3域的兩個半衰期延長域之雜二聚合。此藉由將大型殘基導入半衰期延長域之一者之CH3域中而進行，以充當「杵」。隨後，為了容納大型殘基，在另一半衰期延長域中形成可容納杵之「臼」。經改變之CH3域之任一者可為「杵」，而另一者可為「臼」。導入雙硫鍵以進一步穩定雜二聚體(Merchant, A.M.等人, Nat. Biotechnol. (1998) 16(7)；Atwell, S.等人, J. Mol. Biol. (1997) 270(1): 26-35)以及增加產率。
據報導，高於97%之雜二聚產率可藉由在重鏈中導入S354C及T366W突變以產生「杵」及藉由在重鏈中導入Y349C、T366S、L368A及Y407V突變以產生「臼」(殘基根據Kabat EU編號系統進行編號)來達成。Carter等人, (2001), J. Immunol. Methods, 248: 7-15；Klein等人, (2012), MAbs, 4(6): 653-663。
在包含第一Fc多肽及第二Fc多肽之一些實施例中，第一半衰期Fc多肽包含重鏈多肽或其部分(例如，Fc域或其片段)，其包含胺基酸突變S354C及T366W (根據Kabat EU編號系統進行編號)，且第二Fc多肽包含重鏈多肽或其部分(例如，Fc域或其片段)，其包含胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、及Y407V (根據Kabat EU編號系統進行編號)。在包含第一Fc多肽及第二Fc多肽之一些實施例中，第一Fc多肽包含重鏈多肽或其部分(例如，Fc域或其片段)，其包含胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、及Y407V (根據Kabat EU編號系統進行編號)，且第二Fc多肽包含重鏈多肽或其部分(例如，Fc域或其片段)，其包含胺基酸突變S354C及T366W (根據Kabat EU編號系統進行編號)。
可形成杵及臼之取代的額外實例包括US20140302037A1 (在此通過引用併入本文)中所述之該等。舉例而言，在一些實施例中，可對各自含有Fc域之第一Fc多肽(「第一域」)及成對的第二Fc多肽(「第二域」)進行根據Kabat EU編號系統進行編號之以下胺基酸取代中之任一者：(a)第一域中之Y407T及第二域中之T366Y；(b)第一域中之Y407A及第二域中之T366W；(c)第一域中之F405A及第二域中之T394W；(d)第一域中之F405W及第二域中之T394S；(e)第一域中之Y407T及第二域中之T366Y；(f)第一域中之T366Y與F405A及第二域中之T394W與Y407T；(g)第一域中之T366W與F405W及第二域中之T394S與Y407A；(h)第一域中之F405W與Y407A及第二域中之T366W與T394S；或(i)第一域中之T366W及第二域中之T366S、L368A、及Y407V。
在一些實施例中，可對各自含有Fc域之第一Fc多肽(「第一域」)及成對的第二Fc多肽(「第二域」)進行根據Kabat EU編號系統進行編號之以下胺基酸取代中之任一者：(a)第二域中之Y407T及第一域中之T366Y；(b)第二域中之Y407A及第一域中之T366W；(c)第二域中之F405A及第一域中之T394W；(d)第二域中之F405W及第一域中之T394S；(e)第二域中之Y407T及第一域中之T366Y；(f)第二域中之T366Y與F405A及第一域中之T394W與Y407T；(g)第二域中之T366W與F405W及第一域中之T394S與Y407A；(h)第二域中之F405W與Y407A及第一域中之T366W與T394S；或(i)第二域中之T366W及第一域中之T366S、L368A、及Y407V。
在包含各自包含Fc域之第一Fc多肽及第二Fc多肽的實施例中，本文所述之雜二聚合改變之任一者可用於Fc域中以促進本文所述之經靶向細胞介素中任一者之雜二聚合。
在一些實施例中，第一及第二Fc多肽包含具有胺基取代之SEQ ID NO: 19，以根據『臼包杵(knob into holes)』方法促進根據第一及第二Fc多肽的結合。在一些實施例中，序列SEQ ID NO: 19含有突變Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU編號系統編號)以在第一Fc多肽中形成『臼』且含有突變S354C及T366W (根據Kabat EU編號系統編號)以在第二Fc多肽中形成『杵』。
在一些實施例中，第一Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含突變Y349C、T366S、L368A及Y407V。在一些實施例中，第二Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含突變S354C及T366W。
在一些實施例中，第一及第二半衰期延長域各自進一步包含根據Kabat EU編號系統進行編號之胺基取代N297A：在一些實施例中，第一Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含突變Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A。在一些實施例中，第二Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含突變S354C、T366W及N297A。
第一Fc多肽(Y349C；T366S；L368A；Y407V及N297A) SEQ ID NO: 20: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 20)
在一些實施例中，第一及第二Fc多肽各自進一步包含根據Kabat EU編號系統進行編號之胺基取代I253A。
在一些實施例中，第一及第二Fc多肽各自進一步包含根據Kabat EU編號系統進行編號之胺基取代N297A及I253A。在一些實施例中，第一Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含突變Y349C、T366S、L368A、Y407V、N297A及I253A。在一些實施例中，第二Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含突變S354C、T366W、N297A及I253A。 用於雜二聚合蛋白質純化之RF突變或CH3域交換
相差至少一個胺基酸的兩條免疫球蛋白重鏈允許基於免疫球蛋白重鏈及經修飾或突變之免疫球蛋白重鏈對親和力試劑的差異親和力來分離抗原結合蛋白質。具有IgG CH2及CH3區之抗原結合蛋白質就蛋白質A而言具有不同的親和力，允許IgG區與蛋白質A之差異結合來快速分離。
在一實施例中，第二Fc多肽包含CH3區中之95R修飾(根據IMGT外顯子編號；根據EU編號之435R)。在另一實施例中，第二Fc多肽進一步包含96F修飾(IMGT；根據EU之436F)。在一些實施例中，第一Fc多肽包含源自IgG1或IgG4之野生型CH2及CH3域，且第二Fc多肽包含根據IMGT外顯子編號之95R/96F修飾。在一些實施例中，第一Fc多肽包含源自IgG1或IgG4之野生型CH2及CH3域，且第二Fc多肽包含根據EU編號之435R/436F修飾。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含源自IgG1或IgG4之野生型CH2及CH3域，且第二Fc多肽包含源自IgG3之CH3域。
在一些實施例中，第一Fc多肽或第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。SEQ ID NO: 21包含具有「RF突變(435R/436F)」之「杵突變」。在一些實施例中，第一Fc多肽相對於SEQ ID NO: 19包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變。 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGGSPG (SEQ ID NO: 21)
在一些實施例中，第一Fc多肽包含與SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之胺基酸序列中之任一者具有約或至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約87%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約92%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約93%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約94%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約96%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約97%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約98%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 19之胺基酸序列具有約或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約87%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約92%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約93%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約94%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約96%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約97%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約98%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 20之胺基酸序列具有約或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約85%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約87%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約90%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約92%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約93%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約94%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約95%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約96%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約97%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約98%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽或第二多肽包含與SEQ ID NO: 21之胺基酸序列具有約或至少約99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列且第二多肽包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。 連接子
本文提供用於經遮蔽之細胞介素或其裂解產物的連接子。如本文所提供之連接子係指用於將本文所述之經遮蔽之細胞介素中之兩個功能組分連接在一起的兩個或更多個胺基酸之肽。
在一些實施例中，經遮蔽之細胞介素包含第一連接子及第二連接子，其中至少第一連接子或第二連接子包含蛋白水解裂解肽。在一些實施例中，經遮蔽之細胞介素包含第一連接子及第二連接子，其中第一及第二連接子均為不可裂解連接子。
在一些實施例中，第一Fc多肽透過第一連接子而與細胞介素或其變體連接。在一些實施例中，第二Fc多肽透過第二連接子而與遮蔽部分連接。在一些實施例中，第一Fc多肽透過可裂解連接子而與細胞介素或其變體連接。在一些實施例中，第二Fc多肽透過可裂解連接子而與遮蔽部分連接。在一些實施例中，第一Fc多肽透過可裂解連接子而與細胞介素或其變體連接，且第二Fc多肽透過不可裂解連接子而與遮蔽部分連接。在一些實施例中，第一Fc多肽透過不可裂解連接子而與細胞介素或其變體連接，且第二Fc多肽透過可裂解連接子而與遮蔽部分連接。在一些實施例中，第一Fc多肽透過可裂解連接子而與細胞介素或其變體連接，且第二Fc多肽透過可裂解連接子而與遮蔽部分連接。在一些實施例中，第一Fc多肽透過不可裂解連接子而與細胞介素或其變體連接，且第二Fc多肽透過不可裂解連接子而與遮蔽部分連接。 可裂解連接子
本發明中之可裂解連接子含有裂解肽。 裂解肽
裂解肽為包括蛋白酶裂解位點之多肽，以使得裂解肽可以蛋白水解方式裂解。蛋白酶為裂解及水解標靶受質蛋白質之兩個特定胺基酸殘基之間的肽鍵的酶。如本文所用之「裂解位點」係指用於使在包含本文所述之裂解肽之任一連接子中發現的裂解肽之一部分裂解的可識別位點。因此，可在如本文所述之裂解肽之序列中發現裂解位點。在本揭示之情形下，術語「裂解肽」及「裂解肽模體」可互換使用。在一些實施例中，裂解位點為由裂解劑識別及裂解之胺基酸序列。
在一些實施例中，裂解位點可併入至用於將本文所述之經遮蔽細胞介素中之兩個功能組分連接在一起的連接子中。
在一些實施例中，蛋白酶裂解位點為腫瘤相關蛋白酶裂解位點。如本文所提供，「腫瘤相關蛋白酶裂解位點」為一種由表現係腫瘤細胞或其腫瘤細胞環境所特有或上調的蛋白酶識別之胺基酸序列。
腫瘤細胞環境複雜且可包含多種不同蛋白酶。因此，給定裂解肽在腫瘤細胞環境中裂解之精確位點可在腫瘤類型之間、在具有相同腫瘤類型之患者之間及甚至在同一腫瘤中形成之裂解產物之間變化，視特定腫瘤細胞環境而定。此外，即使在裂解之後，例如藉由移除一或兩個末端胺基酸對初始裂解產物之進一步修飾亦可藉由腫瘤細胞環境中蛋白酶之進一步作用進行。因此，在投與如本文所述之靶向細胞介素後，可預期在患者之腫瘤細胞環境中形成裂解產物之分佈。
應瞭解，如本文中所提及之裂解位點係指裂解肽內兩個特定胺基酸殘基之間的位點，該等胺基酸殘基為已知與腫瘤細胞環境相關之蛋白酶的目標。在此意義上，如本文所述之裂解肽中可存在超過一個裂解位點，其中不同蛋白酶在不同裂解位點裂解該裂解肽。超過一種蛋白酶亦可作用於裂解肽內之同一裂解位點。蛋白酶裂解位點之討論可見於本領域中。
因此，本文揭示之裂解肽可藉由一或多種蛋白酶裂解。在一些實施例中，蛋白酶裂解位點為腫瘤相關蛋白酶裂解位點。腫瘤相關蛋白酶裂解位點可藉由腫瘤相關蛋白酶識別。作為非限制性實例，腫瘤相關蛋白酶為基質金屬蛋白酶(MMP)，其選自由以下組成之群：MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP27及MMP28。在一實施例中，腫瘤相關蛋白酶為MMP2。在另一實施例中，腫瘤相關蛋白酶為MMP3。在一些實施例中，腫瘤相關蛋白酶為MMP7。在又另一實施例中，腫瘤相關蛋白酶為MMP9。在又另一實施例中，腫瘤相關蛋白酶為MMP10。其他疾病相關及組織選擇性蛋白酶包括(但不限於)組織蛋白酶(組織蛋白酶B (catB)、組織蛋白酶D、組織蛋白酶F、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶V、組織蛋白酶S、組織蛋白酶W)、ADAM、ADAMTS、激肽釋放酶1至15、HTRA1-2-3、HGFAc、PRSS、TMPRSS、彈性蛋白酶、PR-3、顆粒酶(顆粒酶A、B、M、H及K)、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、纖維蛋白溶酶、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物(uPA)、類胰蛋白酶、凋亡蛋白酶、凝血酶、豆莢蛋白、凝乳酶、膠原蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶A (napsin A)及蛋白裂解酶(matripatse) 1-2。在一些實施例中，疾病相關及/或組織選擇性蛋白酶為組織蛋白酶(組織蛋白酶B (catB))。
在一些實施例中，裂解肽為共定位於表現細胞介素受體之區域或組織中之蛋白酶的受質。
在一些實施例中，裂解肽係5-聚體(亦即，長度為5個胺基酸之肽)、6-聚體(亦即，長度為6個胺基酸之肽)、7-聚體(亦即，長度為7個胺基酸之肽)、8-聚體(亦即，長度為8個胺基酸之肽)、9-聚體(亦即，長度為9個胺基酸之肽)、10-聚體(亦即，長度為10個胺基酸之肽)、11-聚體(亦即，長度為11個胺基酸之肽)、12-聚體(亦即，長度為12個胺基酸之肽)、13-聚體(亦即，長度為13個胺基酸之肽)、14-聚體(亦即，長度為14個胺基酸之肽)、15-聚體(亦即，長度為15個胺基酸之肽)、16-聚體(亦即，長度為16個胺基酸之肽)、17-聚體(亦即，長度為17個胺基酸之肽)或18-聚體(亦即，長度為18個胺基酸之肽)。
在一些實施例中，裂解肽之長度為5至18個胺基酸。在一些實施例中，裂解肽之長度為6至10個胺基酸。
在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 22 (IHVTLKSL)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 23 (NSYTIKGL)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 24 (SNESLSLS)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 25 (QVSSSLSP)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 26 (PTSTSLSP)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 27 (ESLSLSEE)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 28 (ASLSLAPV)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 29 (SQESLSLS)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 30 (PLGL)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 31 (APAGLIVPYN)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 32 (PVSLRSGS)。在一些實施例中，裂解肽包含PANLVAPDP (SEQ ID NO: 33)。在一些實施例中，裂解肽包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，裂解肽包含ISSGLLSGRS (SEQ ID NO: 35)。在一些實施例中，裂解肽包含RAAAVKSP (SEQ ID NO: 36)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 37 (RPLALWRS)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 38 (TQKPLGLS)。在一些實施例中，裂解肽包含SEQ ID NO: 39 (RSKYLATA)。在一些實施例中，裂解肽包含GRPRHQGV (SEQ ID NO: 40)。在一些實施例中，裂解肽包含GLFG (SEQ ID NO: 41)。在一些實施例中，裂解肽包含GFLG (SEQ ID NO: 42)。在一些實施例中，裂解肽包含AGRRAAK (SEQ ID NO: 43)。在一些實施例中，裂解肽包含FRLWA (SEQ ID NO: 44)。在一些實施例中，裂解肽包含FRLWS (SEQ ID NO: 45)。在一些實施例中，裂解肽包含NFFGVGGE (SEQ ID NO: 46)。在一些實施例中，裂解肽包含PMKRLTLA (SEQ ID NO: 47)。在一些實施例中，裂解肽包含FPLATYAP (SEQ ID NO: 48)。在一些實施例中，裂解肽包含FLVGGASL (SEQ ID NO: 49)。在一些實施例中，裂解肽包含KPMQFLGD (SEQ ID NO: 50)。在一些實施例中，裂解肽包含GIVRAKGV (SEQ ID NO: 51)。在一些實施例中，裂解肽包含ALFKSSFP (SEQ ID NO: 52)。在一些實施例中，裂解肽包含SGRRSPGG (SEQ ID NO: 53)。在一些實施例中，裂解肽包含SLGRRPGG (SEQ ID NO: 54)。在一些實施例中，裂解肽包含SLSGRRGG (SEQ ID NO: 55)。在一些實施例中，裂解肽包含SLSLGRRG (SEQ ID NO: 56)。在一些實施例中，裂解肽包含SLSLSGRR (SEQ ID NO: 57)。在一些實施例中，裂解肽包含GGPRRL (SEQ ID NO: 58)。在一些實施例中，裂解肽包含GGPLRL (SEQ ID NO: 59)。在一些實施例中，裂解肽包含GGPKLL (SEQ ID NO: 60)。在一些實施例中，裂解肽包含GGPRNL (SEQ ID NO: 61)。在一些實施例中，裂解肽包含GGPRML (SEQ ID NO: 62)。在一些實施例中，裂解肽包含EHLRSPGG (SEQ ID NO: 63)。在一些實施例中，裂解肽包含FRSGVPGG (SEQ ID NO: 64)。在一些實施例中，裂解肽包含SLLLRTGN (SEQ ID NO: 65)。在一些實施例中，裂解肽包含AGLRSPGG (SEQ ID NO: 66)。在一些實施例中，裂解肽包含SLFRSAGP (SEQ ID NO: 67)。在一些實施例中，裂解肽包含SLFRAPGP (SEQ ID NO: 68)。在一些實施例中，裂解肽包含WLFRSPLG (SEQ ID NO: 69)。在一些實施例中，裂解肽包含SRLRSPQG (SEQ ID NO: 70)。在一些實施例中，裂解肽包含SLVLSGRR (SEQ ID NO: 71)。在一些實施例中，裂解肽包含KQLRHMRG (SEQ ID NO: 72)。在一些實施例中，裂解肽包含LSGRSDNH (SEQ ID NO: 73)。在一些實施例中，裂解肽包含LSGK (SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，裂解肽包含LSGR (SEQ ID NO: 75)。在一些實施例中，裂解肽包含RQARVVGG (SEQ ID NO: 76)。在一些實施例中，裂解肽包含RQRRVVGG (SEQ ID NO: 77)。在一些實施例中，裂解肽包含RQYRVVGG (SEQ ID NO: 78)。在一些實施例中，裂解肽包含SKGRSLIG (SEQ ID NO: 79)。在一些實施例中，裂解肽包含PRFKIIGG (SEQ ID NO: 80)。在一些實施例中，裂解肽包含KQLRVVNG (SEQ ID NO: 81)。在一些實施例中，裂解肽包含IQPRITGG (SEQ ID NO: 82)。在一些實施例中，裂解肽包含KQSRKFVP (SEQ ID NO: 83)。在一些實施例中，裂解肽包含GRQSRAGG (SEQ ID NO: 84)。在一些實施例中，裂解肽包含SGRSSPGG (SEQ ID NO: 85)。在一些實施例中，裂解肽包含SSGRSPGG (SEQ ID NO: 86)。在一些實施例中，裂解肽包含SLSGRSGG (SEQ ID NO: 87)。在一些實施例中，裂解肽包含SLSSGRSG (SEQ ID NO: 88)。在一些實施例中，裂解肽包含KLSLSGRS (SEQ ID NO: 89)。在一些實施例中，裂解肽包含PLRLSRA (SEQ ID NO: 90)。在一些實施例中，裂解肽包含PLKLSRA (SEQ ID NO: 91)。在一些實施例中，裂解肽包含PLGLSGRS (SEQ ID NO: 92)。在一些實施例中，裂解肽包含PLGLRSRA (SEQ ID NO: 93)。在一些實施例中，裂解肽包含PLGLKSRA (SEQ ID NO: 94)。在一些實施例中，裂解肽包含RGSRAG (SEQ ID NO: 95)。在一些實施例中，裂解肽包含RLSRGK (SEQ ID NO: 96)。在一些實施例中，裂解肽包含RGSRGG (SEQ ID NO: 97)。在一些實施例中，裂解肽包含KGSRAG (SEQ ID NO: 98)。在一些實施例中，裂解肽包含KLSRGK (SEQ ID NO: 99)。在一些實施例中，裂解肽包含GRSRAG (SEQ ID NO: 100)。在一些實施例中，裂解肽包含LRSRGK (SEQ ID NO: 101)。在一些實施例中，裂解肽包含GRSRGG (SEQ ID NO: 102)。在一些實施例中，裂解肽包含GKSRAG (SEQ ID NO: 103)。在一些實施例中，裂解肽包含LKSRGK (SEQ ID NO: 104)。在一些實施例中，裂解肽包含VPLSLYSGP (SEQ ID NO: 105)。在一些實施例中，裂解肽包含DSGGFMLT (SEQ ID NO: 106)。在一些實施例中，裂解肽包含HEQLTV (SEQ ID NO: 107)。在一些實施例中，裂解肽包含VPLSLY (SEQ ID NO: 108)。在一些實施例中，裂解肽包含DLLAVVAAS (SEQ ID NO: 109)。在一些實施例中，裂解肽包含GMPKDLYHAS (SEQ ID NO: 110)。在一些實施例中，裂解肽包含IVGRPRHQGV (SEQ ID NO: 111)。在一些實施例中，裂解肽包含MPYDLYHPS (SEQ ID NO: 112)。在一些實施例中，裂解肽包含VPLSLYSG (SEQ ID NO: 113)。在一些實施例中，裂解肽包含ISSGLLSGRSDQP (SEQ ID NO: 114)。在一些實施例中，裂解肽包含MPY (SEQ ID NO: 115)。在一些實施例中，裂解肽包含QQGNVFSC (SEQ ID NO: 116)。在一些實施例中，裂解肽包含LSLSGRS (SEQ ID NO: 117)。 表 3. 例示性裂解肽
SEQ ID NO: 序列(*指示裂解肽內之裂解位點)
113 VPLSLYSG
116 QQGNVFSC
22 IHVTLKSL
23 NSYTIKGL
24 SNESLSLS
25 QVSSSLSP
26 PTSTSLSP
27 ESLSLSEE
28 ASLSLAPV
29 SQESLSLS
30 PLGL
31 APAGLIVPYN
32 PVSLRSGS
33 PANLVAPDP
34 MPYD*LYHP
35 ISSGLL*SG*RS
36 RAAA*VKSP
37 RPLALWRS
38 TQKPLGLS
39 RSKYLATA
40 GRPRHQGV
41 GLFG
42 GFLG
43 AGRRAAK
44 FRLWA
45 FRLWS
46 NFFGVGGE
47 PMKRLTLA
48 FPLATYAP
49 FLVGGASL
50 KPMQFLGD
51 GIVRAKGV
52 ALFKSSFP
53 SGRRSPGG
54 SLGRRPGG
55 SLSGRRGG
56 SLSLGRRG
57 SLSLSGRR
58 GGPRRL
59 GGPLRL
60 GGPKLL
61 GGPRNL
62 GGPRML
63 EHLRSPGG
64 FRSGVPGG
65 SLLLRTGN
66 AGLRSPGG
67 SLFRSAGP
68 SLFRAPGP
69 WLFRSPLG
70 SRLRSPQG
71 SLVLSGRR
72 KQLRHMRG
73 LSGRSDNH
74 LSGK
75 LSGR
76 RQARVVGG
77 RQRRVVGG
78 RQYRVVGG
79 SKGRSLIG
80 PRFKIIGG
81 KQLRVVNG
82 IQPRITGG
83 KQSRKFVP
84 GRQSRAGG
85 SGRSSPGG
86 SSGRSPGG
87 SLSGRSGG
88 SLSSGRSG
117 LSLSGRS
89 KLSLSGRS
90 PLRLSRA
91 PLKLSRA
92 PLGLSGRS
93 PLGLRSRA
94 PLGLKSRA
95 RGSRAG
96 RLSRGK
97 RGSRGG
98 KGSRAG
99 KLSRGK
100 GRSRAG
101 LRSRGK
102 GRSRGG
103 GKSRAG
104 LKSRGK
105 VPLSLYSGP
106 DSGG*FMLT
107 HEQ*LTV
108 VPLS*LY
109 DLLA*VVAAS
110 GMPKDLYHAS
111 IVGRPRHQGV
112 MPYDLYHPS
114 ISSGLLSGRSDQP
115 MPY
僅舉例而言，在上表中，*指示裂解肽內之已知或觀測到的蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，裂解肽包含選自 表 3之胺基酸序列。
在一些實施例中，可裂解連接子之長度在2與25個胺基酸之間。在一些實施例中，可裂解連接子之長度在3與21個胺基酸之間。在一些實施例中，可裂解連接子之長度在3與18個胺基酸之間。在一些實施例中，可裂解連接子之長度在5與18個胺基酸之間。在一些實施例中，可裂解連接子之長度在3與8個胺基酸之間。在一些實施例中，可裂解連接子之長度在4與6個胺基酸之間。
在一些實施例中，可裂解連接子之長度為15個胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子之長度為16個胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子之長度為17個胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子之長度為18個胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子之長度為19個胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子之長度為20個胺基酸。
在一些實施例中，可裂解連接子包含 表 3中所列之裂解肽。
在一些實施例中，可裂解連接子包含蛋白水解裂解肽(CP)，其兩側上側接有如下式所示之間隔域(SD)： SD-CP-SD
可裂解連接子包含選自 表 3之任何裂解肽。
在一些實施例中，可裂解連接子包含MPYDLYHPS (SEQ ID NO: 112)。在一些實施例中，可裂解連接子包含MPY (SEQ ID NO: 115)。 表 4. 例示性可裂解連接子
SEQ ID NO 序列(裂解肽加底線)
118 GPPSGSSP MPYDLYHPSGGG
119 GPPSGSSPG MPYDLYHPSGGG
120 GGP MPYDLYHPSGGG
121 GSP MPYDLYHPSGGG
122 SSGGP MPYDLYHPSGGG
123 SGSSPG MPYDLYHPSGGG
124 GSSGPSG MPYDLYHPSGGG
125 GSSSGPGS MPYDLYHPSGGG
126 GPPSGSSP VPLSLYSGSGGG
127 GGSP VPLSLYSGSGGG
128 GSGG VPLSLYSGSGGG
129 GGSPG VPLSLYSGSGGG
130 GGSSGP VPLSLYSGSGGG
131 GGSSGSG VPLSLYSGSGGG
132 GGSPGSP VPLSLYSGSGGG
133 GSPG VPLSLYSGSSP MPYDLYHPSGG
134 GGSGGS VPLSLYSGP
135 GGSGGSGGS VPLSLYSGP
136 GGSGGS MPYDLYHPSGP
137 GGSGGSGGS MPYDLYHPSGP
138 GGSGGSDSGGFMLTSGP
139 GGSGGSGGSDSGGFMLTSGP
140 GGSGGSRAAAVKSPSGP
141 GGSGGSGGSRAAAVKSPSGP
142 GGSGGSISSGLLSGRSSGP
143 GGSGGSGGSISSGLLSGRSSGP
144 SPGGGGP MPYDLYHPSGGG
在一些實施例中，可裂解連接子包含SPGGGGPMPYDLYHPSGGG (SEQ ID NO: 144)。 間隔域
間隔域可由一或多種胺基酸組成。間隔域(當存在時)之功能係將蛋白水解裂解肽(CP)連接至本文所述之構築體中之其他功能組分。
應理解，間隔域不改變腫瘤細胞環境中或非腫瘤細胞環境中蛋白水解可裂解肽與蛋白酶之生物學相互作用。換言之，即使在間隔域存在下，本文所揭示之本發明蛋白水解裂解肽亦保持其有利腫瘤特異性。
在一些實施例中，側接蛋白水解裂解肽之間隔域不同。
在一些實施例中，間隔域富含胺基酸殘基G、S及P。
在一些實施例中，間隔域僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。
在一些實施例中，可裂解連接子包含式12： N' SD1-CP-SD2 C' (12) 其中SD1為第一間隔域且SD2為第二間隔域。
在一些實施例中，可裂解連接子包含式12： N' SD1-CP-SD2 C' (12)
在一些實施例中，第一多肽鏈包含下式7且第二多肽鏈包含下式13： N' HL1-不可裂解L1-MM C' (7) N' HL2- SD1-CP-SD2 -C' (13)
在一些實施例中，第一多肽鏈包含下式14且第二多肽鏈包含下式10： N' HL1- SD1-CP-SD2 -MM C' (14) N' HL2-不可裂解L2-C C' (10)
在一些實施例中，SD1由甘胺酸(G)組成。
在一些實施例中，SD1之N端為甘胺酸(G)。
在一些實施例中，第一間隔域(SD1)之長度在3與10個胺基酸之間。在一些實施例中，第一間隔域(SD1)之長度在4至9個胺基酸之間。在一些實施例中，第一間隔域(SD1)之長度在3與6個胺基酸之間。
在一些實施例中，SD1包含選自SEQ ID NO: 145-161之序列。在一些實施例中，SD2包含選自SEQ ID NO: 145-161之序列。
在一些實施例中，SD2由GP組成。
在一些實施例中，SD2之C端序列為-GP C'。
在一些實施例中，第二間隔域(SD2)之長度在3與6個胺基酸之間。 表 5. 例示性間隔域
SD1 之 SEQ ID NO 序列
145 GGSSPP
146 GSGP
147 GSPG
148 GGSG
149 GPPSGSSPG
150 GPPSGSSP
151 GGPS
152 GSGPS
153 GSSGGP
154 GSP
155 GSGSPS
156 PSGSSPG
157 SGSPS
158 SPGGGGP
159 SGP
160 SGGG
161 GSGGG
可裂解連接子中SD1與SD2之例示性組合展示於 表 6中。 表 6. 可裂解連接子結構
連接子結構 SD1序列 SD2序列
SD1-CP-SD2 GPPSGSSPG SEQ ID NO: 149 SGGG SEQ ID NO: 160
SD1-CP-SD2 GPPSGSSPG SEQ ID NO: 149 GSGGG SEQ ID NO: 161
SD1-CP-SD2 GPPSGSSP SEQ ID NO: 150 SGGG SEQ ID NO: 160
SD1-CP-SD2 GGSSPP SEQ ID NO: 145 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GSPG SEQ ID NO: 147 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GGSG SEQ ID NO: 148 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GSGP SEQ ID NO: 146 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GGPS SEQ ID NO: 151 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GSGPS SEQ ID NO: 152 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GSSGGP SEQ ID NO: 153 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GSP SEQ ID NO: 154 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 GSGSPS SEQ ID NO: 155 SGP SEQ ID NO: 159
SD1-CP-SD2 G SGP SEQ ID NO: 159
不可裂解連接子
在一些實施例中，不可裂解連接子之長度在2與25個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度在3與21個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度在3與18個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度在5與18個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度在3與8個胺基酸之間。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度在4與6個胺基酸之間。
在一些實施例中，不可裂解連接子之長度為15個胺基酸。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度為16個胺基酸。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度為17個胺基酸。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度為18個胺基酸。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度為19個胺基酸。在一些實施例中，不可裂解連接子之長度為20個胺基酸。
在一些實施例中，不可裂解連接子富含胺基酸殘基G、S及P。在一些實施例中，不可裂解連接子僅包括選自由G、S及P組成之群的胺基酸殘基類型。在一些實施例中，不可裂解連接子包括「GS」重複序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包括N'端「P」殘基。
在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 162 (PGSGS)中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 163 (GGSSPPGGGSSGGGSGP)中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 164 (GGGGS)中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 165 (GGGGSGGGGS)中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 166 (GGSGGGSGGGGGS)中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 167 (GGSGGSGGSGGSGGSSGP)中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，不可裂解連接子包含如SEQ ID NO: 168 (PGGSGP)中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，不可裂解連接子包含胺基酸序列GGS。
在一些實施例中，不可裂解連接子包括[(G) nS]，其中n=4或5。
在一些實施例中，需要第一及第二多肽鏈之長度相同或類似，以在所組裝之構築體中促進第一半衰期延長域與第二半衰期延長域及遮蔽細胞介素或其功能片段之遮蔽域的結合。因此，在遮蔽部分之胺基酸序列比細胞介素或其功能片段的短之情況下，長度差異可藉由使用較長的連接子L1而完全或部分補償。 靶向部分
在一些實施例中，本文所述之經遮蔽IL-2細胞介素進一步包含靶向部分(例如靶向細胞介素)。因此，本發明亦提供靶向細胞介素，其包含靶向部分、細胞介素或其變異體(例如IL-2多肽)、遮蔽部分(例如本文所述之抗IL-2 VHH)及載體部分。在一些實施例中，靶向細胞介素包含靶向部分、IL-2多肽、遮蔽部分及Fc域。本發明之靶向細胞介素在疾病位點處變得具有活性，且能夠特異性靶向所關注之細胞以便有效治療癌症而不引起非所需副作用。
根據本發明之靶向IL-2多肽可組合如本文中任何地方所描述之IL-2多肽或其功能片段；如本文中任何地方所描述之遮蔽部分；如本文中任何地方所描述之第一及第二Fc域；及如本文中任何地方所描述之可裂解及不可裂解連接子；及如本文中任何地方所描述之靶向部分。
本文提供一種包含靶向部分之靶向細胞介素。在一些實施例中，靶向部分包含結合至表現於目標細胞表面上之抗原的抗原結合部分。
在一些實施例中，靶向部分包含抗原結合部分，其中抗原表現在免疫細胞上。在一些實施例中，靶向部分包含抗原結合部分，其中抗原係選自PD-1、PD-L1、CTLA- 4、TIGIT、TIM-3、LAG-3、OX40、DR5、ICOS、GITR、CD73、CD39、CD25、CD16a、CD8、KLRC1、KLRD1、KLRB1、CD40、CD137、CD28及CD16b。
在一些實施例中，靶向部分特異性結合PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CD25、CD16a、CD16b、OX40、DR5、ICOS、GITR、NKG2D、KLRC1、KLRD1、KLRB1、NKP44、NKP30、BCMA、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、MICA、DLK1、人類表皮生長因子受體3 (HER3)、δ樣蛋白3 (DLL3)、δ樣蛋白4 (DLL4)、表皮生長因子受體(EGFR)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3，GPC3)、c-MET、血管內皮生長因子受體1 (VEGF R1)、血管內皮生長因子受體2 (VEGF R2)、連接素-4 (Nectin-4)、Liv-1、醣蛋白NMB (GPNMB)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、Trop-2、碳酸酐酶IX (CA9)、內皮素B受體(ETBR)、前列腺六跨膜上皮抗原1 (STEAP1)、NAPI2B、葉酸受體α (FR-a)、SLIT及NTRK樣蛋白6 (SLITRK6)、碳酸酐酶VI (CA6)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3 (ENPP3)、間皮素、滋胚層醣蛋白(TPBG)、CD19、CD8、CD20、CD22、CD28、CD33、CD39、CD40、CD56、CD66e、CD70、CD73、CD74、CD79b、CD98、CD123、CD137、CD138、CD352、CD47、信號調節蛋白α (SIRPα)、密連蛋白(Claudin) 18.2、密連蛋白6、5T4、纖維母細胞活化蛋白α (FAPα)、纖維結合蛋白、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白多醣(MCSP)、上皮細胞黏附分子(EPCAM)或其組合。
在一些實施例中，靶向部分結合腫瘤相關抗原。在一些實施例中，靶向部分為結合腫瘤相關抗原之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，靶向部分為結合腫瘤相關抗原之雙特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，靶向部分為抗α-胎蛋白(AFP)抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗B2M抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗β-人類絨毛膜激性腺素(β-hCG)抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD117抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD19抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD20抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD22抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD25抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD30抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD33抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗CD151抗體或其片段。在一些實施例中，靶向部分為抗MUC-1抗體或其片段。 PD-1靶向部分
在一些實施例中，靶向部分特異性結合PD-1。在一些實施例中，靶向部分為抗PD1 Fab。在一些實施例中，靶向部分為抗PD1 scFv。
在一些實施例中，靶向部分衍生自抗PD1抗體。在一些實施例中，靶向部分衍生自帕博利珠單抗或納武單抗。在一些實施例中，靶向部分衍生自帕博利珠單抗。在一些實施例中，靶向部分衍生自納武單抗。
在一些實施例中，靶向部分結合PD-L1。
在一些實施例中，靶向部分包含與標靶特異性地結合之藥劑、肽、或多肽。
在一些實施例中，靶向部分包含Fab、單鏈Fv (scFv)、單域抗體(VHH)、一或多個CDR、可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、Fab樣雙特異性抗體(bsFab)、單域抗體連接之Fab (s-Fab)、抗體、或其組合。在一些實施例中，靶向部分包含Fab。在一些實施例中，靶向部分包含單鏈Fv (scFv)。在一些實施例中，靶向部分包含單域抗體(VHH)。在一些實施例中，靶向部分包含一或多個CDR。在一些實施例中，靶向部分包含可變重鏈(VH)。在一些實施例中，靶向部分包含可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，靶向部分包含Fab樣雙特異性抗體(bsFab)。在一些實施例中，靶向部分包含單域抗體連接之Fab (s-Fab)。在一些實施例中，靶向部分包含抗體或其片段。
在一些實施例中，靶向部分包含帕博利珠單抗之重鏈可變區或輕鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 169)之重鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含SEQ ID NO: 169之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含以下之重鏈可變及恆定區：QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO: 170)。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 170具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含SEQ ID NO: 170之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 171)之重鏈。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 171具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含SEQ ID NO: 171之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含GYTFTNYY (SEQ ID NO: 172)之重鏈CDR1序列、INPSNGGT (SEQ ID NO: 173)之重鏈CDR2序列及ARRDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 174)之重鏈CDR3序列。
在一些實施例中，靶向部分包含EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKTSENLYFQ (SEQ ID NO: 175)之輕鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 175一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 176)之輕鏈。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 176一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含KGVSTSGYSY (SEQ ID NO: 177)之輕鏈CDR1序列、LAS (SEQ ID NO: 178)之輕鏈CDR2序列及QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 179)之輕鏈CDR3序列。
在一些實施例中，靶向部分包含SEQ ID NO: 172之HCDR1、SEQ ID NO: 173之HCDR2、SEQ ID NO: 174之HCDR3、SEQ ID NO: 177之LCDR1、SEQ ID NO: 178之LCDR2及SEQ ID NO: 179之LCDR3。
在一些實施例中，靶向部分包含納武單抗之重鏈可變區或輕鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 180)之重鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 180具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 180一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL DCKASGITFS NSGMHWVRQA PGKGLEWVAV IWYDGSKRYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLF LQMNSLRAED TAVYYCATND DYWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 181)。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 181具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 181一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含GITFSNSG (SEQ ID NO: 182)之重鏈CDR1序列、VIWYDGSKRYYADSVKG (SEQ ID NO: 183)之重鏈CDR2序列及ATNDDY (SEQ ID NO: 184)之重鏈CDR3序列。
在一些實施例中，靶向部分包含重鏈可變區及CH1域，該CH1域包含SEQ ID NO: 185。 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO: 185)。
在一些實施例中，靶向部分包含EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 186)之輕鏈可變區。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 186具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 186一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ SSNWPRTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGE (SEQ ID NO: 187)之輕鏈。
在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 187具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，靶向部分包含與SEQ ID NO: 187一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，靶向部分包含QSVSSY (SEQ ID NO: 188)之輕鏈CDR1序列、DAS (SEQ ID NO: 189)之輕鏈CDR2序列、QQSSNWPRT (SEQ ID NO: 190)之輕鏈CDR3序列。
在一些實施例中，靶向部分包含重鏈可變區及CH1域。在一些實施例中，重鏈可變區及CH1域包含胺基酸序列(SEQ ID NO: 185)。 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC (SEQ ID NO: 185)。
在一些實施例中，靶向結構域與Fc多肽融合。在一些實施例中，靶向結構域之C端與Fc多肽之N端融合。在一些實施例中，Fab之重鏈與Fc多肽融合。在一些實施例中，Fab之重鏈的C端與Fc多肽之N端融合。在一些實施例中，Fc多肽包含裂解位點。
在一些實施例中，靶向部分包含重鏈可變區、輕鏈可變區及CH1域。在一些實施例中，CH1域衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施例中，CH1域衍生自IgG1。在一些實施例中，CH1域衍生自IgG4。 例示性經遮蔽細胞介素型式
本發明尤其提供經遮蔽細胞介素，其包含IL-2多肽或變異體、遮蔽部分及載體部分。本發明之經遮蔽IL-2細胞介素透過位於裂解後釋放IL-2多肽之經遮蔽細胞介素內之裂解肽之腫瘤特異性蛋白酶裂解在腫瘤部位處變得具有活性。
根據本揭示，本文所述之抗IL-2 VHH抗體可用於任何經遮蔽IL-2細胞介素中。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含載體部分、遮蔽部分及細胞介素。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含載體部分、作為細胞介素之IL-2多肽及作為遮蔽部分之抗IL-2 VHH抗體。
特定言之，本發明之經遮蔽細胞介素或包含VHH遮蔽部分之靶向細胞介素藉由以下表徵：(1)有效遮蔽效率，使得IL-2細胞介素之功能在非所需靶標中受到抑制；(2)藉由蛋白酶進行有效IL-2活化以釋放VHH遮蔽部分；(3)腫瘤中而非血漿中之選擇性IL-2活化；及(4)活體內功效(例如高腫瘤生長抑制)。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含減弱的IL-2細胞介素、VHH遮蔽部分及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含減弱的IL-2細胞介素、VHH遮蔽部分及Fc域。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含F42E突變之減弱的IL-2細胞介素、VHH遮蔽部分及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素、VHH遮蔽部分及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素、包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3之VHH遮蔽部分、及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、及載體部分。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3之VHH遮蔽部分、及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、及載體部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、及載體部分。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3之VHH遮蔽部分、載體部分及靶向部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、載體部分及靶向部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、載體部分及靶向部分。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3之VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3之VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含有包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之減弱的IL-2細胞介素、包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VHH遮蔽部分、載體部分及抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、第一Fc多肽、第一連接子及減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、第二Fc多肽、第二連接子及VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E之突變之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、第二Fc多肽、第二連接子及VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、第二Fc多肽、第二連接子及VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、第二Fc多肽、第二連接子及VHH遮蔽部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、第二Fc多肽、第二連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、第二Fc多肽、第二連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、第二連接子及VHH遮蔽部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、第二連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及包含F42E及C125A之突變之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、第二連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、第二連接子及VHH遮蔽部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、第二連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、第二連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分。
在一些實施例中，第二連接子為可裂解的。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、包含可裂解肽之第二連接子及VHH遮蔽部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、包含可裂解肽之第二連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、包含可裂解肽之第二連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含抗PD1靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽自N端至C端包含抗PD1靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、包含可裂解肽之第二連接子及VHH遮蔽部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含抗PD1靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含抗PD1靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、包含可裂解肽之第二連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽及第二多肽，其中該第一多肽自N端至C端包含抗PD1靶向部分、包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變之第一Fc多肽、第一連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，且其中該第二多肽自N端至C端包含抗PD1靶向部分、包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變之第二Fc多肽、包含可裂解肽之第二連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及包含F42E及C125A突變之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及包含F42E及C125A突變之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及包含F42E及C125A突變之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及包含F42E及C125A突變之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分，且其中該VHH遮蔽部分包含GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)之CDR1、AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)之CDR2及ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之CDR3。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含抗PD1靶向部分、第一Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含抗PD1靶向部分、第二Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽包含抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽各自包含SEQ ID NO: 176之抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽、連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽各自包含SEQ ID NO: 176之抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽、不可裂解連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽、可裂解連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽各自包含SEQ ID NO: 176之抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽、不可裂解連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽、可裂解連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽各自包含SEQ ID NO: 176之抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽、不可裂解連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽、包含SEQ ID NO: 34之可裂解連接子及SEQ ID NO: 5之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽各自包含SEQ ID NO: 176之抗PD1靶向部分。
在一個態樣中，本發明尤其提供一種經遮蔽細胞介素，其包含第一多肽、第二多肽、第三多肽及第四多肽，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽、不可裂解連接子及SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2細胞介素，其中該第二多肽包含SEQ ID NO: 170之抗PD1靶向部分、SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽、包含SEQ ID NO: 34之可裂解連接子及SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，其中該第三多肽及該第四多肽各自包含SEQ ID NO: 176之抗PD1靶向部分。
在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於30倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於50倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於100倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於200倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於300倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於500倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於700倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於800倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於1000倍。I在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於3000倍。在一些實施例中，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性的EC50值大於5000倍。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少一個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少兩個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少三個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少四個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少五個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於5×10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少一個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於5×10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少兩個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於5×10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少三個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於5×10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少四個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於5×10 4M -1s -1之Kcat/Km經至少五個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 5M -1s -1之Kcat/Km經至少一個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 5M -1s -1之Kcat/Km經至少兩個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 5M -1s -1之Kcat/Km經至少三個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 5M -1s -1之Kcat/Km經至少四個MMP裂解。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素以大於10 5M -1s -1之Kcat/Km經至少五個MMP裂解。
在一些實施例中，在蛋白酶裂解之後，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值在5倍內。在一些實施例中，在蛋白酶裂解之後，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值在4倍內。在一些實施例中，在蛋白酶裂解之後，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值在3倍內。在一些實施例中，在蛋白酶裂解之後，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值在2倍內。在一些實施例中，在蛋白酶裂解之後，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值在1倍內。在一些實施例中，在蛋白酶裂解之後，與不具有遮蔽部分之IL-2細胞介素相比，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之基於CD8+ T細胞上之pSTAT5活性之EC50值在0.8倍內。
在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少2%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少3%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少4%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少2%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少5%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少7%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少8%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少10%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少12%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少14%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少15%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少20%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少30%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少40%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少50%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少55%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%為至少60%。在一些實施例中，腫瘤中經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素之裂解分子%低於血漿中之定量下限(LLOQ)。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少40%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少50%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少55%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少60%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少65%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少70%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少75%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少80%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少85%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少90%之腫瘤生長抑制(TGI)。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素或靶向細胞介素具有至少95%之腫瘤生長抑制(TGI)。 經遮蔽IL-2細胞介素
在一些實施例中，本發明之經遮蔽細胞介素包含遮蔽部分、載體部分及細胞介素或變異體。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含遮蔽部分、作為載體部分之Fc域及細胞介素或變異體。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含作為遮蔽部分之VHH抗體、載體部分及細胞介素或變異體。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含作為遮蔽部分之VHH抗體、作為載體部分之Fc域及細胞介素或變異體。
在一些實施例中，IL-2多肽透過可裂解或不可裂解連接子連接至Fc域。
在一些實施例中，遮蔽部分透過可裂解或不可裂解連接子連接至Fc域。在一些實施例中，靶向部分連接至具有或不具有可裂解或不可裂解連接子之Fc域。在一些實施例中，遮蔽部分透過可裂解連接子連接至Fc多肽。在一些實施例中，遮蔽部分透過不可裂解連接子連接至Fc多肽。在一些實施例中，IL-2多肽透過可裂解連接子連接至Fc多肽。在一些實施例中，IL-2多肽透過不可裂解連接子連接至Fc多肽。
在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 191。在一些實施例中，第二多肽包含SEQ ID NO: 192。在一些實施例中，第三多肽包含SEQ ID NO: 176。在一些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 191，第二多肽包含SEQ ID NO: 192，且第三多肽包含SEQ ID NO: 176。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含三種多肽：(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 191至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列，(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 193至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列，及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 176至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列的。
在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第一多肽包含與SEQ ID NO: 191至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第二多肽包含與SEQ ID NO: 193至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少90%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少92%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少95%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少96%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少97%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少98%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，第三多肽包含與SEQ ID NO: 176至少99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含三個多肽：(a)第一多肽，其包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列(b)第二多肽，其包含SEQ ID NO: 193之胺基酸序列，及(c)第三多肽，其包含SEQ ID NO: 176之胺基酸序列。 表 13.經遮蔽細胞介素之例示性序列.
SEQ ID NO 序列
191 QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGGGSSPPGGGSSGGGSGPAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTEKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT
192 QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSPGGGGPMPYDLYHPSGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVAAISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMYASSWYEDETDYWGQGTQVTVSSAAA
193 QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGSPGGGGPMPYDLYHPSGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINVMGWYRQAPGKQRELVAAISSGGSTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCMYASSWYEDETDYWGQGTQVTVSS
靶向IL-2細胞介素
在一些實施例中，經遮蔽IL-2細胞介素進一步包含靶向部分以形成靶向IL-2細胞介素。
在一些實施例中，本發明之靶向細胞介素包含遮蔽部分、載體部分、靶向部分及細胞介素或變異體。在一些實施例中，靶向細胞介素包含遮蔽部分、作為載體部分之Fc域、靶向部分及細胞介素或變異體。在一些實施例中，靶向細胞介素包含作為遮蔽部分之VHH抗體、載體部分、靶向部分及細胞介素或變異體。在一些實施例中，靶向細胞介素包含作為遮蔽部分之VHH抗體、作為載體部分之Fc域、靶向部分及細胞介素或變異體。
在一些實施例中，IL-2多肽透過可裂解或不可裂解連接子連接至Fc域。
在一些實施例中，遮蔽部分透過可裂解或不可裂解連接子連接至Fc域。在一些實施例中，靶向部分連接至具有或不具有可裂解或不可裂解連接子之Fc域。在一些實施例中，遮蔽部分透過可裂解連接子連接至Fc多肽。在一些實施例中，遮蔽部分透過不可裂解連接子連接至Fc多肽。在一些實施例中，IL-2多肽透過可裂解連接子連接至Fc多肽。在一些實施例中，IL-2多肽透過不可裂解連接子連接至Fc多肽。
在一些實施例中，靶向細胞介素包含：第一多肽，其包含靶向部分之重鏈及透過在N端至C端定向上之不可裂解連接子連接至細胞介素的第一Fc多肽；第二多肽，其包含靶向部分之重鏈及透過在N端至C端定向上之可裂解連接子連接至遮蔽部分的第二Fc多肽；及第三多肽，其包含與靶向部分之重鏈結合的靶向部分之輕鏈。
在一些實施例中，靶向細胞介素包含：第一多肽，其包含靶向部分之重鏈及透過在N端至C端定向上之可裂解連接子連接至細胞介素的第一Fc多肽；第二多肽，其包含靶向部分之重鏈及透過在N端至C端定向上之不可裂解連接子連接至遮蔽部分的第二Fc多肽；及第三多肽，其包含與靶向部分之重鏈結合的靶向部分之輕鏈。
在一些實施例中，靶向細胞介素包含：第一多肽，其包含scFv靶向部分(例如，融合至輕鏈可變區(VH-VL或VL-VH)之重鏈可變區)，透過在N端至C端定向上之不可裂解連接子連接至細胞介素的第一Fc多肽；及第二多肽，其包含scFv靶向部分(例如，融合至輕鏈可變區(VH-VL或VL-VH)之重鏈可變區)，透過在N端至C端定向上之可裂解連接子連接至遮蔽部分的第二Fc多肽。
在一些實施例中，靶向細胞介素包含：第一多肽，其包含scFv靶向部分(例如，融合至輕鏈可變區(VH-VL或VL-VH)之重鏈可變區)，透過在N端至C端定向上之可裂解連接子連接至細胞介素的第一Fc多肽；及第二多肽，其包含scFv靶向部分(例如，融合至輕鏈可變區(VH-VL或VL-VH)之重鏈可變區)，透過在N端至C端定向上之不可裂解連接子連接至遮蔽部分的第二Fc多肽。 治療方法
本文提供用於治療或預防個體之疾病的方法，其包含向該個體投與有效量之本文所述之任何經遮蔽及/或靶向細胞介素或其組合物。在一些實施例中，提供用於治療或預防個體之疾病的方法，其包含向該個體投與任何本文所述之組合物。在一些實施例中，個體(例如人類患者)已診斷患有癌症或處於罹患此類病症之風險下。在一些實施例中，提供用於治療或預防個體之疾病的方法，其包含向個體投與有效量的本文所述之任何靶向細胞介素或其組合物，其中在由酶裂解後活化靶向細胞介素。在一些實施例中，靶向細胞介素在腫瘤微環境下活化。靶向細胞介素在其裂解之後具有治療活性。因此，在一些實施例中，活性劑為裂解產物。在一些實施例中，靶向經遮蔽細胞介素在遮蔽部分已裂解之後具有治療活性。因此，在一些實施例中，活性劑為未遮蔽靶向細胞介素。
在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在腫瘤微環境下活化。經遮蔽細胞介素在遮蔽部分已裂解之後具有治療活性。因此，在一些實施例中，活性劑為未遮蔽細胞介素。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素在細胞介素已裂解之後具有治療活性。因此，在一些實施例中，活性劑為裂解產物。
在一個態樣中，本發明提供一種用本文所述之經遮蔽細胞介素或組合物中之任一者治療病症或疾病，諸如癌症之方法。可用本發明之調配物治療之病症或疾病包括白血病、淋巴瘤、頭頸癌、大腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤、乳癌、神經母細胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌(例如梅克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma))或睪丸癌。
在一些實施例中，本文提供一種藉由投與本文所述之任何經遮蔽細胞介素或組合物來治療或預防癌症的方法。在一些實施例中，本文提供一種藉由投與本文所述之任何經遮蔽細胞介素或組合物以及抗癌劑來治療或預防癌症的方法。抗癌劑可為能夠減少癌症生長、干擾癌細胞複製、直接或間接殺死癌細胞、減少癌轉移、減少腫瘤血液供應或減少細胞存活之任何藥劑。在一些實施例中，抗癌劑選自由以下組成之群：PD-1抑制劑、EGFR抑制劑、HER2抑制劑、VEGFR抑制劑、CTLA-4抑制劑、BTLA抑制劑、B7H4抑制劑、B7H3抑制劑、CSFIR抑制劑、HVEM抑制劑、CD27抑制劑、KIR抑制劑、NKG2A抑制劑、NKG2D促效劑、TWEAK抑制劑、ALK抑制劑、CD52靶向抗體、CCR4靶向抗體、PD-L1抑制劑、KIT抑制劑、PDGFR抑制劑、BAFF抑制劑、HD AC抑制劑、VEGF配位體抑制劑、CD19靶向分子、FOFR1靶向分子、DFF3靶向分子、DKK1靶向分子、MUC1靶向分子、MUG 16靶向分子、PSMA靶向分子、MSFN靶向分子、NY-ES0-1靶向分子、B7H3靶向分子、B7H4靶向分子、BCMA靶向分子、CD29靶向分子、CD151靶向分子、CD 123靶向分子、CD33靶向分子、CD37靶向分子、CDH19靶向分子、CEA靶向分子、密連蛋白(Claudin) 18.2靶向分子、CFEC12A靶向分子、EGFRVIII靶向分子、EPCAM靶向分子、EPHA2靶向分子、FCRH5靶向分子、FLT3靶向分子、GD2靶向分子、磷脂肌醇蛋白聚醣3靶向分子、gpA33靶向分子、GPRC5D靶向分子、IL-23R靶向分子、IL-1RAP靶向分子、MCSP靶向分子、RON靶向分子、ROR1靶向分子、STEAP2靶向分子、TfR靶向分子、CD166靶向分子、TPBG靶向分子、TROP2靶向分子、蛋白酶體抑制劑、ABE抑制劑、CD30抑制劑、FLT3抑制劑、MET抑制劑、RET抑制劑、IL-1 (3抑制劑、MEK抑制劑、ROS1抑制劑、BRAE抑制劑、CD38抑制劑、RANKE抑制劑、B4GALNT1抑制劑、SLAMF7抑制劑、IDH2抑制劑、mTOR抑制劑、CD20靶向抗體、BTK抑制劑、PI3K抑制劑、FLT3抑制劑、PARP抑制劑、CDK4抑制劑、CDK6抑制劑、EGFR抑制劑、RAF抑制劑、JAK1抑制劑、JAK2抑制劑、JAK3抑制劑、IL-6抑制劑、IL-17抑制劑、平滑(Smoothened)抑制劑、IL-6R抑制劑、BCL2抑制劑、PTCH抑制劑、PIGF抑制劑、TGFB抑制劑、CD28促效劑、CD3促效劑、CD40促效劑、GITR促效劑、0X40促效劑、VISTA促效劑、CD137促效劑、LAG3抑制劑、TIM3抑制劑、TIGIT抑制劑及IL-2R抑制劑。
在一些實施例中，本文提供一種藉由投與本文所述之任何經遮蔽細胞介素以及抗炎劑來治療或預防癌症的方法。抗炎劑可為能夠預防、抵消、抑制、或以其他方式減少發炎之任何藥劑。
在一些實施例中，抗炎劑為環氧化酶(COX)抑制劑。COX抑制劑可為抑制COX-1及/或COX-2之活性的任何藥劑。在一些實施例中，COX抑制劑選擇性地抑制COX-1 (亦即，COX抑制劑抑制COX-1之活性超過其抑制COX-2之活性)。在一些實施例中，COX抑制劑選擇性地抑制COX-2 (亦即，COX抑制劑抑制COX-2之活性超過其抑制COX-1之活性)。在一些實施例中，COX抑制劑抑制COX-1及COX-2。
在一些實施例中，COX抑制劑為選擇性COX-1抑制劑，且選自由以下組成之群：SC-560、FR122047、P6、莫苯唑酸(mofezolac)、TFAP、氟比洛芬(flurbiprofen)、及酮基布洛芬(ketoprofen)。在一些實施例中，COX抑制劑為選擇性COX-2抑制劑，且選自由以下組成之群：塞內昔布(celecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、吡羅昔康(piroxicam)、德拉昔布(deracoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、依他昔布(etoricoxib)、𠳭烯衍生物、𠳭唍衍生物、N-(2-環己基氧基硝基苯基)甲磺醯胺、帕瑞昔布、盧米羅可(lumiracoxib)、RS 57067、T-614、BMS-347070、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、ABT-963、SC-58125、尼美舒利(nimesulide)、氟舒胺(flosulide)、NS-398、L-745337、RWJ-63556、L-784512、達布飛龍(darbufelone)、CS-502、LAS-34475、LAS- 34555、S-33516、雙氯芬酸(diclofenac)、甲芬那酸(mefenamic acid)、及SD-8381。在一些實施例中，COX抑制劑選自由以下組成之群：布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、酮咯酸(ketorolac)、吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹靈(aspirin)、萘普生(naproxen)、托美丁(tolmetin)、吡羅昔康(piroxicam)、及甲氯芬那酸(meclofenamate)。在一些實施例中，COX抑制劑係選自由以下組成之群：SC-560、FR122047、P6、莫苯唑酸、TFAP、氟比洛芬、酮基布洛芬、塞內昔布、羅非昔布、美洛昔康、吡羅昔康、德拉昔布、帕瑞昔布、伐地昔布、依他昔布、𠳭烯衍生物、𠳭唍衍生物、N-(2-環己基氧基硝基苯基)甲磺醯胺、帕瑞昔布、盧米羅可、RS 57067、T-614、BMS-347070、JTE-522、S-2474、SVT- 2016、CT-3、ABT-963、SC-58125、尼美舒利、氟舒胺、NS-398、L- 745337、RWJ-63556、L-784512、達布飛龍、CS-502、LAS-34475、LAS- 34555、S-33516、雙氯芬酸、甲芬那酸、SD-8381、布洛芬、萘普生、酮咯酸、吲哚美辛、阿司匹靈、萘普生、托美丁、吡羅昔康、及甲氯芬那酸。
在一些實施例中，抗炎劑為NF-kB抑制劑。NF-kB抑制劑可為抑制NF-kB路徑之活性的任何藥劑。在一些實施例中，NF-kB抑制劑選自由以下組成之群：IKK複合物抑制劑、IkB降解抑制劑、NF-kB核易位抑制劑、p65乙醯化抑制劑、NF-kB DNA結合抑制劑、NF-kB反式活化抑制劑、及p53誘導抑制劑。
在一些實施例中，IKK複合物抑制劑選自由以下組成之群：TPCA-1、NF-kB活化抑制劑VI (BOT-64)、BMS-345541、胺來呫諾(amlexanox)、SC-514 (GK-01140)、IMD-0354、及IKK-16。在一些實施例中，IkB降解抑制劑選自由以下組成之群：BAY-11-7082、MG-115、MG-132、雷克塔西汀(lactacystin)、埃普黴素(epoxomicin)、小白菊內酯(parthenolide)、卡非佐米(carfilzomib)、及MLN-4924(派伏司他(pevonedistat))。在一些實施例中，NF-kB核易位抑制劑選自由JSH-23及洛利普南(rolipram)組成之群。在一些實施例中，p65乙醯化抑制劑選自由五倍子酸(gallic acid)及漆樹酸(anacardic acid)組成之群。在一些實施例中，NF-kB DNA結合抑制劑選自由GYY-4137、p-XSC、CV-3988、及前列腺素E2 (PGE2)組成之群。在一些實施例中，NF-kB反式活化抑制劑選自由LY-294002、渥曼青黴素(wortmannin)及美塞拉明(mesalamine)組成之群。在一些實施例中，p53誘導抑制劑選自由奎納克林(quinacrine)及夫拉平度(flavopiridol)組成之群。在一些實施例中，NF-kB抑制劑選自由以下組成之群：TPCA-1、NF-KB活化抑制劑VI (BOT- 64)、BMS-345541、胺來呫諾、SC-514 (GK-01140)、IMD-0354、IKK-16、BAY-11-7082、MG-115、MG- 132、雷克塔西汀、埃普黴素、小白菊內酯、卡非佐米、MLN-4924 (派伏司他)、JSH-23洛利普南、五倍子酸、漆樹酸、GYY-4137、p-XSC、CV-3988、前列腺素E2 (PGE2)、LY-294002、渥曼青黴素、美塞拉明、奎納克林、及夫拉平度。
在一些實施例中，本文提供一種藉由投與本文所述之任何經遮蔽細胞介素或組合物以及抗癌治療蛋白來治療或預防癌症的方法。抗癌治療蛋白可為能夠減少癌症生長、干擾癌細胞複製、直接或間接殺死癌細胞、減少轉移、減少腫瘤血液供應、或減少細胞存活之任何治療蛋白。例示性抗癌治療蛋白可為抗體或其片段、抗體衍生物、雙特異性抗體、嵌合抗原受體(CAR) T細胞、融合蛋白、或雙特異性T細胞接合體(BiTE)之形式。在一些實施例中，本文提供一種藉由投與本文所述之任何經遮蔽細胞介素或組合物以及CAR-NK (自然殺手)細胞來治療或預防癌症的方法。 用於產生經遮蔽細胞介素構築體之方法
本文中提供之方法及組合物之一些實施例係關於用於產生靶向的經遮蔽之藥劑(諸如靶向的經遮蔽之細胞介素)的方法。如本文所述之靶向的經遮蔽之細胞介素可使用此項技術中之任何已知技術產生及製造。可使用任何哺乳動物表現系統產生靶向經遮蔽細胞介素及/或構築體。
本文中提供之方法及組合物之一些實施例係關於用於產生經遮蔽劑，諸如經遮蔽細胞介素之方法。如本文所述之經遮蔽細胞介素可使用此項技術中之任何已知技術產生及製造。可使用任何哺乳動物表現系統產生經遮蔽細胞介素及/或構築體。
哺乳動物細胞常用於製造重組蛋白。細胞源自人類、大鼠、小鼠及其他哺乳動物。常用之哺乳動物細胞株包括(但不限於) HEK細胞、CHO細胞、重組CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/O-Ag14細胞、HT-1080細胞、PER.C6細胞、CAP (CEVEC's Amniocyte Production)、Hela細胞、及HuH-7 (人類肝癌)細胞。細胞株可用於短暫基因表現或用作穩定表現之穩定細胞株。
在一些實施例中，細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可為重組CHO細胞株，例如CHO-K1、CHO DUX及CHO DG44。
在一些實施例中，細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為人類胚胎腎臟(HEK)細胞或其變異體(例如HKB11)。
將宿主細胞轉形，以表現編碼本文所述之經靶向之經遮蔽細胞介素的核酸或載體。在適當時，工程化宿主細胞可在常規營養培養基中培養。
在其他實施例中，靶向的經遮蔽之細胞介素可使用非哺乳動物表現系統產生，諸如桿狀病毒表現系統、細菌系統、酵母細胞、昆蟲細胞株及植物細胞。昆蟲細胞株包括(但不限於) Sf9、Sf21及BTI 5B1-4。大腸桿菌細胞為通常用於表現重組蛋白之細菌。
在一些實施例中，經遮蔽之細胞介素及/或構築體可使用無細胞蛋白質表現系統來製造。無細胞表現系統可使用由DNA構築體所轉錄之mRNA，該DNA構築體包含可操作地與編碼多肽或其片段之核酸連接的啟動子。 實例
儘管已根據某些實施例具體描述本發明所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於說明本發明之化合物且不意欲限制該等化合物。 實例1. 經遮蔽細胞介素之有效遮蔽及活化
此實例展現本發明之經遮蔽IL-2細胞介素有效地由VHH遮蔽部分遮蔽，且一旦VHH遮蔽部分由腫瘤特異性蛋白酶釋放時活化。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含 圖 1A所示之形式。在一些實施例中，經遮蔽細胞介素包含 圖 1B所示之形式。 表 7. 例示性經遮蔽 IL-2 細胞介素
構築體 細胞介素 遮蔽部分 靶向部分 載體部分 連接子
C5 IL-2 V3 N/A 抗PD1 Fc域 不可裂解
N/A VHH46 抗PD1 Fc域 可裂解
C6 IL-2 V3 N/A 抗PD1 Fc域 不可裂解
N/A VHH1 抗PD1 Fc域 可裂解
未經遮蔽 對照 IL-2 V3 N/A 抗PD1 Fc域 不可裂解
N/A N/A 抗PD1 Fc域 N/A
在此特定實例中，製備純度大於至少97%之 表 7中所示之經遮蔽IL-2細胞介素。測試之所有經遮蔽IL-2細胞介素均能夠抑制PD-1/PD-L1相互作用，且經至少一個MMP有效裂解(資料未示出)。
在人類PBMC上量測pSTAT5活性。簡言之，用抗CD3及抗CD28活化hPBMC。將用MMP裂解或未裂解之經遮蔽細胞介素滴定至hPBMC上。未遮蔽對照及重組人類IL-2 (rhIL-2)用作對照。針對CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及pSTAT5對hPBMC進行染色。經遮蔽(未切割)細胞介素對CD8+ T細胞之pSTAT活性之高EC50值表明細胞介素經有效遮蔽。與未遮蔽對照相比，經遮蔽(未裂解細胞介素)之EC50值大於300倍表明IL-2細胞介素經有效遮蔽。 表 8. hPBMC 上之 pSTAT
構築體 不具有MMP之平均EC50 (nM) 具有MMP之平均EC50 (nM) 遮蔽倍數 (未裂解/未遮蔽對照) 變化倍數 (裂解/未遮蔽對照)
rhIL-2 0.0017
未遮蔽對照 0.055 1
C5 411 0.25 7473 4.5
C6 470 0.28 8546 5.1
具有不同濃度之rhIL-2、未遮蔽對照、C5及C6之CD8+ T細胞中之pSTAT的%示於 圖 2中。經遮蔽構築體對CD8+ T細胞之pSTAT活性之平均EC50值示於 表 8中。 表 8顯示，與未遮蔽對照相比，C5及C6的EC50值均大於約7400及約8500倍，說明細胞介素經有效遮蔽。另外，當遮蔽部分經MMP裂解時，C5及C6構築體中之IL-2細胞介素恢復其活性，如與 表 8中之未遮蔽對照相比的低變化倍數值所示。 實例2. 經遮蔽IL-2細胞介素之離體腫瘤選擇性裂解
此實例證明本發明之經遮蔽IL-2細胞介素經人類腫瘤活化，但不經人類血漿活化。
培養來自不同癌症適應症、黑色素瘤、頭頸癌(HNC)、肺癌、結腸癌及腎細胞癌(RCC)之腫瘤及血漿樣品，且用 表 9中所示之構築體進行處理。處理後24小時確定裂解分子之%。較佳地，在測試之癌症適應症中之至少一者中，腫瘤中裂解分子之%大於5%，且裂解分子之%低於血漿中之定量下限(LLOQ)。 表 9. 例示性經遮蔽 IL-2 細胞介素
構築體 細胞介素 遮蔽部分 靶向部分 載體部分 連接子
C5 IL-2 V3 N/A 抗PD1 Fc域 不可裂解
N/A VHH46 抗PD1 Fc域 可裂解
C6 IL-2 V3 N/A 抗PD1 Fc域 不可裂解
N/A VHH1 抗PD1 Fc域 可裂解
不可裂解對照 IL-2 V3 N/A 抗PD1 Fc域 不可裂解
N/A VHH1 抗PD1 Fc域 不可裂解
如 圖 3A中所示，C5及C6構築體均以比不可裂解對照顯著更高的速率裂解，說明C5及C6在多種腫瘤適應症中經活化。另外，在所有適應症中在人類血漿中觀測到經遮蔽細胞介素之最小裂解( 圖 3B)。 實例3. 經遮蔽IL-2細胞介素之活體內功效
此實例證明本發明之經遮蔽IL-2細胞介素在腫瘤中經腫瘤特異性蛋白酶優先活化，且在 活體內減小腫瘤體積。所測試之經遮蔽細胞介素含有三個多肽鏈(鏈A之1個複本、鏈B之1個複本及鏈C之兩個複本)，如圖 1A及 表 10所示。 表 10. 經遮蔽 IL-2 細胞介素
構築體 多肽鏈 形式 SEQ ID NO
C5 A [抗PD-1 VH-CH1]-[Fc域]-[不可裂解連接子]-[減弱的IL-2] 191
B [抗PD-11 VH-CH1]-[Fc域]-[可裂解連接子]-[VHH遮蔽部分] 192
C 抗PD1 VL-CL 176
C6 A [抗PD-1 VH-CH1]-[Fc域]-[不可裂解連接子]-[減弱的IL-2] 191
B [抗PD-11 VH-CH1]-[Fc域]-[可裂解連接子]-[VHH遮蔽部分] 193
C 抗PD1 VL-CL 176
未經遮蔽 對照 A [抗PD-1 VH-CH1]-[Fc域]-[不可裂解連接子]-[減弱的IL-2]
B [抗PD-11 VH-CH1]-[Fc域]
C 抗PD1 VL-CL
經遮蔽 IL-2 細胞介素為腫瘤選擇性
為確定本發明之經遮蔽IL-2細胞介素是否在腫瘤中被優先活化，向具有hPD-1之小鼠(每組n=5)皮下注射0.5×10 6個MC38腫瘤細胞。當腫瘤體積達到約350-400 mm 3時開始治療。在第0天及第3天，小鼠接收構築體C5、C6、未遮蔽對照或媒劑。在第6天，處死小鼠且對血液、脾臟及腫瘤組織進行FACS分析。 圖 4分別展示脾臟細胞及腫瘤微環境中之CD8 T細胞概況，此說明經遮蔽之細胞介素C5及C6展現腫瘤內CD8 T細胞之組織選擇性擴增。
亦在腫瘤、血漿及脾臟中量測活性IL-2細胞介素之%。 圖 5顯示C5及C6治療組在血漿及脾臟中不存在可偵測的活性分子%。在所有C5及C6治療組之腫瘤中偵測到活性IL-2細胞介素，此證實C5及C6係腫瘤選擇性的，在血漿或脾臟中的活化最少。 經遮蔽IL-2細胞介素在活體內係有效的
為確定本發明之經遮蔽IL-2細胞介素之 活體內功效，向具有hPD-1之小鼠(每組n=8)之右側腹皮下注射0.5×10 6個MC38腫瘤細胞。當腫瘤體積達到約100-150 mm 3時開始治療。在第0天及第5天，向小鼠給與構築體C5、C6、未遮蔽對照或媒劑。間歇地量測腫瘤體積，直至第12天為止。 圖 6顯示與媒劑對照相比，C5及C6均能夠顯著抑制腫瘤生長。C5及C6之腫瘤生長抑制%分別為66%及64%。
接下來，對具有hPD-1之小鼠(各組中n=8)之右側腹皮下注射1×10 6個MB49腫瘤細胞。在第0天及第5天，向小鼠給藥 表 11中所示之C6構築體、對照經遮蔽IL-2細胞介素、對照經遮蔽細胞介素+抗PD1抗體、抗PD1抗體或媒劑。此研究中所用之對照經遮蔽IL-2細胞介素包含兩種多肽：(1) [Fc域] - [不可裂解連接子] - [非α IL-2]；及(2) [Fc域] - [可裂解連接子] - [IL-2受體β遮蔽部分]； 表 11. 用 MB49 腫瘤小鼠進行活體內研究之治療組
治療組 組分 TGI% ( 第 12 天 )
單一療法 C6 96
對照經遮蔽 IL-2 細胞介素 經遮蔽IL-2細胞介素 2
組合療法 對照經掩蔽IL2細胞介素+抗PD1抗體 85
僅抗體 抗PD1抗體 50
陰性 對照 媒劑 N/A
如圖 7A所示，本發明之經遮蔽IL-2細胞介素抑制腫瘤生長，說明顯著的單一療法活性。另外，總存活率顯著高於所測試之任何其他組( 圖 7B)。 實例4. 例示性經遮蔽IL-2細胞介素阻斷PD-1/PD-L1相互作用
此實例證明例示性經遮蔽IL-2細胞介素維持靶向PD-1且阻斷PD-1/PD-L1軸之能力。
用Promega PD-1/PD-L1阻斷生物分析來測試例示性經遮蔽IL-2細胞介素及對PD-1具有阻斷活性之參考抗PD1抗體。根據製造商之方案設置及運行生物分析。
簡言之，在進行分析前一天，藉由添加所提供之FBS (90% Ham's F-12/10% FBS)來製備生物分析套組提供之細胞恢復培養基。將一小瓶PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞在37℃水浴中溫和地解凍3分鐘。將PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞之解凍小瓶添加至預熱的恢復培養基中，且藉由倒置2次將細胞溶液混合。將100 µL體積之細胞懸浮液添加至組織培養物處理之96孔白色平底分析盤中。將盤覆蓋且培育隔夜(37℃，5% CO 2)。
第二天，將含有PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞之分析盤自培育箱中取出，且自孔中取出95 μl恢復培養基。在所提供之分析緩衝液(99% RPMI 1640/1% FBS)中製備測試品、例示性經遮蔽IL-2細胞介素及參考抗體之連續稀釋液。將40 μl等分試樣之連續稀釋液添加至含有PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞之孔中，其中測試品之最終濃度範圍為0.033-50 nM。接下來，藉由在37℃水浴中解凍此等細胞之小瓶3分鐘且將解凍之效應細胞添加至預熱之分析緩衝液中來製備PD-1效應細胞。在將40 µL效應細胞懸浮液添加至各孔中之前，藉由倒置2次將細胞懸浮液混合。覆蓋分析盤且培育6小時(37℃，5% CO 2)。
在6小時培育之後，將分析盤自培育箱中取出，且使其平衡至環境溫度後維持5-10分鐘。將80 µL Bio-Glo試劑添加至各孔中，且在量測發光之前，將盤在環境溫度下培育5分鐘。
在此分析中添加例示性經遮蔽IL-2細胞介素用於阻斷來自PD-L1 aAPC/CHO-K1之PD-L1與來自PD-1效應細胞之PD-1之間的相互作用。藉由阻斷相互作用，例示性經遮蔽IL-2細胞介素釋放抑制信號，從而引起T細胞受體(TCR)信號傳導及發光增加。例示性經遮蔽IL-2細胞介素之發光誘導倍數示於 圖 8中。
在GraphPad Prism中進行資料分析。藉由自測試品之發光中減去背景之發光，且接著將其除以自無抗體對照中減去背景之乘積(RLU [抗體-背景]/RLU [無抗體對照-背景])來計算誘導倍數。如 表 12中所示，各例示性經遮蔽IL-2細胞介素之計算EC 50值係使用[促效劑]相對於具有可變斜率之反應(四個參數)的非線性回歸計算的。 表 12. 例示性經遮蔽 IL-2 細胞介素之 EC 50 值
測試品 EC 50
抗PD1抗體 0.981
C6 1.459
C5 1.292
總體而言，此實例顯示例示性經遮蔽IL-2細胞介素具有與具有已知阻斷活性之參考抗PD1抗體類似的阻斷PD-1/PD-L1軸之能力。 等效物
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文中所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。本發明之範疇並不意欲限於以上描述，而是如以下申請專利範圍中所闡述。
圖式僅用於說明之目的，而非用於限制。 圖 1A- 圖 1B顯示例示性經遮蔽IL-2細胞介素構築體之示意圖。在 圖 1A中，第一多肽(鏈A)包含靶向部分、具有「杵」及RF突變之Fc域、及IL-2多肽。第二多肽(鏈B)包含靶向部分、具有「臼」突變之Fc域、可裂解連接子及作為遮蔽部分之抗IL-2 VHH。圖1A中之經遮蔽細胞介素具有第三及第四多肽(鏈C之兩個複本)，其包含可變輕鏈(VL)及恆定輕鏈(CL)。在 圖 1B中，第一多肽(鏈A)包含靶向部分、具有「杵」及RF突變之Fc域、IL-2多肽及可裂解連接子。第二多肽(鏈B)包含靶向部分、具有「臼」突變之Fc域及作為遮蔽部分之抗IL-2 VHH。圖1A中之經遮蔽細胞介素具有第三及第四多肽(鏈C之兩個複本)，其包含可變輕鏈(VL)及恆定輕鏈(CL)。十字「X」表示裂解位點的位置。 圖 2顯示回應於hPBMC中之靶向經遮蔽細胞介素活性的pSTAT5活性之例示性活體外量測結果。 圖 3A係顯示不同癌症適應症之腫瘤細胞中之靶向經遮蔽細胞介素之裂解分子%的例示性圖。按以下順序繪製癌症適應症：黑色素瘤、HNC (頭頸癌)、肺癌、結腸癌及RCC (腎細胞癌)。 圖 3B係顯示來自不同癌症適應症之血漿中之靶向經遮蔽細胞介素之裂解分子%的例示性圖。 圖 4顯示回應於靶向經遮蔽細胞介素，分別在脾臟細胞中及腫瘤微環境中CD8 T細胞概況的例示性量測結果。 圖 5繪示顯示腫瘤、血漿及脾臟中由VHH遮蔽部分之蛋白酶裂解引起之活體內活性分子%的例示性圖。 圖 6係顯示在使用C5及C6構築體之15天治療期內接種有腫瘤之小鼠之腫瘤體積的例示性圖。該圖顯示各治療組之腫瘤生長抑制%。 圖 7A係顯示在15天治療期內接種有腫瘤之小鼠之腫瘤體積的例示性圖。 圖 7B為顯示經各種治療給藥之小鼠之存活統計資料的一系列例示性圖。 圖 8係顯示PD-1/PD-L1阻斷生物分析中例示性經遮蔽IL-2細胞介素之TCR信號傳導中之誘導倍數的例示性圖。
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Claims (72)

  1. 一種經遮蔽細胞介素，其包含： a)減弱的介白素2 (IL-2)多肽， b)遮蔽部分，其包含僅重鏈抗體(VHH)， c)載體部分，及 d)抗PD1靶向部分。
  2. 如請求項1之經遮蔽細胞介素，其中與具有SEQ ID NO: 2之成熟IL-2之序列相比，該減弱的IL-2多肽包含胺基酸位置R38、F42、K43、Y45、E62、L72及/或C125處之突變。
  3. 如請求項2之經遮蔽細胞介素，其中該突變為R38G、R38A、F42A、F42K、F42E、K43A、Y45A、Y45N、Y45R、E62R、E62S、E62A、L72G、C125A及/或C125S。
  4. 如請求項2或3中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該減弱的IL-2多肽包含以下突變： a) C125A； b) F42E、C125A； c) E62S、C125A； d) F42A、C125A； e) Y45R、C125A； f) F42S、E62S、C125A； g) F42K； h) F42A、Y45A、L72G、C125A； i) E62R； j) Y45N； k) K43A； l) Y45A、E62S；或 m) R38G、Y45A、E62S。
  5. 如請求項4之經遮蔽細胞介素，其中該減弱的IL-2多肽包含F42E及C125A。
  6. 如請求項5之經遮蔽細胞介素，其中該減弱的IL-2多肽包含SEQ ID NO: 4。
  7. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該VHH特異性結合至該IL-2多肽。
  8. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該VHH包含 HCDR1，其包含胺基酸序列GSIFSINVMG (SEQ ID NO: 6)， HCDR2，其包含胺基酸序列AISSGGSTNYADSVKG (SEQ ID NO: 7)，及 HCDR3，其包含選自ASSWYEDETDY (SEQ ID NO: 8)之胺基酸序列。
  9. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該VHH包含與SEQ ID NO: 5至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列。
  10. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該VHH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列。
  11. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該VHH進一步包含C端胺基酸延伸。
  12. 如請求項11之經遮蔽細胞介素，其中該C端延伸包含1至5個胺基酸。
  13. 如請求項11之經遮蔽細胞介素，其中該C端延伸選自由A、AS、AST、AAA、AH、GS、PP、PPP及GP組成之群。
  14. 如請求項13之經遮蔽細胞介素，其中該遮蔽部分包含有包含AAA之C端胺基酸延伸。
  15. 如請求項14之經遮蔽細胞介素，其包含與SEQ ID NO: 12至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列。
  16. 如請求項15之經遮蔽細胞介素，其包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
  17. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含選自由以下組成之群的抗原結合域：Fab、單鏈Fv (scFv)、單域抗體(VHH)、一或多個CDR、可變重鏈(VH)、可變輕鏈(VL)、Fab樣雙特異性抗體(bsFab)、單域抗體連接之Fab (s-Fab)、抗體及其組合。
  18. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含 GYTFTNYY (SEQ ID NO: 172)之重鏈CDR1序列， INPSNGGT (SEQ ID NO: 173)之重鏈CDR2序列，及 ARRDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 174)之重鏈CDR3序列。
  19. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含 KGVSTSGYSY (SEQ ID NO: 177)之輕鏈CDR1序列， LAS (SEQ ID NO: 178)之輕鏈CDR2序列，及 QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 179)之輕鏈CDR3序列。
  20. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含 GYTFTNYY (SEQ ID NO: 172)之重鏈CDR1序列， INPSNGGT (SEQ ID NO: 173)之重鏈CDR2序列， ARRDYRFDMGFDY (SEQ ID NO: 174)之重鏈CDR3序列， KGVSTSGYSY (SEQ ID NO: 177)之輕鏈CDR1序列， LAS (SEQ ID NO: 178)之輕鏈CDR2序列，及 QHSRDLPLT (SEQ ID NO: 179)之輕鏈CDR3序列。
  21. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含與SEQ ID NO: 169具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之重鏈可變區。
  22. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含與SEQ ID NO: 175具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈可變區。
  23. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含 與SEQ ID NO: 169具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之重鏈可變區，及 與SEQ ID NO: 175具有至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之輕鏈可變區。
  24. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該靶向部分包含 重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 169，及 輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 175。
  25. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該載體部分為PEG分子、白蛋白、白蛋白片段、抗體Fc域或抗體或其抗原結合片段。
  26. 如請求項25之經遮蔽細胞介素，其中該載體部分包含Fc域。
  27. 如請求項26之經遮蔽細胞介素，其中該Fc域包含第一Fc多肽及第二Fc多肽。
  28. 如請求項27之經遮蔽細胞介素，其中該第一Fc多肽透過第一連接子連接至IL-2多肽，且該第二Fc多肽透過第二連接子連接至遮蔽部分，且 其中該第一連接子或該第二連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點，使得該遮蔽部分自該IL-2多肽釋放。
  29. 如請求項28之經遮蔽細胞介素，其中該第一連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點。
  30. 如請求項28之經遮蔽細胞介素，其中該第二連接子包含腫瘤相關蛋白酶裂解位點。
  31. 如請求項27至30中任一項之經遮蔽細胞介素，其中 i) 該第一Fc多肽包含Y349C、T366S、L368A及Y407V突變且該第二Fc多肽包含S354C及T366W突變；或 ii)     該第二Fc多肽包含Y349C、T366S、L368A及Y407V突變且該第一Fc多肽包含S354C及T366W突變。
  32. 如請求項27至31中任一項之經遮蔽細胞介素，其中 i) 該第一Fc多肽包含有包含降低或消除與蛋白質A之結合之修飾的CH3域，及 ii)     該第二Fc多肽包含結合至蛋白質A之CH3域。
  33. 如請求項32之經遮蔽細胞介素，其中降低或消除與蛋白質A之結合之該修飾根據Kabat編號為H435R及Y436F。
  34. 如請求項27至33中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該第一Fc多肽包含N297A突變。
  35. 如請求項27至33中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該第二Fc多肽包含N297A突變。
  36. 如請求項27至34中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該第一Fc多肽包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域或其片段。
  37. 如請求項27至35中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該第二Fc多肽包含IgG1、IgG2或IgG4 Fc域或其片段。
  38. 如請求項28至37中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該腫瘤相關蛋白酶裂解位點包含選自表3之序列。
  39. 如請求項28至38中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該腫瘤相關蛋白酶裂解位點包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)。
  40. 一種經遮蔽細胞介素，其包含： a)減弱的介白素2 (IL-2)多肽，其包含F42E及C125A之胺基酸取代； b) VHH遮蔽部分，其包含SEQ ID NO: 6之CDR1、SEQ ID NO: 7之CDR2及SEQ ID NO: 8之CDR3； c) Fc域，其包含透過第一連接子連接至該減弱的IL-2多肽的第一Fc多肽及透過第二連接子連接至該VHH遮蔽部分的第二Fc多肽，及 d)抗PD1靶向部分。
  41. 一種經遮蔽細胞介素，其包含： a)減弱的介白素2 (IL-2)多肽，其包含SEQ ID NO: 4； b) VHH遮蔽部分，其包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 12； c) Fc域，其包含透過第一連接子連接至該減弱的IL-2多肽之SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽及透過第二連接子連接至該VHH遮蔽部分之SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽，及 d)抗PD1靶向部分，其包含SEQ ID: 169及175。
  42. 一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽： a)第一多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變重鏈、第一Fc多肽、不可裂解連接子及減弱的IL-2多肽； b)第二多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變重鏈、第二Fc多肽、可裂解連接子及VHH遮蔽部分；及 c)第三多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變輕鏈。
  43. 如請求項42之經遮蔽細胞介素，其中該減弱的IL-2多肽包含F42E及C125A突變。
  44. 如請求項43之經遮蔽細胞介素，其中該減弱的IL-2多肽包含SEQ ID NO: 4。
  45. 如請求項42至44中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該VHH遮蔽部分包含SEQ ID NO: 6之CDR1、SEQ ID NO: 7之CDR2及SEQ ID NO: 8之CDR3。
  46. 如請求項45之經遮蔽細胞介素，其中該VHH遮蔽部分包含SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 12。
  47. 如請求項42至46中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該第一Fc多肽包含S354C、T366W、N297A、H435R及Y435F突變，且該第二Fc多肽包含Y349C、T366S、L368A、Y407V及N297A突變。
  48. 如請求項47之經遮蔽細胞介素，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 21，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 20。
  49. 如請求項42至47中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該抗PD-1靶向部分之該可變重鏈包含SEQ ID NO: 172之hCDR1、SEQ ID NO: 173之hCDR2、SEQ ID NO: 174之hCDR3，且該抗PD1靶向部分之該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 177之lCDR1、SEQ ID NO: 178之lCDR2、SEQ ID NO: 179之lCDR3。
  50. 如請求項49之經遮蔽細胞介素，其中該抗PD-1靶向部分之該可變重鏈包含SEQ ID NO: 169，且該抗PD1靶向部分之該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 175。
  51. 如請求項42至50中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該可裂解連接子包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)或SPGGGGPMPYDLYHPSGGG (SEQ ID NO: 144)。
  52. 如請求項42至51中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該不可裂解連接子包含GGSSPPGGGSSGGGSGP (SEQ ID NO: 163)。
  53. 一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽： a)第一多肽，其包含： 抗PD1靶向部分之可變重鏈，其包含SEQ ID NO: 169， SEQ ID NO: 21之第一Fc多肽， 不可裂解連接子，及 SEQ ID NO: 4之減弱的IL-2多肽； b)第二多肽，其包含： 抗PD1靶向部分之可變重鏈，其包含SEQ ID NO: 169， SEQ ID NO: 20之第二Fc多肽， 可裂解連接子，其包含MPYDLYHP (SEQ ID NO: 34)，及 SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 12之VHH遮蔽部分，及 c)第三多肽，其包含抗PD1靶向部分之可變輕鏈，該可變輕鏈包含SEQ ID NO: 175。
  54. 一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽： a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 191至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列； b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 192至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；及 c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 176至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。
  55. 如請求項54之經遮蔽細胞介素，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 191，該第二多肽包含SEQ ID NO: 192，且該第三多肽包含SEQ ID NO: 176。
  56. 一種經遮蔽細胞介素，其包含三種多肽： a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO: 191至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列； b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO: 193至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列；及 c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO: 176至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。
  57. 如請求項56之經遮蔽細胞介素，其中該第一多肽包含SEQ ID NO: 191，該第二多肽包含SEQ ID NO: 193，且該第三多肽包含SEQ ID NO: 176。
  58. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該經遮蔽細胞介素在CD8 T細胞pSTAT5活性分析中具有大於未經遮蔽細胞介素之EC50的EC50。
  59. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中該經遮蔽細胞介素在MMP存在下具有大於或等於10 5M -1s -1之活體外裂解效率Kcat/Km。
  60. 如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素，其中至少5%之該經遮蔽細胞介素在與腫瘤特異性蛋白酶接觸時裂解。
  61. 一種核酸，其編碼如前述請求項中任一項之經遮蔽細胞介素。
  62. 一種載體，其包含如請求項61之核酸。
  63. 一種宿主細胞，其包含如請求項61之核酸。
  64. 一種產生如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素之方法，其包含在產生該經遮蔽細胞介素之條件下培養如請求項63之宿主細胞。
  65. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素及醫藥學上可接受之載劑。
  66. 一種套組，其包含如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素或如請求項65之醫藥組合物。
  67. 一種治療或預防個體之贅生性疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素或如請求項65之醫藥組合物。
  68. 一種治療或預防個體之發炎性或自體免疫性疾病之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素或如請求項65之醫藥組合物。
  69. 如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素，其用於藥物中。
  70. 如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素，其用於治療贅生性疾病。
  71. 如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素，其用於治療或預防發炎性疾病。
  72. 如請求項1至60中任一項之經遮蔽細胞介素，其用於治療或預防自體免疫性疾病。
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