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TW202517683A - 可活化之ror結合劑及其用途 - Google Patents

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TW202517683A
TW202517683A TW113127241A TW113127241A TW202517683A TW 202517683 A TW202517683 A TW 202517683A TW 113127241 A TW113127241 A TW 113127241A TW 113127241 A TW113127241 A TW 113127241A TW 202517683 A TW202517683 A TW 202517683A
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杜方勇
凱瑟琳 戈加斯
傑佛瑞 Ｎ 希加基
希瑪 坎特克
李豔
羅培志
徐江春
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美商艾克塞里克斯公司
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Abstract

本揭示案提供可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，包括單特異性及多特異性抗體，諸如雙特異性抗體)及其用途。

Description

可活化之ROR結合劑及其用途
本揭示案大體上係關於結合至酪胺酸-蛋白激酶跨膜受體(ROR)，包括人類ROR之可活化結合劑，諸如可活化抗體(包括其片段)，及其使用方法。
多種腫瘤可展現酪胺酸-蛋白質激酶跨膜受體(ROR)抗原於細胞表面的表現，如以下文獻中更詳細地描述：Gentile等人( Cancer Res; 71(8) 2011年4月15日), Rebagay等人( Front . Oncol ., 2012年4月18日), Zhang等人( American Journal of Pathology, 第181卷，第6期，2012年12月), Henry等人( Oncotarget, 第6卷，第37期，2015), Zhang等人( PLoS ONE7(3): e31127.)及Bainbridge等人( PLoS ONE9(7): e102695.)，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。另外，ROR表現可不表現於或僅表明有限地表現於正常組織，亦即非癌變組織中，如Balakrishnan等人( Clin Cancer Res .2017年6月15日; 23(12): 3061-3071)中所述，該文獻全文併入本文中。因此，ROR抗原可用作某些腫瘤中之腫瘤特異性標記。表明有ROR表現之腫瘤及癌症之實例包括但不限於胰臟癌、卵巢癌、乳癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、慢性淋巴球性白血病、套細胞淋巴瘤及B-ALL，如Gohil等人( Oncoimmunology. 2017; 6(7): e1326437.)中所述，該文獻全文併入本文中。其他癌症包括但不限於血液學癌症、前列腺癌、結腸癌、腎癌及子宮癌。ROR抗原結合劑因此具有治療癌症之治療潛力。
可活化結合劑(例如可活化抗體)僅能夠在某些環境中(例如在富含蛋白酶之腫瘤微環境中)結合其目標，且因此適用於精確/環境依賴性目標結合。然而，開發可活化結合劑的過程緩慢、勞力密集且成本高。
因此，需要可活化ROR抗原結合劑。
本文中參考文獻之引用不應視為承認此類參考文獻為本發明之先前技術。
本揭示案提供可活化ROR結合劑，包括可活化人類ROR結合劑。此類藥劑包括結合至ROR之可活化抗體，例如結合至ROR之單特異性或多特異性(例如雙特異性)抗體。
在一些實施例中，此類可活化結合劑係包含以下之可活化抗體：掩蔽肽、抗體輕鏈可變(VL)區及抗體重鏈可變(VH)區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區包含本文所述之CDR (例如 表 1)。
在一些實施例中，此類可活化結合劑係包含以下之可活化抗體：(a)包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO:29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區包含本文所述之CDR (例如 表 1)。
在一些實施例中，此類可活化結合劑係包含以下之可活化抗體：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區包含本文所述之CDR (例如 表 1)。
在一些實施例中，此類可活化結合劑係包含以下之可活化抗體：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區如本文所述(例如 表 1)。在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO:35、37或39之胺基酸序列(參見 表 4 - 表 6)。在某些實施例中，多肽如本文所述(例如 表 4 - 表 6中之任一者)或包含SEQ ID NO:34、36或38之胺基酸序列(參見 表 4 - 表 6)。
在一些實施例中，此類可活化結合劑係包含以下之可活化抗體：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈之多肽；及(b)抗體重鏈；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈及抗體重鏈如本文所述(例如 表 3)或包含本文所述之抗體輕鏈及抗體重鏈胺基酸序列(例如 表 3)。在某些實施例中，多肽如本文所述(例如 表 4 - 表 6中之任一者)或包含SEQ ID NO:34、36或38之胺基酸序列(參見 表 4 - 表 6)。
在一些實施例中，此類可活化結合劑係可活化抗體，其與包含本文所述之CDR (例如 表 1)之抗體結合至ROR (例如人類ROR)之相同抗原決定基且包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)。
在一些實施例中，此類可活化結合劑與包含本文所述之重鏈可變區及輕鏈可變區(例如 表 1)之抗體結合至ROR (例如人類ROR)之相同抗原決定基且包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)。
本揭示案亦提供編碼本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體或其片段，諸如可活化抗原結合片段)之核酸、包含此類核酸中之一或多者之載體及包含該核酸、該載體或兩者之細胞(諸如表現結合劑之細胞)。
本揭示案亦提供包含可活化ROR結合劑之組合物。在一些實施例中，此類組合物包括結合至ROR之可活化抗體，例如結合至ROR之單特異性或多特異性(例如雙特異性)抗體。
在一些實施例中，此類組合物包括可活化抗體，其包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區包含本文所述之CDR(例如 表 1)。
在一些實施例中，此類組合物係包含以下之可活化抗體：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區如本文所述(例如 表 1)。在某些實施例中，多肽包含SEQ ID NO:35、37或39之胺基酸序列(參見 表 4 - 表 6)。在某些實施例中，多肽如本文所述(例如 表 4 - 表 6中之任一者)或包含SEQ ID NO:34、36或38之胺基酸序列(參見 表 4 - 表 6)。
在一些實施例中，此類組合物係包含以下之可活化抗體：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈之多肽；及(b)抗體重鏈；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈及抗體重鏈如本文所述(例如 表 3)或包含本文所述之抗體輕鏈及抗體重鏈胺基酸序列(例如 表 3)。在某些實施例中，多肽如本文所述(例如 表 4 - 表 6中之任一者)或包含SEQ ID NO:34、36或38之胺基酸序列(參見 表 4 - 表 6)。
在一些實施例中，此類組合物包括與包含本文所述之CDR (例如 表 1)之抗體結合至ROR (例如人類ROR)之基本上相同抗原決定基之可活化抗體且包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)。
在一些實施例中，此類組合物包括與包含本文所述之重鏈可變區及輕鏈可變區(例如 表 1)之抗體結合至ROR (例如人類ROR)之基本上相同抗原決定基之可活化抗體且包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)。
本揭示案亦提供組合物，其包含編碼本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體或其片段，諸如可活化抗原結合片段)之核酸、包含一或多種核酸之載體或包含核酸、載體或兩者之細胞(諸如表現可活化結合劑之細胞)。
本揭示案進一步提供本發明之可活化結合劑及組合物之各種用途，包括例如用本文提供之可活化ROR結合劑或組合物治療個體之疾病或病症的方法。此類組合物包括結合至ROR之可活化抗體，例如結合至ROR (例如人類ROR)之單特異性或多特異性(例如雙特異性)抗體。
本揭示案進一步提供製備結合至ROR之可活化抗體或其片段的方法，該等方法包含培養本文所述之細胞及表現可活化抗體或其片段。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2023年7月20日申請之美國臨時專利申請案第63/514,782號的權益，該案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有已以XML檔案格式隨本申請案提交之電子版序列表，該序列表之全部內容以全文引用之方式併入本文中。隨本申請案提交之序列表XML檔案名稱為「14529-148-185_SEQ_LISTING.xml」，創建於2024年7月18日且大小為85,072位元組。
本揭示案至少部分地基於新穎可活化ROR結合劑及其特性。此類藥劑包括結合至ROR之可活化抗體(例如單特異性或多特異性，包括雙特異性)，包括結合至人類ROR之可活化抗體。在某些態樣中，此類可活化結合劑可用於治療諸如癌症之疾病或病症的組合物及方法中。
如應理解，如本文中所使用之部分或子部分標題僅用於組織目的，且不應解釋為限制及/或分離所描述之標的物。 5.1.   ROR抗原
本文所述之可活化ROR結合劑與一或多種ROR抗原特異性結合。
如本文所用，「ROR抗原」係指酪胺酸-蛋白質激酶跨膜受體(ROR)家族成員，包括成員ROR1及ROR2。在某些實施例中，可活化ROR結合劑具有僅特異性結合至ROR1之抗原結合位點。在其他實施例中，可活化ROR結合劑具有僅特異性結合至ROR2之抗原結合位點。在較佳實施例中，可活化ROR結合劑具有具交叉反應性且特異性結合至ROR1與ROR2兩者之抗原結合位點。
因此，在一個實施例中，如本文所用，術語「ROR」或「ROR抗原」係指ROR1 (例如人類ROR1)。在另一實施例中，如本文所用之術語「ROR」或「ROR抗原」係指ROR2 (例如人類ROR2)。在一較佳實施例中，如本文所用之術語「ROR」或「ROR抗原」係指ROR1及ROR2兩者(例如人類ROR1及人類ROR2兩者)。
ROR1及ROR2蛋白典型地由至少四個蛋白域組成：三個胞外域 -- Ig樣、FZ及Kringle域，以及胞內蛋白質激酶域。在一些實施例中，可活化ROR結合劑具有特異性結合至ROR抗原之細胞外部分之抗原結合位點。在某些實施例中，可活化ROR結合劑具有特異性結合至Ig樣域之抗原結合位點。在其他實施例中，可活化ROR結合劑具有特異性結合至FZ域之抗原結合位點。在其他實施例中，可活化ROR結合劑具有特異性結合至Kringle域之抗原結合位點。在特定實施例中，可活化ROR結合劑具有特異性結合至單一ROR域之至少一部分的抗原結合位點。在特定實施例中，可活化ROR結合劑具有特異性結合至超過一個ROR域之至少一部分之抗原結合位點，諸如第一ROR域與第二ROR域之間的連接點。ROR域可指ROR1域或ROR2域。
在特定實施例中，ROR抗原為人類。UniProt登錄號Q01973描述典型的人類ROR1蛋白，包括其序列及域特徵，且以全文引用之方式併入本文中。SEQ ID NO:40提供全長ROR1蛋白序列(參見 表 7)。參考自N端至C端之全長序列，Ig樣域被定義為胺基酸42-147，FZ域被定義為胺基酸165-299，且Kringle域被定義為胺基酸312-391。UniProt登錄號Q01974描述典型的人類ROR2蛋白，包括其序列及域特徵，且以全文引用之方式併入本文中。SEQ ID NO:41提供全長ROR2蛋白序列(參見 表 7)。參考自N端至C端之全長序列，Ig樣域被定義為胺基酸55-145，FZ域被定義為胺基酸169-303，且Kringle域被定義為胺基酸316-394。
多種腫瘤可展現ROR抗原之細胞表面表現，如以下文獻中更詳細地描述：Gentile等人( Cancer Res; 71(8) 2011年4月15日), Rebagay等人( Front . Oncol ., 2012年4月18日), Zhang等人( American Journal of Pathology, 第181卷，第6期，2012年12月), Henry等人( Oncotarget, 第6卷，第37期，2015), Zhang等人( PLoS ONE7(3): e31127.)及Bainbridge等人( PLoS ONE9(7): e102695.)，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。另外，ROR表現可不表現於或僅表明有限地表現於正常組織，亦即非癌變組織中，如Balakrishnan等人( Clin Cancer Res .2017年6月15日; 23(12): 3061-3071)中所述，該文獻全文併入本文中。因此，ROR抗原可用作某些腫瘤中之腫瘤特異性標記。表明有ROR表現之腫瘤及癌症之實例包括但不限於胰臟癌、卵巢癌、乳癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、慢性淋巴球性白血病、套細胞淋巴瘤及B-ALL，如Gohil等人( Oncoimmunology .2017; 6(7): e1326437.)中所述，該文獻全文併入本文中。其他癌症包括但不限於血液學癌症、前列腺癌、結腸癌、腎癌及子宮癌。 5.2.     定義
本文中描述或提及之技術及程序包括熟習此項技術者使用習知方法，諸如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版 2001)；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人編, 2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An編 2009)；Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar編 2010)；及Antibody Engineering第1及2卷(Kontermann及Dübel編, 第2版 2010)中所述之廣泛使用之方法而總體上充分理解及/或通常採用之彼等。除非本文中另外定義，否則本說明書中所使用之技術及科學術語應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下術語說明且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數且反之亦然。在所闡述之術語之任何說明與以引用之方式併入本文中之任何文獻存在衝突之情況下，以下文闡述之術語說明為準。
如本文中所使用，術語「結合劑」或其文法等效物係指具有一或多個結合抗原之抗原結合位點的分子(例如抗體)。在一些實施例中，如本文所述之可活化ROR結合劑係可活化抗體(包括可活化抗體片段，諸如可活化抗原結合片段或可活化抗原決定基結合片段)或其他基於可活化肽之分子以及結合至ROR，諸如人類ROR之可活化抗體、可活化抗體片段或基於可活化肽之分子之結合物(例如可活化抗體-藥物結合物)。
在一些實施例中，「可活化」結合劑係指如下之結合劑：當處於經抑制、經掩蔽及/或未裂解之狀態下時展現與靶標之第一結合水平，且在未抑制、未掩蔽及/或經裂解之狀態下展現與靶標之第二結合水平，其中第二靶標結合水平大於第一靶標結合水平。在一些實施例中，在可裂解部分內裂解(例如藉由一或多種蛋白酶)之後，可活化結合劑對靶標之近接更大。
術語「抗體」、「免疫球蛋白」及「Ig」在本文中可互換地使用且在最廣泛意義上使用，且特別涵蓋例如多株抗體、單株抗體(包括促效劑、拮抗劑、中和抗體、全長單株抗體)、具有多抗原決定基或單抗原決定基特異性之抗體組合物、以重組方式產生之抗體、單域(例如VHH)抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、合成抗體、嵌合抗體、人源化抗體，或具有全長重鏈及/或輕鏈之抗體的人類形式。如本文中所使用，VHH係指來源於僅抗體重鏈可變區之域抗體。例示性單域抗體包括但不限於天然缺乏輕鏈之抗體，諸如來自駱駝科物種(例如駱馬)之抗體；來源於習知4鏈抗體之單域抗體；經工程改造之抗體；及除來源於抗體之骨架以外的單域骨架。單域抗體可來源於任何物種，包括但不限於小鼠、人類、駱駝、大羊駝、山羊、兔和牛。VHH亦可衍生自除駱駝科以外的可產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體的其他物種。抗體亦包括保持ROR結合特徵之抗體片段(及/或包含抗體片段之多肽)。抗體片段之非限制性實例包括抗體的抗原結合區及/或效應區，例如Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、(scFv) 2、單鏈抗體分子、雙可變域抗體、單可變域抗體、線性抗體、V區、由抗體片段形成的多特異性抗體、F(ab) 2、Fd、Fc、雙功能抗體、二-雙功能抗體、二硫鍵連接的Fv (dsFv)、單域抗體(例如奈米抗體)或其他片段(例如由非共價偶合之重鏈及輕鏈之可變區組成的片段)。一般而言，可變(V)區域可為免疫球蛋白重鏈(VH)及/或輕鏈(VL)可變域之任何適合排列。舉例而言，抗體亦包括包含兩個重鏈及兩個輕鏈分子之四聚抗體、抗體輕鏈單體及抗體重鏈單體。因此，舉例而言，V區域可為二聚體且含有結合ROR的VHH-VHH、VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。必要時，VH及VL可直接或經由連接子共價偶合以形成單鏈Fv (scFv)。為便於參考，將本文中提及之scFv蛋白包括於「抗體片段」類別中。抗體片段之另一形式為包含抗體之一或多個互補決定區(CDR)的肽。CDR (亦稱為「最小識別單元」或「高變區」)可藉由構築編碼一或多個所關注CDR之聚核苷酸來獲得。此等聚核苷酸係例如藉由使用聚合酶連鎖反應，使用抗體生產細胞之mRNA作為模板合成可變區來製備(參見例如Larrick等人, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:106 (1991)；Courtenay-Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」, Monoclonal Antibodies Production, Engineering and Clinical Application, Ritter等人(編),第166頁, Cambridge University Press (1995)；及Ward等人, 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch等人(編),第137頁, Wiley-Liss, Inc. (1995))。抗體片段可併入例如單域抗體、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、新抗原受體之可變域(v-NAR)及雙-單鏈Fv區中(參見例如Hollinger及Hudson, Nature Biotechnology, 23(9):1126-1136, 2005)。在一些實施例中，包含VH及/或VL之抗體進一步含有輕鏈及/或重鏈恆定區，諸如一或多個恆定區，包括一或多個IgG1、IgG2、IgG3及/或IgG4恆定區。在一些實施例中，抗體可包括上述任一者之抗原決定基結合片段。本文中所描述之抗體可屬於免疫球蛋白分子之任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)或任何子類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。
當參考如本文中所使用之結合劑(例如抗體)使用時，術語「單特異性」表示具有一或多個結合位點之結合劑，該一或多個結合位點各自結合至同一抗原之同一抗原決定基。
當參考結合劑(例如抗體)使用時，術語「多特異性」意謂結合劑能夠特異性結合至少兩個不同抗原決定基，例如各自由一對抗體重鏈可變域(VH)及抗體輕鏈可變域(VL)形成或各自由一對結合至不同抗原或結合至同一抗原上之不同抗原決定基之VHH域形成的兩個結合位點。此類雙特異性結合劑(例如抗體)可具有1+1形式(包含一個針對第一抗原或抗原決定基之結合部位及一個針對第二抗原或抗原決定基之結合部位)。其他雙特異性結合劑(例如抗體)型式可為2+1或1+2型式(包含針對第一抗原或抗原決定基之兩個結合位點及針對第二抗原或抗原決定基之一個結合位點)或2+2型式(包含針對第一抗原或抗原決定基之兩個結合位點及針對第二抗原或抗原決定基之兩個結合位點)。當雙特異性結合劑(例如抗體)包含兩個抗原結合位點時，其各自可結合至不同抗原決定基。此類雙特異性結合劑(例如抗體)可結合至同一抗原上之兩個不同抗原決定基(例如ROR上之抗原決定基)。
術語「一致」或「一致性」百分比，在兩種或更多種核酸或多肽之情形下，係指兩個或更多個序列或子序列當針對最大對應性(correspondence)比較及比對(必要時，引入空隙)時為相同的或具有指定百分比之相同核苷酸或胺基酸殘基，其中不考慮任何保守胺基酸取代為序列一致性之一部分。一致性百分比可使用序列比較軟體或演算法或藉由目視檢查來量測。可用於獲得胺基酸或核苷酸序列比對的各種演算法及軟體係此項技術中熟知的。此等演算法及軟體包括(但不限於)BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Package及其變化形式。在一些實施例中，兩種核酸或多肽基本上一致，意謂其當根據最大一致性比較及比對時，具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%且在一些實施例中，具有至少95%、96%、97%、98%或99%核苷酸或胺基酸殘基一致性，如使用序列比較算法或藉由目視檢查所量測。在一些實施例中，一致性存在於胺基酸序列之一個區域上，該區域之長度為至少約10個殘基、至少約20個殘基、至少約40-60個殘基、至少約60-80個殘基或其間的任何整數值。在一些實施例中，一致性存在於比60-80個殘基更長(諸如至少約80-100個殘基)的區域上，且在一些實施例中，序列在所比較之序列(諸如目標蛋白或抗體之編碼區)的全長上實質上一致。在一些實施例中，一致性存在於核苷酸序列之一個區域上，該區域之長度為至少約10個殘基、至少約20個殘基、至少約40-60個殘基、至少約60-80個殘基或其間的任何整數值。在一些實施例中，一致性存在於比60-80個鹼基更長(諸如至少約80-1000個鹼基或更長)的區域上，且在一些實施例中，序列在所比較之序列(編碼所關注蛋白質之核苷酸序列)的全長上實質上一致。
「保守性胺基酸取代」為其中一個胺基酸殘基經具有類似化學特徵之側鏈的另一胺基酸殘基置換之取代。此項技術中已大體定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。舉例而言，用苯丙胺酸取代酪胺酸為保守取代。一般而言，本發明之多肽、可溶性蛋白質及/或抗體之序列中的保守取代不消除含有胺基酸序列之多肽、可溶性蛋白質或抗體對目標結合位的結合。鑑別不消除結合之胺基酸保守性取代的方法在此項技術中熟知。
術語「多肽」係指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為線性或支化的，其可包含經修飾之胺基酸且其可包括(例如間雜有)非胺基酸。該等術語亦涵蓋已經天然地修飾或藉由介入修飾的胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與諸如標記組分或藥物(例如毒素)之類部分連接或結合(直接地或間接地連接或結合)。該定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解，由於本揭示案之多肽可基於抗體或免疫球蛋白超家族之其他成員，因此在一些實施例中，多肽可以單鏈或單鏈二聚體形式存在。
如本文所使用，「抗原」係含有結合劑(例如抗體)可結合之抗原決定基的部分或分子。因此，抗原可由抗體結合。在一些實施例中，本文所述之結合劑(例如抗體)所結合之抗原為ROR (例如人類ROR)或其片段，包括包含ROR之一或多個域的片段。
如本文所用，「抗原決定基」為此項技術中之術語且係指抗體可結合的抗原之局部化區。抗原決定基可為線性抗原決定基或構形、非線性或不連續之抗原決定基。舉例而言，在多肽抗原之情況下，抗原決定基可為多肽之鄰接胺基酸(「線性」抗原決定基)或抗原決定基可包含來自多肽之兩個或更多個非鄰接區域(「構形」、「非線性」或「不連續」抗原決定基)的胺基酸，例如人類ROR。熟習此項技術者應瞭解，一般而言，線性抗原決定基可或可不依賴於二級、三級或四級結構。舉例而言，在一些實施例中，抗體結合至一組胺基酸，不管其是否在天然三維蛋白質結構中摺疊。在其他實施例中，抗體需要構成抗原決定基的胺基酸殘基展現特定構形(例如彎曲、扭轉、轉彎或摺疊)以便識別及結合抗原決定基。
當兩個抗體識別三維空間中之相同、重疊或相鄰抗原決定基時，抗體與參考抗體結合「抗原決定基」或「基本上相同的抗原決定基」或「相同的抗原決定基」。用於測定兩個抗體是否結合至三維空間中之相同、重疊或相鄰抗原決定基的使用最廣泛及快速之方法為競爭分析法，其可以許多不同型式組態，例如使用經標記之抗原或經標記之抗體。在一些分析中，使抗原固著於96孔盤上，或表現於細胞表面上，且使用放射性、螢光或酶標記來量測未標記之抗體阻斷經標記之抗體結合的能力。
「抗原決定基分組」係基於抗體所識別之抗原決定基而對抗體進行分組的方法。更特定而言，抗原決定基分組包含利用競爭分析與計算方法的組合來區分不同抗體之抗原決定基識別特性的方法及系統，以便基於其抗原決定基識別特性而將抗體聚類且鑑別具有不同結合特異性的抗體。
如本文中所使用，術語「特異性結合」、「特異性識別」、「免疫特異性結合」、「選擇性結合」、「免疫特異性識別」及「免疫特異性」在抗體之情形下為類似術語且係指結合至抗原(例如，抗原決定基)之分子，因為此類結合為熟習此項技術者所理解。在一些實施例中，「特異性結合」意謂例如多肽或分子與抗原決定基、蛋白質或標靶分子之相互作用比替代物質(包括相關及不相關之蛋白質)更頻繁、更快速、持續時間更長、親和力更大或上述一些組合。舉例而言，特異性結合至抗原之分子一般可以較低親和力結合至其他肽或多肽，親和力係藉由例如免疫分析、BIACORE™、KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments, Boise, ID)、OctetQK384系統(ForteBio, Menlo Park, CA)或此項技術中已知之其他分析測定。在一些實施例中，當以比任何交叉反應抗原更高之親和力結合至抗原時，抗體或抗原結合域結合或特異性結合至該抗原，該親和力係使用諸如放射免疫分析法(RIA)及酶聯免疫吸附分析法(ELISA)之實驗技術所測定。通常，特異性或選擇性反應將至少為兩倍背景信號或雜訊且可超過10倍背景。關於結合特異性之論述，參見例如Fundamental Immunology 332-36 (Paul編, 第2版, 1989)。在一些實施例中，抗體或抗原結合域與「非目標」蛋白質之結合程度小於該抗體或抗原結合域與其特定目標抗原之結合的不到約10%，此係例如藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析或RIA測定。在一些實施例中，特異性結合至抗原之分子結合至該抗原的Ka為至少2 log、2.5 log、3 log、4 log或大於該分子結合至另一抗原時的Ka。在一些實施例中，特異性結合至抗原之分子不與其他蛋白質交叉反應。在另一特定實施例中，特異性結合至抗原之分子不與其他非ROR蛋白質交叉反應。在一些實施例中，「特異性結合」意謂例如多肽或分子以約0.1 mM或更小，但更通常小於約1 µM之K D結合蛋白質或標靶。在一些實施例中，「特異性結合」意謂一多肽或分子以至少約0.1 µM或更小、至少約0.01 µM或更小或至少約1 nM或更小的K D結合目標。由於不同物種之同源蛋白質之間存在序列一致性，因此特異性結合可包括多肽或分子識別超過一種物種之蛋白質或標靶。同樣地，由於不同蛋白質之多肽序列之某些區域內存在同源性，因此特異性結合可包括多肽或分子識別超過一種蛋白質或標靶。應瞭解，在一些實施例中，特異性結合第一標靶之多肽或分子可或可不特異性結合第二標靶。因此，「特異性結合」未必需要(儘管其可包括)排他性結合，例如結合至單一標靶。因此，在一些實施例中，多肽或分子可特異性結合超過一種標靶。在一些實施例中，多個標靶可由多肽或分子上之相同抗原結合位點結合。舉例而言，抗體在某些情況下可包含兩個相同抗原結合位點，其各者特異性結合兩個或更多個蛋白質上之相同抗原決定基。在某些替代實施例中，抗體可為雙特異性的且包含至少兩個具有不同特異性之抗原結合位點。一般而言，但未必，提及「結合」意謂「特異性結合」。
「結合親和力」一般係指一分子(例如合劑，諸如抗體)之單一結合部位與其結合搭配物(例如抗原，諸如ROR)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間的1:1相互作用之固有結合親和力。結合分子X針對其結合搭配物Y之親和力一般可由解離常數(K D)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所描述之彼等方法)來量測親和力。低親和力抗體一般緩慢結合抗原且傾向於容易解離，而高親和力抗體一般較快結合抗原且傾向於較長時間保持結合狀態。此項技術中已知多種量測結合親和力的方法，其中之任一者可用於本發明之目的。在一個實施例中，「K D」或「K D值」可藉由生物層干涉術(BLI)，使用例如OctetQK384系統(ForteBio, Menlo Park, CA)來量測。替代地，K D亦可在使用例如感興趣抗體之Fab形式及其抗原(Chen等人, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)執行的放射性標記之抗原結合分析(RIA)中，或使用表面電漿子共振(SPR)分析，藉由BIACORE™，使用例如BIACORE™-2000或BIACORE™-3000 (BIACORE™, Inc., Piscataway, NJ)量測。「締合速率(on-rate)」或「締合之速率(rate of association)」或「締合速率(association rate)」或「k on」以及「解離速率(off-rate)」或「解離之速率(rate of dissociation)」或「解離速率(dissociation rate)」或「k off」亦可使用上文所描述之相同SPR或BLI技術，分別使用例如OctetQK384系統(ForteBio, Menlo Park, CA)或者BIACORE™-2000或BIACORE™-3000 (BIACORE™, Inc., Piscataway, NJ)來測定。
當在ROR結合劑(例如抗體)之上下文中使用時，術語「競爭」或其任何文法變化形式意謂結合劑對目標上之相同抗原決定基或結合位點的競爭，包括此類結合劑之間的競爭，如以下分析所測定：所研究之結合劑阻止或抑制參考分子(例如參考配位體，或參考抗原結合蛋白，諸如參考抗體)對共同抗原(例如ROR)的特異性結合。可利用多種類型的競爭結合分析來確定測試結合劑是否與參考分子競爭結合至ROR (例如人類ROR)。可採用之分析法之實例包括固相直接或間接放射免疫分析法(RIA)；固相直接或間接酶免疫分析法(EIA)、夾心競爭分析法(參見例如Stahli等人, (1983), Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (參見例如Kirkland等人, (1986), J. Immunol. 137:3614-3619或Cheung等人, (1990) Virology 176:546-552)；固相直接標記分析法；固相直接標記夾心分析法(參見例如Harlow及Lane, (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA (參見例如Morel等人, (1988), Molec. Immunol. 25:7-15)；及直接標記RIA (Moldenhauer等人, (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82)。典型地，此類分析涉及使用結合至固體表面的純化抗原(例如ROR，諸如人類ROR)，或帶有未標記之測試抗原結合蛋白(例如測試ROR抗體)或經標記之參考抗原結合蛋白(例如參考ROR抗體)的細胞。競爭抑制可藉由在測試抗原結合蛋白存在下測定結合至固體表面或細胞之標記的量來量測。通常，測試抗原結合蛋白質過量存在。藉由競爭分析(競爭抗體)鑑別之抗體包括與參考抗體結合至相同之抗原決定基的抗體及/或結合至鄰近抗原決定基的抗體，該鄰近抗原決定基足夠靠近參考抗體所結合之抗原決定基以致抗體出現空間位阻(例如，相似抗原決定基或重疊抗原決定基)。通常，當競爭抗體過量存在時，其將參考抗體對共同抗原的特異性結合抑制至少20%，例如至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實例中，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高百分比。
如本文中所使用，術語「恆定區」或「恆定域」為此項技術之熟知抗體術語且係指抗體部分，例如輕鏈及/或重鏈之羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原之結合，但其可展現各種效應功能，諸如與Fc受體之相互作用。該術語包括免疫球蛋白分子中相對於免疫球蛋白可變域，具有通常更保守之胺基酸序列的部分。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(例如原生序列Fc區或胺基酸序列變異型Fc區)的彼等生物活性，且因抗體同型而異。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
在本文中，術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區，包括例如原生序列Fc區、重組型Fc區及變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為自位置Cys226 (根據EU編號系統)處之胺基酸殘基或自Pro230 (根據EU編號系統)延伸至其羧基端。可移除Fc區之C端離胺酸(殘基447，根據EU編號系統)，例如在抗體之製備或純化期間，或藉由以重組方式工程改造編碼抗體之重鏈的核酸。下文提供例示性Fc區序列(CH2域=粗體文字；CH3域=加底線的文字)： CPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:42)。
「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用(諸如抗體依賴性細胞吞噬作用，亦即ADCP)；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。此等效應功能通常需要將Fc區與結合區或結合域(例如抗體可變區或域)組合且可使用所揭示之各種分析法進行評估。
「原生序列Fc區」包含與自然界中所發現之Fc區的胺基酸序列一致的胺基酸序列，且未被人類操縱、修飾及/或改變(例如分離、純化、選擇，包括或與其他序列(諸如可變區序列)組合)。原生序列人類Fc區包括原生序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；原生序列人類IgG2 Fc區；原生序列人類IgG3 Fc區；及原生序列人類IgG4 Fc區，以及其天然存在之變異體。
「變異體Fc區」包含因至少一個胺基酸修飾(例如取代、添加或缺失)，較佳一或多個胺基酸取代而與原生序列Fc區之胺基酸序列不同的胺基酸序列。在一些實施例中，與原生序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，變異體Fc區在原生序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中具有至少一個胺基酸取代，例如約一個至約十個胺基酸取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。本文所述之變異型Fc區可與原生序列Fc區及/或親本多肽之Fc區具有至少約80%同源性，或與其具有至少約90%同源性，例如與其具有至少約95%同源性。本文中所描述之變異體Fc區在本文中可能喪失效應功能(例如靜默Fc)。下文提供例示性變體Fc區(「靜默Fc」)序列(CH2域=粗體文字，其中胺基酸變化加底線；CH3域=加底線的文字)： CPPCP APE AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL KAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:43)。
如本文中所使用，當用於提及抗體時，術語「重鏈」係指約50至70 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約120至130個或更多個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括一或多個恆定區。「重鏈」可指任何不同類型，例如α (alpha)、δ(delta)、ε (epsilon)、γ (gamma)及µ (mu)，基於恆定域之胺基酸序列，其分別產生抗體之IgA、IgD、IgE、IgG及IgM類別，包括IgG之亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
如本文中所使用，當提及抗體使用時，術語「輕鏈」可指約25 kDa之多肽鏈，其中胺基端部分包括約100至約110個或更多個胺基酸之可變區，且羧基端部分包括恆定區。輕鏈之大致長度係211至217個胺基酸。基於恆定域之胺基酸序列，存在兩種不同類型，例如κ (kappa)或λ (lambda)。輕鏈胺基酸序列為此項技術中所熟知的。
在一個實施例中，「鏈」(例如重鏈或輕鏈)本身為分子(例如多肽)。在另一實施例中，「鏈」(例如重鏈或輕鏈)為分子(例如多肽)之一部分，例如與分子之其餘部分(諸如多肽)直接或間接結合。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合域」、「抗原結合區」及類似術語係指抗體中包含與抗原相互作用且賦予結合片段、域或區域對抗原(例如CDR)之特異性及親和力之胺基酸殘基的部分。如本文所使用，「抗原結合片段」包括「抗體片段」，其包含抗體中包括一或多個CDR之部分，諸如抗體之抗原結合區或可變區。
本文中所描述之抗體包括但不限於合成抗體、單株抗體、以重組方式產生之抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、單鏈Fv (scFv) (例如包括單特異性、雙特異性等)、駱駝化抗體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體及上述任一者之抗原決定基結合片段。
在一些實施例中，本文所述之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，包括含有一或多個結合至ROR抗原之抗原結合位點的分子。
抗體可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何子類別(例如IgG2a或IgG2b)之免疫球蛋白分子。在一些實施例中，本文中所描述之抗體為IgG抗體(例如，人類IgG)或其類別(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或子類別。
在一些實施例中，抗體為包含兩個重(H)鏈/輕(L)鏈對之4鏈抗體單元。在其他實施例中，H鏈之胺基酸序列相同且L鏈之胺基酸序列相同。在其他實施例中，H鏈之胺基酸序列彼此不同。或者或另外，L鏈之胺基酸序列彼此不同。舉例而言，抗體包含第一H/L鏈對及第二H/L鏈對，其中第一H/L鏈對結合至ROR抗原且第二H/L鏈對結合至另一ROR抗原或非ROR抗原。在一些實施例中，抗體為包含VHH-VHH對之2鏈抗體單元。在其他實施例中，VHH之胺基酸序列相同。在其他實施例中，VHH之胺基酸序列彼此不同。舉例而言，抗體包含第一VHH及第二VHH，其中第一VHH結合至ROR抗原且第二VHH結合至另一ROR抗原或非ROR抗原。在一些實施例中，H鏈及/或L鏈包含恆定區，例如人類恆定區。在一些實施例中，此等抗體之L鏈恆定區為κ或λ輕鏈恆定區，例如人類κ或λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，此等抗體之H鏈恆定區包含γ重鏈恆定區，例如人類γ重鏈恆定區。在一些實施例中，此等抗體包含IgG恆定區，例如人類IgG恆定區(例如，IgG1、IgG2、IgG3及/或IgG4恆定區)。
抗體或其片段可優先結合至ROR，諸如人類ROR，此意謂該抗體或其片段結合ROR的親和力大於其結合至對照蛋白質(例如無關對照蛋白質，諸如雞蛋白溶菌酶)及/或結合人類ROR的親和力大於其結合至無關對照蛋白質。舉例而言，抗體或其片段可特異性識別且結合ROR或其一部分。「特異性結合」意謂抗體或其片段結合至ROR之親和力比對不相關之對照蛋白質(例如雞卵白溶菌酶)之親和力大至少5、10、15、20、25、50、100、250、500、1000或10,000倍。在一些實施例中，該抗體或其片段可基本上排他性地結合ROR (例如能夠將ROR與其他已知多肽區分開來，例如根據結合親和力的可量測差異)。在一些實施例中，ROR結合劑(例如抗體)可與除人類ROR序列之外的ROR序列反應。在其他實施例中，ROR結合劑(例如抗體)與非人類ROR序列無反應。
術語「可變區」或「可變域係指抗體輕鏈或重鏈的一部分，其一般位於輕鏈或重鏈之胺基末端，在重鏈中長度為約120至130個胺基酸且在輕鏈中長度為約100至110個胺基酸，並用於各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性。重鏈之可變區可稱為「VH」。輕鏈之可變區可稱為「VL」。術語「可變」係指可變區之某些區段在抗體中之序列方面廣泛不同之事實。V區介導抗原結合且定義特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性不均勻分佈於可變區之110個胺基酸跨距內。實際上，V區係由具有約15至30個胺基酸之稱為構架區(FR)之可變性較低(例如相對不變)的區段組成，該等區段藉由稱為「高變區」或替代地稱為「互補決定區(CDR)」之可變性較大(例如可變性極大)的較短區域分隔開。重鏈及輕鏈之可變區各自包含很大程度上採用β片組態之四個構架(FR1、FR2、FR3及FR4)，該等構架藉由三個高變區連接，從而形成連接β片結構之環且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之高變區藉由構架緊密保持在一起且與來自其他鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位之形成(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 美國國家衛生研究院公共衛生處(Public Health Service, National Institutes of Health), Bethesda, MD, (1991))。恆定區不直接涉及抗體與抗原之結合，但呈現多種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。可變區在不同抗體之間的序列方面廣泛不同。序列中之可變性集中於CDR中，而可變區中可變性較低之部分稱為構架區(FR)。輕鏈及重鏈之CDR主要負責抗體與其抗原之相互作用。在特定實施例中，可變區係人類可變區。
當在本文中使用時，術語「高變區」、「HVR」、「HV」、「互補決定區」或「CDR」係指在序列中高變及/或形成結構上定義之環的抗體可變區之區域。一般而言，抗體包含六個高變區：三個位於VH中(H1或VH CDR1、H2或VH CDR2，及H3或VH CDR3)，且三個位於VL中(L1或VL CDR1、L2或VL CDR2，及L3或VL CDR3)。本文中使用且涵蓋多種高變區描述。Kabat CDR係基於序列可變性且最常用(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版，公共衛生處，美國國家衛生研究院, Bethesda, MD. (1991))。Chothia實際上係指結構環之位置(參見例如Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。在使用Kabat編號規約進行編號時，Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變化，此視環之長度而定(此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B；若既不存在35A，亦不存在35B，則環末端位於32；若僅存在35A，則環末端位於33；若35A與35B均存在，則環末端位於34)。AbM高變區表示Kabat CDR與Chothia結構環之間的平衡，且由Oxford Molecular's AbM抗體模型化軟體使用(參見例如Martin, Antibody Engineering, 第2卷, 第3章, Springer Verlag)。「接觸」高變區係基於可用複合晶體結構之分析。來自此等高變區或CDR中之各者的殘基標示於下文中。
已開發且廣泛採用一種通用編號系統：ImMunoGeneTics (IMGT ®)資訊系統(Lafranc等人, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77 (2003))。IMGT為專用於人類及其他脊椎動物之免疫球蛋白(IG)、T細胞受體(TR)及主要組織相容複合體(MHC)的整合式資訊系統。本文中，依據胺基酸序列及輕鏈或重鏈內的位置提及CDR。由於免疫球蛋白可變域之結構內CDR之「位置」在物種之間保守且存在於稱為環之結構中，因此藉由使用根據結構特徵比對可變域序列之編號系統將易於鑑別CDR及構架殘基。此資訊可用於將來自一個物種之免疫球蛋白之CDR殘基移植及置換至通常來自人類抗體之受體架構中。Honegger及Plückthun, J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001)已開發出另一種編號系統(AHon)。編號系統(包括例如Kabat編號及IMGT獨特編號系統)之間的對應性已為熟習此項技術者熟知(參見例如Kabat，同上；Chothia及Lesk，同上；Martin，同上；Lefranc等人，同上)且亦說明於下文中。此項技術中已知或本文中所描述之各種系統表示界定CDR之不同方法，且當其用於界定相同抗體時，其通常被視為等效的。本文中展示之例示性系統組合Kabat及Chothia。來自此等高變區或CDR中之各者的殘基例示於下表中。 根據各種編號系統之例示性CDR
例示性 IMGT Kabat AbM Chothia Contact
V HCDR1 26-35 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V HCDR2 50-65 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V HCDR3 95-102 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V LCDR1 24-34 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V LCDR2 50-56 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V LCDR3 89-97 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
高變區可包含如下「延伸高變區」：VL中之24-36或24-34 (L1)、46-56或50-56 (L2)及89-97或89-96 (L3)，以及VH中之26-35或26-35A (H1)、50-65或49-65 (H2)及93-102、94-102或95-102 (H3)。如本文中所使用，術語「高變區」、「HVR」、「HV」、「互補決定區」及「CDR」可互換地使用。
如本文中可互換地使用，「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度的核苷酸之聚合物且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基，及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。產生本揭示案之結合分子的細胞可包括親代融合瘤細胞，以及已向其中引入編碼抗體之核酸的細菌及真核宿主細胞。除非另有規定，否則本文揭示之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。初生RNA轉錄物之5'至3'添加方向稱為轉錄方向；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物之5'端為5'之序列區域稱為「上游序列」；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物之3'端為3'之序列區域稱為「下游序列」。
術語「載體」係指用於運載或包括核酸序列(包括例如以將核酸序列引入宿主細胞中)之物質。適用之載體包括例如表現載體、質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體及人工染色體，其可包括可操作以穩定整合至宿主細胞染色體中之選擇序列或標記物。另外，載體可以包括一或多個可選標記基因及適當的表現控制序列。可包括之可選標記基因例如賦予針對抗生素或毒素、補體營養缺陷型缺乏之抗性，或供應培養基中不存在之關鍵營養。表現控制序列可包括此項技術中熟知之組成型及/或可誘導型啟動子、轉錄強化子、轉錄終止子及其類似物。當共表現兩個或更多個核酸分子(例如抗體重鏈及輕鏈或抗體VH及VL)時，可將兩個核酸分子插入例如單個表現載體或單獨的表現載體中。對於單一載體表現而言，編碼核酸可操作地連接至一個共同表現控制序列，或連接至不同表現控制序列，諸如一個誘導型啟動子及一個組成型啟動子。可使用此項技術中熟知之方法證實將核酸分子引入宿主細胞。此類方法包括例如核酸分析，諸如北方墨點法或聚合酶連鎖反應(PCR)擴增mRNA；或基因產物表現之免疫墨點法，或測試所引入之核酸序列或其相應基因產物之表現的其他適合分析方法。熟習此項技術者應瞭解，核酸分子以足以產生所需產物(例如，本文所述之可活化ROR結合劑)的量表現，且應進一步瞭解，可使用此項技術中熟知之方法使表現量最佳化以獲得充分表現。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)、歐洲藥典(European Pharmacopeia)或其他公認藥典中用於動物，且更特定言之人類。
「賦形劑」意謂醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或囊封材料。賦形劑包括例如囊封材料或添加劑，諸如吸收加速劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、包衣劑、著色劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增效劑、填充劑、調味劑、保濕劑、潤滑劑、香料、防腐劑、推進劑、釋放劑、滅菌劑、甜味劑、增溶劑、潤濕劑及其混合物。術語「賦形劑」亦可指稀釋劑、佐劑(例如費氏佐劑(Freunds' adjuvant) (完全或不完全)或媒劑。在一些實施例中，賦形劑為醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑之實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(例如低於約10個胺基酸殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™。醫藥學上可接受之賦形劑之其他實例描述於Remington及Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版 1990)中。在一個實施例中，各組分在以下意義上為「醫藥學上可接受的」：與醫藥調配物之其他成分相容且適合用於與人類及動物之組織或器官接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配。參見例如Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 第6版; Rowe等人編；The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009；Handbook of Pharmaceutical Additives, 第3版; Ash及Ash編; Gower Publishing Company: 2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 第2版; Gibson編; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑在採用之劑量及濃度下對暴露於其之細胞或哺乳動物無毒。在一些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑為水性pH緩衝溶液。在一些實施例中，賦形劑為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。靜脈內投與組合物(例如醫藥組合物)時，水為例示性賦形劑。亦可採用鹽水溶液及右旋糖與甘油水溶液作為液體賦形劑，尤其用於可注射溶液。賦形劑亦可包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊(chalk)、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇及其類似者。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，或pH緩衝劑。組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、持續釋放型調配物及其類似物之形式。口服組合物(包括調配物)可以包括標準賦形劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、鈉糖精、纖維素、碳酸鎂等。組合物(包括醫藥化合物)可含有預防或治療有效量之呈例如分離或純化形式之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，以及適合量之賦形劑，以便提供適於投與個體(例如患者)之形式。調配物應適合投與模式。
「有效量」通常為足以達成以下效果的量：降低症狀之嚴重程度及/或頻率、消除症狀及/或潛在病因、預防或延遲症狀及/或其潛在病因之發生、及/或改善或修復由疾病、病症或病況引起或與疾病、病症或病況相關之損傷。在一些實施例中，有效量為治療有效量或預防有效量。
如本文中所使用，術語「治療有效量」係指足以降低及/或改善給定疾病、病症或病況及/或與其相關之症狀的嚴重程度及/或持續時間之藥劑(例如，本文中所描述之抗體或本文中所描述之任何其他藥劑)的量。藥劑(包括治療劑)之治療有效量可為以下所需之量：(i)減慢、延遲或改善給定疾病、病症或病況之進展或進程；(ii)減少、延遲或改善給定疾病、病症或病況之復發、發展或發作；及/或(iii)改良或增強另一療法(例如，除投與本文中所描述之藥劑以外的療法)之預防或治療作用。本揭示案之物質/分子/藥劑(例如可活化ROR抗體)之「治療有效量」可根據諸如以下之因素而變化：個體之疾病病狀、年齡、性別及體重，以及物質/分子/藥劑在個體中引發所需反應之能力。治療有效量涵蓋其中該物質/分子/藥劑之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的量。在某些實施例中，術語「治療有效量」係指有效「治療」個體或哺乳動物之疾病、病症或病況之藥劑的量。
術語「治療」或其任何文法變化形式係指降低及/或改善給定疾病、病症或病況，及/或與其相關之症狀之嚴重程度及/或持續時間，諸如(i)減慢、延遲或改善給定疾病、病症或病況之進展或進程；(ii)減少、延遲或改善給定疾病、病症或病況之復發、發展或發作；及/或(iii)改良或增強另一療法(例如，除投與本文中所描述之藥劑以外的療法)之預防或治療作用。
「預防有效量」係當投與至個體時，將具有以下預期預防作用之醫藥組合物的量：例如，預防或延遲病症、疾病或病況之發作(或復發)，或降低疾病、病症或病況或相關症狀之發作(或復發)之可能性。
完全治療或預防作用在投與一次劑量時未必會發生，且可能僅在投與一系列劑量之後才發生。因此，治療或預防有效量可以一或多次投與來投與。
術語「約」及「大約」意謂在給定值或範圍的20%以內、15%以內、10%以內、9%以內、8%以內、7%以內、6%以內、5%以內、4%以內、3%以內、2%以內、1%以內或更低百分比內的變化。
如本文所用，本文所使用之比較性術語，諸如降低、減少、增加或其任何文法變化形式皆可指相對於參考值之某些變化。在一些實施例中，此類變化可指比參考值高約10%、或約20%、或約30%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約80%、或約90%、或約1倍、或約2倍、或約3倍、或約4倍、或約5倍、或約10倍、或約20倍、或約30倍、或約40倍、或約100倍或更高。在一些實施例中，此類變化可指參考值之約1%、或約2%、或約3%、或約4%、或約5%、或約6%、或約7%、或約8%、或約9%、或約10%、或約20%、或約30%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約80%、或約90%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%。
除非上下文另有明確規定，否則如本發明及申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數形式。
在一些實施例中，組分名稱中之術語「第一」、「第二」、「第三」、「第四」及類似術語係用於區分及鑑別超過一種在其名稱中共有某種一致性的組分。舉例而言，使用「第一抗體」與「第二抗體」區分兩種抗體。
應理解，當本文中用術語「包含」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似實施例。亦應理解，當在本文中用片語「基本上由……組成」描述實施例時，亦提供用術語「由……組成」描述之其他類似的實施例。
如在諸如「在A與B之間」或「在A-B之間」之片語中使用的術語「在……之間」係指包括A與B之範圍。
本文中如在諸如「A及/或B」之片語中所使用的術語「及/或」意欲包括A及B；A或B；A (單獨)；及B(單獨)。同樣，如在諸如「A、B及/或C」之片語中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
術語「視情況選用」或「視情況」意謂隨後描述之情況可能發生或可能不發生，因此本說明書包括該情況發生之情況及該情況不發生之情況。 5.3.     ROR結合劑
在一些實施例中，本揭示案提供可活化ROR結合劑。此類藥劑包括結合至ROR之可活化抗體(例如單特異性或多特異性，包括雙特異性)。例示性可活化抗體包括多株、單株、人源化、人類、雙特異性及異結合物抗體，以及其親和力或其他特性增加或降低之變異體。
在一些實施例中，本揭示案之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)係環境依賴性的(例如在某些環境中(諸如在富含蛋白酶之腫瘤微環境中)活化(僅能夠結合ROR))。在一些實施例中，本揭示案之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)提供了比更傳統的不可活化結合劑(例如抗體)更高的安全性(例如展示降低的毒性，不誘導許多器官重量之顯著改變，不改變肝組織病理學、血液學及/或血液生化等)。在一些實施例中，與更傳統的不可活化結合劑(例如抗體)相比，本揭示案之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)具有改善的藥物動力學特性(例如，具有更長的活體內半衰期)。
在一些實施例中，本文描述與ROR，包括ROR多肽、ROR多肽片段、ROR肽或ROR抗原決定基結合之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)。在一些實施例中，可活化ROR結合劑係與ROR，包括ROR多肽、ROR多肽片段、ROR肽或ROR抗原決定基結合之人類或人源化抗體(例如包含人類恆定區)。在一些實施例中，可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，諸如可活化人類ROR結合劑可與在哺乳動物(例如人類)細胞，包括表現ROR之腫瘤細胞之表面上表現之ROR結合。在一些實施例中，可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與暴露於細胞，諸如腫瘤細胞上之ROR細胞外抗原決定基結合。在一些實施例中，本文描述與ROR，諸如人類ROR或其一部分結合之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)。在一些實施例中，ROR係人類ROR。在一特定實施例中，ROR係ROR1。在另一特定實施例中，ROR係ROR2。在另一特定實施例中，ROR係ROR1及ROR2。在一些實施例中，可活化ROR結合劑係可活化人類ROR結合劑(例如與人類ROR結合之可活化抗體)。
在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)以≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM之解離常數(K D)與ROR (例如人類ROR)結合。量測結合親和力之多種方法係此項技術中已知的，其中任一者可用於本揭示案之目的，包括藉由RIA，例如使用所關注之抗體的Fab形式及其抗原所執行((Chen等人, 1999, J. Mol Biol 293:865-81)；藉由Octet® (使用例如Octet®Red96系統)或藉由Biacore® (使用例如Biacore®TM-2000或Biacore®TM-3000)進行生物層干涉術(BLI)或表面電漿子共振(SPR)分析。「締合速率(on-rate)」或「締合速率(rate of association)」或「締合速率(association rate)」或「kon」亦可使用上述相同生物層干涉術(BLI)或表面電漿子共振(SPR)技術，使用例如Octet ®Red96、Biacore ®TM-2000、Biacore ®TM-3000系統、Biacore ®TM-8K或Biacore ®TM-8K+系統測定。
在各種態樣中，本揭示亦關於結合至ROR (例如人類ROR)之可活化結合多肽(亦即，可活化抗體)，包括包含本文所述之抗ROR抗體、可活化抗ROR抗體之抗原結合片段及/或可活化抗ROR抗體之衍生物中之任一者的可活化抗體。在一些實施例中，本文所述之可活化抗ROR抗體可具有改良的安全概況。舉例而言，本文所述之可活化抗ROR抗體可具有較佳安全裕度，例如當呈無活性形式時，不結合至胰臟(例如人類胰島)，或當呈無活性形式時對胰臟(例如人類胰島)的結合比呈活性形式時弱。與胰臟(例如人類胰島)之結合可藉由任何適合方法量測，例如IHZ、免疫組織化學(IHC)或免疫螢光(IF)染色。
在一些實施例中，本揭示之可活化抗體包含：(a)掩蔽部分(MM)；(b)可裂解部分(CM)；以及(c)目標結合部分(TBM)。在一些實施例中，MM為本文所述之任一掩蔽部分。在一些實施例中，CM為本文所述之任一可裂解部分。在一些實施例中，TBM為本文所述之任一目標結合部分(例如目標結合部分(TBM)，其包含抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區，諸如本文所述之任一抗ROR抗體中的VH及/或VL)。在一些實施例中，當CM不裂解時，MM干擾及/或抑制可活化抗體與其目標(例如人類ROR)之結合。在一些實施例中，當CM裂解時，可活化抗體能夠與其目標(例如人類ROR)結合。
在一些實施例中，自N端至C端包含例如MM及CM之多肽在本文中稱為掩蔽肽。
在一些實施例中，可活化抗體包含：(a)多肽，其自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及目標結合部分(TBM)，其中MM為本文所述之任一掩蔽部分，CM為本文所述之任一可裂解部分，且其中TBM包含抗體輕鏈可變區(VL)；以及(b)抗體重鏈可變區(VH)。
在一些實施例中，可活化抗體包含：(a)多肽，其自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及目標結合部分(TBM)，其中MM為本文所述之任一掩蔽部分，CM為本文所述之任一可裂解部分且其中TBM包含抗體重鏈可變區(VH)；以及(b)抗體輕鏈可變區(VL)。
在一些實施例中，可活化抗體包含：多肽，其自N端至C端包含掩蔽部分(MM)、可裂解部分(CM)及目標結合部分(TBM)，其中MM為本文所述之任一掩蔽部分，CM為本文所述之任一可裂解部分且其中TBM包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)。
術語「可活化結合多肽」、「ABP」或「可活化抗體」包括多肽，該多肽包含目標結合部分(TBM)、可裂解部分(CM)及掩蔽部分(MM)。在一些實施例中，TBM包含與目標結合之胺基酸序列。在一些實施例中，TBM包含抗體或其抗體片段(例如本文所述之任一抗體或抗原結合片段)之抗原結合域(ABD)。在一些實施例中，抗原結合域包含有包含本文所述之重鏈可變區CDR中之一者、兩者或三者的重鏈可變區及包含本文所述之輕鏈可變區CDR中之一者、兩者或三者的輕鏈可變區(例如如 表 1中所示之重鏈可變區CDR序列中之一者、兩者或三者及/或輕鏈可變區CDR序列中之一者、兩者或三者，包括如 表 1中所示之任一例示性抗體的所有六個CDR)。在一些實施例中，抗原結合域包含有包含本文所述之任一重鏈可變區序列的重鏈可變區及包含本文所述之任一輕鏈可變區序列的輕鏈可變區(例如如 表 1中所示之重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列)。在一些實施例中，TBM (例如包含ABD)包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)，其中VH與VL形成在不存在MM之情況下結合至目標之結合域。在一些實施例中，VH與VL共價連接，例如在scFv中。在一些實施例中，VH與VL不共價連接。在一些實施例中，VH及VL形成Fab片段。在一些實施例中，VH連接至抗體重鏈恆定區，且VL連接至抗體輕鏈恆定區。
在一些實施例中，可活化抗體包含多肽，該多肽自N端至C端包含如下結構：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VL，且可活化抗體進一步包含有包含VH (例如Fab片段)之第二多肽。在一些實施例中，可活化抗體包含多肽，該多肽自N端至C端包含如下結構：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VL-VH (例如scFv)。在一些實施例中，可活化抗體包含多肽，該多肽自N端至C端包含如下結構：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VH，且可活化抗體進一步包含有包含VL (例如Fab片段)之第二多肽。在一些實施例中，可活化抗體包含多肽，該多肽自N端至C端包含如下結構：掩蔽部分(MM)-可裂解部分(CM)-VH-VL (例如scFv)。
CM一般包括可裂解(例如充當酶受質)之胺基酸序列，及/或能夠形成可還原二硫鍵之半胱胺酸-半胱胺酸對。因此，當術語「裂解(cleavage)」、「可裂解(cleavable)」、「裂解(cleaved)」及其類似術語結合CM使用時，該等術語涵蓋酶裂解，例如藉由蛋白酶(例如MMP9)裂解，以及經由二硫鍵還原將半胱胺酸-半胱胺酸對之間的二硫鍵破壞，該二硫鍵還原可起因於暴露於還原劑。
MM一般係指如下胺基酸序列：當可活化抗體之CM完整(例如未被相應酶裂解及/或含有未還原的半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵)時，MM干擾或抑制TBM與其目標之結合。在一些實施例中，MM如此高效地干擾或抑制TBM與其目標之結合，以致TBM與其目標之結合極低及/或低於偵測極限(例如在ELISA或流式細胞術分析中不能偵測結合)。CM之胺基酸序列可與MM重疊或包括於MM內。應注意，為方便起見，「ABP」或「可活化抗體」在本文中用於指處於未裂解(或「原生」)狀態以及處於裂解狀態之ABP或可活化抗體，此視上下文而定。對於一般技術者顯而易見的是，在一些實施例中，由於CM裂解(例如被蛋白酶裂解)，因此裂解之ABP可缺乏MM，引起至少MM釋放(例如其中共價鍵(例如半胱胺酸殘基之間的二硫鍵)不能使MM與ABP接合)。例示性ABP更詳細地描述於下文中。
在一些實施例中，掩蔽部分(MM)干擾、阻礙、減少能力、阻止、抑制或與目標結合部分競爭結合至其目標(例如「無活性的可活化抗體」)。在一些實施例中，僅當多肽尚未活化(例如尚未藉由pH變化(增加或降低)活化、藉由溫度偏移(增加或降低)活化、在與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸之後活化等)時，掩蔽部分(MM)干擾、阻礙、減少、阻止、抑制或與目標結合部分競爭結合至其目標。在一些實施例中，活化誘導多肽在裂解部分內裂解。在一些實施例中，活化誘導多肽發生構形變化(例如掩蔽部分(MM)之位移)，使得掩蔽部分不再阻止可活化抗體結合至其目標。在一些實施例中，僅當可裂解部分(CM)尚未被在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶裂解時，掩蔽部分(MM)干擾、阻礙、減少能力、阻止、抑制或與目標結合部分競爭結合至其目標。在一些實施例中，在活化之前，掩蔽部分(MM)之掩蔽效率為至少約2.0(例如至少約2.0、至少約3.0、至少約4.0、至少約5.0、至少約6.0、至少約7.0、至少約8.0、至少約9.0、至少約10、至少約25、至少約50、至少約75、至少約100、至少約150、至少約200、至少約300、至少約400、至少約500等)。在一些實施例中，掩蔽效率係按照包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)結合其目標之親和力相對於缺乏掩蔽部分之多肽結合其目標之親和力的差異(例如包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)對目標抗原(諸如ROR)之親和力相對於缺乏掩蔽部分(MM)之親本抗體的差異，或包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)對目標抗原(諸如ROR)之親和力相對於可活化抗體在活化之後對目標抗原之親和力的差異)來量測。在一些實施例中，掩蔽效率如下量測：將包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體(在活化之前)之結合的EC 50除以親本抗體的EC 50(例如藉由ELISA量測EC 50)。在一些實施例中，掩蔽效率係按照包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體在活化之前結合其目標之親和力相對於包含掩蔽部分(MM)之可活化抗體在活化之後結合其目標之親和力的差異(例如可活化抗體在活化之前對目標抗原(諸如ROR)之親和力相對於可活化抗體在活化之後之親和力的差異)來量測。在一些實施例中，掩蔽部分(MM)結合至目標結合部分(TBM)且阻止可活化抗體結合至其目標(例如「無活性」的可活化抗體)。在一些實施例中，掩蔽部分(MM)結合至目標結合部分(TBM)的解離常數大於目標結合部分(TBM)對其目標之解離常數。
在一些實施例中，在可活化抗體已活化(例如藉由在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理而活化、藉由pH變化(增加或減少)而活化、藉由溫度偏移(增加或減少)而活化、在與第二分子(諸如酶或蛋白質配位體)接觸之後而活化等)之後，掩蔽部分(MM)不干擾、阻礙、減少能力、阻止、抑制或與目標結合部分(TBM)競爭結合至其目標。在一些實施例中，在可裂解部分(CM)已藉由在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶裂解之後，掩蔽部分(MM)不干擾、阻礙、減少能力、阻止、抑制或與目標結合部分(TBM)競爭結合其目標。在一些實施例中，在活化之後，掩蔽部分(MM)的掩蔽效率為至多約1.75 (例如至多約1.75、至多約1.5、至多約1.4、至多約1.3、至多約1.2、至多約1.1、至多約1.0、至多約0.9、至多約0.8、至多約0.7、至多約0.6、或至多約0.5等) (例如相較於親本抗體之親和力，可活化抗體在活化之後的相對親和力)。
在一些實施例中，本揭示之可活化抗體具有環境依賴性(例如在某些情境下(諸如在富含蛋白酶之腫瘤微環境中)活化(僅能夠結合其目標))。在一些實施例中，本揭示之可活化抗體相對於更傳統的不可活化抗體提供改善之安全性(例如顯示減少的毒性，不誘導多種器官重量發生顯著的變化，不改變肝臟組織病理學、血液學及/或血液生物化學等)。在一些實施例中，本揭示之可活化抗體相較於更傳統的不可活化抗體具有改善之藥物動力學特性(例如具有更長的活體內半衰期)。
在一些實施例中，本揭示係關於當呈活性形式時結合至人類ROR的可活化抗體(例如在可裂解部分中裂解(例如用一或多種蛋白酶)之後具有活性、但在可裂解部分中裂解(例如用一或多種蛋白酶)之前無活性的可活化抗體)。本文亦提供一或多種可活化抗體，該等抗體與本文所述之靶向ROR之可活化抗體及/或抗ROR抗體中之一或多者競爭或交叉競爭結合至人類ROR。
在一些實施例中，可活化抗體當呈無活性形式時，以約500 nM或更大之K D結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或犬ROR。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約500 nM或更小之K D結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或犬ROR (例如約500 nM或更小、約450 nM或更小、約400 nM或更小、約350 nM或更小、約300 nM或更小、約250 nM或更小、約200 nM或更小、約150 nM或更小、約100 nM或更小、約90 nM或更小、約80 nM或更小、約70 nM或更小、約60 nM或更小、約50 nM或更小、約40 nM或更小、約30 nM或更小、約25 nM或更小、約20 nM或更小、約10 nM或更小、約9 nM或更小、約8 nM或更小、約7 nM或更小、約6 nM或更小、約5 nM或更小、約4 nM或更小、約3 nM或更小、約2 nM或更小、約1 nM或更小、約0.5 nM或更小、約0.1 nM或更小，等)。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約10 nM或更小之K D結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或犬ROR。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約5 nM或更小之K D結合至人類ROR。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約2 nM或更小之K D結合至人類、食蟹獼猴、小鼠、大鼠及/或犬ROR。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約1 nM或更小之K D結合至人類ROR。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約2 nM或更小 (例如約1.5 nM或更小、約1.2 nM或更小、或約1.1 nM或更小)之K D結合至人類及食蟹獼猴ROR1 IgG樣域。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約2 nM或更小(例如約1.5 nM或更小、約1.2 nM或更小、約1.1 nM或更小、約1.0 nM或更小、約0.9 nM或更小、或約0.8 nM或更小)之K D結合至人類及食蟹獼猴ROR2 IgG樣域。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約2 nM或更小(例如約1.5 nM或更小、約1.2 nM或更小、約1.1 nM或更小、約1.0 nM或更小、約0.9 nM或更小、或約0.8 nM或更小)之K D結合至小鼠ROR1 IgG樣域。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約100 nM或更小(例如約90 nM或更小、約80 nM或更小、約70 nM或更小、約60 nM或更小、約50 nM或更小、或約40 nM或更小)之K D結合至小鼠ROR2 IgG樣域。在一些實施例中，可活化抗體當呈活性形式時，以約2 nM或更小(例如約1.5 nM或更小、約1.2 nM或更小、約1.1 nM或更小、約1.0 nM或更小、約0.9 nM或更小、或約0.8 nM或更小)之K D結合至大鼠ROR1 IgG樣域。量測可活化抗體之K D的方法可使用此項技術中已知之任何方法進行，包括例如表面電漿子共振、ELISA、等溫調定量熱法、過濾結合分析、EMSA等。在一些實施例中，K D係藉由ELISA量測。在一些實施例中，K D係藉由生物層干涉術(BLI)量測。在其他實施例中，K D係藉由表面電漿子共振(SPR)量測(參見例如以下實例3)。
在一些實施例中，在活體內投與之後，可活化抗體以其無活性形式在循環中保持完整約24小時、48小時或96小時。
在一些實施例中，可活化抗體能夠抑制腫瘤細胞生長及/或增殖。在一些實施例中，相對於與可活化抗體不接觸的對應腫瘤細胞(或相對於與同型對照抗體接觸的對應腫瘤細胞)，當與可活化抗體接觸時，腫瘤細胞生長及/或增殖被抑制至少約5% (例如至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約99%)。在一些實施例中，當向個體投與可活化抗體時，可活化抗體能夠減小個體之腫瘤體積。在一些實施例中，相對於個體之初始腫瘤體積(例如在投與可活化抗體之前；相較於同型對照抗體所投與之個體的對應腫瘤)，可活化抗體能夠將個體的腫瘤體積減小至少約5% (例如至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約99%)。監測腫瘤細胞生長/增殖、腫瘤體積及/或腫瘤抑制之方法在此項技術中已知。
在一些實施例中，可活化抗體對癌症具有治療功效。在一些實施例中，可活化抗體減輕癌症之一或多種徵象或症狀。在一些實施例中，當投與可活化抗體時，罹患癌症之個體出現部分或完全緩解。
掩蔽部分(MM)
在一些實施例中，本揭示係關於包含掩蔽部分(MM)的可活化抗體。在一些實施例中，掩蔽部分(MM)包含根據式(I)：X mCX nCX o(SEQ ID NO: 45)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，其中各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。在一些實施例中，X不為W、M及/或C。在一些實施例中，式(I)之X m中之各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H及P，及/或式(I)之X n中之各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H及P。在一些實施例中，MM包含由根據式(II)：(NNK) mTGY(NNK) nTGY(NNK) o(SEQ ID NO:46)之聚核苷酸序列編碼的多肽，其中各N獨立地為A、G、T或C，其中各K獨立地為T或G，且其中各Y獨立地為T或C。在一些實施例中，m為2，n為8且o為2。在一些實施例中，m為6，n為8且o為2。
在一些實施例中，掩蔽部分(MM)包含根據式(III)：Z mCZ nCZ o(SEQ ID NO: 47)之胺基酸序列，其中m為2至10，n為3至10，且o為1至10，且各Z獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H及P。在一些實施例中，m為6，n為8且o為2。
在一些實施例中，m為2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10。在一些實施例中，m為6-8。在一些實施例中，m為3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，m為6。
在一些實施例中，n為3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10。在一些實施例中，n為6-8。在一些實施例中，n為3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，n為6。在一些實施例中，n為8。
在一些實施例中，o為1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、8-9或9-10。在一些實施例中，o為1-2。在一些實施例中，o為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，o為2。
在一些實施例中，掩蔽部分(MM)包含根據式(IV)：(X 6)C(X 8)C(X 2) (SEQ ID NO: 48)之胺基酸序列，其中各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一些實施例中，掩蔽部分(MM)包含根據式(V)：(Z 6)C(Z 8)C(Z 2) (SEQ ID NO: 49)之胺基酸序列，其中各Z獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H及P。
在一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)，該掩蔽部分包含選自由以下組成之群的序列：X mCYYFDPPSHCXX (SEQ ID NO: 50)、X mC PFFFPAALCXX (SEQ ID NO: 51)及X mCHFADFVPYCXX (SEQ ID NO: 52)，其中m為2至10，且其中各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。
在一些實施例中，可活化抗體包含掩蔽部分(MM)，該掩蔽部分包含序列ADCPFFFPAALCSQ (SEQ ID NO: 73)、EVGSYADCPFFFPAALCSQ (SEQ ID NO: 53)、HDHHFDCYYFDPPSHCPA (SEQ ID NO: 54)、EVGSYHDHHFDCYYFDPPSHCPA (SEQ ID NO: 55)、ADPFSVCHFADFVPYCYY (SEQ ID NO: 56)或EVGSYADPFSVCHFADFVPYCYY (SEQ ID NO: 57)。
在一些實施例中，掩蔽部分(MM)包含選自以下之胺基酸序列：ADCPFFFPAALCSQ (SEQ ID NO: 73)、EVGSYADCPFFFPAALCSQ (SEQ ID NO: 53)、HDHHFDCYYFDPPSHCPA (SEQ ID NO: 54)、EVGSYHDHHFDCYYFDPPSHCPA (SEQ ID NO: 55)、ADPFSVCHFADFVPYCYY (SEQ ID NO: 56)或EVGSYADPFSVCHFADFVPYCYY (SEQ ID NO: 57)。
在一些實施例中，本文所述之任一掩蔽部分(MM)可進一步包含一或多個額外胺基酸序列(例如一或多個多肽標籤)。適合之額外胺基酸序列之實例可包括但不限於純化標籤(諸如his標籤、flag標籤、麥芽糖結合蛋白及麩胱甘肽-S-轉移酶標籤)、偵測標籤(諸如可以光度測定法偵測的標籤(例如紅色或綠色螢光蛋白等))、具有可偵測之酶活性的標籤(例如鹼性磷酸酶等)、含有分泌序列、前導序列及/或穩定化序列的標籤、蛋白酶裂解位點(例如弗林蛋白酶裂解位點、TEV裂解位點、凝血酶裂解位點)及其類似物。在一些實施例中，一或多個額外胺基酸序列位於掩蔽部分(MM)之N端。在一些實施例中，額外胺基酸序列包含或由序列EVGSY (SEQ ID NO: 58)組成。
在一些實施例中，掩蔽部分在活化之前結合至目標結合部分(TBM)且抑制可活化抗體結合至其目標(例如在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理之前、在經歷pH (局部)變化(增加或降低)之前、在溫度偏移(增加或降低)之前、在與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸之前，等)，但在活化之後不結合至TBM及/或不抑制可活化抗體結合至其目標(例如在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理之後、在經歷pH (局部)變化(增加或降低)之後、在溫度偏移(增加或降低)之後、在與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸之後，等)。在一些實施例中，當CM未裂解時，掩蔽部分(MM)抑制可活化抗體結合至其目標，但當CM裂解時，掩蔽部分(MM)不抑制可活化抗體結合至其目標。在一些實施例中，掩蔽部分(MM)結合至TBM之解離常數比可活化抗體(當呈活性形式時)針對其目標之解離常數大(例如大至少約1.5倍、大至少約2倍、大至少約2.5倍、大至少約3倍、大至少約3.5倍、大至少約4倍、大至少約4.5倍、大至少約5倍、大至少約10倍、大至少約100倍、大至少約500倍等)。
可裂解部分(CM)
在一些實施例中，本揭示案係關於包含可裂解部分(CM)之可活化抗體。在一些實施例中，藉由在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理、藉由pH變化(增加或降低)、藉由溫度偏移(增加或降低)及/或藉由與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸等而將可裂解部分(CM)裂解及/或破壞。
在一些實施例中，可裂解部分(CM)包含至少第一裂解位點(CS1) (例如第一蛋白酶裂解位點)。在一些實施例中，第一裂解位點為第一蛋白酶裂解位點。可使用由此項技術中已知之任何蛋白酶(例如，已知與包含CM之可活化抗體之靶標共定位的蛋白酶)識別及/或裂解之任何適合之蛋白酶裂解位點，包括例如由以下各者識別及/或裂解之蛋白酶切割位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化劑(uPA)；基質金屬蛋白酶(例如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26及/或MMP-27)；菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶；纖維蛋白溶酶；凝血酶；PSA；PSMA；ADAM/ADAMT (例如ADAM 8、ADAM 9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4及/或ADAMTS5)；凋亡蛋白酶(例如凋亡蛋白酶-1、凋亡蛋白酶-2、凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-4、凋亡蛋白酶-5、凋亡蛋白酶-6、凋亡蛋白酶-7、凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-9、凋亡蛋白酶-10、凋亡蛋白酶-11、凋亡蛋白酶-12、凋亡蛋白酶-13及/或凋亡蛋白酶-14)；天冬胺酸蛋白酶(例如RACE及/或腎素)；天冬胺酸組織蛋白酶(例如組織蛋白酶D及/或組織蛋白酶E)；半胱胺酸組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2及/或組織蛋白酶X/Z/P)；半胱胺酸蛋白酶(例如克魯茲蛋白酶(Cruzipain)、豆莢蛋白及/或泛素特異性蛋白酶-2)；KLK (例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13及/或KLK14)；金屬蛋白酶(例如穿膜肽酶、腦啡肽酶、PSMA及/或BMP-1)；絲胺酸蛋白酶(例如活化蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、糜蛋白酶及/或凝血因子蛋白酶(諸如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa))；彈性蛋白酶；顆粒酶B；胍基苯甲酸蛋白酶；HtrA1;人類嗜中性球彈性蛋白酶；乳鐵傳遞蛋白；通道活化蛋白酶；NS3/4A；PACE4；tPA；類胰蛋白酶；II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP) (例如DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶、基質蛋白酶-2、MT-SP1/基質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3及/或TMPRSS4)；等。在一些實施例中，第一蛋白酶裂解位點為選自以下各者之蛋白酶的裂解位點：uPA、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、TEV蛋白酶、纖維蛋白溶酶、凝血酶、因子X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、凋亡蛋白酶-1、凋亡蛋白酶-2、凋亡蛋白酶-3、凋亡蛋白酶-4、凋亡蛋白酶-5、凋亡蛋白酶-6、凋亡蛋白酶-7、凋亡蛋白酶-8、凋亡蛋白酶-9、凋亡蛋白酶-10、凋亡蛋白酶-11、凋亡蛋白酶-12、凋亡蛋白酶-13、凋亡蛋白酶-14及TACE。在一些實施例中，第一蛋白酶裂解位點為選自uPA、MMP-2、MMP-9及/或TEV蛋白酶之蛋白酶的裂解位點。在一些實施例中，蛋白酶裂解包含選自SGRSA (SEQ ID NO: 59)、PLGLAG (SEQ ID NO: 44)及ENLYFQG (SEQ ID NO: 60)之胺基酸序列。
在一些實施例中，可裂解部分(CM)進一步包含第一連接子(L1)。在一些實施例中，第一連接子(L1)位於第一裂解位點(CS1)(例如第一蛋白酶裂解位點)之N端。在一些實施例中，可裂解部分(CM)自N端至C端包含如下結構：L1-(CS1)。
可使用此項技術中已知之任何適合連接子(例如可撓性連接子)，包括例如：甘胺酸聚合物(G) n，其中n為至少1之整數(例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)；甘胺酸-絲胺酸聚合物(GS) n，其中n為至少1之整數(例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)，諸如GGGGS (SEQ ID NO: 61)、SGGS (SEQ ID NO: 62)、GGSG (SEQ ID NO: 63)、GGSGG  (SEQ ID NO: 64)、GSGSG (SEQ ID NO: 65)、GSGGG (SEQ ID NO: 66)、GGGSG (SEQ ID NO: 67)及/或GSSSG (SEQ ID NO: 68))；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；及其類似物。連接序列可具有任何長度，諸如約1個胺基酸(例如甘胺酸或絲胺酸)至約20個胺基酸(例如20個胺基酸甘胺酸聚合物或甘胺酸-絲胺酸聚合物)、約1個胺基酸至約15個胺基酸、約3個胺基酸至約12個胺基酸、約4個胺基酸至約10個胺基酸、約5個胺基酸至約9個胺基酸、約6個胺基酸至約8個胺基酸等。在一些實施例中，連接子之長度為約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個胺基酸中之任一者。
在一些實施例中，可裂解部分(CM)進一步包含至少第二連接子(例如至少第二、至少第三、至少第四、至少第五連接子等)。在一些實施例中，可裂解部分(CM)進一步包含第二連接子(L2)。第二連接子(L2)可為上文所述之任何適合之連接子。在一些實施例中，第一連接子(L1)與第二連接子(L2)相同。在一些實施例中，第一連接子(L1)與第二連接子(L2)不同。在一些實施例中，至少第二連接子(L2)位於第二裂解位點(CS1)之C端。在一些實施例中，可裂解部分(CM)自N端至C端包含如下結構：L1-(CS1)-L2。在其他實施例中，CM包含GGGPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 69)。
例示性MM-CM序列
在一些實施例中，本揭示案之可活化抗體自N端至C端包含掩蔽肽：(MM)-L1-(CS1)-L2。在一些實施例中，本揭示之多肽自N端至C端包含如下結構：(MM)-L1-(CS1)-L2-(TBM)。
在一些實施例中，可活化抗體包含根據式(VI)：EVGSY(X 2)C(X 8)C(X 2) GGGPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 70)之胺基酸序列，其中各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。在其他實施例中，掩蔽肽包含EVGSYADCPFFFPAALCSQGGG PLGLAGSGGS (SEQ ID NO:29)。
在一些實施例中，可活化抗體包含根據式(VII)之胺基酸序列：EVGSY(X 6)C(X 8)C(X 2) GGGPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 71)，其中各X獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y。在一些實施例中，可活化抗體包含根據式(VIII)：EVGSY(Z 6)C(Z 8)C(Z 2)GGGPLGLAGSGGS (SEQ ID NO: 72)之胺基酸序列，其中各Z獨立地為選自由以下組成之群的胺基酸：D、A、Y、S、T、N、I、L、F、V、H及P。在其他實施例中，掩蔽肽包含EVGSYHDHHFDCYYFDPPSHCPAGGG PLGLAGSGGS (SEQ ID NO:30)。在其他實施例中，掩蔽肽包含EVGSYADPFSVCHFADFVPYCYYGGG PLGLAGSGGS (SEQ ID NO:31)。
在一些實施例中，本揭示案之可活化結合多肽(亦即，可活化抗體)包含：(a)掩蔽部分(MM)；(b)可裂解部分；及(c)目標結合部分。在一些實施例中，相較於缺乏掩蔽部分之對應結合多肽與ROR (例如人類ROR)之結合及/或相較於親本抗體與ROR (例如人類ROR)之結合，掩蔽部分(MM)結合至可活化抗體之目標結合部分(TBM)且減少或抑制可活化結合部分與ROR (例如人類ROR)之結合。
在一些實施例中，「可活化」結合多肽係指如下之結合多肽：當處於經抑制、經掩蔽及/或未裂解之狀態下時展現與ROR之第一結合水平，且在未抑制、未掩蔽及/或經裂解之狀態下展現與ROR之第二結合水平，其中第二ROR結合水平大於第一ROR結合水平。在一些實施例中，在可裂解部分內裂解(例如藉由一或多種蛋白酶)之後，可活化結合多肽對ROR之近接更大。
在一些實施例中，當相比於可活化抗體活化之前，在可活化抗體活化之後(例如，在藉由用在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理進行活化之後、在藉由pH變化(增加或減少)進行活化之後、在藉由溫度轉變(增加或減少)進行活化之後、在藉由與第二分子(諸如小分子)接觸進行活化之後等)，多肽與ROR (例如人類ROR)之結合親和力增加至少約2倍(例如至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1000倍或更多倍)時，一般認為本揭示案之可活化抗體係「可活化」結合多肽。在一些實施例中，若在「活化」之後，可活化抗體之EC 50降低至少約2倍(例如至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍、或至少約1000倍、或更大) (例如藉由ELISA或FACS分析所量測；參見下文實例)，則一般認為本揭示之可活化抗體為「可活化的」。在一些實施例中，若在可裂解部分(CM)內裂解之蛋白酶處理之後，多肽之EC 50降低至少約2倍，則一般認為本揭示之可活化抗體為「可活化的」。
在一些實施例中，當掩蔽部分(MM)結合至可活化抗體之目標結合部分(TBM)時，可活化抗體對ROR之K D比掩蔽部分(MM)不結合至目標結合部分(TBM)時(例如在可活化抗體「活化」之後(諸如蛋白酶處理之後以便在可裂解部分(CM)內裂解))及/或親本抗體對ROR之K D高約2倍(例如約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750、或約1000倍或更大)。
在一些實施例中，當掩蔽部分結合至可活化抗體之目標結合部分時，可活化抗體對ROR之K D相對於當掩蔽部分不結合至目標結合部分時(例如在可活化抗體「活化」之後(諸如在蛋白酶處理之後以便在可裂解部分(CM)內裂解))及/或相對於親本抗體對ROR之K D降低至少約25% (例如至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%)。
在一些實施例中，掩蔽部分在空間上阻礙可活化抗體與ROR之結合及/或以異位方式阻礙可活化抗體與ROR之結合。在一些實施例中，掩蔽部分不包含可活化抗體及/或親本抗體之天然結合搭配物之胺基酸序列。
在一些實施例中，掩蔽部分對目標結合部分之解離常數大於可活化抗體對ROR之解離常數(當活化時)。在一些實施例中，掩蔽部分對目標結合部分之解離常數比可活化抗體對ROR之解離常數(當活化時)高約2倍(例如約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750、或約1000倍或更大)。在一些實施例中，掩蔽部分對目標結合部分之解離常數約等於可活化抗體對ROR之解離常數(當活化時)。
在各種態樣中，本文提供可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，其包含：掩蔽肽、抗體輕鏈可變(VL)區及抗體重鏈可變(VH)區；其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中該抗體輕鏈可變區及該抗體重鏈可變區如本文所述(例如，包含本文所述之CDR (例如 表 1))。
在各種態樣中，本文提供可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，其包含：(a)包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中該抗體輕鏈可變區及該抗體重鏈可變區如本文所述(例如，包含本文所述之CDR (例如 表 1))。
在各種態樣中，本文提供可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，其包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中該抗體輕鏈可變區及該抗體重鏈可變區如本文所述(例如，包含本文所述之CDR (例如 表 1))。
在某些實施例中，本文所描述之可活化ROR結合劑包含兩個抗體輕鏈可變區，且掩蔽肽直接或間接與各抗體輕鏈可變區結合(例如，與各抗體輕鏈可變區之N端結合)。在某些實施例中，本文所描述之可活化ROR結合劑包含多於兩個抗體輕鏈可變區，且掩蔽肽直接或間接與各抗體輕鏈可變區結合(例如，與各抗體輕鏈可變區之N端結合)。在某些實施例中，本文所描述之可活化ROR結合劑包括兩個抗體輕鏈可變區，且掩蔽肽直接或間接地與抗體輕鏈可變區中之僅一者結合(例如，與其N端結合)。在某些實施例中，本文所描述之可活化ROR結合劑包含多於兩個抗體輕鏈可變區，且掩蔽肽直接或間接地與抗體輕鏈可變區中之僅一者綴合(例如，與其N端結合)。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：掩蔽肽、抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區；其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：掩蔽肽、抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區；其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：掩蔽肽、抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區；其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈可變區之多肽；及(b)抗體重鏈可變區；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈之多肽；及(b)抗體重鏈；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈之多肽；及(b)抗體重鏈；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
在一個實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)自N端至C端包含掩蔽肽及抗體輕鏈之多肽；及(b)抗體重鏈；其中掩蔽肽包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。
在較佳實施例中，本文所述之掩蔽肽自N端至C端包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，且視情況進一步包含一個、兩個或更多個連接子。
CM一般包括可裂解(例如充當酶受質)之胺基酸序列，及/或能夠形成可還原二硫鍵之半胱胺酸-半胱胺酸對。因此，當術語「裂解(cleavage)」、「可裂解(cleavable)」、「裂解(cleaved)」及其類似術語結合CM使用時，該等術語涵蓋酶裂解，例如藉由蛋白酶裂解，以及經由二硫鍵還原將半胱胺酸-半胱胺酸對之間的二硫鍵破壞，該二硫鍵還原可起因於暴露於還原劑。
MM係指如下胺基酸序列：當可活化抗體之CM完整(例如未被相應酶裂解及/或含有未還原的半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵)時，MM干擾或抑制抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視具體情況而定)與其目標之結合。在一些實施例中，MM如此高效地干擾或抑制抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視具體情況而定)與其目標之結合，以致抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視具體情況而定)與其目標之結合極低及/或低於偵測極限(例如在ELISA或流式細胞術分析中無法偵測到結合)。CM之胺基酸序列可與MM重疊或包括於MM內。
在一些實施例中，掩蔽部分在空間上阻礙可活化結合劑與其目標之結合及/或以異位方式阻礙可活化結合劑與其目標之結合。在一些實施例中，掩蔽部分不包含可活化結合劑之天然結合搭配物之胺基酸序列。
在一些實施例中，當相比於結合劑活化之前，在結合劑活化之後(例如，在藉由用在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理進行活化之後、在藉由pH變化(增加或減少)進行活化之後、在藉由溫度轉變(增加或減少)進行活化之後、在藉由與第二分子(諸如小分子)接觸進行活化之後等)，試劑與其目標之結合親和力增加(例如至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1000倍或更多倍)時，一般認為本揭示案之結合劑係「可活化」結合劑。在一些實施例中，若在「活化」之後，結合劑之EC 50降低(例如降低至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約6.5倍、至少約7倍、至少約7.5倍、至少約8倍、至少約8.5倍、至少約9倍、至少約9.5倍、至少約10倍、至少約25倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約250倍、至少約500倍、至少約750倍、或至少約1000倍或更大)(例如藉由ELISA或FACS分析所量測)，則一般認為本揭示案之結合劑為「可活化的」。在一些實施例中，若在用在可裂解部分內裂解之蛋白酶處理後，結合劑之EC 50降低(例如，降低至少約2倍) (例如藉由ELISA或FACS分析所量測)，則一般認為本揭示案之結合劑係「可活化的」。
在一些實施例中，當掩蔽部分與可活化結合劑之抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視情況而定)結合時，相比於掩蔽部分不與抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視情況而定)結合時(例如，在可活化結合劑「活化」之後(諸如在蛋白酶處理以在可裂解部分內裂解之後))及/或相比於親本抗體對目標之K D，可活化結合劑對其目標之K D更大(例如，大約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750或約1000倍或更多倍)。量測親和力之方法係此項技術中已知的。
在一些實施例中，當掩蔽部分與可活化結合劑之抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視情況而定)結合時，相對於掩蔽部分不與抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視情況而定)結合時(例如，在可活化結合劑「活化」之後(諸如在蛋白酶處理以在可裂解部分內裂解之後))及/或相對於親本抗體對目標之K D，該可活化結合劑對其目標之K D降低(例如，降低至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%)。量測親和力之方法係此項技術中已知。
在一些實施例中，相比於可活化結合劑對目標(當呈活化形式時)之解離常數，抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視情況而定)之掩蔽部分之解離常數更大(例如，大於約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10、約25、約50、約75、約100、約250、約500、約750或約1000倍或更多倍)。在一些實施例中，抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區之掩蔽部分之解離常數(視情況而定)約等於可活化結合劑對目標(當呈活化形式時)之解離常數。在一些實施例中，掩蔽部分與抗體輕鏈可變區及/或重鏈可變區(視情況而定)結合，且僅當可活化結合劑未經活化(例如，未經過在可裂解部分(CM)內裂解之一或多種蛋白酶處理進行活化、未藉由pH變化(增加或減少)進行活化、未藉由溫度偏移(增加或減少)活化、未在與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸後活化等)時，防止可活化結合劑與其目標之結合。在一些實施例中，活化作用會誘導裂解部分內之可活化結合劑之裂解。在一些實施例中，活化作用會誘導可活化結合劑發生構形變化(例如掩蔽部分之位移)，使得掩蔽部分不再阻止結合劑結合至其目標。
在一些實施例中，本文所描述之可活化ROR結合劑(例如，可活化抗體)包含本文所描述之抗體中之任一者之VH區、VL區、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3，諸如 表 1中所描繪之VH區、VL區、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3之胺基酸序列。因此，在一些實施例中，本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含 表 1中所描繪之任一個、任兩個及/或所有三個重鏈CDR及/或任一個、任兩個及/或所有三個輕鏈CDR。在一些實施例中，本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含 表 1中所描繪之任一個、任兩個及/或所有三個重鏈CDR及任一個、任兩個及/或所有三個輕鏈CDR。
在一些實施例中，可活化ROR結合劑(例如可活化ROR抗體)包含本文所述之任一結合劑之VH區及/或VL區，該VH區包含VH CDR1、VH CDR2及/或VH CDR3，該VL區包含VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3(參見例如 表 1)。因此，在一些實施例中，本文所描述之可活化ROR抗體(例如可活化抗體)包含來自 表 1之任一個、任兩個及/或所有三個重鏈CDR及/或任一個、任兩個及/或所有三個輕鏈CDR。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(i)如包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列之VH中所闡述之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及/或(ii)如包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之VL中所闡述之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含如包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列之VH中所闡述之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，以及如包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之VL中所闡述之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。可根據熟知編號系統或其組合來確定CDR序列。在一些實施例中，CDR係根據IMGT編號。在一些實施例中，CDR係根據Kabat編號。在一些實施例中，CDR係根據AbM編號。在其他實施例中，CDR係根據Chothia編號。在其他實施例中，CDR係根據接觸編號。在一些實施例中，CDR序列係根據上文所提及之編號系統中之任兩者或更多者之組合，例如Kabat與Chothia之組合來確定。各種例示性CDR編號系統在上文章節5.2中描述及說明。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：(a)VH區，其包含具有選自由SEQ ID NO: 1、7、12、13、18及27組成之群的胺基酸序列之VH CDR1；具有選自由SEQ ID NO: 2、8、14、19及24組成之群的胺基酸序列之VH CDR2；以及具有選自由SEQ ID NO: 3、9、15、20及28組成之群的胺基酸序列之VH CDR3；及/或(b) VL區，其包含具有選自由SEQ ID NO: 4、10、16及21組成之群的胺基酸序列之VL CDR1；具有選自由SEQ ID NO: 5、11及22組成之群的胺基酸序列之VL CDR2；及具有選自由SEQ ID NO: 6、17及23組成之群的胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含：VH區，其包含有包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之VH CDR2及包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之VH CDR3；以及VL區，其包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列之VL CDR2及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，可活化抗體進一步包含SEQ ID NO: 25及/或26之一或多個構架區。在一些實施例中，可活化抗體或其片段進一步包含SEQ ID NO: 25或26中所闡述之構架1 (FR1)、構架2 (FR2)、構架3 (FR3)及/或構架4 (FR4)序列。在一些實施例中，本文所提供之可活化抗體為人源化抗體。基於CDR編號系統之邊界來確定本文所述之構架區。換言之，若CDR係藉由例如Kabat、IMGT或Chothia測定，則構架區為可變區中之CDR周圍的胺基酸殘基，其自N端至C端呈以下型式：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。舉例而言，FR1定義為在CDR1胺基酸殘基之N端的胺基酸殘基，如由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義，FR2定義為在CDR1與CDR2胺基酸殘基之間的胺基酸殘基，如由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義，FR3定義為在CDR2與CDR3胺基酸殘基之間的胺基酸殘基，如由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義，且FR4定義為在CDR3胺基酸殘基之C端的胺基酸殘基，如由例如Kabat編號系統、IMGT編號系統或Chothia編號系統所定義。
在一些實施例中，本文所描述之包括可活化人類ROR結合劑之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，諸如單特異性或雙特異性抗體)包含VH區或VH域。另外或替代地，在一些實施例中，本文所描述之包括可活化人類ROR結合劑之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，諸如單特異性或雙特異性抗體)包含多肽，其自N端至C端包含本文所描述之掩蔽肽(例如 表 2)及VL區或VL域。在一些實施例中，本文所描述之包括可活化人類ROR結合劑之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，如單特異性或雙特異性抗體)具有以下之組合：(i)VH域或VH區；以及(ii)多肽，其自N端至C端包含本文所描述之掩蔽肽(例如 表 2)及VL域或VL區。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，其自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29、30或31之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29、30或31之掩蔽肽及包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之VL。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，其自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，其自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，其自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列。在一些實施例中，本文提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH及多肽，該多肽自N端至C端包含有包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之掩蔽肽及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL，其中多肽包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列。
在某些實施例中，相對於本文提供之任何抗體或其片段，例如 表 1中之CDR、VH或VL，或如本文所揭示之任何全長抗體鏈(例如 表 3 - 表 6中描繪之胺基酸序列)，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體或其片段)包含具有某一百分比一致性(諸如至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%、或至少約86%、或至少約87%、或至少約88%、或至少約89%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%或更高)之胺基酸序列。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體或其片段)包含本文所提供之任何抗體或其片段之CDR，例如在 表 1中。在其他實施例中，相對於本文提供之任何抗體或其片段，例如 表 1中之VH或VL，或如本文所揭示之任何全長抗體鏈(例如 表 3 - 表 6中描繪之胺基酸序列)，本文所提供之可活化ROR結合劑包含具有某一百分比一致性(諸如至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%、或至少約86%、或至少約87%、或至少約88%、或至少約89%、或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%或更高)之胺基酸序列。
測定兩個序列(例如胺基酸序列或核酸序列)之間的百分比一致性可使用數學算法來實現。用於比較兩個序列之數學演算法的非限制性實例為Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268 (1990)之演算法，如Karlin及Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877 (1993)中所修改。將此類演算法併入Altschul等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403之NBLAST及XBLAST程式中。可利用NBLAST核苷酸程式參數集(例如分數=100，字長=12)進行BLAST核苷酸搜尋，以獲得與本文所描述之核酸分子同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程式參數集(例如分數為50，字長=3)進行BLAST蛋白質搜尋，以獲得與本文所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為使空位比對達成比較目的，可如Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25:3389 3402 (1997)中所述使用空位BLAST。在一些實施例中，兩個序列之間的一致性百分比係藉由用在比對之兩個序列之間變化的殘基數目(排除或包括保守性胺基酸取代或簡併性核苷酸取代)除以以下中之任一者之殘基數目來計算：(i)較短序列之全長，(ii)較長序列之全長，(iii)兩個序列之平均長度，(iv)比對之無空位部分的總長度，(v)不包括突出端之比對的長度，或(vi)包括突出端之比對的長度。如本文中所使用，關於序列比對之突出端係指比對之任一端或兩端，該比對中一個序列之殘基被視為經比對在另一序列中無殘基(例如，空位)。或者，PSI BLAST可用於進行迭代搜尋，其偵測分子間之遠距離關係(同上)。當利用BLAST、空位BLAST及PSI Blast程式時，可使用相應方案(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數(參見例如全球資訊網上之國家生物技術資訊中心(NCBI)，ncbi.nlm.nih.gov)。用於序列比較之數學演算法的另一個非限制實例為Myers及Miller, CABIOS 4:11-17 (1998)之演算法。將此類演算法併入於ALIGN程式(2.0版)中，該ALIGN程式為GCG序列比對軟體套件之一部分。當利用ALIGN程式來比較胺基酸序列時，可使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4。兩個序列之間的一致性百分比可在允許有空位或不允許有空位的情況下，使用與上文所描述類似的技術來確定。在計算一致性百分比時，通常僅對精確匹配進行計數。
在一些實施例中，本文所提供之可活化結合劑(例如可活化抗體)含有相對於參考序列之取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之可活化結合劑仍能夠結合至ROR。在一些實施例中，參考胺基酸序列中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，取代、插入或缺失發生於CDR外部之區域中(亦即，FR及/或恆定區中)。
在一些實施例中，一或多個CDR沿著本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，包括可活化的人類ROR結合劑之VH (例如CDR1、CDR2或CDR3)及/或VL (例如CDR1、CDR2或CDR3)區之位置可發生一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸位置的變化，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。舉例而言，在一些實施例中，界定表1中之CDR之位置可藉由將CDR之N端及/或C端邊界相對於當前CDR位置轉移一個、兩個、三個、四個、五個或六個胺基酸而改變，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。另外或替代地，在一些實施例中，一或多個CDR沿著本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，包括可活化人類ROR結合劑之VH (例如CDR1、CDR2或CDR3)及/或VL (例如CDR1、CDR2或CDR3)區之長度可發生一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸之變化(例如更短或更長)，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。舉例而言，在一些實施例中，本文所述之VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3可比由SEQ ID NO:1-24及27-28描述之CDR中之一或多者短一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。在其他實施例中，本文所述之VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3可比由SEQ ID NO:1-24及27-28描述之CDR中之一或多者長一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。在一些實施例中，相比於由SEQ ID NO:1-24及27-28描述之CDR中之一或多者，本文所述之VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3之胺基末端可延長或縮短一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。另外或替代地，相比於由SEQ ID NO:1-24及27-28描述之CDR中之一或多者，本文所述之VH及/或VL CDR1、CDR2及/或CDR3之羧基末端可延長或縮短一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸，只要與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。此項技術中已知之任何方法可用於判定對ROR (例如人類ROR)的結合是否得以維持。
在其他實施例中，本文中所呈現之結合至ROR的包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)進一步包含保守序列修飾。關於作為可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，諸如可活化人類ROR結合劑之多肽，保守序列修飾包括保守胺基酸取代，包括其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。因此，在一些實施例中，可活化ROR結合劑中預測之非必需胺基酸殘基係經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。鑑定不消除抗原結合之胺基酸保守取代及其編碼核苷酸之方法為此項技術中熟知的(參見例如Brummell等人, Biochem. 32:1180-1187 (1993)；Kobayashi等人 Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；及Burks等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997))。在一些實施例中，本文所描述之保守序列修飾將可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，包括可活化人類ROR結合劑之胺基酸序列修飾50%、或55%、或60%、或65%、或70%、或75%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%或99%。在一些實施例中，胺基酸序列修飾係指對CDR (諸如 表 1中所述之CDR)之至多1、2、3、4、5或6個胺基酸取代。因此，舉例而言，此類各CDR可含有至多5個保守胺基酸取代，例如至多(不超過) 4個保守胺基酸取代，例如至多(不超過) 3個保守胺基酸取代，例如至多(不超過) 2個保守胺基酸取代，或不超過1個保守胺基酸取代。在一些實施例中，可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，包括可活化人類ROR結合劑，含有與 表 1中所描繪之抗體CDR具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之一或多個(包括六個) CDR。
在一些實施例中，可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，包括可活化人類ROR結合劑，含有包含與 表 1中所描繪之抗體CDR一致之CDR的VH及VL。在一些實施例中，胺基酸序列修飾不包括SDR內之任何修飾。在一些實施例中，胺基酸序列修飾不包括CDR (諸如CDR1、CDR2、CDR3或其任何組合)內之任何修飾。另外或替代地，胺基酸序列修飾在構架、恆定區及/或片段可結晶區(Fc)中。
在一些實施例中，本文所提供之可活化抗體或片段包含與SEQ ID NO: 25之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之VH域及/或與SEQ ID NO:26之胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之VL域，且可活化抗體或其片段與ROR (例如人類ROR)之結合得以維持(例如基本上維持，例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%)。
在一些實施例中，可例如藉由組合丙胺酸掃描來繪製功能性抗原決定基，以鑑定ROR蛋白中與本文所提供之可活化ROR結合劑(諸如可活化抗體)相互作用所必需之胺基酸。在一些實施例中，結合至ROR之可活化ROR結合劑(諸如可活化抗體)之構形及晶體結構可用於鑑定抗原決定基。在一些實施例中，本揭示案提供一種可活化抗體，其與本文所提供之任何可活化ROR結合劑(諸如可活化抗體或其片段)特異性結合至相同抗原決定基。
舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與抗ROR抗體結合至相同抗原決定基，該抗ROR抗體包含如包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH中所闡述之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及如包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL中所闡述之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與抗ROR抗體結合至相同抗原決定基，該抗ROR抗體包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與本文所述之抗ROR抗體或其片段競爭性地特異性結合至ROR。
在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與抗ROR抗體競爭性地特異性結合至ROR，該抗ROR抗體包含如包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH中所闡述之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，及如包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL中所闡述之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些實施例中，本文所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與抗ROR抗體競爭性地特異性結合至ROR，該抗ROR抗體包含有包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH，及包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL。
在一些實施例中，可活化ROR結合劑包含如 表 1之一列中所列出之六個CDR。在一些實施例中，可活化ROR結合劑包含SEQ ID NO:25中所闡述之重鏈可變區之三個CDR及SEQ ID NO:26中所闡述之輕鏈可變區之三個CDR。在一些實施例中，可活化ROR結合劑包含SEQ ID NO:25中所闡述之重鏈可變區及SEQ ID NO: 26中所闡述之輕鏈可變區。
在一些實施例中，基於此項技術中已知之分析法，例如各種層析方法，包括尺寸排阻層析法(SEC)、疏水相互作用層析法(HIC)及直立單層吸附層析法(SMAC)，可活化結合劑具有優良可開發性。在一些實施例中，基於單體百分比、溶解度及/或抗體聚集或沉澱之量測，結合劑具有優良可開發性。
在一些實施例中，本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，諸如單特異性或雙特異性抗體)，包括可活化人類ROR結合劑包含具有如下之組合的重鏈：(i)本文所述之VH，諸如在 表 1中；及(ii)一或多個重鏈恆定域(例如CH1、鉸鏈、CH2及/或CH3)。在其他實施例中，VH之羧基端(C端)與一或多個重鏈恆定域之胺基端(N端)直接或間接地結合。在一特定實施例中，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列。在一特定實施例中，除(i) D356E取代及/或L358M取代及/或(ii) K213R取代或K214R取代之外，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，諸如單特異性或雙特異性抗體)，包括可活化人類ROR結合劑包含多肽，其自N端至C端包含本文所述之掩蔽肽(例如 表 2)及具有以下之組合的輕鏈：(i)本文所述之VL域，諸如在 表 1中；及(ii)輕鏈恆定域(CL)。在其他實施例中，VL之C端與CL之N端直接或間接地結合。在其他實施例中，掩蔽肽與輕鏈之N端直接地或間接地結合。在一特定實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在一特定實施例中，多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在一特定實施例中，多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一特定實施例中，多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體，諸如單特異性或雙特異性抗體)，包括可活化人類ROR結合劑包含(a)具有以下之組合的重鏈：(i)本文所述之VH，諸如在 表 1中，及(ii)一或多個重鏈恆定域(例如CH1、鉸鏈、CH2及/或CH3)；及(b)多肽，其自N端至C端包含本文所述之掩蔽肽(例如 表 2)及具有以下之組合的輕鏈：(i)本文所述之VL，諸如在 表 1中，及(ii)輕鏈恆定域(CL)。在其他實施例中，VH之C端與一或多個重鏈恆定域之N端直接地或間接地結合。在其他實施例中，VL之C端與CL之N端直接或間接地結合。在其他實施例中，掩蔽肽與輕鏈之N端直接地或間接地結合。在特定實施例中，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列。在特定實施例中，除(i) D356E取代及/或L358M取代及/或(ii) K213R取代或K214R取代之外，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列。在特定實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在特定實施例中，多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在特定實施例中，多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在特定實施例中，多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。在一特定實施例中，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在一特定實施例中，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在一特定實施例中，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一特定實施例中，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。在一特定實施例中，除(i) D356E取代及/或L358M取代及/或(ii) K213R取代或K214R取代之外，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且輕鏈包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列。在一特定實施例中，除(i) D356E取代及/或L358M取代及/或(ii) K213R取代或K214R取代之外，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在一特定實施例中，除(i) D356E取代及/或L358M取代及/或(ii) K213R取代或K214R取代之外，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。在一特定實施例中，除(i) D356E取代及/或L358M取代及/或(ii) K213R取代或K214R取代之外，重鏈包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，且多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
在一些實施例中，如本文所用之親本ROR抗體之CDR揭示於美國專利申請公開案第US20210155692A1號中，該案以全文引用之方式併入。在一些實施例中，如本文所用之親本ROR抗體揭示於美國專利申請公開案第US20210155692A1中。
在一些實施例中，本文提供一種可活化ROR結合蛋白，其包含本文所述之可活化抗ROR抗體中之任一者。在一些實施例中，可活化ROR結合蛋白為包含兩條重鏈及兩條輕鏈之可活化抗體。在一些實施例中，可活化ROR結合蛋白係包含有包含相同VH區之兩條重鏈及包含相同VL區之兩條輕鏈之可活化抗體。
在一些實施例中，可活化ROR結合蛋白為單株抗體，包括小鼠、嵌合、人源化或人類抗體。在一些實施例中，可活化抗ROR抗體為抗體片段，例如scFv。在一些實施例中，可活化ROR結合蛋白係包含本文所提供之可活化抗ROR抗體之融合蛋白。在其他實施例中，可活化ROR結合蛋白係包含本文所提供之可活化抗ROR抗體或其片段之多特異性可活化抗體。
本文中亦提供經活化之可活化結合劑(亦即，呈活化形式之可活化結合劑)。在一些實施例中，可活化結合劑(呈不活化形式)如本文中所揭示。在其他實施例中，可活化結合劑(呈不活化形式)之掩蔽肽包含掩蔽部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM位於MM與輕鏈可變區之間。在其他實施例中，可活化結合劑(呈不活化形式)之掩蔽肽自N端至C端包含MM、CM及輕鏈可變區。在一些實施例中，CM自N端至C端包含視情況存在之第一連接子、裂解位點及視情況存在之第二連接子。在其他實施例中，藉由使不活化形式與蛋白酶(例如MMP9)接觸、使裂解位點裂解，可活化結合劑之活化形式已自不活化形式活化。因此，在一些實施例中，經活化之可活化結合劑(亦即，呈活化形式之可活化結合劑)包含：(a)多肽，其自N端至C端包含蛋白酶裂解之後的裂解位點之胺基酸殘基(若存在) (諸如裂解位點之零個、或一個、或兩個、或三個、或四個或更多個C端胺基酸)、第二視情況選用之連接子及輕鏈可變區；及(b)抗體重鏈可變區；其中蛋白酶裂解之前的掩蔽肽包含SEQ ID NO:29、30或31之胺基酸序列(參見 表 2)，且其中抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區如本文所述(例如，包含本文所述之CDR (例如 表 1))。
其他例示性可活化ROR結合分子更詳細地描述於以下章節中。在一些實施例中，根據以上實施例中之任一者之可活化抗ROR抗體或抗原結合蛋白可單獨地或組合地併入如以下章節5.3.1至5.3.4中所描述之任何特徵。 表 1: 抗體CDR、VH及VL
例示性 IMGT Kabat Chothia Contact AbM CDR 組 1
VH CDR Seq. VH CDR1 GFTFSSYFIH (SEQ ID NO:1) GFTFSSYF (SEQ ID NO:7) SYFIH (SEQ ID NO:12) GFTFSSY (SEQ ID NO:13) SSYFIH (SEQ ID NO:18) GFTFSSYFIH (SEQ ID NO:1) FSSYFI (SEQ ID NO:27)
VH CDR2 GIYPSEGYTSYADSVKG (SEQ ID NO:2) IYPSEGYT (SEQ ID NO:8) GIYPSEGYTSYADSVKG (SEQ ID NO:2) PSEG (SEQ ID NO:14) WVAGIYPSEGYTS (SEQ ID NO:19) GIYPSEGYTS (SEQ ID NO:24) GIYPSEGYTS (SEQ ID NO:24)
VH CDR3 YYVSGMDY (SEQ ID NO:3) ARYYVSGMDY (SEQ ID NO:9) YYVSGMDY (SEQ ID NO:3) YVSGMD (SEQ ID NO:15) ARYYVSGMD (SEQ ID NO:20) YYVSGMDY (SEQ ID NO:3) YYVSGM (SEQ ID NO:28)
VL CDR Seq. VL CDR1 RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:4) QSVSSA (SEQ ID NO:10) RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:4) SQSVSSA (SEQ ID NO:16) SSAVAWY (SEQ ID NO:21) RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:4) RASQSVSSAVA (SEQ ID NO:4)
VL CDR2 SASSLQS (SEQ ID NO:5) SAS (SEQ ID NO:11) SASSLQS (SEQ ID NO:5) SAS (SEQ ID NO:11) LLIYSASSLQ (SEQ ID NO:22) SASSLQS (SEQ ID NO:5) SASSLQS (SEQ ID NO:5)
VL CDR3 QQYYYYPGT (SEQ ID NO:6) QQYYYYPGT (SEQ ID NO:6) QQYYYYPGT (SEQ ID NO:6) YYYYPG (SEQ ID NO:17) QQYYYYPG (SEQ ID NO:23) QQYYYYPGT (SEQ ID NO:6) YYYYPG (SEQ ID NO:17)
VH序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:25)
VL序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:26)
表 2：掩蔽肽
掩蔽肽1序列： EVGSYADCPFFFPAALCSQGGG PLGLAGSGGS (SEQ ID NO:29) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，基質金屬蛋白酶-2 (MMP-2)及基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)之蛋白酶識別位點)
掩蔽肽2序列： EVGSYHDHHFDCYYFDPPSHCPAGGG PLGLAGSGGS (SEQ ID NO:30) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
掩蔽肽3序列： EVGSYADPFSVCHFADFVPYCYYGGG PLGLAGSGGS (SEQ ID NO:31) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
表 3：親本抗體P0
重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:32) (加底線：位置213-215；加底線及斜體：位置356-358)
輕鏈序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:33)
表 4：抗體M1
重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:32) (加底線：位置213-215；加底線及斜體：位置356-358)
多肽(掩蔽肽及輕鏈)序列： EVGSYADCPFFFPAALCSQGGG PLGLAGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:34) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
掩蔽肽及VL序列： EVGSYADCPFFFPAALCSQGGG PLGLAGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:35) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
表 5：抗體M2
重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:32) (加底線：位置213-215；加底線及斜體：位置356-358)
多肽(掩蔽肽及輕鏈)序列： EVGSYHDHHFDCYYFDPPSHCPAGGG PLGLAGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:36) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
掩蔽肽及VL序列： EVGSYHDHHFDCYYFDPPSHCPAGGG PLGLAGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:37) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
表 6：抗體M3
重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYFIHWVRQAPGKGLEWVAGIYPSEGYTSYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYVSGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:32) (加底線：位置213-215；加底線及斜體：位置356-358)
多肽(掩蔽肽及輕鏈)序列： EVGSYADPFSVCHFADFVPYCYYGGG PLGLAGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:38) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
掩蔽肽及VL序列： EVGSYADPFSVCHFADFVPYCYYGGG PLGLAGSGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLQSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYYYPGTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:39) (加底線：PLGLAG (SEQ ID NO:44)，MMP-2及基質金屬蛋白酶-9 MMP-9之蛋白酶識別位點)
表 7：人類ROR1及ROR2序列
人類ROR1 (UniProt登錄號Q01973)序列： MHRPRRRGTRPPLLALLAALLLAARGAAAQETELSVSAELVPTSSWNISSELNKDSYLTLDEPMNNITTSLGQTAELHCKVSGNPPPTIRWFKNDAPVVQEPRRLSFRSTIYGSRLRIRNLDTTDTGYFQCVATNGKEVVSSTGVLFVKFGPPPTASPGYSDEYEEDGFCQPYRGIACARFIGNRTVYMESLHMQGEIENQITAAFTMIGTSSHLSDKCSQFAIPSLCHYAFPYCDETSSVPKPRDLCRDECEILENVLCQTEYIFARSNPMILMRLKLPNCEDLPQPESPEAANCIRIGIPMADPINKNHKCYNSTGVDYRGTVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDENFKSDLCDIPACDSKDSKEKNKMEILYILVPSVAIPLAIALLFFFICVCRNNQKSSSAPVQRQPKHVRGQNVEMSMLNAYKPKSKAKELPLSAVRFMEELGECAFGKIYKGHLYLPGMDHAQLVAIKTLKDYNNPQQWTEFQQEASLMAELHHPNIVCLLGAVTQEQPVCMLFEYINQGDLHEFLIMRSPHSDVGCSSDEDGTVKSSLDHGDFLHIAIQIAAGMEYLSSHFFVHKDLAARNILIGEQLHVKISDLGLSREIYSADYYRVQSKSLLPIRWMPPEAIMYGKFSSDSDIWSFGVVLWEIFSFGLQPYYGFSNQEVIEMVRKRQLLPCSEDCPPRMYSLMTECWNEIPSRRPRFKDIHVRLRSWEGLSSHTSSTTPSGGNATTQTTSLSASPVSNLSNPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIPQNQRFIPINGYPIPPGYAAFPAAHYQPTGPPRVIQHCPPPKSRSPSSASGSTSTGHVTSLPSSGSNQEANIPLLPHMSIPNHPGGMGITVFGNKSQKPYKIDSKQASLLGDANIHGHTESMISAEL (SEQ ID NO:40)
人類ROR2 (UniProt登錄號Q01974)序列： MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYILVPSIAIPLVIACLFFLVCMCRNKQKASASTPQRRQLMASPSQDMEMPLINQHKQAKLKEISLSAVRFMEELGEDRFGKVYKGHLFGPAPGEQTQAVAIKTLKDKAEGPLREEFRHEAMLRARLQHPNVVCLLGVVTKDQPLSMIFSYCSHGDLHEFLVMRSPHSDVGSTDDDRTVKSALEPPDFVHLVAQIAAGMEYLSSHHVVHKDLATRNVLVYDKLNVKISDLGLFREVYAADYYKLLGNSLLPIRWMAPEAIMYGKFSIDSDIWSYGVVLWEVFSYGLQPYCGYSNQDVVEMIRNRQVLPCPDDCPAWVYALMIECWNEFPSRRPRFKDIHSRLRAWGNLSNYNSSAQTSGASNTTQTSSLSTSPVSNVSNARYVGPKQKAPPFPQPQFIPMKGQIRPMVPPPQLYVPVNGYQPVPAYGAYLPNFYPVQIPMQMAPQQVPPQMVPKPSSHHSGSGSTSTGYVTTAPSNTSMADRAALLSEGADDTQNAPEDGAQSTVQEAEEEEEGSVPETELLGDCDTLQVDEAQVQLEA (SEQ ID NO:41)
5.3.1. 抗體片段
即使術語「抗體」在本文中有時用於片語「抗體或其片段」中，但應理解，如本文中所使用，術語「抗體」亦包括各種抗體片段，諸如抗原結合片段或抗原決定基結合片段。因此，當術語「抗體」單獨使用，而隨後無「其片段」或類似術語時，應理解，術語「抗體」包括抗體片段，諸如抗原結合片段或抗原決定基結合片段。本文中所提供之抗體包括但不限於免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分。
抗體之變異體及衍生物包括保留結合至抗原之能力的抗體功能片段。抗體片段包括但不限於上文章節5.2中所描述之抗體片段。例示性功能片段包括Fab片段(例如，含有抗原結合域且包含藉由二硫鍵橋接之輕鏈及部分重鏈的抗體片段)；Fab' (例如，含有單一抗原結合域之抗體片段，該單一抗原結合域包含透過鉸鏈區接合的Fab及額外重鏈部分)；F(ab')2 (例如，藉由重鏈鉸鏈區中之鏈間二硫鍵接合的兩個Fab'分子；Fab'分子可針對相同或不同之抗原決定基)；雙特異性Fab (例如，具有兩個抗原結合域之Fab分子，該等兩個抗原結合域各自可針對不同之抗原決定基)；包含可變區之單鏈，亦稱為scFv (例如，藉由一系列，例如藉由10至25個胺基酸連接在一起的抗體之單一輕鏈及重鏈的可變、抗原結合決定區)；二硫鍵連接之Fv，或dsFv (例如，藉由二硫鍵連接在一起的抗體之單一輕鏈及重鏈之可變、抗原結合決定區)；雙特異性scFv (例如，scFv或具有兩個抗原結合域之dsFv分子，該等兩個抗原結合域各自可針對不同之抗原決定基)；雙功能抗體(例如，當第一scFv之VH域與第二scFv之VL域組裝在一起且第一scFv之VL域與第二scFv之VH域組裝在一起時形成的二聚化scFv；雙功能抗體之兩個抗原結合區可針對相同或不同之抗原決定基)；三功能抗體(例如，以與雙功能抗體類似之方式形成，但三個抗原結合域以單一複合物形式產生之三聚化scFv；該等三個抗原結合域可針對相同或不同之抗原決定基)；及四功能抗體(例如，以與雙功能抗體類似之方式形成，但四個抗原結合域以單一複合物形式產生之四聚化scFv；該等四個抗原結合域可針對相同或不同之抗原決定基)。
已開發出用於產生抗體片段的多種技術。傳統地，此等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化而得到(參見例如Morimoto等人, 1992, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-17；及Brennan等人, 1985, Science 229:81-83)。然而，此等片段現可藉由重組型宿主細胞直接產生。舉例而言，Fab、Fv及 ScFv抗體片段均可在大腸桿菌( E . coli)、酵母或昆蟲細胞中表現且由其分泌，由此允許便捷地產生大量此等片段。抗體片段可自上文所論述之抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab'-SH片段可自大腸桿菌直接回收且化學偶合以形成F(ab') 2片段(Carter等人, 1992, Bio/Technology 10:163-67)。根據另一方法，F(ab') 2片段可自重組宿主細胞培養物直接分離。具有延長之活體內半衰期且包含救助受體(salvage receptor)結合抗原決定基殘基之Fab及F(ab') 2片段描述於例如美國專利第5,869,046號中。用於產生抗體片段之其他技術將為熟習此項技術者顯而易見。在某些實施例中，抗體係單鏈Fv片段(scFv) (參見例如WO 93/16185；美國專利第5,571,894號及第5,587,458號)。Fv及scFv具有不含恆定區之完整組合位點；因此，其適合於在活體內使用期間減少非特異性結合。可構築scFv融合蛋白，以產生效應蛋白在scFv之胺基或羧基末端的融合物(參見例如Borrebaeck編，同上)。抗體片段亦可為「線抗體」，例如如上文所引用之參考文獻中所述。此等線性抗體可為單特異性或多特異性抗體，諸如雙特異性抗體。 5.3.2. 人源化抗體
本揭示案提供結合ROR (包括人類ROR)之人源化可活化抗體。本揭示案之人源化可活化抗體可包含一或多個來自本文所揭示之VH及/或VL的CDR，諸如 表 1中所示之彼等。用於使非人類抗體人源化之各種方法為此項技術中已知的。舉例而言，人源化抗體中可以引入一或多個來自非人類來源的胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其通常取自「輸入」可變域。結合ROR之人源化抗體可使用熟習此項技術者已知之技術產生(Zhang等人, Molecular Immunology, 42(12): 1445-1451, 2005；Hwang等人, Methods, 36(1): 35-42, 2005；Dall'Acqua等人, Methods, 36(1): 43-60, 2005；Clark, Immunology Today, 21(8): 397-402, 2000及美國專利第6,180,370號；第6,054,927號；第5,869,619號；第5,861,155號；第5,712,120號；及第4,816,567號)。
在一些情況下，人源化抗體係藉由CDR移植來構築，其中親本非人類抗體(例如，嚙齒動物)之VH及VL之六個CDR的胺基酸序列移植至人類抗體構架上。舉例而言，Padlan等人( FASEB J., 9:133-139, 1995)確定，CDR中僅約三分之一的殘基實際上接觸抗原，且將此等殘基稱為「特異性決定殘基」或SDR。在SDR接枝技術中，僅將SDR殘基接枝至人類抗體構架上(參見例如Kashmiri等人, Methods36: 25-34, 2005)。
選用於製備人源化抗體的人類可變域(輕鏈與重鏈)對於減少抗原性而言非常重要。舉例而言，根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫篩選非人類(例如嚙齒動物)抗體之可變域序列。可選擇與嚙齒動物序列最接近的人類序列作為人源化抗體之人類構架(Sims等人(1993) J . Immunol .151:2296；Chothia等人(1987) J . Mol . Biol .196:901)。另一方法使用來源於輕鏈或重鏈之特定子組的所有人類抗體之共同序列的特定構架。若干不同人源化抗體可使用相同構架(Carter等人(1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285；Presta等人(1993) J . Immunol ., 151:2623)。在一些情況下，構架來源於最豐富之人類子類別(V L6子組I (V L6I)及V H子組III (V HIII))之共有序列。在另一方法中，在構架區之來源使用人類生殖系基因。
在基於比較CDR之替代性範例(稱為超人源化)中，構架同源性無關。該方法由比較非人類序列與人類生殖系功能基因譜系組成。接著選擇編碼與鼠類序列相同或緊密相關之典型結構的彼等基因。隨後，在與非人類抗體共有典型結構之基因內，選擇在CDR內具有最高同源性之基因作為構架供體。最終，將非人類CDR接枝至此等構架上(參見例如Tan等人, J . Immunol. 169: 1119-1125, 2002)。
通常進一步需要抗體經人源化以保持其對抗原的親和力及其他有利生物特性。為達成此目標，根據一種方法，人源化抗體係藉由一種使用親本及人源化序列的三維模型分析親本序列及各種概念性人源化產物的方法製備。三維免疫球蛋白模型通常可獲得，且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明且顯示所選擇之候選免疫球蛋白序列的可能三維構形結構之電腦程式。此等程式包括例如WAM (Whitelegg及Rees, Protein Eng .13: 819-824, 2000)、Modeller (Sali及Blundell, J . Mol . Biol .234: 779-815, 1993)及Swiss PDB Viewer (Guex及Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-2713, 1997)。檢查此等呈現可分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中的可能作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自受體及輸入序列選擇構架殘基且組合，以便達成所需抗體特徵，諸如對標靶抗原之親和力增加。一般而言，高變區殘基直接且最實質性涉及影響抗原結合。
另一種用於抗體人源化之方法係基於稱為人類鏈帶含量(HSC)之抗體人源化量度。此方法比較小鼠序列與人類生殖系基因之基因譜且對差異進行評分作為HSC。接著，將標靶序列藉由使其HSC最大化而非使用整體一致性量度進行人源化以產生多種不同之人源化變異體。參見例如Lazar等人, Mol . Immunol .44: 1986-1998, 2007。
除上述方法以外，可使用經驗方法產生及選擇人源化抗體。此等方法包括使用富集技術或高輸送量篩選技術之基於人源化變異體之大型文庫之產生及最佳純系之選擇的方法。抗體變異體可自噬菌體、核糖體及酵母呈現庫中以及藉由細菌群落篩選分離(參見例如Hoogenboom, Nat . Biotechnol .23: 1105-1116, 2005；Dufner等人, Trends Biotechnol .24: 523-529, 2006；Feldhaus等人, Nat . Biotechnol .21: 163-70, 2003；Schlapschy等人, Protein Eng . Des . Sel. 17: 847-60, 2004)。
在構架庫方法中，在構架中之特定位置處引入一組殘基變異體，隨後篩選庫以選擇最佳支持所接枝之CDR之構架。待取代之殘基可包括鑑別為潛在促成CDR結構之「維尼爾(Vernier)」殘基中之一些或全部(參見例如Foote及Winter, J . Mol . Biol .224: 487-499, 1992)，或來自由Baca等人( J . Biol . Chem .272: 10678-10684, 1997)鑑別之目標殘基之更有限集合的殘基。
在構架改組中，全部構架與非人類CDR組合而非產生所選擇之殘基變異體之組合庫(參見例如Dall'Acqua等人, Methods 36: 43-60, 2005)。可在兩步選擇程序(首先人源化VL，隨後VH)中針對結合來篩選庫。或者，可使用單步構架改組過程。已證實此類方法與兩步篩選相比更有效，因為所得抗體呈現改良之生物化學及物理化學特性，包括增強之表現、增加之親和力及熱穩定性(參見例如Damschroder等人, Mol . Immunol .44: 3049-60, 2007)。
「人源化工程改造」方法係基於基本最小特異性決定子(MSD)之實驗鑑別且基於非人類片段至人類構架庫中之依序置換及對結合之評估。其以非人類VH及VL鏈之CDR3之區域開始且將非人類抗體之其他區域漸進地置換至人類構架中，包括VH及VL兩者之CDR1及CDR2。此方法通常引起抗原決定基滯留及自具有不同人類V區段CDR之多個子類中鑑別抗體。人源化工程改造允許分離出與人類生殖系基因抗體具有91%至96%同源性之抗體。參見例如Alfenito, Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007。
「人類工程改造」方法涉及藉由使抗體之胺基酸序列產生特異性變化以便產生在人類中具有降低之免疫原性，但仍保留所需原始非人類抗體之結合特性的經修飾之抗體來改變非人類抗體或抗體片段，諸如小鼠或嵌合抗體或抗體片段。通常，該技術涉及將非人類(例如小鼠)抗體之胺基酸殘基分類為「低風險」、「中等風險」或「高風險」殘基。使用整體風險/獎勵計算進行分類，其針對取代將影響所得抗體之摺疊及/或經人類殘基取代之風險來評估進行特定取代(例如，人類中之免疫原性)之所預測益處。可藉由將來自非人類抗體可變區的胺基酸序列與特定或共同人類抗體序列之相應區域比對來選擇在非人類(例如小鼠)抗體序列之指定位置(例如低或中度風險)待取代的特定人類胺基酸殘基。根據比對，非人類序列中低風險或中等風險位置處之胺基酸殘基可取代人類抗體序列中之相應殘基。用於製備人類工程改造之蛋白質的技術更詳細地描述於Studnicka等人, Protein Engineering, 7: 805-814 (1994)；美國專利第5,766,886號、第5,770,196號、第5,821,123號及第5,869,619號；以及WO 93/11794中。 5.3.3. 抗體變異體
涵蓋對結合至本文中所描述之ROR的可活化抗體之修飾。舉例而言，可能需要最佳化抗體之結合親和力及/或其他生物特性，包括(但不限於)特異性、熱穩定性、表現量、效應功能、糖基化、減小之免疫原性，或溶解性。因此，經考慮，可製備本文中所描述之結合至ROR的可活化抗體之變異體且包括於本揭示案中。在一些實施例中，抗體變異體為與原始抗體相比具有胺基酸序列變異，例如具有上文所描述之一或多個胺基酸之取代、缺失或插入的抗體。舉例而言，與原始抗體或多肽相比，變異可為引起胺基酸序列變化(例如，保守性取代)的編碼該抗體或多肽之一或多個密碼子的取代、缺失或插入。用於取代型突變誘發之所關注位點包括CDR、FR及/或恆定區。舉例而言，抗體變體可藉由將適當核苷酸變化引入至編碼DNA中及/或藉由合成所需抗體或多肽來製備。熟習此項技術者瞭解，胺基酸變化可改變抗體之轉譯後過程。 化學修飾
其他例示性修飾包括例如藉由將任何類型之分子共價連接至抗體進行之化學修飾。抗體衍生物可包括已例如藉由醣基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、用已知之保護/封端基團衍生化、蛋白水解分解、與細胞配體或其他蛋白質之連接或與一或多個免疫球蛋白域(例如Fc或Fc之一部分)之結合進行化學修飾的抗體。多種化學修飾中之任一者可藉由已知技術進行，包括但不限於特異性化學裂解、乙醯化、調配、衣黴素(tunicamycin)之代謝合成等。另外，抗體可含有一或多個非經典胺基酸。
在一些實施例中，更改本文中所提供之可活化抗體以增加或降低抗體醣基化之程度。向抗體中添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。
當本文中所提供之可活化抗體與Fc區融合時，可改變連接至其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體通常包含分支鏈雙觸角寡糖，其通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297。參見例如Wright等人, TIBTECH15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本文中所提供之結合分子中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良特性之變異體。
在其他實施例中，當本文中所提供之可活化抗體與Fc區融合時，本文中所提供之抗體變異體可具有缺乏連接(直接或間接地)至該Fc區之岩藻糖的碳水化合物結構。舉例而言，此類抗體中岩藻醣之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量藉由計算相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析量測之附接於Asn 297之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)的總和，糖鏈內Asn297處之岩藻糖之平均量來確定，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指位於Fc區中約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，歸因於抗體中微小序列變化，Asn297亦可位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，亦即位於位置294與300之間。此類岩藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第2003/0157108號及第2004/0093621號。與「去岩藻糖基化」或「缺少岩藻糖」之抗體變異體有關之公開案的實例包括：美國專利公開案第2003/0157108號；WO 2000/61739；WO 2001/29246；美國專利公開案第2003/0115614號；美國專利公開案第2002/0164328號；美國專利公開案第2004/0093621號；美國專利公開案第2004/0132140號；美國專利公開案第2004/0110704號；美國專利公開案第2004/0110282號；美國專利公開案第2004/0109865號；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人, J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質岩藻醣基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人, Arch . Biochem . Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108號；及WO 2004/056312)及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-岩藻醣基轉移酶基因 FUT8基因剔除之CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人, Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人, Biotechnol . Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
包含本文中所提供之可活化抗體的可活化結合分子進一步具備平分寡醣，例如其中連接至Fc區之雙觸角寡醣藉由GlcNAc平分。此類變異體可具有降低之岩藻醣基化及/或改良之ADCC功能。此等變異體之實例描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利公開案第6,602,684號(Umana等人)；及美國專利公開案第2005/0123546號(Umana等人)中。亦提供其中寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區連接之變異體。此等變異體可具有改良之CDC功能。此等變異體描述於例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764中。
在包含本發明之可活化抗體及Fc區之分子中，可將一或多個胺基酸修飾引入Fc區中，由此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施例中，本申請案涵蓋具有一些而非全部效應功能之變異體，此使得該等變異體成為其中可活化結合分子之活體內半衰期至關重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的理想候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析法以確保可活化結合分子不具有FcγR結合能力(因此可能不具有ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用以評估感興趣分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人, P roc . Nat ' l Acad . Sci . USA83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人, Proc . Nat ' l Acad . Sci . USA82:1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人, J . Exp . Med .166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流式細胞分析技術的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96 ®非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可例如在動物模型中活體內評定所關注分子之ADCC活性，諸如Clynes等人 Proc. Nat ' l Acad. Sci. USA95:652-656 (1998)。亦可進行C1q結合分析以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評定補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J . Immunol . Methods202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人, Blood101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除/半衰期(參見例如Petkova, S.B.等人, Int. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
具有降低之效應子功能的結合分子包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者具有取代者(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括具有胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或兩者以上之取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述與FcR具有改良或降低之結合的某些變異體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields等人, J . Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。
在一些實施例中，變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334 (殘基之EU編號)處之取代的Fc區。在一些實施例中，在Fc區中進行使C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即，改良或減弱)之改變，例如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人, J . Immunol .164: 4178-4184 (2000)中所描述。
具有延長之半衰期且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)之結合改良(Guyer等人, J . Immunol .117:587 (1976)及Kim等人, J . Immunol. 24:249 (1994))的結合分子描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。此等分子包含其中具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn之結合。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利案第7,371,826號)。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter, Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
在一些實施例中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造之抗體，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在一些實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可進入位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基進而定位於抗體之可近接位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。
抗體之其他已知之共價修飾包括在本揭示案之範疇內。共價修飾包括使抗體之靶向胺基酸殘基與有機衍生劑反應，該有機衍生劑能夠與抗體之所選側鏈或N端或C端殘基反應。其他修飾包括麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基分別去醯胺化而形成相應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基、脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基甲基化(參見例如Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties 79-86 (1983))、N端胺之乙醯化，及任何C端羧基之醯胺化。
本揭示案之結合至ROR之可活化抗體亦可經修飾以形成嵌合分子，該等嵌合分子包含結合至ROR之可活化抗體，該抗體與另一異源多肽或胺基酸序列或者小分子化合物，例如免疫活化劑(諸如細胞介素)、抗原決定基標籤(參見例如Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:523-33 (2003))或IgG分子之Fc區(參見例如Aruffo, Antibody Fusion Proteins 221-42 (Chamow及Ashkenazi編, 1999))融合或結合。
本文亦提供融合蛋白，其包含本發明之結合至ROR之可活化抗體及異源多肽。在一些實施例中，與抗體以基因方式融合或以化學方式結合之異源多肽適用於使抗體靶向具有細胞表面表現之ROR的細胞。以基因方式融合或以化學方式結合之抗體更詳細地描述於以下章節中。 活體外親和力成熟
在一些實施例中，可藉由活體外親和力成熟來製備與親本抗體相比具有改良之特性(諸如親和力、穩定性或表現量)的抗體變異體。與天然原型類似，活體外親和力成熟係基於突變及選擇之原理。抗體庫呈現於生物體(例如噬菌體、細菌、酵母或哺乳動物細胞)表面上或與其編碼mRNA或DNA結合(例如共價或非共價)。所呈現之抗體之親和力選擇允許分離攜帶編碼抗體之遺傳資訊的生物體或複合物。使用呈現方法(諸如噬菌體呈現)之兩輪或三輪突變及選擇通常產生親和力在低奈莫耳濃度範圍內之抗體片段。親和力成熟抗體可以對目標抗原具有奈莫耳濃度或甚至皮莫耳濃度之親和力。
噬菌體呈現為廣泛用於呈現及選擇抗體之方法。抗體以與噬菌體外殼蛋白之融合物形式呈現於Fd或M13噬菌體表面上。選擇涉及暴露於抗原以允許噬菌體所呈現的抗體結合其目標，一種稱為「淘選」的方法。回收結合於抗原的噬菌體且用於感染細菌，以產生噬菌體以用於另外多輪選擇。關於綜述，參見例如Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178:1-37 (2002)；及Bradbury及Marks, J. Immunol. Methods 290:29-49 (2004)。
在酵母呈現系統(參見例如Boder等人, Nat. Biotech. 15:553-57 (1997)；及Chao等人, Nat. Protocols 1:755-68 (2006))中，抗體可融合至經由與Aga1p之二硫鍵連接至酵母細胞壁的酵母凝集素蛋白Aga2p之黏附次單位。蛋白質經由Aga2p呈現使該蛋白質突出而遠離細胞表面，從而使與酵母細胞壁上的其他分子之潛在相互作用最小化。使用磁性分離及流式細胞分析技術篩選庫，以選擇親和力或穩定性改良之抗體。與所關注之可溶性抗原的結合係藉由用經生物素標記之抗原及第二試劑(諸如與螢光團結合之鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin))標記酵母來測定。抗體之表面表現的變化可透過對側接單鏈抗體(例如scFv)之血球凝集素或c-Myc抗原決定基標籤的免疫螢光標記來量測。經顯示，表現與所呈現蛋白質之穩定性相關，且因此可針對改良之穩定性以及親和力選擇抗體(參見例如Shusta等人, J. Mol. Biol. 292:949-56 (1999))。酵母呈現之另一優勢在於，所呈現之蛋白質在真核酵母細胞之內質網中摺疊，從而利用內質網伴護蛋白及品質控制機制。一旦完全成熟，則可在呈現於酵母表面上的同時方便地「滴定」抗體親和力，從而消除表現及純化各純系的需要。酵母表面呈現之理論侷限性為功能庫規模潛在地比其他呈現方法之規模小；然而，最新方法使用酵母細胞配合系統產生大小估計為10 14的組合多樣性(參見例如美國專利公開案2003/0186374；及Blaise等人, Gene 342:211-18 (2004))。
在核糖體呈現時，產生抗體-核糖體-mRNA (ARM)複合物以便在無細胞系統中選擇。使編碼特定抗體庫之DNA庫與缺少終止密碼子之間隔子序列進行基因融合。此間隔序列在轉譯時仍連接至肽基tRNA且佔據核糖體隧道，且因此允許相關蛋白質自核糖體突出且摺疊。mRNA、核糖體及蛋白質之所得複合物可結合至表面結合之配體，從而允許透過配體之親和力捕捉來同時分離抗體及其編碼mRNA。接著，使核糖體結合之mRNA再逆轉錄成cDNA，cDNA接著可經歷突變誘發且用於下一輪選擇(參見例如Fukuda等人, Nucleic Acids Res. 34:e127 (2006))。在mRNA呈現時，抗體與mRNA之間的共價鍵係使用嘌呤黴素(puromycin)作為轉接分子來建立(Wilson等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750-55 (2001))。
由於此等方法完全在活體外進行，因此其提供優於其他選擇技術的兩個主要優勢。首先，庫之多樣性不受細菌細胞之轉型效率限制，而僅受存在於試管中之核糖體及不同mRNA分子的數目限制。其次，在每輪選擇(例如藉由非校正聚合酶)之後，可容易地引入隨機突變，因為文庫在任何多樣化步驟之後無需轉型。在一些實施例中，可使用哺乳動物呈現系統。
亦可以靶向方式或經由隨機引入將多樣性引入抗體文庫之CDR中。前一方法包括經由高或低水平之突變誘變依序靶向抗體之所有CDR或靶向經分離之體細胞超突變熱點(參見例如Ho等人, J. Biol. Chem. 280:607-17 (2005))或在實驗基礎上或出於結構原因而懷疑影響親和力之殘基。亦可藉由經由DNA改組或類似技術置換天然多樣化的區域來引入多樣性(參見例如Lu等人, J. Biol. Chem. 278:43496-507 (2003)；美國專利第5,565,332號及第6,989,250號)。替代技術採用CDR中之環缺失及插入或使用基於雜交之多樣化(參見例如美國專利公開案第2004/0005709號)靶向延伸至構架區殘基中之高變環(參見例如Bond等人, J. Mol. Biol. 348:699-709 (2005))。產生CDR中之多樣性之額外方法揭示於例如美國專利第7,985,840號中。可用於產生抗體文庫及/或抗體親和力成熟之其他方法揭示於例如美國專利第8,685,897號及第8,603,930號，及美國公開案第2014/0170705號、第2014/0094392號、第2012/0028301號、第2011/0183855號及第2009/0075378號中，其各自以引用之方式併入本文中。
可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，抗體可固定至固體載體、管柱、銷或纖維素/聚(偏二氟乙烯)膜/其他過濾器上，在附著至吸附盤之宿主細胞上表現或用於細胞分選中，或與生物素結合以用塗有鏈黴抗生物素蛋白之珠粒捕捉或用於任何其他用於淘選呈現文庫之方法中。
關於活體外親和力成熟方法之綜述，參見例如Hoogenboom, Nature Biotechnology 23:1105-16 (2005)；Quiroz及Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51 (2010)；以及其中之參考文獻。
抗體內化分析法可用於確定當結合至抗體時受體介導之胞吞作用。在一些實施例中，某些基於抗體之治療劑的功效取決於抗體內化過程。在一些實施例中，抗體內化分析法檢查抗體內化之速率及程度，以便評價抗體將治療遞送至所關注之部位或細胞的能力。非限制性例示性分析法簡要描述於下文中。將所關注之標靶細胞以適當接種密度(例如於96孔U形底盤中)接種，並將測試抗體用信號報導試劑，例如螢光化合物、辣根過氧化酶(HRP)試劑、經放射性標記之化合物或生物素標記。接著，將測試抗體與標靶細胞以適當莫耳比培育。培育之後，藉由洗滌移除未結合之抗體。細胞可保留在冰上或在37℃下培育一段時間以促進內化。接著，細胞可在存在終止試劑之情況下培育一時段以抑制內化。隨後，洗滌細胞並將其與信號顯現試劑一起培育。最終信號可使用盤讀取器或成像儀器及分析軟體研究。舉例而言，可使用流式細胞儀量測細胞之平均螢光強度(MFI)，且MFI減小可表示抗體內化、抗體解離或兩者之組合。可掃描且採集細胞成像以分析信號強度、大小與形狀。或者，將細胞溶解，釋放出內化之抗體。接著，將此抗體捕捉於塗有產生抗體之特定抗原的微量滴定孔盤中。使用鹼性磷酸酶或HRP結合之二次抗體及發色受質偵測孔中結合之抗體。抗體之替代性可偵測標記及用於偵測內化之經標記抗體的方式對於熟習有關本揭示案之此項技術者將為顯而易見的。此項技術中已知的測定抗體內化之任何方法均可用於本揭示案中。 5.3.4. 包含抗體之其他結合劑
在一些實施例中，本文中所提供之可活化抗體或其片段為較大可活化結合劑之一部分。包含本文中所提供之可活化抗體或片段的非限制性例示性可活化結合劑描述於下文中。
本揭示案提供具有掩蔽肽之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)。此類可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)亦適用於製備結合物，包括免疫結合物及抗體-藥物結合物(ADC)，該等結合物包含本揭示案之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體) (諸如可活化人類ROR結合劑)中之任一者，包括直接或間接地連接至另一藥劑，諸如藥物及/或免疫活化劑(諸如細胞介素)之彼等。舉例而言，本揭示案之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，諸如可活化人類ROR結合劑可藉由合成連接子與一或多種藥劑，諸如藥物及/或免疫活化劑(諸如細胞介素)共價結合。
視需要，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)連接或結合(直接或間接地)至具有效應功能，諸如細胞毒活性(例如化學療法部分或放射性同位素)、免疫募集或調節活性之部分。(直接或間接)連接或結合之部分包括細胞毒性藥物(例如毒素，諸如奧瑞他汀)或非細胞毒性藥物，例如信號轉導調節劑，諸如激酶。促進免疫募集之部分可包括其他抗原結合劑，諸如選擇性地結合至先天及/或後天免疫系統之細胞的病毒蛋白。或者或另外，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)視情況連接或結合(直接或間接地)至促進自混合物(例如，標籤)中分離之部分或具有報導子活性之部分(例如，偵測標籤或報導蛋白)。應瞭解，本文所描述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之特徵亦擴展至包含可活化ROR結合劑片段之多肽。
在一些實施例中，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)連接或結合(直接或間接)至另一藥劑。在一些實施例中，額外藥劑為藥物，從而產生ADC。
在一些實施例中，本文所述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)結合或以重組方式連接(直接或間接)至治療劑(例如細胞毒性劑或細胞介素)或診斷劑或可偵測劑。結合或以重組方式連接之抗體可適用於例如治療或預防疾病、病症或病狀，諸如ROR介導之疾病、病症或病狀。結合或以重組方式連接之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可適用於例如監測或預測ROR介導之疾病、病症或病狀之發作、發展、進展及/或嚴重程度。
此類診斷及偵測可例如藉由使可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)與包括例如以下之可偵測物質偶合來實現：酶，包括但不限於辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，包括但不限於鏈黴抗生物素蛋白/生物素或抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，包括但不限於傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三𠯤基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，包括但不限於流明諾(luminol)；生物發光材料，包括但不限於螢光素酶、螢光素或發光蛋白質(aequorin)；化學發光材料，包括但不限於基於吖啶之化合物或HALOTAG；放射性材料，包括但不限於碘( 131I、 125I、 123I及 121I)、碳( 14C)、硫( 35S)、氚( 3H)、銦( 115In、 113In、 112In及 111In)、鎝( 99Tc)、鉈( 201Ti)、鎵( 68Ga及 67Ga)、鈀( 103Pd)、鉬( 99Mo)、氙( 133Xe)、氟( 18F)、 153Sm、 177Lu、 159Gd、 149Pm、 140La、 175Yb、 166Ho、 90Y、 47Sc、 186Re、 188Re、 142Pr、 105Rh、 97Ru、 68Ge、 57Co、 65Zn、 85Sr、 32P、 153Gd、 169Yb、 51Cr、 54Mn、 75Se、 113Sn或 117Sn；使用各種正子發射斷層攝影之正電子發射金屬；及非放射性順磁性金屬離子。
本文亦描述以重組方式連接或結合(直接或間接地共價或非共價結合)至異源蛋白質或多肽或其片段，例如多肽(例如，約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100個胺基酸)以產生融合蛋白之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，以及其用途。特定言之，本文描述融合蛋白，其包含本文中所描述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)的抗原結合片段(例如，包含VH及/或VL之CDR1、CDR2及/或CDR3)及異源蛋白質、多肽或肽。在一些實施例中，可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)所連接之異源蛋白質、多肽或肽可用於將可活化ROR結合劑靶向至特定細胞(例如ROR表現細胞，包括腫瘤細胞)。可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)所連接之其他非限制性異源蛋白質、多肽或肽可用作內化信號或使腫瘤細胞與免疫細胞接合。
此外，本文所描述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體) (包括可活化人類ROR結合劑)可連接(直接地或間接地)至標記物或「標籤」序列(諸如肽)以促進純化。在一些實施例中，標記或標籤胺基酸序列為六-組胺酸肽，諸如尤其為提供於pQE載體(參見例如QIAGEN, Inc.)中之標籤，其中之許多為市售的。舉例而言，如Gentz等人, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-24中所描述，六-組胺酸為融合蛋白之純化提供便利。適用於純化之其他肽標籤包括但不限於血球凝集素(「HA」)標籤，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白之抗原決定基(Wilson等人, 1984, Cell 37:767-78)，及「FLAG」標籤。
用於將部分(包括多肽)連接或結合(直接或間接地)至抗體之方法為此項技術中所熟知的，其中之任一者可用於製備本文中所描述之抗體-藥物結合物或融合蛋白。
在一些實施例中，本文中所描述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)為融合蛋白。如本文中所使用，術語「融合蛋白」係指包含結合劑(例如抗體)之胺基酸序列及異源多肽或蛋白質(例如，多肽或蛋白質通常不為抗體之一部分)之胺基酸序列的多肽。在某些實施例中，融合蛋白保留可活化ROR結合劑之生物活性。在某些實施例中，融合蛋白包含可活化ROR抗體VH區、VL區、VH CDR (一、二或三個VH CDR)及/或VL CDR (一、二或三個VL CDR)，其中融合蛋白結合至ROR抗原決定基、ROR片段及/或ROR多肽。在一些實施例中，融合蛋白包含可活化ROR抗體之VH或重鏈、可活化ROR抗體之VL或輕鏈，其藉由連接子，諸如可裂解連接子分隔開。
融合蛋白可透過例如基因改組、模體改組、外顯子改組及/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)之技術產生。DNA改組可用於改變如本文所描述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體) (包括可活化人類ROR結合劑)，包括例如具有較高親和力及較低解離速率之ROR結合劑之活性(參見例如美國專利第5,605,793號；第5,811,238號；第5,830,721號；第5,834,252號；及第5,837,458號；Patten等人, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82；Hansson等人, 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76；及Lorenzo及Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-13)。在一些實施例中，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑可藉由在重組之前藉由易錯PCR、隨機核苷酸插入或其他方法進行隨機突變誘發而改變。編碼本文中所描述之可活化ROR結合劑的聚核苷酸可與一或多個異源分子之一或多種組分、模體、區段、部分、域、片段等重組。
本文中所描述之包括人類可活化ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)亦可連接至固體支撐物，其適用於標靶抗原之免疫分析或純化。此類固體支撐物包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、耐綸、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本文所描述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)亦可連接或結合(直接或間接)至第二抗體以形成抗體異結合物。
連接子可為促進經連接或結合之藥劑在細胞中釋放的「可裂解部分」，但本文亦涵蓋不可裂解連接子。用於本揭示案之結合物(例如ADC)之連接子包括但不限於酸不穩定連接子(例如腙連接子)、含二硫鍵之連接子、肽酶敏感性連接子(例如，包含胺基酸之肽連接子，例如纈胺酸及/或瓜胺酸，諸如瓜胺酸-纈胺酸或苯丙胺酸-離胺酸)、光不穩定連接子、二甲基連接子、硫醚連接子或經設計以逃避多藥轉運蛋白介導之抗性的親水性連接子。
抗體和藥劑之結合物，包括其中該藥劑係用於製備ADC之藥物，可使用各種雙官能蛋白質偶合劑製備。
本揭示案進一步涵蓋抗體及藥劑之結合物，包括其中藥劑為用於製備ADC之藥物，可使用如此項技術中所揭示之任何適合方法(參見例如Bioconjugate Techniques (Hermanson編, 第2版, 2008))製備。
抗體及藥劑(包括其中藥劑為用於製備ADC之藥物)之習知結合策略已基於涉及Lys殘基之ε-胺基或Cys殘基之硫醇基的隨機結合化學反應，其產生非均質結合物。新近研發的技術允許與抗體定點結合，從而產生均質負載且避免結合物亞群的抗原結合或藥物動力學發生變化。此等技術包括「thiomab」之工程化，其包含重鏈及輕鏈上之位置處的半胱胺酸取代，該等半胱胺酸取代提供反應性硫醇基且不破壞免疫球蛋白摺疊及組裝或改變抗原結合(參見例如Junutula等人, 2008, J. Immunol. Meth. 332: 41-52；及Junutula等人, 2008, Nature Biotechnol. 26:925-32)。在另一方法中，硒半胱胺酸係藉由將來自終端之終止密碼子UGA重新編碼成硒半胱胺酸插入序列而共轉譯地插入至抗體序列中，從而允許在存在其他天然胺基酸之情況下在硒半胱胺酸之親核性硒醇基團處的位點特異性共價結合(參見例如Hofer等人, 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:12451-56；及Hofer等人, 2009, Biochemistry 48(50):12047-57)。
在一些實施例中，本文中所描述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)結合至藥劑，例如免疫活化劑或細胞毒性劑。在一些實施例中，本文中所揭示之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可視情況與本文中所揭示或此項技術中已知之一或多種細胞毒性劑結合，從而產生ADC。在一些實施例中，細胞毒性劑係化學治療劑。在一些實施例中，細胞毒性劑係細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段。在一些實施例中，細胞毒性劑為放射性同位素，以產生放射性結合物或放射性結合劑。多肽或分子與一或多種小分子毒素之結合物。多肽或分子與細胞毒性藥劑之結合物係使用多種雙官能蛋白質偶合劑製備。
在其他實施例中，本文中所描述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)結合至藥物，諸如信號轉導調節劑、促凋亡劑、有絲分裂抑制劑、抗腫瘤抗生素、免疫調節劑、用於基因療法之核酸、烷基化劑、抗血管生成劑、抗代謝物、含硼劑、化學保護劑、激素劑、抗激素劑、皮質類固醇、光活性治療劑、寡核苷酸、放射性核種劑、放射增敏劑、拓樸異構酶抑制劑(諸如喜樹鹼(camptothecin)或其類似物)，及酪胺酸激酶抑制劑。
本文中所描述之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可具有單特異性、雙特異性、三特異性或更高之多特異性。此等藥劑可包括單特異性或多特異性可活化抗體。多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)為單株抗體，其對至少兩個不同標靶(例如抗原)或同一標靶上之兩個不同抗原決定基具有結合特異性(例如，針對ROR之雙特異性抗體，其具有針對ROR之第一抗原決定基的第一結合域及針對ROR之第二抗原決定基的第二結合域)。在一些實施例中，單特異性及多特異性(例如雙特異性)抗體可基於本文中所描述之抗體之序列，例如 表 1中所列出之CDR序列來構築。在一些實施例中，本文所描述之多特異性抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體為小鼠、嵌合、人類或人源化抗體。
在一些實施例中，多特異性抗體之結合特異性中之一者係針對ROR且另一者係針對任何其他標靶(例如，抗原)。在一些實施例中，多特異性(例如雙特異性)抗體可包含超過一個標靶(例如，抗原)結合域，其中不同結合域對不同標靶具有特異性(例如，第一結合域結合ROR且第二結合域結合另一標靶(例如，抗原))。
在一些實施例中，多特異性(例如雙特異性)抗體分子可結合相同標靶(例如，抗原)上超過一個(例如，兩個或更多個)抗原決定基。
用於製備多特異性抗體之方法為此項技術中已知的，諸如藉由兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性(參見例如Milstein及Cuello, 1983, Nature 305:537-40)。關於產生多特異性抗體(例如雙特異性抗體)之其他細節，參見例如Bispecific Antibodies (Kontermann編, 2011)。
多特異性抗體之例示性結構為此項技術中已知的且進一步描述於Weidle等人, 2013, Cancer Genomics & Proteomics 10: 1-18；Brinkman等人, 2017, MABS, 9:2, 182-212；Godar等人, 2018, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 28:3, 251-276；及Spiess等人, 2015, Mol. Immunol. 67 95-106中。
舉例而言，雙特異性抗體分子可分類為不同結構組：(i)雙特異性免疫球蛋白G (BsIgG)；(ii) 與額外抗原結合部分附接之IgG；(iii)雙特異性抗體片段；(iv)雙特異性融合蛋白；及(v)雙特異性抗體結合物。作為非限制性實例，BsIgG型式可包括crossMab、DAF (二合一)、DAF (四合一)、DutaMab、DT-IgG、臼包杵(knobs-in-holes)共同LC、臼包杵總成、電荷對、Fab-臂交換、SEED體、三功能單抗(triomab)、LUZ-Y、Fcab、κλ體及/或正交Fab。
在一些實施例中，BslgG包含經工程改造以用於異二聚之重鏈。舉例而言，重鏈可經工程改造以使用「臼包杵」策略、SEED平台、共同重鏈(例如，以κλ體形式)及使用異二聚體Fc區進行異二聚。策略為此項技術中已知的，以避免BsIgG中之均二聚體之重鏈配對，包括臼包杵、雙抗體(duobody)、azymetric、電荷對、HA-TF、SEED體及差異蛋白質A親和力。
另一雙特異性抗體型式為與額外抗原結合部分附接之IgG。舉例而言，單特異性IgG可藉由將額外抗原結合單元附接於單特異性IgG上(例如，在重鏈或輕鏈之N端或C端處)而經工程改造以具有雙特異性。例示性額外抗原結合單元包括單域抗體(例如，可變重鏈或可變輕鏈)、經工程改造之蛋白質骨架及經配對之抗體可變域(例如，單鏈可變片段或可變片段)。附接IgG格式之非限制性實例包括雙重可變域IgG (DVD-Ig)、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、zybody及DVI-IgG (四合一)。參見Spiess等人, Mol. Immunol. 67(2015):95-106。在一些實施例中，例示性抗體型式為例如WO 2018/075692及美國專利公開案第2018/0118811號中所描述的單特異性或多特異性B-Body型式(例如雙特異性抗體)。
雙特異性(Bs)抗體(BsAb)片段為缺少一些或全部抗體恆定域之雙特異性抗體分子型式。舉例而言，一些BsAb缺少Fc區。在實施例中，雙特異性抗體片段包括藉由肽連接子連接之重鏈及輕鏈區，該肽連接子准許BsAb在單一宿主細胞中之有效表現。雙特異性抗體片段之非限制性實例包括但不限於奈米抗體、奈米抗體-HAS、BiTE、雙功能抗體、DART、TandAb、sc雙功能抗體、sc雙功能抗體-CH3、雙功能抗體-CH3、三體(triple body)、微型抗體(miniantibody)、微抗體(minibody)、TriBi微抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab') 2、F(ab') 2-scFv 2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙功能抗體-Fc、雙功能抗體-Fc、串聯scFv-Fc及胞內抗體(intrabody)。
雙特異性融合蛋白包括連接至其他蛋白質之抗體片段。舉例而言，雙特異性融合蛋白可連接至其他蛋白質以添加額外特異性及/或功能性。在一些實施例中，可使用對接及鎖定(dock-and-lock；DNL)方法來產生具有更高價數之雙特異性抗體分子。舉例而言，與白蛋白結合蛋白或人類血清白蛋白之雙特異性抗體融合物可延長抗體片段之血清半衰期。在實施例中，化學結合(例如，抗體及/或抗體片段之化學結合)可用於產生BsAb分子。例示性雙特異性抗體結合物包括CovX體型式，其中低分子量藥物位點特異性地結合至各Fab臂或抗體或其片段中之單一反應性離胺酸。在一些實施例中，結合改良血清半衰期。
產生多特異性抗體(包括雙特異性抗體)之方法為此項技術中已知的。舉例而言，多特異性抗體(包括雙特異性抗體)可藉由在不同宿主細胞中單獨表現組分抗體且隨後純化/組裝或藉由在單一宿主細胞中表現組分抗體來產生。多特異性(例如雙特異性)抗體分子之純化可藉由此項技術中已知之各種方法(包括親和力層析法)進行。
在一些實施例中，本文中所揭示之包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可提供於本文中所揭示或此項技術中已知之任何抗體型式中。作為非限制性實例，在一些實施例中，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可選自Fab串聯-lg (FIT-lg)；DVD-lg；雜交融合瘤(四聯瘤或四體雜交瘤)；抗運載蛋白平台(Pieris)；雙功能抗體；單鏈雙功能抗體；串聯單鏈Fv片段；TandAb，三特異性Ab (Affimed)；Darts雙重親和力再靶向(Macrogenics)；雙特異性Xmab (Xencor)；雙特異性T細胞接合子(Bites；Amgen；55kDa)；三功能抗體；三功能抗體= Fab-scFv融合蛋白多官能性重組抗體衍生物(CreativeBiolabs)；雙抗體平台(Genmab)；dock and lock平台；臼包杵(KIH)平台；人源化雙特異性IgG抗體(REGN1979) (Regeneron)；Mab2雙特異性抗體(F-Star)；DVD-lg=雙重可變域免疫球蛋白(Abbott)；κ-λ體；TBTI =四價雙特異性串聯Ig；及CrossMab (Roche)。
在一些實施例中，本文中所揭示之多特異性(例如雙特異性)抗體包含ROR結合域及結合至一或多個非ROR標靶之一或多個額外結合域。在一些實施例中，本文所揭示之多特異性(例如，雙特異性)抗體包含ROR結合域，其包含如本文所揭示之VH及/或VL胺基酸序列，諸如 表 1之彼等。
在一些實施例中，本文描述一種多特異性(例如，雙特異性)抗體，其包含結合於ROR的結合域，該結合域包含本文所揭示之VH及VL CDR，諸如 表 1中所闡述之彼等。
在一些實施例中，可活化ROR結合劑為包含第一結合域及第二結合域之雙特異性抗體。在一些實施例中，第一結合域包含如 表 1之一列中所列出之六個CDR。在一些實施例中，第一結合域包含如SEQ ID NO: 25中所闡述之重鏈可變區的三個CDR及如SEQ ID NO: 26中所闡述之輕鏈可變區的三個CDR。在一些實施例中，第一結合域包含如SEQ ID NO: 25中所闡述之重鏈可變區及如SEQ ID NO: 26中所闡述之輕鏈可變區。
在另一態樣中，本文中所提供之可活化抗體或其抗原結合片段可為經工程改造之細胞表面受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)之一部分。通常，CAR包含胞外域、跨膜域及胞內信號傳導域。
在一些實施例中，本文提供一種CAR，其包含有包含一或多種本文中所提供之可活化抗體或其片段的胞外域。在一些實施例中，本文中所提供之CAR之胞外域包含本文中所揭示之VH及VL CDR，諸如 表 1中所闡述之CDR。
本揭示案之CAR包含可與胞外抗原結合域直接或間接融合之跨膜域。跨膜結構域可來源於天然或合成來源。如本文中所使用，「跨膜域」係指在細胞膜，較佳在真核細胞膜中為熱力學上穩定之任何蛋白質結構。與本文中所描述之CAR相容使用之跨膜域可自天然存在之蛋白質獲得。或者，其可為合成的非天然存在之蛋白質區段，例如在細胞膜中為熱力學上穩定之疏水性蛋白質區段。跨膜域係基於跨膜域之三維結構分類。舉例而言，跨膜域可形成α螺旋、超過一個α螺旋之複合物、β-桶，或能夠跨越細胞之磷脂雙層之任何其他穩定結構。
本揭示案之CAR包含胞內信號傳導域。胞內信號傳導域負責表現CAR之免疫效應細胞之正常效應功能中之至少一者的活化。術語「效應功能」係指細胞之特殊功能。T細胞之效應功能例如可為溶胞活性或輔助活性，包括分泌細胞激素。因此，術語「細胞質信號傳導域」係指轉導效應功能信號且引導細胞執行特殊功能之蛋白質的部分。雖然通常可採用整個細胞質信號傳導域，但在許多情況下，無需使用整條鏈。就使用細胞質信號傳導域之經截短部分而言，此類經截短部分可用於替代完整鏈，只要其轉導效應功能信號即可。因此，術語細胞質信號傳導域意謂包括足以轉導效應功能信號之細胞質信號傳導域的任何經截短部分。
在一些實施例中，胞內信號傳導域包含免疫效應細胞之主要胞內信號傳導域。在一些實施例中，CAR包含基本上由免疫效應細胞之主要胞內信號傳導域組成的胞內信號傳導域。「主要胞內信號傳導域」係指以刺激性方式起作用以誘導免疫效應功能之細胞質信號傳導序列。
除了刺激抗原特異性信號以外，許多免疫效應細胞需要共刺激以促進細胞增殖、分化及存活，以及活化細胞之效應功能。在一些實施例中，CAR包含至少一個共刺激信號傳導域。如本文中所使用，術語「共刺激信號傳導域」係指介導細胞內之信號轉導以誘導免疫反應(諸如效應功能)之蛋白質之至少一部分。
本揭示案之CAR可包含位於胞外抗原結合域與跨膜域之間的鉸鏈域。鉸鏈域為胺基酸區段，其通常存在於蛋白質的兩個域之間且可允許蛋白質之可撓性及該等域中之一或兩者相對於彼此的移動。可使用提供此類可撓性及效應分子之胞外抗原結合域相對於跨膜域之移動的任何胺基酸序列。
本揭示案之CAR在多肽之N端處可包含信號肽(亦稱為信號序列)。一般而言，信號肽為使多肽靶向細胞中之所需位點的肽序列。
包含本文中所提供之抗體或片段的其他經工程改造之跨膜受體亦包括於本揭示案中。 5.4. 核酸、載體及細胞
另外提供一種編碼如本文中所揭示之可活化ROR結合劑(例如，可活化抗體或抗體片段)或融合多肽之核酸、與其互補之核酸；包含如本文中所揭示之核酸的載體；及包含以下中之任一或多者的細胞：如本文中所揭示之可活化ROR結合劑、如本文中所揭示之核酸或如本文中所揭示之載體。在一些實施例中，細胞表現可活化ROR結合劑。在一些實施例中，細胞複製核酸或載體。在一些實施例中，提供用於產生可活化ROR結合劑(例如可活化人類ROR結合劑)及其片段之材料。舉例而言，分離之細胞可產生可活化ROR結合劑(例如，可活化抗體或抗體片段)。就此而言，細胞(例如經分離之細胞)可產生包含如本文中所揭示之VH及VL的可活化抗體或其片段。在一些實施例中，本文中所描述之聚核苷酸可包含一或多種編碼可活化ROR結合劑(例如，可活化抗體或抗體片段)之核酸序列。在一些實施例中，聚核苷酸為經分離及/或重組之聚核苷酸。在各個態樣中，經分離之聚核苷酸包含編碼VH及/或VL之核苷酸序列，其中VH及VL包含與如本文中所揭示之CDR一致的互補決定區(CDR)。
如本文中所使用，術語「互補」係指基於聚核苷酸之序列的聚核苷酸之間的特異性結合。如本文中所使用，若第一聚核苷酸與第二聚核苷酸在嚴格條件下在雜交分析法中彼此結合，例如若其在雜交分析法中產生給定或可偵測水平之信號，則其為互補的。聚核苷酸之各部分在其遵循習知鹼基配對規則(例如A與T (或U)配對且G與C配對)時彼此互補，但可能存在失配、插入或缺失序列之小區域(例如，少於約3個鹼基)。術語「嚴格分析法條件」係指以下條件：與產生具有充足互補性之核酸(例如探針及標靶mRNA)之結合對以便在分析法中提供所需程度之特異性相容，同時通常與形成具有不充足互補性之結合成員之間的結合對以便提供所需特異性不相容。術語「嚴格分析法條件」通常係指雜交條件及洗滌條件之組合。
在一些實施例中，一或多種載體(例如，表現載體)可包含一或多種聚核苷酸，其用於在適合宿主細胞中表現一或多種聚核苷酸。使用重組技術，此等載體適用於例如擴增宿主細胞中之聚核苷酸以產生其適用數量，及用於表現可活化結合劑，諸如可活化抗體或抗體片段。
在一些實施例中，一或多種載體為表現載體，其中一或多種聚核苷酸可操作地連接至包含表現控制序列之一或多種聚核苷酸。特別考慮了自控複製的重組表現構築體，諸如併有一或多種聚核苷酸的質體及病毒DNA載體，該等聚核苷酸編碼結合ROR的可活化抗體序列。表現控制DNA序列包括啟動子、強化子及操縱子，且通常基於其中將使用表現構築體之表現系統來選擇。啟動子及強化子序列通常根據其增強基因表現之能力來選擇，而操縱子序列通常根據其調節基因表現之能力來選擇。表現構築體亦可包括編碼一或多種可選標記物之序列，該一或多種可選標記物准許對攜載構築體之宿主細胞之鑑別。表現構築體亦可包括有助於且較佳促進宿主細胞中之同源重組的序列。在一些實施例中，表現構築體亦可包括在宿主細胞中複製所必需之序列。
例示性表現控制序列包括啟動子/強化子序列，例如巨細胞病毒啟動子/強化子(Lehner等人, J. Clin. Microbiol., 29: 2494-2502, 1991；Boshart等人, Cell, 41: 521-530, 1985)；勞斯氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子(Davis等人, Hum. Gene Ther., 4: 151, 1993)；Tie啟動子(Korhonen等人, Blood, 86(5): 1828-1835, 1995)；猿猴病毒40啟動子；DRA (在腺瘤中下調；Alrefai等人, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 293: G923-G934, 2007)；MCT1 (單羧酸轉運蛋白1；Cuff等人, Am. J. Physiol. Gastrointet. Liver Physiol., G977-G979. 2005)；及用於在哺乳動物細胞中表現之Math1 (小鼠無調性同源物1；Shroyer等人, Gastroenterology, 132: 2477-2478, 2007)，該啟動子可操作地連接多肽編碼序列之上游(例如5')。在另一變化形式中，啟動子為上皮特異性啟動子或內皮特異性啟動子。聚核苷酸亦可視情況包括可操作地連接多肽編碼序列之下游(例如3')的適合聚腺苷酸化序列(例如，SV40或人類生長激素基因聚腺苷酸化序列)。
必要時，一或多種聚核苷酸亦視情況包含編碼分泌信號肽之核苷酸序列，該等分泌信號肽與多肽序列在框架內融合。分泌信號肽藉由表現一或多種聚核苷酸之細胞引導抗體多肽之分泌，且藉由細胞自所分泌之多肽裂解。一或多種聚核苷酸可進一步視情況包含僅預期功能有助於載體之大規模生產的序列。吾人可使用文獻中關於各種轉殖基因已描述之程序來製造且投與聚核苷酸以用於基因療法。參見例如Isner等人, Circulation, 91: 2687-2692, 1995；及Isner等人, Human Gene Therapy, 7: 989-1011, 1996。
在一些實施例中，聚核苷酸可進一步包含額外序列以促進宿主細胞之吸收及抗體或其片段(及/或任何其他肽)之表現。在一些實施例中，採用編碼本文中所描述之抗體或其片段的「裸」轉殖基因(例如，不具有病毒、脂質體或促進轉染之其他載體的轉殖基因)。
本揭示案之聚核苷酸可呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因體DNA及合成DNA；且可為雙股或單股，且若為單股，則可為編碼股或非編碼(反義)股。在一些實施例中，聚核苷酸呈cDNA形式。在一些實施例中，聚核苷酸為合成聚核苷酸。
本揭示案進一步係關於本文中所描述之聚核苷酸的變異體，其中變異體編碼例如本揭示案之結合分子之片段、類似物及/或衍生物。在某些實施例中，本揭示案提供一種聚核苷酸，其包含具有與編碼本揭示案之結合分子的聚核苷酸至少約75%一致、至少約80%一致、至少約85%一致、至少約90%一致、至少約95%一致，且在一些實施例中，至少約96%、97%、98%或99%一致之核苷酸序列的聚核苷酸。如本文所使用，片語「與參考核苷酸序列具有至少例如95%「一致性」之聚核苷酸」欲意謂該聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但該聚核苷酸序列可參考核苷酸序列之每100個核苷酸包括至多五個點突變。換言之，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列之聚核苷酸，參考序列中之核苷酸之至多5%可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中之全部核苷酸之至多5%的多個核苷酸可插入參考序列中。參考序列中之此等突變可發生於參考核苷酸序列之5'或3'端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散置於參考序列之核苷酸中或參考序列內的一或多個鄰接基團中。
聚核苷酸變異體可含有編碼區、非編碼區或兩者之變化。在一些實施例中，聚核苷酸變異體含有產生靜默取代、添加或缺失，但不改變經編碼之多肽之特性或活性的變化。在一些實施例中，聚核苷酸變異體包含靜默取代，其不引起多肽之胺基酸序列發生變化(由於基因密碼之簡併)。聚核苷酸變異體可出於多種原因產生，例如使特定宿主之密碼子表現最佳化(亦即，將人類mRNA中之密碼子改變為諸如大腸桿菌之細菌宿主偏好的密碼子)。在一些實施例中，聚核苷酸變異體在序列之非編碼區或編碼區中包含至少一個靜默突變。
在一些實施例中，產生聚核苷酸變異體以調節或改變經編碼之多肽之表現(或表現水準)。在一些實施例中，產生聚核苷酸變異體以增強經編碼多肽之表現。在一些實施例中，產生聚核苷酸變異體以減少經編碼多肽之表現。在一些實施例中，相較於親本聚核苷酸序列，聚核苷酸變異體使經編碼多肽之表現增強。在一些實施例中，相較於親本聚核苷酸序列，聚核苷酸變異體使經編碼多肽之表現減少。
可使用任何適合之載體將一或多種編碼抗體或其片段之聚核苷酸引入宿主中。已經描述之例示性載體包括複製缺陷型反轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體(Kim等人, J. Virol., 72(1): 811-816, 1998；Kingsman及Johnson, Scrip Magazine, 1998年10月, 第43-46頁)；細小病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體(美國專利第5,474,935l號、第5,139,941號、第5,622,856號、第5,658,776號、第5,773,289號、第5,789,390號、第5,834,441號、第5,863,541號、第5,851,521號、第5,252,479；Gnatenko等人, J. Invest. Med., 45: 87-98, 1997)；腺病毒(AV)載體(美國專利第5,792,453號、第5,824,544號、第5,707,618號、第5,693,509號、第5,670,488號、第5,585,362號；Quantin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2581-2584, 1992；Stratford Perricaudet等人, J. Clin. Invest., 90: 626-630, 1992；及Rosenfeld等人, Cell, 68: 143-155, 1992)；腺病毒腺相關病毒嵌合體(美國專利第5,856,152號)或者牛痘病毒或疱疹病毒載體(美國專利第5,879,934號、第5,849,571號、第5,830,727號、第5,661,033號、第5,328,688號)；脂質體介導之基因轉移(BRL)；脂質體載體(美國專利第5,631,237號)；及其組合。此等表現載體中之任一者可使用描述於例如Sambrook等人, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 第2d版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates及John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)中之標準重組DNA技術製備。視情況，病毒載體藉由例如缺失或中斷病毒複製所需之所選基因而呈現複製缺陷型。
預期之其他非病毒遞送機制包括磷酸鈣沉澱((Graham及Van Der Eb, Virology, 52: 456-467, 1973；Chen及Okayama, Mol . Cell Biol., 7: 2745-2752, 1987；Rippe等人, Mol . Cell Biol., 10: 689-695, 1990)、DEAE-聚葡萄糖(Gopal, Mol . Cell Biol., 5: 1188-1190, 1985)、電穿孔(Tur-Kaspa等人, Mol . Cell Biol., 6: 716-718, 1986；Potter等人, Proc . Nat . Acad . Sci . USA, 81: 7161-7165, 1984)、直接顯微注射(Harland及Weintraub, J . Cell Biol., 101: 1094-1099, 1985)、DNA負載脂質體(Nicolau及Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721: 185-190, 1982；Fraley等人, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 76: 3348-3352, 1979；Felgner, Sci Am., 276(6): 102-6, 1997；Felgner, Hum Gene Ther., 7(15): 1791-3, 1996)、細胞音波處理(Fechheimer等人, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 84: 8463-8467, 1987)、使用高速度微彈之基因轟擊(Yang等人, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 87: 9568-9572, 1990)及受體介導之轉染(Wu及Wu, J . Biol . Chem., 262: 4429-4432, 1987；Wu及Wu, Biochemistry, 27: 887-892, 1988；Wu及Wu, Adv . Drug Delivery Rev., 12: 159-167, 1993)。
載體(或抗體或其片段或如本文所論述之核酸)可包埋於脂質體中。參見例如Ghosh及Bachhawat, Liver diseases , targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu G, Wu C編, New York: Marcel Dekker,第87-104頁(1991)；Radler等人, Science, 275(5301): 810-814, 1997)。亦涵蓋涉及「脂質體轉染」技術之各種商業方法。在一些實施例中，脂質體可與血球凝集病毒(HVJ)複合。此已展示促進與細胞膜之融合且促進脂質體囊封之DNA進入細胞(Kaneda等人, Science, 243: 375-378, 1989)。在一些實施例中，脂質體與核非組蛋白染色體蛋白(HMG-1)複合或組合使用(Kato等人, J . Biol . Chem ., 266: 3361-3364, 1991)。在一些實施例中，脂質體與HVJ及HMG-1兩者複合或組合使用。此類表現構築體已成功地用於活體外及活體內轉移及表現核酸。在一些實施例中，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)係包括於脂質體中，以將脂質體靶向至在其表面上表現ROR之細胞(諸如腫瘤細胞)。
細胞可包含一或多種聚核苷酸或一或多種載體，例如細胞經一或多種編碼包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之聚核苷酸，或一或多種包含一或多種聚核苷酸之載體轉型或轉染。在一些實施例中，細胞表現包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，該結合劑含有一或多個，包括六個與 表 1中描繪之抗體之CDR具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的CDR。在一些實施例中，細胞表現包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，該結合劑含有包括與 表 1中描繪之抗體之CDR相同之CDR的VH及VL。細胞可為原核細胞，諸如大腸桿菌( Escherichia coli)細胞(參見例如Pluckthun等人, Methods Enzymol., 178: 497-515, 1989)；或真核細胞，諸如動物細胞(例如骨髓瘤細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或融合瘤細胞)；酵母(例如釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae))、昆蟲細胞或植物細胞(例如菸草、玉米、大豆或稻米細胞)。使用哺乳動物宿主細胞可提供轉譯修飾(例如醣基化、截斷、脂質化及磷酸化)，可能需要該等轉譯修飾來為重組表現產物賦予最佳生物活性。類似地，多肽(例如可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)，包括可活化人類ROR結合劑)可經醣基化或非醣基化及/或已經共價修飾，以包括一或多種水溶性聚合物連接物，諸如聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。
用於將DNA或RNA引入宿主細胞中之方法為熟知的且包括轉型、轉染、電穿孔、細胞核注射或與載劑(諸如脂質體、膠束、空骸細胞及原生質體)融合。此等宿主細胞適用於擴增聚核苷酸且亦用於表現由聚核苷酸編碼之多肽。就此而言，用於產生可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之方法可包含培養宿主細胞及分離可活化ROR結合劑。將裸DNA表現構築體轉移至細胞中可使用粒子轟擊實現，此視以下而定：使經DNA塗佈之微彈加速至高速，從而允許其穿透細胞膜且進入細胞而不殺死細胞的能力(Klein等人, Nature, 327: 70-73, 1987)。已開發出用於使小粒子加速之若干裝置。一個此類裝置依賴於高電壓放電以產生電流，電流又提供原動力(Yang等人, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 87: 9568-9572, 1990)。所使用之微彈係由諸如鎢或金珠粒之生物學上之惰性物質組成。可分離及/或純化宿主細胞。宿主細胞亦可為活體內轉型之細胞以在活體內引起多肽之短暫或永久性表現。宿主細胞亦可為離體轉型且轉型後引入的經分離之細胞，例如以在活體內產生用於治療目的之多肽。宿主細胞之定義明確地不包括轉殖基因人類。 5.5. 製備方法
結合ROR之抗體可藉由任何適合之方法獲得，諸如但不限於用包含ROR之全細胞免疫接種且收集抗體、重組技術或使用ROR細胞外域抗原決定基篩選抗體或抗體片段之庫。可使用多種已知技術產生單株抗體(參見例如Coligan等人(編), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991)； Monoclonal Antibodies , Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn及Bechtol (編) (1980)； Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow及Lane (編), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)；及Picksley等人, 「Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli」, DNA Cloning 2 : Expression Systems, 第2版, Glover等人(編), 第93頁(Oxford University Press 1995))。一種用於產生單株抗體之例示性技術包含用人類ROR抗原對動物進行免疫接種且由獲自動物之脾細胞產生融合瘤。融合瘤可產生結合ROR之單株抗體或抗體片段。
在另一實施例中，單株抗體或抗體片段可自使用例如 Antibody Phage Display: Methods and Protocols, P.M. O'Brien及R. Aitken編, Humana Press, Totawa N.J., 2002中所描述之技術產生的抗體噬菌體文庫分離。原則上，合成抗體純系藉由篩檢含有噬菌體之噬菌體文庫來選擇，該等文庫呈現融合至噬菌體鞘蛋白之抗體可變區(Fv)之各種片段。針對所需抗原篩選此等噬菌體庫。能夠結合於所需抗原的表現Fv片段之純系吸附至抗原且因此與文庫中之非結合純系分離。結合純系隨後自抗原溶離，且可藉由額外抗原吸附/溶離循環進一步增濃。
可變域可以單鏈Fv (scFv)片段形式(其中VH與VL經由短可撓性肽共價連接)或Fab片段形式(其中Fab片段各自與恆定域融合且非共價相互作用)功能性展示於噬菌體上，如例如Winter等人, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)中所描述。
VH及VL基因之譜系可藉由聚合酶連鎖反應(PCR)單獨地選殖且在噬菌體庫中隨機重組，其接著可以Winter等人, 見上文中所描述搜尋抗原結合純系。來自免疫來源之庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖原生譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一人類抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人, EMBO J, 12: 725-734 (1993)所述。最終，亦可以合成方式如下製備原生文庫：自幹細胞選殖未重排V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼CDR3高度可變區及實現活體外重排，如Hoogenboom及Winter, J . Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)所描述。
可藉由此項技術中已知的多種技術實現文庫之篩選。舉例而言，ROR (例如ROR多肽、片段或抗原決定基)可用於塗佈吸附盤之孔，在貼附至吸附盤之寄主細胞上表現且用於細胞分選，或結合至生物素以用經鏈黴抗生物素蛋白塗佈之珠粒捕捉，或用於任何其他淘選呈現庫之方法中。具有緩慢解離動力學(例如良好結合親和力)之抗體之選擇可藉由使用長時間洗滌及單價噬菌體呈現(如Bass等人, Proteins, 8: 309-314 (1990)及WO 92/09690中所描述)，以及抗原之低塗佈密度(如Marks等人, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)中所描述)來促成。
ROR結合劑(例如抗體)可藉由設計適合抗原篩檢程序以選擇所關注噬菌體純系，隨後使用VH及/或VL序列(例如Fv序列)或來自VH及VL序列之各種CDR序列由Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), 第1-3卷中所描述之所關注噬菌體純系及適合恆定區(例如Fc)序列構築全長可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)純系來獲得。
同樣地，結合ROR之人類抗體可藉由多種技術中之任一者產生，包括但不限於人類周邊血細胞(例如含有B淋巴球)之埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus；EBV)轉型、人類B細胞之活體外免疫接種、來自攜帶插入之人類免疫球蛋白基因的經免疫接種之轉殖基因小鼠之脾細胞的融合、自人類免疫球蛋白V區噬菌體庫之分離，或此項技術中已知且基於本文中之揭示內容的其他程序。用於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法進一步描述於例如Bruggemann等人, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 455 58, 1997；Jakobovits等人, Ann. N. Y. Acad. Sci., 764: 525 35, 1995；Green等人, Nature Genet., 7: 13-21, 1994；Lonberg等人, Nature, 368: 856-859, 1994；Taylor等人, Int. Immun. 6: 579-591, 1994；及美國專利第5,877,397號中。
舉例而言，結合ROR之人類抗體可自已經工程改造成回應於抗原攻擊而產生特異性人類抗體的轉殖基因動物獲得。舉例而言，WO 98/24893揭示具有人類Ig基因座之轉殖基因動物，其中歸因於內源性重鏈及輕鏈基因座之不活化，該等動物不產生功能性內源性免疫球蛋白。亦已描述能夠建立針對免疫原之免疫反應的轉殖基因非靈長類哺乳動物宿主，其中抗體具有靈長類動物恆定區及/或可變區，且其中編碼基因座之內源性免疫球蛋白經取代或不活化。WO 96/30498揭示使用Cre/Lox系統以修飾哺乳動物中之免疫球蛋白基因座，以便置換恆定區或可變區之全部或一部分，由此形成經修飾之抗體分子。WO 94/02602揭示具有不活化之內源性Ig基因座及功能性人類Ig基因座之非人類哺乳動物。美國專利第5,939,598號揭示製備轉殖基因小鼠之方法，其中小鼠缺乏內源性重鏈且表現包含一或多個異種恆定區之外源性免疫球蛋白基因座。使用轉殖基因動物，諸如本文中所描述之轉殖基因動物，可產生針對所選抗原分子之免疫反應，且產抗體細胞可自動物移除且用於產生分泌人類衍生之單株抗體的融合瘤。免疫接種方案、佐劑及其類似物為此項技術中已知的，且用於對例如WO 96/33735中所描述之轉殖基因小鼠進行免疫接種。可測試單株抗體抑制或中和對應蛋白質之生物活性或生理作用的能力。
在一些實施例中，本文中所描述之可活化ROR結合劑包含非抗體蛋白質骨架。此類非抗體蛋白質骨架之非限制性實例包括纖維結合蛋白骨架、抗運載蛋白、阿德奈汀(adnectin)、親和抗體、DARPin、菲諾體(fynomer)、阿菲亭(affitin)、阿非林(affilin)、高親和性多聚體(avimer)、富含半胱胺酸之打結素肽，或經工程改造之孔尼茲型抑制劑(Kunitz-type inhibitor)。用於產生此等非抗體蛋白質骨架之方法為此項技術中熟知的，其中之任一者均可用於產生包含非抗體蛋白質骨架之可活化ROR結合劑(參見例如，Simeon及Chen, Protein Cell, 9(1):3-14 (2018)；Yang等人, Annu Rev Anal Chem ( Palo Alto Calif ).10(1):293-320 (2017))。
用於自聚核苷酸產生抗體之各種方法通常為熟知的。舉例而言，基礎分子生物學程序係由Maniatis等人, Molecular Cloning , A Laboratory Manual,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989描述(亦參見，Maniatis等人,第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001)。另外，許多公開案描述適用於藉由操縱DNA、產生表現載體及轉化且培養適當細胞來製備抗體之技術(參見例如Mountain及Adair, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews之第1章, Tombs編, Intercept, Andover, UK, 1992；及Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel編, Wiley Interscience, New York, 1999)。
使用任何適合之方法，例如自經免疫接種之動物分離、以重組方式或以合成方式產生或經基因工程改造，包括以上文所描述來製備包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)。藉由例如抗體之蛋白分解水解獲得衍生自抗體之抗體片段。舉例而言，全抗體之木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化分別產生稱為F(ab') 2之5S片段或兩個單價Fab片段及一個Fc片段。F(ab) 2可使用硫醇還原劑進一步裂解以產生3.5S Fab單價片段。產生抗體片段之方法進一步描述於例如Edelman等人, Methods in Enzymology, 1: 422 Academic Press (1967)；Nisonoff等人, Arch. Biochem. Biophys., 89: 230-244, 1960；Porter, Biochem. J., 73: 119-127, 1959；美國專利第4,331,647號；及Andrews, S.M.及Titus, J.A. Current Protocols in Immunology(Coligan等人編), John Wiley & Sons, New York (2003),第2.8.1 2.8.10及2.10A.1 2.10A.5頁中。
包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可經基因工程改造。舉例而言，包括可活化人類ROR結合劑在內之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)包含例如由重組DNA工程改造技術產生之可變區域。就此而言，可變區視情況藉由插入、缺失或改變抗體之胺基酸序列而經修飾以產生所關注抗體，包括以上文所描述。例如藉由使用聚合酶連鎖反應以合成可變區使用產抗體細胞之mRNA作為模板來製備編碼所關注CDR之聚核苷酸(參見例如Courtenay Luck, 「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter等人(編), 第166頁(Cambridge University Press 1995)；Ward等人, 「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」, Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch等人,(編), 第137頁(Wiley Liss, Inc. 1995)；及Larrick等人, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2: 106-110, 1991)。目前抗體操縱技術允許構築經工程改造之可變區域，該等可變區域含有至少一個CDR且視情況含有來自第一抗體之一或多個構架胺基酸及來自第二抗體之可變區域的其餘部分。此等技術用於例如使抗體人源化或改良其對結合標靶之親和力。用於產生人源化抗體之例示性方法亦描述於以上章節中。
在一些實施例中，本文所描述之製備可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之方法包含培養本文所描述之細胞及表現可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)。
在一些實施例中，本文所描述之製備可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之方法進一步包含測試可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)維持可活化表型之能力，例如，在可溶時維持可活化表型之能力或當在哺乳動物細胞中表現時維持可活化表型之能力。
在一些實施例中，本文所描述之製備可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之方法包含如以下實例中所述之一個、兩個、三個或更多個步驟。在一些實施例中，製備本文所描述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)之方法如以下實例中所描述。 5.6. 醫藥組合物
在一個態樣中，本揭示案進一步提供一種組合物，諸如醫藥組合物，其包含以下中之至少一者：本文中所提供之可活化結合劑(例如，本揭示案之一種可活化抗體或其抗原結合片段)、本文中所提供之核酸、本文中所提供之載體或本文中所提供之細胞。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之本文中所提供之可活化ROR結合劑(例如，本文中所提供之可活化抗體或其抗原結合片段)及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之本文中所提供之核酸(諸如編碼本文中所提供之抗體或其抗原結合片段的核酸)及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之本文中所提供之載體(諸如包含如本文中所揭示之核酸及表現如本文中所揭示之可活化ROR結合劑的載體)及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含治療有效量之本文中所提供之細胞(諸如包含編碼本文中所提供之可活化抗體或其抗原結合片段之核酸及/或表現本文中所提供之可活化抗體或其抗原結合片段的細胞)及醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物係藉由將具有所需純度的本文所提供之結合劑、核酸、載體或細胞與視情況選用的生理學上可接受之賦形劑(參見例如Remington, Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, 1980))混合而以水溶液形式或凍乾或其他乾燥形式製備以供儲存。
本揭示案之結合劑、核酸、載體或細胞可調配成任何適合形式以便遞送至標靶細胞/組織，例如呈微膠囊或巨乳液形式(Remington, 見上文；Park等人, 2005, Molecules 10:146-61；Malik等人, 2007, Curr. Drug. Deliv. 4:141-51)、呈持續釋放調配物形式(Putney及Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16:153-57)，或呈脂質體形式(Maclean等人, 1997, Int. J. Oncol. 11:325-32；Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8:39-45)。
亦可將本文中所提供之結合劑、核酸、載體或細胞包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合所製備的微膠囊，例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；膠狀藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)；或巨乳液中。此類技術揭示於例如Remington, 見上文中。
各種組合物及遞送系統為已知的且可與本文中所描述之結合劑、核酸、載體或細胞一起使用，包括但不限於囊封於脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現抗體或其抗原結合片段之重組細胞中、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu及Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-32)、構築核酸作為逆轉錄病毒或其他載體之一部分等。在另一實施例中，組合物可作為控制釋放或持續釋放系統提供。在一個實施例中，可使用泵來達成控制釋放或持續釋放(參見例如Langer, 前述；Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40；Buchwald等人, 1980, Surgery 88:507-16；及Saudek等人, 1989, N. Engl. J. Med. 321:569-74)。在另一實施例中，聚合材料可用於達成本文中所提供之預防劑或治療劑(例如，本文中所描述之抗體或其抗原結合片段)或組合物的控制釋放或持續釋放(參見例如，Medical Applications of Controlled Release (Langer及Wise編, 1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen及Ball編, 1984)；Ranger及Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126；Levy等人, 1985, Science 228:190-92；During等人, 1989, Ann. Neurol. 25:351-56；Howard等人, 1989, J. Neurosurg. 71:105-12；美國專利第5,679,377號；第5,916,597號；第5,912,015號；第5,989,463號；及第5,128,326號；WO 99/15154及WO 99/20253)。持續釋放調配物中所用之聚合物之實例包括(但不限於)聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚乳酸交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。在一個實施例中，持續釋放型調配物中所用之聚合物呈惰性，不含可浸出雜質，儲存穩定，無菌且可生物降解。
在另一實施例中，控制釋放或持續釋放系統可近接特定標靶組織(例如鼻道或肺)置放，因此僅需要全身劑量之一部分(參見例如Goodson, Medical Applications of Controlled Release第2卷, 115-38 (1984))。控制釋放系統論述於例如Langer, 1990, Science 249:1527-33中。熟習此項技術者已知之任何技術可用於產生包含一或多種本文中所描述之可活化抗體或其抗原結合片段的持續釋放型調配物(參見例如美國專利第4,526,938號、WO 91/05548及WO 96/20698，Ning等人, 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-89；Song等人, 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97；Cleek等人, 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54；及Lam等人, 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60)。 5.7.     使用方法
在另一態樣中，提供治療疾病或病症之方法，該等方法包含向個體投與如本文所描述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)以治療疾病或病症。在較佳實施例中，疾病或病症與ROR表現(例如，ROR之過度表現)相關。在特定實施例中，此類可活化ROR抗原結合劑可用於治療表現ROR之癌症，包括表現ROR1抗原之癌症、表現ROR2抗原之癌症及/或表現ROR1抗原及ROR2抗原兩者之癌症。
在一些實施例中，本揭示案之可活化抗體可用於治療多種癌症。癌症可為膀胱癌、血液癌(骨髓白血病[急性及慢性]、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病、骨髓增生性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)、骨癌、骨髓癌、腦癌(星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚細胞瘤[松果體瘤]、多形性神經膠母細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤)、乳癌、結腸癌、食道癌(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃腸癌、齒齦癌、頭癌、腎臟癌(腺癌、威姆氏腫瘤(Wilm's tumor)[腎母細胞瘤]、淋巴瘤、白血病、腎細胞癌)、肝癌、肺癌、鼻咽癌、頸癌、卵巢癌、前列腺癌(腺癌、肉瘤、抗去勢前列腺癌)、皮膚癌、胃癌(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、睪丸癌(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎上皮癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質細胞癌瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂肪瘤)、舌癌或子宮癌。在一些實施例中，癌症可為贅瘤，惡性；癌；癌，未分化；巨細胞及梭狀細胞癌；小細胞癌；乳頭狀癌；鱗狀細胞癌；淋巴上皮癌；基底細胞癌；毛母質癌；移行細胞癌；乳頭狀移行細胞癌；腺癌；惡性胃泌素瘤；膽管癌；肝細胞癌；組合肝細胞癌及膽管癌；小樑腺癌；腺樣囊性癌症；腺瘤息肉中之腺癌；腺癌，家族性結腸息肉病；實體癌；類癌腫瘤，惡性；細支氣管肺泡腺癌；乳頭狀腺癌；嫌色細胞癌；嗜酸性癌；嗜氧性腺癌；嗜鹼性球癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾泡性腺癌；乳頭狀及濾泡性腺癌；無包膜硬化癌；腎上腺皮質癌；子宮內膜癌；皮膚附屬器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聹腺癌；黏液表皮樣癌；囊腺癌；乳頭狀囊腺癌；乳頭狀漿液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；戒環細胞癌；浸潤性導管癌；髓樣癌；小葉癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(paget's disease)；腺泡細胞癌；腺鱗癌；腺癌伴鱗狀化生；胸腺癌，惡性；卵巢間質瘤，惡性；泡膜細胞瘤，惡性；顆粒細胞瘤，惡性；睪丸母細胞瘤，惡性；塞特利氏細胞癌(sertoli cell carcinoma)；萊迪希氏細胞瘤(leydig cell tumor)，惡性；脂質細胞腫瘤，惡性；副神經節瘤，惡性；乳腺外副神經節瘤，惡性；嗜鉻細胞瘤；血管球肉瘤；惡性黑色素瘤；無黑色素性黑色素瘤；淺表擴散性黑色素瘤；巨型色素沉著黑斑中之惡性黑色素瘤；上皮樣細胞黑色素瘤；藍斑，惡性；肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤)；纖維肉瘤；纖維組織細胞瘤，惡性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；橫紋肌肉瘤；胚胎性橫紋肌肉瘤；腺泡狀橫紋肌肉瘤；間質肉瘤；混合瘤，惡性；苗勒混合瘤；腎母細胞瘤；肝母細胞瘤；癌肉瘤；間質瘤，惡性；布倫納氏瘤(brenner tumor)，惡性；葉狀腫瘤，惡性；滑膜肉瘤；間皮瘤，惡性；無性細胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，惡性；卵巢甲狀腺腫，惡性；絨毛膜癌；中腎瘤，惡性；血管肉瘤；血管內皮瘤，惡性；卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)；血管外皮瘤，惡性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮質旁骨肉瘤；軟骨肉瘤；軟骨母細胞瘤，惡性；間充質軟骨肉瘤；骨巨細胞瘤；尤文氏肉瘤(ewing's sarcoma)；牙源性腫瘤，惡性；釉質母細胞牙肉瘤；釉質母細胞瘤，惡性；釉質母細胞纖維肉瘤；松果體瘤，惡性；脊索瘤；神經膠質瘤，惡性；室管膜瘤；星形細胞瘤；原生質星形細胞瘤；原纖維星形細胞瘤；星形母細胞瘤；神經膠母細胞瘤；少突神經膠質瘤；少突神經膠質母細胞瘤；原始神經外胚層；小腦肉瘤；神經節母細胞瘤；神經母細胞瘤；視網膜母細胞瘤；嗅神經源性腫瘤；腦脊髓膜瘤，惡性；神經纖維肉瘤；神經鞘瘤，惡性；顆粒細胞瘤，惡性；惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)；霍奇金氏病(hodgkin's disease)；霍奇金氏；類肉芽腫；惡性淋巴瘤，小淋巴球性；惡性淋巴瘤，大細胞，瀰漫性；惡性淋巴瘤，濾泡性；蕈樣黴菌病；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；惡性組織細胞增多症；多發性骨髓瘤；肥大細胞肉瘤；免疫增殖性小腸疾病；白血病；淋巴性白血病；漿細胞白血病；紅白血病；淋巴肉瘤細胞白血病；骨髓白血病；嗜鹼性球白血病；嗜酸性球白血病；單核球性白血病；肥大細胞白血病；巨核母細胞白血病；骨髓肉瘤；毛細胞白血病；黏液瘤；橫紋肌瘤；纖維瘤；頭頸部鱗狀細胞癌；喉癌及下咽癌；鼻腔及鼻竇癌；鼻咽癌；唾液腺癌；口腔癌；咽癌；支氣管癌(鱗狀細胞癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌、非小細胞肺癌)；肺泡(細支氣管)癌；支氣管腺癌；軟骨瘤性錯構瘤；結腸直腸癌；胃腸道間質瘤；類癌；透克氏症候群(Turcot Syndrome)；胃癌；胃食管結合部腺癌；胰臟(導管腺癌、胰島素瘤、升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌腫瘤、血管活性腸肽瘤)；小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌腫瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)；大腸(腺癌、腎小管腺癌、絨毛腺癌、錯構瘤、平滑肌瘤)；轉移性乳癌；乳腺管原位癌；侵襲性乳腺管癌；管狀癌；黏液性癌；小葉原位癌；三陰性乳癌；膀胱及尿道(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌、尿道上皮癌)；透明細胞癌；肝癌(肝細胞癌)；血管肉瘤；肝細胞瘤；血管瘤；骨原性肉瘤(骨肉瘤)；惡性纖維組織細胞瘤；惡性巨細胞瘤脊索瘤；骨軟骨瘤(骨軟骨外生骨疣)；良性軟骨瘤；軟骨黏液性纖維瘤；骨樣骨瘤；巨細胞瘤；甲狀腺髓樣癌；分化型甲狀腺癌；乳頭狀甲狀腺癌；濾泡性甲狀腺癌；赫氏細胞癌(hurthle cell cancer)；甲狀腺未分化癌；顱骨(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃瘤、變形性骨炎)；腦膜(腦脊髓膜瘤、腦膜肉瘤、神經膠質瘤病)；脊髓(神經纖維瘤、腦脊髓膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；子宮(透明)；子宮頸(子宮頸癌、腫瘤前子宮頸發育不良)；卵巢(卵巢癌[漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、未分類癌]、顆粒層‑鞘細胞腫瘤、塞特利氏-萊迪希氏細胞腫瘤、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)；外陰(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤)；陰道(透明細胞癌、鱗狀細胞癌)；葡萄狀肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤)；輸卵管(癌)；非霍奇金氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；卡波西氏肉瘤；發育不良痣；血管瘤；皮膚纖維瘤；瘢痕瘤；銀屑病；神經母細胞瘤；腎上腺皮質癌；嗜鉻細胞瘤；副神經節瘤；梅克爾細胞癌(merkel cell carcinoma)；胰臟神經內分泌及類癌腫瘤；神經內分泌腫瘤；類癌腫瘤；胰臟癌；胃食道癌；透明細胞腎細胞癌；以及原發性腹膜癌。
本揭示案之可活化抗體可本身或以醫藥組合物之形式向個體投與以治療例如癌症。
在另一態樣中，如本文所描述之可活化ROR結合劑(例如可活化抗體)可與一或多種額外療法組合用於治療患有癌症之個體之方法中。可與本文所描述之可活化ROR抗原結合劑(例如可活化抗體)組合使用之額外療法包括但不限於：(i)外科手術；(ii)放射線療法；(iii)內分泌療法；(iv)免疫療法(包括輔助療法及細胞療法，諸如CAR T細胞療法)；以及(v)化學療法，包括細胞毒性劑及化學治療劑。
具有抗癌活性之任何療法均可與本文所提供之可活化ROR抗原結合分子(例如可活化抗體)組合使用。此類藥劑用於癌症治療之實例可見於例如www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs及可公開獲得的來源，諸如Cancer Principles and Practice of Oncology, V. T. Devita及S. Hellman (編者), 第11版(2018), Lippincott Williams & Wilkins Publishers。基於藥物之具體特徵及所涉及癌症之類型，一般技術者將能夠辨別適用之藥劑的組合。
在某些實施例中，其他療法為放射線療法，包括例如γ輻射、中子射束放射線療法、電子束放射線療法、質子療法、近接療法及全身性放射性同位素。放射線療法可包含輻射或相關的放射性醫藥投與。輻射源可處於所治療的個體外部或內部(輻射治療可呈例如外部輻射束療法(EBRT)或近接療法(BT)形式)。例示性放射性元素包括例如鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鎝-99、碘-123、碘-131及銦-111。
在某些實施例中，額外療法為免疫療法。免疫療法(亦稱作生物反應調節劑療法、生物療法(biologic therapy/biotherapy)、免疫療法或生物學療法)為使用部分免疫系統對抗疾病之治療。免疫療法可幫助免疫系統識別癌細胞或促進針對癌細胞之反應。免疫療法包括主動及被動免疫療法。主動免疫療法(包括免疫治療劑)刺激身體自身之免疫系統(例如疫苗)，而被動免疫療法(包括免疫治療劑)一般利用在身體外部產生之免疫系統組分(例如抗體)、與藥物、毒素或放射性核素結合的抗體、及靶向治療劑。
例示性免疫治療劑包括免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，治療方法中所用之免疫檢查點抑制劑可完全或部分地減少、抑制、干擾或調節一或多種檢查點蛋白質，該等檢查點蛋白質調節T細胞活化或功能。已知大量的檢查點蛋白質，諸如CTLA-4及其配位體CD80及CD86；及PD-1與其配體PD-Ll及PD-L2(Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12, 252-264)。免疫檢查點抑制劑包括抗體或衍生自抗體。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為OX40 (CD134)促效劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑為抗OX40抗體。在一些實施例中，抗OX40抗體為抗OX-40。在一些實施例中，抗OX40抗體為MEDI6469。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為CD40促效劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑為抗CD40抗體。在一些實施例中，抗CD40抗體為CF-870,893。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為CTLA-4抑制劑。在一些實施例中，CTLA-4抑制劑為抗CTLA-4抗體。抗CTLA 4抗體之實例包括但不限於美國專利第5,811,097號、第5,811,097號、第5,855,887號、第6,051,227號、第6,207,157號、第6,682,736號、第6,984,720號及第7,605,238號中所述的彼等物。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為曲美單抗(tremelimumab) (亦稱為替西木單抗(ticilimumab)或CP-675,206)。在一些實施例中，抗CTLA-4抗體為伊匹單抗(ipilimumab) (亦稱為MDX-010或MDX-101)。伊匹單抗係結合至CTLA-4之完全人類單株IgG抗體。伊匹單抗以商標名Yervoy™出售。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為PD-1/PD-L1抑制劑。PD-L/PD-L1抑制劑之實例包括但不限於美國專利第7,488,802號、第7,943,743號、第8,008,449號、第8,168,757號、第8,217,149號及PCT專利申請公開案WO2003042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400及WO2011161699中所述之彼等物。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為PD-1抑制劑。在一些實施例中，PD-1抑制劑為抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體為BGB-A317、納武單抗(nivolumab) (亦稱為ONO-4538、BMS-936558或MDX1106)或帕博利珠單抗(pembrolizumab) (亦稱為MK-3475、SCH 900475，或藍布洛利珠單抗(lambrolizumab))。在一些實施例中，抗PD-1抗體為納武單抗。納武單抗為人類IgG4抗PD-1單株抗體，且以商標名Opdivo™出售。在一些實施例中，抗PD-1抗體為派立珠單抗。帕博利珠單抗為人源化單株IgG4抗體，且以商標名Keytruda™出售。在一些實施例中，抗PD-1抗體為人源化抗體CT-011。在復發情況下單獨投與CT-011未能顯示治療急性骨髓白血病(AML)之反應。在一些實施例中，抗PD-1抗體為融合蛋白AMP-224。在一些實施例中，PD-1抗體為BGB-A317。BGB A317為一種單株抗體，其中特異性地工程改造出結合Fc γ受體I之能力，且其具有以高親和力及優良目標特異性與PD-1獨特結合之特徵。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為PD-L1抑制劑。在一個實施例中，PD-L1抑制劑為抗PD-L1抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為MEDI4736 (度伐魯單抗(durvalumab))。在一些實施例中，抗PD-L1抗體為BMS-936559 (亦稱為MDX-1105-01)。在一些實施例中，PD-L1抑制劑為阿特珠單抗(atezolizumab) (亦稱為MPDL3280A，及Tecentriq®)。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為PD-L2抑制劑。在一些實施例中，PD-L2抑制劑係抗PD-L2抗體。在一些實施例中，抗PD-L2抗體為rHIgM12B7A。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為淋巴球活化基因-3 (LAG-3)抑制劑。在一個實施例中，LAG-3抑制劑為可溶性Ig融合蛋白IMP321 (Brignone等人, J. Immunol., 2007, 179, 4202-4211)。在一些實施例中，LAG-3抑制劑為BMS-986016。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為B7抑制劑。在一些實施例中，B7抑制劑為B7-H3抑制劑或B7-H4抑制劑。在一些實施例中，B7-H3抑制劑為抗B7-H3抗體MGA271 (Loo等人, Clin. Cancer Res., 2012, 3834)。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為TIM3 (T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域3)抑制劑(Fourcade等人, J. Exp. Med., 2010, 207, 2175-86；Sakuishi等人, J. Exp. Med., 2010, 207, 2187-94)。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為GITR促效劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑為抗GITR抗體。在一些實施例中，抗GITR抗體為TRX518。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為CD137促效劑。在一些實施例中，檢查點抑制劑為抗CD137抗體。在一些實施例中，抗CD137抗體為優瑞路單抗。在一些實施例中，抗CD137抗體為PF-05082566。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為重組人類介白素-15 (rhIL-15)。
在某些實施例中，檢查點抑制劑為IDO抑制劑。在一些實施例中，IDO抑制劑為INCB024360。在一些實施例中，IDO抑制劑為因多莫德(indoximod)。
其他例示性免疫療法包括輔助療法，包括免疫治療劑，諸如細胞介素、趨化因子、干擾素、介白素或淋巴因子。實例包括細胞激素，諸如顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞炎症蛋白(MIP)-1-α、介白素(包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-6, IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21及IL-27)、腫瘤壞死因子(包括TNF-α)及干擾素(包括IFN-α、IFN-β及IFN-γ)；氫氧化鋁(明礬)；卡介苗(Bacille Calmette-Guerin；BCG)；匙孔螺血氰蛋白(Keyhole limpet hemocyanin；KLH)；不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's adjuvant；IFA)；QS-21；DETOX；左旋咪唑；及二硝基苯基(DNP)及其組合，諸如介白素(例如IL-2)與其他細胞介素(諸如IFN-α)之組合。
其他例示性免疫療法包括細胞療法，例如免疫細胞群，諸如白血球(有核的白血球)，其包含(例如表現)結合至所關注之抗原的受體。本揭示之白血球可為例如嗜中性球、嗜伊紅血球、嗜鹼性球、淋巴球或單核球。在一些實施例中，白血球為淋巴球。淋巴球之實例包括T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞或NKT細胞。在一些實施例中，T細胞為CD4+ Th (T輔助)細胞、CD8+細胞毒性T細胞、γδT細胞或調節(抑制) T細胞。在一些實施例中，免疫細胞為樹突狀細胞。在一些實施例中，細胞療法為CAR-T細胞療法。在一些實施例中，雙特異性CAR由串聯存在於單一轉殖基因受體(稱為TanCAR；參見例如Grada Z等人, Molecular Therapy Nucleic Acids 2013; 2:e105，該文獻以全文引用的方式併入本文中)上之兩個不同抗原識別域構成。因此，在一些實施例中，方法包含將包含可活化ROR抗原結合分子(諸如可活化抗體)及免疫治療劑之組合遞送至腫瘤，其中免疫治療劑為編碼抗原的工程化核酸；或將誘導自身抗原表現的工程化核酸遞送至腫瘤，及將表現雙特異性CAR的免疫細胞遞送至腫瘤，該雙特異性CAR結合至兩種抗原，其中之一者由工程化核酸編碼。
其他例示性免疫療法包括免疫治療劑，諸如癌症疫苗，其可用於誘發個體之針對癌症抗原的免疫反應。例示性方法涉及向個體投與RNA疫苗，該疫苗包含至少一種RNA聚核苷酸，該至少一種RNA聚核苷酸具有編碼至少一種抗原多肽或其免疫原性片段之開讀框，藉此在個體中誘導對抗原多肽或其免疫原性片段具有特異性之免疫反應，與以相同組合物或單獨的組合物投與可活化ROR抗原結合分子(例如可活化抗體)相結合，同時投與或依序給藥，其中相對於用預防有效劑量之針對該癌症之傳統疫苗接種之個體之抗抗原多肽抗體滴度，在疫苗接種之後該個體之抗抗原多肽抗體滴度增加。
在某些實施例中，額外療法包括化學療法，諸如一或多種細胞毒性劑或一或多種化學治療劑。細胞毒性劑可抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞。細胞毒素劑包括但不限於放射性同位素(例如At 211、I 131、I 125、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、Bi 212、P 32、Pb 212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體。
在某些實施例中，額外療法包括一或多種化學治療劑。化學治療劑包括可用於治療癌症之化合物。化學治療劑包括：(i)用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑；(ii)抑制芳香酶之芳香酶抑制劑，該芳香酶調節腎上腺中之雌激素產生；(iii)抗雄激素；(iv)蛋白激酶抑制劑；(v)脂質激酶抑制劑；(vi)反義寡核苷酸，包括抑制涉及異常細胞增殖之信號傳導路徑中之基因表現的反義寡核苷酸；(viii)疫苗，諸如基因療法疫苗。化學治療劑亦可包括抗體。
例示性激酶抑制劑包括厄洛替尼(erlotinib)(Tarceva®)、吉非替尼(gefitinib)(Iressa®)、達沙替尼(dasatinib)(Sprycel®)、尼羅替尼(nilotinib)(Tasigna®)、克卓替尼(crizotinib)(Xalkori®)、蘆可替尼(ruxolitinib)(Jakafi®)、維羅非尼(vemurafenib)(Zelboraf®)、凡德他尼(vandetanib)(Caprelsa®)、帕唑帕尼(pazopanib)(Votrient®)、阿法替尼(afatinib)、阿立塞替(alisertib)、阿姆替尼(amuvatinib)、阿西替尼(axitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、布立尼布(brivanib)、卡奈替尼(canertinib)、卡博替尼(cabozantinib)(Cabometyx®)、西地尼布(cediranib)、塞利替尼(ceritinib)、克拉尼布(crenolanib)、達拉非尼(dabrafenib)、達可替尼(dacomitinib)、達魯舍替(danusertib)、多韋替尼(dovitinib)、弗雷替尼(foretinib)、加利特皮(ganetespib)、依魯替尼(ibrutinib)、艾德昔布(idelalisib)、伊馬替尼(imatinib)、伊尼帕利(iniparib)、拉帕替尼(lapatinib)、侖伐替尼(lenvatinib)、立尼法尼(linifanib)、林賽替尼(linsitinib)、馬賽替尼(masitinib)、莫羅替尼(momelotinib)、莫替沙尼(motesanib)、來那替尼(neratinib)、尼達尼布(nintedanib)、尼拉帕尼(niraparib)、奧普洛佐米(oprozomib)、奧拉帕尼(olaparib)、帕博西尼(palbociclib)、皮克昔布(pictilisib)、吡非尼酮(pirfenidone)、普納替尼(ponatinib)、奎紮替尼(quizartinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、利戈色替(rigosertib)、盧卡帕尼(rucaparib)、塞卡替尼(saracatinib)、薩瑞德吉(saridegib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、坦度替尼(tandutinib)、塔索替尼(tasocitinib)、特拉替尼(telatinib)、提瓦替尼(tivantinib)、替沃紮尼(tivozanib)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、維利帕尼(veliparib)、維莫德吉(vismodegib)、沃納瑟替(volasertib)、考比替尼(cobimetinib)(Cotellic®)、XL-147、XL-765、XL-499、XL-880及其他。在一些實施例中，ROR抗原結合分子(例如抗體)可與HSP90抑制劑(例如XL888)、肝臟X受體(LXR)調節劑、類視黃素相關孤兒受體γ (RORy)調節劑、CK1抑制劑、CK1-α抑制劑、Wnt路徑抑制劑(例如SST-215)或鹽皮質激素受體抑制劑(例如埃沙西林酮(esaxerenone)或XL-550)組合用於治療癌症。
激酶抑制劑可為酪胺酸激酶抑制劑，諸如EGFR抑制劑；小分子HER2酪胺酸激酶抑制劑，諸如目布妥尼(Mubritonib) (TAK165，Takeda)；CP-724.714 (Axon Medchem BV，ErbB2受體酪胺酸激酶之口服選擇性抑制劑)；雙重HER抑制劑，諸如優先與EGFR結合但抑制過度表現HER2及EGFR之細胞兩者之EKB-569 (購自Wyeth)；拉帕替尼(lapatinib) (GSK572016；購自Glaxo-SmithKline)，一種口服HER2及EGFR酪胺酸激酶抑制劑；PKI-166 (購自Novartis)；泛HER抑制劑，諸如卡奈替尼(canertinib) (CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制劑，諸如購自ISIS Pharmaceuticals之反義藥劑ISIS-5132，其抑制Raf-1信號傳導；非HER靶向TK抑制劑，諸如甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC®，購自Glaxo SmithKline)；多靶向酪胺酸激酶抑制劑，諸如舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT®，購自Pfizer)；VEGF受體酪胺酸激酶抑制劑，諸如瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787/ZK222584，購自Novartis/Schering AG)；MAPK細胞外調節激酶1抑制劑CI-1040 (購自Pharmacia)；喹唑啉，諸如PD 153035、4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶；嘧啶并嘧啶；吡咯并嘧啶，諸如CGP 59326、CGP 60261及CGP 62706；吡唑并嘧啶、4-(苯胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；薑黃素(二阿魏醯甲烷、4,5-雙(4-氟苯胺基)鄰苯二甲醯亞胺)；含有硝基噻吩部分之酪胺酸磷酸化抑制劑；反義分子(例如與HER編碼核酸結合之反義分子)；喹口咢啉(美國專利第5,804,396號)；酪胺酸磷酸化抑制劑(美國專利第5,804,396號)；阿芬泰克(Affinitac) (ISIS 3521；ISIS/Lilly)；PKI166 (Novartis)；司馬西尼(Semaxinib) (Pfizer)；INC-1C11 (Imclone)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®)；或如以下專利公開案中之任一者中所描述：美國專利第5,804,396號；WO 1999/09016 (American Cyanamid)；WO 1998/43960 (American Cyanamid)；WO 1997/38983 (Warner Lambert)；WO 1999/06378 (Warner Lambert)；WO 1999/06396 (Warner Lambert)；WO 1996/30347 (Pfizer, Inc)；WO 1996/33978 (Zeneca)；WO 1996/3397 (Zeneca)及WO 1996/33980 (Zeneca)。
使用本文所提供之可活化ROR抗原結合分子(例如可活化抗體)及諸如治療劑之額外療法進行之組合治療可為同時的、單獨的或按任何次序依次的。對於同時投與之治療劑(諸如可活化ROR抗原結合提供分子)與另一治療劑(諸如免疫治療劑或化學治療劑)之組合，治療劑在適當時可作為一種組合物或作為各別組合物投與。 基因及細胞療法
在一些實施例中，根據本揭示案使用之組合物包含一或多種編碼本文中所提供之可活化ROR結合劑(例如，可活化抗體或其片段)的核酸或其互補核酸。在一特定實施例中，向個體投與核酸以用於本文中所提供之方法中，例如以藉助於基因療法預防、管理、治療及/或改善疾病或病症(例如癌症，例如表現ROR之癌症)。此類療法涵蓋藉由向個體投與經表現或可表現之核酸來進行之療法。在一實施例中，核酸產生其所編碼之可活化抗體，且抗體介導預防性或治療性作用。
可以使用此項技術中可利用的任何重組基因表現(或基因治療)方法。
關於基因療法之方法的一般綜述，參見Goldspiel等人, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu及Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596；Mulligan, 1993, Science 260:926-932；及Morgan及Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217；May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215。可使用的此項技術中通常已知的重組型DNA技術之方法描述於Ausubel等人(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；及Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)。
在一特定實施例中，組合物包含編碼本文中所提供之可活化抗體或融合蛋白之核酸，該等核酸為在適合之宿主中表現可活化抗體或融合蛋白或多肽或其重鏈或輕鏈的表現載體之一部分。特定言之，此等核酸具有可操作地連接至編碼區的啟動子，諸如異源啟動子，該啟動子為可誘導型或組成型的且視情況具有組織特異性及/或腫瘤/癌症特異性。在另一特定實施例中，使用核酸分子，其中抗體序列及任何其他所需序列與促進基因體中所需位點處之同源重組的區域側接，由此提供編碼可活化抗體或融合蛋白之核酸在染色體內的表現(Koller及Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；Zijlstra等人, 1989, Nature 342:435-438)。
核酸可直接遞送至個體，在此情況下，使個體直接暴露於核酸或攜帶核酸之載體，或間接遞送至個體，在此情況下，首先將細胞在活體外用核酸轉型，接著移植至個體中。此等兩種方法分別稱為活體內或離體基因療法。
在特定實施例中，活體內直接投與核酸序列，其中序列經表現以產生經編碼之產物。此可藉由此項技術中已知之多種方法中之任一者實現，例如藉由將其構築為適當核酸表現載體之一部分且投與該載體以使得序列變成胞內的，例如藉由使用有缺陷的或減毒的逆轉錄病毒或其他病毒載體感染(參見美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射裸DNA，或藉由使用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic, Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染劑塗佈、囊封於脂質體、微粒或微膠囊中，或藉由將其進行投與以便與已知進入細胞核內之肽連接，藉由將其進行投與以便與經歷受體介導之胞吞作用的配體連接(參見例如，Wu及Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432) (其可用於靶向特異性表現該等受體之細胞類型)等。在另一實施例中，可形成核酸-配位體複合物，其中配位體包含膜融合病毒肽以破壞核內體，允許核酸避免溶酶體降解。在另一實施例中，可藉由靶向特定受體而在活體內靶向核酸以便細胞特異性吸收及表現(參見例如WO 92/06180；WO 92/22635；WO 92/20316；WO 93/14188；WO 93/20221)。或者，可藉由同源重組，在細胞內引入核酸且併入宿主細胞DNA內以用於表現(Koller及Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935；及Zijlstra等人, 1989, Nature 342:435-438)。
在一個特定實施例中，使用含有編碼抗體之核酸序列的病毒載體。舉例而言，可使用逆轉錄病毒載體(參見Miller等人, 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599)。此等逆轉錄病毒載體含有病毒基因體正確封裝及整合至宿主細胞DNA中所必需的組分。可將編碼用於基因療法之抗體的核酸序列選殖入一或多種載體中，其促進基因遞送至個體中。關於逆轉錄病毒載體之更多細節可見於例如Boesen等人, 1994, Biotherapy 6:291-302中，該文獻描述使用逆轉錄病毒載體將MDR1基因遞送至造血幹細胞以便使幹細胞對化學療法更具抗性。其他說明逆轉錄病毒載體於基因療法中之用途的參考文獻為：Clowes等人, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651；Klein等人, 1994, Blood 83:1467-1473；Salmons及Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141；及Grossman及Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114。
腺病毒為可用於抗體之重組產生的其他病毒載體。腺病毒為尤其具有吸引力之媒劑，用於遞送基因至呼吸道上皮中。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，其在呼吸道上皮中引起輕度疾病。基於腺病毒之遞送系統的其他目標為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞之優勢。Kozarsky及Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503呈現基於腺病毒之基因療法的評述。Bout等人, 1994, Human Gene Therapy 5:3-10展現腺病毒載體將基因轉移至恆河猴之呼吸道上皮的用途。腺病毒在基因療法中之用途之其他實例可見於Rosenfeld等人, 1991, Science 252:431-434；Rosenfeld等人, 1992, Cell 68:143-155；Mastrangeli等人, 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234；PCT公開案W094/12649；及Wang等人, 1995, Gene Therapy 2:775-783中。在一特定實施例中，使用腺病毒載體。
亦可使用腺相關病毒(AAV) (Walsh等人, 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；及美國專利第5,436,146號)。在一特定實施例中，使用AAV載體表現如本文中所提供之可活化抗ROR抗體。在某些實施例中，AAV包含編碼VH域之核酸。在其他實施例中，AAV包含編碼VL域之核酸。在某些實施例中，AAV包含編碼VH域及VL域之核酸。在本文中所提供之方法之一些實施例中，向個體投與包含編碼VH域之核酸的AAV及包含編碼VL域之核酸的AAV。在其他實施例中，向個體投與包含編碼VH域及VL域之核酸的AAV。在某些實施例中，過度表現VH及VL域。
在一些實施例中，溶瘤病毒可用於本文中所提供之可活化抗體的重組產生。溶瘤病毒可優先感染及殺傷癌細胞。當受感染之癌細胞藉由瘤溶解而破壞時，其可釋放新感染性病毒粒子或病毒體以幫助破壞其餘腫瘤。在一特定實施例中，溶瘤病毒係在注射至腫瘤中時引起腫瘤消退之病毒。在另一特定實施例中，溶瘤病毒係在癌細胞中選擇性地複製且殺傷癌細胞，並在腫瘤內擴散之病毒。在另一特定實施例中，溶瘤病毒係在癌細胞中選擇性地複製且殺傷癌細胞，並在腫瘤內擴散而不會引起正常組織之任何顯著損傷的病毒。在一些實施例中，使用熟習此項技術者已知之活體外或離體分析法來測定相對於非癌變細胞(例如健康細胞)，對在癌細胞中複製之病毒的選擇性。在一個實施例中，若在與病毒一起培育後，相對於在相同分析法中偵測到的非癌變細胞(例如健康細胞)中病毒粒子之數目，在活體外分析法或離體分析法中偵測到的癌細胞中病毒粒子之數目具有統計學上顯著之增加，則該病毒在癌細胞中選擇性地複製。在另一實施例中，若相對於在相同分析法中殺傷之非癌變細胞(例如健康細胞)的量，在活體外或離體分析法中殺傷之癌細胞的量為統計學上顯著的，則病毒選擇性地殺傷癌細胞。在一個實施例中，溶瘤病毒天然地優先在癌細胞中複製且在人體中為非致病性的。溶瘤病毒可因對先天抗病毒信號之敏感性升高或對致癌信號傳導路徑之依賴性而在人體中為非致病性的。在一些實施例中，溶瘤病毒為細小病毒(例如自主細小病毒)、黏液瘤病毒、禽類副黏液病毒(例如新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus))、呼腸孤病毒或塞內加谷病毒(Seneca valley virus)。在一個實施例中，溶瘤病毒為野生型細小病毒H1 (ParvOryx)。在另一實施例中，溶瘤病毒為水疱性口炎病毒。在另一實施例中，溶瘤病毒為禽類副黏液病毒。在一些實施例中，溶瘤病毒為經基因工程改造之流感病毒、麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、牛痘病毒、痘病毒、微小RNA病毒、α病毒、逆轉錄病毒、棒形病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、單純疱疹病毒或水疱性口炎病毒。在一些實施例中，此等病毒經減毒。
基因及細胞療法之另一方法涉及藉由諸如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣介導之轉染或病毒感染之方法將基因轉移至組織培養物中之細胞中。通常，轉移方法包括可選標記物轉移至細胞。接著，在選擇下置放細胞以分離此等溶解且表現轉移基因之細胞。接著將此等細胞遞送至個體。
在此實施例中，將核酸引入細胞中，隨後活體內投與所得重組型細胞。此類引入可藉由此項技術中已知之任何方法進行，包括(但不限於)轉染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列之病毒或細菌噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導之基因轉移、微細胞介導之基因轉移、球形質體融合等。此項技術中已知多種用於將外源基因引入細胞之技術(參見例如Loeffler及Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618；Cohen等人, 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644；Clin. Pharma. Ther. 29:69-92 (1985))，且可根據本文所提供之方法使用，其限制條件為不破壞接受者細胞之必需發育及生理學功能。該技術應使得核酸穩定轉移至細胞中，從而使核酸可由細胞表現，諸如可由其細胞後代遺傳及表現。
所得重組細胞可藉由此項技術中已知之各種方法遞送至個體。可靜脈內投與重組血細胞(例如造血幹細胞或前驅細胞)。設想供使用的細胞之量視所需作用、患者狀態等而定，且可以由熟習此項技術者確定。
可引入核酸以用於基因及/或細胞療法之目的之細胞涵蓋任何所需、可用的細胞類型，且包括但不限於上皮細胞、內皮細胞、角質細胞、纖維母細胞、肌肉細胞、肝細胞；血細胞，諸如T淋巴球、B淋巴球、單核球、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、巨核細胞、顆粒球；各種幹細胞或前驅細胞，尤其造血幹細胞或前驅細胞，例如自骨髓、臍帶血、周邊血液、胎兒肝臟等獲得之幹細胞或前驅細胞。
在一特定實施例中，用於基因及/或細胞療法之細胞為個體之自體細胞。在其他實施例中，用於細胞及/或基因療法之細胞對個體而言係同種異體的。
在將重組細胞用於基因及/或細胞療法之一實施例中，將編碼抗體之核酸序列引入細胞中，從而使得該等核酸序列可由細胞或其後代表現，且接著活體內投與重組細胞以獲得治療作用。在特定實施例中，使用幹細胞或祖細胞。可活體外分離及維持之任何幹細胞及/或前驅細胞可潛在地根據本文中所提供之方法的此實施例使用(參見例如WO 94/08598；Stemple及Anderson, 1992, Cell 7 1:973-985；Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229；及Pittelkow及Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771)。
在一特定實施例中，所引入之用於基因及/或細胞療法之目的之核酸包含可操作地連接至編碼區之可誘導型啟動子，從而使得核酸之表現可藉由控制存在或不存在適合之轉錄誘導劑來控制。 診斷用途及偵測方法
免疫特異性結合至抗原的經標記之結合分子(諸如經標記之抗體及其衍生物及類似物)可用於診斷目的以偵測、診斷或監測疾病。
本文中所提供之抗體可用於使用本文中所描述或如熟習此項技術者已知的經典免疫組織化學方法來分析生物樣品中之抗原含量(例如，參見Jalkanen等人, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985；及Jalkanen等人, 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096)。適用於偵測蛋白質基因表現的其他基於抗體之方法包括免疫分析法，諸如酶聯免疫吸附分析法(ELISA)及放射免疫分析法(RIA)。適合之抗體分析標記為此項技術中已知的，且包括酶標記，諸如，葡萄糖氧化酶；放射同位素，諸如碘( 125I、 121I)、碳( 14C)、硫( 35S)、氚( 3H)、銦( 121In)及鎝( 99Tc)；冷光標記，諸如魯米諾；及螢光標記，諸如螢光素及若丹明，以及生物素。
此項技術中應瞭解，個體之體型及所使用之成像系統將判定為了產生診斷影像所需之成像部分的量。在放射性同位素部分之情況下，對於人類個體而言，所注射之放射能的量通常在約5至20毫居里 99Tc之範圍內。經標記之抗體接著將在含有特定蛋白質之細胞的位置處聚積。活體內腫瘤成像描述於S.W. Burchiel等人, 「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.」 (第13章, Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel及B.A. Rhodes編, Masson Publishing Inc. (1982))中。
視若干變數(包括所用標記類型及投藥模式)而定，投藥之後允許經標記之抗體在個體中之位點集中且清除未結合之經標記抗體至背景水準的時間間隔為6至48小時或6至24小時或6至12小時。在另一實施例中，投藥後的時間間隔為5至20天或5至10天。
經標記之分子在個體中的存在可使用此項技術中已知之活體內掃描方法來偵測。此等方法視所使用之標記的類型而定。熟習此項技術者能夠決定用於偵測特定標記之適當方法。可用於本文中所提供之診斷方法中的方法及裝置包括但不限於電腦斷層攝影CT)、全身掃描(諸如正電子發射斷層攝影(PET))、磁共振成像(MRI)及超音波掃描。
在一特定實施例中，分子用放射性同位素標記且使用輻射反應性手術儀器對患者進行偵測(Thurston等人，美國專利第5,441,050號)。在另一實施例中，分子經螢光化合物標記且使用螢光反應性掃描儀器在患者中偵測。在另一實施例中，分子經正電子發射金屬標記且使用正電子發射斷層攝影在患者中偵測。在另一實施例中，分子經順磁性標記進行標記且使用磁共振成像(MRI)在患者中偵測。 5.8. 套組
本文亦提供套組，其包含封裝至適合之封裝材料中的本文中所提供之可活化ROR結合劑(例如可活化抗ROR抗體)或組合物(例如醫藥組合物)。套組視情況包括標籤或藥品說明書，包括組分之描述或關於其中組分之活體外、活體內或離體使用之說明。
術語「封裝材料」係指容納套組之組分之物理結構。封裝材料可維持組分無菌，且可由常用於此等目的之材料(例如紙、波紋狀纖維、玻璃、塑膠、箔、安瓿、小瓶、管等)製成。
本文所提供之套組可包括標記或插頁。標記或插頁包括「印刷物」，例如紙或紙板，其為單獨的或附著至組分、套組或封裝材料(例如盒)或附接至例如含有套組組分的安瓿、管或小瓶。標記或插頁可額外包括電腦可讀取媒體，諸如磁碟(例如硬碟、卡、記憶體磁碟)；光碟，諸如CD-ROM/RAM或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁帶；或電儲存媒體，諸如RAM及ROM，或此等之混合，諸如磁/光學儲存媒體、FLASH介質或記憶體型卡。標籤或插頁可包括鑑別製造商資訊、批號、製造地點及日期之資訊。
本文所提供之套組可另外包括其他組件。套組之各組分可包封於個別容器內，且所有各種容器可位於單一封裝內。套組亦可經設計以用於冷儲存。套組可進一步經設計以含有本文中所提供之抗體，或含有編碼本文中所提供之抗體之核酸的細胞。套組中之細胞可維持在適當儲存條件下直至即用。
本文中亦提供免疫特異性結合至ROR抗原之抗體之組。在特定實施例中，本文提供具有不同締合速率常數、不同解離速率常數、針對ROR抗原之不同親和力及/或針對ROR抗原之不同特異性的抗體組。在某些實施例中，本文提供約10種、較佳約25、約50、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約300、約350、約400、約450、約500、約550、約600、約650、約700、約750、約800、約850、約900、約950或約1000種或更多種抗體之組。抗體組可用於例如96孔或384孔盤中，諸如用於諸如ELISA之分析法。
除非另外定義，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解相同的含義。儘管與本文所述類似或等效之方法及材料可用於本發明的實施或測試，但本文描述適合之方法及材料。
如本文中所使用，在整個本文中，數值通常以範圍格式呈現。除非上下文另外明確指示，否則範圍型式之使用僅為了方便及簡潔起見且不應理解為對本發明之範疇的不靈活限制。因此，除非上下文另外明確指示，否則範圍之使用明確地包括所有可能子範圍、該範圍內的所有個別數值，及此等範圍內的所有數值或數值範圍(包括整數)，及範圍內的分數值或整數。不論範圍之廣度，此構築皆適用且適用於此專利文獻通篇中的所有上下文中。因此，例如，提及範圍90-100%包括91-99%、92-98%、93-95%、91-98%、91-97%、91-96%、91-95%、91-94%、91-93%等。提及範圍90%至100%亦包括91%、92%、93%、94%、95%、95%、97%等，以及91.1%、91.2%、91.3%、91.4%、91.5%等，92.1%、92.2%、92.3%、92.4%、92.5%等，諸如此類。
此外，提及範圍1-3、3-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-225、225-250包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。在另一實例中，提及範圍25-250、250-500、500-1,000、1,000-2,500、2,500-5,000、5,000-25,000、25,000-50,000包括此類值內之任何數值或範圍或涵蓋此類值的任何數值或範圍，例如25、26、27、28、29……250、251、252、253、254……500、501、502、503、504……等。
亦如本文中所使用，本文通篇揭示一系列範圍。一系列範圍之使用包括上限與下限範圍之組合以提供另一範圍。不論範圍之廣度，此構築皆適用且適用於此專利文獻通篇中的所有上下文中。因此，舉例而言，提及一系列範圍(諸如5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-75、75-100、100-150)包括諸如5-20、5-30、5-40、5-50、5-75、5-100、5-150及10-30、10-40、10-50、10-75、10-100、10-150及20-40、20-50、20-75、20-100、20-150之範圍等。
應瞭解，在本文中所描述之標的物之定義內亦提供實質上不影響本文中所描述之各種實施例之活性的修改。因此，以下實例意欲說明而非限制本揭示案。 6.  實施例
本揭示案涵蓋以下非限制性實施例：
1. 一種結合至ROR之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含：掩蔽肽、抗體輕鏈可變(VL)區及抗體重鏈可變(VH)區； 其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:29、30或31之胺基酸序列，且 其中該VH區包含如包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH中所闡述之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，且該VL區包含如包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL中所闡述之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；且 視情況其中該可活化抗體或其片段包含多肽，該多肽自N端至C端包含該掩蔽肽及該抗體VL區。
2. 如實施例1之可活化抗體或其片段，其中 該VH區包含： (1)    具有選自由SEQ ID NO: 1、7、12、13、18及27組成之群的胺基酸序列之VH CDR1； (2)    具有選自由SEQ ID NO: 2、8、14、19及24組成之群的胺基酸序列之VH CDR2；及 (3)    具有選自由SEQ ID NO: 3、9、15、20及28組成之群的胺基酸序列之VH CDR3；且 該VL區包含： (1)    具有選自由SEQ ID NO: 4、10、16及21組成之群的胺基酸序列之VL CDR1； (2)    具有選自由SEQ ID NO: 5、11及22組成之群的胺基酸序列之VL CDR2；及 (3)    具有選自由SEQ ID NO: 6、17及23組成之群的胺基酸序列之VL CDR3。
3. 如實施例1之可活化抗體或其片段，其中： (i)    該VH區包含有包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3； (ii)   該VH區包含有包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3； (iii)  該VH區包含有包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3； (iv)   該VH區包含有包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL CDR3； (v)    該VH區包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的VL CDR3； (vi)   該VH區包含有包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3；或 (vii)  該VH區包含有包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL CDR3。
4. 如實施例1-3中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段進一步包含構架1 (FR1)、構架2 (FR2)、構架3 (FR3)及/或構架4 (FR4)序列。
5. 如實施例1-4中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段進一步包含人類構架序列，視情況如SEQ ID NO: 25或26中所闡述之構架1 (FR1)、構架2 (FR2)、構架3 (FR3)及/或構架4 (FR4)序列。
6. 如實施例1-5中任一項之可活化抗體或其片段，其中該VH包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。
7. 如實施例1-6中任一項之可活化抗體或其片段，其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列。
8. 如實施例7之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含多肽，且其中該多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。
9. 如實施例1-6中任一項之可活化抗體或其片段，其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列。
10.   如實施例9之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含多肽，且其中該多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。
11.   如實施例1-6中任一項之可活化抗體或其片段，其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列。
12.   如實施例11之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含多肽，且其中該多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
13.   如實施例1-12中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含有包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的重鏈。
14.   如實施例1-13中任一項之可活化抗體或其片段，其中可活化抗體係單株抗體。
15.   如實施例1-14中任一項之可活化抗體或其片段，其中可活化抗體為人源化、人類或嵌合抗體。
16.   如實施例1-15中任一項之可活化抗體或其片段，其為Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、(scFv) 2、單鏈抗體分子、雙重可變區抗體、單一可變區抗體、線性抗體、V區或由抗體片段形成之多特異性抗體。
17.   如實施例1-16中任一項之可活化抗體或其片段，其結合或以重組方式融合至診斷劑、可偵測劑或治療劑。
18.   如實施例17之可活化抗體或其片段，其中該治療劑為化學治療劑、細胞毒素或藥物。
19.   如實施例1-18中任一項之可活化抗體或其片段，其中可活化抗體係多特異性抗體。
20.   如實施例19之可活化抗體或片段，其中多特異性抗體為雙特異性抗體。
21.   一種可活化結合劑，其與如實施例1-20中任一項之可活化抗體或其片段結合至基本上相同的抗原決定基。
22.   如實施例21之可活化結合劑，其為可活化抗體或其片段。
23.   如實施例22之可活化結合劑，其中可活化抗體為多特異性抗體。
24.   一種可活化結合劑，其與如實施例1-20中任一項之可活化抗體或其片段競爭結合至人類ROR。
25.   如實施例24之可活化結合劑，其中該可活化結合劑係可活化抗體或其片段。
26.   如實施例25之可活化結合劑，其中可活化抗體為多特異性抗體。
27.   一種聚核苷酸，其編碼如實施例1-20中任一項之可活化抗體或其片段或如實施例22-23及25-26中任一項之可活化結合劑。
28.   一或多種載體，其包含一或多種如實施例27之聚核苷酸或互補聚核苷酸。
29.   一種細胞，其包含以下中之任何一或多者：如實施例1-20中任一項之可活化抗體或其片段、如實施例21-26中任一項之可活化結合劑、如實施例27之聚核苷酸或如實施例28之一或多種載體。
30.   一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑及以下中之任何一或多者：如實施例1-20中任一項之可活化抗體或其片段、如實施例21-26中任一項之可活化結合劑、如實施例27之聚核苷酸、如實施例28之一或多種載體或如實施例29之細胞。
31.   一種用於治療個體之疾病或病症之方法，其包含向個體投與如實施例1-20中任一項之可活化抗體或其片段，或如實施例21-26中任一項之可活化結合劑，或如實施例30之醫藥組合物。
32.   如實施例31之方法，其中該疾病或病症為表現ROR之癌症。
33.   如實施例31或32之方法，其中該個體為人類個體。
34.   一種製備結合至ROR之可活化抗體或其片段之方法，其包含培養如實施例29之細胞及表現該可活化抗體或其片段。 7. 實例
實例1.  抗ROR可活化抗體之產生
為了使抗ROR抗體對免疫細胞達成腫瘤特異性活化，進一步開發 P0之可活化抗體。使用重組DNA技術且如US20210207126A1中所述，將掩蔽部分(MM)及含有酶特異性裂解位點之可裂解部分(CM)連接子串聯連接至親本抗體 P0之輕鏈N端以產生可活化抗體 M1、 M2及 M3。
簡言之，如下 表 8中所述之抗原經設計且購自Acro Biosystems或內部製得。首先將 P0呈現於細胞表面上且證實其具有結合至其抗原ROR1及ROR2的作用。接著，將US20210207126A1中所述之經改良之肽文庫直接與輕鏈之N端融合，且構築在細胞表面上呈現融合蛋白之細胞文庫。細胞文庫接著經歷基於FACS之數輪篩選：首先，富集對抗原結合弱的細胞純系(負向選擇)，接著用蛋白酶(例如MMP9)處理經富集的細胞純系以移除N端肽，且選擇對抗原結合高的純系(正向選擇)。參見 圖 1。在數輪正向選擇之後，自此等純系提取質體且透過DNA定序來證實掩蔽肽序列。 表 8. 所製備之抗原，包括人類及小鼠ROR1及ROR2之胞外域(ECD)。
靶標 物種 域 描述
ROR1 人類 30-403 人類蛋白質，Fc標籤
人類 39-151 人類(39-151，Ig樣域)蛋白質，His標籤
小鼠 30-403 小鼠蛋白質，Fc標籤
ROR2 人類 34-403 人類蛋白質，Fc標籤
小鼠 34-403 小鼠蛋白質，Fc標籤
接著將所獲得之抗體純系轉化為IgG1。在一個實施例中，將重鏈及輕鏈分別選殖入哺乳動物表現載體pCDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific，目錄號K830001)中，且以與呈現於細胞表面上相同之方式將掩蔽肽及無變異裂解肽與輕鏈N端融合。將質體對短暫轉染至HEK293F細胞中。六天後，收集上清液，藉由離心及過濾澄清，且用標準蛋白質A親和層析(MabSelect SuRe, GE Healthcare)純化IgG。將IgG溶離且中和，且在PB緩衝液(20 mM磷酸鈉、150 mM NaCl，pH 7.0)中進行緩衝交換。
為了更好地表徵所選抗體純系，獲得若干細胞株，包括如下 表 9中所說明之彼等物。接著，使用酶聯免疫吸附分析(ELISA) (量測450 nm吸光度)或螢光活化細胞分選(FACS) (量測APC平均螢光強度(MFI))，評估所選抗體純系以及親本抗體 P0與以下各者之結合：293細胞上所表現之ROR1、293細胞上所表現之ROR2、HT-29 (SIBS，目錄號HTB-38，培養於McCoy's 5A (Gibco，目錄號16600082) + 10% FBS (Gibco，目錄號10099-141C))、H226 (SIBS，目錄號CRL-5826，培養於RPMI1640 (Gibco，目錄號11875119) + 10% FBS)、及293F (293F，Sigma，目錄號A14528，培養於Dynamis TM培養基(Gibco，目錄號A2661501))細胞。 表 9. 所製備之細胞株。
細胞株 細胞類型 所報導之 ROR1 複本數 所報導之 ROR2 複本數
K562 慢性骨髓性白血病 ＜7,000 68,000
PANC1 胰臟癌 60,773 ＜7,000
MDA-MB-231 TNBC 114,262 ＜7,000
RPMI-8226 B-淋巴瘤 111,000 72,000
HOP-92 肺腺癌 227,038 9,000
HT-29 結腸直腸癌 TBD TBD
當指示時，本文所揭示之掩蔽抗體如下活化且接著用於如本文所述之分析中。
在DMSO中製備100 mM APMA (Sigma，目錄號164610-700MG)。APMA (700 mg)用20 mL DMSO復原以產生100 mM之儲備溶液。粉末完全溶解之後，輕輕地搖動溶液以充分混合。將不少於20 μL/小瓶之儲備溶液等分且在≤-20℃下儲存。避免重複冷凍及解凍。
製備MMP-9。獲取≤-20℃之凍乾MMP-9 (人類MMP-9蛋白質，His標籤，Acro Biosystems，目錄號MM9-H5221)的小瓶，且在實驗台上平衡至少15分鐘。20 μg MMP-9於80 μL水中復原以產生250 μg/mL儲備溶液，且在實驗台上擱置30分鐘至60分鐘。避免渦旋。凍乾粉末完全溶解之後，輕輕地搖動溶液以充分混合。避免重複冷凍及解凍。多個小瓶可在各製備時復原，且在使用之前充分混合。
製備MMP-9活化系統。製備10 mM APMA。用水將AMPA儲備液(100 mM)稀釋至10 mM APMA之最終濃度。接著如下製備MMP-9活化系統：20 μL之250 μg/mL MMP-9 (最終濃度100 μg/mL)、25 μL之TCNB (50 mM Tris、10 mM CaCl 2、150 mM NaCl、0.05% Brij-35，pH 7.50)及5 μL之10 mM AMPA (最終濃度1 mM)。輕輕地搖動溶液以充分混合，同時避免產生泡沫及氣泡，且在37℃下培育24小時。活化系統在5±3℃下7天之後到期。
接著將所測試之抗體活化。如下製備酶消化系統：最終濃度為1 mg/mL之測試抗體、10 μL之100 μg/mL活化MMP-9，及使最終體積達到100 μL之TCNB。首先將TCNB緩衝液添加至微量離心管中，接著添加測試抗體及活化MMP-9。抗體之最終濃度為0.5至2 mg/mL，且抗體/酶(w/w)為100:1。將反應混合物輕輕地混合以避免產生泡沫及氣泡，且在37℃下培育20至24小時。
ELISA：用塗覆緩衝液(15 mM NaCO 3、35 mM NaHCO 3、pH 9.6)將人類ROR1 (人類ROR1-Fc，Acro Biosystems，目錄號R01-H5250)稀釋至2 μg/mL。向96孔ELISA盤(Corning，目錄號3690)中添加50 μL/孔經稀釋之人類ROR1。覆蓋ELISA盤且在濕箱中在5±3℃下培育隔夜。接著使用BioTEK 405LS微量盤洗滌器，用含0.05% Tween 20之PBS洗滌ELISA盤三次(洗滌循環：003；分配/抽吸體積：150 μL/孔；及流動速率07)。用一堆紙巾將盤揩乾，直至觀測不到殘餘流體。將含3%脫脂乳之PBS以每孔150 μL添加至96孔ELISA盤中。將ELISA盤保存於濕箱中且在37℃下培育1小時。
用UV-Vis分光光度計量測樣品濃度。樣品首先用含3%脫脂乳之PBS稀釋至20 μg/mL且接著執行第一輪連續稀釋以達到較低濃度，諸如100 μg/mL及20000 ng/mL。在低結合96孔盤中進行第二輪連續稀釋(例如始於20000 ng/mL)以達到以下最終濃度：20000 ng/mL、6666.667 ng/mL、2222.222 ng/mL、740.741 ng/mL、246.914 ng/mL、82.305 ng/mL、27.435 ng/mL、9.145 ng/mL、3.048 ng/mL、1.016 ng/mL及0.339 ng/mL。含3%脫脂乳之PBS用作空白。
使用BioTEK 405LS微量盤洗滌器，用含0.05% Tween 20之PBS洗滌ELISA盤三次(洗滌循環：003；分配/抽吸體積：150 μL/孔；及流動速率07)。用一堆紙巾將盤揩乾，直至觀測不到殘餘流體。
用多注式吸液管將樣品及空白對照轉移至ELISA盤(50 μL/孔)，一式兩份。將ELISA盤保存於濕箱中且在37℃下培育1小時。培育之後，使用BioTEK 405LS微量盤洗滌器，用含0.05% Tween 20之PBS洗滌ELISA盤四次(洗滌循環：004；分配/抽吸體積：150 μL/孔；及流動速率07)。接著用一堆紙巾將盤揩乾，直至觀測不到殘餘流體。
用含有3%脫脂乳之PBS將HRP山羊-抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma-Aldrich，目錄#A0293-1ML)稀釋至1000 ng/mL，接著以50 μL/孔添加至ELISA盤中。將ELISA盤保存於濕箱中且在37℃下培育1小時。培育之後，使用BioTEK 405LS微量盤洗滌器，用含0.05% Tween 20之PBS洗滌ELISA盤四次(洗滌循環：004；分配/抽吸體積：150 μL/孔；及流動速率07)。接著用一堆紙巾將盤揩乾，直至觀測不到殘餘流體。
用多注式電子移液管將每孔50 μL TMB (KPL，目錄號52-00-01)添加至ELISA盤中。約5分鐘之後，用多注式電子移液管添加50 μL/孔之1 M磷酸以淬滅反應。一旦反應淬滅，即用微量盤讀取器讀取每個有效孔在450 nm下之吸光度。計算測試樣品之莫耳濃度。將標準曲線之莫耳濃度轉換為log (M)。藉由GraphPad，用Asymmetric Sigmoidal, 4 PL擬合作為X之log (M)及作為Y之吸光度。
FACS：對於經工程改造以表現ROR1 (培養於Waymouth之MB 752/1培養基 + 15% FBS + 2 mM L-麩醯胺酸 + 3 µg/mL嘌呤黴素(InvivoGen，目錄號ant-pr-1))之貼附型細胞(HT-29、NCI-H226、EMT6 (ATCC，目錄號CRL-2755，培養於Waymouth之MB 752/1培養基(Sigma，目錄號W1625) + 15% FBS + 2 mM L-麩醯胺酸(Gibco，目錄號25030081))及經工程改造以表現ROR2 (Waymouth之MB 752/1培養基 + 15% FBS + 2 mM L-麩醯胺酸 + 3 µg/mL嘌呤黴素))之EMT6而言，丟棄用過的細胞培養基，且用DPBS (Meilunobio，目錄號MA0010)洗滌細胞。細胞接著用胰蛋白酶-EDTA (Gibco，目錄# 25300-062)消化，直至細胞自燒瓶脫離。添加細胞培養基以停止消化，且藉由吸液至細胞層表面若干次來分散培養基，得到細胞懸浮液。對於懸浮細胞(293F)而言，將細胞懸浮液輕輕地混合。
輕輕地混合細胞懸浮液。將20 μL細胞懸浮液添加至1.5 mL計數器管中且亦添加1 μL Solution 18 AO·DAPI染色溶液(ChemoMetec，產品編號：910-3018)。接著充分混合樣品且將12 µL混合溶液添加至計數盤中以用NucleoCounter計算細胞數目。將必需數目之細胞轉移至50 mL離心管中。將細胞懸浮液在室溫下以200×g離心5分鐘且棄去上清液。細胞接著用5 mL DPBS洗滌一次且在室溫下以200×g離心5分鐘。棄去上清液。細胞集結粒用2% FBS/DPBS再懸浮以將細胞密度調節至2×10 6個細胞/mL。充分混合細胞懸浮液且將50 μL/孔之細胞轉移至96孔盤中。
測試抗體在96孔盤中用2% FBS/DPBS稀釋以製備7-9個連續稀釋液(2×工作濃度)。將50 μL/孔之連續稀釋測試抗體轉移至含有50 μL/孔之細胞懸浮液的96孔盤中，且在4℃下避光培育30分鐘。細胞接著用每孔150 μL之2% FBS/DPBS洗滌，且在室溫下以500×g離心5分鐘。棄去上清液。細胞進一步用250 μL/孔之2% FBS/DPBS洗滌，且在室溫下以500×g離心5分鐘。棄去上清液。向盤中添加具有2% FBS/DPBS之100 µL/孔之APC抗人類IgG Fc (1:200稀釋度，Biolegend，目錄號410712)，且在4℃下避光培育30分鐘。細胞接著用2% FBS/DPBS洗滌兩次，且在室溫下以500×g離心5分鐘。棄去上清液。細胞集結粒用100 µL DPBS再懸浮用於流式細胞術分析。
如 圖2 A - 圖 2F及下 表 10中所示，所選ROR可活化抗體純系(包括 M1、 M2及 M3)在掩蔽肽存在下展現與抗原之極小結合，表明所有主要候選物展現掩蔽肽之有效/容易裂解。 表 10. M1、 M2及 M3相對於 P0之掩蔽效率(ME)。
抗體 掩蔽效率 (ME)
ROR1 (ELISA) ROR2 (ELISA) HT-29 H226 293F
M1 90 40 430 350 380
M2 140 150 820 490 500
M3 50 60 220 200 210
P0 1 1 1 1 1
實例2.  抗ROR可活化抗體之可開發性
藉由UV-分光光度法測定所產生之可活化抗體的蛋白質濃度，且藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及尺寸排阻-高效液相層析(SEC-HPLC)在變性、還原及非還原條件下分析IgG純度。
SDS-PAGE：用調配物緩衝液將抗體樣品稀釋至1 mg/mL。在非還原條件下，用SDS樣品緩衝液(Bio-Rad #1610737)將抗體樣品進一步稀釋至0.5 mg/mL。在還原條件下，抗體樣品用20 mM DTT內之SDS樣品緩衝液進一步稀釋至0.5 mg/mL。所有樣品接著在70℃下加熱5分鐘。使用12%凝膠及8%凝膠。將1 μg變性樣品裝載至凝膠孔中且使用電泳設備分離樣品。在用考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue，CBB)染色之後，將凝膠脫色，且用凝膠相機描繪。
SEC-HPLC：使用以下儀器及材料，包括HPLC：Thermo U3000；管柱：Waters XBridge BEH SEC管柱(200Å，3.5 μm，7.8×300 mm)；及移動相：50 mM磷酸鹽、300 mM氯化鈉、pH 6.8。抗體樣品如下製備：若樣品濃度高於10.0 mg/mL，則用樣品緩衝液將樣品稀釋至10.0 mg/mL；且若樣品濃度低於或等於10.0 mg/mL，則不進行稀釋。樣品接著以13,800 g離心10分鐘。在測試之前，管柱依次用各至少15個管柱體積之超純水及移動相洗滌。監測吸光度及背壓直至獲得穩定基線。樣品注射量為40 μg且流速為0.7 mL/min，而運行時間為20分鐘。根據280 nm吸光度量測峰強度。藉由面積標準化方法測定高分子量(HMW)及低分子量(LMW)單體之相對峰面積百分比。
如 表 11中所示，所有所選候選物展現高表現、高純度及單體(SEC-HPLC)。 表 11. P0、 M1 、 M2及 M3 之活體外表徵。
抗體 滴度 (mg/L) SEC 純度 SDS-PAGE 易於裂解
HMW (%) LMW (%)
M1 170 1.7 0.5 正常 是
M2 91 3.4 0.0 正常 是
M3 122 3.4 0.1 正常 是
P0 146 2.6 0.5 正常 NA
接著使用差示掃描螢光測定法(DSF)評估掩蔽抗體穩定性(Tm)。簡言之，用調配物緩衝液將測試抗體稀釋至1 mg/mL且將染料試劑(SYPRO® Orange，Invitrogen #S6650)稀釋至50倍。將16 μL樣品溶液與4 μL染料溶液混合於96孔盤(Roche #4729692001)中。接著將樣品溶液在LightCycler 480系統中以0.02℃/s之升溫速率自20℃加熱至95℃。分析DSF數據且用LCS480軟體1.5.1.62進行擬合。
結果顯示於下 表 12及 圖 3A - 圖 3B中，表明掩蔽抗體之Tm 1及Tm 2類似於親本 P0。此等結果指示掩蔽抗體之總體穩定性不變。 表 12.  P0、 M1、 M2及 M3之穩定性。
抗體 Tm 1 Tm 2
M1 64.7 81.3
M2 64.7 81.1
M3 64.7 81.1
P0 64.8 80.4
亦使用還原及非還原性毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)評估掩蔽抗體。使用以下儀器及材料：毛細管電泳：Protein Simple Maurice及Maurice CE-SDS濾筒(Protein Simple #PS-MC02-SP)。首先用SDS樣品緩衝液(非還原用Protein Simple #046-567，還原用Protein Simple #046-012)將抗體樣品稀釋至1 mg/mL。向50 μL經稀釋之樣品中添加2 μL 25×內標(Protein Simple #046-144)。在非還原條件下，樣品用2.5 μL 250 mM IAM (Aladdin #I105563)處理且在65℃下加熱10分鐘。在還原條件下，樣品用2.5 μL 14.2 M 2-巰基乙醇(BME) (Sigma #97622)處理且在70℃下加熱10分鐘。接著量測所製備之樣品(偵測：220 nm；裝載樣品：4600 V，20 s；及分離：5750 V 35 min (非還原)及5750 V 25 min (還原))。
例示性結果展示於 圖 4A - 圖 4D中，表明相對於親本 P0抗體，掩蔽抗體的CE-SDS圖案(HC及LC)未顯示顯著差異。
使用毛細管等電聚焦(cIEF)評估掩蔽抗體之等電點(pI)。使用以下儀器及材料：毛細管電泳：Protein Simple Maurice；及Maurice cIEF濾筒(Protein Simple #PS-MC02-C)。簡言之，根據總樣品數及各樣品所需之組分量製備預混液(對於100 µL總體積而言，每個樣品之預混液包括0.5 µL之pI標記物(pI 5.85，Protein Simple #102225)；1 µL之pI標記物(pI 10.17，Protein Simple #046-035)；1 µL之Pharmalyte 3-10 (Cytiva #17045601)；3 µL之Pharmalyte 5-8 (Cytiva #17045301)；35 µL之1%甲基纖維素(Protein Simple #101876)；20 µL之10 M尿素；2 µL之500 mM精胺酸(Sigma #V900343)；及17.5 µL之超純水)。將抗體樣品稀釋至1.0 mg/mL。接著將20 μL經稀釋之樣品與80 μL預混液混合於微量離心管中。將混合物充分混合，短暫離心且量測(聚焦電壓及持續時間：聚焦週期1：在1500 V下為1分鐘，且聚焦週期2：在3000 V下為9分鐘；及樣品注射持續時間：55秒)。
結果展示於 圖 5A - 圖 5D中，同時指示主峰%。結果顯示所有掩蔽抗體候選物之pI相對於親本 P0減小。
使用疏水性相互作用層析(HIC)進一步測試抗體。使用以下儀器及材料：HPLC：Thermo U3000；管柱：Thermo MAbPac HIC-10，5 μm，1000 Å，4.6×100 mm；移動相A：1 M硫酸銨、100 mM磷酸鈉，pH 7.0；及移動相B：100 mM磷酸鈉，pH 7.0。若樣品濃度超過2 mg/mL，則用移動相A將樣品稀釋至1 mg/mL。若樣品濃度小於2 mg/mL，則樣品用移動相A對半稀釋。注射樣品量為10 μg，且儀器如下 表 13中所說明設定。 表 13. HIC設定。
泵參數
編號 時間 流量(mL/min) B% C% D% 曲線
1 0.000 1.0 0.0 0.0 0.0 5
2 15.000 1.0 100.0 0.0 0.0 5
3 20.000 1.0 100.0 0.0 0.0 5
4 20.001 1.0 0.0 0.0 0.0 5
5 25.000 1.0 0.0 0.0 0.0 5
6 25.000 停止運行
取樣器參數
注射模式 正常
溫度 5±3℃
管柱烘箱參數
溫度 25 ± 5℃
待用溫度Δ 5℃
UV偵測器參數
編號 通道 波長(nm) 頻寬(nm) 參考波長(nm)
1 UV_VIS_1 280 4 Off
主要呈現單一峰之所有主要候選物的親水性大於親本 P0抗體，且展現改良之疏水性概況，而 M3之疏水性大於 M1及 M2。參見 圖 6及下 表 14。 表 14.  P0、 M1、 M2及 M3之HIC-HPLC結果。
抗體 RT (min)
M1 7.8
M2 7.8
M3 11.0
P0 12.4
另外，在不同應力條件下檢查抗體穩定性。
首先，在高溫(40℃)下0天、7天及14天之後，評估掩蔽抗體之穩定性。簡言之，用20 mM組胺酸pH 5.5將樣品稀釋至1.0 mg/mL。將120 μL經稀釋之樣品等分至各管中。樣品接著在40℃、75%相對濕度下儲存7或14天，且藉由UV280吸光度、SEC及SDS-PAGE加以分析。
如 圖 7A - 圖 7D中所示，觀測到主峰%出現極輕微的減小，而主峰%的輕微減小類似於親本 P0。
此外，在3個及6個循環的冷凍及解凍(F/T或FT)之後，分析掩蔽抗體之穩定性。簡言之，用20 mM組胺酸pH 5.5將樣品稀釋至1.0 mg/mL。將120 μL經稀釋之樣品等分至各管中。將樣品在-80℃冷凍機中置放70分鐘，移除且在室溫下解凍70分鐘。此類冷凍及解凍步驟重複執行總共3或6個循環(在本文中亦分別稱為FT3或FT6)。接著藉由UV280吸光度、SEC及SDS-PAGE分析樣品。
結果展示於 圖 8A - 圖 8D中，表明候選物在3個F/T循環之後均穩定，額外F/T循環(6)展示可偵測水平之HMW值及輕微不穩定性。因此，建議避免額外的F/T循環。
另外，如藉由SEC-HPLC所量測及 圖 9A - 圖 9D中所示，掩蔽抗體在低pH條件下係穩定的；同時如藉由SEC-HPLC所量測及 圖 10A - 圖 10D中所示，掩蔽抗體在氧化條件(2% H 2O 2)下係穩定的。
掩蔽抗體在食蟹獼猴血液(血漿或血清，暴露1週)中亦為穩定的。簡言之，100 µg/mL抗體在食蟹獼猴血漿或血清中、在37℃下培育1週，且接著藉由ELISA (抗Fc捕捉、抗Fab偵測)量測總抗體，同時基於與ROR1抗原之結合藉由ELISA來偵測活化抗體。
樣品如下製備。測試抗體在猴血漿或血清中以100 μg/mL稀釋，等分且在37℃下培育3小時、6小時、24小時、48小時、96小時或168小時。培育之後，將各樣品在-20℃下儲存直至分析。一個小瓶樣品隨即在-20℃下保存作為0小時對照。
盤接著如下包被。向96孔ELISA盤中添加100 μL包被抗體溶液(對於總形式之偵測而言，山羊抗人類IgG，1 μg/mL，SouthernBiotech，目錄號2049-01)或包被抗原溶液(對於裂解形式之偵測而言，經His標記之ROR1域1，1 μg/mL，Acro Biosystems，目錄號RO1-H5221)。接著將盤密封且在4℃下培育隔夜。在培育之後，如下阻斷該盤。用0.05% PBST洗滌盤三次。將300 μL阻斷緩衝液(含有2%脫脂乳之PBS)添加至各孔中。接著將盤密封，且在37℃下培育1小時。
標準物(STD)如下製備。藉由用含有2%脫脂乳之PBS將合併之猴血漿或血清稀釋100倍來製備Sol 0溶液。MRD (最小所需稀釋度)為1:100。對於包被抗體(山羊抗人類IgG) STD (總形式，製備各抗體之標準曲線)，製備2.00、4.41、9.70、21.34、46.96、103.31、227.27及500 ng/mL的抗體濃度，且對於包被抗原(經His標記之ROR1域1) STD (裂解/活化形式，親本抗體 P0用作所有經測試之可活化抗體的STD)，製備8.82、19.40、42.69、93.91、206.61、454.55及1000 ng/mL的抗體濃度。對於兩種STD中之各者，製備100 ng/mL之品質對照(QC)。
樣品就總抗體測試而言用Sol 0稀釋800倍且就活化抗體測試而言稀釋100倍且如下培育。用300 μL/孔之0.05% PBST洗滌盤三次。向各孔中添加100 μL樣品。將盤密封且在37℃下培育1小時。在培育之後，盤用300 μL/孔之0.05% PBST洗滌三次。向各孔中添加100 μL偵測抗體(HRP山羊抗hIgG (Fab特異性)，Sigma，目錄號A0293，用2%脫脂乳以1:5000稀釋)。將盤密封且在37℃下培育1小時。用300 μL/孔之0.05% PBST洗滌盤四次之後，向各孔中添加50 μL TMB受質(Abcam，目錄號ab171525)，且在室溫下培育2至3分鐘，直至達到所需顏色強度。添加50 μL終止溶液(Abcam，目錄號ab171529)來終止反應且用微量盤讀取器量測OD 450及OD 630值。所得數據藉由GraphPad Prism 7.0及Asymmetric Sigmoidal, 5PL處理，X為log(濃度)回歸模式。將測試樣品之OD 450-OD 630內插至標準曲線中且計算樣品濃度。
結果展示於 圖 11A - 圖 11C中，表明經活化之掩蔽抗體含量低於所有候選物之偵測極限(＜2 µg/mL)且所有候選物在食蟹獼猴血液中被掩蔽。
總之，此等結果表明即使在未對調配物最佳化之情況下， M1、 M2及 M3亦具有極佳的可開發性概況。
實例3.  抗ROR可活化抗體之結合親和力
量測對人類/食蟹獼猴(食蟹猴)、小鼠及大鼠ROR1及ROR2之結合親和力，例如使用表面電漿子共振(SPR)或生物層干涉術(BLI)量測。
BLI：動力學緩衝液(1×PBS、0.02% Tween20 (v/v)、0.1% BSA (w/v)、pH 7.4)用作樣品稀釋緩衝液。將抗體及抗原稀釋至100 nM。ForteBio Octet RED96系統之測試溫度設定為25℃。將AHC生物感測器(Sartorius Fortebio #18-2060)浸入含有動力學緩衝液之孔中持續60秒作為基線階段，浸入含有抗體之孔中持續300秒作為負載階段，且浸入含有動力學緩衝液之孔中持續120秒作為基線階段。接著將AHC生物感測器浸入含有抗原之孔中持續300秒以進行締合階段，隨後浸入動力學緩衝液中持續300秒以進行解離階段。最後，將AHC生物感測器浸入再生緩衝液(10 mM甘胺酸-HCl，pH 1.5)中持續30秒以進行再生階段。所得ForteBio數據用數據擷取軟體7.1處理。使用1:1朗格繆爾結合模型擬合動力學數據。
SPR：根據胺偶合套組(Cytiva，目錄# BR-1000-50)的說明書，將抗人類IgG (Fc)抗體(Cytiva，目錄號BR-1008-39)固著於CM5晶片上，此藉由將其胺基與感測器晶片之羧基化表面偶合來達成。固著層面之最終反應應在5,000 RU與10,000 RU之間(艾德韋斯實驗(Edelweiss experiments)測得為6,000)。測試抗體用1×HBS-EP緩衝液(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA·2Na、0.005% (v/v) Tween 20，pH 7.4)稀釋至7.5 μg/mL，且以10 μL/min流速注入系統中持續10秒，以達成300-500 RU捕捉水平範圍內之固著(例如測得415 RU)。抗原用1×HBS-EP緩衝液連續稀釋至0.625至20 nM範圍內之濃度，且以30 μL/min流速流經測試抗體被捕捉之表面持續300秒。締合之後，將1×HBS-EP緩衝液以30 μL/min流速注射至表面上持續另外1200秒，以量測抗原解離速率。使用10 mM甘胺酸-HCl pH 1.5移除被晶片捕捉之測試抗體/抗原複合物以將感測器晶片再生，用於下一輪測試抗體/抗原締合/解離量測循環。應用雙參考減除方法，包括使用未捕捉測試抗體之參考通道的參考減除及使用零濃度之空白樣品的空白減除。使用Biacore T200評估軟體將締合及解離感測圖譜與1:1結合模型擬合。
結果展示於下 表 15中。 P0mAb對ROR1與ROR2受體兩者展現結合。在 不存在活化MMP9之情況下，掩蔽mAb不展現ROR1或ROR2受體結合。在 存在活化MMP9之情況下，未掩蔽之mAb展現與未掩蔽之 P0mAb相當的結合。 表 15. 測試抗體之單價K D值(nM)。
作為配位體(捕捉於晶片上) 作為分析物 ( 流量 )
抗體測試物 重組蛋白質抗原
ROR1 (IgG樣域) ROR2 (IgG樣域)
人類/食蟹猴 小鼠 大鼠 人類/食蟹猴 小鼠 大鼠
Hu v食蟹猴ROR1 IgG樣域係相同的 Mo v大鼠ROR1 IgG樣域：1AA差異 Hu v食蟹猴ROR2 IgG樣域係相同的 Mo v大鼠ROR2 IgG樣域：1AA差異
M1掩蔽 NB NB NB NB NB n/a
M2掩蔽 NB NB NB NB NB n/a
M3掩蔽 NB NB NB NB NB n/a
M1未掩蔽 1.15 0.838 0.924 0.695 32.1 n/a
M2未掩蔽 1.06 0.704 0.815 0.741 51.7 n/a
M3未掩蔽 1.09 0.776 0.784 0.796 48.87 n/a
P0 0.671 0.544 0.556 0.387 28.94 n/a
實例4.  抗ROR可活化抗體之活體內特徵 - 研究1
將表現ROR1之EMT6細胞植入BALB/c小鼠中，且接著如下 表 16中詳述，用測試物治療荷瘤小鼠。在投與之後的第24小時收集小鼠血漿且使用蛋白質A珠粒純化總IgG。接著處理樣品以進行抗人類IgG西方墨點法(WB)。結果顯示於 圖 12中，表明 M2在給藥後的24小時完整保留於循環中。 表 16.  EMT6-ROR1荷瘤BALB/c小鼠之活體內投與。
組號 N 測試物 劑量 (mg/kg) 給藥途徑 頻率
1 1 P0 3 i.p. 單次給藥
2 1 P0 10 i.p. 單次給藥
3 1 M2 3 i.p. 單次給藥
4 1 M2 10 i.p. 單次給藥
5 1 PBS - i.p. 單次給藥
隨後執行類似但經擴展的實驗。參見下 表 17中所示之實驗設計。在投與之後的第24、72及96小時收集小鼠血漿(N=3隻小鼠/組)且使用蛋白質A珠粒純化總IgG。接著處理樣品以進行抗人類IgG西方墨點法(WB)。並行測試100 ng P0且其充當對照，且測試掩蔽抗體與活體外裂解之抗體中之各者之100 ng混合物。結果展示於 圖 13A - 圖 13C中，表明所有三種掩蔽抗體在給藥後的長達96小時完整保留於循環中。 表 17.  EMT6-ROR1荷瘤BALB/c小鼠之活體內投與。
組號 N 測試物 劑量 (mg/kg) 給藥途徑 頻率
1 9 P0 10 i.p. 單次給藥
2 9 M1 10 i.p. 單次給藥
3 9 M2 10 i.p. 單次給藥
4 9 M3 10 i.p. 單次給藥
5 9 同型對照 10 i.p. 單次給藥
總之，在全身性給予荷瘤小鼠之後，掩蔽抗體主要作為完整/掩蔽抗體循環。
實例5.  抗ROR可活化抗體之活體內特徵 - 研究2
將表現ROR1之EMT6細胞植入BALB/c小鼠中。當平均腫瘤體積達到約196 mm 3時，如下 表 18中所詳述，用測試物治療荷瘤小鼠。接著在給藥後的第14小時及96小時收集異種移植腫瘤，使用流式細胞術進行受體佔有率(RO)分析(N=3隻小鼠/組)。 表 18.  EMT6-ROR1荷瘤BALB/c小鼠之活體內投與。
組號 N 測試物 劑量(mg/kg) 給藥途徑 頻率
1 6 P0 10 i.p. 單次給藥
2 6 M1 10 i.p. 單次給藥
3 6 M2 10 i.p. 單次給藥
4 6 M3 10 i.p. 單次給藥
5 2 同型對照 10 i.p. 單次給藥
用無菌刮刀或剪刀將所收集的腫瘤組織切成約1 mm碎片且將組織碎片轉移至15 mL管中。組織碎片接著用10 ml PBS洗滌三次。移除殘餘PBS。將預溫熱的0.25%胰蛋白酶添加至組織碎片中(每100 mg組織1 ml胰蛋白酶)且在37℃下培育10分鐘。在培育期間，每5分鐘輕輕地拍打管。在胰蛋白酶消化期結束時，藉由添加含有2% FBS之PBS來中和胰蛋白酶。將懸浮液及組織傾入50 ml管頂部之40 μm細胞過濾器中。使用杵棒輕輕地研磨組織碎片，同時不時地添加PBS以沖洗經研磨之組織碎片。殘留之組織碎片若有，則丟棄。細胞懸浮液以500×g離心5分鐘。用PBS洗滌細胞兩次。使用Vi-CELL XR量測總細胞數目及存活率。
如下所述評估受體佔有率。對於各腫瘤樣品而言，將3×10 6個細胞添加至1.5 ml微量離心管中。將細胞離心，且丟棄上清液。細胞離心塊用含有1:1000 live/dead染料(Invitrogen, L34955)之100 μl PBS再懸浮且在室溫下在黑暗中培育10分鐘。添加300 μl PBS以中止染色。樣品以500×g離心5分鐘，且用PBS再洗滌一次。添加300 μl PBS以將細胞再懸浮，接著將細胞等量分入3個管中，分別標記為P0、同型、細胞空白對照。將P0或同型抗體添加至對應管中直至各自的最終濃度為100 nM且在4℃下培育30分鐘。培育之後，細胞用PBS洗滌兩次，且與含有1:500 APC抗人類IgG(H+L)二級抗體(Jackson Immuno Research，109-136-088)及1:300抗小鼠CD45抗體(BD, 557235)的PBS一起在4℃下、在黑暗中培育30分鐘。細胞進一步用PBS洗滌兩次，再懸浮於PBS中，且接著藉由流式細胞術進行分析。
如 圖 14 、圖 15A - 圖 15B 及表 19中所示，在第14小時之早期時間點觀測到較高RO含量(40-60%)且在親本抗體與掩蔽抗體之間，RO含量相似。如 圖 14、 圖 16A - 圖 16B及 表 20中所示，在第96小時，RO含量降低，且觀測到親本抗體之降低速度大於掩蔽抗體。 表 19. 給藥後第14小時之RO。
測試物 P0 M1 M2 M3 同型對照
組號 1 2 3 4 5
動物編號 1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1
抗ROR 104122 79584 80042 130639 111226 65290 102635 77155 115691 97944 75023 77459 105228
IgG1 72500 46624 50727 47450 39744 39861 69135 44568 73712 52160 45744 51052 8898
RO% 66.79% 53.37% 58.79% 31.67% 30.14% 54.91% 64.26% 52.26% 60.69% 48.58% 55.72% 61.48% -
表 20. 給藥後第96小時之RO。
測試物 P0 M1 M2 M3 同型對照
組號 1 2 3 4 5
動物編號 1-4 1-5 1-6 2-4 2-5 2-6 3-4 3-5 3-6 4-4 4-5 4-6 5-2
抗ROR 88290 43072 63123 67703 72623 98372 49866 92876 44103 59678 44827 65005 71505
IgG1 16088 10822 10779 15579 27882 13773 17374 37802 14893 20729 18272 19671 1198
RO% 17.01% 22.81% 15.34% 21.51% 37.28% 12.85% 33.11% 39.86% 31.77% 33.29% 39.00% 28.84% -
總之，當以10 mg/kg全身性給予荷瘤小鼠時，掩蔽抗體達成≥90%的瘤內RO計算值(或與親本Ab相似的水平)。
實例6.  抗ROR可活化抗體之活體內特徵 - 研究3
開發同時顯示ROR1及胰島素的雙重染色IHZ分析。為了證實IHZ的染色圖案與IF之染色圖案無差異，將病理學家認為完整性良好的冷凍人類胰臟樣品固定且針對ROR1及胰島素進行IF染色。結果展示於 圖 17中。胰島素染色以綠色螢光示出(如 圖 17中箭頭所示)，而ROR1染色以紅色螢光示出(如 圖 17中箭頭所示)。胰島容易鑑別且IF與IHZ均顯示胰島內部及外部之ROR1染色。
驗證IHZ分析方案之後，使用 P0、 M1、 M2或 M3測試以下冷凍樣品中之ROR1表現，包括充當陽性對照之HT-29、充當陰性對照之MCF7及若干人類胰臟樣品。此處使用之所有人類胰臟樣品經病理學家認為具有良好完整性且進一步針對胰島素進行染色。
代表性結果展示於 圖 18A - 圖 18D中。如 圖 18A中所示，使用親本 P0，觀測到HT-29 (陽性對照)細胞之染色強，而MCF7 (陰性對照)細胞之染色顯示極弱。使用三種所測試之掩蔽抗體或同型對照，任一細胞株均未觀測到染色。如 圖 18B中所示，在人類胰臟樣品#5及#3中，親本 P0抗體在整個胰臟中及在胰島中顯示分散的一些細胞質及膜染色。 M1及 M2在胰臟中顯示分散的極弱染色，但在胰島中無染色，而 M3顯示分散的弱染色。如 圖 18C中所示，在人類胰臟樣品#6及#7中，親本 P0抗體在整個胰臟中及在胰島中顯示分散的一些細胞質及膜染色。 M1、 M2及 M3在胰臟中顯示分散的極弱染色，但在胰島中無染色。如 圖 18D中所示，在人類胰臟樣品#8及#9中，親本 P0抗體在整個胰臟中及在胰島中顯示分散的一些細胞質及膜染色。 M1、 M2及 M3顯示人類胰臟#8存在微弱、分散的染色(所有3種掩蔽抗體在此胰臟中得到相對較高的染色(相對於其他五個胰臟))。 M3顯示微弱、分散的染色。
總體而言， P0在整個胰臟中及在胰島中展現分散的細胞質及膜染色。在胰島中的染色似乎更密集，且 P0在IHZ中產生的染色圖案類似於IHC。三種掩蔽抗體在胰臟中顯示極弱的染色且在胰島中無染色。在人類胰臟#8中之染色略微高於其他5個人類胰臟。不希望受理論束縛，胰臟#8之完整性可能比其他5個差。此外，M3之染色略微高於其他2種掩蔽抗體，從而與活體外掩蔽效率水平相關。參見下 表 21。總之，對IHC中，掩蔽抗體對胰島(人類組織)不顯示結合。 表 21. 活體外遮蔽效率。
HT-29 EC 50(nM) ME %Max EC 50(nM) ME %Max
CHO-S產生之抗體 HEK293產生之抗體
P0 0.45 1 100 0.34 1 100
M1 92 200 49 150 430 50
M2 220 480 45 280 820 52
M3 51 110 46 76 220 46
在本申請案通篇中，已提及各種公開案、專利、專利申請案及其他文獻。此等公開案、專利、專利申請案及其他文獻之揭示內容特此以全文引用之方式併入本申請案中以用於所有目的，包括為了更充分地描述與本文中所揭示之此標的物有關的目前技術水平。雖然所揭示之標的物已結合上文所提供之實例加以描述，但應瞭解，可在不偏離所揭示之標的物之精神的情況下進行各種修改。熟習此項技術者在審閱本說明書後將顯而易知諸多變型。
圖 1顯示自阻斷肽之例示性選擇方法的示意圖，如 實例 1中進一步說明。
圖 2A - 圖 2F提供測試抗體結合至抗原之例示性結果，如 實例 1中進一步說明。 圖 2A顯示藉由ELISA所量測之測試抗體( P0及 M1)與ROR1-Fc之結合。 圖 2B顯示藉由ELISA所量測之測試抗體( P0、 M2及 M3)與ROR1-Fc之結合。 圖 2C顯示藉由ELISA所量測之測試抗體( P0、 M1、 M2及 M3)與ROR2-Fc之結合。 圖 2D顯示藉由FACS所量測之測試抗體( P0、 M1、 M2及 M3)與HT-29之結合。 圖 2E顯示藉由FACS所量測之測試抗體( P0、 M1、 M2及 M3)與H226之結合。 圖 2F顯示藉由FACS所量測之測試抗體( P0、 M1、 M2及 M3)與293F之結合。
圖 3A - 圖 3B提供測試抗體( M1、 M2及 M3)之例示性差示掃描螢光測定(DSF)結果，如在 實例 2中進一步說明。 圖 3A描繪螢光，而 圖 3B描繪d(螢光)/dT。
圖 4A - 圖 4D提供測試抗體( P0 ： 圖 4A ， M1 ： 圖 4B ， M2 ： 圖 4C ， 及 M3 ： 圖 4D)之例示性毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)結果，如在 實例 2中進一步說明。
圖 5A - 圖 5D提供測試抗體( P0 ： 圖 5A ， M1 ： 圖 5B ， M2 ： 圖 5C ， 及 M3 ： 圖 5D)之例示性毛細管等電聚焦(cIEF)結果，如在 實例 2中進一步說明。
圖 6提供測試抗體( P0、 M1、 M2及 M3)之例示性疏水性相互作用層析(HIC)結果，如在 實例 2中進一步說明。
圖 7A - 圖 7D提供測試抗體( P0 ： 圖 7A ， M1 ： 圖 7B ， M2 ： 圖 7C ， 及 M3 ： 圖 7D)在40℃培育下之例示性加速穩定性評估結果，如在 實例 2中進一步說明。
圖 8A - 圖 8D提供測試抗體( P0 ： 圖 8A ， M1 ： 圖 8B ， M2 ： 圖 8C ， 及 M3 ： 圖 8D)在冷凍及解凍(3輪：FT3；及6輪：FT6)之後的例示性加速穩定性評估結果，如在 實例 2中進一步說明。
圖 9A - 圖 9D提供測試抗體( P0 ： 圖 9A ， M1 ： 圖 9B ， M2 ： 圖 9C ， 及 M3 ： 圖 9D)在低pH下之例示性加速穩定性評估結果，如在 實例 2中進一步說明。
圖 10A - 圖 10D提供測試抗體( P0 ： 圖 10A ， M1 ： 圖 10B ， M2 ： 圖 10C ， 及 M3 ： 圖 10D)在氧化下之例示性加速穩定性評估，如進一步在 實例 2中說明。
圖 11A - 圖 11C提供測試抗體之例示性血漿或血清穩定性結果，如在 實例 2中進一步說明。 圖 11A繪製由總抗體濃度示出之血漿穩定性。 圖 11B繪製由總抗體濃度示出之血清穩定性。 圖 11C繪製由經活化抗體濃度示出之穩定性。
圖 12提供例示性西方墨點法結果，其顯示經3 mg/kg或10 mg/kg P0或 M2注射之小鼠產生了人類IgG，如在 實例 4中進一步說明。
圖 13A - 圖 13C提供例示性西方墨點法結果，其顯示經10 mg/kg M1( 圖 13A)、 M2( 圖 13B)或 M3( 圖 13C)注射之小鼠產生了人類IgG，如在 實例 4中進一步說明。
圖 14描繪在給予10 mg/kg P0、 M1、 M2或 M3之後的第14小時或96小時，小鼠的例示性瘤內受體佔有率(RO)結果，如在 實例 5中進一步說明。
圖 15A - 圖 15B提供在給與10 mg/kg同型對照物、 P0、 M1、 M2或 M3之後的第14小時，小鼠之例示性RO流式細胞術圖，如在 實例 5中進一步說明。 圖 15A提供與同型對照物、 P0及 M1有關的圖，而 圖 15B提供與 M2及 M3有關的圖。
圖 16A - 圖 16B提供在給與10 mg/kg同型對照物、 P0、 M1、 M2或 M3之後的第96小時，小鼠之例示性RO流式細胞術圖，如在 實例 5中進一步說明。 圖 16A提供與同型對照物、 P0及 M1有關的圖，而 圖 16B提供與 M2及 M3有關的圖。
圖 17提供例示性IHZ及免疫螢光(IF)染色結果，如在 實例 6中進一步說明。白色箭頭之頭部顯示胰島外部之ROR1染色，而白色箭頭顯示胰島內部之ROR1染色。
圖 18A - 圖 18D提供例示性IHZ染色結果，如在 實例 6中進一步說明。 圖 18A顯示HT-29及MCF7細胞上之ROR的IHZ染色。 圖 18B顯示正常人類胰臟樣品#3及#5中之ROR及胰島素的IHZ染色。 圖 18C顯示正常人類胰臟樣品#6及#7中之ROR及胰島素的IHZ染色。 圖 18D顯示正常人類胰臟樣品#8及#9中之ROR及胰島素的IHZ染色。在P0+胰島素組中，白色箭頭之頭部顯示胰臟中之ROR1染色，而白色箭頭顯示胰島內部之ROR1染色。在其他胰島素組中，白色箭頭顯示胰島。
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Claims (34)

  1. 一種結合至ROR之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含：掩蔽肽、抗體輕鏈可變(VL)區及抗體重鏈可變(VH)區； 其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:29、30或31之胺基酸序列，且 其中該VH區包含如包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之VH中所闡述之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3，且該VL區包含如包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之VL中所闡述之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3；且 視情況其中該可活化抗體或其片段包含多肽，該多肽自N端至C端包含該掩蔽肽及該抗體VL區。
  2. 如請求項1之可活化抗體或其片段，其中 該VH區包含： (1)   具有選自由SEQ ID NO: 1、7、12、13、18及27組成之群的胺基酸序列之VH CDR1； (2)   具有選自由SEQ ID NO: 2、8、14、19及24組成之群的胺基酸序列之VH CDR2；及 (3)   具有選自由SEQ ID NO: 3、9、15、20及28組成之群的胺基酸序列之VH CDR3；且 該VL區包含： (1)   具有選自由SEQ ID NO: 4、10、16及21組成之群的胺基酸序列之VL CDR1； (2)   具有選自由SEQ ID NO: 5、11及22組成之群的胺基酸序列之VL CDR2；及 (3)   具有選自由SEQ ID NO: 6、17及23組成之群的胺基酸序列之VL CDR3。
  3. 如請求項1之可活化抗體或其片段，其中： (i)    該VH區包含有包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3； (ii)   該VH區包含有包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3； (iii)  該VH區包含有包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3； (iv)   該VH區包含有包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL CDR3； (v)    該VH區包含有包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列的VL CDR3； (vi)   該VH區包含有包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列的VL CDR3；或 (vii)  該VH區包含有包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列的VH CDR2及包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列的VH CDR3；且該VL區包含有包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列的VL CDR2及包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列的VL CDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段進一步包含構架1 (FR1)、構架2 (FR2)、構架3 (FR3)及/或構架4 (FR4)序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段進一步包含人類構架序列，視情況如SEQ ID NO: 25或26中所闡述之構架1 (FR1)、構架2 (FR2)、構架3 (FR3)及/或構架4 (FR4)序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之可活化抗體或其片段，其中該VH包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列且該VL包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之可活化抗體或其片段，其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列。
  8. 如請求項7之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含多肽，且該多肽包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至6中任一項之可活化抗體或其片段，其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列。
  10. 如請求項9之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含多肽，且其中該多肽包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至6中任一項之可活化抗體或其片段，其中該掩蔽肽包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列。
  12. 如請求項11之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含多肽，且其中該多肽包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體或其片段包含有包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列的重鏈。
  14. 如請求項1至13中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體係單株抗體。
  15. 如請求項1至14中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體係人源化、人類或嵌合抗體。
  16. 如請求項1至15中任一項之可活化抗體或其片段，其為Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、(scFv) 2、單鏈抗體分子、雙重可變區抗體、單一可變區抗體、線性抗體、V區或由抗體片段形成之多特異性抗體。
  17. 如請求項1至16中任一項之可活化抗體或其片段，其結合或以重組方式融合至診斷劑、可偵測劑或治療劑。
  18. 如請求項17之可活化抗體或其片段，其中該治療劑為化學治療劑、細胞毒素或藥物。
  19. 如請求項1至18中任一項之可活化抗體或其片段，其中該可活化抗體係多特異性抗體。
  20. 如請求項19之可活化抗體或片段，其中該多特異性抗體係雙特異性抗體。
  21. 一種可活化結合劑，其與如請求項1至20中任一項之可活化抗體或其片段結合至基本上相同的抗原決定基。
  22. 如請求項21之可活化結合劑，其係可活化抗體或其片段。
  23. 如請求項22之可活化結合劑，其中該可活化抗體係多特異性抗體。
  24. 一種可活化結合劑，其與如請求項1至20中任一項之可活化抗體或其片段競爭結合至人類ROR。
  25. 如請求項24之可活化結合劑，其中該可活化結合劑係可活化抗體或其片段。
  26. 如請求項25之可活化結合劑，其中該可活化抗體係多特異性抗體。
  27. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至20中任一項之可活化抗體或其片段或如請求項22至23及25至26中任一項之可活化結合劑。
  28. 一或多種載體，其包含一或多種如請求項27之聚核苷酸或互補聚核苷酸。
  29. 一種細胞，其包含以下中之任何一或多者：如請求項1至20中任一項之可活化抗體或其片段、如請求項21至26中任一項之可活化結合劑、如請求項27之聚核苷酸或如請求項28之一或多種載體。
  30. 一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑及以下中之任何一或多者：如請求項1至20中任一項之可活化抗體或其片段、如請求項21至26中任一項之可活化結合劑、如請求項27之聚核苷酸、如請求項28之一或多種載體或如請求項29之細胞。
  31. 一種治療個體之疾病或病症之方法，其包含向該個體投與如請求項1至20中任一項之可活化抗體或其片段，或如請求項21至26中任一項之可活化結合劑，或如請求項30之醫藥組合物。
  32. 如請求項31之方法，其中該疾病或病症為表現ROR之癌症。
  33. 如請求項31或32之方法，其中該個體為人類個體。
  34. 一種製備結合至ROR之可活化抗體或其片段之方法，其包含培養如請求項29之細胞及表現該可活化抗體或其片段。
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