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TW202502799A - 酶裂解連接子及包含其的配體-艾瑞布林偶聯物 - Google Patents

酶裂解連接子及包含其的配體-艾瑞布林偶聯物 Download PDF

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TW202502799A
TW202502799A TW113105977A TW113105977A TW202502799A TW 202502799 A TW202502799 A TW 202502799A TW 113105977 A TW113105977 A TW 113105977A TW 113105977 A TW113105977 A TW 113105977A TW 202502799 A TW202502799 A TW 202502799A
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TW
Taiwan
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antibody
group
antibodies
ligand
cancer
Prior art date
Application number
TW113105977A
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English (en)
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尚玉栓
邱均專
王振生
明德 夏
陳如雷
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大陸商英諾湖醫藥（杭州）有限公司
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Publication date
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Abstract

本公開涉及生物醫藥技術領域，具體而言，涉及一種酶裂解連接子及包含其的配體-艾瑞布林偶聯物。更具體的，涉及SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子的應用。

Description

酶裂解連接子及包含其的配體-艾瑞布林偶聯物
本公開涉及生物醫藥技術領域，具體而言，涉及一種酶裂解連接子及包含其的配體-艾瑞布林偶聯物。
抗體偶聯藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是通過連接子(linker)將具有生物活性的小分子藥物偶聯至單克隆抗體（單抗）上而產生的。目前絕大部分ADC是由靶向腫瘤抗原的抗體通過連接子與高效細胞毒性的小分子化學藥物偶聯而成，利用抗體與靶抗原特異性結合的特點，將小分子藥物靶向遞送至腫瘤細胞進而發揮殺傷腫瘤的作用。也有將特異性結合的配體、抗原和多肽等具有與抗體相似的特異性結合性質的蛋白及多肽偶聯連接子毒素的。
連接子是關係到藥物穩定性和治療窗口的關鍵之一。首先，連接子需要具備一定的穩定性，從而在未達到腫瘤細胞之前，能確保 ADC 在血液循環過程中的完整性，避免提前釋放毒素導致脫靶毒性，影響 ADC 藥物的治療窗口。而在進入靶細胞後，連接子要確保毒素的有效釋放，發揮殺傷作用。多肽連接子是一種較為常見的可裂解連接子。截止2022年9月，已經有十個以上ADC藥物被批准上市，多數通過將毒素經多肽連接子接頭偶聯于單克隆抗體半胱胺酸殘基上，多肽可被腫瘤細胞的組織蛋白酶切斷從而釋放毒素，產生抗腫瘤作用。
現在臨床研究中最常用的是纈胺酸-瓜胺酸（VC），已上市藥物Adcetris即採用這種連接子將MMAE與抗體相連。還有一些ADCs藥物採用纈胺酸-丙胺酸（VA）和甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸（GGFG，SEQ ID NO:16所示的短肽），如SGN-CD33A，Loncastuximab tesirine和DS-8201a。
艾瑞布林（艾日布林，Eribulin）作為抗體偶聯物的毒素，其分子量大，結構複雜，親水性較好。分子量大需要篩選合適長度連接子，結構複雜可能不同的連接子由於空間位阻酶切釋放效率不同，親水性好比較適合製備一個抗體分子偶聯多個毒素的高偶聯比值偶聯物。PEG作為一種連接子常用的組件，其親水性好、穩定性好，常用PEG長度為2~8個，但是其光吸收不明顯，合成較為複雜。
本公開首次發現了SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子的應用。
配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述配體-藥物偶聯物的通式為TL-(L-D)n；
其中，TL為靶向配體，L為接頭單元，D為艾瑞布林，n為1~20的正整數；
L中包含SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子。
本公開還涉及如上所述的配體-藥物偶聯物的製備方法、藥物組合物及醫藥用途。
本公開所新發現的連接子，其具有顯著提升的藥物釋放效率，對腫瘤細胞的殺傷能力更強，在配體-藥物偶聯物中具有很好的應用前景。
現將詳細地提供本發明實施方式的參考，其一個或多個實例描述於下文。提供每一實例作為解釋而非限制本發明。實際上，對本領域技術人員而言，顯而易見的是，可以對本發明進行多種修改和變化而不背離本發明的範圍或精神。例如，作為一個實施方式的部分而說明或描述的特徵可以用於另一實施方式中，來產生更進一步的實施方式。
除非另有說明，用於披露本發明的所有術語(包括技術和科學術語)的意義與本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同。通過進一步的指導，隨後的定義用於更好地理解本發明的教導。本文中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在於限制本發明。
本文所使用的術語“和/或”、“或/和”、“及/或”的選擇範圍包括兩個或兩個以上相關所列項目中任一個項目，也包括相關所列項目的任意的和所有的組合，所述任意的和所有的組合包括任意的兩個相關所列項目、任意的更多個相關所列項目、或者全部相關所列項目的組合。需要說明的是，當用至少兩個選自“和/或”、“或/和”、“及/或”的連詞組合連接至少三個項目時，應當理解，在本申請中，該技術方案毫無疑問地包括均用“邏輯與”連接的技術方案，還毫無疑問地包括均用“邏輯或”連接的技術方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三種並列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技術方案，包括A、B、C、D中任一項（也即均用“邏輯或”連接的技術方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的組合，也即包括A、B、C、D中任兩項或任三項的組合，還包括A、B、C、D的四項組合（也即均用“邏輯與”連接的技術方案）。
本公開中所使用的術語“含有”、“包含”和“包括”是同義詞，其是包容性或開放式的，不排除額外的、未被引述的成員、元素或方法步驟。
本公開中用端點表示的數值範圍包括該範圍內所包含的所有數值及分數，以及所引述的端點。
本公開中涉及濃度數值，其含義包括在一定範圍內的波動。比如，可以在相應的精度範圍內波動。比如2%，可以允許±0.1%範圍內波動。對於數值較大或無需過於精細控制的數值，還允許其含義包括更大波動。比如100mM，可以允許±1%、±2%、±5%等範圍內的波動。涉及分子量，允許其含義包括±10%的波動。
本公開中，涉及“多個”、“多種”等描述，如無特別限定，指在數量上指大於等於2。
本公開中，以開放式描述的技術特徵中，包括所列舉特徵組成的封閉式技術方案，也包括包含所列舉特徵的開放式技術方案。
本公開中，“優選”、“更好”、“更佳”、“為宜”僅為描述效果更好的實施方式或實施例，應當理解，並不構成對本公開保護範圍的限制。本公開中，“可選地”、“可選的”、“可選”，指可有可無，也即指選自“有”或“無”兩種並列方案中的任一種。如果一個技術方案中出現多處“可選”，如無特別說明，且無矛盾之處或相互制約關係，則每項“可選”各自獨立。
如本文所用，術語“艾瑞布林”是指軟海綿素B(最初從海綿岡田軟海綿（Halichondria okadais）分離的大環化合物)的合成類似物，其CAS為253128-41-5。艾瑞布林為微管動力學抑制劑，認為其結合微管蛋白並通過抑制有絲分裂紡錘體組件，在G2/M期引起細胞週期停滯。術語“艾瑞布林甲磺酸鹽”，CAS為441045-17-6，是指艾瑞布林的甲磺酸鹽，其以商品名Halaven TM出售。
在本公開提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。除非和本申請的發明目的和/或技術方案相衝突，否則，本公開涉及的引用文獻以全部內容、全部目的被引用。本公開中涉及引用文獻時，相關技術特徵、術語、名詞、短語等在引用文獻中的定義也一併被引用。本公開中涉及引用文獻時，被引用的相關技術特徵的舉例、優選方式也可作為參考納入本申請中，但以能夠實施本公開為限。應當理解，當引用內容與本申請中的描述相衝突時，以本申請為准或者適應性地根據本申請的描述進行修正。
本公開涉及SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子的應用。
可採用的短肽還包括SEQ ID NO:18所示的短肽（X 1X 2GGFG），其中，X 1X 2均為胺基酸殘基，X 1和X 2各自獨立的選自甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、蛋胺酸、天冬胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、賴胺酸、精胺酸、谷胺酸和組胺酸；在一些實施方式中，X 1X 2為VC、VA、AC、AV、AA、VV中的任一種。進一步的，SEQ ID NO:18所示的短肽（X 1X 2GGFG）中的任一個胺基酸可以被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代。
本公開還涉及一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述配體-藥物偶聯物的通式為TL-(L-D)n；
其中，TL為靶向配體，L為接頭單元，D為艾瑞布林，n為1~20的正整數；
L中包含SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子。
其中，n的值還可以取2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19；優選1~8，更優選4~8。
術語“靶向配體”是能靶向性識別和結合目標細胞相關的抗原或受體的大分子化合物。配體的作用是將藥物呈遞給與配體結合的目標細胞群，這些配體包括但不限於蛋白類激素、凝集素、生長因子、抗體、具有結合能力的多肽或其他能與細胞結合的分子。在本公開的實施方式中，靶向配體表示為TL，靶向配體可通過配體上的雜原子與連接單元形成連接鍵。
術語“藥學上可接受的鹽”是指本公開配體-藥物偶聯物的鹽，意指對於給藥至患者(例如哺乳動物)是可接受的鹽(對於給定的劑量方案，其為包含具有可接受的哺乳動物安全性的抗衡離子的鹽)。這種鹽可衍生自藥學上可接受的無機鹼或有機鹼，以及衍生自藥學上可接受的無機酸或有機酸。本公開的配體-藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性示例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。尤其當所偶聯的藥物為艾瑞布林時，其優選的藥學上可接受的鹽是艾瑞布林甲磺酸鹽。
本公開所用術語“溶劑化物”是指通過溶劑化作用形成的本公開化合物與溶劑分子的組合。在某些情況下，溶劑化物指水合物，即溶劑分子為水分子，本公開化合物與水的組合形成水合物。
在一些實施方式中，所述接頭單元為-L 1-L 2-L 3-L 4-，L 1與TL相連，L 4與D相連；
其中，
L 1選自： 或點擊化學所需基團（優選 ）；
L 2選自：
-NC(R 1R 2)C(O)、-NR 3(CH 2) oC(O)-、-NR 3(CH 2CH 2O) oCH 2C(O)-、-S(CH 2) pC(O)-或化學鍵，其中o選自0~20的整數；p選自0~20的整數；
R 1、R 2各自獨立地選自氫原子、氘原子、烷基、取代烷基、氘代烷基、雜烷基、羧基、胺基、取代胺基；
R 3選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、芳基、取代芳基或雜芳基；
L 1與L 2共用N原子；
L 3為VAGGFG；
L 4選自：-NR 4(CR 5R 6) q-、-C(O)NR 4-、-C(O)NR 4(CH 2) q-或者化學鍵，q選自0~6的整數；
R 4、R 5和R 6各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基、取代芳基或雜芳基。
在一些實施方式中，L 4還可以選自：-NR 4-芳基-(CR 5R 6) q-OC(O)-、-NR 4(CR 5R 6) q-OC(O)-，q選自0~6的整數；
R 4、R 5和R 6各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基、取代芳基或雜芳基。
在一些實施方式中，o可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。
在一些實施方式中，p可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。
在一些實施方式中，q可為0、1、2、3、4、5、6。
“L 1與L 2共用N原子”是指，當所定義的L 1基團右側端基、所定義的L 2基團左側端基均含N原子時，二者共用N原子。
很明顯，可以通過將L 1簡單替換為其它，進而偶聯到TL的其它天然胺基酸位點、非天然胺基酸位點、末端位點、糖基化位點，或通過螯合或點擊化學等方式進行連接。點擊化學偶聯的實例如環加成反應、親核開環反應、非醇醛的羰基化學或碳碳多鍵的加成反應。
在一些實例中，TL具有官能團F 1，L 1具有或為其互補官能團。優選地，反應性基團L 1和官能團F 1能夠在生物正交反應中反應，因為那些反應不會干擾在該反應過程中存在的生物分子。生物正交反應和其中適合的官能團是本領域技術人員已知的，例如已知於Gong和Pan，Tetrahedron Lett.2015，56，2123‑2132，包括Staudinger連接和無銅點擊化學。因此，優選L 1選自1，3‑偶極子、炔烴、(雜)環辛炔、環辛烯、四嗪、酮、醛、烷氧基胺、肼和三苯基膦。例如，當F 1是疊氮基時，疊氮化物修飾的抗體和接頭‑綴合物的連接優選通過環加成反應進行。然後，官能團L 1優選選自炔基，優選末端炔基和(雜)環炔基。例如，當F 1是酮基時，酮修飾的抗體與接頭‑綴合物的連接優選通過與羥胺衍生物或肼的選擇性綴合進行，分別產生肟或腙。然後，官能團L 1優選為伯胺基(例如，‑NH 2基團)、胺氧基(例如，‑O‑NH 2)或肼基(例如，‑N(H)NH 2)。例如，當F 1是炔基時，炔烴修飾的抗體與接頭‑綴合物的連接優選通過環加成反應，優選1，3‑偶極環加成反應進行。然後，官能團L 1優選為1，3‑偶極子，例如疊氮化物、硝酮或氧化腈。F 1和L 1的位置也可以互換。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，優選含有1至12個碳原子的烷基，更優選含有1至10個碳原子的烷基，最優選含有1至6個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1‑二甲基丙基、1,2‑二甲基丙基、2,2‑二甲基丙基、1‑乙基丙基、2‑甲基丁基、3‑甲基丁基、正己基、1‑乙基‑2‑甲基丙基、1,1,2‑三甲基丙基、1,1‑二甲基丁基、1,2‑二甲基丁基、2,2‑二甲基丁基、1,3‑二甲基丁基、2‑乙基丁基、2‑甲基戊基、3‑甲基戊基、4‑甲基戊基、2,3‑二甲基丁基、正庚基、2‑甲基己基、3‑甲基己基、4‑甲基己基、5‑甲基己基、2,3‑二甲基戊基、2,4‑二甲基戊基、2,2‑二甲基戊基、3,3‑二甲基戊基、2‑乙基戊基、3‑乙基戊基、正辛基、2,3‑二甲基己基、2,4‑二甲基己基、2,5‑二甲基己基、2,2‑二甲基己基、3,3‑二甲基己基、4,4‑二甲基己基、2‑乙基己基、3‑乙基己基、4‑乙基己基、2‑甲基‑2‑乙基戊基、2‑甲基‑3‑乙基戊基、正壬基、2‑甲基‑2‑乙基己基、2‑甲基‑3‑乙基己基、2,2‑二乙基戊基、正癸基、3,3‑二乙基己基、2,2‑二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更優選的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1‑二甲基丙基、1,2‑二甲基丙基、2,2‑二甲基丙基、1‑乙基丙基、2‑甲基丁基、3‑甲基丁基、正己基、1‑乙基‑2‑甲基丙基、1,1,2‑三甲基丙基、1,1‑二甲基丁基、1,2‑二甲基丁基、2,2‑二甲基丁基、1,3‑二甲基丁基、2‑乙基丁基、2‑甲基戊基、3‑甲基戊基、4‑甲基戊基、2,3‑二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基。
術語“取代烷基”指烷基中的氫被取代基團取代，除非文中另有說明，烷基的取代基可以是選自下組的多種基團：‑鹵素、‑OR’、‑NR’R”、‑SR’、‑SiR’R”R”’、‑OC(O)R’、‑C(O)R’、‑CO 2R’、‑CONR’R”、‑OC(O)NR’R”、‑NR”C(O)R’、‑NR’‑C(O)NR”R”’、‑NR”C(O) 2R’、‑NH‑C(NH 2)＝NH、‑NR’C(NH 2)＝NH、‑NH‑C(NH 2)＝NR’、‑S(O)R’、‑S(O) 2R’、‑S(O) 2NR’R”、‑NR’S(O) 2R”、‑CN和‑NO 2，取代基數量為0至(2m’+1)，其中m’為該基團中碳原子的總數。R’、R”和R”’各自獨立的指代氫、未取代的C 1‑8烷基、未取代的芳基、由1‑3個鹵素取代的芳基、未取代的C 1‑8烷基、C 1‑8烷氧基或C 1‑8硫代烷氧基、或未取代的芳基‑C 1‑4烷基。R’和R”連接於同一個氮原子時，它們可與該氮原子一起形成3‑，4‑，5‑，6‑或7‑元環。例如，‑NR’R”包括1‑吡咯烷基和4‑嗎啉基。
術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O或S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。
術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“烷氧基烷基”指烷基被一個或多個烷氧基取代，優選被一個烷氧基取代，其中烷基如上所定義，其中烷氧基如上所定義。
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，優選包含3至12個碳原子，更優選包含3至10個碳原子，最優選包含3至8個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O) m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括‑O‑O‑、‑O‑S‑或‑S‑S‑的環部分，其餘環原子為碳。優選包含3至12個環原子，其中1、2、3或4個是雜原子；更優選雜環基環包含3至10個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高呱嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
術語“環烷基烷基”指烷基被一個或多個環烷基取代，優選被一個環烷基取代，其中烷基如上所定義，其中環烷基如上所定義。
術語“芳基”是指含有6至14個碳環原子的全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，具有共軛的π電子體系的多環(即其帶有相鄰對碳原子的環)基團。芳基可以是單環或多環的(即，可以含有一個以上的環)。在多環芳環的情況下，只要求多環系統中的一個環是芳香環，而其餘的環可以是飽和、部分飽和或不飽和環。芳基優選為6至10元的，例如苯基和萘基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子包括氧、硫和氮。雜芳基優選為5至10元。更優選是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N‑烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基等，所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環。雜芳基可以是任選取代的或未取代的。
術語“氘代烷基”指烷基上的氫被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，優選為最多5個，更優選為1個、2個或3個氫原子彼此獨立地被取代基取代。取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(通過實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
在一些實施方式中，-L 1-L 2-為 ，且s1為2、3、4、5、6、7或8。
在一些實施方式中，L 4為對胺基苄氧羰基（PAB）。
在一些實施方式中，所述靶向配體為抗體或其抗原結合片段。
本文使用的術語“抗體”以它的最廣泛意義使用，包括包含一個或更多個特異性結合抗原的抗原結合結構域的免疫球蛋白或其他類型分子，為對特定抗原表現出結合特異性的蛋白質或多肽。抗體的具體實例可包括完整抗體（例如經典四鏈抗體分子）、單鏈抗體、單域抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體等。經典抗體分子通常為由2個相同重鏈和2個相同輕鏈通過二硫鍵相互連接組成的四聚體。根據胺基酸序列的保守性差異，將重鏈和輕鏈分為位於胺基端的可變區（V）和位於羧基端的恒定區（C）。可變區用於識別和結合抗原，恒定區（如Fc片段）用於啟動下游效應，比如抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用（ADCC）。在重鏈和輕鏈的可變區內，分別有三個局部區域的胺基酸組成和排列順序具有更高的變異程度，為抗體與抗原結合的關鍵位置，因而也稱為互補決定區（CDR）。CDR的胺基酸序列可以使用本領域公認的編號方案，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact容易地確定。抗體可以為IgG、IgM、IgD、IgE或IgA抗體。
抗體的“抗原結合片段”指抗體分子中參與抗原特異性結合的胺基酸片段，例如，F(ab') 2、Fab以及scFv中的一種。
術語“F(ab') 2”是由胃蛋白酶消化整個全長抗體去除大部分Fc區同時完整保留一些鉸鏈區後得到的。F(ab') 2片段具有通過二硫鍵連接在一起的兩個抗原結合Fab部分，因此F(ab') 2片段為雙價抗體，以IgG抗體製備得到的F(ab') 2為例，分子量為約110 kDa。
術語“Fab”是仍可與抗原結合的抗體結構，其為單價並且不含 Fc 部分。木瓜蛋白酶消化全長抗體後得到兩個Fab片段以及一個 Fc 片段，每個Fab片段均為約50kDa。
術語“scFv”是由抗體重鏈可變區和輕鏈可變區通過短肽連接成一條肽鏈而構成。通過正確折疊，來自重鏈和輕鏈的可變區通過非共價鍵相互作用形成Fv段，因而scFv能較好地保留其對抗原的親和活性。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段選自兔源抗體、鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。
“兔源抗體/鼠源抗體”是指可變區和恒定區（如果存在的話）衍生自兔/鼠免疫球蛋白序列的抗體。兔源抗體/鼠源抗體可方便地以相應抗原免疫兔/鼠（包括小鼠或大鼠）並從其分離目的抗體而獲得。或者，在以相應抗原免疫兔/鼠後，分離並培養表達目的抗體的細胞(如B細胞)而獲得。又或者，在以相應抗原免疫兔/鼠後，分離並培養表達目的抗體的細胞，將其與永生化細胞如骨髓瘤細胞融合而獲得雜交瘤細胞，培養雜交瘤細胞則可長期和大量獲得目的抗體(如單克隆抗體)。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一動物源性抗體的可變區與第二動物源性的抗體的恒定區融合而成的抗體。建立嵌合抗體，要先建立分泌第一動物源性特異性單抗的雜交瘤，然後從雜交瘤細胞中克隆可變區基因，再根據需要克隆第二動物源性抗體的恒定區基因，將第一動物源性可變區基因與第二動物源性恒定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個優選的實施方案中，第一動物源性為兔源或鼠源，第二動物源性優選為人源，可以減輕第一動物源性抗體誘發的免疫應答反應。所述嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。所述嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區。抗體恒定區的亞型、不同人的異構體和基於恒定區效應功能的變化產生的突變不影響抗體偶聯物的製備。連接子毒素偶聯位點比如半胱胺酸、賴胺酸、穀胺醯胺、肽鏈羧基末端和糖基化位點等，包括天然位點和工程化改造位點，這些位點一般用於偶聯。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將第一動物源性的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量第一動物源性蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)獲得，以及在Kabat，E.A.等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本公開一個優選的實施方案中，第一動物源性為兔源或鼠源。人的抗體可變區框架經過設計選擇。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
全人源化抗體（human antibody）是指將人類抗體基因通過轉基因或轉染色體技術，將人類編碼抗體的基因轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體全人源化的目的。
在一些實施方式中，所述抗體選自：抗CD3抗體、抗FOLR1抗體、抗ROR1抗體、抗TNFα抗體、抗組織因子（tissue factor，TF）抗體、抗EpCAM抗體、抗EGFRvIII抗體、抗DLL‑3抗體、抗PSMA抗體、抗MUC16抗體、抗ENPP3抗體、抗TDGF1抗體、抗ETBR抗體、抗MSLN抗體、抗TIM‑1抗體、抗LRRC15抗體、抗LIV‑1抗體、抗CanAg/AFP抗體、抗Claudin 6抗體、抗Claudin 9抗體、抗Claudin 18.2抗體、抗Mesothelin抗體、抗HER2(ErbB2)抗體、抗EGFR抗體、抗c‑MET抗體、抗SLITRK6抗體、抗KIT/CD117抗體、抗STEAP1抗體、抗SLAMF7/CS1抗體、抗NaPi2B/SLC34A2抗體、抗GPNMB抗體、抗HER3(ErbB3)抗體、抗MUC1/CD227抗體、抗AXL抗體、抗CD166抗體、抗B7‑H3(CD276)抗體、抗PTK7/CCK4抗體、抗PRLR抗體、抗EFNA4抗體、抗5T4抗體、抗NOTCH3抗體、抗Nectin 4抗體、抗TROP‑2抗體、抗CD142抗體、抗CA6抗體、抗GPR20抗體、抗CD174抗體、抗CD70抗體、抗CD71抗體、抗EphA2抗體、抗LYPD3抗體、抗FGFR2抗體、抗FGFR3抗體、抗FRα抗體、抗CEACAMs抗體、抗GCC抗體、抗Integrin Av抗體、抗CAIX抗體、抗P‑cadherin抗體、抗GD3抗體、抗Cadherin 6抗體、抗LAMP1抗體、抗FLT3抗體、抗BCMA抗體、抗CD79b抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD74抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD37抗體、抗CD47抗體、抗CD138抗體、抗CD352抗體、抗CD25抗體和抗CD123抗體。
在一些具體的實施方式中，所述抗體選自下列抗體所組成的組：
抗GD2抗體3F8、阿巴伏單抗（Abagovomab）、阿昔單抗（Abciximab）、ACZ885 （卡那單抗（canakinumab））、阿達木單抗（Adalimumab）、阿德木單抗（Adecatumumab）、阿非莫單抗（Afelimomab）、阿托珠單抗（Afutuzumab）、培化阿珠單抗（Alacizumab pegol）、阿侖單抗（Alemtuzumab）、噴替酸阿妥莫單抗（Altumomab pentetate）、麻安莫單抗（Anatumomab mafenatox）、安蘆珠單抗（Anrukinzumab） （IMA-638）、阿泊珠單抗（Apolizumab）、阿西莫單抗（Arcitumomab）、阿塞珠單抗（Aselizumab）、阿替珠單抗（Atezolizumab）、阿托木單抗（Atorolimumab）、阿維單抗（Avelumab）、巴匹珠單抗（Bapineuzumab）、巴利昔單抗（Basiliximab）、巴土昔單抗（Bavituximab）、貝妥莫單抗（Bectumomab）、貝利木單抗（Belimumab）、桕替木單抗（Bertilimumab）、貝索單抗（Besilesomab）、貝伐單抗（Bevacizumab）、比西單抗（Biciromab）、比伐單抗-DMl （Bivatuzumab mertansine）、蘭妥莫單抗（Blinatumomab）、Brentuximab vedotin、Briakinumab、卡那單抗（Canakinumab）、美坎珠單抗（Cantuzumab mertansine）、卡羅單抗噴地肽偶聯物（Capromab pendetide）、卡妥索單抗（Catumaxomab）、西利珠單抗（Cedelizumab）、培舍珠單抗（Certolizumabpegol）、西妥昔單抗（Cetuximab）、泊西他珠單抗（Citatuzumab bogatox）、西妥木單抗（Cixutumumab）、克立昔單抗（Clenoliximab）、Clivatuzumab tetraxetan、CNTO148 （戈利木單抗（golimumab））、CNTO 1275 （優特克單抗（ustekinumab））、可那木單抗（Conatumumab）、達西珠單抗（Dacetuzumab）、達克珠單抗（Daclizumab）、地諾單抗（Denosumab）、地莫單抗（Detumomab）、阿托度單抗（Dorlimomab aritox）、Dorlixizumab、度伐單抗（durvalumab）、依美昔單抗（Ecromeximab）、依庫珠單抗（Eculizumab）、埃巴單抗（Edobacomab）、依決洛單抗（Edrecolomab）、依法珠單抗（Efalizumab）、依夫單抗（Efungumab）、艾西莫單抗（Elsilimomab）、培戈賴莫單抗（Enlimomab pegol）、西依匹莫單抗（Epitumomabcituxetan）、依帕珠單抗（Epratuzumab）、厄利珠單抗（Erlizumab）、厄馬索單抗（Ertumaxomab）、埃達珠單抗（Etaracizumab）、艾韋單抗（Exbivirumab）、法索單抗（Fanolesomab）、法拉莫單抗（Faralimomab）、非維珠單抗（Felvizumab）、非紮奴單抗（Fezakinumab）、芬妥木單抗（Figitumumab）、芳妥珠單抗（Fontolizumab）、福拉韋單抗（Foravirumab）、夫蘇木單抗（Fresolimumab）、加利昔單抗（Galiximab）、加維莫單抗（Gavilimomab）、吉妥珠單抗奧佐米星（Gemtuzumab ozogamicin）、戈利木單抗 （Golimumab）、戈利昔單抗（Gomiliximab）、Ibalizumab、替伊莫單抗（Ibritumomab tiuxetan）、伊戈伏單抗（Igovomab）、英西單抗（Imciromab）、英利昔單抗（Infliximab）、英妥木單抗（Intetumumab）、伊諾莫單抗（Inolimomab）、伊珠單抗奧佐米星（Inotuzumab ozogamicin）、伊匹木單抗（Ipilimumab）、伊妥木單抗（Iratumumab）、凱利昔單抗（Keliximab）、拉貝珠單抗（Labetuzumab）、來金珠單抗（Lebrikizumab）、來馬索單抗（Lemalesomab）、樂地單抗（Lerdelimumab）、來沙木單抗（Lexatumumab）、利韋單抗（Libivirumab）、林妥珠單抗（Lintuzumab）、魯卡木單抗（Lucatumumab）、魯昔單抗（Lumiliximab）、馬帕木單抗（Mapatumumab）、馬司莫單抗（Maslimomab）、馬妥珠單抗（Matuzumab）、美泊利單抗（Mepolizumab）、美替木單抗（Metelimumab）、米拉珠單抗（Milatuzumab）、明瑞莫單抗（Minretumomab）、米妥莫單抗（Mitumomab）、莫羅木單抗（Morolimumab）、莫他珠單抗（Motavizumab）、莫羅單抗-CD3 （Muromonab_CD3）、MY0-029 （司他莫單抗（stamulumab）、他那可單抗（Nacolomab tafenatox）、他那莫單抗（Naptumomab estafenatox）、那他珠單抗（Natalizumab）、奈巴庫單抗（Nebacumab）、奈昔木單抗（Necitumumab）、奈瑞莫單抗（Nerelimomab）、尼妥珠單抗（Nimotuzumab）、納武單抗（Nivolumab）、巰諾莫單抗（Nofetumomab merpentan）、奧瑞珠單抗（Ocrelizumab）、奧度莫單抗（Odulimomab）、奧法木單抗（Ofatumumab）、奧馬珠單抗（Omalizumab）、莫奧珠單抗（Oportuzumab monatox）、奧戈伏單抗（Oregovomab）、奧昔珠單抗（Otelixizumab）、帕昔單抗（Pagibaximab）JQ利珠單抗（Palivizumab）、帕木單抗（Panitumumab）、帕諾庫單抗（Panobacumab）、帕考珠單抗（Pascolizumab）、派姆單抗（Pembrolizumab）、帕尼單抗（Pemtumomab）、培妥珠單抗（Pertuzumab）、培克珠單抗（Pexelizumab）、平妥莫單抗（Pintumomab）、普立昔單抗（Priliximab）、普立木單抗（Pritumumab）、PRO 140、雷韋單抗（Rafivirumab）、雷莫蘆單抗（Ramucirumab）、雷珠單抗（Ranibizumab）、雷昔庫單抗（Raxibacumab）、瑞加韋單抗（Regavirumab）、瑞利珠單抗（Reslizumab）、利妥木單抗（Rilotumumab）、利妥昔單抗（Rituximab）、羅妥木單抗（Robatumumab）、羅利珠單抗（Rontalizumab）、羅維珠單抗（Rovelizumab）、魯利珠單抗（Ruplizumab）、沙妥莫單抗（Satumomab）、司韋單抗（Sevirumab）、西羅珠單抗（Sibrotuzumab）、西法木單抗（Sifalimumab）、司妥昔單抗（Siltuximab）、西利珠單抗（Siplizumab）、蘇蘭珠單抗（Solanezumab）、索耐珠單抗（Sonepcizumab）、松妥珠單抗（Sontuzumab）、司他蘆單抗（Stamulumab）、硫索單抗（Sulesomab）、他珠單抗（Tacatuzumab tetraxetan）、他度珠單抗（Tadocizumab）、他利珠單抗（Talizumab）、他尼珠單抗（Tanezumab）、帕他莫單抗（Taplitumomab paptox）、替非珠單抗（Tefibazumab）、阿替莫單抗（Telimomab aritox）、替妥莫單抗（Tenatumomab）、替奈昔單抗（Teneliximab）、替利珠單抗（Teplizumab）、TGN1412、替西木單抗（Ticilimumab）、曲美木單抗（tremeIimumab）、替加珠單抗（Tigatuzumab）、TNX-355 （伊巴珠單抗（ibalizumab））、TNX-650、TNX-901 （他利珠單抗（talizumab））、托珠單抗（Tocilizumab）、托利珠單抗（Toralizumab）、托西莫單抗（Tositumomab）、曲妥珠單抗（Trastuzumab）、曲美木單抗（Tremelimumab）、西莫白介素單抗（Tucotuzumab celmoleukin）、妥韋單抗（Tuvirumab）、烏珠單抗（Urtoxazumab）、優特克單抗（Ustekinumab）、伐利昔單抗（Vapaliximab）、維多珠單抗（Vedolizumab）、維妥珠單抗（Veltuzumab）、維帕莫單抗（Vepalimomab）、維西珠單抗（Visilizumab）、伏洛昔單抗（Volociximab）、伏妥昔單抗（Votumumab）、紮蘆木單抗（Zalutumumab）、紮木單抗（Zanolimumab）、齊拉木單抗（Ziralimumab）以及阿佐莫單抗（Zolimomab aritox）。
在一些實施方式中，所述抗體選自：
i) 曲妥珠單抗（Trastuzumab）抗體；
ii)貝馬珠單抗（ Bemarituzumab）抗體；
iii) 抗B7‑H3抗體：其重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3依次如SEQ ID NO:1~3所示，輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3依次如SEQ ID NO:4~6所示。
在一些實施方式中，所述抗B7‑H3抗體的重鏈可變區HCVR如SEQ ID NO:7所示，輕鏈可變區LCVR如SEQ ID NO:8所示。
在一些實施方式中，所述抗B7‑H3抗體的重鏈恒定區如SEQ ID NO:9或10所示，輕鏈恒定區如SEQ ID NO:11所示。
上述胺基酸序列的變體也在本發明範圍內，相應的變體與SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:6任一多肽相比，分別包含發生在至少一個CDR區域的至多3個胺基酸的突變；或者，變體相對於SEQ ID NO:7~ SEQ ID NO:15整體序列而言，可包含3個以內或更多的突變，例如與SEQ ID NO:7~ SEQ ID NO:15任一多肽相比具有至少80%、85%、90%、93%、95%、97%或99%同一性的序列。突變可以為胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；優選地，所述突變為保守置換。
“保守置換”是指具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等）的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。
通常視為保守置換的置換是在脂肪族胺基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置換、羥基殘基Ser和Thr的互換、酸性殘基Asp和Glu的交換、醯胺殘基Asn和Gln之間的置換、鹼性殘基Lys和Arg的交換以及芳香殘基Phe、Tyr間的置換。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub.Co., 第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。
在一些實施方式中，所述配體-藥物偶聯物的結構如下所示：
。
本公開還涉及製備如上所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，包括：
將所述靶向配體還原後，與預先合成的-L-D進行偶聯反應，得到通式為TL-L-D所示的化合物。
還原劑優選TCEP，特別地，優選還原靶向配體上的二硫鍵。
本公開還涉及藥物組合物，其包含如上所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
如本公開所用，“藥學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑”包括當與活性組分組合時允許所述組分保持生物學活性並且與受試者的免疫系統不發生反應的任何材料。
本公開還涉及如上所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物在製備用於治療腫瘤的藥物中的用途。
術語“癌症”指的是以失調的細胞生長為特徵的生理病症或疾病。“腫瘤”包括癌細胞。在一些實施方式中，所述的腫瘤為乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、肺癌（如非小細胞肺癌）、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、多形性膠質細胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病等實體瘤或血液瘤。
本公開還涉及一種治療受試者的醫學狀況的方法，包括施用安全和有效量的如上所述的配體-藥物偶聯物。
優選其中所述醫學狀況為癌症。
短語“安全和有效量的”。如本文所用，意指在合理的醫藥調節範圍內化合物或組合物的量大到足以明顯有效地緩解所治療的症狀或病症，但小到足以避免嚴重的副作用（以合理的有益/危險比率）。本公開的方法所用的藥物組合物中的活性成份的安全和有效量隨所治療的特定症狀、年齡和所治療患者的身體狀況，疾病的嚴重性、治療時間、同期治療情況、使用的特定活性成份、使用的特定的藥物學可接受的賦形劑及包括參與治療醫師的知識和技能在內的這類因素的不同而不同。
應該理解的是，設想的治療方法還將包括施用其他治療實體，特別優選為免疫治療實體，包括病毒癌症疫苗（例如，編碼癌症特異性抗原的腺病毒載體）、細菌癌症疫苗（例如，表達一種或多種癌症特異性抗原的非熱原性大腸桿菌）、酵母癌症疫苗、N-803（也被稱為ALT-803，ALTOR生物科學公司）、化療藥物、抗體（例如，與腫瘤相關抗原或患者特異性腫瘤新抗原結合）、幹細胞移植物（例如，異體或自體）和腫瘤靶向細胞因子（例如，NHS-IL12，IL-12與腫瘤靶向抗體或其片段偶聯）。在一些實施方式中，設想的治療方法還包括對所述患者進行放射性治療。在一些實施方式中，設想的治療方法還包括對所述患者進行手術，例如腫瘤切除手術。
配體-藥物偶聯物也可以與抗病毒劑、抗生素、鎮痛劑、皮質類固醇、類固醇、氧、抗氧化劑、COX抑制劑、心臟保護劑、金屬螯合劑、IFN‑γ和/或NSAID組合施用和/或共配製。藥物組合物中可以包含上述治療實體。
術語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，是指任何動物，例如任何哺乳動物，包括（但不限於）人類、非人類靈長類動物、齧齒類動物、狗、貓、黑猩猩、猩猩、長臂猿、獼猴、狨猴、豬、馬、熊貓和大象等等。
如本文所用，“治療”是指任何疾病後果的任何改善，例如存活期延長、發病率較小和/或作為替代治療方式的副產物的副作用減輕。如本領域中容易瞭解，疾病完全根除為優選的，但並不是治療行為的必要條件。如本文所用，“治療”是指向受試者（例如患者）施用所述配體-藥物偶聯物。治療可以為治癒、醫治、緩和、減輕、改變、醫治、改善、減弱、好轉或影響病症、病症的症狀或例如癌症的患病傾向性。
本公開的藥物組合物可通過任何途徑投予，如所屬領域的技術人員將瞭解。在一些實施例中，本公開的醫藥組合物通過靜脈內（IV）投與。
下面將結合實施例對本公開的實施方案進行詳細描述。應理解，這些實施例僅用於說明本公開而不用於限制本公開的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，優先參考本公開中給出的指引，還可以按照本領域的實驗手冊或常規條件，還可以參考本領域已知的其它實驗方法，或者按照製造廠商所建議的條件。
下述的具體實施例中，涉及原料組分的量度參數，如無特別說明，可能存在稱量精度範圍內的細微偏差。涉及溫度和時間參數，允許儀器測試精度或操作精度導致的可接受的偏差。
實施例1 Anti-B7-H3抗體製備
以公開日為2021年09月17日的中國專利申請CN113402610A中anti-B7-H3抗體序列為基礎，進一步進行單克隆抗體的表達和純化。
如無特殊說明，本公開中所有抗體的表達可以選擇使用商業化載體pTT5，在其啟動子後的EcoR I和Hind III限制性酶切位點之間插入抗體序列，抗體輕鏈或重鏈序列前包括信號肽在內的核酸序列可以選用如下序列為：
GAATTCGCCGCCACC ATGGGATGGTCCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCTACCGCTACCGGTGTCCACTCA
上述序列下劃線為EcoR I和起始胺基酸。
抗體輕鏈或重鏈序列後為：
TGAAAGCTT（其為終止密碼子和Hind III）。
抗體胺基酸序列優化為核苷酸序列後插入上述信號肽和終止子之間。
重鏈H00序列
SEQ ID NO: 7 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAVSWVRQAPGKGLEWVASISGGGIYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGGAGYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 9 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
輕鏈H00序列
SEQ ID NO: 8 DSQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRGSESVHSYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYGSPPWTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 11 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鏈H04序列：
SEQ ID NO: 7 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAVSWVRQAPGKGLEWVASISGGGIYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGGAGYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 10 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Anti-B7-H3抗體為克隆7B7，輕鏈L00和重鏈H00的抗體為7B7。輕鏈L00和重鏈H04的抗體為7B7-H04。7B7-H04抗體為工程化改造抗體，工程化改造適合產生均一偶聯比值的偶聯產物，非常適合評估不同連接子毒素。
將上述抗體輕重鏈分別構建於載體中，提取質粒。將懸浮馴化CHO-K1細胞復蘇於OPM-CD TransCHO培養基（廠家：奧浦邁，OPM，貨號P83059），培養至密度2百萬個細胞/ml，活率95%以上，體積1000ml。將輕鏈質粒0.5mg和重鏈質粒0.5mg合並且溶於10ml培養基，將3mg溶於培養基的PEI（廠家：Polyscience，貨號：24765-1）稀釋於10ml培養基中，混合質粒和PEI的溶液並置於室溫10分鐘，然後滴加至1000ml細胞培養液中，置於37℃培養5天後以12000g離心15分鐘收穫上清。將上清用HiTrap Mabselect SuRe進行純化，並用50mM乙酸洗脫，中和後的收集峰用30KD超濾管（廠家Merck，貨號UFC9030）置換於PBS pH7.4中。將抗體測定280nm吸光度值，吸光度值除以理論消光係數為濃度值。
實施例2  對照連接子毒素的合成
1. 連接子毒素MC-VA-PAB-Eribulin的合成
設計的連接子毒素MC-VA-PAB-Eribulin（LK-322018）結構如下：
化合物LK-322018的合成路線為：
化合物LK-322018的合成：將市售化合物MC-VA-PABC-PNP（5.9 mg，0.091 mmol）溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.1 mg，0.024 mmol）和市售艾瑞布林（5 mg，0.007mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到LK-322018。ESI-MS m/z:1240(M-H)。
2. 連接子毒素MC-（GGFG）-PAB-Eribulin的合成
設計的連接子毒素MC-（GGFG）-PAB-Eribulin（LK-322016）結構如下：
化合物LK-322016的合成路線為：
化合物3的合成：將市售化合物1（50 mg）溶於2ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入Bis-PNP （36 mg，0.1182 mmol）和N,N-二異丙基乙基胺（20.3 mg，0.006053 mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入15ml水，用乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到標題化合物3。ESI-MS m/z:743(M+H)。
化合物LK-322016的合成：將化合物3（7.26 mg，0.009079 mmol）溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.1 mg， 0.02412 mmol）和市售艾瑞布林（5 mg，0.007 mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到LK-322016。ESI-MS m/z:1389(M-H)。
3. 連接子毒素Mal-PEG2-VC-PAB-Eribulin的合成
具體合成步驟參考公開日為2018年11月23日的中國專利申請CN108883198A第145頁，合成方法與步驟均與專利相同。在（DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-17-1215，MORAb-202，an Antibody-Drug Conjugate Utilizing Humanized Anti-human FRα Farletuzumab and the Microtubule-targeting Agent Eribulin, has Potent Antitumor Activity）一文中顯示Mal-PEG2-VC-PAB-Eribulin與MC-VC-PAB-Eribulin對若干細胞系活性方面相同，認為二者基本一致。因而，在本公開中於某些情況下可將Mal-PEG2-VC-PAB-Eribulin與MC-VC-PAB-Eribulin替換使用。
實施例3 實驗組連接子毒素的合成
連接子毒素MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的合成
設計的連接子毒素MC-VAGGFG-PAB-Eribulin（LK-322022）結構如下：
化合物LK-322022的合成路線為：
化合物2的合成：將市售的化合物1（100 mg，0.244 mmol）溶於3ml四氫呋喃中，降溫至0℃，加入HOSU（33.7 mg，0.293 mmol）和DCC（60.3 mg，0.293 mmol），室溫反應2小時，通過TLC點板和液質聯用色譜監測原料反應完畢後，將反應液過濾，濾液濃縮所得粗品直接投入下一步反應。ESI-MS m/z:508(M+H)。
化合物4的合成：將化合物2（crude，0.244 mmol)與市售的化合物3（82 mg，0.244 mmol）混合於3ml N,N-二甲基甲醯胺中，加入N,N-二異丙基乙基胺（126 mg，0.976 mmol），室溫反應2小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，減壓蒸餾去除溶劑，粗品用10ml水打漿，過濾得到標題化合物粗品（200 mg，收率: 100%）。ESI-MS m/z:729(M+H)。
化合物6的合成：將化合物4（200 mg，0.274 mmol）溶於5ml N,N-二甲基甲醯胺中，降溫至0℃，依次加入化合物5（41 mg，0.329 mmol）、N,N-二異丙基乙基胺（107 mg，0.823 mmol）和DEPBT（124 mg，0.412 mmol），室溫反應4小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，反應液用10ml氯化銨水溶液淬滅，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品經過矽膠柱層析[二氯甲烷/甲醇=88:12(v/v)]純化得到標題化合物6（100 mg，收率: 43.8%）。ESI-MS m/z:834(M+H)。
化合物7的合成：將化合物6（100 mg，0.120 mmol）溶於3ml N,N-二甲基甲醯胺中，加入呱啶（31 mg，0.360 mmol），室溫反應0.5小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，減壓蒸餾去除溶劑，所得粗品經過矽膠柱層析[二氯甲烷/甲醇=82:18(v/v)]純化得到標題化合物7（76 mg, 收率: 100%）。ESI-MS m/z:612(M+H)。
化合物9的合成：將化合物7（76mg，0.124mmol）與市售的化合物8（46 mg，0.149mmol）混合於3ml N,N-二甲基甲醯胺中，加入N,N-二異丙基乙基胺（32mg，0.248 mmol），室溫反應2小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，減壓蒸餾去除溶劑，所得粗品經過矽膠柱層析[二氯甲烷/甲醇=82:18(v/v)]純化得到標題化合物9（70mg，收率：70%）。ESI-MS m/z:805(M+H)。
化合物10的合成：將化合物9（70 mg, 0.087 mmol）溶於3ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入Bis-PNP（40 mg，0.130 mmol） 和N,N-二異丙基乙基胺（22 mg，0.174 mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，減壓蒸餾去除溶劑，所得粗品經過矽膠柱層析[二氯甲烷/甲醇=90:10(v/v)]純化得到標題化合物10（40 mg，收率: 47.6%）。ESI-MS m/z:970(M+H)。
化合物LK-322022的合成：將化合物10（14 mg，0.014 mmol）溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.5 mg， 0.027 mmol）和市售艾瑞布林（5 mg，0.007 mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到LK-322022（5.1 mg，收率: 48.1%）。ESI-MS m/z:1560(M-H)。
實施例4 抗體偶聯
取上述實施例中待偶聯的抗體7B7-H04和7B7，各取3mg抗體，用10mM磷酸鈉緩衝液pH7.4稀釋至3mg/ml，加入三（2-羥乙基）膦鹽酸鹽TCEP母液，TCEP母液為以10mM磷酸鈉緩衝液pH7.4配置10mM母液（TCEP廠家Sigma，貨號C4706-2G，CAS. 51805-45-9），確保TCEP摩爾終濃度與抗體摩爾終濃度為4：1，將抗體置於37℃還原45分鐘。加入實施例2和3中的連接子毒素母液，母液為以二甲基亞碸DMSO溶解連接子毒素至5mM，確保連接子毒素摩爾終濃度與抗體摩爾終濃度為6：1，將抗體置於2~8℃偶聯2小時。後將抗體轉入30 KD超濾管中（廠家Merck，貨號UFC9030），置於3000g離心力2~8℃換液，將殘留毒素降至反應濃度的千分之一，隨後無菌過濾，測定濃度，分裝凍存。
為獲得不同偶聯比值DAR的產物，將抗體：還原劑：連接子毒素的摩爾比在1: 1~6 : 2~15間調整，其餘條件保持不變，最終偶聯產物的DAR值以檢測結果為准。
實施例5 不同ADC的效果的體外比較
一、檢測方法
1. 細胞活性檢測
將人Calu-6（廠家Procell，貨號CL-327，人肺癌細胞）復蘇，接種96孔培養板，培養基為DMEM/F12（廠家Hyclone，貨號SH30023.01）且含10%FBS（廠家Gibco，貨號10099141），每孔2500個細胞，體積150微升，置於37℃，5%二氧化碳培養箱培養，約20小時後加入含有不同抗體偶聯藥物的培養基50微升，使藥物最終濃度在0~100nM之間的12個稀釋濃度（首孔濃度100nM，後續依次5倍稀釋10個梯度，最後一個梯度藥物為0，每個樣品複孔重複），繼續共培養4~7天後取出培養板，每孔加入CTG檢測試劑50微升（CellTiterGlo，廠家Promega，貨號G7575），反應2分鐘，按試劑盒推薦操作進行，然後用Tecan Spark測定熒光度值。將複孔取平均值並作為Y軸，以稀釋梯度log10值為X軸，做平滑曲線圖，按照四參數計算EC/IC 50值。
採用類似的細胞活性檢測方法，可將細胞系替換為Jurket、MCF-7和MDA-MB-468進行再次驗證。
2. 偶聯比值檢測分析
抗體所連接藥物數量的平均值（DAR）值通過疏水層析HIC-HPLC方法檢測，分析柱為TSKgel Butyl-NPR，4.6mm × 10cm，2.5微米，廠家TOSOH，貨號042168。取待測樣品約0.3mg，體積為150微升，加入150微升的流動相A，10000g離心5分鐘取上清。流動相A為20mM磷酸鈉+1.5M硫酸銨pH7.0，流動相B為20mM磷酸鈉+20%（v/v）乙腈 pH7.0。分析柱連接在安捷倫1260高效液相色譜儀，流速0.6ml/min，流動相A沖洗30分鐘以上至280nm紫外基線平穩，進樣50微克樣品，流動相A沖洗2分鐘後進行18分鐘梯度洗脫（0%B – 100%B），繼續保持100%流動相B沖洗5分鐘後結束。根據每個DAR值的峰面積計算每個DAR值占百分比。將每個峰的百分比與DAR值乘積後累加，然後除以總百分比即為平均DAR值。
3. 純度檢測分析
SEC-HPLC純度通過分子篩方法檢測，分析柱為TSKgel G3000SWXL，7.8mm x 30cm，5微米，廠家TOSOH， 貨號 08541。取待測樣品約0.3mg，體積為300微升，10000g離心5分鐘取上清。流動相為50mM磷酸鈉+0.1M氯化鈉pH6.8。分析柱連接在安捷倫1260高效液相色譜儀，流速0.8ml/min，流動相沖洗30分鐘以上至280nm紫外基線平穩，進樣100微克樣品，流動相沖洗20分鐘。根據峰面積計算高分子、單體、低分子各個峰占百分比。
二、檢測結果
1. 細胞活性檢測結果
抗體7B7-H04偶聯MC-VA-PAB-Eribulin，Mal-PEG2-VC-PAB-Eribulin，MC-（GGFG）-PAB-Eribulin和MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin，偶聯物針對Calu6細胞活性EC/IC 50顯示，EC/IC 50分別是115.9pM、29.97pM，62.32pM和11.40pM（圖1），即MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的效果顯著優於其他各組。
對於7B7偶聯Mal-PEG2-VC-PAB-Eribulin和MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin，EC/IC 50分別是50.23pM和9.241pM（圖1），依然是MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin取得了更佳的技術效果。
在除Calu-6細胞系外的其他細胞系中檢測得到的EC/IC 50趨勢與上述相似，均是MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin效果最優。
2. 偶聯比值和純度結果
各組的偶聯物平均DAR值和SEC-HPLC純度結果如圖2和下表所示：
組別 平均DAR值 SEC-HPLC純度（%）
7B7 naked antibody 0 -
7B7-H04 MC-VA-PAB-Eribulin 3.33 97.15
7B7-H04 MC- （GGFG ）-PAB-Eribulin 3.27 97.10
7B7-H04 MC- （VAGGFG ）-PAB-Eribulin 3.31 98.66
7B7 MC- （VAGGFG ）-PAB-Eribulin 4.25 95.88
7B7-H04 Mal-PEG2-VC-PAB-Eribulin ＜4.2 ＞95
偶聯物平均DAR值為3.33，3.27和3.31（圖2），說明SEQ ID NO:17所示的（VAGGFG）的多肽連接子在偶聯比值接近時活性好於SEQ ID NO:16示的（GGFG）和VA多肽連接子。
採用與上述類似的方法，在其他幾種常見的腫瘤細胞系（例如：MCF-7和MDA-MB-468）中進行驗證，均有一致的趨勢，即相比其他幾種偶聯物，採用包含SEQ ID NO:17所示的（VAGGFG）連接子的偶聯物具有最佳的EC/IC 50表現，且平均DAR值和SEC-HPLC純度表現穩定，滿足抗體偶聯物要求。
實施例6 體內藥效學分析
委託Bioduro公司（www.bioduro-sundia.com）進行體內藥效評估，取培養良好的人乳腺癌腫瘤細胞系（MDA-MB-468）接種於免疫缺陷型小鼠（B-NDG），每只接種1000萬個細胞，至腫瘤生長至100mm 3後隨機分組，次日，每組按3mg/kg累計給藥2次，每週一次，每週兩次測定腫瘤大小，至實驗結束。整個過程經過實驗動物委員會審批通過。
實驗結果如圖3所示，從結果可知，7B7 MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin組在對腫瘤體積的抑制方面有效果。
採用同樣的動物模型，將細胞系替換為Calu6和MCF-7進行再次驗證，每組獨立地選自按1~10mg/kg給藥（如2、3、4、5、6、7、8或9mg/kg），與MDA-MB-468的實驗趨勢一致，對腫瘤體積的抑制方面效果最佳。
實施例7 穩定性測試
將7B7 MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin偶聯物在PBS緩衝液、食蟹猴血漿和小鼠血漿中測試穩定性，濃度100nM，置於37℃放置0、4、7、10、14天，然後測定樣品對Jurket細胞的殺傷活性。發現艾瑞布林釋放率（Y軸）隨著時間（X軸）延長，最高有0.1~5%比例艾瑞布林釋放，顯示連接子血漿穩定性非常好。
實施例8 其它抗體的偶聯測試
上述實施例的實驗結果均基於抗體7B7-H04和7B7進行驗證。
曲妥珠單抗（Trastuzumab）重鏈序列：
SEQ ID NO: 12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
曲妥珠單抗（Trastuzumab）輕鏈序列：
SEQ ID NO: 13 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
貝馬珠單抗（Bemarituzumab）重鏈序列：
SEQ ID NO: 14 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYIFTTYNVHWVRQAPGQGLEWIGSIYPDNGDTSYNQNFKGRATITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
貝馬珠單抗（Bemarituzumab）輕鏈序列：
SEQ ID NO: 15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQGVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHSTTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
進一步的，按照上述實施例，製備曲妥珠單抗（Trastuzumab）和貝馬珠單抗（Bemarituzumab）偶聯連接子毒素MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的ADC進行驗證。結果顯示偶聯比值平均DAR值2~3，純度＞95%（圖4、圖5）。以SK-BR-3細胞系（人乳腺癌細胞）和KATO III細胞系（人胃癌細胞）進行活性測定，與Calu-6相同方法測定細胞活性EC/IC 50值為32pM和97pM。
實施例9 其它藥物的偶聯測試
為了測試不同毒素的差異，合成了不同多肽連接子毒素，按照上述實施例的相關實驗方法進行偶聯物製備和活性測定，結果表明：在甲基澳瑞他汀EMMAE和依喜替康Exatecan中，測試的不同多肽連接子在細胞水平未表現出顯著差異，與上述實施例中艾瑞布林作為毒素的結果有差異。
化合物MC-VC-PAB-MMAE為市售，MC-VA-PAB-MMAE已有報道與MC-VC-PAB-MMAE無顯著差異。
化合物MC-（GGFG）-PAB-MMAE的合成路線為：
合成步驟為：將市售化合物1（50 mg，0.0865 mmol）溶於2ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入Bis-PNP（36 mg，0.1182 mmol）和N,N-二異丙基乙基胺（20.3 mg，0.006053 mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入15ml水，用乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到化合物3（50 mg，收率: 77.8%）。將化合物3（7.26 mg，0.009 mmol）溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.1 mg，0.02412 mmol）和市售 MMAE （7.9 mg，0.011 mmol），室溫反應15小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到目標化合物（8.5 mg，收率: 62%）。ESI-MS m/z:1378(M+H)。
化合物MC-（VAGGFG）-PAB-MMAE的合成路線為：
步驟：將化合物1（合成路線同實驗組）（9.7mg，0.01mmol）溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.0 mg，0.02 mmol）和市售 MMAE（7.9 mg，0.011 mmol），室溫反應15小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到目標化合物（9.3 mg，收率: 60%）。ESI-MS m/z:1548(M+H)。
化合物MC-VA-PAB-Exatecan為市售。
化合物MC-（GGFG）-PAB-Exatecan的合成路線為：
步驟：將市售化合物1（50 mg，0.0865 mmol）溶於2ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入Bis-PNP（36 mg，0.1182 mmol）和N,N-二異丙基乙基胺（20.3 mg，0.006053 mmol），室溫反應16小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入15ml水，用乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到化合物3（50 mg，收率: 77.8%）。將化合物3（7.26 mg，0.009079 mmol）溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.1 mg，0.02412 mmol）和市售 Exatecan（5 mg，0.011 mmol），室溫反應15小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到目標化合物（6.0 mg, 收率: 61%）。ESI-MS m/z:1096(M+H)。
化合物MC-（VAGGFG）-PAB-Exatecan合成路線為：
步驟：將化合物1（合成路線同實驗組）（9.7mg，0.01mmol） 溶於1ml N,N-二甲基甲醯胺中，依次加入N,N-二異丙基乙基胺（3.0 mg， 0.02 mmol）和市售 Extecan（5 mg，0.011 mmol），室溫反應15小時，通過液質聯用色譜監測原料反應完畢後，加入5ml水，乙酸乙酯萃取三次（每次10ml），分液後合併有機相，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥後並濃縮，所得粗品通過製備液相純化得到目標化合物（7.3 mg，收率: 58%）。ESI-MS m/z:1266(M+H)。
將上述化合物按照實施例4偶聯抗體7B7，製備偶聯比值為3~4的偶聯物，並按照實施例5測定針對細胞系MCF-7的活性。結果如下：1）偶聯MMAE毒素，為VC、（GGFG）和（VAGGFG）多肽連接子的偶聯物活性IC 50為0.49、0.41、0.27 nM；2）偶聯Extecan毒素，為VA、（GGFG）和（VAGGFG）多肽連接子的偶聯物活性IC 50為242、270、307 nM。
以上所述實施例僅表達了本公開的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本公開構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬本公開的保護範圍。因此，本公開專利的保護範圍應以所附申請專利範圍為準，說明書及附圖可以用於解釋權利要求的內容。
為了更清楚地說明本公開具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本公開的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。 圖1為本公開一個實施例所提供的抗體7B7-H04和7B7通過不同接頭單元偶聯艾瑞布林的細胞活性檢測結果。 圖2為本公開一個實施例所提供的抗體7B7-H04和7B7通過不同接頭單元偶聯艾瑞布林的偶聯比值和純度結果； A：7B7 裸抗體（naked antibody）的DAR檢測結果； B：7B7-H04 MC-VA-PAB-Eribulin的DAR檢測結果； C：7B7-H04 MC-VA-PAB-Eribulin的SEC-HPLC純度檢測結果； D：7B7-H04 MC-（GGFG）-PAB-Eribulin的DAR檢測結果； E：7B7-H04 MC-（GGFG）-PAB-Eribulin的SEC-HPLC純度檢測結果； F：7B7-H04 MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的DAR檢測結果； G：7B7-H04 MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的SEC-HPLC純度檢測結果； H：7B7 MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的DAR檢測結果； I：7B7 MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的SEC-HPLC純度檢測結果。 圖3為本公開一個實施例所提供的抗體7B7通過不同接頭單元偶聯艾瑞布林的體內抗腫瘤實驗結果。 圖4為本公開一個實施例所提供的抗體曲妥珠單抗（Trastuzumab）偶聯MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的偶聯比值、SEC-HPLC純度結果； A：曲妥珠單抗裸抗體（Trastuzumab naked antibody）的DAR檢測結果； B：Trastuzumab MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的DAR檢測結果； C：Trastuzumab MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的SEC-HPLC純度檢測結果。 圖5為本公開一個實施例所提供的抗體貝馬珠單抗（Bemarituzumab）偶聯MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的偶聯比值、SEC-HPLC純度結果； A：貝馬珠單抗裸抗體（Bemarituzumab naked antibody）的DAR檢測結果； B：Bemarituzumab MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的DAR檢測結果； C：Bemarituzumab MC-（VAGGFG）-PAB-Eribulin的SEC-HPLC純度檢測結果。
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Claims (18)

  1. 一種SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子的應用。
  2. 一種配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述配體-藥物偶聯物的通式為TL-(L-D)n； 其中，TL為靶向配體，L為接頭單元，D為艾瑞布林，n為1~20的正整數； L中包含SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）作為酶裂解連接子。
  3. 如請求項2所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述接頭單元為-L 1-L 2-L 3-L 4-，L 1與TL相連，L 4與D相連； 其中， L 1選自： 或點擊化學所需基團（優選 ）； L 2選自： -NC(R 1R 2)C(O)、-NR 3(CH 2) oC(O)-、-NR 3(CH 2CH 2O) oCH 2C(O)-、-S(CH 2) pC(O)-或化學鍵，其中o選自0~20的整數；p選自0~20的整數； R 1、R 2各自獨立地選自氫原子、氘原子、烷基、取代烷基、氘代烷基、雜烷基、羧基、胺基、取代胺基； R 3選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、芳基、取代芳基或雜芳基； L 1與L 2共用N原子； L 3為SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）； L 4選自：-NR 4(CR 5R 6) q-、-C(O)NR 4-、-C(O)NR 4(CH 2) q-或者化學鍵，q選自0~6的整數； R 4、R 5和R 6各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基、取代芳基或雜芳基。
  4. 如請求項3所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，-L 1-L 2-為 ，且s1為2、3、4、5、6、7或8。
  5. 如請求項2所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述接頭單元為-L 1-L 2-L 3-L 4-，L 1與TL相連，L 4與D相連； 其中， L 1選自： 或點擊化學所需基團（優選 ）； L 2選自： -NC(R 1R 2)C(O)、-NR 3(CH 2) oC(O)-、-NR 3(CH 2CH 2O) oCH 2C(O)-、-S(CH 2) pC(O)-或化學鍵，其中o選自0~20的整數；p選自0~20的整數； R 1、R 2各自獨立地選自氫原子、氘原子、烷基、取代烷基、氘代烷基、雜烷基、羧基、胺基、取代胺基； R 3選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、芳基、取代芳基或雜芳基； L 1與L 2共用N原子； L 3為SEQ ID NO:17所示的短肽（VAGGFG）； L 4選自：-NR 4-芳基-(CR 5R 6) q-OC(O)-、-NR 4(CR 5R 6) q-OC(O)-，q選自0~6的整數； R 4、R 5和R 6各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、取代烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基、取代芳基或雜芳基。
  6. 如請求項5所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，-L 1-L 2-為 ，且s1為2、3、4、5、6、7或8。
  7. 如請求項5所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，L 4為對胺基苄氧羰基（PAB）。
  8. 如請求項2~7中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述靶向配體為抗體或其抗原結合片段。
  9. 如請求項8所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述抗體或其抗原結合片段選自兔源抗體、鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。
  10. 如請求項9所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述抗體選自：抗CD3抗體、抗FOLR1抗體、抗ROR1抗體、抗TNFα抗體、抗TF抗體、抗EpCAM抗體、抗EGFRvIII抗體、抗DLL‑3抗體、抗PSMA抗體、抗MUC16抗體、抗ENPP3抗體、抗TDGF1抗體、抗ETBR抗體、抗MSLN抗體、抗TIM‑1抗體、抗LRRC15抗體、抗LIV‑1抗體、抗CanAg/AFP抗體、抗Claudin 6抗體、抗Claudin 9抗體、抗Claudin 18.2抗體、抗Mesothelin抗體、抗HER2抗體、抗EGFR抗體、抗c‑MET抗體、抗SLITRK6抗體、抗KIT/CD117抗體、抗STEAP1抗體、抗SLAMF7/CS1抗體、抗NaPi2B/SLC34A2抗體、抗GPNMB抗體、抗HER3抗體、抗MUC1/CD227抗體、抗AXL抗體、抗CD166抗體、抗B7‑H3(CD276)抗體、抗PTK7/CCK4抗體、抗PRLR抗體、抗EFNA4抗體、抗5T4抗體、抗NOTCH3抗體、抗Nectin 4抗體、抗TROP‑2抗體、抗CD142抗體、抗CA6抗體、抗GPR20抗體、抗CD174抗體、抗CD70抗體、抗CD71抗體、抗EphA2抗體、抗LYPD3抗體、抗FGFR2抗體、抗FGFR3抗體、抗FRα抗體、抗CEACAMs抗體、抗GCC抗體、抗Integrin Av抗體、抗CAIX抗體、抗P‑cadherin抗體、抗GD3抗體、抗Cadherin 6抗體、抗LAMP1抗體、抗FLT3抗體、抗BCMA抗體、抗CD79b抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD33抗體、抗CD56抗體、抗CD74抗體、抗CD22抗體、抗CD30抗體、抗CD37抗體、抗CD47抗體、抗CD138抗體、抗CD352抗體、抗CD25抗體和抗CD123抗體。
  11. 如請求項8所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述抗體選自： i) Trastuzumab抗體； ii) Bemarituzumab抗體； iii) 抗B7‑H3抗體：其重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3依次如SEQ ID NO:1~3所示，輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3依次如SEQ ID NO:4~6所示。
  12. 如請求項11所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述抗B7‑H3抗體的重鏈可變區HCVR如SEQ ID NO:7所示，輕鏈可變區LCVR如SEQ ID NO:8所示。
  13. 如請求項12所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述抗B7‑H3抗體的重鏈恒定區如SEQ ID NO:9或10所示，輕鏈恒定區如SEQ ID NO:11所示。
  14. 如請求項2、5~7、9~13任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，所述配體-藥物偶聯物的結構如下所示： 。
  15. 一種製備請求項2~14中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，包括： 將所述靶向配體還原後，與預先合成的-L-D進行偶聯反應，得到通式為TL-L-D所示的化合物。
  16. 一種藥物組合物，其包含請求項2~14中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，以及藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
  17. 一種如請求項2~14中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物在製備用於治療腫瘤的藥物中的用途。
  18. 如請求項17所述的用途，所述的腫瘤為乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、多形性膠質細胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病等實體瘤或血液瘤。
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