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TW202509060A - 免疫球蛋白單可變結構域的醣基化 - Google Patents

免疫球蛋白單可變結構域的醣基化 Download PDF

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TW202509060A
TW202509060A TW113117040A TW113117040A TW202509060A TW 202509060 A TW202509060 A TW 202509060A TW 113117040 A TW113117040 A TW 113117040A TW 113117040 A TW113117040 A TW 113117040A TW 202509060 A TW202509060 A TW 202509060A
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polypeptide
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晟惠 朴
群 周
周豔峰
羅伯特 科斯特
比約恩 尼貝爾
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法商賽諾菲公司
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Abstract

本發明涉及免疫球蛋白單可變結構域（immunoglobulin single variable domains，ISVD）的醣基化。本發明具體地涉及ISVD的胺基酸序列內的特定位置以用作醣基化受體位點。本發明還涉及在指定醣基化受體位點處用特定聚醣修飾的ISVD及其接合物。本發明還涉及包含至少一種本發明技術的ISVD、至少一種具有特定聚醣的ISVD或其至少一種接合物的多肽。本發明還涉及一種編碼這種ISVD和/或多肽的核苷酸序列或核酸，一種製備此類ISVD和/或多肽的方法，一種包含此類ISVD、接合物和/或多肽的組成物，以及根據本發明技術的多肽、核酸序列或核酸、接合物或組成物在藥劑中的用途。

Description

免疫球蛋白單可變結構域的醣基化
本發明技術涉及免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）的醣基化領域。更具體地，本發明技術提供了ISVD的胺基酸序列內的特定位置以用作醣基化受體位點。本發明技術還涉及在指定醣基化受體位點用特定聚醣修飾的ISVD及其接合物。本發明技術還涉及包含至少一種本發明技術的ISVD、至少一種具有特定聚醣的ISVD或其至少一種接合物的多肽。本發明還涉及一種編碼這種ISVD和/或多肽的核苷酸序列或核酸，一種製備此類ISVD和/或多肽的方法，以及一種包含此類ISVD、接合物和/或多肽的組成物。
在過去的幾年裡，抗體療法已在醫學界迅速受到關注。選擇性地僅靶向受疾病影響的組織同時保持健康組織完整的能力對於患者的生活品質是非常理想的。
儘管抗體療法是標靶特異性的，但使用此類複雜的生物分子通常會遇到問題。例如，穩定性或溶解性方面的問題。因此，存在改進現有抗體療法的持續動力。
醣基化是抗體治療劑（特別是對於單株抗體）中通常應用的轉譯後修飾。醣基化是獲得期望的治療功效可能需要的過程。此外，醣基化可以促進一種抗體與另一種抗體和/或與可以為抗體提供另外的功能的其他部分的接合。
免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）由於其小尺寸而在抗體治療劑領域內呈現令人關注的治療潛力。此外，生產比單株抗體的生產更簡單、更快並且更便宜。
ISVD在指定醣基化受體位點的醣基化已經描述在WO 2016/150845、WO 2018/206734和WO 2021/116252中。
然而，ISVD的醣基化已被證明是具有挑戰性的。取決於所使用的宿主細胞/生物體，醣基化根本不會發生，或者它以有限的方式發生。此外，引入醣基化受體位點經常導致干擾ISVD蛋白的折疊，結果導致親和力和/或穩定性喪失，由此喪失功能性。
然而，由於醣基化促進ISVD與其他部分的接合並且可能對治療功效有影響，因此仍然需要有效且穩定的醣基化ISVD。
本發明技術旨在解決與ISVD的醣基化有關的問題。因此，在第一態樣，本發明技術涉及包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在另一個態樣，本發明技術涉及包含一個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在另一個態樣，本發明技術涉及包含一個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
在另一態樣，本發明技術涉及包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、105、108和110。
在又另一態樣，本發明技術涉及包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
在另一個態樣，本發明技術涉及包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
在又另一態樣，本發明技術涉及包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、55、105和108。
在另一態樣，本發明技術涉及包含至少三個ISVD的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在又另一態樣，本發明技術涉及包含三個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在另一個態樣，本發明技術涉及包含三個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、55、73、75、76、105、108和110。
在另一態樣，本發明技術涉及包含三個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26和105。
在又另一態樣，本發明技術涉及包含三個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
本發明技術還涉及在這些醣基化受體位點中的一個或多個處醣基化的此類多肽。
在另一態樣，本發明技術涉及編碼根據本發明技術的多肽的核苷酸序列或核酸。
在另一態樣，本發明技術涉及用於產生根據本發明技術的多肽的方法，所述方法包括以下步驟： -          在合適的宿主細胞或宿主生物體中表現根據本發明技術的核苷酸序列或核酸， 其中所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化表現的多肽。
在又另一態樣，本發明技術涉及用於將所述多肽與部分接合的方法。
本發明技術還提供了包含所述醣基化多肽和接合部分的接合物，其中所述部分與所述多肽上的聚醣接合。
在另一態樣，本發明技術涉及包含根據本發明技術的多肽、核酸或接合物的組成物。
1. 定義
除非另外指示或定義，否則所使用的所有術語都具有其在本領域中通常的含義，這將是具有通常知識者清楚的。例如，參考標準手冊，Sambrook等人（Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第2版）第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989），F. Ausubel等人（Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987），Lewin（Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985），Old等人（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering（第2版）University of California Press, Berkeley, CA, 1981）；Roitt等人（Immunology（第6版）Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001），Roitt等人（Roitt’s Essential Immunology（第10版）Blackwell Publishing, UK, 2001）以及Janeway等人（Immunobiology（第6版）Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005），以及本文引用的一般背景技術。
除非另外指示，否則如具有通常知識者將清楚的，所有未詳細地具體描述的方法、步驟、技術和操作都可以按本身已知的方式進行並且已進行。例如，再次參考標準手冊和本文提到的一般背景技術以及其中引用的其他參考文獻；以及例如以下綜述：Presta（Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006），Levin和Weiss（Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006），Irving等人（J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001），Schmitz等人（Placenta 21增刊A: S106-12, 2000），Gonzales等人（Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005），它們描述了用於蛋白質工程化的技術（如親和力成熟）和用於改善蛋白質（如免疫球蛋白）的特異性和其他所需特性的其他技術。
如本文所用的術語「序列」（例如，在「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「可變結構域序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」等術語中）通常應理解為包括相關的胺基酸序列以及編碼所述胺基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更受限的解釋。
核酸或胺基酸被認為「（呈）（基本上）分離的（形式）」，例如，與從中獲得它的反應介質或培養基相比，此時它與在所述來源或培養基中通常與之結合的至少一種其他組分分離，例如另一種核酸、另一種蛋白質/多肽、另一種生物組分或大分子或至少一種污染物、雜質或次要組分。特別地，當核酸或胺基酸被純化至少2倍，特別地至少10倍，更特別地至少100倍和高達1000倍或更多時，它被認為是「（基本上）分離的」。「呈（基本上）分離的形式」的核酸或胺基酸優選基本上是同質的，如使用合適的技術（例如合適的層析技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳）測定。
在稱核苷酸序列或胺基酸序列分別「包含」另一個核苷酸序列或胺基酸序列，或「基本上由另一個核苷酸序列或胺基酸序列組成」時，這可以意味著後一個核苷酸序列或胺基酸序列已分別併入第一個提及的核苷酸序列或胺基酸序列中，但更通常這意味著第一個提及的核苷酸序列或胺基酸序列在其序列內分別包含核苷酸或胺基酸殘基的延伸段，所述延伸段分別與後一個序列具有相同的核苷酸序列或胺基酸序列，而不論第一個提及的序列實際上是如何產生或獲得的（例如，其可能是通過本文所述的任何合適的方法產生或獲得的）。透過非限制性示例方式，在稱多肽包含免疫球蛋白單可變結構域時，這可以意味著所述免疫球蛋白單可變結構域序列已併入所述多肽的序列中，但更通常這意味著所述多肽在其序列內含有所述免疫球蛋白單可變結構域的序列，而不論所述多肽是如何產生或獲得的。此外，在稱核酸或核苷酸序列包含另一個核苷酸序列時，第一個提及的核酸或核苷酸序列優選地使得當其表現為表現產物（例如，多肽）時，由後一個核苷酸序列編碼的胺基酸序列形成所述表現產物的一部分（換言之，後一個核苷酸序列與第一個提及的更大的核酸或核苷酸序列在同一閱讀框中）。
「（基本上）由……組成」意指後面的核酸序列或胺基酸序列與多肽（例如，CDR區；ISVD）完全相同或對應於多肽（例如CDR區；ISVD），所述多肽在免疫球蛋白單可變結構域的胺基末端處、羧基末端處、或胺基末端和羧基末端兩者處具有有限數量的胺基酸殘基，如1-20個胺基酸殘基，例如1-10個胺基酸殘基並且優選1-6個胺基酸殘基，如1、2、3、4、5或6個胺基酸殘基。
胺基酸殘基將根據標準的三字母或單字母的胺基酸代碼來指示。參考WO 08/020079第48頁的表A-2。
2. 具有醣基化受體位點的多肽和 ISVD
ISVD醣基化提出了挑戰。諸位發明人現在出人意料地發現，可以在先前未知的位置引入醣基化受體位點，並且這些醣基化受體位點提供具有良好醣基化特性的ISVD，同時所述醣基化不干擾所述ISVD的結合和折疊，這又提供了良好的接合特性，例如在ISVD接合物的生產中。
醣基化是如下反應，其中碳水化合物（或「聚醣」，即醣基供體）附接到另一分子（醣基受體）的羥基或其他官能團以形成醣接合物。在生物學中，醣基化通常是指酶催化的反應。醣基化是共轉譯和轉譯後修飾的形式。在粗糙內質網中合成的蛋白質大多經歷醣基化。醣基化也作為O-GlcNAc修飾存在於細胞質和細胞核中。產生不同類別的聚醣：附接到天門冬醯胺酸或精胺酸側鏈的氮的N-連接的聚醣；附接到絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、羥離胺酸或羥脯胺酸側鏈的羥基氧或附接到脂質（如神經醯胺）上的氧的O-連接的聚醣；透過磷酸絲胺酸的磷酸基連接的磷酸聚醣；以及C-連接的聚醣，這是一種罕見的醣基化形式，其中糖添加至色胺酸側鏈上的碳。
如本文所用，「聚醣」通常是指糖苷連接的單醣、寡醣和多醣。因此，醣接合物如醣蛋白、醣脂或蛋白聚醣的碳水化合物部分在本文中稱為「聚醣」。聚醣可以是單醣殘基的均聚物或異聚物，並且可以是直鏈的或支鏈的。N-連接的聚醣可以由半乳糖、神經氨酸、N-乙醯葡糖胺（GalNAc）、岩藻糖、甘露糖和其他單醣構成，也如本文進一步所例示的。在真核生物中，O-連接的聚醣在高爾基體中在肽鏈的絲胺酸或蘇胺酸殘基上一次組裝一個糖。與N-連接的聚醣不同，沒有已知的共有序列，但是在相對於所述絲胺酸或蘇胺酸的-1或+3處的脯胺酸殘基的位置有利於O-連接醣基化。
術語「免疫球蛋白單可變結構域」（ISVD）可與「單可變結構域」互換使用，定義如下免疫球蛋白分子，其中抗原結合位點存在於單個免疫球蛋白結構域上並由其形成。這使免疫球蛋白單可變結構域與「常規」免疫球蛋白（例如單株抗體）或其片段（如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、二scFv）區分開來，其中兩個免疫球蛋白結構域、特別是兩個可變結構域相互作用形成抗原結合位點。典型地，在常規免疫球蛋白中，重鏈可變結構域（VH）和輕鏈可變結構域（VL）相互作用以形成抗原結合位點。在這種情況下，VH和VL兩者的互補決定區（CDR）將促成抗原結合位點，即總共6個CDR將參與抗原結合位點的形成。
鑒於上述定義，常規4鏈抗體（如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本領域已知）或者源自這種常規4鏈抗體的Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段（如雙硫鍵連接的Fv或scFv片段）或雙抗體（均為本領域已知的）的抗原結合結構域通常不會被視為免疫球蛋白單可變結構域，因為在這些情況下，與抗原相應表位的結合通常不會通過一個（單個）免疫球蛋白結構域來進行，而是通過一對（締合的）免疫球蛋白結構域（如輕鏈和重鏈可變結構域）來進行，即，透過免疫球蛋白結構域的VH-VL對來進行，它們與相應抗原的表位聯合結合。
相比之下，免疫球蛋白單可變結構域能夠在不與另外的免疫球蛋白可變結構域配對的情況下與抗原的表位特異性結合。免疫球蛋白單可變結構域的結合位點是由單VH、單VHH或單VL結構域形成。
因此，單可變結構域可以是輕鏈可變結構域序列（例如，VL序列）或其合適的片段；或者重鏈可變結構域序列（例如，VH序列或VHH序列）或其合適的片段；只要它能夠形成單個抗原結合單元（即，基本上由單可變結構域組成的功能性抗原結合單元，使得單個抗原結合結構域不需要與另一個可變結構域相互作用才能形成功能性抗原結合單元）。
免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）可以是例如重鏈ISVD，如VHH（包括人源化VHH）、VH（包括駝類化VH和人類VH）。在一個實施例中，其是VHH、駝類化VH或人源化VHH。重鏈ISVD可以源自常規四鏈抗體或重鏈抗體。
例如，免疫球蛋白單可變結構域可以是單結構域抗體（或適合用作單結構域抗體的胺基酸序列）、「dAb」或dAb（或適合用作dAb的胺基酸序列）或NANOBODY ®ISVD（如本文所定義，並且包括但不限於VHH）；其他單可變結構域，或其任一種的任何合適的片段。[注意：NANOBODY ®和NANBODIES ®是Ablynx N.V.的註冊商標]
特別地，免疫球蛋白單可變結構域可以是NANOBODY ®ISVD（如VHH，包括人源化VHH或駝類化VH）或其合適的片段。
「VHH結構域」（也被稱為VHH或VHH抗體片段）最初被描述為「重鏈抗體」的（即，「缺乏輕鏈的抗體」的；Hamers-Casterman等人 Nature 363: 446-448, 1993）抗原結合免疫球蛋白可變結構域。已選擇術語「VHH結構域」以將這些可變結構域與常規4鏈抗體中存在的重鏈可變結構域（其在本文中稱為「VH結構域」）以及與常規4鏈抗體中存在的輕鏈可變結構域（其在本文中稱為「VL結構域」）區分開來。有關VHH的進一步描述，參考Muyldermans的評論文章（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）。
免疫球蛋白序列（如VHH）的生成已經在各種出版物（包括WO 94/04678、Hamers-Casterman等人 1993和Muyldermans等人 2001（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001））中被廣泛地描述。在這些方法中，用目標抗原對駱駝科動物進行免疫接種以誘導針對所述靶抗原的免疫反應。將從所述免疫接種獲得的VHH的庫針對結合所述靶抗原的VHH進行進一步篩選。在這些情況下，抗體的生成需要純化的抗原用於免疫接種和/或篩選。抗原可以從天然來源純化或在重組產生的過程中純化。免疫球蛋白序列的免疫接種和/或篩選可以使用此類抗原的肽片段進行。
在本發明技術中可以使用不同起源的免疫球蛋白序列，所述起源包括小鼠、大鼠、兔、驢、人類和駱駝科動物免疫球蛋白序列。此外，可以使用全人類序列、人源化序列或嵌合序列。例如，本文可以使用駱駝科動物免疫球蛋白序列和人源化駱駝科動物免疫球蛋白序列，或者駝類化結構域抗體，例如，如由Ward等人（參見例如，WO 94/04678和Riechmann, Febs Lett., 339:285-290, 1994和Prot. Eng., 9:531-537, 1996）所述的駝類化dAb。ISVD可以融合形成多價和/或多特異性構建體（對於含有一個或多個VHH結構域的多價和多特異性多肽及其製備，還參考Conrath等人2001（J. Biol. Chem., 第276卷, 10. 7346-7350），以及例如WO 96/34103和WO 99/23221）。
然而應注意，本發明技術中包含的ISVD並不限於所述起源的ISVD序列（或不限於用於表現它的核苷酸序列），也不限於生成或獲得（或已經生成或獲得）ISVD序列或核苷酸序列的方式。因此，ISVD序列可以是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成或半合成序列。在特定但非限制性的態樣，ISVD序列是天然存在的序列（來自任何合適的物種）或者合成或半合成序列，包括但不限於「人源化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（如部分或完全人源化的駱駝科動物、小鼠或兔免疫球蛋白序列，且特別是部分或完全人源化的VHH序列）、「駝類化」（如本文所定義）免疫球蛋白序列（且特別是駝類化VH序列），以及已經透過諸如以下的技術獲得的ISVD：親和力成熟（例如，從合成的、隨機的或天然存在的免疫球蛋白序列開始）、CDR移植、鑲飾（veneering）、組合源自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重疊引子的PCR組裝以及具有通常知識者熟知的用於工程化免疫球蛋白序列的類似技術；或前述任一種的任何合適的組合。
類似地，核苷酸序列可以是天然存在的核苷酸序列或合成或半合成序列，並且可以例如是透過PCR從合適的天然存在的模板（例如，從細胞分離的DNA或RNA）分離的序列、已經從文庫（並且特別是表現文庫）分離的核苷酸序列、已經透過將突變引入天然存在的核苷酸序列中而製備（使用本身已知的任何合適的技術，如錯配PCR）的核苷酸序列、已經使用重疊引子通過PCR製備的核苷酸序列或已經使用本身已知的用於DNA合成的技術製備的核苷酸序列。
「人源化VHH」包含與天然存在的VHH結構域的胺基酸序列對應的胺基酸序列，但是所述胺基酸序列已經被「人源化」，即通過將所述天然存在的VHH序列的胺基酸序列中（並且特別是框架序列中）的一個或多個胺基酸殘基用存在於來自人類的常規4鏈抗體的VH結構域中的一個或多個相應位置處的一個或多個胺基酸殘基替代。這可以以本身已知的方式進行，所述方式是具有通常知識者清楚的，例如基於現有技術（例如，WO 2008/020079）。此外，應注意，此類人源化VHH可以以本身已知的任何合適的方式獲得，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VHH結構域的多肽作為起始材料獲得的多肽。
「駝類化VH」包含與天然存在的VH結構域的胺基酸序列對應的胺基酸序列，但是所述胺基酸序列已經被「駝類化」，即透過將來自常規4鏈抗體的天然存在的VH結構域的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基用存在於（駱駝科動物）重鏈抗體的VHH結構域中的一個或多個相應位置處的一個或多個胺基酸殘基替代。這可以以本身已知的方式進行，所述方式是具有通常知識者清楚的，例如基於現有技術中的描述（例如，Davies和Riechman（1994和1996），同上）。此類「駝類化」取代在形成VH-VL介面和/或存在於VH-VL介面處的胺基酸位置處插入，和/或在所謂的駱駝科標誌殘基處插入，如本文所定義（參見例如WO 94/04678，以及Davies和Riechmann（1994和1996），同上）。在一個實施例中，用作產生或設計駝類化VH的起始材料或起點的VH序列是來自哺乳動物的VH序列，如人類的VH序列，如VH3序列。然而應注意，此類駝類化VH可以以本身已知的任何合適的方式獲得，並因此並不嚴格限於已經使用包含天然存在的VH結構域的多肽作為起始材料獲得的多肽。
免疫球蛋白單可變結構域序列的結構可以被認為由四個框架區（「FR」）構成，所述框架區在本領域中和本文中分別被稱為「框架區1」（「FR1」）；「框架區2」（「FR2」）；「框架區3」（「FR3」）；和「框架區4」（「FR4」）；所述框架區被三個互補決定區（「CDR」）中斷，所述互補決定區在本領域中和本文中分別被稱為「互補決定區1」（「CDR1」）；「互補決定區2」（「CDR2」）；和「互補決定區3」（「CDR3」）。
如在WO 08/020079的第58和59頁的段落q) 中進一步描述的，ISVD的胺基酸殘基可以根據Kabat等人（「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD，公佈號91）給出的用於VH結構域的通用編號來編號，如在Riechmann和Muyldermans, 2000的論文（J. Immunol. Methods 240 (1-2): 185-195，參見例如該出版物的圖2）中應用於來自駱駝科動物的V HH結構域。在本申請中，除非另有說明，否則根據Kabat編號確定ISVD的序列。
應注意，如本領域中對於VH結構域和對於VHH結構域所熟知的，每個CDR中胺基酸殘基的總數可以變化，並且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數。也就是說，根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或者實際序列可能含有比Kabat編號所允許的數量更多的胺基酸殘基。這意味著，通常，根據Kabat的編號可以對應於或可以不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。VH結構域和VHH結構域中胺基酸殘基的總數通常在110至120範圍內，常常在112與115之間。然而應注意，更小和更長的序列也可能適合於本文中描述的目的。
CDR區的確定也可以根據不同方法進行。在根據Kabat的CDR確定中，ISVD的FR1包含位置1-30處的胺基酸殘基，ISVD的CDR1包含位置31-35處的胺基酸殘基，ISVD的FR2包含位置36-49處的胺基酸，ISVD的CDR2包含位置50-65處的胺基酸殘基，ISVD的FR3包含位置66-94處的胺基酸殘基，ISVD的CDR3包含位置95-102處的胺基酸殘基，並且ISVD的FR4包含位置103-113處的胺基酸殘基。
框架序列是免疫球蛋白框架序列或已經（例如，通過人源化或駝類化）源自免疫球蛋白框架序列的框架序列（的合適的組合）。例如，框架序列可以是源自輕鏈可變結構域（例如，VL序列）和/或源自重鏈可變結構域（例如，VH序列或VHH序列）的框架序列。在一個特定態樣，框架序列是已經源自VHH序列的框架序列（其中所述框架序列可以視情況地已經被部分或完全人源化）或者是已經駝類化的常規VH序列（如本文所定義）。
特別地，本文所述方法中使用的ISVD序列中存在的框架序列可以含有一個或多個標誌殘基（如下文所定義），使得ISVD序列是NANOBODY ®ISVD，如例如VHH，包括人源化VHH或駝類化VH。此類框架序列（的合適的組合）的非限制性例子將從本文的進一步公開中變得清楚。
通常，NANOBODY ®ISVD（特別是VHH序列，包括（部分）人源化VHH序列和駝類化VH序列）的特徵可以是在一個或多個框架序列（同樣如本文進一步所述）中存在一個或多個「標誌殘基」（如本文所述）。因此，通常，NANOBODY ®ISVD可以被定義為具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指框架區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中標誌殘基中的一個或多個是如本文進一步所定義的。
特別地，NANOBODY ®ISVD可以是具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指框架區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中所述框架序列是如本文進一步所定義的。
更特別地，NANOBODY ®ISVD可以是具有以下（一般）結構的免疫球蛋白序列： FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 其中FR1至FR4分別是指框架區1至4，並且其中CDR1至CDR3分別是指互補決定區1至3，並且其中根據Kabat編號在位置11、37、44、45、47、83、84、103、104和108處的胺基酸殘基中的一個或多個選自下表1中提及的標誌殘基。
表 1 ： NANOBODY ®ISVD 中的標誌殘基
位置 人 VH3 標誌殘基
11 L、V；主要是L L、S、V、M、W、F、T、Q、E、A、R、G、K、Y、N、P、I；優選L
37 V、I、F；通常V F (1)、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T、P，優選F (1)或Y
44 (8) G E (3)、Q (3)、G (2)、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M、I； 優選G (2)、E (3)或Q (3)；最優選G (2)或Q (3)。
45 (8) L L (2)、R (3)、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D、V；優選L (2)或R (3)
47 (8) W、Y F (1)、L (1)或W (2)、G、I、S、A、V、M、R、Y、E、P、T、C、H、K、Q、N、D；優選W (2)、L (1)或F (1)
83 R或K；通常是R R、K (5)、T、E (5)、Q、N、S、I、V、G、M、L、A、D、Y、H；優選K或R；最優選K
84 A、T、D；主要是A P (5)、S、H、L、A、V、I、T、F、D、R、Y、N、Q、G、E；優選P
103 W W (4)、R (6)、G、S、K、A、M、Y、L、F、T、N、V、Q、P (6)、E、C；優選W
104 G G、A、S、T、D、P、N、E、C、L；優選G
108 L、M或T；主要是L Q、L (7)、R、P、E、K、S、T、M、A、H；優選Q或L (7)
注釋： (1)       特別地，但非排他地，與位置43-46處的KERE或KQRE組合。 (2)       通常作為位置44-47處的GLEW。 (3)       通常作為位置43-46處的KERE或KQRE，例如作為位置43-47處的KEREL、KEREF、KQREL、KQREF、KEREG、KQREW或KQREG。可替代地，如以下的序列也是可能的：TERE（例如，TEREL）、TQRE（例如，TQREL）、KECE（例如，KECEL或KECER）、KQCE（例如，KQCEL）、RERE（例如，REREG）、RQRE（例如，RQREL、RQREF或RQREW）、QERE（例如，QEREG）、QQRE（例如，QQREW、QQREL或QQREF）、KGRE（例如，KGREG）、KDRE（例如，KDREV）。一些其他可能的但不太優選的序列包括例如DECKL和NVCEL。 (4)       具有位置44-47處的GLEW和位置43-46處的KERE或KQRE兩者。 (5)       通常作為天然存在的VHH結構域的位置83-84處的KP或EP。 (6)       特別地，但非排他地，與位置44-47處的GLEW組合。 (7)       條件是當位置44-47為GLEW時，在還含有103處的W的（非人源化）V HH序列中，位置108始終為Q。 (8)       GLEW組還含有位置44-47處的GLEW樣序列，如例如GVEW、EPEW、GLER、DQEW、DLEW、GIEW、ELEW、GPEW、EWLP、GPER、GLER和ELEW。
在第一態樣，本發明技術涉及包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
術語「醣基化受體位點」是指ISVD內可以被N-醣基化或O-醣基化的位置。N-連接的聚醣典型地附接到天門冬醯胺酸（Asn），而O-連接的聚醣通常連接到絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、羥離胺酸或羥脯胺酸側鏈的羥基氧。在一個實施例中，醣基化受體位點是N-醣基化位點。在一個實施例中，用於N-醣基化的醣基化受體位點是天門冬醯胺酸（Asn）。在一個實施例中，用於O-醣基化的醣基化受體位點是絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、羥離胺酸或羥脯胺酸。
出人意料的是，諸位發明人發現，除了已知的醣基化受體位點之外，可以在ISVD胺基酸序列中在先前未發現適合於醣基化的位置處產生新的醣基化受體位點。
對於聚醣的有效轉移，在一個實施例中，天門冬醯胺酸位於多肽的一級結構中的特定共有序列（NXS、NXT或NXC）中。因此，用於N-連接醣基化的醣基化受體位點通常將包含在NXT基序或NXS基序（其中X可以是任何胺基酸殘基）中，所述基序在天門冬醯胺酸（N）殘基上醣基化。因此，在本發明技術中，當陳述一個位置可以被醣基化，並且該位置意圖被N-醣基化時，則根據本發明技術的ISVD的一級序列通常將含有NXT或NXS基序（通過突變和/或取代一個或多個相關胺基酸位置適當地引入），使得所述基序的天門冬醯胺酸殘基存在於待醣基化的位置處，即，醣基化受體位點處。
因此，在另外的實施例中，醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是醣基化受體位點並且存在於以下胺基酸位置處，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在另一個實施例中，醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、26和105。
發現具有這三個醣基化受體位置19、26和105之一的ISVD在任何格式（單價或多價）中都具有顯著高的醣基化程度，不論在構建體中使用時ISVD在所述構建體中的位置如何。
在一個實施例中，多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。在該實施例中，所述醣基化受體位點可以存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在另外的實施例中，多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。在該實施例中，所述醣基化受體位點可以存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
從免疫球蛋白單可變結構域（如VHH、人源化VHH、駝類化VH、結構域抗體或dAb）開始設計/選擇和/或製備多肽的過程在本文中也稱為「格式化」所述免疫球蛋白單可變結構域；並且稱構成多肽的一部分的免疫球蛋白單可變結構域是「格式化的」或「處於所述多肽的格式中」。具有通常知識者基於本文的公開文本將清楚可以將免疫球蛋白單可變結構域格式化的方式的例子以及此類格式的例子；並且這種格式化的免疫球蛋白單可變結構域形成本發明技術的另一態樣。
例如且不限制地，一個或多個免疫球蛋白單可變結構域可以用作用於多肽製備的「結合單元」、「結合結構域」或「構建單元」（這些術語可互換使用），所述多肽可以視情況地含有一個或多個可以用作結合單元的另外的免疫球蛋白單可變結構域。
本發明技術還提供了包含一個或多個免疫球蛋白單可變結構域或基本上由其組成的多肽或構建體。單價多肽僅包含僅一個結合單元（如例如，免疫球蛋白單可變結構域）或基本上由其組成。包含兩個或更多個結合單元（如例如，免疫球蛋白單可變結構域）的多肽在本文中也將稱為「多價」多肽，並且存在於此類多肽中的結合單元/免疫球蛋白單可變結構域在本文中也將稱為「多價格式」。例如，「二價」多肽可以包含視情況地經由連接子序列連接的兩個免疫球蛋白單可變結構域，而「三價」多肽可以包含視情況地經由兩個連接子序列連接的三個免疫球蛋白單可變結構域；而「四價」多肽可以包含視情況地經由三個連接子序列連接的四個免疫球蛋白單可變結構域；而「五價」多肽可以包含視情況地經由四個連接子序列連接的五個免疫球蛋白單可變結構域；而「六價」多肽可以包含視情況地經由五個連接子序列連接的六個免疫球蛋白單可變結構域等。
在另一個態樣，本發明技術涉及包含一個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在一個實施例中，本發明技術涉及包含一個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
在另一個實施例中，本發明技術涉及包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在另外的實施例中，本發明技術涉及包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
諸位發明人出人意料地發現，位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110是可以被醣基化以具有功能性的ISVD以及充分醣基化的ISVD（例如，用作單價多肽和/或與其他部分接合）中的醣基化受體位點。
在本發明技術的一個態樣，根據本發明技術的所述多肽包含至少兩個ISVD。在該實施例中，所述至少兩個ISVD中的至少一個可以包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在一個實施例中，所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
諸位發明人出人意料地發現，存在於位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110處的醣基化受體位點也可以在多價多肽中（如例如，在包含至少兩個ISVD的多肽中）提供良好的醣基化程度。有趣的是，發現了用作醣基化受體位點的另一個位置（即位置3），其在單價格式中給出的醣基化程度不足，但在多價多肽中給出的醣基化程度極高。具體而言，不管ISVD在多價多肽（如例如，包含至少兩個ISVD的多肽）內的位置如何，位置3、19、26、55、105和108給出高度醣基化。
在另外的實施例中，所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。在另一個實施例中，所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、105、108和110。
在另一個實施例中，所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。在另一個實施例中，所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
因此，在另一態樣，本發明技術涉及包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
在一個實施例中，所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
諸位發明人出人意料地發現，對於使用一些位置作為醣基化受體位點，ISVD在多肽中的位置對獲得的醣基化程度有影響。具體地，在一些實施例中，醣基化程度取決於具有醣基化受體位點的ISVD是C末端ISVD還是N末端ISVD。對於使用位置3、19、26、55、105和108作為醣基化受體位點，具有醣基化受體位點的ISVD在多肽中的位置對所獲得的醣基化程度沒有影響。然而，對於使用位置53、68、75和110作為醣基化受體位點，諸位發明人出人意料地發現，當包含醣基化受體位點的ISVD是C末端ISVD時，獲得了不良的醣基化。此外，對於位置1，當包含醣基化位點的ISVD是N末端ISVD時，獲得不良的醣基化，而當包含醣基化位點的ISVD是C末端ISVD時，獲得良好的醣基化。發現在二價格式中，不管ISVD的位置如何，位置15具有尚可但不高的醣基化程度。此外，發現位置102在二價格式中時具有不良醣基化，但在三價格式中具有良好醣基化。
因此，在另一個實施例中，所述至少兩個ISVD中的N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
在另外的實施例中，所述至少兩個ISVD中的C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、55、73、105和108。
因此，在另一態樣，本發明技術涉及包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
在另外的實施例中，所述至少兩個ISVD中的C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、55、73、105和108。
如前所提及的，諸位發明人出人意料地發現，作為醣基化受體位點的位置3在多價格式（包括二價多肽）中僅提供了良好的醣基化程度。此外，他們發現除了二價格式外，位置102在單價和多價格式中提供了良好的醣基化程度。其他公開的醣基化受體位點在單價和多價格式（包括二價多肽）中提供了的良好的醣基化程度。
在另一個態樣，根據本發明技術的所述多肽包含至少三個ISVD。在一個實施例中，所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
諸位發明人出人意料地發現，僅當ISVD在（至少）三價格式中時，存在於ISVD中位置15處的醣基化受體位點導致ISVD的高度醣基化。當ISVD在單價格式中時，對於存在於ISVD中位置15處的醣基化受體位點觀察到醣基化程度不足，並且在二價格式中僅觀察到剛好可接受的醣基化程度。然而，當這種ISVD在三價多肽中格式化時，觀察到極高度醣基化。此外，當ISVD在（至少）三價格式中時，存在於ISVD中先前已經討論的位置1、3、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110處的醣基化受體位點也提供了高度醣基化。
在一個實施例中，所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26和105。
諸位發明人出人意料地發現，當醣基化受體位點在至少三價多肽中胺基酸位置3、15、19、26或105時，ISVD在多肽內的位置對醣基化程度沒有影響。
在另一個實施例中，所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。如上所提及的，存在於ISVD中位置15處的醣基化受體位點出人意料地在三價多肽中提供了高度醣基化。此外，在多價格式中（包括在三價多肽中），存在於ISVD中位置1、3、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110處的醣基化受體位點提供了高度醣基化。
諸位發明人出人意料地發現，對於使用一些位置作為醣基化受體位點，ISVD在格式化多肽中的位置對獲得的醣基化程度有影響，在三價格式中也是如此。具體地，在一些情況下，醣基化程度取決於具有醣基化受體位點的ISVD是C末端ISVD、N末端ISVD還是既不在C末端也不在N末端的ISVD（即，在C末端ISVD與N末端ISVD之間的ISVD，如中間ISVD）。對於使用位置3、15、19、26、55、73、105和108作為醣基化受體位點，具有醣基化受體位點的ISVD在多肽中的位置對所獲得的醣基化程度沒有影響。然而，對於使用位置53、68、75、102和110作為醣基化受體位點，諸位發明人出人意料地發現，當包含醣基化受體位點的ISVD是C末端ISVD時，獲得了不良的醣基化。此外，諸位發明人發現，位置1處的醣基化受體位點可能僅存在於C末端ISVD中才獲得高度醣基化。對於使用位置68、75和110作為醣基化受體位點，ISVD在多肽內除C末端之外的任何其他位置將導致高度醣基化。
因此，在一個實施例中，所述至少三個ISVD中的N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、55、73、75、76、105、108和110。
在另一個實施例中，所述至少三個ISVD中的C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26和105。
在又另一個實施例中，所述至少三個ISVD中既不在C末端也不在N末端的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
下文提供了每個特定醣基化受體位點的具體項目。本發明不應被認為是限於這些項目。
位置 1
項目1.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.2. 根據項目1.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目1.3. 根據項目1.1或1.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點。
項目1.4. 根據項目1.1至1.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目1.5. 根據項目1.1至1.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目1.6. 根據項目1.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.7. 根據項目1.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.8. 根據項目1.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.9. 根據項目1.5至1.8中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目1.10. 根據項目1.1至1.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目1.11. 根據項目1.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.12. 根據項目1.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.13. 根據項目1.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.14. 根據項目1.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點。
項目1.15. 根據項目1.10至1.14所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 3
項目3.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.2. 根據項目3.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目3.3. 根據項目3.1或3.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3。
項目3.4. 根據項目3.1至3.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目3.5. 根據項目3.4所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.6. 根據項目3.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.7. 根據項目3.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.8. 根據項目3.4所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.9. 根據項目3.4至3.8所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目3.10. 根據項目3.1至3.3所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目3.11. 根據項目3.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.12. 根據項目3.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.13. 根據項目3.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.14. 根據項目3.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.15. 根據項目3.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.16. 根據項目3.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點。
項目3.17. 根據項目3.10-3.16中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 15
項目15.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.2. 根據項目15.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目15.3. 根據項目15.1或15.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15。
項目15.4. 根據項目15.1至15.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目15.5. 根據項目15.4所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.6. 根據項目15.5所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.7. 根據項目15.5所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.8. 根據項目15.5所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.9. 根據項目15.4所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.10. 根據項目15.4所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點。
項目15.11. 根據項目15.4至15.10中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 19
項目19.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.2. 根據項目19.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目19.3. 根據項目19.1或19.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19。
項目19.4. 根據項目19.1至19.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目19.5. 根據項目19.1至19.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目19.6. 根據項目19.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.7. 根據項目19.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.8. 根據項目19.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.9. 根據項目19.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.10. 根據項目19.5至19.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目19.11. 根據項目19.1至19.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目19.12. 根據項目19.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.13. 根據項目19.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.14. 根據項目19.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.15. 根據項目19.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.16. 根據項目19.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.17. 根據項目19.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點。
項目19.18. 根據項目19.11-19.17中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 26
項目26.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.2. 根據項目26.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目26.3. 根據項目26.1或26.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26。
項目26.4. 根據項目26.1至26.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目26.5. 根據項目26.1至26.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目26.6. 根據項目26.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.7. 根據項目26.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.8. 根據項目26.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.9. 根據項目26.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.10. 根據項目26.5至26.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目26.11. 根據項目26.1至26.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目26.12. 根據項目26.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.13. 根據項目26.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.14. 根據項目26.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.15. 根據項目26.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.16. 根據項目26.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.17. 根據項目26.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點。
項目26.18. 根據項目26.11至26.17所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 53
項目53.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.2. 根據項目53.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目53.3. 根據項目53.1或53.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53。
項目53.4. 根據項目53.1至53.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目53.5. 根據項目53.1至53.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目53.6. 根據項目53.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.7. 根據項目53.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.8. 根據項目53.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.9. 根據項目53.5至53.8中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目53.10. 根據項目53.1-53.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目53.11. 根據項目53.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.12. 根據項目53.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.13. 根據項目53.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.14. 根據項目53.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.15. 根據項目53.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點。
項目53.16. 根據項目53.10-53.15中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 55
項目55.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.2. 根據項目55.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目55.3. 根據項目55.1或55.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55。
項目55.4. 根據項目55.1至55.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目55.5. 根據項目55.1至55.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目55.6. 根據項目55.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.7. 根據項目55.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.8. 根據項目55.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.9. 根據項目55.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.10. 根據項目55.5至55.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目55.11. 根據項目55.1-55.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目55.12. 根據項目55.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.13. 根據項目55.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.14. 根據項目55.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.15. 根據項目55.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.16. 根據項目55.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.17. 根據項目55.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點。
項目55.18. 根據項目55.11至55.17所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 68
項目68.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.2. 根據項目68.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目68.3. 根據項目68.1或68.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68。
項目68.4. 根據項目68.1至68.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目68.5. 根據項目68.1至68.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目68.6. 根據項目68.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.7. 根據項目68.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.8. 根據項目68.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.9. 根據項目68.5至68.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目68.10. 根據項目68.1至68.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目68.11. 根據項目68.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.12. 根據項目68.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.13. 根據項目68.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.14. 根據項目68.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.15. 根據項目68.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點。
項目68.15. 根據項目68.10至68.15所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 73
項目73.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.2. 根據項目73.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目73.3. 根據項目73.1或73.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73。
項目73.4. 根據項目73.1至73.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目73.5. 根據項目73.1至73.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目73.6. 根據項目73.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.7. 根據項目73.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.8. 根據項目73.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.9. 根據項目73.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.10. 根據項目73.5至73.9所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目73.11. 根據項目73.1-73.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目73.12. 根據項目73.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.13. 根據項目73.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.14. 根據項目73.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.15.根據項目73.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.16. 根據項目73.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.17. 根據項目73.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點。
項目73.18. 根據項目73.11至73.17所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 75
項目75.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.2. 根據項目75.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目75.3. 根據項目75.1或75.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75。
項目75.4. 根據項目75.1至75.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目75.5. 根據項目75.1至75.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目75.6. 根據項目75.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.7. 根據項目75.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.8. 根據項目75.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.9. 根據項目75.5至75.8所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目75.10. 根據項目75.1至75.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目75.11. 根據項目75.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.12. 根據項目75.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.13. 根據項目75.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.14. 根據項目75.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.15. 根據項目75.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點。
項目75.16. 根據項目75.10至75.15中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 76
項目76.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.2. 根據項目76.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目76.3. 根據項目76.1或76.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76。
項目76.4. 根據項目76.1至76.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目76.5. 根據項目76.1至76.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目76.6. 根據項目76.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.7. 根據項目76.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.8. 根據項目76.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.9. 根據項目76.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.10. 根據項目76.5至76.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目76.11. 根據項目76.1至76.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目76.12. 根據項目76.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.13. 根據項目76.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.14. 根據項目76.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.15. 根據項目76.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.16. 根據項目76.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.17. 根據項目76.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點。
項目76.18. 根據項目76.11至76.17中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 102
項目102.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點。
項目102.2. 根據項目1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目102.3. 根據項目102.1或102.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102。
項目102.4. 根據項目102.1至102.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目102.5. 根據項目102.1至102.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目102.6. 根據項目102.5所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置102處的醣基化受體位點。
項目102.7. 根據項目102.6所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置102處的醣基化受體位點。
項目102.8. 根據項目102.6所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置102處的醣基化受體位點。
項目102.9. 根據項目102.5所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置102處的醣基化受體位點。
項目102.10. 根據項目102.5所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點。
項目102.11. 根據項目102.5-102.10中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 105
項目105.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.2. 根據項目105.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目105.3. 根據項目105.1或105.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105。
項目105.4. 根據項目105.1至105.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目105.5. 根據項目105.1至105.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目105.6. 根據項目105.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.7. 根據項目105.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.8. 根據項目105.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.9. 根據項目105.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.10. 根據項目105.5至105.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目105.11. 根據項目105.1至105.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目105.12. 根據項目105.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.13. 根據項目105.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.14. 根據項目105.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.15. 根據項目105.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.16. 根據項目105.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.17. 根據項目105.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點。
項目105.18. 根據項目105.11至105.17中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 108
項目108.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.2. 根據項目108.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目108.3. 根據項目108.1或108.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108。
項目108.4. 根據項目108.1至108.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目108.5. 根據項目108.1至108.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目108.6. 根據項目108.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.7. 根據項目108.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.8. 根據項目108.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.9. 根據項目108.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.10. 根據項目108.5至108.9中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目108.11. 根據項目108.1至108.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目108.12. 根據項目108.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.13. 根據項目108.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.14. 根據項目108.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.15. 根據項目108.12所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅C末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和中間ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.16. 根據項目108.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.17. 根據項目108.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點。
項目108.18. 根據項目108.11至108.17中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
位置 110
項目110.1. 一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.2. 根據項目110.1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
項目110.3. 根據項目110.1或110.2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點並且存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110。
項目110.4. 根據項目110.1至110.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
項目110.5. 根據項目110.1至110.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD或（基本上）由其組成。
項目110.6. 根據項目110.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.7. 根據項目110.6所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，並且剩餘的C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.8. 根據項目110.5所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的兩個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.9. 根據項目110.5至110.8中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
項目110.10. 根據項目110.1至110.3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成。
項目110.11. 根據項目110.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，並且剩餘的兩個ISVD不包含存在於胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.12. 根據項目110.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅N末端ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，並且剩餘的中間ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.13. 根據項目110.11所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中僅既不在C末端也不在N末端的ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，並且剩餘的N末端ISVD和C末端ISVD不包含存在於胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.14. 根據項目110.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少兩個包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，並且剩餘的ISVD不包含存在於胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.15. 根據項目110.10所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的所有三個都包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點。
項目110.16. 根據項目110.10至110.15中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
醣基化受體位點的組合
項目A.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置1處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目B.      一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置3處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目C.      一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置15處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目D.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置19處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目E.      一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置26處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、53、55、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目F.      一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置53處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、55、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目G.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置55處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、68、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目H.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置68處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、73、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目I.       一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置73處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、75、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目J.       一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置75處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、76、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目K.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置76處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和/或110中的任一個處。
項目L.      一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置102處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、105、108和/或110中的任一個處。
項目M.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置105處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、108和/或110中的任一個處。
項目N.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置108處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105和/或110中的任一個處。
項目O.     一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於根據Kabat編號的胺基酸位置110處的醣基化受體位點，與至少一個另外的醣基化受體位點組合，所述至少一個另外的醣基化受體位點存在於根據Kabat編號的位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105和/或108中的任一個處。
3. ISVD 醣蛋白
存在於多肽中的醣基化受體位點可以（但不是必需）用N-或O-連接的聚醣修飾。本發明技術還涉及在指定醣基化受體位點中的一個或多個處醣基化的本發明技術的多肽。在能夠醣基化多肽（如本文進一步定義的）的宿主或宿主細胞中表現具有所述醣基化受體位點的多肽後，將在所述宿主或宿主細胞中用一種或多種聚醣直接修飾所產生的多肽。獲得的醣基化多肽，在本文中也稱為ISVD醣蛋白，其包含一種或多種聚醣。在一個實施例中，多肽可以包含具有末端N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc）、（末端）甘露糖、（末端）唾液酸、（末端）半乳糖或其組合的一種或多種聚醣。因此，本發明技術提供了包含如本文所述的ISVD的多肽，其中所述多肽用選自N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc）、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和唾液酸的一種或多種聚醣醣基化。
在一些實施例中，本發明技術的ISVD醣蛋白示出了高親和力。在一些實施例中，本發明技術的ISVD醣蛋白與在指定醣基化受體位點沒有醣基化的多肽相比具有相同的親和力。
親和力是部分與目標分子上結合位點之間的結合強度的量度：解離常數（K D）值越低，目標分子與靶向部分之間的結合強度越強。通常，本發明技術中使用的結合單元（如ISVD）將與其標靶以如下K D結合：10 -5至10 -12莫耳/升或更低、10 -7至10 -12莫耳/升或更低、或10 -8至10 -12莫耳/升（即以如下締合常數（K A）結合：10 5至10 12升/莫耳或更高、10 7至10 12升/莫耳或更高、或10 8至10 12升/莫耳）。通常認為任何大於10 -4mol/升的K D值（或任何小於10 4升/mol的K A值）指示非特異性結合。被認為具有特異性的生物學相互作用（如免疫球蛋白序列與抗原的結合）的K D典型地在10 -5莫耳/升（10000 nM或10 µM）至10 -12莫耳/升（0.001 nM或1 pM）或更低的範圍內。
如具有通常知識者將清楚的，解離常數可以是實際的或表觀的解離常數。用於確定解離常數的方法將是具有通常知識者清楚的，並且例如包括以下提及的技術。在這一方面，還將清楚的是，可能無法測量大於10 -4莫耳/升或10 -3莫耳/升（例如，10 -2莫耳/升）的解離常數。視情況地，如具有通常知識者也將清楚的，（實際或表觀）解離常數可以基於（實際或表觀）締合常數借助關係[K D= 1/K A]來計算。
兩個分子之間的分子相互作用的親和力可以通過本身已知的不同技術來測量，如熟知的表面等離子體共振（SPR）生物感測器技術（參見例如，Ober等人, 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）。如本文所用，術語「表面等離子體共振」是指一種光學現象，其允許通過檢測生物感測器矩陣中蛋白質濃度的改變來分析即時生物特異性相互作用，其中將一種分子固定在生物感測器晶片上，並且使另一種分子在流動條件下經過所固定的分子，從而產生k on、k off測量值，並因此產生K D（或K A）值。例如，這可以使用熟知的BIAcore ®系統（BIAcore International AB，GE Healthcare公司，瑞典烏普薩拉和新澤西州皮斯卡塔韋）進行。有關進一步說明，參見Jonsson等人1993（Ann. Biol. Clin. 51: 19-26）、Jonsson等人1991（Biotechniques 11: 620-627）、Johnsson等人1995（J. Mol. Recognit. 8: 125-131）和Johnnson等人1991（Anal. Biochem. 198: 268-277）。
用於確定生物分子相互作用的親和力的另一種熟知的生物感測器技術是生物層干涉測量法（BLI）（參見例如，Abdiche等人 2008, Anal. Biochem. 377: 209-217）。如本文所用，術語「生物層干涉測量法」或「BLI」是指一種無標籤光學技術，其分析從兩個表面反射的光的干涉圖案：內部參考層（參考光束）和生物感測器尖端上的固定蛋白質的層（訊號光束）。與生物感測器尖端結合的分子的數量變化導致干涉圖案的偏移，報告為波長偏移（nm），其大小是與生物感測器尖端表面結合的分子的數量的直接量度。由於可以即時測量相互作用，因此可以確定締合和解離速率以及親和力。例如，BLI可以使用熟知的Octet ®系統（ForteBio，Pall Life Sciences的分公司，美國門洛派克,）進行。
可替代地，可以使用KinExA ®平臺（Sapidyne Instruments Inc，美國博伊西），在動力學排阻測定（KinExA）中測量親和力（參見例如Drake等人 2004, Anal. Biochem., 328: 35-43）。如本文所用，術語「KinExA」是指用於測量未修飾分子的真實平衡結合親和力和動力學的基於溶液的方法。使抗體/抗原複合物的平衡溶液通過具有用抗原（或抗體）預塗佈的珠的管柱，從而允許游離的抗體（或抗原）與被塗佈的分子結合。對由此捕獲的抗體（或抗原）的檢測用結合所述抗體（或抗原）的螢光標記的蛋白質來完成。
GYROLAB ®免疫測定系統為自動化生物分析和快速樣品周轉提供了平臺（Fraley等人 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）。
在一些實施例中，本發明技術的醣基化多肽與其標靶以如下解離常數（K D）特異性結合：10 -5至10 -12莫耳/升或更低、10 -7至10 -12莫耳/升或更低、或10 -8至10 -12莫耳/升，如通過表面等離子體共振所確定。在一些實施例中，本發明技術的醣基化多肽與其標靶以如下解離常數（K D）特異性結合：10 -5至10 -12莫耳/升或更低、10 -7至10 -12莫耳/升或更低、或10 -8至10 -12莫耳/升，如通過Meso Scale Discovery所確定。
在一些實施例中，本發明技術的ISVD醣蛋白與在指定醣基化受體位點沒有醣基化的多肽相比具有（基本上）相同或更高的熔融溫度（Tm）。將蛋白質的變性中點定義為如下溫度（Tm）或變性劑濃度，在所述溫度或濃度下，折疊和未折疊兩種狀態在平衡狀態下均等分佈（假設為兩態蛋白質折疊）。Tm通常使用熱移位測定（如在本申請的實例部分中描述的熱移位測定）來確定。熔融溫度被定義為50%的蛋白質未折疊的所述蛋白質的溫度。
多肽中存在的組分（例如，ISVD）可以透過一個或多個合適的連接子（如肽連接子）彼此連接。使用連接子來連接兩個或更多個（多）肽是本領域熟知的。一類常用的肽連接子稱為「Gly-Ser」或「GS」連接子。這些連接子是基本上由甘胺酸（G）和絲胺酸（S）殘基組成的連接子，並且通常包含肽基序，如GGGGS（SEQ ID NO: 150）基序的一個或多個重複（例如，具有式(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n可以是1、2、3、4、5、6、7或更大）。此類GS連接子的一些常用的例子是9GS連接子（GGGGSGGGS，SEQ ID NO: 151）、15GS連接子（n = 3；SEQ ID NO: 152）和35GS連接子（n = 7；SEQ ID NO: 153）。參考例如Chen等人 2013（Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10): 1357-1369）和Klein等人 2014（Protein Eng. Des. Sel. 27 (10): 325-330）。在本發明技術的多肽的一個實施例中，使用9GS連接子將所述多肽的組分彼此連接。在本發明技術的多肽的一個實施例中，使用35GS連接子將所述多肽的組分彼此連接。
本發明技術還提供了在穩定性研究期間儲存時示出了增加的穩定性的序列最佳化的ISVD和多肽。序列最佳化的ISVD和多肽示出了減少的N末端的焦麩胺酸轉譯後修飾，並且因此具有增加的產物穩定性。焦麩胺酸修飾導致最終產物的異質性並且需要避免。透過將N末端麩胺酸（E）改變為天門冬胺酸（D），消除了N末端的pGlu轉譯後修飾的可能性，導致提高了產物的穩定性。因此，本發明還涉及如上所述的ISVD和多肽，其中位置1（所述位置根據Kabat編號來確定）處的麩胺酸改變為天門冬胺酸（E1D）。
本發明技術還提供了「人源化的」序列最佳化的ISVD和多肽，即其中所述天然存在的VHH序列的胺基酸序列中（並且特別是框架序列中）的一個或多個胺基酸殘基被存在於來自人類的常規4鏈抗體（例如，上文所指示）的VH結構域中的一個或多個相應位置處的一個或多個胺基酸殘基替代。因此，本發明還涉及人源化的如上所述的ISVD和多肽。
本發明技術還提供了序列最佳化的ISVD和多肽，其展現出與存在於人類血清中的預先存在的抗體的結合降低。為此，在一個實施例中，所述多肽在至少一個ISVD中包含胺基酸位置11（根據Kabat編號）處的纈胺酸（V）和胺基酸位置89處的白胺酸（L）。在一個實施例中，所述多肽在每個ISVD中包含胺基酸位置11（根據Kabat編號）處的纈胺酸（V）和胺基酸位置89處的白胺酸（L）。因此，本發明技術還涉及如上所述的ISVD和多肽，其已經在至少一個ISVD中（如在所有ISVD中）用胺基酸位置11（根據Kabat編號）處的纈胺酸（V）和胺基酸位置89處的白胺酸（L）進行了序列最佳化。
在一個實施例中，ISVD或多肽具有序列VTVSS(X)n（SEQ ID NO: 154）的C末端，其中n是1至10，優選1至5，如1、2、3、4或5，並且其中每個X是獨立選擇的胺基酸殘基。在一個實施例中，多肽在其C末端包含這個ISVD。在一個實施例中，n是1或2，如1。在一個實施例中，X是天然存在的胺基酸。在一個實施例中，X選自丙胺酸（A）、甘胺酸（G）、纈胺酸（V）、白胺酸（L）或異白胺酸（I）。
在另一個實施例中，多肽在至少一個ISVD中包含位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在另一個實施例中，ISVD在至少一個ISVD中包含位置112（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q）。在這些實施例中，ISVD的C末端是VKVSS（SEQ ID NO: 155）、VQVSS（SEQ ID NO: 156）、VTVKS（SEQ ID NO: 157）、VTVQS（SEQ ID NO: 158）、VKVKS（SEQ ID NO: 159）、VKVQS（SEQ ID NO: 160）、VQVKS（SEQ ID NO: 161）或VQVQS（SEQ ID NO: 162），使得在添加單個丙胺酸後，多肽的C末端例如包含序列VTVSSA（SEQ ID NO: 163）、VKVSSA（SEQ ID NO: 164）、VQVSSA（SEQ ID NO: 165）、VTVKSA（SEQ ID NO: 166）、VTVQSA（SEQ ID NO: 167）、VKVKSA（SEQ ID NO: 168）、VKVQSA（SEQ ID NO: 169）、VQVKSA（SEQ ID NO: 170）或VQVQSA（SEQ ID NO: 171）。在一個實施例中，多肽在每個ISVD中包含胺基酸位置11（根據Kabat編號）處的纈胺酸（V）和胺基酸位置89處的白胺酸（L），視情況地在至少一個ISVD中包含位置110（根據Kabat編號）處的離胺酸（K）或麩醯胺酸（Q），並且在C末端ISVD的C末端包含1至5個（天然存在的）胺基酸（如上文所定義）的延伸，如單個丙胺酸（A）延伸，使得所述多肽的C末端例如包含序列VTVSSA（SEQ ID NO: 163）、VKVSSA（SEQ ID NO: 164）或VQVSSA（SEQ ID NO: 165）。關於這方面的其他資訊，參見例如WO2012/175741和WO2015/173325。
提供了ISVD醣蛋白的一些實施例，當ISVD中的醣基化受體位點如本文所述時，所述ISVD醣蛋白具有特別高的醣基化程度。
在本發明技術的一個態樣，所述ISVD醣蛋白是單價多肽，其中所述多肽的序列選自SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 73-78、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89-91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96和SEQ ID NO: 177-179。
在本發明技術的另一個態樣，所述ISVD醣蛋白是二價多肽，其中所述多肽的序列選自SEQ ID NO: 99-102、SEQ ID NO: 105-108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 116-118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123-125、SEQ ID NO: 128-133、SEQ ID NO: 141-143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183和SEQ ID NO: 187。
在本發明技術的另一態樣，所述ISVD醣蛋白是三價多肽，其中所述多肽的序列選自SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22-24、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 44-52、 SEQ ID NO: 55-57、SEQ ID NO: 59-61、SEQ ID NO: 63-65、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 190和SEQ ID NO: 191。
4. 接合物
本發明技術還涉及一種接合物，所述接合物包含根據本發明技術的多肽和與聚醣接合的接合部分。在指定醣基化受體位點處用聚醣修飾的多肽由於其高度醣基化而成為基於聚醣的接合的理想起點。
接合可以以化學方式進行（例如，使用聚醣組分的高碘酸鹽氧化，隨後透過本領域已知的方法（如肟連接、腙連接）或透過還原胺化進行接合）或以酶促方式進行（例如，使用半乳糖氧化酶氧化半乳糖，隨後透過肟連接、腙連接或透過還原胺化進行接合）。可替代地，可以摻入標記的聚醣殘基以允許隨後的接合反應（例如，使用突變半乳糖基轉移酶在聚醣鏈中摻入GalNAz，隨後通過點擊化學進行接合反應）。
在某些實施例中，接合物包含在聚醣與接合部分之間的連接子。特定連接子的使用將取決於應用，並且將是具有通常知識者清楚的。例如，肟和腙（特別是源自脂族醛）在水中或在較低pH下顯示隨時間變化更低的穩定性。芳香族穩定的結構對於將聚醣與接合部分穩定連接可能更有用。此類穩定的連接子也在本申請的範圍內，因為它們可以限制由於接合部分的過早釋放而引起的不良影響，特別是當接合部分是毒性物質（例如，旨在殺傷腫瘤細胞）時。特別令人感興趣的是雙環[6.1.0]壬-4-炔試劑以及芳香族穩定的三唑連接子和磺醯胺連接子。在技術常識中，接合物的穩定性增加也可能是由於所述接合物內包含的任何部分的聚集趨勢降低引起的。對於穩定性增加的ISVD接合物的產生，向讀者非排他性地提及WO 2013036748、WO 2014065661、WO 2015057064和WO 2016053107以及Synaffix B.V提交的其他專利申請。
本領域已知的各種連接子可以用於連接醣基化多肽和接合部分。應當清楚的是，可以採用可切割和不可切割的連接子來實現所需的釋放特徵。通常，連接子與接合化學的最佳組合必須量身定制以關聯每個獨特方面：醣基化多肽、接合部分和待治療疾病的概況。關於本文使用的抗體-藥物接合物和連接子的綜述，參見例如McCombs和Owen 2015（AAPS J. 17(2), 2015）和Lu等人 2016（Int. J. Mol. Sci. 17(4: 561); doi: 10.3390/ijms17040561），以及Pillow等人 2017（Pharm Pat Anal. 6(1)），其描述了一種新型季銨鹽連接子，可在用於治療癌症和感染性疾病的接合物中使用。
其他合適的連接子通常包括有機化合物或聚合物，特別是適合在用於藥物用途的多肽中使用的那些。例如，聚(乙二醇)部分已經用於連接抗體結構域，參見例如WO 04/081026。在本發明的範圍內涵蓋，連接子的長度、柔性程度和/或其他特性可能對最終接合物的特性具有一些影響，包括但不限於對特定標靶的親和力、特異性或親合力。基於本文的公開文本，具有通常知識者將能夠確定用於特定接合物中的最佳連接子，視情況地在一些有限常規實驗之後確定。
在一些實施例中，與未接合的多肽相比，包含根據本發明技術的多肽和接合部分的接合物具有至少一種另外的功能或特性。例如，包含本發明技術的多肽和作為接合部分的細胞毒性藥物的接合物導致形成具有藥物細胞毒性作為第二功能（即，除了由所述多肽中包含的ISVD所賦予的抗原結合外）的結合多肽。作為另一個例子，第二結合多肽與本發明技術的多肽的接合可以賦予另外的結合特性。作為另一個例子，接合部分可以是提供葡萄糖轉運功能的另一個糖部分（如葡萄糖）（Ancey等人 2018, FEBS J. 285: 2926）或提供降解劑功能的雙-甘露糖-6-磷酸。作為又另一個例子，接合部分可以是提供半衰期延長和/或穩定/增溶功能的PEG分子。作為另一個例子，接合部分可以是提供降解劑功能的蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）（Sakamoto等人 2001, PNAS 98: 8554-9）。作為另一個例子，接合部分可以是提供治療功能的治療部分（例如，抗真菌、抗細菌、抗病毒、抗寄生蟲、細胞毒性、放射性核苷酸）。可以與存在於醣基化受體位點處的聚醣接合的其他部分包括半衰期延長部分（PEG或PEG類比物、大的多醣）、檢測單元（生色團單元、螢光單元、磷光單元、發光單元、光吸收單元、放射性單元）、靶向部分（例如，小分子、抗體）。
5. 核酸分子
本發明技術的另一態樣涉及編碼根據本發明技術的多肽的核苷酸序列或核酸。
「 核酸分子」（可與「 核酸」互換使用）是經由磷酸主鏈彼此連接以形成核苷酸序列的核苷酸單體的鏈。核酸可以用於轉化/轉染宿主細胞或宿主生物體，例如，用於多肽的表現和/或產生。用於產生目的的合適的宿主或宿主細胞將是具有通常知識者清楚的，優選地是能夠醣基化多肽的宿主生物體，並且可以例如是任何合適的真菌、原核或真核細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核生物體。包含編碼本發明技術的多肽的核酸的宿主或宿主細胞也被本發明技術涵蓋。
核酸可以是例如DNA、RNA或其雜合體，並且還可以包含（例如，以化學方式）修飾的核苷酸，如PNA。其可以是單股的或雙股的。在一個實施例中，其呈雙股DNA的形式。例如，本發明技術的核苷酸序列可以是基因體DNA或cDNA。
本發明技術的核酸可以以本身已知的方式製備或獲得，和/或可以從合適的天然來源分離。編碼天然存在的（多）肽的核苷酸序列可以例如進行定點誘變，以便提供編碼具有序列變異的多肽的核酸分子。另外，如具有通常知識者將清楚的是，為了製備核酸，或者若干個核苷酸序列，如編碼靶向部分的至少一個核苷酸序列和例如編碼一種或多種連接子的核酸可以以合適的方式連接在一起。
用於生成核酸的技術將是具有通常知識者清楚的，並且可以例如包括但不限於自動化DNA合成；定點誘變；將兩個或更多個天然存在的和/或合成序列（或其兩個或更多個部分）組合；引入導致截短的表現產物的表現的突變；引入一個或多個限制位點（例如，以產生可以易於使用合適的限制酶消化和/或連接的盒和/或區域）；和/或借助PCR反應使用一種或多種「錯配」引子引入突變。
在一個實施例中，所述核苷酸序列或核酸被最佳化用於在宿主細胞或宿主生物體中表現，所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化由所述核苷酸序列或核酸編碼的多肽。
在另外的實施例中，所述核苷酸序列或核酸呈可以在宿主細胞或宿主生物體中表現的構建體或（表現）載體的形式，所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化由所述核苷酸序列或核酸編碼的多肽。如本文所用的載體是適合於將遺傳物質攜帶至細胞中的載具。載體包括裸核酸（如質體或mRNA）或嵌入更大結構（如脂質體或病毒載體）中的核酸。
在一些實施例中，載體包含至少一種核酸，其視情況地連接到一個或多個調節元件，例如一個或多個合適的啟動子、增強子、終止子等。在一個實施例中，載體是表現載體，即適用於在合適的條件下（例如，當所述載體被引入（例如，人類）細胞中時）表現編碼的多肽或構建體的載體。基於DNA的載體包括用於轉錄（例如，啟動子和多腺苷酸訊號）和轉譯（例如，科紮克序列）的元件的存在。
在一個實施例中，在載體中，所述至少一種核酸和所述調節元件彼此「可操作地連接」，這通常意指它們彼此之間具有功能關係。例如，如果啟動子能夠啟動或以其他方式控制/調節編碼序列的轉錄和/或表現，則所述啟動子被認為與編碼序列「可操作地連接」（其中所述編碼序列應理解為在所述啟動子的「控制下」）。通常，當兩個核苷酸序列可操作地連接時，它們處於相同定向，並且通常也處於同一閱讀框中。它們通常也是基本上連續的，但這也可能不是必需的。
在一個實施例中，載體的任何調節元件使得其能夠在預期的宿主細胞或宿主生物體中提供其預期的生物學功能。例如，啟動子、增強子或終止子在預期的宿主細胞或宿主生物體中應是「可操作的」，這意味著例如所述啟動子應能夠啟動或以其他方式控制/調節與其可操作地連接的核苷酸序列（例如編碼序列）的轉錄和/或表現。
在另一態樣，本發明技術涉及用於產生根據本發明技術的多肽和/或ISVD醣蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟： -          在合適的（非人類）宿主細胞或（非人類）宿主生物體中表現根據本發明技術的核苷酸序列或核酸，其中所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化表現的多肽；視情況地隨後 -          分離和/或純化獲得的多肽和/或ISVD醣蛋白。
能夠醣基化表現的多肽的宿主細胞或宿主生物體通常是真核細胞或生物體。在一個實施例中，宿主細胞是高等真核細胞。如本文所用，「高等真核細胞」是指不是來自單細胞生物體的細胞的真核細胞。換句話說，高等真核細胞是來自（或在細胞培養物的情況下源自）多細胞真核生物（如人類細胞株或另一種哺乳動物細胞株（例如，CHO細胞株））的細胞。典型地，高等真核細胞將不是真菌細胞。具體地，該術語通常是指哺乳動物細胞、人類細胞株和昆蟲細胞株。更具體地，該術語是指脊椎動物細胞，甚至更具體地是指哺乳動物細胞或人類細胞。如本文所述的高等真核細胞典型地將是細胞培養物（例如，細胞株，如HEK或CHO細胞株）的一部分，儘管這並不總是嚴格要求的（例如，在植物細胞的情況下，植物本身可以用於產生重組蛋白）。
在一個實施例中，宿主細胞是低等真核細胞。「低等真核細胞」意指絲狀真菌細胞或酵母細胞。酵母細胞可以來自以下物種：酵母菌屬（ Saccharomyces）（例如，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae））、漢遜酵母屬（ Hansenula）（例如，多形漢遜酵母（ Hansenula polymorpha））、阿氏酵母屬（ Arxula）（例如，解腺嘌呤阿氏酵母（Arxula adeninivorans））、耶氏酵母屬（ Yarrowia）（例如，解脂耶氏酵母（ Yarrowia lipolytica））、克魯維酵母屬（ Kluyveromyces）（例如，乳酸克魯維酵母（ Kluyveromyces lactis））、黑麯黴（ Aspergillus niger）或法夫駒形氏酵母（ Komagataella phaffii）（Kurtzman, C.P.(2009) J lnd Microbiol Biotechnol.36(11)），所述法夫駒形氏酵母先前被命名為巴斯德畢赤酵母（ Pichia pastoris）並且舊名稱更為人所知，並且所述命名在本文中也將被進一步使用。根據具體實施例，低等真核細胞是畢赤酵母屬（ Pichia）細胞，並且在最具體的實施例中是巴斯德畢赤酵母細胞。
合適的哺乳動物細胞株或酵母菌株的一些非限制性例子包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、人類胚胎腎（HEK）細胞、Sp2/0或Ns0小鼠骨髓瘤細胞和幼倉鼠腎（BHK）細胞以及可以用於旨在投予人類受試者和/或用於治療用途的多肽和蛋白質的表現/產生/製造的其他哺乳動物細胞株和酵母菌株。
本發明技術還涉及這樣的（非人類）宿主細胞或（非人類）宿主生物體，其包含本發明技術的多肽或ISVD醣蛋白、編碼本發明技術的多肽或ISVD醣蛋白的核酸和/或包含所述核酸分子的載體。
6. 組成物
在又另一態樣，本發明技術涉及一種組成物，其包含根據本發明技術的多肽；使用本發明技術的方法產生的多肽或ISVD醣蛋白；根據本發明技術的接合物；編碼本發明技術的多肽的核酸或包含這種核酸分子的載體。所述組成物可以是醫藥組成物。所述組成物可以進一步包含至少一種醫藥上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，並且視情況地包含一種或多種另外的醫藥活性多肽和/或化合物。
7. 用途
本發明技術的多肽、ISVD醣蛋白或接合物、如本文所述的核酸分子或載體、或包含本發明技術的多肽、ISVD醣蛋白、接合物、核酸分子或載體的組成物可用作藥劑。因此，本發明技術提供了本發明技術的多肽、ISVD醣蛋白或接合物、如本文所述的核酸分子或載體、或包含本發明技術的多肽、ISVD醣蛋白、接合物、核酸分子或載體的組成物以用作藥劑。
因此，進一步提供了用於診斷、預防和/或治療至少一種疾病和/或障礙的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予醫藥活性量的至少一種本發明技術的多肽、ISVD醣蛋白或接合物，如本文所述的核酸分子或載體，或包含本發明技術的多肽、ISVD醣蛋白、接合物、核酸分子或載體的組成物。
8. 實施例
本發明進一步例示為但不限於以下實施例。
實施例1.  一種包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例2.  根據實施例1所述的多肽，其中所述醣基化受體位點是N-醣基化位點。
實施例3.  根據實施例1或2所述的多肽，其中所述醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中所述NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是所述醣基化受體位點。
實施例4.  根據實施例1至3中任一項所述的多肽，其中所述醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
實施例5.  根據實施例1至3中任一項所述的多肽，其中所述醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、26、55、73、105和108。
實施例6.  根據實施例1至3中任一項所述的多肽，其中所述醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
實施例7.  根據實施例6所述的多肽，其中所述多肽是包含一個ISVD或（基本上）由其組成的單價多肽。
實施例8.  一種包含一個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例9.  根據實施例8所述的多肽，其中所述醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
實施例10.       根據實施例1至3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少兩個ISVD。
實施例11.       根據實施例10所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例12.       根據實施例10所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
實施例13.       根據實施例10所述的多肽，其中所述至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
實施例14.       根據實施例10所述的多肽，其中所述多肽是包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的二價多肽。
實施例15.       根據實施例14所述的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
實施例16.       根據實施例14所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、55、105和108。
實施例17.       根據實施例14所述的多肽，其中所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
實施例18.       一種包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、105、108和110。
實施例19.       根據實施例18所述的多肽，其中所述兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、55、105和108。
實施例20.       根據實施例18所述的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
實施例21.       根據實施例18所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、55、105和108。
實施例22.       一種包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、19、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
實施例23.       一種包含兩個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、19、26、55、105和108。
實施例24.       根據實施例1至3中任一項所述的多肽，其中所述多肽包含至少三個ISVD。
實施例25.       根據實施例24所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例26.       根據實施例24所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26和105。
實施例27.       根據實施例24至26中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
實施例28.       根據實施例24、25或27所述的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、55、73、75、76、105、108和110。
實施例29.       根據實施例24、25或27所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26和105。
實施例30.       根據實施例24、25或27所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中既不在C末端也不在N末端的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例31.       一種包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成的多肽，其中所述至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例32.       根據實施例31所述的多肽，其中N末端ISVD包含位於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、55、73、75、76、105、108和110。
實施例33.       根據實施例31所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置1、3、15、19、26和105。
實施例34.       根據實施例31所述的多肽，其中所述至少三個ISVD中既不在C末端也不在N末端的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，所述胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置3、15、19、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
實施例35.       根據實施例31至34中任一項所述的多肽，其中所述多肽是包含三個ISVD或（基本上）由其組成的三價多肽。
實施例36.       根據實施例1至35中任一項所述的多肽，所述多肽在所述醣基化受體位點處被一個或多個聚醣醣基化。
實施例37.       根據實施例36所述的多肽，其中所述聚醣選自末端N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc）、（末端）甘露糖、（末端）唾液酸、（末端）半乳糖或其組合。
實施例38.       根據實施例1所述的多肽，其中所述ISVD醣蛋白是單價多肽，其中所述多肽的序列選自SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 73-78、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89-91、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 96和SEQ ID NO: 177-179。
實施例39.       根據實施例1所述的多肽，其中所述ISVD醣蛋白是二價多肽，其中所述多肽的序列選自SEQ ID NO: 99-102、SEQ ID NO: 105-108、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 116-118、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 123-125、SEQ ID NO: 128-133、SEQ ID NO: 141-143、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183和SEQ ID NO: 187。
實施例40.       根據實施例1所述的多肽，其中所述ISVD醣蛋白是三價多肽，其中所述多肽的序列選自SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22-24、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 44-52、 SEQ ID NO: 55-57、SEQ ID NO: 59-61、SEQ ID NO: 63-65、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 190和SEQ ID NO: 191。
實施例41.       一種編碼根據實施例1至40中任一項所述的多肽的核苷酸序列或核酸。
實施例42.       根據實施例41所述的核苷酸序列或核酸，所述核苷酸序列或核酸被最佳化用於在宿主細胞或宿主生物體中表現，所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化由所述核苷酸序列或核酸編碼的多肽。
實施例43.       根據實施例41或42所述的核苷酸序列或核酸，所述核苷酸序列或核酸呈可以在宿主細胞或宿主生物體中表現的構建體或（表現）載體的形式，所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化由所述核苷酸序列或核酸編碼的多肽。
實施例44.       一種用於產生根據實施例1至40中任一項所述的多肽的方法，其中所述方法包括以下步驟： -          在合適的宿主細胞或宿主生物體中表現根據實施例41至43中任一項所述的核苷酸序列或核酸， 其中所述宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化表現的多肽。
實施例45.       一種用於將部分與根據實施例1至40中任一項所述的多肽接合的方法，所述方法包括以下步驟： -          所述多肽上存在的一個或多個聚醣的氧化，視情況地使用高碘酸鹽氧化；以及 -          使所述經氧化的聚醣與所述部分的接合。
實施例46.       根據實施例45所述的方法，其中所述部分選自(雙-)甘露糖-6-磷酸、PROTAC和PEG部分。
實施例47.       一種包含根據實施例1至40中任一項所述的多肽和接合部分的接合物，其中所述部分與聚醣接合。
實施例48.       根據實施例47所述的接合物，其中所述部分選自(雙-)甘露糖-6-磷酸、PROTAC和PEG部分。
實施例49.       一種組成物，所述組成物包含根據實施例1至40中任一項所述的多肽、使用根據實施例45或46所述的方法產生的多肽或根據實施例47或48所述的接合物。
實施例50.       根據實施例1至40中任一項所述的多肽、根據實施例41至43中任一項所述的核苷酸序列或核酸、根據實施例47或48所述的接合物或根據實施例49所述的組成物，用作藥劑。
實施例51.根據實施例1至40中任一項所述的多肽、根據實施例41至43中任一項所述的核苷酸序列或核酸、根據實施例47或48所述的接合物或根據實施例49所述的組成物用於製造藥劑的用途。
下表2A和表2B中列出了存在於根據本發明技術的ISVD中的優選醣基化受體位點，以及具有醣基化受體位點的這種ISVD的一種或多種優選格式。
表 2A ： ISVD 中醣基化受體位點的優選位置（ Kabat 編號）
位置 價數
1 單價、多價
3 多價
15 多價
19 單價、多價
26 單價、多價
53 單價、多價
55 單價、多價
68 單價、多價
73 單價、多價
75 單價、多價
76 多價
102 單價、多價
105 單價、多價
108 單價、多價
110 單價、多價
表 2B ： ISVD 中醣基化受體位點的其他優選位置（ Kabat 編號）
位置 價數
1 單價；多價，優選在C末端ISVD中多價
3 多價，優選二價，更優選三價
15 多價，優選二價，更優選三價
19 單價；多價
26 單價；多價，優選二價或三價
53 單價；多價，優選在並非C末端ISVD的ISVD中二價或三價
55 單價；多價，優選三價，更優選二價
68 單價；多價，優選在並非C末端ISVD的ISVD中二價或三價
73 單價；多價
75 單價；多價，優選在並非C末端ISVD的ISVD中
76 多價，優選三價
102 單價；多價，優選在並非C末端ISVD的ISVD中三價
105 單價；多價，優選二價或三價
108 單價；多價，優選三價，更優選二價
110 多價，優選在並非C末端ISVD的ISVD中二價或三價
將在下文實例部分中進一步強調本發明技術及其實施例。
實例
實例 1 ： ISVD 表現構建體的生成
將透過PCR用各自攜帶獨特限制性位點的正向FR1和反向FR4引子的特定組合獲得的編碼ISVD的DNA片段用適當的限制性酶消化，並連接到ISVD表現載體的匹配選殖盒中。然後使用連接混合物轉化電感受態或化學感受態大腸桿菌（ Escherichia coli）TG1（Lucigen，分別為目錄號60502或定制的）或TOP10（ThermoFisher Scientific，分別為目錄號C404052或C4081201）細胞，使所述細胞在適當的抗生素選擇壓力（卡那黴素或吉歐黴素）下生長。透過質體DNA的桑格定序（LGC Genomics）驗證抗性殖株。
用於在大腸桿菌中表現單價 ISVD 的構建體的製備
單價ISVD在大腸桿菌TG1細胞中由質體表現載體表現，所述質體表現載體含有lac啟動子、卡那黴素抗性基因、大腸桿菌複製起點以及位於OmpA訊號肽的編碼序列之後的ISVD選殖位點，所述OmpA訊號肽將表現的ISVD引導至細菌宿主的周質腔。與ISVD編碼序列同框，所述載體編碼C末端的3xFLAG和His6標籤。
用於在 CHO 細胞中表現 ISVD 的構建體的製備
用於表現ISVD蛋白的哺乳動物表現載體含有RSV-LTR啟動子、吉歐黴素的抗性基因和小鼠輕鏈的訊號肽。經由Golden Gate選殖在表現載體中選殖編碼ISVD構建單元和GS連接子的DNA（Engler C, Marillonnet S. Golden Gate cloning. Methods Mol. Biol. 2014;1116:119-31）。表現載體含有兩個BpiI限制性位點，其用於選殖在一個或多個載體中的經PCR擴增的單價ISVD DNA以及GS連接子DNA。所有這些元件均側接有BpiI位點。在選殖盒的每個位置使用獨特的核苷酸單鏈突出端允許按預定順序無縫連接。在桑格定序確認後，將源自大腸桿菌TOP10的質體DNA轉染到CHOEBNALT85細胞中。
實例 2 ： ISVD 在大腸桿菌中的表現
將含有ISVD表現載體的大腸桿菌細胞在37ºC下生長2小時，隨後在含有「5052」自誘導培養基（50x儲備液：25%甘油、2.5%葡萄糖、10%乳糖）的帶擋板搖瓶中在30ºC下生長29小時（250 rpm）。透過離心（20分鐘，4500 rpm，4ºC）使細胞沉澱，棄去上清液，並且將沉澱在-20ºC下冷凍隔夜。然後將冷凍的細胞沉澱按原始培養體積的1/12.5溶解在DPBS（Gibco，目錄號14190-094）中，並且在4ºC下培育1小時，同時輕輕旋轉以破壞細胞的外膜。將細胞再次沉澱（20分鐘，8500 rpm，4ºC），並且收集含有ISVD蛋白的上清液並過濾以立即繼續進行純化。
在大腸桿菌中表現的ISVD被認為是對照，因為在透過大腸桿菌的表現中將不發生醣基化。
實例 3 ： ISVD 在哺乳動物細胞中的表現
將CHOEBNALT85-1E9細胞（從Icosagen獲得許可的QMCF技術）以1.5E06個細胞/mL的密度接種於含有GlutaMAX™補充物（Gibco，目錄號35050-038）的10 mL的CHO TF培養基（Xell，目錄號8860001）中，並且用DNA/轉染試劑007複合物轉染。複合物通過以下方式形成：將300 µL水中的10 µg質體DNA與200 µL水中的50 µg轉染試劑007（Icosagen，目錄號R007P001）混合，並且在室溫下培育5分鐘。在37ºC下培育1.5小時後，添加10 mL含有GlutaMAX™補充物的新鮮CHO TF培養基，並且允許細胞在37ºC下生長24小時。隨後，添加10 mL含有GlutaMAX™補充物和青黴素-鏈黴素（Gibco，目錄號15140-122）的新鮮CHO TF培養基，並且將細胞在37ºC下再培育72小時。然後，確定細胞密度，並且在達到3.5E06個細胞/mL且活力 ＞ 90%時，將1.8 mL基礎補料（Basic Feed，Xell，目錄號1092-0001）添加至細胞，並且將培育溫度降低至30ºC。48小時後再次添加基礎補料，並且在另一48小時後再次添加。在72小時的最後培育後，通過離心（在1000 rpm下10分鐘）使細胞沉澱，然後將上清液轉移至另一個管中。將上清液再次離心以清除剩餘的細胞碎片（在8500 rpm下30分鐘），並且收集含有ISVD的培養基，過濾，並且儲存在-20ºC下直至純化。所有培育均在8% CO 2的存在下，在加濕的定軌搖床培養箱中以200 rpm進行。
實例 4 ：使用蛋白 A 親和層析法純化 ISVD
在蛋白A上純化ISVD構建體，隨後進行脫鹽步驟，且如果需要，則在D-PBS中進行製備型SEC。經由OD280/OD340測量確定濃度。通過SDS-PAGE和質譜法進行品質控制。
生成的ISVD的完整列表可見於下文實例5中示出的表3。
實例 5 ：醣基化分析
透過SDS page分析獲自哺乳動物細胞的ISVD醣蛋白在不同醣基化受體位點處的醣基化。透過PNG酶去除N-連接的寡醣以證實，SDS-PAGE中分子量（MW）的變化事實上是由於醣基化所致的。更具體地，如果與野生型非醣基化對照相比，在PNG酶處理後MW的變化沒有消失，則意味著除了添加的糖之外的事物引起MW的增加。
PNG 酶 F 步驟
透過PNG酶F（N-糖苷酶F）從ISVD醣蛋白中去除N-連接的寡醣。所述方法根據製造商的說明書（NEB，目錄號P0704S）來進行：添加5-10 µg的醣基化ISVD、1 µL的10x醣蛋白變性緩衝液和H 2O至10 µL的總體積。將混合物在100ºC下加熱10分鐘，然後在冰上冷卻並且短暫離心10秒。隨後，添加2 µL的10x Glycobuffer、2 µL的10% NP-40和6 µL H 2O，然後添加1 μL PNG酶F。將反應輕輕混合並且在37ºC培育1小時。根據下文描述的方案，最終使用SDS-PAGE分析來分析2 µg的混合物。
方案 SDS-PAGE 分析
在還原（R）、加熱和非還原（NR）、非加熱兩種條件下，在預製的4%-12% BT NuPAGE SDS PAGE凝膠（Invitrogen，#NP0321BOX或NP0323BOX）上分析2 µg樣品。上樣緩衝液是NuPAGE，4x LDS樣品緩衝液（Invitrogen，#NR0008）。  加熱在98ºC下進行3 min。載入5 µl的標記物（Sharp預染色的蛋白質標準品，Novex，#LC5800），然後在40 min期間在180 V的電壓下在1x MES運行緩衝液中運行凝膠。最後，將凝膠用Instant Blue染色並且用自來水脫色8 h。
質譜法分析
完整質量LC-MS分析在聯用Agilent Q-TOF 6530質譜儀的Agilent 1290系列UHPLC（二者均來自Agilent Technologies）上進行，或在聯用Q-Exactive Plus質譜儀的Vanquish Flex UHPLC（二者均來自hermo Fisher Scientific）上進行。在使用MassPREP脫鹽小柱（Waters）線上脫鹽之後，在對原始MS資料進行電荷態解卷積後，確定一種或多種主要產物的分子質量。
結果
只認為醣基化程度超過50%的ISVD是充分醣基化的。測試的ISVD的完整列表可見於下文表3中。
表 3 ：生成的 ISVD 的醣基化分析
ISVD ID SEQ ID NO 醣基化受體位點 ( 多個 ) 價 / 位置突變 醣基化程度
ALB00606 1 15N 單價 N/A
ALB00607 2 19N 單價 N/A
ALB00608 3 26N 單價 N/A
ALB00609 4 55N 單價 N/A
ALB00610 5 105N 單價 N/A
ALB00611 6 108N 單價 N/A
ALB00612 7 75T* 單價 N/A
ALB00613 8 15N 單價 20%
ALB00614 9 19N 單價 50%
ALB00615 10 26N 單價 60%
ALB00616 11 55N 單價 100%
ALB00617 12 105N 單價 40%
ALB00618 13 108N 單價 20%
ALB00619 14 75T* 單價 100%
ALB00620 15 3N，5T** 單價 5%
ALB00621 16 3N，5T** 單價 N/A
ALB00622 17 無 單價 N/A
ALB00623 18 無 單價 0%
T043800001 19 無 三價 0%
T043800002 20 3N，5T** 三價 / C末端 100%
T043800003 21 5N 三價 / C末端 10%
T043800004 22 15N 三價 / C末端 80%
T043800005 23 19N 三價 / C末端 95%
T043800006 24 26N 三價 / C末端 99%
T043800007 25 53N 三價 / C末端 10%
T043800008 26 55N 三價 / C末端 50%
T043800009 27 68N 三價 / C末端 0%
T043800010 28 A74N，T76** 三價 / C末端 10%
T043800011 29 102N 三價 / C末端 5%
T043800012 30 105N 三價 / C末端 70%
T043800013 31 108N 三價 / C末端 50%
T043800014 32 110N 三價 / C末端 0%
T043800015 33 75N 三價 / C末端 10%
T043800016 34 75T* 三價 / C末端 50%
T043800055 35 無 三價 0%
T043800056 36 15N 三價 / N末端 60%
T043800057 37 19N 三價 / N末端 100%
T043800058 38 26N 三價 / N末端 100%
T043800059 39 53N 三價 / N末端 nd
T043800060 40 55N 三價 / N末端 100%
T043800061 41 68N 三價 / N末端 nd
T043800062 42 74N 三價 / N末端 60%
T043800063 43 102N 三價 / N末端 nd
T043800064 44 105N 三價 / N末端 100%
T043800065 45 75N 三價 / N末端 100%
T043800066 46 76N 三價 / N末端 100%
T043800067 47 15N 三價 / 中間 90%
T043800068 48 19N 三價 / 中間 100%
T043800069 49 26N 三價 / 中間 100%
T043800070 50 53N 三價 / 中間 90%
T043800071 51 55N 三價 / 中間 100%
T043800072 52 68N 三價 / 中間 100%
T043800073 53 74N 三價 / 中間 50%
T043800074 54 102N 三價 / 中間 90%
T043800075 55 105N 三價 / 中間 100%
T043800076 56 75N 三價 / 中間 100%
T043800089 57 3N，5T** 三價 / N末端 90%
T043800090 58 5N 三價 / N末端 nd
T043800091 59 3N，5T** 三價 / 中間 100%
T043800092 60 108N 三價 / N末端 100%
T043800093 61 110N 三價 / N末端 100%
T043800094 62 5N 三價 / 中間 0%
T043800095 63 108N 三價 / 中間 100%
T043800096 64 110N 三價 / 中間 100%
T043800097 65 76N 三價 / 中間 100%
T043800098 66 無 三價 0%
T043800118 67 3N，5T** 單價 20%
T043800119 68 110N 單價 50%
T043800120 69 75N 單價 100%
T043800121 70 75T* 單價 100%
T043800122 71 5N 單價 0%
T043800123 72 15N 單價 10%
T043800124 73 19N 單價 100%
T043800125 74 26N 單價 90%
T043800126 75 55N 單價 100%
T043800127 76 68N 單價 90%
T043800128 77 105N 單價 90%
T043800129 78 108N 單價 90%
T043800130 79 無 單價 0%
T043800131 80 5N 單價 5%
T043800133 81 55N 單價 90%
T043800134 82 68N 單價 40%
T043800135 83 108N 單價 90%
T043800136 84 110N 單價 30%
T043800137 85 75T* 單價 95%
T043800138 86 無 單價 0%
T043800139 87 110N 單價 80%
T043800143 88 15N 單價 20%
T043800144 89 19N 單價 80%
T043800145 90 26N 單價 90%
T043800146 91 55N 單價 80%
T043800147 92 68N 單價 30%
T043800148 93 105N 單價 90%
T043800149 94 108N 單價 90%
T043800150 95 無 單價 0%
T043800159 96 1N，3S** 單價 100%
T043800161 97 3N，5T** 單價 10%
T043800178 98 無 二價/N末端 0%
T043800179 99 3N，5T** 二價/N末端 90%
T043800180 100 110N 二價/N末端 99%
T043800181 101 75N 二價/N末端 99%
T043800182 102 75T* 二價/N末端 99%
T043800183 103 5N 二價/N末端 0%
T043800184 104 15N 二價/N末端 40%
T043800185 105 19N 二價/N末端 100%
T043800186 106 26N 二價/N末端 99%
T043800187 107 55N 二價/N末端 99%
T043800188 108 108N 二價/N末端 100%
T043800189 109 無 二價/C末端 0%
T043800190 110 3N，5T** 二價/C末端 99%
T043800191 111 110N 二價/C末端 0%
T043800192 112 75N 二價/C末端 30%
T043800193 113 75T* 二價/C末端 50%
T043800194 114 5N 二價/C末端 0%
T043800195 115 15N 二價/C末端 30%
T043800196 116 19N 二價/C末端 100%
T043800197 117 26N 二價/C末端 99%
T043800198 118 55N 二價/C末端 90%
T043800199 119 68N 二價/C末端 10%
T043800200 120 105N 二價/C末端 90%
T043800201 121 108N 二價/C末端 90%
T043800202 122 無 二價/N末端 0%
T043800203 123 110N 二價/N末端 99%
T043800204 124 75N 二價/N末端 100%
T043800205 125 73N 二價/N末端 100%
T043800206 126 5N 二價/N末端 0%
T043800207 127 15N 二價/N末端 50%
T043800208 128 19N 二價/N末端 99%
T043800209 129 26N 二價/N末端 100%
T043800210 130 55N 二價/N末端 100%
T043800211 131 68N 二價/N末端 100%
T043800212 132 105N 二價/N末端 100%
T043800213 133 108N 二價/N末端 100%
T043800214 134 3N，5T** 二價/N末端 60%
T043800215 135 無 二價/C末端 0%
T043800216 136 110N 二價/C末端 0%
T043800217 137 75N 二價/C末端 40%
T043800218 138 73N 二價/C末端 60%
T043800219 139 5N 二價/C末端 0%
T043800220 140 15N 二價/C末端 50%
T043800221 141 19N 二價/C末端 90%
T043800222 142 26N 二價/C末端 100%
T043800223 143 55N 二價/C末端 80%
T043800224 144 68N 二價/C末端 30%
T043800225 145 105N 二價/C末端 90%
T043800226 146 108N 二價/C末端 80%
T043800227 147 3N，5T** 二價/C末端 50%
T043800228 148 68N 二價/N末端 95%
T043800229 149 105N 二價/N末端 100%
T043800899 177 53N 單價 100%
T043800901 178 53N 單價 95%
T043800902 179 102N 單價 100%
T043800969 180 1N 二價/N末端 10%
T043800970 181 1N 二價/N末端 10%
T043800971 182 1N 二價/C末端 95%
T043800972 183 1N 二價/C末端 90%
T043800973 184 1N 三價/N末端 10%
T043800974 185 1N 三價/中間 0%
T043800975 186 1N 三價/C末端 100%
T043800976 187 53N 二價/N末端 95%
T043800977 188 53N 二價/C末端 5%
T043800978 189 53N 三價/N末端 nd
T043800979 190 73N 三價/N末端 90%
T043800980 191 73N 三價/中間 100%
T043800981 192 102N 二價/N末端 0%
T043800982 193 102N 二價/C末端 0%
T043800983 194 102N 三價/N末端 nd
T043800984 195 102N 三價/中間 nd
T043800985 196 102N 三價/C末端 0%
注釋：N/A代表「不適用」 nd代表「未確定」 * = 實際的醣基化受體位點在位置73，但突變在位置75 ** = 完整的NXS / NXT基序發生突變；實際的醣基化受體位點是Asn。
出人意料的是，諸位發明人發現一些醣基化受體位點僅在一些ISVD格式中和/或在ISVD的某些特定組態中發生醣基化，而其他醣基化受體位點獲得高度醣基化的要求是不同的。
基於進行的醣基化分析得出結論，當ISVD呈單價格式以及呈多價格式時，ISVD中用作醣基化受體位點的以下位置（Kabat編號）具有良好的醣基化程度：1、19、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。然而，出人意料的是，使用存在於多價格式的C末端ISVD中的位置53、68、75、102和110中之一處的醣基化受體位點導致低醣基化程度，而使用不存在於多價格式的C末端ISVD中的這些位置處的醣基化受體位點導致高度醣基化。對於位置102，具體而言，在三價或更高格式中如此。
以相反的方式，對於位置1，觀察到在多價格式中，只有當醣基化受體位點存在於C末端ISVD中時才觀察到高度醣基化。
對於ISVD中位置3和位置15處的醣基化受體位點，觀察到只有當ISVD呈多價格式時才可以獲得高度醣基化。具體而言，對於ISVD中位置15處的醣基化受體位點，觀察到只有當ISVD呈三價或更高格式時才可以獲得高度醣基化。位置76僅在三價格式中測試，並且在該格式中產生高度醣基化。
實例 6 ：熱移位測定
在該測定中，確定ISVD的醣基化是否對熔融溫度有影響。使用以下ISVD：ALB00606（SEQ ID NO: 1）、ALB00607（SEQ ID NO: 2）、ALB00608（SEQ ID NO: 3）、ALB00609（SEQ ID NO: 4）、ALB00610（SEQ ID NO: 5）、ALB00611（SEQ ID NO: 6）、ALB00612（SEQ ID NO: 7）、ALB00616（SEQ ID NO: 11）、ALB00621（SEQ ID NO: 16）、ALB00622（SEQ ID NO: 17）。
其中，ALB00606、ALB00607、ALB00608、ALB00609、ALB00610、ALB00611、ALB00612、ALB00621和ALB00622在大腸桿菌中產生（其中不發生醣基化），並且用作對照。
ALB00616在CHO細胞中產生，因此將發生醣基化，並且用作示例性醣基化ISVD。由於ALB00616的序列與ALB00609的序列相同，這些以不同方式產生的ISVD之間的唯一區別是它們是否被醣基化。
熱移位測定（TSA）在qPCR機器（LightCycler 480II，Roche）上的96孔板中進行。每行，在以下pH範圍內分析一個ISVD：4、5、6、7、8和9。在一些情況下，還包括六種不同的配製緩衝液，即20 mM乙酸鹽（pH 5）、20 mM組胺酸（pH 6）或20 mM磷酸鹽（pH 7），它們含有或不含有8%蔗糖。每孔，將5 µL的ISVD樣品（0.8 mg/mL在D-PBS中）添加至5 µL的Sypro Orange（40×在MilliQ水中；Invitrogen，目錄號S6551）和10 µL的緩衝液（100 mM磷酸鹽、100 mM硼酸鹽、100 mM檸檬酸鹽和115 mM NaCl，pH範圍從4至9）。施加溫度梯度（37ºC至99ºC，速率為0.03ºC/s），這會誘導ISVD的解折疊，並且因此暴露疏水斑塊。Sypro Orange與那些疏水斑塊的結合引起螢光強度的增加，對其進行測量（Ex/Em = 465/580 nm）。螢光強度曲線在pH 7的一階導數的拐點用作熔融溫度（Tm）的量度。
結果
熱測定的結果示於下表4中。
表 4 ：當在大腸桿菌或 CHO 細胞中產生時，測量的 ISVD 的熔融溫度
ISVD ID SEQ ID NO 熔融溫度（ ºC ）
ALB00606 1 71
ALB00607 2 72
ALB00608 3 71
ALB00609 4 74
ALB00610 5 74
ALB00611 6 72
ALB00612 7 74
ALB00616 11 74
ALB00621 16 72
ALB00622 17 74
從表4可以看出，非醣基化ISVD與醣基化ISVD的熔融溫度相同。具體而言，具有相同序列ALB00609（在大腸桿菌中產生的對照ISVD）和ALB00616（在CHO細胞中產生的示例性ISVD）的ISVD顯示出熔融溫度無差異，無論其是否發生醣基化。
因此，可以得出結論，醣基化ISVD的熔融溫度不受所述ISVD的醣基化的影響。
實例 7 ：使用表面等離子體共振對 ISVD/ 人類血清白蛋白相互作用進行的親和力分析
透過表面等離子體共振（SPR）確定ISVD對人類血清白蛋白（HSA）的親和力。對T043800002（SEQ ID NO: 20）、T043800003（SEQ ID NO: 21）、T043800004（SEQ ID NO: 22）、T043800005（SEQ ID NO: 23）、T043800008（SEQ ID NO: 26）和T043800012（SEQ ID NO: 30）進行了測試。使用野生型ISVD T04380001（SEQ ID NO: 19）作為參考。
將HSA（Sigma-Aldrich，目錄號A8763000）直接固定在Biacore 8K(+)儀器上的C1 Biacore晶片的流通池2（FC）上：通過EDC（N-(3-二甲基胺基丙基)-N′-乙基碳化二亞胺，200 mM，Sigma Aldrich，目錄號39391）/NHS（N-羥基琥珀醯亞胺，50 mM，Sigma Aldrich，目錄號130672）的7 min注射啟動晶片，將HSA在10 mM乙酸鹽緩衝液（pH 4.5）中稀釋至4 µg/ml，並且流過FC1的通道1至8以供固定，然後用乙醇胺HCl（1M，Cytiva）進行失活步驟7 min。將啟動、固定和失活期間的流速設為10 µL/min。用ISVD的範圍在1000 nM與1 nM之間的6點稀釋系列建立親和力測定。在1x HBS-EP+緩衝液中，以多循環動力學模式，以30 µL/min流速、120 s締合時間和600 s解離時間來測試各種濃度。每次相互作用分析後的再生條件通過使10 mM的甘胺酸pH 1.5緩衝液以30 µL/min的流速流過晶片表面60 s來進行。使用Biacore insight評價軟體進行資料分析。
結果
測試的ISVD的親和力測量結果可見於下文表5中。
表 5 ： ISVD 對 HSA 的親和力測定（ SPR ）
ISVD ID SEQ ID NO ISVD 中的價 / 突變 K D （ M ）
T04380001（野生型） 19 三價 / C末端 8,40E-09
T043800002 20 三價 / C末端 1,50E-08
T043800004 22 三價 / C末端 1,10E-08
T043800005 23 三價 / C末端 1,30E-08
T043800008 26 三價 / C末端 1,30E-08
T043800012 30 三價 / C末端 1,50E-08
從表5可以看出，醣基化ISVD與野生型參考ISVD的親和力是可比的。這表明醣基化ISVD維持其對其標靶的高親和力。
實例 8 ：使用表面等離子體共振對 ISVD/EGFR 相互作用進行的親和力分析
透過表面等離子體共振（SPR）確定ISVD對EGFR的親和力。對ISVD T043800179（SEQ ID NO: 99）、T043800180（SEQ ID NO: 100）、T043800181（SEQ ID NO: 101）、T043800182（SEQ ID NO: 102）、T043800185（SEQ ID NO: 105）、T043800187（SEQ ID NO: 107）、T043800190（SEQ ID NO: 110）、T043800196（SEQ ID NO: 116）、T043800198（SEQ ID NO: 118）和T043800200（SEQ ID NO: 120）進行了測試。將野生型ISVD T043800178（SEQ ID NO: 98）和T043800189（SEQ ID NO: 109）作為參考。
將EGFR（Sino Biological，目錄號LC14JA1103）直接固定在Biacore 8K(+)儀器上的CM5 Biacore晶片的流通池2（FC）上：通過EDC（N-(3-二甲基胺基丙基)-N′-乙基碳二亞胺，200 mM，Sigma Aldrich，目錄號39391）/NHS（N-羥基琥珀醯亞胺，50 mM，Sigma Aldrich，目錄號130672）的7 min注射啟動晶片，將EGFR在10 mM乙酸鹽緩衝液（pH 4.5）中稀釋至4 µg/ml，並且流過FC1的通道1至8以供固定，然後用乙醇胺HCl（1M，Cytiva）進行失活步驟7 min。將啟動、固定和失活期間的流速設為10 µL/min。用ISVD的範圍在2500 nM與0.06 nM之間的6點稀釋系列建立親和力測定。在1x HBS-EP+緩衝液中，以多循環動力學模式，以30 µL/min流速、120 s締合時間和600 s解離時間來測試各種濃度。每次相互作用分析後的再生條件通過使10 mM的甘胺酸pH 2.5緩衝液以45 µL/min的流速流過晶片表面2次30 s來進行。使用Biacore insight評價軟體進行資料分析。
結果
親和力分析的結果可見於下文表6中。
表 6 ： ISVD 對 EGFR 的親和力測定（ SPR ）
ISVD ID SEQ ID NO ISVD 中的價 / 突變 K D （ M ）
T043800178（野生型） 98 二價/N末端 2,30E-06
T043800179 99 二價/N末端 3,40E-06
T043800180 100 二價/N末端 2,20E-06
T043800181 101 二價/N末端 3,20E-06
T043800182 102 二價/N末端 6,00E-06
T043800185 105 二價/N末端 2,50E-06
T043800187 107 二價/N末端 3,60E-06
T043800189（野生型） 109 二價/C末端 7,50E-06
T043800190 110 二價/C末端 6,40E-05
T043800196 116 二價/C末端 9,30E-06
T043800198 118 二價/C末端 9,00E-06
T043800200 120 二價/C末端 3,20E-05
從表6可以看出，醣基化ISVD的親和力相對於野生型參考ISVD降低了最多4倍，所有ISVD均維持高親和力。這表明醣基化ISVD維持其對其標靶的高親和力。
實例 9 ：使用 Meso Scale Discovery 對 ISVD/ 人類血清白蛋白相互作用進行的親和力分析
透過Meso Scale Discovery（MSD）進一步確定ISVD對HSA的親和力。對ISVD T043800056（SEQ ID NO: 36）、T043800057（SEQ ID NO: 37）、T043800060（SEQ ID NO: 40）、T043800064（SEQ ID NO: 44）、T043800065（SEQ ID NO: 45）、T043800066（SEQ ID NO: 46）、T043800067（SEQ ID NO: 47）、T043800068（SEQ ID NO: 48）、T043800070（SEQ ID NO: 50）、T043800071（SEQ ID NO: 51）、T043800072（SEQ ID NO: 52）、T043800074（SEQ ID NO: 54）、T043800075（SEQ ID NO: 55）、T043800076（SEQ ID NO: 56）、T043800089（SEQ ID NO: 57）、T043800093（SEQ ID NO: 61）和T043800096（SEQ ID NO: 64）進行了測試。將野生型ISVD T043800055（SEQ ID NO: 35）和T043800098（SEQ ID NO: 66）作為參考。
根據製造商的說明書，使用NHS-LC-生物素（ThermoFisher，目錄號21336）將人類血清白蛋白（HSA，Sigma-Aldrich，目錄號A8763000）生物素化，平均標記度為1。將生物素化的HSA以1 µg/mL的濃度捕獲在MSD GOLD 96孔小斑鏈黴親和素SECTOR板（MSD，目錄號L45SA-1）上。隨後，將25 µL預平衡混合物（在室溫下2小時）添加至板中，所述預平衡混合物含有100 pM固定濃度的待測試的ISVD化合物與範圍分別為1.13 pM至10 µM（23個稀釋度，1/3稀釋因子）的HSA。允許將板培育10分鐘以捕獲游離的ISVD化合物，然後用3 x 150 µL PBS + 0.05% Tween-20洗滌。在最終檢測步驟期間，以2 µg/ml的濃度添加25 µL的磺基標籤標記的抗ISVD抗體，並且允許其培育1小時，隨後用150 μL的1x PBS + 0.05% Tween-20進行最終洗滌。添加150 µL的MSD讀取緩衝液（Meso Scale Diagnostics，目錄號R92TG-1）後，在MSD QuickPlex SQ120讀取儀上讀取板。在GraphPad Prism 8中使用四參數邏輯斯諦（4PL）擬合分析資料。
結果
親和力分析的結果可見於下文表7中。
表 7 ： ISVD 對 HSA 的親和力測定（ MSD ）
ISVD ID SEQ ID NO ISVD 中的價 / 突變 K D （ M ）
T043800055（野生型） 35 三價 / N末端 3,10E-09
T043800056 36 三價 / N末端 1,60E-09
T043800057 37 三價 / N末端 2,00E-09
T043800060 40 三價 / N末端 2,30E-09
T043800064 44 三價 / N末端 4,30E-10
T043800065 45 三價 / N末端 5,90E-10
T043800066 46 三價 / N末端 1,60E-09
T043800067 47 三價 / 中間 5,7E-09
T043800068 48 三價 / 中間 4,2E-09
T043800070 50 三價 / 中間 4,7E-09
T043800071 51 三價 / 中間 4,9E-09
T043800072 52 三價 / 中間 4,2E-09
T043800074 54 三價 / 中間 5,8E-09
T043800075 55 三價 / 中間 5,4E-09
T043800076 56 三價 / 中間 2,9E-09
T043800089 57 三價 / N末端 8,8E-10
T043800093 61 三價 / N末端 4,5E-10
T043800096 64 三價 / 中間 5,10E-09
T043800098（野生型） 66 三價 / 中間 2,1E-09
從表7可以看出，醣基化ISVD與野生型參考ISVD的親和力是可比的。這表明醣基化ISVD維持其對其標靶的高親和力。
實例 10 ：使用 Meso Scale Discovery 對 ISVD/TNFα 相互作用進行的親和力分析
透過Meso Scale Discovery（MSD）確定ISVD對TNFα的親和力。對T043800002（SEQ ID NO: 20）、T043800003（SEQ ID NO: 21）、T043800004（SEQ ID NO: 22）、T043800005（SEQ ID NO: 23）、T043800008（SEQ ID NO: 26）、T043800012（SEQ ID NO: 30）和T043800016（SEQ ID NO: 34）進行了測試。使用野生型ISVD T04380001（SEQ ID NO: 19）作為參考。
根據製造商的說明書，使用NHS-LC-生物素（ThermoFisher，目錄號21336）將人TNFα（Bio-techne，目錄號210-TA）生物素化，平均標記度為1。將生物素化的TNFα以0.5 µg/mL的濃度捕獲在MSD GOLD 96孔小斑鏈黴親和素SECTOR板（MSD，目錄號L45SA-1）上。隨後，將25 µL預平衡混合物（在室溫下24小時）添加至板中，所述預平衡混合物含有12.8 pM固定濃度的待測試的ISVD化合物與範圍分別為78 fM至10 µM的TNFα（23個稀釋度，從1 µM至0,01 µM的1/10稀釋因子；從10 nM至78 fM的1/1.8稀釋因子））。允許將板培育10分鐘以捕獲游離的ISVD化合物，然後用3 x 150 µL PBS + 0.05% Tween-20洗滌。在最終檢測步驟期間，以2 ug/ml的濃度添加25 µL的磺基標籤標記的抗ISVD抗體，並且允許其培育1小時，隨後用150 µL的1x PBS + 0.05% Tween-20進行最終洗滌。添加150 µL的MSD讀取緩衝液，在MSD QuickPlex SQ120讀取儀上讀取板。在GraphPad Prism 8中使用四參數邏輯（Four Parameter Logistic，4PL）擬合分析資料。
結果
親和力分析的結果可見於下文表8中。
表 8 ： ISVD 對 TNF 的親和力測定（ MSD ）
ISVD ID SEQ ID NO ISVD 中的價 / 突變 K D （ M ）
T04380001（野生型） 19 三價 / C末端 1,6E-11
T043800002 20 三價 / C末端 1,3E-11
T043800004 22 三價 / C末端 3,4E-11
T043800005 23 三價 / C末端 1,2E-11
T043800008 26 三價 / C末端 1,5E-11
T043800012 30 三價 / C末端 1,6E-11
T043800016 34 三價 / C末端 3,4E-12
從表8可以看出，醣基化ISVD與野生型參考ISVD的親和力是可比的。這表明醣基化ISVD維持其對其標靶的高親和力。
實例 11 ： ISVD 醣蛋白的聚醣譜分析
透過LC-MS進一步分析ISVD醣蛋白T043800002（SEQ ID NO: 20）、T043800004（SEQ ID NO: 22）、T043800005（SEQ ID NO: 23）、T043800006（SEQ ID NO: 24）、T043800008（SEQ ID NO: 26）、T043800012（SEQ ID NO: 30）和T043800016（SEQ ID NO: 34）上的聚醣模式。
根據RapiFluor-MS（Waters）方案製備用於聚醣分析的樣品。在分析之前，使用2.1：1的乙腈：二甲基甲醯胺（Waters）以9：31稀釋樣品。在6545XT LC-QTOF上將樣品與RapiFluor-MS性能測試標準品（Waters）一起分析，其中利用從在水（Fisher）中的25% 50 mM甲酸銨pH 4.4（Waters）至56% 乙腈（Thermo Scientific）的線性梯度，以0.4 mL/min經35分鐘，且將柱（Glycan BEH Amide，Waters）保持在60ºC。使用Genedata Expressionist分析資料。
結果
LC-QTOF上ISVD醣蛋白的聚醣模式的例子示出於圖1和圖2中。所有ISVD醣蛋白均顯示出類似的聚醣種類模式；除了中性聚醣（如G0F、G1F和G2F）外，典型地含有高比例的含有唾液酸的聚醣（如G1FS1、G2FS1和G2FS2）。聚醣種類的量在ISVD醣蛋白之間略有不同。具有一個或兩個唾液酸的唾液酸化種類存在的量最豐富。
實例 12 ：雙 - 甘露糖 6- 磷酸接合
將ISVD醣蛋白T043800005（SEQ ID NO: 23）、T043800002（SEQ ID NO: 20）、T043800124（SEQ ID NO: 73）、T043800125（SEQ ID NO: 74）、T043800126（SEQ ID NO: 75）、T043800127（SEQ ID NO: 76）、T043800128（SEQ ID NO: 77）和T043800129（SEQ ID NO: 78）用於與雙-甘露糖6-磷酸（雙-M6P）接合。
含有聚醣的雙-甘露糖6-磷酸（內部生產的）與醣基化ISVD的接合通過以下方式來完成：首先在100 mM乙酸鈉（Sigma）（pH 5.6）中在4ºC和溫和振盪下將ISVD用高碘酸鈉（Sigma）氧化30分鐘，濃度分別為2.5 mg/mL和20 mM。然後在4ºC下用3%甘油（Sigma）將反應淬滅15分鐘。通過離心最少五次交換經由分子量截留過濾器（Millipore）將ISVD純化到100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中。
在經由Stunner（Unchained Labs）確定蛋白質濃度後，將氧化的ISVD與雙-M6P聚醣在100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中接合。允許反應在室溫和溫和振盪下繼續進行至少16小時。然後通過離心最少五次交換經由分子量截留過濾器將ISVD純化到PBS中。然後經由Stunner確定所得ISVD的濃度和多分散性。然後完成完整質量LC-QTOF和MALDI-TOF以分析接合物（以下描述的方案）。
方案完整質量分析 LC-QTOF
將用於完整質量分析的樣品稀釋至1 mg/mL，然後添加20 mM DTT（終濃度，Sigma）並且在37ºC下培育30分鐘。然後在6545XT LC-QTOF（Agilent）上分析樣品，利用從75%水 + 0.1%甲酸（Fisher）至60%乙腈 + 0.1%甲酸（Fisher）的線性梯度，以0.5 mL/min經7.5分鐘，且將柱（PLRP-S，Agilent）保持在60ºC。使用Expressionist（Genedata）分析資料。
方案 MALDI-TOF 分析
將用於MALDI-TOF的樣品首先用樣品稀釋劑（在水中的0.1%甲酸（Sigma））稀釋至1 mg/mL，然後與基質溶液（在水中的50%乙腈和1%甲酸）1：1混合。將基質稀釋的樣品各自在MALDI靶板（Bruker）上點樣3次，並且允許其在室溫下乾燥。然後在MALDI-TOF儀器（Bruker）上分析樣品重複，並且經由FlexAnalysis軟體（Bruker）分析資料。
結果
具有T043800005的接合物的MALDI-TOF分析可見於圖3。每個ISVD具有一個和兩個雙-M6P的接合物是可見的。獲得每個ISVD 0.9個雙-M6P的平均標記度（DoL）。
具有T043800002的接合物的MALDI-TOF分析可見於圖4。每個ISVD具有一個、兩個和三個雙-M6P的接合物是可見的。獲得每個ISVD 2.1個雙-M6P的平均標記度（average degree of labeling，DoL）。
實例 13 ： PROTAC 接合
將ISVD醣蛋白T043800005（SEQ ID NO: 23）進一步與烷氧基胺-DBCO連接子接合，隨後與PROTAC接合。PROTAC BRD4降解劑-5-CO-PEG3-N3（PROTAC，MedChemExpress）與醣基化ISVD T04380005的接合透過以下方式來完成：首先在100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中將ISVD用高碘酸鈉氧化，濃度分別為2.5 mg/mL和20 mM。允許氧化在4ºC和溫和振盪下繼續進行30分鐘，然後在4ºC下用3%甘油淬滅15分鐘。然後透過離心最少五次交換經由分子量截留過濾器將ISVD純化到100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中。
在經由Stunner確定蛋白質濃度後，然後在100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中將ISVD與胺基氧基-PEG2-雙-PEG3-DBCO（連接子，Conju-Probe）偶聯，兩種材料的終濃度均為2.5 mg/mL。允許反應在室溫和溫和振盪下繼續進行至少16小時。然後透過離心最少五次交換經由分子量截留過濾器將ISVD純化到PBS中。
純化後，經由Stunner確定蛋白質濃度，然後在PBS中將ISVD與PROTAC接合，其終濃度分別為2.5 mg/mL和1.8 mg/mL。允許反應在室溫和溫和振盪下繼續進行至少16小時。然後透過離心最少五次交換經由分子量截留過濾器將ISVD純化到PBS中。然後經由Stunner確定所得ISVD的濃度和多分散性。然後完成SDS-PAGE（以下示出的方案）和實例12中描述的MALDI-TOF方案以分析接合物。
方案 SDS-PAGE
首先將用於SDS-PAGE的樣品在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS，Gibco）中稀釋至1 mg/mL。然後將樣品在70ºC下培育10分鐘。培育後，將樣品與4X NuPAGE LDS樣品緩衝液（Invitrogen）和水混合，然後與PageRuler標準梯（Thermo Scientific）一起載入到4%-12% bis-tris NuPAGE凝膠（Invitrogen）上。在具有Powerease電源供應（Invitrogen）和MES運行緩衝液（Invitrogen）且利用NuPAGE凝膠設置的Xcell Surelock池中運行凝膠。程式完成後，從盒中提取凝膠並且置於InstantBlue染色劑（Abcam）中15分鐘。然後將凝膠在ChemiDoc成像儀和Image Lab軟體（Bio-Rad）中進行視覺化。
結果
根據SDS-PAGE，以0.42的DoL（標記度）觀察到與PROTAC接合。
實例 14 ：聚乙二醇化
將ISVD醣蛋白T043800005（SEQ ID NO: 23）進一步與烷氧基胺功能化的PEG接合。2 kDa胺基氧基-PEG（PEG，BroadPharm）與醣基化ISVD T043800005的接合通過以下方式來完成：首先在100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中在4ºC和溫和振盪下將ISVD用高碘酸鈉氧化30分鐘，濃度分別為2.5 mg/mL和20 mM。然後在4ºC下用3%甘油將反應淬滅15分鐘。然後通過離心最少五次交換經由分子量截留過濾器將ISVD純化到100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中。
在經由Stunner確定蛋白質濃度後，在100 mM乙酸鈉（pH 5.6）中將ISVD聚乙二醇化，濃度分別為2.5 mg/mL和7.5 mg/mL。允許反應在室溫和溫和振盪下繼續進行至少16小時。然後通過離心最少五次經由分子量截留過濾器將ISVD純化到PBS中。然後經由Stunner確定所得ISVD的濃度和多分散性。然後完成SDS-PAGE（實例13中描述的方案）和MALDI-TOF（實例12中描述的方案）以分析接合物。
結果
根據SDS-PAGE，以0.55的DoL觀察到與PEG接合。
實例 15 ：由 ISVD 醣變體媒介的 TNF-α 內化
材料與方法
材料
生物素化的TNF購自R&D systems，而Alexa Fluor™647標記的鏈黴親和素獲自Thermo Fisher Scientific。除非另有說明，否則除了內部生產的雙M6P聚醣外，所有其他化學試劑均購自Millipore Sigma。
ISVD 醣變體的表現和純化
透過引入具有R19N的N-醣基化位點將三價ISVD醣變體T043800005（SEQ ID NO: 23）工程化，並且使用定點誘變產生突變體。ISVD構建體由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞產生。所述方案如實例1和實例4中所述。
與雙 M6P 聚醣的位點特異性 ISVD 接合
基於本領域已知技術進行所述接合。簡言之，在冰上，在磷酸鹽緩衝液（pH 7.2）中將抗TNF ISVD用20 mM高碘酸鈉氧化30分鐘。將氧化反應避光並且用甘油（3% v/v）淬滅15分鐘。透過經由Amicon ®超離心過濾器進行5輪超濾，將氧化的ISVD緩衝液交換為100 mM乙酸鈉（pH 5.6）。然後使脫鹽的ISVD與30倍莫耳過量的雙M6P聚醣在室溫下反應隔夜。使用與關於氧化的ISVD相同的方案通過超濾去除未接合的游離聚醣。
ISVD 表徵
使用LC-MS完整蛋白質分析表徵ISVD和ISVD接合物。所述測定透過在37ºC下用20 mM二硫蘇糖醇將0.1 mg/mL的ISVD或ISVD接合物部分還原30分鐘來進行。用0.1%三氟乙酸淬滅反應，然後將還原的樣品在Agilent 1290/6545XT Q-ToF UPLC/MS系統上運行。
UPLC-MS在55ºC下使用Agilent PLRP柱（2.1 mm x 50 mm，5 µm）來運行，其中使用移動相A（在水中的0.1%甲酸）和移動相B（在乙腈中的0.1%甲酸），m/z範圍為100-9000 Da。使用Expressionist 16.5軟體處理獲得的資料。使用MaxEnt演算法（解析度：1.0 Da，質量範圍20-200 kDa），將每個光譜中最強電荷態用於解卷積。
使用MALDI-TOF MS測量ISVD和ISVD雙M6P接合物的分子量，以確定每個ISVD的雙M6P聚醣的拷貝數。所述分析在Bruker Autoflex III上運行。使用線性陽性模式，在用與芥子酸基質混合的ISVD或接合物樣品點樣的靶板上確定完整蛋白質質量。每個樣品的資料以一式三份獲得。通過以下方式計算每個ISVD接合的雙M6P聚醣的數量：從接合物的分子量減去ISVD的分子量，然後將所述差值除以聚醣的分子量。
在Water ACQUITY UPLC H級PLUS Bio系統上進行尺寸排阻超高效液相層析（SEC-UPLC）。在室溫下在Superdex 200 increase 10/300 gl柱上分離ISVD或雙M6P接合的ISVD（約5 µg），其中流速為0.3 mL/分鐘，在等度條件下，使用PBS（pH 7.2）作為移動相。
透過流式細胞術表徵目的蛋白（ POI ）內化
在補充有10%胎牛血清、2 mM l-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉、0.1 mM非必需胺基酸、100 U/ml青黴素、100 µg/ml鏈黴素、0.25 µg/mL兩性黴素B、55 µM 2-巰基乙醇和10 mM HEPES（均來自Gibco）的RPMI 1640中培養Jurkat細胞或K562細胞（ATCC）。將它們以1 x 10 5個細胞/孔鋪板於U形底96孔板中。
分別以50 nM和100 nM的終濃度依序添加生物素化的重組人TNF-α和用Alexa Fluor TM647標記的鏈黴親和素。隨後以0.78-50 nM之間的各種濃度引入ISVD T043800005或雙M6P接合的ISVD。
將細胞在37ºC下培養1或4小時後，將其用冷的磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）（pH 7.2）洗滌兩次，然後進行流式細胞術以評估含有Alexa Fluor TM的TNF複合物的螢光。
通過蛋白質印跡表徵 POI 降解
將K562細胞或Jurkat細胞以1 x 10 5個細胞/孔鋪板於U形底96孔板中。以25 nM的終濃度依序添加重組人類TNF-α（50 nM，Peprotech）和抗TNF ISVD（T043800005）或雙M6P接合的ISVD。
將細胞在37ºC下培養2小時後，將其用培養基洗滌兩次並且用RIPA緩衝液（Boston BioProducts）裂解。將一些細胞在DMSO或100 nM巴佛洛黴素A1（InvivoGen）存在下保持再培養4或24小時。
在每個時間點，將細胞用冷PBS洗滌兩次並且用RIPA緩衝液裂解。使用Jess（ProteinSimple）用製備的裂解物進行蛋白質印跡以檢測TNF-α或β-肌動蛋白，其使用抗TNF（殖株D5G9，Cell Signaling Technology）和隨後的抗兔檢測模組（ProteinSimple）或抗β-肌動蛋白（殖株8H10D10，Cell Signaling Technology）和隨後的抗小鼠檢測模組（ProteinSimple）。
為了在內化後測量培養基上清液中的TNF-α，在37ºC下用50 nM的TNF-α和25 nM的ISVD或雙M6P接合的ISVD處理K562細胞（1 x 10 5個細胞/孔）。
在培育期期間，在不同時間點（24、48和72小時）收集培養基上清液，並且用如上所提及的ISVD或接合物進行蛋白質印跡。
結果
透過MALDI-TOF MS確定，醣基化的ISVD中每個ISVD含有一個拷貝的雙M6P。
含有與單個引入的N-醣基化位點附接的大約1個雙M6P的ISVD接合物在Jurkat細胞或K562細胞中有效誘導TNF-α內化（圖5）。
雙M6P接合的ISVD構建體在培育1和4小時後顯示出劑量依賴性TNF-α內化，而在50 nM的高ISVD濃度下觀察到內化減少，這可能是由鉤狀效應（hook effect）所致（圖6）。
這透過細胞裂解物（圖7A）和上清液（圖7B）的蛋白質印跡分析得到進一步證實。內化的TNF-α的量在培育後4小時已經相當低，並且在培育後22小時檢測不到。巴佛洛黴素A1的添加在4和22小時顯著延遲了TNF-α降解，表明在溶酶體中發生經由雙M6P接合的ISVD的TNF-α降解。還確定了細胞培養基中剩餘的TNF-α的量。儘管源自僅用對照抗TNF ISVD處理的人K562細胞的培養上清液中的TNF-α水準幾乎沒有變化，但在將細胞與雙M6P接合的ISVD一起培育24至72小時期間，TNF-α的量顯著降低。
這顯示由具有一個拷貝的雙M6P的ISVD醣變體媒介的TNF-α內化是有效的，從而表明一個ISVD上的單個雙M6P足以在溶酶體中誘導可溶性POI的內化和降解。
下表示出了本文公開的序列：
ISVD ID SEQ ID NO 序列
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T043800013 31 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTNVTVSS
T043800014 32 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTALYYCTIGGSLSRSSQGTLVNVSS
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5GS連接子 150 GGGGS
9GS連接子 151 GGGGSGGGS
15GS連接子 152 GGGGSGGGGSGGGGS
35GS連接子 153 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
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C末端序列 156 VQVSS
C末端序列 157 VTVKS
C末端序列 158 VTVQS
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無
圖 1示出了醣基化ISVD T043800005透過LC-QTOF測量的聚醣譜。
圖 2示出了醣基化ISVD T043800002透過LC-QTOF測量的聚醣譜。
圖 3示出了如實例12中所描述的ISVD T043800005與雙-甘露糖-6-的接合物的MALDI-TOF測量磷酸結果。
圖 4示出了如實例12中所描述的ISVD T043800002與雙-甘露糖-6-磷酸的接合物的MALDI-TOF測量結果。
圖 5示出了用於評估在用TNF複合物和抗TNF ISVD或雙M6P-抗TNF ISVD接合物以不同濃度處理1小時和4小時後，Jurkat細胞（ A）或K562細胞（ B）中的TNF內化的流式細胞術測量結果。
圖 6示出了Jurkat細胞（ A）或K562細胞（ B）中平均螢光強度（mean fluorescence intensity，MFI）的增加倍數，其表明雙M6P-抗TNF ISVD接合物超過僅抗TNF ISVD的TNF內化。
圖 7示出了在以下條件下，在不同的時間點用抗TNF ISVD或雙M6P-抗TNF ISVD處理後，TNF-α的蛋白質印跡： （ A ）在細胞裂解物中，在37ºC下在K562細胞或Jurkat細胞中內化2 h，隨後用或不用巴佛洛黴素（bafilomycin）處理4 h和24 h後，以及 （ B ）在來自相同K562細胞培養物的上清液中。
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Claims (47)

  1. 一種多肽，該多肽包含重鏈免疫球蛋白單可變結構域（ISVD）或（基本上）由其組成，其中該ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  2. 如請求項1所述的多肽，其中該醣基化受體位點是N-醣基化位點。
  3. 如請求項1或2所述的多肽，其中該醣基化受體位點包含在NXT或NXS基序中，其中X可以是任何胺基酸，並且其中該NXT或NXS基序的天門冬醯胺酸殘基是該醣基化受體位點。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的多肽，其中該醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
  5. 如請求項1至3中任一項所述的多肽，其中該醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、26、55、73、105和108。
  6. 如請求項1至3中任一項所述的多肽，其中該醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
  7. 如請求項6所述的多肽，其中該多肽是單價多肽，該單價多肽包含一個ISVD或（基本上）由其組成。
  8. 一種多肽，該多肽包含一個ISVD或（基本上）由其組成，其中該ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  9. 如請求項8所述的多肽，其中該醣基化受體位點存在於以下胺基酸位置，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、26、53、55、68、73、75、102、105、108和110。
  10. 如請求項1至3中任一項所述的多肽，其中該多肽包含至少兩個ISVD。
  11. 如請求項10所述的多肽，其中該至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  12. 如請求項10所述的多肽，其中該至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
  13. 如請求項10所述的多肽，其中該至少兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、26、55、105和108。
  14. 如請求項10所述的多肽，其中該多肽是二價多肽，該二價多肽包含兩個ISVD或（基本上）由其組成。
  15. 如請求項14所述的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
  16. 如請求項14所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、26、55、105和108。
  17. 如請求項14所述的多肽，其中該兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、26、55、105和108。
  18. 一種多肽，該多肽包含兩個ISVD或（基本上）由其組成，其中該兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26、53、55、68、73、75、76、105、108和110。
  19. 如請求項18所述的多肽，其中該兩個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、26、55、105和108。
  20. 如請求項18所述的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
  21. 如請求項18所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、26、55、105和108。
  22. 一種多肽，該多肽包含兩個ISVD或（基本上）由其組成，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、26、53、55、68、73、75、105、108和110。
  23. 一種多肽，該多肽包含兩個ISVD或（基本上）由其組成，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、26、55、105和108。
  24. 如請求項1至3中任一項所述的多肽，其中該多肽包含至少三個ISVD。
  25. 如請求項24所述的多肽，其中該至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  26. 如請求項24所述的多肽，其中該至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、15、26和105。
  27. 如請求項24至26中任一項所述的多肽，其中該多肽是三價多肽，該三價多肽包含三個ISVD或（基本上）由其組成的。
  28. 如請求項24、25或27所述的多肽，其中N末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、15、26、55、73、75、76、105、108和110。
  29. 如請求項24、25或27所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26和105。
  30. 如請求項24、25或27所述的多肽，其中該至少三個ISVD中既不在C末端也不在N末端的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  31. 一種多肽，該多肽包含至少三個ISVD或（基本上）由其組成，其中該至少三個ISVD中的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  32. 如請求項31所述的多肽，其中N末端ISVD包含位於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、15、26、55、73、75、76、105、108和110。
  33. 如請求項31所述的多肽，其中C末端ISVD包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、1、3、15、26和105。
  34. 如請求項31所述的多肽，其中該至少三個ISVD中既不在C末端也不在N末端的至少一個包含存在於以下胺基酸位置處的醣基化受體位點，該胺基酸位置選自根據Kabat編號的胺基酸位置19、3、15、26、53、55、68、73、75、76、102、105、108和110。
  35. 如請求項31至34中任一項所述的多肽，其中該多肽是三價多肽，該三價多肽包含三個ISVD或（基本上）由其組成。
  36. 如請求項1至35中任一項所述的多肽，該多肽在該醣基化受體位點處被一個或多個聚醣醣基化。
  37. 如請求項36所述的多肽，其中該聚醣選自末端N-乙醯基葡糖胺（N-acetyl glucosamine，GlcNAc）、（末端）甘露糖、（末端）唾液酸、（末端）半乳糖或其組合。
  38. 一種核苷酸序列或核酸，其編碼如請求項1至37中任一項所述的多肽。
  39. 如請求項38所述的核苷酸序列或核酸，該核苷酸序列或核酸被最佳化用於在宿主細胞或宿主生物體中表現，該宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化由該核苷酸序列或核酸編碼的多肽。
  40. 如請求項38或39所述的核苷酸序列或核酸，該核苷酸序列或核酸呈可以在宿主細胞或宿主生物體中表現的構建體或（表現）載體的形式，該宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化由該核苷酸序列或核酸編碼的多肽。
  41. 一種用於產生如請求項1至37中任一項所述的多肽的方法，其中該方法包括以下步驟： - 在合適的宿主細胞或宿主生物體中表現如請求項38至40中任一項所述的核苷酸序列或核酸， 其中該宿主細胞或宿主生物體能夠醣基化表現的多肽。
  42. 一種用於將部分與如請求項1至37中任一項所述的多肽接合的方法，該方法包括以下步驟： - 該多肽上存在的一個或多個聚醣的氧化，視情況地使用高碘酸鹽氧化；以及 - 使該經氧化的聚醣與該部分的接合。
  43. 如請求項42所述的方法，其中該部分選自(雙-)甘露糖-6-磷酸、PROTAC和PEG部分。
  44. 一種接合物，該接合物包含如請求項1至37中任一項所述的多肽和接合部分，其中該部分與該聚醣接合。
  45. 如請求項44所述的接合物，其中該部分選自(雙-)甘露糖-6-磷酸、PROTAC和PEG部分。
  46. 一種組成物，該組成物包含如請求項1至37中任一項所述的多肽、使用如請求項42或43所述的方法產生的多肽或如請求項44或45所述的接合物。
  47. 如請求項1至37中任一項所述的多肽、如請求項38至40中任一項所述的核苷酸序列或核酸、如請求項44或45所述的接合物或如請求項46所述的組成物，用作藥劑。
TW113117040A 2023-05-08 2024-05-08 免疫球蛋白單可變結構域的醣基化 TW202509060A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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DE69330523D1 (de) 1992-08-21 2001-09-06 Vrije Universiteit Brussel Bru Immunoglobuline ohne leichte ketten
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BR9813276A (pt) 1997-10-27 2000-08-22 Unilever Nv Proteìna multivalente de ligação de antìgeno, sequências de nucleotìdeos, vetor de expressão, célula hospedeira, processo para preparação de proteìna multivalente de ligação de antìgeno, e, uso da mesma
DE602004017726D1 (de) 2003-06-30 2008-12-24 Domantis Ltd Pegylierte Single-domain-antikörper (dAb)
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
WO2010040736A2 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against il18 and/or the il-18 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and/or disorders associated with il-18 mediated signaling
DK2723769T4 (da) 2011-06-23 2022-09-05 Ablynx Nv Teknikker til at forudsige, påvise og reducere uspecifik proteininterferens i assays, som involverer variable immunglobulin-enkeltdomæner
WO2013036748A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Berry, Lana, L. Bicyclo[6.1.0]non-4-yne reagents for chemical modification of oligonucleotides
HRP20230690T1 (hr) 2012-10-23 2023-10-13 Synaffix B.V. Modificirano antitijelo, konjugat antitijela i postupak za njihovo pripremanje
US9987373B2 (en) 2013-10-14 2018-06-05 Synaffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
IL295534B2 (en) 2014-05-16 2025-03-01 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable sites
EP3134128B1 (en) 2014-10-03 2019-06-05 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation
WO2016150845A1 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Ablynx Nv Glycosylated immunoglobulin single variable domains
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