TW202509058A

TW202509058A - 抗豬感染之多價疫苗

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Publication number: TW202509058A
Application number: TW113131539A
Authority: TW
Inventors: 維吉法辛格; 史蒂芬戈齊奧; 普雷本莫騰森
Original assignee: 法商西華動物藥品股份有限公司
Priority date: 2023-08-24
Filing date: 2024-08-22
Publication date: 2025-03-01
Also published as: WO2025040792A1

Abstract

本揭露係關於多價疫苗組成物及其在保護豬隻及其後代免於大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)、梭菌屬(Clostridium spp.)、豬小病毒(porcine parvovirus)、及紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathie, E. rhusiopathie)感染中之用途，較佳地採用新投予方案對豬及其後代進行被動及主動免疫。

Description

抗豬感染之多價疫苗

本揭露係關於多價疫苗組成物及其在保護豬隻及其後代免於大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)、梭菌屬(Clostridium spp.)、豬小病毒(porcine parvovirus)、及紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathie, E. rhusiopathie)感染中之用途，較佳的是具有用於豬及其後代的被動及主動免疫新投予方案。

豬隻生產佔全球蛋白質總消耗量超過四分之一。傳染病影響豬隻健康及全球養豬業之生產力。母豬及其後代中最常見的病原體包括小病毒、紅班丹毒絲菌、鉤端螺旋體屬、沙門桿菌屬、胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、PRRSV、PCV2、A型流感病毒、致病性大腸桿菌、及梭菌屬。

母豬及小母豬(gilt)在其一生中藉由多次注射不同的疫苗來接種針對此等不同病原體之疫苗。疫苗介導之保護作用會隨時間而減弱，因此主動及被動免疫所需的最大保護時間有所不同。用以主動保護母豬及小母豬免於疾病（諸如丹毒及小病毒）之疫苗通常在首次授精前投予，小母豬通常在授精前6至3週之間投予，母豬在授精前3週至一天之間投予，加強疫苗接種通常在各個週期的受精前1天至3週投予，或每6個月進行一次大規模疫苗接種。藉由此等疫苗接種排程，可確保在妊娠期間達到保護，因為許多上述病原體與母豬繁殖障礙及流產相關聯（亦即需要在妊娠期間提供保護）。

疫苗亦可用於被動免疫。事實上，幼年時期之母源免疫性對於新生豬之被動保護至關重要。一般而言，用於仔豬之被動免疫的疫苗（例如針對由梭菌屬或大腸桿菌引起之新生豬腹瀉）在母豬分娩前7至2週之間投予兩次，而加強疫苗接種通常在母豬分娩前4至2週之間投予一次，藉由仔豬攝取初乳為仔豬提供被動免疫保護。

多價疫苗能夠透過一次注射同時賦予對不同病原體或疾病之免疫力，作為保護動物最容易管理的解決方案。事實上，所欲的是在單一疫苗中注射所有必需的抗原，使得疫苗接種程序對動物之創傷及疼痛更小，對從業者而言更省時且更易於管理。儘管一些組合疫苗已成功開發，但在體內同時誘導之二或多種抗原特異性免疫反應之間可能會發生免疫干擾。

此外，需要闡明注射多價疫苗之最適當時機，以便為豬及其後代提供有效的主動及被動免疫保護。

仍需要開發一種安全有效的多價疫苗，可在豬隻中投予，經由主動免疫提供保護，並透過攝取初乳之被動免疫為仔豬提供保護。

本發明人表明，投予多價疫苗可有效保護雌性豬免於大腸桿菌、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、小病毒、及丹毒感染。此種多價疫苗對接種疫苗之雌性豬沒有負面影響，並藉由主動免疫保護接種疫苗之雌性豬免於紅斑丹毒絲菌、豬小病毒、大腸桿菌、及梭菌屬感染，以及透過攝取初乳保護動物後代。

因此，本發明人出乎意料地表明，儘管存在免疫干擾，但包含9種不同抗原/類毒素之多價疫苗在仔豬中具有安全性及血清學可偵測的功效，且對小母豬及母豬有效。本申請案中製備之此種多價疫苗之功效及安全性的證明將允許修改豬之疫苗接種規程，並藉由減少對豬之創傷而極大地促進豬之疫苗接種。

此外，相比於適用於被動或主動免疫且需要對豬進行多次注射的典型投予方案，本申請案之發明人首次開發一種用於初級疫苗接種之新投予方案，其允許同時進行主動及被動免疫兩者，且非常有效。因此，此種高效率的新投予方案可減少注射次數並有助於豬之疫苗接種。

本發明係關於一種疫苗組成物，其包含： i) 大腸桿菌菌毛黏附素抗原， ii) 梭菌類毒素， iii) 豬小病毒抗原，較佳地不活化豬小病毒，更較佳地不活化豬小病毒K22株，及 iv) 紅斑丹毒絲菌抗原，較佳地不活化紅斑丹毒絲菌。

在一較佳實施例中，該大腸桿菌菌毛黏附素抗原係選自由下列所組成之群組：F4ab、F4ac、F5、F6、F41、F17、F18、F165、CS1541、及CS31A抗原，較佳地F4ab、F4ac、F5、及F6抗原，更佳地該組成物包含大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原。

在一具體實施例中，該梭菌類毒素抗原係產氣莢膜梭菌類毒素抗原，較佳地選自由下列所組成之群組：產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、產氣莢膜梭菌C型β1類毒素、產氣莢膜梭菌A型或C型腸毒素(CPE)、及產氣莢膜梭菌（所有菌株）θ類毒素（產氣莢膜梭菌溶素(Perfringolysin)，PFO），較佳地，該組成物包含產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素。

在一較佳實施例中，該疫苗組成物包含佐劑，較佳地氫氧化鋁佐劑。

在一更佳實施例中，根據本發明之疫苗組成物包含： i) 大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原， ii) 產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素， iii) 不活化豬小病毒，及 iv) 不活化紅斑丹毒絲菌細菌。

在另一態樣中，本發明係關於如上所述之疫苗組成物，其用於保護豬及其後代免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染。

在一較佳實施例中，本發明係關於如上所述之疫苗組成物，其用於保護雌性豬（較佳地小母豬及其後代）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染，其中，該組成物在授精前至少兩次且在授精至分娩之間的時間間隔內至少一次投予於雌性豬（較佳地小母豬），較佳地，該組成物在授精前不大於10週（較佳地在授精前不大於9、8、7、6、5週）投予至少兩次，且較佳地在授精前的兩次投予之間間隔至少兩週，且在分娩前不大於4週、較佳地不大於3週、更佳地不大於2週投予至少一次。

在更佳的實施例中，該組成物在授精前10至4週之間、較佳地9至4週之間、8至4週之間、或更佳地7至5週之間投予至少一次，在授精前6至1週之間、較佳地5至1週之間、或4至1週之間、更佳地3至2週之間投予至少一次，且在分娩前6至1週之間、較佳地5至1週之間、4至1週之間、更佳地3至2週之間投予至少一次。

在一較佳實施例中，該疫苗組成物係藉由肌內、皮內、經皮、或皮下途徑投予，更佳地藉由肌內途徑投予。在一具體實施例中，在向雌性豬投予疫苗組成物之前將免疫有效量的該大腸桿菌菌毛黏附素抗原、梭菌類毒素、豬小病毒抗原、及紅斑丹毒絲菌抗原進行混合。

疫苗組成物

本發明人已證明，可預防大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒(porcine Parvovirus, PPV)、及丹毒感染之包含9種不同抗原/類毒素之多價疫苗組成物在仔豬中具有安全性及血清學可偵測的功效，且對小母豬及母豬有效。

本揭露係關於一種疫苗組成物，其包含： i) 大腸桿菌菌毛黏附素抗原， ii) 梭菌類毒素， iii) 豬小病毒抗原，及 iv) 紅斑丹毒絲菌細菌抗原。

疫苗組成物係可安全投予於對象動物之醫藥組成物，並在投予於對象時引發針對病原微生物之免疫反應，亦即誘導針對微生物之成功保護。疫苗組成物包含具有抗原特性之分子，諸如免疫原性多肽。

根據本揭露，疫苗組成物包含大腸桿菌抗原、梭菌類毒素、豬小病毒(PPV)抗原、及紅斑丹毒絲菌抗原。

大腸桿菌係革蘭氏陰性、兼性厭氧、桿狀、埃希氏菌屬之大腸桿菌群。腸毒性大腸桿菌(ETEC)感染之關鍵毒力因子係黏附素，亦稱為移生因子及腸毒素。菌毛黏附素使其等能夠黏附或移生於空腸及迴腸之吸收性上皮細胞。

根據本揭露，疫苗組成物至少包含大腸桿菌抗原，較佳地大腸桿菌菌毛黏附素抗原，更佳地選自由下列所組成之群組：F4ab（K88ab，UniProtKB - P02970，最後修改於2022年5月25日）、F4ac（K88ac，UniProtKB - P14190，最後修改於2020年5月25日）、F5（K99，UniProtKB - P18103，最後修改於2022年5月25日）、F6（987P，UniProtKB - P21413，最後修改於2022年5月25日）、F41（F7，UniProtKB - P11900，最後修改於2022年5月25日）、F17（F17a-g，UniProtKB –各別係Q99003、Q47200、Q47033、Q47199、Q9RH92、Q9RH91、Q47341，最後修改於2022年5月25日）、F18（UniProtKB - Q47212，最後修改於2021年6月2日）、F165（UniProtKB - Q46685，最後修改於2022年5月25日）、CS1541(Crotty D. et al. Dev Biol. 2020 Mar 1; 459(1):11-12)、及CS31A (Song Li et al. Vet Med Sci. 2020 Feb;6(1):69-75)。

與致病性相關聯之菌毛常見抗原類型係F4ab、F4ac、F5 (K99)、F6、F41 (F7)、及F18。新生兒感染通常由F4ab、F4ac、F5、及F6菌株引起，而斷乳後大腸桿菌病幾乎總是由F4及F18菌株引起（參見Vet Rec. 2002 Janl2; 150(2): 35-7）。

在一較佳實施例中，疫苗組成物包含一或多種大腸桿菌抗原，其等係選自菌毛黏附素F4ab (K88ab)、F4ac (K88ac)、F5 (K99)、F6 (987P)、F41 (F7)、及F18抗原。在一更佳實施例中，根據本揭露之疫苗組成物包含大腸桿菌F4ab (K88ab)、F4ac (K88ac)、及F5 (K99)、及F6 (987P)抗原。

根據本揭露，該醫藥組成物進一步包含至少一種梭菌抗原。

梭菌屬係革蘭氏陽性菌之屬。此屬包括數種重要的人類病原體，包括肉毒桿菌中毒及破傷風之致病因子(causative agent)。此屬包括腹瀉之重要原因，困難梭菌(Clostridium difficile)。根據本揭露，梭菌屬可作為非限制性實例：肉毒桿菌、破傷風梭菌、困難梭菌、或產氣莢膜梭菌，較佳地困難梭菌或產氣莢膜梭菌，更佳地產氣莢膜梭菌。

產氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)（以前稱為 Bacillus aerogenes capsulatus、 Bacillus perfringens、 Bacillus welchii或 Clostridium welchii）係革蘭氏陽性、形成孢子、厭氧、桿狀細菌。產氣莢膜梭菌根據主要毒素之產生，分為A至E不同的生物型。

產氣莢膜梭菌產生以下毒素：α毒素亦稱為磷脂酶C、溶血素、卵磷脂酶、或磷脂醯膽鹼磷酸水解酶（UniProtKB - Q0TV31，最後修改於2022年5月25日）；β1毒素（UniProtKB - Q46181，最後修改於2022年5月25日）；ε毒素（UniProtKB - Q02307，最後修改於2022年5月25日）；ι毒素（NCBI參考序列：WP_003463422.1，最後更新於2019年7月29日）；β2毒素（UniProtKB - O86264，最後更新於2021年6月2日）；θ毒素亦稱為產氣莢膜梭菌溶素O (PFO)或硫醇活化之溶細胞素（UniProtKB - P0C2E9，最後修改於2022年5月25日）；Mu毒素亦稱為透明質酸葡萄糖胺酶（UniProtKB - P26831，最後修改於2022年5月25日）；δ毒素亦稱為α溶血素（UniProtKB - B8QGZ7，最後修改於2022年5月25日）；kappa毒素亦稱為膠原蛋白酶A（UniProtKB - P43153，最後修改於2022年5月25日）；lambda毒素（UniProtKB - Q46237，最後修改於2022年5月25日）；梭菌腸毒素(CPE)亦稱為不耐熱腸毒素B鏈（UniProtKB - P01558，最後修改於2022年5月25日）；及壞死性腸炎B樣毒素(NetB)（UniProtKB - A0A2P0ZHP7，最後修改於2022年5月25日）。

如本文中所使用，用語「類毒素(toxoid)」係指已藉由化學（例如戊二醛）、分子、或熱處理使其毒性不活化或抑制而同時維持免疫原性之不活化毒素。在疫苗接種期間使用時，會產生免疫反應，並針對類毒素之分子標記形成免疫記憶，而不會導致毒素誘導之疾病。大多數類毒素具有與其等來源之上述毒素相同的多肽序列。類毒素可自大腸桿菌中單離出來，或藉由DNA重組產生。

根據本揭露之梭菌類毒素（例如產氣莢膜梭菌）可衍生自由梭菌菌株編碼之任何天然毒素。其中，菌株可選自野外菌株、收集菌株、或基因改造菌株。不同的類毒素可自相同菌株獲得，例如A型α及β2類毒素，或自不同菌株獲得。替代地，根據本揭露之產氣莢膜梭菌類毒素可藉由重組DNA方法來獲得。

類毒素可藉由化學（例如戊二醛）、分子、或熱處理獲得，特別是藉由化學處理、蛋白酶裂解、藉由製造毒素片段或突變（例如點突變）之重組DNA方法、或藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知的常規方法熱處理對應的毒素。具體地，使用EDTA或戊二醛處理係用於不活化本發明之細菌類毒素的合適化學不活化劑之實例。其他化學不活化劑係福馬林或甲醛。不活化可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的標準方法執行。在一個實施例中，EDTA較佳地用於α類毒素之製備，且戊二醛用於β1及β2類毒素之製備。

產氣莢膜梭菌A型感染係導致豬腸道疾病、新生仔豬及其他動物腹瀉之常見原因。產氣莢膜梭菌A型主要產生α毒素，同時產生或不產生β2毒素。產氣莢膜梭菌C型菌株會導致新生仔豬發生嚴重且致命的壞死性腸炎(NE)，且定義為攜帶兩種毒素基因 cpa（編碼α-毒素或CPA）、 cpb1（編碼β1-毒素）。

在一較佳實施例中，根據本揭露之疫苗組成物包含產氣莢膜梭菌A型抗原及/或產氣莢膜梭菌C型抗原，較佳地產氣莢膜梭菌A型類毒素及/或產氣莢膜梭菌C型類毒素。

在一較佳實施例中，該疫苗組成物包含至少一種選自由下列所組成之群組的抗原：產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素，更佳地，該疫苗組成物包含產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素。

本揭露之疫苗組成物進一步包含豬小病毒抗原。

豬小病毒(PPV)係一種小型ssDNA二十面體無外膜病毒，基因體DNA長5 kbp，屬於小病毒科、細小病毒亞科、及原小病毒屬。

該PPV可分為不同的基因型PPV1至PPV7，基於該些基因型作為小病毒科內的單獨屬的不同特徵將其等進一步分類。在一較佳實施例中，根據本揭露之疫苗組成物包含PPV1。

根據本揭露，疫苗組成物包含不活化或減毒活豬小病毒，較佳地不活化豬小病毒。

任何PPV菌株可用作本揭露之抗原來源。其中，菌株可選自野外菌株、收集菌株、或基因改造菌株。在一具體實施例中，作為非限制性實例，該疫苗組成物可包含小病毒株中之任一種，包括：NADL-2、MSV、Kresse、143a、27a、或K22。在一較佳實施例中，該疫苗組成物包含不活化豬小病毒K22株。

該不活化PPV可藉由所屬技術領域已知的任何方法進行失活，包括熱處理或化學處理，例如藉由添加福馬林、BEI（二元伸乙亞胺）或具有類似此等試劑之性質的其他化學試劑。

該疫苗組成物可包含減毒活PPV，其一般藉由在組織培養細胞中繼代而經改變，以減弱其引起疾病之能力，但當投予於動物時維持其預防疾病或感染之能力。

在另一實施例中，該疫苗組成物可包含次單元抗原，諸如表位、蛋白質、多醣、多肽、或肽，或抗原之一部分（亦稱為片段），其可直接投予於對象或藉由投予於該對象之病毒或細菌載體表現。次單元抗原亦可以VLP之形式存在。

在一較佳實施例中，該次單元抗原可係PPV主要結構蛋白質，諸如VP1及/或VP2殼體蛋白。該次單元抗原可以包含VP2蛋白質之病毒樣粒子(VLP)之形式存在，其組裝成與原始病毒體在尺寸及形態上類似的VLP。

本揭露之疫苗組成物進一步包含紅斑丹毒絲菌抗原。

紅斑丹毒絲菌係一種革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性、桿狀、不形成孢子、不抗酸、不動的細菌。

根據本揭露，該疫苗組成物可包含選自由下列所組成之群組的紅斑丹毒絲菌抗原：紅斑丹毒絲菌減毒活細菌、紅斑丹毒絲菌不活化細菌（亦稱為紅斑丹毒絲菌菌苗）、或紅斑丹毒絲菌細菌次單元抗原，其包括以下作為非限制性實例：SpaA、cbpB、rspaA、GAPDH、HP0728、HP1472、CpbA、及ERT2T-A抗原。

任何紅斑丹毒絲菌可用作本揭露之抗原來源。在一具體實施例中，該疫苗組成物可包含紅斑丹毒絲菌細菌血清型1或2抗原。

任何紅斑丹毒絲菌可用作本揭露之抗原來源。在一較佳實施例中，該紅斑丹毒絲菌株係紅斑丹毒絲菌IM950菌株。

在一較佳實施例中，該疫苗組成物包含不活化紅斑丹毒絲菌細菌，較佳地不活化紅斑丹毒絲菌血清型2細菌。該不活化紅斑丹毒絲菌可藉由所屬技術領域已知的任何方法進行失活，包括熱處理或化學處理，例如藉由添加硫柳汞(thiomersal)或具有類似此等試劑之性質的其他化學試劑。

在一較佳實施例中，該疫苗組成物包含： i) 大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原， ii) 產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌C型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素， iii) 不活化豬小病毒，及 iv) 不活化紅斑丹毒絲菌細菌。

根據本揭露之疫苗組成物可包含如上所述的該抗原與醫藥上可接受之載體（即生物相容性介質）（亦即投予之後不會在對象動物中誘導顯著不良反應之介質）組合，能夠在投予疫苗之後向宿主動物之免疫系統呈現抗原。此類醫藥上可接受之載體可例如係含有水及/或任何其他生物相容性溶劑之液體，或諸如通常用於獲得冷凍乾燥疫苗（基於糖及/或蛋白質）之固體載體，可選地包含免疫刺激劑（佐劑）。可選地，取決於疫苗之預期用途或所需特性添加其他物質，諸如穩定劑、黏度改質劑、或其他組分。

在一較佳實施例中，根據本揭露之疫苗組成物可包含佐劑。如所屬技術領域眾所周知的，佐劑係免疫系統之非特異性刺激劑，其與抗原一起投予，增強免疫反應。所屬技術領域熟知的習知佐劑係例如弗氏(Freund's)完全佐劑及不完全佐劑、氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁、二氧化矽、高嶺土、膨潤土、油乳液（諸如水包油(O/W)、水包油包水乳液(W/O/W)、油包水(W/O)）、生育醇-α、維生素E、非離子嵌段聚合物、胞壁醯二肽、Quill A ^®、礦物油（例如Bayol ^®或Markol ^®；Drakeol ^®）、植物油、及卡波姆(carbomer)、或其組合。在一較佳實施例中，該佐劑係氫氧化鋁。可將佐劑摻入如上所述之疫苗組成物中以增強其效力。替代地，可在投予本發明之疫苗之前或之後投予佐劑。 疾病預防用途

在另一態樣中，本揭露係關於如上所述之疫苗組成物，其用於保護有需要之對象免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染。

如本文中所使用，「免於感染之保護(protection of an infection)」係指由於刺激對該微生物之免疫反應而引起對抗微生物之保護，預防、改善與病原體感染或由該感染引起之病症相關聯的一或多種臨床徵象，例如預防或減少由病原體感染引起之一或多種臨床徵象，或在特定實施例中，降低與該病原體感染相關聯的死亡率。

豬小病毒(PPV)感染可導致母豬之繁殖障礙。其特徵在於出現大量木乃伊胎、回情數增加、窩仔數少、分娩失敗、分娩率下降、及很少流產。豬小病毒感染(PPV)在大多數豬群中流行，且可能是導致豬隻繁殖障礙之最常見的感染原因。

困難梭菌係一種引起結腸感染之細菌。症狀範圍自腹瀉到危及生命之結腸損傷。

產氣莢膜梭菌A型引起卡他性(katarrhalic)腸炎，導致奶油色糊狀腹瀉（死亡率低），而產氣莢膜梭菌C型引起出血壞死性腸炎，導致特發性、急性、或慢性血性腹瀉，死亡率高。兩種感染皆係口腔感染，且皆在出生時發生，生物體在小腸及大腸之最後部分迅速達到非常高的數目。產氣莢膜梭菌C型之β1毒素迅速破壞小腸內壁細胞，使血液流失到腸道導致死亡。產氣莢膜梭菌A型之α及β2毒素引起小腸分泌液體，及一些發炎及腹瀉。其亦可能達到高數目並導致哺乳仔豬腹瀉。

紅斑丹毒絲菌感染引起稱為丹毒之疾病，可能影響多種動物。丹毒描述一種主要見於生長豬之急性細菌性疾病，臨床特徵係例如敗血症、皮膚紅斑（包括特徵性菱形病灶）、敗血症、關節炎、心內膜炎、休克、或死亡。

大腸桿菌常見於溫血生物腸道下部，係豬隻多種疾病之致病因子，亦係全球哺乳仔豬及斷乳豬死亡之重要原因。腸道大腸桿菌病涉及兩種主要致病型：腸毒性大腸桿菌(ETEC)及腸病性大腸桿菌(EPEC)。ETEC係豬最重要的致病型。大腸桿菌感染，特別是腸毒性大腸桿菌(ETEC)感染係造成農場動物（特別是新生仔豬、哺乳仔豬、以及斷乳後仔豬）水樣腹瀉之原因，並與生長速度降低、發病率、及死亡率相關聯。

如本文中所使用，用語「宿主(host)」或「對象(subject)」意指需要投予本發明之免疫性組成物或疫苗之目標個體，其中包括易於用本發明之組成物疫苗接種之人類、哺乳動物、家畜、或任何其他動物物種。較佳地，哺乳動物係豬物種，更佳地係豬，又更佳地係母豬。

如本文中所使用，用語「豬(pig)」或「豬(swine)」意指豬物種，包括但不限於任何年齡或處於其生產週期之任何階段的豬、公豬、母豬、小母豬、及仔豬。根據本揭露，該豬較佳地係雌性豬。該雌性豬可係母豬或小母豬。在一較佳實施例中，該豬係小母豬。小母豬係指尚未分娩之雌性豬。一旦豬產下一窩並經過第一年，稱為母豬。

本發明人判定根據本揭露之多價疫苗組成物用於初次疫苗接種的最適當投予時機，藉由主動免疫為已接種疫苗之小母豬或母豬（較佳地小母豬及其後代）經由攝取初乳而賦予對不同病原體之同時免疫力。

初次疫苗接種係指給予對象以建立對特定疾病之免疫力的起始一系列疫苗劑量。劑量次數及劑量時間可能會取決於特定疫苗及個體年齡而有所不同。

此後，當免疫力及臨床保護力隨時間而下降到低於該群體視為足夠的水平時，可向已完成初次疫苗接種系列的該已接種疫苗之雌性豬（例如小母豬）投予加強劑量。

本揭露係關於如上所述之疫苗組成物，其用於保護雌性豬（較佳地小母豬及其後代）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染，其中，該組成物在授精前至少兩次且在授精至分娩之間的時間間隔內至少一次投予於該雌性豬（較佳地小母豬）。

根據一較佳實施例，該組成物投予於小母豬時，疫苗組成物作為初次疫苗接種在第一次授精前至少兩次且在第一次授精與第一次分娩之間的時間間隔內至少一次投予於該小母豬。

「授精(insemination)」係指自然或人工授精。人工授精係將精液插入並遞送到雌性豬（小母豬或母豬）之生殖道。最常見的人工授精方法係將精液遞送到子宮頸。

「分娩(farrowing)」係指產下一窩豬之程序。

「授精前幾週(weeks before insemination)」或「分娩前幾週(weeks before farrowing)」各別意指與雌性豬之荷爾蒙繁殖週期有關的預期自然或人工授精日期及預期產仔豬日期。

在一具體實施例中，該組成物在授精前不大於10週（較佳地在授精前不大於9、8、7、6、5週）投予至少兩次，且較佳地在授精前的兩次投予之間間隔至少兩週，且在分娩前不大於4週、較佳地不大於3週、更佳地不大於2週投予至少一次，以用於初次疫苗接種。

在一較佳實施例中，投予該疫苗組成物用於初次疫苗接種： - 在授精前10至1週之間、較佳地在8至1週之間至少兩次，且較佳地在授精前的兩次投予之間間隔至少兩週， - 且在分娩前6至1週之間、較佳地4至1週之間至少一次。

在一具體實施例中，在該初次疫苗接種過程之後，在各次後續分娩前6至1週之間、較佳地4至1週之間、又更佳地3至2週之間進行一次加強疫苗接種。

在一較佳實施例中，投予該疫苗組成物： - 在授精前10至4週之間、較佳地在9至4週之間、更佳地在8至4週之間、又更佳地在授精前7至5週之間至少一次， - 在授精前6至1週之間、較佳地在授精前5至1週之間、4至1週之間、更佳地在授精前3至2週之間至少一次，及 - 在分娩前6至1週之間、較佳地在分娩前5至1週之間、或4至1週之間、又更佳地在分娩前3至2週之間至少一次。

在另一具體實施例中，該疫苗組成物作為初次疫苗接種在授精前投予兩次，其中兩次注射間隔2、3、或4週執行，且第二次注射在授精前至少1週、較佳地在授精前2或3週、甚至更佳地在授精前4週投予，且該疫苗組成物作為加強劑在分娩前4至1週之間、較佳地在分娩前3至1週、更佳地在分娩前2週投予至少一次。

在一具體實施例中，在該初次疫苗接種過程之後，在各次後續分娩前6至1週之間、較佳地5至1週之間、或4至1週之間、又更佳地6至1週之間、較佳地5至1週之間、或4至1週之間、再更佳地在每次後續分娩前3至2週之間進行一次加強疫苗接種。

在一具體實施例中，本揭露係關於如上所述之疫苗組成物用於製備用於保護有需要之雌性豬（較佳地小母豬）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染之藥劑中的用途。在另一具體實施例中，本揭露係關於如上所述之疫苗組成物用於製備用於保護有需要之雌性豬（較佳地小母豬及其後代）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染之藥劑中的用途，其中該組成物如上所述投予。

在另一具體實施例中，本揭露係關於一種用於保護有需要之雌性豬（較佳地小母豬）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染的方法，其包含在該對象中投予免疫有效量的如上所述之疫苗組成物。

如本文中所使用，「免疫有效量(immunologically effective amount)」係指在對象中誘導免疫反應所需的抗原之量，倘若相較於未免疫豬感染野生型感染因子（亦即紅斑丹毒絲菌、大腸桿菌、豬小病毒、或梭菌屬）所引起之病理效應，其降低感染或由野生型感染因子感染所引起之病理效應。免疫有效量可由通常知識者經由所屬技術領域習知的常規方法建立，例如藉由向接種疫苗之動物投予實驗性攻擊感染(challenge infection)，接著判定目標動物之病理評分、攝取量、疾病之臨床徵象、血清學參數，或藉由測量病原體之重新分離，之後將此等結果與在現場感染之豬中觀察到的結果進行比較。

本發明之疫苗可藉由任何合適的投予途徑投予，包括腸胃外投予，例如透過注射入或穿透皮膚之所有途徑，例如肌內、靜脈內、腹膜內、皮內、黏膜下、或皮下，但一般經調適，亦即適合於肌內注射。在一較佳實施例中，該疫苗組成物係藉由肌內途徑投予。

在一具體實施例中，在向雌性豬投予疫苗組成物之前，將免疫有效量的該大腸桿菌抗原（例如大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原）、產氣莢膜梭菌類毒素（例如產氣莢膜梭菌A型α類毒素、A型β2類毒素、及C型β1類毒素）、豬小病毒（例如不活化豬小病毒）、及紅斑丹毒絲菌細菌（例如不活化紅斑丹毒絲菌細菌）混合。在一較佳實施例中，不同抗原在投予前混合不大於48小時、較佳地不大於24小時、更佳地不大於10小時、較佳地在投予前1至10小時之間。

在一個實施例中，根據本揭露之該疫苗組成物可以所屬技術領域中具有通常知識者熟知的可獲得保護性免疫之劑量（諸如可商購疫苗所指示之劑量）投予於豬以保護其免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染。

劑量可藉由常規實驗建立，並取決於所選抗原之免疫性特性以及所需的保護程度。在一具體實施例中，如本申請案之實例中所說明，包含該抗原之可商購疫苗在投予於豬之前被混合。實例 實例1 ：仔豬中之安全性及功效研究

第一項研究之目的係探討聯合使用兩種疫苗進行主動或被動免疫是否對疫苗接種後之安全性或誘導之抗體水平具有任何影響。仔豬在9週齡時接種疫苗。選擇其等係因為其等不含針對各別抗原之抗體，且因為預期母豬或幼仔豬之免疫反應不會彼此不同。此外，由於此年齡層之動物相比母豬體重較輕，因此觀察到任何可能的安全性反應之機率較高。

此研究之目的係評估ENTEROPORC Coli AC與商業批次PARVORUVAX混合後對仔豬進行疫苗接種（兩次疫苗接種，間隔3週）之功效及安全性。第1組（n=10隻動物）接受ENTEROPORC Coli AC及PARVORUVAX (IVP)疫苗之混合物；第2組（n=10隻動物）接受ENTEROPORC Coli AC (CP1)；及第3組接受PARVORUVAX (CP2)。

所有動物皆接種兩次疫苗。第一次疫苗接種日係研究第0天，第二次疫苗接種日係研究第21天。在疫苗接種當天及第二次疫苗接種之後14天（研究第35天）自動物身上採集血液樣本，以證實疫苗接種引起之抗體水平之增加。評估注射部位之局部反應直到各次疫苗接種後14天。在各次疫苗接種前一天、疫苗接種當天（疫苗接種之前）、疫苗接種後的2、4、及6 h、及之後每天一次記錄直腸溫度，各別記錄到第一次疫苗接種後7天及第二次疫苗接種後4天。在整個研究過程中，每天檢查一般健康狀況。研究在動物最後一次採血（研究第35天）之後終止。在疫苗接種之前（研究第0天）及第二次疫苗接種之後2週（研究第35天）測量對各種疫苗抗原之血清反應。 1.1 材料與方法-動物

此研究使用30頭仔豬，並在9週齡+/- 3天時第一次接種疫苗。

定期監測豬群動物。該些動物來自於已知不含以下的母豬：A型流感病毒、PRRS、豬肺炎支原體、假性狂犬病、豬瘟病毒、以及部分呈陽性的PCV2、大腸桿菌(ETEC)、及多殺性巴氏桿菌。 -疫苗

為了證明組合疫苗之功效，使用來自IDT Biologika GmbH及Ceva Santé Animale之兩種註冊產品ENTEROPORC Coli AC及PARVORUVAX。

研究中獸醫產品(investigational Veterinary Product, IVP)係ENTEROPORC Coli AC（包含大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原及產氣莢膜梭菌A型α類毒素、A型β2類毒素、及C型β1類毒素）與PARVORUVAX（包含不活化紅斑丹毒絲菌細菌及不活化豬小病毒）混合。PARVORUVAX產品亦可以品牌名稱PARVORUVAC出現於市場上，兩種產品具有相同的組分，僅註冊商標名稱不同。

CP1及CP2各別對應於單獨的對照ENTEROPORC Coli AC及單獨的PARVORUVAX。

將Enteroporc COLI（3 x 10劑量= 67.5 ml）轉移至100 ml無菌Schott燒瓶中。自其中丟棄15 ml Enteroporc COLI懸浮液，將剩餘的52.5 ml ENTEROPORC Coli懸浮液用於重新懸浮ENTEROPORC AC之冷凍乾燥物（25劑量）。將約5 ml的ENTEROPORC Coli懸浮液轉移至含有ENTEROPORC AC冷凍乾燥物之小瓶中來執行混合。將小瓶溫和振盪，並將內容物重新轉移至無菌Schott燒瓶中。此程序再重複一次。將25.0 ml重組疫苗與25.0 ml PARVORUVAX（即用型疫苗）混合以達到50.0 ml的IVP。將最終疫苗儲存於2至8℃下直到疫苗接種，並在回溶之後2小時內使用。

藉由肌內途徑在頸部右側及左側對動物進行疫苗接種。

所有研究動物在兩天內接受2 x 4 ml的各別治療。投予期間未發生誤服情形。動物技術員每天觀察所有動物之整體健康狀況，以積極確認動物是否健康。 -直腸體溫

在事件排程中指示之時間點使用校準溫度計測量直腸體溫。 -注射部位之檢查

在疫苗接種之前及事件排程中指示之日期，根據標準程序檢查注射部位。注射針插入處之病灶及該病灶周圍0.1 cm之區域不視為相關的局部反應，因此既不記錄顏色變化也不記錄腫脹。藉由卡尺測量腫脹之大小（長度及寬度）及顏色變化（紅色）。

評分系統描述於表 1，用於評定注射部位之發紅及灼熱。

範圍	評分
發紅	0 =無發紅 1 =輕微發紅（略微發紅） 2 =中度發紅（微紅） 3 =嚴重發紅（紫色）
灼熱	0 =未偵測到灼熱 1 =偵測到灼熱

表1 ：注射部位評分系統-樣本收集及儲存

自頸靜脈收集血液樣本（約5至8 ml），不添加抗凝血劑。自凝固之血液樣本中製備血清。樣本未經熱失活。在使用之前，將血清儲存於-15℃至-25℃下。採血與儲存之時間間隔不超過24小時。 -ELISA測試

將96孔微孔盤(MTP)塗佈與各別抗原特異性結合之單株抗體。藉由酶聯抗豬IgG抗體偵測抗體，並藉由測量450及620奈米處之光密度來偵測酶依賴性顏色變化。 1.2 結果

使用單獨的Enteroporc COLI AC或Enteroporc COLI AC加Parvoruvax進行疫苗接種之組中，在疫苗接種當天的直腸溫度略微增加。直腸溫度之增加在此兩組中沒有差異（圖 2 及圖3）。

同時使用Enteroporc COLI AC及Parvoruvax所產生之抗丹毒及小病毒抗體與單獨使用Parvoruvax時相當（圖 4）。相較於Enteroporc COLI AC組，聯合使用組針對大腸桿菌抗原之抗體反應略低，但仍高於先前已證實可保護小母豬及其後代之抗體力價。

總之，在安全性及（血清）功效方面，相較於單獨使用，在疫苗接種2次混合物後，未觀察到混合物Enteroporc COLI AC與PARVORUVAC之相關干擾。 實例2 ：母豬中之安全性及功效研究

第二項研究之目的係確認母豬之仔豬結果。IVP組之母豬在授精前6週及3週接受混合疫苗Enteroporc Coli AC與Parvoruvax，且在分娩前2週接受單獨的Enteroporc COLI AC。疫苗之混合係在疫苗接種之前執行的。此研究中使用之疫苗組成物及分析方法類似於第一實例中所使用者。

CP組之母豬在授精前6週及3週接受Parvoruvax疫苗。

在各次疫苗接種之第-1天、第0天、第0+4h天、第0+6h天、以及隨後四天測量直腸溫度。在各次疫苗接種之後的14天內檢查局部及全身性反應。

在第一次疫苗接種前14天、第二次疫苗接種當天（研究第21天）、授精前（研究第44天）、及分娩後4天（研究第167天）測量血清反應。此外，對初乳中之抗體力價進行判定。

接種Enteroporc COLI AC加Parvoruvax之組在疫苗接種當天直腸溫度略微增加，但在兩種疫苗之各別SPC給出之可接受範圍內（圖 5 ）。

對於兩個接種疫苗之組，皆未觀察到局部及全身性反應。同時使用Enteroporc COLI AC及Parvoruvax所產生之抗丹毒及小病毒抗體與單獨使用Parvoruvax時相當。出乎意料的是，相較於單獨使用Enteroporc COLI AC，血液及初乳中針對大腸桿菌及梭菌屬抗原之抗體反應明顯高於保護性抗體力價（圖 6）。總之，此等結果指示同時使用大腸桿菌、梭菌屬、小病毒、及紅斑丹毒絲菌之9種不同抗原對小母豬及母豬係安全且有效的，並透過攝取初乳為仔豬提供保護。

無

［圖 1］疫苗之習知方案（上）與新方案（下）的比較［圖 2］仔豬在第一次疫苗接種之後的平均直腸體溫。［圖 3］仔豬在第二次疫苗接種之後的平均直腸溫度。［圖 4］仔豬在疫苗接種之後第0天及第35天時仔豬血液中之抗體力價。［圖 5］母豬在疫苗接種後的直腸體溫。［圖 6］在疫苗接種之前及之後不同天數下母豬血液及初乳中之抗體力價。

Claims

一種疫苗組成物，其包含： i) 大腸桿菌菌毛黏附素抗原， ii) 梭菌類毒素， iii) 豬小病毒抗原，及 iv) 紅斑丹毒絲菌抗原。
如請求項1之疫苗組成物，其中該大腸桿菌菌毛黏附素抗原係選自由下列所組成之群組：F4ab、F4ac、F5、F6、F41、F17、F18、F165、CS1541、及CS31A抗原。
如請求項2之疫苗組成物，其中該組成物包含大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原。
如請求項1至3中任一項之疫苗組成物，其中，該梭菌類毒素係選自由下列所組成之群組：困難梭菌、產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、產氣莢膜梭菌C型β1類毒素、產氣莢膜梭菌A型或C型腸毒素(CPE)、及產氣莢膜梭菌（所有菌株）θ類毒素（產氣莢膜梭菌溶素(Perfringolysin)，PFO）。
如請求項4之疫苗組成物，其中該組成物包含產氣莢膜梭菌A型或C型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素。
如請求項1至5中任一項之疫苗組成物，其中該紅斑丹毒絲菌抗原係不活化紅斑丹毒絲菌。
如請求項1至6中任一項之疫苗組成物，其中該豬小病毒抗原係不活化豬小病毒。
如請求項1至7中任一項之疫苗組成物，其包含不活化豬小病毒K22株。
如前述請求項中任一項之疫苗組成物，其包含佐劑，較佳地氫氧化鋁佐劑。
如前述請求項中任一項之疫苗組成物，其包含： i) 大腸桿菌菌毛黏附素F4ab、F4ac、F5、及F6抗原， ii) 產氣莢膜梭菌A型α類毒素、產氣莢膜梭菌A型β2類毒素、及產氣莢膜梭菌C型β1類毒素， iii) 不活化豬小病毒，及 iv) 不活化紅斑丹毒絲菌血清型2細菌。
如請求項1至10中任一項之疫苗組成物，其用於保護有需要之豬（較佳地雌性豬及其後代）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染。
如請求項1至10中任一項之疫苗組成物，其用於保護有需要之雌性豬（較佳地小母豬及其後代）免於大腸桿菌、梭菌屬、豬小病毒、及紅斑丹毒絲菌感染，其中，該組成物在授精前至少兩次且在授精至分娩之間的時間間隔內至少一次投予於該雌性豬（較佳地小母豬）。
如請求項12之用途的疫苗組成物，其中，該組成物在授精前不大於10週投予至少兩次，且較佳地在授精前的兩次投予之間間隔至少兩週，且在分娩前不大於4週投予至少一次，較佳地 - 在授精前10至4週之間、較佳地8至6週之間投予至少一次， - 在授精前6至1週、較佳地5至2週投予至少一次，且 - 在分娩前6至1週、較佳地4至2週投予至少一次。
如請求項11至13中任一項之用途的疫苗組成物，其中在向雌性豬投予疫苗組成物之前將免疫有效量的該大腸桿菌菌毛黏附素抗原、梭菌抗原、豬小病毒抗原、及紅斑丹毒絲菌抗原進行混合。
如請求項11至14中任一項之用途的疫苗組成物，其中該疫苗組成物係藉由肌內途徑、皮下、皮內、或經皮途徑，較佳地肌內途徑投予。