TW202506726A - 雙特異性工程化抗體 - Google Patents

Abstract

本文提供了一種多特異性抗體，其含有能夠結合第一靶標的兩個抗原結合臂和能夠結合第二靶標的至少一個抗原結合臂。該多特異性抗體包含引入重鏈和輕鏈介面中的λ電荷對，以減少鏈錯配。

Description

雙特異性工程化抗體

本揭露關於多特異性抗體，其含有能夠結合第一靶標的兩個抗原結合臂和能夠結合第二靶標的一個抗原結合臂，其中該多特異性抗體包含引入重鏈和輕鏈的介面中的λ電荷對，作為減少鏈錯配的策略。本揭露還關於產生該等多特異性抗體之方法及其治療性用途。

識別兩種不同表位的雙特異性抗體在診斷性和治療性應用中越來越受到關注，並且可以支持單特異性抗體所不具備的新型作用機制。然而，它們的生成也面臨著挑戰。在一個細胞中表現的兩種抗體的重鏈和輕鏈進行混雜配對，可能會產生幾種不同的分子，其中只有一種具有雙特異性，而其餘的配對產生的是非功能性或單特異性分子。

已經開發出多種策略來嘗試克服這一問題並促進期望的雙特異性抗體的正確組裝。用於促進兩條不同重鏈進行異二聚化的這樣的策略包括諸如「杵入臼（knobs-into-hole）」等技術（Ridgway 1990）。用於規避輕鏈錯配的策略包括使用共同輕鏈（Merchant 1998）、結構域交換（Schaefer 2011）、以及將天然二硫鍵替換為鏈間二硫鍵（Mazor 2015）。

二價雙特異性形式的一個實例係WO 2013/096291中描述的「DuetMab」。DuetMab抗體分子採用杵入臼技術對兩條不同的重鏈進行異二聚化，並藉由將CH1-CL介面之一中的天然二硫鍵替換為工程化二硫鍵來提高同源重鏈和輕鏈配對的效力。不對稱三價雙特異性形式的一個實例係「2+1」形式，其中雙特異性抗體含有三個抗原結合臂，其中兩個結合相同的表位，第三個結合不同的表位。

儘管上述策略已在一定程度上減少了鏈錯配，但仍然需要另外的機制來改進雙特異性抗體中多肽鏈的配對並促進其高效產生。

在一些方面，本揭露關於「2+1」形式的雙特異性抗體中鏈配對的改進，其中該雙特異性抗體含有能夠結合第一表位的第一抗原結合臂和能夠結合不同於第一表位的第二表位的兩個抗原結合臂（第二和第三抗原結合臂）。在這種「2+1」形式中，第三抗原結合臂與第一或第二抗原結合臂融合（例如，通過各自重鏈結構域中結構域之間的肽連接子融合）。

藉由將電荷對引入λ輕鏈（LC）和重鏈（HC）介面中，可以改進HC和LC的配對。然而，為κLC和CH1介面設計的電荷對在應用於λLC和CH1介面時不太可能成功。鑒定了在可以引入電荷對的λLC和HC之間介面處的胺基酸殘基，證明引入該等λ電荷對可以有利於改進鏈配對，優於在先前DuetMab雙特異性形式中所實現的效果。

進一步明確所鑒定的λ電荷對可用於改進「2+1」雙特異性形式中的配對。如本文所證明的，含有λ電荷對的2+1雙特異性抗體被很好地表現，顯示出高水平（＞ 90%）的正確鏈配對，並且具有良好的分子穩定性。此外，證明含有λ電荷對和單價靶向T細胞上CD3且二價靶向另一（非T細胞）靶標的抗原結合臂的2+1雙特異性抗體在T細胞細胞毒性測定中引發強活性，高於與兩種靶標均單價結合的雙特異性抗體所達到的活性。因此，在一些方面，在2+1雙特異性抗體中，只有單個抗原結合結構域與CD3結合，並被稱為雙特異性T細胞銜接器DuetMab（「TED2」）。

因此，在一個方面，本文提供了一種雙特異性抗體，其包含： (a)    第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈；和 (b)   第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈， (c)    第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈， 其中該第一抗原結合臂結合第一表位，該第二和第三抗原結合臂結合第二表位， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂或該第二和第三抗原結合臂包含位於輕鏈的恒定輕鏈λ區（CLλ）和CH1中以下位置對中一或多對處的λ電荷對： (i)    CLλ中的位置117和CH1中的位置141； (ii)   CLλ中的位置117和CH1中的位置185； (iii)  CLλ中的位置119和CH1中的位置128； (iv)  CLλ中的位置134和CH1中的位置128； (v)   CLλ中的位置134和CH1中的位置145； (vi)  CLλ中的位置134和CH1中的位置183； (vii) CLλ中的位置136和CH1中的位置185； (viii) CLλ中的位置178和CH1中的位置173；以及 (ix)  CLλ中的位置117和CH1中的位置187， 其中該λ電荷對包含位於該λ電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於該λ電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基，並且 其中編號係根據EU索引進行的。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置141處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對選自上述列表中的a.至e.。在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.、b.和e.中的任一項。在一些方面，λ電荷對選自上述列表中的a.和b.。在一些方面，λ電荷對係在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置185處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置119和CH1中的位置128處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置128處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置145處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置183處。在一些方面，λ電荷對係在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸或絲胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置136和CH1中的位置185處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置178和CH1中的位置173處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸。

在一些方面，第一抗原結合臂包含λ電荷對，而第二和第三抗原結合臂不包含相同的λ電荷對。在其他方面，第二和第三抗原結合臂均包含相同的λ電荷對，而第一抗原結合臂不包含相同的λ電荷對。

如本文進一步所述，可以將λ電荷對與用於促進輕鏈配對的其他途徑組合，例如以便進一步提高期望的多特異性抗體的正確組裝。

在一些方面，將多特異性抗體在CH1-CL介面之一中的天然鏈間二硫鍵替換為工程化鏈間二硫鍵。在一些方面： (i)    該第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間，而該第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接均形成於天然半胱胺酸對之間；或者 (ii)   該第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接均形成於經工程化到該第二輕鏈與該第二CH1以及第三輕鏈與第三CH1兩者中的半胱胺酸對之間，而該第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間。

在一些方面，經工程化到輕鏈和CH1中的半胱胺酸對位於該輕鏈的位置122和該CH1的位置126處，並且其中該輕鏈在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。

在一些方面，CLλ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。SEQ ID NO: 1提供了示例性野生型（天然的）CLλ，而SEQ ID NO: 2提供了將其中參與天然鏈間二硫鍵的半胱胺酸替換為工程化半胱胺酸以形成工程化二硫鍵的示例性CLλ。

在一些方面，CH1包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。SEQ ID NO: 4提供了示例性野生型（天然的）CH1，而SEQ ID NO: 5提供了將其中參與天然鏈間二硫鍵的半胱胺酸替換為工程化半胱胺酸以形成工程化二硫鍵的示例性CH1。

在一些方面，一或多個抗原結合臂中缺乏λ電荷對的一條或多條輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）。如本文所述，使用不同的輕鏈（λ和κ）係有利的，因為這樣允許使用諸如輕鏈親和層析之類的方法來選擇性純化那些含有正確輕鏈的多特異性抗體。在多特異性抗體中包含κ輕鏈還允許包含κ電荷對，這可以促進第二CH1:CLκ多肽的配對。

在一些方面，包含具有CLκ的輕鏈的一或多個抗原結合臂包含位於該一或多個抗原結合臂的CLκ和CH1中的κ電荷對，其中該κ電荷對包含位於該κ電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於該κ電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基。

在一些方面，κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於CLκ的位置133處，而κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於同一抗原結合臂中對應CH1的位置183處。在一些方面，在該CLκ的位置133處的帶負電荷的胺基酸殘基係麩胺酸，並且其中在同一抗原結合臂中對應CH1的位置183處的帶正電荷的胺基酸殘基係離胺酸。

在一些方面，CLκ包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

在一些方面，雙特異性抗體以「2+2」形式提供，包含第四抗原結合臂，該第四抗原結合臂包含與第四CH1藉由二硫鍵連接的第四輕鏈。第四抗原結合臂與第一抗原結合臂結合相同的表位，因此第一和第四抗原結合臂結合第一表位，第二和第三抗原結合臂結合第二表位。因此，在2+2形式中，雙特異性抗體包含結合一個表位的兩個結合臂和結合不同表位的兩個結合臂。與第一抗原結合臂一樣，第四抗原結合臂也包含λ電荷對，即第一和第四抗原結合臂都包含λ電荷對。

在一些方面，第二和第三輕鏈係相同的（即它們具有相同的胺基酸序列）。

在一些方面，第一抗原結合臂和/或第二抗原結合臂包含Fc區。在一些方面，第一抗原結合臂包含第一Fc區並且第二抗原結合臂包含第二Fc區。可以使用多種策略來促進兩條重鏈的異二聚化（即，含有第一CH1和第一Fc區的第一重鏈與含有第二CH1和第二Fc區的第二重鏈的異二聚化）。

在一些方面，第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾。在一些方面，該等修飾位於Fc區的CH3中。

在一些方面，第一和第二Fc區之一的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較大側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成凸起（杵），而另一Fc區的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較小側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成空腔（臼），視需要其中含有凸起（杵）的CH3結構域係第一重鏈多肽的一部分，並且含有空腔（臼）的CH3結構域係第二重鏈的一部分。

在一些方面，其中形成杵的取代係在位置366處取代為色胺酸，而形成臼的取代係作為以下中一或多項的形成臼的取代： i)      在位置407處取代為纈胺酸； ii)     在位置366處取代為絲胺酸；以及 iii)    在位置368處取代為丙胺酸。

在一些方面，含有該凸起（杵）的CH3結構域包含在位置354處的半胱胺酸，並且含有該空腔（臼）的CH3結構域包含在位置349處的半胱胺酸。

在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之工程化二硫化物、κ電荷對和促進異二聚化的Fc修飾中任何一或多種的組合。例如，在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之工程化二硫化物的組合。在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之κ電荷對的組合。在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之促進異二聚化的Fc修飾的組合。在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之工程化二硫化物和促進異二聚化的Fc修飾的組合。在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之κ電荷對和促進異二聚化的Fc修飾的組合。在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之工程化二硫化物和促進異二聚化的Fc修飾的組合。在一些方面，多特異性抗體包含λ電荷對與本文所述之工程化二硫化物、κ電荷對和促進異二聚化的Fc修飾的組合。

在一些方面，第一抗原結合臂與CD3上的表位結合。

在一些方面，多特異性抗體進一步包含另外的抗原結合結構域，視需要其中該另外的抗原結合結構域係VHH。除了「2+1」雙特異性之外，包含另外的抗原結合結構域允許產生三特異性抗體。此外，使用VHH作為抗原結合結構域之一減少了三特異性抗體生產過程中存在的重鏈和輕鏈的數量，因此從生產角度來看，與包含含有另外的VH、VL和CH1的另外抗原結合臂相比可能是有利的。

在一些方面，另外的抗原結合結構域（例如VHH）能夠結合CD8上的表位。在一些方面，第一抗原結合臂能夠結合CD3，並且另外的抗原結合結構域（例如，VHH）能夠結合CD8上的表位。不希望受理論束縛，據信在多特異性抗體中包括能夠結合CD8的抗原結合結構域（例如，VHH）允許優先活化CD8 ⁺T細胞，這可以改進治療功效。

因此，可將該形式稱為四特異性T細胞銜接器DuetMab（「TED4」），並且在一些方面該形式包含結合相同靶標的兩個抗原結合結構域。在一些方面，TED4形式包含結合相同或不同抗原靶標的兩個抗原結合結構域、CD3結合結構域和CD8結合結構域。

在一些方面，抗原1/抗原2/CD3 TriMab的抗原結合臂之一能夠結合抗原1或抗原2上不會誘導細胞毒性的表位。在一些方面，抗原1/抗原2/CD3 TriMab的抗原1結合臂會誘導細胞毒性，並且抗原2結合臂將作為錨定臂，無法在僅表現抗原2的細胞中誘導細胞毒性。在一些方面，抗原1/抗原2/CD3 TriMab的抗原2結合臂會誘導細胞毒性，並且抗原1結合臂將作為錨定臂，無法在僅表現抗原1的細胞中誘導細胞毒性。錨定臂無法誘導細胞毒性可能是由於例如與膜遠端表位的結合，從而使其不能形成活性免疫突觸。

本文還提供了一種產生本文所述之多特異性抗體之方法。在一些方面，該方法包括 a)  在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1； b) 使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並使該第一結合臂與該第二結合臂配對，從而形成該多特異性抗體；以及 c)  從該宿主細胞中純化該多特異性抗體。

在一些方面，該方法包括產生多特異性抗體，該方法包括在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1；其中使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，其中使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，其中使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並且其中使該第一結合臂與該第二和第三結合臂配對，從而形成該多特異性抗體；以及從該宿主細胞中純化該多特異性抗體。

在一些方面，純化多特異性抗體包括親和層析。在一些方面，純化多特異性抗體包括輕鏈親和層析。

在一些方面，在純化多特異性抗體後，少於25%、少於20%、少於15%、或少於10%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%、或少於1%的輕鏈會發生錯配。在一些方面，少於10%的輕鏈會發生錯配。在一些方面，少於5%的輕鏈會發生錯配。本文描述了用於確定錯配百分比的合適方法。

本文還提供了編碼本文所述之多特異性抗體的一或多種核酸。本文還提供了一種包含一或多種核酸或載體的分離的宿主細胞。

本文還提供了藥物組成物和涉及該等藥物組成物或多特異性抗體的治療方法，如下文進一步描述。

本揭露包括所描述的方面和特徵的組合，除非明顯不容許或明確避免這樣的組合的情況外。

現在將參考附圖來討論本揭露的各方面。對於熟悉該項技術者而言，另外的各方面將是顯而易見的。此文本中提及的所有文件均藉由引用併入本文。

如下文更充分討論的，本文提供了包含λ電荷對的「2+1」形式的多特異性抗體（例如，雙特異性抗體），該等λ電荷對位於多特異性抗體的一或多個結合臂中恒定輕鏈λ區（CLλ）和重鏈恒定區1（CH1）中的某些位置對處。本文還提供了多特異性抗體，其除了「2+1」雙特異性的抗原結合臂之外，還包含另外的抗原結合結構域（例如，VHH）。

用於產生多特異性抗體的方法係已知的。然而，這類方法經常受到多種可能的抗體形式的限制，該等抗體形式可能會包括錯誤的重鏈和輕鏈的配對的若干組合。這類錯配會降低生產效率。使用如本文所述之λ電荷變體藉由優先使一個結合臂中的λ輕鏈與正確CH1配對來克服該等限制，從而生成較佳的多特異性抗體組裝體。特別是，可以將該等λ電荷變體與用於促進重鏈和輕鏈正確配對的已知方法（諸如下文更詳細描述的杵入臼（KiH）、工程化二硫化物和κ電荷配對）進行組合，以進一步改進較佳的多特異性抗體的形成並減少錯配變體的形成。 抗體

術語「抗體」或「抗體分子」描述了免疫球蛋白，無論是天然的還是部分或全部合成產生的。抗體可為人抗體或人源化抗體。在一些方面，抗體係單株抗體分子。抗體之實例係免疫球蛋白同種型，例如免疫球蛋白G（IgG），和它們的同種型亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。

抗體由兩種不同類型的多肽鏈組成：一種稱為重鏈，而另一種稱為輕鏈。天然單特異性抗體由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成。兩條重鏈藉由二硫鍵相互連接，並且每條重鏈藉由二硫鍵與輕鏈連接。連接輕鏈和重鏈的二硫鍵有時被稱為「鏈間」二硫鍵，以將其與存在於單條重鏈和輕鏈多肽內的「鏈內」二硫鍵區分開。

天然抗體中的輕鏈係「拉姆達（λ）」或卡帕「（κ）」輕鏈，它們在胺基酸序列上有所不同。輕鏈由單個輕鏈恒定區（CL）和單個輕鏈可變區（VL）組成。提供了恒定輕鏈λ區（CLλ）胺基酸序列之實例為SEQ ID NO: 1，並提供了恒定輕鏈κ區（CLκ）胺基酸序列之實例為SEQ ID NO: 3。本文所述之多特異性抗體中使用的輕鏈可為嵌合輕鏈，例如含有CLλ和VLκ。

IgG重鏈由一個重鏈可變區（VH）和三個重鏈恒定區（CH1、CH2和CH3）組成，在CH1和CH2之間還有另外的「鉸鏈區」。提供了IgG1 CH1區胺基酸序列之實例為SEQ ID NO: 4。提供了IgG1 CH2胺基酸序列之實例為SEQ ID NO: 6。提供了IgG1 CH3胺基酸序列之實例為SEQ ID NO: 7。提供了包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3的重鏈胺基酸序列之實例為SEQ ID NO: 8。

除非另有指示，否則恒定結構域中的胺基酸殘基位置（包括如本文所述之胺基酸序列、取代、缺失和插入的位置）根據EU編號（Edelman, 2007）進行編號。

輕鏈與重鏈中的VH和CH1結合以形成「抗原結合臂」，並且抗原結合臂中的可變結構域相互作用以形成「抗原結合結構域」。

「抗原結合結構域」描述了分子中與全部或部分靶表位結合的部分，並且通常包含六個互補決定區（CDR）；三個在VH區：HCDR1、HCDR2和HCDR3，還有三個在VL區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。這六個CDR共同定義了抗原結合結構域的互補位，它係抗原結合結構域中與靶表位結合的部分。如本文所用，術語「表位」係指抗原中抗原結合結構域結合的部分。單株單特異性IgG抗體分子含有兩個抗原結合結構域，其中每個抗原結合結構域都能夠結合相同的表位（即，對於單個表位而言它係二價的）。如本文所用，術語「價」表示在結合表位的抗體中存在指定數目的抗原結合結構域。

VH區和VL區包含每個CDR任一側的框架區（FR），其為CDR提供支架。從N-末端到C-末端，VH區包含以下結構：N末端-[HFR1]-[HCDR1]-[HFR2]-[HCDR2]-[HFR3]-[HCDR3]-[HFR4]-C末端；並且VL區包含以下結構：N末端-[LFR1]-[LCDR1]-[LFR2]-[LCDR2]-[LFR3]-[LCDR3]-[LFR4]-C末端。 雙特異性「 2+1 」抗體

本揭露提供了「2+1」形式的多特異性（例如雙特異性）抗體。在不含污染物（諸如能夠結合其他多肽和/或血清組分的抗體）的意義上，根據本揭露的多特異性抗體可以以分離的形式提供。

本揭露的多特異性抗體能夠結合相同或不同抗原上的兩種不同的表位，並且包含三個抗原結合臂，在本文中各自稱為「第一抗原結合臂」、「第二抗原結合臂」和「第三抗原結合臂」。根據本揭露，「抗原結合臂」包含輕鏈、VH和CH1（即，重鏈和輕鏈各自的至少一個恒定結構域和一個可變結構域），其中該輕鏈與CH1藉由二硫鍵連接。本文提及的第一、第二和第三結構域（CH1、VH、VL等）分別係指第一、第二和第三抗原結合臂的所述結構域。

半胱胺酸殘基之間二硫鍵的形成發生在進入分泌途徑的許多蛋白質的折疊期間。當多肽鏈塌縮時，靠近的半胱胺酸可以在由蛋白質二硫化物異構酶家族成員催化的過程中形成共價連接。如本文所用，術語「二硫鍵連接」或「藉由二硫鍵連接」係指由硫醇基團、特別是半胱胺酸殘基的偶合形成的單個共價鍵。在一些方面，兩個半胱胺酸之間的共價連接係在每個殘基的兩個硫原子之間。然而，根據環境的不同，並非所有蛋白質種類都可能始終存在二硫化物，例如，在二硫化物還原的情況下。因此，在一些方面，術語「二硫鍵連接」或「藉由二硫鍵連接」（無論是天然的還是工程化的）還指存在能夠形成二硫鍵連接的兩個半胱胺酸殘基，而不管在該單個時間點上它們是否實際連接。

在本發明多特異性抗體的「2+1」形式中，第一抗原結合臂單價結合第一表位，第二和第三抗原結合臂二價結合第二表位，其中第二表位不同於第一表位。第三抗原結合臂與第一或第二抗原結合臂融合，典型地經由重鏈結構域之間的肽連接子融合。合適的肽連接子係本領域已知的，並且可以由5至100個胺基酸、5至50個胺基酸、5至25個胺基酸、或5至15個胺基酸組成。肽連接子主要由甘胺酸和絲胺酸的胺基酸殘基形成，並且可包含胺基酸序列GGGGS（SEQ ID NO: 16）或SGGGGS（SEQ ID NO: 17）。在一個方面，肽連接子包含(GGGGS)2（SEQ ID NO: 18）或由其組成。

第三抗原結合臂與多特異性抗體中存在的兩條重鏈之一融合。在一些方面，第三抗原結合臂在其CH1結構域的N-末端處與第一抗原結合臂或第二抗原結合臂上的VL結構域的C-末端融合。因此，在一個方面，第三抗原結合臂的CH1結構域的N-末端與第一抗原結合臂的VL結構域的C-末端融合。圖12提供了這一示例性方面的示意圖。在另一方面，第三抗原結合臂的CH1結構域的N-末端與第二抗原結合臂的VL結構域的C-末端融合。

第一和第二抗原結合臂還可以進一步包含另外的重鏈區，即鉸鏈、CH2和CH3中的一或多個。在一些方面，第一和第二抗原結合臂進一步包含Fc區（即，包含鉸鏈、CH2和CH3的重鏈的其餘部分）。在一些方面，第一和第二抗原結合臂包含完整的重鏈（即，VH、CH1、鉸鏈、CH2和CH3）。在一些方面，第一抗原結合臂的重鏈與第二抗原結合臂的重鏈藉由二硫鍵連接（例如，經由Fc結構域中存在的半胱胺酸之間的鏈間二硫鍵或該等半胱胺酸形成這樣的鍵的能力）。

第一抗原結合臂與第二和第三結合臂在輕鏈VL和CH1胺基酸序列的CDR中至少一或多個方面不同，反映了第一抗原結合臂與第二和第三抗原結合臂結合的表位不同的事實。

在一些方面，第二和第三抗原結合臂具有相同的CDR序列。在其他方面，它們具有相同的VH和VL序列。在一些方面，第二和第三輕鏈係相同的（即它們具有相同的胺基酸序列）。 雙特異性 2+2 抗體

還提供了「2+2」形式的多特異性（例如雙特異性）抗體，其係「2+1」形式的變體。

本質上，「2+2」形式的多特異性抗體包含上述「2+1」形式的特徵，外加另外的第四抗原結合臂。與上述第一至第三抗原結合臂類似，第四抗原結合臂包含與第四CH1二硫鍵連接的第四輕鏈。第四抗原結合臂與第一抗原結合臂結合相同的表位（本文中稱為「第一表位」）。因此，儘管上述「2+1」形式的抗體單價結合第一表位且二價結合第二表位，但「2+2」形式的抗體雙價結合每個表位。

如同在「2+1」形式抗體中一樣，結合相同表位的抗原結合臂可以位於多特異性抗體的相同重鏈或不同重鏈上。典型地，四個抗原結合臂排列成使得抗體的每條重鏈包含一個結合第一表位的抗原結合臂和一個結合第二表位的抗原結合臂。在該等方面，第三抗原結合臂與第一抗原結合臂融合，且第四抗原結合臂與第二抗原結合臂融合。

可替代地，抗原結合臂可以排列成使得抗體的每條重鏈特異性結合一個表位，即抗體的每條重鏈包含結合相同表位的兩條抗原結合臂。因此，在一些方面，第三抗原結合臂與第二抗原結合臂融合，且第四抗原結合臂與第一抗原結合臂融合。

當2+2形式排列成使得每條重鏈包含一條結合第一表位的抗原結合臂和一條結合第二表位的抗原結合臂時，抗體可以具有對稱排列或不對稱排列。對稱/不對稱係指抗體兩條重鏈內抗原結合臂的排列。圖17A和17B分別示出了對稱和不對稱排列的示意圖。

在對稱排列中，識別第一表位的兩個抗原結合臂都位於識別第二表位的抗原結合臂的N-末端或C-末端。因此，在一些方面，2+2形式對稱排列，並且第三抗原結合臂與第一抗原結合臂的N-末端融合，且第二抗原結合臂與第四抗原結合臂的N-末端融合。在其他方面，2+2形式對稱排列，並且第三抗原結合臂與第一抗原結合臂的C-末端融合，且第二抗原結合臂與第四抗原結合臂的C-末端融合。

在不對稱排列中，結合第一表位的一個抗原結合臂位於結合第二表位的抗原結合臂的N-末端，而結合第一表位的另一個抗原結合臂位於結合第二表位的抗原結合臂的C-末端。因此，在一些方面，2+2形式不對稱排列，使得第三抗原結合臂與第一抗原結合臂的N-末端融合，且第二抗原結合臂與第四抗原結合臂的C-末端融合（或反之亦然）。

如上文所述，第一和第二抗原結合臂可以進一步包含另外的重鏈區，例如Fc區。從前述對「2+2」抗體形式的可能排列的討論中可以理解，在這種情況下，當存在另外的重鏈區時，另外的結合臂可以位於第一和/或第二抗原結合臂和其相應的另外重鏈區之間。例如，在一些方面，第三抗原結合臂可以位於第一抗原結合臂和其另外的重鏈區（例如Fc結構域）之間。在一些方面，第四抗原結合臂可以位於第二抗原結合臂和其另外的重鏈區之間。

如上文關於第二和第三抗原結合臂所述，第一和第四抗原結合臂可以具有相同的CDR序列。在一些方面，它們具有相同的VH和VL序列。在一些方面，第一和第四輕鏈係相同的。 λ 電荷對

術語「一或多個電荷對」和「一或多個電荷突變」在整個本說明書中可互換使用，並且係指帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，其中一種位於抗原結合臂的輕鏈區（例如，輕鏈恒定區）中，另一種位於該抗原結合臂的重鏈區（例如，重鏈恒定區1（CH1））中，它們位於旨在促進輕鏈和重鏈結合的位置處。「λ電荷對」係指電荷對，其中帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基位於λ輕鏈（例如，CLλ）中。「κ電荷對」係指電荷對，其中輕鏈中帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基位於κ輕鏈（例如，CLκ）中。

不希望受理論束縛，據信電荷對中相反電荷的胺基酸殘基增加了抗原結合臂中重鏈對輕鏈的吸引力，從而促進了具有正確重鏈和輕鏈的抗原結合臂的形成。

已將電荷對中至少一個胺基酸殘基工程化到抗原結合臂中（即，該對中的至少一個胺基酸殘基不是野生型胺基酸殘基）。在一些方面，將電荷對中兩個胺基酸殘基都工程化到抗原結合臂中（即，該對中的兩個胺基酸殘基都不是野生型胺基酸殘基）。

電荷對的胺基酸殘基典型地是天然存在的。根據本揭露的天然存在的帶正電荷的胺基酸殘基包括精胺酸、離胺酸和組胺酸。根據本揭露的天然存在的帶負電荷的胺基酸殘基包括麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和天冬胺酸。儘管在本領域中經常將絲胺酸和蘇胺酸描述為「不帶電荷的」胺基酸，但是它們具有低於6的等電點，因此在中性pH下係部分帶負電荷的。就本文揭露的電荷對而言，絲胺酸和蘇胺酸係帶負電荷的胺基酸殘基之實例（還有麩胺酸和天冬胺酸）。

因此，電荷對可以包含位於電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基。例如，電荷對可以包含以下胺基酸殘基對中的任一對： 精胺酸和天冬胺酸； 精胺酸和麩胺酸； 精胺酸和絲胺酸； 精胺酸和蘇胺酸； 離胺酸和天冬胺酸； 離胺酸和麩胺酸； 離胺酸和絲胺酸； 離胺酸和蘇胺酸； 組胺酸和天冬胺酸； 組胺酸和麩胺酸； 組胺酸和絲胺酸；以及 組胺酸和蘇胺酸。

在一些方面，電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於輕鏈上，而電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於重鏈上。在其他方面，電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於輕鏈上，而帶正電荷的胺基酸殘基位於重鏈上。

如本文所例示的，可以在多個位置處引入λ電荷對以改進抗原結合臂中正確輕鏈和重鏈的配對。

在一些方面，λ電荷對在恒定輕鏈λ區（CLλ）的位置117、119、134、136或178處包含帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基。在一些方面，λ電荷對在CH1的位置141、185、128、145、183、185、173或187處包含帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基。如其他地方所述，編號根據EU編號進行。根據EU編號，CLλ的位置117、119、134、136和178對應於SEQ ID No: 1和2的胺基酸位置10、12、27、29和71。根據EU編號，CH1的位置141、185、128、145、183、185、173和187對應於SEQ ID No: 4和5的胺基酸位置24、68、11、28、66、68、56和70。

在一些方面，λ電荷對位於以下位置對中的一或多對處： (i)    CLλ中的位置117和CH1中的位置141； (ii)   CLλ中的位置117和CH1中的位置185； (iii)  CLλ中的位置119和CH1中的位置128； (iv)  CLλ中的位置134和CH1中的位置128； (v)   CLλ中的位置134和CH1中的位置145； (vi)  CLλ中的位置134和CH1中的位置183； (vii) CLλ中的位置136和CH1中的位置185； (viii) CLλ中的位置178和CH1中的位置173；以及 (ix)  CLλ中的位置117和CH1中的位置187。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置141處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.至f.中的任一項。在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.至e.中的任一項。在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.、b.和e.中的任一項。在一些方面，λ電荷對係a.。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置185處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置119和CH1中的位置128處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置128處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置145處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置183處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對係在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸或絲胺酸。在以SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5提供的CH1序列中，EU位置183係絲胺酸，因此無需在SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5的CH1中引入修飾即可與在CLλ的位置134處的帶正電荷的胺基酸一起產生電荷對。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置136和CH1中的位置185處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置178和CH1中的位置173處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； b.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； c.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸； d.  在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸； e.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； f.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； g.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸；以及 h.  在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸。

在一些方面，包含λ電荷對的抗原結合臂包含多於一個λ電荷對。例如，第一抗原結合臂可以在上述位置 (i) 至 (ix) 處包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個λ電荷對。

在本文所述之多特異性抗體中，上文定義的λ電荷對係i) 在第一抗原結合臂內；或ii) 在第二和第三抗原結合臂內，但相同的λ電荷對不在所有三個抗原結合臂內。在本文所述之「2+2」形式抗體的背景下，上文定義的λ電荷對係i) 在第一和第四抗原結合臂內；或ii) 在第二和第三抗原結合臂內，但相同的λ電荷對不在所有四個抗原結合臂內。

除非上下文另外明確指出，否則本文對單數（例如「一個/種」或「該」）電荷對或結構域的提及還涵蓋多個電荷對或多個結構域。例如，如本文所述，第一抗原結合臂或第二和第三抗原結合臂可包含λ電荷對。在第二和第三抗原結合臂都包含λ電荷對的方面，應理解第二抗原結合臂的CH1和CLλ包含λ電荷對，並且第三抗原結合臂的CH1和CLλ也包含相同的λ電荷對。

在一些方面，λ電荷對位於第一抗原結合臂內。也就是說，第一輕鏈包含CLλ，並且λ電荷對位於第一輕鏈的CLλ和第一CH1的位置之間。在該等方面，第二和第三抗原結合臂包含與第一抗原結合臂中存在的不同的λ電荷對，或者不包含λ電荷對（例如，它們包含野生型CLλ，或者它們包含恒定輕鏈κ區（CLκ））。在「2+2」形式抗體的背景下，在該等方面，第一抗原結合臂中存在的λ電荷對也存在於第四抗原結合臂中。

在一些方面，λ電荷對位於第二和第三抗原結合臂內。也就是說，第二和第三輕鏈包含CLλ，並且λ電荷對位於第二和第三輕鏈的CLλ以及第二和第三CH1的位置之間。在該等方面，第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））包含與第二和第三抗原結合臂中存在的不同的λ電荷對，或者不包含λ電荷對（例如，其包含野生型CLλ，或者其包含恒定輕鏈κ區（CLκ））。

例如，多特異性抗體中的第一、第二和第三抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））可以都包含上述λ電荷對，其中第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））中的λ電荷對不同於第二和第三抗原結合臂中的λ電荷對。也就是說，第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））中的λ電荷對可以位於上述 (i) 至 (ix) 的位置對中的任一對處，並且第二和第三抗原結合臂中的λ電荷對可以位於上述 (i) 至 (ix) 內的不同位置對處。例如，第一抗原結合臂可以在第一抗原結合臂的CLλ中的位置117和第一CH1中的位置141處包含λ電荷對，並且第二和第三抗原結合臂可以在例如第二和第三抗原結合臂的CLλ中的位置134以及第二和第三CH1中的位置145處包含不同的λ電荷對。

在另一個實例中，多特異性抗體中的第一、第二和第三抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））在相同位置處（即，在上述 (i) 至 (ix) 之一處）均可以包含λ電荷對，但是帶正電荷和帶負電荷的胺基酸殘基位於各自抗原結合臂中的不同多肽鏈上。也就是說，第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））可以包含在CLλ中位置之一處的帶正電荷的胺基酸殘基和在第一CH1中的帶負電荷的胺基酸殘基，並且第二和第三抗原結合臂包含在第二和第三抗原結合臂的CLλ的相同位置處的帶負電荷的胺基酸殘基以及在第二和第三CH1中相同位置處的帶正電荷的胺基酸殘基，或者反之亦然。例如，第一抗原結合臂可以包含λ電荷對，該λ電荷對係第一抗原結合臂的CLλ的位置117處的精胺酸和第一CH1的位置141處的天冬胺酸，並且第二和第三抗原結合臂可以包含λ電荷對，該λ電荷對係第二和第三抗原結合臂的CLλ的位置117處的天冬胺酸以及第二和第三CH1的位置141處的精胺酸。

在另外的實例中，第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））包含上述λ電荷對，並且第二和第三抗原結合臂均包含恒定輕鏈κ區（CLκ）（視需要具有κ電荷對），如下文更詳細描述的。或者第二和第三抗原結合臂包含上述λ電荷對，並且第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））包含恒定輕鏈κ區（CLκ）（視需要具有κ電荷對），如下文更詳細描述的。

如本文所示，當與不含λ電荷對的多特異性抗體相比時，含有λ電荷對的多特異性抗體表現出更高的正確輕鏈配對。也就是說，當產生在第一抗原結合臂中含有λ電荷對的多特異性抗體時，與產生不含λ電荷對的等同多特異性抗體相比，含有正確的第一輕鏈和第一CH1的多特異性抗體的比例增加。

如實例中所述，已知有幾種方法可用於確定正確的輕鏈配對。該等方法包括基於質譜的途徑，其可用於確定正確的重鏈/輕鏈結合。當多特異性抗體含有κ和λ輕鏈的混合物時，所組裝的多特異性抗體中κ和λ輕鏈的比率可以使用基於微流控技術的電泳來確定，作為正確輕鏈比率的讀數。

因此，在一些方面，當與不含λ電荷對的等同多特異性抗體相比時，含有λ電荷對的多特異性抗體表現出更高的正確輕鏈配對。在一些方面，含有λ電荷對的多特異性抗體表現出大於90%、95%、96%、97%、98%或99%的正確輕鏈比率（例如，使用基於微流控技術的電泳法確定），視需要在使用輕鏈親和純化來純化多特異性抗體之後。 與其他配對途徑的組合

可以將本文所述之λ電荷對與用於促進異二聚化的其他策略進行組合，以進一步提高重鏈和輕鏈多肽的正確配對。

用於促進異二聚化的策略的非限制性實例在下文中更詳細地描述，並且包括在CH1/CL介面處使用二硫化物工程化、引入另外的電荷對（例如，κ電荷對）和Fc區修飾如杵入臼以及允許分級純化策略的修飾。 工程化二硫化物

在一些方面，多特異性抗體除了含有λ電荷對之外，還含有工程化二硫化物。「工程化二硫化物」係指已將第一抗原結合臂、或第二和第三抗原結合臂的CH1-CL介面處（例如，在CH1的220處和LC的212處）的天然鏈間二硫鍵替換為工程化（非天然）鏈間二硫化物，而另外一或多個抗原結合臂在CH1-CL介面處含有天然鏈間二硫鍵。工程化二硫化物典型地藉由將半胱胺酸工程化到輕鏈的CL和相對應重鏈的CH1中並替換正常情況下形成鏈間二硫化物的半胱胺酸而形成。可以在例如美國專利案號9,527,927和Mazor, 2015中找到涉及為了促進異二聚化之目的而將工程化二硫化物引入多特異性抗體中的揭露內容，這兩篇文獻均藉由引用以其全文併入本文。

因此，在一些方面： (i)    第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和該第一CH1中的半胱胺酸對之間，而第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間。圖12提供了這一方面的示意圖； (ii)   第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第二和第三輕鏈以及第二和第三CH1中的半胱胺酸對之間，而該第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間；或者 (iii)  所有三個抗原結合臂都含有工程化二硫化物，但是經工程化到第一抗原結合臂中的半胱胺酸與經工程化到第二和第三抗原結合臂中的半胱胺酸位於不同的位置（例如在輕鏈中）。

在這三個方面的任何一個方面，在「2+2」形式中，第四抗原結合臂具有與第一抗原結合臂相同類型的二硫鍵連接。

在一些方面，經工程化到CLλ和CH1中的半胱胺酸對位於CLλ的位置122和CH1的位置126處，並且其中相同的CLλ在位置212處包含非半胱胺酸殘基且相同的CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。

包含工程化半胱胺酸的CLλ的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 2提供，並且包含相對應工程化半胱胺酸以形成工程化二硫化物的CH1的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 5提供。

在本文例示的雙特異性抗體中，工程化二硫化物存在於含有λ電荷對的第一（單價）抗原結合臂上，而天然二硫化物存在於不含λ電荷對的第二（二價）和第三抗原結合臂上。然而，還特別考慮了其他排列，例如，天然二硫化物存在於含有λ電荷對的一或多個抗原結合臂上，而工程化二硫化物存在於缺乏λ電荷對的一或多個臂上。

在一些方面，經工程化到恒定輕鏈κ區（CLκ）和CH1中的半胱胺酸對位於CLκ的位置121和CH1的位置126處，並且其中相同的CLκ在位置214處包含非半胱胺酸殘基且相同的CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。 κ 鏈和電荷對

在一些方面，抗原結合臂中的至少一個包含具有恒定輕鏈κ區（CLκ）的輕鏈。也就是說，在多特異性抗體中，一個抗原結合臂含有CLλ，而另一抗原結合臂包含CLκ。如本文所述，利用對CLκ或CLλ具有特異性的親和樹脂的輕鏈親和層析等技術可用於基於抗體的輕鏈選擇性純化抗體。這樣的親和樹脂之實例包括通用電氣醫療集團（GE Healthcare）提供的LambdaFabSelect和KappaSelect樹脂。此類方法可用於選擇性純化同時含有CLκ和CLλ的多特異性抗體，因此可用於提高這種形式的多特異性抗體的產生。

在一個方面，第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））包含λ電荷對，並且第二和第三抗原結合臂包含作為第二和第三輕鏈一部分的CLκ。在另一方面，第二和第三抗原結合臂包含λ電荷對，並且第一抗原結合臂（以及第四抗原結合臂（如果存在的話））包含作為第一輕鏈一部分的CLκ。

提供了CLκ胺基酸序列的一個實例為SEQ ID NO: 3。

在一些方面，含有CLκ的一或多個抗原結合臂包含κ電荷對。如上所述，κ電荷對係指帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，其中一種位於抗原結合臂的κ輕鏈（例如，CLκ）中，而另一種位於該抗原結合臂的重鏈（例如，CH1）中，它們位於旨在促進第二抗原結合臂的輕鏈和CH1結合的位置處。

在一些方面，含有CLκ的一或多個抗原結合臂包含位於CLκ中的位置133和第二CH1中的位置183處的κ電荷對。在一些方面，κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於CLκ的位置133處，而κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於第二CH1的位置183處。在其他方面，κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於CLκ的位置133處，而κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於第二CH1的位置183處。在一些方面，帶負電荷的胺基酸殘基（例如，在CLκ的位置133處）係麩胺酸，並且其中帶正電荷的胺基酸殘基（例如，在第二CH1的位置183處）係離胺酸。如其他地方所述，這種編號根據EU編號進行。

根據EU編號，CLκ的位置133對應於SEQ ID NO: 3的胺基酸位置26。根據EU編號，CH1的位置183對應於SEQ ID NO: 4和5的胺基酸位置66。

在某些示例性方面，多特異性抗體包含具有如上所述之λ電荷對的第一抗原結合臂（以及視需要第四抗原結合臂）和具有如上所述之κ電荷對的第二和第三抗原結合臂，其中該多特異性抗體包含工程化二硫化物。此類示例性方面在圖12和17提供的示意圖中示出。

例如，在一個示例性方面，第一抗原結合臂（以及視需要的第四抗原結合臂）包含λ電荷對（例如，在CLλ中的位置117和第一CH1中的位置141處）,並且在第一輕鏈和第一CH1之間（以及視需要的第四輕鏈和第四CH1之間）的二硫鍵連接形成於經工程化到CLλ和第一CH1中的半胱胺酸對之間；並且第二和第三抗原結合臂包含κ電荷對（例如在兩個CLκ中的位置133以及第二和第三CH1中的位置183處），並且第二輕鏈和第二CH1之間以及第三輕鏈和第三CH1之間的二硫鍵連接形成於第二和第三輕鏈以及第二和第三CH1的CLκ中的天然半胱胺酸對之間。

還特別考慮了κ電荷對和工程化二硫化物的其他組合。在一個這樣的實例中，第一抗原結合臂（以及視需要的第四抗原結合臂）包含λ電荷對和天然二硫化物，並且第二和第三抗原結合臂包含κ電荷對和工程化二硫化物。作為另一實例，第一抗原結合臂（以及視需要的第四抗原結合臂）包含κ電荷對和工程化二硫化物，並且第二和第三抗原結合臂包含λ電荷對和天然二硫化物。作為又一實例，第一抗原結合臂（以及視需要的第四抗原結合臂）包含κ電荷對和天然二硫化物，並且第二和第三抗原結合臂包含λ電荷對和工程化二硫化物。 Fc 區修飾

如上所述，在一些方面，第一和第二抗原結合臂進一步包含第一和第二Fc區（即，進一步包含重鏈的CH2和CH3區）。

在一些方面，多特異性抗體在CH1、CH2和CH3結構域中的一或多個中包含一或多個修飾，其藉由促進第一和第二Fc區的形成來促進異二聚體抗體分子的形成。這可能涉及杵入臼（KiH）策略，該策略基於在CH3結構域中促進重鏈異二聚化的單個胺基酸取代，如Ridgway, 1996中所述。杵變體重鏈CH3具有的小胺基酸已經替換為較大的胺基酸，從而在所述CH3結構域的表面上形成凸起（杵），而臼變體具有的大胺基酸已經替換為較小的胺基酸，從而在所述CH3結構域的表面上形成空腔（臼）。還可以引入另外的修飾以穩定重鏈之間的結合。

增強異二聚化的CH3修飾包括，例如，在一個Fc區上的「臼」突變Y407V/T366S/L368A和在另一個Fc區上的「杵」突變T366W。該等修飾可以進一步包括穩定性胱胺酸突變Y349C（例如，在具有「臼」突變的Fc區上）和在另一Fc區上的穩定性S354C突變（例如，在具有「杵」突變的Fc區上）。經工程化以含有「臼」突變的CH3結構域的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 9和10提供。經工程化以含有「杵」突變的CH3結構域的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 11和12提供。

因此，在一個方面，形成杵的取代係在位置366處取代為色胺酸，而形成臼的取代係以下中的一或多種： i)      在位置407處取代為纈胺酸； ii)     在位置366處取代為絲胺酸；以及 iii)    在位置368處取代為丙胺酸。

在本文例示的多特異性抗體中，「杵」存在於第一（單價）抗原結合臂上，而臼存在於第二抗原結合臂上（其與第三抗原結合臂一起二價結合第二表位）。這種排列在圖12提供的示意圖中展示。然而，還特別考慮了相反的排列，即，其中「臼」存在於第一抗原結合臂的CH3上，而「杵」存在於第二抗原結合臂的CH3上。

增強異二聚化的CH3修飾的其他實例在例如Brinkmann和Kontermann, 2017 MABS 9(2), 182-212的表1中進行了描述，該文獻藉由引用具體併入本文。

例如，一個Fc區可以包括允許藉由蛋白A層析進行分級洗脫的修飾，如Tustian, 2016中所述。簡而言之，Fc區之一可以包含消除與蛋白A結合的修飾（稱為Fc*），從而允許選擇性純化異二聚體FcFc*多特異性產物。用於產生Fc*區的合適修飾之實例包括將H435取代為精胺酸以及將Y436取代為苯丙胺酸。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 第一抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第一Fc區； 如上所述之第二抗原結合臂，其包含第二Fc區；以及 如上所述之第三抗原結合臂， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 如上所述之第一抗原結合臂，其包含第一Fc區； 第二抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第二Fc區，以及 如上所述之第三抗原結合臂，其包含與第二抗原結合臂相同的λ電荷對， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 第一抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第一Fc區； 如上所述之第二抗原結合臂，其包含第二Fc區；以及 如上所述之第三抗原結合臂， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾，並且其中該多特異性抗體包含工程化二硫化物。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 如上所述之第一抗原結合臂，其包含第一Fc區； 第二抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第二Fc區，以及 如上所述之第三抗原結合臂，其包含與第二抗原結合臂相同的λ電荷對， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾，並且其中該多特異性抗體包含工程化二硫化物。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 第一抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第一Fc區； 第二抗原結合臂，其包含如上所述之κ電荷對和第二Fc區； 如上所述之第三抗原結合臂，其包含與第二抗原結合臂相同的κ電荷對， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 第一抗原結合臂，其包含如上所述之κ電荷對和第一Fc區； 第二抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第二Fc區； 如上所述之第三抗原結合臂，其包含與第二抗原結合臂相同的λ電荷對， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 第一抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第一Fc區； 第二抗原結合臂，其包含如上所述之κ電荷對和第二Fc區；以及 如上所述之第三抗原結合臂，其包含與第二抗原結合臂相同的κ電荷對， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾，並且其中該多特異性抗體包含工程化二硫化物。

在一些方面，該多特異性抗體包含： 第一抗原結合臂，其包含如上所述之κ電荷對和第一Fc區； 第二抗原結合臂，其包含如上所述之λ電荷對和第二Fc區；以及 如上所述之第三抗原結合臂，其包含與第二抗原結合臂相同的λ電荷對， 其中該第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾，並且其中該多特異性抗體包含工程化二硫化物。

在實例中提供了多特異性抗體的非限制性實例，其包含λ電荷對、κ電荷對、工程化二硫化物以及促進第一和第二Fc區進行異二聚化的修飾。

本文所考慮的其他Fc修飾係減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體（諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII）和/或與補體結合的那些修飾。這樣的突變降低或消除Fc效應功能。降低或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體和/或補體結合的突變係已知的，包括L234F/L235E/P331S的「三重突變」或「TM」（根據歐盟編號慣例），例如在Organesyan等人, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr [晶體學報，D輯：生物晶體學] 64(6): 700-704, 2008中所述。

在一些方面，免疫球蛋白重鏈恒定結構域之一或兩者的CH2結構域包含以下取代：E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。這種突變組合可在本文中被稱為「Fc效應子無效突變」。

其他適合的Fc區胺基酸取代或修飾係本領域已知的並且包括例如三重取代：位置252處的甲硫胺酸（M）到酪胺酸（Y）取代、位置254處的絲胺酸（S）到蘇胺酸（T）取代、以及位置256處的蘇胺酸（T）到麩胺酸（E）取代，如由Kabat中所示的EU索引進行編號（M252Y/S254T/T256E；稱為「YTE」或「YTE突變」）（參見例如，美國專利7,658,921；美國專利申請公開2014/0302058；和Yu等人, Antimicrob. Agents Chemother.[抗微生物藥劑與化學療法], 61(1): e01020-16 (2017)，其中每個藉由引用以其全文併入本文）。突變組合可以延長抗體的半衰期。

三重突變、Fc效應子無效突變和YTE突變（當存在時）可以存在於一個或兩個重鏈恒定結構域中。通常，如果包含，它們包含在兩個重鏈恒定結構域中。

在一些方面，Fc區包含YTE突變和三重突變。在其他方面，Fc區包含YTE突變和Fc效應子無效突變。 CD3 靶標和 T 細胞銜接器

在一些方面，第一抗原結合臂能夠結合CD3。

CD3（分化簇3）係一種由四個亞單位即CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈組成的蛋白複合物。CD3與T細胞受體和ζ鏈結合以在T淋巴球中產生活化訊息。已將靶向CD3和靶細胞抗原的雙特異性抗體用於強制該靶細胞和T細胞之間發生臨時相互作用，從而引起交聯、T細胞活化和後續對該靶細胞的抗原依賴性T細胞殺傷。雙特異性抗體的2+1形式非常適合CD3結合，因為目標係僅單價鍵合CD3蛋白，使得T細胞受體僅在結合靶細胞時交聯和活化。 另外的結合結構域

本文還描述了多特異性抗體，其進一步包含能夠結合第三表位（例如第三抗原上的第三表位）的另外的抗原結合結構域，該第三表位不同於第一和第二表位。此類抗體可為三特異性四價抗體：第一抗原結合臂與第一表位單價結合，第二和第三抗原結合臂與第二表位二價結合，而另外的抗原結合結構域與第三表位單價結合。可替代地，此類抗體可為三特異性五價抗體：第一和第四抗原結合臂與第一表位二價結合，第二和第三抗原結合臂與第二表位二價結合，且另外的抗原結合結構域與第三表位單價結合。

在一些方面，另外的抗原結合結構域係單結構域抗體，例如缺少CH1和輕鏈的重鏈可變（VH）結構域。源自天然缺乏輕鏈的重鏈抗體的重鏈可變結構域在本文中被稱為VHH，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VHH分子可以源自在駱駝科（ camelidae）物種諸如駱駝、羊駝、單峰駱駝、美洲駝和原駝中產生的抗體。駱駝科以外的物種也可以產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，並且還涵蓋了這樣的VHH。

駱駝科重鏈抗體的VHH可以藉由基因工程過程獲得。參見美國專利案號5,759,808。與其他非人抗體片段類似，可以藉由重組方式改變駱駝科VHH的胺基酸序列，以獲得更接近地模擬人序列的序列，即「人源化的」，從而降低駱駝科VHH對人的抗原性。另外，還可以將源自駱駝科VHH的關鍵元件轉移至人VH結構域中以獲得駱駝化的人VH結構域。

VHH的分子量係人IgG分子的分子量的十分之一，並且其物理直徑只有幾奈米。VHH本身具有極高的熱穩定性、對極端pH和蛋白水解消化的穩定性以及低抗原性。使用VHH作為抗原結合結構域之一減少了三特異性抗體生產過程中存在的重鏈和輕鏈的數量，因此從生產角度來看，與包含含有VH、VL和CH1的另外抗原結合臂相比可能是有利的。

可以將駱駝科抗原結合結構域（例如，VHH）典型地經由肽連接子與第一、第二、第三或第四抗原結合臂融合。合適的肽連接子係本領域已知的，並且可以由5至100個胺基酸、5至50個胺基酸、5至25個胺基酸、或5至15個胺基酸組成。肽連接子主要由甘胺酸和絲胺酸的胺基酸殘基形成，並且可包含胺基酸序列GGGGS或SGGGGS。在一個示例性方面，肽連接子包含(GGGGS)2或由其組成。

在第三抗原結合臂與第一抗原結合臂融合的一些方面，將另外的抗原結合結構域（例如，VHH）與第二抗原結合臂融合。可替代地，在第三抗原結合臂與第二抗原結合臂融合的情況下，將另外的抗原結合結構域（例如，VHH）與第一抗原結合臂融合。

在一些方面，另外的抗原結合結構域（例如，Fab或VHH）能夠結合CD8上的表位。在一些方面，第一抗原結合臂能夠結合CD3，並且另外的抗原結合結構域（例如，VHH）能夠結合CD8上的表位。

CD8（分化簇8）係由一對CD8鏈組成的二聚體。最常見的CD8形式由CD8-α和CD8-β鏈組成。CD8作為MHC I類限制性T細胞上的輔助受體，並藉由在與T細胞受體結合的位點不同的位點處結合MHCI的基本不變區而發揮增強CD8 ⁺T細胞的抗原敏感性的作用。不希望受理論束縛，據信在多特異性抗體中包括能夠結合CD8的抗原結合結構域（例如，VHH）允許優先活化CD8 ⁺T細胞，這可以提供優異的治療功效。 序列同一性和突變

如本文所述，「2+1」形式的雙特異性抗體包含第一、第二和第三抗原結合臂，其中抗原結合臂中的至少一個包含恒定輕鏈λ區（CLλ）以及CLλ與對應的CH1之間的λ電荷對。本文還描述了包含恒定輕鏈κ區（CLκ）的抗原結合臂。本文另外描述了多特異性抗體，其除了「2+1」雙特異性抗體的結合臂之外，還包含另外的抗原結合區（例如，VHH）。

在一些方面，一條或多條輕鏈的CLλ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些方面，第一輕鏈的CLλ包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。

在一些方面，一條或多條輕鏈的CLκ（如果存在的話）包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些方面，CLκ（如果存在的話）包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾的SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。

在一些方面，第一、第二和/或第三CH1包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一些方面，CH1包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾的SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。

這1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾可為除引入上述電荷對、工程化二硫化物和/或Fc區修飾的上述修飾之外的修飾。例如，與SEQ ID NO: 1中所示的野生型CLλ相比，多特異性抗體中使用的CLλ可以含有λ電荷對突變、工程化二硫化物（例如，S122C和C212V）和1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個另外的胺基酸修飾。作為另一實例，與SEQ ID NO: 4中提供的野生型CH1相比，多特異性抗體中使用的CH1可以含有λ電荷突變、工程化二硫化物（例如，F126C、C220V）和1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個另外的胺基酸修飾。

胺基酸修飾可為插入、取代或缺失。在一些方面，胺基酸修飾係將胺基酸殘基取代為任何其他天然存在的或非天然存在的胺基酸殘基。

基於共同的側鏈特性可以將天然存在的殘基分類： 1) 非極性、脂肪族：甘胺酸（G）、甲硫胺酸（M）、丙胺酸（A）、纈胺酸（V）、白胺酸（L）、異白胺酸（I）； 2) 極性：半胱胺酸（C）、天冬醯胺（N）、麩醯胺酸（Q）、脯胺酸（P）； 3) 極性、部分帶負電荷的：絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）； 4) 酸性（帶負電荷的）：天冬胺酸（D）、麩胺酸（E）； 5) 鹼性（帶正電荷的）：組胺酸（H）、離胺酸（K）、精胺酸（I）； 6) 芳香族：色胺酸（W）、酪胺酸（Y）、苯丙胺酸（F）。

如上所述，絲胺酸（S）和蘇胺酸（T）具有低於6的等電點，並且在中性pH下部分帶負電荷，因此將它們在此歸類為「極性、部分帶負電荷的」。

胺基酸取代可為保守胺基酸取代。保守胺基酸取代可能涉及該等類別之一的一個成員與同一類別的另一成員的交換。例如，保守胺基酸取代可為酸性胺基酸麩胺酸（E）取代酸性胺基酸天冬胺酸（D）。 核酸、載體和宿主細胞

本文還提供了編碼本文所述之多特異性抗體的一或多種核酸。在一些方面，一或多種核酸係例如從其他核酸或天然存在的生物材料中純化或分離出來的。技術者使用本領域熟知的方法製備這樣的核酸分子不會有困難。

在一些方面，該一或多種核酸編碼如本文所述之輕鏈和/或如本文所述之CH1。編碼第一或第二CH1的一或多種核酸可以進一步編碼其他重鏈結構域，例如鉸鏈、CH2和CH3，並且可以編碼完整的重鏈。

本揭露還提供了一或多種載體，其包含編碼本文所述之多特異性抗體的一或多種核酸。可以選擇或構建合適的載體，該等載體含有適當的調控序列，包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、強化子序列、標誌基因和其他適當的序列。在一些方面，載體含有適當的調控序列以驅動核酸在宿主細胞中的表現。載體可為質體、病毒，例如噬菌體或噬菌粒，視情況而定。

多特異性抗體可以由輕鏈載體和重鏈載體產生。輕鏈載體可以含有編碼第一輕鏈的核酸和編碼第二輕鏈酸的核酸，它們可以作為不同的盒（例如，各自可操作地連接至不同的啟動子）存在於該載體上。如上所述，第三輕鏈可以與第二輕鏈相同，因此由相同的核酸編碼。可替代地，第三輕鏈可為單獨的核酸。

重鏈載體可以含有用於同時編碼第一CH1和第一VH（和第一Fc區，如果存在的話）以及第二CH1和第二VH（和第二Fc區，如果存在的話），其可以作為不同的盒存在於該載體上。如上所述，在「2+1」形式中，第三抗原結合臂的CH1與第一抗原結合臂或第二抗原結合臂的VH融合。因此，如果第三抗原結合臂與第一抗原結合臂融合，則第三CH1和第三VH將由編碼第一CH1和第一VH的核酸編碼，並且如果第三抗原結合臂與第二抗原結合臂融合，則第三CH1和第三VH將由編碼第二CH1和第二VH的核酸編碼。藉由延伸，這同樣適用於編碼上述「2+2」形式抗體的核酸。類似地，當存在另外的抗原結合結構域（例如，VHH）時，其與第一抗原結合臂或第二抗原結合臂的VH融合，因此將由編碼第一CH1和第一VH的核酸或編碼第二CH1和第二VH的核酸編碼。

可以將如本文所述之核酸分子或載體引入宿主細胞中。用於將核酸或載體引入宿主細胞中的技術在本領域中已經非常成熟，並且可以採用任何合適的技術。適於產生重組抗體分子的一系列宿主細胞係本領域已知的，並且包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。在一些方面，宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0或HEK細胞，例如HEK293細胞。在一些方面，宿主細胞係CHO細胞。 產生多特異性抗體之方法

本文還提供了一種產生本文所述之多特異性抗體之方法。

在一些方面，該方法包括 a)  在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1； b) 使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並使該第一結合臂與該第二和第三結合臂配對，從而形成該多特異性抗體；以及 c)  從該宿主細胞中純化該多特異性抗體。

在一些方面，部分 (a) 進一步包括在宿主細胞中表現第四輕鏈和第四CH1。在這種情況下，部分 (b) 進一步包括使第四輕鏈與第四CH1配對以形成第四結合臂，並使第一至第四結合臂配對以形成多特異性抗體。

在宿主細胞中表現第一、第二和第三以及視需要第四輕鏈以及第一、第二和第三以及視需要第四CH1可以包括使用如上所述之合適技術將核酸或載體引入宿主細胞（例如，CHO細胞）中。然後可以使用合適的技術培養宿主細胞，使得輕鏈和重鏈多肽進行配對並形成第一和第二結合臂。在正常的多特異性抗體產生期間，各種輕鏈和重鏈多肽相互結合（例如，通過天然半胱胺酸之間形成的鏈間二硫鍵，和/或通過經工程化到如本文所述之多特異性抗體中的半胱胺酸），並且該等重鏈也相互結合（例如，通過兩個Fc結構域中的半胱胺酸之間形成的鏈間二硫鍵）。如本文所述，λ電荷對的存在促進在多特異性抗體中形成正確的重鏈/輕鏈對。

用於純化重組抗體分子的技術係本領域熟知的，並且包括例如高效液相層析、快速蛋白液相層析、離子交換層析和親和層析，例如使用蛋白A或蛋白L或者藉由結合親和標籤。在一些方面，使用親和層析（例如，蛋白A親和層析）進行純化。在一些方面，純化進一步包括（例如，除了蛋白A層析之外）輕鏈親和層析。如本文所述，輕鏈親和層析可用於選擇性純化同時含有CLκ和CLλ的多特異性抗體，因此可用於提高這種形式的多特異性抗體的產生。

在一些方面，經純化後（例如，藉由蛋白A親和層析、或在蛋白A親和層析和輕鏈親和層析之後），多特異性抗體中少於25%、少於20%、少於15%、或少於10%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%、或少於1%的輕鏈會發生錯配（即，與來自不同抗原結合臂的CH1配對）。用於確定正確輕鏈配對之方法係本領域已知的，並且包括質譜分析和基於微流控技術的電泳，如本文更詳細描述的。在一些情況下，該方法包括測量正確的輕鏈配對。

該方法還可以包括將抗體分子配製成藥物組成物，視需要與藥學上可接受的賦形劑或如下所述之其他物質一起配製。 治療

因此，本文所述之多特異性抗體可用於治療性應用，例如在治療癌症方面。

如本文所述之多特異性抗體可用於治療人體或動物體之方法中。本揭露的相關方面提供了： (i) 用作藥物的本文所述之多特異性抗體， (ii) 在治療疾病或病症之方法中使用的本文所述之多特異性抗體， (iii) 在製備用於治療疾病或病症的藥物中的本文所述之多特異性抗體；以及， (iv) 治療個體的疾病或病症之方法，其中該方法包括向個體投與治療有效量的如本文所述之多特異性抗體。

個體可為患者，或者更特別地人類患者。

治療可為其中實現一些期望的治療效果的任何治療或療法，例如，抑制或延遲病況的進展，並且包括降低進展的速率、暫停進展的速率、改善病況、治癒或緩解病況（無論是部分的還是全部的）、預防、改善、延遲、減輕或阻止病況的一或多種症狀和/或體征，或延長個體或患者的生存期，使其超過在未治療的情況下的預期生存期。

還包括作為預防性措施（即，預防）的治療。例如，易患疾病例如癌症或處於疾病例如癌症發生或復發風險中的個體可以如本文所述進行治療。這樣的治療可以預防或延緩個體疾病的發生或復發。

所描述的治療方法可以包括除了多特異性抗體之外向個體投與至少一種另外的治療。因此，本文所述之多特異性抗體可以單獨或者與一或多種其他治療聯合投與於個體。當多特異性抗體與另一種治療聯合投與於個體時，可以將另外的治療與投與多特異性抗體同時、順序或分開投與於個體。當另外的治療與多特異性抗體同時投與時，可以將多特異性抗體和另外的治療作為組合製劑投與於個體。例如，另外的療法可為用於待治療的疾病的已知療法或治療劑。

雖然多特異性抗體可以單獨投與，但多特異性抗體通常會以藥物組成物的形式投與，其可以包含除該多特異性抗體之外的至少一種組分。因此，本揭露的另一方面提供了一種包含如本文所述之多特異性抗體的藥物組成物。還提供了一種包括將多特異性抗體配製成藥物組成物之方法。

除了多特異性抗體之外，藥物組成物還可以包含藥學上可接受的賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟悉該項技術者熟知的其他材料。如本文所用，術語「藥學上可接受的」涉及化合物、材料、組成物和/或劑型，其在合理的醫學判斷範圍內適用於與受試者（例如，人）的組織接觸而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，且與合理的益處/風險比相稱。每種載劑、賦形劑等在與配製物的其他成分相容的意義上也必須是「可接受的」。

可以以「治療有效量」投與，這足以顯示對個體的益處。所投與的實際量以及投與的速率和時程將取決於所治療疾病的性質和嚴重程度、所治療的特定個體、個體的臨床狀況、病症的原因、組成物的遞送部位、抗體分子的類型、投與方法和投與時間表。 ***

以其特定形式或根據用於執行所揭露的功能的方式、或者用於獲得所揭露的結果的方法或過程來表現的在前面的說明書或在以下申請專利範圍或在附圖中揭露的特徵，視情況可以單獨地，或以這樣的特徵的任何組合的方式用於以其各種形式來實現本揭露。

雖然已經結合上述示例性方面描述了本揭露，但是當給出本揭露時，許多等同的修改和變化對於熟悉該項技術者而言將是顯而易見的。因此，上述揭露的示例性方面被認為是說明性的而非限制性的。在不脫離本揭露的精神和範圍的情況下，可以對所描述的方面進行各種改變。

為了避免任何疑問，本文提供的任何理論解釋均為為了提高讀者的理解而提供的。諸位發明人不希望受到任何該等理論解釋的束縛。

本文使用的任何章節標題只是出於組織之目的，而不應被解釋為限制所描述的主題。

除非上下文另有要求，否則在本說明書（包括後面的申請專利範圍）全篇，詞語「包含（comprise）」和「包括（include）」及變型（如，「包含（comprises）」、「包含（comprising）」和「包括（including）」）應當被理解為意味著包括所指定的整數或步驟或者多個整數或步驟的組，但不排除任何其他整數或步驟或者多個整數或步驟的組。

必須指出的是，如本說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一個/種（a/an）」和「該」包括複數指示物。本文可以將範圍表示為從「約」一個特定值，和/或至「約」另一個特定值。在表示這樣的範圍時，另一方面包括從該一個特定值和/或到另一個特定值。類似地，當藉由使用先行詞「約」將值表述為近似值時，應當理解，該特定值形成了另一方面。關於數值的術語「約」係視需要的並且意指例如+/-10%。 實例 實例 1 - λ LC-HC 介面中電荷對變體的設計

為了改進正確的鏈配對，使其超過可替代的二硫化物在DuetMab環境中所能實現的效果（參見WO 2013/096291，藉由引用併入本文），使用參與λ輕鏈（LC）-重鏈（HC）介面的胺基酸來設計電荷對。確定了λLC-HC介面中適用於取代的胺基酸對。應用了以下四個標準：必須是介面的一部分；Cb原子應該指向介面（對於甘胺酸胺基酸，羰基應該面向與介面相反的方向）；Cb之外必須有可用的空間來引入更長的胺基酸；並且必須有至少一種允許的Chi角組合將新胺基酸的側鏈置於與現有胺基酸不衝突的位置。

將以下位置評估為參與與CH1結構域的介面形成的λ輕鏈胺基酸：T117、F119、S122、E124、E125、K130、T132、V134、L136、S138、D139、E161、T163、S166、Q168、A174、S176、Y178、S180，以及以下參與與λ輕鏈CL結構域的介面形成的重鏈CH1結構域胺基酸：S124、F126、L128、A129、S131、S132、K133、S134、A141、G143、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S181、S183、V185、T187、V211、K213。

成對地或單獨地研究該等胺基酸，一次一對或以組合方式，使用可替代的鏈間二硫化物或保持二硫化物為天然狀態。引入帶正電荷的或部分帶正電荷的胺基酸意指將該位置處的現有胺基酸取代為離胺酸和精胺酸，並且在一些情況下取代為天冬醯胺或麩醯胺酸或組胺酸。引入帶負電荷的或部分帶負電荷的胺基酸意指將該位置處的現有胺基酸取代為天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸，並且在一些情況下取代為天冬醯胺或麩醯胺酸。在其中一些位置處添加組胺酸殘基將允許引入pH依賴性CH1-CL相互作用。

表1中提供了滿足上述標準的λLC-HC介面中的九組配對組合作為非窮舉性實例，並測試了改進的配對。

[ 表 1].此處呈現的所有突變對於含有λ輕鏈的分子具有特異性，並且預計在野生型和V12形式中都會發揮作用（參見下文）。另外，相反的電荷對 [即，V134（D，E，S，T）-L128（R，K，H）]也預計會提供優先配對。含有無電荷側鏈的胺基酸，如天冬醯胺和麩醯胺酸，可用於取代帶有部分正電荷或部分負電荷的胺基酸，因為已發現它們參與與帶正電荷的和帶負電荷的胺基酸二者以及彼此之間形成氫鍵。

組	Cλ （ + ）	CH1 （ - ）
1號	V134（R，K，H）	L128（D，E，S，T）
2號	V134（R，K，H）	L145（D，E，S，T）
3號	L136（R，K，H）	V185（D，E，S，T）
4號	T117（R，K，H）	V185（D，E，S，T）
5號	T117（R，K，H）	A141（D，E，S，T）
6號	F119（R，K，H）	L128（D，E，S，T）
7號	Y178（R，K，H）	V173（D，E，S，T）
8號	V134（R，K，H）	S183（D，E，T）
9號	T117（R，K，H）	T187（D，E）

實例 2 - 材料和方法

本文闡述的材料和方法用於進行後續實例中描述的實驗。除非另有說明，否則所有試劑均來自麻塞諸塞州沃爾瑟姆（Waltham, MA）的賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）。如其他地方所述，術語「一或多個電荷對」和「一或多個電荷突變」在整個本說明書中可互換使用，並且除非另有指示，否則胺基酸編號基於EU編號系統。 具有電荷對的 DuetMab 的 pDuet- 重和 pDuet- 輕哺乳動物表現載體的構建

為了構建在重鏈-輕鏈介面中具有電荷對突變的DuetMab抗體，使用了在以下文獻中描述的pDuet-重和pDuet-輕質體作為骨架載體：WO 2013/096291和Mazor等人 mAbs [單株抗體] 2015。簡而言之，pDuet-重載體含有兩個人γ1重鏈（HC）盒以支持HC異二聚化，其中前者重鏈在CH3結構域中攜帶「臼」突變組（T366S/L368A/Y407V）和穩定性突變（Y349C），而後者在CH3中攜帶互補的「杵」突變（T366W）和穩定性突變（S354C），儘管盒的順序可以很容易地顛倒。pDuet-輕載體含有兩個人輕鏈（LC）盒，其中前者輕鏈攜帶κ恒定結構域（Cκ），而後者攜帶λ恒定結構域（Cλ）。pDuet-重和pDuet-輕載體還含有突變以去除CH1/Cλ中的天然鏈間二硫鍵並提供可替代的二硫鍵，其在本說明書中表示為「V12 DS」或「V12」，其中將突變F126C/C220V引入「杵」重鏈的CH1結構域中，並將突變S122C/C212V引入λ恒定結構域中。例示的DuetMab抗體骨架中恒定結構域的胺基酸序列（在引入電荷突變之前）提供如下：

鏈中恒定結構域：	SEQ ID NO:
臼HC	13
κLC	3
杵V12 HC	15
λV12 LC	2

本文使用的「杵和臼」組以及穩定性/可替代的二硫鍵的突變僅作為實例提供。熟悉該項技術者可以使用本領域已知的「杵和臼」技術和/或穩定性/可替代的二硫鍵的任何其他突變組合來支持HC異二聚化。

為了構建具有電荷突變的pDuet-重載體，採用藉由BssHII/HindIII的限制性選殖技術，利用含有上述「臼」重鏈突變的VH-CH1-CH2-CH3結構域的合成DNA片段，將「臼」重鏈選殖到pDuet-重載體中。視需要，「臼」重鏈在CH1結構域中含有電荷突變S183K。採用藉由BsrGI/EcoRI的限制性選殖技術，利用含有上述「杵」重鏈突變的VH-CH1-CH2-CH3結構域的合成DNA片段，將「杵」重鏈選殖到載體中。視需要，「杵」重鏈在CH1結構域含有電荷突變之一：L128D、L128E、L128S、L128T、A141D、A141E、A141S、A141T、L145D、L145E、L145S、L145T、S183D、V185D、V185E、V185S、V185T、V173D、V173E、V173S和V173T。

為了構建具有電荷突變的pDuet-輕載體，採用藉由BssHII/NheI的限制性選殖技術，利用VL-Cκ結構域的合成DNA片段，將κ輕鏈選殖到pDuet-輕載體中。視需要，恒定κ（Cκ）結構域含有電荷突變V133E。採用藉由BsrGI/EcoRI的限制性選殖技術，利用含有上述λ輕鏈的S122C/C212V突變的VL-Cλ結構域的合成DNA片段，將λ輕鏈選殖到pDuet-輕載體中。視需要，恒定λ（Cλ）結構域含有以下電荷突變之一：V117R、V117K、F119R、F119K、V134R、V134K、L136R、L136K、Y178R和Y178K。輕鏈可變結構域（VL）可為可變κ結構域（Vκ）或可變λ結構域（Vλ）。 表現、親和純化以及蛋白定量

使用PEI-MAX（賓夕法尼亞州沃靈頓（Warrington, PA）的多元科學公司（Polysciences, Inc.））作為轉染試劑，將所有構建體在懸浮狀態的CHO細胞中瞬時表現，並在內部製造的CHO培養基中生長。在該等研究中，含有以下電荷對組合的載體用於表現抗體。圖2中提供了所構建的含有電荷對的DuetMab的示意圖。針對在細胞表面上表現的幾種不同抗原生成雙特異性抗體，該等抗原在此處稱為抗原1、2、3、4、5和6。抗原3係CD3。所生成的雙特異性抗體稱為「靶標1/靶標2-DuetMab」或簡稱為「靶標1/靶標2」：

[ 表 2]：所生成的電荷對變體列表。

樣本編號	pDuet- 重	pDuet- 輕
臼重鏈	杵重鏈	κ 輕鏈	λ 輕鏈
靶標 1	CH1	靶標 2	CH1 （ V12 ）	靶標 1	CL	靶標 2	CL （ V12 ）
1	抗原1	WT	抗原2	WT	抗原1	WT	抗原2	WT
2	抗原1	S183K	抗原2	WT	抗原1	V133E	抗原2	N/A
3	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	V134R
4	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	V134R
5	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	V134R
6	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	V134R
7	抗原1	S183K	抗原2	L145D	抗原1	V133E	抗原2	V134R
8	抗原1	S183K	抗原2	L145E	抗原1	V133E	抗原2	V134R
9	抗原1	S183K	抗原2	L145S	抗原1	V133E	抗原2	V134R
10	抗原1	S183K	抗原2	L145T	抗原1	V133E	抗原2	V134R
11	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	V134K
12	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	V134K
13	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	V134K
14	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	V134K
15	抗原1	S183K	抗原2	L145D	抗原1	V133E	抗原2	V134K
16	抗原1	S183K	抗原2	L145E	抗原1	V133E	抗原2	V134K
17	抗原1	S183K	抗原2	L145S	抗原1	V133E	抗原2	V134K
18	抗原1	S183K	抗原2	L145T	抗原1	V133E	抗原2	V134K
19	抗原1	S183K	抗原2	WT	抗原1	V133E	抗原2	V134K
20	抗原1	S183K	抗原2	S183D	抗原1	V133E	抗原2	V134K
21	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	L136R
22	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	L136R
23	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	L136R
24	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	L136R
25	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	L136K
26	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	L136K
27	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	L136K
28	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	L136K
29	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	T117R
30	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	T117R
31	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	T117R
32	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	T117R
33	抗原1	S183K	抗原2	A141D	抗原1	V133E	抗原2	T117R
34	抗原1	S183K	抗原2	A141E	抗原1	V133E	抗原2	T117R
35	抗原1	S183K	抗原2	A141S	抗原1	V133E	抗原2	T117R
36	抗原1	S183K	抗原2	A141T	抗原1	V133E	抗原2	T117R
37	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	T117K
38	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	T117K
39	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	T117K
40	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	T117K
41	抗原1	S183K	抗原2	A141D	抗原1	V133E	抗原2	T117K
42	抗原1	S183K	抗原2	A141E	抗原1	V133E	抗原2	T117K
43	抗原1	S183K	抗原2	A141S	抗原1	V133E	抗原2	T117K
44	抗原1	S183K	抗原2	A141T	抗原1	V133E	抗原2	T117K
45	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	F119R
46	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	F119R
47	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	F119R
48	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	F119R
49	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	F119K
50	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	F119K
51	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	F119K
52	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	F119K
53	抗原1	S183K	抗原2	V173D	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
54	抗原1	S183K	抗原2	V173E	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
55	抗原1	S183K	抗原2	V173S	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
56	抗原1	S183K	抗原2	V173T	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
57	抗原1	S183K	抗原2	V173D	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
58	抗原1	S183K	抗原2	V173E	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
59	抗原1	S183K	抗原2	V173S	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
60	抗原1	S183K	抗原2	V173T	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
1	抗原1	WT	抗原3	WT	抗原1	WT	抗原3	WT
2	抗原1	S183K	抗原3	WT	抗原1	V133E	抗原3	WT
33	抗原1	S183K	抗原3	A141D	抗原1	V133E	抗原3	T117R
34	抗原1	S183K	抗原3	A141E	抗原1	V133E	抗原3	T117R
35	抗原1	S183K	抗原3	A141S	抗原1	V133E	抗原3	T117R
36	抗原1	S183K	抗原3	A141T	抗原1	V133E	抗原3	T117R
41	抗原1	S183K	抗原3	A141D	抗原1	V133E	抗原3	T117K
1	抗原4	WT	同種型對照	WT	抗原4	WT	同種型對照	WT
2	抗原4	S183K	同種型對照	WT	抗原4	V133E	同種型對照	WT
33	抗原4	S183K	同種型對照	A141D	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
34	抗原4	S183K	同種型對照	A141E	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
35	抗原4	S183K	同種型對照	A141S	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
36	抗原4	S183K	同種型對照	A141T	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
41	抗原4	S183K	同種型對照	A141D	抗原4	V133E	同種型對照	T117K
1	抗原5	WT	抗原3	WT	抗原5	WT	抗原3	WT
2	抗原5	S183K	抗原3	WT	抗原5	V133E	抗原3	WT
33	抗原5	S183K	抗原3	A141D	抗原5	V133E	抗原3	T117R
34	抗原5	S183K	抗原3	A141E	抗原5	V133E	抗原3	T117R
35	抗原5	S183K	抗原3	A141S	抗原5	V133E	抗原3	T117R
36	抗原5	S183K	抗原3	A141T	抗原5	V133E	抗原3	T117R
41	抗原5	S183K	抗原3	A141D	抗原5	V133E	抗原3	T117K
1	抗原6	WT	抗原1	WT	抗原6	WT	抗原1	WT
2	抗原6	S183K	抗原1	WT	抗原6	V133E	抗原1	WT
33	抗原6	S183K	抗原1	A141D	抗原6	V133E	抗原1	T117R
34	抗原6	S183K	抗原1	A141E	抗原6	V133E	抗原1	T117R
35	抗原6	S183K	抗原1	A141S	抗原6	V133E	抗原1	T117R
36	抗原6	S183K	抗原1	A141T	抗原6	V133E	抗原1	T117R
41	抗原6	S183K	抗原1	A141D	抗原6	V133E	抗原1	T117K

在轉染後7至13天收集培養基，並通過0.22 μm無菌過濾器進行過濾。根據製造商的方案，使用蛋白A感測器藉由Octet384儀器（德國哥廷根（Göttingen, Germany）的賽多利斯公司（Sartorius））測量培養上清液中的抗體濃度。根據製造商的方案，藉由蛋白A磁珠親和純化（新澤西州皮斯卡特維（Piscataway, NJ）的金斯瑞公司（Genscript））或標準蛋白A親和層析（麻塞諸塞州馬爾波羅（Marlborough, MA）的思拓凡公司（Cytiva））、如有必要然後進行輕鏈親和層析純化抗體，隨後在PBS（pH 7.2）中進行緩衝液交換。藉由基於微流控技術的電泳和分析型粒徑排阻層析（參見下文的方法）測定所純化分子的純度和寡聚狀態。藉由製備型SEC去除蛋白質聚集體。使用理論上確定的消光係數，藉由讀取280 nm處的吸光度來確定所純化抗體的濃度。 粒徑排阻層析（ SEC ）

使用TSK-gel G3000SWxL柱（賓夕法尼亞州普魯士國王（King of Prussia, PA）的托索生物科學集團（Tosoh Biosciences））進行分析型SEC-HPLC（安捷倫公司（Agilent）的1260 Infinity HPLC系統）以測定所純化分子的寡聚狀態。使用Superdex 200柱（思拓凡公司）進行製備型SEC-HPLC以去除蛋白質聚集體。 基於微流控技術的電泳

根據製造商的方案（加利福尼亞州聖克拉拉（Santa Clara, CA）的安捷倫公司），使用生物分析儀（Bioanalyzer）進行基於微流控技術的電泳，以評估抗體的κ和λ輕鏈的比率，在此基礎上計算出正確輕鏈比率的百分比。 結合動力學測定

在Octet384儀器上藉由生物層干涉測量法測量結合動力學。將鏈黴親和素（SA）生物感測器在PBS pH 7.2、1 mg/ml BSA、0.05% （v/v）吐溫（動力學緩衝液）中加載生物素化蛋白抗原（德拉瓦州紐華克（Newark, DE）的ACRO生物公司（ACRO Biosystems））。將加載的生物感測器在相同的緩衝液中洗滌，然後在指定時間內用各種抗體進行結合和解離測量。使用Octet384軟體v.12.2.1.24對數據進行非線性擬合，由此計算出動力學參數（K _on和K _off）和親和力（K _D）。 加速穩定性研究

將蛋白質測試樣本在PBS（pH 7.2）中稀釋至1 mg/mL，並分成3個相等的等分試樣以用作對照、熱應激和光應激樣本。將對照樣本在4°C下孵育14天，將熱應激樣本在45°C下孵育14天，並在符合ICH要求的光穩定性試驗箱中，將光應激樣本置於玻璃小瓶中，暴露於3000 lux冷白光，在25°C下孵育7天。然後藉由HP-SEC對樣本進行分析，以確定聚集體、單體和片段的水平。 差示掃描螢光法（ DSF ）

樣本製備方法為：在96孔PCR板中，將20 µL在PBS（pH 7.2）中的1 mg/mL蛋白樣本與5 µL在PBS（pH 7.2）中稀釋至40倍的SYPRO Orange染料進行混合，一式兩份。將板密封，並在QuantStudio 7 Flex即時PCR系統中進行測量。將樣本在25°C下進行2分鐘的初始平衡步驟，然後以0.05°C/秒的增量升溫至99°C。使用FAM濾光片組監測螢光發射。使用Boltzmann方法在Protein Thermal Shift ^TM軟體中計算每個樣本的Tm值。 亞單位 LC-MS 分析

進行亞單位LC/MS分析以表徵錯配種類。將50 μg樣本乾燥，並在50 µL的100 mM磷酸鈉緩衝液（pH 7.0）中進一步重構。藉由在每個樣本中添加60個單位的FabALACTICA酶（IgdE）（瑞典隆德（Lund, Sweden）的Genovis AB公司）並在37°C下孵育16-18小時來進行消化。將Waters ACQUITY UPLC系統（麻塞諸塞州米爾福德（Milford, MA）的沃特世公司（Waters））與Waters Xevo G2-XS QTof質譜儀串聯，用於亞單位分離和質量測定。將2 µg經消化的亞單位注入Waters BioResolve RP mAb聚苯柱（2.1 x 150 mm，2.7 mm，450 Å）中進行分離。流動相A含有在水中的0.1%甲酸（FA）、0.01%三氟乙酸（TFA），並且流動相B含有在水加ACN中的0.1% FA、0.01% TFA。以0.2 mL/min的流速進行40分鐘的25% B到45% B的梯度。將柱溫設定為75°C。在280 nm的波長下獲得洗脫亞單位的UV圖譜。 微差掃描熱量法分析（ DSC ）

使用MICROCAL VP-DSC掃描微量熱儀（麻塞諸塞州北安普敦（Northampton, MA）的瑪律文公司（Malvern））進行DSC實驗。在DSC分析之前，將所有樣本在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS，pH 7.2）中稀釋至約0.6 mg/mL。使用UV-VIS分光光度計（NanoDrop 2000C）通過重複測量來確定精確濃度。將400 µL的每個樣本和相應的緩衝液（PBS，pH 7.2）加載到96孔板中，並置於自動進樣器室中在10°C下儲存直至分析。所有DSC測量均使用20°C至100°C的溫度窗，掃描速率為60°C/h。在樣本測量之前，獲得基線測量值（緩衝液與緩衝液）以用於從樣本測量值中扣除。使用Microcal公司提供的Origin™ DSC軟體進行數據分析、基線校正和解褶積。使用軟體內的線性連接函數執行基線校正。使用非二態模型進行解褶積分析，並使用1次和200次反覆運算循環獲得最佳擬合，直到卡方值最小化。對DSC解褶積結果的解釋係基於以下事實：抗體形式中的不同結構域會獨立展開。將T _起始值定義為熱譜圖開始從基線顯著升高時的溫度。將T _m值定義為與熱譜圖或解褶積化熱譜圖上每個峰最大值相對應的溫度值。 細胞活力測定

使用CellTiter-Glo™發光法細胞活力測定套組（普洛麥格公司（Promega））測定細胞活力。這種測定對存在的ATP進行定量，ATP表示具有代謝活性細胞的存在。利用發光讀板儀測量由螢光素酶催化的螢光素和ATP的反應所產生的發光。簡而言之，將表現抗原1的靶細胞以約1 × 10 ⁴個細胞/孔的密度接種在96孔板中，培養基為RPMI 1640，補充有0.1% BSA和0.2 ng/ml人重組EGF。將不同濃度的抗體添加到一式三份的樣本中，並將細胞在37°C和5% CO2條件下於濕化培養箱中孵育72小時。處理後，將細胞暴露於CellTiter-Glo®試劑（普洛麥格公司）約15分鐘，並採用EnVision 2104多模式讀板儀（珀金埃爾默公司（PerkinElmer））測量OD409。藉由測量相對於無抗體對照的ATP水平來確定細胞活力。 實例 3 - 電荷對變體的表現和性質

表3和圖4總結了在小規模細胞培養（3 mL）中產生的帶有所提出的電荷對組的抗原1/抗原2 DuetMab的表現和生物化學特徵。圖4示出了以X-Y散布圖繪製的表1的正確LC比率數據。與對照1號和2號相比，電荷對變體33號、34號、35號、36號和41號表現出更高的正確LC比率，並被選定進行另外的分析。

[ 表 3]：在小規模細胞培養（3 mL）中產生的帶有所提出的電荷對組的抗原1/抗原2 DuetMab的表現和生物化學特徵總結。藉由蛋白A磁珠親和純化來純化抗體。

殘基組	樣本編號	抗原 1 （臼臂）	抗原 2 （杵臂）	第 7 天的效價（ µg/mL ）	正確 LC 比率 %
CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）
對照	1	WT	WT	WT	WT	183.5	69.8
2	S183K	V133E	WT	WT	121.9	91.8
A	3	S183K	V133E	L128D	V134R	93.7	38.4
4	S183K	V133E	L128E	V134R	125.0	26.7
5	S183K	V133E	L128S	V134R	130.3	30.1
6	S183K	V133E	L128T	V134R	104.6	25.8
B	7	S183K	V133E	L145D	V134R	166.3	48.8
8	S183K	V133E	L145E	V134R	157.8	72.6
9	S183K	V133E	L145S	V134R	163.2	47.8
10	S183K	V133E	L145T	V134R	129.0	37.5
A	11	S183K	V133E	L128D	V134K	127.8	37.2
12	S183K	V133E	L128E	V134K	108.2	27.9
13	S183K	V133E	L128S	V134K	137.7	30.6
14	S183K	V133E	L128T	V134K	149.2	35.8
B	15	S183K	V133E	L145D	V134K	158.1	33.3
16	S183K	V133E	L145E	V134K	155.9	45.6
17	S183K	V133E	L145S	V134K	193.8	21.6
18	S183K	V133E	L145T	V134K	130.5	21.9
H	19	S183K	V133E	WT	V134K	158.7	12.2
20	S183K	V133E	S183D	V134K	130.9	25.8
C	21	S183K	V133E	V185D	L136R	169.0	21.0
22	S183K	V133E	V185E	L136R	167.0	8.6
23	S183K	V133E	V185S	L136R	138.3	9.7
24	S183K	V133E	V185T	L136R	148.8	11.9
25	S183K	V133E	V185D	L136K	128.5	38.5
26	S183K	V133E	V185E	L136K	129.3	32.7
27	S183K	V133E	V185S	L136K	151.1	28.2
28	S183K	V133E	V185T	L136K	143.5	27.4
D	29	S183K	V133E	V185D	T117R	130.4	53.2
30	S183K	V133E	V185E	T117R	137.2	77.0
31	S183K	V133E	V185S	T117R	150.9	80.8
32	S183K	V133E	V185T	T117R	144.4	79.5
E	33	S183K	V133E	A141D	T117R	242.2	96.0
34	S183K	V133E	A141E	T117R	256.8	95.6
35	S183K	V133E	A141S	T117R	214.0	93.1
36	S183K	V133E	A141T	T117R	132.4	95.0
D	37	S183K	V133E	V185D	T117K	89.0	46.2
38	S183K	V133E	V185E	T117K	108.3	57.0
39	S183K	V133E	V185S	T117K	152.0	76.4
40	S183K	V133E	V185T	T117K	131.7	74.1
E	41	S183K	V133E	A141D	T117K	167.7	93.5
42	S183K	V133E	A141E	T117K	177.0	90.8
43	S183K	V133E	A141S	T117K	167.0	80.4
44	S183K	V133E	A141T	T117K	119.9	82.2
F	45	S183K	V133E	L128D	F119R	79.1	56.4
46	S183K	V133E	L128E	F119R	99.5	18.5
47	S183K	V133E	L128S	F119R	100.3	28.0
48	S183K	V133E	L128T	F119R	87.4	28.8
49	S183K	V133E	L128D	F119K	48.2	56.7
50	S183K	V133E	L128E	F119K	106.0	43.0
51	S183K	V133E	L128S	F119K	91.7	41.4
52	S183K	V133E	L128T	F119K	67.4	39.5
G	53	S183K	V133E	V173D	Y178R	95.3	46.7
54	S183K	V133E	V173E	Y178R	89.6	16.2
55	S183K	V133E	V173S	Y178R	105.7	21.5
56	S183K	V133E	V173T	Y178R	94.6	13.5
57	S183K	V133E	V173D	Y178K	139.1	10.8
58	S183K	V133E	V173E	Y178K	94.0	74.3
59	S183K	V133E	V173S	Y178K	130.0	12.9
60	S183K	V133E	V173T	Y178K	105.3	12.1

表4總結了在大規模細胞培養（100 mL）中產生的帶有所選定電荷對變體1號、2號、33號、34號、35號、36號和41號的抗原1/抗原2 DuetMab的表現（表4A）和生物化學特徵（表4B）。儘管生產規模不同，但所選定DuetMab的生物化學特徵係一致的。對於另外的分析，藉由輕鏈親和層析進一步純化DuetMab，以去除錯配的副產物，並藉由製備型SEC去除聚集體。

[ 表 4A]：在大規模細胞培養（100 mL）中產生的所選定電荷對樣本1號、2號、33號、34號、35號、36號和41號的表現數據總結。

樣本編號	抗原 1 （臼臂）	抗原 2 （杵臂）	效價（ µg/mL ）
CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）	第 7 天	第 10 天	第 14 天
1	WT	WT	WT	WT	99.8	228.4	361
2	S183K	V133E	WT	WT	83.5	189.2	316.8
33	S183K	V133E	A141D	T117R	86.6	190.2	291
34	S183K	V133E	A141E	T117R	99.6	218.3	342.9
35	S183K	V133E	A141S	T117R	107.7	237	383
36	S183K	V133E	A141T	T117R	115.4	247.1	388.5
41	S183K	V133E	A141D	T117K	40.4	82.2	103.9

[ 表 4B]：在大規模細胞培養（100 mL）中產生的所選定電荷對樣本1號、2號、33號、34號、35號、36號和41號的生物化學特徵總結。為了進行進一步的生物化學、生物物理和生物學分析，藉由蛋白A親和層析，之後藉由輕鏈親和層析純化抗體，然後進行製備型SEC以去除聚集體。

樣本編號	抗原 1 （臼臂）	抗原 2 （杵臂）	蛋白 A 純化後的特徵	輕鏈親和純化後的特徵
	CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）	正確 LC 比率 %	單體 %	正確 LC 比率 %	單體 %
1	WT	WT	WT	WT	64.9	91.9	90.9	＞99
2	S183K	V133E	WT	WT	92.1	91.7	93.6	＞99
33	S183K	V133E	A141D	T117R	98.6	93.5	99.7	＞99
34	S183K	V133E	A141E	T117R	97.1	92.3	99.7	＞99
35	S183K	V133E	A141S	T117R	90.2	94.3	95.3	＞99
36	S183K	V133E	A141T	T117R	99.7	92.5	93.8	＞99
41	S183K	V133E	A141D	T117K	96.3	92.5	99.0	＞99

圖5和表5示出了帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的結合動力學。圖5示出了對照樣本1號和代表測試變體的變體33號的響應訊息和擬合曲線。變體33號、34號、35號、36號和41號對抗原2的結合親和力與對照1號和2號相當。

[ 表 5]：使用Ocet384儀器獲得對可溶性單體形式的抗原2的動力學測量。對數據進行非線性擬合，由此將解離常數K _D計算為k _off/k _on的比率。

樣本編號	抗原 1 （ CH1/Cκ ）	抗原 2 （ CH1/Cλ ）	KD （ M ）	KD 誤差	ka （ 1/Ms ）	ka 誤差	kdis （ 1/s ）	kdis 誤差	全量 X^2	全量 R^2
1	WT	WT	3.45E-10	2.58E-12	5.20E+05	9.11E+02	1.80E-04	1.30E-06	0.2098	0.9994
2	S183K/V133E	WT	5.08E-10	1.83E-12	4.89E+05	5.64E+02	2.48E-04	8.45E-07	0.0905	0.9998
33	S183K/V133E	A141D/T117R	2.43E-10	2.11E-12	4.19E+05	5.69E+02	1.02E-04	8.74E-07	0.0893	0.9997
34	S183K/V133E	A141E/T117R	4.13E-10	2.17E-12	5.67E+05	8.45E+02	2.34E-04	1.18E-06	0.1941	0.9995
35	S183K/V133E	A141S/T117R	4.72E-10	1.79E-12	4.43E+05	4.90E+02	2.09E-04	7.59E-07	0.0821	0.9998
36	S183K/V133E	A141T/T117R	4.04E-10	1.97E-12	4.86E+05	6.21E+02	1.96E-04	9.23E-07	0.1196	0.9997
41	S183K/V133E	A141D/T117K	4.90E-10	1.37E-12	5.03E+05	4.45E+02	2.46E-04	6.53E-07	0.0567	0.9999

表6總結了藉由差示掃描螢光法（DSF）獲得的帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的熱穩定性及其加速穩定性特徵。NIP228用作IgG1對照。抗原1/抗原2 DuetMab變體在熱應激後未表現出聚集或斷裂的問題。抗原1/抗原2 DuetMab變體的HP-SEC滯留時間與NIP228 IgG1對照的滯留時間一致（與NIP228的ΔRT ＜ 0.2 m）。DSF值在各電荷對變體之間未顯示出顯著性差異，並且與NIP228 IgG1對照的值一致。

[ 表 6]：在45°C下孵育14天後，藉由SEC對變體的加速穩定性進行測量。DSF值記錄了所選定變體的T _起始和T _m。

	加速穩定性（45°C，14 d）	DSF
樣本	單體損失（＜ 5%）	聚集體增加（＜ 1%）	片段增加（＜ 4%）	與NIP228的ΔRT（＜ 0.2 m）	T 起始	T m
對照1號	-1.20	0.10	1.10	0.16	56.91	66.44
對照2號	-1.10	0.00	1.10	0.15	56.74	66.16
變體33號	-1.90	0.00	1.90	0.14	57.09	66.41
變體34號	-1.13	0.00	1.13	0.14	56.74	65.91
變體35號	-3.67	0.00	3.67	0.15	57.55	66.04
變體36號	-1.15	0.00	1.15	0.15	57.61	66.14
變體41號	-1.10	0.00	1.10	0.14	57.79	66.28

圖6和表7示出了使用微差掃描熱量法（DSC）分析對帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的熱穩定性研究。圖3展示了抗原1/抗原2 DuetMab變體的堆疊熱譜圖。對熱譜圖的解褶積揭示了Fab、CH2和CH3結構域的轉變，其中一些轉變重疊並在相同的TM峰下。表7列出了抗原1/抗原2 DuetMab電荷對變體的解褶積化TM和近似T _起始值。所有變體具有相似的近似T _起始值，表明所選定的電荷對不會顯著影響熱穩定性。

[ 表 7]：DSC熱穩定性測量捕獲的Fab、CH2和CH3結構域符合T _M1、T _M2、T _M3和T _M4描述的轉變。一些轉變處於相同的T _M峰轉變下。

樣本	抗原1（CH1/Cκ）	抗原2（CH1/Cλ）	T M1（°C）	T M2（°C）	T M3（°C）	T M4（°C）	近似T 起始（°C）± S.D.
對照1號	WT	WT	67.6	68.5	72.1	79.8	49.5 ± 0.7
對照2號	S183K/V133E	WT	64.8	68.7	NA	79.3	48.4 ± 0.3
變體33號	S183K/V133E	A141D/T117R	64.5	68.8	NA	79.2	49.3 ± 1.4
變體34號	S183K/V133E	A141E/T117R	63.7	68.7	NA	79.4	50.3 ± 1.1
變體35號	S183K/V133E	A141S/T117R	64	68.7	NA	79.4	48.3 ± 0.5
變體36號	S183K/V133E	A141T/T117R	64.5	68.7	NA	79.4	52.5 ± 0.3
變體41號	S183K/V133E	A141D/T117K	64.5	68.7	NA	79.3	50.8 ± 0.3

圖7和表8示出了帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的亞單位質譜數據。理論質量和實測質量的比對證實了每種變體的分子完整性和LC/HC結合特性。

[ 表 8]：亞單位LC/MS分析的MS結果。

對照1號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47474	47474
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47020	47021
具有2個G0F的Fc	53015	53016
對照2號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47020	47021
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體33號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47119	47120
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體34號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47133	47134
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體35號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47091	47092
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體36號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47105	47106
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體41號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47091	47092
具有2個G0F的Fc	53015	53016

圖8示出了帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的細胞毒性特性，這係藉由對ATP進行定量來測定的，ATP表示具有代謝活性細胞的存在。變體33號、34號、35號、36號和41號顯示與對照1號和2號相同程度的細胞毒性，表明電荷對變體不會影響抗原1/抗原2 DuetMab的生物學功能。

圖9和表9總結了不同Fv DuetMab中所選定電荷對變體的表現和生物化學特徵。圖9示出了以分組箱型圖繪製的表9的正確LC比率數據。在不同的Fv DuetMab中，與對照1號和2號相比，電荷對變體33號、34號、35號、36號和41號顯示出更高的正確LC比率。

[ 表 9]：不同Fv DuetMab中所選定電荷對變體的表現和生物化學特徵總結。

DuetMab	樣本編號	臼臂	杵臂	第 10/12 天的效價（ µg/mL ）	正確 LC 比率 %	單體 %
CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）
抗原1/抗原2	1	WT	WT	WT	WT	228.4	63.3	91.8
2	S183K	V133E	WT	WT	189.2	92.1	91.7
33	S183K	V133E	A141D	T117R	190.2	98.6	93.5
34	S183K	V133E	A141E	T117R	218.3	97.1	92.3
35	S183K	V133E	A141S	T117R	237.0	90.2	94.2
36	S183K	V133E	A141T	T117R	247.1	99.7	92.5
41	S183K	V133E	A141D	T117K	82.2	96.3	93.5
抗原1/抗原3	1	WT	WT	WT	WT	364.2	38.2	94.8
2	S183K	V133E	WT	WT	313.6	66.4	97.3
33	S183K	V133E	A141D	T117R	289.9	89.8	96.5
34	S183K	V133E	A141E	T117R	365.5	93.6	96.2
35	S183K	V133E	A141S	T117R	262.7	78.4	97.4
36	S183K	V133E	A141T	T117R	241.1	79.2	97.1
41	S183K	V133E	A141D	T117K	252.7	92.1	97.1
抗原4/同種型對照	1	WT	WT	WT	WT	254.9	50.2	100.0
2	S183K	V133E	WT	WT	243.2	80.7	100.0
33	S183K	V133E	A141D	T117R	173.2	99.7	100.0
34	S183K	V133E	A141E	T117R	305.4	98.2	100.0
35	S183K	V133E	A141S	T117R	257.0	96.5	100.0
36	S183K	V133E	A141T	T117R	219.5	98.9	100.0
41	S183K	V133E	A141D	T117K	175.4	98.6	100.0
抗原5/抗原3	1	WT	WT	WT	WT	162.2	86.9	95.4
2	S183K	V133E	WT	WT	124.8	98.1	100.0
33	S183K	V133E	A141D	T117R	93.8	96.8	100.0
34	S183K	V133E	A141E	T117R	90.5	96.0	100.0
35	S183K	V133E	A141S	T117R	124.0	92.9	100.0
36	S183K	V133E	A141T	T117R	127.0	96.3	100.0
41	S183K	V133E	A141D	T117K	100.5	100.0	100.0
抗原6/抗原1	1	WT	WT	WT	WT	138.7	88.2	96.9
2	S183K	V133E	WT	WT	110.6	83.4	99.0
33	S183K	V133E	A141D	T117R	128.7	97.7	96.5
34	S183K	V133E	A141E	T117R	63.1	95.2	98.9
35	S183K	V133E	A141S	T117R	143.4	82.6	95.0
36	S183K	V133E	A141T	T117R	109.3	76.1	96.6
41	S183K	V133E	A141D	T117K	124.4	98.7	97.8

實例 4 - CH1-CL （ λ ）介面中提出的突變的晶體學研究

進行X射線晶體學分析以進一步研究輕鏈: CH1介面處的λ電荷變體。 Fab 選殖和表現

(i) 來自抗抗原2抗體的輕鏈的可變結構域和含有T117R、S122C和C212V突變的人λ輕鏈的恒定結構域，以及 (ii) 抗抗原2抗體重鏈的可變結構域和含有A141D或A141E以及F126C和C220V突變的CH1結構域的編碼序列均以合成DNA gBlock的形式向集成DNA技術公司（Integrated DNA Technologies）（愛荷華州柯拉爾維爾（Coralville, IA））訂購。輕鏈的編碼序列兩側係N-末端BssHII和C-末端NheI限制性位點，並且重鏈的編碼序列兩側係N-末端BsrGI和C-末端EcoRI限制性位點以便於選殖。將gBlock消化並插入到哺乳動物表現載體（pOE；馬里蘭州蓋瑟斯堡（Gaithersburg, MD）的阿斯利康公司（AstraZeneca））中。將One Shot Top10化學感受態大腸桿菌細胞（加利福尼亞州喀斯巴德（Carlsbad, CA）的英傑公司（Invitrogen））用作基因選殖的宿主。

使用293fectin轉染試劑（加利福尼亞州喀斯巴德的生命科技公司（Life Technologies））和標準方案，在人胚腎（HEK）293細胞的懸浮液中瞬時表現兩種Fab。使細胞在FreeStyle 293-F表現培養基（生命科技公司）中生長10天，並用專有的細胞補料溶液（阿斯利康公司）補料，之後將懸浮液離心，並使上清液通過0.2 μM過濾器過濾。使用5 ml CaptureSelect CH1-XL柱（麻塞諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司）從上清液中純化Fab，用25 mM Hepes pH 7透析，並用5 ml HiTrap SP HP陽離子交換柱（麻塞諸塞州馬爾波羅（Marlborough, MA）的思拓凡公司）在NaCl梯度中進一步精製，以提高樣本的均質性。 結晶、收穫和 X 射線繞射數據獲取

使Fab分別在Superdex 200 Increase 10/300 GL柱（思拓凡公司）上運行，該柱已用25 mM HEPES（pH 7.5）和100 mM NaCl預平衡，以確保在安排結晶篩選之前樣本的均質性。兩種蛋白質的初始結晶嘗試均在20°C下藉由坐滴蒸氣擴散法進行。使用Phoenix結晶機器人（藝術羅賓斯儀器公司（Art Robbins Instruments））和市售結晶篩選物將結晶液滴分配到96孔結晶板（Intelli-Plate 102-0001-20；加利福尼亞州森尼韋爾（Sunnyvale, CA）的藝術羅賓斯儀器公司）中。液滴由等體積的蛋白質和池液組成。 結果

利用以下結晶溶液，從原先的坐滴板上直接收穫繞射品質晶體：A141E：0.1 M BIS-TRIS pH 6.5；25% w/v PEG 3350，蛋白質濃度為18.4 mg/ml。A141D：200 mM氯化鈉；0.1 M BIS-TRIS pH 5.5；25% w/v PEG 3350，蛋白質濃度為9 mg/ml。將收穫用於X射線分析的所有晶體都在液氮中快速冷卻，並且在Stanford Synchrotron Radiation Lightsource（加利福尼亞州門洛派克（Menlo Park, CA））的光束線B14-1上以100 K進行繞射實驗。使用XDS軟體（Kabsch, 2010）對從每種Fab的單晶採集的繞射數據進行處理、整合和標準化。

兩種Fab分子的結構均使用CCP4（Winn, 2011）晶體學套裝軟體的程式MolRep（Vagin, 1997）使用分子置換法來確定。使用Coot（Emsley, 2004）進行模型建立，對於細化，使用了程式Refmac5（Kovalevskiy, 2018）。

T117R/A141D Fab的晶體繞射至2.1 Å。在完成細化後，我們發現與我們的預測一致，即突變胺基酸的側鏈確實構建了相當強的氫鍵（圖10）。

T117R/A141E Fab的晶體繞射至2.0 Å。在完成細化後，我們發現與我們的預測一致，即突變胺基酸的側鏈確實構建了氫鍵（圖11）。 實例 5 – 含有 λ 電荷對的 2+1 雙特異性抗體的產生

本文闡述的材料和方法用於進行後續實例中描述的實驗。除非另有說明，否則所有試劑均來自麻塞諸塞州沃爾瑟姆（Waltham, MA）的賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）。 具有電荷突變的 Duet2 （ 2+1 ）雙特異性 p2+1- 重哺乳動物表現載體的構建

在實例2中所述之pDuet-重的骨架上構建載體p2+1-重。為了構建具有電荷突變的p2+1-重載體，如前所述藉由BssHII/HindIII將「臼」重鏈選殖到載體中。使用BsrGI/EcoRI的限制性選殖技術，藉由VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3結構域的合成DNA片段將「杵」重鏈選殖到載體中，其中前面的VH-CH1區段對應於在「臼」重鏈上發現的序列，隨後的VH-CH1區段含有針對另一個靶標的VH以及CH1中的電荷突變A141D和V12 DS。pDuet-輕載體對於Duet2（2+1）雙特異性和DuetMab構建體係共同的。 表現、親和純化以及蛋白定量

所有Duet2（2+1）雙特異性構建體均如上文所述針對DuetMab分子那樣進行瞬時表現和純化。

結合動力學測定、加速穩定性研究、亞單位LC-MS分析和微差掃描熱量法分析（DSC）基本上如上所述針對DuetMab蛋白那樣進行。 xCELLigence 細胞殺傷測定

用xCELLigence即時細胞分析儀（ACEA生物科學公司（ACEA Biosciences））評估T細胞介導的細胞毒性。將每孔總共1 x 10 ⁴個靶細胞接種在E板（E-Plate）中，該等靶細胞用補充有10%熱滅活FBS和50 μM 2-巰基乙醇的RPMI1640培養基重懸。在37°C和5% CO ₂下過夜細胞黏附後，以10:1的E:T比率加入效應細胞（來自健康供體的PBMC），並加入不同濃度的抗體。每10分鐘監測細胞指數（即相對細胞阻抗）值，並將接近48小時的時間點（高於或低於）用於數據分析。將細胞毒性歸一化為未經抗體處理的最大細胞指數值，並使用GraphPad Prism v 9.0.0繪圖。 CD69 和 CD25 表現測定

利用流式細胞術在T細胞介導的細胞毒性測定中表徵人T細胞活化。孵育兩天後，收穫來自細胞毒性測定的T細胞並進行分析。藉由對CD2和CD4（均來自美國加利福尼亞州聖地牙哥的百進生技公司（BioLegend））表面表現的染色來測量來自PBMC的T細胞。T細胞活化藉由兩種T細胞活化標誌（CD69、CD25）（均來自美國加利福尼亞州聖地牙哥的百進生技公司）的染色來確定，並藉由來自BD的流式細胞儀FACSymphony A3來分析。使用FlowJo v 10.6.1分析數據，並使用GraphPad Prism v 9.0.0繪圖。 結果

表10總結了在500 mL細胞培養中產生的帶有所選定電荷對組的抗原1/CD3和NIP228/CD3 Duet2（2+1）雙特異性分子的表現和生物化學特徵。對於另外的分析，藉由輕鏈親和層析進一步純化DuetMab，以去除錯配的副產物，並藉由製備型SEC去除聚集體。

[ 表 10] ：具有電荷突變的Duet2（2+1）雙特異性的產生

Duet2 （ 2+1 ）雙特異性

抗原 1/ NIP228 （臼臂）

抗原 1/ NIP228 （杵臂）

CD3 （杵臂）

效價（ µg/mL ）

蛋白 A 純化後的特徵

輕鏈純化後的特徵

第 7 天

第 14 天

κ 和 λ 的比率

單體 %

κ 和 λ 的比率

單體 %

內毒素（ EU/mg ）

CH1

C K

CH1

C K

CH1 （ V12 ）

Cλ （ v12 ）

抗原1/CD3 2+1

S183K

V133E

S183K

V133E

A141D

T117R

55

130

2.49:1

90

2 : 1

＞99

＜0.5

NIP228 /CD3 2+1

S183K

V133E

S183K

V133E

A141D

T117R

96

380

2.39:1

91

1.9:1

＞99

＜0.5

圖13示出了抗原1/CD3 Duet2（2+1）雙特異性分子與抗原1和CD3抗原的結合動力學。表11示出了響應訊息和擬合曲線。

[ 表 11] ：具有電荷突變的抗原1/CD3 Duet2（2+1）雙特異性的動力學結合。

Duet2 （ 2+1 ）雙特異性

抗原

抗原 1 （ CH1/Cκ ）

抗原 1 （ CH1/Cκ ） - CD3 （ CH1/Cλ ）

KD （ M ）

KD 誤差

ka （ 1/Ms ）

ka 誤差

kdis （ 1/s ）

kdis 誤差

全量 X^2

全量 R^2

抗原 1 （ CH1/Cκ ）

CD3 （ CH1/Cλ ）

抗原1/CD3 2+1

抗原1

S183K/V133E

S183K /V133E

A141D /T117R

1.521E-10

2.291E-12

5.884E05

1.177E03

8.948E-05

1.336E-06

0.2425

0.9987

抗原1/CD3 2+1

CD3

S183K/V133E

S183K /V133E

A141D /T117R

3.180E-08

2.752E-11

3.004E04

2.455E01

9.555E-04

2.721E-07

2.4719

0.9997

表12總結了藉由差示掃描螢光法（DSF）獲得的抗原1/CD3和NIP228 /CD3 Duet2（2+1）雙特異性分子的熱穩定性及其加速穩定性特徵。Duet2（2+1）雙特異性分子在熱應激後未表現出聚集或斷裂的問題。

[ 表 12] ：具有電荷突變的Duet2（2+1）雙特異性的可開發性總結

Duet2 （ 2+1 ）雙特異性	加速穩定性（45°C，14 d）	DSF
單體損失（%）	聚集體增加（%）	片段增加（%）	與NIP228的ΔRT (m)	T 起始	T m
抗原1/CD3 2+1	6.18	0.30	5.87	6.18	50	60.6
NIP228 /CD3 2+1	3.19	0.69	2.49	3.19	47	58.3

圖14和表13示出了抗原1/CD3和NIP228/CD3 Duet2（2+1）雙特異性分子的亞單位質譜數據。理論質量和實測質量的比對證實了每種變體的分子完整性和LC/HC結合特性。

[ 表 13] ：亞單位LC/MS分析的MS結果。

抗原 1/ CD3 2+1	實測質量	理論質量
具有2個G0F的Fc	53095	53095
抗原1 LC + 抗原1 HC Fab（臼臂）	47545	47544
抗原1 LC + 抗原1 HC Fab + CD3 LC + CD3 HC Fab（杵臂）	95876	95876
NIP228/ CD3 2+1	實測質量	理論質量
具有2個G0F的Fc	53095	53095
NIP228-LC + NIP228 HC Fab（臼臂）	46991	46991
NIP228 LC + NIP228 HC Fab + CD3 LC + CD3 HC Fab（杵臂）	95322	95322

圖15和表14示出了使用微差掃描熱量法（DSC）分析對抗原1/CD3和NIP228/CD3 Duet2（2+1）雙特異性分子的熱穩定性研究。圖15展示了抗原1/CD3和NIP228/CD3 Duet2（2+1）雙特異性分子的堆疊熱譜圖。對熱譜圖的解褶積揭示了Fab、CH2和CH3結構域的轉變，其中一些轉變重疊並在相同的TM峰下。表14列出了Duet2（2+1）雙特異性分子的解褶積化TM和近似T起始值。

[ 表 14] ：亞單位LC/MS分析的MS結果。

名稱	T M1（°C）	T M2（°C）	T M3（°C）	近似T 起始（°C）± S.D.
抗原1/CD3 Duet2（2:1）	64.6	70.5	79.0	51.8 ± 0.4
NIP228/CD3 Duet2（ 2:1）	66.7	71.8	79.3	53  ± 1.3

圖16示出了DuetMab和Duet2（2+1）雙特異性分子的細胞毒性特性，如藉由xCELLigence細胞毒性測定所確定的。與對應的1+1抗原1/CD3 DuetMab相比，具有兩個抗抗原1 Fab臂的抗原1/CD3 Duet2雙特異性在消除表現抗原1的靶細胞方面表現出更優的效力。與用抗原1/CD3 DuetMab處理的孔相比，抗原1/CD3 Duet2雙特異性處理的孔表現出升高的CD8和CD4 T細胞活化。NIP228/CD3 DuetMab和NIP228/CD3 Duet2（2+1）雙特異性作為同種型對照包括在該測定中。對照分子表現出低細胞毒性，並誘導有限的CD8和CD4 T細胞活化。 序列 1. WT CLλ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 1 ） GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 2. 經修飾以形成工程化二硫橋的「 V12 」 LCλ 恒定（ CLλ ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 2 ） 以下取代帶有底線： 工程化二硫化物：S122C、C212V GQPKAAPSVTLFPP CSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE VS 3. WT LCκ 恒定（ Cκ ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 3 ） RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 4. IgG1 CH1 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:4 ） ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC 5. 經修飾以形成工程化二硫橋的「 V12 」 CH1 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:5 ） 以下取代帶有底線： 工程化二硫化物：F126C、C220V ASTKGPSV CPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V 6. IgG1 CH2 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:6 ） LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS 7. IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:7 ） GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8. IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:8 ） ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9. 經工程化以含有「臼」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:9 ） 以下取代帶有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）。 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 10. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「臼」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:10 ） 以下取代帶有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；和穩定性半胱胺酸突變（Y349C）。 GQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 11. 經工程化以含有「杵」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:11 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）。 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 12. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「杵」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:12 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）；穩定性半胱胺酸突變（S354C）。 GQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 13. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「臼」突變的 IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:13 ） 以下取代帶有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；和穩定性半胱胺酸突變（Y349C）。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 14. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「杵」突變的 IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:14 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）；穩定性半胱胺酸突變（S354C）。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸、鏈間半胱胺酸突變和「杵」突變的「 V12 」 IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:15 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C220V）；穩定性半胱胺酸突變（S354C）。 ASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 16. 連接子（ SEQ ID NO:16 ） GGGGS 17. 連接子（ SEQ ID NO:17 ） SGGGGS 18. 連接子（ SEQ ID NO:18 ） GGGGSGGGGS

無

現在將參考附圖來討論展示本揭露原理的各方面和實驗，其中：

[ 圖 1A]展示了抗體中κ輕鏈（LC）和重鏈（HC）的CH1之間的介面。標記了κLC的V133和HC的S183。

[ 圖 1B]展示了抗體中λLC與HC的CH1之間的介面。標記了λLC的V134和Y178以及HC的S183K。

[ 圖 2]包含含有電荷對的DuetMab抗體的示意圖。左側的「臼」HC經由天然半胱胺酸與κLC形成二硫鍵連接，並含有κ電荷對（例如，S183K/V133E），由κLC上的減（「-」）號和「臼」HC上的加（「+」）號表示。右側的「杵」HC經由工程化半胱胺酸與λLC形成二硫鍵，並含有λ電荷對，由λLC上的加（「+」）號和「杵」HC上的減（「-」）號表示。

[ 圖 3]展示了含有示例性λ電荷對（T117R和A141S）的抗體中λLC與HC的CH1之間的介面。標記了λLC的T117R和HC的A141S。

[ 圖 4] .將表1中正確LC比率%的數據繪製在X-Y散布圖中。根據正確LC比率%，選擇電荷對變體33號、34號、35號、36號和41號進行另外的分析。

[ 圖 5]示出了對照樣本1號和代表測試變體的變體33號的響應訊息和擬合曲線。使用Ocet384儀器獲得對可溶性單體形式的抗原2的動力學測量。對數據進行非線性擬合，由此將解離常數KD計算為k _off/k _on的比率。

[ 圖 6]示出了DSC熱穩定性測量捕獲的Fab、CH2和CH3結構域符合T _M1、T _M2、T _M3和T _M4描述的轉變。

[ 圖 7]示出了每個樣本的亞單位LC/MS分析的UV層析圖。未鑒定出與錯配種類相對應的亞單位。

[ 圖 8] .測定了具有不同電荷對的變體的細胞毒活性。每個點代表一式三份孔的平均值，並且平均值±標準誤差（SEM）由誤差條表示。R347係同種型對照。

[ 圖 9]提供了以分組箱型圖繪製的表9中正確LC比率%的數據的圖示。

[ 圖 10]提供了基於從本文所述之晶體學研究生成的數據而獲得的CH1-CL結構域介面的卡通圖示，其中在λ輕鏈的CL中存在突變T117R，並在重鏈的CH1中存在突變A141D。在CH1結構域的位置141處的天冬胺酸的OD1原子與λ輕鏈的位置117處的精胺酸的NH1原子之間看似形成了距離為約2.4 Å的強氫鍵。

[ 圖 11]提供了基於從本文所述之晶體學研究生成的數據而獲得的CH1-CL結構域介面的卡通圖示，其中在λ輕鏈的CL中存在突變T117R，並在重鏈的CH1中存在突變A141E。在CH1結構域的位置141處的天冬胺酸的OE1原子與λ輕鏈的位置117處的精胺酸的NH1原子之間看似形成了距離為約3.0 Å的氫鍵。

[ 圖 12]包含含有電荷對的DuetMab「2+1」抗體的示意圖。右側的「杵」HC經由工程化半胱胺酸與λLC形成二硫鍵，並含有λ電荷對，由λLC上的加（「+」）號和「杵」HC上的減（「-」）號表示。這種杵HC的CH1和VH區與λLC形成「第一抗原結合臂」。左側的「臼」HC經由天然半胱胺酸與κLC形成二硫鍵，並含有κ電荷對（例如，S183K/V133E），由κLC上的減（「-」）號和「臼」HC上的加（「+」）號表示。這種「臼」HC的CH1和VH區與κLC形成「第二抗原結合臂」。第三抗原結合臂藉由肽連接子從其CH1的N-末端融合至「杵」HC的C-末端。第三抗原結合臂的CH1經由天然半胱胺酸與κLC形成二硫鍵，並含有κ電荷對。如不同陰影所示，第一抗原結合臂結合第一表位（例如，CD3），第二和第三結合臂結合不同的第二表位。

[ 圖 13]提供了說明使用Ocet384儀器獲得的可溶性單體形式的抗原1（上圖）和異二聚體形式的CD3ε/δ（下圖）的動力學測量的代表性圖像。

[ 圖 14]提供了抗原1/CD3 2+1雙特異性（上層析圖）和NIP228/CD3 2+1雙特異性（下層析圖）的亞單位LC/MS分析的UV層析圖。未鑒定出與錯配種類相對應的亞單位。

[ 圖 15]提供了抗原1/CD3 2+1雙特異性（實線）和NIP228/CD3 2+1雙特異性（虛線）的代表性DSC熱穩定性測量圖。

[ 圖 16]提供了DuetMab和Duet2（2+1）雙特異性的殺傷測定和T細胞活化（CD8和CD4）數據。細胞毒性的每個點代表一式三份孔的平均值，並且平均值±標準誤差（SEM）由誤差條表示。

[ 圖 17]包含含有電荷對的DuetMab「2+2」抗體的示意圖。抗體對應於圖12的抗體，具有另外的抗原結合臂。匹配顏色的抗原結合臂結合相同的表位。 A示出了「2+2」形式的對稱排列，其中第一表位的抗原結合臂位於重鏈的N-末端，第二表位的抗原結合臂緊鄰它們的C-末端。 B示出了「2+2」形式的不對稱排列，其中含有第一表位的抗原結合臂的一條重鏈位於其N-末端，含有第二表位的抗原結合臂的另一條重鏈位於其N-末端。

無

TW202506726A_113112828_SEQL.xml

Claims (46)

1. 一種多特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈；和 (b)   第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈；以及 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈， 其中該第一抗原結合臂結合第一表位，該第二和第三抗原結合臂結合第二表位， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂或該第二和第三抗原結合臂兩者包含位於輕鏈的恒定輕鏈λ區（CLλ）和CH1中以下位置對中一或多對處的λ電荷對： (i)    該CLλ中的位置117和該CH1中的位置141； (ii)   該CLλ中的位置117和該CH1中的位置185； (iii)  該CLλ中的位置119和該CH1中的位置128； (iv)  該CLλ中的位置134和該CH1中的位置128； (v)   該CLλ中的位置134和該CH1中的位置145； (vi)  該CLλ中的位置134和該CH1中的位置183； (vii) 該CLλ中的位置136和該CH1中的位置185； (viii)       該CLλ中的位置178和該CH1中的位置173；以及 (ix)  該CLλ中的位置117和該CH1中的位置187， 其中該λ電荷對包含位於該λ電荷對中位置之一處的視需要選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於該λ電荷對中另一位置處的視需要選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基，並且 其中編號係根據EU索引進行的。
2. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置117和該CH1中的位置141處。
3. 如請求項2所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的蘇胺酸。
4. 如請求項2所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的蘇胺酸；以及 e.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸。
5. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置117和該CH1中的位置185處，視需要其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸。
6. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置119和該CH1中的位置128處，視需要其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸。
7. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置134和該CH1中的位置128處，視需要其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸。
8. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置134和該CH1中的位置145處，視需要其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的蘇胺酸。
9. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置134和該CH1中的位置183處，視需要其中該λ電荷對係在該CLλ的位置134處的離胺酸，以及在該CH1的位置183處的天冬胺酸或絲胺酸。
10. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置136和該CH1中的位置185處，視需要其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸。
11. 如請求項1所述之多特異性抗體，其中該λ電荷對位於該CLλ中的位置178和該CH1中的位置173處，視需要其中該λ電荷對選自以下列表： a.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的天冬胺酸； b.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的麩胺酸； c.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的絲胺酸； d.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的蘇胺酸； e.     在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的麩胺酸； g.     在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的絲胺酸；以及 h.     在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的蘇胺酸。
12. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中以下兩者中任一： (i)    該第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間，而該第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接均形成於天然半胱胺酸對之間；或者 (ii)   該第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接均形成於經工程化到該第二輕鏈與該第二CH1以及第三輕鏈與第三CH1兩者中的半胱胺酸對之間，而該第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間。
13. 如請求項12所述之多特異性抗體，其中經工程化到輕鏈和CH1中的該半胱胺酸對位於該輕鏈的位置122和該CH1的位置126處，並且其中該輕鏈在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基，視需要其中該等非半胱胺酸殘基為纈胺酸。
14. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該CLλ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
15. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該第一、第二和/或第三CH1包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
16. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該一或多個抗原結合臂中缺乏該λ電荷對的輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）。
17. 如請求項16所述之多特異性抗體，其中包含該CLκ的該一或多個抗原結合臂包含位於該一或多個抗原結合臂的CLκ和CH1中的κ電荷對，其中該κ電荷對包含位於該κ電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於該κ電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基。
18. 如請求項17所述之多特異性抗體，其中該κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於該CLκ的位置133處，而該κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於該CH1的位置183處， 視需要，其中在該CLκ的位置133處的帶負電荷的胺基酸殘基係麩胺酸，並且其中在該CH1的位置183處的帶正電荷的胺基酸殘基係離胺酸。
19. 如請求項17或請求項18所述之多特異性抗體，其中該CLκ包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
20. 一種多特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ），其中： (i) 該第一抗原結合臂包含位於該CLλ中的位置117和該第一CH1中的位置141處的λ電荷對，其中該λ電荷對包含位於該λ電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於該λ電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基；並且 (ii) 該第一輕鏈和第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該CLλ和第一CH1中的半胱胺酸對之間； 和 (b)   第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈；以及 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，其中： (i) 該第二和第三輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）；並且 (ii) 該第二和第三抗原結合臂均包含位於該CLκ和對應CH1中的κ電荷對，其中該κ電荷對包含位於該κ電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於該κ電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基；並且 (iii) 該第二輕鏈與第二CH1之間以及該第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接形成於該CLκ和第二CH1中的天然半胱胺酸對之間， 其中該第一抗原結合臂結合第一表位，該第二和第三抗原結合臂結合第二表位， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合，並且 其中編號係根據EU索引進行的。
21. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其進一步包含：第四抗原結合臂，其包含與第四CH1藉由二硫鍵連接的第四輕鏈，其中該第四抗原結合臂結合第一表位， 其中該第一和第四抗原結合臂均包含該λ電荷對，並且其中： (a) 該第三抗原結合臂與該第一抗原結合臂融合，且該第四抗原結合臂與該第二抗原結合臂融合；或者 (b) 該第三抗原結合臂與該第二抗原結合臂融合，且該第四抗原結合臂與該第一抗原結合臂融合。
22. 如請求項21所述之多特異性抗體，其中： (a) 該第三抗原結合臂與該第一抗原結合臂的N-末端融合；並且 (b) 該第二抗原結合臂與該第四抗原結合臂的C-末端融合。
23. 如請求項21所述之多特異性抗體，其中： (a) 該第三抗原結合臂與該第一抗原結合臂的N-末端融合，且該第二抗原結合臂與該第四抗原結合臂的N-末端融合；或者 (b) 該第三抗原結合臂與該第一抗原結合臂的C-末端融合，且該第二抗原結合臂與該第四抗原結合臂的C-末端融合。
24. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中 (i) 該第二和第三輕鏈係相同的；和/或 (ii) 該第一和第四輕鏈係相同的。
25. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該第一抗原結合臂進一步包含第一Fc區並且該第二抗原結合臂進一步包含第二Fc區。
26. 如請求項25所述之多特異性抗體，其包含在該第一和第二Fc區中的修飾以促進該第一和第二Fc區進行異二聚化。
27. 如請求項26所述之多特異性抗體，其中該等修飾位於該等Fc區的CH3中。
28. 如請求項27所述之多特異性抗體，其中該第一和第二Fc區之一的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較大側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成凸起（杵），而另一Fc區的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較小側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成空腔（臼），視需要其中含有該凸起（杵）的該CH3結構域係第一重鏈多肽的一部分，並且含有該空腔（臼）的該CH3結構域係第二重鏈的一部分。
29. 如請求項28所述之多特異性抗體，其中該形成杵的取代係在位置366處取代為色胺酸，而該形成臼的取代係作為以下中一或多項的形成臼的取代： i)     在位置407處取代為纈胺酸； ii)    在位置366處取代為絲胺酸；以及 iii)   在位置368處取代為丙胺酸。
30. 如請求項28或請求項29所述之多特異性抗體，其中該含有凸起（杵）的CH3結構域包含在位置354處的半胱胺酸，並且該含有空腔（臼）的CH3結構域包含在位置349處的半胱胺酸。
31. 如請求項25至30中任一項所述之多特異性抗體，其中該等Fc區中至少一個包含胺基酸取代： (a)   L234F/L235E/P331S； (b)   E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；和/或 (c)   M252Y/S254T/T256E。
32. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其中該第一抗原結合臂與CD3上的表位結合。
33. 如前述請求項中任一項所述之多特異性抗體，其進一步包含：另外的抗原結合結構域，其中該另外的抗原結合結構域係VHH，視需要，其中該VHH與CD8上的表位結合。
34. 一種產生如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體之方法，該方法包括在宿主細胞中表現該第一、第二和第三輕鏈以及該第一、第二和第三CH1；其中使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，其中使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，其中使該第三輕鏈與該第三CH1配對以形成第三結合臂，並且其中： (a) 使該第一結合臂與該第二和第三結合臂配對；或者 (b) 使該第一和第三結合臂與該第二結合臂配對， 以形成該多特異性抗體；以及從該宿主細胞中純化該多特異性抗體。
35. 如請求項34所述之方法，其進一步包括在該宿主細胞中表現第四輕鏈和第四CH1，其中使該第四輕鏈與該第四CH1配對以形成第四結合臂，其中使該第一和第三結合臂與該第二和第四結合臂配對以形成該多特異性抗體。
36. 如請求項35所述之方法，其中純化該多特異性抗體包括親和層析，該方法視需要進一步包括使用輕鏈親和層析純化該抗體。
37. 如請求項35或請求項36所述之方法，其中該等多特異性抗體中少於25%、少於20%、少於15%、或少於10%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%、或少於1%的輕鏈會發生錯配。
38. 一或多種核酸，其編碼如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體。
39. 一種載體，其包含如請求項38所述之一或多種核酸。
40. 一種分離的宿主細胞，其包含如請求項38所述之一或多種核酸或者如請求項39所述之載體。
41. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體和藥學上可接受的載劑。
42. 一種治療有需要的患者的疾病之方法，該方法包括向該患者投與有效量的如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體或如請求項41所述之藥物組成物。
43. 如請求項42所述之方法，其中該疾病係癌症。
44. 如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體或如請求項41所述之藥物組成物，其用作藥物。
45. 如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體或如請求項41所述之藥物組成物，其用於治療癌症。
46. 如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體或如請求項41所述之藥物組成物在製備用於治療癌症的藥物中之用途。