TW202506725A - 三特異性工程化抗體 - Google Patents

Abstract

本揭露關於含有三個抗原結合臂的三特異性抗體，每個抗原結合臂能夠結合不同的靶標，其中每個抗原結合臂含有引入到各自重鏈和輕鏈的介面中的不同λ或κ電荷對，作為減少鏈誤配的策略。在一些情況下，三特異性抗體還含有工程化二硫化物。本揭露還關於產生該等三特異性抗體的方法及其治療性用途。

Description

三特異性工程化抗體

本揭露關於含有三個抗原結合臂的三特異性抗體，每個抗原結合臂能夠結合不同的靶標，其中每個抗原結合臂含有引入到各自重鏈和輕鏈的介面中的不同λ或κ電荷對，作為減少鏈誤配的策略。在一些情況下，三特異性抗體還含有工程化二硫化物。本揭露還關於產生該等三特異性抗體的方法及其治療性用途。

識別兩種或不同表位的多特異性抗體在診斷性和治療性應用中越來越受到關注，並且可以支持單特異性抗體所不具備的新型作用機制。然而，它們的生成也面臨著挑戰。在一個細胞中表現的兩種抗體的重鏈和輕鏈進行混雜配對，可能會產生幾種不同的分子，其中只有一種具有雙特異性，而其餘的配對產生的是非功能性或單特異性分子。

已經開發出多種策略來嘗試克服這一問題並促進期望的雙特異性抗體的正確組裝。用於促進兩條不同重鏈進行異二聚化的這樣的策略包括諸如「杵入臼（knobs-into-hole）」等技術（Ridgway 1990）。用於規避輕鏈誤配的策略包括使用共同輕鏈（Merchant 1998）、結構域交換（Schaefer 2011）、將天然二硫鍵替換為鏈間二硫鍵（Mazor 2015）。

在Mazor 2015和WO 2013/096291中描述的「DuetMab」係雙特異性抗體形式的實例，該雙特異性抗體形式包含了其中一些修飾以提高該等分子的高效產生。DuetMab抗體分子採用杵入臼技術對2條不同的重鏈進行異二聚化，並藉由將CH1-CL介面之一中的天然二硫鍵替換為工程化二硫鍵來提高同源重鏈和輕鏈配對的效力。

雙特異性抗體的自然演化係引入了三特異性抗體，它們能夠與三種不同的表位發生相互作用。然而，引入另外的抗原結合臂通常會增加需要正確配對的重鏈和輕鏈的數量，這對高效構建該等分子提出了更多挑戰。

因此，仍然需要另外的機制來改進三特異性抗體中多肽鏈的配對並促進其高效產生。根據以上考慮設計了本揭露。

本文描述了重鏈（HC）和輕鏈（LC）的配對，這係藉由將電荷對引入到λLC和HC之間的介面中來實現的。還描述了在λLC和HC之間介面處的胺基酸殘基，在該介面處可以引入電荷對以有利於改進鏈配對，這優於在先前DuetMab雙特異性形式中所實現的鏈配對。進一步確定，新發現的λ電荷對可用於產生含有三個不同抗原結合臂的三特異性抗體。特別地，認識到： -      第一抗原結合臂的高效配對可以藉由在第一抗原結合臂的CH1和CLλ之間使用λ電荷對來實現； -      第二抗原結合臂的高效配對可以藉由在第二抗原結合臂的CH1和CLκ之間使用κ電荷對來實現；並且 -      第三抗原結合臂的高效配對可以藉由在第三抗原結合臂的CH1和CLκ之間使用κ電荷對來實現，其中帶電荷的胺基酸殘基的排列方式與第二抗原結合臂中的排列相反。

具有與第二抗原結合臂中排列相反排列的κ電荷對意味著，如果第二抗原結合臂的κ電荷對含有在CH1上的帶正電荷的胺基酸殘基和在CLκ上的帶負電荷的胺基酸殘基，那麼第三抗原結合臂的κ電荷對就含有在CH1上的帶負電荷的殘基和在CLκ上的帶正電荷的胺基酸殘基。如本文所證明的，含有這種λ電荷對和κ電荷對組合的三特異性抗體以高度（＞ 90%）的正確鏈配對高效產生。

因此，在一個方面，本文提供了一種三特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ）；和 (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLκ， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂包含一或多個λ電荷對，該一或多個λ電荷對包含位於該第一CH1和該CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基， 其中視需要地，該第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且該第三抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ上的κ電荷對的該等帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的κ電荷對具有相反電荷，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基視需要地選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基視需要地選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。

另外還認識到，如果交換λ鏈和κ鏈，也可以產生具有正確鏈配對的三特異性抗體。因此，在另一方面，本文提供了一種三特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）；和 (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ）；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLλ， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂視需要地包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第一CH1和該CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基， 其中該第二抗原結合臂包含一或多個λ電荷對，該一或多個λ電荷對包含位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且 其中該第三抗原結合臂視需要地包含一或多個λ電荷對，該一或多個λ電荷對包含位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLλ上的一或多個λ電荷對的該等帶電荷的胺基酸殘基視需要地與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLλ上的一或多個λ電荷對的該等帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基視需要地選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基視需要地選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。

在一些方面，該三特異性抗體包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ）； (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLκ， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂包含λ電荷對，該λ電荷對包含位於該第一CH1和該CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基， 其中該第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且 其中該第三抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。

在另一方面，本文提供了一種三特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）； (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ）；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLλ， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂包含λ電荷對，該λ電荷對包含位於該第一CH1和該CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基， 其中該第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且 其中該第三抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於以下位置對中之一對或多對處： (i)       CLλ中的位置117和CH1中的位置141； (ii)      CLλ中的位置117和CH1中的位置185； (iii)     CLλ中的位置119和CH1中的位置128； (iv)     CLλ中的位置134和CH1中的位置128； (v)      CLλ中的位置134和CH1中的位置145； (vi)     CLλ中的位置134和CH1中的位置183； (vii)    CLλ中的位置136和CH1中的位置185； (viii)   CLλ中的位置178和CH1中的位置173；以及 (ix)     CLλ中的位置117和CH1中的位置187， 其中編號係根據EU索引進行的。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置141處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對選自上述列表中的a.至e.。在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.、b.和e.中之任一項。在一些方面，λ電荷對選自上述列表中的a.和b.。在一些方面，λ電荷對係在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置185處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置119和CH1中的位置128處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置128處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置145處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置183處。在一些方面，λ電荷對係在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸或絲胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置136和CH1中的位置185處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置178和CH1中的位置173處。在一些方面，λ電荷對選自以下列表： a.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸。

在一些方面，κ電荷對位於該抗原結合臂中CLκ的位置133和相對應CH1的位置183處。

在一些方面，位於該第二CH1與該第二輕鏈的CLκ之間介面處的κ電荷對包含該第二輕鏈的CLκ上的帶負電荷的胺基酸殘基和該第二CH1上的帶正電荷的胺基酸殘基，並且位於該第三CH1與該第三輕鏈的CLκ之間介面處的κ電荷對包含該第三輕鏈的CLκ上的帶正電荷的胺基酸殘基和該第三CH1上的帶負電荷的胺基酸殘基。

在一些方面，位於該第二CH1與該第二輕鏈的CLκ之間介面處的κ電荷對包含在該第二輕鏈的CLκ的位置133處的帶負電荷的胺基酸殘基和在該第二CH1的位置183處的帶正電荷的胺基酸殘基，並且位於該第三CH1與該第三輕鏈的CLκ之間介面處的κ電荷對包含在該第三輕鏈的CLκ的位置133處的帶正電荷的胺基酸殘基和在該第三CH1的位置183處的帶負電荷的胺基酸殘基。

在一些方面，κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基係麩胺酸。在一些方面，κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基係離胺酸。

如本文進一步所述，可以將電荷對與用於促進輕鏈配對的其他途徑組合，例如以便進一步提高期望的三特異性抗體的正確組裝。

在一些方面，將三特異性抗體在CH1-CL介面之一中的天然鏈間二硫鍵替換為工程化鏈間二硫鍵。在一些方面，第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間，而第二輕鏈與第二CH1之間以及第三輕鏈與第三CH1之間的二硫鍵連接均形成於天然半胱胺酸對之間。

另外還認識到，將工程化二硫化物引入到另外的抗原結合臂（除了第一抗原結合臂之外）中可用於進一步改進正確配對。例如，在第二和第三抗原結合臂均含有κ電荷對的方面，將工程化二硫化物引入到該等臂之一（例如，第三抗原結合臂）中可以限制第二和第三抗原結合臂之間任何潛在的誤配。在第一和第三抗原結合臂均含有工程化二硫化物的情況下，期望引入到該第三抗原結合臂中的工程化二硫化物與引入到該第一抗原結合臂中的工程化二硫化物不同。

因此，在一些方面，第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間，在第二輕鏈與第二CH1之間形成的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間，並且在第三輕鏈與第三CH1之間形成的二硫鍵連接形成於經工程化到第三輕鏈和第三CH1中的半胱胺酸對之間，其中插入到第三輕鏈和第三CH1中的半胱胺酸對與插入到第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對處於不同的胺基酸殘基位置。

在一些方面，經工程化到輕鏈（例如，CLλ）中的半胱胺酸對位於該輕鏈的位置122和CH1的位置126處，並且其中該輕鏈（例如，CLλ）在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。

在一些方面，經工程化到輕鏈（例如，CLκ）中的半胱胺酸對位於該輕鏈的位置121和CH1的位置126處，並且其中該輕鏈（例如，CLκ）在位置214處包含非半胱胺酸殘基且該CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。

在一些方面，第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到CLλ的位置122和第一CH1的位置126中的半胱胺酸對之間，其中該CLλ在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該第一CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基； 在第二輕鏈和第二CH1之間形成的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間；並且 在第三輕鏈與第三CH1之間形成的二硫鍵連接形成於經工程化到CLκ的位置121和第一CH1的位置126中的半胱胺酸對之間，其中該CLκ在位置214處包含非半胱胺酸殘基且該第一CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。

在一些方面，CLλ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。SEQ ID NO: 1提供了示例性野生型（天然的）CLλ，而SEQ ID NO: 2提供了將其中參與天然鏈間二硫鍵的半胱胺酸替換為工程化半胱胺酸以形成工程化二硫鍵的示例性CLλ。

在一些方面，CH1包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。SEQ ID NO: 4提供了示例性野生型（天然的）CH1，而SEQ ID NO: 5提供了將其中參與天然鏈間二硫鍵的半胱胺酸替換為工程化半胱胺酸以形成工程化二硫鍵的示例性CH1。

在一些方面，CLκ包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

在一些方面，CLκ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。

在一些方面，第一抗原結合臂和/或第二抗原結合臂包含Fc區。在一些方面，第一抗原結合臂包含第一Fc區並且第二抗原結合臂包含第二Fc區。可以使用多種策略來促進兩條重鏈的異二聚化（即，含有第一CH1和第一Fc區的第一重鏈與含有第二CH1和第二Fc區的第二重鏈的異二聚化）。

在一些方面，第一和第二Fc區包含促進該第一與第二Fc區進行異二聚化的修飾。在一些方面，該等修飾位於Fc區的CH3中。

在一些方面，第一和第二Fc區之一的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較大側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成凸起（杵），而另一Fc區的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較小側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成空腔（臼），視需要地其中含有凸起（杵）的CH3結構域係第一重鏈多肽的一部分，並且含有空腔（臼）的CH3結構域係第二重鏈的一部分。

在一些方面，其中形成杵的取代係在位置366處取代為色胺酸，而形成臼的取代係作為以下中一項或多項的形成臼的取代： i)     在位置407處取代為纈胺酸； ii)    在位置366處取代為絲胺酸；以及 iii)   在位置368處取代為丙胺酸。

在一些方面，含有該凸起（杵）的CH3結構域包含在位置354處的半胱胺酸，並且含有該空腔（臼）的CH3結構域包含在位置349處的半胱胺酸。

在一些方面，三特異性抗體包含上述λ和κ電荷對的組合、上述工程化二硫化物和上述促進異二聚化的Fc修飾。

在一些方面，抗原結合臂之一與CD3上的表位結合。

本文還提供了一種產生本文所述之三特異性抗體的方法。在一些方面，該方法包括 a)    在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1； b)    使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並使該第一結合臂與該第二結合臂配對，從而形成該三特異性抗體；以及 c)    從該宿主細胞中純化該三特異性抗體。

在一些方面，該方法包括產生多特異性抗體，該方法包括在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1；其中使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，其中使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，其中使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並且其中使該第一結合臂與該第二和第三結合臂配對，從而形成該多特異性抗體；以及從該宿主細胞中純化該多特異性抗體。

在一些方面，純化三特異性抗體包括親和層析。在一些方面，純化三特異性抗體包括輕鏈親和層析。

在一些方面，在純化三特異性抗體後，少於25%、少於20%、少於15%、或少於10%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%、或少於1%的輕鏈會發生誤配。在一些方面，少於10%的輕鏈會發生誤配。在一些方面，少於5%的輕鏈會發生誤配。本文描述了用於確定誤配百分比的合適方法。

本文還提供了編碼本文所述之三特異性抗體的一或多種核酸。本文還提供了一種包含一或多種核酸或載體的分離的宿主細胞。

本文還提供了藥物組成物和涉及該等藥物組成物或三特異性抗體之治療方法，如下文進一步描述。

本揭露包括所描述的方面和特徵的組合，除非明顯不容許或明確避免這樣的組合的情況外。

現在將參考附圖來討論本揭露之各方面。對於熟悉該項技術者而言，另外的各方面將是顯而易見的。此文本中提及的所有文件均藉由引用併入本文。

如下文更全面討論的，本文提供了在三個抗原結合臂中含有λ和κ電荷對的三特異性抗體。

用於產生雙特異性和三特異性抗體的方法係已知的。然而，這樣的方法經常受到許多可能的抗體形成物的限制，該等抗體形成物可能包括重鏈和輕鏈錯誤配對的若干組合。這樣的誤配會降低生產效率。組合使用如本文所述之λ和κ電荷變體藉由優先使一個結合臂中的正確輕鏈與正確CH1進行配對來克服該等限制，從而生成三特異性抗體組裝體。另外，還可以將該等電荷對與用於促進重鏈和輕鏈正確配對的已知途徑（諸如下文更詳細描述的杵入臼（KiH）和工程化二硫化物）進行組合，以進一步改進三特異性抗體的形成。 抗體

術語「抗體」或「抗體分子」描述了免疫球蛋白，無論是天然的還是部分或全部合成產生的。抗體可為人抗體或人源化抗體。在一些方面，抗體係單株抗體分子。抗體的實例係免疫球蛋白同種型，例如免疫球蛋白G（IgG），和它們的同種型亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。

抗體由兩種不同類型的多肽鏈組成：一種稱為重鏈，而另一種稱為輕鏈。天然單特異性抗體由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈組成。兩條重鏈藉由二硫鍵相互連接，並且每條重鏈藉由二硫鍵與輕鏈連接。連接輕鏈和重鏈的二硫鍵有時被稱為「鏈間」二硫鍵，以將其與存在於單條重鏈和輕鏈多肽內的「鏈內」二硫鍵區分開。

天然抗體中的輕鏈係「拉姆達（λ）」或卡帕「（κ）」輕鏈，它們在胺基酸序列上有所不同。輕鏈由單個輕鏈恒定區（CL）和單個輕鏈可變區（VL）組成。提供了恒定輕鏈λ區（CLλ）胺基酸序列的實例為SEQ ID NO: 1，並提供了恒定輕鏈κ區（CLκ）胺基酸序列的實例為SEQ ID NO: 3。本文所述之三特異性抗體中使用的輕鏈可為嵌合輕鏈，例如含有CLλ和VLκ。

IgG重鏈由一個重鏈可變區（VH）和三個重鏈恒定區（CH1、CH2和CH3）組成，在CH1和CH2之間還有另外的「鉸鏈區」。提供了IgG1 CH1區胺基酸序列的實例為SEQ ID NO: 4。提供了IgG1 CH2胺基酸序列的實例為SEQ ID NO: 6。提供了IgG1 CH3胺基酸序列的實例為SEQ ID NO: 7。提供了包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3的重鏈胺基酸序列的實例為SEQ ID NO: 8。

除非另有指示，否則恒定結構域中的胺基酸殘基位置（包括如本文所述之胺基酸序列、取代、缺失和插入的位置）根據EU編號（Edelman, 2007）進行編號。

輕鏈與重鏈中的VH和CH1結合以形成「抗原結合臂」，並且抗原結合臂中的可變結構域相互作用以形成「抗原結合結構域」。

「抗原結合結構域」描述了分子中與全部或部分靶表位結合的部分，並且通常包含六個互補決定區（CDR）；三個在VH區：HCDR1、HCDR2和HCDR3，還有三個在VL區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。這六個CDR共同定義了抗原結合結構域的互補位，它係抗原結合結構域中與靶表位結合的部分。如本文所用，術語「表位」係指抗原中抗原結合結構域結合的部分。單株單特異性IgG抗體分子含有兩個抗原結合結構域，其中每個抗原結合結構域都能夠結合相同的表位（即，對於單個表位而言它係二價的）。如本文所用，術語「價」表示在結合表位的抗體中存在指定數目的抗原結合結構域。

VH區和VL區包含每個CDR任一側的框架區（FR），其為CDR提供支架。從N-末端到C-末端，VH區包含以下結構：N末端-[HFR1]-[HCDR1]-[HFR2]-[HCDR2]-[HFR3]-[HCDR3]-[HFR4]-C末端；並且VL區包含以下結構：N末端-[LFR1]-[LCDR1]-[LFR2]-[LCDR2]-[LFR3]-[LCDR3]-[LFR4]-C末端。 三特異性形式

本揭露提供了三特異性抗體。在不含污染物（諸如能夠結合其他多肽和/或血清組分的抗體）的意義上，根據本揭露之三特異性抗體可以以分離的形式提供。

半胱胺酸殘基之間二硫鍵的形成發生在進入分泌途徑的許多蛋白質的折疊期間。當多肽鏈塌縮時，靠近的半胱胺酸可以在由蛋白質二硫化物異構酶家族成員催化的過程中形成共價連接。如本文所用，術語「二硫鍵連接」或「藉由二硫鍵連接」係指由硫醇基團、特別是半胱胺酸殘基的偶合形成的單個共價鍵。在一些方面，兩個半胱胺酸之間的共價連接係在每個殘基的兩個硫原子之間。然而，根據環境的不同，並非所有蛋白質種類都可能始終存在二硫化物，例如，在二硫化物還原的情況下。因此，在一些方面，術語「二硫鍵連接」或「藉由二硫鍵連接」（無論是天然的還是工程化的）還指存在能夠形成二硫鍵連接的兩個半胱胺酸殘基，而不管在該單個時間點上它們是否實際連接。

本揭露之三特異性抗體能夠結合相同抗原上的或在一些方面不同抗原上的三種不同的表位，並且該等三特異性抗體包含三個抗原結合臂，在本文中稱為「第一抗原結合臂」、「第二抗原結合臂」和「第三抗原結合臂」。根據本揭露，「抗原結合臂」包含輕鏈、VH和CH1（即，重鏈和輕鏈各自的至少一個恒定結構域和一個可變結構域），其中該輕鏈與CH1藉由二硫鍵連接。本文提及的第一、第二和第三結構域（CH1、VH、VL等）分別係指第一、第二和第三抗原結合臂的所述結構域。

三特異性抗體中的第一和第二抗原結合臂還可以進一步包含另外的重鏈區，即鉸鏈、CH2和CH3中之一或多個。在一些方面，第一和第二抗原結合臂進一步包含Fc區（即，包含鉸鏈、CH2和CH3的重鏈的其餘部分）。在一些方面，第一和第二抗原結合臂包含完整的重鏈（即，VH、CH1、鉸鏈、CH2和CH3）。在一些方面，第一抗原結合臂的重鏈與第二抗原結合臂的重鏈藉由二硫鍵連接（例如，經由天然（如IgG）抗體中存在的鏈間二硫鍵）。

第三抗原結合臂與第一或第二抗原結合臂的重鏈融合，典型地經由該等重鏈結構域之間的肽連接子融合。合適的肽連接子係本領域已知的，並且可以由5至100個胺基酸、5至50個胺基酸、5至25個胺基酸、或5至15個胺基酸組成。肽連接子主要由甘胺酸和絲胺酸的胺基酸殘基形成，並且在一些方面包含胺基酸序列GGGGS（SEQ ID NO: 16）或SGGGGS（SEQ ID NO: 17）。在一個方面，肽連接子包含(GGGGS)2（SEQ ID NO: 18）或由其組成。

在一些方面，第三抗原結合臂在其CH1結構域的N-末端處與第一抗原結合臂或第二抗原結合臂上的VL結構域的C-末端融合。因此，在一個方面，第三抗原結合臂的CH1結構域的N-末端與第一抗原結合臂的VL結構域的C-末端融合。圖12提供了這方面的示意圖。在另一方面，第三抗原結合臂的CH1結構域的N-末端與第二抗原結合臂的VL結構域的C-末端融合。 電荷對

術語「一或多個電荷對」和「一或多個電荷突變」在整個本說明書中可互換使用，並且係指帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，其中一種位於抗原結合臂的輕鏈區（例如，輕鏈恒定區）中，另一種位於該抗原結合臂的重鏈區（例如，重鏈恒定區1（CH1））中，它們位於旨在促進輕鏈和重鏈結合的位置處。「λ電荷對」係指引入或取代的電荷對，其中帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基位於λ輕鏈（例如，CLλ）和重鏈恒定區（例如，CH1）中。「κ電荷對」係指引入或取代的電荷對，其中輕鏈中帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基位於κ輕鏈（例如，CLκ）和重鏈恒定區（例如，CH1）中。

不希望受理論束縛，據信電荷對中相反電荷的胺基酸殘基增加了抗原結合臂中重鏈對輕鏈的吸引力，從而促進了具有正確重鏈和輕鏈的抗原結合臂的形成。

已將電荷對中至少一個胺基酸殘基工程化到抗原結合臂中（即，該對中之至少一個胺基酸殘基不是野生型胺基酸殘基）。在一些方面，將電荷對中兩個胺基酸殘基都工程化到抗原結合臂中（即，該對中的兩個胺基酸殘基都不是野生型胺基酸殘基）。

在一些方面，電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於輕鏈上，而電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於相對應的重鏈上。在其他方面，電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於輕鏈上，而帶正電荷的胺基酸殘基位於相對應的重鏈上。

電荷對的胺基酸殘基典型地是天然存在的。根據本揭露之天然存在的帶正電荷的胺基酸殘基包括精胺酸、離胺酸和組胺酸。根據本揭露之天然存在的帶負電荷的胺基酸殘基包括麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和天冬胺酸。儘管在本領域中經常將絲胺酸和蘇胺酸描述為「不帶電荷的」胺基酸，但是它們具有低於6的等電點，因此在中性pH下係部分帶負電荷的。就本文揭露的電荷對而言，絲胺酸和蘇胺酸係帶負電荷的胺基酸殘基的實例（還有麩胺酸和天冬胺酸）。

因此，電荷對可以包含位於電荷對中位置之一處的選自精胺酸、離胺酸或組胺酸的帶正電荷的胺基酸殘基和位於電荷對中另一位置處的選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸的帶負電荷的胺基酸殘基。例如，電荷對可以包含以下胺基酸殘基對中之任一對： 精胺酸和天冬胺酸； 精胺酸和麩胺酸； 精胺酸和絲胺酸； 精胺酸和蘇胺酸； 離胺酸和天冬胺酸； 離胺酸和麩胺酸； 離胺酸和絲胺酸； 離胺酸和蘇胺酸； 組胺酸和天冬胺酸； 組胺酸和麩胺酸； 組胺酸和絲胺酸；以及 組胺酸和蘇胺酸。 λ電荷對

如本文所例示的，可以在多個位置處引入λ電荷對以改進抗原結合臂中正確輕鏈和重鏈的配對。

在一些方面，λ電荷對在恒定輕鏈λ區（CLλ）的位置117、119、134、136或178處包含帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基。在一些方面，λ電荷對在CH1的位置141、185、128、145、183、185、173或187處包含帶正電荷的或帶負電荷的胺基酸殘基。如其他地方所述，編號根據EU編號進行。根據EU編號，CLλ的位置117、119、134、136和178對應於SEQ ID NO: 1和2的胺基酸位置10、12、27、29和71。根據EU編號，CH1的位置141、185、128、145、183、185、173和187對應於SEQ ID NO: 4和5的胺基酸位置24、68、11、28、66、68、56和70。

在一些方面，λ電荷對位於以下位置對中之一對或多對處： (i)   CLλ中的位置117和CH1中的位置141； (ii)  CLλ中的位置117和CH1中的位置185； (iii) CLλ中的位置119和CH1中的位置128； (iv) CLλ中的位置134和CH1中的位置128； (v)          CLλ中的位置134和CH1中的位置145； (vi) CLλ中的位置134和CH1中的位置183； (vii) CLλ中的位置136和CH1中的位置185； (viii)       CLλ中的位置178和CH1中的位置173；以及 (ix) CLλ中的位置117和CH1中的位置187。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置141處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置141處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.至f.中之任一項。在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.至e.中之任一項。在一些方面，λ電荷對選自上述列表的a.、b.和e.中之任一項。在一些方面，λ電荷對係a.。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置117和CH1中的位置185處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置117處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置117處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置119和CH1中的位置128處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置119處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置119處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置128處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置128處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置145處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置145處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置134和CH1中的位置183處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置134處的精胺酸和在CH1的位置183處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對係在CLλ的位置134處的離胺酸和在CH1的位置183處的天冬胺酸或絲胺酸。在以SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5提供的CH1序列中，EU位置183係絲胺酸，因此無需在SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5的CH1中引入修飾即可與在CLλ的位置134處的帶正電荷的胺基酸一起產生電荷對。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置136和CH1中的位置185處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置136處的精胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置136處的離胺酸和在CH1的位置185處的蘇胺酸。

在一些方面，λ電荷對位於CLλ中的位置178和CH1中的位置173處。例如，λ電荷對可以選自以下列表： a.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； b.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； c.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸； d.    在CLλ的位置178處的精胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸； e.    在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的天冬胺酸； f.     在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的麩胺酸； g.    在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的絲胺酸；以及 h.    在CLλ的位置178處的離胺酸和在CH1的位置173處的蘇胺酸。

在一些方面，包含λ電荷對的抗原結合臂包含多於一個λ電荷對。例如，第一抗原結合臂可以在上述位置 (i) 至 (ix) 處包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個λ電荷對。

在一些示例性方面，第一抗原結合臂包含λ電荷對，如圖12所展示。在其他方面，第一抗原結合臂包含κ電荷對，並且第二和第三抗原結合臂均包含λ電荷對，其中位於第三CH1和第三輕鏈的CLλ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於第二CH1和第二輕鏈的CLλ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷。

在一些示例性方面，λ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於輕鏈上，而λ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於重鏈上，如圖12所展示。在其他方面，λ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於輕鏈上，而帶正電荷的胺基酸殘基位於重鏈上。 κ電荷對

在本文所述之三特異性抗體中，至少一個抗原結合臂包含κ電荷對。如上所述，κ電荷對係指帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，其中一種位於抗原結合臂的κ輕鏈（例如，CLκ）中，而另一種位於該抗原結合臂的重鏈（例如，CH1）中，它們位於旨在促進第二抗原結合臂的輕鏈和CH1結合的位置處。

在一些方面，含有CLκ的一或多個抗原結合臂包含位於CLκ中的位置133和第二CH1中的位置183處的κ電荷對。在一些方面，κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於CLκ的位置133處，而κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於第二CH1的位置183處。在其他方面，κ電荷對中帶正電荷的胺基酸殘基位於CLκ的位置133處，而κ電荷對中帶負電荷的胺基酸殘基位於第二CH1的位置183處。在一些方面，帶負電荷的胺基酸殘基（例如，在CLκ的位置133處）係麩胺酸，並且其中帶正電荷的胺基酸殘基（例如，在第二CH1的位置183處）係離胺酸。如其他地方所述，這種編號根據EU編號進行。

根據EU編號，CLκ的位置133對應於SEQ ID NO: 3的胺基酸位置26。根據EU編號，CH1的位置183對應於SEQ ID NO: 4和5的胺基酸位置66。

在一些示例性方面，第二抗原結合臂和第三抗原結合臂均包含κ電荷對，如圖12所展示。在其他方面，第一抗原結合臂包含κ電荷對，而第二和第三抗原結合臂包含λ電荷對。

在一些示例性方面，第二抗原結合臂中κ電荷對中的帶正電荷的胺基酸殘基位於第二CH1上，而帶負電荷的胺基酸殘基位於第二輕鏈上；並且第三抗原結合臂中κ電荷對中的帶正電荷的胺基酸殘基位於第三輕鏈上，而帶負電荷的胺基酸殘基位於第三CH1上，如圖12所展示。在其他方面，第二抗原結合臂中κ電荷對中的帶正電荷的胺基酸殘基位於第二輕鏈上，而帶負電荷的胺基酸殘基位於第二CH1上；並且第三抗原結合臂中κ電荷對中的帶正電荷的胺基酸殘基位於第三CH1上，而帶負電荷的胺基酸殘基位於第三輕鏈上。 電荷對的組合

如本文所述，示例性三特異性抗體在第一抗原結合臂中含有λ電荷對，在第二抗原結合臂中含有κ電荷對，並且在第三抗原結合臂中含有κ電荷對，其中位於第三CH1和第三輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於第二CH1和第二輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷。不希望受理論束縛，據信例如第三CLκ不會優先結合第二CH1，因為兩條鏈在HC:LC介面處含有相同（例如，正）電荷。如本文所證明的，組合使用該等λ對和帶相反電荷的κ對產生了具有高度（＞ 90%）正確鏈配對的三特異性抗體。

因此，在一些方面： 第一抗原結合臂包含λ電荷對，該λ電荷對包含位於第一CH1和CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基； 第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於第二CH1和第二輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基；並且 第三抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於第三CH1和第三輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷。

在其他方面，第一抗原結合臂含有κ電荷對，並且第二和第三抗原結合臂含有帶相反電荷的λ電荷對。因此，在一些方面： 第一抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於第一CH1和CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基； 第二抗原結合臂包含λ電荷對，該λ電荷對包含位於第二CH1和第二輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基；並且 第三抗原結合臂包含λ電荷對，該λ電荷對包含位於第三CH1和第三輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLλ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLλ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷。

例如，第二抗原結合臂中的電荷對可以由第二CH1中的帶正電荷的胺基酸殘基和第二輕鏈中的帶負電荷的胺基酸殘基形成，並且第三抗原結合臂中的κ電荷對可以由第三CH1中的帶負電荷的胺基酸殘基和第三輕鏈中的帶正電荷的胺基酸殘基形成。

可替代地，第二抗原結合臂中的電荷對可以由第二CH1中的帶負電荷的胺基酸殘基和第二輕鏈中的帶正電荷的胺基酸殘基形成，並且第三抗原結合臂中的κ電荷對可以由第三CH1中的帶正電荷的胺基酸殘基和第三輕鏈中的帶負電荷的胺基酸殘基形成。

如實例中所述，已知有幾種方法可用於確定正確的輕鏈配對。該等方法包括基於質譜的途徑，其可用於確定正確的重鏈/輕鏈結合。當三特異性抗體含有κ和λ輕鏈的混合物時，所組裝的三特異性抗體中κ和λ輕鏈的比率可以使用基於微流控技術的電泳來確定，作為正確輕鏈比率的讀數。

因此，在一些方面，當與不含λ電荷對的等同三特異性抗體相比時，含有λ電荷對的三特異性抗體表現出更高的正確輕鏈配對。在一些方面，含有λ電荷對的三特異性抗體表現出大於90%、95%、96%、97%、98%或99%的正確輕鏈比率（例如，使用基於微流控技術的電泳法確定），視需要地在使用輕鏈親和純化來純化三特異性抗體之後。

如本文所述，利用對CLκ或CLλ具有特異性的親和樹脂的輕鏈親和層析等技術可用於基於抗體的輕鏈選擇性純化抗體。這樣的親和樹脂的實例包括通用電氣醫療集團（GE Healthcare）提供的LambdaFabSelect和KappaSelect樹脂。這樣的方法可用於選擇性純化同時含有CLκ和CLλ的三特異性抗體，因此可用於提高這種形式的三特異性抗體的產生。 與其他配對途徑的組合

可以將本文所述之電荷對與用於促進異二聚化的其他策略進行組合，以進一步提高重鏈和輕鏈多肽的正確配對。

用於促進異二聚化的策略的非限制性實例在下文中更詳細地描述，並包括在CH1/CL介面處使用二硫化物工程化和Fc區修飾，諸如杵入臼以及允許分級純化策略的那些修飾。 工程化二硫化物

在一些方面，三特異性抗體除了含有電荷對之外，還含有工程化二硫化物。「工程化二硫化物」係指已將第一抗原結合臂、第二抗原結合臂和第三抗原結合臂中至少一個的CH1-CL介面處（例如，在CH1的220處和LC的212處）的天然鏈間二硫鍵替換為工程化（非天然）鏈間二硫化物，而另外一或多個抗原結合臂在CH1-CL介面處含有天然鏈間二硫鍵。工程化二硫化物典型地藉由將半胱胺酸工程化到輕鏈的CL和相對應重鏈的CH1中並替換正常情況下形成鏈間二硫化物的半胱胺酸而形成。可以在例如美國專利案號9,527,927中找到涉及為了促進異二聚化的目的將工程化二硫化物引入抗體中的揭露內容，該美國專利藉由引用以其全文併入本文。

在一些方面，該等抗原結合臂中之至少一個中的輕鏈和CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該抗原結合臂的輕鏈和CH1中的半胱胺酸對之間。在一些方面，兩個抗原結合臂（例如，第一抗原結合臂和第三抗原結合臂、第一抗原結合臂和第二抗原結合臂、第一抗原結合臂和第三抗原結合臂、或第二抗原結合臂和第三抗原結合臂）中輕鏈和CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到這兩個抗原結合臂的輕鏈和CH1中的半胱胺酸對之間。

在一些方面，第一輕鏈和第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間。在一些方面，第三輕鏈和第三CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第三輕鏈和第三CH1中的半胱胺酸對之間。如上所述，輕鏈可以包含CLλ或CLκ。在一些方面，經工程化到CLλ和CH1中的半胱胺酸對位於CLλ的位置122和CH1的位置126處，並且其中相同的CLλ在位置212處包含非半胱胺酸殘基且相同的CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。

包含工程化半胱胺酸的CLλ的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 2提供，並且包含相對應工程化半胱胺酸以形成工程化二硫化物的CH1的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 5提供。

在一些方面，經工程化到恒定輕鏈κ區（CLκ）和CH1中的半胱胺酸對位於CLκ的位置121和CH1的位置126處，並且其中相同的CLκ在位置214處包含非半胱胺酸殘基且相同的CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。在一些方面，非半胱胺酸殘基係纈胺酸。

在一些方面，第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間，第二輕鏈和第二CH1之間形成的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間，並且第三輕鏈和第三CH1之間形成的二硫鍵連接： 形成於天然半胱胺酸對之間；或者 形成於經工程化到第三輕鏈多肽和第三重鏈多肽中的半胱胺酸對之間，其中插入到第三輕鏈和重鏈多肽中的半胱胺酸對與插入到第一輕鏈和重鏈多肽中的半胱胺酸對處於不同的胺基酸殘基位置。

在一些方面，第一輕鏈與第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到CLλ的位置122和第一CH1的位置126中的半胱胺酸對之間，其中該CLλ在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該第一CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基； 在第二輕鏈和第二CH1之間形成的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間；並且 在第三輕鏈與第三CH1之間形成的二硫鍵連接形成於經工程化到CLκ的位置121和第一CH1的位置126中的半胱胺酸對之間，其中該CLκ在位置214處包含非半胱胺酸殘基且該第一CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基。

在某些示例性方面，三特異性抗體包含具有如上所述之λ電荷對和工程化二硫化物的第一抗原結合臂、具有如上所述之κ電荷對和天然二硫化物的第二抗原結合臂和具有如上所述之κ電荷對和工程化二硫化物的第三抗原結合臂。這一方面在圖12提供的示意圖中展示。

還特別考慮了電荷對和工程化二硫化物的其他組合。在一個這樣的實例中，第一抗原結合臂包含λ電荷對和天然二硫化物，並且第二和第三抗原結合臂包含κ電荷對和工程化二硫化物。作為另一實例，第一抗原結合臂包含κ電荷對和工程化二硫化物，並且第二和第三抗原結合臂包含λ電荷對和天然二硫化物。作為又一實例，第一抗原結合臂包含κ電荷對和天然二硫化物，並且第二和第三抗原結合臂包含λ電荷對和工程化二硫化物。 Fc區修飾

如上所述，在一些方面，第一和第二抗原結合臂進一步包含第一和第二Fc區（即，進一步包含重鏈的CH2和CH3區）。

在一些方面，三特異性抗體在CH1、CH2和CH3結構域中之一或多個中包含一或多個修飾，其藉由推動第一和第二Fc區的配對來促進異二聚物抗體分子的形成。這可能涉及杵入臼（KiH）策略，該策略基於在CH3結構域中促進重鏈異二聚化的單個胺基酸取代，如Ridgway, 1996中所述。杵變體重鏈CH3具有的小胺基酸已經替換為較大的胺基酸，從而在所述CH3結構域的表面上形成凸起（杵），而臼變體具有的大胺基酸已經替換為較小的胺基酸，從而在所述CH3結構域的表面上形成空腔（臼）。還可以引入另外的修飾以穩定重鏈之間的結合。

增強異二聚化的CH3修飾包括，例如，在一個Fc區上的「臼」突變Y407V/T366S/L368A和在另一個Fc區上的「杵」突變T366W。該等修飾可以進一步包括穩定性胱胺酸突變Y349C（例如，在具有「臼」突變的Fc區上）和在另一Fc區上的穩定性S354C突變（例如，在具有「杵」突變的Fc區上）。經工程化以含有「臼」突變的CH3結構域的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 9和10提供。經工程化以含有「杵」突變的CH3結構域的示例性胺基酸序列以SEQ ID NO: 11和12提供。

因此，在一個方面，形成杵的取代係在位置366處取代為色胺酸，而形成臼的取代係以下中之一或多種： i)     在位置407處取代為纈胺酸； ii)    在位置366處取代為絲胺酸；以及 iii)   在位置368處取代為丙胺酸。

在本文例示的三特異性抗體中，「杵」存在於含有λ電荷對的第一抗原結合臂上，而臼存在於含有κ電荷對之一的第二抗原結合臂上。這種排列在圖12提供的示意圖中展示。然而，還特別考慮了相反的排列，即，其中「臼」存在於第一抗原結合臂的CH3上，而「杵」存在於第二抗原結合臂的CH3上。

例如，一個Fc區可以包括允許藉由蛋白A層析進行分級洗脫的修飾，如Tustian, 2016中所述。簡而言之，Fc區之一可以包含消除與蛋白A結合的修飾（稱為Fc*），從而允許選擇性純化異二聚物FcFc*雙特異性產物。用於產生Fc*區的合適修飾的實例包括將H435取代為精胺酸以及將Y436取代為苯丙胺酸。

除了用於增強異二聚化的Fc修飾之外，可以使用的其他Fc修飾係減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體（諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII）和/或與補體結合的那些修飾。這樣的突變降低或消除Fc效應功能。用於減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體和補體的結合的突變係已知的，並且包括例如Organesyan, 2008中描述的L234F/L235E/P331S的「三重突變」或「TM」。

在一些方面： 第一抗原結合臂包含λ電荷對和第一Fc區，第一輕鏈和第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間，並且該第一Fc區包含「杵」突變； 第二抗原結合臂包含κ電荷對和第二Fc區，在第二輕鏈和第二CH1之間形成的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間，並且該第二Fc區包含「臼」突變；並且 第三抗原結合臂包含κ電荷對，其中位於第三CH1和第三輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷，並且其中在該第三輕鏈和第三CH1之間形成的二硫鍵連接： 形成於天然半胱胺酸對之間；或者 形成於經工程化到第三輕鏈多肽和第三重鏈多肽中的半胱胺酸對之間，其中插入到第三輕鏈和重鏈多肽中的半胱胺酸對與插入到第一輕鏈和重鏈多肽中的半胱胺酸對處於不同的胺基酸殘基位置。

在實例中提供了三特異性抗體的非限制性實例，其包含λ電荷對、κ電荷對、工程化二硫化物以及促進第一和第二Fc區進行異二聚化的修飾。 四特異性形式

本文還描述了四特異性抗體，其具有本文所述之三特異性抗體的特徵，並且進一步包含能夠結合第四表位（例如，第四抗原上的第四表位）的另外的抗原結合結構域，該第四表位典型地不同於第一表位、第二表位和第三表位。因此，該形式可以稱為四特異性T細胞銜接器型DuetMab（「TED4」）。在一些方面，TED4形式包含能夠結合相同靶標的兩個抗原結合結構域。

在一些方面，另外的抗原結合結構域係單結構域抗體，例如缺少CH1和輕鏈的重鏈可變（VH）結構域。源自天然缺乏輕鏈的重鏈抗體的重鏈可變結構域在本文中被稱為VHH，以將其與四鏈免疫球蛋白的常規VH區分開。這種VHH分子可以源自在駱駝科（ camelidae）物種諸如駱駝、羊駝、單峰駱駝、駱馬和原駝中產生的抗體。駱駝科以外的物種也可以產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體，並且還涵蓋了這樣的VHH。

駱駝科重鏈抗體的VHH可以藉由基因工程過程獲得。參見美國專利案號5,759,808。與其他非人抗體片段類似，可以藉由重組方式改變駱駝科VHH的胺基酸序列，以獲得更接近地模擬人序列的序列，即「人源化的」，從而降低駱駝科VHH對人的抗原性。另外，還可以將源自駱駝科VHH的關鍵元件轉移至人VH結構域中以獲得駱駝化的人VH結構域。

VHH的分子量係人IgG分子的分子量的十分之一，並且其物理直徑只有幾奈米。VHH本身具有極高的熱穩定性、對極端pH和蛋白水解消化的穩定性以及低抗原性。

可以將另外的抗原結合結構域（例如，VHH）典型地經由肽連接子與第一、第二或第三抗原結合臂重鏈融合。合適的肽連接子係本領域已知的，並且可以由5至100個胺基酸、5至50個胺基酸、5至25個胺基酸、或5至15個胺基酸組成。肽連接子主要由甘胺酸和絲胺酸的胺基酸殘基形成，並且在一些方面包含胺基酸序列GGGGS（SEQ ID NO: 16）或SGGGGS（SEQ ID NO: 17）。在一個方面，肽連接子包含(GGGGS)2（SEQ ID NO: 18）或由其組成。

在第三抗原結合臂與第一抗原結合臂融合的一些方面，將另外的抗原結合結構域（例如，VHH）與第二抗原結合臂融合。可替代地，在第三抗原結合臂與第二抗原結合臂融合的情況下，將另外的抗原結合結構域（例如，VHH）與第一抗原結合臂融合。

在一些方面，另外的抗原結合結構域（例如，VHH）能夠結合CD8上的表位。在一些方面，第一抗原結合臂能夠結合CD3，並且另外的抗原結合結構域（例如，VHH）能夠結合CD8上的表位。

CD8（分化簇8）係由一對CD8鏈組成的二聚物。最常見的CD8形式由CD8-α和CD8-β鏈組成。CD8作為MCHI類限制性T細胞上的輔助受體，並藉由在與T細胞受體結合的位點不同的位點處結合MHCI的基本不變區而發揮增強CD8 ⁺T細胞的抗原敏感性的作用。不希望受理論束縛，據信在多特異性抗體中包括能夠結合CD8的抗原結合結構域（例如，VHH）允許優先活化CD8 ⁺T細胞，這可以提供優異的治療功效。 靶標

在一些方面，抗原結合臂之一能夠結合CD3。

CD3（分化簇3）係一種由四個亞單位即CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈組成的蛋白複合物。CD3與T細胞受體和ζ鏈結合以在T淋巴球中產生活化訊息。已將靶向CD3和一或多種靶細胞抗原的雙特異性和三特異性抗體用於強制該一或多種靶細胞和T細胞之間發生臨時相互作用，從而引起交聯、T細胞活化和後續對該靶細胞的抗原依賴性T細胞殺傷。通常，目標係只與CD3蛋白進行單價結合，使得T細胞受體只有在與該靶細胞結合時才會發生交聯和活化。因此，在一些方面，三特異性抗體中只有一個抗原結合結構域與CD3結合，並被稱為三特異性T細胞銜接器型DuetMab（「TED3」）。

在一些方面，抗原結合臂之一能夠結合CD8。

CD8（分化簇8）係由一對CD8鏈組成的二聚物。最常見的CD8形式由CD8-α和CD8-β鏈組成。CD8作為MHC-I類限制性T細胞上的輔助受體，並藉由在與T細胞受體結合的位點不同的位點處結合MHCI的基本不變區而發揮增強CD8 ⁺T細胞的抗原敏感性的作用。

在一些方面，抗原結合臂之一能夠結合CD3，並且其他抗原結合臂之一能夠結合CD8。

在一些方面，抗原1/抗原2/CD3 TriMab的抗原結合臂之一能夠結合抗原1或抗原2上不會誘導細胞毒性的表位。在一些方面，抗原1/抗原2/CD3 TriMab的抗原1結合臂會誘導細胞毒性，並且抗原2結合臂將作為錨定臂，無法在僅表現抗原2的細胞中誘導細胞毒性。在一些方面，抗原1/抗原2/CD3 TriMab的抗原2結合臂會誘導細胞毒性，並且抗原1結合臂將作為錨定臂，無法在僅表現抗原1的細胞中誘導細胞毒性。錨定臂無法誘導細胞毒性可能是由於例如與膜遠端表位的結合，從而使其不能形成活性免疫突觸。 序列同一性和突變

如本文所述，本文所述之三特異性抗體含有第一、第二和第三抗原結合臂，其中該等抗原結合臂中之至少一個包含恒定輕鏈λ區（CLλ）和CLλ與相對應的CH1之間的λ電荷對，並且其他抗原結合臂中之至少一個包含恒定輕鏈κ區（CLκ）和CLκ與相對應的CH1之間的κ電荷對。

在一些方面，一條或多條輕鏈的CLλ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些方面，一條或多條輕鏈的CLλ包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾的SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。

在一些方面，一條或多條輕鏈的CLκ包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。在一些方面，一條或多條輕鏈的CLκ包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾的SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。

在一些方面，第一、第二和/或第三CH1包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列。在一些方面，第一、第二和/或第三CH1包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾的SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。

這1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸修飾可為除引入上述電荷對、工程化二硫化物和/或Fc區修飾的上述修飾之外的修飾。例如，與SEQ ID NO: 1中所示的野生型CLλ相比，三特異性抗體中使用的CLλ可以含有λ電荷對突變、工程化二硫化物（例如，S122C和C212V）和1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個另外的胺基酸修飾。作為另一實例，與SEQ ID NO: 4中提供的野生型CH1相比，三特異性抗體中使用的CH1可以含有λ電荷突變、工程化二硫化物（例如，F126C、C220V）和1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個另外的胺基酸修飾。

胺基酸修飾可為插入、取代或缺失。在一些方面，胺基酸修飾係將胺基酸殘基取代為任何其他天然存在的或非天然存在的胺基酸殘基。

基於共同的側鏈特性可以將天然存在的殘基分類： 1) 非極性、脂族：甘胺酸（G）、甲硫胺酸（M）、丙胺酸（A）、纈胺酸（V）、白胺酸（L）、異白胺酸（I）； 2) 極性：半胱胺酸（C）、天冬醯胺（N）、麩醯胺（Q）、脯胺酸（P）； 3) 極性、部分帶負電荷的：絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）； 4) 酸性（帶負電荷的）：天冬胺酸（D）、麩胺酸（E）； 5) 鹼性（帶正電荷的）：組胺酸（H）、離胺酸（K）、精胺酸（I）； 6) 芳香族：色胺酸（W）、酪胺酸（Y）、苯丙胺酸（F）。

如上所述，絲胺酸（S）和蘇胺酸（T）具有低於6的等電點，並且在中性pH下部分帶負電荷，因此將它們在此歸類為「極性、部分帶負電荷的」。

胺基酸取代可為保守胺基酸取代。保守胺基酸取代可能涉及該等類別之一的一個成員與同一類別的另一成員的交換。例如，保守胺基酸取代可為酸性胺基酸麩胺酸（E）取代酸性胺基酸天冬胺酸（D）。 核酸、載體和宿主細胞

本文還提供了編碼本文所述之三特異性抗體的一或多種核酸。在一些方面，一或多種核酸係例如從其他核酸或天然存在的生物材料中純化或分離出來的。技術者使用本領域熟知的方法製備這樣的核酸分子不會有困難。

在一些方面，一或多種核酸編碼如本文所述之第一、第二和/或第三輕鏈和/或如本文所述之第一、第二和/或第三CH1。編碼第一或第二CH1的一或多種核酸可以進一步編碼其他重鏈結構域，例如鉸鏈、CH2和CH3，並且可以編碼完整的重鏈。

本揭露還提供了一或多種載體，其包含編碼本文所述之三特異性抗體的一或多種核酸。可以選擇或構建合適的載體，該等載體含有適當的調節序列，包括啟動子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、強化子序列、標誌基因和其他適當的序列。在一些方面，載體含有適當的調節序列以驅動核酸在宿主細胞中的表現。載體可為質體、病毒，例如噬菌體或噬菌粒，視情況而定。

三特異性抗體可以由一或多種輕鏈載體和一或多種重鏈載體產生。輕鏈載體可以含有編碼第一輕鏈的核酸、編碼第二輕鏈的核酸和編碼第三輕鏈的核酸，它們可以作為不同的盒（例如，各自可操作地連接至不同的啟動子）存在於該載體上。可替代地，可以使用不同的載體，即，含有編碼第一輕鏈的核酸的一種載體、含有編碼第二輕鏈的核酸的一種載體和含有編碼第三輕鏈的核酸的一種載體。

重鏈載體可以含有用於同時編碼第一CH1和第一VH（和第一Fc區，如果存在的話）以及第二CH1和第二VH（和第二Fc區，如果存在的話），其可以作為不同的盒存在於該載體上。可替代地，可以使用不同的載體，即，含有編碼第一CH1和第一VH（和第一Fc區，如果存在的話）的核酸的一種載體和含有編碼第二CH1和第二VH（和第二Fc區，如果存在的話）的核酸的一種載體。如上所述，在本文所述之三特異性形式中，第三抗原結合臂的CH1與第一抗原結合臂或第二抗原結合臂的重鏈融合。因此，如果第三抗原結合臂與第一抗原結合臂融合，則第三CH1和第三VH將由編碼第一CH1和第一VH的核酸編碼，並且如果第三抗原結合臂與第二抗原結合臂融合，則第三CH1和第三VH將由編碼第二CH1和第二VH的核酸編碼。

可以將如本文所述之核酸分子或載體引入宿主細胞中。用於將核酸或載體引入宿主細胞中的技術在本領域中已經非常成熟，並且可以採用任何合適的技術。適於產生重組抗體分子的一系列宿主細胞係本領域已知的，並且包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。在一些方面，宿主細胞係哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0或HEK細胞，例如HEK293細胞。在一些方面，宿主細胞係CHO細胞。 產生三特異性抗體的方法

本文還提供了一種產生本文所述之三特異性抗體的方法。

在一些方面，該方法包括 a)    在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1； b)    使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並使第一結合臂與第二和第三結合臂配對（例如，經由Fc區），從而形成三特異性抗體；以及 c)    從該宿主細胞中純化該三特異性抗體。

在宿主細胞中表現第一、第二和第三輕鏈以及第一、第二和第三CH1可以包括使用如上所述之合適技術將核酸或載體引入宿主細胞（例如，CHO細胞）中。然後可以使用合適的技術培養宿主細胞，使得輕鏈和重鏈多肽進行配對並形成第一和第二結合臂。在正常的抗體產生期間，各種輕鏈和重鏈多肽相互結合（例如，藉由天然半胱胺酸之間形成的鏈間二硫鍵，和/或藉由經工程化到如本文所述之三特異性抗體中的半胱胺酸），並且該等重鏈也相互結合（例如，藉由兩個Fc結構域中的半胱胺酸之間形成的鏈間二硫鍵）。如本文所述，λ和κ電荷對以及（如果存在的話）工程化二硫化物的存在促進在三特異性抗體中形成正確的重鏈/輕鏈對。

用於純化重組抗體分子的技術係本領域已知的，並且包括例如高效液相層析、快速蛋白液相層析、離子交換層析和親和層析，例如使用蛋白A或蛋白L或者藉由結合親和標籤。在一些方面，使用親和層析（例如，蛋白A親和層析）進行純化。在一些方面，純化進一步包括（例如，除了蛋白A層析之外）輕鏈親和層析。如本文所述，輕鏈親和層析可用於選擇性純化同時含有CLκ和CLλ的三特異性抗體，因此可用於提高這種形式的三特異性抗體的產生。

在一些方面，經純化後（例如，藉由蛋白A親和層析、或在蛋白A親和層析和輕鏈親和層析之後），三特異性抗體中少於25%、少於20%、少於15%、或少於10%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%、或少於1%的輕鏈會發生誤配（即，與來自不同抗原結合臂的CH1配對）。用於確定正確輕鏈配對的方法係本領域已知的，並且包括質譜分析和基於微流控技術的電泳，如本文更詳細描述的。在一些情況下，該方法包括測量正確的輕鏈配對。

該方法還可以包括將抗體分子配製成藥物組成物，視需要地與藥學上可接受的賦形劑或如下所述之其他物質一起配製。 治療

因此，本文所述之三特異性抗體可用於治療性應用，例如在治療癌症方面。

如本文所述之三特異性抗體可用於治療人體或動物體的方法中。本揭露之相關方面提供了： (i) 用作藥物的本文所述之三特異性抗體， (ii) 在治療疾病或病症的方法中使用的本文所述之三特異性抗體， (iii) 在製備用於治療疾病或病症的藥物中的本文所述之三特異性抗體；以及， (iv) 治療個體的疾病或病症的方法，其中該方法包括向個體投與治療有效量的如本文所述之三特異性抗體。

該個體可為患者，並且在一些方面，可為人患者。

治療可為其中實現一些期望的治療效果的任何治療或療法，例如，抑制或延遲病況的進展，並且包括降低進展的速率、暫停進展的速率、改善病況、治癒或緩解病況（無論是部分的還是全部的）、預防、改善、延遲、減輕或阻止病況的一或多種症狀和/或體征，或延長個體或患者的生存期，使其超過在未治療的情況下的預期生存期。

還包括作為預防性措施（即，預防）的治療。例如，易患疾病例如癌症或處於疾病例如癌症發生或復發風險中的個體可以如本文所述進行治療。這樣的治療可以預防或延緩個體疾病的發生或復發。

所描述之治療方法可以包括除了三特異性抗體之外向個體投與至少一種另外的治療。因此，本文所述之三特異性抗體可以單獨或者與一或多種其他治療聯合投與於個體。當三特異性抗體與另一種治療聯合投與於個體時，可以將另外的治療與投與三特異性抗體同時、順序或分開投與於個體。當另外的治療與三特異性抗體同時投與時，可以將三特異性抗體和另外的治療作為組合製劑投與於個體。例如，另外的療法可為用於待治療的疾病的已知療法或治療劑。

雖然三特異性抗體可以單獨投與，但三特異性抗體通常會以藥物組成物的形式投與，其可以包含除該三特異性抗體之外的至少一種組分。因此，本揭露之另一方面提供了一種包含如本文所述之三特異性抗體的藥物組成物。還提供了一種包括將三特異性抗體配製成藥物組成物的方法。

除了三特異性抗體之外，藥物組成物還可以包含藥學上可接受的賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或熟悉該項技術者熟知的其他材料。如本文所用，術語「藥學上可接受的」涉及化合物、材料、組成物和/或劑型，其在合理的醫學判斷範圍內適用於與受試者（例如，人）的組織接觸而沒有過度毒性、刺激、過敏或其他問題或併發症，且與合理的益處/風險比相稱。每種載劑、賦形劑等在與配製物的其他成分相容的意義上也必須是「可接受的」。載劑或其他材料的確切性質將取決於投與途徑，其可為藉由輸注、注射或任何其他合適的途徑，如下所述。

可以以「治療有效量」投與，這足以顯示對個體的益處。所投與的實際量以及投與的速率和時程將取決於所治療疾病的性質和嚴重程度、所治療的特定個體、個體的臨床狀況、病症的原因、組成物的遞送部位、抗體分子的類型、投與方法和投與時間表。 ***

在前面的描述中、或在以下申請專利範圍中、或在附圖中揭露的特徵，係以其特定形式或按照用於執行所揭露的功能的手段、或用於獲得所揭露的結果的方法或過程來表述，視情況而定，該等特徵可以單獨地、或以這樣的特徵的任意組合的方式用於以其各種形式來實現本揭露之範圍。

雖然已經結合上述示例性方面描述了本揭露，但是當給出本揭露時，許多等同的修改和變化對於熟悉該項技術者而言將是顯而易見的。因此，上述揭露的示例性方面被認為是說明性的而非限制性的。在不脫離本揭露之精神和範圍的情況下，可以對所描述的方面進行各種改變。

為了避免任何疑問，本文提供的任何理論解釋都是為了提高讀者的理解而提供的。本文使用的任何章節標題只是出於組織的目的，而不應被解釋為限制所描述的主題。

除非上下文另有要求，否則在本說明書（包括後面的申請專利範圍）全篇，詞語「包含（comprise）」和「包括（include）」及變型（如，「包含（comprises）」、「包含（comprising）」和「包括（including）」）應當被理解為意味著包括所指定的整數或步驟或者多個整數或步驟的組，但不排除任何其他整數或步驟或者多個整數或步驟的組。

必須指出的是，如本說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一個/種（a/an）」和「該」包括複數指示物。本文可以將範圍表示為從「約」一個特定值，和/或至「約」另一個特定值。在表示這樣的範圍時，另一方面包括從該一個特定值和/或到另一個特定值。類似地，當藉由使用先行詞「約」將值表述為近似值時，應當理解，該特定值形成了另一方面。關於數值的術語「約」係視需要的並且意指例如 +/- 10%。 實例 實例1 - λLC-HC介面中電荷對變體的設計

為了改進正確的鏈配對，使其超過可替代的二硫化物在DuetMab環境中所能實現的效果（參見WO 2013/096291，藉由引用併入本文），使用參與λ輕鏈（LC）-重鏈（HC）介面的胺基酸來設計電荷對。

認識到經工程化到κLC-HC介面中的電荷對在工程化到λ/CH1介面中的等同位置時不太可能以相同的方式發揮作用。例如，λLC中Y178的存在預計會破壞經工程化到λLC的V134（等同於κLC的V133）和CH1的S138中的電荷對（參見圖1B）。

將以下位置評估為參與與CH1結構域的介面形成的λ輕鏈胺基酸：T117、F119、S122、E124、E125、K130、T132、V134、L136、S138、D139、E161、T163、S166、Q168、A174、S176、Y178、S180，以及以下參與與λ輕鏈CL結構域的介面形成的重鏈CH1結構域胺基酸：S124、F126、L128、A129、S131、S132、K133、S134、A141、G143、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S181、S183、V185、T187、V211、K213。

成對地或單獨地研究該等胺基酸，一次一對或以組合方式，使用可替代的鏈間二硫化物或保持二硫化物為天然狀態。引入帶正電荷的或部分帶正電荷的胺基酸意指將該位置處的現有胺基酸取代為離胺酸和精胺酸，並且在一些情況下取代為天冬醯胺或麩醯胺或組胺酸。引入帶負電荷的或部分帶負電荷的胺基酸意指將該位置處的現有胺基酸取代為天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸，並且在一些情況下取代為天冬醯胺或麩醯胺。在其中一些位置處添加組胺酸殘基將允許引入pH依賴性CH1-CL相互作用。

表1中提供了滿足上述標準的λLC-HC介面中的九組配對組合作為非窮舉性實例，並在本說明書中測試了改進的配對。

[ 表 1].此處呈現的所有突變對於含有λ輕鏈的分子具有特異性，並且預計在野生型和V12形式中都會發揮作用（參見下文）。另外，相反的電荷對 [即，V134（D，E，S，T）-L128（R，K，H）]也預計會提供優先配對。含有無淨電荷側鏈的胺基酸，如天冬醯胺和麩醯胺，可用於取代帶有部分正電荷或部分負電荷的胺基酸，因為已發現它們參與與帶正電荷的和帶負電荷的胺基酸二者以及彼此之間形成氫鍵。

組	Cλ （ + ）	CH1 （ - ）
1號	V134（R，K，H）	L128（D，E，S，T）
2號	V134（R，K，H）	L145（D，E，S，T）
3號	L136（R，K，H）	V185（D，E，S，T）
4號	T117（R，K，H）	V185（D，E，S，T）
5號	T117（R，K，H）	A141（D，E，S，T）
6號	F119（R，K，H）	L128（D，E，S，T）
7號	Y178（R，K，H）	V173（D，E，S，T）
8號	V134（R，K，H）	S183（D，E，T）
9號	T117（R，K，H）	T187（D，E）

實例2 -材料和方法

本文闡述的材料和方法用於進行後續實例中描述的實驗。除非另有說明，否則所有試劑均來自麻塞諸塞州沃爾珊（Waltham, MA）的賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）。如其他地方所述，術語「一或多個電荷對」和「一或多個電荷突變」在整個本說明書中可互換使用，並且除非另有指示，否則胺基酸編號基於EU編號系統。 具有電荷對的DuetMab的pDuet-重和pDuet-輕哺乳動物表現載體的構建

為了構建在重鏈-輕鏈介面中具有電荷對突變的DuetMab抗體，使用了在以下文獻中描述的pDuet-重和pDuet-輕質體作為骨架載體：WO 2013/096291和Mazor等人 mAbs [單株抗體] 2015。簡而言之，pDuet-重載體含有兩個人γ1重鏈（HC）盒以支持HC異二聚化，其中前者重鏈在CH3結構域中攜帶「臼」突變組（T366S/L368A/Y407V）和穩定性突變（Y349C），而後者在CH3中攜帶互補的「杵」突變（T366W）和穩定性突變（S354C），儘管盒的順序可以很容易地顛倒。pDuet-輕載體含有兩個人輕鏈（LC）盒，其中前者輕鏈攜帶κ恒定結構域（Cκ），而後者攜帶λ恒定結構域（Cλ）。pDuet-重和pDuet-輕載體還含有突變以去除CH1/Cλ中的天然鏈間二硫鍵並提供可替代的二硫鍵，其在本說明書中表示為「V12 DS」或「V12」，其中將突變F126C/C220V引入「杵」重鏈的CH1結構域中，並將突變S122C/C212V引入λ恒定結構域中。例示的DuetMab抗體骨架中恒定結構域的胺基酸序列（在引入電荷突變之前）提供如下：

鏈中恒定結構域：	SEQ ID NO:
臼HC	13
κLC	3
杵V12 HC	15
λV12 LC	2

本文使用的「杵和臼」組以及穩定性/可替代的二硫鍵的突變僅作為實例提供。熟悉該項技術者可以使用本領域已知的「杵和臼」技術和/或穩定性/可替代的二硫鍵的任何其他突變組合來支持HC異二聚化。

為了構建具有電荷突變的pDuet-重載體，採用藉由BssHII/HindIII的限制性選殖技術，利用含有上述「臼」重鏈突變的VH-CH1-CH2-CH3結構域的合成DNA片段，將「臼」重鏈選殖到pDuet-重載體中。視需要地，「臼」重鏈在CH1結構域中含有電荷突變S183K。採用藉由BsrGI/EcoRI的限制性選殖技術，利用含有上述「杵」重鏈突變的VH-CH1-CH2-CH3結構域的合成DNA片段，將「杵」重鏈選殖到載體中。視需要地，「杵」重鏈在CH1結構域含有電荷突變之一：L128D、L128E、L128S、L128T、A141D、A141E、A141S、A141T、L145D、L145E、L145S、L145T、S183D、V185D、V185E、V185S、V185T、V173D、V173E、V173S和V173T。

為了構建具有電荷突變的pDuet-輕載體，採用藉由BssHII/NheI的限制性選殖技術，利用VL-Cκ結構域的合成DNA片段，將κ輕鏈選殖到pDuet-輕載體中。視需要地，恒定κ（Cκ）結構域含有電荷突變V133E。採用藉由BsrGI/EcoRI的限制性選殖技術，利用含有上述λ輕鏈的S122C/C212V突變的VL-Cλ結構域的合成DNA片段，將λ輕鏈選殖到pDuet-輕載體中。視需要地，恒定λ（Cλ）結構域含有以下電荷突變之一：V117R、V117K、F119R、F119K、V134R、V134K、L136R、L136K、Y178R和Y178K。輕鏈可變結構域（VL）可為可變κ結構域（Vκ）或可變λ結構域（Vλ）。 表現、親和純化以及蛋白定量

使用PEI-MAX（賓夕凡尼亞州沃靈頓（Warrington, PA）的多元科學公司（Polysciences, Inc.））作為轉染試劑，將所有構建體在懸浮狀態的CHO細胞中暫態表現，並在內部製造的CHO培養基中生長。在該等研究中，含有以下電荷對組合的載體用於表現抗體。圖2中提供了所構建的含有電荷對的DuetMab的示意圖。針對在細胞表面上表現的幾種不同抗原生成雙特異性抗體，該等抗原在此處稱為抗原1、2、3、4、5和6。抗原3係CD3。所生成的雙特異性抗體稱為「靶標1/靶標2-DuetMab」或簡稱為「靶標1/靶標2」：

[ 表 2]：所生成的電荷對變體列表。

樣本編號	pDuet- 重	pDuet- 輕
臼重鏈	杵重鏈	κ 輕鏈	λ 輕鏈
靶標 1	CH1	靶標 2	CH1 （ V12 ）	靶標 1	CL	靶標 2	CL （ V12 ）
1	抗原1	WT	抗原2	WT	抗原1	WT	抗原2	WT
2	抗原1	S183K	抗原2	WT	抗原1	V133E	抗原2	N/A
3	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	V134R
4	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	V134R
5	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	V134R
6	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	V134R
7	抗原1	S183K	抗原2	L145D	抗原1	V133E	抗原2	V134R
8	抗原1	S183K	抗原2	L145E	抗原1	V133E	抗原2	V134R
9	抗原1	S183K	抗原2	L145S	抗原1	V133E	抗原2	V134R
10	抗原1	S183K	抗原2	L145T	抗原1	V133E	抗原2	V134R
11	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	V134K
12	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	V134K
13	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	V134K
14	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	V134K
15	抗原1	S183K	抗原2	L145D	抗原1	V133E	抗原2	V134K
16	抗原1	S183K	抗原2	L145E	抗原1	V133E	抗原2	V134K
17	抗原1	S183K	抗原2	L145S	抗原1	V133E	抗原2	V134K
18	抗原1	S183K	抗原2	L145T	抗原1	V133E	抗原2	V134K
19	抗原1	S183K	抗原2	WT	抗原1	V133E	抗原2	V134K
20	抗原1	S183K	抗原2	S183D	抗原1	V133E	抗原2	V134K
21	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	L136R
22	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	L136R
23	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	L136R
24	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	L136R
25	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	L136K
26	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	L136K
27	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	L136K
28	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	L136K
29	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	T117R
30	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	T117R
31	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	T117R
32	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	T117R
33	抗原1	S183K	抗原2	A141D	抗原1	V133E	抗原2	T117R
34	抗原1	S183K	抗原2	A141E	抗原1	V133E	抗原2	T117R
35	抗原1	S183K	抗原2	A141S	抗原1	V133E	抗原2	T117R
36	抗原1	S183K	抗原2	A141T	抗原1	V133E	抗原2	T117R
37	抗原1	S183K	抗原2	V185D	抗原1	V133E	抗原2	T117K
38	抗原1	S183K	抗原2	V185E	抗原1	V133E	抗原2	T117K
39	抗原1	S183K	抗原2	V185S	抗原1	V133E	抗原2	T117K
40	抗原1	S183K	抗原2	V185T	抗原1	V133E	抗原2	T117K
41	抗原1	S183K	抗原2	A141D	抗原1	V133E	抗原2	T117K
42	抗原1	S183K	抗原2	A141E	抗原1	V133E	抗原2	T117K
43	抗原1	S183K	抗原2	A141S	抗原1	V133E	抗原2	T117K
44	抗原1	S183K	抗原2	A141T	抗原1	V133E	抗原2	T117K
45	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	F119R
46	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	F119R
47	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	F119R
48	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	F119R
49	抗原1	S183K	抗原2	L128D	抗原1	V133E	抗原2	F119K
50	抗原1	S183K	抗原2	L128E	抗原1	V133E	抗原2	F119K
51	抗原1	S183K	抗原2	L128S	抗原1	V133E	抗原2	F119K
52	抗原1	S183K	抗原2	L128T	抗原1	V133E	抗原2	F119K
53	抗原1	S183K	抗原2	V173D	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
54	抗原1	S183K	抗原2	V173E	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
55	抗原1	S183K	抗原2	V173S	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
56	抗原1	S183K	抗原2	V173T	抗原1	V133E	抗原2	Y178R
57	抗原1	S183K	抗原2	V173D	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
58	抗原1	S183K	抗原2	V173E	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
59	抗原1	S183K	抗原2	V173S	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
60	抗原1	S183K	抗原2	V173T	抗原1	V133E	抗原2	Y178K
1	抗原1	WT	抗原3	WT	抗原1	WT	抗原3	WT
2	抗原1	S183K	抗原3	WT	抗原1	V133E	抗原3	WT
33	抗原1	S183K	抗原3	A141D	抗原1	V133E	抗原3	T117R
34	抗原1	S183K	抗原3	A141E	抗原1	V133E	抗原3	T117R
35	抗原1	S183K	抗原3	A141S	抗原1	V133E	抗原3	T117R
36	抗原1	S183K	抗原3	A141T	抗原1	V133E	抗原3	T117R
41	抗原1	S183K	抗原3	A141D	抗原1	V133E	抗原3	T117K
1	抗原4	WT	同種型對照	WT	抗原4	WT	同種型對照	WT
2	抗原4	S183K	同種型對照	WT	抗原4	V133E	同種型對照	WT
33	抗原4	S183K	同種型對照	A141D	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
34	抗原4	S183K	同種型對照	A141E	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
35	抗原4	S183K	同種型對照	A141S	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
36	抗原4	S183K	同種型對照	A141T	抗原4	V133E	同種型對照	T117R
41	抗原4	S183K	同種型對照	A141D	抗原4	V133E	同種型對照	T117K
1	抗原5	WT	抗原3	WT	抗原5	WT	抗原3	WT
2	抗原5	S183K	抗原3	WT	抗原5	V133E	抗原3	WT
33	抗原5	S183K	抗原3	A141D	抗原5	V133E	抗原3	T117R
34	抗原5	S183K	抗原3	A141E	抗原5	V133E	抗原3	T117R
35	抗原5	S183K	抗原3	A141S	抗原5	V133E	抗原3	T117R
36	抗原5	S183K	抗原3	A141T	抗原5	V133E	抗原3	T117R
41	抗原5	S183K	抗原3	A141D	抗原5	V133E	抗原3	T117K
1	抗原6	WT	抗原1	WT	抗原6	WT	抗原1	WT
2	抗原6	S183K	抗原1	WT	抗原6	V133E	抗原1	WT
33	抗原6	S183K	抗原1	A141D	抗原6	V133E	抗原1	T117R
34	抗原6	S183K	抗原1	A141E	抗原6	V133E	抗原1	T117R
35	抗原6	S183K	抗原1	A141S	抗原6	V133E	抗原1	T117R
36	抗原6	S183K	抗原1	A141T	抗原6	V133E	抗原1	T117R
41	抗原6	S183K	抗原1	A141D	抗原6	V133E	抗原1	T117K

在轉染後7至13天收集培養基，並藉由0.22 μm無菌過濾器進行過濾。根據製造商的方案，使用蛋白A感測器藉由Octet384儀器（德國哥廷根（Göttingen, Germany）的賽多利斯公司（Sartorius））測量培養上清液中的抗體濃度。根據製造商的方案，藉由蛋白A磁珠親和純化（新澤西州皮斯卡特維（Piscataway, NJ）的金斯瑞公司（Genscript））或標準蛋白A親和層析（麻塞諸塞州馬爾波羅（Marlborough, MA）的思拓凡公司（Cytiva））、如有必要然後進行輕鏈親和層析純化抗體，隨後在PBS（pH 7.2）中進行緩衝液交換。藉由基於微流控技術的電泳和分析型粒徑篩析層析（參見下文的方法）測定所純化分子的純度和寡聚狀態。藉由製備型SEC去除蛋白質聚集體。使用理論上確定的消光係數，藉由讀取280 nm處的吸光度來確定所純化抗體的濃度。 粒徑篩析層析（SEC）

使用TSK-gel G3000SWxL柱（賓夕凡尼亞州普魯士國王（King of Prussia, PA）的托索生物科學集團（Tosoh Biosciences））進行分析型SEC-HPLC（安捷倫公司（Agilent）的1260 Infinity HPLC系統）以測定所純化分子的寡聚狀態。使用Superdex 200柱（思拓凡公司）進行製備型SEC-HPLC以去除蛋白質聚集體。 基於微流控技術的電泳

根據製造商的方案（加利福尼亞州聖克拉拉（Santa Clara, CA）的安捷倫公司），使用生物分析儀（Bioanalyzer）進行基於微流控技術的電泳，以評估抗體的κ和λ輕鏈的比率，在此基礎上計算出正確輕鏈比率的百分比。 結合動力學測定

在Octet384儀器上藉由生物層干涉測量法測量結合動力學。將卵白素（SA）生物感測器在PBS pH 7.2、1 mg/ml BSA、0.05% （v/v）吐溫（動力學緩衝液）中加載生物素化蛋白抗原（德拉瓦州紐華克（Newark, DE）的ACRO生物公司（ACRO Biosystems））。將加載的生物感測器在相同的緩衝液中洗滌，然後在指定時間內用各種抗體進行結合和解離測量。使用Octet384軟體v.12.2.1.24對數據進行非線性擬合，由此計算出動力學參數（K _on和K _off）和親和力（K _D）。 加速穩定性研究

將蛋白質測試樣本在PBS（pH 7.2）中稀釋至1 mg/mL，並分成3個相等的等分試樣以用作對照、熱應激和光應激樣本。將對照樣本在4°C下孵育14天，將熱應激樣本在45°C下孵育14天，並在符合ICH要求的光穩定性試驗箱中，將光應激樣本置於玻璃小瓶中，暴露於3000 lux冷白光，在25°C下孵育7天。然後藉由HP-SEC對樣本進行分析，以確定聚集體、單體和片段的水平。 差示掃描螢光法（DSF）

樣本製備方法為：在96孔PCR板中，將20 µL在PBS（pH 7.2）中的1 mg/mL蛋白樣本與5 µL在PBS（pH 7.2）中稀釋至40倍的SYPRO Orange染料進行混合，一式兩份。將板密封，並在QuantStudio 7 Flex即時PCR系統中進行測量。將樣本在25°C下進行2分鐘的初始平衡步驟，然後以0.05°C/秒的增量升溫至99°C。使用FAM濾光片組監測螢光發射。使用Boltzmann方法在Protein Thermal Shift ^TM軟體中計算每個樣本的Tm值。 亞單位LC-MS分析

進行亞單位LC/MS分析以表徵誤配種類。將50 μg樣本乾燥，並在50 µL的100 mM磷酸鈉緩衝液（pH 7.0）中進一步重構。藉由在每個樣本中添加60個單位的FabALACTICA酶（IgdE）（瑞典隆德（Lund, Sweden）的Genovis AB公司）並在37°C下孵育16-18小時來進行消化。將Waters ACQUITY UPLC系統（麻塞諸塞州密爾弗德（Milford, MA）的沃特世公司（Waters））與Waters Xevo G2-XS QTof質譜儀串聯，用於亞單位分離和質量測定。將2 µg經消化的亞單位注入Waters BioResolve RP mAb聚苯柱（2.1 × 150 mm，2.7 mm，450 Å）中進行分離。流動相A含有在水中的0.1%甲酸（FA）、0.01%三氟乙酸（TFA），並且流動相B含有在水加ACN中的0.1% FA、0.01% TFA。以0.2 mL/min的流速進行40分鐘的25% B到45% B的梯度。將柱溫設定為75°C。在280 nm的波長下獲得洗脫亞單位的UV圖譜。 微差掃描熱量法分析（DSC）

使用MICROCAL VP-DSC掃描微量熱儀（麻塞諸塞州北安普敦（Northampton, MA）的瑪律文公司（Malvern））進行DSC實驗。在DSC分析之前，將所有樣本在磷酸鹽緩衝液（PBS，pH 7.2）中稀釋至約0.6 mg/mL。使用UV-VIS分光光度計（NanoDrop 2000C）藉由重複測量來確定精確濃度。將400 µL的每個樣本和相應的緩衝液（PBS，pH 7.2）加載到96孔板中，並置於自動進樣器室中在10°C下儲存直至分析。所有DSC測量均使用20°C至100°C的溫度窗，掃描速率為60°C/h。在樣本測量之前，獲得基線測量值（緩衝液與緩衝液）以用於從樣本測量值中扣除。使用Microcal公司提供的Origin™ DSC軟體進行數據分析、基線校正和解摺積。使用軟體內的線性連接函數執行基線校正。使用非二態模型進行解摺積分析，並使用1次和200次反覆運算循環獲得最佳擬合，直到卡方值最小化。對DSC解摺積結果的解釋係基於以下事實：抗體形式中的不同結構域會獨立展開。將T起始值定義為熱譜圖開始從基線顯著增加時的溫度。將Tm值定義為與熱譜圖或解摺積化熱譜圖上每個峰最大值相對應的溫度值。 細胞活力測定

使用CellTiter-Glo™發光法細胞活力測定套組（普洛麥格公司（Promega））測定細胞活力。這種測定對存在的ATP進行定量，ATP表示具有代謝活性細胞的存在。利用發光讀板儀測量由螢光素酶催化的螢光素和ATP的反應所產生的發光。簡而言之，將靶細胞（NCI H358）以約1 × 10 ⁴個細胞/孔的密度接種在96孔板中，培養基為RPMI 1640，補充有0.1% BSA和0.2 ng/ml人重組EGF。將不同濃度的抗體添加到一式三份的樣本中，並將細胞在37°C和5% CO2條件下於濕化培養箱中孵育72小時。處理後，將細胞暴露於CellTiter-Glo®試劑（普洛麥格公司）約15分鐘，並採用EnVision 2104多模式讀板儀（珀金埃爾默公司（PerkinElmer））測量OD409。藉由測量相對於無抗體對照的ATP水平來確定細胞活力。 實例3 -電荷對變體的表現和性質

表3和圖4總結了在小規模細胞培養（3 mL）中產生的帶有所提出的電荷對組的抗原1/抗原2 DuetMab的表現和生物化學特徵。圖4示出了以X-Y散布圖繪製的表1的正確LC比率數據。與對照1號和2號相比，電荷對變體33號、34號、35號、36號和41號表現出更高的正確LC比率，並被選定進行另外的分析。

[ 表 3]：在小規模細胞培養（3 mL）中產生的帶有所提出的電荷對組的抗原1/抗原2 DuetMab的表現和生物化學特徵總結。藉由蛋白A磁珠親和純化來純化抗體。

殘基組	樣本編號	抗原 1 （臼臂）	抗原 2 （杵臂）	第 7 天的效價（ µg/mL ）	正確 LC 比率 %
CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）
對照	1	WT	WT	WT	WT	183.5	69.8
2	S183K	V133E	WT	WT	121.9	91.8
A	3	S183K	V133E	L128D	V134R	93.7	38.4
4	S183K	V133E	L128E	V134R	125.0	26.7
5	S183K	V133E	L128S	V134R	130.3	30.1
6	S183K	V133E	L128T	V134R	104.6	25.8
B	7	S183K	V133E	L145D	V134R	166.3	48.8
8	S183K	V133E	L145E	V134R	157.8	72.6
9	S183K	V133E	L145S	V134R	163.2	47.8
10	S183K	V133E	L145T	V134R	129.0	37.5
A	11	S183K	V133E	L128D	V134K	127.8	37.2
12	S183K	V133E	L128E	V134K	108.2	27.9
13	S183K	V133E	L128S	V134K	137.7	30.6
14	S183K	V133E	L128T	V134K	149.2	35.8
B	15	S183K	V133E	L145D	V134K	158.1	33.3
16	S183K	V133E	L145E	V134K	155.9	45.6
17	S183K	V133E	L145S	V134K	193.8	21.6
18	S183K	V133E	L145T	V134K	130.5	21.9
H	19	S183K	V133E	WT	V134K	158.7	12.2
20	S183K	V133E	S183D	V134K	130.9	25.8
C	21	S183K	V133E	V185D	L136R	169.0	21.0
22	S183K	V133E	V185E	L136R	167.0	8.6
23	S183K	V133E	V185S	L136R	138.3	9.7
24	S183K	V133E	V185T	L136R	148.8	11.9
25	S183K	V133E	V185D	L136K	128.5	38.5
26	S183K	V133E	V185E	L136K	129.3	32.7
27	S183K	V133E	V185S	L136K	151.1	28.2
28	S183K	V133E	V185T	L136K	143.5	27.4
D	29	S183K	V133E	V185D	T117R	130.4	53.2
30	S183K	V133E	V185E	T117R	137.2	77.0
31	S183K	V133E	V185S	T117R	150.9	80.8
32	S183K	V133E	V185T	T117R	144.4	79.5
E	33	S183K	V133E	A141D	T117R	242.2	96.0
34	S183K	V133E	A141E	T117R	256.8	95.6
35	S183K	V133E	A141S	T117R	214.0	93.1
36	S183K	V133E	A141T	T117R	132.4	95.0
D	37	S183K	V133E	V185D	T117K	89.0	46.2
38	S183K	V133E	V185E	T117K	108.3	57.0
39	S183K	V133E	V185S	T117K	152.0	76.4
40	S183K	V133E	V185T	T117K	131.7	74.1
E	41	S183K	V133E	A141D	T117K	167.7	93.5
42	S183K	V133E	A141E	T117K	177.0	90.8
43	S183K	V133E	A141S	T117K	167.0	80.4
44	S183K	V133E	A141T	T117K	119.9	82.2
F	45	S183K	V133E	L128D	F119R	79.1	56.4
46	S183K	V133E	L128E	F119R	99.5	18.5
47	S183K	V133E	L128S	F119R	100.3	28.0
48	S183K	V133E	L128T	F119R	87.4	28.8
49	S183K	V133E	L128D	F119K	48.2	56.7
50	S183K	V133E	L128E	F119K	106.0	43.0
51	S183K	V133E	L128S	F119K	91.7	41.4
52	S183K	V133E	L128T	F119K	67.4	39.5
G	53	S183K	V133E	V173D	Y178R	95.3	46.7
54	S183K	V133E	V173E	Y178R	89.6	16.2
55	S183K	V133E	V173S	Y178R	105.7	21.5
56	S183K	V133E	V173T	Y178R	94.6	13.5
57	S183K	V133E	V173D	Y178K	139.1	10.8
58	S183K	V133E	V173E	Y178K	94.0	74.3
59	S183K	V133E	V173S	Y178K	130.0	12.9
60	S183K	V133E	V173T	Y178K	105.3	12.1

表4總結了在大規模細胞培養（100 mL）中產生的帶有所選定電荷對變體1號、2號、33號、34號、35號、36號和41號的抗原1/抗原2 DuetMab的表現（表4A）和生物化學特徵（表4B）。儘管生產規模不同，但所選定DuetMab的生物化學特徵係一致的。對於另外的分析，藉由輕鏈親和層析進一步純化DuetMab，以去除誤配的副產物，並藉由製備型SEC去除聚集體。

[ 表 4A]：在大規模細胞培養（100 mL）中產生的所選定電荷對樣本1號、2號、33號、34號、35號、36號和41號的表現數據總結。

樣本編號	抗原 1 （臼臂）	抗原 2 （杵臂）	效價（ µg/mL ）
CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）	第 7 天	第 10 天	第 14 天
1	WT	WT	WT	WT	99.8	228.4	361
2	S183K	V133E	WT	WT	83.5	189.2	316.8
33	S183K	V133E	A141D	T117R	86.6	190.2	291
34	S183K	V133E	A141E	T117R	99.6	218.3	342.9
35	S183K	V133E	A141S	T117R	107.7	237	383
36	S183K	V133E	A141T	T117R	115.4	247.1	388.5
41	S183K	V133E	A141D	T117K	40.4	82.2	103.9

[ 表 4B]：在大規模細胞培養（100 mL）中產生的所選定電荷對樣本1號、2號、33號、34號、35號、36號和41號的生物化學特徵總結。為了進行進一步的生物化學、生物物理和生物學分析，藉由蛋白A親和層析，之後藉由輕鏈親和層析純化抗體，然後進行製備型SEC以去除聚集體。

樣本編號	抗原 1 （臼臂）	抗原 2 （杵臂）	蛋白 A 純化後的特徵	輕鏈親和純化後的特徵
	CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）	正確 LC 比率 %	單體 %	正確 LC 比率 %	單體 %
1	WT	WT	WT	WT	64.9	91.9	90.9	＞ 99
2	S183K	V133E	WT	WT	92.1	91.7	93.6	＞ 99
33	S183K	V133E	A141D	T117R	98.6	93.5	99.7	＞ 99
34	S183K	V133E	A141E	T117R	97.1	92.3	99.7	＞ 99
35	S183K	V133E	A141S	T117R	90.2	94.3	95.3	＞ 99
36	S183K	V133E	A141T	T117R	99.7	92.5	93.8	＞ 99
41	S183K	V133E	A141D	T117K	96.3	92.5	99.0	＞ 99

圖5和表5示出了帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的結合動力學。圖5示出了對照樣本1號和代表測試變體的變體33號的響應訊息和擬合曲線。變體33號、34號、35號、36號和41號對抗原2的結合親和力與對照1號和2號相當。

[ 表 5]：使用Ocet384儀器獲得對可溶性單體形式的抗原2的動力學測量。對數據進行非線性擬合，由此將解離常數K _D計算為k _off/k _on的比率。

樣本編號	抗原 1 （ CH1/Cκ ）	抗原 2 （ CH1/Cλ ）	KD （ M ）	KD 誤差	ka （ 1/Ms ）	ka 誤差	kdis （ 1/s ）	kdis 誤差	全量 X^2	全量 R^2
1	WT	WT	3.45E-10	2.58E-12	5.20E+05	9.11E+02	1.80E-04	1.30E-06	0.2098	0.9994
2	S183K/V133E	WT	5.08E-10	1.83E-12	4.89E+05	5.64E+02	2.48E-04	8.45E-07	0.0905	0.9998
33	S183K/V133E	A141D/T117R	2.43E-10	2.11E-12	4.19E+05	5.69E+02	1.02E-04	8.74E-07	0.0893	0.9997
34	S183K/V133E	A141E/T117R	4.13E-10	2.17E-12	5.67E+05	8.45E+02	2.34E-04	1.18E-06	0.1941	0.9995
35	S183K/V133E	A141S/T117R	4.72E-10	1.79E-12	4.43E+05	4.90E+02	2.09E-04	7.59E-07	0.0821	0.9998
36	S183K/V133E	A141T/T117R	4.04E-10	1.97E-12	4.86E+05	6.21E+02	1.96E-04	9.23E-07	0.1196	0.9997
41	S183K/V133E	A141D/T117K	4.90E-10	1.37E-12	5.03E+05	4.45E+02	2.46E-04	6.53E-07	0.0567	0.9999

表6總結了藉由差示掃描螢光法（DSF）獲得的帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的熱穩定性及其加速穩定性特徵。NIP228用作IgG1對照。抗原1/抗原2 DuetMab變體在熱應激後未表現出聚集或斷裂的問題。抗原1/抗原2 DuetMab變體的HP-SEC滯留時間與NIP228 IgG1對照的滯留時間一致（與NIP228的ΔRT ＜ 0.2 m）。DSF值在各電荷對變體之間未顯示出顯著性差異，並且與NIP228 IgG1對照的值一致。

[ 表 6]：在45°C下孵育14天後，藉由SEC對變體的加速穩定性進行測量。DSF值記錄了所選定變體的T起始和Tm。

	加速穩定性（45°C，14 d）	DSF
樣本	單體損失（＜ 5%）	聚集體增加（＜ 1%）	片段增加（＜ 4%）	與NIP228的ΔRT（＜ 0.2 m）	T 起始	T m
對照1號	-1.20	0.10	1.10	0.16	56.91	66.44
對照2號	-1.10	0.00	1.10	0.15	56.74	66.16
變體33號	-1.90	0.00	1.90	0.14	57.09	66.41
變體34號	-1.13	0.00	1.13	0.14	56.74	65.91
變體35號	-3.67	0.00	3.67	0.15	57.55	66.04
變體36號	-1.15	0.00	1.15	0.15	57.61	66.14
變體41號	-1.10	0.00	1.10	0.14	57.79	66.28

圖6和表7示出了使用微差掃描熱量法（DSC）分析對帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的熱穩定性研究。圖3展示了抗原1/抗原2 DuetMab變體的堆疊熱譜圖。對熱譜圖的解摺積揭示了Fab、CH2和CH3結構域的轉變，其中一些轉變重疊並在相同的TM峰下。表7列出了抗原1/抗原2 DuetMab電荷對變體的解摺積化T _M和近似T _起始值。所有變體具有相似的近似T起始值，表明所選定的電荷對不會顯著影響熱穩定性。

[ 表 7]：DSC熱穩定性測量捕獲的Fab、CH2和CH3結構域符合T _M1、T _M2、T _M3和T _M4描述的轉變。一些轉變處於相同的T _M峰轉變下。

樣本	抗原1（CH1/Cκ）	抗原2（CH1/Cλ）	T M1（°C）	T M2（°C）	T M3（°C）	T M4（°C）	近似T 起始（°C）± S.D.
對照1號	WT	WT	67.6	68.5	72.1	79.8	49.5 ± 0.7
對照2號	S183K/V133E	WT	64.8	68.7	NA	79.3	48.4 ± 0.3
變體33號	S183K/V133E	A141D/T117R	64.5	68.8	NA	79.2	49.3 ± 1.4
變體34號	S183K/V133E	A141E/T117R	63.7	68.7	NA	79.4	50.3 ± 1.1
變體35號	S183K/V133E	A141S/T117R	64	68.7	NA	79.4	48.3 ± 0.5
變體36號	S183K/V133E	A141T/T117R	64.5	68.7	NA	79.4	52.5 ± 0.3
變體41號	S183K/V133E	A141D/T117K	64.5	68.7	NA	79.3	50.8 ± 0.3

圖7和表8示出了帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的亞單位質譜數據。理論質量和實測質量的比對證實了每種變體的分子完整性和LC/HC結合特性。

[ 表 8]：亞單位LC/MS分析的MS結果。

對照1號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47474	47474
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47020	47021
具有2個G0F的Fc	53015	53016
對照2號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47020	47021
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體33號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47119	47120
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體34號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47133	47134
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體35號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47091	47092
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體36號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47105	47106
具有2個G0F的Fc	53015	53016
變體41號	理論質量	實測質量
抗原1_LC +抗原1 HC Fab	47545	47545
抗原2_LC +抗原2 HC Fab	47091	47092
具有2個G0F的Fc	53015	53016

圖8示出了帶有所選定電荷對變體的抗原1/抗原2 DuetMab的細胞毒性特性，這係藉由對ATP進行定量來測定的，ATP表示具有代謝活性細胞的存在。變體33號、34號、35號、36號和41號顯示與對照1號和2號相同程度的細胞毒性，表明電荷對變體不會影響抗原1/抗原2 DuetMab的生物學功能。

圖9和表9總結了不同Fv DuetMab中所選定電荷對變體的表現和生物化學特徵。圖9示出了以分組箱型圖繪製的表9的正確LC比率數據。在不同的Fv DuetMab中，與對照1號和2號相比，電荷對變體33號、34號、35號、36號和41號顯示出更高的正確LC比率。

[ 表 9]：不同Fv DuetMab中所選定電荷對變體的表現和生物化學特徵總結。

DuetMab	樣本編號	臼臂	杵臂	第 10/12 天的效價（ µg/mL ）	正確 LC 比率 %	單體 %
CH1	Cκ	CH1 （ V12 ）	Cλ （ V12 ）
抗原1/抗原2	1	WT	WT	WT	WT	228.4	63.3	91.8
2	S183K	V133E	WT	WT	189.2	92.1	91.7
33	S183K	V133E	A141D	T117R	190.2	98.6	93.5
34	S183K	V133E	A141E	T117R	218.3	97.1	92.3
35	S183K	V133E	A141S	T117R	237.0	90.2	94.2
36	S183K	V133E	A141T	T117R	247.1	99.7	92.5
41	S183K	V133E	A141D	T117K	82.2	96.3	93.5
抗原1/抗原3	1	WT	WT	WT	WT	364.2	38.2	94.8
2	S183K	V133E	WT	WT	313.6	66.4	97.3
33	S183K	V133E	A141D	T117R	289.9	89.8	96.5
34	S183K	V133E	A141E	T117R	365.5	93.6	96.2
35	S183K	V133E	A141S	T117R	262.7	78.4	97.4
36	S183K	V133E	A141T	T117R	241.1	79.2	97.1
41	S183K	V133E	A141D	T117K	252.7	92.1	97.1
抗原4/同種型對照	1	WT	WT	WT	WT	254.9	50.2	100.0
2	S183K	V133E	WT	WT	243.2	80.7	100.0
33	S183K	V133E	A141D	T117R	173.2	99.7	100.0
34	S183K	V133E	A141E	T117R	305.4	98.2	100.0
35	S183K	V133E	A141S	T117R	257.0	96.5	100.0
36	S183K	V133E	A141T	T117R	219.5	98.9	100.0
41	S183K	V133E	A141D	T117K	175.4	98.6	100.0
抗原5/抗原3	1	WT	WT	WT	WT	162.2	86.9	95.4
2	S183K	V133E	WT	WT	124.8	98.1	100.0
33	S183K	V133E	A141D	T117R	93.8	96.8	100.0
34	S183K	V133E	A141E	T117R	90.5	96.0	100.0
35	S183K	V133E	A141S	T117R	124.0	92.9	100.0
36	S183K	V133E	A141T	T117R	127.0	96.3	100.0
41	S183K	V133E	A141D	T117K	100.5	100.0	100.0
抗原6/抗原1	1	WT	WT	WT	WT	138.7	88.2	96.9
2	S183K	V133E	WT	WT	110.6	83.4	99.0
33	S183K	V133E	A141D	T117R	128.7	97.7	96.5
34	S183K	V133E	A141E	T117R	63.1	95.2	98.9
35	S183K	V133E	A141S	T117R	143.4	82.6	95.0
36	S183K	V133E	A141T	T117R	109.3	76.1	96.6
41	S183K	V133E	A141D	T117K	124.4	98.7	97.8

實例4 -CH1-CL（λ）介面中提出的突變的晶體學研究

進行X射線結晶學分析以進一步研究輕鏈: CH1介面處的λ電荷變體。 Fab選殖和表現

(i) 來自抗抗原2抗體的輕鏈的可變結構域和含有T117R、S122C和C212V突變的人λ輕鏈的恒定結構域，以及 (ii) 抗抗原2抗體重鏈的可變結構域和含有A141D或A141E以及F126C和C220V突變的CH1結構域的編碼序列均以合成DNA gBlock的形式向集成DNA技術公司（Integrated DNA Technologies）（愛荷華州柯拉爾維爾（Coralville, IA））訂購。輕鏈的編碼序列兩側係N-末端BssHII和C-末端NheI限制性位點，並且重鏈的編碼序列兩側係N-末端BsrGI和C-末端EcoRI限制性位點以便於選殖。將gBlock消化並插入到哺乳動物表現載體（pOE；馬里蘭州蓋瑟斯堡（Gaithersburg, MD）的阿斯利康公司（AstraZeneca））中。將One Shot Top10化學感受態大腸桿菌細胞（加利福尼亞州喀斯巴德（Carlsbad, CA）的英傑公司（Invitrogen））用作基因殖株/選殖的宿主。

使用293fectin轉染試劑（加利福尼亞州喀斯巴德的生命科技公司（Life Technologies））和標準方案，在人胚腎（HEK）293細胞的懸浮液中暫態表現兩種Fab。使細胞在FreeStyle 293-F表現培養基（生命科技公司）中生長10天，並用專有的細胞補料溶液（阿斯利康公司）補料，之後將懸浮液離心，並使上清液通過0.2 μM過濾器過濾。使用5 ml CaptureSelect CH1-XL柱（麻塞諸塞州沃爾珊的賽默飛世爾科技公司）從上清液中純化Fab，用25 mM Hepes pH 7透析，並用5 ml HiTrap SP HP陽離子交換柱（麻塞諸塞州馬爾波羅（Marlborough, MA）的思拓凡公司）在NaCl梯度中進一步精製，以提高樣本的均質性。 結晶、收穫和X射線繞射數據獲取

使Fab分別在Superdex 200 Increase 10/300 GL柱（思拓凡公司）上運行，該柱已用25 mM HEPES（pH 7.5）和100 mM NaCl預平衡，以確保在安排結晶篩選之前樣本的均質性。兩種蛋白質的初始結晶嘗試均在20°C下藉由坐滴蒸氣擴散法進行。使用Phoenix結晶機器人（藝術羅賓斯儀器公司（Art Robbins Instruments））和市售結晶篩選物將結晶液滴分配到96孔結晶板（Intelli-Plate 102-0001-20；加利福尼亞州森尼韋爾（Sunnyvale, CA）的藝術羅賓斯儀器公司）中。液滴由等體積的蛋白質和池液組成。 結果

利用以下結晶溶液，從原先的坐滴板上直接收穫繞射品質晶體：A141E：0.1 M BIS-TRIS pH 6.5；25% w/v PEG 3350，蛋白質濃度為18.4 mg/ml。A141D：200 mM氯化鈉；0.1 M BIS-TRIS pH 5.5；25% w/v PEG 3350，蛋白質濃度為9 mg/ml。將收穫用於X射線分析的所有晶體都在液氮中快速冷卻，並且在Stanford Synchrotron Radiation Lightsource（加利福尼亞州門洛派克（Menlo Park, CA））的光束線B14-1上以100 K進行繞射實驗。使用XDS軟體（Kabsch, 2010）對從每種Fab的單晶採集的繞射數據進行處理、整合和標準化。

兩種Fab分子的結構均使用CCP4（Winn, 2011）晶體學套裝軟體的程式MolRep（Vagin, 1997）使用分子置換法來確定。使用Coot（Emsley, 2004）進行模型建立，對於細化，使用了程式Refmac5（Kovalevskiy, 2018）。

T117R/A141D Fab的晶體繞射至2.1 Å。在完成細化後，我們發現與我們的預測一致，即突變胺基酸的側鏈確實構建了相當強的氫鍵（圖10）。這種鍵的形成係這對突變體的期望的結果，並且我們認為這係這兩條多肽鏈較佳的配對的基礎。

T117R/A141E Fab的晶體繞射至2.0 Å。在完成細化後，我們發現與我們的預測一致，即突變胺基酸的側鏈確實構建了氫鍵（圖11）。我們認為這種鍵的形成係這兩條多肽鏈較佳的配對的基礎。 討論

這兩種Fab分子的比較表明，突變T117R/A141D構建了比T117R/A141E更強（更短）的氫鍵。對於含有117R/141D對的分子，正確配對分子的百分比更高已經證實了這一結果。 實例5 -含有λ和κ電荷對的三特異性抗體的生成

本文闡述的材料和方法用於進行後續實例中描述的實驗。除非另有說明，否則所有試劑均來自麻塞諸塞州沃爾珊的賽默飛世爾科技公司。 具有3個電荷對的Trimab的pTriMab-重、pTriMab-輕1和pTriMab-輕2哺乳動物表現載體的構建

在上文實例1中所述之pDuet-重的骨架上構建載體pTriMab-重。為了構建具有電荷突變的pTriMab-重載體，如前所述藉由BssHII/HindIII將「臼」重鏈選殖到載體中，其中將「臼」重鏈中的VH-CH1區段定義為「Fab1」，其具有針對第一靶標的VH，並在CH1中具有電荷突變S183K。採用藉由BsrGI/EcoRI的限制性選殖技術，利用VH-CH1-VH-CH1-CH2-CH3結構域的合成DNA片段將「杵」重鏈選殖到載體中。將前述「杵」重鏈的VH-CH1區段定義為「Fab2」，其具有針對第二靶標的VH以及CH1中的電荷突變S183E和視需要地V12 DS。將隨後「杵」重鏈的VH-CH1區段定義為「Fab3」，其具有針對第三靶標的VH以及CH1中的電荷突變A141D和V12 DS。參考在本說明書中其他地方使用的術語，「Fab1」對應於第二抗原結合臂，「Fab2」對應於與第一抗原結合臂融合的第三抗原結合臂，並且「Fab3」對應於第一抗原結合臂。

在上文實例1中所述之pDuet-輕的骨架上構建載體pTriMab-輕1和pTriMab-輕2。為了構建具有電荷突變的pTriMab-輕1，如前所述藉由BssHII/NheI將Fab1的κ輕鏈選殖到載體中，其中Cκ結構域含有電荷突變V133E。去除pTriMab-輕1中的第二（λ）LC盒。

為了構建具有電荷突變的pTriMab-輕2，如前所述藉由BssHII/NheI將Fab2的κ輕鏈選殖到載體中，其中Cκ結構域含有電荷突變V133K和視需要地V12 DS（Cκ的S121C/C214V）。如前所述，藉由BsrGI/EcoRI將Fab3的λ輕鏈選殖到載體中，其中Cλ結構域含有電荷突變T117R和V12 DS。 表現、親和純化以及蛋白定量

所有TriMab構建體均如上文所述針對DuetMab分子那樣進行暫態表現和純化。

結合動力學測定、加速穩定性研究、亞單位 LC-MS 分析和微差掃描熱量法分析（ DSC ）基本上如上所述針對DuetMab蛋白那樣進行。 使用Octet同時結合

在Octet384儀器（加利福尼亞州菲蒙市（Fremont, CA）的福特生物公司（ForteBio））上藉由生物層干涉測量法測量與重組可溶形式的HER2、EGFR和CD3蛋白的同時結合。在抗人IgG Fc生物感測器（福特生物公司）上捕獲PBS pH 7.2、3 mg/mL BSA、0.05%（v/v）吐溫-20（測定緩衝液）中濃度為2 μg/mL的三特異性TriMab抗體。在洗滌步驟以去除任何未結合的蛋白質之後，使各自加載的生物感測器進行連續的結合和解離相互作用，首先與HER2（100 nM），然後與EGFR（200 nM）和CD3（200 nM）。使用Octet384軟體v.9.0對數據進行非線性擬合，由此計算出結合和解離曲線。 細胞活力和T細胞活化FACS測定

在BD FACSymphony™ A5細胞分析儀上進行重定向T細胞的細胞毒性和T細胞活化測定。為了測定選擇性細胞毒性，根據製造商的說明，首先用CellTracker™ Violet（賽默飛世爾科技公司）對僅表現EGFR的親本NCI-H358 HER2 KO細胞（「單陽性」）或表現EGFR和HER2的親本NCI-H358（「雙陽性」）進行染色。然後在補充有10%熱滅活FBS和50 μM 2-巰基乙醇的RPMI1640中將細胞與人PBMC（周邊血單核細胞，效應細胞:靶細胞比率為10 : 1）混合，並接種在96孔板中。將不同濃度的抗體添加到一式三份的樣本中，並將細胞在37°C和5% CO ₂條件下置於濕化培養箱中孵育。為了檢測T細胞活化，使用抗CD4、抗CD8、抗CD25和抗CD69抗體（全部來自美國加利福尼亞州聖地牙哥的百進生技公司（BioLegend））對細胞進行染色。數據採用FlowJo v 10.6.1進行分析。已經用以下公式確定了消耗的靶細胞的數量：%溶解 = 100 -（處理組的活細胞/未處理的對照組的活細胞 × 100），並使用GraphPad Prism v 9.0.0繪圖。 結果

表10總結了在500 mL細胞培養中產生的帶有所選定電荷對組的HER2/EGFR/CD3 TriMab的表現和生物化學特徵。對於另外的分析，藉由蛋白A親和層析進一步純化TriMab，並且藉由製備型CHT柱（利用陽離子交換和鈣-親和相互作用的不可壓縮性混合模式層析介質）去除聚集體。

[ 表 10]：具有電荷突變的HER2/EGFR/CD3 TriMab三特異性抗體。使用Agilent Protein 80晶片，藉由在還原條件下毛細管凝膠電泳的條帶密度計算出κ和λ的比率。藉由完整抗體的分析型粒徑篩析層析圖計算出單體含量。CHT羥磷灰石陶瓷係一種混合模式純化方法。

TriMab

Fab1-HER2 （臼臂）

Fab2-EGFR- （杵臂）

Fab3-CD3 （杵臂）

效價（ µg/mL ）

蛋白 A 純化後的特徵

CHT 後的特徵

第 12 天

κ 和 λ 的比率

單體 %

κ 和 λ 的比率

單體 %

CH1

C K

CH1 （ v12 ）

C K （ v12 ）

CH1 （ v12 ）

Cλ （ v12 ）

HER2/EGFR/ CD3 TriMab

S183K

V133E

S183E

V133K

A141D

T117R

176

2.12

95

2.41

＞ 99

表11總結了藉由差示掃描螢光法（DSF）獲得的HER2/EGFR/CD3 TriMab的熱穩定性及其加速穩定性特徵。HER2/EGFR/CD3 TriMab分子在熱應激後未表現出聚集或斷裂的標誌。

[ 表 11]：具有電荷突變的HER2/EGFR/CD3 TriMab的可開發性總結。使用Agilent Protein 80晶片，藉由在還原條件下毛細管凝膠電泳的條帶密度計算出κ和λ的比率。藉由完整抗體的分析型粒徑篩析層析圖計算出單體含量。

分子名稱	加速穩定性加熱（ 45°C ， 14 d ）	DSF
單體損失（ % ）	聚集體增加（ % ）	片段增加（ % ）	T m （ °C ）	T 起始 （ °C ）
HER2/EGFR/CD3 TriMab	2.21	0	2.21	60.6	54.1

圖13和表12示出了HER2/EGFR/CD3 TriMab的亞單位質譜數據。理論質量和實測質量的比對證實了每個峰的分子完整性和LC/HC結合特性。

[ 表 12]：HER2/EGFR/CD3 TriMab的亞單位LC/MS分析的MS結果。

峰	實測質量（ Da ）	理論質量（ Da ）	注釋
1	23588	23589	HER2 LC+Cys
2	53096	53096	Fc（2xG0F）
53126	53128	Fc（2xG0F）+三硫化物
3	50205	50205	Fc（無聚糖）
51650	51650	Fc（1xG0F）
4	100680	100677	Fab（HER2）+Fc
100710	100709	Fab（HER2）+Fc+三硫化物
5	47599	47599	Fab（HER2）
6	148953	148951	Fab（EGFR-CD3）+Fc+三硫化物
7	95842	95841	Fab（EGFR-CD3）

圖14和表13示出了使用微差掃描熱量法（DSC）分析對HER2/EGFR/CD3 TriMab的熱穩定性研究。圖14展示了HER2/EGFR/CD3 TriMab的堆疊熱譜圖。表13列出了HER2/EGFR/CD3 TriMab的解摺積化TM和近似T起始值。

[ 表 13]：DSC熱穩定性測量捕獲的Fab、CH1、CH2和CH3結構域符合T _m1、T _m2和T _m3描述的轉變。一些轉變疊加在相同的Tm峰轉變中。

名稱	T M1 （ °C ）	T M2 （ °C ）	T M3 （ °C ）	總焓 （ kcal/mol ） FIO	近似 T 起始 （ °C ） ± S.D.
HER2/EGFR/CD3 TriMab	64.0	68.3	77.0	1549.74	49.6 ± 3.1

圖15示出了HER2/EGFR/CD3 TriMab與HER2、EGFR和CD3抗原的同時結合。

圖16示出了EGFR/CD3 DuetMab、 HER2/EGFR/CD3 TriMab和HER2/V _κS93A + V _HP97A EGFR/CD3 TriMab分子的細胞毒性和T細胞活化特性，如藉由細胞活力和T細胞活化FACS測定所確定的。在本研究中，對HER2和EGFR抗原呈陽性的NCI-H358 WT癌細胞模擬雙陽性靶細胞，而僅對EGFR抗原呈陽性的NCI-H358 HER2 KO細胞模擬單陽性非靶正常組織。與EGFR高親和力；EGFR/CD3 DuetMab和HER2/EGFR/CD3 TriMab分子相比，該EGFR親和力調變的HER2/V _κS93A + V _HP97A EGFR/CD3 TriMab變體介導了更高程度的靶選擇性，這體現在相對於EGFR單陽性非靶細胞，優先殺傷雙陽性靶細胞。由HER2/VκS93A + VHP97A EGFR/CD3 TriMab介導的針對靶細胞的選擇性提高還體現在與EGFR單陽性非靶細胞一起孵育時CD8和CD4 T細胞活化水平顯著降低。 序列 1. WT CLλ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 1 ） GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 2. 經修飾以形成工程化雙硫鍵的「 V12 」 LCλ 恒定（ CLλ ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 2 ） 以下取代帶有底線： 工程化二硫化物：S122C、C212V GQPKAAPSVTLFPP CSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE VS 3. WT LCκ 恒定（ Cκ ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 3 ） RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 4. IgG1 CH1 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:4 ） ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC 5. 經修飾以形成工程化雙硫鍵的「 V12 」 CH1 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:5 ） 以下取代帶有底線： 工程化二硫化物：F126C、C220V ASTKGPSV CPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V 6. IgG1 CH2 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:6 ） LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS 7. IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:7 ） GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 8. IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:8 ） ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 9. 經工程化以含有「臼」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:9 ） 以下取代帶有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）。 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 10. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「臼」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:10 ） 以下取代帶有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；和穩定性半胱胺酸突變（Y349C）。 GQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 11. 經工程化以含有「杵」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:11 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）。 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 12. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「杵」突變的 IgG1 CH3 的胺基酸序列（ SEQ ID NO:12 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）；穩定性半胱胺酸突變（S354C）。 GQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 13. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「臼」突變的 IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:13 ） 以下取代帶有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；和穩定性半胱胺酸突變（Y349C）。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 14. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸和「杵」突變的 IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:14 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）；穩定性半胱胺酸突變（S354C）。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 15. 經工程化以含有穩定性半胱胺酸、鏈間半胱胺酸突變和「杵」突變的「 V12 」 IgG1 重鏈多肽的胺基酸序列（ SEQ ID NO:15 ） 以下取代帶有底線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C220V）；穩定性半胱胺酸突變（S354C）。 ASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 16. 連接子（ SEQ ID NO:16 ） GGGGS 17. 連接子（ SEQ ID NO:17 ） SGGGGS 18. 連接子（ SEQ ID NO:18 ） GGGGSGGGGS

無

現在將參考附圖來討論展示本揭露原理的各方面和實驗，其中：

[ 圖 1A] 展示了抗體中κ輕鏈（LC）和重鏈（HC）的CH1之間的介面。標記了κLC的V133和HC的S183。

[ 圖 1B] 展示了抗體中λLC與HC的CH1之間的介面。標記了λLC的V134和Y178以及HC的S183K。

[ 圖 2] 包含含有電荷對的DuetMab抗體的示意圖。左側的「臼」HC經由天然半胱胺酸與κLC形成二硫鍵，並含有κ電荷對（例如，S183K/V133E），由κLC上的減（「-」）號和「臼」HC上的加（「+」）號表示。右側的「杵」HC經由工程化半胱胺酸與λLC形成二硫鍵，並含有λ電荷對，由λLC上的加（「+」）號和「杵」HC上的減（「-」）號表示。

[ 圖 3] 展示了含有示例性λ電荷對（T117R和A141S）的抗體中λLC與HC的CH1之間的介面。標記了λLC的T117R和HC的A141S。

[ 圖 4] .將表1中正確LC比率%的數據繪製在X-Y散布圖中。根據正確LC比率%，選擇電荷對變體33號、34號、35號、36號和41號進行另外的分析。

[ 圖 5] 示出了對照樣本1號和代表測試變體的變體33號的響應訊息和擬合曲線。使用Ocet384儀器獲得對可溶性單體形式的抗原2的動力學測量。對數據進行非線性擬合，由此將解離常數K _D計算為k _off/k _on的比率。

[ 圖 6] 示出了DSC熱穩定性測量捕獲的Fab、CH2和CH3結構域符合T _M1、T _M2、T _M3和T _M4描述的轉變。

[ 圖 7] 示出了每個樣本的亞單位LC/MS分析的UV層析圖。未鑒定出與誤配種類相對應的亞單位。

[ 圖 8] .測定了具有不同電荷對的變體的細胞毒活性。每個點代表一式三份孔的平均值，並且平均值±標準誤差（SEM）由誤差槓表示。R347係同種型對照。

[ 圖 9] 提供了以分組箱型圖繪製的表9中正確LC比率%的數據的圖示。

[ 圖 10] 提供了基於從本文所述之晶體學研究生成的數據而獲得的CH1-CL結構域介面的卡通圖示，其中在λ輕鏈的CL中存在突變T117R，並在重鏈的CH1中存在突變A141D。在CH1結構域的位置141處的天冬胺酸的OD1原子與λ輕鏈的位置117處的精胺酸的NH1原子之間看似形成了距離為約2.4 Å的強氫鍵。

[ 圖 11] 提供了基於從本文所述之晶體學研究生成的數據而獲得的CH1-CL結構域介面的卡通圖示，其中在λ輕鏈的CL中存在突變T117R，並在重鏈的CH1中存在突變A141E。在CH1結構域的位置141處的天冬胺酸的OE1原子與λ輕鏈的位置117處的精胺酸的NH1原子之間看似形成了距離為約3.0 Å的氫鍵。

[ 圖 12] 包含含有電荷對的「TriMab」三特異性抗體的示意圖。右側的「杵」HC經由工程化半胱胺酸與λLC形成二硫鍵，並含有λ電荷對，由λLC上的加（「+」）號和「杵」HC上的減（「-」）號表示。這種杵HC的CH1和VH區與λLC形成「第一抗原結合臂」。左側的「臼」HC經由天然半胱胺酸與κLC形成二硫鍵，並含有κ電荷對，由κLC上的減（「-」）號和「臼」HC上的加（「+」）號表示。這種「臼」HC的CH1和VH區與κLC形成「第二抗原結合臂」。第三抗原結合臂藉由肽連接子從其CH1的N-末端融合至「杵」HC的C-末端。第三抗原結合臂的CH1經由工程化半胱胺酸與κLC形成二硫鍵，並含有κ電荷對，其具有與第二抗原結合臂相反的電荷——CH1中係帶負電荷的胺基酸殘基（「-」）並且κLC中係帶正電荷的胺基酸殘基（「+」）。如不同陰影所示，第一抗原結合臂（深色陰影）結合第一表位，第二抗原結合臂（淺色陰影）結合第二表位，並且第三結合臂（斜線陰影）結合第三表位。

[ 圖 13] 示出了HER2/EFGR/CD3 TriMab的亞單位LC/MS分析的UV層析圖。未鑒定出與誤配種類相對應的亞單位。

[ 圖 14] 示出了DSC熱穩定性測量捕獲的Fab、CH1、CH2和CH3結構域符合T _m1、T _m2和T _m3描述的轉變。

[ 圖 15] 提供了使用Ocet384儀器獲得的展示TriMab與可溶性單體形式的HER2、EGFR和異二聚物形式的CD3ε/δ的連續結合的代表性圖像。A：HER2/EGFR/CD3 TriMab。B：HER2/VκS93A + VHP97A/CD3 TriMab。

[ 圖 16] 提供了HER2/EGFR/CD3 TriMab和親和力調變的HER2/V _κS93A+V _HP97A EGFR/CD3的細胞毒活性和T細胞活化數據。(A) 所測試的雙陽性細胞和單陽性細胞以分別模擬靶腫瘤和正常組織。(B) 選擇性細胞毒活性（上）以及CD8 ⁺（中）和CD4 ⁺（下）T細胞活化，圖上的每個點代表一式兩份孔的平均值，並且平均值±標準誤差（SEM）由誤差槓表示。

無

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Claims (45)

1. 一種三特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ）；和 (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLκ， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂包含一或多個λ電荷對，該一或多個λ電荷對包含位於該第一CH1和該CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基， 其中視需要地，該第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且該第三抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ上的κ電荷對的該等帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的κ電荷對具有相反電荷，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基視需要地選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基視需要地選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。
2. 一種三特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ）；和 (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ）；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLλ， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合， 其中該第一抗原結合臂視需要地包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第一CH1和該CLκ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基， 其中該第二抗原結合臂包含一或多個λ電荷對，該一或多個λ電荷對包含位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且 其中該第三抗原結合臂視需要地包含一或多個λ電荷對，該一或多個λ電荷對包含位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLλ之間介面處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLλ上的一或多個λ電荷對的該等帶電荷的胺基酸殘基視需要地與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLλ上的一或多個λ電荷對的該等帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基視需要地選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基視需要地選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。
3. 如請求項1或請求項2所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於以下位置對中之一對或多對處： (i)   該CLλ中的位置117和該CH1中的位置141； (ii)  該CLλ中的位置117和該CH1中的位置185； (iii) 該CLλ中的位置119和該CH1中的位置128； (iv) 該CLλ中的位置134和該CH1中的位置128； (v)          該CLλ中的位置134和該CH1中的位置145； (vi) 該CLλ中的位置134和該CH1中的位置183； (vii) 該CLλ中的位置136和該CH1中的位置185； (viii)       該CLλ中的位置178和該CH1中的位置173；以及 (ix) 該CLλ中的位置117和該CH1中的位置187， 其中編號係根據EU索引進行的。
4. 如請求項1至3中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置117和該CH1中的位置141處。
5. 如請求項1至5中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的蘇胺酸； e.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的麩胺酸； g.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的絲胺酸；以及 h.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的蘇胺酸。
6. 如請求項1至6中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置141處的蘇胺酸；以及 e.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置141處的天冬胺酸。
7. 如請求項1至6中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置117和該CH1中的位置185處，視需要地其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置117處的精胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸； e.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； g.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.    在該CLλ的位置117處的離胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸。
8. 如請求項1至7中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置119和該CH1中的位置128處，視需要地其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置119處的精胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸； e.    在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； g.    在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.    在該CLλ的位置119處的離胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸。
9. 如請求項1至8中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置134和該CH1中的位置128處，視需要地其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸； e.    在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的麩胺酸； g.    在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的絲胺酸；以及 h.    在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置128處的蘇胺酸。
10. 如請求項1至9中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置134和該CH1中的位置145處，視需要地其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置134處的精胺酸和在該CH1的位置145處的蘇胺酸； e.    在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的麩胺酸； g.    在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的絲胺酸；以及 h.    在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置145處的蘇胺酸。
11. 如請求項1至10中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置134和該CH1中的位置183處，視需要地其中該一或多個λ電荷對係在該CLλ的位置134處的離胺酸和在該CH1的位置183處的天冬胺酸或絲胺酸。
12. 如請求項1至11中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置136和該CH1中的位置185處，視需要地其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： a.    在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； b.    在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； c.    在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸； d.    在該CLλ的位置136處的精胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸； e.    在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的天冬胺酸； f.     在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的麩胺酸； g.    在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的絲胺酸；以及 h.    在該CLλ的位置136處的離胺酸和在該CH1的位置185處的蘇胺酸。
13. 如請求項1至12中任一項所述之三特異性抗體，其中該一或多個λ電荷對位於該CLλ中的位置178和該CH1中的位置173處，視需要地其中該一或多個λ電荷對選自以下列表： i.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的天冬胺酸； j.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的麩胺酸； k.    在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的絲胺酸； l.     在該CLλ的位置178處的精胺酸和在該CH1的位置173處的蘇胺酸； m.   在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的天冬胺酸； n.    在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的麩胺酸； o.    在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的絲胺酸；以及 p.    在該CLλ的位置178處的離胺酸和在該CH1的位置173處的蘇胺酸。
14. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該κ電荷對位於該抗原結合臂中該CLκ的位置133和相對應CH1的位置183處， 視需要地其中該κ對中帶負電荷的胺基酸殘基係麩胺酸，並且其中該κ對中帶正電荷的胺基酸殘基係離胺酸。
15. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中位於該第二CH1與該第二輕鏈的CLκ之間介面處的該κ電荷對包含該第二輕鏈的CLκ上的帶負電荷的胺基酸殘基和該第二CH1上的帶正電荷的胺基酸殘基，並且位於該第三CH1與該第三輕鏈的CLκ之間介面處的該κ電荷對包含該第三輕鏈的CLκ上的帶正電荷的胺基酸殘基和該第三CH1上的帶負電荷的胺基酸殘基。
16. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該等抗原結合臂中之至少一個中的該輕鏈和CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該抗原結合臂的該輕鏈和CH1中的半胱胺酸對之間。
17. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中： (i)   該第一輕鏈和第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈和第一CH1中的半胱胺酸對之間； (ii)  該第二輕鏈和第二CH1之間的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間；和/或 (iii) (a)    該第三輕鏈多肽和第三重鏈多肽之間的二硫鍵連接形成於天然半胱胺酸對之間；或者 (b)       該第三輕鏈和第三CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第三輕鏈和該第三CH1中的半胱胺酸對之間，其中插入到該第三輕鏈和第三CH1中的該半胱胺酸對與插入到該第一輕鏈和第一CH1中的該半胱胺酸對處於不同的胺基酸殘基位置。
18. 如請求項17所述之三特異性抗體，其中經工程化到該第一輕鏈和該第一CH1中的該半胱胺酸對位於該第一輕鏈的位置122和該第一CH1的位置126處，並且其中該第一輕鏈在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該第一CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基，視需要地其中該等非半胱胺酸殘基為纈胺酸。
19. 如請求項17或請求項18所述之三特異性抗體，其中經工程化到該第三輕鏈和該第三CH1中的該半胱胺酸對位於該第三輕鏈的位置121和該第三CH1的位置126處，並且其中該第三輕鏈在位置214處包含非半胱胺酸殘基且該第三CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基，視需要地其中該等非半胱胺酸殘基為纈胺酸。
20. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該CLλ包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
21. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該CLκ包含與SEQ ID NO: 3具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
22. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該第一、第二和/或第三CH1包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
23. 一種三特異性抗體，其包含： (a)   第一抗原結合臂，其包含與第一重鏈恒定區1（CH1）藉由二硫鍵連接的第一輕鏈，該第一輕鏈包含恒定輕鏈λ區（CLλ），其中： (i)   該第一抗原結合臂包含λ電荷對，該λ電荷對包含位於該CLλ中的位置117和該第一CH1中的位置141處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且 (ii)  該第一輕鏈和第一CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第一輕鏈的CLλ和該第一CH1中的半胱胺酸對之間； (b)  第二抗原結合臂，其包含與第二CH1藉由二硫鍵連接的第二輕鏈，該第二輕鏈包含恒定輕鏈κ區（CLκ），其中： (i)   該第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第二輕鏈的CLκ的位置133和該第二CH1中的位置183處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，並且 (ii)  該第二輕鏈和第二CH1之間的二硫鍵連接形成於該第二輕鏈的CLκ和該第二CH1中的天然半胱胺酸對之間；和 (c)   第三抗原結合臂，其包含與第三CH1藉由二硫鍵連接的第三輕鏈，該第三輕鏈包含CLκ，其中： (i)   該第二抗原結合臂包含κ電荷對，該κ電荷對包含位於該第二輕鏈的CLκ的位置133和該第二CH1中的位置183處的帶正電荷的胺基酸殘基和帶負電荷的胺基酸殘基，其中位於該第三CH1和該第三輕鏈的CLκ上的該等帶電荷的胺基酸殘基與位於該第二CH1和該第二輕鏈的CLκ上的那些帶電荷的胺基酸殘基具有相反電荷，並且 (ii)  該第三輕鏈的CLκ和第三CH1之間的二硫鍵連接形成於經工程化到該第三輕鏈的CLκ和該第三CH1中的半胱胺酸對之間，其中插入到該第三輕鏈的CLκ和該第三CH1中的該半胱胺酸對與插入到該第一輕鏈的CLλ和該第一CH1中的半胱胺酸對處於不同或相同的胺基酸殘基位置， 其中該第三抗原結合臂與該第一或第二抗原結合臂融合，並且 其中該等帶正電荷的胺基酸殘基視需要地選自精胺酸、離胺酸或組胺酸，並且該等帶負電荷的胺基酸殘基視需要地選自天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸或蘇胺酸。
24. 如請求項23所述之三特異性抗體，其中經工程化到該第一輕鏈的CLλ和該第一CH1中的該半胱胺酸對位於該第一輕鏈的位置122和該第一CH1的位置126處，並且其中該第一輕鏈在位置212處包含非半胱胺酸殘基且該第一CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基，視需要地其中該等非半胱胺酸殘基為纈胺酸。
25. 如請求項23或請求項24所述之三特異性抗體，其中經工程化到該第三輕鏈的CLκ和該第三CH1中的該半胱胺酸對位於該第三輕鏈的位置121和該第三CH1的位置126處，並且其中該第三輕鏈在位置214處包含非半胱胺酸殘基且該第三CH1在位置220處也包含非半胱胺酸殘基，視需要地其中該等非半胱胺酸殘基為纈胺酸。
26. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該第一抗原結合臂進一步包含第一Fc區並且該第二抗原結合臂進一步包含第二Fc區。
27. 如請求項26所述之三特異性抗體，其包含在該等第一和第二Fc區中的修飾以促進該等第一和第二Fc區進行異二聚化。
28. 如請求項27所述之三特異性抗體，其中該等修飾位於該等Fc區的CH3中。
29. 如請求項28所述之三特異性抗體，其中該等第一和第二Fc區之一的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較大側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成凸起（杵），而另一Fc區的CH3中的修飾係將胺基酸殘基取代為具有較小側鏈的胺基酸殘基，從而在所述CH3結構域的表面上形成空腔（臼），視需要地其中含有該凸起（杵）的該CH3結構域係第一重鏈多肽的一部分，並且含有該空腔（臼）的該CH3結構域係第二重鏈的一部分。
30. 如請求項29所述之三特異性抗體，其中該形成杵的取代係在位置366處取代為色胺酸，而該形成臼的取代係作為以下中一項或多項的形成臼的取代： i)     在位置407處取代為纈胺酸； ii)    在位置366處取代為絲胺酸；以及 iii)   在位置368處取代為丙胺酸。
31. 如請求項29或請求項30所述之三特異性抗體，其中含有該凸起（杵）的CH3結構域包含在位置354處的半胱胺酸，並且含有該空腔（臼）的該CH3結構域包含在位置349處的半胱胺酸。
32. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該等抗原結合臂之一與CD3上的表位結合。
33. 如前述請求項中任一項所述之三特異性抗體，其中該等抗原結合臂之一與CD8上的表位結合。
34. 一種產生如請求項1至33中任一項所述之多特異性抗體的方法，該方法包括在宿主細胞中表現該第一、第二和第三輕鏈以及該第一、第二和第三CH1；其中使該第一輕鏈與該第一CH1配對以形成第一結合臂，其中使該第二輕鏈與該第二CH1配對以形成第二結合臂，其中使該第三輕鏈與該第三CH1配對，並且其中使該第一結合臂與該第二和第三結合臂配對，從而形成該多特異性抗體；以及從該宿主細胞中純化該多特異性抗體。
35. 如請求項34所述之方法，其中純化該三特異性抗體包括親和層析，該方法視需要地進一步包括使用輕鏈親和層析純化該抗體。
36. 如請求項34或請求項35所述之方法，其中該等三特異性抗體中少於25%、少於20%、少於15%、或少於10%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%、或少於1%的輕鏈會發生誤配。
37. 一或多種核酸，其編碼如請求項1至33中任一項所述之三特異性抗體。
38. 一種載體，其包含如請求項37所述之一或多種核酸。
39. 一種分離的宿主細胞，其包含如請求項37所述之一或多種核酸或者如請求項38所述之載體。
40. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至33中任一項所述之三特異性抗體和藥學上可接受的載劑。
41. 一種治療有需要的患者的疾病的方法，該方法包括向該患者投與有效量的如請求項1至33中任一項所述之三特異性抗體或如請求項40所述之藥物組成物。
42. 如請求項41所述之方法，其中該疾病係癌症。
43. 如請求項1至33中任一項所述之三特異性抗體或如請求項40所述之藥物組成物，其用作藥物。
44. 如請求項1至33中任一項所述之三特異性抗體或如請求項40所述之藥物組成物，其用於治療癌症。
45. 如請求項1至33中任一項所述之三特異性抗體或如請求項40所述之藥物組成物在製備用於治療癌症的藥物中之用途。