TW202442874A - 膀胱癌之生物標記 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種生物標記，其係非肌層浸潤性膀胱癌之生物標記，且係ADGRG6增強子所編碼之蛋白質之1個或複數個突變。

Description

膀胱癌之生物標記

廣義上，本發明係關於一種膀胱癌之生物標記等。

於膀胱癌等許多癌症中，於TERT(telomerase reverse transcriptase，端粒酶逆轉錄酶)之啟動子區發生了點突變。其中，5號染色體之1,295,228位之自C向T之置換、5號染色體之1,295,250位之自C向T之置換作為在複數個患者中共同發現之突變、所謂之熱點而被熟知(非專利文獻1)。

就膀胱癌而言，除TERT啟動子以外，還已知ADGRG6(adhesion G protein-coupled receptor G6，黏附G蛋白偶聯受體G6)、PLEKHS1(Pleckstrin homology domain-containing family S member 1，含普列克底物蛋白同源結構域之家族S成員1)、WDR74(WD repeat domain 74，WD重複結構域74)等中之熱點，提示了其等可成為膀胱癌之生物標記(非專利文獻2)。 先前技術文獻 非專利文獻

非專利文獻1：Yujiro Hayashi等人，"Clinical significance of hotspot mutation analysis of urinary cell-free DNA in urothelial bladder cancer", Frontiers in oncology, 2020 非專利文獻2：L. Baxter等人，"Properties of non-coding mutation hotspots as urinary biomarkers for bladder cancer detection"、Scientific Rep orts volume 13, Article number: 1060 (2023)

[發明所欲解決之問題]

本發明之目的在於提供一種膀胱癌之新穎生物標記等。 [解決問題之技術手段]

本發明人等發現在非肌層浸潤性膀胱癌中可見ADGRG6增強子之鹼基之變化，從而完成了本發明。

即，本案包括以下之發明。 [1] 一種生物標記，其係非肌層浸潤性膀胱癌之生物標記，且 係ADGRG6增強子之1個或複數個突變。 [2] 如[1]所記載之生物標記，其中突變為單核苷酸多態性。 [3] 如[2]所記載之生物標記，其中單核苷酸多態性為6號染色體之142,706,206位之鳥嘌呤及/或142,706,209位之胞嘧啶之突變。 [4] 如[1]至[3]中任一項所記載之生物標記，其用於預測非肌層浸潤性膀胱癌之預後。 [5] 如[1]至[4]中任一項所記載之生物標記，其中非肌層浸潤性膀胱癌為高度異型性非肌層浸潤性膀胱癌。 [6] 如[4]或[5]所記載之生物標記，其中預後為無復發生存期之長短或復發風險之高低。 [7] 如[4]至[6]中任一項所記載之生物標記，其係預後不良標記。 [8] 如[1]至[7]中任一項所記載之生物標記，其中突變存在於循環腫瘤DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)(ctDNA)、循環游離DNA(cfDNA)、基因組DNA或互補DNA(cDNA)。 [9] 一種方法，其係對來自罹患或可能罹患非肌層浸潤性膀胱癌之對象之檢體中的ADGRG6增強子之1個或複數個突變進行檢測之方法，且 包括如下步驟：藉由與野生型ADGRG6增強子比較，檢測自上述對象獲得之檢體中之ADGRG6增強子之1個或複數個突變之存在。 [10] 如[9]所記載之方法，其中於檢測出突變之情形時，為對象之預後不良。 [11] 如[9]或[10]所記載之方法，其中檢測步驟中所使用之核酸擴增法為數位PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)。 [12] 如[9]至[11]中任一項所記載之方法，其中檢體為體液檢體。 [13] 如[9]至[12]中任一項所記載之方法，其中檢體包含血液循環DNA(cfDNA)。 [14] 一種引子，其係用於檢測檢體中之非肌層浸潤性膀胱癌之存在者，且 係以ADGRG6增強子之1個或複數個突變為標的之16個鹼基長度以上且21個鹼基長度以下之寡核苷酸。 [15] 一種探針，其係用於檢測檢體中之非肌層浸潤性膀胱癌之存在者，且以ADGRG6增強子之1個或複數個突變為標的。 [16] 一種套組，其包含如[14]所記載之引子及/或如[15]所記載之探針。 [發明之效果]

在未經治療之膀胱癌中病例數最多之組即非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)，尤其是復發之可能性較高之高度異型性之非肌層浸潤性膀胱癌之病例組中，預後不良之病例需要早期發現復發、轉移，並且需要進一步抑制惡化。因此，ADGRG6增強子之突變可成為非肌層浸潤性膀胱癌之有用標記。

如ADGRG6增強子之鹼基之變化之類之預後標記與如顯示出作為膀胱癌之預後不良標記之有用性的TERT啟動子突變之類之先前之預後標記等組合，可實現臨床上之多元化隨訪。

進而，新設計之用於檢測ADGRG6增強子之鹼基之變化之引子及探針與先前之TERT啟動子突變之檢測方法組合，能夠覆蓋更多之膀胱癌患者。

以下，對本發明之實施方式(以下，稱為「本實施方式」)進行說明，但本發明之範圍不限定於以下之實施方式而解釋。

(生物標記) 於第一態樣中，提供一種生物標記，其係非肌層浸潤性膀胱癌之生物標記，且係ADGRG6增強子所編碼之蛋白質之1個或複數個突變。

膀胱癌係發生於膀胱之癌症之總稱，起源於膀胱之尿路上皮黏膜。大多數膀胱癌為尿路上皮癌。膀胱癌具有如下之特徵：難以預測預後，儘管多數情況為即便在早期發現並切除病灶亦反覆復發。根據浸潤深度，膀胱癌分為癌症停留在黏膜至黏膜下層之非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)、及癌症擴散至肌層、結締組織之肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)。膀胱癌之診斷係業者公知的，例如，可依據膀胱癌診療指南(日本泌尿外科協會)進行。根據膀胱癌診療指南，有無肌層浸潤係根據經尿道膀胱腫瘤切除術(trans urethral resection of bladder tumor：TURBT)或膀胱全摘除術標本來判定。

膀胱癌根據其異型性以輕度異型性(低級別(low grade))及高度異型性(高級別(high grade))2個階段、或G1至G3三個階段進行評估。高度異型性或G3之惡性度最高。高度異型性非肌層浸潤性膀胱癌之復發時間因患者而異，但就日本人而言，於1～5年之各年度之無復發生存期(RFS：Relapse free survival)中，1年時70%復發，3年時55%復發，5年時半數以上復發。

於在本說明書中使用之情形時，「ADGRG6增強子」係指ADGRG6基因之增強子區，相當於6號染色體之142,705,538位至142,707,537位。

於在本說明書中使用之情形時，「1個或複數個鹼基之變化」意指ADGRG6增強子中之1個或複數個鹼基與對照組相比變化為1個或複數個不同之鹼基之狀態。較佳為如SNP(Single nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態性)、SNV(single nucleotide variation，單核苷酸突變)之類之單核苷酸多態性變化。例如，於處於ADGRG6基因之增強子區內之位於6號染色體之142,706,206位及/或142,706,209位之位置的鹼基(野生型之情形時，前者為鳥嘌呤，後者為胞嘧啶)被置換為其他鹼基之情形時，確定ADGRG6增強子中之鹼基發生了變化。此種確定可直接測定ADGRG6增強子之鹼基之變化來進行，亦可藉由反義股等中之對應之鹼基之變化來進行。例如，此種變化可使用檢測循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環游離DNA(cfDNA)、基因組DNA或互補DNA(cDNA)之手段來簡便地確認。確認變化之核酸不限於DNA，亦可為mRNA、血液循環腫瘤RNA等RNA。鹼基之變化亦可以對偶基因頻率之變化之量之形式進行評估。例如，於突變對偶基因頻率經時地上升之情形時，可評估為存在復發徵兆。

於確定ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之變化時，成為基準之具有變化前之鹼基之對照組可為接受膀胱癌治療之對象、就相應之鹼基而言具有野生型之健康人。鹼基之變化可藉由經時地反覆進行ADGRG6增強子之序列測定來確認。此種序列測定可在後續觀察時實施。後續觀察時間無特別限定，可在治療之數個月後至1年以內進行，例如在治療之3個月後至10個月以內進行。頻率亦假定為每數個月1次左右，例如3個月1次左右。膀胱癌之後續觀察通常為3個月進行1次，但非肌層浸潤性膀胱癌係預後相對良好類型之癌症，因此，於2年無復發之情形時，可將頻率設為6個月1次。

後續觀察之方法根據膀胱癌之類型而不同。例如，非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)通常在後續觀察時進行尿細胞學檢查及膀胱鏡檢查。NMIBC為非浸潤性，且臨床上轉移至其他器官之可能性較低，因此通常不進行影像診斷(CT)。肌層浸潤性膀胱癌(MIBC)由於在治療時完全摘除膀胱，故隨訪不適合進行膀胱鏡檢查。相反，MIBC之後續觀察進行尿細胞學檢查及CT(Computed Tomography，電腦斷層攝影)影像診斷。

於一實施方式中，針對膀胱癌術後之對象，經時地進行ADGRG6增強子之序列測定，並藉由與以前之比較來確定鹼基之變化。鹼基之變化亦可以對偶基因頻率之變化之量之形式評估。例如，顯示較監測開始之初相對地上升之突變對偶基因頻率之患者可評估為存在復發徵兆。

於一實施方式中，ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之變化係6號染色體之142,706,206位之鳥嘌呤之變化及/或6號染色體之142,706,209位之胞嘧啶之變化。

ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之變化為用於預測膀胱癌之預後之指標(生物標記)。於本說明書中使用之情形時，「預後」意指在對膀胱癌實施某種治療，例如經尿道膀胱腫瘤切除術、將藥物注入膀胱內之膀胱內注入療法、膀胱全摘除術、藥物療法等後，對患者病情發展之醫學預測、及患者之預期壽命。根據癌症之進展程度適當確定治療方法。作為與膀胱癌之預後相關之評估項目，可例舉：有無復發、無復發生存期、生存率、生存期。該等評估項目包括其他主要評估項目、次要評估項目，例如無病生存期(DFS)、非尿路上皮無復發生存期(NUTRFS)、無遠處轉移生存期(DMFS)、二線治療前之無惡化生存期(PFS2)等。生物標記之用途較佳為預後之預測，更佳為復發之預測。

預後之預測係在非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)之後續觀察期間進行。非肌層浸潤性膀胱癌之後續觀察包括尿細胞學檢查、膀胱鏡檢查。於在後續觀察期間確認到突變之情形時，能夠快速地實施治療。監測突變之時間一般假定為與進行尿細胞學檢查、膀胱鏡檢查之時間為同時期。

6號染色體之142,706,206位之鳥嘌呤及/或142,706,209位之胞嘧啶之突變可成為預後不良標記。於觀察某兩組時，於無復發生存期、生存率方面存在有意義差且生存改善之組被判斷為「預後良好組」，生存惡化之組被判斷為「預後不良組」。

(檢測方法) 於第二態樣中，提供一種方法，其係對來自罹患或可能罹患非肌層浸潤性膀胱癌之對象之檢體中的ADGRG6增強子之1個或複數個突變進行檢測之方法，且包括如下步驟：藉由與野生型ADGRG6增強子比較，檢測自上述對象獲得之檢體中之ADGRG6增強子之1個或複數個突變之存在。

檢體採取自疑似患有膀胱癌之對象。膀胱癌可為非肌層浸潤性或肌層浸潤性中之任一種。採取次數可為1次，出於膀胱癌治療後之預後觀察等目的亦可為複數次。

檢體無特別限定，只要為能夠檢測出ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之變化者即可，較佳為包含cfDNA之體液檢體，例如血液、其他體液。更具體而言，檢體較佳為血液、血清、血漿、尿液、糞便、唾液、喀痰、組織液、腦脊髓液、拭子等體液等或其稀釋物等，尤佳為血漿。

藉由液體活檢獲得之cfDNA、cfRNA中所含之來自膀胱癌之DNA(ctDNA)、RNA(ctRNA)之比率非常少，因此可根據檢體之種類，實施於核酸擴增前自檢體中提取ctDNA、ctRNA之步驟、去除夾雜物等之步驟。若以血液為例進行說明，則可藉由進行血漿分離交換法等公知之方法來增大ctDNA、ctRNA之回收率。

作為核酸擴增法，有PCR法，除通常之PCR之外，還可例舉：數位PCR、多重PCR、LAMP(Loop-mediated isothermal AMPlification，環介導等溫擴增)法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids，等溫及嵌合引子引發之核酸擴增)法、RCA(Rolling Circle Amplification，滾環擴增)法、LCR(Ligase Chain Reaction，連接酶鏈反應)法、SDA(Strand Displacement Amplification，鏈置換擴增)法等。

於以cfDNA或cfRNA中之突變為對象之情形時，核酸擴增法較佳為數位PCR。數位PCR可為微滴式數位PCR。

於一實施方式中，ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基係6號染色體之142,706,206位之鳥嘌呤及/或142,706,209位之胞嘧啶。

於檢測ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之變化時，較佳為亦一併檢測TERT啟動子區、PLEKHS1啟動子區等與膀胱癌相關聯之基因上之熱點區之突變。亦可於檢測步驟之前後實施其他步驟、試樣之採取。例如，可在檢測步驟前自疑似患有膀胱癌之對象採取檢體。檢測步驟可進行複數次，例如亦可定期地採取來自同一對象之檢體，並且每次採取時均對其等實施檢測步驟。

於檢測出ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之變化之情形時，預測成為檢體之來源之對象之膀胱癌之預後。藉此，能夠輔助醫生等診斷膀胱癌、確定其後之治療方法。此種診斷、確定包括公知之關於膀胱癌之其他輔助診斷、尿細胞學檢查、膀胱活檢、活檢組織之病理組織學檢查等確定診斷。對於診斷為復發之對象，可進行經尿道膀胱腫瘤切除術、根治性膀胱摘除術等手術(外科治療)、術前化學療法、術後化學療法、復發化學療法等化學療法(抗癌劑治療)、放射治療。

於一實施方式中，於檢測出ADGRG6增強子之1個或複數個鹼基之突變之情形時，判斷為對象之預後不良。

(引子) 於第三態樣中，提供一種引子，其係用於檢測檢體中之非肌層浸潤性膀胱癌之存在者，且係以ADGRG6增強子之1個或複數個突變為標的之16個鹼基長度以上且21個鹼基長度以下之寡核苷酸。

於一實施方式中，ADGRG6增強子之1個或複數個突變係6號染色體之142,706,206位之鳥嘌呤置換為腺嘌呤(以下，亦稱為「206G＞A」)及/或6號染色體之142,706,209位之胞嘧啶置換為胸腺嘧啶(以下，亦稱為「209C＞T」)。

引子係16個鹼基長度以上且21個鹼基長度以下之寡核苷酸。其中，較佳為Tm值較低者。具體而言，藉由將反置引子之Tm值設定得較探針高1～3℃，使得探針相對於模板DNA先退火，其後反置引子退火。

進而，引子可設計為使得進行擴增之擴增子之尺寸未達200 bp。

作為基於如上所述之設計思想，且對包含檢測206G＞A及209C＞T之突變之探針的序列進行擴增之引子之例，可例舉：鹼基長度為20個鹼基之序列編號1所記載之前置引子(TGCATATTTCACATGGAC)、鹼基長度為20個鹼基之序列編號2所記載之反置引子(ATCCTGGAGGGAGAATAC)。引子較佳為使用包含序列編號1及2所記載之序列者。亦可將該等引子與公知之引子組合，該公知之引子係擴增TERT啟動子區、PLEKHS1啟動子區等與膀胱癌相關聯之基因上之熱點區者。

於一實施方式中，TERT啟動子之突變可為5號染色體之1,295,228位之C置換為T(以下，亦稱為「228C＞T」)、5號染色體之1,295,250位之C置換為T(以下，亦稱為「250C＞T」)或該兩者。已知228C＞T在膀胱癌中檢出率較高，並且250C＞T在非肌層浸潤性膀胱癌中檢出率較高。

作為對包含檢測228C＞T及250C＞T兩種突變之探針之序列進行擴增之引子，有BioRad公司製造之引子(TERT C228T_113：dHsaEXD72405942，TERT C250T_113：dHsaEXD46675715)(擴增子尺寸：113 bp)(亦參照J Mol Diagn. 2019 Mar; 21 (2) 274-285)。

於一實施方式中，PLEKHS1啟動子之突變亦可為10號染色體之115,511,590位之G置換為A(以下，亦稱為「590G＞A」)、10號染色體之115,511,593位之C置換為T(以下，亦稱為「593C＞T」)或該兩者。

構成引子等之鹼基序列之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸中之任一種。該等寡核苷酸可用已知之方法合成，例如，可根據鹼基序列，藉由固相亞磷醯胺法及三酯法等任意之核酸合成法合成。

使用上述引子之核酸擴增反應能夠擴增包含與膀胱癌相關聯之熱點區之序列。

(探針) 於第四態樣中，提供一種探針，其係用於檢測檢體中之膀胱癌之存在者，且以ADGRG6增強子之1個或複數個突變為標的。

構成探針之序列並無限定，只要為能夠檢測ADGRG6增強子之突變者即可，例如較佳為能夠檢測206G＞A或209C＞T之突變之探針。

於一實施方式中，檢測206G＞A之突變之探針具有序列編號3所記載之序列(AGGCTCTTTGTATGTTTATACAAAG)。探針較佳為包含序列編號3所記載之序列者。

於一實施方式中，檢測209C＞T之突變之探針具有序列編號4所記載之序列(AGGCTCTTTGTATATTCATACAAAG)。探針較佳為包含序列編號4所記載之序列者。

探針之一部分可經修飾，作為其例，可例舉：末端經胺化者、一部分之鹼基經成為連接子之鹼基修飾者等。又，亦可向鹼基序列之一部分中插入其他鹼基，或者使該鹼基序列之一部分之鹼基缺失，或者置換為其他之鹼基，或者置換為鹼基以外之物質。

進而，探針亦可經標記物質等修飾，例如可具有螢光色素及其淬滅劑。此種標記物質可使用市售者。淬滅劑無特別限制，只要為能夠淬滅來自螢光色素之螢光者即可。可對構成探針之核苷酸殘基本身進行修飾，例如，可置換為經人工修飾之核苷酸殘基。

(套組) 於第五態樣中，提供一種套組，其包含用於檢測檢體中之膀胱癌之存在之引子及/或探針。引子可使用上述之引子。

套組亦可進而包含以ADGRG6增強子之突變為標的之探針。作為檢測206G＞A之突變之探針，可例舉具有序列編號3所記載之鹼基序列者。又，作為檢測209C＞T之突變之探針，可例舉具有序列編號4所記載之鹼基序列者。

套組亦可進而包含以TERT啟動子區、PLEKHS1啟動子區等與膀胱癌相關聯之基因上之熱點區為標的之1對或複數對引子及探針。

於藉由數位PCR擴增核酸之情形時，製備包含上述引子、探針、檢體、及DNA聚合酶之反應溶液。將反應溶液分配至孔或微滴中後，進行擴增反應。

於核酸擴增反應中獲得之擴增產物之檢測可利用能夠特異性識別擴增產物之標記物質。作為此種標記物質，可例舉螢光色素、生物素、地高辛等。於使用螢光作為標記物之情形時，可使用螢光顯微鏡、螢光讀板儀等檢測該螢光。

亦可使用嵌入擴增產物之物質作為標記物質。嵌入劑無特別限定，只要為嵌入雙鏈DNA並發出螢光之物質即可。

或者，亦可藉由使用聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠之電泳法等已知之方法進行檢測。例如，於電泳中，可根據擴增產物相對於分子量已知之標記之遷移率的遷移率來鑑定擴增產物之存在。

以下，例舉實施例來更具體地說明本發明，但本發明並不限定於該等。 實施例

1.引子/探針之設計 1)確定探針之識別部位 利用NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術資訊中心)等獲取6號染色體之142,706,206位及/或142,706,209位周邊之鹼基序列，將檢測用探針之識別部位設定於包含突變之部位。探針之識別位置、鹼基長度係考慮GC含有率及Tm值而確定。

2)引子設計 設計複數個擴增包含探針之序列之引子對，藉由PCR之電泳確認gDNA、cfDNA中有無非特異性擴增子形成、引子二聚物評估，並藉由定量PCR確認每個引子對之PCR效率。由於以cfDNA為對象，故擴增子設為80～150聚體之範圍內，引子之序列、鹼基數考慮了根據探針所算出之Tm值。考慮PCR效率、引子二聚物、非特異性條帶，確定最有效率之引子對，並藉由桑格定序確認正確地擴增了標的區。

3)探針序列之確定 比較各者之引子之Tm值與探針之Tm值，確定探針之鹼基序列是鍵結於正義股側還是鍵結於反義股側鍵結。

將按照上述程序確定之序列示於以下之表中。 [表1]

ADGRG6	序列	長度 (mer)	Tm值 (℃)	GC含量 (%)
WT	AGGCTCTTTGTATGTTCATACAAAG	25	61.2(55.56)	36.0
206G＞A	AGGCTCTTTGTATGTTTATACAAAG	25	58.5(53.92)	32.0
209C＞T	AGGCTCTTTGTATATTCATACAAAG	25	58.4(53.92)	32.0
Fw5	TGCATATTTCACATGGAC	18	54.9(48.97)	38.9
Re117	ATCCTGGAGGGAGAATAC	18	55.2(53.52)	50.0

2.根據膀胱癌確定診斷及病理診斷分類患者 根據膀胱癌診療指南(日本泌尿外科協會)，對疑似膀胱癌之患者進行是否罹患膀胱癌之確定診斷，其後，根據病理診斷評估癌症之性質，對患者進行分類。將程序示於以下。 ・對疑似膀胱癌之患者進行尿細胞學檢查，進行陽性或陰性判定，以進行膀胱癌之確定診斷。 ・以鑑別診斷為膀胱癌之患者中之無治療既往史之初發患者為對象。 ・對於確診為膀胱癌患者，使用藉由經尿道膀胱腫瘤切除術(trans urethral resection of bladder tumor：TURBT)或膀胱全摘除術所獲得之組織標本進行病理診斷，鑑別膀胱癌有無固有肌層浸潤。

有無固有肌層浸潤之鑑別診斷之結果，43例被鑑別為非肌層浸潤性膀胱癌，36例被鑑別為肌層浸潤性膀胱癌，並將該等病例納入本研究。根據手術摘除組織標本之觀察結果，鑑別組織學異型性為低異型性還是高異型性作為腫瘤之惡性度。

3.確定診斷後之檢體採取方法及自檢體中提取核酸之方法 在獲得確診為罹患膀胱癌且能夠參加本研究之患者對於參加研究之同意後，在治療或後續觀察期間進行採血。腫瘤組織僅在進行經尿道膀胱腫瘤切除術或膀胱全摘除術之情形時採取。對於治療或後續觀察期間之病例，每次均進行採血。關於採血方法，通常藉由採血(EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)採血管)回收末梢白血球、血漿，至於腫瘤組織，將藉由手術摘除之腫瘤組織冷凍保存。於提取、分析前，於-80℃下冷凍保存。

對於所獲得之檢體，提取來自腫瘤組織之DNA作為tDNA(腫瘤DNA)，提取來自體細胞(末梢白血球)之DNA作為gDNA(基因組DNA)，提取血漿中之血液循環DNA作為cfDNA(循環游離DNA)。DNA之提取藉由使用套組(QIAGEN公司製造之QIAamp DNA血液迷你套組或QIAamp循環核酸套組)之柱純化來進行。

採取膀胱癌(不論非肌層浸潤、肌層浸潤)患者之腫瘤組織、血液檢體作為對象檢體。對於診斷為肌層浸潤性膀胱癌之患者，於治療後亦每3個月採取一次血液檢體。

4.利用數位PCR之基因突變分析方法 4.1.實驗之流程 使用數位PCR，確認如上所述獲得之血液檢體中是否存在ADGRG6突變。首先，檢查按照以下之順序設計之引子之有效性。 (i)藉由PCR擴增片段。 (ii)DNA純化。 (iii)藉由電泳確認目標片段及確認引子二聚物。 (iv)藉由桑格定序確認片段之序列。

繼而，按照以下之順序製作驗證用質體。 (i)自患者之腫瘤樣本提取基因組DNA。 (ii)藉由PCR擴增包含野生型ADGRG6之142,706,206位或142,706,209位之區之DNA片段。 (iii)將ADGRG6片段插入至載體中。 (iv)將載體導入大腸桿菌中，分離出10～20個左右之群落，進行大量培養。 (v)藉由小量提取(mini prep)回收載體，並藉由桑格定序確認各者之載體是WT(Wild type，野生型)還是突變體(Mutant)。 (vi)於僅回收到WT之情形時，藉由以野生型ADGRG6轉殖質體為模板之突變(Mutagenesis)套組導入206G＞A及209C＞T突變。 (vii)獲取突變型ADGRG6轉殖質體。

按照以下之順序，使用驗證用質體確認引子/探針之檢測精度。 (i)對於野生型ADGRG6轉殖質體及突變型ADGRG6轉殖質體，分別藉由使用野生型引子/探針組、以及突變型引子/探針組之dPCR來確認檢測精度。 再者，使用包含序列編號1所記載之序列(TGCATATTTCACATGGAC)者作為用於檢測野生型ADGRG6及突變型ADGRG6之前置引子，並且使用包含序列編號2所記載之序列(ATCCTGGAGGGAGAATAC)者作為反置引子。於該階段，驗證用質體係藉由桑格定序來確認，且正確之突變率未達10%尚未可知，因此，於該階段一併驗證：驗證用質體是否為大致100%野生型或大致100%突變型，及是否值得在下一步驟(ii)中使用。 (ii)多階段地摻入野生型、突變型質體，製作100%、10%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.0625%、0%突變質體。 (iii)確認上述突變質體之檢測精度。

使用患者樣本，藉由dPCR檢測TERT及ADGRG6突變。 (i)使用經驗證過之野生型ADGRG6引子/探針及突變型ADGRG6引子/探針，以tDNA及gDNA(各27個檢體)為樣本，進行突變檢測確認。 (ii)同樣地使用TERT之引子/探針，以tDNA及gDNA(各27個檢體)為樣本，進行突變檢測確認。再者，TERT之引子/探針使用市售品(BioRad公司製造之引子/探針之組(TERT C228T_113：dHsaEXD72405942，TERT C250T_113：dHsaEXD46675715)(擴增子尺寸：113 bp))。雖然其等之序列未知，但2種擴增子尺寸均為113 bp，又，一般以突變部位為中心設計引子，並以探針觸碰到突變部位之方式設計探針，因此認為在以C228或C250為起點，上游或下游之113 bp之範圍內存在引子及探針。亦可在自上述突變部位向上游或下游50～200 bp之範圍內進行設計。 (iii)對於可確認在tDNA中為突變型陽性，且在gDNA中為突變型陰性之病例，以cfDNA為樣本，進行突變檢測，算出MAF(Mutant Allele Frequency，突變等位基因頻率)。於在腫瘤中為低頻率之情形時，預計難以在血液中檢測出，因此將在tDNA中突變率為10%以上者設為突變型陽性。

將用於數位PCR之材料及方法記載於以下。 材料： 樣本DNA(-20℃) 2x ddPCR探針預混液(Supermix for Probes)(No dU TP)(4℃) 20x引子/探針： 限制酶：HaeIII

方法： 1.將DNA溶液之濃度調整為＜50 ng/孔(最多7 μL)(於10-50個複製數之情形時，可追加15 ng) 2.於室溫下進行渦旋，離心並遮光。 3.製備混合液(Mix)(限制酶為10 U/μL原液) [表2]

成分	量(μL)	終濃度
2x ddPCR探針預混液	10	1 x
20x突變型引子 /探針	1	1 x
20x 野生型引子 /探針	1	1 x
限制酶	0.5	2-5 U/反應(reaction)
DNA樣本＋水	1-7	＜50 ng
合計	20	-

4.對混合液進行渦旋，離心，於室溫下放置3分鐘 5.向DG8(註冊商標)筒之樣本孔中添加20 μL混合液，並向油孔中添加70 μL微滴生成油(Droplet Generation Oil)。 6.放入微滴生成儀(Droplet Generator)中以製作溶液中之微滴(Droplet) 7.將40 μL微滴放入PCR 96孔(well)中並密封(鋁箔) [表3]

循環步驟	溫度(℃)	時間	循環次數
酶活化	95	10 min	1
改性	94	30 sec	40
退火/伸長	55	1 min	40
酶失活	98	10 min	1

8.利用微滴讀取儀(Droplet Reader)進行分析

4.2.確認檢測精度 製作驗證用之質體(野生型、突變型)，確認檢測精度。關於ADGRG6 206G＞A之檢測，野生型與突變型之檢測精度分別為99.98%、100.00%。關於ADGRG6 209C＞T之檢測，野生型與突變型之檢測精度分別為99.99%、100.00%。又，對用野生型稀釋突變型而得之DNA溶液進行檢測，結果可顯著地檢測出0.063%之突變(206G＞A：p＝0.0017，209C＞T：p＜0.001)。

以自患者之血液檢體提取之核酸(tDNA、cfDNA)為模板，實施dPCR，結果野生型、突變型之檢測訊號均良好，且在所有樣本中均能夠明確地分離出陽性微滴及陰性微滴。

經時地對為突變陽性之患者之cfDNA之突變等位基因頻率(MAF)進行分析，結果所有患者經時地均未超過0.3%。認為其反映出了所有患者目前為止均未達到藉由影像診斷為復發之程度。

4.3.利用數位PCR之基因突變分析 在自確診為罹患尿路上皮癌之104例患者中除去25例解剖學上認為係腎盂癌及尿管癌之上部尿路癌之外之79例中，對在後續觀察期間之膀胱癌中之43例確診為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)之43個病例進一步進行研究。試驗以自接受治療之43例患者採取檢體之日為開始時間。試驗之開始時間因各患者參加試驗之時間而異，但後續觀察期間之檢體係在自第一位患者之試驗開始起36個月後之時間獲得。其結果，觀察期為10個月至36個月不等。關於對檢體實施數位PCR而獲得之結果，將可檢測出ADGRG6之142,706,206位之G(鳥嘌呤)突變為C(胞嘧啶)或142,706,209位之C(胞嘧啶)突變為T(胸腺嘧啶)之病例登記為突變陽性病例。又，同時發現第206號G＞A及第209號C＞T之突變之病例亦同樣地登記。此時，同時發現2處突變之病例亦以病例數計而計數為「1」。

於試驗開始後36個月時，對43例非肌層浸潤性癌(NMIBC)之復發、無復發病例數進行計數，繼而進行TERT基因及ADGRG6基因有無突變之評估。當於後續觀察期間，在自胸部至骨盆部之影像檢查(CT)中發現局部復發、轉移至其他器官時，視為復發病例。又，對於組織學異型性之輕度異型性(低級別)及高度異型性(高級別)，分別計數TERT基因及ADGRG6基因有無突變。

對於非肌層浸潤性癌(NMIBC)之復發、無復發組，同時確認以下2個：1)僅TERT、及2)TERT及ADGRG6兩者，並算出計數突變陽性病例數時之比率。對於NMIBC之輕度異型性(低級別)及高度異型性(高級別)，同時確認以下2個：1)僅TERT、及2)TERT及ADGRG6兩者，並算出計數突變陽性病例數時之比率。將結果示於圖1。

於非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)病例中，在異型性為輕度異型性之組中，即便除如TERT啟動子突變之類之先前之預後標記之外，還評估了ADGRG6增強子之突變，覆蓋率亦未大幅增加，與此相對，在異型性為高度異型性之組中，藉由組合兩者之突變，覆蓋率顯著提高。膀胱癌中病例數較多之非肌層浸潤性膀胱癌中之預後不良之病例需要早期發現復發、轉移，並且進一步抑制惡化，因此ADGRG6增強子之變化可成為非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC)、尤其是惡性度較高之高度異型性非肌層浸潤性膀胱癌之預後不良標記。

圖1係表示以TERT啟動子之突變、TERT啟動子及ADGRG6增強子之突變為指標之生物標記之覆蓋率(陽性檢測之比率)(43例)。

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Claims (16)

1. 一種生物標記，其係非肌層浸潤性膀胱癌之生物標記，且 係ADGRG6增強子所編碼之蛋白質之1個或複數個突變。
2. 如請求項1之生物標記，其中突變為單核苷酸多態性。
3. 如請求項2之生物標記，其中單核苷酸多態性為6號染色體之142,706,206位之鳥嘌呤及/或142,706,209位之胞嘧啶之突變。
4. 如請求項1或2之生物標記，其用於預測非肌層浸潤性膀胱癌之預後。
5. 如請求項4之生物標記，其中非肌層浸潤性膀胱癌為高度異型性非肌層浸潤性膀胱癌。
6. 如請求項4之生物標記，其中預後為無復發生存期之長短或復發風險之高低。
7. 如請求項4之生物標記，其係預後不良標記。
8. 如請求項1或2之生物標記，其中突變存在於循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環游離DNA(cfDNA)、基因組DNA或互補DNA(cDNA)。
9. 一種方法，其係對來自罹患或可能罹患非肌層浸潤性膀胱癌之對象之檢體中的ADGRG6增強子之1個或複數個突變進行檢測之方法，且 包括如下步驟：藉由與野生型ADGRG6增強子比較，檢測自上述對象獲得之檢體中之ADGRG6增強子之1個或複數個突變之存在。
10. 如請求項9之方法，其中於檢測出突變之情形時，為對象之預後不良。
11. 如請求項9或10之方法，其中檢測步驟中所使用之核酸擴增法為數位PCR。
12. 如請求項9或10之方法，其中檢體為體液檢體。
13. 如請求項9或10之方法，其中檢體包含血液循環DNA(cfDNA)。
14. 一種引子，其係用於檢測檢體中之非肌層浸潤性膀胱癌之存在者，且 係以ADGRG6增強子之1個或複數個突變為標的之16個鹼基長度以上且21個鹼基長度以下之寡核苷酸。
15. 一種探針，其係用於檢測檢體中之非肌層浸潤性膀胱癌之存在者，且以ADGRG6增強子之1個或複數個突變為標的。
16. 一種套組，其包含如請求項14之引子及/或如請求項15之探針。