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TW202449166A - Ｄｍ－１肌強直性營養不良的靶向基因療法 - Google Patents

Ｄｍ－１肌強直性營養不良的靶向基因療法 Download PDF

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TW202449166A
TW202449166A TW113113038A TW113113038A TW202449166A TW 202449166 A TW202449166 A TW 202449166A TW 113113038 A TW113113038 A TW 113113038A TW 113113038 A TW113113038 A TW 113113038A TW 202449166 A TW202449166 A TW 202449166A
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TW
Taiwan
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seq
nucleic acid
raav
dmpk
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Application number
TW113113038A
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English (en)
Inventor
承興 鄭
莎拉 雅各布
森口隆子
凱薩琳 奧里奧丹
阮國祥
Original Assignee
美商健臻公司
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Abstract

本文提供了用於治療肌強直性營養不良1型（DM1）的RNAi分子。本文還提供了含有該RNAi的表現盒、載體（例如，rAAV）、病毒顆粒和醫藥組成物。本文還進一步提供了與使用該RNAi例如治療DM1有關的方法和套組。

Description

DM-1肌強直性營養不良的靶向基因療法
相關申請的交叉引用
本申請要求2023年4月5日提交的美國臨時專利申請序號63/494,453以及2023年10月11日提交的美國臨時專利申請序號63/589,417的優先權；該等美國臨時專利申請的內容藉由援引以其全文特此併入。 序列表的提交
以下以XML文件提交的內容藉由援引以其全文併入本文：序列表的電腦可讀形式（CRF）（檔案名：752749- SA9-363BPC.xml，創建日期：2024年4月3日，大小：84,754位元組）。
本發明關於變體RNAi分子。在一些方面，本發明關於用於治療肌肉失養症的變體RNAi分子。
在對基因功能的基礎研究中，已經證實RNA干擾（RNAi）係基因緘默化的有用工具，並且RNAi顯示出作為治療劑阻抑與許多疾病的發展相關的基因的巨大前景。在自然界中，由RNAi進行的基因調控藉由稱為微小RNA（miRNA）的小RNA進行（Ambros, (2004) Nature[自然] 431:350-355；Krol等人, (2010) Nat. Rev. Genet. [自然綜述：遺傳學] 11:597-610）。微小RNA（microRNA）已經成為多種細胞過程的有力調控劑，並且當由病毒載體遞送時，人工miRNA被連續表現，從而導致靶基因的穩健且持續的阻抑。對miRNA加工中涉及的機制的闡明已經允許科學家利用內源性細胞RNAi機制並使用人工miRNA來引導靶基因產物的降解（參見，例如US PG Pub. [授權前公開] 2014/0163214和Davidson等人, (2012) Cell[細胞] 150:873-875）。
肌強直性營養不良1型（Myotonic Dystrophy Type-1，DM1）係由DMPK基因座中CTG重複序列（＞ 50）的擴增引起的單基因、體染色體顯性的進行性疾病。具有重複序列的DMPK轉錄成mRNA，該mRNA形成髮夾並結合RNA結合蛋白，從而使該等結合蛋白無法發揮其正常功能。這導致核灶的出現、mRNA的錯誤剪接並且最終導致肌強直。DM1主要影響骨骼肌、心肌和平滑肌，從而引起顯著的身體、認知和行為損害和殘疾。目前尚無批准用於DM1的療法。因此，對於治療DM1的療法存在高度未滿足的醫學需求。
本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物，均藉由援引以其全文併入。
在一些方面，本發明提供了一種重組腺相關病毒（rAAV）顆粒，該rAAV顆粒包含：包含第一股和第二股的RNAi，其中第一股和第二股形成雙股體，第一股包含指導區，其中該指導區包含具有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或具有與SEQ ID NO:1的序列具有約90%同一性的序列的核酸，並且第二股包含非指導區；和包含與野生型AAVrh74衣殼具有約90%同一性的胺基酸序列的AAV衣殼。在一些實施方式中，該第一股包含具有SEQ ID NO:1的序列的核酸，並且該非指導區包含具有SEQ ID NO:2的序列的核酸。在一些實施方式中，該第一股和該第二股藉助於能夠形成環結構的RNA連接子連接。在一些實施方式中，該RNA連接子包含約4至約50個核苷酸。在一些實施方式中，該環結構包含約4至約20個核苷酸。在一些實施方式中，該環結構包含具有SEQ ID NO:3的序列或具有與SEQ ID NO:3的序列具有約90%同一性的序列的核酸序列。在一些實施方式中，該RNAi從5'至3'包含該第二股、該RNA連接子和該第一股。在一些實施方式中，該RNAi從5'至3'包含該第一股、該RNA連接子和該第二股。在一些實施方式中，該RNAi包含具有SEQ ID NO:7的序列或具有與SEQ ID NO:7的序列具有約90%同一性的序列的核酸。在一些實施方式中，該RNAi係小抑制性RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）或小髮夾RNA（shRNA）。
在本發明之一些實施方式中，該RNAi進一步包含支架。在一些實施方式中，該支架包含SEQ ID No: 11的核酸的全部或一部分。在一些實施方式中，該miRNA嵌入該支架內。在一些實施方式中，該支架具有5'臂和3'臂，其中該5'臂位於編碼該RNAi的核酸的5'，其中該3'臂位於編碼該RNAi的核酸的3'。在一些實施方式中，該支架係miR-155支架。在一些實施方式中，該miR-155支架包含位於該RNAi的5'的具有SEQ ID NO:9的序列或與SEQ ID NO:9的序列具有約90%同一性的序列的核酸。在一些實施方式中，該miR-155支架包含位於該RNAi的3'的具有SEQ ID NO:10的序列或與SEQ ID NO:10的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
在本發明之一些實施方式中，該RNAi靶向編碼與肌強直性營養不良1型（DM1）相關的多肽的RNA。在一些實施方式中，該多肽係失養性肌強直蛋白激酶（dystrophia myotonica protein kinase，DMPK）。在一些實施方式中，該DMPK包含與DM1相關的突變。在一些實施方式中，編碼DMPK的基因包含5個或更多個CTG三核苷酸重複序列。
在一些方面，本發明提供了一種表現盒，該表現盒包含編碼本文所述之任何RNAi的核酸。在一些實施方式中，編碼該RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。在一些實施方式中，該啟動子係肌肉特異性啟動子。在一些實施方式中，該啟動子係結蛋白啟動子或其變體。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含：包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或與SEQ ID NO:21的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或與SEQ ID NO:22的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或與SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該表現盒進一步包含內含子。在一些實施方式中，該內含子係兔β-球蛋白內含子。在一些實施方式中，該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或與SEQ ID NO:13的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼該RNAi的核酸嵌入該內含子中。在一些實施方式中，該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於編碼該RNAi的核酸的5'並且該3'臂位於編碼該RNAi的核酸的3'。在一些實施方式中，該內含子的5'臂包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或與SEQ ID NO:14的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該內含子的3'臂包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或與SEQ ID NO:15的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。在一些實施方式中，該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。在一些實施方式中，該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息。在一些實施方式中，該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或與SEQ ID NO:16的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該表現盒包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或與SEQ ID NO:17的序列具有約90%同一性的序列。
在一些方面，本發明提供了一種表現盒，其中該表現盒包含經修飾的結蛋白啟動子，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該經修飾的結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該經修飾的結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。在一些實施方式中，該經修飾的結蛋白啟動子包含：包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或與SEQ ID NO:21的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或與SEQ ID NO:22的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或與SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該表現盒進一步包含內含子。在一些實施方式中，該內含子係兔β-球蛋白內含子。在一些實施方式中，該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或與SEQ ID NO:13的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，編碼轉基因的核酸嵌入該內含子中。在一些實施方式中，該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於該編碼轉基因的核酸的5'並且該3'臂位於該編碼轉基因的核酸的3'。在一些實施方式中，該內含子的5'臂包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或與SEQ ID NO:14的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該內含子的3'臂包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或與SEQ ID NO:15的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。在一些實施方式中，該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。在一些實施方式中，該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息。在一些實施方式中，該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或與SEQ ID NO:16的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該轉基因編碼多肽或核酸。在一些實施方式中，該轉基因編碼RNAi。
在一些方面，本發明提供了包含本文所述之任何表現盒的載體。在一些實施方式中，該表現盒的側翼係一或多個填充（stuffer）核酸序列。在一些實施方式中，該一或多個填充核酸序列源自人類SerpinA1基因。在一些實施方式中，位於該表現盒5'的填充核酸序列源自該人類SerpinA1基因。在一些實施方式中，位於該表現盒5'的填充序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或與SEQ ID NO:18的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，位於該表現盒3'的填充核酸序列源自該人類SerpinA1基因。在一些實施方式中，位於該表現盒3'的填充序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或與SEQ ID NO:19的序列具有約90%同一性的序列。
在本發明之一些實施方式中，該載體係重組腺相關病毒（rAAV）載體。在一些實施方式中，該表現盒的側翼係一或多個AAV反向末端重複（ITR）序列。在一些實施方式中，該表現盒的側翼係兩個AAV ITR。在一些實施方式中，該等AAV ITR係AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些實施方式中，該等AAV ITR係AAV2 ITR。在一些實施方式中，該rAAV載體包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或與SEQ ID NO:20的序列具有約90%同一性的序列。在一些實施方式中，該載體係自身互補的rAAV載體。
在一些實施方式中，本發明提供了包含本文所述之任何表現盒、本文所述之任何載體或本文所述之任何rAAV載體的細胞。
在一些方面，本發明提供了包含本文所述之任何載體的病毒顆粒。在一些方面，本發明提供了包含本文所述之任何rAAV載體的重組AAV顆粒。在一些實施方式中，該AAV衣殼包含在位置502處包含胺基酸取代的胺基酸序列。在一些實施方式中，位置502處的該胺基酸取代係異白胺酸（I）。在一些實施方式中，該rAAV病毒顆粒包含AAVrh74 N502I血清型衣殼。在一些實施方式中，該ITR係AAV2 ITR並且該rAAV顆粒的衣殼係AAVrh74 N502I血清型衣殼。在一些實施方式中，該AAV衣殼包含在位置505處包含胺基酸取代的胺基酸序列。在一些實施方式中，位置505處的該胺基酸取代係精胺酸（R）。在一些實施方式中，該rAAV顆粒包含AAVrh74 W505R血清型衣殼。在一些實施方式中，該ITR係AAV2 ITR並且該rAAV顆粒的衣殼係AAVrh74 W505R血清型衣殼。
在一些方面，本發明提供了一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼係AAVrh74 N502I衣殼。
在一些方面，本發明提供了一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼係AAVrh74 N502I衣殼。在一些實施方式中，該AAVrh74 N502I衣殼包含含有SEQ ID NO:50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
在一些方面，本發明提供了一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼包含含有SEQ ID NO: 50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
在一些方面，本發明提供了一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼包含含有SEQ ID NO: 50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
在一些方面，本發明提供了一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼係AAVrh74 W505R衣殼。
在一些實施方式中，本發明提供了一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼係AAVrh74 W505R衣殼。在一些實施方式中，該AAVrh74 W505R衣殼包含含有SEQ ID NO:52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
在一些方面，本發明提供了一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
在一些實施方式中，本發明提供了一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
在一些方面，本發明提供了包含本文所述之任何病毒顆粒或rAAV顆粒的組成物。在一些實施方式中，本發明提供了包含本文所述之任何病毒顆粒或rAAV顆粒的醫藥組成物。在一些實施方式中，該組成物進一步包含醫藥上可接受的載劑。
在一些方面，本發明提供了套組（kit），該等套組包含如本文所述之RNAi、如本文所述之病毒顆粒、如本文所述之AAV顆粒或如本文所述之組成物中之一或多種。在一些實施方式中，該套組進一步包含使用說明書。
在一些方面，本發明提供了用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的本文所述之任何RNAi。在一些方面，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的本文所述之任何RNAi。在一些方面，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的本文所述之任何RNAi。
在一些方面，本發明提供了用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的如本文所述之任何病毒顆粒（例如，rAAV顆粒）。在一些方面，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的如本文所述之任何病毒顆粒（例如，rAAV顆粒）。在一些方面，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的如本文所述之任何病毒顆粒（例如，rAAV顆粒）。
在本發明之一些實施方式中，病毒顆粒（例如，rAAV顆粒）的有效量係約1 × 10 8至約2 × 10 13個基因組複本/mL的劑量。在本發明之一些實施方式中，該劑量為約5 × 10 12個基因組複本/mL。在本發明之一些實施方式中，該劑量為約1 × 10 13個基因組複本/mL。在本發明之一些實施方式中，該劑量為約2 × 10 13個基因組複本/mL。
在本發明之一些實施方式中，病毒顆粒（例如，rAAV顆粒）的有效量係約1 × 10 8至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重的劑量。在本發明之一些實施方式中，該劑量為約5 × 10 13個基因組複本/kg體重。在本發明之一些實施方式中，該劑量為約1 × 10 14個基因組複本/kg體重。在本發明之一些實施方式中，該劑量為約2 × 10 14個基因組複本/kg體重。
在一些方面，本發明提供了用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的如本文所述之任何組成物。在一些方面，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的如本文所述之任何組成物。在一些方面，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該等方法包括向該哺乳動物投與有效量的如本文所述之任何組成物。
在本發明之一些實施方式中，該RNAi與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該RNAi投與之前、同時和/或之後投與。在一些實施方式中，該病毒顆粒或該rAAV顆粒與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該病毒顆粒或該rAAV顆粒投與之前、同時和/或之後投與。在一些實施方式中，該組成物與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該組成物投與之前、同時和/或之後投與。
在一些方面，本發明提供了包含第一股和第二股的RNAi，其中a) 該第一股和該第二股形成雙股體；b) 該第一股包含指導區，其中該指導區包含具有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或具有與SEQ ID NO:1的序列具有約90%同一性的序列的核酸；並且c) 該第二股包含非指導區，其中該非指導區包含具有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或具有與SEQ ID NO:2的序列具有約90%同一性的序列的核酸。在一些實施方式中，本發明提供了用於表現編碼該RNAi的核酸；例如，用於在哺乳動物的肌肉中表現該RNAi的表現盒。在一些實施方式中，該表現盒在rAAV載體中。
在一些方面，本發明提供了藉由向哺乳動物投與本發明的RNAi來治療該哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM-1）的方法。在一些實施方式中，投與的RNAi抑制哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現；從而改善哺乳動物的DM-1。 一般技術
本文描述或參考的技術和程序通常被熟悉該項技術者充分理解並且通常使用常規方法加以採用，例如以下文獻中描述的廣泛利用的方法： Molecular Cloning: A Laboratory Manual[分子選殖：實驗室手冊]（Sambrook等人，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor, N.Y. [紐約冷泉港], 2012）； Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學實驗操作手冊]（F.M. Ausubel等人編輯，2003）； Methods in Enzymology[酶學方法]系列（Academic Press, Inc. [學術出版社公司]）； PCR 2: A Practical Approach[ PCR 2：實用方法]（M.J. MacPherson, B.D. Hames和G.R. Taylor編輯，1995）； Antibodies[抗體] , A Laboratory Manual[實驗室手冊]（Harlow和Lane編輯，1988）； Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications[動物細胞培養：基本技術和專門應用手冊]（R.I. Freshney，第6版，J. Wiley and Sons [約翰·威利父子出版公司], 2010）； Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成]（M.J. Gait編輯，1984）； Methods in Molecular Biology[分子生物學方法], Humana Press [胡馬納出版社]； Cell Biology: A Laboratory Notebook[細胞生物學：實驗室筆記本]（J.E. Cellis編輯，Academic Press [學術出版社], 1998）； Introduction to Cell and Tissue Culture[細胞和組織培養的介紹]（J.P. Mather和P.E. Roberts, Plenum Press [普倫姆出版社], 1998）； Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures[細胞和組織培養：實驗室程序]（A. Doyle, J.B. Griffiths和D.G. Newell編輯，J. Wiley and Sons [約翰·威利父子出版公司], 1993-8）；Handbook of Experimental Immunology [實驗免疫學手冊]（D.M. Weir和C.C. Blackwell編輯，1996）； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells[用於哺乳動物細胞的基因轉移載體]（J.M. Miller和M.P. Calos編輯，1987）； PCR: The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶鏈反應]，（Mullis等人編輯，1994）； Current Protocols in Immunology[免疫學實驗室指南]（J.E. Coligan等人編輯，1991）； Short Protocols in Molecular Biology[精編分子生物學實驗指南] （Ausubel等人編輯，J. Wiley and Sons [約翰·威利父子出版公司], 2002）； Immunobiology[免疫生物學]（C.A. Janeway等人，2004）； Antibodies[抗體]（P. Finch, 1997）； Antibodies: A Practical Approach[抗體：實用方法]（D. Catty編輯，IRL Press [IRL出版社], 1988-1989）； Monoclonal Antibodies: A Practical Approach[單株抗體：實用方法]（P. Shepherd和C. Dean編輯，Oxford University Press [牛津大學出版社], 2000）； Using Antibodies: A Laboratory Manual[使用抗體：實驗室手冊]（E. Harlow和D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 1999）； The Antibodies[抗體]（M. Zanetti和J. D. Capra編輯，Harwood Academic Publishers [哈伍德學術出版社], 1995）；和 Cancer: Principles and Practice of Oncology[癌症：腫瘤學原理和實踐]（V.T. DeVita等人編輯，J.B. Lippincott Company [利賓考特公司], 2011）。 定義
如本文所用的「載體」係指包含要在體外或體內遞送到宿主細胞中的核酸的重組質體或病毒。
如本文所用的術語「多核苷酸」或「核酸」係指任何長度的核苷酸（核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸）的聚合形式。因此，該術語包括但不限於單股、雙股或多股DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜種，或包含嘌呤和嘧啶鹼基或其他天然的、經化學或生物化學修飾的、非天然的或衍生化的核苷酸鹼基的聚合物。多核苷酸的主鏈可以包含糖和磷酸基團（如通常可以在RNA或DNA中發現的），或經修飾的或經取代的糖或磷酸基團。替代性地，多核苷酸的主鏈可以包含合成亞基如胺基磷酸酯的聚合物，因此可為寡去氧核苷胺基磷酸酯（P-NH 2）或混合的胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，雙股多核苷酸可以藉由以下方式從化學合成的單股多核苷酸產物獲得：藉由合成互補股並在適當條件下使股退火，或藉由使用DNA聚合酶用適當引物從頭合成互補股。
術語「多肽」和「蛋白質」可互換使用，係指胺基酸殘基的聚合物，並且不限於最小長度。此類胺基酸殘基的聚合物可以含有天然或非天然胺基酸殘基，並且包括但不限於胺基酸殘基的肽、寡肽、二聚物、三聚物和集合體。全長蛋白質及其片段都涵蓋在該定義中。該等術語還包括多肽的表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化等。此外，為了本發明的目的，「多肽」係指包括對天然序列的修飾，諸如缺失、添加和取代（通常在性質上係保守的）的蛋白質，只要該蛋白質維持所期望的活性。該等修飾可為有意的，如藉由定點誘變，或者可為偶然的，諸如藉由產生蛋白質的宿主的突變或由於PCR擴增的錯誤產生。
「重組病毒載體」係指包含一或多個異源序列（即，非病毒來源的核酸序列）的重組多核苷酸載體。在重組AAV載體的情況下，重組核酸的側翼係至少一個，並且在一些實施方式中係兩個反向末端重複序列（inverted terminal repeat sequence，ITR）。
「重組AAV載體（rAAV載體）」係指包含一或多個異源序列（即，非AAV來源的核酸序列）的多核苷酸載體，該等異源序列的側翼係至少一個，並且在一些實施方式中係兩個AAV反向末端重複序列（ITR）。當存在於已被合適的輔助病毒感染（或正在表現合適的輔助功能）並且正在表現AAV rep和cap基因產物（即，AAV Rep和Cap蛋白）的宿主細胞中時，此類rAAV載體可以複製並包裝到感染性病毒顆粒中。當rAAV載體摻入較大的多核苷酸中（例如，染色體中或另一種載體諸如用於選殖或轉染的質體中）時，則rAAV載體可稱為「前載體」，其可以在AAV包裝功能和合適的輔助功能的存在下藉由複製和衣殼化得以「挽救」。rAAV載體可為多種形式中之任一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、封裝在脂質體中以及衣殼化在病毒顆粒，特別是AAV顆粒中。rAAV載體可以包裝到AAV病毒衣殼中以產生「重組腺相關病毒顆粒（rAAV顆粒）」。
「異源」意指源自與它進行比較或將它引入或摻入其中的實體的其餘部分基因型上不同的實體。例如，藉由基因工程技術引入不同細胞類型中的多核苷酸係異源多核苷酸（並且當表現時，可以編碼異源多肽）。類似地，併入病毒載體中的細胞序列（例如，基因或其部分）相對於載體係異源核苷酸序列。
術語「轉基因」係指引入細胞中並且能夠轉錄成RNA並視需要地在適當的條件下翻譯和/或表現的多核苷酸。在一些方面，它賦予其被引入的細胞期望的性質，或以其他方式產生期望的治療或診斷結果。在另一個方面，它可以轉錄成介導RNA干擾的分子，諸如miRNA、siRNA或shRNA。
如關於病毒滴定量使用的術語「基因組顆粒（genome particle，gp）」、「基因組當量」或「基因組複本（genome copy，gc）」係指含有重組AAV DNA基因組的病毒體的數目，而與感染性或功能性無關。特定載體製劑中基因組顆粒的數目可以藉由諸如本文實例中或例如Clark等人(1999) Hum. Gene Ther. [人類基因療法], 10:1031-1039；Veldwijk等人(2002) Mol. Ther. [分子療法], 6:272-278中描述的程序測量。
如本文所用的術語「載體基因組（vector genome，vg）」可以指包含載體（例如，病毒載體）的一組多核苷酸序列的一或多種多核苷酸。載體基因組可以衣殼化在病毒顆粒中。根據特定病毒載體，載體基因組可以包含單股DNA、雙股DNA或單股RNA或雙股RNA。載體基因組可以包括與特定病毒載體相關的內源序列和/或藉由重組技術插入特定病毒載體中之任何異源序列。例如，重組AAV載體基因組可以包括在啟動子、填充序列、目標序列（例如，RNAi）和聚腺苷酸化序列側翼的至少一個ITR序列。完整的載體基因組可以包括載體的一組多核苷酸序列。在一些實施方式中，病毒載體的核酸滴定量可以按照vg/mL測量。適於測量這種滴定量的方法係本領域已知的（例如，定量PCR）。
如本文所用，術語「抑制」可以指阻斷、減少、消除或以其他方式拮抗特定標的的存在或活性的作用。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制基因的表現可以指會導致該基因表現的阻滯、減少、消除或任何其他拮抗的任何作用，包括mRNA豐度的降低（例如，使mRNA轉錄緘默化）、mRNA的降解、mRNA翻譯的抑制等。在一些實施方式中，抑制DMPK的表現可以指DMPK表現的阻滯、減少、消除或任何其他拮抗，包括DMPK mRNA豐度的降低（例如，使DMPK mRNA轉錄緘默化）、DMPK mRNA的降解、DMPK mRNA翻譯的抑制等。例如，抑制細胞中蛋白質的積聚可以指會導致該蛋白質表現的阻滯、減少、消除或其他拮抗的任何作用，包括mRNA豐度的降低（例如，使mRNA轉錄緘默化）、mRNA的降解、mRNA翻譯的抑制、蛋白質的降解等。在一些實施方式中，抑制細胞中DMPK蛋白質的積聚係指細胞中DMPK蛋白質表現的阻滯、減少、消除或其他拮抗，包括DMPK mRNA豐度的降低（例如，使DMPK mRNA轉錄緘默化）、DMPK mRNA的降解、DMPK mRNA翻譯的抑制、DMPK蛋白質的降解等。
如關於病毒滴定量使用的術語「感染單位（infection unit，iu）」、「感染性顆粒」或「複製單位」係指藉由感染中心測定（也稱為複製中心測定），如例如McLaughlin等人(1988) J. Virol. [病毒學雜誌], 62:1963-1973中所述測量的感染性和可複製重組AAV載體顆粒的數目。
如關於病毒滴定量使用的術語「轉導單位（transducing unit，tu）」係指引起功能性轉基因產物產生的感染性重組AAV載體顆粒的數目，如諸如本文實例中或例如Xiao等人(1997) Exp. Neurobiol. [實驗神經生物學], 144:113-124；或Fisher等人(1996) J. Virol.[病毒學雜誌], 70:520-532中描述的功能性測定中所測量的。
「反向末端重複」或「ITR」序列係本領域眾所周知的術語，係指在病毒基因組末端發現的處於相反取向的相對短的序列。
「AAV反向末端重複（ITR）」序列係本領域眾所周知的術語，係存在於天然單股AAV基因組的兩個末端的大約145個核苷酸的序列。ITR最外面的125個核苷酸可以以兩個選擇性取向中之任一取向存在，導致不同AAV基因組之間和單個AAV基因組的兩個末端之間的異質性。最外面的125個核苷酸還含有幾個較短的自身互補區（命名為A區、A'區、B區、B'區、C區、C'區和D區），允許在ITR的該部分內發生股內鹼基配對。
「末端解析序列」（terminal resolution sequence）或「trs」係AAV ITR的D區中在病毒DNA複製期間被AAV rep蛋白切割的序列。突變體末端解析序列係耐AAV rep蛋白切割的。
「AAV輔助功能」係指允許AAV被宿主細胞複製和包裝的功能。AAV輔助功能可以多種形式中之任何形式提供，包括但不限於有助於AAV複製和包裝的輔助病毒或輔助病毒基因。其他AAV輔助功能係本領域已知的，例如基因毒性劑。
AAV的「輔助病毒」係指允許AAV（其係缺陷型微小病毒）被宿主細胞複製和包裝的病毒。輔助病毒提供允許AAV複製的「輔助功能」。已經鑒定了許多此類輔助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒諸如牛痘和桿狀病毒。腺病毒涵蓋許多不同的亞群，但是C亞群的5型腺病毒（Ad5）係最常用的。人、非人哺乳動物和禽類來源的許多腺病毒係已知的並且可從諸如ATCC等保藏機構獲得。也可從諸如ATCC等保藏機構獲得的疱疹家族的病毒包括例如單純疱疹病毒（herpes simplex viruse，HSV）、艾司坦氏-巴爾氏病毒（Epstein-Barr viruses，EBV）、巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和假狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）。用於AAV複製的腺病毒輔助功能的實例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。可從保藏機構獲得的桿狀病毒包括苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）。
如果感染性AAV顆粒與感染性輔助病毒顆粒的比率為至少約102:1、至少約104:1、至少約106:1或至少約108:1或更大，則稱rAAV製劑「基本上不含」輔助病毒。在一些實施方式中，製劑也不含等量的輔助病毒蛋白（即，如果上述輔助病毒顆粒雜質以被破壞的形式存在，則由於此類水準的輔助病毒而存在的蛋白）。病毒和/或細胞蛋白質污染通常可以在SDS凝膠上作為考馬斯染色（Coomassie staining）條帶的存在（例如，除了對應於AAV衣殼蛋白VPl、VP2和VP3的那些以外的條帶的出現）而被觀察到。
關於參考多肽或核酸序列的「百分比（%）序列同一性」被定義為在比對序列並引入空位（如果必要）以獲得最大百分比的序列同一性之後，並且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分時，候選序列中的胺基酸殘基或核苷酸與參考多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的百分比。用於測定胺基酸或核酸序列百分比同一性目的的比對可以本領域技術範圍內的各種方式實現，例如，使用公開可用的電腦軟體程式，例如，在Current Protocols in Molecular Biology [分子生物學實驗操作手冊]（Ausubel等人編輯，1987），增刊30，部分7.7.18，表7.7.1中描述的那些，並且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體。較佳的比對程式係ALIGN Plus（科學教育軟體公司（Scientific and Educational Software），賓夕法尼亞州（Pennsylvania））。熟悉該項技術者可以確定用於測量比對的適當參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。出於本文的目的，給定胺基酸序列A與、和或針對給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性（可以替代性地表述為給定胺基酸序列A與、和或針對給定胺基酸序列B具有或包含一定的%胺基酸序列同一性）計算如下：100乘以分數X/Y，其中X係藉由序列比對程式在程式對A和B的比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，並且其中Y係B中胺基酸殘基的總數。應當理解，在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等時，A與B的%胺基酸序列同一性將和B與A的%胺基酸序列同一性不相等。出於本文的目的，給定核酸序列C與、和或針對給定核酸序列D的%核酸序列同一性（可以替代性地表述為給定核酸序列C與、和或針對給定核酸序列D具有或包含一定的%核酸序列同一性）計算如下：100乘以分數W/Z，其中W係藉由序列比對程式在該程式對C和D的比對中評分為相同匹配的核苷酸的數目，並且其中Z係D中核苷酸的總數。應當理解，在核酸序列C的長度與核酸序列D的長度不相等時，C與D的%核酸序列同一性將和D與C的%核酸序列同一性不相等。
「分離的」分子（例如，核酸或蛋白質）或細胞意指它已經從其天然環境的組分中鑒定並且分離和/或回收。
「有效量」係足以實現有益的或期望的結果，包括臨床結果（例如，症狀的改善、臨床終點的實現等）的量。有效量能以一次或多次投與來投與。就疾病狀態而言，有效量係足以改善、穩定或延遲疾病發展的量。
「個體」或「受試者」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物（例如，奶牛、綿羊、貓、狗和馬）、靈長類（例如，人類和非人靈長類，諸如猴）、兔以及齧齒類（例如，小鼠和大鼠）。在某些實施方式中，個體或受試者係人。
如本文所用，「治療」係用於獲得有益或期望的臨床結果的方法。出於本發明的目的，有益的或期望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度的減小、疾病狀態的穩定（例如，不惡化）、防止疾病的傳播（例如，轉移）、疾病進展的延遲或減緩、疾病狀態的改善或緩和，以及可檢測或不可檢測的緩解（部分或完全）。「治療」還可以意指與不接受治療情況下的預期存活相比延長存活。
如本文所用，術語「預防性治療」係指這樣的治療，其中個體已知或懷疑患有病症或處於患有病症的風險中，但尚未展示出病症的症狀或展示出病症的最小症狀。進行預防性治療的個體可以在症狀發作之前進行治療。
如本文所用，術語「肌強直性營養不良1型」或「DM1」係指影響骨骼肌和平滑肌以及眼、心臟、內分泌系統和中樞神經系統的多系統病症。有三種重疊類別的DM-1（Bird, TD, Myotonic Dystrophy Type 1. [肌強直性營養不良1型] 1999年9月17日[2021年3月25日更新].見於：Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA等人編輯. GeneReviews® [互聯網]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle [西雅圖華盛頓大學]; 1993-2022）。輕度DM1的特徵在於白內障和輕度肌強直，經典DM1的特徵在於肌無力和消瘦、肌強直、白內障、並且常常特徵在於心臟傳導異常。先天性DM1的特徵在於出生時張力減退和嚴重全身無力，常常伴有呼吸功能不全和早期死亡；智力障礙係常見的。
如本文所用，術語「失養性肌強直蛋白激酶」、「DMPK」、「肌強直蛋白-蛋白激酶」、「MT-PK」、「肌強直性營養不良蛋白激酶」或「MDPK」可以指與大多數DM1病例相關的基因或其多肽產物。DMPK基因的3'非翻譯區含有CTG三核苷酸重複序列的5-37個複本。這種不穩定模體擴展到50-1,000個複本導致肌強直性營養不良I型，其嚴重程度隨著重複元件複本數的增加而增加。
如本文所用，「RNAi」可以指在細胞中誘導RNA干擾的任何RNA分子。RNAi的實例包括但不限於小抑制性RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和小髮夾RNA（shRNA）。
「miRNA」可以指含有以下的多核苷酸：(i) 靶向目標基因以藉由RNAi敲落的雙股序列和 (ii) 形成類似於內源miRNA的莖-環結構的附加序列。在一些實施方式中，miRNA包括位於莖-環結構側翼的核酸。該等側翼序列稱為「miRNA支架」。靶向RNAi的目標基因的序列（例如，~20-nt的短序列）可以連接至產生miRNA樣莖-環的序列以及當將多核苷酸組裝成miRNA樣二級結構時與目標序列鹼基配對以形成雙股體的序列。如本文所述，該雙股體可以不完全雜交，例如它可以含有一或多個未配對的或誤配的鹼基。當藉由Dicer切割該多核苷酸時，含有靶向目標基因的序列的該雙股體可以展開並摻入RISC複合物中。miRNA支架可以指miRNA本身或指編碼miRNA的DNA多核苷酸。miRNA支架的實例包括miR-155序列（Lagos-Quintana, M.等人(2002) Curr. Biol. [當代生物學] 12:735-9）和mirGE支架（WO 2014016817A2）。用於將序列選殖到miRNA支架中的市售套組係本領域已知的（例如，來自生命科技公司（Life Technologies）、賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）的Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體套組；麻薩諸塞州沃爾珊（Waltham, MA））。
如本文所用，術語「DMPK介導的剪接缺陷」係指在受DM1影響的組織中發生的選擇性剪接的失調。該等剪接缺陷造成疾病的核心症狀，諸如胰島素抗性、肌強直、肌無力和心律不整。DMPK轉錄物中的CUG重複序列擴增在細胞核中積聚，從而損害參與轉錄、剪接或RNA輸出的蛋白質的生理功能。由於剪接機制的改變，該等聚集導致不同轉錄物的選擇性剪接的失調。在一些實施方式中，已知在DM1中具有剪接失調的基因轉錄物可用於測量用如本文所述之構建體治療的效果。在一些實施方式中，可以測量剪接的挽救。在一些實施方式中，與同等健康組織相比，剪接的挽救可為約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%。在一些實施方式中，所測量的基因轉錄物可為MBNL1、SOS1、PKM、zTTN、GOGLA4和CLASP1中之任何一或多種。剪接可以藉由本領域已知的任何一或多種技術測量，例如RNA定序（RNA-seq）或平臺技術諸如Nanostring平臺。
如本文所用，術語「有義」核酸係包含編碼轉基因的全部或一部分的序列的核酸。在一些實例中，轉基因的mRNA係有義核酸。
如本文所用，「反義」核酸係與「有義」核酸互補的核酸序列。例如，反義核酸可以與編碼轉基因的mRNA互補。
如本文所用，RNAi的「指導區」係通常基於互補性結合目標mRNA的RNAi股。互補區可以涵蓋指導區的全部或一部分。通常，互補區至少包括種子區。在許多情況下，RNAi的反義區係指導區。
如本文所用，在本文中可互換使用的RNAi的「乘客區」或「非指導區」，係RNAi的與指導區互補的區域。在許多情況下，RNAi的有義區係乘客區。
如本文所用，RNAi（例如，miRNA）的「種子區」係微小RNA的長度為約1-8個核苷酸的區域。在一些實例中，種子區及其目標mRNA的3'-UTR可為RNAi識別中的關鍵決定因子。
如本文所用，「脫靶基因緘默化」係指RNAi的種子區與非預期mRNA的3′-UTR中的序列配對並且引導那些轉錄物的翻譯壓制和去穩定（例如，減少非預期mRNA的表現）。
本文中提及的「約」值或參數包括（並且描述）涉及該值或參數本身的實施方式。例如，提及「約X」的描述包括對「X」的描述。
如本文所用，除非另有指示，否則冠詞的單數形式「一」、「一個（一種）」和「該」包括複數引用物。
應理解，本文所述之本發明的方面和實施方式包括「包含方面和實施方式」、「由方面和實施方式組成」和/或「基本上由方面和實施方式組成」。 RNAi
在一些方面，本發明提供了用於治療肌強直性營養不良1型（DM1）的靶向DMPK RNA的改良RNAi。在一些實施方式中，該RNAi係小抑制性RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）或小髮夾RNA（shRNA）。小的抑制性或干擾RNA（siRNA）在本領域中已知為長度大約19-25（例如，19-23）個鹼基對的雙股RNA分子，其在細胞中誘導RNAi。miRNA通常比siRNA小，可以具有多個標的，並且發揮壓制翻譯的功能，降解mRNA和在一些情況下以內切核苷酸的方式切割mRNA的功能。小髮夾RNA（shRNA）在本領域中已知為包含藉由短環（例如，約4-11個核苷酸）連接的雙股RNA的約19-25（例如，19-23）個鹼基對的RNA分子，其在細胞中誘導RNAi。在一些實施方式中，RNAi包含第一股和第二股，其中a) 第一股和第二股形成雙股體；b) 第一股包含指導區，其中該指導區包含核酸序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）；並且c) 第二股包含非指導區。在一些實施方式中，指導區包含核酸序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1），且非指導區包含序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）。
在一些實施方式中，第一股包含指導區，其中該指導區包含與5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列。在一些實施方式中，第一股包含指導區，其中該指導區包含與5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列，但保持至少一個CpG模體。在一些實施方式中，第二股包含非指導區，其中該非指導區包含與5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列。在一些實施方式中，第二股包含非指導區，其中該非指導區包含與5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列，但保持至少一個CpG模體。
在一些實施方式中，RNAi包含SEQ ID NO:7的核酸序列。在一些實施方式中，RNAi包含與SEQ ID NO:7具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列。在一些實施方式中，RNAi包含與SEQ ID NO:7具有超過約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列，但保持至少一個序列（例如，在種子序列中）。
在一些實施方式中，本發明提供了編碼RNAi的核酸，該RNAi包含第一股和第二股，其中a) 第一股和第二股形成雙股體；b) 第一股包含指導區，並且c) 第二股包含非指導區。在一些實施方式中，編碼RNAi的核酸包含SEQ ID NO:4的核酸序列和/或SEQ ID NO:5的核酸。在一些實施方式中，編碼RNAi的核酸包含與SEQ ID NO:4具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列和/或與SEQ ID NO:5具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列。在一些實施方式中，RNAi由SEQ ID NO:8的核酸序列編碼。在一些實施方式中，RNAi由與SEQ ID NO:8具有大於約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列編碼。
微小RNA（miRNA）在本領域中已知為在細胞中誘導RNAi的RNA分子，其包含藉由環連接的雙股RNA的短（例如，19-25個鹼基對）序列並且含有包含一或多個凸起（例如，配對錯誤或未配對的鹼基對）的雙股RNA的一或多個另外的序列。如本文所用，術語「miRNA」涵蓋內源miRNA以及外源或異源miRNA。在一些實施方式中，「miRNA」可以指pri-miRNA或pre-miRNA。在miRNA加工期間，產生pri-miRNA轉錄物。由Drosha-DGCR8藉由以下方式加工pri-miRNA以產生pre-miRNA：切除一或多個序列留下具有5'側翼區、指導股、環區、非指導股和3'側翼區；或5'側翼區、非指導股、環區、指導股和3'側翼區的pre-miRNA。然後將pre-miRNA輸出至細胞質並由Dicer加工以產生具有指導股和非指導（或乘客）股的siRNA。然後RISC複合物使用指導股來催化基因緘默化，例如藉由識別與指導股互補的目標RNA序列。miRNA的進一步描述可以例如在WO 2008/150897中找到。miRNA對目標序列的識別主要藉由標的與miRNA種子序列（例如指導股的核苷酸1至8（5'至3'））之間的配對來確定（參見例如Boudreau, R.L.等人(2013) Nucleic Acids Res.[核酸研究] 41:e9）。
在pri/pre-miRNA結構中，雙股體中指導股:非指導股介面部分地藉由互補鹼基配對（例如，瓦生克立克鹼基配對）形成。然而，在一些實施方式中，該互補鹼基配對不延伸通過整個雙股體。在一些實施方式中，介面中的凸起可存在於一或多個核苷酸位置。如本文所用，術語「凸起」可以指與雙股體中與其相對的核酸非互補的核酸區域。在一些實施方式中，當互補核酸的區域彼此結合，而中心非互補區域的區域不結合時形成凸起。在一些實施方式中，當位於兩個互補區之間的兩條核酸股具有不同長度時形成凸起。如下所述，凸起可以包含1個或多個核苷酸。
在miRNA加工期間，miRNA在鄰近指導股:非指導股介面的切割位點被切割，從而釋放指導股和非指導股的siRNA雙股體。在一些實施方式中，miRNA在鄰近切割位點的有義股或反義股中包含凸起。換言之，在一些實施方式中，miRNA在鄰近種子序列的指導股或非指導股中包含凸起。
在一些實施方式中，miRNA在與成熟非指導股的5'切割位點相對的指導股中包含凸起。在一些實施方式中，miRNA包含與非指導股的5'核苷酸相對的凸起。在一些實施方式中，miRNA在與成熟指導股的3'切割位點相對的有義股中包含凸起。在一些實施方式中，miRNA包含與指導股的3'核苷酸相對的凸起。
基於RNAi的療法的安全性可受到小抑制性RNA（siRNA）與非預期mRNA結合並減少其表現的能力（稱為脫靶基因緘默化的效應）的阻礙。脫靶主要發生在種子區（小RNA的核苷酸2至8）與非預期mRNA的3′-UTR中的序列配對並指導那些轉錄物的翻譯阻遏和去穩定時。減少的脫靶RNAi可以藉由以下方式設計：取代指導序列和非指導序列內的鹼基；例如，藉由產生CpG模體。可以使用SiSPOTR演算法來評價可產生顯著較低的脫靶評分的潛在取代，SiSPOTR演算法係鑒定具有最低脫靶潛力和有效緘默化能力的候選序列的特異性聚焦的siRNA設計演算法（Boudreau等人， Nucleic Acids Res.[核酸研究] 2013年1月；41(1) e9）。降低的SiSPOTR評分預測與親本RNAi分子相比具有較低數目的潛在人類脫靶的序列。在本發明之一些實施方式中，改進RNAi以減少脫靶基因緘默化。
在一些實施方式中，第一股和第二股藉助於能夠形成環結構的RNA（例如，RNA連接子）連接。如本領域通常已知的，當RNA分子包含兩個RNA序列時，形成RNA環結構（例如，莖-環或髮夾），這兩個RNA序列鹼基配對在一起，被未鹼基配對在一起的RNA序列隔開。例如，如果序列A和序列C互補或部分互補使得它們鹼基配對在一起，但序列B中的鹼基不鹼基配對在一起，則可以在RNA分子A-B-C中形成環結構。
在一些實施方式中，能夠形成環結構的RNA包含4至50個核苷酸。在某些實施方式中，能夠形成環結構的RNA包含13個核苷酸。在一些實施方式中，能夠形成環的RNA中的核苷酸數目為4至50個核苷酸或其間的任何整數。在一些實施方式中，環的0至50%可以與環的另一部分互補。如本文所用，術語「環結構」係連接核酸的兩條互補股的序列。在一些實施方式中，環結構的1至3個核苷酸與核酸的互補股相鄰，並且可以與環結構的遠端部分的1至3個核苷酸互補。例如，環結構的5'端的三個核苷酸可以與環結構的3'端的三個核苷酸互補。
在一些實施方式中，編碼本揭露之RNAi的核酸包含異源miRNA支架。在一些實施方式中，使用異源miRNA支架來調節miRNA表現；例如，增加miRNA表現或降低miRNA表現。可以使用本領域已知的任何miRNA支架。在一些實施方式中，miRNA支架源自miR-155支架（參見，例如，Lagos-Quintana, M.等人(2002) Curr. Biol.[當代生物學] 12:735-9和來自生命科技公司、賽默飛世爾科技公司的Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體套組；麻薩諸塞州沃爾珊）或mirGE支架（WO 2014/016817）。 治療肌強直性營養不良 1 型（ DM-1 ）的方法
肌強直性營養不良1型（DM1）係由DMPK基因座（失養性肌強直蛋白激酶）中CTG重複序列（＞ 50）的擴展引起的單基因、體染色體顯性、進行性疾病。具有重複序列的DMPK轉錄成mRNA，該mRNA形成髮夾並結合RNA結合蛋白，使其無法發揮其正常功能。這導致出現核灶、錯誤剪接並且最終導致肌強直。DM1主要影響骨骼肌、心肌和平滑肌，從而引起顯著的身體、認知和行為損害和殘疾。
在一些方面，本發明提供了用於治療哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法和組成物，該等方法包括向該哺乳動物投與本揭露之醫藥組成物（例如，包含本揭露之rAAV顆粒的醫藥組成物）。在一些方面，本發明提供了用於抑制患有DM-1的哺乳動物中DMPK的表現的方法和組成物，該等方法包括向該哺乳動物投與本揭露之醫藥組成物（例如，包含本揭露之rAAV顆粒的醫藥組成物）。在一些方面，本發明提供了用於抑制患有DM1的哺乳動物的細胞中DMPK的積聚的方法和組成物，該等方法包括向該哺乳動物投與本揭露之醫藥組成物（例如，包含本揭露之rAAV顆粒的醫藥組成物）。在一些方面，本發明提供了用於改善DM1症狀的方法和組成物，該等方法包括向哺乳動物的肌腦投與有效量的包含編碼本揭露之RNAi的載體的rAAV顆粒。
在一些方面，本發明提供了用於靶向患有DM1的哺乳動物中的DMPK mRNA的RNAi。在一些實施方式中，RNAi包含第一股和第二股，第一股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）的第一核酸，第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）的第二核酸。本文所述之RNAi（例如，作為rAAV載體的一部分）尤其可用於治療DM1。
在一些實施方式中，該RNAi係小抑制性RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）或小髮夾RNA（shRNA）。小的抑制性或干擾RNA（siRNA）在本領域中已知為長度大約19至25（例如，19至23）個鹼基對的雙股RNA分子，其在細胞中誘導RNAi。miRNA通常比siRNA小，可以具有多個標的，並且發揮壓制翻譯的功能，降解mRNA和在一些情況下以內切核苷酸的方式切割mRNA的功能。小髮夾RNA（shRNA）在本領域中已知為包含藉由短環（例如，約4至11個核苷酸）連接的雙股RNA的大約19至25（例如，19至23）個鹼基對的RNA分子，其在細胞中誘導RNAi。
在一些實施方式中，miRNA包含與SEQ ID NO:1約90%相同的指導序列。在一些實施方式中，miRNA包含與SEQ ID NO:1約90%相同、91%相同、92%相同、93%相同、94%相同、95%相同、96%相同、97%相同、98%相同、99%相同或100%相同中之任一情況的指導序列。
在一些實施方式中，miRNA包含與SEQ ID NO:2約90%相同的非指導序列（乘客股）。在一些實施方式中，miRNA包含與SEQ ID NO:2約90%相同、91%相同、92%相同、93%相同、94%相同、95%相同、96%相同、97%相同、98%相同、99%相同或100%相同中之任一情況的非指導序列。
在一些實施方式中，該第一股和該第二股藉助於能夠形成環結構的RNA連接。如本領域通常已知的，當RNA分子包含兩個RNA序列時，形成RNA環結構（例如，莖-環或髮夾），這兩個RNA序列鹼基配對在一起，被未鹼基配對在一起的RNA序列隔開。例如，如果序列A和序列C互補或部分互補使得它們鹼基配對在一起，但序列B中的鹼基不鹼基配對在一起，則可以在RNA分子A-B-C中形成環結構。
在一些實施方式中，能夠形成環結構的RNA包含4至50個核苷酸。在某些實施方式中，能夠形成環結構的RNA包含13個核苷酸。在某些實施方式中，能夠形成環結構的RNA包含核苷酸序列GUUUUGGCCACUGACUGAC（SEQ ID NO:3）。在一些實施方式中，載體基因組包含與SEQ ID NO:3的序列至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同中之任一情況的核苷酸序列。
在一些方面，本發明提供了包括向哺乳動物（例如，患有DM1的哺乳動物）投與包含第一股和第二股的RNAi的方法，該第一股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）的第二核酸。在一些實施方式中，重組病毒顆粒包含RNAi。在一些實施方式中，重組病毒顆粒係將rAAV載體衣殼化的AAV顆粒，其中該rAAV載體編碼RNAi。
在一些實施方式中，rAAV顆粒的遞送係藉由向哺乳動物全身注射rAAV顆粒。在一些實施方式中，全身注射係靜脈內注射、動脈內注射、肌內注射、腹膜內注射、皮內注射或皮下注射、CSF內和鞘內投與（intrathecal administration，IT）。
在一些方面，本發明提供了用於治療哺乳動物的DM1的方法，該等方法包括向哺乳動物投與本揭露之醫藥組成物。在一些方面，本發明提供了用於抑制患有DM1的哺乳動物的細胞中DMPK的積聚的方法，該等方法包括向哺乳動物投與本揭露之醫藥組成物。在一些方面，本發明提供了用於抑制患有DM1的哺乳動物中DMPK的表現的方法，該等方法包括向哺乳動物投與本揭露之醫藥組成物。在一些實施方式中，DMPK係突變體DMPK（例如，包含大於37個或大於50個CTG重複序列的DMPK）。
在一些實施方式中，本發明提供了藉由投與有效量的包含編碼本揭露之RNAi的rAAV載體的醫藥組成物以阻抑突變體DMPK的活性來治療患有DM1的人的方法。在一些實施方式中，醫藥組成物包含一或多種醫藥上可接受的賦形劑。
在一些實施方式中，該等方法包括投與有效量的包含編碼本揭露之RNAi的rAAV載體的醫藥組成物以阻抑突變體DMPK的活性。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量為至少約5 × 10 12、6 × 10 12、7 × 10 12、8 × 10 12、9 × 10 12、10 × 10 12、11 × 10 12、15 × 10 12、20 × 10 12、25 × 10 12、30 × 10 12或50 × 10 12個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量為約5 × 10 12至6 × 10 12、6 × 10 12至7 × 10 12、7 × 10 12至8 × 10 12、8 × 10 12至9 × 10 12、9 × 10 12至10 × 10 12、10 × 10 12至11 × 10 12、11 × 10 12至15 × 10 12、15 × 10 12至20 × 10 12, 20 × 10 12至25 × 10 12, 25 × 10 12至30 × 10 12、30 × 10 12至50 × 10 12或50 × 10 12至100 × 10 12個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量為約5 × 10 12至10 × 10 12、10 × 10 12至25 × 10 12或25 × 10 12至50 × 10 12個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量為至少約5 × 10 9、6 × 10 9、7 × 10 9、8 × 10 9、9 × 10 9、10 × 10 9、11 × 10 9、15 × 10 9、20 × 10 9、25 × 10 9、30 × 10 9或50 × 10 9個轉導單位/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量為約5 × 10 9至6 × 10 9、6 × 10 9至7 × 10 9、7 × 10 9至8 × 10 9、8 × 10 9至9 × 10 9、9 × 10 9至10 × 10 9、10 × 10 9至11 × 10 9、11 × 10 9至15 × 10 9、15 × 10 9至20 × 10 9、20 × 10 9至25 × 10 9、25 × 10 9至30 × 10 9、30 × 10 9至50 × 10 9或50 × 10 9至100 × 10 9個轉導單位/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量為約5 × 10 9至10 × 10 9、10 × 10 9至15 × 10 9、15 × 10 9至25 × 10 9或25 × 10 9至50 × 10 9個轉導單位/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量至少為約5 × 10 10、6 × 10 10、7 × 10 10、8 × 10 10、9 × 10 10、10 × 10 10、11 × 10 10、15 × 10 10、20 × 10 10、25 × 10 10、30 × 10 10、40 × 10 10或50 × 10 10個感染單位/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量至少為約5 × 10 10至6 × 10 10、6 × 10 10至7 × 10 10、7 × 10 10至8 × 10 10、8 × 10 10至9 × 10 10、9 × 10 10至10 × 10 10、10 × 10 10至11 × 10 10、11 × 10 10至15 × 10 10、15 × 10 10至20 × 10 10、20 × 10 10至25 × 10 10、25 × 10 10至30 × 10 10、30 × 10 10至40 × 10 10、40 × 10 10至50 × 10 10或50 × 10 10至100 × 10 10個感染單位/mL中之任一種。在一些實施方式中，該等rAAV顆粒的病毒滴定量至少為約5 × 10 10至10 × 10 10、10 × 10 10至15 × 10 10、15 × 10 10至25 × 10 10或25 × 10 10至50 × 10 10個感染單位/mL中之任一種。
在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 8至約2 × 10 13個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 8至約5 × 10 8、約5 × 10 8至約10 × 10 8、約10 × 10 8至約20 × 10 8、約20 × 10 8至約30 × 10 8、約30 × 10 8至約40 × 10 8、約40 × 10 8至約50 × 10 8或約50 × 10 8至約100 × 10 8個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 9至約5 × 10 9、約5 × 10 9至約10 × 10 9、約10 × 10 9至約20 × 10 9、約20 × 10 9至約30 × 10 9、約30 × 10 9至約40 × 10 9、約40 × 10 9至約50 × 10 9或約50 × 10 9至約100 × 10 9個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 10至約5 × 10 10、約5 × 10 10至約10 × 10 10、約10 × 10 10至約20 × 10 10、約20 × 10 10至約30 × 10 10、約30 × 10 10至約40 × 10 10、約40 × 10 10至約50 × 10 10或約50 × 10 10至約100 × 10 10個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 11至約5 × 10 11、約5 × 10 11至約10 × 10 11、約10 × 10 11至約20 × 10 11、約20 × 10 11至約30 × 10 11、約30 × 10 11至約40 × 10 11、約40 × 10 11至約50 × 10 11或約50 × 10 11至約100 × 10 11個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 12至約5 × 10 12、約5 × 10 12至約10 × 10 12、約10 × 10 12至約20 × 10 12、約20 × 10 12至約30 × 10 12、約30 × 10 12至約40 × 10 12、約40 × 10 12至約50 × 10 12或約50 × 10 12至約100 × 10 12個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 13至約2 × 10 13個基因組複本/mL中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 8、約5 × 10 8、約1 × 10 9、約5 × 10 9、約1 × 10 10、約5 × 10 10、約1 × 10 11、約5 × 10 11、約1 × 10 12、約5 × 10 12、約1 × 10 13或約2 × 10 13個基因組複本/mL。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約5 × 10 12個基因組複本/mL。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約1 × 10 13個基因組複本/mL。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量濃度為約2 × 10 13個基因組複本/mL。
在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量為至少約1 × 10 8至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量介於約1 × 10 8至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重中之任一者之間。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量介於約1 × 10 8至約1 × 10 14、5 × 10 8至約1 × 10 14、1 × 10 9至約1 × 10 14、5 × 10 9至約1 × 10 14、1 × 10 10至約1 × 10 14、5 × 10 10至約1 × 10 14、1 × 10 11至約1 × 10 14、5 × 10 11至約1 × 10 14、1 × 10 12至約1 × 10 14、5 × 10 12至約1 × 10 14、1 × 10 13至約1 × 10 14、5 × 10 13至約1 × 10 14、1 × 10 8至約5 × 10 13、5 × 10 8至約5 × 10 13、1 × 10 9至約5 × 10 13、5 × 10 9至約5 × 10 13、1 × 10 10至約5 × 10 13、5 × 10 10至約5 × 10 13、1 × 10 11至約5 × 10 13、5 × 10 11至約5 × 10 13、1 × 10 12至約5 × 10 13、5 × 10 12至約5 × 10 13、1 × 10 13至約5 × 10 13、1 × 10 8至約1 × 10 13、5 × 10 8至約1 × 10 13、1 × 10 9至約1 × 10 13、5 × 10 9至約1 × 10 13、1 × 10 10至約1 × 10 13、5 × 10 10至約1 × 10 13、1 × 10 11至約1 × 10 13、5 × 10 11至約1 × 10 13、1 × 10 12至約1 × 10 13、5 × 10 12至約1 × 10 13、1 × 10 8至約5 × 10 12、5 × 10 8至約5 × 10 12、1 × 10 9至約5 × 10 12、5 × 10 9至約5 × 10 12、1 × 10 10至約5 × 10 12、5 × 10 10至約5 × 10 12、1 × 10 11至約5 × 10 12、5 × 10 11至約5 × 10 12、1 × 10 12至約5 × 10 12、1 × 10 8至約1 × 10 12、5 × 10 8至約1 × 10 12、1 × 10 9至約1 × 10 12、5 × 10 9至約1 × 10 12、1 × 10 10至約1 × 10 12、5 × 10 10至約1 × 10 12、1 × 10 11至約1 × 10 12、5 × 10 11至約1 × 10 12、1 × 10 8至約5 × 10 11、5 × 10 8至約5 × 10 11、1 × 10 9至約5 × 10 11、5 × 10 9至約5 × 10 11、1 × 10 10至約5 × 10 11、5 × 10 10至約5 × 10 11、1 × 10 11至約5 × 10 11、1 × 10 8至約1 × 10 11、5 × 10 8至約1 × 10 11、1 × 10 9至約1 × 10 11、5 × 10 9至約1 × 10 11、1 × 10 10至約1 × 10 11、5 × 10 10至約1 × 10 11、1 × 10 8至約5 × 10 10、5 × 10 8至約5 × 10 10、1 × 10 9至約5 × 10 10、5 × 10 9至約5 × 10 10、1 × 10 10至約5 × 10 10、1 × 10 8至約1 × 10 10、5 × 10 8至約1 × 10 10、1 × 10 9至約1 × 10 10、5 × 10 9至約1 × 10 10、1 × 10 8至約5 × 10 9、5 × 10 8至約5 × 10 9、1 × 10 9至約5 × 10 9、1 × 10 8至約1 × 10 9、5 × 10 8至約1 × 10 9或1 × 10 8至約5 × 10 8gc/kg體重中之任一者之間。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量為約1 × 10 9、約5 × 10 9、約1 × 10 10、約5 × 10 10、約1 × 10 11、約5 × 10 11、約1 × 10 12、約5 × 10 12、約1 × 10 13、約5 × 10 13、約1 × 10 14或約2 × 10 14個基因組複本/kg體重。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量為約5 × 10 13個基因組複本/kg體重。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量為約1 × 10 14個基因組複本/kg體重。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的劑量為約2 × 10 14個基因組複本/kg體重。
在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的總量為至少約1 × 10 9至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重中之任一種。在一些實施方式中，投與給個體的rAAV顆粒的總量為約1 × 10 9至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重中之任一種。在本發明之一些實施方式中，注射至紋狀體的組成物的體積大於約10 µl、25 µl、50 µl、75 µl、100 µl、200 µl、300 µl、400 µl、500 µl、600 µl、700 µl、800 µl、900 µl、1 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL、75 mL或100 mL中之任一種或其間的任何量。
本發明的組成物（例如，包含編碼本揭露之RNAi的載體的rAAV顆粒）可以單獨使用或與一或多種用於治療DM1的另外的治療劑組合使用。依次投與之間的間隔可為至少（或替代性地，少於）幾分鐘、幾小時或幾天。
在一些實施方式中，用於治療DM1的RNAi與免疫抑制劑組合投與；例如，以阻抑對RNAi的免疫響應。在一些實施方式中，在投與RNAi之前投與免疫抑制劑。在一些實施方式中，在投與RNAi的同時投與免疫抑制劑。在一些實施方式中，在投與RNAi之後投與免疫抑制劑。在一些實施方式中，免疫抑制劑以在投與RNAi之前、期間或之後的任何組合投與。
在一些實施方式中，用於治療DM1的rAAV顆粒與免疫抑制劑組合投與；例如，以阻抑對rAAV顆粒和/或rAAV顆粒的轉基因產物的免疫響應。在一些實施方式中，在投與rAAV顆粒之前投與免疫抑制劑。在一些實施方式中，在投與rAAV顆粒的同時投與免疫抑制劑。在一些實施方式中，在投與rAAV顆粒之後投與免疫抑制劑。在一些實施方式中，免疫抑制劑以在投與rAAV顆粒之前、期間或之後的任何組合投與。
在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之RNAi在製造用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的藥物中之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之RNAi在製造用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現的藥物中之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之RNAi在製造用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的藥物中之用途。
在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之RNAi治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之RNAi用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之RNAi用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚之用途。
在一些實施方式中，本發明提供了用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的本文所述之RNAi。在一些實施方式中，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現的任何本文所述之RNAi。在一些實施方式中，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的任何本文所述之RNAi。
在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）在製造用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的藥物中之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）在製造用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現的藥物中之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）在製造用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的藥物中之用途。
在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚之用途。
在一些實施方式中，本發明提供了用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）。在一些實施方式中，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）。在一些實施方式中，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的任何本文所述之病毒顆粒（例如，AAV顆粒）。
在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之組成物在製造用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的藥物中之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之組成物在製造用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現的藥物中之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之組成物在製造用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的藥物中之用途。
在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之組成物用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之組成物用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現之用途。在一些實施方式中，本發明提供了有效量的任何本文所述之組成物用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚之用途。
在一些實施方式中，本發明提供了用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的本文所述之組成物。在一些實施方式中，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）的表現的任何本文所述之組成物。在一些實施方式中，本發明提供了用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的任何本文所述之組成物。 RNAi 表現構建體和載體
本發明提供了用於表現本文所述之RNAi的表現構建體、載體和rAAV顆粒。
在一些實施方式中，編碼本揭露之RNAi的核酸包含異源miRNA支架。在一些實施方式中，使用異源miRNA支架來調節miRNA表現；例如，增加miRNA表現或降低miRNA表現。可以使用本領域已知的任何miRNA支架。在一些實施方式中，miRNA支架源自miR-155支架（參見，例如，Lagos-Quintana, M.等人(2002) Curr. Biol. [當代生物學] 12:735-9和來自生命科技公司、賽默飛世爾科技公司的Invitrogen™ BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體套組；麻薩諸塞州沃爾珊）或mirGE支架（WO 2014/016817）。在一些實施方式中，編碼本揭露之RNAi的核酸包含miRNA支架。在一些實施方式中，miRNA支架由SEQ ID NO:11提供。在一些實施方式中，miRNA支架包含與SEQ ID NO:11的核酸序列具有大於80%、85%、90%、95%或99%同一性的核酸。
在一些實施方式中，RNAi靶向編碼與DM1相關的多肽（例如，突變體DMPK）的RNA。不希望受理論束縛，認為RNAi可以用於減少或消除其功能獲得已經與DM1相關的多肽（例如，突變體DMPK）的表現和/或活性。
在一些實施方式中，轉基因（例如，編碼本揭露之RNAi）與啟動子可操作地連接。示例性的啟動子包括但不限於巨細胞病毒（CMV）立即早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1（phosphoglycerate kinase-1，PGK）啟動子、猿猴病毒40（SV40）啟動子和CK6啟動子、轉甲狀腺素蛋白啟動子（transthyretin promoter，TTR）、TK啟動子、四環素反應性啟動子（tetracycline responsive promoter，TRE）、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝特異性啟動子（LSP）、E2F啟動子、端粒酶（hTERT）啟動子；巨細胞病毒強化子/雞β-肌動蛋白/兔β-球蛋白啟動子（CAG啟動子；Niwa等人， Gene[基因], 1991, 108(2):193-9）和延伸因子1-α啟動子（EFl-α）啟動子（Kim等人， Gene[基因], 1990, 91(2):217-23和Guo等人， Gene Ther.[基因療法], 1996, 3(9):802-10）。在一些實施方式中，啟動子包括人類β-葡萄糖醛酸酶啟動子或與雞β-肌動蛋白（CBA）啟動子連接的巨細胞病毒強化子。啟動子可為組成型啟動子、誘導型啟動子或抑制型啟動子。
誘導型啟動子允許調控基因表現並且可以受外源供給的化合物、環境因素（諸如溫度）或特定生理狀態的存在調控，特定生理狀態例如急性期、細胞的特定分化狀態，或僅在複製細胞中。受外源供給啟動子調控的誘導型啟動子的實例包括鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白（metallothionine，MT）啟動子、地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）啟動子、T7聚合酶啟動子系統（WO 98/10088）；蛻皮激素昆蟲啟動子（No等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊], 93:3346-3351 (1996)）、四環素阻遏型系統（Gossen等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊], 89:5547-5551 (1992)）、四環素誘導型系統（Gossen等人， Science[科學], 268:1766-1769 (1995)，還參見Harvey等人， Curr. Opin. Chem. Biol. [化學生物學的當前觀點], 2:512-518 (1998)）、RU486誘導型系統（Wang等人， Nat. Biotech. [自然生物技術], 15:239-243 (1997)和Wang等人， Gene Ther. [基因療法], 4:432-441 (1997)）和雷帕黴素誘導型系統（Magari等人， J. Clin. Invest. [臨床研究雜誌], 100:2865-2872 (1997)）。在該上下文中可用的其他類型的誘導型啟動子係受特定生理狀態調控的啟動子，特定生理狀態例如溫度、急性期、細胞的特定分化狀態，或僅在複製細胞中。
在一些實施方式中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況下，組織特異性調節序列結合以組織特異性方式誘導轉錄的組織特異性轉錄因子。此類組織特異性調節序列（例如，啟動子、強化子等）係本領域眾所周知的。在一些實施方式中，該啟動子係肌肉特異性啟動子。在一些實施方式中，該啟動子係結蛋白啟動子。在一些實施方式中，該啟動子係人類結蛋白啟動子（例如，人類結蛋白基因的-228至+75；例如，SEQ ID NO:23）。在一些實施方式中，該啟動子係經修飾的結蛋白啟動子。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含對於肌細胞中的高水準表現很重要的結蛋白啟動子元件（Li和Paulin等人1991. Journal of Biol Chem.[生物化學雜誌]）。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含至少一個複本的Byrne結蛋白強化子（例如，SEQ ID NO:21）。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含至少一個複本的Paulin結蛋白強化子（-973至-693）（例如，SEQ ID NO:22）。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一個複本的Byrne結蛋白強化子和一個複本的Paulin結蛋白強化子（-973至-693）。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一個複本的Byrne結蛋白強化子和一個複本的Paulin結蛋白強化子（-973至-693）以及人類結蛋白基因的啟動子（-228至+75）。
在一些方面，本發明提供了表現盒（例如，和用於在肌細胞中表現轉基因（例如，治療性轉基因）的表現盒），其中該表現盒包含經修飾的結蛋白啟動子，其中該結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的強化子元件和一或多個包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含與SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含與SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含與SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件，和一或多個包含與SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件。
在一些實施方式中，包含經修飾的結蛋白啟動子的表現盒進一步包含內含子。在一些實施方式中，該內含子係兔β-球蛋白內含子。在一些實施方式中，該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。在一些實施方式中，該內含子包含與SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼轉基因（例如，治療性轉基因）的核酸嵌入該內含子中。在一些實施方式中，該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於該編碼轉基因的核酸的5'並且該3'臂位於該編碼轉基因的核酸的3'。在一些實施方式中，該內含子的5'臂包含具有SEQ ID NO:14的序列的核酸。在一些實施方式中，該內含子的5'臂包含具有與SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的序列的核酸。在一些實施方式中，該內含子的3'臂包含具有SEQ ID NO:15的序列的核酸。在一些實施方式中，該內含子的3'臂包含具有與SEQ ID NO:15的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的序列的核酸。在一些實施方式中，該內含子的5'臂包含具有SEQ ID NO:14的序列的核酸，並且該內含子的3'臂包含具有SEQ ID NO:15的序列的核酸。在一些實施方式中，該內含子的5'臂包含具有與SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的序列的核酸，並且該內含子的3'臂包含具有與SEQ ID NO:15的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的序列的核酸。
在一些實施方式中，包含經修飾的結蛋白啟動子的表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。在一些實施方式中，該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。在一些實施方式中，該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息。在一些實施方式中，該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含具有SEQ ID NO:16的序列的核酸。在一些實施方式中，該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含具有與SEQ ID NO:16的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的序列的核酸。
在一些實施方式中，本發明提供了包含經修飾的結蛋白啟動子用於在肌細胞中表現轉基因（例如，治療性轉基因）的表現盒。在一些實施方式中，該轉基因編碼多肽（例如，治療性多肽）。在一些實施方式中，該轉基因編碼核酸（例如，治療性核酸）。在一些實施方式中，該轉基因編碼RNAi。在一些實施方式中，該轉基因編碼siRNA、shRNA或miRNA。
在一些方面，本發明提供了經修飾的結蛋白啟動子，其中該結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。在一些實施方式中，該結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列的強化子元件和一或多個包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含與SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含與SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件。在一些實施方式中，結蛋白啟動子包含一或多個包含與SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件，和一或多個包含與SEQ ID NO:22的核苷酸序列具有至少約80%、85%、90%、95%或99%同一性中之任一種的核苷酸序列的強化子元件。
在一些方面，本發明提供了包含重組自身互補基因組（例如，自身互補rAAV載體）的rAAV顆粒。具有自身互補載體基因組的AAV病毒顆粒和使用自身互補AAV基因組的方法描述於美國專利第6,596,535號、第7,125,717號、第7,465,583號、第7,785,888號、第7,790,154號、第7,846,729號、第8,093,054號和第8,361,457號；以及Wang Z.等人, (2003) Gene Ther[基因療法] 10:2105-2111，每個參考文獻藉由援引以其全文併入本文。包含自身互補基因組的rAAV依靠其部分互補序列（例如，異源核酸的互補編碼股和非編碼股）將快速形成雙股DNA分子。在一些實施方式中，載體包含編碼異源核酸的第一核酸序列和編碼該核酸的互補序列的第二核酸序列，其中第一核酸序列可沿其大部分或全部長度與第二核酸序列形成股內鹼基對。
在一些實施方式中，編碼RNAi的第一異源核酸序列和編碼RNAi的互補序列的第二異源核酸序列藉由突變的ITR（例如，右側ITR）連接。在一些實施方式中，ITR包含多核苷酸序列5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA-3（SEQ ID NO:27）。突變的ITR包含含有末端解析序列的D區的缺失。因此，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因組，並且因此，按5'至3'順序包含以下項的重組病毒基因組將包裝在病毒衣殼中：AAV ITR，包含調節序列的第一異源多核苷酸序列，突變的AAV ITR，與第一異源多核苷酸處於相反取向的第二異源多核苷酸，和第三AAV ITR。 rAAV 顆粒和產生 rAAV 顆粒的方法
本發明提供了包含如本文揭露的RNAi的rAAV顆粒。在一些實施方式中，本發明提供了使用重組病毒顆粒遞送RNAi以治療DM1的方法。在一些實施方式中，rAAV顆粒包含編碼本揭露之RNAi的序列，該序列的側翼係一或兩個ITR。將核酸衣殼化在AAV顆粒中。AAV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些實施方式中，核酸包含在轉錄方向上操作性連接的組分的目標編碼序列（例如，編碼本揭露之RNAi的核酸）、控制序列（包括轉錄起始序列和終止序列），由此形成表現盒。該表現盒在5'端和3'端側翼係至少一個功能性AAV ITR序列。「功能AAV ITR序列」意指ITR序列的功能如同預期用於AAV病毒體的挽救、複製和包裝。參見 Davidson等人, PNAS[美國國家科學院院刊], 2000, 97(7)3428-32；Passini等人, J. Virol. [病毒學雜誌], 2003, 77(12):7034-40；和Pechan等人, Gene Ther.[基因療法], 2009, 16:10-16，該等文獻全部藉由援引以其全文併入本文。為了實踐本發明之一些方面，重組載體至少包含衣殼化所必需的所有AAV序列和供rAAV感染的物理結構。用於本發明載體的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列（例如，如Kotin, Hum. Gene Ther. [人類基因療法], 1994, 5:793-801中所述），並且可以藉由核苷酸的插入、缺失或取代而改變，或者AAV ITR可以源自幾種AAV血清型中之任一種。當前已知超過40種血清型的AAV，並且繼續鑒定新的血清型和現有血清型的變體。參見Gao等人， PNAS[美國國家科學院院刊], 2002, 99(18): 11854-6；Gao等人， PNAS[美國國家科學院院刊], 2003, 100(10):6081-6；及Bossis等人， J. Virol. [病毒學雜誌], 2003, 77(12):6799-810。任何AAV血清型的使用都被認為在本發明的範圍內。在一些實施方式中，rAAV載體係源自AAV血清型的載體，包括但不限於AAV ITR係AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVrh74、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣殼血清型ITR等。在一些實施方式中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAVrh74、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV的ITR或小鼠AAV衣殼血清型ITR等。在一些實施方式中，AAV中的核酸進一步編碼如本文所述之RNAi。例如，AAV中的核酸可以包含本文考慮的任何AAV血清型的至少一個ITR，並且可以進一步編碼包含一條包含指導區的股和另一條包含非指導區的股的RNAi。在一個實施方式中，AAV中的核酸可以包含任何AAV血清型的至少一個ITR並且可以進一步編碼包含第一股和第二股的RNAi，該第一股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或與SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或與SEQ ID NO:2具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第二核酸。
在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）、啟動子、編碼如本文揭露的RNAi的核酸、聚腺苷酸化訊息和AAV ITR（例如，AAV2 ITR）。在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）、啟動子、編碼RNAi的核酸、聚腺苷酸化訊息和AAV ITR（例如，AAV2 ITR），該RNAi包含第一股和第二股，該第一股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或與SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或與SEQ ID NO:2具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第二核酸。在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）、結蛋白啟動子、編碼如本文揭露的RNAi的核酸、聚腺苷酸化訊息（例如，牛生長激素polyA）和AAV ITR（例如，AAV2 ITR）。在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）的全部或功能部分、結蛋白啟動子、內含子（例如，嵌合內含子）、編碼RNAi的核酸、聚腺苷酸化訊息（例如，牛生長激素polyA）和AAV ITR（例如，AAV2 ITR），該RNAi包含第一股和第二股，該第一股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或與SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或與SEQ ID NO:2具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第二核酸。在一些實施方式中，第一股和第二股形成雙股體。在一些實施方式中，第一股藉由連接子與第二股連接。在一些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO:3的核酸序列或與SEQ ID NO:3具有80%、85%、90%或95%同一性的序列。
在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）的全部或功能部分、填充序列（例如，人類α1-抗胰蛋白酶（alpha-1-antitrypsin，AAT）填充序列的全部或一部分）、結蛋白啟動子、內含子（例如，兔β-球蛋白內含子）的5’臂、編碼RNAi的核酸、內含子（例如，兔β-球蛋白內含子）的3’臂、聚腺苷酸化訊息（例如，牛生長激素polyA）、填充序列（例如，人類α1-抗胰蛋白酶（AAT）填充序列的全部或一部分）和AAV ITR（例如，AAV2 ITR），該RNAi包含第一股和第二股，該第一股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或與SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或與SEQ ID NO:2具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第二核酸。
在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）、結蛋白啟動子、編碼RNAi的核酸、聚腺苷酸化訊息（例如，牛生長激素polyA）和AAV ITR（例如，AAV2 ITR），該RNAi包含第一股和第二股，該第一股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或與SEQ ID NO:2具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:1）或與SEQ ID NO:1具有80%、85%、90%或95%同一性的序列的第二核酸。在一些實施方式中，第一股和第二股形成雙股體。在一些實施方式中，第一股藉由連接子與第二股連接。在一些實施方式中，連接子包含SEQ ID NO:6的核酸序列。
在一些實施方式中，AAV中的核酸從5'至3'包含編碼以下的核酸：ITR（例如，AAV2 ITR）的全部或功能部分、填充序列（例如，人類α1-抗胰蛋白酶（AAT）填充序列的全部或一部分）、結蛋白啟動子、內含子（例如，兔β-球蛋白內含子）的5’臂、編碼RNAi的核酸、內含子（例如，兔β-球蛋白內含子）的3’臂、聚腺苷酸化訊息（例如，牛生長激素polyA）、填充序列（例如，人類α1-抗胰蛋白酶（AAT）填充序列的全部或一部分）和AAV ITR（例如，AAV2 ITR），該RNAi包含第一股和第二股，該第一股包含含有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）的第一核酸，該第二股包含含有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）的第二核酸。
在一些實施方式中，載體可包括（一或多種）填充核酸。在一些實施方式中，該填充核酸可以包含編碼報告多肽的序列。如熟悉該項技術者將理解的，填充核酸可以位於載體內的多個區域中，並且可以由載體內的連續序列（例如，單個位置中的單個填充核酸）或多個序列（例如，多於一個位置（例如，2個位置、3個位置等）中的多於一個填充核酸）組成。在一些實施方式中，填充核酸可以位於RNAi序列的下游。在實施方式中，填充核酸可以位於RNAi序列的上游（例如，在啟動子和編碼RNAi的核酸之間）。熟悉該項技術者還將理解，多種核酸可以用作填充核酸。在一些實施方式中，填充核酸包含人類α1-抗胰蛋白酶（AAT）填充序列或C16 P1染色體16 P1殖株（人類C16）填充序列的全部或一部分。在一些實施方式中，填充序列包含基因的全部或一部分。例如，填充序列包含人AAT序列的一部分。熟悉該項技術者將認識到，基因的不同部分（例如，人AAT序列）可以用作填充片段。例如，填充片段可以來自基因的5'端、基因的3'端、基因的中間、基因的非編碼部分（例如，內含子）、基因的編碼區（例如，外顯子），或基因的非編碼部分和編碼部分的混合。熟悉該項技術者還將認識到填充序列的全部或一部分可以用作填充序列。在一些實施方式中，載體包含含有SEQ ID NO:18的核苷酸序列或與SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有大於約80%、85%、90%、95%或99%同一性的核苷酸序列的5'填充序列。在一些實施方式中，載體包含含有SEQ ID NO:19的核苷酸序列或與SEQ ID NO:19的核苷酸序列具有大於約80%、85%、90%、95%或99%同一性的核苷酸序列的3'填充序列。在一些實施方式中，載體包含含有SEQ ID NO:18的核苷酸序列或與SEQ ID NO:18的核苷酸序列具有大於約80%、85%、90%、95%或99%同一性的核苷酸序列的5'填充序列並且包含含有SEQ ID NO:19的核苷酸序列或與SEQ ID NO:19的核苷酸序列具有大於約80%、85%、90%、95%或99%同一性的核苷酸序列的3'填充序列。
在進一步的實施方式中，rAAV顆粒包含衣殼蛋白，該衣殼蛋白包含AAVrh74或其變體的衣殼蛋白。在一些實施方式中，AAVrh74衣殼係變體衣殼。在一些實施方式中，AAVrh74變體衣殼蛋白保持形成AAV衣殼的能力。在一些實施方式中，AAVrh74變體衣殼與野生型AAVrh74衣殼蛋白至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少100%相同。在一些實施方式中，AAVrh74變體衣殼在胺基酸位置N502處包含取代。在一些實施方式中，胺基酸位置N502處的取代係異白胺酸（I）。在一些實施方式中，AAVrh74變體衣殼蛋白在胺基酸位置W505處包含取代。在一些實施方式中，胺基酸位置W505處的取代係精胺酸（R）。
不同的AAV血清型用於最佳化特定目標細胞的轉導或靶向特定靶組織（例如，患病組織，例如肌肉組織）內的特定細胞類型。rAAV顆粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些實施方式中，rAAV顆粒可以包含AAVrh74衣殼蛋白或其變體和不同AAV血清型的至少一個ITR。在一些實施方式中，rAAV顆粒可包含AAVrh74衣殼蛋白或其變體和至少一個AAV2 ITR。在一些實施方式中，rAAV顆粒包含AAVrh74N502I衣殼蛋白和至少一個AAV2 ITR。在一些實施方式中，rAAV顆粒包含AAVrhW505R衣殼蛋白和至少一個AAV2 ITR。
在一些方面，本發明提供了包含重組自身互補基因組的病毒顆粒。具有自身互補基因組的rAAV顆粒和使用自身互補AAV基因組的方法描述於美國專利第6,596,535號、第7,125,717號、第7,465,583號、第7,785,888號、第7,790,154號、第7,846,729號、第8,093,054號和第8,361,457號；以及Wang Z.等人, (2003) Gene Ther[基因療法] 10:2105-2111，每個參考文獻藉由援引以其全文併入本文。包含自身互補基因組的rAAV依靠其部分互補序列（例如，轉基因的互補編碼股和非編碼股）將快速形成雙股DNA分子。在一些實施方式中，本發明提供了包含AAV基因組的rAAV顆粒，其中該rAAV基因組包含第一異源多核苷酸序列（例如，本揭露之RNAi）和第二異源多核苷酸序列（例如，本揭露之RNAi的反義股），其中該第一異源多核苷酸序列可沿其大部分或全部長度與該第二多核苷酸序列形成股內鹼基對。在一些實施方式中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列藉由促進股內鹼基配對的序列（例如，髮夾DNA結構）連接。髮夾結構係本領域已知的，例如在miRNA或siRNA分子中。在一些實施方式中，第一異源多核苷酸序列和第二異源多核苷酸序列藉由突變的ITR（例如，右側ITR）連接。在一些實施方式中，ITR包含多核苷酸序列5'-CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA-3（SEQ ID NO:27）。突變的ITR包含含有末端解析序列的D區的缺失。因此，在複製AAV病毒基因組時，rep蛋白將不會在突變的ITR處切割病毒基因組，並且因此，按5'至3'順序包含以下項的重組病毒基因組將包裝在病毒衣殼中：AAV ITR，包含調節序列的第一異源多核苷酸序列，突變的AAV ITR，與第一異源多核苷酸處於相反取向的第二異源多核苷酸，和第三AAV ITR。在一些實施方式中，本發明提供了包含重組病毒基因組的AAV病毒顆粒，該重組病毒基因組包含：功能性AAV2 ITR，編碼本揭露之RNAi的第一多核苷酸序列，包含D區缺失而缺乏功能性末端解析序列的突變型AAV2 ITR，包含第一多核苷酸序列的編碼本揭露之RNAi的序列的互補序列的第二多核苷酸序列和功能性AAV2 ITR。
可以使用本領域已知的方法產生rAAV顆粒。參見例如，美國專利第6,566,118號；第6,989,264號；和第6,995,006號。在實踐本發明時，用於產生rAAV顆粒的宿主細胞包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、微生物和酵母。宿主細胞也可為其中AAV rep和cap基因在宿主細胞中穩定維持的包裝細胞或其中AAV載體基因組穩定維持的生產細胞。示例性的包裝細胞和生產細胞源自293細胞、A549細胞或HeLa細胞。使用本領域已知的標準技術純化和配製AAV載體。
本領域已知的用於產生rAAV載體的方法包括但不限於轉染、穩定細胞系生產和感染性雜合病毒生產系統，該等系統包括腺病毒-AAV雜合物、疱疹病毒-AAV雜合物（Conway, JE等人，(1997) J. Virology[病毒學雜誌] 71(11):8780-8789）和桿狀病毒-AAV雜合物。用於產生rAAV病毒顆粒的rAAV生產培養全部需要；1) 在桿狀病毒生產系統的情況下，合適的宿主細胞，包括例如人來源的細胞系諸如HeLa細胞、A549細胞或293細胞，或昆蟲來源的細胞系諸如SF-9；2) 由野生型或突變體腺病毒（諸如溫度敏感型腺病毒）、疱疹病毒、桿狀病毒或提供輔助功能的質體構建體提供的合適的輔助病毒功能；3) AAV rep和cap基因和基因產物；4) 側翼係至少一個AAV ITR序列的核酸（諸如治療性核酸）；和5) 支持rAAV產生的合適的培養基和培養基組分。在一些實施方式中，AAV rep和cap基因產物可以來自任何AAV血清型。一般而言，但不是必須的，AAV rep基因產物與rAAV載體基因組的ITR具有相同的血清型，只要rep基因產物可以起到複製和包裝rAAV基因組的作用即可。本領域已知的合適培養基可用於產生rAAV載體。該等培養基包括但不限於由Hyclone實驗室（Hyclone Laboratories）和JRH生產的培養基，包括改良的伊格爾培養基（Modified Eagle Medium，MEM）、杜爾貝科改良的伊格爾培養基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM），客製化配製物諸如美國專利第6,566,118號中描述的那些定製配製物，和如美國專利第6,723,551號中描述的Sf-900 II SFM培養基，其各自藉由援引以其全文併入本文，特別是關於用於產生重組AAV載體的定製培養基配製物。在一些實施方式中，AAV輔助功能由腺病毒或HSV提供。在一些實施方式中，AAV輔助功能由桿狀病毒提供，並且宿主細胞係昆蟲細胞（例如，草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）（Sf9）細胞）。
在一些實施方式中，rAAV顆粒可以藉由三重轉染方法，諸如下文提供的示例性三重轉染方法產生。易言之，可以將含有rep基因和衣殼基因的質體與輔助腺病毒質體一起轉染（例如，使用磷酸鈣方法）到細胞系（例如，HEK-293細胞）中，並且可以收集和視需要地純化病毒。因此，在一些實施方式中，藉由將編碼rAAV載體的核酸、編碼AAV rep和cap的核酸和編碼AAV輔助病毒功能的核酸三重轉染到宿主細胞中來產生rAAV顆粒，其中將核酸轉染到宿主細胞中產生能夠產生rAAV顆粒的宿主細胞。
在一些實施方式中，rAAV顆粒可藉由生產細胞系方法，諸如下文提供的示例性生產細胞系方法產生（還參見Martin等人，(2013) Human Gene Therapy Methods[人類基因治療方法] 24:253-269中的參考文獻）。易言之，可以用含有rep基因、衣殼基因和啟動子異源核酸序列的質體穩定轉染細胞系（例如，HeLa細胞系）。可以篩選細胞系以選擇用於rAAV產生的前導殖株，然後可以將前導殖株擴增到生產生物反應器中並用腺病毒（例如，野生型腺病毒）作為輔助物感染以活化rAAV產生。隨後可以收穫病毒，可以滅活（例如，藉由加熱）和/或去除腺病毒，並且可以純化rAAV顆粒。因此，在一些實施方式中，rAAV顆粒由包含以下中之一或多種的生產細胞系產生：編碼rAAV載體的核酸，編碼AAV rep和cap的核酸，和編碼AAV輔助病毒功能的核酸。
在一些方面，提供了用於產生如本文揭露的任何rAAV顆粒的方法，該方法包括 (a) 在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含 (i) 一或多個AAV包裝基因，其中每個所述AAV包裝基因均編碼AAV複製和/或衣殼化蛋白；(ii) rAAV原載體，其包含編碼如本文所述之本揭露之RNAi的核酸，該核酸的側翼係至少一個AAV ITR，和 (iii) AAV輔助功能；以及 (b) 回收由該宿主細胞產生的rAAV顆粒。在一些實施方式中，RNAi包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在一些實施方式中，所述至少一個AAV ITR選自由以下AAV ITR組成之群組：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAVrh74、AAVrh74 N502I、AAVrh74 W505R、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣殼血清型ITR等。在一些實施方式中，所述衣殼化蛋白選自由AAVrh74或其變體，諸如AAVrh74 N502I或AAVrh74 W505R組成之群組。在一些實施方式中，衣殼化蛋白係AAVrh74蛋白。在一些實施方式中，衣殼化蛋白係AAVrh74蛋白的變體。在一些實施方式中，衣殼化蛋白係AAVrh74N502I蛋白。在一些實施方式中，衣殼化蛋白係AAVrh74W505R蛋白。在一些實施方式中，變體AAVrh74衣殼蛋白保持形成AAV衣殼的能力。在一些實施方式中，rAAV顆粒包含AAVrh74 N502I衣殼及包含AAV2 ITR和編碼本揭露之RNAi的核酸的重組基因組。在一些實施方式中，rAAV顆粒包含AAVrh74 W505R衣殼及包含AAV2 ITR和編碼本揭露之RNAi的核酸的重組基因組。在另一個實施方式中，純化rAAV顆粒。如本文所用的術語「純化」包括不含至少一些其他組分的rAAV顆粒的製劑，該等其他組分也可存在於rAAV顆粒天然存在或最初製備的地方。因此，例如，分離的rAAV顆粒可以使用純化技術使其從來源混合物諸如培養裂解物或生產培養上清液中增濃來製備。增濃可以以多種方式測量，例如藉由溶液中存在的DNA酶抗性顆粒（DRP）或基因組複本（gc）的比例，或藉由感染性，或者可以相對於來源混合物中存在的第二種潛在干擾物質對增濃進行測量，該第二種潛在干擾物質諸如為污染物，包括生產培養物污染物或過程中污染物，包括輔助病毒、培養基組分等。
本文還提供了包含rAAV顆粒和醫藥上可接受的載劑的醫藥組成物，該rAAV顆粒包含編碼本揭露之RNAi的轉基因。該等醫藥組成物可適合本文所述之任何投與模式。包含編碼本揭露之RNAi的核酸的rAAV顆粒的醫藥組成物可以全身引入。例如，可以靜脈內、動脈內、皮下或腹膜內投與包含編碼本揭露之RNAi的核酸的重組病毒顆粒。
在一些實施方式中，包含重組病毒顆粒和醫藥上可接受的載劑的醫藥組成物適合投與於人，該重組病毒顆粒包含編碼本文所述之本揭露之RNAi的轉基因。此類載劑係本領域眾所周知的（參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences [雷明頓製藥科學]，第15版，第1035-1038和1570-1580頁）。在一些實施方式中，包含本文所述之rAAV和醫藥上可接受的載劑的醫藥組成物適於全身注射到哺乳動物中。
此類醫藥上可接受的載劑可為無菌液體，諸如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油等。鹽水溶液及右旋糖、聚乙二醇（PEG）和甘油水溶液也可以用作液體載劑，特別是對於注射液而言。醫藥組成物可以進一步包含另外的成分，例如防腐劑、緩衝液、張力劑、抗氧化劑和穩定劑、非離子潤濕劑或澄清劑、增黏劑等。本文所述之醫藥組成物可以單一單位劑量或以多劑量形式包裝。該等組成物通常配製為無菌和基本上等滲的溶液。 製品和套組
還提供了在本文所述之方法中使用的套組或製品。在各方面中，套組在合適的包裝中包含本文所述之組成物（例如，包含編碼本揭露之RNAi的核酸的本揭露之rAAV顆粒）。本文所述之組成物的合適包裝係本領域已知的，並且包括例如小瓶（諸如密封小瓶）、容器、安瓿、瓶、罐、柔性包裝（例如，密封的Mylar或塑膠袋）等。該等製品可以進一步滅菌和/或密封。
本發明還提供了包含本文所述之組成物的套組，並且可以進一步包含關於使用該組成物的方法，諸如本文所述之用途的說明書。本文所述之套組可以進一步包含從商業和使用者角度來看合乎需要的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器以及含進行本文所述之任何方法的說明書的包裝插頁。例如，在一些實施方式中，該套組包含：包含編碼本揭露之RNAi的轉基因以將有效量的rAAV顆粒遞送至哺乳動物的重組病毒顆粒、適於注射到哺乳動物中的醫藥上可接受的載劑的組成物和以下的一或多種：緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器以及含進行向哺乳動物的注射的說明書的包裝插頁。在一些實施方式中，該套組包含用本文所述之rAAV顆粒治療DM-1的說明書。在一些實施方式中，該套組包含根據本文所述方法中之任一種使用本文所述rAAV顆粒的說明書。 示例性實施方式
本發明包括以下列舉的示例性實施方式。 1.  一種重組腺相關病毒（rAAV）顆粒，該rAAV顆粒包含： a) 包含第一股和第二股的RNAi，其中 i) 該第一股和該第二股形成雙股體； ii) 該第一股包含指導區，其中該指導區包含具有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）或具有與SEQ ID NO:1的序列具有約90%同一性的序列的核酸；並且 iii) 該第二股包含非指導區；以及 b) 包含與野生型AAVrh74衣殼具有約90%同一性的胺基酸序列的AAV衣殼。
2.     如實施方式1所述之rAAV顆粒，其中該非指導區包含具有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）或具有與SEQ ID NO:2的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
3.     如實施方式1或2所述之rAAV顆粒，其中該第一股包含具有SEQ ID NO:1的序列的核酸，並且該非指導區包含具有SEQ ID NO:2的序列的核酸。
4.     如實施方式1至3中任一項所述之rAAV顆粒，其中該第一股和該第二股藉助於能夠形成環結構的RNA連接子連接。
5.     如實施方式4所述之rAAV顆粒，其中該RNA連接子包含約4至約50個核苷酸。
6.     如實施方式4或5所述之rAAV顆粒，其中該環結構包含約4至約20個核苷酸。
7.     如實施方式4至6中任一項所述之rAAV顆粒，其中該環結構包含具有SEQ ID NO:3的序列或具有與SEQ ID NO:3的序列具有約90%同一性的序列的核酸序列。
8.     如實施方式4至7中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi從5'至3'包含該第二股、該RNA連接子和該第一股。
9.     如實施方式4至7中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi從5'至3'包含該第一股、該RNA連接子和該第二股。
10.   如實施方式1至8中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi包含具有SEQ ID NO:7的序列或具有與SEQ ID NO:7的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
11.   如實施方式1至10中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi係小抑制性RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）或小髮夾RNA（shRNA）。
12.   如實施方式1至11中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi進一步包含支架。
13.   如實施方式12所述之rAAV顆粒，其中該支架包含SEQ ID No: 11的核酸的全部或一部分。
14.   如實施方式13所述之rAAV顆粒，其中該miRNA嵌入該支架內。
15.   如實施方式14所述之rAAV顆粒，其中該支架具有5'臂和3'臂，其中該5'臂位於編碼該RNAi的核酸的5'，其中該3'臂位於編碼該RNAi的核酸的3'。
16.   如實施方式12至15中任一項所述之rAAV顆粒，其中該支架係miR-155支架。
17.   如實施方式12至16中任一項所述之rAAV顆粒，其中該miR-155支架包含位於該RNAi的5'的具有SEQ ID NO:9的序列或與SEQ ID NO:9的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
18.   如實施方式12至17中任一項所述之rAAV顆粒，其中該miR-155支架包含位於該RNAi的3'的具有SEQ ID NO:10的序列或與SEQ ID NO:10的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
19.   如實施方式1至18中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi靶向編碼與肌強直性營養不良1型（DM1）相關的多肽的RNA。
20.   如實施方式19所述之rAAV顆粒，其中該多肽係失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）。
21.   如實施方式20所述之rAAV顆粒，其中該DMPK包含與DM 1相關的突變。
22.   如實施方式20或21所述之rAAV顆粒，其中編碼DMPK的基因包含5個或更多個CTG三核苷酸重複序列。
23.   一種表現盒，該表現盒包含編碼如實施方式1至22中任一項所述之RNAi的核酸序列。
24.   如實施方式23所述之表現盒，其中編碼該RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。
25.   如實施方式24所述之表現盒，其中該啟動子係肌肉特異性啟動子。
26.   如實施方式24或25所述之表現盒，其中該啟動子係結蛋白啟動子或其變體。
27.   如實施方式26所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。
28.   如實施方式26或27所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。
29.   如實施方式26至28中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。
30.   如實施方式26至29中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含：包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或與SEQ ID NO:21的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或與SEQ ID NO:22的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件。
31.   如實施方式26至30中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或與SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有約90%同一性的序列。
32.   如實施方式23至31中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含內含子。
33.   如實施方式32所述之表現盒，其中該內含子係兔β-球蛋白內含子。
34.   如實施方式32或33所述之表現盒，其中該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或與SEQ ID NO:13的序列具有約90%同一性的序列。
35.   如實施方式32至34中任一項所述之表現盒，其中編碼該RNAi的核酸嵌入該內含子中。
36.   如實施方式35所述之表現盒，其中該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於編碼該RNAi的核酸的5'並且該3'臂位於編碼該RNAi的核酸的3'。
37.   如實施方式36所述之表現盒，其中該內含子的5’臂包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或與SEQ ID NO:14的序列具有約90%同一性的序列。
38.   如實施方式36或37所述之表現盒，其中該內含子的3’臂包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或與SEQ ID NO:15的序列具有約90%同一性的序列。
39.   如實施方式23至38中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。
40.   如實施方式39所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
41.   如實施方式40所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息。
42.   如實施方式39至41中任一項所述之表現盒，其中該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或與SEQ ID NO:16的序列具有約90%同一性的序列。
43.   如實施方式23至42中任一項所述之表現盒，其中該表現盒包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或與SEQ ID NO:17的序列具有約90%同一性的序列。
44.   一種表現盒，其中該表現盒包含經修飾的結蛋白啟動子，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。
45.   如實施方式44所述之表現盒，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。
46.   如實施方式44或45所述之表現盒，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。
47.   如實施方式44至46中任一項所述之表現盒，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含：包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或與SEQ ID NO:21的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或與SEQ ID NO:22的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件。
48.   如實施方式44至47中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或與SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有約90%同一性的序列。
49.   如實施方式44至48中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含內含子。
50.   如實施方式49所述之表現盒，其中該內含子係兔β-球蛋白內含子。
51.   如實施方式49或50所述之表現盒，其中該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或與SEQ ID NO:13的序列具有約90%同一性的序列。
52.   如實施方式44至51中任一項所述之表現盒，其中該編碼轉基因的核酸嵌入該內含子中。
53.   如實施方式52所述之表現盒，其中該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於該編碼轉基因的核酸的5'並且該3'臂位於該編碼轉基因的核酸的3'。
54.   如實施方式53所述之表現盒，其中該內含子的5’臂包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或與SEQ ID NO:14的序列具有約90%同一性的序列。
55.   如實施方式53或54所述之表現盒，其中該內含子的3’臂包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或與SEQ ID NO:15的序列具有約90%同一性的序列。
56.   如實施方式44至55中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。
57.   如實施方式56所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
58.   如實施方式57所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息。
59.   如實施方式56至58中任一項所述之表現盒，其中該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或與SEQ ID NO:16的序列具有約90%同一性的序列。
60.   如實施方式44至59中任一項所述之表現盒，其中該轉基因編碼多肽或核酸。
61.   如實施方式44至60中任一項所述之表現盒，其中該轉基因編碼RNAi。
62.   一種載體，該載體包含如實施方式23至61中任一項所述之表現盒。
63.   如實施方式62所述之載體，其中該表現盒的側翼係一或多個填充核酸序列。
64.   如實施方式63所述之載體，其中該一或多個填充核酸序列源自人類SerpinA1基因。
65.   如實施方式63或64所述之載體，其中位於該表現盒5'的填充核酸序列源自該人類SerpinA1基因。
66.   如實施方式63至65中任一項所述之載體，其中位於該表現盒5'的填充序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或與SEQ ID NO:18的序列具有約90%同一性的序列。
67.   如實施方式63至66中任一項所述之載體，其中位於該表現盒3'的填充核酸序列源自該人類SerpinA1基因。
68.   如實施方式63至67中任一項所述之載體，其中位於該表現盒3'的填充序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或與SEQ ID NO:19的序列具有約90%同一性的序列。
69.   如實施方式62至68中任一項所述之載體，其中該載體係重組腺相關病毒（rAAV）載體。
70.   如實施方式69所述之rAAV載體，其中該表現盒的側翼係一或多個AAV反向末端重複（ITR）序列。
71.   如實施方式70所述之rAAV載體，其中該表現盒的側翼係兩個AAV ITR。
72.   如實施方式70或71所述之rAAV載體，其中該等AAV ITR係AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
73.   如實施方式70至72中任一項所述之rAAV載體，其中該等AAV ITR係AAV2 ITR。
74.   如實施方式69至73中任一項所述之rAAV載體，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或與SEQ ID NO:20的序列具有約90%同一性的序列。
75.   如實施方式69至74中任一項所述之rAAV載體，其中該載體係自身互補的rAAV載體。
76.   一種細胞，該細胞包含如實施方式23至61中任一項所述之表現盒、如實施方式62至68中任一項所述之載體、或如實施方式69至75中任一項所述之rAAV載體。
77.   如實施方式1至22中任一項所述之rAAV顆粒，其中該AAV衣殼包含在位置502處包含胺基酸取代的胺基酸序列。
78.   如實施方式77所述之rAAV顆粒，其中位置502處的胺基酸取代係異白胺酸（I）。
79.   如實施方式77或78所述之rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含AAVrh74 N502I血清型衣殼。
80.   如實施方式77或78所述之rAAV顆粒，其中該ITR係AAV2 ITR並且該rAAV顆粒的衣殼係AAVrh74 N502I血清型衣殼。
81.   如實施方式1至22中任一項所述之rAAV顆粒，其中該AAV衣殼包含在位置505處包含胺基酸取代的胺基酸序列。
82.   如實施方式81所述之rAAV顆粒，其中位置505處的胺基酸取代係精胺酸（R）。
83.   如實施方式1至22中任一項所述之rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含AAVrh74 W505R血清型衣殼。
84.如實施方式83所述之rAAV顆粒，其中該ITR係AAV2 ITR並且該rAAV顆粒的衣殼係AAVrh74 W505R血清型衣殼。
85.   一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼係AAVrh74 N502I衣殼。
86.   一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼係AAVrh74 N502I衣殼。
87.如實施方式85或86所述之rAAV顆粒，其中該AAVrh74 N502I衣殼包含含有SEQ ID NO:50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
88.   一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼係AAVrh74 W505R衣殼。
89.   一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼係AAVrh74 W505R衣殼。
90.   如實施方式88或89所述之rAAV顆粒，其中該AAVrh74 W505R衣殼包含含有SEQ ID NO:52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
91.   一種組成物，該組成物包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
92.   一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
93.   如實施方式91或92所述之組成物，其中該組成物進一步包含醫藥上可接受的載劑。
94.   一種套組，該套組包含如實施方式1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
95.   一種套組，該套組包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
96.   一種套組，該套組包含如實施方式91至93中任一項所述之組成物。
97.   如實施方式94至96中任一項所述之套組，該套組進一步包含使用說明書。
98.   一種用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如實施方式1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
99.   一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如實施方式1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
100. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如實施方式1至22和77至90中任一項所述之RNAi。
101. 一種用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
102. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
103. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
104. 如實施方式100至104中任一項所述之方法，其中該病毒顆粒或rAAV顆粒的有效量係約1 × 10 8至約2 × 10 13個基因組複本/mL的劑量。
105. 如實施方式104所述之方法，其中該劑量為約5 × 10 12個基因組複本/mL。
106. 如實施方式104所述之方法，其中該劑量為約1 × 10 13個基因組複本/mL。
107. 如實施方式104所述之方法，其中該劑量為約2 × 10 13個基因組複本/mL。
108. 如實施方式101至103中任一項所述之方法，其中該病毒顆粒或rAAV顆粒的有效量係約1 × 10 8至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重的劑量。
109. 如實施方式108所述之方法，其中該劑量為約5 × 10 13個基因組複本/kg體重。
110. 如實施方式108所述之方法，其中該劑量為約1 × 10 14個基因組複本/kg體重。
111. 如實施方式108所述之方法，其中該劑量為約2 × 10 14個基因組複本/kg體重。
112. 一種用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如實施方式91至93中任一項所述之組成物。
113. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如實施方式91至93中任一項所述之組成物。
114. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如實施方式91至93中任一項所述之組成物。
115. 如實施方式98至100中任一項所述之方法，其中該RNAi與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該RNAi投與之前、同時和/或之後投與。
116. 如實施方式101至103中任一項所述之方法，其中該病毒顆粒或該rAAV顆粒與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該病毒顆粒或該rAAV顆粒投與之前、同時和/或之後投與。
117. 如實施方式112至114中任一項所述之方法，其中該組成物與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該組成物投與之前、同時和/或之後投與。 實例
藉由參考以下實例將更好地理解當前揭露的主題，該等實例係作為本發明的示例提供的，而不是以限制的方式提供的。 實例 1 ： amiR-DMPK 204 表現盒的產生
合理設計了一系列9個轉錄啟動子（S1至S9），目的係鑒定在肌肉中具有高而在肝臟中具有低活性的候選物。在原代人成肌細胞和Huh7肝癌細胞中篩選一組啟動子以分別代表肌肉和肝臟。將新設計的啟動子與泛在CAG啟動子和一組先前公開的在肌細胞中具有高活性的啟動子序列進行比較：包含四個肌肉特異性轉錄因子結合位點（transcription factor binding site，TFBS）和雞骨骼肌α-肌動蛋白基因的核心啟動子片段的合成MH啟動子，設計為靶向心肌並組合的嵌合MHCK7啟動子；α-MCK強化子和MCK啟動子加上來自小鼠α-肌凝蛋白重鏈的強化子；和sk-CRM4/Des，一種組合骨骼肌特異性順式調控模組、結蛋白啟動子和MVM內含子的合成啟動子。為了篩選，用含有受目標啟動子控制的螢光素酶基因的質體轉染細胞。48小時後，測量成肌細胞（ 圖 16A）和Huh7細胞（ 圖 16B）中的相對螢光素酶活性。與所有其他新設計的啟動子相比，除了驅動全身高表現的CAG啟動子以外，S6啟動子驅動在肌細胞中的最高表現。S6啟動子在肝臟中的表現相對較低。因此，選擇S6啟動子用於AAV表現構建體。
產生了編碼設計用於靶向DMPK基因的微小RNA（amiR-DMPK 204）的單股AAV病毒載體（ 圖 1A）。構建體被設計成使得amiR-DMPK 204微小RNA嵌入最佳化的微小RNA骨架miR155（BLOCK-iT；賽默飛世爾目錄號K4935-00、K4936-00、K4937-00、K4938-00）中且下文稱為「miR155 amiR-DMPK 204」或「amiR155-DMPK 204」。miR155 amiR-DMPK 204的側翼係兔β-球蛋白內含子序列並且置於雜合肌肉啟動子（nDes；「S6」啟動子）的調控下。
藉由常規寡核苷酸合成（美國金斯瑞（Genscript, USA））合成包含Byrne結蛋白強化子、一個複本的Paulin結蛋白強化子（-973至-693）、和人類結蛋白基因的啟動子（-228至+75）的nDesmin啟動子。
將牛生長激素聚腺苷酸化序列置於側接內含子的amiR-DMPK 204微小RNA（minBGHpA）的3'。包括填補序列（「填充序列」）。整個基因盒的側翼係野生型AAV血清型2反向末端重複（ITR）序列，用於DNA挽救和複製，以及包裝到AAV衣殼中。將序列工程改造到ITR質體中，將該質體用於產生進行體內功效研究的載體。 5' 和 3' ITR 序列
ITR序列係145 bp的AAV2野生型序列。3' ITR（表現盒的下游）處於Flip取向（GenBank：LQ493091.1）。5' ITR（表現盒的上游）處於Flop取向（145 bp）（Miller等人，2004， Nature Genetics[自然遺傳學] 36.7 (2004): 767-773）。藉由Sanger定序確認序列的準確性。 nDes 啟動子
使用文獻中示出的結蛋白啟動子元件構建nDes啟動子（Li和Paulin等人，1991, J Biol Chem. [生物化學雜誌] 266.10: 6562-6570）。nDes啟動子包含一個複本的Byrne結蛋白強化子、一個複本的Paulin結蛋白強化子（-973至-693）、和人類結蛋白基因的啟動子（-228至+75）。 兔 β - 球蛋白內含子的 5' 臂和 3' 臂
該內含子用於側接amiR-DMPK 204盒，因為已知miRNA的內含子表現會增強標的敲落。 具有 miR155 支架的 amiR-DMPK 204 （ miR155-amiRDMPK 204 ）
內源miRNA係在許多初級RNA轉錄物（pri-miRNA）中發現的髮夾樣二級結構。在核中，微處理器Drosha/DGCR8複合物結合並切割pri-miRNA的基底莖以釋放莖-環先質miRNA（pre-miRNA）。然後將pre-miRNA從核中輸出，在核中環被Dicer/TRBP切割以形成成熟的RNA雙股體。指導股，也稱為靶向股，與乘客股分開並負載到RNA誘導的緘默化複合物（RNA induced silencing complex，RISC）中的argonaute蛋白上，然後靶向互補mRNA轉錄物進行降解或翻譯壓制。
將amiR-DMPK 204序列鑒定為DM1治療的標的。amiR-DMPK 204的目標序列位於DMPK核苷酸序列的3' UTR內的「CUG」重複序列的上游。因此，amiR-DMPK 204可阻抑野生型和突變體DMPK轉錄物兩者。
另外，amiR-DMPK 204靶區在非人靈長類（NHP-石蟹獼猴）和人類中係保守的，從而允許在NHP中進行DMPK敲落的臨床前評估（ 圖 11）。評價amiR-DMPK 204微小RNA，並且顯示miR155支架具有有效的指導股加工和最小限度的乘客股加工，降低了脫靶效應的可能性（參見以下實例2）。
選擇用於開發的最終構建體係具有miR155支架的amiR-DMPK 204（amiR155-DMPK 204），其中當經過加工時，指導股靶向DMPK mRNA進行降解。經工程改造的pre-miRNA序列結構基於鼠miR-155序列（Lagos-Quintana等人, 2002, Current Biology[當代生物學], 12:9, 735-739）。將源自miR-155轉錄物的5'和3'側翼區插入載體中以盡可能地保留miR-155結構。最佳化莖-環結構，並且2個核苷酸的內環導致比在天然miR-155分子中發現的5個核苷酸/3個核苷酸的內環更高的敲落率（來源：BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體，英傑公司（Invitrogen））。經證實載體nDes-miR155-amiR-DMPK 204，在AAV衣殼的背景下，在DM1的DMSXL小鼠模型中具有有效的體內活性（參見以下實例4）。 minBGH polyA
將186 bp的最小BGH polyA位點插入amiR-DMPK 204序列的下游以允許mRNA的轉錄終止和聚腺苷酸化。 來自 A1AT 內含子的填充序列
使用來自α-1抗胰蛋白酶基因內含子序列4的填充序列使基因盒達到rAAV載體的包裝限度。 具有 nDes-miR155-amiR-DMPK 204 盒的 ITR 質體（ nDes-miR155-amiR-DMPK 204 ）的選殖
設計表現構建體nDes-miR155-amiR-DMPK204-minBGHpolyA盒的1938 bp ITR-ITR序列。將nDes-miR155- amiR-DMPK 204-minBGHpolyA盒選殖到ITR質體中。合成的nDes-miR155-amiR-DMPK204-minBGHpolyA包括用於選殖到ITR質體中的5' Nco1位點和3' Sph1位點（ 圖 1B）。易言之，用NcoI和SphI消化含有合成的nDes-miR155- amiR-DMPK2 04-minBGHpolyA序列的質體，並凝膠純化1.9 kB片段。將ITR質體用NcoI和SphI消化，使用牛小腸鹼性磷酸酶去磷酸化（新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs）；目錄號M0290）並凝膠純化8.2 kB載體骨架片段。連接含有表現盒的經過消化的1.9 kB片段和經過消化的ITR質體以產生質體ITR-nDes-miR155-amiR-DMPK 204。 小規模 rAAV 載體生產
在HEK 293細胞中進行小規模包裝測定，以確認ITR-nDes-miR155-amiR-DMPK 204質體的包裝。使用AAV rep/cap質體進行小規模生產。 圖 1C示出與標準EGFP質體基因盒相比，每個HEK 293細胞產生的載體的量。
為了確定amiR-DMPK 204校正DM1表現型的潛力，測試了在來自DM1患者的骨骼肌成肌細胞培養物中使人DMPK轉錄物緘默化和校正剪接缺陷的能力。由於DMPK基因的3' UTR中的CTG擴增，DMPK mRNA髮夾結構聚集為不溶性核糖核灶並隔絕幾種RNA結合蛋白。所引起的必需剪接因子諸如盲肌樣蛋白1（MBNL1）的再分布導致負責肌肉組織分化的下游效應物的錯誤剪接。用amiR-DMPK 204處理DM1患者細胞導致超過50%的DMPK mRNA緘默化和剪接校正，如藉由MBNL1外顯子7包含所測量的。 實例 2 ： miR155-amiRDMPK 204 的表現在體外校正 DM1 表現型
在兩種DM1體外模型中測試由nDes啟動子驅動的miR155-amiRDMPK 204構建體的表現。用含有在nDes啟動子控制下靶向DMPK的人工miRNA的AAV2載體轉導DM1永生化人類肌管。藉由PCR測量 DMPKamiRNA（ 圖 17A）和 DMPKmRNA（ 圖 17B）。正如所預期的， DMPKamiRNA僅在經處理的細胞中係可檢測的，其中 DMPK水準與未處理的細胞相比降低65%（未處理的 = 1 ± 0.04；經處理的 = 0.34 ± 0.018；平均值±SD；p ＜ 0.0001，雙尾非配對t檢驗）。
DM1的標誌之一係核RNA灶的存在。 DMPKmRNA的3'-UTR中的CUG重複序列的擴增導致mRNA保留在核中，在核中它結合並隔絕重要的RNA結合蛋白，包括盲肌樣蛋白1（muscleblind-like protein 1，MBNL1），從而調控pre-mRNA剪接和mRNA定位。另外，認為突變體 DMPK轉錄物的存在會導致 CELF1（CUG RNA結合蛋白和胚胎致死性異常視覺型RNA結合蛋白3樣因子1）的過度磷酸化和穩定， CELF1也在選擇性剪接和RNA穩定性的調控中起作用。使用螢光原位雜交（fluorescent in situhybridization，FISH），定量經處理和未處理的DM1人類肌管中呈現核灶的細胞的百分比以及灶/核的數目（ 圖 17C- 圖 17D）。用nDes-miR155- amiR-DMPK 204處理使含灶的細胞的百分比降低60%（未處理的= 74.36% ± 9.3；經處理的=15.36%±4.2，平均值±SEM；p = 0.0044，雙尾非配對t檢驗）（ 圖 17E）。另外，當與未處理的細胞相比時，經處理的細胞每個細胞具有顯著更少的灶（未處理的= 1.55 ± 0.08；經處理的= 0.15 ± 0.03，平均值±SEM；p ＜ 0.0001，雙尾非配對t檢驗）（ 圖 17F）。 實例 3 ： miR155 amiR-DMPK 204 的加工
將amiR-DMPK 204包裝到AAV衣殼中，並在體內分析DMPK敲落功效、乘客股活性和加工模式。將帶有nDes-miR155- amiR-DMPK 204的構建體包裝到AAV中。將載體靜脈注射到表現具有＞ 1,000個CTG重複序列的人DMPK的DMSXL成體人源化DM1小鼠模型中。九週後，對動物實施安樂死，收集多個組織以測量DMPK敲落功效，並且選擇心臟組織測量乘客股活性和加工模式。
RT-PCR分析顯示amiR-DMPK 204在多種肌肉組織中穩健表現，在心臟中具有較高表現（ 圖 2B）。伴隨amiR-DMPK 204表現，RT PCR分析確認心臟中穩健的DMPK抑制，在不同骨骼肌中具有平均＞ 70%和約30%的DMPK阻抑（ 圖 2C）。在心臟組織中，相對於TBP（TATA結合蛋白）表現，DMPK表現低於50%。值得注意的是，相對於TBP表現低水準DMPK（約50%，由 圖 2C中的虛線指示）的DSMXL小鼠沒有明顯的DM1表現型。有趣的是，即使在肝臟中觀察到較高的轉導（ 圖 2A），但nDesmin啟動子在心臟組織中顯示出強活性並且在骨骼肌中顯示出相似的水準（ 圖 2B）。這表明表現主要限於受DM1病理影響的心肌和骨骼肌。
為了評估amiR-DMPK 204的加工，藉由用於小總轉錄本分析的NGS分析心臟組織的成熟amiR-DMPK 204長度及指導股和乘客股的序列組成。
amiR-DMPK 204的加工不產生乘客股。在小鼠心肌細胞中amiR-DMPK 204專門加工成指導股（＞ 99%），但常常產生比從miRBase數據庫預測的更長的股（ 表 1）。miR155加工最常產生22至26個核苷酸長的成熟長度，但在5'端精確加工（ 表 1）。映射到miR155 amiR-DMPK 204的不同指導股長度（nt）的序列分布以百分比（%讀段）計算。預期的amiR-DMPK 204指導股加底線，並且種子序列為粗體。星號指示對應於amiR-DMPK 204指導股的預測長度的讀段。 [ 表 1] . 映射到 miR155 amiR-DMPK 204 的不同指導股長度（ nt ）的序列分布以百分比（ % 讀段）計算。預期的amiR-DMPK 204指導股加底線。星號指示對應於amiR-DMPK 204指導股的預測長度的讀段。
miR-155 讀段序列 長度 % 序列 SEQ ID NO
A GTCGAAGACAGTTCTAGGGT GT 23 52 33
A GTCGAAGACAGTTCTAGGGT GTT 24 24 34
A GTCGAAGACAGTTCTAGGGT GTTT 25 11 35
A GTCGAAG ACAGTTCTAGGGT * 22 6 36
A GTCGAAGACAGTTCTAGGGT GTTTT 26 3 37
A GTCGAAGACAGTTCTAGGGT G 22 4 38
綜上所述，用具有miR155的amiR-DMPK 204沒有檢測到乘客股（%指導股＞99%）。因此，選擇miR155作為臨床前研究的先導物，因為miR155 miRNA支架對於RNAi係充分驗證的。 實例 4 ：藉由在轉基因小鼠中全身注射編碼 miR155-amiRDMPK 204 的 AAV 對人 DMPK 的劑量依賴性阻抑
為了確定最有效的劑量，研究了三種單獨劑量的親肌AAV（WO/2019/207132）衣殼的遞送。在劑量遞增研究中評價編碼具有miR155支架的amiR-DMPK 204的表現盒（amiR155-DMPK 204）的AAV。向攜帶含有超過1,000個重複序列的CTG擴增的人 DMPK轉基因的8週齡DMSXL小鼠靜脈內注射5.0 × 10 11個載體基因組（vg）/kg、5 × 10 12vg/kg和1.0 × 10 13vg/kg（對應於低劑量、中劑量和高劑量）。在AAV輸注後8週分析小鼠的臨床症狀，諸如體重、存活率、肌強直和心臟功能。基因轉移後8週對小鼠實施安樂死，並測量DMPK阻抑和剪接校正。藉由小RNA TaqMan測量miR155-amiRDMPK 204表現水準，並將mRNA輸入水準針對u6小核RNA進行標準化。
以劑量依賴性方式觀察到amiR155-DMPK 204的表現（ 圖 3A），並引起多種組織中總DMPK表現的劑量依賴性降低（ 圖 3B）。總之，觀察到約10個amiR155-DMPK 204複本/U6足以使心臟和隔肌中的DMPK降低≥ 50%，該量足以治療DM1患者。
將DMSXL小鼠佇列用單劑量的miR155-DMPK 204以9 × 10 13vg/kg的劑量處理，這引起骨骼肌和心肌中人工miRNA的表現以及心臟、TA、隔肌和腓腸肌中DMPK mRNA的顯著緘默化，但在肝臟中沒有，從而確認了較高劑量下該平臺的肌肉特異性（ 圖 18）。
藉由原位雜交測量經過處理的小鼠的心臟中的核RNA灶。灶常常呈現為大的形成，因此測量陽性細胞中每種形成的線性大小。用miR155-amiRDMPK 204處理使灶的大小顯著減小（未處理的= 7 ± 0.32 μm；經處理的= 2.7 ± 0.08 μm；平均值±SEM；p ＜ 0.0001，單因子ANOVA； 圖 19）。
接下來，研究DMPK阻抑對特徵性DM1表現型諸如剪接異常的後果。為了確定處理是否可以改善小鼠的剪接表現型，收集心臟和脛骨前肌（TA）肌肉，並在野生型、緩衝液陰性對照和經處理的小鼠中進行RNA-Seq分析（Shen等人(2014) Proc Natl Acad Sci[國家科學院院刊] 111(51):E5593-E5601；Park等人(2013) Methods Mol Biol[分子生物學方法] 1038:171-9；Shen等人(2012) Nucleic Acids Res[核酸研究] 40(8):e61）。發現心臟和TA中選擇性剪接事件的整體改變，指示疾病隨處理的分子改變。DMSXL小鼠心臟中改變的基因有Ldb3、Mbnl2和Spag9（ 圖 20）。引起Ldb3轉錄物中包含外顯子11的LIM結構域結合蛋白3（Ldb3）的異常剪接已被證明是由CUG重複RNA隔絕RNA剪接機制引起的DM1-特異性表現型（Yamashita等人2014. Neurobiol Dis. [疾病神經生物學] 69:200-5）。在用中劑量或高劑量的AAV nDes-miR155- amiR-DMPK 204處理的小鼠中觀察到腓腸肌中包含外顯子11的Ldb3轉錄物的顯著減少，確認在用amiR155-DMPK 204處理的肌肉中剪接缺陷得到有效校正（ 圖 4）。先前也已經證實，該等基因的胎兒同種型的持久性促成DM1病理學。在TA中，當比較野生型和DMSXL小鼠時，一組不同但重疊的選擇性剪接事件被改變。其中，以下三個基因在處理組中顯示出顯著的剪接挽救：DNA酶I、Tnnt3和Zbtb49（ 圖 20）。對於該等轉錄物，在心臟以及TA兩者中，野生型和經過處理的DMSXL小鼠之間沒有顯著差異，表明處理後正常剪接恢復。
除了該等分子校正外，然後還根據疾病的生理和功能表現測量了AAV nDes-miR155- amiR-DMPK 204的功效。
為了確定處理是否可以改善存活和減輕體重損失，用三種不同劑量的AAV nDes-miR155- amiR-DMPK 204處理DMSXL小鼠，並監測存活和體重。在用中劑量和高劑量處理8週後觀察到體重和存活率的改善。另一方面，用低劑量或平衡鹽溶液（BSS）對照沒有觀察到改善（ 圖 5A 和圖 5B）。
接下來，根據疾病的功能表現諸如預防肌強直和心臟異常來測量AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204的功效。肌電圖測量揭示用AAV nDes-miR155- amiR-DMPK 204處理的小鼠的肌強直顯著降低（ 表 2）。具體地，處理後，僅7.6%的用中劑量處理的動物具有肌強直。相比之下，對照（用BSS處理的）或低劑量組中＞ 50%的小鼠具有持久性肌強直（評分1）。 [ 表 2] . 用 AAV nDes-miR155- amiR-DMPK 204 處理後具有肌強直的 DMSXL DM1 小鼠的數目。
肌強直放電按4分量表分級：0，無肌強直；1，在少於50%的針插入中偶見肌強直放電；2，在大於50%的針插入中有肌強直放電；3：幾乎每個插入都有肌強直放電。
在處理組（DMSXL小鼠中的野生型、媒介物對照，及DMSXL小鼠中amiR155-DMPK 204的單次靜脈內劑量）中比較0級事件與1-3級事件的數目（ 圖 21）。正如所預期的，所有野生型小鼠在所分析的所有三種肌肉中評分為0。在用媒介物處理的DMSXL小鼠中，在所分析的所有三種肌肉中記錄到的0級事件顯著減少（腓腸肌，0級：WT = 30；DMSXL媒介物= 1；1-3級：WT = 0，DMSXL媒介物= 9；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值＜0.0001；四頭肌，0級：WT = 30；DMSXL媒介物 = 2；1-3級：WT = 0，DMSXL媒介物= 8；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值＜ 0.0001；TA，0級：WT = 30；DMSXL媒介物= 7；1-3級：WT = 0；DMSXL媒介物= 3；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值= 0.036）。然而，與媒介物組相比，兩個劑量的處理都顯著改善了腓腸肌中的肌強直表現型並且在另兩種肌肉中顯示出積極的改善傾向（腓腸肌：DMSXL 9 X1013，0級= 9；1-3級= 3；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值=0.0041；DMSXL 1.8 X1014，0級= 15；1-3級= 6；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值= 0.0041；四頭肌：DMSXL 9 X1013，0級= 9；1-3級= 3；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值= 0.059；DMSXL 1.8 X1014，0級= 13；1-3級= 8；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值= 0.059；TA：DMSXL 9 X1013，0級= 12；1-3級=0；費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值= 0.155；DMSXL 1.8 X1014，0級= 19；1-3級= 2：費舍爾精確檢驗，Bonferroni-Holm調整p值=0.295）。為了確定用含有miR155-DMPK 204構建體的AAV衣殼處理是否可以校正該缺陷，經由EMG測量腓腸肌、四頭肌和TA中肌強直事件的等級。雖然野生型小鼠在所分析的任何肌肉中都沒有表現出肌強直事件，但是大多數DMSXL未處理的小鼠顯示出等級在1和2之間的事件，並且大多數經過處理的小鼠顯示出等級在0和1之間的肌強直（ 圖 21）。
該疾病的另一個臨床標誌係心臟功能缺陷。在高達75%的DM1成年患者中發現傳導缺陷，並且心律不整係導致死亡的主要原因。DMSXL小鼠的心臟功能也在處理後8週使用表面心臟超音波圖連同骨骼肌功能一起監測。與BSS處理的對照相比，AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204改善心輸出量。在處理8週後，在中劑量組（5e12 vg/kg）中注意到心輸出量的顯著改善（ 圖 6）。
DSMXL心臟的心臟超音波圖分析顯示，與其野生型同窩出生仔畜相比，小鼠表現出主動脈狹窄（ 圖 22，p ＜ 0.001，單因素ANOVA）。然而，用9 × 10 13vg/kg amiR-DMPK 204處理顯著增加了主動脈直徑（p ＜ 0.05）。經過處理的DMSXL小鼠與野生型沒有顯著差異（ 圖 22A）。而且，發現DMSXL小鼠與野生型相比具有降低的升主動脈血流速度（心輸出量不足； 圖 22B），（p ＜ 0.0001），並且這種缺陷也經處理得以校正（p ＜ 001）。 實例 5 ： AAVrh74N502I 衣殼改善了肌肉轉導並降低了肝臟轉導
進行實驗以測試含有AAVrh74N502I VP1衣殼蛋白（SEQ ID NO: 50）的AAV衣殼在非人靈長類動物的各種組織中的轉導效率。 圖 7A中示出了實驗的概要。用1 × 10 13vg/kg各自含有eGFP表現盒的AAV9、AAVrh74或AAVrh74N502I衣殼靜脈內處理非人靈長類動物。處理後21天，處死動物，並測量脛骨前肌（TA）、股二頭肌、四頭肌、心臟和肝臟中的eGFP表現水準。
與比較衣殼相比，含有AAVrh74N502I衣殼蛋白的衣殼在非人靈長類動物中具有改善的肌肉轉導（ 圖 7B 至圖 7E）和降低的肝臟轉導（ 圖 7F）。（ 表 3）。 [ 表 3] . 用 AAVrh74N502I 衣殼處理的非人靈長類動物的組織中的 eGFP 水準相對於用 AAV9 和 AAVrh74 衣殼處理的非人靈長類動物增加。
組織 AAV9 AAVrh74
脛骨前肌 +13x +178x
股二頭肌 +303x +56x
四頭肌 NS* +32x
心臟 NS +13x
肝臟 -15x -2x
*NS =不顯著 實例 6 ：對 DMSXL 小鼠模型中 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 靶接合的評價
為了確定最有效的劑量，研究了兩種單獨劑量的AAVrh74N502I衣殼的遞送。在劑量遞增研究中評價編碼具有miR155支架的amiR-DMPK 204的表現盒（miR155- amiR-DMPK 204）的AAV。8週齡DMSXL小鼠靜脈內注射9 × 10 13個載體基因組（vg）/kg和1.8 × 10 14vg/kg（對應於低高劑量和高劑量）。基因轉移後8週對小鼠實施安樂死，並藉由小RNA TaqMan測量DMPK阻抑和amiR-DMPK 204表現水準，並將mRNA輸入水準針對u6小核RNA進行標準化。
以劑量依賴性方式觀察到amiR-DMPK 204的表現（ 圖 8A），並引起多種組織中總DMPK表現的劑量依賴性降低（ 圖 8B）。總之，觀察到約10個amiR-DMPK 204複本/U6足以使心臟和隔肌中的DMPK降低≥ 50%，該量足以治療DM1患者。
最後，經證實前導載體nDes-miR155-amiR-DMPK 204，在親肌衣殼AAVrh74N502I（SEQ ID NO: 50）的背景下，在心肌細胞來源的DM1 iPSC中具有有效的體外活性（ 圖 9）。 實例 7 ：總轉錄本上 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 的評價
為了確定amiR-DMPK 204處理對總轉錄本是否具有任何重大影響，進行全基因組RNA定序（RNA-seq），藉由將CBA miR155- amiR-DMPK 204質體轉染到HEK293細胞系中來比較amiR-DMPK 204處理與CTL3（加擾miRNA）。為了評價觀察到的非 DMPK基因表現變化是否是由於amiR-DMPK 204的脫靶效應引起的，評價了顯著下調的標的中種子互補性的增濃。使用5%的偽發現率（FDR）顯著性閾值，存在4個差異性表現的基因OPN4（12.5倍）、DMPK（1.7倍）、KRTAP21-2（1.7倍）、C8ORF44-SGK3（1.7倍），它們的3′ UTR含有TTCGAC種子互補序列（ 表 4）。對於1% FDR，僅有OPN4（12.5倍）、DMPK（1.7倍）顯示出差異表現（ 圖 10）。正如所預期的， DMPK係受影響最顯著的mRNA水準之一（44%緘默化）。總之，amiR-DMPK 204在HEK293細胞中過表現後觀察到最小的脫靶效應。 [ 表 4]
基因名稱 log2 倍數 204 對比 CTL3 倍數 204 對比 CTL3 P 值 FDR_BH ＜ 0.05 FDR_BH ＜ 0.01
OPN4 -3.64 12.5 2.7746E-17 5E-13 是
DMPK -0.77 1.7 3.4308E-10 2E-06 是
KRTAP21-2 -0.76 1.7 0.0001 0.0103
C8orf44-SGK3 -0.79 1.7 0.0003 0.0191
實例 8 ：探索 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 在非人靈長類動物中的生物分布和活性的劑量範圍發現研究
為了確定AAVrh74MN502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204的生物分布和活性，向石蟹獼猴投與單次靜脈內輸注（IV）劑量。研究持續時間為單次注射後12週。
共有16隻石蟹獼猴（8隻雄性，8隻雌性；24至48月齡）在研究的第1天經由隱靜脈IV給藥一次。劑量示於下面表5中。基於以下劑量水準（vg/kg）將動物分組（每組2隻雄性和2隻雌性）為四個不同的類別：配製緩衝液（第1組）；5 × 10 13vg/kg（第2組）；1 × 10 14vg/kg（第3組）；和2 × 10 14vg/kg（第4組）。12週後，處死動物並收穫組織用於分析。 [ 表 5]
分組 劑量水準 劑量濃度 動物數目
試驗品或對照品 （vg/kg） （vg/mL） 雄性 雌性
1 配製緩衝液 0 0 2 2
2 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 5 × 10 13 5 × 10 12vg/ml 2 2
3 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 1 × 10 14 1 × 10 13vg/ml 2 2
4 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 2 × 10 14 2 × 10 13vg/ml 2 2
機械均質化收穫的組織進行RNA和DNA提取，並用數位PCR（dPCR）分析樣本。
AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204的劑量依賴性生物分布和活性在幾種肌肉和非肌肉組織中得以證明。分析幾種骨骼肌（脛骨前肌（tibialis anterior muscle，TA）；腓腸肌；四頭肌；二頭肌；比目魚肌；伸趾長肌（extensor digitorum longus，EDL）；膈肌）以及心肌和肝臟組織。在測試的所有組織中都發現病毒基因組複本，並且每個組織中複本數/細胞係劑量依賴性方式的（圖12）。amiR-DMPK表現（圖13）和DMPK下調（圖14）在各種肌肉組織、心臟組織和肝臟組織中亦為劑量依賴性方式的。發現DMPK表現的劑量依賴性減少與對照組相比減少高達90%。發現在動物中測試的所有劑量係安全的並且係動物耐受良好的。 實例 9 ：用 amiR-DMPK 204b 處理後對剪接缺陷的挽救   
DMPK介導的剪接缺陷係DM1組織中的分子標誌。為了確定amiR-DMPK 204處理是否對該等剪接缺陷有影響，使用RNA定序（RNA-seq）和Nanostring平臺進行靶向剪接分析，集中於36個基因（Tanner等人2021. Nucleic Acids Res. [核酸研究] 49(4):2240-2254. doi: 10.1093/nar/gkab022）。
兩種平臺之間的數據具有可比性。用AAV2-nDesmin-nDES-miR155-DMPK 204轉導永生化人DM1肌管，並與未處理的DM1肌管和健康對照肌管進行比較。36個基因中的25個基因在處理前顯示出其剪接的統計學顯著改變。與未處理的細胞相比，在經過處理的細胞中25個基因中的6個基因（MBNL1、SOS1、PKM、zTTN、GOLGA4和CLASP1）展示出顯著恢復（ 圖 15）。總之，數據證明用amiR-DMPK 204處理人類肌管能夠至少部分地挽救由DMPK突變引起的剪接缺陷。 實例 10 ：高達 2 × 10 14vg/kg 的 AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204 在非人靈長類動物中耐受良好。
評價來自用AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204處理的動物的組織切片對AAV構建體的耐受性。在活體階段監測研究中的所有動物，包括詳細的籠側觀察、體重、食物消耗和生命徵象測量。
未注意到與試驗品相關的宏觀觀察結果。在投與1 × 10 14vg/kg的一隻雄性和投與2 × 10 14vg/kg的一隻雌性的肝臟中觀察到與試驗品相關的最低限度個體肝細胞壞死（ 表 6）。在投與單劑量≥ 1 × 10 14的動物中減低較小的試驗品相關的臨床化學效應，其特徵在於最低程度至輕度增加的天冬胺酸胺基轉移酶（AST）、丙胺酸胺基轉移酶（ALT）和麩胺酸脫氫酶活性（GDH）（ 表 7）。僅在早期時間點觀察到酶增加，到第43天完全逆轉到基線值，並且在受影響的動物中缺乏相關的微觀肝臟發現，除了在投與2 × 10 14vg/kg的一隻雌性中發現最低限度個體肝細胞壞死以外。在投與5 × 10 13vg/kg的動物中沒有鑒定出肝臟影響的證據。在任何劑量水準均未鑒定出對血液學或凝血參數的試驗品相關的影響。基於一般較小的變化幅度、最小的嚴重程度和發生率和/或缺乏劑量相關性，認為該等變化不是不利的。 [ 表 6]. 在投與 amiR-DMPK 204 的動物中試驗品相關微觀發現的發生率和嚴重程度。
rAAVmiR
性別 雄性 雌性
劑量水準（vg/kg） 0 5 × 10 13 1 × 10 14 2 × 10 14 0 5 × 10 13 1 × 10 14 2 × 10 14
肝臟 檢查數目 2 2 2 2 2 2 2 2
壞死，個體肝細胞 最小 0 0 1 0 0 0 0 1
[ 表 7] . 投與 amiR-DMPK 204 的選定動物中試驗品相關的肝酶變化。
酶絕對活性，U/L（與給藥前相比的倍數變化） a
給藥前 給藥期
天 -41 4 8 15 29 30 31 43 85
動物P0202，雄性，投與1 × 10 14vg/kg
AST 33 133（4.0X） 38 35 - 35 - 37 40
ALT 32 74（2.3X） 126（3.9X） 52 - 34 - 31 35
GDH 22 89（4.0X） 92（4.2X） 35 ? 28 - 26 28
動物P0601，雌性，投與1 × 10 14vg/kg
AST 33 102（3.1X） 52 40 - 32 - 29 32
ALT 84 180（2.1X） 171（2.0X） 113 - 59 - 60 59
GDH 24 59（2.5X） 68（2.8X） 36 - 16 - 18 19
動物P0401，雄性，投與2 × 10 14vg/kg
AST 48 91 198（4.1X） 96（2.0X） - - 60 52 40
ALT 34 63 197（5.8X） 80（2.4X） - - 50 35 26
GDH 35 45 87（2.5X） 45 ? ? 40 34 32
動物P0302，雄性，投與2 × 10 14vg/kg
AST 48 688（14.3X） 58 80 - - 57 52 50
ALT 83 686（8.3X） 306（3.7X） 99 - - 66 64 61
GDH 45 92（＞2.0X） 75 37 32 31 30
動物P0701，雌性，投與2 × 10 14vg/kg
AST 43 136（3.2X） 82 110（2.6X） - - 51 54 61
ALT 40 119（3.0X） 109（2.7X） 109（2.7X） - - 41 59 62
GDH 27 44 54（2.0X） 61（2.3X） - - 23 36 46
動物P0702，雌性，投與2 × 10 14vg/kg
AST 35 58 65 51 - - 34 43 35
ALT 45 69 99（2.2X） 60 - - 34 61 42
GDH 23 32 53（2.3X） 26 - - 16 28 22
序列 除非另有指示，否則所有多肽序列以N-末端至C-末端呈現。除非另有指示，否則所有核酸序列以5'至3'呈現。 Byrne 結蛋白強化子序列 CACCCATGCCTCCTCAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTC CCAGCCATGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTG CTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGT GTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAAACTG AAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTTGAGGCCCCACC CTCGA（ SEQ ID NO:21） 來源：Li和Paulin等人1991. 「High level desmin expression depends on a muscle-specific enhancer [高水準結蛋白表現取決於肌肉特異性強化子]. 」Journal of Biol Chem. [生物化學雜誌] 266.10: 6562-6570。 Homo sapiensdesmin locus control region (DES-LCR) on chromosome 2 [2號染色體上的智人類結蛋白基因座控制區（DES-LCR）]（NCBI參考序列：NG_046330.1） Byrne強化子序列對應於參考序列中的17767-18125。 Paulin 結蛋白強化子序列 CCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCGTTCTCCTCT ATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGGG TTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTG AGTAGGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAAACTGAA（ SEQ ID NO:22） 來源：Li和Paulin等人1991. 「High level desmin expression depends on a muscle-specific enhancer [高水準結蛋白表現取決於肌肉特異性強化子]. 」Journal of Biol Chem. [生物化學雜誌] 266.10: 6562-6570。 Homo sapiensdesmin locus control region (DES-LCR) on chromosome 2 [2號染色體上的智人類結蛋白基因座控制區（DES-LCR）]（NCBI參考序列：NG_046330.1） Paulin強化子序列對應於參考序列中的17787-18063 Paulin 結蛋白啟動子序列（ -228 至 +75 ） CTGCAGAC C TGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTCACAGGA CCCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCC CACGGCCACGGGCCGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAG GGGAGGCGGGGGCTGATGTCAGGAGGGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGT CTCCCCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGGCCGCCTGCCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCG（ SEQ ID NO:23） 與公開的序列有一個鹼基對差異（C而不是A，以粗體和底線顯示）。 來源：Li和Paulin等人1991. 「High level desmin expression depends on a muscle-specific enhancer [高水準結蛋白表現取決於肌肉特異性強化子]. 」Journal of Biol Chem. [生物化學雜誌] 266.10: 6562-6570。 Homo sapiensdesmin locus control region (DES-LCR) on chromosome 2 [2號染色體上的智人類結蛋白基因座控制區（DES-LCR）]（NCBI參考序列：NG_046330.1） Paulin啟動子序列對應於參考序列中的18535-18844 完整 nDes 啟動子序列 CACCCATGCCTCCTCAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTC CCAGCCATGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTG CTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGT GTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGG GGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAAACTG AAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTTGAGGCCCCACCCTCGAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCG TTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAG ATGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTG GGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCC ACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAAACTGAAAGCTTCTGC AGACCTGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTCACAGGACCCC CGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCACG GCCACGGGCCGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGA GGCGGGGGCTGATGTCAGGAGGGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGTCTCC CCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGGCCGCCTGCCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCG（ SEQ ID NO:12） 來源：Li和Paulin等人1991. 「High level desmin expression depends on a muscle-specific enhancer [高水準結蛋白表現取決於肌肉特異性強化子]. 」Journal of Biol Chem. [生物化學雜誌] 266.10: 6562-6570。 兔 β- 球蛋白內含子 GTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATA TGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACC ATG CATG GACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATT GTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATT TGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGATCCCATCGATT CCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTA AATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATT GGTAGAAACAACTACA T CCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATA TACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACC ATGTTCATGCCTTCTTCT T TTTCCTACAG （ SEQ ID NO: 13 ） 兔 β - 球蛋白內含子的 5' 臂 GTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATA TGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACC ATG CATG GACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATT GTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATT TGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGATCCCATCGATTC（ SEQ ID NO:14） 來源：穴兔（ Oryctolagus cuninculus）血紅素，β（HBB2）基因ID 100009084 本發明的序列具有另外的CATG（以粗體和底線顯示），其不存在於基因ID 100009084中。 兔 β - 球蛋白內含子的 3' 臂 CAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAATTGTTATAATTA AATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATT GGTAGAAACAACTACA T CCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATA TACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCT T TTTCCTACAG（ SEQ ID NO:15） 來源：穴兔血紅素，β（HBB2）基因ID 100009084 本發明的序列具有兩個T殘基（以粗體和底線顯示），而不是基因ID 100009084中的兩個C殘基。 miR155-DMPK 204 序列： 5' miR155 側翼序列RNA序列 CUGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCU（ SEQ ID NO:9） DNA 序列CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT（ SEQ ID NO:40） 來源：BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體套組目錄號#K493500 經工程改造的pre-miRNA序列結構基於鼠miR-155序列（Lagos-Quintana等人, 2002, Current Biology[當代生物學], 12:9, 735-739）。 amiR-DMPK 204 指導 -DNAAGTCGAAGACAGTTCTAGGGT（ SEQ ID NO:4） miR155 末端環 -DNAGTTTTGGCCACTGACTGAC（ SEQ ID NO:6） 來源：BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體套組目錄號#K493500 經工程改造的pre-miRNA序列結構基於鼠miR-155序列（Lagos-Quintana等人, 2002, Current Biology[當代生物學], 12:9, 735-739）。 amiR-DMPK 204 乘客 -DNAACCCTAGATGTCTTCGATT（ SEQ ID NO:5） amiR-DMPK 204 指導 -RNA-miR155 末端環 -amiR-DMPK 204 乘客 -RNAAGUCGAAGACAGUUCUAGGGUUGUUUUGGCCACUGACUGACACCCUAGAUGUCUUCGAUU（ SEQ ID NO:7） amiR-DMPK 204 指導 -DNA-miR155 末端環 -amiR-DMPK 204 乘客 -DNAAGTCGAAGACAGTTCTAGGGTTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCTAGATGTCTTCGATT（ SEQ ID NO:8） 3' miR155 側翼序列RNA序列 GACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCC（ SEQ ID NO:10） DNA 序列GACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC（ SEQ ID NO:41） 來源：BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi表現載體套組目錄號#K493500 經工程改造的pre-miRNA序列結構基於鼠miR-155序列（Lagos-Quintana等人, 2002, Current Biology[當代生物學], 12:9, 735-739）。 miR155RNA CUGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCUGACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCC （ SEQ ID NO:11 ）DNA CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC （ SEQ ID NO:42 ） 完整 miR155-DMPK 204 雙股體序列 -RNACUGGAGGCUUGCUGAAGGCUGUAUGCUGAGUCGAAGACAGUUCUAGGGUGUUUUGGCCACUGACUGACACCCUAGAUGUCUUCGAUUCAGGACACAAGGCCUGUUACUAGCACUCACAUGGAACAAAUGGCC（ SEQ ID NO:24） 完整 miR155-DMPK 204 雙股體序列 -DNACTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGAAGACAGTTCTAGGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCTAGATGTCTTCGATTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC（ SEQ ID NO:25） 最小 BGHpA 序列 TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGG TGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTA GGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAA GACAATAGC（ SEQ ID NO:16） 來源：家牛（ Bos taurus）生長激素1（GH1）mRNA NCBI參考序列NM_180996.1 1138 bp A1AT 內含子填充序列（表現盒的上游） TACGTACAATTGGGATCCTTCGAACTTGAGAGAAAACATCCCAGGGATTTACAGATCAC ATGCAGGCAGGGACCAGCTCAACCCTTCTTTAATGTCATCCAGGGAGGGGGCCAGGGAT GGAGGGGAGGGGTTGAGGAGCGAGAGGCAGTTATTTTTGGGTGGGATTCACCACTTTTC CCATGAAGAGGGGAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAGAAGACAAAGGGTTTGTTG AACTTGACCTCGGGGGGGATAGACATGGGTATGGCCTCTAAAAACATGGCCCCAGCAGC TTCAGTCCCTTTCTCGTCGATGGTCAGCACAGCCTTATGCACGGCCTGGAGGGGAGAGA AGCAGAGACACGTTGTAAGGCTGATCCCAGGCCTCGAGCAAGGCTCACGTGGACACCTC CCAGGAAGCGCTCACTCCCCCTGGACGGCCCTGGCCCTGCACATCCTCTCCCTCCCTGT CACATAGGCCTTGCTCCTCCTCAAGGCTTTGGCTGATGGGGCTGGCTCCCCTCTGTCCA TCTTCCTGACAAGCGCCTCTCCCCCTGCTCAGGTGCACCCACAACTCAGAACAGGGAAG AGCATCGTCACTCCACTAGTCTGCCTCCAGGGCTCTCTCCTTTCTAGTACACGGCTTGA AGCTCCTTGAGGACACGGACCCTGGCAGTGACCTTCACAGTGCCCAGACCCCAAGATAA TGCAGCCATTCATGGAACTGCAGGTTGTTCATTGGTCGCCTTTAGTTTTCCAAAATAAG TGTCACTTTAGCTGAAATCATTCATTAATTCAGACACCAAATCTCACAGATCGAAGGAG TCAGAAATTCCTTTGAAACAACTTAGCCCAAACCTTTCTGTGTCAGTATGGATAAATCA AGGCCCAATGTCTAGAAGGTCTTGGGCAAAGTTGAAATTCAGGGTCAGTGACACAACCT CAAGGGAGGCCCCGAAAGTGCCAGCTGCACAGCAGCCCCTGCCTGGCTTTGCTGTTTGC CCACCGTCCCGTGTCAGTGAATCACGGGCATCTTCAGGAGCTCAGCCTGGGTCTTCATT TGTTTCCCTCGGCCCCTTCCTCAGCCTCAGGACAGTGCTAGCAGCCCCCACACATTCTTCCCTACAGATACCATGG（ SEQ ID NO:18） 來源：質體DC 969（SerpinA1=A1AT）染色體14 NG_008290.1 398 bp A1AT 內含子填充序列（表現盒的下游） GCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGA AGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAG GACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGA GCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCC CTATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAATGCCCTGGGGCCCCCAGGAC CCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTCGACATTTAAATT（ SEQ ID NO:19） 來源：質體DC 969（SerpinA1=A1AT）染色體14 NG_008290.1 ITR-nDes-miR155-amiR-DMPK 204-BGHpA- 填充序列 -ITR （ 3739 bp ） TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGAC CTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTT CCTTACGTACAATTGGGATCCTTCGAACTTGAGAGAAAACATCCCAGGGATTTACAGATCACATGCAGGCA GGGACCAGCTCAACCCTTCTTTAATGTCATCCAGGGAGGGGGCCAGGGATGGAGGGGAGGGGTTGAGGAGC GAGAGGCAGTTATTTTTGGGTGGGATTCACCACTTTTCCCATGAAGAGGGGAGACTTGGTATTTTGTTCAA TCATTAAGAAGACAAAGGGTTTGTTGAACTTGACCTCGGGGGGGATAGACATGGGTATGGCCTCTAAAAAC ATGGCCCCAGCAGCTTCAGTCCCTTTCTCGTCGATGGTCAGCACAGCCTTATGCACGGCCTGGAGGGGAGA GAAGCAGAGACACGTTGTAAGGCTGATCCCAGGCCTCGAGCAAGGCTCACGTGGACACCTCCCAGGAAGCG CTCACTCCCCCTGGACGGCCCTGGCCCTGCACATCCTCTCCCTCCCTGTCACATAGGCCTTGCTCCTCCTC AAGGCTTTGGCTGATGGGGCTGGCTCCCCTCTGTCCATCTTCCTGACAAGCGCCTCTCCCCCTGCTCAGGT GCACCCACAACTCAGAACAGGGAAGAGCATCGTCACTCCACTAGTCTGCCTCCAGGGCTCTCTCCTTTCTA GTACACGGCTTGAAGCTCCTTGAGGACACGGACCCTGGCAGTGACCTTCACAGTGCCCAGACCCCAAGATA ATGCAGCCATTCATGGAACTGCAGGTTGTTCATTGGTCGCCTTTAGTTTTCCAAAATAAGTGTCACTTTAG CTGAAATCATTCATTAATTCAGACACCAAATCTCACAGATCGAAGGAGTCAGAAATTCCTTTGAAACAACT TAGCCCAAACCTTTCTGTGTCAGTATGGATAAATCAAGGCCCAATGTCTAGAAGGTCTTGGGCAAAGTTGA AATTCAGGGTCAGTGACACAACCTCAAGGGAGGCCCCGAAAGTGCCAGCTGCACAGCAGCCCCTGCCTGGC TTTGCTGTTTGCCCACCGTCCCGTGTCAGTGAATCACGGGCATCTTCAGGAGCTCAGCCTGGGTCTTCATT TGTTTCCCTCGGCCCCTTCCTCAGCCTCAGGACAGTGCTAGCAGCCCCCACACATTCTTCCCTACAGATAC CATGGCACCCATGCCTCCTCAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCA TGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGG GTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGAT GAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACA TAGCAATTGGAAACTGAAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTTGAGGCCC CACCCTCGAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCGTTCTCCTC TATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGACATGCGG CTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATCAGGGAGG GGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCAATTGGAA ACTGAAAGCTTCTGCAGACCTGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTCACAGGAC CCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCACGGCCACGGGC CGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGAGGCGGGGGCTGATGTCAGGAG GGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGTCTCCCCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGGCCGCCTG CCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCG GAGCTCTGAGTAGACGAAGCTAAGGCGCGCCTGA GAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATG GAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATGGACCCTC ATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTT CTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCA GATTGTAAGATCCCATCGATTCGGATCCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGAAGACAGTTC TAGGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCTAGATGTCTTCGATTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACT CACATGGAACAAATGGCCCTCGAGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACAA TTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATT GGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGA GATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCC TACAGCTCCTGGGCAACGTGCTG ACCGGTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTG AGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCGCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAG CCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTG GCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAATGCCCTGG GGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCA CCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTCGACATTTAAATT AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCA CTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA （ SEQ ID NO:20 ）[ 表 5] .從5'ITR至3'ITR的ITR-nDes-miR155-amiR-DMPK 204序列注釋（3739 bp）
序列 編號 SEQ ID NO 注釋
1至145 43 5' ITR
146至1283 44 A1AT填充序列
1284至2238 12 nDes啟動子（詳情如下）
1284至1642 21 Byrne強化子
1643至1648 n/a Kpn1限制性位點
1647至1923 22 Paulin強化子
1923至1928 n/a HindIII限制性位點
1929至1934 n/a PstI限制性位點
1929至2238 23 Paulin啟動子
2268至2578 45 兔β-球蛋白內含子的5'臂
2579至2584 n/a BamH1限制性位點
2585至2611 46 5'miR155側翼序列
2612 n/a 來自Invitrogen Block-IT套組的附加鹼基
2613至2633 4 DMPK 204miRNA指導序列
2634至2652 6 miR155末端環
2653至2671 5 DMPK 204miRNA乘客序列
2672至2674 來自Invitrogen Block-IT套組的附加鹼基
2675至2716 41 3'miR155側翼序列
2717至2722 n/a Xho1限制性位點
2723至3005 47 兔β-球蛋白內含子的3'臂
3011至3196 16 minBGH polyA
3197至3594 48 A1AT填充序列
3595至3739 49 3'ITR
合成的 nDes-miR155-204 片段的序列 ： AGATCTCCATGGCACCCATGCCTCCTCAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTC CCAGCCATGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGA TGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTA GGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGA GCGCACATAGCAATTGGAAACTGAAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTT GAGGCCCCACCCTCGAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCGT TCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGA CATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATC AGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCA ATTGGAAACTGAAAGCTTCTGCAGACCTGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTC ACAGGACCCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCACGGC CACGGGCCGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGAGGCGGGGGCTGATG TCAGGAGGGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGTCTCCCCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGG CCGCCTGCCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCGGAGCTCTGAGTAGACGAAGCTAAGGCG CGCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATG TTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATG GACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTT TCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTA TTTGTCAGATTGTAAGATCCCATCGATTCGGATCCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGAAG ACAGTTCTAGGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCTAGATGTCTTCGATTCAGGACACAAGGCCTGTTAC TAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCTCGAGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAG AGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATAT TCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACAC TGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTC TTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGACCGGTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCC GTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCGCATGCGTCGACT （ SEQ ID NO: 26 ） nDes-miR155-204 啟動子至 polyA CACCCATGCCTCCTCAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTC CCAGCCATGCGTTCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGA TGGTTGGGTTGACATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTA GGGGGATGAATCAGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGA GCGCACATAGCAATTGGAAACTGAAAGCTTATCAGACCCTTTCTGGAAATCAGCCCACTGTTTATAAACTT GAGGCCCCACCCTCGAGGTACCCCCTGCCCCCCACAGCTCCTCTCCTGTGCCTTGTTTCCCAGCCATGCGT TCTCCTCTATAAATACCCGCTCTGGTATTTGGGGTTGGCAGCTGTTGCTGCCAGGGAGATGGTTGGGTTGA CATGCGGCTCCTGACAAAACACAAACCCCTGGTGTGTGTGGGCGTGGGTGGTGTGAGTAGGGGGATGAATC AGGGAGGGGGCGGGGGACCCAGGGGGCAGGAGCCACACAAAGTCTGTGCGGGGGTGGGAGCGCACATAGCA ATTGGAAACTGAAAGCTTCTGCAGACCTGCTTGCTGCCTGCCCTGGCGAAGGATTGGCAGGCTTGCCCGTC ACAGGACCCCCGCTGGCTGACTCAGGGGCGCAGGCCTCTTGCGGGGGAGCTGGCCTCCCCGCCCCCACGGC CACGGGCCGCCCTTTCCTGGCAGGACAGCGGGATCTTGCAGCTGTCAGGGGAGGGGAGGCGGGGGCTGATG TCAGGAGGGATACAAATAGTGCCGACGGCTGGGGGCCCTGTCTCCCCTCGCCGCATCCACTCTCCGGCCGG CCGCCTGCCCGCCGCCTCCTCCGTGCGCCCGCCAGCCTCGCCCGGAGCTCTGAGTAGACGAAGCTAAGGCG CGCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATG TTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGCATG GACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTT TCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTA TTTGTCAGATTGTAAGATCCCATCGATTCGGATCCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAGTCGAAG ACAGTTCTAGGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCCTAGATGTCTTCGATTCAGGACACAAGGCCTGTTAC TAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCTCGAGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAG AGAACAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATAT TCTTATTGGTAGAAACAACTACATCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACAC TGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTC TTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGACCGGTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCC GTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA TTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAG ACAATAGC （ SEQ ID NO: 17 ） AAVrh74N502I 的胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSIFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL（ SEQ ID NO: 50） 編碼 AAVrh74 N502I 衣殼的核苷酸序列 ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACAACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCCAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGCGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGCGGGTTCTCGAACCTCTGGGCCTGGTTGAATCGCCGGTTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGCTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCAAAAAAGAGACTCAATTTTGGGCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCTCAACCAATCGGAGAACCACCAGCAGGCCCCTCTGGTCTGGGATCTGGTACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGCACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGGCTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGATTCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTGCTCGGCTCGGCGCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGCAGTCAGGCTGTGGGCCGGTCGTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAATTCAGCTACAACTTCGAGGACGTGCCCTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCTCTCATCGACCAGTACTTGTACTACCTGTCCCGGACTCAAAGCACGGGCGGTACTGCAGGAACTCAGCAGTTGCTATTTTCTCAGGCCGGGCCTAACAACATGTCGGCTCAGGCCAAGAACTGGCTACCCGGTCCCTGCTACCGGCAGCAACGCGTCTCCACGACACTGTCGCAGAACAACAACAGCATCTTTGCCTGGACGGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCTGGCGTTGCCATGGCTACCCACAAGGACGACGAAGAGCGATTTTTTCCATCCAGCGGAGTCTTAATGTTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAAAGACAACGTGGACTATAGCAGCGTGATGCTAACCAGCGAGGAAGAAATAAAGACCACCAACCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCGTGGTGGCCGATAACCTGCAACAGCAAAACGCCGCTCCTATTGTAGGGGCCGTCAATAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTGTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCATACGGACGGCAACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAGCATCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAAAACACACCTGTTCCCGCGGATCCTCCGACCACCTTCAATCAGGCCAAGCTGGCTTCTTTCATCACGCAGTACAGTACCGGCCAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAGAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAATACTGAGGGTACTTATTCCGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAA（ SEQ ID NO: 51） AAVrh74W505R 的胺基酸序列 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVESPVKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYNFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFARTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL（ SEQ ID NO: 52） 編碼 AAVrh74W505R 的核苷酸序列 ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACCTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACAACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCCAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAATCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGCGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGCGGGTTCTCGAACCTCTGGGCCTGGTTGAATCGCCGGTTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCCATCACCCCAGCGCTCTCCAGACTCCTCTACGGGCATCGGCAAGAAAGGCCAGCAGCCCGCAAAAAAGAGACTCAATTTTGGGCAGACTGGCGACTCAGAGTCAGTCCCCGACCCTCAACCAATCGGAGAACCACCAGCAGGCCCCTCTGGTCTGGGATCTGGTACAATGGCTGCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAGTTCCTCAGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGCACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGGACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCCAAGAGGCTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAAGTCAAGGAGGTCACGCAGAATGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGATTCAGGTCTTTACGGACTCGGAATACCAGCTCCCGTACGTGCTCGGCTCGGCGCACCAGGGCTGCCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGATTCCTCAGTACGGGTACCTGACTCTGAACAATGGCAGTCAGGCTGTGGGCCGGTCGTCCTTCTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAAATGCTGAGAACGGGCAACAACTTTGAATTCAGCTACAACTTCGAGGACGTGCCCTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAGAGCCTGGACCGGCTGATGAACCCTCTCATCGACCAGTACTTGTACTACCTGTCCCGGACTCAAAGCACGGGCGGTACTGCAGGAACTCAGCAGTTGCTATTTTCTCAGGCCGGGCCTAACAACATGTCGGCTCAGGCCAAGAACTGGCTACCCGGTCCCTGCTACCGGCAGCAACGCGTCTCCACGACACTGTCGCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCAGGACGGGTGCCACCAAGTATCATCTGAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCTGGCGTTGCCATGGCTACCCACAAGGACGACGAAGAGCGATTTTTTCCATCCAGCGGAGTCTTAATGTTTGGGAAACAGGGAGCTGGAAAAGACAACGTGGACTATAGCAGCGTGATGCTAACCAGCGAGGAAGAAATAAAGACCACCAACCCAGTGGCCACAGAACAGTACGGCGTGGTGGCCGATAACCTGCAACAGCAAAACGCCGCTCCTATTGTAGGGGCCGTCAATAGTCAAGGAGCCTTACCTGGCATGGTGTGGCAGAACCGGGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAGATTCCTCATACGGACGGCAACTTTCATCCCTCGCCGCTGATGGGAGGCTTTGGACTGAAGCATCCGCCTCCTCAGATCCTGATTAAAAACACACCTGTTCCCGCGGATCCTCCGACCACCTTCAATCAGGCCAAGCTGGCTTCTTTCATCACGCAGTACAGTACCGGCCAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAGAACAGCAAACGCTGGAACCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAATACTGAGGGTACTTATTCCGAGCCTCGCCCCATTGGCACCCGTTACCTCACCCGTAATCTGTAA（ SEQ ID NO: 53）
無
藉由結合附圖參考以下描述可以理解本申請。
[ 圖 1A]描繪了nDes-miR155-amiR-DMPK 204基因盒的序列示意圖。雜合肌肉啟動子位於miR155-amiR-DMPK 204序列的上游。miRNA的下游係牛生長激素聚腺苷酸化序列（minBGHpA）。來自A1AT內含子的填充序列側接該盒的任一側。所有該等的側翼係兩個AAV2 ITR，從而產生3739 bp的組合載體基因組大小。
[ 圖 1B]描繪了用於選殖nDes-miR155-amiR-DMPK 204基因盒的ITR質體。ITR質體含有側翼係AAV2 5'和3' ITR的A1AT填充序列。A1AT填充序列包含用於選殖的NcoI和SphI限制性位點。
[ 圖 1C]描繪了在HEK 293細胞中進行小規模包裝測定以確認DC969-nDes-miR155-amiR-DMPK 204質體的包裝的結果。使用AAV rep/cap質體進行小規模生產。y軸示出與標準EGFP質體基因盒（CD627-CBA-GFP）相比，每個HEK 293細胞產生的載體的量。DRP：DNA酶抗性顆粒。
[ 圖 2A 至 圖 2C]描繪了尾靜脈注射後對DMSXL小鼠中由AAV即nDes-miR155- amiR-DMPK 204（amiR155-204）表現盒對DMPK敲落的評價。 圖 2A示出了藉由定量不同器官中的轉基因複本數評價的AAV的轉導效率和生物分布。qPCR結果表示為AAV複本數/細胞核的平均比率。 圖 2B示出了經轉導組織中amiR-DMPK 204的水準。將微小RNA輸入水準針對U6小核RNA標準化，並相對於經過BSS（平衡鹽溶液）處理的細胞設置。 圖 2C示出了經轉導組織中DMPK的緘默化。藉由qRT-PCR測定總DMPK。將mRNA輸入針對tata盒結合蛋白（TBP）標準化並相對於經過BSS處理的細胞設置。虛線指示相對於TBP表現的50% DMPK表現。對於 圖 2A- 圖 2C，使用配對學生T檢驗評價數據：*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。n = 13（BSS），n = 12（amiR155-204）。
[ 圖 3A 至 圖 3B]描繪了AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204對人DMPK的阻抑。將DMSXL小鼠以劑量依賴性方式全身注射AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204。8週後對小鼠實施安樂死，收穫器官，並測量amiR-DMPK 204和DMPK轉錄物水準。 圖 3A描繪了各種組織中針對U6標準化的amiR-DMPK 204的豐度。 圖 3B描繪了各種組織中針對mTBP標準化的hDMPK轉錄物的豐度。使用ANOVA，多重比較檢驗對數據進行評價：*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。（n = wt-10，BSS-7，低劑量5，中劑量13和高劑量7）。
[ 圖 4]描繪了用AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204全身處理後DMSXL小鼠中剪接異常的校正。處理8週後，使用RT-PCR評估腓腸肌中LDB3中選擇性外顯子11的剪接。使用ANOVA，多重比較檢驗對數據進行評價：*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。（n = wt-10，BSS-7，低劑量5，中劑量13和高劑量7）。
[ 圖 5A和 圖 5B]示出了用AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204以劑量依賴性方式處理的雌性DMSXL小鼠的存活率和體重增加。 圖 5A示出了Kaplan-Meier存活曲線，顯示與低劑量或BSS處理的動物相比，用中劑量處理8週後的存活率提高。 圖 5B示出了與BSS處理的或低劑量處理的動物相比，在用AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204處理的DMSXL動物中觀察到的體重提高。
[ 圖 6]描繪了用AAV nDes-miR155-amiR-DMPK 204以劑量依賴性方式全身處理DMSXL DM1小鼠模型後DM1疾病的電生理特徵的逆轉。使用ANOVA，多重比較檢驗對數據進行評價：*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。（n = wt-10，BSS-7，低劑量5，中劑量13和高劑量7）。
[ 圖 7A]示出了實驗方案的示意圖。在第-1天收集血液（ ）以再次確認中和抗體。在第0天以1e13 vg/kg的劑量向NHP投與編碼GFP報告因子的AAV，並在D21進行屍體剖檢並收集多個組織以評價生物分布。 圖 7B 至圖 7E示出了來自注射AAV9、AAVrh74和AAVrh74 N502I（rh74M）的動物的各種組織的GFP表現的定量。橫條圖表示脛骨前肌（TA； 圖 7B）、股二頭肌（ 圖 7C）、四頭肌（ 圖 7D）、心臟（ 圖 7E）和肝臟（ 圖 7F）中藉由ELISA測量的GFP量。使用ANOVA，多重比較檢驗對數據進行評價：*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。
[ 圖 8A 和圖 8B]描繪了AAV rh74 N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204對人DMPK的阻抑。將DMSXL小鼠以劑量依賴性方式全身注射AAV rh74 N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204。8週後對小鼠實施安樂死，收穫器官，並測量amiR-DMPK 204和DMPK轉錄物水準。 圖 8A描繪了各種組織中針對U6標準化的amiR-DMPK 204的豐度。 圖 8B描繪了各種組織中針對mTBP標準化的hDMPK轉錄物的豐度。使用ANOVA，多重比較檢驗對數據進行評價：*p ＜ 0.05，**p ＜ 0.01，***p ＜ 0.001，且****p ＜ 0.0001。
[ 圖 9]示出了AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204對內源性DMPK的緘默化。藉由qRT-PCR對從iPSC分化的人DM1心肌細胞提取的RNA測定總DMPK水準。該等心肌細胞用AAVrh74N502I nDes-miR155-amiR-DMPK 204轉導。將mRNA輸入水準針對TBP mRNA標準化。miRCTL3用作陰性對照並設為1。配對學生T檢驗：**p ＜ 0.01。
[ 圖 10]係顯示amiR-DMPK 204處理的HEK293細胞中全基因組基因表現變化的火山圖（Benjamini Hochberg FDR ＜ 1%）。表格示出了前4個差異性表現（DE）基因，其中3′ UTR種子互補，FDR ＜ 1%和FDR ＜ 5%。
[ 圖 11]示出了 多個序列中amiRDMPK 204目標序列的保守性。人類標的係SEQ ID NO:28，獼猴標的係SEQ ID NO:29，小鼠標的係SEQ ID NO:30，大鼠標的係SEQ ID NO:31，並且狗標的係SEQ ID NO:32。
[ 圖 12]說明在所示處理組中病毒基因組複本數/細胞在多種組織中的生物分布。
[ 圖 13]示出了在所示處理組中在不同肌肉組織中的劑量依賴性amiR-DMPK表現。
[ 圖 14]示出了每個所示處理組的不同肌肉中在處理後的DMPK表現水準。
[ 圖 15A 至 圖 15F]說明了6個基因（MBNL1、SOS1、PKM、zTTN、GOLGA4和CLASP1）的剪接的變化，比較了健康肌管、未處理的DM1肌管和用amiR-DMPK 204處理的DM1肌管。
[ 圖 16A 至圖 16B]說明了用以鑒定在骨骼肌（人類肌管； 圖 16A）中具有高活性和在肝細胞（Huh7細胞； 圖 16B）中具有低活性的啟動子的體外篩選。將啟動子S1-S9與公開的肌肉啟動子以及與泛在CAG啟動子進行比較。
[ 圖 17A 至圖 17F]說明來自於用攜帶在結蛋白啟動子下表現的靶向 DMPK的miRNA的AAV2轉導的永生化人DM1肌管的數據。使用PCR定量miRNA（ 圖 17A）和 DMPKmRNA水準（ 圖 17B）。使用螢光原位雜交（FISH）對核CTG RNA灶成像，並在未處理的（ 圖 17C）和經過處理的（ 圖 17D）細胞中定量。灶的量化可以在 圖 17E 至 圖 17F中看到。
[ 圖 18]說明了以9×10 13vg/kg AAV.amiR155-DMPK 204給藥的DMSXL小鼠中的 DMPK水準。給藥後8週，藉由PCR測量 DMPK表現。與未處理的小鼠相比，經過處理的小鼠在幾種肌肉中的 DMPK顯著減少，而在肝臟中沒有檢測到 DMPKmRNA的顯著減少。
[ 圖 19]說明了與對照（緩衝液；DMSXL-）相比，在處理後（DMSXL+）小鼠心臟中RNA灶大小的顯著減小。
[ 圖 20]說明了野生型小鼠、用緩衝液處理的DMSXL小鼠（DMSXL-）和接受處理的DMSXL小鼠（DMSXL+）中各種基因（Ldb3、Mbnl2、Spag9、DNA酶1、Tnnt3和Zbtb49）的剪接。
[ 圖 21]描繪了用AAV.amiR155-DMPK 204處理的DMSXL小鼠中的功能益處。使用肌電描記法（EMG）測量野生型小鼠、未接受處理的DMSXL小鼠（DMSXL-）和接受治療的DMSXL小鼠（DMSXL+）的三種不同肌群-腓腸肌、四頭肌和脛骨前肌（TA）中的肌強直。比較各組0級事件（無肌強直）與1-3級事件的數目。
[ 圖 22A 至 圖 22B]描繪了與WT小鼠相比，用或不用AAV.amiR155-DMPK 204處理的DMSXL小鼠的心臟變化。 圖 22A係描繪主動脈直徑（mm）變化的圖表。 圖 22B描繪了心輸出量（μL/s）的變化。
無
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Claims (125)

  1. 一種重組腺相關病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）顆粒，該rAAV顆粒包含： a) 包含第一股和第二股的RNAi，其中： i) 該第一股和該第二股形成雙股體； ii) 該第一股包含指導區，其中該指導區包含具有序列5'-AGUCGAAGACAGUUCUAGGGU-3'（SEQ ID NO:1）的核酸或具有與SEQ ID NO:1的序列具有約90%同一性的序列的核酸；並且 iii) 該第二股包含非指導區；以及 b) 包含與野生型AAVrh74衣殼具有約90%同一性的胺基酸序列的AAV衣殼。
  2. 如請求項1所述之rAAV顆粒，其中該非指導區包含具有序列5'-ACCCUAGAUGUCUUCGAUU-3'（SEQ ID NO:2）的核酸或具有與SEQ ID NO:2的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
  3. 如請求項1或2所述之rAAV顆粒，其中該第一股包含具有SEQ ID NO:1的序列的核酸，並且該非指導區包含具有SEQ ID NO:2的序列的核酸。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之rAAV顆粒，其中該第一股和該第二股藉助於能夠形成環結構的RNA連接子連接。
  5. 如請求項4所述之rAAV顆粒，其中該RNA連接子包含約4至約50個核苷酸。
  6. 如請求項4或5所述之rAAV顆粒，其中該環結構包含約4至約20個核苷酸。
  7. 如請求項4至6中任一項所述之rAAV顆粒，其中該環結構包含具有SEQ ID NO:3的序列或具有與SEQ ID NO:3的序列具有約90%同一性的序列的核酸序列。
  8. 如請求項4至7中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi從5'至3'包含該第二股、該RNA連接子和該第一股。
  9. 如請求項4至7中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi從5'至3'包含該第一股、該RNA連接子和該第二股。
  10. 如請求項1至8中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi包含具有SEQ ID NO:7的序列或具有與SEQ ID NO:7的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi係小抑制性RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）或小髮夾RNA（shRNA）。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi進一步包含支架。
  13. 如請求項12所述之rAAV顆粒，其中該支架包含SEQ ID NO: 11的核酸的全部或一部分。
  14. 如請求項13所述之rAAV顆粒，其中該miRNA嵌入該支架內。
  15. 如請求項14所述之rAAV顆粒，其中該支架具有5'臂和3'臂，其中該5'臂位於編碼該RNAi的核酸的5'，其中該3'臂位於編碼該RNAi的核酸的3'。
  16. 如請求項12至15中任一項所述之rAAV顆粒，其中該支架係miR-155支架。
  17. 如請求項12至16中任一項所述之rAAV顆粒，其中該miR-155支架包含位於該RNAi的5'的具有SEQ ID NO:9的序列或與SEQ ID NO:9的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
  18. 如請求項12至17中任一項所述之rAAV顆粒，其中該miR-155支架包含位於該RNAi的3'的具有SEQ ID NO:10的序列或與SEQ ID NO:10的序列具有約90%同一性的序列的核酸。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之rAAV顆粒，其中該RNAi靶向編碼與肌強直性營養不良1型（myotonic dystrophy-1，DM1）相關的多肽的RNA。
  20. 如請求項19所述之rAAV顆粒，其中該多肽係失養性肌強直蛋白激酶（dystrophia myotonica protein kinase，DMPK）。
  21. 如請求項20所述之rAAV顆粒，其中該DMPK包含與DM-1相關的突變。
  22. 如請求項20或21所述之rAAV顆粒，其中編碼DMPK的基因包含5個或更多個CTG三核苷酸重複序列。
  23. 一種表現盒，該表現盒包含編碼如請求項1至22中任一項所述之RNAi的核酸序列。
  24. 如請求項23所述之表現盒，其中編碼該RNAi的核酸與啟動子可操作地連接。
  25. 如請求項24所述之表現盒，其中該啟動子係肌肉特異性啟動子。
  26. 如請求項24或25所述之表現盒，其中該啟動子係結蛋白啟動子（desmin promoter）或其變體。
  27. 如請求項26所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。
  28. 如請求項26或27所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。
  29. 如請求項26至28中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。
  30. 如請求項26至29中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含：包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或與SEQ ID NO:21的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或與SEQ ID NO:22的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件。
  31. 如請求項26至30中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或與SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有約90%同一性的序列。
  32. 如請求項23至31中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含內含子。
  33. 如請求項32所述之表現盒，其中該內含子係兔β-球蛋白內含子。
  34. 如請求項32或33所述之表現盒，其中該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或與SEQ ID NO:13的序列具有約90%同一性的序列。
  35. 如請求項32至34中任一項所述之表現盒，其中編碼該RNAi的核酸係嵌入在該內含子中。
  36. 如請求項35所述之表現盒，其中該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於編碼該RNAi的核酸的5'並且該3'臂位於編碼該RNAi的核酸的3'。
  37. 如請求項36所述之表現盒，其中該內含子的5'臂包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或與SEQ ID NO:14的序列具有約90%同一性的序列。
  38. 如請求項36或37所述之表現盒，其中該內含子的3'臂包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或與SEQ ID NO:15的序列具有約90%同一性的序列。
  39. 如請求項23至38中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。
  40. 如請求項39所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
  41. 如請求項40所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息（minimal bovine growth hormone polyadenylation signal）。
  42. 如請求項39至41中任一項所述之表現盒，其中該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或與SEQ ID NO:16的序列具有約90%同一性的序列。
  43. 如請求項23至42中任一項所述之表現盒，其中該表現盒包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列或與SEQ ID NO:17的序列具有約90%同一性的序列。
  44. 一種表現盒，其中該表現盒包含經修飾的結蛋白啟動子，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含一或多個強化子元件、和人類結蛋白基因的啟動子。
  45. 如請求項44所述之表現盒，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含兩個強化子元件、和該人類結蛋白基因的啟動子。
  46. 如請求項44或45所述之表現盒，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含一或多個Byrne強化子元件和/或一或多個Paulin強化子元件。
  47. 如請求項44-46中任一項所述之表現盒，其中該經修飾的結蛋白啟動子包含：包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列或與SEQ ID NO:21的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件，和/或包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列或與SEQ ID NO:22的序列具有約90%同一性的核苷酸序列的一或多個強化子元件。
  48. 如請求項44至47中任一項所述之表現盒，其中該結蛋白啟動子包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列或與SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有約90%同一性的序列。
  49. 如請求項44至48中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含內含子。
  50. 如請求項49所述之表現盒，其中該內含子係兔β-球蛋白內含子。
  51. 如請求項49或50所述之表現盒，其中該內含子包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列或與SEQ ID NO:13的序列具有約90%同一性的序列。
  52. 如請求項44至51中任一項所述之表現盒，其中編碼轉基因的核酸係嵌入在該內含子中。
  53. 如請求項52所述之表現盒，其中該內含子包含5'臂和3'臂，其中該5'臂位於該編碼轉基因的核酸的5'並且該3'臂位於該編碼轉基因的核酸的3'。
  54. 如請求項53所述之表現盒，其中該內含子的5'臂包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列或與SEQ ID NO:14的序列具有約90%同一性的序列。
  55. 如請求項53或54所述之表現盒，其中該內含子的3'臂包含SEQ ID NO:15的核苷酸序列或與SEQ ID NO:15的序列具有約90%同一性的序列。
  56. 如請求項44至55中任一項所述之表現盒，其中該表現盒進一步包含聚腺苷酸化訊息。
  57. 如請求項56所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係牛生長激素聚腺苷酸化訊息、SV40聚腺苷酸化訊息或HSV TK pA。
  58. 如請求項57所述之表現盒，其中該聚腺苷酸化訊息係最小牛生長激素聚腺苷酸化訊息。
  59. 如請求項56至58中任一項所述之表現盒，其中該牛生長激素聚腺苷酸化訊息包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列或與SEQ ID NO:16的序列具有約90%同一性的序列。
  60. 如請求項44至59中任一項所述之表現盒，其中該轉基因編碼多肽或核酸。
  61. 如請求項44-至60中任一項所述之表現盒，其中該轉基因編碼RNAi。
  62. 一種載體，該載體包含如請求項23至61中任一項所述之表現盒。
  63. 如請求項62所述之載體，其中該表現盒的側翼係一或多個填充核酸序列。
  64. 如請求項63所述之載體，其中該一或多個填充核酸序列源自人類SerpinA1基因。
  65. 如請求項63或64所述之載體，其中位於該表現盒5'的填充核酸序列源自該人類SerpinA1基因。
  66. 如請求項63至65中任一項所述之載體，其中位於該表現盒5'的填充序列包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列或與SEQ ID NO:18的序列具有約90%同一性的序列。
  67. 如請求項63至66中任一項所述之載體，其中位於該表現盒3'的填充核酸序列源自該人類SerpinA1基因。
  68. 如請求項63至67中任一項所述之載體，其中位於該表現盒3'的填充序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列或與SEQ ID NO:19的序列具有約90%同一性的序列。
  69. 如請求項62至68中任一項所述之載體，其中該載體係重組腺相關病毒（rAAV）載體。
  70. 如請求項69所述之rAAV載體，其中該表現盒的側翼係一或多個AAV反向末端重複（inverted terminal repeat，ITR）序列。
  71. 如請求項70所述之rAAV載體，其中該表現盒的側翼係兩個AAV ITR。
  72. 如請求項70或71所述之rAAV載體，其中該等AAV ITR係AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
  73. 如請求項70至72中任一項所述之rAAV載體，其中該等AAV ITR係AAV2 ITR。
  74. 如請求項69至73中任一項所述之rAAV載體，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列或與SEQ ID NO:20的序列具有約90%同一性的序列。
  75. 如請求項69至74中任一項所述之rAAV載體，其中該載體係自身互補的rAAV載體。
  76. 一種細胞，該細胞包含如請求項23至61中任一項所述之表現盒、如請求項62至68中任一項所述之載體、或如請求項69至75中任一項所述之rAAV載體。
  77. 如請求項1至22中任一項所述之rAAV顆粒，其中該AAV衣殼包含在位置502處包含胺基酸取代的胺基酸序列。
  78. 如請求項77所述之rAAV顆粒，其中位置502處的該胺基酸取代係異白胺酸（I）。
  79. 如請求項77或78所述之rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含AAVrh74 N502I血清型衣殼。
  80. 如請求項所述之rAAV顆粒，其中該ITR係AAV2 ITR並且該rAAV顆粒的衣殼係AAVrh74 N502I血清型衣殼。
  81. 如請求項1至22中任一項所述之rAAV顆粒，其中該AAV衣殼包含在位置505處包含胺基酸取代的胺基酸序列。
  82. 如請求項81所述之rAAV顆粒，其中位置505處的該胺基酸取代係精胺酸（R）。
  83. 如請求項1至22中任一項所述之rAAV顆粒，其中該rAAV顆粒包含AAVrh74 W505R血清型衣殼。
  84. 如請求項83所述之rAAV顆粒，其中該ITR係AAV2 ITR並且該rAAV顆粒的衣殼係AAVrh74 W505R血清型衣殼。
  85. 一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3'包含以下核酸： AAV2 ITR， 編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸， Byrne結蛋白強化子元件， Paulin結蛋白強化子元件， 結蛋白啟動子， 兔β-球蛋白內含子的5’臂， 5' miR155支架序列， DMPK 204miRNA指導序列， miR155末端環序列， DMPK 204miRNA乘客序列， 3' miR155支架序列， 兔β-球蛋白內含子的3’臂， 最小牛生長激素聚腺苷酸化序列， 編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和 AAV2 ITR； 並且其中該衣殼係AAVrh74 N502I衣殼。
  86. 一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3'包含以下核酸： 包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR， 編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸， 包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件， 包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件， 包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子， 包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂， 包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列， 包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列， 包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列， 包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列， 包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列， 包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂， 包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列， 編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和 包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR； 並且其中衣殼係AAVrh74 N502I衣殼。
  87. 如請求項85或86所述之rAAV顆粒，其中該AAVrh74 N502I衣殼包含含有SEQ ID NO:50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
  88. 一種包含rAAV載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：AAV2 ITR，編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，Byrne結蛋白強化子元件，Paulin結蛋白強化子元件，結蛋白啟動子，兔β-球蛋白內含子的5'臂，5' miR155支架序列，DMPK 204miRNA指導序列，miR155末端環序列，DMPK 204miRNA乘客序列，3' miR155支架序列，兔β-球蛋白內含子的3'臂，最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和AAV2 ITR；並且其中該衣殼係AAVrh74 W505R衣殼。
  89. 一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3’包含以下核酸：包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR，編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件，包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子，包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂，包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列，包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列，包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列，包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列，包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂，包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列，編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR；並且其中衣殼係AAVrh74 W505R衣殼。
  90. 如請求項88或89所述之rAAV顆粒，其中該AAVrh74 W505R衣殼包含含有SEQ ID NO:52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
  91. 一種組成物，該組成物包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  92. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  93. 如請求項91或92所述之組成物，其中該組成物進一步包含醫藥上可接受的載劑。
  94. 一種套組，該套組包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  95. 一種套組，該套組包含如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  96. 一種套組，該套組包含如請求項91至93中任一項所述之組成物。
  97. 如請求項94至96中任一項所述之套組，該套組進一步包含使用說明書。
  98. 一種用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  99. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  100. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之RNAi。
  101. 一種用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  102. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  103. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒。
  104. 如請求項100至103中任一項所述之方法，其中該rAAV顆粒的有效量係約1 × 10 8至約2 × 10 13個基因組複本/mL的劑量。
  105. 如請求項104所述之方法，其中該劑量為約5 × 10 12個基因組複本/mL。
  106. 如請求項104所述之方法，其中該劑量為約1 × 10 13個基因組複本/mL。
  107. 如請求項104所述之方法，其中該劑量為約2 × 10 13個基因組複本/mL。
  108. 如請求項101至103中任一項所述之方法，其中該rAAV顆粒的有效量係約1 × 10 8至約2 × 10 14個基因組複本/kg體重的劑量。
  109. 如請求項108所述之方法，其中該劑量為約5 × 10 13個基因組複本/kg體重。
  110. 如請求項108所述之方法，其中該劑量為約1 × 10 14個基因組複本/kg體重。
  111. 如請求項108所述之方法，其中該劑量為約2 × 10 14個基因組複本/kg體重。
  112. 一種用於治療有需要的哺乳動物的肌強直性營養不良1型（DM1）的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項91至93中任一項所述之組成物。
  113. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物中的失養性肌強直蛋白激酶（DMPK）表現的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項91至93中任一項所述之組成物。
  114. 一種用於抑制有需要的患有DM-1的哺乳動物的細胞中DMPK RNA的積聚的方法，該方法包括向該哺乳動物投與有效量的如請求項91至93中任一項所述之組成物。
  115. 如請求項98至100中任一項所述之方法，其中該RNAi與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該RNAi投與之前、同時和/或之後投與。
  116. 如請求項101至103中任一項所述之方法，其中該病毒顆粒或該rAAV顆粒與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該病毒顆粒或該rAAV顆粒投與之前、同時和/或之後投與。
  117. 如請求項112至114中任一項所述之方法，其中該組成物與免疫抑制劑組合投與，其中該免疫抑制劑在該組成物投與之前、同時和/或之後投與。
  118. 如請求項98至117中任一項所述之方法，其中投與如請求項1至22和77至90中任一項所述之rAAV顆粒、如請求項23至61中任一項所述之表現盒、如請求項75所述之載體、如請求項91至93中任一項所述之組成物或如請求項94至97中任一項所述之套組，其中在投與後測量基因轉錄物的剪接。
  119. 如請求項118所述之方法，其中該等基因轉錄物的剪接係治療功效的量度。
  120. 如請求項118或119所述之方法，其中與同等健康組織相比，該等基因轉錄物的剪接為約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%。
  121. 如請求項118至119中任一項所述之方法，其中測量的該等基因轉錄物包括選自MBNL1、SOS1、PKM、zTTN、GOGLA4、CLASP1、LDB3、MBNL2、SPAG9、DNA酶I、TNNT3和ZBTB49的基因中之一或多種。
  122. 一種包含重組腺相關病毒（rAAV）載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3'包含以下核酸： AAV2 ITR， 編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸， Byrne結蛋白強化子元件， Paulin結蛋白強化子元件， 結蛋白啟動子， 兔β-球蛋白內含子的5’臂， 5' miR155支架序列， DMPK 204miRNA指導序列， miR155末端環序列， DMPK 204miRNA乘客序列， 3' miR155支架序列， 兔β-球蛋白內含子的3’臂， 最小牛生長激素聚腺苷酸化序列， 編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和 AAV2 ITR； 並且其中該衣殼包含含有SEQ ID NO: 50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
  123. 一種包含重組腺相關病毒（rAAV）載體和衣殼的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3'包含以下核酸： AAV2 ITR， 編碼來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸， Byrne結蛋白強化子元件， Paulin結蛋白強化子元件， 結蛋白啟動子， 兔β-球蛋白內含子的5’臂， 5' miR155支架序列， DMPK 204miRNA指導序列， miR155末端環序列， DMPK 204miRNA乘客序列， 3' miR155支架序列， 兔β-球蛋白內含子的3’臂， 最小牛生長激素聚腺苷酸化序列， 編碼來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和 AAV2 ITR； 並且其中該衣殼包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
  124. 一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3'包含以下核酸： 包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR， 編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸， 包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件， 包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件， 包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子， 包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂， 包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列， 包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列， 包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列， 包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列， 包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列， 包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂， 包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列， 編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和 包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR； 並且其中衣殼包含含有SEQ ID NO: 50的胺基酸序列的衣殼蛋白。
  125. 一種包含rAAV載體的rAAV顆粒，其中該rAAV載體從5'至3'包含以下核酸： 包含SEQ ID NO:43的多核苷酸序列的AAV2 ITR， 編碼包含SEQ ID NO:18的多核苷酸序列的來自人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸， 包含SEQ ID NO:21的多核苷酸序列的Byrne結蛋白強化子元件， 包含SEQ ID NO:22的多核苷酸序列的Paulin結蛋白強化子元件， 包含SEQ ID NO:23的多核苷酸序列的結蛋白啟動子， 包含SEQ ID NO:14的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的5'臂， 包含SEQ ID NO:40的多核苷酸序列的5' miR155支架序列， 包含SEQ ID NO:4的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA指導序列， 包含SEQ ID NO:6的多核苷酸序列的miR155末端環序列， 包含SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的DMPK 204miRNA乘客序列， 包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列的3' miR155支架序列， 包含SEQ ID NO:15的多核苷酸序列的兔β-球蛋白內含子的3'臂， 包含SEQ ID NO:16的多核苷酸序列的最小牛生長激素聚腺苷酸化序列， 編碼包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列的來自該人類SerpinA1基因的填充核酸序列的核酸，和 包含SEQ ID NO:49的多核苷酸序列的AAV2 ITR； 並且其中衣殼包含含有SEQ ID NO: 52的胺基酸序列的衣殼蛋白。
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