TW202430633A - 新穎的ｈｉｖ－１變異體及其在動物激發模型中的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於能夠感染梟猴（owl monkey）之經基因修飾之HIV-1變異體，其包括一個或多個新穎的點突變以及病毒感染因子（Vif）基因的置換。
Description
本發明係關於新穎的經基因修飾之人類免疫缺乏病毒-1（HIV-1）變異體。在一個較佳實施例中，本發明之HIV-1變異體可用於靈長類動物激發模型中，以開發疫苗及其他治療劑。
在過去40年中，全球每100人中就有1人感染了HIV-1（根據世界衛生組織，已超過8400萬人）。HIV-1感染從不會自行消退，且若不持續治療，則終會致命。約有一半的感染個體已死亡，而另一半感染個體目前存活且處於慢性感染狀態。目前不存在疫苗以保護免遭此病毒，且全球每年約有150萬例新的感染。開發HIV-1疫苗之最大阻礙為缺乏有效的動物模型系統。在動物模型中，一個模型將被投與候選疫苗，讓免疫系統起反應，且隨後用HIV-1激發動物。然而，HIV-1不感染任何猴或嚙齒動物物種，因此激發步驟始終為不可能的。獼猴模型經過數十年的深思熟慮才得以開發，但獼猴亦無法感染HIV-1，僅感染其同源猿猴免疫缺乏病毒（SIVmac）。已製成混合HIV-SIVmac病毒（稱為SHIV），但目前最先進的SHIV的基因體仍僅有30%衍生自HIV-1。SHIV往往僅編碼HIV-1基因體之Env（表面蛋白）部分，因此其僅可充當基於Env免疫原之疫苗的激發病毒。此領域中的領導者已注意到，一種其全部或至少大部分病毒基因體衍生自HIV-1之動物模型將克服[獼猴/SIV]模型的許多侷限性。此前，人們曾製造出一種在獼猴中複製的最小修飾形式之HIV-1，但該模型需要長期的免疫抑制（CD8+ T細胞耗竭），且因此尚未得到積極的研究。因此，長期以來需要一種可用作激發動物模型之可行的HIV-1變異體，以便能夠測試更多樣化的治療方法，包括針對HIV-1之新穎藥物及疫苗。
如下文所描述，本發明之新穎的HIV-1變異體有助於長期尋求的動物模型，以便對疫苗及治療劑進行評估，且亦將作為HIV-1傳播及發病機制的首個靈長類動物模型。
本發明描述HIV-1之首個免疫勝任動物模型。在一較佳實施例中，本發明包括使用梟猴（owl monkey）之HIV-1的免疫勝任動物模型。此等動物特別適用，因為其展現人類中可見之HIV-1感染之所有關鍵標誌：急性感染、血清轉化、淋巴球反應及潛伏儲庫之建立。因此，梟猴可充當長期尋求之HIV-1模型且將為疫苗及治癒的開發以及研究HIV-1傳播、免疫及控制提供一個令人興奮的新平台。在一個範疇中，本發明包括能夠感染梟猴之經基因修飾之HIV-1變異體。在一個較佳範疇中，梟猴感染有實質上為野生型的本發明之HIV-1變異體。在一個較佳範疇中，本發明之HIV-1變異體包括多個新穎的點突變以及病毒感染因子（Vif）基因的置換。
本發明包括經組態以感染梟猴之HIV-1變異體，該等變異體可選自以下病毒株：依本文所描述，HIVom1（ATCC專利寄存號PTA-127572）、HIVom1*（ATCC專利寄存號PTA-127575）、HIVom2（ATCC專利寄存號PTA-127574）及HIVom2*（ATCC專利寄存號PTA-127573），在本文中亦稱為HIVom v1.4或NLRP+4。
在一個範疇中，本發明包括一種HIV-1變異體，其經基因修飾以感染秘魯夜猴（
Aotus nancymaae）（梟猴），其中該HIV-1變異體包括根據SEQ ID NO. 3或其片段或變異體之經基因修飾之衣殼肽，該經基因修飾之衣殼肽具有以下突變：ΔH87突變；A88P突變；A92P突變；P93A突變。
在一較佳實施例中，HIV-1變異體經進一步基因修飾以使得內源病毒感染因子（Vif）被破壞或經猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif）置換，該SIVVif可選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7，或其片段或變異體。在此較佳範疇中，SIVVif插入Pol區之上游及Vpr區之下游。
在一個範疇中，本發明包括一種HIV-1變異體，其經基因修飾以感染秘魯夜猴（梟猴），其中該HIV-1變異體包括衣殼肽、Tat肽或Env Env的一個或多個額外突變，其中突變係選自：在HIV-1衣殼蛋白之位置120處進行取代的精胺酸；在HIV-1 Tat蛋白之位置58處進行取代的蘇胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置9處進行取代的精胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置10處的色胺酸；及在HIV-1 Env蛋白之位置545處進行取代的甘胺酸；或在HIV-1 Env蛋白之位置167處進行取代的甘胺酸；或以上突變之組合。
本發明之額外範疇包括梟猴，其經本文所描述之HIV-1變異體中之一者或多者活體內、離體或活體外感染。
本發明之額外範疇將基於下文提供之說明書、圖式及申請專利範圍變得顯而易見。
相關申請案之交叉參考
此國際PCT申請案主張2022年12月7日申請之美國臨時申請案第63/413,003號及2023年6月21日申請之美國臨時申請案第63/522,321號之權益及優先權，該等之說明書、申請專利範圍及附圖以全文引用之方式併入本文中。
政府利益
本發明係在政府支持下在由美國國家衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）授予的授權號DP1-DA-046108下進行。美國政府對本發明可擁有某些權利。
序列表
本申請案含有電子序列表之內容（________-_________.xml；大小：______位元組；及創建日期：2023年______月______日），其以全文引用之方式併入本文中。
寄存資訊
HIV病毒株ATCC專利寄存號PTA-127572（在本文中亦被稱作HIVom1、HIVom v1.1或NLRM）、ATCC專利寄存號PTA-127575（在本文中亦被稱作HIVom1*、HIVom v1. 2或NLRM+4）、ATCC專利寄存號PTA-127574（在本文中亦被稱作HIVom2, HIVom v1.3或NLRP）及ATCC專利寄存號PTA-127573（在本文中亦被稱作__________或NLRP+4）已寄存在一個國際儲藏所，其條件係保證在本專利申請案及由此發佈的任何專利的有效期內，由專利及商標局局長根據37 C.F.R. 1.14及35 U.S.C. 122確定有權獲得該培養物的人可以獲得該培養物。此等病毒株已寄存在美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），地址為10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110-2209 United States of America。
本發明人在本文中描述首個感染有HIV-1之猴物種，秘魯夜猴（梟猴）。梟猴係一種小型溫順動物，可忍受清醒時抽血，無人畜共通病原體，且繁殖速度比獼猴快得多。梟猴經HIV-1修飾之變異體感染，該變異體包括異源病毒感染因子（Vif）且進一步包括衣殼肽（CA）之親環素結合環中或其附近之點突變組合，但在其他情況下為100%未改變之HIV-1。特定言之，為感染梟猴，本發明人用八至九個非同義點突變修飾HIV-1且置換Vif輔助基因。值得注意地，病毒仍為93%野生型（與NL4-3之GenBank寄存號相比：AF324493，SEQ ID NO. 1）。
此等相對較小的修飾允許病毒繞過梟猴APOBEC3及TRIM-Cyp限制因子。由於SHIV僅包括約30%之HIV-1基因體，所以梟猴模型係一個巨大的進步，因為其模型化了HIV-1本身，以及與體液免疫性及細胞介導免疫性相關的所有抗原決定基，重要的是包括了CD8+ T細胞。重要的是，梟猴感染有HIV-1後能重現人類的感染情況：急性感染期內血漿病毒血症高達10
7個複本/毫升，隨後病毒得到控制及發生血清轉化。此模型將首次實現在靈長類動物模型中研究HIV-1且為疫苗及治癒開發提供了一個令人興奮的新平台。
對於免疫研究及對於疫苗開發，本發明模型比先前SHIV模型更先進。現在清楚的是，基於抗體之免疫性及CD8+ T細胞之免疫性對於HIV-1保護及控制係至關重要的。抗體可以多種方式抵抗病毒，且CD8+ T細胞對於殺死感染HIV之細胞而言係至關重要的。然而，在SHIV中，僅存在約30%的HIV-1基因體（基本上僅為Env）。因此，SHIV並不含有與體液及細胞介導之免疫性相關的所有抗原決定基。如梟猴之真實HIV-1激發模型可以能夠測試除Env免疫原以外的更多樣化的疫苗方法。此外，梟猴模型正確地捕獲HIV-1感染中之所有關鍵事件：傳播、急性感染、血清轉化及潛伏儲庫之建立。此外，本發明人已確立高品質梟猴基因體項目，且已鑑別且最佳化在此物種中HIV-1研究所需的必需試劑、抗體及診斷劑。在一個較佳實施例中，本發明可包括產生代表全球主要亞型之傳播-創始（T/F）病毒（開始新感染之病毒）。該病毒對於在此新模型中研發疫苗及治癒而言可為至關重要的，且亦允許研究HIV-1傳遞、保護性免疫及潛伏儲庫之其他範疇。
本發明之另一實施例包括創建經本發明之一種或多種新穎HIV-1型變異體感染之新穎HIV-1模型動物，且較佳為梟猴。本發明可進一步包括篩選或測試一種或多種潛在治療化合物或針對HIV-1之其他療法之功效的方法。在一個較佳實施例中，可建立一種轉殖基因非人類動物，且較佳地為梟猴，其可感染本發明之一種或多種新穎HIV-1變異體，亦即展現出至少一種與HIV-1感染相關之表型的HIVom1、HIVom1*、HIVom2或HIVon2*。
接著，且較佳可向動物投與治療有效量之針對治療與HIV-1相關之一種或多種病理性表型的治療化合物，以確定治療化合物是否減少與HIV-1相關之一種或多種表型，且將任何表型變化與未接受治療化合物之動物進行比較。投與可經由多種途徑完成，包括經口、經鼻、注射及其類似途徑。此外，治療化合物可包括一種或多種小分子，諸如蛋白質功能或基因表現之抑制劑，或可包括一種或多種生物治療劑，諸如基於單株或其他抗體之治療。在一較佳實施例中，治療化合物可包括針對HIV-1之疫苗。值得注意的是，治療化合物可為具有醫藥載劑之醫藥組合物的一部分，該醫藥載劑將為一般熟習此項技術者所知。
本發明包括經組態以感染梟猴之多個HIV-1變異體，該等變異體可選自以下病毒株：依本文所描述，HIVom1（ATCC專利寄存號PTA-127572）、HIVom1*（ATCC專利寄存號PTA-127575）、HIVom2（ATCC專利寄存號PTA-127574）及HIVom2*（ATCC專利寄存號PTA-127573）。
在一個實施例中，本發明之新穎HIV-1變異體包括在親環素結合環處或其附近具有一個或多個突變之經基因修飾之衣殼肽。在此較佳實施例中，親環素結合環之一個或多個突變可位於根據SEQ ID NO. 3之親環素結合環的位置87與93之間，且較佳為根據SEQ ID NO. 3之親環素結合環的位置87、88、92及/或93，且甚至更佳地：
− 在該親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失；
− 在該親環素結合環之位置88處進行取代的脯胺酸；
− 在該親環素結合環之位置92處進行取代的脯胺酸；
− 在該親環素結合環之位置93處進行取代的丙胺酸；或
− 或根據SEQ ID NO. 3之位置87與93之間的任何保守胺基酸取代。
在此較佳實施例中，親環素結合環位置之突變包含胺基酸序列SEQ ID NO. 9中所體現的胺基酸缺失或取代，其中該等突變包括：
− ΔH87突變，其中在該親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失；
− A88P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換；
− A92P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換；及
− P93A突變，其中該親環素結合環之脯胺酸經丙胺酸殘基置換；或
− 或根據SEQ ID NO. 3之位置87-88及92-93的任何保守胺基酸取代。
在某些替代實施例中，本發明可包括一種醫藥組合物，其包含一種或多種具有根據胺基酸序列SEQ ID NO. 9或11之衣殼蛋白的HIV-1變異體，及醫藥學上可接受之載劑。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼根據胺基酸序列SEQ ID NO. 9或11之經基因修飾之衣殼肽，該核苷酸序列可進一步併入至表現載體中。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼包括根據胺基酸序列SEQ ID NO. 9或11之經基因修飾之衣殼肽的HIV變異體，該核苷酸序列可進一步併入至表現載體中。
本發明包括具有異源病毒感染因子（Vif）之新穎HIV-1變異體。在一較佳實施例中，本發明之HIV-1變異體經基因修飾以用異源Vif（較佳選自猿猴免疫缺乏病毒（SIVVif））置換野生型Vif（SEQ ID NO. 2）。在一個實施例中，本發明之SIVVif係選自：SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7，或具有至少85%序列同源性之序列，或其片段或變異體。在此實施例中，SIVVif插入Pol區之上游及Vpr區之下游，使得SIVVif包括插入Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子以及插入Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞，例如經由定點誘變。在此組態中，HIV-1變異體可進一步經修飾，使得位於Vif/Vpr重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞，且進一步使一個或多個位於Pol/Vif重疊區內之起始密碼子被破壞。
在某些替代實施例中，本發明可包括一種醫藥組合物，其包含一種或多種HIV-1變異體，其具有根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7之異源SIVVif蛋白，或具有至少85%序列同源性之序列，或其片段或變異體，及醫藥學上可接受之載劑。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7之SIVVif蛋白，或具有至少85%序列同源性之序列，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼HIV-變異體，該HIV變異體包括根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7之SIVVif蛋白，或具有至少85%序列同源性之序列，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。
本發明包括具有調節變異體之感染性之一個或多個突變的新穎HIV-1變異體。在一較佳實施例中，本發明之一個或多個突變存在於衣殼蛋白、Tat蛋白及包膜（Env）蛋白中。在此實施例中，本發明之新穎HIV-1變異體包括一個或多個選自以下之突變：
− 在根據SEQ ID NO. 3之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處的取代突變；
− 在根據SEQ ID NO. 4之該HIV-1 Tat蛋白的位置58處的取代突變；
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置9或10處的取代突變；
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置545處的取代突變；
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置167處的取代突變；或
− 以上突變之組合。
在其他實施例中，本發明之新穎HIV-1變異體包括一個或多個選自以下之突變：
− 在根據SEQ ID NO. 3之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處進行取代的精胺酸；
− 在根據SEQ ID NO. 4之該HIV-1 Tat蛋白的位置58處進行取代的蘇胺酸；
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置9處進行取代的精胺酸；
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置10處的色胺酸；及
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置545處進行取代的甘胺酸；或以上突變之組合。
− 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置167處進行取代的甘胺酸；或以上突變之組合。
在其他實施例中，本發明之新穎HIV-1變異體包括一個或多個選自以下之突變：
− 根據SEQ ID NO. 10之該HIV-1衣殼蛋白的H120R取代；
− 根據SEQ ID NO. 12之該HIV-1 Tat蛋白的A58T取代；
− 根據SEQ ID NO. 13之該HIV-1 Env蛋白的H9R取代；
− 根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的L10W取代；
− 根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的D545G取代；
− 根據SEQ ID NO. 20之該HIV-1 Env蛋白的D167G；或
− 以上突變之組合。
值得注意的是，在一些實施例中，未經修飾之鹼基可為可變的且包括一個或多個保守取代，使得在一些實施例中，本發明可包括衣殼或本文所描述之其他經修飾之肽，其中點突變或缺失為保守性的，但插入序列可包括與其具有至少85%至99%之間的序列同源性的序列。
在某些替代實施例中，本發明可包括一種醫藥組合物，其包含一種或多種具有一種以上蛋白質之HIV-1變異體，該一種或多種HIV-1變異體係選自：
− 根據SEQ ID NO. 10之該HIV-1衣殼蛋白的H120R取代；
− 根據SEQ ID NO. 12之該HIV-1 Tat蛋白的A58T取代；
− 根據SEQ ID NO. 13之該HIV-1 Env蛋白的H9R取代；
− 根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的L10W取代；
− 根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的D545G取代；
− 根據SEQ ID NO. 20之該HIV-1 Env蛋白的位置167處進行取代的甘胺酸；
− 以上突變之組合；及
− 醫藥學上可接受之載劑。
在其他實施例中，本發明可包括一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼一種或多種具有以下之蛋白質：在HIV-1衣殼蛋白之位置120處進行取代的精胺酸；在HIV-1 Tat蛋白之位置58處進行取代的蘇胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置9處進行取代的精胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置10處的色胺酸；及在HIV-1 Env蛋白之位置545處進行取代的甘胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置167處進行取代的甘胺酸；或以上突變之組合，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。在其他實施例中，本發明可包括一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼包括一種或多種具有以下之蛋白質的HIV變異體：在HIV-1衣殼蛋白之位置120處進行取代的精胺酸；在HIV-1 Tat蛋白之位置58處進行取代的蘇胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置9處進行取代的精胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置10處的色胺酸；及在HIV-1 Env蛋白之位置545處進行取代的甘胺酸；在HIV-1 Env蛋白之位置167處進行取代的甘胺酸；或以上突變之組合，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。
在某些替代實施例中，本發明可包括一種HIV-1變異體，其具有一種或多種根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6-20之蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼一種或多種根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6-20之蛋白質，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼包括一種或多種根據胺基酸序列SEQ ID NO. 10-16之蛋白質的HIV變異體，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。
本發明包括一種或多種適於感染秘魯夜猴（梟猴）之經基因修飾之HIV-1變異體。本發明之HIV-1變異體包括根據SEQ ID NO. 3之經修飾之衣殼肽，其中親環素結合環經結合親環素結合環猿猴免疫缺乏病毒（SIV）取代，且在一較佳實施例中為猿猴免疫缺乏病毒（SIV）。在一較佳實施例中，適於感染梟猴之本發明之HIV-1變異體包括根據SEQ ID NO. 9之經修飾之衣殼肽，其可編碼具有親環素結合環之衣殼肽，該親環素結合環具有以下突變：
− ∆H87突變，其中在該親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失；
− A88P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換；
− A92P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換；
− P93A突變，其中該親環素結合環之脯胺酸經丙胺酸殘基置換；及
− 插入Pol區之上游及Vpr區之下游的異源猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif），其選自：SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7、或具有至少85%-99%序列同源性之序列。
在此實施例中，本發明之SIVVif可包括插入Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子，及插入Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞。另外，可破壞位於Vif/Vpr及Pol/Vif重疊區內之一個或多個起始密碼子。
在某些替代實施例中，本發明可包括一種HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑，該HIV-1變異體具有根據SEQ ID NO. 9之經修飾衣殼肽，及根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7之SIVVif蛋白質，或具有至少85%序列同源性之序列。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼根據SEQ ID NO. 9之經修飾衣殼肽，及根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7之SIVVif蛋白質，或具有至少85%序列同源性之序列，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。在其他實施例中，本發明可包括可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼HIV變異體，該HIV變異體包括根據SEQ ID NO. 9之經修飾衣殼肽，及根據胺基酸序列SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7之SIVVif蛋白質，或具有至少85%序列同源性之序列，該核苷酸序列可進一步併入表現載體中。
本發明包括一種或多種適於感染秘魯夜猴（梟猴）之經基因修飾之HIV-1變異體。在一較佳實施例中，本發明之HIV-1變異體包括根據SEQ ID NO. 9之經修飾之衣殼肽，其衣殼肽編碼具有以下突變之親環素結合環：ΔH87突變，其中位置87處的組胺酸殘基缺失；A88P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換；A92P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換；P93A突變，以及猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif），其選自SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7、或具有至少85%序列同源性之序列，該SIVVif較佳插入Pol區之上游及Vpr區之下游，以及選自以下一個或多個額外突變：
− 根據SEQ ID NO. 10之該HIV-1衣殼蛋白的H120R取代；
− 根據SEQ ID NO. 12之該HIV-1 Tat蛋白的A58T取代；
− 根據SEQ ID NO. 13之該HIV-1 Env蛋白的H9R取代；
− 根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的L10W取代；
− 根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的D545G取代；
− 根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的D167G取代；或
− 或以上突變之組合。
在其他實施例中，本發明包括一種或多種適於感染秘魯夜猴（梟猴）之經基因修飾之HIV-1變異體。在一較佳實施例中，本發明之HIV-1變異體包括：
− 根據SEQ ID NO. 9-11之經修飾衣殼肽，或與SEQ ID NO. 9-11具有85%至99%序列同源性之序列；
− 猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif），其選自：SEQ ID NO. 6-7，或與SEQ ID NO. 6-7具有85%至99%序列同源性的序列；
− 及在保守突變之外的選自以下之一個或多個額外突變：
− 根據SEQ ID NO. 10之HIV-1衣殼蛋白或與SEQ ID NO. 10具有85%至99%序列同源性之序列的H120R取代；
− 根據SEQ ID NO. 12之HIV-1 Tat蛋白或與SEQ ID NO. 12具有85%至99%序列同源性之序列的A58T取代；
− 根據SEQ ID NO. 13之HIV-1 Env蛋白或與SEQ ID NO. 13具有85%至99%序列同源性之序列的H9R取代；
− 根據SEQ ID NO. 14之HIV-1 Env蛋白或與SEQ ID NO. 14具有85%至99%序列同源性之序列的L10W取代；
− 根據SEQ ID NO. 15之HIV-1 Env蛋白或與SEQ ID NO. 15具有85%至99%序列同源性之序列的D545G取代；
− 根據SEQ ID NO. 18之HIV-1 Env蛋白或與SEQ ID NO. 18具有85%至99%序列同源性之序列的D545G、H9R及L10W取代；或
− 根據SEQ ID NO. 19之HIV-1 Env蛋白或與SEQ ID NO. 19具有85%至99%序列同源性之序列的D167G取代；
− 根據SEQ ID NO. 20之HIV-1 Env蛋白或與SEQ ID NO. 20具有85%至99%序列同源性之序列的D545G、H9R、L10W及D167G取代。
在此實施例中，本發明之SIVVif可包括插入Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子，及插入Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞。另外，可破壞位於Vif/Vpr及Pol/Vif重疊區內之一個或多個起始密碼子。
如上文所指出，在本發明之其他實施例中，本發明之一種或多種HIV變異體可投與至哺乳動物以引起感染，其中該動物較佳為秘魯夜猴（梟猴）。其他實施例可包括使生物樣品（諸如來自梟猴之細胞、體液組織樣品）與本發明之一種或多種HIV變異體接觸。另外其他實施例可包括提取生物樣品，諸如來自暴露於或感染有本發明之一種或多種HIV變異體之梟猴的細胞、體液組織樣品。
在其他實施例中，本發明之一種或多種HIV變異體可投與至哺乳動物以引起感染，其中該動物較佳為秘魯夜猴（梟猴），且隨後可用野生型HIV-1變異體「激發」受感染之梟猴，且量測由此產生之免疫反應。
在其他實施例中，向哺乳動物且較佳為秘魯夜猴（梟猴）投與治療劑，諸如針對治療或預防HIV感染之醫藥組合物，且隨後可用本發明之HIV-1變異體「激發」受感染之梟猴，且量測由此產生之免疫反應。在一較佳實施例中，治療劑包含疫苗。
在其他實施例中，向哺乳動物且較佳為秘魯夜猴（梟猴）投與治療劑，諸如針對治療或預防HIV感染之醫藥組合物，且隨後可用本發明之HIV-1變異體「激發」受感染之梟猴，且量測由此產生之免疫反應。在一較佳實施例中，治療劑包含經組態以治療HIV感染之治療化合物，或經組態以預防HIV感染之預防性化合物。
提供以下定義以輔助讀者理解本發明之各種範疇。除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者所通常瞭解相同之含義。特定言之，細胞生物學及分子生物學中之常見術語之定義可見於以下：The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science有限公司出版，1994 (ISBN 0-632-02182-9)；Benjamin Lewin, Genes X，由Jones & Bartlett出版社出版，2009 (ISBN-10: 0763766321)；Kendrew等人（編）, Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers出版社出版，1995 (ISBN 1-56081-569-8)及Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan等人編。除非另有說明，否則本發明使用標準程序進行，例如以下中所描述：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001)；Davis等人, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995)；Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan等人編, John Wiley and Sons, Inc.)；Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino等人編, John Wiley and Sons, Inc.)；及Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique，由R. Ian Freshney著, 出版社：Wiley-Liss；第5版(2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology，第57卷，Jennie P. Mather及David Barnes編，Academic Press，第1版，1998)，該等之所有全部內容以引用之方式併入本文中。
如本文所用，「HIV-1」意謂人類免疫缺乏病毒1型。HIV-1包括（但不限於）細胞外病毒顆粒及與HIV-1感染細胞有關之HIV-1形式。亦如本文中所使用，「病毒」及/或「病毒粒子」可意謂HIV-1或HIV-1病毒顆粒或病毒肽亞單位。
HIV-1中之突變係指點突變、添加、缺失（但較佳不在裂解域中）及重排中之任一者。突變可發生在HIV-1基因體中之單個位點或多個位點。突變可由包括隨機突變誘發、靶向遺傳學及一般技術者已知之其他方法的標準技術來產生。
「醫藥組合物」為組合物，其包括某一量（例如單位劑量）之所揭示之化合物以及一種或多種無毒醫藥學上可接受之添加劑，包括載劑、稀釋劑及/或佐劑，及視情況存在之其他生物學活性成分。此類醫藥組合物可藉由標準醫藥調配物技術製備，諸如於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa.（第19版）中揭示的技術。在一個實施例中，本發明之醫藥組合物可包括某一量之HIV-1及醫藥學上可接受之載劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
此類醫藥組合物/調配物適用於活體內或離體向個體投與。醫藥組合物及調配物包括載劑或賦形劑以用於向個體投與。如本文所用，術語「醫藥學上可接受」及「生理學上可接受」意謂生物學上相容之調配物、氣體、液體或固體或其混合物，其適用於一種或多種投與途徑、活體內遞送或接觸。此類調配物包括與醫藥投與或活體內接觸或遞送相容的溶劑（水性或非水性）、溶液（水性或非水性）、乳液（例如水包油或油包水）、懸浮液、糖漿、酏劑、分散介質及懸浮介質、包衣、等張劑及吸收促進劑或延遲劑。水性及非水性溶劑、溶液及懸浮液可包括懸浮劑及增稠劑。此等醫藥學上可接受之載劑包括錠劑（有包衣或無包衣）、膠囊（硬的或軟的）、微珠、粉劑、顆粒劑及晶體。補充活性化合物（例如，防腐劑、抗細菌劑、抗病毒劑及抗真菌劑）亦可併入至組合物中。為方便起見，調配物可作為單位劑型製備或提供。一般而言，藉由使活性成分與液體載劑或細粉狀固體載劑或兩者均勻且緊密締合，且隨後在必要時使產物成形來製備調配物。舉例而言，錠劑可藉由壓縮或模製來製備。壓縮錠劑可藉由在適合機器中壓縮視情況與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合的呈自由流動形式之活性成分（諸如粉末或顆粒）而製備。模製錠劑可藉由使經惰性液體稀釋劑潤濕之粉末化合物之混合物在適合之設備中模製來產生。錠劑可視情況包覆包衣或刻痕，且可經調配以便提供其中活性成分之緩慢或控制釋放。
適合於本發明之組合物及方法之醫藥調配物及遞送系統為此項技術中已知的（參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 第20版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.；Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 第18版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.；The Merck Index (1996) 第12版, Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.；Ansel及Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 第11版, Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.；及Poznansky等人, Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano編, Oxford, N.Y., 第253-315頁）。舉例而言，醫藥組合物可視情況經調配以與特定投與途徑相容。例示性投與途徑包括向生物流體、免疫細胞（例如T或B細胞）或組織、黏膜細胞或組織（例如口腔、頰腔、陰唇、鼻咽、食道、氣管、肺、胃、小腸、陰道、直腸或結腸）、神經細胞或組織（例如神經節、運動或感覺神經元）或上皮細胞或組織（例如鼻、手指、耳、角膜、結膜、皮膚或真皮）投與。因此，醫藥組合物包括適用於活體內、離體（例如組織或器官移植）或活體外藉由各種途徑及遞送（局部、區域性或全身性）投與至任何細胞、組織或器官之載劑（賦形劑、稀釋劑、媒劑或填充劑）。
用於接觸或活體內遞送目標抑制劑之例示性投與途徑為足以達成所需治療效應之化合物的劑量，諸如可視情況調配的投與途徑包括吸入、呼吸、插管、肺內灌注、口服（經頰、舌下、黏膜）、肺內、經直腸、經陰道、子宮內、皮內、局部、真皮、非經腸（例如皮下、肌肉內、靜脈內、真皮內、眼內、氣管內及硬膜外）、鼻內、鞘內、關節內、腔內、透皮、離子導入、經眼、光學（例如角膜）、腺內、器官內及淋巴管內。
如本文所用，「治療有效量」意謂足以顯著誘發生理反應（諸如因動物（且較佳為梟猴）感染HIV-1所引起之免疫反應）的治療化合物的量。
如本文所用，術語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用以表示一連串胺基酸殘基，其彼此間藉由相鄰殘基之α胺基與羧基之間的肽鍵連接。術語「蛋白質」及「多肽」係指胺基酸（包括經修飾之胺基酸（例如磷酸化、糖化、醣基化等）及胺基酸類似物）之聚合物，不論其大小或功能。「蛋白質」及「多肽」通常在參考相對較大的多肽時使用，而術語「肽」通常在參考較小多肽時使用，但在此項技術中對此等術語之使用重疊。當提及基因產物及其片段時，術語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用。因此，例示性多肽或蛋白質包括基因產物、天然存在之蛋白質、同源物、異種同源物、同種同源物、片段及前述者之其他等效物、變異體、片段及類似物。
如本文所用，術語「核酸」或「核酸序列」係指併有核糖核酸、去氧核糖核酸或其類似物之單元的任何分子，較佳為聚合物分子。核酸可為單股或雙股。單股核酸可為變性雙股DNA中之一股核酸。替代地，其可為非衍生自任何雙股DNA之單股核酸。在一個範疇中，核酸可為DNA。在另一範疇中，核酸可為RNA。適合之核酸分子為DNA，包括基因體DNA或cDNA。其他適合之核酸分子為RNA，包括mRNA。值得注意地，當提供核苷酸序列時，相應胺基酸序列亦涵蓋於本發明及定義內。反之，當提供胺基酸序列時，相應核苷酸序列亦涵蓋於本發明及定義內。
「經分離」核酸分子為自至少一種污染核酸分子鑑別及分離之核酸分子，核酸分子與污染核酸分子在核酸之天然來源中通常締合。經分離之核酸分子不呈其於自然界中所發現之形式或設定。因此，經分離之核酸分子區別於在天然細胞中存在的核酸分子。
術語「基因」係指（a）含有編碼蛋白質（例如CA）之DNA序列的基因；（b）編碼蛋白質的任何DNA序列（例如，或突變CA基因胺基酸序列），及/或；（c）與蛋白質之編碼序列之互補序列雜交的任何DNA序列。在某些實施例中，術語包括編碼以及非編碼區，且較佳包括正常基因表現所必需的所有序列。
如本文所用，術語「基因體」係指HIV-1基因體，包括所有編碼、非編碼及調節元件。
如本文所用，「野生型」意謂不含異源重組DNA的細胞或生物體，該DNA表現如本文所描述之賦予增強性狀之蛋白質或元件。
「表現（Expression）」或「表現（expressing）」係指產生功能性產物，諸如由所引入的構築體、內源DNA序列或穩定併入的異源DNA序列產生RNA轉錄物。核苷酸編碼序列可包含介入序列（例如intrans）或可缺乏此類介入非轉譯序列（例如cDNA）。表現基因包括轉錄成mRNA且隨後轉譯成蛋白質之基因以及轉錄成RNA但不轉譯之基因（例如siRNA、轉移RNA及核糖體RNA）。該術語亦可指由以上DNA前驅體中之任一者產生的mRNA所產生的多肽。因此，核酸片段（諸如基因或基因之啟動子區）之表現可指核酸片段之轉錄（例如，轉錄產生mRNA或其他功能RNA）及/或RNA轉譯成前驅體或成熟蛋白（多肽）或兩者兼而有之。
術語「異源」係指與其環境而言外來的核酸片段或蛋白質。在核酸片段之情況下，此通常藉由將衍生自一個來源之此類片段引入至不同宿主中來實現。異源核酸片段，諸如插入宿主生物體的編碼序列，通常不存在於宿主生物體的基因補體中。如本文所用，術語「異源」亦指來源於同一生物體，但位於此生物體之基因體內的不同位置（例如非原生位置）的核酸片段。因此，生物體在其基因體內之正常位置上，以及在植物細胞的情況下，在細胞內之不同基因體中，例如在核基因體及色素體或粒線體基因體中，亦可能有超過通常數目的此類片段的複本。就其已插入或轉移至其中之生物體而言為異源的核酸片段有時被稱作「轉殖基因」。
當術語「可操作地連接」用於提及調節序列及編碼序列時，意指調節序列影響被連接的編碼序列的表現。「調節序列」或「控制元件」係指有助於真核細胞中類真核細胞mRNA之轉錄的核苷酸序列，及/或促進真核細胞中類真核細胞mRNA之輸出的核苷酸序列，及/或促進真核細胞中類核樣mRNA之吸收的核苷酸序列，及/或促進真核細胞中類核樣mRNA之轉譯的核苷酸序列。術語可另外涵蓋影響相關編碼序列之轉錄、RNA處理或穩定性或轉譯之時序及水平/量的核苷酸序列。調節序列可包括啟動子、轉譯前導序列、內含子、強化子、莖-環結構、抑制因子結合序列、終止序列、聚腺苷酸化識別序列及其類似物。特定調節序列可位於與其可操作地連接之編碼序列的上游及/或下游。此外，與編碼序列可操作地連接之特定調節序列可位於雙股核酸分子之相關互補股上。如本文所用，術語「啟動子」係指DNA區，其可在轉錄起始的上游，且可涉及RNA聚合酶及其他蛋白質之識別及結合以起始轉錄。啟動子可操作地連接至用於在細胞中表現之編碼序列，或啟動子可操作地連接至編碼信號序列之核苷酸序列，該信號序列可操作地連接至用於在細胞中表現之編碼序列。
術語「啟動子」或「調節元件」係指區域或核酸序列，該區域或核酸序列位於轉錄起始上游或下游且其涉及RNA聚合酶及/或其他蛋白質之識別及結合以起始RNA轉錄。
「表現卡匣」或「表現載體」或「載體」係指核酸構築體，其在引入至宿主細胞中時分別引起RNA或多肽之轉錄及/或轉譯。更特定言之，術語「載體」係指可將DNA、RNA、蛋白質或多肽引入宿主中之一些方式。待引入宿主中之聚核苷酸、蛋白質及多肽在本質上可為治療性或預防性的；可編碼抗原或為抗原；在本質上可為調節性的等。存在各種類型的載體，包括病毒、質體、噬菌體、黏質體及細菌。同樣，更特定言之，「表現載體」係能夠在所選宿主細胞或生物體中複製的核酸。表現載體可作為自主結構進行複製，或可替代地將其全部或部分整合至宿主細胞染色體或細胞器之核酸中，或其用作用於將外來DNA遞送至細胞的梭子，且因此與宿主細胞基因體一起複製。因此，表現載體係能夠在所選宿主細胞、細胞器或生物體（例如質體、病毒、人工染色體、核酸片段）中複製的聚核苷酸且表現載體上之某些基因（包括所關注之基因）在細胞、細胞器或生物體內經轉錄且轉譯成多肽或蛋白質；或此項技術中已知之任何適合構築體，其包含「表現卡匣」。相比之下，如本文中之實例中所描述，「卡匣式」係含有本發明之表現載體之一部分的聚核苷酸。卡匣之使用幫助組裝表現載體。表現載體為複製子，諸如質體、噬菌體、病毒、嵌合病毒或黏質體，且其含有可操作地連接至表現控制序列之所需聚核苷酸序列。當表現控制序列控制及調節該聚核苷酸序列之轉錄及/或轉譯時，該聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列（例如啟動子及視情況選用之強化子）。
本發明涵蓋經分離或實質上經純化之HIV-1病毒粒子或其成分。「經分離」或「經純化」之HIV-1病毒粒子或其成分，實質上或基本上不含通常伴隨或與如在其天然存在之環境中發現之HIV-1病毒粒子或其成分相互作用的組分。因此，經分離或經純化之聚核苷酸或蛋白質實質上不含其他細胞材料或培養基（當由重組技術產生時），或實質上不含化學前驅體或其他化學物質（當化學合成時）。最佳地，「經分離」之聚核苷酸不含在衍生聚核苷酸之生物體之基因體DNA中天然地側接聚核苷酸（亦即，位於聚核苷酸之5'及3'端處之序列）的序列（最佳地，蛋白質編碼序列）。
「變異體」或「同功異型物」或「蛋白質變異體」係進行相同或類似生物作用的一組類似蛋白質的成員。舉例而言，本發明亦涵蓋所揭示之HIV-1聚核苷酸及由此編碼之胺基酸序列的片段及變異體。「片段」意指聚核苷酸之一部分或胺基酸序列之一部分。對於聚核苷酸，變異體包含在5'及/或3'端具有缺失（亦即，截短）之聚核苷酸；在天然聚核苷酸中之一個或多個內部位點處缺失及/或添加一個或多個核苷酸；及/或在天然聚核苷酸中之一個或多個位點處取代一個或多個核苷酸。一般而言，本文所揭示之特定HIV-1成分或基因體之變異體將與如本文其他地方所描述之序列比對程式及參數所測定之特定聚核苷酸具有至少約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列一致性。
值得注意地，揭示於中之所有肽均特定涵蓋具有保守胺基酸取代之肽。如本文所用，「保守性胺基酸取代」意指某些胺基酸可取代蛋白質結構中之其他胺基酸而不會顯著損失生物化學或生物活性的表現。由於蛋白質之相互作用能力及性質界定該蛋白質之生物學功能活性，因此可在蛋白質序列並且當然亦在其基本DNA編碼序列中進行某些胺基酸序列取代，而仍然獲得具有類似特性之蛋白質。因此，可在本文所揭示之胺基酸序列中或在編碼此等胺基酸序列之相應DNA序列中進行各種變化，而不會明顯損失其生物學效用或活性。
以此方式定義之胺基酸基團之實例包括：「帶電荷極性基團」，由麩胺酸（Glu）、天冬胺酸（Asp）、天冬醯胺（Asn）、麩醯胺酸（Gln）、離胺酸（Lys）、精胺酸（Arg）及組胺酸（His）組成；「芳族或環狀基團」，由脯胺酸（Pro）、苯丙胺酸（Phe）、酪胺酸（Tyr）及色胺酸（Trp）組成；及「脂族基團」，由甘胺酸（Gly）、丙胺酸（Ala）、纈胺酸（Val）、白胺酸（Leu）、異白胺酸（Ile）、甲硫胺酸（Met）、絲胺酸（Ser）、蘇胺酸（Thr）及半胱胺酸（Cys）組成。
在各組內，亦可鑑別亞組，例如帶電荷之極性胺基酸組可再分成由以下組成的亞組：由Lys、Arg及His組成的「帶正電荷之亞組」、由Glu及Asp組成的「帶負電之亞組」以及由Asn及Gin組成的「極性亞組」。芳族或環狀基團可再分成由以下組成的亞組：由Pro、His及Trp組成的「氮環亞組」；以及由Phe及Tyr組成的「苯基亞組」。脂族基團可再分成由以下組成的亞組：由Val、Leu及Ile組成的「大脂族非極性亞組」；由Met、Ser、Thr及Cys組成的「脂族弱極性亞組」；以及由Gly及Ala組成的「小殘基亞組」。保守突變之實例包括以上亞組中胺基酸之取代，例如Arg取代Lys，且反之亦然，使得可維持正電荷；Asp取代Glu，且反之亦然，使得可維持負電荷；Thr取代Ser，使得可維持游離-OH；及Asn取代Gin，使得可維持游離-NH2。
生物學功能上等效於本文所揭示之蛋白質及肽之蛋白質及肽包括在基本胺基酸序列中含有保守胺基酸變化之胺基酸序列。在此類胺基酸序列中，基本序列中之一個或多個胺基酸可經例如另一胺基酸取代，另一胺基酸之電荷及極性與天然胺基酸之電荷及極性類似，亦即保守性胺基酸取代，引起沉默變化。應注意，在此項技術中存在已開發許多不同分類系統，用以描述肽、多肽及蛋白質內胺基酸彼此之互換性。以下論述僅說明此等系統中之一些，且本發明涵蓋對一般熟習肽、多肽及蛋白質化學之技術者而言顯而易見的來自此等不同系統中之任一者的任何「保守性」胺基酸變化。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體（例如簡併密碼子取代）、互補（或補體）序列及反向補體序列，以及明確指示之序列。特定言之,簡併密碼子取代可藉由產生一個或多個（或所有）所選密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列達成（參見例如Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。由於核酸密碼子之簡併性，可使用各種不同的聚核苷酸來編碼一致多肽。下文表13含有關於哪些核酸密碼子編碼哪些胺基酸的資訊。
胺基酸核酸密碼子
| 胺基酸 | 核酸密碼子 |
| Ala/A | GCT, GCC, GCA, GCG |
| Arg/R | CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG |
| Asn/N | AAT, AAC |
| Asp/D | GAT, GAC |
| Cys/C | TGT, TGC |
| Gln/Q | CAA, CAG |
| Glu/E | GAA, GAG |
| Gly/G | GGT, GGC, GGA, GGG |
| His/H | CAT, CAC |
| Ile/I | ATT, ATC, ATA |
| Leu/L | TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG |
| Lys/K | AAA, AAG |
| Met/M | ATG |
| Phe/F | TTT, TTC |
| Pro/P | CCT, CCC, CCA, CCG |
| Ser/S | TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC |
| Thr/T | ACT, ACC, ACA, ACG |
| Trp/W | TGG |
| Tyr/Y | TAT, TAC |
| Val/V | GTT, GTC, GTA, GTG |
除非上下文另外明確指示，否則如在本文及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一（a/an）」及「該（the）」包括複數個指示物。因此，舉例而言，參考「植物」包括複數個此類植物；參考「細胞」包括熟習此項技術者已知之一個或多個細胞及其等效物，等等。類似地，除非上下文另外明確指示，否則字語「或」意欲包括「及」。因此，「包含A或B」意謂包括A，或B，或A及B。此外，術語「包括（including）」以及諸如「包括（includes）」及「包括（included）」之其他相關形式的使用不具限制性。
如本文中所使用，術語「約」為具有與「大約」或「幾乎」類似的含義之靈活字語。術語「約」指示不主張精確性，而是所涵蓋之變化。因此，如本文中所使用，術語「約」意謂在離特定敍述值1個或2個標準差內，或與特定敍述值相比，±至多20%、至多15%、至多10%、至多5%或至多4%、3%、2%或1%之範圍。
在本文中之請求項中所使用的「包含」之術語省略係開放性的，且意謂請求項必須具有其中特定敍述的所有特徵，但不妨礙未敍述的其他特徵亦存在。「包含」之術語使請求項具有開放性，可包括非特定成分，即使量較大。術語「基本上由……組成」在請求項中意謂本發明必須包括所列出之成分，且對未列出之成分開放，而該等成分不會實質上影響本發明之基本及新穎特性。「基本上由……組成」之請求項在以「由……組成」之形式寫成的封閉式請求項與以「包含」形式起草之完全開放式請求項之間處於中間立場。若必要且當此可變成必要時，此等術語在本文中可互換使用。此外，術語「包括（including）」以及諸如「包括（includes）」及「包括（included）」之其他相關形式的使用不具限制性。值得注意的是，在本申請案之說明書或其他部分係指聚核苷酸序列時，其亦可指對應蛋白質序列，且反之亦然。
現將參考以下實例更容易地理解本發明，該等實例僅出於說明本發明之實施例之某些範疇的目的而包括在內。實例不意欲限制本發明，如熟習此項技術者將自以上教示及以下實例認識到，其他技術及方法可滿足申請專利範圍且可在不背離所主張之本發明之範疇的情況下採用。實際上，雖然本發明已參照其較佳實施例特定展示及描述，但熟習此項技術者應瞭解，在不背離由隨附申請專利範圍涵蓋的本發明之範疇之情況下，可在其中做出形式及細節之各種改變。
實例實例1：背景、實驗概述及基本原理。
HIV/AIDS係一種持續的大流行病，除非研製出疫苗，否則不會停止。HIV-1之慢性及致命性質的關鍵在於病毒在人體內設立了受感染細胞的儲庫。HIV-1穩定整合至目標細胞之基因體中，且此等細胞隨後分裂且維持能夠產生感染HIV-1之細胞群體。因此，HIV-1疫苗誘導有效的非中和抗體及T細胞尤其重要，因為此等機制可殺死受感染細胞。反之，有效的HIV-1疫苗將可能不僅僅基於HIV-1之表面蛋白質（包膜蛋白，Env），因為基於Env的免疫原主要誘導中和抗體，該等抗體可阻斷游離病毒但不會殺死受感染細胞。
如上文所指出，HIV疫苗之開發的一個主要限制為當前疫苗激發模型（獼猴之SHIV感染），其僅允許對Env免疫原之測試。為開發有效的HIV-1疫苗，除了Env之外，亦需要不同的HIV-1免疫原，以及如何遞送。因為各HIV-1蛋白質中之抗原決定基可理論上誘導獨特的非中和抗體及T細胞，所以疫苗含有儘可能多的HIV-1蛋白質來作為免疫原係至關重要的。為了恰當地測試由候選疫苗誘導之免疫反應的廣度，激發病毒亦必須含有大部分或全部HIV-1基因體（且因此含有大部分或全部抗原決定基）。
本領域中之其他人已嘗試產生適用於HIV疫苗研發之動物模型。舉例而言，先前研究已研發出感染最低限度修飾之HIV-1的靈長類動物的單一模型。病毒起初設計成具有經取代之Vif且用於感染豬尾獼猴，其中病毒在豬尾獼猴CD4、Tetherin及MX2上進化出相容性（15，26）。猴中慢性CD8+ T細胞耗竭係該病毒達至高效價且進化出與豬尾獼猴之相容性所需要的。在經過4年多的適應及繼代之後，分離出一個病原性殖株。一個潛在問題為此病毒係在不存在CD8+細胞毒性T細胞的情況下進化的，其將可能使其對疫苗誘導之T細胞免疫過度敏感。迄今為止，此病毒在豬尾獼猴中尚未被證明可作為疫苗模型。
在本文中，申請人報告此HIV-1所需的靈長類動物模型的研發。完全免疫勝任型梟猴容易經HIV-1（序列中93%為野生型）感染，其以純化病毒形式經靜脈內投與或經由來自先前感染動物之輸血投與。梟猴感染再現了人類HIV-1感染之關鍵特徵：急性感染期血漿病毒血症高達10
7個複本/毫升，隨後病毒得到控制，血清轉化，且建立一個小型病毒儲庫，該儲庫中的病毒會反彈。因此，梟猴模型代表長期尋求的HIV-1疫苗之臨床前測試場。特定言之，申請人的發明允許在梟猴中測試疫苗以評估其能力：1）在急性期期間阻斷病毒複製，2）更快速地自體內清除病毒，及3）在隨後的數週及數月中，藉由地塞米松誘導之病毒反彈所量測，阻斷儲庫的形成。
如下詳述，在一個實施例中，HIVom1*為相對於使用SHIV之現有HIV-1疫苗模型的改良。SHIV為具有Env周圍區域經HIV-1基因體置換之SIVmac病毒株。即使最先進的SHIV，其基因體中僅有約30%來自HIV-1。相反地，申請人的經工程改造之病毒在序列上係93%的野生型HIV-1，且因此與將含有約30%之SHIV相比，將含有93%的與適應性免疫反應相關之HIV-1抗原決定基。此外，SHIV必須經調適以使其Env發生突變，從而能夠使用獼猴CD4，因為獼猴CD4不允許HIV-1進入。申請人已表明，此等Env適應性以尚未完全理解之方式改變了HIV-1之生物學。相比之下，梟猴CD4的行為與人類CD4相似，且對大部分HIV-1病毒株不存在阻礙。
實例2：梟猴對於HIV-1具有有利的宿主遺傳學。
CD4係HIV-1進入細胞之主要受體。申請人發現梟猴（秘魯夜猴）的CD4異種同源物支持HIV-1進入細胞，其與包括獼猴在內的大部分其他靈長類動物物種的CD4異種同源物不同，因此申請人首次對開發梟猴（秘魯夜猴）模型感興趣。申請人開始以MD安德森癌症中心（MD Anderson Cancer Center）圈養的南希馬夜猴（
A. nancymaae）群落展開工作，以評估該物種的其他遺傳特徵是否可能與HIV-1病毒相容。在自該群落採集191個個體的血液樣品後，申請人對三種編碼強大先天免疫蛋白的基因進行了基因分型，該三種基因已知可有效控制HIV-1的物種趨向性：Tetherin、APOBEC3G及TRIMCyp。關於其中的第一種，申請人發現了編碼8種不同Tetherin蛋白變異體的對偶基因，以上所有在阻斷HIV-1複製方面均為非功能性的（圖5），其與來自另一梟猴物種的報導一致。因此，梟猴具有兩個關鍵的基因優勢：CD4及Tetherin並不妨礙此等動物的HIV-1感染。
已知梟猴編碼細胞質蛋白質TRIMCyp，其有效阻斷HIV-1進入細胞。申請人在梟猴群落中發現TRIMCyp之37個獨特對偶基因，且除了一個例外（對偶基因8），此等TRIMCyp蛋白均有效抑制HIV-1（
圖 1A）。先前已展示在HIV-1衣殼的「親環素結合環」中引入G89V點突變可使HIV-1逃脫梟猴TRIMCyp的限制，但申請人發現此突變對病毒的適應性有很大影響（
圖 6）。因此，申請人試圖以更自然方式工程改造HIV-1以逃脫梟猴TRIMCyp；因此，申請人自5種猿猴免疫缺乏病毒（SIV）及一種P組HIV-1中取代親環素結合環（
圖 7），且確定了一種（來自紅帽白眉猴（red-capped mangabey）的SIVrcm）可繞過梟猴TRIMCyp（
圖 1B）。HIV-1與SIVrcm之親環素結合環（CBL）僅在4個位置處不同（
圖 1C），且將此等四個突變引入HIV-1中會引起強病毒適應性（
圖 6）。經修飾以僅含有此等四個突變之HIV-1在OMK（梟猴腎臟）細胞上穩固地複製（
圖 1D）。此最後一個結果係關鍵的，因為其揭示病毒生命週期所需的所有胞內宿主蛋白質之梟猴同源物（轉錄因子、轉運機制等）均支持HIV-1。此為出人意料的，但亦為偶然發現的。因此，申請人已鑑別了梟猴的三大天然屬性：CD4及Tetherin不為障礙，且所有細胞內輔助因子均能將HIV-1複製至高效價。此外，申請人僅需在HIV-1基因體中進行4個點突變，便能輕鬆繞過梟猴TRIMCyp限制因子。
儘管APOBEC3G不表現於OMK細胞中，但預期其亦阻斷初級梟猴T細胞中之HIV-1。申請人在群落中發現14種APOBEC3G對偶基因，其中四種係常見的。實際上，申請人發現此等四種APOBEC3G蛋白質確實為有效的HIV-1限制因子（
圖 1E ， 圖 8），HIV-1 Vif蛋白降解梟猴APOBEC3G的程度不如降解人類APOBEC3G（
圖 9）。申請人選殖來自42個HIV及SIV病毒株之Vif基因，且鑑別出若干降解梟猴APOBEC3G的基因（
圖 10）。感染實驗表明，來自兩種不同SIV（恆河猴（
Macaca mulatta，rhesus macaque）之SIVmac及豬尾獼猴（
Macaca nemestrina，pig-tailed macaque）之SIVmne）的Vif足以繞過梟猴APOBEC3G（
圖 1E 及圖 11）。
實例3：HIVom在活體內感染中的初步評估。
申請人隨後此將兩種限制因子繞過合併至單一HIV-1基因體中。自HIV-1分離株NL4-3（B分枝系，CXCR4-熱帶）之分子殖株開始，申請人在親環素結合環（來自SIVrcm）中引入了四個點突變，且用來自SIVmac或SIVmne的Vif置換HIV-1 Vif。此等病毒分別稱為HIVom1及HIVom2（
圖 1F）。此等兩種病毒之儲備由原病毒殖株產生，其接著用於梟猴之靜脈內接種實驗。下文中，各感染動物按以下定則命名：指示病毒，隨後連字符，以及感染該病毒之動物的順序指示符。因此，感染HIVom1之第一動物將命名為1/a且第二動物將為1/b。
兩隻梟猴感染有2.07×10
6個感染單位的HIVom1，且兩隻感染有1.27×10
6個感染單位的HIVom2（
圖 2A）。在本文中之所有動物實驗中，在一條後腿上進行感染，且隨後在約5分鐘後自另一條後腿上採血，作為圖中所示的零時間點。在長達30週（7個月）內所有動物接受每週抽血監測。為量測血漿病毒血症（亦即病毒負荷），申請人能夠利用現有HIV-1診斷之基礎設施，且將此等樣品傳送至華盛頓大學（美國西雅圖）的人類臨床HIV測試實驗室。明顯地，申請人已工程改造之病毒在所有四隻猴中進行複製。在各動物中，存在至少一個時間點，其中血漿病毒血症至少略有增加，其僅可藉由一些水平之病毒增殖來解釋（
圖 2A）。因此，申請人已在完全免疫勝任型靈長類動物宿主中實現活體內HIV-1複製。
HIV-1之關鍵特徵為其能夠在人與人之間有效地傳播。為了測試梟猴的傳播，將在第22週自動物1/a採集的血漿輸給動物1*/a（
圖 2B）。動物1*/a之初始血漿病毒血症經量測為526個病毒RNA複本/毫升，但在第2週及第8週之間擴大了5個對數。隨後將在第5週及第8週自動物1*/a採集的血漿分別輸給動物1*/b及1*/c。此等動物顯示適度至嚴重的病毒複製跡象（
圖 2B）。儘管申請人尚未探究性傳播，但申請人在此表明，HIV-1在個體間的靜脈內傳播係易於達成的。
由HIV-1疫苗誘導之免疫需要在感染的前幾天至數週內阻斷HIV-1，接著永久性地建立起持久的儲庫。因此，申請人隨後在梟猴上研究了人類早期感染HIV-1的四個關鍵特徵。人類感染之第一特徵為病毒複製以及在感染之後的最初10週內血漿病毒血症增加。同樣，所有七隻猴在前十週內至少一個時間點顯示出血漿病毒血症增加，其僅可在病毒活體內複製時解釋（
圖 2A 、圖 2B）。在兩種情況下，動物1*/a及1*/c之急性期病毒血症達到2.1×10
7及1.1×10
6個RNA複本/毫升，非常類似於人類之平均急性病毒峰值10
6.7個複本/毫升（範圍10
4.5至10
8.5）（11）。申請人注意到，當接種量較低時，急性激增更為明顯（
圖 2A 、 圖 2B），其表明，在接種量極其高的動物中，病毒激增在一定程度上被體內緩慢排出的大量病毒推注所遮蔽。人類感染之第二特徵為在偵測出最初的vRNA後平均14天（範圍1-48）出現針對HIV-1蛋白的抗體（血清轉化）（11）。梟猴之血清轉化係在華盛頓大學臨床診斷實驗室或使用FDA批准的偵測針對HIV-1 gp41/Env之抗體的定點照護診斷法（Abbott實驗室Determine檢定）對血漿進行量測的。七隻猴中之六隻猴以與人類類似之動力學進行血清轉化，而動物1/a的血清轉化更耗時（
圖 2A 、圖 2 B中的星形）。人類感染之第三特徵出現在感染急性期之後，其中人類將病毒控制至低水平，稱為「設定點」（11）。同樣，在感染後第12週所有七隻猴的血漿病毒血症控制在80個複本/毫升（虛線）或以下的檢定定量極限（
圖 2A 、圖 2B）。申請人應注意，在梟猴中觀測到的病毒設定點低於未經治療之人類，後者的病毒設定點中值為2.4×10
4個複本/毫升（範圍為320至1.0×10
6）（11）。最後，在人類中HIV-1在未知位置形成持久的感染細胞的儲庫。梟猴之病毒血症的極低設定點允許吾等開始探究此模型中之病毒儲庫之概念。在已實現病毒控制且在血流中未偵測到病毒之後，申請人將地塞米松投與至四隻猴中，持續約6週療程（
圖 2A 、圖 2B）。地塞米松可逆地耗竭血液淋巴球、NK細胞及B細胞（12）（
圖 20）。在所有四隻動物中，地塞米松治療導致病毒反彈回血液中，其水平超過了定量的極限（
圖 2A 、圖 2B 、圖 2D）。此等前七項實驗共同證明，梟猴如同人類，對HIV-1感染具有易感性，其經證實為血清轉化、血漿病毒血症時間點增加（表明病毒活體內複製）、地塞米松治療後病毒的控制及反彈以及個體間的傳播。
實例4：HIVom對梟猴的活體內適應性。
申請人隨後研究HIV-1在此等實驗期間是否獲得任何突變。藉由對動物1/a之PBMC中的整合原病毒進行定序，申請人能夠偵測到病毒基因體在第8週沒有發生突變，當時血漿病毒血症處於上升期（
表 1）。（由於申請人使用的係對原病毒進行桑格定序（Sanger sequencing），因此未偵測到低頻突變；其中此處報導的突變最初係在原病毒群體中固定觀測到的）。然而，在第35週，四個非同義突變似乎在病毒群體中固定：Tat中之A58T、Env gp41中之D545G、Env信號肽中之H9R及Env中之D167G。向動物1*/a之輸血發生在第22週，且在此第二隻動物中出現前兩個突變，而非後兩個突變，表明後兩個突變係在第22週後出現的。隨後動物1*/a出現若干個突變，包括L10W，該突變與先前在Env信號肽中觀測到的突變相差一個胺基酸。在此動物中第5週觀測到的6個突變（4個非同義突變及2個同義突變）在兩個時間點以及自動物1*/a抽血感染下一隻動物的16週內均保持穩定。在所有後續感染中，此等六個HIV-1突變均保持固定及穩定；在1*/b、1*/c或下文所描述後續實驗中使用的任何其他猴子中，亦未偵測到新的固定HIV-1突變。出於此報導之目的，自動物1*/a獲得之病毒（其中首次一起出現了所有六個突變）稱為HIVom1*，因為其為適應形式之HIVom1（
圖 2C）。自此向前，申請人專注於在其中4個非同義突變上，且將其建構至HIVom1的原病毒殖株中，以使得申請人就能創建出HIVom1*（適應病毒）的儲備。有趣的是，四個突變中之三個（除H120R外的全部）將由NL4-3編碼之胺基酸改變為另一個在HIV-1的傳播分離株中常見的胺基酸（
圖 12 至圖 15），表明儘管此等突變可能對梟猴具有適應性，但其並不損害病毒的HIV-1性質。
申請人隨後希望確定在活體內連續傳播期間出現之四個突變是否改良了病毒在梟猴中的複製。為此申請人用HIVom1及HIVom1*（適應型）之50:50混合物（各病毒9×10
5IU）感染四隻猴（1*/d、1*/e、1*/f、1*/g）。此實驗中之四隻動物代表不同年齡及兩種性別（
圖 3A）。應注意，此兩種病毒在人類T細胞上之複製同樣良好（
圖 3B）。若干發現表明由HIV-1獲得之四個突變適於此物種。首先，在所有四隻猴中，活體內適應型HIVom1*在1週後進入固定，且此後不再偵測到HIVom1（
圖 3C 、圖 16 至圖 19）。其次，申請人亦注意到，與感染原始HIVom1或HIVom2之動物相比，感染此適應型病毒之動物的血清轉化更快速。值得注意的是，血清轉化時間與感染動物之病毒劑量無關（
圖 21），而僅與病毒是否藉由此等四個點突變適應梟猴有關（
圖 3D）。第三，適應型病毒在兩隻動物（1*/d及1*/g）中達成更高設定點，持久血漿病毒血症超過80個複本/毫升之定量下限，長達8至9個月（
圖 3A）。至少在一些動物中，此適應型病毒現模擬更類似於人類的病毒設定點。在對此等兩隻動物進行屍檢時對病毒進行定序，且即使在進行數月的可偵測活體內複製之後，亦未在HIV-1中觀測到額外的突變。總體而言，在梟猴中在連續繼代期間由HIV-1獲得之4個突變似乎已完成對此物種之適應過程。
在此階段期間，在所有動物中，向此等動物中之三隻（1*/e、1*/f、1*/g）投與地塞米松且可偵測到HIV-1 RNA（
圖 3A）。在無其持久儲庫之情況下，HIV-1將係一種急性及非致命感染。鑒於此，申請人應注意在梟猴中可能建立的病毒儲庫的更多範疇。申請人總共用地塞米松治療7隻動物（
圖 2 、圖 3）。所有動物中的反彈病毒血症係適度的，其中峰值病毒血症係18,220（動物1/a，第6週）、92（動物1*/b，第5週）、612（動物1/b，第6週）、276（動物2/b，第5週）、258（動物1*/g，第5週）個病毒RNA複本/毫升，其中週數係指開始使用DEX治療後的週數。在最後兩隻動物（1*/e及1*/f）中，在DEX治療期間偵測到HIV-1 RNA，但其水平決不超出定量限制（
圖 3A）。此時所有申請人可說在投與地塞米松之時間點，HIV-1尚未自體內消除。將需要較長實驗以理解猴中之此儲庫的持久性，以及其是否真正地類似於人類中之長期儲庫。儘管需要更深的理解，但在5至6週的免疫耗竭之後產生的極其細微的病毒血症反映出相當小的儲庫。此與人類中觀測到的一致，其中感染極早期接受抗反轉錄病毒療法的人在停止抗反轉錄病毒療法後的中值26天內保持無病毒血症，其與正在用病毒重新填入身體的小型儲庫一致。如申請人在梟猴中所見，此類人的初始反彈極低（＜100個病毒複本/毫升）（13，14）。由此推測在一些HIV-1感染之個體中（該等個體在感染後不久用抗反轉錄病毒控制感染），僅200個感染細胞可能會構成儲庫（14）。因為存在極少細胞，所以鑑別此儲庫之解剖位置極其困難。然而，梟猴具有控制感染之敏銳能力，為可促進此類病理學研究提供動物模型。
申請人檢查了受感染之梟猴中的免疫反應及病理學。除一隻外（動物1*/c），所有猴產生中和抗體（
圖 4A）。所有動物發生血清轉化，且產生了可偵測之Env（gp41及gp120）的抗體，且兩隻感染有適應型HIVom1*的動物產生了CA（p24）的抗體（
圖 4B）。因為p24（衣殼）為內部病毒蛋白質，所以p24的抗體僅在細胞受感染之後形成。因此，申請人可表明此等生產性感染產生了適當的抗體反應，如在人體內所觀測到的一樣。申請人注意到一隻動物（1*/c）控制1.1×10
6個RNA複本/毫升的大規模急性病毒激增，卻從未產生中和抗體。此進一步證明了T細胞及非中和抗體對HIV-1的強大控制能力。
實例5：材料及方法。
梟猴群落之基因表徵。用Paxgene™血液RNA試管（BD Biosciences，762165）採集191隻圈養在MD安德森比較醫學與研究中心（MD Anderson Center for Comparative Medicine and Research）的梟猴的血液樣品。使用TRIzol（Invitrogen，15596018）自此等血液樣品中分離出RNA，且使用SuperScript IV First-Strand合成系統（Invitrogen，18091200）製備cDNA庫。然後使用基因特異性引子，用Q5高保真DNA聚合酶（New England BioLabs, M0491L）自cDNA中擴增CD4、CCR5、APOBEC3G、Tetherin及TRIMCyp。所有PCR產物均用核酸外切酶I（Affymetrix，70073）及重組蝦鹼性磷酸酶（rSAP，Affymetrix，78390）處理，且隨後用EZQuant dsDNA定量套組（螢光法（Fluorometric），BioVision，K900-2000）定量。此等產物藉由個體進行條形碼編碼，隨後以等莫耳量彙集，隨後對彙集的產物進行定序（Illumina MiSeq）。原始定序讀數如下處理。使用Trimmomatic（v0.36（27））修整配接器，生成成對末端及非成對修整讀數。FastQC（v0.11.7；（28））用於評估經修整的原始序列的品質。使用參考序列CD4（XM_021670978）、CCR5（XM_012470795）、APOBEC3G（NM_001308530）、Tetherin（XM_021669213）及TRIMCyp（XM_012456799）將定序讀數重新組裝成五個目標基因。利用BWA（v0.7.17（29））及Samtools（v1.6（30））產生索引參考序列。使用BWA-MEM（v0.7.17（arXiv:1303.3997v2 [q-bio.GN]））創建SAM檔案，將經修整的品質控制讀數映射至索引參考序列。使用Picard Tools（v2.6.0（
broadinstitute.github.io/picard/; Broad Institute））將SAM轉換為二進位BAM格式，且後續進行歸類及移除重複讀數。使用BCFtools（v1.8（31））中的mpileup演算法自標記BAM檔案生成含有基因型可能性的VCF檔案。使用BCFtools（v1.8）中的多對偶基因調用及罕見變異體調用模型創建了一個變異體調用集，先驗機率為1.1e-2，其後設置過濾器以排除QUAL＜20的位點。使用此變異體調用集及GATK（v3.7.0；（32））中之FastaAlternate ReferenceMaker函數，為各樣品及基因生成了單獨的FASTA檔案，其中均質SNP位點取置換各自的參考鹼基，而在異型接合位點則使用了IUPAC不定性程式碼。然後將含有不定性程式碼之FASTA檔案修整至各基因的編碼區，且使用Linux命令行公用程式命令按基因及個體進行操作合併。使DnaSP（v5.10.1，（33））對5個相關基因中之各者的序列資料進行了譜系非依賴性對偶基因定相。對偶基因定相隨後用梟猴群落之可獲得的譜系資訊進行了驗證，且藉由自cDNA庫中進行PCR擴增、選殖及藉由桑格定序對個別產物進行定序，最終確認了已鑑別的對偶基因。
產生 HIV-1 之經修飾形式的分子殖株 ：此研究中所用之病毒變異體係經由操縱編碼完全HIV-1原病毒之HIV-1 NL4-3
8（目錄號ARP-114，由M. Martin博士提供）質體構築的，該完整HIV-1原病毒經由NIH HIV試劑計劃（NIAID，NIH，AIDS部門）獲得。此質體產生感染性病毒。首先，申請人使用三個片段之Gibson選殖來構築體NL4-3之
Vif缺失版本（示意圖見於圖
22中）。在HIV-1基因體中，Vif與Pol上游及Vpr下游重疊Gibson選殖片段中之兩個係自原病毒中擴增的PCR產物，因此申請人獲得了自質體主鏈中的安比西林（ampicillin）抗性基因至Pol/Vif重疊（5'片段）以及自氨安比西林抗性基因至Vif/Vpr重疊（3'片段）的產物。5'及3'片段含有安比西林抗性基因座中之重疊序列。申請人藉由將此等PCR片段彼此接合且連接至跨越Pol/Vif重疊區至Vif/Vpr重疊區的Vif基因塊（在任一端上具有上文所描述之5'及3'片段的互補序列）來重構原病毒質體。在此情況下，Vif基因阻斷抹去所有ATG序列，包括Pol/Vif重疊區中之原始Vif起始密碼子，且在Vif開放閱讀框中含有284個鹼基對的內部缺失。
申請人亦使用三片段Gibson選殖來將NL4-3的Vif開放閱讀框取代為SIVmne（豬尾獼猴；Genbank U79412）或SIVmac（恆河猴；Genbank M19499）的Vif。如上產生5'及3'原病毒Gibson選殖片段。然而，在此情況下，基因塊包括來自SIVmne或SIVmac基因體之完全Vif開放讀數。在組裝之後，所得原病毒具有緊接在HIV-1 Pol終止密碼子下游之獼猴Vif的起始密碼子，以及緊接在HIV-1 Vpr之起始密碼子上游之獼猴Vif的終止密碼子（因此消除Pol/Vif及Vif/Vpr開放閱讀框重疊）（
圖 23）。該基因塊亦含有核苷酸取代以自Pol/Vif重疊區移除所有ATG序列，由此確保Vif僅自獼猴Vif起始密碼子轉錄。亦移除獼猴Vif內之原始Vpx起始密碼子以確保不產生雜交Vpx/Vpr蛋白質產物。
為了用SIVrcm（GAB）置換NL4-3 gag親環素結合環，申請人定購了長度為440 bp之gBlock，大致集中於親環素結合環上（
圖 1）。以具有插入SIVmac Vif或SIVmne Vif之修飾的NL4-3原病毒作為模板，對Gibson原病毒片段進行PCR擴增。此等PCR產物與含SIVrcm（GAB）親環素結合環之gBlock的5'及3'端重疊，且與質體上的安比西林抗性基因重疊。所得的含有Vif置換及親環素結合環交換的NL4-3殖株被命名為HIVom 1（來自SIVmac的Vif）及HIVom 2（來自SIVmne的Vif）。隨後使用HIVom 1構築了一個衍生殖株（稱為HIVom 1*），其中含有於梟猴活體內適應性期間出現的四個胺基酸取代。該殖株係使用基於網路的NEBaseChanger程式（https://nebasechanger.neb.com/）及NEB Q5定點誘變套組（New England Biolabs, E0554S）的標準方案設計的引子，經由四個連續SDM反應製成的。
工程改造 HIV-1 以 繞過梟猴 TRIMCyp ：使用逆反轉錄病毒載體轉導CRFK細胞，使其穩定表現各種梟猴TRIMCyp對偶基因（Alignment SX）。為產生反轉錄病毒載體，293T細胞以1×10
6個細胞/孔之濃度接種於6孔培養皿中。24小時後，使用標準TransIT-293方案（Mirus Bio，MIR 2705），用2 μg pLPCX質體（Takara目錄號631511；空質體或編碼所關注之TRIMCyp對偶基因的質體）、1 μg編碼MLV gag-pol的pCS2-mGP質體（34）及0.2 μg編碼VSV-G之pC-VSV-G質體轉染各孔。在48小時之後收集上清液，通過0.2 μm過濾器，且用於感染CRFK細胞。在24小時之後，添加含有8 μg/ml嘌呤黴素之培養基以選擇轉導細胞。使細胞株擴增且在嘌呤黴素中生長至少兩週，隨後藉由西方墨點法偵測TRIMCyp構築體之表現。
隨後用在親環素結合環中攜帶各種突變之VSV-G假型HIV-1假病毒感染此等細胞。使用表現HIV-1 gag-pol之pMDLg/pRRE質體（35）作為模板，以使用PfuTurbo DNA聚合酶（Stratagene，#600250）進行定點誘變，如中（36）所描述。親環素結合環序列可見於
圖 7中。藉由共轉染編碼病毒蛋白及VSV-G之質體以及轉運載體（pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G、pRRLSIN.cPPT、PGK-GFP.WPRE；均可自Addgene獲得）而將用於單週期感染檢定之病毒封裝於293T細胞中。在轉染之前，以1×10
6個細胞/孔之濃度將293T細胞接種至6孔盤中。48小時後，收集含有病毒之上清液，使用0.45微米過濾器過濾且冷凍。藉由量測沿著病毒上清液之體積梯度的GFP陽性細胞百分比，對穩定表現人類Trim5或梟猴Trim-Cyp蛋白質之CRFK細胞滴定病毒。對於感染分析，將CRFK穩定細胞株以7.5×10
4個細胞/孔之濃度接種於24孔盤中，且用HIV-1或親環素結合環突變體感染。感染後兩天，將細胞在2%多聚甲醛中固定15分鐘，用2 mL FACS緩衝液（補充有2% FBS及1 mM EDTA之DPBS）洗滌三次，再懸浮於500 μl FACS緩衝液中，且使用BD Accuri流式細胞儀藉由流式細胞測量術分析GFP的表現。計算各細胞株之GFP+細胞的百分比且相對於對照株中GFP+細胞之百分比進行標準化。所有感染均使用單一病毒儲備液一式三份進行，且所有結果均使用至少兩個實驗重複來確認。
工程改造 HIV-1 以繞過梟猴 APOBEC3G ：申請人篩選42種HIV-1及SIV Vif蛋白質，以評估其降解梟猴APOBEC3G的能力（
圖 10）。此等降解檢定揭露，來自SIVmne及SIVmac之Vif蛋白質可降解梟猴APOBEC3G。使用活體感染檢定，申請人測試此等Vif在各種APOBEC3G蛋白質存在下對HIV-1病毒產生之影響。四種主要梟猴APOBEC3G對偶基因之編碼序列自產生自血液之梟猴cDNA中進行PCR擴增。所使用的人類APOBEC3G序列與Genbank NM_021822匹配。將293T細胞以200,000個細胞/孔之濃度接種於24孔盤中。二十四小時後，將其用編碼APOBEC3G之質體（人類20 ng，梟猴200 ng）及編碼NL4-3 HIV-1原病毒變異體（NL4-3野生型、ΔVif、SIVmne Vif或SIVmac Vif）之300 ng質體共轉染。轉染後四十八小時，收集含有上清液之病毒且旋轉以移除細胞碎片（1,200×g，持續5分鐘）。將4 μl上清液添加至TZM-bl細胞中，前一天該等細胞以10,000個細胞/孔接種於96孔盤中。感染後四十八小時，用DPBS洗滌細胞，且再懸浮於被動溶解緩衝液（Promega，目錄號E194A）中，且在室溫下培育15分鐘。使用Promega螢光素酶分析系統（目錄號E1501）活化螢光素酶信號，且使用BioTek Synergy盤讀取器（目錄號S1LFA）進行偵測。
梟猴 之感染：在此研究中，梟猴感染有三種不同的病毒：HIVom1、HIVom2、HIVom1*。各病毒係由基於質體之全長HIV-1分子殖株如下產生。在轉染前一天，將13×10
6個293T細胞接種於15 cm組織培養皿中之無抗生素培養基中。第二天，使用標準Trans-IT 293轉染試劑方案（Mirus Bio，MIR 2705）轉染20 ug原病毒質體。轉染後六小時，自細胞移除培養基且置換為僅含3% FBS之完整DMEM。四十八小時後，自細胞移除培養基且旋轉（1200 g，5分鐘）以移除細胞碎片。含有病毒之上清液經由0.45 uM乙酸纖維素針筒過濾器澄清，接著經100 kDa Amicon管柱（Millipore UFC910024）濃縮。經濃縮之病毒藉由經20%蔗糖墊（在4℃下21,000×g，持續90分鐘）旋轉進一步純化。將病毒集結粒再懸浮於1 ml DPBS中且製備100 ml等分試樣以供將來使用。使用β-半乳糖苷酶檢定（（37）；與NIH HIV試劑項目條目ARP-1470相關之方案）對TZM-bl細胞滴定病毒。為確保經修飾之病毒能夠支持擴散感染，經由旋轉接種法（在30℃下500×g，90分鐘）以0.1的MOI感染表現CD4及CCR5兩者的SupT1細胞。每隔一天收集細胞上清液持續12至14天，冷凍且接著使用SG-pert檢定（38）以及藉由感染TZM-bl細胞後量測螢光素酶水平來測試病毒之存在。
用1.27×10
6個感染單位之HIVom2病毒或2.07×10
6個感染單位的HIVom1病毒感染猴子。或者，在競爭實驗之情況下，用與9.1×10
6個感染單位的HIVom1*病毒預混合之9.3×10
6個感染單位的HIVom1病毒感染猴子。所有感染均係靜脈內進行。使用參考抗體，對新鮮全血進行流式分析。
特殊生物安全 考量 ：由於此等動物實驗涉及一種可能會感染人類之病毒，因此所有儲備均首先藉由第三方實驗室（Vela實驗室）證實對標準PEP（暴露後預防）治療中使用的三種藥物具有敏感性。此確保任何暴露研究人員必要時可成功地用標準HIV-1 PEP治療。
測定病毒負荷及血清轉化 ：本文中之所有血漿病毒血症（病毒負荷）值係藉由華盛頓大學反轉錄病毒學實驗室（美國西雅圖）使用Abbott即時HIV-1 RNA檢定藉由RT-qPCR對血液樣品進行測定，未稀釋標本的定量範圍為40至10,000,000複本/毫升（梟猴標本在分析前經雙重稀釋）。所有血清檢定均在同一機構使用Geenius Reader（BioRad）進行，或在靈長類動物機構使用人類定點照護HIV測試套組（Determine HIV-1/2 Ag/Ab Combo測試，Abbott實驗室，目錄號：7D2648）進行。所有動物之所有血漿病毒血症及血清學值之完整對數均已核對，以供參考。
偵測梟猴 血漿中之中和抗體：測試梟猴血漿對HIVom1*的中和。根據圖標，在感染後之不同週數的抽血中分離血漿樣品。冷凍血漿樣品且在56℃下加熱不活化30分鐘。隨後將此等樣品以1:5混合於完整DMEM（+10% FBS，+L-麩醯胺酸，+P/S）中且連續2倍稀釋。隨後將此等稀釋液與HIVom1*（4000 IU/孔）1:1混合且使其在37℃下培育一小時。在1小時培育之後，移除TZM-bl細胞培養基（前一天將細胞以1.1×10
4個細胞/孔接種於96孔盤）且用病毒/血漿混合物置換。使樣品培育48小時，其後溶解細胞（Promega螢光素酶分析系統，目錄號E1500），且使用光度計量測RLU。未感染細胞用於校正背景螢光素酶活性。
對受感染 梟猴之 整合 HIV-1 原病毒進行 定序 ：在各感染期間自多個時間點自受感染梟猴獲取初級PBMC樣品，且提取基因體DNA（Qiagen，目錄號69504）。十二個引子對經設計用於巢式PCR以擴增來自整合原病毒DNA之六個獨立重疊擴增子（各自為900至2500 bp），使得呈現整個編碼蛋白之HIVom1病毒基因體。使用Q5
®高保真2X主混合物（NEB目錄號M0492S）進行PCR。使用Wizard® SV凝膠及PCR清除系統（Promega，目錄號A9281）對各巢式組擴增子的第一股進行凝膠提取，且所得產物在無核酸酶水中以1:100稀釋，然後用作第二輪PCR的模板。使用Quintara Biosciences（https://www.quintarabio.com/）的服務對第二輪擴增子的兩股進行桑格定序。由於HIVom1病毒在不同動物間繼代，因此在各動物之各時間點標記原病毒池中達到固定的SNP。除了手稿中提及的彼等突變外，另外兩個HIV-1突變（Env中之H9R及D167G）亦在第35週在動物1/a中固定，但此等突變在連續繼代後未出現在隨後的動物中，因此肯定係在第22週輸血給動物1*/a後出現的。
活體內 HIVom1 （ NLRM ） 與 HIVom1* （ NLRM+4 ） 病毒競爭檢定 ：用HIVom1及HIVom1*之50:50混合物感染四隻猴子。兩種病毒儲備液均由工程改造之原病毒分子殖株產生。四個研究動物用等量的吾人的最初經工程改造之HIVom1及HIVom1*（適應型）病毒共感染。隨後自各感染期間的早期及晚期時間點（感染後1至12週及14至38週）獲得至少四個PBMC樣品，且如先前描述提取gDNA。gDNA隨後用作原病毒DNA之巢式PCR及桑格定序的模板，如上文所描述。樣品在原始病毒與適應型病毒之間不同的四個位點處選擇性定序。在屍檢時，對gDNA進行病毒全長定序，以鑑別在感染期間可能出現的任何新突變。
Vif 篩選 （ 圖 10 ）：為創建Vif庫，使用Codon Optimization OnLine（COOL）（44）對來自8個HIV-1分離株、2個HIV-2分離株及30個不同SIV的40個獨特vif序列進行密碼子最佳化。所有vif隨後以gblock（Integrated DNA Technologies）形式合成，且選殖至帶有C端HA標籤的反轉錄病毒表現載體pLPCX中。所使用的人類APOBEC3G序列與Genbank NM_021822匹配。自此，使用定點誘變產生已知對Vif介導之降解（40）具有抗性的人類APOBEC3G（D128K）的突變體形式。梟猴及人類APOBEC3G對偶基因經C端HA標記且選殖至pLPCX中。
降解檢定用於測試庫中之各Vif降解梟猴APOBEC3G的能力（測試群落中之各主要對偶基因）。人類APOBEC3G及APOBEC3G（D128K）分別充當陽性及陰性對照。將無抗生素之DMEM培養基中之293T細胞以200,000個細胞/孔之濃度接種於24孔培養皿中。二十四小時後，使用TransIT-293轉染試劑（Mirus Bio，目錄號MIR 2705）用兩種質體共轉染細胞：一種表現APOBEC3G（人類20 ng或梟猴200 ng），另一種表現Vif（200 ng）。轉染後四十八小時，細胞在DPBS中洗滌且溶解於補充有1×完全蛋白酶抑制劑（Sigma，目錄號11873580001）之NP-40細胞溶解緩衝液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，1% Nonidet P-40，pH 7.8）中。細胞在溶解緩衝液中在4℃下旋轉45分鐘且藉由以16,000g旋轉15分鐘來清除全細胞提取物。蛋白質濃度係使用Pierce BCA蛋白質檢定（Thermo Scientific，目錄號23227）測定使用12% TGX無染色FastCast丙烯醯胺凝膠（Biorad，目錄號1610185）解析等量蛋白質（10 μg），且轉移至Immobilon-P PVDF膜（EMD Millipore，目錄號IPVH07850）上。將墨點在室溫下在3%牛奶中阻斷30分鐘。使用與辣根過氧化酶（Thermo Scientific，目錄號MA1-91878-HRP）結合之小鼠抗HA抗體的1:5000稀釋液來偵測HA標記之APOBEC3G及Vif蛋白質。用1:5000稀釋之小鼠抗β-肌動蛋白抗體（Cell Signaling Technology，目錄號3700S）偵測的內源性β-肌動蛋白來作為內參考物。用1:10,000稀釋之山羊抗小鼠辣根過氧化物結合抗體（Promega，目錄號W4021）作為第二探針。用ECL prime西方墨點法偵測試劑（GE Healthcare,目錄號RPN2236）活化化學發光，且在BioRad ChemiDoc成像系統上成像。
表 表 1. 原病毒 HIVom1 插入之突變的出現
在HIV基因體中偵測之非同義突變以灰色字體展示，同義突變以黑色字體顯示。加框係內置於HIVom1*病毒之原病毒殖株中的四個突變。部分線下的兩個突變係動物1/a在第22週輸血給動物1*/a後出現的，因此沒有向前繼續。短劃線指示無法擴增之區域。因此，H120R可能出現在動物1/a或1*/a中。
1基於不具有SIVrcm親環素結合環之野生型衣殼進行編號
2亦適用於E11E rev（重疊閱讀框）
3亦適用於L63L vpu（重疊閱讀框）；此突變位於Env信號肽中
4於gp41中
5亦適用於A62A vpu（重疊閱讀框）；此突變位於Env信號肽中
6於gp120之V2環中
表 2 ： 用於梟猴血液之流式細胞測量術的抗體
| 動物 1/a | 動物 1*/a | 動物 1*/c | |||||
| 第8週 | 第35週 | 第5週 | 第8週 | 第16週 | |||
| K103K基質 | --- | --- | 是 | 是 | 是 | ||
| H120R 1衣殼 | --- | --- | 是 | 是 | 是 | ||
| A58T Tat 2 | 否 | 是 | 是 | 是 | 是 | ||
| L10W Env 3 | 否 | 否 | 是 | 是 | 是 | ||
| D545G Env 4 | --- | 是 | 是 | 是 | 是 | ||
| syn LTR | --- | 否 | 是 | 是 | 是 | ||
| H9R Env 5 | 否 | 是 | 否 | 否 | 否 | ||
| D167G Env 6 | 否 | 是 | 否 | 否 | 否 |
| 補償對照物 | |||
| 抗體 | 目錄號 | 供應商 | 狀態 |
| PerCP小鼠抗人類CD3（SP34-2） | 552851 | BD | 5及7色區 |
| PE小鼠抗人類CD3（SP34-2） | 552127 | BD | 5及7色區 |
| FITC小鼠抗人類CD3（SP34） | 556611 | BD | 5及7色區 |
| APC小鼠抗人類CD3（SP34-2） | 557597 | BD | 5及7色區 |
| BV650小鼠抗人類CD3（SP34-2） | 563916 | BD | 5及7色區 |
| AF700 小鼠抗人類 CD3 （ SP34-2 ） | 561805 | BD | 7 色區 |
| BV786 小鼠抗人類 CD3 （ SP34-2 ） | 563918 | BD | 7 色區 |
| 同型對照 | |||
| 抗體 | 目錄號 | 供應商 | 狀態 |
| PerCP小鼠IgG1同型對照（MOPC-21） | 559425 | BD | 5及7色區 |
| FITC小鼠IgG2a同型對照 | MG2A01 | LifeTech | 5及7色區 |
| BV650小鼠IgG1同型對照（X40） | 563231 | BD | 5及7色區 |
| APC小鼠IgG1同型對照 | 340442 | BD | 5及7色區 |
| PE小鼠IgG3同型對照 | 556659 | BD | 5及7色區 |
| AF700 IgG2a 同型對照（ G155-178 ） | 557880 | BD | 7 色區 |
| BV786 IgG1 同型對照（ X40 ） | 563330 | BD | 7 色區 |
| 樣品 | |||
| 抗體 | 目錄號 | 供應商 | 狀態 |
| CD20APC（L27） | 340941 | BD | 5及7色區 |
| PE小鼠抗人類CD195 CCR5（3A9） | 556042 | BD | 5及7色區 |
| PerCP小鼠抗人類 CD4（L200） | 550631 | BD | 5及7色區 |
| CD8FITC人類（3B5） | MHCD0801 | Invitrogen | 5及7色區 |
| BV650 小鼠抗人類 CD3 （ SP34-2 ） | 563916 | BD | 僅 5 色區 |
| BV650 小鼠抗人類 CD16 （ 3G8 ） | 563892 | BD | 僅 7 色區 |
| AF700 小鼠抗人類 CD14 （ M5E2 ） | 557923 | BD | 僅 7 色區 |
| BV786 小鼠抗人類 CD3 （ SP34-2 ） | 563918 | BD | 僅 7 色區 |
參考文獻1. Fauci AS. 2017. An HIV Vaccine is Essential for Ending the HIV/AIDS Pandemic. JAMA 318:1535.
2. Meyerson NR、Sharma A、Wilkerson GK、Overbaugh J、Sawyer SL. 2015. Identification of owl monkey CD4 receptors broadly compatible with early-stage HIV-1 Isolates. J Virol 89:8611-8622.
3. Warren CJ、Meyerson NR、Dirasantha O、Feldman ER、Wilkerson GK、Sawyer SL. 2019. Selective use of primate CD4 receptors by HIV-1. PLoS Biol 17:e3000304.
4. Humes D、Emery S、Laws E、Overbaugh J. 2012. A Species-Specific Amino Acid Difference in the Macaque CD4 Receptor Restricts Replication by Global Circulating HIV-1 Variants Representing Viruses from Recent Infection. J Virol 86:12472-12483.
5. Nisole S、Lynch C、Stoye JP、Yap MW. 2004. A Trim5-cyclophilin A fusion protein found in owl monkey kidney cells can restrict HIV-1. Proc National Acad Sci 101:13324-13328.
6. Sayah DM、Sokolskaja E、Berthoux L、Luban J. 2004. Cyclophilin A retrotransposition into TRIM5 explains owl monkey resistance to HIV-1. Nature 430:569-573.
7. Sauter D、Kirchhoff F. 2019. Key viral adaptations preceding the AIDS pandemic. Cell Host Microbe 25:27-38.
8. Wong SK、Connole M、Sullivan JS、Choe H、Carville A、Farzan M. 2009. A New World Primate Deficient in Tetherin-Mediated Restriction of Human Immunodeficiency Virus Type 1. J Virol 83:8771-8780.
9. Adachi A、Gendelman HE、Koenig S、Folks T、Willey R、Rabson A、Martin MA. 1986. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J Virol 59:284-291.
10. Okoye AA、等人. 2018. Early antiretroviral therapy limits SIV reservoir establishment to delay or prevent post-treatment viral rebound. Nat Med 24:1430-1440.
11. Robb ML、Eller LA、Kibuuka H、Rono K、Maganga L、Nitayaphan S、Kroon E、Sawe FK、Sinei S、Sriplienchan S、Jagodzinski LL、Malia J、Manak M、Souza MS de、Tovanabutra S、Sanders-Buell E、Rolland M、Dorsey-Spitz J、Eller MA、Milazzo M、Li Q、Lewandowski A、Wu H、Swann E、O'Connell RJ、Peel S、Dawson P、Kim JH、Michael NL、Team R 217 S. 2016. Prospective Study of Acute HIV-1 Infection in Adults in East Africa and Thailand. New Engl J Medicine 374:2120-2130.
12. Barden A、Phillips M、Hill LM、Fletcher EM、Mas E、Loh PS、French MA、Ho KM、Mori TA、Corcoran TB. 2018. Antiemetic doses of dexamethasone and their effects on immune cell populations and plasma mediators of inflammation resolution in healthy volunteers. Prostaglandins, Leukot Essent Fat Acids 139:31-39.
13. Colby DJ.等人, group TR study. 2018. Rapid HIV RNA rebound after antiretroviral treatment interruption in persons durably suppressed in Fiebig I acute HIV infection. Nat Med 24:923-926.
14. Henrich TJ等人, 2017. HIV-1 persistence following extremely early initiation of antiretroviral therapy (ART) during acute HIV-1 infection: An observational study. PLoS Med 14:e1002417.
15. Hatziioannou T、Prete GQD、Keele BF、Estes JD、McNatt MW、Bitzegeio J、Raymond A、Rodriguez A、Schmidt F、Trubey CM、Smedley J、Piatak M、KewalRamani VN、Lifson JD、Bieniasz PD. 2014. HIV-1-induced AIDS in monkeys. Science 344:1401-1405.
16. Ambrose Z、KewalRamani VN、Bieniasz PD、Hatziioannou T. 2007. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends Biotechnol 25:333-337.
17. Li H等人, 2016. Envelope residue 375 substitutions in simian-human immunodeficiency viruses enhance CD4 binding and replication in rhesus macaques. Proc National Acad Sci 113:E3413-E3422.
18. Joseph SB、Swanstrom R. 2018. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. J Leukocyte Biol 103:421-431.
19. Pugach P、Kuhmann SE、Taylor J、Marozsan AJ、Snyder A、Ketas T、Wolinsky SM、Korber BT、Moore JP. 2004. The prolonged culture of human immunodeficiency virus type 1 in primary lymphocytes increases its sensitivity to neutralization by soluble CD4. Virology 321:8-22.
20. Wrin T、Loh TP、Vennari JC、Schuitemaker H、Nunberg JH. 1995. Adaptation to persistent growth in the H9 cell line renders a primary isolate of human immunodeficiency virus type 1 sensitive to neutralization by vaccine sera. J Virol 69:39-48.
21. Munro JB、Gorman J、Ma X、Zhou Z、Arthos J、Burton DR、Koff WC、Courter JR、Smith AB、Kwong PD、Blanchard SC、Mothes W. 2014. Conformational dynamics of single HIV-1 envelope trimers on the surface of native virions. Science 346:759-763.
22. Unutmaz D、KewalRamani VN、Littman DR. 1998. G protein-coupled receptors in HIV and SIV entry: New perspectives on lentivirus-host interactions and on the utility of animal models. Semin Immunol 10:225-236.
23. Sina ST、Ren W、Cheng-Mayer C. 2011. Coreceptor use in nonhuman primate models of HIV infection. J Transl Med 9:S7.
24. Riddick NE、Hermann EA、Loftin LM、Elliott ST、Wey WC、Cervasi B、Taaffe J、Engram JC、Li B、Else JG、Li Y、Hahn BH、Derdeyn CA、Sodora DL、Apetrei C、Paiardini M、Silvestri G、Collman RG. 2010. A novel CCR5 mutation common in sooty mangabeys reveals SIVsmm infection of CCR5-null natural hosts and efficient alternative coreceptor use in vivo. Plos Pathog 6:e1001064.
25. Wetzel KS、Yi Y、Elliott STC、Romero D、Jacquelin B、Hahn BH、Muller-Trutwin M、Apetrei C、Pandrea I、Collman RG. 2017. CXCR6-Mediated Simian Immunodeficiency Virus SIVagmSab Entry into Sabaeus African Green Monkey Lymphocytes Implicates Widespread Use of Non-CCR5 Pathways in Natural Host Infections. J Virol 91.
26. Schmidt F、Keele BF、Prete GQD、Voronin D、Fennessey CM、Soll S、Kane M、Raymond A、Gifford RJ、KewalRamani V、Lifson JD、Bieniasz PD、Hatziioannou T. 2019. Derivation of simian tropic HIV-1 infectious clone reveals virus adaptation to a new host. Proc National Acad Sci 116:10504-10509.
27. Bolger AM、Lohse M、Usadel B. 2014. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30:2114-2120.
28. Andrews S. FastQC. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc.
29. Li H、Durbin R. 2009. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25:1754-1760.
30. Li H、Handsaker B、Wysoker A、Fennell T、Ruan J、Homer N、Marth G、Abecasis G、Durbin R、Subgroup 1000 Genome Project Data Processing. 2009. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25:2078-2079.
31. Danecek P、Bonfield JK、Liddle J、Marshall J、Ohan V、Pollard MO、Whitwham A、Keane T、McCarthy SA、Davies RM、Li H. 2021. Twelve years of SAMtools and BCFtools. GigaScience 10:giab008.
32. Auwera GV der、O'Connor B. 2020. Genomics in the Cloud: Using Docker, GATK, and WDL in Terra.
33. Librado P、Rozas J. 2009. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics 25:1451-1452.
34. Yamashita M、Emerman M. 2004. Capsid Is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol 78:5670-5678.
35. Dull T、Zufferey R、Kelly M、Mandel RJ、Nguyen M、Trono D、Naldini L. 1998. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology 72:8463-8471.
36. Meyerson NR、Warren CJ、Vieira DASA、Diaz-Griffero F、Sawyer SL. 2018. Species-specific vulnerability of RanBP2 shaped the evolution of SIV as it transmitted in African apes. PloS Pathog 14:e1006906.
37. Kimpton J、Emerman M. 1992. Detection of replication-competent and pseudotyped human immunodeficiency virus with a sensitive cell line on the basis of activation of an integrated beta-galactosidase gene. Journal of Virology 66:2232-2239.
38. Vermeire J、Naessens E、Vanderstraeten H、Landi A、Iannucci V、Nuffel AV、Taghon T、Pizzato M、Verhasselt B. 2012. Quantification of Reverse Transcriptase Activity by Real-Time PCR as a Fast and Accurate Method for Titration of HIV, Lenti- and Retroviral Vectors. PLoS ONE 7:e50859.
39. Leigh JW、Bryant D. 2015. popart: full‐feature software for haplotype network construction. Methods Ecol Evol 6:1110-1116.
40. Zhen A、Wang T、Zhao K、Xiong Y、Yu X-F. 2010. A Single Amino Acid Difference in Human APOBEC3H Variants Determines HIV-1 Vif Sensitivity. J Virol 84:1902-1911.
41. Poss M、Overbaugh J. 1999. Variants from the diverse virus population identified at seroconversion of a clade A human immunodeficiency virus type 1-infected woman have distinct biological properties. Journal of Virology 73:5255-5264.
42. Ochsenbauer C、Edmonds TG、Ding H、Keele BF、Decker J、Salazar MG、Salazar-Gonzalez JF、Shattock R、Haynes BF、Shaw GM、Hahn BH、Kappes JC. 2012. Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages. J Virol 86:2715-2728.
43. Xu H、Svarovskaia ES、Barr R、Zhang Y、Khan MA、Strebel K、Pathak VK. 2004. A single amino acid substitution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resistance to HIV-1 virion infectivity factor-induced depletion. Proc National Acad Sci 101:5652-5657.
44. Chin JX、Chung BK-S、Lee D-Y. 2014. Codon Optimization OnLine (COOL): a web-based multi-objective optimization platform for synthetic gene design. Bioinformatics 30:2210-2212.
45. Kukkonen S、Martinez-Viedma MDP、Kim N、Manrique M、Aldovini A. 2014. HIV-1 Tat second exon limits the extent of Tat-mediated modulation of interferon-stimulated genes in antigen presenting cells. Retrovirology 11:30.
46. Wei X、Decker JM、Liu H、Zhang Z、Arani RB、Kilby JM、Saag MS、Wu X、Shaw GM、Kappes JC. 2002. Emergence of Resistant Human Immunodeficiency Virus Type 1 inPatients Receiving Fusion Inhibitor (T-20) Monotherapy. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY.
47. Gamble TR、Vajdos FF、Yoo S、Worthylake DK、Houseweart M、Sundquist WI、Hill CP. 1996. Crystal structure of human cyclophilin A bound to the amino-terminal domain of HIV-1 capsid. Cell 87:1285-1294.
48. Bichel K、Price AJ、Schaller T、Towers GJ、Freund SM、James LC. 2013. HIV-1 capsid undergoes coupled binding and isomerization by the nuclear pore protein NUP358. Retrovirology 10:81.
49. Ylinen LMJ、Price AJ、Rasaiyaah J、Hue S phane、Rose NJ、FlaviaMarzetta、James LC、Towers GJ. 2010. Conformational Adaptation of Asian Macaque TRIMCyp Directs Lineage Specific Antiviral Activity. PLoS Pathogens 6:e1001062.
序列表 SEQ ID NO. 1DNA
NL4-3病毒株
HIV-1TGGAAGGGCTAATTTGGTCCCAAAAAAGACAAGAGATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGATCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTTCAAGTTAGTACCAGTTGAACCAGAGCAAGTAGAAGAGGCCAATGAAGGAGAGAACAACAGCTTGTTACACCCTATGAGCCAGCATGGGATGGAGGACCCGGAGGGAGAAGTATTAGTGTGGAAGTTTGACAGCCTCCTAGCATTTCGTCACATGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTACAAAGACTGCTGACATCGAGCTTTCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGTGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTACATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGTAAAGCCAGAGGAGATCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCGGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATAAATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAACAATATAAACTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTTTTAGAGACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAATAGCAGTCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGATGTAAAAGACACCAAGGAAGCCTTAGATAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGAAAAAGGCACAGCAAGCAGCAGCTGACACAGGAAACAACAGCCAGGTCAGCCAAAATTACCCTATAGTGCAGAACCTCCAGGGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCACCTAGAACTTTAAATGCATGGGTAAAAGTAGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGCCCAGAAGTAATACCCATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGATTTAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGATAGATTGCATCCAGTGCATGCAGGGCCTATTGCACCAGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGAAGTGACATAGCAGGAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAGGATGGATGACACATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAATCTATAAAAGATGGATAATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTACCAGCATTCTGGACATAAGACAAGGACCAAAGGAACCCTTTAGAGACTATGTAGACCGATTCTATAAAACTCTAAGAGCCGAGCAAGCTTCACAAGAGGTAAAAAATTGGATGACAGAAACCTTGTTGGTCCAAAATGCGAACCCAGATTGTAAGACTATTTTAAAAGCATTGGGACCAGGAGCGACACTAGAAGAAATGATGACAGCATGTCAGGGAGTGGGGGGACCCGGCCATAAAGCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAGCCAAGTAACAAATCCAGCTACCATAATGATACAGAAAGGCAATTTTAGGAACCAAAGAAAGACTGTTAAGTGTTTCAATTGTGGCAAAGAAGGGCACATAGCCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGACACCAAATGAAAGATTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCCCACAAGGGAAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCACCAGAAGAGAGCTTCAGGTTTGGGGAAGAGACAACAACTCCCTCTCAGAAGCAGGAGCCGATAGACAAGGAACTGTATCCTTTAGCTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAGCGACCCCTCGTCACAATAAAGATAGGGGGGCAATTAAAGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACAGTATGATCAGATACTCATAGAAATCTGCGGACATAAAGCTATAGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGCTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAGACTGTACCAGTAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCATACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTCAAGATTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATCCTGCAGGGTTAAAACAGAAAAAATCAGTAACAGTACTGGATGTGGGCGATGCATATTTTTCAGTTCCCTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAGTATAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCACAGGGATGGAAAGGATCACCAGCAATATTCCAGTGTAGCATGACAAAAATCTTAGAGCCTTTTAGAAAACAAAATCCAGACATAGTCATCTATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGGATCTGACTTAGAAATAGGGCAGCATAGAACAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAAAGAACCTCCATTCCTTTGGATGGGTTATGAACTCCATCCTGATAAATGGACAGTACAGCCTATAGTGCTGCCAGAAAAGGACAGCTGGACTGTCAATGACATACAGAAATTAGTGGGAAAATTGAATTGGGCAAGTCAGATTTATGCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGTAAACTTCTTAGGGGAACCAAAGCACTAACAGAAGTAGTACCACTAACAGAAGAAGCAGAGCTAGAACTGGCAGAAAACAGGGAGATTCTAAAAGAACCGGTACATGGAGTGTATTATGACCCATCAAAAGACTTAATAGCAGAAATACAGAAGCAGGGGCAAGGCCAATGGACATATCAAATTTATCAAGAGCCATTTAAAAATCTGAAAACAGGAAAGTATGCAAGAATGAAGGGTGCCCACACTAATGATGTGAAACAATTAACAGAGGCAGTACAAAAAATAGCCACAGAAAGCATAGTAATATGGGGAAAGACTCCTAAATTTAAATTACCCATACAAAAGGAAACATGGGAAGCATGGTGGACAGAGTATTGGCAAGCCACCTGGATTCCTGAGTGGGAGTTTGTCAATACCCCTCCCTTAGTGAAGTTATGGTACCAGTTAGAGAAAGAACCCATAATAGGAGCAGAAACTTTCTATGTAGATGGGGCAGCCAATAGGGAAACTAAATTAGGAAAAGCAGGATATGTAACTGACAGAGGAAGACAAAAAGTTGTCCCCCTAACGGACACAACAAATCAGAAGACTGAGTTACAAGCAATTCATCTAGCTTTGCAGGATTCGGGATTAGAAGTAAACATAGTGACAGACTCACAATATGCATTGGGAATCATTCAAGCACAACCAGATAAGAGTGAATCAGAGTTAGTCAGTCAAATAATAGAGCAGTTAATAAAAAAGGAAAAAGTCTACCTGGCATGGGTACCAGCACACAAAGGAATTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTGGTCAGTGCTGGAATCAGGAAAGTACTATTTTTAGATGGAATAGATAAGGCCCAAGAAGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTACCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGGGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGCCCAGGAATATGGCAGCTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCTTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTAATTCCAGCAGAGACAGGGCAAGAAACAGCATACTTCCTCTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAGTACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGGATCAAGCAGGAATTTGGCATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAATAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGACAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGGAAAGGACCAGCAAAGCTCCTCTGGAAAGGTGAAGGGGCAGTAGTAATACAAGATAATAGTGACATAAAAGTAGTGCCAAGAAGAAAAGCAAAGATCATCAGGGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATGATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGATTAACACATGGAAAAGATTAGTAAAACACCATATGTATATTTCAAGGAAAGCTAAGGACTGGTTTTATAGACATCACTATGAAAGTACTAATCCAAAAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACTAGGGGATGCTAAATTAGTAATAACAACATATTGGGGTCTGCATACAGGAGAAAGAGACTGGCATTTGGGTCAGGGAGTCTCCATAGAATGGAGGAAAAAGAGATATAGCACACAAGTAGACCCTGACCTAGCAGACCAACTAATTCATCTGCACTATTTTGATTGTTTTTCAGAATCTGCTATAAGAAATACCATATTAGGACGTATAGTTAGTCCTAGGTGTGAATATCAAGCAGGACATAACAAGGTAGGATCTCTACAGTACTTGGCACTAGCAGCATTAATAAAACCAAAACAGATAAAGCCACCTTTGCCTAGTGTTAGGAAACTGACAGAGGACAGATGGAACAAGCCCCAGAAGACCAAGGGCCACAGAGGGAGCCATACAATGAATGGACACTAGAGCTTTTAGAGGAACTTAAGAGTGAAGCTGTTAGACATTTTCCTAGGATATGGCTCCATAACTTAGGACAACATATCTATGAAACTTACGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATCCATTTCAGAATTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGTTACTCGACAGAGGAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATGACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAGCTCATCAGAACAGTCAGACTCATCAAGCTTCTCTATCAAAGCAGTAAGTAGTACATGTAATGCAACCTATAATAGTAGCAATAGTAGCATTAGTAGTAGCAATAATAATAGCAATAGTTGTGTGGTCCATAGTAATCATAGAATATAGGAAAATATTAAGACAAAGAAAAATAGACAGGTTAATTGATAGACTAATAGAAAGAGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGAAGGAGAAGTATCAGCACTTGTGGAGATGGGGGTGGAAATGGGGCACCATGCTCCTTGGGATATTGATGATCTGTAGTGCTACAGAAAAATTGTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGTGGAAGGAAGCAACCACCACTCTATTTTGTGCATCAGATGCTAAAGCATATGATACAGAGGTACATAATGTTTGGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGAAGTAGTATTGGTAAATGTGACAGAAAATTTTAACATGTGGAAAAATGACATGGTAGAACAGATGCATGAGGATATAATCAGTTTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTGTTAGTTTAAAGTGCACTGATTTGAAGAATGATACTAATACCAATAGTAGTAGCGGGAGAATGATAATGGAGAAAGGAGAGATAAAAAACTGCTCTTTCAATATCAGCACAAGCATAAGAGATAAGGTGCAGAAAGAATATGCATTCTTTTATAAACTTGATATAGTACCAATAGATAATACCAGCTATAGGTTGATAAGTTGTAACACCTCAGTCATTACACAGGCCTGTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTCCCATACATTATTGTGCCCCGGCTGGTTTTGCGATTCTAAAATGTAATAATAAGACGTTCAATGGAACAGGACCATGTACAAATGTCAGCACAGTACAATGTACACATGGAATCAGGCCAGTAGTATCAACTCAACTGCTGTTAAATGGCAGTCTAGCAGAAGAAGATGTAGTAATTAGATCTGCCAATTTCACAGACAATGCTAAAACCATAATAGTACAGCTGAACACATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAAAGTATCCGTATCCAGAGGGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATGAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATGCCACTTTAAAACAGATAGCTAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGAAATAATAAAACAATAATCTTTAAGCAATCCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTCTACTGTAATTCAACACAACTGTTTAATAGTACTTGGTTTAATAGTACTTGGAGTACTGAAGGGTCAAATAACACTGAAGGAAGTGACACAATCACACTCCCATGCAGAATAAAACAATTTATAAACATGTGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATTAGATGTTCATCAAATATTACTGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAACAACAATGGGTCCGAGATCTTCAGACCTGGAGGAGGCGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGATATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAACAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATAACATGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCCTTAGCACTTATCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTACCACCGCTTGAGAGACTTACTCTTGATTGTAACGAGGATTGTGGAACTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAGCCCTCAAATATTGGTGGAATCTCCTACAGTATTGGAGTCAGGAACTAAAGAATAGTGCTGTTAACTTGCTCAATGCCACAGCCATAGCAGTAGCTGAGGGGACAGATAGGGTTATAGAAGTATTACAAGCAGCTTATAGAGCTATTCGCCACATACCTAGAAGAATAAGACAGGGCTTGGAAAGGATTTTGCTATAAGATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGTGTGATTGGATGGCCTGCTGTAAGGGAAAGAATGAGACGAGCTGAGCCAGCAGCAGATGGGGTGGGAGCAGTATCTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTAACAATGCTGCTTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAAGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTGGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGAATGGATGACCCTGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGACATCGAGCTTGCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCACCCAGGAGGTAGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGCGCCACTGCATTCCAGCCTGGGCAAGAAAACAAGACTGTCTAAAATAATAATAATAAGTTAAGGGTATTAAATATATTTATACATGGAGGTCATAAAAATATATATATTTGGGCTGGGCGCAGTGGCTCACACCTGCGCCCGGCCCTTTGGGAGGCCGAGGCAGGTGGATCACCTGAGTTTGGGAGTTCCAGACCAGCCTGACCAACATGGAGAAACCCCTTCTCTGTGTATTTTTAGTAGATTTTATTTTATGTGTATTTTATTCACAGGTATTTCTGGAAAACTGAAACTGTTTTTCCTCTACTCTGATACCACAAGAATCATCAGCACAGAGGAAGACTTCTGTGATCAAATGTGGTGGGAGAGGGAGGTTTTCACCAGCACATGAGCAGTCAGTTCTGCCGCAGACTCGGCGGGTGTCCTTCGGTTCAGTTCCAACACCGCCTGCCTGGAGAGAGGTCAGACCACAGGGTGAGGGCTCAGTCCCCAAGACATAAACACCCAAGACATAAACACCCAACAGGTCCACCCCGCCTGCTGCCCAGGCAGAGCCGATTCACCAAGACGGGAATTAGGATAGAGAAAGAGTAAGTCACACAGAGCCGGCTGTGCGGGAGAACGGAGTTCTATTATGACTCAAATCAGTCTCCCCAAGCATTCGGGGATCAGAGTTTTTAAGGATAACTTAGTGTGTAGGGGGCCAGTGAGTTGGAGATGAAAGCGTAGGGAGTCGAAGGTGTCCTTTTGCGCCGAGTCAGTTCCTGGGTGGGGGCCACAAGATCGGATGAGCCAGTTTATCAATCCGGGGGTGCCAGCTGATCCATGGAGTGCAGGGTCTGCAAAATATCTCAAGCACTGATTGATCTTAGGTTTTACAATAGTGATGTTACCCCAGGAACAATTTGGGGAAGGTCAGAATCTTGTAGCCTGTAGCTGCATGACTCCTAAACCATAATTTCTTTTTTGTTTTTTTTTTTTTATTTTTGAGACAGGGTCTCACTCTGTCACCTAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCAATCACAGCTCACTGCAGCCTCAACGTCGTAAGCTCAAGCGATCCTCCCACCTCAGCCTGCCTGGTAGCTGAGACTACAAGCGACGCCCCAGTTAATTTTTGTATTTTTGGTAGAGGCAGCGTTTTGCCGTGTGGCCCTGGCTGGTCTCGAACTCCTGGGCTCAAGTGATCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGACAACCGGGGCCAGTCACTGCACCTGGCCCTAAACCATAATTTCTAATCTTTTGGCTAATTTGTTAGTCCTACAAAGGCAGTCTAGTCCCCAGGCAAAAAGGGGGTTTGTTTCGGGAAAGGGCTGTTACTGTCTTTGTTTCAAACTATAAACTAAGTTCCTCCTAAACTTAGTTCGGCCTACACCCAGGAATGAACAAGGAGAGCTTGGAGGTTAGAAGCACGATGGAATTGGTTAGGTCAGATCTCTTTCACTGTCTGAGTTATAATTTTGCAATGGTGGTTCAAAGACTGCCCGCTTCTGACACCAGTCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGGGGAGGCAGAGATTGCAGTAAGCTGAGATCGCAGCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGTAAGACTCTGTCTCAAAAATAAAATAAATAAATCAATCAGATATTCCAATCTTTTCCTTTATTTATTTATTTATTTTCTATTTTGGAAACACAGTCCTTCCTTATTCCAGAATTACACATATATTCTATTTTTCTTTATATGCTCCAGTTTTTTTTAGACCTTCACCTGAAATGTGTGTATACAAAATCTAGGCCAGTCCAGCAGAGCCTAAAGGTAAAAAATAAAATAATAAAAAATAAATAAAATCTAGCTCACTCCTTCACATCAAAATGGAGATACAGCTGTTAGCATTAAATACCAAATAACCCATCTTGTCCTCAATAATTTTAAGCGCCTCTCTCCACCACATCTAACTCCTGTCAAAGGCATGTGCCCCTTCCGGGCGCTCTGCTGTGCTGCCAACCAACTGGCATGTGGACTCTGCAGGGTCCCTAACTGCCAAGCCCCACAGTGTGCCCTGAGGCTGCCCCTTCCTTCTAGCGGCTGCCCCCACTCGGCTTTGCTTTCCCTAGTTTCAGTTACTTGCGTTCAGCCAAGGTCTGAAACTAGGTGCGCACAGAGCGGTAAGACTGCGAGAGAAAGAGACCAGCTTTACAGGGGGTTTATCACAGTGCACCCTGACAGTCGTCAGCCTCACAGGGGGTTTATCACATTGCACCCTGACAGTCGTCAGCCTCACAGGGGGTTTATCACAGTGCACCCTTACAATCATTCCATTTGATTCACAATTTTTTTAGTCTCTACTGTGCCTAACTTGTAAGTTAAATTTGATCAGAGGTGTGTTCCCAGAGGGGAAAACAGTATATACAGGGTTCAGTACTATCGCATTTCAGGCCTCCACCTGGGTCTTGGAATGTGTCCCCCGAGGGGTGATGACTACCTCAGTTGGATCTCCACAGGTCACAGTGACACAAGATAACCAAGACACCTCCCAAGGCTACCACAATGGGCCGCCCTCCACGTGCACATGGCCGGAGGAACTGCCATGTCGGAGGTGCAAGCACACCTGCGCATCAGAGTCCTTGGTGTGGAGGGAGGGACCAGCGCAGCTTCCAGCCATCCACCTGATGAACAGAACCTAGGGAAAGCCCCAGTTCTACTTACACCAGGAAAGGC
SEQ ID NO. 2胺基酸
Vif蛋白質（野生型）
HIV-1MENRWQVMIVWQVDRMRINTWKRLVKHHMYISRKAKDWFYRHHYESTNPKISSEVHIPLGDAKLVITTYWGLHTGERDWHLGQGVSIEWRKKRYSTQVDPDLADQLIHLHYFDCFSESAIRNTILGRIVSPRCEYQAGHNKVGSLQYLALAALIKPKQIKPPLPSVRKLTEDRWNKPQKTKGHRGSHTMNGH
SEQ ID NO. 3**胺基酸
衣殼肽（野生型）
HIV-1PIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSP
SEQ ID NO. 4胺基酸
Tat（野生型）
HIV-1MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFMTKALGISYGRKKRRQRRRAHQNSQTHQASLSKQPTSQSRGDPTGPKE
SEQ ID NO. 5胺基酸
Env（野生型）
HIV-1MRVKEKYQHLWRWGWKWGTMLLGILMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRDKVQKEYAFFYKLDIVPIDNTSYRLISCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEDVVIRSANFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNATLKQIASKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNNNNGSEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSDIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL
SEQ ID NO. 6DNA
Vif（NLRM）
恆河猴ATGGAGGAGGAAAAGAGGTGGATAGCAGTTCCCACATGGAGGATACCGGAGAGGCTAGAGAGGTGGCATAGCCTCATAAAATATCTGAAATATAAAACTAAAGATCTACAAAAGGTTTGCTATGTGCCCCATTTTAAGGTCGGATGGGCATGGTGGACCTGCAGCAGAGTAATCTTCCCCCTACAGGAAGGAAGCCATTTAGAAGTACAAGGGTATTGGCATTTGACACCAGAAAGAGGGTGGCTCAGTACTTATGCAGTGAGGATAACCTGGTACTCAAGGAACTTTTGGACAGATGTAACACCAGACTATGCAGACATTTTACTGCATAGCACTTATTTCCCTTGCTTTACAGCGGGAGAAGTGAGAAGGGCCATCAGGGGAGAACAACTGCTGTCTTGCTGCAAGTTCCCGAGAGCTCATAGGTACCAGGTACCAAGCCTACAGTACTTAGCACTAAAAGTAGTAAGCGAcGTCAGATCCCAGGGAGAGAATCCCACCTGGAAACAGTGGAGAAGAGACAATAGGAGAGGCCTTCGAATGGCTAAACAGAACAGTAGAGGAGATAAACAGAGAGGCAGTAAACCACCTACCAAGGGAGCTGATTTTCCAGGTTTGGCAAAGGTCTTGGGAATACTGGCATGA
SEQ ID NO. 7DNA
Vif（NLRP）
豬尾獼猴ATGGAGGAGGAAAAGAGGTGGATAGCAGTTCCCACATGGAGGATACCGGAGAGGCTAGAGAGGTGGCATAGCCTCATAAAATATCTGAAATATAAAACTAAAGATCTACAAAAGGTTTGCTATGTGCCCCATCATAAGGTCGGATGGGCATGGTGGACCTGCAGCAGAGTAATCTTCCCACTACAAGAAGAAAGCCAGTTAGAAGTACAAGGGTATTGGAATTTAACACCAGAAAGAGGGTGGCTCAGTACTTATGCAGTGAGAATAACCTGGTACTCAAGGAACTTTTGGACAGATGTAACACCAGACTATGCAGACATTTTACTGCATAGCACTTATTTCCCTTGCTTTACAGCGGGAGAAGTGAGAAGGGCCATCAGGGGAGAACAACTGCTGTCTTGCTGCAGGTTCCCGAGAGCTCATAAGAACCAGGTACCAAGTCTACAGTACTTAGCACTGAGAGTAGTAAGTTACGTCAGATCCCAGAGAGAGAATCCCACCTGGAAACAGTGGAGAAGAGACAATAGGAGAAGCCTTCGAATGGCTAAACAGAACAGTAGAGGAGATAAACAGAGAGGCAGTAAACCACCTACCAAGGGAGCTGATTTTCCAGGTTTGGCAAAGGTCTTGGGAATACTGGCATGA
SEQ ID NO. 8胺基酸
Vif蛋白質（野生型）
HIV-1MENRWQVMIVWQVDRMRINTWKRLVKHHMYISRKAKDWFYRHHYESTNPKISSEVHIPLGDAKLVITTYWGLHTGERDWHLGQGVSIEWRKKRYSTQVDPDLADQLIHLHYFDCFSESAIRNTILGRIVSPRCEYQAGHNKVGSLQYLALAALIKPKQIKPPLPSVRKLTEDRWNKPQKTKGHRGSHTMNGH
SEQ ID NO. 9*胺基酸
衣殼肽（A-突變體）
HIV-1PIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLH
PVPGPIPAG QMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTHNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSP
SEQ ID NO. 10* **胺基酸
衣殼肽（H120R）
HIV-1PIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLHPVPGPIPAGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMT
R NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSP
SEQ ID NO. 11*胺基酸
衣殼肽（A-突變體H120R）
HIV-1PIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLH
PVPGPIPAG QMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMT
R NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSP
SEQ ID NO. 12*胺基酸
Tat（A58T）
HIV-1MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFMTKALGISYGRKKRRQRRR
T HQNSQTHQASLSKQPTSQSRGDPTGPKE
SEQ ID NO. 13*胺基酸
Env（H9R）
HIV-1MRVKEKYQ
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SEQ ID NO. 14*胺基酸
Env（L10W）
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SEQ ID NO. 15*胺基酸
Env（D545G）
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SEQ ID NO. 16*胺基酸
Env（D545G，L10W）
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SEQ ID NO. 17*胺基酸
Env（D545G，H9R）
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SEQ ID NO. 18*胺基酸
Env（D545G、H9R、L10W）
HIV-1MRVKEKYQ
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SEQ ID NO. 19*胺基酸
Env（D167G）
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SEQ ID NO. 20*胺基酸
Env（D545G、H9R、L10W、D167G）
HIV-1MRVKEKYQ
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*突變以
粗體且帶下劃線 顯示
[ 圖 1A] 至 [ 圖 1F]。針對梟猴修飾HIV-1。A）梟猴TRIMCyp對偶基因對HIV-1限制。CRFK細胞經表現不同梟猴TRIMCyp對偶基因（灰色）或空質體（黑色）之質體轉導，接著經VSV-G假型HIV-1-GFP感染。使用流式細胞測量術對變成GFP+之細胞百分比進行計數且標準化為對照品系。兩個生物複本，各具有兩個技術複本；資料點係根據四個獨立量測值計算且誤差條表示SEM。B）用體積增加（µl，X軸）之VSV-G假型HIV-1-GFP感染A圖中的經轉導之CRFK細胞（對照、對偶基因8、對偶基因30），該VSV-G假型HIV-1-GFP經工程改造以編碼不同的HIV或SIV的親環素結合環（圖式的頂部，亦參見圖7）。使用流式細胞測量術量測GFP+細胞之百分比（Y軸）。C）HIV-1（NL4-3）及SIVrcmGAB（GenBank AF028608）之親環素結合環之比對。對四個差異進行加框，且紅色胺基酸建構於此研究中之活體內實驗中所用的所有病毒中。D）穩定表現人類CD4及CCR5之人類T細胞（Hut78）及梟猴腎細胞（OMK）用野生型HIV-1（分離株Q23-17
7，CCR5-熱帶亞型A）或經工程改造以含有4個重構SIVrcm之親環素結合環（CBL）的突變的HIV-1以MOI=0.1進行感染。生長曲線係藉由在指定時間點量測上清液中p24之濃度來產生。E）全長NL4-3 HIV-1原病毒經修飾以使Vif基因缺失，或用來自SIVmac或SIVmne之Vif與其進行置換。293T細胞與各HIV-1質體以及編碼人類或指定梟猴APOBEC3G對偶基因（1、4、7、8）之質體共轉染。48小時後，收集上清液且將4ul添加至報導TZM-bl細胞中以量化已產生的感染性病毒。相對螢光素酶單位（Y軸）經標準化成無APOBEC3G對照。對各APOBEC3G及VIf對進行兩個生物複製（各具有四個技術複本）。F）最終梟猴HIV-1殖株HIVom1及HIVom2之示意圖，該等殖株經工程改造（紅色）以在親環素結合環（CBL，突變如C圖所示）中具有四個突變，且分別編碼SIVmac Vif或SIVmne Vif。
[ 圖 2A] 至 [ 圖 2D] 。梟猴的HIV感染。A）四隻動物直接感染由圖1F中所示之原病毒殖株產生之HIV-1梟猴儲備液。頂部之兩隻猴感染HIVom1，底部之兩隻猴感染HIVom2；所有感染均經由靜脈內。圖中Y軸展示血漿病毒血症，且X軸展示感染後週數。三隻動物用地塞米松治療（灰條顯示DEX-治療週數），且所有動物經歷病毒反彈。在A組及B圖中：星形表示各動物經血清轉化之週且虛線水平線為80個複本/毫升之定量的分析極限。B）將動物1/a（A圖）在第22週的血漿輸至另一隻個體1*/a。此個體中之病毒重新命名為HIVom1*，因為首次4個活體內調適一起出現；HIVom1*於C圖中示出。在第5週及第8週，隨後對額外兩隻猴（1*/c及1*/d）進行來自1*/a的輸血。C）具有在活體內連續繼代期間獲取之4個非同義突變的HIVom1重新命名為HIVom1*。D）展示了A圖及B圖中三隻動物在地塞米松治療期間的詳細資訊。展示了來自全血球計數之總淋巴球（頂圖）。在灰色框內的數週內，投與地塞米松（DEX），且淋巴球水平降低。血漿病毒血症圖（底圖）以地塞米松治療前後的數週為中心來顯示。
[ 圖 3A] 至 [ 圖 3D] 。HIVom1*係梟猴適應型病毒。A）四隻梟猴感染有HIVom1及HIVom1*之50:50混合物，各病毒由原病毒分子殖株產生。圖中X軸展示感染後週數，且Y軸展示血漿病毒血症。注意Mel與Jitterbug均具有高於偵測極限之病毒設定點。地塞米松（DEX）治療之週期用灰色方框表示。B）亦對人類T細胞人類T細胞（SupT1細胞）評估HIVom1及HIVom1*病毒，且在人類細胞上的4個附加突變僅導致輕微的生長缺陷。C）雖然HIVom1及HIVom1*（具有4個活體內調適）兩者可在接種之後五分鐘於所有四個猴中偵測到，但在所有四種情況下，適應型HIVom1*病毒為可由第1週偵測到的唯一病毒。D）展示了感染有不含所有四個活體內調適之HIVom病毒（HIVom1及HIVom2）的猴與感染有含有活體內適應性之HIVom1*的猴的血清轉化之週數。此圖中之血清轉化時間係使用華盛頓大學（U. Washington）血清轉化測試（BioRad Geenius）或定點照護Abbott Determine檢定的組合來確定的。圖上之線表示中位值。動物1*/a顯示出病毒不完全適應（表1）。
[ 圖 4A] 至 [ 圖 4B] 。受感染猴中之免疫學。A）梟猴血漿中對中和抗體之存在的檢定。熱不活化梟猴血漿經連續稀釋（X軸），且接著與HIVom1*病毒（4000 IU）預混合。隨後將TZM-bl細胞暴露於此混合物。將細胞培育48小時，溶解且使用光度計量測相對螢光素酶單位。未感染細胞用於校正背景螢光素酶活性。樣品標準化為經病毒感染但不暴露於血漿的細胞。一些樣品之感染性超過100%，其表明在病毒負荷極其高的樣品中病毒未完全熱不活化。B）在感染後不同時間偵測受感染動物之血漿中之三種不同HIV-1抗體。關於此圖之所有資料均衍生自華盛頓大學臨床測試實驗室（BioRad Geenius檢定）。
[ 圖 5A] 至 [ 圖 5C] 。無論病毒是否編碼Vpu，梟猴Tetherin都不會限制HIV-1。A）西方墨點法顯示人類、恆河猴及各種梟猴（「An」）Tetherin-HA構築體（內部標記）之表現，其中An1-An8代表在梟猴群落中鑑別的八種獨特Tetherin對偶基因。用50 ng之各Tetherin編碼質體轉染24孔培養皿中之293T細胞，接著48小時後收穫全細胞提取物（WCE）。對WCE進行西方墨點法，且使用抗HA抗體（1:5000稀釋，Roche #12013819001）偵測Tetherin蛋白。非醣基化形式之Tetherin為大約25 kDa。B）將50 ng指定Tetherin質體與300 ng表現HIV-1全長原病毒（NL4-3（野生型）或NL4-3Δvpu）之質體共轉染至293T細胞中。轉染後48小時，藉由使用螢光素酶讀數（RLU=相對光單位）滴定至TZM-bl報導細胞上來對澄清上清液中的病毒進行計數。將值標準化為不含有Tetherin（空白載體）之樣品。展示兩個生物複本之平均值，其各自一式三份地進行。誤差條表示標準誤差。C）對於B圖中之各樣品（NL4-3，左；NL4-3Δvpu，右），使用抗p24抗體（1:1000稀釋，AIDS試劑資料庫#3537）於西方墨點法上探測WCE或粗病毒粒子製備物。使用抗β-肌動蛋白抗體（1:1000，Santa Cruz #sc-47778）偵測內源性β-肌動蛋白作為內參考物。各墨點底部之數字為使用載體對照標準化之抗p24信號的標準化譜帶強度值。
[ 圖 6] 。經工程改造之病毒的適應性將編碼全長HIV-1原病毒（野生型NL4-3及關鍵字中所示的衍生物）的質體轉染至293T生產細胞中，且使用TZM-bl β-gal檢定（量測感染單位）或SG-PERT檢定（量測反轉錄活性）進行滴定。在最終圖式中，每皮克反轉錄酶之感染單位量經計算，作為各突變體之總體適應性的代表。自近似值來看，吾等的經工程改造之病毒對適應性的命中為1對數，而G89V突變對適應性的命中為2對數。
[ 圖 7A] 至 [ 圖 7B] 。SIV及HIV中之衣殼親環素結合環之自然變異。A）各種HIV及SIV病毒株之親環素結合環之胺基酸比對。頂部之編號係相對於衣殼之N端域。紅色中所示之序列用於突變分析。B）HIV-1亞型A、B、C及D之親環素結合環之WebLogo比對。序列係自Los Alamos HIV-1序列資料庫獲得。可變位點以黃色突出顯示。在比對底部展示親環素結合環中之NL4-3序列與SIVrcm（GenBank登錄號AF028608）中相同區域的結果。在此論文使用的梟猴適應型版本之NL4-3中，加框殘基變成紅色突出顯示之殘基，其在NL4-3殖株內重新創建SIVrcmGAB親環素結合環。
[ 圖 8] 。梟猴APOBEC3G對偶基因能強力地限定HIV-1。首先，申請人首先希望知曉梟猴APOBEC3G對偶基因是否編碼活性限制因子。因此，在此實驗中，藉由自兩種被測病毒中刪除vif基因，避開了Vif對APOBEC3G的抵抗作用。將兩種質體共轉染至293T細胞中：編碼缺失vif之全長HIV-1原病毒之質體（300 ng編碼NL4-3ΔVif或Q23-17ΔVif之質體）及編碼APOBEC3G蛋白質之質體（25 ng用於人類或200 ng用於梟猴APOBEC3G對偶基因）。「Hum mut」係指人類APOBEC3G D128K，其防止Vif介導之降解（40）。48小時之後，移除上清液且將4 ul各樣品添加至報導TZM-bl細胞中以對釋放之感染性病毒粒子進行計數。來自此等細胞之讀數（相對螢光素酶單位[RLU]）代表所產生之病毒。感染後四十八小時，收集TZM-bl細胞，溶解且分析其螢光素酶信號。所有結果均減去背景且標準化為無APOBEC3G對照。資料呈現為平均值+SEM，且係來自兩個各自具有四個技術複本之生物複本的彙集資料。虛線表示此檢定之偵測極限，按背景螢光素酶水平之兩倍計算。總體而言，由此實驗申請人得出結論：1）梟猴APOBEC3G為HIV-1之功能性限制因子，其中對偶基因7可能比其他對偶基因具有略微較弱的活性，且2）HIV-1分離株Q23-17對於梟猴APOBEC3G的敏感性可低於分離株NL4-3。HIV-1 Q23-17（41）（目錄ARP-12649，由Julie Overbaugh博士提供），且針對方法中對於NL4-3的描述進行Q23-17 ΔVif的選殖。
[ 圖 9A] 至 [ 圖 9D] 。HIV-1 Vif對梟猴APOBEC3G蛋白質的降解。A）顯示四種主要APOBEC3G對偶基因。B）已鑑別的每一APOBEC3G對偶基因之各可變位點處編碼的胺基酸。C）將編碼人類或四種主要梟猴APOBEC3G對偶基因中之一者的質體以及編碼HIV-1 Vif（來自HIV-1分離株Q23-17（41））之質體共轉染至HEK 293T細胞中。西方墨點法顯示，HIV-1 Vif降解人類，但對四種梟猴APOBEC3G蛋白的降解有限（若存在）。EV，空載體。D）梟猴APOBEC3G蛋白變異體（群落中頻率最高的11個變異體）在與三種不同的HIV-1 Vif蛋白（分別衍生自HIV-1分離株NL4-3（9）、Q23-17（41）及CH077（42））共轉染後的降解。包括人類APOBEC3G及人類APOBEC3G-D128K（43）作為對照（分別為被Vif降解與不被Vif降解）。用200 ng含有三種HIV-1 Vif蛋白（彩色方框）中之一種的質體以及編碼APOBEC3G的質體（25 ng用於人類APOBEC3G及APOBEC3G-D128K；200 ng用於梟猴APOBEC3G對偶基因）共轉染293T細胞。轉染後四十八小時，收集細胞且溶解，且藉由西方墨點法，藉由探測APOBEC3G（HA）、Vif（HA）及作為內參考物的β肌動蛋白來確定降解程度。此資料代表兩次獨立實驗。
[ 圖 10A] 至 [ 圖 10B] 。篩選42種SIV及HIV Vif蛋白以尋求降解梟猴APOBEC3G之蛋白。各泳道表示一個實驗，其中兩種質體共轉染至293T細胞中：一種表現人類或梟猴APOBEC3G對偶基因（25 ng人類或200 ng梟猴），且一種表現來自指定SIV或HIV基因體之Vif蛋白質（200 ng質體）。A）此等圖展示42種不同Vif蛋白質之初始篩選，其中一些出現超過一次，且其中許多具有可變表現量。對於各種由對偶基因1（群落中頻率最高的對偶基因）編碼之梟猴APOBEC3G蛋白質的降解進行測試。自此篩選，紅色星形表示至少部分降解梟猴APOBEC3G之六種Vif蛋白質。B）接著針對由梟猴群落中四種主要蛋白質單倍型（對偶基因1、4、7、8）編碼之各梟猴APOBEC3G測試A圖中所鑑別之此等六種Vif。自此分析，似乎SIVmne（豬尾獼猴（pig-tailed macaque，
Macaca nemestrina）之SIV）之Vif在降解梟猴APOBEC3G蛋白質方面為最強效的。
[ 圖 11A] 至 [ 圖 11B] 。一些SIV Vif蛋白中和梟猴APOBEC3G蛋白質。用三種質體同時共轉染293T細胞：一種編碼全長HIV-1原病毒（300 ng編碼HIV-1 Q23-17（41）或Q23-17ΔVif之質體）、一種編碼Vif（200 ng編碼HIV-1或SIV Vif之質體）及一種編碼APOBEC3G（「A3G」；25 ng用於人類或200 ng用於梟猴）。A）收集轉染後四十八小時，收集細胞且用偵測APOBEC3G（抗HA）、Vif（抗HA）及作為內參考物的β肌動蛋白抗體對溶解物進行西方墨點法。此資料代表兩次獨立實驗。B）在轉染後四十八小時，亦自293T細胞中收集上清液且對其中的病毒進行計數。將四微升上清液添加至報導TZM-bl細胞中。感染後四十八小時，溶解TZM-bl細胞，且分析其螢光素酶信號。所有結果均減去背景且標準化為無APOBEC3G對照。資料呈現為平均值+SEM，其來自兩個各自具有四個技術複本之生物複本。虛線表示此檢定之偵測極限，按背景螢光素酶水平之兩倍計算。白色橫條及黃色方框僅為理論的，以幫助比較來自梟猴APOBEC3G之相對拯救。
[ 圖 12A] 至 [ 圖 12B] 。梟猴中活體內繼代期間出現的Tat中之A58T突變。A）來自NL4-3之Tat（頂圖）、在梟猴中繼代之後的活體內適應型病毒（第二列）及來自文獻之傳播/創始病毒的部分比對。B）使用LANL之「亞型參考」序列（每個亞型4個，無重組體，僅M組）製作了緊鄰該突變區的標識（Logo）。根據兩個圖，吾人可見在此位置處T及A均比較常見。因此不清楚為何梟猴活體內繼代會選擇此突變。應注意，A及T均在HIV-1 Tat中之此位置被觀測到。此外，已顯示A58T顯著增加來自HIV-1 LTR之基因轉錄活化（45）。
[ 圖 13] 。梟猴中活體內繼代期間出現的gp41中之D545G突變。來自NL4-3之gp41（頂圖）、在梟猴中繼代之後的活體內適應型病毒（第二列及第三列）及來自文獻之傳播/創始病毒的部分比對。保守「GIV」模體提及於文獻（46）中。相比之下，「DIV」形式的NL4-3野生型似乎在梟猴中於此位置恢復成GIV。申請人得出結論，「DIV」可能已成為NL4-3之實驗室適應。
[ 圖 14A] 至 [ 圖 14E] 。梟猴中活體內繼代期間出現的H120R CA突變。A）使用LANL之「亞型參考」序列（每個亞型4個，無重組體，僅M組）製作了衣殼之部分區域的標識圖。在位置120（亦即R在梟猴中連續繼代之後出現的位置），R從未出現在此等參考HIV亞型中之任一者中。取而代之，HIV-1似乎對G/S/N進行取樣，該等均較小且具有極性側鏈。就大小及電荷狀態而言，精胺酸（R）極其不同，因此申請人假設此可能為梟猴的一個重要物種特異性適應。B）來自SIV病毒株之此區域的部分比對，其中對應於衣殼120之殘基位置以黃色突出顯示。在少數SIV病毒株中R確實出現在位置120處。在SIV病毒株中在附近位置亦似乎存在插入/缺失。C-E）顯示了用於與三種宿主結合搭配物（紫色）之親環素域複合之HIV-1衣殼（棕褐色）的共晶體（47-49）。在衣殼上，親環素結合環呈紅色。在梟猴活體內繼代期間，突變（H120R；紅色球）自發地出現在梟猴中且變得固定。在親環素A中，人類與梟猴蛋白質之間僅有2個胺基酸差異係以紫色星形表示。在其他兩種宿主蛋白質中，展示了僅在向H120R突出之環中人類與梟猴（或梟猴及恆河猴，中心）之間的胺基酸差異（紫色星形）。
[ 圖 15] 。Env中之H9R及L10W信號肽突變在梟猴活體內繼代期間（分別）出現。A）來自NL4-3之Env（頂圖）、在兩種不同梟猴中繼代之後的活體內適應型病毒（第2列及第3列）及來自文獻之傳播/創始HIV-1分離株的部分比對。B）使用LANL之「亞型參考」序列（每個亞型4個，無重組體，僅M組）製作了緊鄰此等突變區的標識圖。根據兩幅圖，可看出由NL4-3編碼之胺基酸以及在梟猴活體內取代之胺基酸均常見於HIV-1病毒株中。因此不清楚為何梟猴活體內繼代會選擇此等突變。
[ 圖 16] 。動物1*/d中病毒競爭實驗之結果。在HIV 1*病毒中4個點突變位點上展示了正向及反向定序跡線。在時間0時，動物感染有病毒之50:50混合物。在感染之後5分鐘所採集的來自血漿之病毒經純化及定序，且可看到病毒群體之混合性質。隨後數週，自PBMC純化DNA且定序原病毒DNA。在基因體中之每個位置，且在每個時間點，僅觀察到與病毒1*相關之鹼基，且從未觀測到與病毒1相關之鹼基。
[ 圖 17] 。動物1*/e中病毒競爭實驗之結果。在HIV 1*病毒中4個點突變位點上展示了正向及反向定序跡線。在時間0時，動物感染有病毒之50:50混合物。在感染之後5分鐘所採集的來自血漿之病毒經純化及定序，且可看到病毒群體之混合性質。隨後數週，自PBMC純化DNA且定序原病毒DNA。在基因體中之每個位置，且在每個時間點，僅觀察到與病毒1*相關之鹼基，且從未觀測到與病毒1相關之鹼基。
[ 圖 18] 。動物1*/f中病毒競爭實驗之結果。在HIV 1*病毒中4個點突變位點上展示了正向及反向定序跡線。在時間0時，動物感染有病毒之50:50混合物。在感染之後5分鐘所採集的來自血漿之病毒經純化及定序，且可看到病毒群體之混合性質。隨後數週，自PBMC純化DNA且定序原病毒DNA。在基因體中之每個位置，且在每個時間點，僅觀察到與病毒1*相關之鹼基，且從未觀測到與病毒1相關之鹼基。
[ 圖 19] 。動物1*/g中病毒競爭實驗之結果。在HIV 1*病毒中4個點突變位點上展示了正向及反向定序跡線。在時間0時，動物感染有病毒之50:50混合物。在感染之後5分鐘所採集的來自血漿之病毒經純化及定序，且可看到病毒群體之混合性質。隨後數週，自PBMC純化DNA且定序原病毒DNA。在基因體中之每個位置，且在每個時間點，僅觀察到與病毒1*相關之鹼基，且從未觀測到與病毒1相關之鹼基。
[ 圖 20] 。感染期間之免疫細胞動力學。用左邊展示的針對表面標記之抗體對新鮮血液進行流式細胞測量術。對於大部分表面標記，各猴子之各時間點進行兩次流式細胞測量術（在顯示誤差條的各處，在此情況下則繪製平均值及SD）。在此資料中可見若干圖案，1）大部分動物在急性感染期間具有CD8+ T細胞之激增，2）兩隻動物在急性感染下具有B細胞之激增，3）一隻動物在急性感染後可能具有NK細胞之激增。應注意，地塞米松（DEX）治療（灰色譜帶）抑制淋巴球、NK細胞及B細胞，但刺激單核球，所有結果正如預期。CD8抗體（粉紅色帶）抑制CD8 T細胞，但導致單核球之激增。CD8 Ab僅投與一次劑量，但粉色譜帶延長直至實驗結束，因為其作用持久（在本文中其他地方展示）。
[ 圖 21] 。隨感染劑量而變之血清轉化時間。血清轉化時間似乎為適應病毒之函數，而非感染劑量之函數。應注意，動物1/a之劑量為近似的，因為此讀數命中該檢定之偵測上限。
[ 圖 22A] 至 [ 圖 22B]。NL4-3-ΔVif及Q23-17-ΔVif原病毒分子殖株的構築及測試。HIV-1分離株NL4-3（9）及Q23-17（41）HIV-1之全長原病毒殖株係獲自HIV試劑項目（HIV Reagent Program）（參見方法）。此圖描述Vif基因在此等殖株內如何被破壞。A）NL4-3原病毒HIV-1殖株中在Vif基因周圍區域之註釋序列。以黃色突出顯示之序列表示Pol/Vif重疊區（5'區）及Vif/Vpr重疊區（3'區）。以紅色標出的係Pol/Vif重疊區中產生的變化，該等變化消除了「ATG」序列，包括Vif起始密碼子。此等變化在聚合酶蛋白質之3'端引入三個同義取代及一個非同義取代。以綠色突出顯示之序列為被缺失的Vif蛋白質之284個內部鹼基。B）NL4-3ΔVif及Q23-17ΔVif病毒為功能性的且並不降解人類Apobec3G。用兩種質體共轉染293T細胞：一種表現人類APOBEC3G（25 ng編碼人類野生型APOBEC3G或APOBEC3G D128K的質體——「HM」表示「人類突變體」），另一種表現HIV-1原病毒殖株（300 ng表現NL4-3、Q23-17、NL4-3ΔVif或Q23-17ΔVif的質體——「FL」表示「全長帶有Vif」，且「DV」表示「△Vif」）。轉染後四十八小時，收集細胞且溶解，且藉由西方墨點法，藉由探測APOBEC3G（HA；Thermo Scientific，MA1-91878-HRP）、小鼠抗Vif（AIDS試劑資料庫，#6459）及作為內參考物的小鼠抗β肌動蛋白（Cell Signaling Technology，3700S）來確定降解程度。山羊抗小鼠辣根過氧化物結合抗體（Promega，W4021）用作Vif及β肌動蛋白墨點之二級探針。申請人亦用HIV-1 P24抗體（AIDS試劑資料庫，#3537）作為活病毒產生的代表探針。此資料代表兩次獨立實驗。注意：對293T生產細胞之WCL進行NL4-3之p24墨點法，而對自293T生產細胞之上清液所分離的病毒進行Q23-17之p24墨點法。
[ 圖 23] 。用SIVmac或SIVmne置換NL4-3 Vif。在吾等設計中，將獼猴Vif之起始密碼子緊接著Pol之終止密碼子的下游插入，且Vif之終止密碼子緊接著Vpr起始之上游插入。此設計避免藉由消除Pol/Vif及Vif/Vpr重疊來避免嵌合Pol或Vpr蛋白質。藉由取代ATG模體內之核苷酸來消除Pol/Vif重疊序列內之NL4-3 Vif的起始密碼子。Pol及Vif重疊中之所有其他「ATG」串亦被消除，如上圖四條綠線所繪示。此等變化在NL4-3 Pol之3'處引起三個同義變化及一個非同義變化。SIVmac Vpx之起始密碼子（位於SIVmac中Vif/Vpx基因體重疊處）類似地被消除且由紅色線表示。
[ 圖 24] 。本發明之一個實施例中描述之病毒之基因特徵的概述。
[ 圖 25] 。本發明中所鑑別之病毒。
Claims (123)
- 一種HIV-1變異體，其由ATCC專利寄存號PTA-127572（HIVom1）識別。
- 一種HIV-1變異體，其由ATCC專利寄存號PTA-127575（HIVom1*）識別。
- 一種HIV-1變異體，其由ATCC專利寄存號PTA-127574（HIVom2）識別。
- 一種HIV-1變異體，其由ATCC專利寄存號PTA-127573（HIVom2*）識別。
- 如請求項1至4中任一項之HIV-1變異體，其中該HIV-1變異體係經分離的。
- 一種細胞，其感染有如請求項1至4中任一項之HIV-1變異體。
- 如請求項6之細胞，其中該細胞包含哺乳動物細胞。
- 如請求項6之細胞，其中該哺乳動物細胞包含秘魯夜猴（ Aotus nancymaae）細胞。
- 一種動物，其感染有如請求項1至4中任一項之HIV-1變異體。
- 如請求項9之動物，其中該動物包含哺乳動物。
- 如請求項10之動物，其中該哺乳動物包含秘魯夜猴。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至4中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種用HIV-1感染動物之方法，其包含向該動物投與治療有效量之如請求項12之醫藥組合物的步驟。
- 一種用HIV-1激發動物之方法，其包含向已投與治療有效量之如請求項1至4中任一項之HIV-1變異體的動物投與治療有效量之HIV-1變異體或野生型HIV-1的步驟。
- 如請求項14之方法，其中該動物包含哺乳動物。
- 如請求項15之動物，其中該動物包含秘魯夜猴（梟猴（owl monkey））。
- 一種用HIV-1激發動物之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之治療組合物及如請求項1至4中任一項之HIV-1變異體的步驟。
- 如請求項17之方法，其中該治療組合物包含HIV-1疫苗或HIV-1治療化合物。
- 如請求項17至18中任一項之方法，其中該治療組合物係： − 在投與該HIV-1變異體之前投與； − 在投與該HIV-1變異體之後投與；或 − 在投與該HIV-1變異體的同時投與。
- 如請求項17至19中任一項之方法，其中該個體包含哺乳動物。
- 如請求項20之方法，其中該動物包含秘魯夜猴（梟猴）。
- 一種HIV-1變異體，其具有適於感染秘魯夜猴（梟猴）的經基因修飾之衣殼肽。
- 如請求項22之HIV-1變異體，其中該經基因修飾之衣殼肽包含親環素結合環之一個或多個突變。
- 如請求項23之HIV-1變異體，其中該親環素結合環之該等突變在根據SEQ ID NO. 3或其片段或變異體之位置87及93之間。
- 如請求項24之HIV-1變異體，其中該親環素結合環位置之該等突變包含在殘基87、88、92或93處的胺基酸缺失或突變。
- 如請求項24之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含一個或多個選自以下之突變： − 在該親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失； − 在該親環素結合環之位置88處進行取代的脯胺酸； − 在該親環素結合環之位置92處進行取代的脯胺酸； − 在該親環素結合環之位置93處進行取代的丙胺酸； − 以上突變之組合。
- 如請求項24之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含一個或多個選自以下之突變： − ∆H87突變； − A88P突變； − A92P突變； − P93A突變；或 − 以上突變之組合。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項22至27中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NO 9-11或其片段或變異體之經基因修飾之衣殼肽。
- 一種表現載體，其編碼如請求項29之核苷酸序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼具有選自SEQ ID NO 9-11或其片段或變異體之經基因修飾之衣殼肽的HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項31之核苷酸序列。
- 一種HIV-1變異體，其具有適於感染秘魯夜猴（梟猴）之異源病毒感染因子（Vif）。
- 如請求項33之HIV-1變異體，其中該異源Vif包含選自猿猴免疫缺乏病毒（SIVVif）之異源Vif。
- 如請求項34之HIV-1變異體，其中該SIVVif係選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6-7、與SEQ ID NO. 6-7具有至少85%序列同源性之序列，或其片段或變異體。
- 如請求項35之HIV-1變異體，其中該SIVVif插入Pol區之上游及Vpr區之下游。
- 如請求項36之HIV-1變異體，其中該SIVVif包含插入該Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子，及插入該Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞。
- 如請求項36之HIV-1變異體，其中位於Vif/Vpr重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 如請求項36之HIV-1變異體，其中位於Pol/Vif重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項33至39中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼選自以下之異源SIVVif：NLRM、NLRP、SEQ ID NO. 6-7、與SEQ ID NO. 6-7具有至少85%序列同源性之序列，或其片段或變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項41之核苷酸序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項33至39中任一項之具有異源SIVVif的HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項43之核苷酸序列。
- 一種HIV-1變異體，其具有一個或多個調節適於感染秘魯夜猴（梟猴）的感染性之突變。
- 如請求項45之HIV-1變異體，其中該一個或多個突變存在於衣殼蛋白、Tat蛋白及/或包膜（Env）蛋白中。
- 如請求項46之HIV-1變異體，其中至少一個突變係選自： − 在根據SEQ ID NO. 3之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處的取代突變； − 在根據SEQ ID NO. 4之該HIV-1 Tat蛋白的位置58處的取代突變； − 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置9或10處的取代突變；及 − 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置545處的取代突變；或 − 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置167處的取代突變；或 − 以上突變之組合。
- 如請求項46之HIV-1變異體，其中該一個或多個突變係選自： − 在根據SEQ ID NO. 10或11之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處進行取代的精胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 12之該HIV-1 Tat蛋白的位置58處進行取代的蘇胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 13之該HIV-1 Env蛋白的位置9處進行取代的精胺酸， − 在根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的位置10處的色胺酸；及 − 在根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的位置545處進行取代的甘胺酸；或 − 在根據SEQ ID NO. 19之該HIV-1 Env蛋白的位置167處進行取代的甘胺酸；或 − 以上突變之組合。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項45至48中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NO. 10-15、19-20或其片段或變異體之經基因修飾之肽。
- 一種表現載體，其編碼如請求項50之核苷酸序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項45至48中任一項之具有經基因修飾之肽的HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項52之核苷酸序列。
- 一種經基因修飾之HIV-1變異體，其適於感染秘魯夜猴（梟猴）。
- 如請求項54之HIV-1變異體，其中該HIV-1變異體包含： − 經基因修飾之衣殼肽；及 − 異源病毒感染因子（Vif）。
- 如請求項55之HIV-1變異體，其中該經基因修飾之衣殼肽包含親環素結合環之一個或多個突變。
- 如請求項56之HIV-1變異體，其中該親環素結合環之該一個或多個突變在根據SEQ ID NO. 3之位置87與93之間。
- 如請求項57之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含根據SEQ ID NO.3之殘基87、88、92或93中之一者或多者處的胺基酸缺失或突變。
- 如請求項57之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含以下中之一者或多者： − 在該親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失； − 在該親環素結合環之位置88處進行取代的脯胺酸； − 在該親環素結合環之位置92處進行取代的脯胺酸；及 − 在該親環素結合環之位置93處進行取代的丙胺酸。
- 如請求項57之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含以下中之一者或多者： − ΔH87突變； − A88P突變； − A92P突變； − P93A突變；或 − 以上突變之組合。
- 如請求項55之HIV-1變異體，其中該異源Vif包含選自猿猴免疫缺乏病毒（SIVVif）之異源Vif。
- 如請求項61之HIV-1變異體，其中該SIVVif係選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6-7、與SEQ ID NO. 6-7具有至少85%序列同源性之序列，或其片段或變異體。
- 如請求項62之HIV-1變異體，其中該SIVVif插入Pol區之上游及Vpr區之下游。
- 如請求項63之HIV-1變異體，其中該SIVVif包含插入該Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子，及插入該Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞。
- 如請求項63之HIV-1變異體，其中位於Vif/Vpr重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 如請求項63之HIV-1變異體，其中位於Pol/Vif重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項54至66中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項56至66中任一項之經基因修飾之衣殼肽及異源病毒感染因子（Vif）。
- 一種表現載體，其編碼如請求項68之核苷酸序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項54至66中任一項之具有一個或多個突變的HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項70之核苷酸序列。
- 一種經基因修飾之HIV-1變異體，其適於感染秘魯夜猴（梟猴）。
- 如請求項72之HIV-1變異體，其中該HIV-1變異體包含： − 經基因修飾之衣殼肽； − 經修飾之病毒感染因子（Vif）；及 − 一個或多個調節該變異體之感染性的額外突變。
- 如請求項73之HIV-1變異體，其中該經基因修飾之衣殼肽包含親環素結合環之一個或多個突變。
- 如請求項74之HIV-1變異體，其中該親環素結合環之該一個或多個突變在根據SEQ ID NO. 3之位置87與93之間。
- 如請求項75之HIV-1變異體，其中該親環素結合環位置包含根據SEQ ID NO. 3之殘基87、88、92或93中之一者或多者處的胺基酸缺失或突變。
- 如請求項74之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含以下位置處的胺基酸缺失或取代： − 在該親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失； − 在該親環素結合環之位置88處進行取代的脯胺酸； − 在該親環素結合環之位置92處進行取代的脯胺酸；及 − 在該親環素結合環之位置93處進行取代的丙胺酸；或 − 以上缺失或取代之組合。
- 如請求項74之HIV-1變異體，其中該親環素結合環包含以下一個或多個突變： − ΔH87突變； − A88P突變； − A92P突變； − P93A突變；或 − 以上突變之組合。
- 如請求項73之HIV-1變異體，其中該經基因修飾之Vif包含選自猿猴免疫缺乏病毒（SIVVif）之Vif。
- 如請求項79之HIV-1變異體，其中該SIVVif係選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6-7、與SEQ ID NO. 6-7具有至少85%序列同源性之序列，或其片段或變異體。
- 如請求項80之HIV-1變異體，其中該SIVVif插入Pol區之上游及Vpr區之下游。
- 如請求項81之HIV-1變異體，其中該SIVVif包含插入該Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子，及插入該Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞。
- 如請求項81之HIV-1變異體，其中位於Vif/Vpr重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 如請求項81之HIV-1變異體，其中位於Pol/Vif重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 如請求項73之HIV-1變異體，其中該一個或多個突變存在於衣殼蛋白、Tat蛋白及/或包膜（Env）蛋白中。
- 如請求項85之HIV-1變異體，其中至少一個突變係選自： − 在根據SEQ ID NO. 3之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處的取代突變； − 在根據SEQ ID NO. 4之該HIV-1 Tat蛋白的位置58處的取代突變； − 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置9或10處的取代突變；及 − 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置545處的取代突變；或 − 在根據SEQ ID NO. 5之該HIV-1 Env蛋白的位置167處的取代突變；或 − 以上突變之組合。
- 如請求項85之HIV-1變異體，其中該一個或多個突變係選自： − 在根據SEQ ID NO. 10或11之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處進行取代的精胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 12之該HIV-1 Tat蛋白的位置58處進行取代的蘇胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 13之該HIV-1 Env蛋白的位置9處進行取代的精胺酸， − 在根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的位置10處的色胺酸；及 − 在根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的位置545處進行取代的甘胺酸；或 − 在根據SEQ ID NO. 19之該HIV-1 Env蛋白的位置167處進行取代的甘胺酸；或 − 以上突變之組合。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項72至87中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項72至87中任一項之具有一個或多個突變的經基因修飾之肽。
- 一種表現載體，其編碼如請求項89之核苷酸序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項72至87中任一項之具有一個或多個突變的HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項91之核苷酸序列。
- 一種HIV-1變異體，其經基因修飾以感染秘魯夜猴（梟猴），其中該HIV-1變異體包含： − 根據SEQ ID NO. 9之經修飾之衣殼肽，其具有一個或多個選自以下之突變： − ΔH87突變，其中在親環素結合環之位置87處的組胺酸殘基缺失； − A88P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換； − A92P突變，其中該親環素結合環之丙胺酸殘基經脯胺酸置換； − P93A突變，其中該親環素結合環之脯胺酸經丙胺酸殘基置換； − 及插入Pol區之上游及Vpr區之下游之猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif），其中該SIVVif係選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7、或具有至少85%序列同源性之序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項93之具有一個或多個突變的經基因修飾之肽。
- 一種表現載體，其編碼如請求項94之核苷酸序列。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項93之具有一個或多個突變的HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項96之核苷酸序列。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項93之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種HIV-1變異體，其經基因修飾以感染秘魯夜猴（梟猴），其中該HIV-1變異體包含： − 根據SEQ ID NO. 3或其片段或變異體之衣殼肽，該衣殼肽具有以下突變： − ΔH87突變； − A88P突變； − A92P突變； − P93A突變； − 插入Pol區之上游及Vpr區之下游之猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif），其中該SIVVif係選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7，或其片段或變異體；及 − 一個或多個選自以下之額外突變： − 在根據SEQ ID NO. 10或11之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處進行取代的精胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 12之HIV-1 Tat蛋白的位置58處進行取代的蘇胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 13之HIV-1 Env蛋白的位置9處進行取代的精胺酸， − 在根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的位置10處的色胺酸；及 − 在根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的位置545處進行取代的甘胺酸；或 − 在根據SEQ ID NO. 19之該HIV-1 Env蛋白的位置167處進行取代的甘胺酸；或 − 以上突變之組合。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼如請求項99之HIV-1變異體。
- 一種表現載體，其編碼如請求項100之核苷酸序列。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項99之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種哺乳動物，其感染有如請求項99之HIV-1變異體。
- 一種生物樣品，其來自感染有如請求項99之HIV-1變異體之哺乳動物模型。
- 如請求項103至104中任一項之哺乳動物，其中該哺乳動物包含秘魯夜猴（梟猴）。
- 一種經分離之核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NO. 1-20或其片段或變異體之蛋白質。
- 一種可操作地連接至啟動子之經分離之核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NO. 6-20或其片段或變異體之蛋白質。
- 一種HIV-1變異體，其具有蛋白質，該蛋白質包含根據SEQ ID NO. 6-20或其片段或變異體之胺基酸序列中之一者或多者。
- 一種編碼HIV-1變異體之經分離之核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NO. 6-20或其片段或變異體之蛋白質。
- 一種可操作地連接至啟動子之編碼HIV-1變異體的經分離之核苷酸序列，其編碼選自SEQ ID NO. 6-20或其片段或變異體之蛋白質。
- 一種HIV-1變異體，其經基因修飾以感染秘魯夜猴（梟猴），其中該HIV-1變異體包含根據SEQ ID NO. 3或其片段或變異體之經基因修飾之衣殼肽，該經基因修飾之衣殼肽具有以下突變：∆H87突變；A88P突變；A92P突變；P93A突變。
- 如請求項111之HIV-1變異體，其中內源病毒感染因子（Vif）經猿猴免疫缺乏病毒病毒感染因子（SIVVif）置換。
- 如請求項112之HIV-1變異體，其中該SIVVif係選自：NLRMmac、NLRPptm、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7，或其片段或變異體。
- 如請求項113之HIV-1變異體，其中該SIVVif插入Pol區之上游及Vpr區之下游。
- 如請求項114之HIV-1變異體，其中該SIVVif包含插入該Pol區之終止密碼子下游的起始密碼子，及插入該Vpr區之起始密碼子上游的終止密碼子，且其中位於該SIVVif內的內部起始密碼子被破壞。
- 如請求項115之HIV-1變異體，其中位於Vif/Vpr重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 如請求項115之HIV-1變異體，其中位於Pol/Vif重疊區內之一個或多個起始密碼子被破壞。
- 如請求項111至117中任一項之HIV-1變異體，其進一步包含一個或多個選自以下之額外突變： − 在根據SEQ ID NO. 10或11之該HIV-1衣殼蛋白的位置120處進行取代的精胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 12之HIV-1 Tat蛋白的位置58處進行取代的蘇胺酸； − 在根據SEQ ID NO. 13之HIV-1 Env蛋白的位置9處進行取代的精胺酸， − 在根據SEQ ID NO. 14之該HIV-1 Env蛋白的位置10處的色胺酸；及 − 在根據SEQ ID NO. 15之該HIV-1 Env蛋白的位置545處進行取代的甘胺酸；或 − 在根據SEQ ID NO. 19之該HIV-1 Env蛋白的位置167處進行取代的甘胺酸；或 − 以上突變之組合。
- 如請求項111至117中任一項之HIV-1變異體，其中該HIV-1包含HIV-1之NL4-3殖株。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項111至117中任一項之HIV-1變異體及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種哺乳動物，其感染有如請求項111至117中任一項之HIV-1變異體。
- 一種生物樣品，其來自感染有如請求項111至117中任一項之HIV-1變異體之哺乳動物模型。
- 如請求項121至122中任一項之哺乳動物，其中該哺乳動物包含秘魯夜猴（梟猴）。
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