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TW202430569A - 靶向sirpa與密連蛋白18.2的雙特異性分子 - Google Patents

靶向sirpa與密連蛋白18.2的雙特異性分子 Download PDF

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TW202430569A
TW202430569A TW113102013A TW113102013A TW202430569A TW 202430569 A TW202430569 A TW 202430569A TW 113102013 A TW113102013 A TW 113102013A TW 113102013 A TW113102013 A TW 113102013A TW 202430569 A TW202430569 A TW 202430569A
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陸文強
耿亞男
蔣海俠
高瑞
宏韜 盧
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中國商科望（蘇州）生物醫藥科技有限公司
中國商科望（上海）生物醫藥科技有限公司
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Abstract

本揭露涉及抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，靶向SIRPα與密連蛋白18.2的雙特異性分子，藥物組成物，以及這樣的分子在預防、診斷或治療癌症疾病中的用途。

Description

靶向SIRPA與密連蛋白18.2的雙特異性分子
本揭露涉及抗SIRPα抗體或其抗原結合片段以及靶向SIRPα（訊號調節蛋白α）與密連蛋白（Claudin）18.2（密連蛋白18同種型2）的雙特異性分子及其用途。
本部分中的陳述僅提供與本揭露相關的背景資訊，並且不必然構成先前技術。
隨著癌症治療領域研究的不斷深入，針對癌症的分子標靶治療藥物的研究、開發及應用越來越受到重視。抗體藥物因具有靶向性強、副作用小及治療效果顯著的優點而迅速成為癌症標靶治療的熱點。
然而，腫瘤細胞可以透過修飾其自身表面抗原及改變腫瘤組織周圍的微環境來逃避先天免疫系統的監視、識別及攻擊（即所謂的腫瘤免疫逃脫）從而不斷分裂及生長。例如，腫瘤細胞透過高表現CD47來抑制巨噬細胞的免疫功能並顯著抑制免疫細胞的活性，該CD47與巨噬細胞表面的抑制性受體訊號調節蛋白α（SIRPα或SIRPA）結合。（Willingham S B等人 The CD47-signal regulatory protein Alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors.[CD47訊號調節蛋白α（SIRPα）相互作用是人類實體腫瘤的治療標靶] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [美國國家科學院院刊]. 2012, 109(17): 6662-6667）。
訊號調節蛋白α（SIRPα、SIRPA）是SIRP家族的調節膜糖蛋白。它主要由骨髓細胞表現，也由幹細胞或神經元表現。SIRPα作為抑制性受體，並與廣泛表現的跨膜蛋白CD47相互作用。這種相互作用負向控制先天免疫細胞的效應物功能，例如宿主細胞吞噬作用。
因此，CD47對免疫細胞的抑制作用可以透過阻斷CD47-SIRPα訊號傳遞路徑（如SIRPα-Fc融合蛋白）來緩解，並表現出一定的抗腫瘤活性。野生型SIRPα-Fc融合蛋白由於其對CD47的低親和力而不具有有效的功效。
密連蛋白18（CLDN 18.2）屬密連蛋白家族，該家族在哺乳動物中具有至少27個成員（Furuse M.等人, J Cell Biol.[ 細胞生物學雜誌], 1998, 141, 1539）。密連蛋白18具有兩種不同的剪接變體，密連蛋白18.1或CLDN 18.1與密連蛋白18.2或CLDN 18.2。（Sanada Y.等人, J Pathol.[病理學雜誌], 2006, 208, 633）。CLDN 18.2是CD20樣分化蛋白，在各種類型的癌症中過度表現，例如胃癌、食管癌、胰腺癌及非小細胞肺癌。因此，該分子是治療這樣的癌症的有價值的標靶。
一般來說，需要開發新型腫瘤標靶分子。
出於上述目的，本揭露涉及如本文所述的抗SIRPα抗體。具體而言，本揭露涉及抗SIRPα單鏈可變片段、基於抗SIRPα單鏈可變片段的雙特異性分子與藥物組成物及其用途。
本文提供了新型抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變結構域（VH）及重鏈可變結構域（VL）。抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；(2) 分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；(3) 分別地，SEQ ID NO: 20、47及48。抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；(2) 分別地，SEQ ID NO: 25、27及28。
在一些實施例中，HCDR1具有SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列，HCDR2具有如X 1DPEDX 2ETK（SEQ ID NO: 60）所示的胺基酸序列，HCDR3具有如DRGLX 3Y（SEQ ID NO: 61）所示的胺基酸序列，LCDR1具有如X 4ASX 5SVSSSYLY（SEQ ID NO: 45）所示的胺基酸序列，LCDR2具有如YSX 6SNX 7AS（SEQ ID NO: 46）所示的胺基酸序列，以及LCDR3具有SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，X 1是V或I，X 2是A或G，X 3是V或A，X 4是R或S，X 5是Q或S，X 6是A或T，X 7是R或L。
在一些實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、21及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 24、26及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、22及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、47及48中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；(2) 分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；(3) 分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；(2) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；(3) 分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含VH及/或VL，該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO: 14、16、18及54中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同；該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO: 15、17、19及55中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段與人及/或小鼠SIRPα結合。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段或單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段是scFv，其中VH及VL經由第一肽連接子連接，可選地，第一肽連接子包括(Gly4Ser)4。在一些實施例中，在抗SIRPα抗體或其抗原結合片段中，VH的N端與VL的C端相連接。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段是嵌合抗體或人源化抗體。
在另一方面，本文提供了雙特異性分子，其包含 (1) SIRPα結合結構域，其包含重鏈可變結構域（VH）及重鏈可變結構域（VL），其中VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%，例如約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；(2) 分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；(3) 分別地，SEQ ID NO: 20、47及48。VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%，例如約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；(2) 分別地，SEQ ID NO: 25、27及28；以及 (2) 與標靶抗原結合的第二結構域，該第二結構域與SIRPα結合結構域融合。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，HCDR1具有SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列，HCDR2具有如X 1DPEDX 2ETK（SEQ ID NO: 60）所示的胺基酸序列，HCDR3具有如DRGLX 3Y（SEQ ID NO: 61）所示的胺基酸序列，LCDR1具有如X 4ASX 5SVSSSYLY（SEQ ID NO: 45）所示的胺基酸序列，LCDR2具有如YSX 6SNX 7AS（SEQ ID NO: 46）所示的胺基酸序列，以及LCDR3具有SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，X 1是V或I，X 2是A或G，X 3是V或A，X 4是R或S，X 5是Q或S，X 6是A或T，X 7是R或L。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，(1) HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、21及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 24、26及28中所示的胺基酸序列；(2) HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、22及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列；或 (3) HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、47及48中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，在雙特異性分子中，SIRPα結合結構域的VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；(2) 分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；(3) 分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33；以及/或者SIRPα結合結構域的VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；(2) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；(3) 分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
在一些實施例中，在雙特異性分子中，SIRPα結合結構域的VH包含分別與SEQ ID NO: 14、16、18及54中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及/或者SIRPα結合結構域的VL包含分別與SEQ ID NO: 15、17、19及55中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，(1) VH包含與SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；(2) VH包含與SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；(3) VH包含與SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；或 (4) VH包含與SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，在雙特異性分子中，SIRPα結合結構域是scFv，其中VH及VL經由第一多肽連接子連接，可選地第一多肽連接子包括(Gly4Ser)4。在一些實施例中，VH的N端與VL的C端相連接。
在一些實施例中，第二結構域與癌細胞表面表現的標靶抗原結合。標靶抗原可以是免疫檢查點分子，例如CD47、PD1、密連蛋白18.2或CTLA-4。在一些實施例中，第二結構域與密連蛋白18.2及/或CD47結合，較佳為密連蛋白18.2。
在一些實施例中，第二結構域包含：a) 包含CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區（VH），其中VH CDR1、CDR2及CDR3分別具有與SEQ ID NO: 39、40及41中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同的胺基酸序列；以及b) 包含CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區（VL），其中VL CDR1、CDR2及CDR3分別具有與SEQ ID NO: 42、43及44中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二結構域包含VH及VL，該VH具有與SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，該VL具有與SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二結構域包含輕鏈恒定區（CL），其為κ或λ輕鏈。在一些實施例中，CL包含SEQ ID NO: 12或13中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二結構域包含具有SEQ ID NO: 11中所示的胺基酸序列的重鏈恒定區（CH）。
在一些實施例中，雙特異性分子是對稱的雙特異性分子，其中SIRPα結合結構域在SIRPα結合結構域的重鏈可變結構域的N端處與第二結構域的重鏈恒定區的C端融合。較佳地，SIRPα結合結構域及第二結構域經由具有式(Gly4Ser)n的第二肽連接子共價連接，其中n是1至5的整數，例如1、2、3、4、5。在一些實施例中，第一結構域及第二結構域經由(Gly4Ser)3共價連接。
在一些實施例中，雙特異性分子包含重鏈及輕鏈，該重鏈包含與SEQ ID NO: 56、58或59中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及該輕鏈包含與SEQ ID NO: 57中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，雙特異性分子的重鏈包含與SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及雙特異性分子的輕鏈包含與SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，雙特異性分子的重鏈包含與SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及雙特異性分子的輕鏈包含與SEQ ID NO: 6中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，雙特異性分子阻斷CD47及SIRPα的相互作用，去除SHP-1/2抑制，及/或與免疫效應細胞（例如巨噬細胞）上的Fc受體接合以活化吞噬作用。
在一些實施例中，雙特異性分子增強免疫效應細胞對表現與第二結構域結合的標靶抗原（例如人密連蛋白18.2及人SIRPα）的癌細胞的吞噬作用。
在另一方面，本揭露提供了編碼上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子的分離的多核苷酸。
在另一方面，本揭露提供了包含上述多核苷酸的構築物。
在另一方面，本揭露提供了抗體表現系統，其包含上述構築物或具有與上述外源多核苷酸整合的基因組，較佳地，該表現系統是細胞表現系統。
在另一方面，本揭露提供了用於產生上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子的方法，該方法包括：在適合表現抗體的條件下，使用上述抗體表現系統表現抗體或蛋白。
在另一方面，本揭露提供了藥物組成物，其包含上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子，以及藥學上可接受的載體。
在另一方面，本揭露提供了套組，其包含本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子、分離的多核苷酸或構築物。
在另一方面，本揭露提供了本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物在製造用於預防、診斷或治療疾病、障礙或病症的治療劑中的用途。在一些實施例中，該疾病、障礙或病症是癌症。在一些實施例中，至少癌細胞表現密連蛋白18.2，較佳為人密連蛋白18.2。
在一些實施例中，癌症是實體腫瘤。在一些實施例中，癌症包括食管癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、典型何杰金氏淋巴瘤、血液惡性腫瘤、頭頸癌及鼻咽癌、膽囊癌及其轉移、Krukenberg氏瘤、腹膜轉移及/或淋巴結轉移。
在另一方面，本揭露提供了治療患有癌症的受試者的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物。在一些實施例中，受試者是哺乳動物，這些哺乳動物包括人、小鼠及食蟹猴。
在另一方面，本揭露提供了降低腫瘤生長速率的方法，該方法包括使腫瘤細胞與有效量的本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物接觸。
在另一方面，本揭露提供了殺死腫瘤細胞的方法，該方法包括使腫瘤細胞與有效量的本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物接觸。
下面將更詳細地解釋本揭露。本說明書不旨在是可以實現本發明的所有不同方式或可添加到本發明中的所有特徵的詳細目錄。例如，可以將關於一個實施例說明的特徵併入其他實施例中，並且可以將關於特定的實施例說明的特徵從該實施例中刪除。另外，在不偏離本發明的情況下考慮本揭露，本文所建議的各種實施例的眾多變化及添加對於本案所屬技術領域中具有通常知識者來說將是顯而易見的。因此，以下描述旨在說明本發明的一些特定實施例，而不是窮盡地指定其所有排列、組合及變化。
除非另有定義，否則本文所使用的全部技術及科學術語具有與本揭露所屬領域的具有通常知識者通常所理解的相同的含義。儘管在本揭露的測試實踐中可以使用與本文所述的方法及材料類似或等同的任何方法及材料，但是本文描述了較佳的材料及方法。在描述及要求保護本揭露時，將使用以下術語。
本揭露的其他特徵及優點將透過以下詳細描述及圖式以及請求項變得顯而易見。
術語 術語「抗體」（可以複數互換使用）是免疫球蛋白分子，其能夠透過位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別位點與標靶（例如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等）特異性結合。如本文所用，術語「抗體」不僅包括完整（即全長）多株或單株抗體，還包括其抗原結合片段（例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）、單鏈（scFv）、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體、奈米抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體）及包含具有所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構築物，包括抗體的糖基化變體、抗體的胺基酸序列變體及共價修飾的抗體。抗體包括任何類別的抗體，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM（或其亞類），並且抗體不需要是任何特定類別。根據其重鏈恒定結構域的抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類別。免疫球蛋白主要有五類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其中幾種可進一步分為亞類（同種型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構及三維構型是熟知的。
典型的抗體分子包含重鏈可變區（VH）及輕鏈可變區（VL）。可變區是在抗體分子的N端處的胺基酸組成及排列具有較大變化的區域。特異性結合位點（即抗原結合位點）用於確定抗體識別的特異性。VH及VL區可以進一步細分為高度變異區，也稱為「互補決定區」（CDR），其間穿插稱為「框架區」（FR）的更保守區域。每個VH及VL通常由三個CDR及四個FR組成，它們從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」是免疫球蛋白（例如，小鼠或人）的重鏈（VH）及輕鏈（VL）可變區共價連接形成VH::VL異二聚體的融合蛋白。重鏈（VH）及輕鏈（VL）直接連接或透過編碼肽的連接子或間隔子連接，該連接子或間隔子將VH的N端與VL的C端連接，或將VH的C端與VL的N端連接。本案所屬技術領域中具有通常知識者將能夠選擇用於本發明的適當構型。
如本文所用，術語「雙特異性分子」是指對兩個特定表位表現出雙重結合特異性及親和力的抗體，或其中所有抗體對兩個特定表位均表現出雙重結合特異性及親和力的抗體組成物。
「Fc區」（片段可結晶區）或「Fc結構域」或「Fc片段」是指介導免疫球蛋白與宿主組織或因子結合的抗體重鏈的C端區域，包括與位於免疫系統各種細胞（例如效應細胞）上的Fc受體結合或與經典補體系統的第一組分（Clq）結合。因此，Fc區包含抗體的恒定區，不包含第一恒定區免疫球蛋白結構域（例如，CH1或CL）。Fc也可以單獨地或在包含Fc的蛋白質多肽的上下文中指代該區域。
術語「融合（fusion）」或「融合（fused）」當用於胺基酸序列（例如，肽、多肽或蛋白質）時，是指將兩個或多個胺基酸序列（例如透過化學鍵合或重組手段）組合成單個胺基酸序列。融合胺基酸序列可以透過兩個編碼多核苷酸序列的基因重組產生，以及可以透過將含有重組多核苷酸的構築物引入宿主細胞的方法來表現。
術語「序列同一性百分比（%）」定義為在比對序列並引入缺口（如果需要）以實現最大序列同一性百分比後，並且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分，候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。用於確定胺基酸序列同一性百分比的比對可以使用揭露可用的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體以各種方式實現。例如，可以使用NCBI資料庫的BLAST程式來確定同一性。
術語「人源化抗體」是指具有基本上來源於來自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點的分子，其中分子的其餘免疫球蛋白結構基於人免疫球蛋白的結構及/或序列。抗原結合位點可以包含與恒定結構域融合的完整可變結構域，或者僅包含移植到可變結構域中的適當框架區中的互補決定區（CDR）。抗原結合位點可以是野生型，或者經一個或多個胺基酸取代修飾。例如，進行修飾以使抗體更類似於人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗體保留了所有CDR序列（例如，人源化單結構域抗體包含來自羊駝的所有三個CDR）。其他形式具有一個或多個相對於原始抗體已被改變的CDR。
「嵌合抗體」是指可變區來源於一種物種而恒定區來源於另一種物種的抗體，例如可變區來源於小鼠或羊駝抗體而恒定區來源於人抗體的抗體。
藥劑（例如藥物組成物）的「治療有效量」是指在一定劑量水平及一段時間內有效達到所需治療或預防效果的量。例如，治療有效量的藥劑可以消除、減少、延緩、最大程度減輕或預防疾病的不良影響。
術語「藥學上可接受的載體」是指藥物組成物中除活性成分以外的對受試者無毒的成分。藥學上可接受的載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語「治療/預防」（及其語法變體）是指試圖改變被治療個體疾病的自然進展，並且可以是在臨床病理學過程中實施的預防或臨床干預。期望的治療效果包括但不限於預防疾病的發生或復發、緩解症狀、減輕疾病的任何直接或間接病理後果、防止轉移、減緩疾病進展速度、改善或減輕疾病狀態、以及減輕或改善預後。在一些實施例中，本揭露的抗體可用於延緩疾病的發展或延緩障礙的進展。
如本文所用，術語「約」或「近似」是指量、水平、值、數量、頻率、百分比、同一性、尺寸、大小、數目、重量或長度相對於參考量、水平、值、數量、頻率、百分比、同一性、尺寸、大小、數目、重量或長度變化多達30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在特定實施例中，當在數值之前時，術語「約」或「近似」表示該值加上或減去20%、15%、10%或5%的範圍。
在本揭露中，「胺基酸」是指含有胺基（-NH 2）及羧基（-COOH）官能團以及每個胺基酸所特有的側鏈的有機化合物。胺基酸的名稱用標準的單字母或三字母代碼表示，如下所示：
胺基酸名稱 三字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
半胱胺酸 Cys C
天冬胺酸 Asp D
谷胺酸 Glu E
苯丙胺酸 Phe F
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異亮胺酸 Ile I
賴胺酸 Lys K
亮胺酸 Leu L
甲硫胺酸 Met M
天冬醯胺 Asn N
脯胺酸 Pro P
麩醯胺 Gln Q
精胺酸 Arg R
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
纈胺酸 Val V
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
通常，與本文所述的細胞及組織培養、病理學、腫瘤學、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交相關的術語及技術是本領域中熟知及常用的那些。除非另有說明，否則本揭露的方法及技術通常根據本領域熟知的傳統方法且如在本說明書中全篇引用及討論的各種通用及更具體的參考文獻中所描述的來進行。參見例如，Green及Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子複製：實驗室手冊], 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], Cold Spring Harbor, N.Y. [紐約冷泉港] (2012)；Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic [治療性單株抗體：從實驗台到臨床], Zhiqiang An (編輯), Wiley [威利出版社], (2009)；以及Antibody Engineering [抗體工程化], 第二版, 第1卷及第2卷, Ontermann及Dubel編輯, Springer-Verlag [施普林格出版社], Heidelberg [海德堡] (2010)。
抗SIRPα抗體或其抗原結合片段 本揭露提供了新型抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的示例，其包含重鏈可變結構域（VH）及重鏈可變結構域（VL）。VH包含互補決定區（CDR）1、2及3，以及VL包含CDR1、CDR2及CDR3。
在一些實施例中，VH的CDR1（即HCDR1）與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。VH的CDR2（即HCDR2）與SEQ ID NO: 21、22或47的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。VH的CDR3（即HCDR3）與SEQ ID NO: 23或48的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。
在一些實施例中，VL的CDR1（即LCDR1）與SEQ ID NO: 24或25的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。VL的CDR2（即LCDR2）與SEQ ID NO: 26或27的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。VL的CDR3（即LCDR3）與SEQ ID NO: 28的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH包含CDR1、CDR2及CDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；(2) 分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；(3) 分別地，SEQ ID NO: 20、47及48。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH的CDR1、CDR2及CDR3具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；或分別地，SEQ ID NO: 20、47及48。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL包含CDR1、CDR2及CDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；(2) 分別地，SEQ ID NO: 25、27及28。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL的CDR1、CDR2及CDR3具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；或分別地，SEQ ID NO: 25、27及28。
在一些實施例中，HCDR1具有SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列，HCDR2具有如X 1DPEDX 2ETK（SEQ ID NO: 60）所示的胺基酸序列，HCDR3具有如DRGLX 3Y（SEQ ID NO: 61）所示的胺基酸序列，LCDR1具有如X 4ASX 5SVSSSYLY（SEQ ID NO: 45）所示的胺基酸序列，LCDR2具有如YSX 6SNX 7AS（SEQ ID NO: 46）所示的胺基酸序列，以及LCDR3具有SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，X 1是V或I，X 2是A或G，X 3是V或A，X 4是R或S，X 5是Q或S，X 6是A或T，X 7是R或L。
在一些實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、21及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 24、26及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、22及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、47及48中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH包含FR1、FR2、FR3及FR4。VH的FR1與SEQ ID NO: 29或49的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。VH的FR2與SEQ ID NO: 30、31或50的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。VH的FR3與SEQ ID NO: 32或51中所示的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。VH的FR4與SEQ ID NO: 33的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH的FR1、FR2、FR3及FR4具有與以下中所示的胺基酸序列約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；或分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VH的FR1、FR2、FR3及FR4具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；或分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL包含FR1、FR2、FR3及FR4。VL的FR1與SEQ ID NO: 34的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。VL的FR2與SEQ ID NO: 35或52的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。VL的FR3與SEQ ID NO: 36或53中所示的胺基酸序列差異不超過3、2、1、0個胺基酸。VL的FR4與SEQ ID NO: 37或38的胺基酸序列差異不超過5、4、3、2、1、0個胺基酸。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL的FR1、FR2、FR3及FR4具有與以下中所示的胺基酸序列約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；或分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的VL的FR1、FR2、FR3及FR4具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；或分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
在一些實施例中，VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、30、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
在一些實施例中，VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、31、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及38中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
在一些實施例中，VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 49、50、51及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、52、53及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含VH，該VH的胺基酸序列與SEQ ID NO: 14、16、18及54中所示的胺基酸序列之一80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含VL，該VL的胺基酸序列與SEQ ID NO: 15、17、19及55中所示的胺基酸序列之一80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH包含與SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列的VH及具有SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列的VL；或具有SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列的VH及具有SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列的VL；或具有SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列的VH及具有SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列的VL；或具有SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列的VH及具有SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段結合人及/或小鼠SIRPα，較佳為結合人SIRPα。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段或單鏈可變片段（scFv），較佳為scFv，以及VH及VL經由第一肽連接子連接。在某些實施例中，VH的N端與VL的C端融合。
在一些實施例中，第一肽連接子包括(Gly4Ser)4。在一些實施例中，第一肽連接子是(Gly4Ser)4。
在一些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段是嵌合抗體或人源化抗體。
本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段特異性結合人SIRPα，從而阻斷CD47與SIRPα之間的相互作用，上調免疫應答並增強對不需要的宿主細胞（如腫瘤細胞）的吞噬作用。
基於本揭露中特異性互補決定區的用途，根據本領域技術設計的人源化抗體均包含在本揭露中。人源化抗體進一步提高了藥物安全性，有效降低了抗體的免疫原性。本揭露獲得的具有修飾框架區的人源化抗體仍保持高親和力，使其可用於實際臨床應用。
雙特異性分子 本揭露涉及基於上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段的雙特異性分子。雙特異性分子包含SIRPα結合結構域及與標靶抗原結合的第二結構域，其中第二結構域與SIRPα結合結構域融合。
SIRPα結合結構域包含重鏈可變結構域（VH）及重鏈可變結構域（VL）。SIRPα結合結構域的VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同：分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；或分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；或分別地，SEQ ID NO: 20、47及48。在一些實施例中，SIRPα結合結構域的HCDR1、HCDR2及HCDR3具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；或分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；或分別地，SEQ ID NO: 20、47及48。
SIRPα結合結構域的VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同：分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；或分別地，SEQ ID NO: 25、27及28。在一些實施例中，SIRPα結合結構域的LCDR1、LCDR2及LCDR3具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；或分別地，SEQ ID NO: 25、27及28。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，HCDR1具有SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列，HCDR2具有如X 1DPEDX 2ETK（SEQ ID NO: 60）所示的胺基酸序列，HCDR3具有如DRGLX 3Y（SEQ ID NO: 61）所示的胺基酸序列，LCDR1具有如X 4ASX 5SVSSSYLY（SEQ ID NO: 45）所示的胺基酸序列，LCDR2具有如YSX 6SNX 7AS（SEQ ID NO: 46）所示的胺基酸序列，以及LCDR3具有SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，X 1是V或I，X 2是A或G，X 3是V或A，X 4是R或S，X 5是Q或S，X 6是A或T，X 7是R或L。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，(1) HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、21及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 24、26及28中所示的胺基酸序列；(2) HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、22及23中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列；或 (3) HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、47及48中所示的胺基酸序列；以及LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；或分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；或分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33。在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VH FR1、FR2、FR3及FR4具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；或分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；或分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33。
在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列至少80%，例如約80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%相同：分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；或分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；或分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VL FR1、FR2、FR3及FR4具有以下中所示的胺基酸序列：分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；或分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；或分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、30、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、31、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及38中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 49、50、51及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、52、53及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VH包含與分別在SEQ ID NO: 14、16、18及54中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列。在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VH具有分別在SEQ ID NO: 14、16、18及54中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VL包含與分別在SEQ ID NO: 15、17、19及55中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VL具有分別在SEQ ID NO: 15、17及19中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含與SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含與SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含與SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，在SIRPα結合結構域中，VH包含與SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及VL包含與SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，SIRPα結合結構域的VH包含或具有SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列，以及SIRPα結合結構域的VL包含或具有SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列；或SIRPα結合結構域的VH包含或具有SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列，以及SIRPα結合結構域的VL包含或具有SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列；或SIRPα結合結構域的VH包含或具有SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列，以及SIRPα結合結構域的VL包含或具有SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列；或SIRPα結合結構域的VH包含或具有SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列，以及SIRPα結合結構域的VL包含或具有SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，SIRPα結合結構域是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段或單鏈可變片段（scFv），較佳地，SIRPα結合結構域是scFv，其中VH及VL經由第一多肽連接子連接。
在一些實施例中，第一多肽連接子包括或是(Gly4Ser)4。
在一些實施例中，VH的N端與VL的C端相連接。
第二結構域與癌細胞表面表現的標靶抗原結合。標靶抗原可以是免疫檢查點分子，例如CD47、PD1、密連蛋白18.2或CTLA-4。在一些實施例中，第二結構域與密連蛋白18.2及/或CD47結合，較佳為密連蛋白18.2。
在一些實施例中，第二結構域包含： a) 重鏈可變區（VH），其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中VH CDR1具有與SEQ ID NO: 39的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列；VH CDR2具有與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列；VH CDR3具有與SEQ ID NO: 41的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列；以及 b) 輕鏈可變區（VL），其包含CDR1、CDR2及CDR3，其中VL CDR1具有與SEQ ID NO: 42的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列；VL CDR2具有與SEQ ID NO: 43的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列；VL CDR3具有與SEQ ID NO: 44的胺基酸序列至少80%，例如80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二結構域包含具有分別在SEQ ID NO: 39、40及41中所示的胺基酸序列的VH CDR1、CDR2及CDR3；以及具有分別在SEQ ID NO: 42、43及44中所示的胺基酸序列的VL CDR1、CDR2及CDR3。
在一些實施例中，第二結構域包含VH及VL，該VH具有與SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，該VL具有與SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，第二結構域包含具有SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列的VH及具有SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列的VL。
在一些實施例中，第二結構域包含輕鏈恒定區（CL），其為κ或λ輕鏈。輕鏈恒定區（κ）具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列，以及輕鏈恒定區（λ）具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列。
在一些實施例中，第二結構域包含重鏈恒定區（CH），較佳為人IgG1 CH。在一些實施例中，人IgG1 CH具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列。
在一些實施例中，雙特異性分子是對稱的雙特異性分子，其中SIRPα結合結構域的重鏈可變結構域的N端與第二結構域的重鏈恒定區的C端融合。較佳地，SIRPα結合結構域及第二結構域經由具有式(Gly4Ser)n的第二肽連接子共價連接，其中n是1至5的整數，例如1、2、3、4、5。在一些實施例中，SIRPα結合結構域及第二結構域經由(Gly4Ser)3共價連接。
雙特異性分子包含重鏈及輕鏈。在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 56、58或59中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及輕鏈包含與SEQ ID NO: 57中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及輕鏈包含與SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈包含與SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及輕鏈包含與SEQ ID NO: 6中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈具有SEQ ID NO: 56、58或59中所示的胺基酸序列；以及輕鏈具有SEQ ID NO: 57中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈具有SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列；以及輕鏈具有SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，重鏈具有SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列；以及輕鏈具有SEQ ID NO: 6中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，雙特異性分子阻斷CD47及SIRPα的相互作用，去除SHP-1/2抑制，及/或與免疫效應細胞（例如巨噬細胞）上的Fc受體接合以活化吞噬作用。「SHP」是指酪胺酸磷酸酶抑制劑。「效應細胞」是可以執行免疫效應物功能的免疫細胞，例如巨噬細胞、自然殺手細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞。
在一些實施例中，雙特異性分子增強免疫效應細胞對表現與第二結構域結合的標靶抗原（例如人密連蛋白18.2及人SIRPα）的癌細胞的吞噬作用。
本申請案的雙特異性分子具有高雙標靶結合親和力及特異性的優點，從而進一步增強抗腫瘤免疫功能。
提供的雙特異性分子顯示出對SIRPα（例如，人SIRPα）的更高親和力。在一些實施例中，雙特異性分子與人SIRPα結合，透過Octet規則檢測的KD不超過9.9E-7 M，或不超過9.9E-8 M。通常，KD值或親和常數是抗體與其標靶抗原之間的平衡解離常數或Kd/Ka的比率。Kd是指解離常數，並且Ka是指締合常數。
在一些實施例中，雙特異性分子與SIRPα（例如，人SIRPα、過表現人SIRPα的CHOK1細胞）結合，透過FACS（螢光流式細胞分選儀）檢測的EC50不超過3 nM、2 nM、1.5 nM、1 nM。
熱穩定性是蛋白質在不同溫度環境下保持其結構及功能完整性的能力，以及是抗體的固有特性，在製造及儲存過程中可影響產品穩定性（如聚集）。熔解溫度（Tm）值通常可以預測它們的熱穩定性。本文提供的雙特異性分子的Tm值範圍為40°C-70°C，較佳為55°C-60°C，例如48°C、50°C、55°C或57°C，表明抗體具有良好的熱穩定性。
在低pH條件下的良好穩定性對於抗體是重要的，因為純化過程通常涉及暴露於酸性溶液條件及常用的低pH病毒滅活。低pH通常會導致可溶性、不溶性聚集體並加速碎裂。本文提供的雙特異性分子在pH 3.0-3.5條件下具有良好的穩定性。
本文提供的雙特異性分子具有良好的凍融穩定性（freeze-thaw stability）。凍融穩定性通常被用來確定抗體對產品經常暴露的溫度循環的易感性。例如，原料藥經常被冷凍以能夠長期儲存。作為凍乾（lyophilization）過程的一部分，藥品可能會暴露在冷凍溫度下。凍融的主要降解途徑是聚集體，包括沉澱物、顆粒及可溶性顆粒。
本文提供的雙特異性分子具有良好穩定性，在4°C條件下至少7、14、28、28天，以及在40°C條件下至少14天，雙特異性分子的純度變化很小。
多核苷酸 本揭露提供了編碼上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子的分離的多核苷酸。
多核苷酸是DNA、RNA、DNA/RNA雜交體或其修飾形式的聚合物。在一些實施例中，多核苷酸是DNA的聚合物。多核苷酸是RNA的聚合物。使用傳統的程序（例如，透過使用能夠與編碼抗體的重鏈及輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針），可以容易地對編碼上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子的DNA或RNA進行分離及測序。也可以透過合成方法獲得編碼DNA或RNA。
使用本領域已知的重組技術，可以將編碼上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或雙特異性分子的分離的多核苷酸插入構築物中用於進一步複製（DNA擴增）或表現。
有許多構築物可用。構築物組分通常包含但不限於以下中的一種或多種：訊號序列、複製起點、一個或多個標記基因、強化子元件、啟動子（例如SV40、CMV、EF-1α）及轉錄終止序列。
構築物 本文提供的構築物包含以上提供的分離的多核苷酸。構築構築物的方法是本案所屬技術領域中具有通常知識者已知的。例如，構築物可以透過體外重組DNA技術、DNA合成技術或體內重組技術獲得。更特別地，構築物可以透過將分離的多核苷酸插入表現載體的多複製位點來構築。本揭露中的表現載體一般是指本領域熟知的各種可商購表現載體，例如，細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物細胞感染的病毒、哺乳動物細胞感染的病毒如腺病毒、反轉錄病毒或其他載體。載體還可以包含一個或多個可操作地連接到多核苷酸序列的調節序列，其中調節序列可以包含合適的啟動子序列。啟動子序列通常可操作地連接到編碼要表現的胺基酸序列的序列。啟動子可以是在選定的宿主細胞中表現出轉錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的及雜交的啟動子，並且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。調節序列還可以包含合適的轉錄終止子序列，該序列被宿主細胞識別以終止轉錄。終止子序列連接到編碼多肽的核苷酸序列的3'端或端，並且任何在所選宿主細胞中起作用的終止子都可以在本揭露中使用。
通常，合適的載體可以包含能夠在至少一種生物體中的複製起點、啟動子序列、方便的限制酶位點及一個或多個選擇性標記。例如，這些啟動子可以包括但不限於大腸桿菌（ Escherichia coli, E. coli）的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；及真核啟動子（包括CMV極早期啟動子（immediate-early promoter）、HSV胸苷激酶啟動子、早期及晚期SV40啟動子、畢赤酵母（ Pichia pastoris）的甲醇氧化酶啟動子），以及能夠控制原核細胞或真核細胞或病毒中基因表現的一些其他已知啟動子。標記基因可用於為選擇轉化的宿主細胞提供表型特徵。例如，標記基因可以包括但不限於用於真核細胞培養的二氫葉酸還原酶、新黴素抗性及綠色螢光蛋白（GFP），或用於大腸桿菌的四環素抗性或胺苄青黴素抗性。當多核苷酸被表現時，表現載體可以進一步包含強化子序列。如果將強化子序列插入載體中，則轉錄將得到強化。強化子是DNA的順式作用因子，典型地包含約10至300個堿基對。強化子作用於啟動子以強化基因轉錄。
抗體表現系統 本揭露提供了抗體表現系統，其包含以上提供的構築物或將以上提供的外源多核苷酸摻入基因組中。任何適合表現載體表現的細胞都可以用作宿主細胞。例如，宿主細胞可以是原核細胞，例如細菌細胞；或低級真核細胞，例如酵母細胞；或高等真核細胞，例如哺乳動物細胞，特別地包括但不限於大腸桿菌、鏈黴菌；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；或真菌細胞，例如酵母及絲狀真菌；植物細胞；來源於果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；動物細胞，例如CHO、COS、HEK293細胞或Bowes黑色素瘤細胞，或其組合。構築表現系統的方法應是本案所屬技術領域中具有通常知識者已知的，例如，包括但不限於顯微注射、基因槍法、電穿孔、病毒介導的轉化、電子轟擊、磷酸鈣沉澱或其組合。
藥物組成物 本揭露涉及藥物組成物，其包含上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或上述雙特異性分子以及藥學上可接受的載體。較佳地，組成物為藥物組成物，其含有上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或上述雙特異性分子以及藥學上可接受的載體。
通常，這些物質可以在無毒、惰性及藥學上可接受的水性載體培養基中配製，其中pH通常為約5-8，較佳為約6-8，儘管pH可以根據所配製物質的性質及要治療的疾病病症而改變。配製的藥物組成物可以透過傳統途徑施用，包括（但不限於）瘤內施用、腹膜內施用、靜脈內施用或局部施用。
本揭露的藥物組成物含有安全有效量（例如0.001重量%-99重量%，較佳為0.01重量%-95重量%，更佳為0.1重量%-90重量%）的所提供的單結構域抗體或融合蛋白以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括（但不限於）鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。藥物製劑應與施用模式相匹配。本申請案的藥物組成物可以製備成注射劑形式，例如，藥物組成物透過傳統方法用生理鹽水或含有葡萄糖及其他佐劑的水溶液製備。藥物組成物如注射劑及溶液應在無菌條件下製造。活性成分的劑量是治療有效量，例如每天約10 μg/kg體重至約100 mg/kg體重。此外，上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或上述雙特異性分子也可與其他治療劑一起使用。
套組 本揭露提供了套組，其包含本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子、分離的多核苷酸、構築物及/或藥物組成物。如果需要，這樣的套組可以進一步包括多種傳統藥物套組組分中的一種或多種，例如具有一種或多種藥學上可接受的載體的容器、另外的容器等，對本案所屬技術領域中具有通常知識者而言顯而易見。作為指示要施用的組分的量的插頁或標籤的說明書、施用指南及/或混合組分的指南也可以包括在套組中。
用途 本揭露提供了上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物在製造用於預防、診斷或治療疾病、障礙或病症的治療劑中的用途。
在一些實施例中，疾病、障礙或病症是腫瘤，以及腫瘤細胞至少表現SIRPα，較佳為人SIRPα。在一些實施例中，腫瘤細胞至少表現密連蛋白18.2，較佳為人密連蛋白18.2。在某些實施例中，腫瘤是實體腫瘤。一般來說，腫瘤包括良性腫瘤及惡性腫瘤（也稱為癌症）。
在本揭露中可以診斷、治療及/或預防的與表現密連蛋白18.2的細胞相關的疾病的示例可以包括所有表現密連蛋白18.2的癌症及腫瘤實體。在一些實施例中，疾病包括但不限於食管癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、典型何杰金氏淋巴瘤、血液惡性腫瘤、頭頸癌、鼻咽癌、膽囊癌及其轉移、Krukenberg氏瘤、腹膜轉移及淋巴結轉移，其可能是早期、中期或晚期，例如轉移性癌症。
在另一方面，本文提供了治療患有癌症的受試者的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的本文提供的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物。
「治療有效量」的上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或本揭露中提供的藥物組成物較佳為引起疾病症狀嚴重程度降低以及疾病、障礙或病症的無症狀期的頻率及持續時間增加，或防止因疾病或痛苦而造成的傷害或殘疾。例如，對於腫瘤（包括，例如黑色素瘤、淋巴瘤、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭頸癌及結腸癌）的治療，相對於未經治療的受試者，「治療有效量」較佳為抑制細胞生長或腫瘤生長至少約10%，較佳為至少約20%，更佳為至少約30%，更佳為至少約40%，更佳為至少約50%，更佳為至少約60%，更佳為至少約70%，更佳為至少約80%。抑制腫瘤生長的能力可以在預測對人類腫瘤功效的動物模型系統中進行評估，或透過檢測抑制細胞生長的能力來評估。這樣的抑制作用可以透過本案所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的測定法在體外測定。治療有效量的上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子及藥物組成物通常能夠減小腫瘤大小，或以其他方式緩解受試者的症狀。本案所屬技術領域中具有通常知識者可以根據實際情況（例如，受試者的腫瘤大小、受試者症狀的嚴重程度以及所選擇的特定組成物或施用途徑）選擇合適的治療有效劑量。治療處方（例如，劑量決定等）可由醫生確定，通常考慮的因素包括但不限於正在治療的疾病、患者狀態、遞送部位、施用途徑及其他因素。預防有效量是指在一定劑量及所需時間段內實現預期預防效果的有效量。通常，但不一定，因為在疾病發作前或疾病早期對受試者施用預防劑量，因此「預防有效量」通常低於「治療有效量」。
受試者是哺乳動物，例如人、小鼠及食蟹猴。
本揭露提供了降低腫瘤生長速率的方法，該方法包括使腫瘤細胞與有效量的上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物接觸。
本揭露提供了殺死腫瘤細胞的方法，該方法包括使腫瘤細胞與有效量的上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、雙特異性分子或藥物組成物接觸。
實施例 在以下實施例中進一步描述了本發明，這些實施例不限制申請專利範圍中描述的本發明的範圍。
實施例1：試劑的產生 1.1. 野生型抗體 表1中示出了野生型抗體抗密連蛋白18.2抗體及抗SIRPα scFv（Seq. 2534m1v3）的胺基酸序列，這些抗體由雜交瘤產生並透過內部開發人源化。
表1 野生型抗體的胺基酸序列（單字母代碼）
密連蛋白18.2抗體中的VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNWVHWVRQAPGQGLEWMGEINPTNARSNYNEKFKKRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARIYYGNSFAHWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 1）
密連蛋白18.2抗體中的VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNAGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWSSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCQNNYYYPLTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 2）
抗SIRPα scFv (2534m1V3) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSASNRASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYMHWVQQAPGKGLEWIGRVDPEDAETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCDRGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 3）
1.2. 穩定的細胞株 已生成穩定表現人SIRPα的細胞株CHOK1/SIRPα，用於嵌合抗體體外測定。為了生成細胞株，用人SIRPα（Uniprot登錄號P78324，AA Met1-Lys504）表現慢病毒轉染CHOK1細胞，並在含有10 g/mL嘌呤黴素的培養基中選擇性培養2周。然後透過有限稀釋分離單細胞複製，並透過FACS篩選，以獲得穩定表現SIRPα的單株細胞株。
1.3. 重組蛋白 具有或不具有生物素化的人SIRPα胞外結構域（extracellular domain, ECD；Uniprot登錄號P78324，AA Met1-Arg369）重組蛋白購自義翹神州公司（SinoBiological）（目錄號：30014-H08H-B及目錄號：30014-H08H）。
實施例2：庫建構及抗體篩選 2.1. 隨機突變庫建構 將突變隨機引入抗SIRPα scFv 2534m1V3模板中。首先，使用GeneMorph II隨機誘變套組進行隨機突變PCR。然後將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上分離。使用DNA標記DL2000來指示DNA條帶的長度。切除約750 bp的DNA條帶，並透過NucleoSpin凝膠及PCR清除套組根據其方案進行純化。在下一步中，使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶套組透過相同的引子擴增突變的DNA。將PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上分離，並透過NucleoSpin凝膠及PCR清除套組根據其方案進行純化。將12 ug突變DNA與8 ug線性化酵母展示載體混合，然後濃縮到20 ul雙蒸餾水中。透過電穿孔將濃縮的DNA混合物轉移到酵母BEY100中。產生具有2.8E8多樣性的突變庫並在SDCAA培養基中擴增。
2.2. 透過MACS富集穩定菌落 將酵母庫在30°C在SGRCAA培養基中誘導過夜，然後用於第一輪磁性活化細胞分選（magnetic-activated cell sorting, MACS）。
將來自初始庫的2.8E9誘導的酵母用0.1%磷酸鹽NaCl緩衝液（PBSA）洗滌兩次，並與生物素化的SIRPα（bio-SIRPα）在50 mL 0.1% PBSA中在R.T.（室溫）下一起培養2小時。然後用0.1% PBSA洗滌混合物，並與鏈黴親和素標記的磁珠在50 mL 0.1% PBSA中在R.T.下一起培養1小時。透過磁珠捕獲顯示SIRPα-結合物的酵母，並透過磁體組從庫中分離酵母-磁珠複合物。將珠粒捕獲的酵母在SDCAA培養基中擴增，並在SG培養基中誘導，形成新的庫，標記為庫1。
在第二輪MACS中，將來自庫1的2.3E8酵母洗滌並重新懸浮（resuspend）於3 M胍溶液中，並在4°C下在旋轉器上以適當轉速培養過夜。第二天，將酵母洗滌並與5 nM bio-SIRPα在0.5 M胍溶液中在R.T.下一起培養2小時。然後用0.1% PBSA洗滌混合物，並與鏈黴親和素標記的磁珠在R.T.下一起培養1小時。透過磁珠捕獲顯示SIRPα-結合物的酵母，並透過磁體組從庫1中分離酵母-磁珠複合物。然後，將珠粒捕獲的酵母在SDCAA培養基中擴增，並在SG培養基中誘導，形成新的庫，標記為庫2。
2.3. 透過分選富集穩定菌落 在第一輪分選中，將來自庫2的3E7酵母洗滌並重新懸浮於3 M胍中，並在4°C下在旋轉器上以適當轉速培養過夜。第二天，將酵母洗滌並與5 nM bio-SIRPα在0.5 M胍中在R.T.下一起培養2小時。然後，將混合物洗滌並重新懸浮於含有PE-鏈黴親和素（PE綴合的鏈黴親和素）及FITC-抗HA抗體（異硫氰酸螢光素綴合的血凝素標籤抗體）的0.1% PBSA中，並在R.T.下培養0.5小時。將野生型2534m1V3（抗SIRPα scFv）在酵母上展示作為對照（下文的野生型對照）並進行相同的處理。將兩組酵母洗滌並注射到S3e細胞分選儀中。基於野生型對照組的抗原結合譜，如圖1中的門1作為對照，將庫2中所需的酵母群體門R2收集到FACS管中。然後，將酵母在SDCAA培養基中擴增，並在SG培養基中誘導，形成新的庫，標記為庫3。
在第二輪分選中，收穫來自庫3的3E7酵母，並用0.1% PBSA洗滌兩次。將酵母重新懸浮於含有1 M胍及1 nM bio-SIRPα的2 ml PBS（磷酸鹽緩衝鹽水）中並在R.T.下在旋轉器上以適當轉速培養2小時。然後將混合物洗滌並重新懸浮於含有PE-鏈黴親和素及FITC-抗HA抗體的0.1% PBSA中，並在R.T.下培養0.5小時。將野生型對照以相同的程序進行處理。將兩組酵母注射到S3e細胞分選儀中。基於野生型對照組的抗原結合譜，如圖2中的門1作為對照，將庫3中所需的酵母群體門2收集到FACS管中。然後將酵母在SDCAA培養基中擴增，並鋪板到SD（沙氏葡萄糖（Sabouraud Dextrose））瓊脂板上。
2.4. 穩定菌落的篩選 挑取板上的菌落並在96深孔板中的SG培養基中在30°C下誘導過夜。野生型複製也被誘導作為對照。將誘導的酵母等分到新的96孔低吸收板中，並用0.1% PBSA洗滌兩次。將酵母用含有1 M胍及1 nM bio-SIRPα的PBS重新懸浮，並在R.T.下培養2小時。然後將混合物用0.1% PBSA洗滌並重新懸浮於含有PE-鏈黴親和素及FITC-抗HA抗體的0.1% PBSA中，並在R.T.下培養0.5小時。將酵母洗滌並注射到BD Celesta中進行訊號收集。挑取並篩選了380個菌落。
突變菌落及野生型對照之間的比較基於scFv展示水平及SIRPα結合效力。將具有改進的scFv展示水平及結合效力的菌落定義為改進的菌落，並對所有改進的菌落進行測序。如圖3所示，複製201在scFv展示水平及抗原結合效力方面均有改進。複製201的序列顯示為SEQ ID NO: 4。
實施例3：雙特異性抗體（BsAb）生成及表徵 3.1. BsAb生成 如圖4A所示，雙特異性抗體是對稱結構，具有與實施例1.1中密連蛋白18.2抗體的Fc的C端融合的抗SIRPa scFv（Seq. 2534m1v3）。野生型雙特異性抗體已經用IgG1同種型生成並用作對照。
合成複製201的序列，並用(G4S)3連接子將其複製到密連蛋白18.2抗體的Fc片段的C端，並與輕鏈共電穿孔到CHO細胞株中，並在30 mL培養基中表現，得到BsAb抗體AE016_201。作為對照，wt（野生型的縮寫）BsAb 005-08也在30 ml培養基中表現。表2中列出了AE016_201的序列。在第5天收穫表現的蛋白質，並透過一步蛋白-A親和層析法純化。測量蛋白質，表3中示出了生產率。與wt對照相比，突變體使產物產量提高了7倍。還透過SEC分析了一步純化後產物的純度。如表3及圖4B所示，AE016_201在SEC表徵中的純度高於90%。
表2 AE016_201的胺基酸序列（單字母代碼）
AE016_201 重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNWVHWVRQAPGQGLEWMGEINPTNARSNYNEKFKKRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARIYYGNSFAHWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSASNRASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGRVDPEDAETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCDRGLVYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 5）
AE016_201 輕鏈 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNAGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWSSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCQNNYYYPLTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 6）
表3 30 mL表現系統中突變體的生產率及一步純度
突變體ID 產量（mg/L） 純度
005-08 20.7
AE016_201 107 100%
3.2. BsAb表徵 3.2.1. 結合親和力 使用生物層干涉法（Octet）測定AE016_201及wt BsAb與人SIRPα ECD重組蛋白的結合親和力。締合及解離曲線用1 : 1結合模型擬合，計算AE016_201的Kon/Koff/KD值並總結在表4中。圖5中示出了結合曲線。AE016_201顯示出與wt BsAb相當的親和力。
表4 透過Octet檢測的AE016_201與SIRPα的親和力
突變體ID 親和力
KD（M） Kon（1/Ms） Koff（1/s）
005-08 1.2E-09 4.8E+05 5.5E-04
AE016_201 1.1E-09 5.2E+05 5.8E-04
3.2.2. 細胞株結合 透過TrypLE消化及離心收穫SIRPα過表現細胞CHOK1/SIRPα。將細胞重新懸浮於含有DPBS（杜爾貝科（Dulbecco）磷酸鹽緩衝鹽水）及2%胎牛血清（FBS）的FACS緩衝液中30分鐘。將1E5細胞等分到含有稀釋抗體的96孔板的每個孔中。第一孔所用抗體的濃度為100 nM，而其餘孔稀釋5倍。在4°C培養60分鐘後，用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，並用二抗AF647抗人Fc抗體重新懸浮。然後將細胞在4°C下在黑暗中培養30分鐘。之後，用FACS緩衝液洗滌細胞兩次，重新懸浮於FACS緩衝液中，並在流式細胞儀上分析。使用IgG4同種型的抗SIRPα抗體2534m1V3作為對照。如圖6所示，透過GraphPad Prism 9軟體計算結合曲線和EC 50。
3.2.3. Tm值測試 熱穩定性是蛋白質在不同溫度環境下保持其結構及功能完整性的能力，以及是抗體的固有特性，在製造及儲存過程中可影響產品穩定性（如聚集）。
測量AE016_201在10 mM組胺酸及10 mM甘胺酸緩衝液（HG緩衝液）、PBS或20 mM組胺酸緩衝液中的熔解溫度（Tm）值，以預測其熱穩定性。簡言之，命中抗體AE016_201在HGS或PBS或20 mM組胺酸緩衝液中溶解。然後使用QuantStudio 7 Flex即時PCR系統透過差示掃描螢光測定法（differential scanning fluorimetry, DSF）檢測Tm值。表5中列出了AE016_201在不同緩衝液中的Tm1值，表明其在不同緩衝液中具有良好的熱穩定性。
表5 AE016_201在不同緩衝液中的Tm1值
緩衝液 Tm1（°C）
PBS 48.9
HG緩衝液 56.5
20 mM組胺酸緩衝液 55.6
3.2.4. 4°C下的長期穩定性測試 為了確定變體在4°C下的長期穩定性，將200 μl蛋白質保持在4°C下，以及將第7、14、21及28天的20 μl樣品以0.5 ml/min的速度加載到SEC柱。圖7中示出了不同時間的樣品純度。結果表明，AE016_201在4°C下長期保存後是穩定的。
3.2.5. 凍融穩定性測試 為了確定反復凍融後變體的穩定性，首先將50 μl濃度為1 mg/ml的蛋白質冷凍並在-80°C中儲存1小時，然後在R.T.下保持1小時。重複此程序3次（3xFT），然後以0.5 ml/min的速度加載20 μl樣品，並透過SEC進行分析。圖6中示出了3xFT後的樣品純度。結果表明，AE016_201在3xFT處理後是穩定的。
表6 AE016_201在3xFT處理前後的純度變化
突變體ID SEC純度
T0（%） 3xFT後（%） △單體%
005-08 96.1 95.2 -0.9
AE016_201 100 98.6 -1.4
△單體為3xFT處理前後樣品的純度變化。
3.2.6. 低pH穩定性測試 為了確定低pH處理後變體的穩定性，向50 μL樣品中添加1 μL檸檬酸，在該條件下樣品溶液的pH為3.63。將樣品在RT下保持2小時，然後用15 μL Tris 9.0中和。然後將17 μl PBS添加到33 μl樣品中，製成2 mg/mL儲備液用於SEC測試。將20 μl儲備溶液加載到SEC柱中，並以0.5 ml/min的速度運行。表7中示出了用低pH AE016_201處理前後的純度。
表7 AE016_201在低pH處理前後的純度變化
突變體ID SEC純度
T0（%） 低pH處理後（%） △單體%
AE016_201 98.09 97.16 -0.93
△單體為低pH處理前後樣品的純度變化。
3.2.7. 加速穩定性測試 溫度超過正常儲存條件時的熱應力會加速降解，從而提高潛在降解途徑的可檢測性，以提供有關預期儲存條件下長期降解的資訊。
AE016_201在HGS中的熱應力測試在40°C下進行，持續14天。檢測SEC純度以監測不溶性或可溶性聚集體。如表8所示，在40°C下培養14天後，AE016_201在HG緩衝液中的純度變化極小。
表8 AE016_201在40°C下1周及2周的純度變化
突變體ID 純度（%）
T0 40°C-1周 40°C-2周
AE016_201 97.5 96.9 95.2
實施例4：再工程化AE016_201 4.1. 再工程化AE016_201及表徵 基於BsAb 005-08及AE016_201中scFv部分的結構比較及序列比對，透過反向突變對AE016_201進行再工程化，以產生新的突變體AE016_201.003。AE016_201.003的突變設計是抗SPRPα抗體的CDR及/或FR區的R486S、Q489S、A514T、R517L、V641I及A646G。表9中示出了AE016_201.003的序列。突變體AE016_201.003在30 ml培養基中的CHO細胞株中表現。產量為91 mg/L，一步純化後，純度為97.3%。如上所述評估親和力、Tm值及凍融穩定性（FT）。結果總結在表10中。
表9 AE016_201.003的胺基酸序列（單字母代碼）
AE016_201.003 重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNWVHWVRQAPGQGLEWMGEINPTNARSNYNEKFKKRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARIYYGNSFAHWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGRIDPEDGETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCDRGLVYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 7）
AE016_201.003 輕鏈 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNAGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWSSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCQNNYYYPLTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO: 8）
表10 突變體AE016_201.003的特性
突變體ID 產量（mg/L） 純度（%） 親和力 Tm 1 (°C, DSF) 3 FT穩定性後的純度（%）
KD （M） Kon （1/Ms） Koff （1/s）
AE016_201.003 91 97.3 1.2E-09 3.7E+05 4.5E-04 60.6 96.7
實施例5：抗密連蛋白18.2抗體 抗密連蛋白18.2抗體由雜交瘤產生，並透過內部開發進行人源化。為了表現，使用同一表現載體或分開的表現載體中編碼輕鏈與重鏈的DNA轉染CHO細胞以進行轉染。收穫培養基，以及透過蛋白A瓊脂糖柱純化融合蛋白。表11示出了hu26.H1L2的VH與VL。
表11. 抗密連蛋白18.2抗體hu26.H1L2的可變區的胺基酸序列
抗體 VH VL
hu26.H1L2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLSSYALSWVRQAPGKGLEWVS YISNLGGSTFYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HLYNYDAFASWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 9） DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC RASSSVNYIHWYQQKPGKAPKALIY ATSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC QQWNA NPLTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 10）
CDR加底線，以及使用Kabat定義進行定義。
實施例6：抗SIRPα抗體 抗SIRPα抗體由雜交瘤產生，並透過內部開發進行人源化。為了表現，使用同一表現載體或分開的表現載體中編碼輕鏈與重鏈的DNA轉染CHO細胞以進行轉染。收穫培養基，以及透過蛋白A瓊脂糖柱純化融合蛋白。表12示出了hu025.060（ES0040025）、hu025.201、hu025.003及hu025.003.SS的VH與VL。
表12. 抗SIRPα抗體或scFv的可變區的胺基酸序列
抗體 VH VL
hu025.060 EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKA SGFNIKDYYMHWVQQAPGKGLEWIGR IDPEDAETKYAPKFQGRVTITADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYC DRGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 54） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SA SSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLWI YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 55）
hu025.201 EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKV SGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGR VDPEDAETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC DRGLVYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 14） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLI YSASNRASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 15）
hu025.003 EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKV SGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGR IDPEDGETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC DRGLVYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 16） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SA SSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLI YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 17）
hu025.003.SS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKV SGFNIKDYYMHWVRQAPGKCLEWIGR IDPEDGETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC DRGLVYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 18） EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SA SSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLI YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGCGTKLEIK（SEQ ID NO: 19）
CDR加底線，以及使用Kabat定義進行定義。
實施例7：抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體構築及表徵 7.1 抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體構築及表現 將抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體構築為在重鏈C端具有抗SIRPα scFv（hu025.201、hu025.003、hu025.003.SS）的抗密連蛋白18.2抗體（hu26.H1L2）。將柔性(Gly4Ser)3連接子基因地連接到抗SIRPα scFv的N端。圖4A中示出了抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體的示意圖。所得雙特異性抗體的胺基酸序列如下所示：
表13 ES028.26.201的胺基酸序列（單字母代碼）
ES028.26.201 重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLSSYALSWVRQAPGKGLEWVS YI SNLGGSTFYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HLYNYDAFASWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC RASQSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLI YSAS NRASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGQGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKV SGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGR VDPEDAETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC DR GLVYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 56）
ES028.26.201 輕鏈 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC RASSSVNYIHWYQQKPGKAPKALIY ATSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC QQWNANPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 57）
表14. ES028.26.003的胺基酸序列（單字母代碼）
ES028.26.003 重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLSSYALSWVRQAPGKGLEWVS Y ISNLGGSTFYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HLYNYDAFASWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLI YSTSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGQGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKV SGFNIKDYYMHWVRQAPGKGLEWIGR IDPEDGETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC DRGLVYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 58）
ES028.26.003 輕鏈 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC RASSSVNYIHWYQQKPGKAPKALIY ATSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC QQWNANPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 57）
表15. ES028.26.003.SS的胺基酸序列（單字母代碼）
ES028.26.003.SS 重鏈 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLSSYALSWVRQAPGKGLEWVS YISNLGGSTFYPDTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK HLYNYDAFASWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK GGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC SASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLI YST SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC HQWSSYPYTFGCGTKLEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKV SGFNIKDYYMHWVRQAPGKCLEWIGR IDPEDGETKYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYC DRGLVYWGQGTLVTVSS （SEQ ID NO: 59）
ES028.26.003.SS 輕鏈 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC RASSSVNYIHWYQQKPGKAPKALIY ATS NLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC QQWNANPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 57）
為了表現，使用同一表現載體或分開的表現載體中編碼輕鏈及重鏈的DNA轉染CHO-K1細胞以進行轉染。收穫培養基，以及透過蛋白A瓊脂糖柱純化融合蛋白。
7.2 抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體結合親和力 根據製造商手冊，使用Octet測定法（ForeBio）分別表徵抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性蛋白與人密連蛋白18.2或SIRPα的結合親和力。簡言之，將抗體複合在傳感器上，然後將傳感器浸入密連蛋白18.2或SIRPα蛋白梯度（從200 nM開始，稀釋2倍，共8劑）中。即時測量它們的結合反應，以及將結果全域擬合。表13及表14總結了測試抗體的親和力數據。
表13. 雙特異性抗體與人SIRPα的結合親和力
樣品 KD（M） Kon（1/Ms） Koff（1/s）
抗SIRPα mAb hu025.003 2.07E-09 5.32E+05 1.10E-03
ES028.26.201 8.4E-09 3.9E+05 3.3E-03
ES028.26.003 1.9E-09 3.1E+05 6.0E-04
ES028.26.003.SS 2.52E-09 2.09E+05 5.27E-04
表14. 雙特異性抗體與人密連蛋白18.2的結合親和力
樣品 KD（M） Kon（1/Ms） Koff（1/s）
抗密連蛋白18.2 mAb，hu26.H1L2 7.25E-10 2.42E+05 1.75E-04
ES028.26.003.SS 8.33E-10 1.70E+05 1.42E-04
7.3 透過FACS分析的抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體與密連蛋白18.2及SIRPα的結合 用洗滌緩衝液洗滌透過慢病毒穩定轉染產生的約100,000個過表現人密連蛋白18.2的Raji淋巴瘤細胞（Raji/人密連蛋白18.2），以及與100 μl密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性蛋白的連續稀釋液一起在冰上培養30分鐘。然後用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次，以及與100 μl AF647抗人Fc抗體一起在冰上培養30分鐘。然後用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次，以及在FACS Canto II分析儀（BD生物科學公司（BD Biosciences））上進行分析。如圖8A所示，抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體以劑量依賴性方式與Raji/人密連蛋白18.2細胞結合。與抗密連蛋白18.2單株抗體hu26.H1L2相似，雙特異性抗體ES028.26.201、ES028.26.003、ES028.26.003.SS結合Raji/人密連蛋白18.2。
用洗滌緩衝液洗滌過表現人SIRPα的CHOK1細胞（CHOK1/SIRPα），以及與100 μl密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性蛋白的連續稀釋液一起在冰上培養30分鐘。然後用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次，以及與100 μl AF647抗人Fc抗體一起在冰上培養30分鐘。然後用洗滌緩衝液洗滌細胞兩次，以及在FACS Canto II分析儀（BD生物科學公司）上進行分析。如圖8B所示，與抗SIRPα單株抗體hu025.060相似，抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體ES028.26.201、ES028.26.003、ES028.26.003.SS以劑量依賴性方式與CHOK1/SIRPα細胞結合。
7.4 抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體增強巨噬細胞對密連蛋白18.2 +癌細胞的體外吞噬作用
用螢光染料CFSE標記表現人CD47及人密連蛋白18.2的小鼠MC38結腸腫瘤細胞，以及在抗密連蛋白18.2抗體hu26.H1L2、抗SIRPα抗體hu025.060、抗密連蛋白18.2及抗SIRPα抗體組合、抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體存在下，與從C57BL6/hCD47/hSIRPα敲入小鼠製備的小鼠骨髓源性巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage , BMDM）一起培養。2小時後，收穫巨噬細胞，用螢光標記的抗小鼠巨噬細胞抗體染色，以及透過流式細胞術進行分析。CD11b+CFSE+雙陽性事件鑑定吞噬CFSE標記的腫瘤細胞的巨噬細胞。顯示了三個單獨樣品的吞噬指數。
如圖9所示，抗密連蛋白18.2抗體hu28H1L2透過抗體依賴性細胞吞噬作用（antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP）誘發約25%吞噬作用，抗SIRPα抗體幾乎不誘發吞噬作用。抗密連蛋白18.2及抗SIRPα抗體的組合顯著改善吞噬作用。與組合治療及單一治療相比，抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體ES028.26.201、ES028.26.003、ES028.26.003.SS以劑量依賴性方式誘發更強的吞噬作用。
7.5 抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體增強體內抗腫瘤功效 用hCD47/hCLDN18.2過表現MC38細胞（上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc）用慢病毒穩定轉染）接種人SIRPα/CD47雙敲入小鼠（上海南方模式生物科技股份有限公司）。當平均腫瘤體積達到約60-100 mm 3時，根據腫瘤體積將小鼠分為5組。向小鼠i.p.給藥相同莫耳濃度的hu26.H1L2、ES028.26.201、ES028.26.003、ES028.26.003.SS或載體。給藥方案是BIW，共5劑。每週測量腫瘤體積兩次。第5次給藥後3天，犧牲小鼠，以及對腫瘤進行稱重。透過雙因子變異數分析（2-way ANOVA）進行統計，比較不同治療組與對照組的平均腫瘤體積。
如下計算相對腫瘤抑制率TGI（%）： TGI% = (1-T/C) × 100%。（T及C分別是治療組及對照組在特定時間點的相對腫瘤體積（relative tumor volume, RTV）或腫瘤重量（,tumor weight TW））。
T/C % = TRTV / CRTV × 100%（TRTV：治療組的平均RTV；CRTV：載體對照組的平均RTV； RTV = Vt/V0，V0為分組時動物的腫瘤體積，Vt為治療後動物的腫瘤體積）； 也可以基於腫瘤重量如下計算T/C： T/C % = TTW / CTW × 100%（TTW：結束時治療組的平均腫瘤重量；CTW：結束時載體對照組的平均腫瘤重量）。
如圖10所示，抗密連蛋白18.2抗體hu26.H1L2單一療法與載體治療類似，不能抑制腫瘤生長。與單一療法或載體治療相比，抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體ES028.26.201、ES028.26.003、ES028.26.003.SS誘發強烈的腫瘤生長抑制。
雖然已經描述了特定的實施例，但是可能會出現對申請人或本案所屬技術領域中其他具有通常知識者來說未預見或可能當前未預見的替代方案、修改、變化、改進及實質上均等物。因此，如所提交的以及如可能修改的所附申請專利範圍旨在涵蓋所有這樣的替代方案、修改、變化、改進及實質上均等物。
無
以下是圖式的簡要描述，呈現這些圖式是出於說明本文揭露的示例性實施例的目的，並不是出於對其進行限制的目的。
圖1顯示了透過螢光流式細胞分選儀（fluorescence-activated cell sorter, FACS）檢測的第一輪酵母庫分選中野生型對照組及庫2的抗原結合譜。 圖2顯示了透過螢光流式細胞分選儀（FACS）檢測的第一輪酵母庫分選中野生型對照組及庫2的抗原結合譜。 圖3顯示了透過螢光流式細胞分選儀（FACS）檢測的野生型對照組及複製201之間的結合效力的比較。 圖4A是抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性分子的示意圖，其中兩個抗SIRPα scFv經由連接子與抗密連蛋白18.2抗體重鏈的C端融合。 圖4B顯示了AE016_201的粒徑篩析層析法（size-exclusion chromatograph, SEC）譜圖，蛋白質樣品中每種組分的純度列於SEC譜圖的下表中。 圖5顯示了透過Octet檢測的AE016_201與SIRPα的結合曲線。 圖6顯示了透過FACS檢測的AE016_201及IgG4同種型的抗SIRPα抗體的CHO-K1 SIRPα結合曲線。EC50值列於結合曲線的下表中。 圖7顯示了AE016_201在4°C下的長期穩定性。 圖8A顯示了透過FACS檢測的代表性雙特異性抗體與Raji/人密連蛋白（hClaudin）18.2細胞的結合曲線。使用抗密連蛋白18.2抗體hu26.H1L2作為對照。 圖8B顯示了透過FACS檢測的代表性雙特異性抗體與CHOK1/SIRPα細胞的結合曲線。使用抗SIRPα抗體hu025.060作為對照。 圖9顯示了抗密連蛋白18.2/SIRPα雙特異性抗體比單一或聯合治療更好地刺激BMDM對MC38/hCD47/人密連蛋白18.2細胞的吞噬作用。 圖10顯示了抗密連蛋白18.2/SIRPα在MC38/人密連蛋白18.2/hSIRPα同源模型中的體內抗腫瘤功效。
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Claims (52)

  1. 一種抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，包含重鏈可變結構域（VH）及重鏈可變結構域（VL），其中 VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；(2) 分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；(3) 分別地，SEQ ID NO: 20、47及48； VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；(2) 分別地，SEQ ID NO: 25、27及28。
  2. 如請求項1所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述HCDR1具有SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列，所述HCDR2具有如X 1DPEDX 2ETK（SEQ ID NO: 60）所示的胺基酸序列，所述HCDR3具有如DRGLX 3Y（SEQ ID NO: 61）所示的胺基酸序列，所述LCDR1具有如X 4ASX 5SVSSSYLY（SEQ ID NO: 45）所示的胺基酸序列，所述LCDR2具有如YSX 6SNX 7AS（SEQ ID NO: 46）所示的胺基酸序列，以及所述LCDR3具有SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，X 1是V或I，X 2是A或G，X 3是V或A，X 4是R或S，X 5是Q或S，X 6是A或T，X 7是R或L。
  3. 如請求項1或2所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中 (1) 所述HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、21及23中所示的胺基酸序列；以及所述LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 24、26及28中所示的胺基酸序列； (2) 所述HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、22及23中所示的胺基酸序列；以及所述LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列；或者 (3) 所述HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、47及48中所示的胺基酸序列；以及所述LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；(2) 分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；(3) 分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33；以及/或者 所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；(2) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；(3) 分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
  5. 如請求項1-3中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中 (1) 所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、30、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同； (2) 所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、31、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及38中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；或者 (3) 所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 49、50、51及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、52、53及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中 (1) 所述VH包含與SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (2) 所述VH包含與SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (3) 所述VH包含與SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (4) 所述VH包含與SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中 所述VH包含SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列；或者 所述VH包含SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列；或者 所述VH包含SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列；或者 所述VH包含SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列，以及所述VL包含SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述抗SIRPα抗體或抗原結合片段與人及/或小鼠SIRPα結合。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述抗SIRPα抗體或抗原結合片段是Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段或單鏈可變片段（scFv）。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述抗SIRPα抗體或抗原結合片段是scFv，其中所述VH及VL經由第一肽連接子連接，可選地所述第一肽連接子包括(Gly4Ser)4。
  11. 如請求項10所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述VH的N端與所述VL的C端相連接。
  12. 如請求項1-11中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其中所述抗SIRPα抗體或抗原結合片段是嵌合抗體或人源化抗體。
  13. 一種雙特異性分子，其包含： (1) SIRPα結合結構域，其包含重鏈可變結構域（VH）及重鏈可變結構域（VL），其中VH包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 20、21及23；(2) 分別地，SEQ ID NO: 20、22及23；(3) 分別地，SEQ ID NO: 20、47及48；VL包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，這三者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 24、26及28；(2) 分別地，SEQ ID NO: 25、27及28；以及 (2) 與標靶抗原結合的第二結構域，所述第二結構域與所述SIRPα結合結構域融合。
  14. 如請求項13所述的雙特異性分子，在所述SIRPα結合結構域中，所述HCDR1具有SEQ ID NO: 20中所示的胺基酸序列，所述HCDR2具有如X 1DPEDX 2ETK（SEQ ID NO: 60）所示的胺基酸序列，所述HCDR3具有如DRGLX 3Y（SEQ ID NO: 61）所示的胺基酸序列，所述LCDR1具有如X 4ASX 5SVSSSYLY（SEQ ID NO: 45）所示的胺基酸序列，所述LCDR2具有如YSX 6SNX 7AS（SEQ ID NO: 46）所示的胺基酸序列，以及所述LCDR3具有SEQ ID NO: 28中所示的胺基酸序列，X 1是V或I，X 2是A或G，X 3是V或A，X 4是R或S，X 5是Q或S，X 6是A或T，X 7是R或L。
  15. 如請求項13或14所述的雙特異性分子，其中在所述SIRPα結合結構域中， (1) 所述HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、21及23中所示的胺基酸序列；以及所述LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 24、26及28中所示的胺基酸序列； (2) 所述HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、22及23中所示的胺基酸序列；以及所述LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列；或者 (3) 所述HCDR1、HCDR2及HCDR3分別具有SEQ ID NO: 20、47及48中所示的胺基酸序列；以及所述LCDR1、LCDR2及LCDR3分別具有SEQ ID NO: 25、27及28中所示的胺基酸序列。
  16. 如請求項13-15中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域的VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 29、30、32及33；(2) 分別地，SEQ ID NO: 29、31、32及33；(3) 分別地，SEQ ID NO: 49、50、51及33；以及/或者 所述SIRPα結合結構域的VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列與以下中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同：(1) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及37；(2) 分別地，SEQ ID NO: 34、35、36及38；(3) 分別地，SEQ ID NO: 34、52、53及37。
  17. 如請求項13-16中任一項所述的雙特異性分子，其中，在所述SIRPα結合結構域中， (1) 所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、30、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同； (2) 所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 29、31、32及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、35、36及38中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；或者 (3) 所述VH包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 49、50、51及33中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同；以及所述VL包含FR1、FR2、FR3及FR4，這四者的胺基酸序列分別與SEQ ID NO: 34、52、53及37中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同。
  18. 如請求項13-17中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域的VH包含與SEQ ID NO: 14、16、18及54中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；以及/或者 所述SIRPα結合結構域的VL包含與SEQ ID NO: 15、17、19及55中所示的胺基酸序列之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  19. 如請求項13-18中任一項所述的雙特異性分子，其中在所述SIRPα結合結構域中， (1) 所述VH包含與SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (2) 所述VH包含與SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (3) 所述VH包含與SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列； (4) 所述VH包含與SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的胺基酸序列；以及所述VL包含與SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
  20. 如請求項13-19中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域的VH包含SEQ ID NO: 14中所示的胺基酸序列，以及所述SIRPα結合結構域的VL包含SEQ ID NO: 15中所示的胺基酸序列；或者 所述SIRPα結合結構域的VH包含SEQ ID NO: 16中所示的胺基酸序列，以及所述SIRPα結合結構域的VL包含SEQ ID NO: 17中所示的胺基酸序列；或者 所述SIRPα結合結構域的VH包含SEQ ID NO: 18中所示的胺基酸序列，以及所述SIRPα結合結構域的VL包含SEQ ID NO: 19中所示的胺基酸序列；或者 所述SIRPα結合結構域的VH包含SEQ ID NO: 54中所示的胺基酸序列，以及所述SIRPα結合結構域的VL包含SEQ ID NO: 55中所示的胺基酸序列。
  21. 如請求項13-20中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域是scFv，其中所述VH及VL經由第一多肽連接子連接，可選地所述第一多肽連接子包括(Gly4Ser)4。
  22. 如請求項13-21中任一項所述的雙特異性分子，其中在所述SIRPα結合結構域中，所述VH的N端與所述VL的C端相連接。
  23. 如請求項13-22中任一項所述的雙特異性分子，其中所述第二結構域與癌細胞表面表現的標靶抗原結合。
  24. 如請求項13-23中任一項所述的雙特異性分子，其中所述第二結構域與密連蛋白18.2及/或CD47結合，較佳為密連蛋白18.2。
  25. 如請求項13-24中任一項所述的雙特異性分子，其中所述第二結構域包含： a)     包含CDR1、CDR2及CDR3的重鏈可變區（VH），其中所述VH CDR1、CDR2及CDR3分別具有與SEQ ID NO: 39、40及41中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同的胺基酸序列；以及 b)     包含CDR1、CDR2及CDR3的輕鏈可變區（VL），其中所述VL CDR1、CDR2及CDR3分別具有與SEQ ID NO: 42、43及44中所示的胺基酸序列約80%至約100%相同的胺基酸序列。
  26. 如請求項13-25中任一項所述的雙特異性分子，其中所述第二結構域包含VH及VL，所述VH具有與SEQ ID NO: 9中所示的胺基酸序列至少約80%相同的胺基酸序列，所述VL具有與SEQ ID NO: 10中所示的胺基酸序列至少約80%相同的胺基酸序列。
  27. 如請求項13-26中任一項所述的雙特異性分子，其中所述第二結構域包含輕鏈恒定區（CL），其中所述輕鏈為κ或λ輕鏈。
  28. 如請求項27所述的雙特異性分子，其中所述CL包含SEQ ID NO: 12或13中所示的胺基酸序列。
  29. 如請求項13-28中任一項所述的雙特異性分子，其中所述第二結構域包含具有SEQ ID NO: 11中所示的胺基酸序列的重鏈恒定區（CH）。
  30. 如請求項13-29中任一項所述的雙特異性分子，其中所述雙特異性分子是對稱的雙特異性分子。
  31. 如請求項27-30中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域的重鏈可變結構域的N端與所述第二結構域的重鏈恒定區的C端融合。
  32. 如請求項13-31中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域及所述第二結構域經由具有式(Gly4Ser)n的第二肽連接子共價連接，其中n是1至5的整數。
  33. 如請求項13-32中任一項所述的雙特異性分子，其中所述SIRPα結合結構域及所述第二結構域經由(Gly4Ser)3共價連接。
  34. 如請求項13-33中任一項所述的雙特異性分子，其包含重鏈及輕鏈，其中所述重鏈包含與SEQ ID NO: 56、58或59中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及所述輕鏈包含與SEQ ID NO: 57中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；或者 所述重鏈包含與SEQ ID NO: 7中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及所述輕鏈包含與SEQ ID NO: 8中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列； 所述重鏈包含與SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列；以及所述輕鏈包含與SEQ ID NO: 6中所示的胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。
  35. 如請求項13-34中任一項所述的雙特異性分子，其中所述雙特異性分子阻斷CD47及SIRPα的相互作用，去除SHP-1/2抑制，及/或與免疫效應細胞（例如巨噬細胞）上的Fc受體接合以活化吞噬作用。
  36. 如請求項13-35中任一項所述的雙特異性分子，其中所述雙特異性分子增強免疫效應細胞對表現與所述第二結構域結合的標靶抗原的癌細胞的吞噬作用。
  37. 如請求項13-36中任一項所述的雙特異性分子，其中所述雙特異性分子與人密連蛋白18.2及人SIRPα結合。
  38. 一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或編碼如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子。
  39. 一種構築物，其包含如請求項38所述的多核苷酸。
  40. 一種抗體表現系統，其包含含有如請求項38所述的分離的多核苷酸的構築物或具有與如請求項38所述的外源多核苷酸整合的基因組，其中較佳地，所述表現系統是細胞表現系統。
  41. 一種用於產生如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子的方法，所述方法包括：在適合表現所述抗體的條件下，使用如請求項40所述的抗體表現系統表現所述抗體或蛋白。
  42. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子以及藥學上可接受的載體。
  43. 一種套組，其包含如請求項1-2中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子、如請求項38所述的分離的多核苷酸或如請求項39所述的構築物。
  44. 一種如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子或如請求項42所述的藥物組成物在製造用於預防、診斷或治療疾病、障礙或病症的治療劑中的用途。
  45. 如請求項44所述的用途，其中所述疾病、障礙或病症是腫瘤。
  46. 如請求項45所述的用途，其中腫瘤細胞至少表現密連蛋白18.2，較佳為人密連蛋白18.2。
  47. 如請求項45或46所述的用途，其中所述腫瘤是實體腫瘤。
  48. 如請求項44-47中任一項所述的用途，其中所述腫瘤包括食管癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、典型何杰金氏淋巴瘤、血液惡性腫瘤、頭頸癌及鼻咽癌、膽囊癌及其轉移、Krukenberg氏瘤、腹膜轉移及/或淋巴結轉移。
  49. 一種治療患有癌症的受試者的方法，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子或如請求項42所述的藥物組成物。
  50. 如請求項49所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物，所述哺乳動物包括人、小鼠及食蟹猴。
  51. 一種降低腫瘤生長速率的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效量的如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子或如請求項42所述的藥物組成物接觸。
  52. 一種殺死腫瘤細胞的方法，所述方法包括使腫瘤細胞與有效量的如請求項1-12中任一項所述的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或如請求項13-37中任一項所述的雙特異性分子或如請求項42所述的藥物組成物接觸。
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