TW202430160A - 投予貝魯舒地爾（ｂｅｌｕｍｏｓｕｄｉｌ）治療多發性骨髓瘤之方法 - Google Patents

Abstract

本公開文本提供了向患有多發性骨髓瘤的患者投予貝魯舒地爾的方法。

Description

投予貝魯舒地爾(BELUMOSUDIL)治療多發性骨髓瘤之方法

本公開文本涉及向患者投予貝魯舒地爾(belumosudil)用於治療多發性骨髓瘤的方法。

多發性骨髓瘤（MM）是在骨髓中積聚的漿細胞的惡性腫瘤，導致腎衰竭、高鈣血症、骨破壞和由於骨髓衰竭引起的貧血。在美國，MM占所有癌症的大約1.8%和血液惡性腫瘤的18.7%。（Siegel等人，CA Cancer J Clin 2021, 71:7-33）。MM最常在年齡為65至74歲的人群中被診斷出，中值年齡為69歲。（國家癌症研究所。監測、流行病學和最終結果程式。癌症統計資料：骨髓瘤。2021年11月24日訪問。可在以下網址獲得：https://seer.cancer.gov/statfacts/html/mulmy.html）。美國癌症協會估計，美國2021年將診斷出34,920例新的MM病例，估計有12,410例死亡。（Siegel等人）。非常需要治療多發性骨髓瘤的另外的療法。

MM細胞上的CD38表現水平是影響對抗CD38抗體（像艾薩妥昔單抗（isatuximab）和達雷木單抗（daratumumab））的反應的關鍵因素。（Kitadate等人，Haematologica. 2020, 105(1):e37-e40）。在結合至表現CD38的MM細胞後，抗CD38抗體（像艾薩妥昔單抗和達雷木單抗）經由抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）和補體依賴性細胞毒性（CDC），以及經由直接凋亡誘導腫瘤細胞殺傷。（Zhu等人，Front Immunol. 2020;11, 1771）。

幾項研究報導，在首次用達雷木單抗治療後，患者的骨髓和MM細胞中的CD38表現降低（Horenstein等人，Cells. 2015, 4(3), 520-37；Krejcik等人，Clin Cancer Res. 2017, 23(24), 7498-511；Nijhof等人，Blood. 2016, 128(7), 959-70），並且在達雷木單抗停用後，CD38表現再次增加（Nijhof等人）。此外，艾薩妥昔單抗通過誘導CD38內化來降低幾種MM細胞株中的CD38表現（Moreno等人，Clin Cancer Res. 2019, 25(10), 3176-87）。

使用充分表徵的人類MM細胞株的體外研究被認為是適當的模型。參見例如，Kassem等人，Blood 2022年2月24日, 139(8):1160-1176（「Kassem」）；Matsuo等人，Leuk Res 2004年8月, 28(8):869-77；以及Deckert等人，Clin Cancer Res 2014年9月1日, 20(17):4574-83，描述了MOLP-8 MM細胞株，Kassem；De Veirman K等人，Oncotarget 2015, 6:10532-10547（「De Veirman」）；Li M等人，Cancer Cell Int 2021年12月19日, 21(1):683（「Li」）；以及Moreaux J等人，Haematologica, 2011年4月, 96(4):574-82（「Moreaux」），描述了RPMI-8226 MM細胞株，Moreaux；De Veirman；以及Li，描述了LP-1 MM細胞株，以及Chauhan D等人，Blood 2004年4月15日, 103(8):3158-66；以及Yasui H等人，Blood 2005年7月15日, 106(2):706-12，描繪了MM.1R細胞株。

本公開文本提供了對多發性骨髓瘤問題的一種解決方案，其透過提供用單獨的以及與抗骨髓瘤劑（如抗CD38抗體或免疫調節藥物（immunomodulatory drug，IMiD））組合的貝魯舒地爾治療多發性骨髓瘤的方法來解決。

本公開文本涉及治療多發性骨髓瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）。

本公開文本還涉及治療多發性骨髓瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）和抗CD38抗體。

本公開文本還涉及治療多發性骨髓瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）和免疫調節藥物（IMiD）。

本公開文本還涉及克服多發性骨髓瘤受試者中的IMiD耐藥性的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾），任選地與抗CD38抗體或免疫調節藥物（IMiD）一起。

通過參考詳細描述和實例可以更全面理解本發明實施例，詳細描述和實例旨在舉例說明非限制性實施例。

概述

貝魯舒地爾是一種口服的選擇性rho相關含捲曲螺旋蛋白激酶2（coiled-coil–containing protein kinase-2，ROCK2）抑制劑。ROCK2抑制作用於失調的適應性免疫系統和因異常組織修復而發生的纖維化。貝魯舒地爾抑制ROCK2和ROCK1，IC ₅₀值分別為大約100 nM和3 μM。

在離體或體外人類T細胞測定中，貝魯舒地爾經由調節STAT3/STAT5磷酸化和改變Th17/Treg平衡來下調促炎反應。在體外，貝魯舒地爾還抑制異常的促纖維化訊息傳遞。通過控制ROCK2活性，貝魯舒地爾介導免疫細胞功能和纖維化途徑中的訊息傳遞，從而減輕由這種令人衰弱的疾病造成的影響，諸如多種組織的炎症以及可能涉及包括肺、肝膽系統、肌肉骨骼系統、胃腸（GI）道和皮膚在內的多個器官的纖維化變化。在體內，貝魯舒地爾在慢性GVHD的動物模型中展現出活性。

貝魯舒地爾的甲磺酸鹽在美國和其他國家作為REZUROCK ^TM銷售，用於治療患有慢性GVHD（cGVHD）的患者，在一些情況下，用於在至少兩個先前系統治療線失敗後治療慢性GVHD患者。化合物貝魯舒地爾的化學名稱如下：2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺。化合物貝魯舒地爾也稱為KD025。REZUROCK ^TM的活性藥物成分是貝魯舒地爾甲磺酸鹽，其分子式為C ₂₇H ₂₈N ₆O ₅S，分子量為548.62 g/mol，並且化學名稱為2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺甲磺酸鹽（1：1）。

貝魯舒地爾甲磺酸鹽的化學結構如下：

貝魯舒地爾和用於製備所述化合物的方法描述於以下美國專利中：美國專利號8,357,693、美國專利號9,815,820、美國專利號10,183,931和美國專利號10,696,660。

本公開文本提供了將貝魯舒地爾甲磺酸鹽（REZUROCK™）投予於有需要的受試者，以治療多發性骨髓瘤的方法。還公開了將貝魯舒地爾甲磺酸鹽（REZUROCK™）與抗骨髓瘤劑（如抗CD38抗體或免疫調節藥物（IMiD））組合投予於有需要的患者，以治療多發性骨髓瘤的方法。 定義

如本文所用的「約」包括由術語約修飾的確切量以及預期在實驗誤差內（諸如在15%、10%或5%內）的量。例如，「約200 mg」意指「200 mg」以及在實驗誤差（例如加或減200 mg的15%、10%或5%）內的mg範圍。如本文所用，術語「約」可用於修飾範圍以及特定值。

如本文所用，「投予」或「投予於」（例如，包括關於停止向受試者投予和/或恢復向受試者投予API（包括化合物或貝魯舒地爾）而提及的此術語的使用）是指開處一種或多種含有API的藥品供受試者在治療期間服用的動作、將所述一種或多種藥品分配給受試者的動作和/或身體上接受或攝取所述一種或多種藥品的動作。因此，API（例如，化合物或貝魯舒地爾）可以由以下人員「投予」：寫出一種或多種藥品的處方的醫師或其他醫學專業人員；和/或按所述處方配藥和/或將所述一種或多種藥品分配給受試者的藥劑師；和/或攝取藥品的患者或受試者和/或向受試者提供藥品的他或她的同伴或照管者，其中的每一人員也可以「停止」投予和/或「恢復」投予API。

當本文使用術語「貝魯舒地爾」時，應當理解，除非上下文另有明確指示，否則所述術語可涵蓋任何形式的化合物貝魯舒地爾以及其醫藥上可接受的鹽。術語「貝魯舒地爾」既指代化合物貝魯舒地爾（例如，游離鹼形式、無定形形式或結晶形式），指代貝魯舒地爾的醫藥上可接受的鹽（例如，如在REZUROCK ^TM中使用的甲磺酸鹽形式），又指代可在用於將所述化合物投予於患者的調配物或醫藥組成物中使用的貝魯舒地爾的任何形式。

「治療線」或「療法線」描述了當患者的疾病進展時向患者給予不同療法的順序或次序。初始治療（一線療法）可能無效或在一段時間後停止起作用。在停止一線治療後，可以給予第二種不同的治療（二線療法）。當二線療法不起作用或停止起作用時，可以給予後續療法線。一些患者在疾病的過程中可能被投予多線療法。

除非上下文另有要求，否則「或」以包含的含義使用（等同於「和/或」）。

如本文所用的「患者」或「受試者」包括動物或人類，在一個實施例中包括人類。

「醫藥組成物」意指適於向個體投予的物質（其包括藥劑）的混合物。例如，醫藥組成物可包含無菌水溶液或以口服劑型（如片劑或膠囊）配製的API。

「醫藥上可接受的鹽」意指本文提供的化合物的生理上和醫藥上可接受的鹽。「醫藥上可接受的鹽」是指所公開的化合物的衍生物，其中通過將現有的酸或鹼部分轉化為其鹽形式而對母本化合物進行修飾。醫藥上可接受的鹽的例子包括但不限於諸如胺等鹼性殘基的礦物酸鹽或有機酸鹽；諸如羧酸等酸性殘基的鹼鹽或有機鹽等。本發明的醫藥上可接受的鹽包括例如從無毒的無機酸或有機酸形成的母本化合物的常規無毒鹽。本發明的醫藥上可接受的鹽可以通過常規化學方法從含有鹼性或酸性部分的母體化合物合成。通常，此類鹽可以通過使這些化合物的游離酸或鹼形式與化學計量量的適當鹼或酸在水中或在有機溶劑中或在水與有機溶劑的混合物中反應來製備；通常，像醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈的非水性介質是優選的。

「復發」或「復發性」意指在一段時間的改善後，疾病或病症的體徵和症狀的再現。在多發性骨髓瘤中，復發涉及以下中的一種或多種：(1) 現有漿細胞瘤或骨病變的大小的明確增加，(2) 高鈣血症，其高於血液中的正常鈣水平（＞ 11 mg/dL），(3) 與療法無關的血紅蛋白（紅細胞中攜帶氧的蛋白質）減少 ≥ 2 g/dL或其他非骨髓瘤相關病症，(4) 從治療開始起血清肌酐（血液中的肌肉廢物）升高2 mg/dL或更多，可歸因於骨髓瘤，(5) 與血清蛋白相關的高黏滯（血液增稠），(6) 以下標準中的一項或多項較最低確認反應值增加25%：a) 血清M蛋白（增加必須為至少0.5 g/dL），b) 尿液M蛋白（增加必須為至少200 mg/24小時），c) 如果測量不到血清或尿M蛋白，則為受累的（異常或單株）與未受累的（正常或多株）游離輕鏈水平之間的差異（增加必須 ＞ 10 mg/dL）。（Kumar等人，Lancet Oncol, 2016, 17(8), E328-E346）。

「難治性」意指最初對治療無反應或隨時間推移變得對治療無反應的疾病或病症。

活性藥物成分（API）的「治療有效量」意指當投予於人以治療疾病（例如，多發性骨髓瘤）時足以實現對所治療的疾病狀態的治療的量。如應用於人的多發性骨髓瘤，「治療（treating）」或「治療（treatment）」包括 (1) 降低患上多發性骨髓瘤的風險和/或抑制多發性骨髓瘤，即阻止或降低多發性骨髓瘤或其臨床症狀的發展；以及 (2) 緩解多發性骨髓瘤，即引起多發性骨髓瘤的消退、逆轉或改善，或者降低其臨床症狀的數量、頻率、持續時間或嚴重程度。API的治療有效量可根據待治療的受試者的健康和身體狀況、疾病進展程度、醫學狀況的評估和其他相關因素而變化。 示例性實施例

在一個實施例中，本公開文本提供了一種治療多發性骨髓瘤的方法，所述方法包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}-N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）。

在一些實施例中，將所述貝魯舒地爾作為單一療法投予。在一些實施例中，將貝魯舒地爾與抗CD38抗體組合投予。

在一些實施例中，所述抗CD38抗體是達雷木單抗、艾薩妥昔單抗、MOR202或邁澤妥單抗（mezagitamab，TAK-079）。在一些實施例中，所述抗CD38抗體是艾薩妥昔單抗。在一些實施例中，將所述艾薩妥昔單抗以10 mg/kg或20 mg/kg的劑量靜脈內投予於所述受試者。在一些實施例中，以1000 mg或1400 mg的劑量皮下投予所述艾薩妥昔單抗。在一些實施例中，將所述艾薩妥昔單抗以28天週期投予。在一些實施例中，在第一個28天週期中，每週投予所述艾薩妥昔單抗一次。在一些實施例中，在隨後的28天週期中，每週投予所述艾薩妥昔單抗兩次。在一些實施例中，在艾薩妥昔單抗投予12個月後，每4週投予所述艾薩妥昔單抗一次。

在一些實施例中，將貝魯舒地爾與免疫調節藥物（immunomodulatory drug，IMiD）組合投予。

在一些實施例中，所述IMiD選自泊馬度胺、來那度胺（lenalidomide）、沙利度胺（thalidomide）、伊伯度胺（iberdomide）和美齊度胺（mezigdomide）。在一些實施例中，所述IMiD是泊馬度胺，並且從每個28天週期的第1天至第21天以4 mg的劑量每天向所述受試者投予所述泊馬度胺一次。在一些實施例中，口服投予泊馬度胺。

在一些實施例中，將貝魯舒地爾以28天週期投予。在一些實施例中，將所述貝魯舒地爾每天以至多1000 mg的劑量投予於所述受試者。在一些實施例中，將所述貝魯舒地爾每天以200 mg的劑量投予於所述受試者。在一些實施例中，將所述貝魯舒地爾每天以200 mg的劑量投予於所述受試者兩次。在一些實施例中，將所述貝魯舒地爾每天以400 mg的劑量投予於所述受試者。

在一些實施例中，將所述貝魯舒地爾以500 mg/天、600 mg/天、700 mg/天、800 mg/天、900 mg/天和1000 mg/天的劑量投予於所述受試者。在一些實施例中，口服投予所述貝魯舒地爾。

在一些實施例中，貝魯舒地爾是2-{3-[4-(1H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}-N-(丙-2-基)乙醯胺的甲磺酸鹽。

在一些實施例中，受試者正在接受伴隨的皮質類固醇療法。在一些實施例中，所述伴隨的皮質類固醇療法選自地塞米松、強體松（prednisone）和甲基培尼皮質醇（methylprednisolone）。

在一些實施例中，包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}-N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）的治療多發性骨髓瘤的所述方法進一步包括投予艾薩妥昔單抗和地塞米松。

在一些實施例中，包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}-N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）的治療多發性骨髓瘤的所述方法進一步包括投予泊馬度胺和地塞米松。

在一些實施例中，所述受試者已經接受用於治療多發性骨髓瘤的先前療法。在一些實施例中，所述受試者患有復發性多發性骨髓瘤。在一些實施例中，所述受試者患有復發性和難治性多發性骨髓瘤。在一些實施例中，所述多發性骨髓瘤是燜燃型多發性骨髓瘤。

在一些實施例中，所述治療克服了患有多發性骨髓瘤的受試者的IMiD耐藥性。

在一些實施例中，提供了治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾）用於製備用於治療有需要的受試者的多發性骨髓瘤的藥劑的用途。

在一些實施例中，提供了一種化合物，其包含治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾），其用於治療有需要的受試者的多發性骨髓瘤。 貝魯舒地爾的投予

在一些實施例中，將貝魯舒地爾以約1000 mg/天、900 mg/天、800 mg/天、700 mg/天、600 mg/天或500 mg/天的劑量投予於受試者。在一些實施例中，將貝魯舒地爾以選自每天200 mg、每天200 mg兩次和每天400 mg的劑量投予於受試者。在一些實施例中，所述劑量為每天200 mg。在一些實施例中，所述劑量為每天200 mg兩次。在一些實施例中，所述劑量為每天400 mg。

在一些實施例中，將貝魯舒地爾以28天週期投予。 貝魯舒地爾片劑

在一個實施例中，將貝魯舒地爾配製成用於口服投予的片劑。貝魯舒地爾甲磺酸鹽是一種幾乎不溶於水的黃色粉末。可製備貝魯舒地爾片劑用於口服投予。每個片劑含有200 mg游離鹼，相當於242.5 mg 貝魯舒地爾甲磺酸鹽。所述片劑還可以含有以下非活性成分：微晶纖維素、羥丙甲纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉、膠體二氧化矽和硬脂酸鎂。片劑薄膜由聚乙烯醇、聚乙二醇、滑石粉、二氧化鈦和黃色氧化鐵組成。每個200 mg片劑是淡黃色薄膜包衣的橢圓形片劑，一側具凹入圖案「KDM」，且另一側具凹入圖案「200」。片劑在室溫20ºC至25ºC（68°F至77°F）下儲存；允許的溫度偏差為15ºC至30ºC（59°F至86°F）。 多發性骨髓瘤

使用充分表徵的MM細胞株的體外研究被認為是適當的模型。因此，在MM細胞株MOLP-8、LP-1、RPMI-8226和MM.1R中的研究應理解為用於評估多發性骨髓瘤治療劑的相關體外模型。參見例如，Kassem S 等人，Blood 2022年2月24日;139(8):1160-1176；Matsuo Y 等人，Leuk Res. 2004年8月;28(8):869-77；Deckert J 等人，Clin Cancer Res. 2014年9月1日;20(17):4574-83；De Veirman K 等人，Oncotarget. 2015; 6:10532-10547；Li M 等人，Cancer Cell Int. 2021年12月19日;21(1):683；Moreaux J 等人，Haematologica. 2011年4月;96(4):574-82；Chauhan D 等人，Blood 2004年4月15日;103(8):3158-66；以及Yasui H 等人，Blood 2005年7月15日;106(2):706-12。

國際骨髓瘤工作組多發性骨髓瘤診斷標準修訂版要求無性骨髓漿細胞 ≥ 10%或經活檢證實的骨或髓外漿細胞瘤以及以下骨髓瘤定義事件中的任何一種或多種：(1) 可以歸因於潛在的漿細胞增殖性障礙的終末器官損傷的證據，具體而言：(a) 高鈣血症：血清鈣高於正常值上限 ＞ 0.25 mmol/L（＞ 1 mg/dL），或者為 ＞ 2.75 mmol/L（＞ 11 mg/dL）；(b) 腎功能不全：肌酐清除率 ＜ 40 mL/min（透過經驗證的方程測量或估計）或血清肌酐 ＞ 177 μmol/L（＞ 2 mg/dL）；(c) 貧血：血紅蛋白值低於正常值下限 ＞ 20 g/L，或血紅蛋白值 ＜ 100 g/L；或 (d) 骨病變：骨骼X射線攝影、CT或PET-CT上的一處或多處溶骨性病變（如果骨髓具有小於10%的無性漿細胞，則需要多於一處的骨病變以與具有最小骨髓受累的孤立性漿細胞瘤相區分）；(2) 惡性腫瘤的以下生物標誌物中的任何一種或多種：(a) 無同源骨髓漿細胞百分比 ≥ 60%；(b) 受影響的：不受影響的血清游離輕鏈比率 ≥ 100（這些值基於血清Freelite測定（The Binding Site Group，英國伯明罕），受累的游離輕鏈必須 ≥ 100 mg/L）；或 (c) MRI研究中 ＞ 1個局灶性病變（每個局灶性病變的大小必須為5 mm或更大）。（Rajkumar等人，Lancet Oncol. 2014, 15(12), e538-48）。

國際骨髓瘤工作組燜燃型多發性骨髓瘤（smouldering multiple myeloma）診斷標準修訂版要求符合以下兩項標準：(1) 血清單株蛋白（IgG或IgA） ≥ 30 g/L或尿單株蛋白 ≥ 500 mg/24 h和/或無性骨髓漿細胞為10%至60%；和 (2) 不存在骨髓瘤定義事件或澱粉樣變性。（Rajkumar等人）。

在一個實施例中，應測量PET-CT = ¹⁸F-氟去氧葡萄糖PET聯用CT。應透過在流式細胞儀、免疫組織化學或免疫螢光上顯示κ/λ輕鏈限制來確立單株性（Clonality）。優選從核心活檢樣本估計骨髓漿細胞百分比；如果在抽吸物與核心活檢物之間存在差異，則應使用最高值。

CRAB是多發性骨髓瘤的最常見的症狀的首字母縮寫字：高鈣血症、腎衰竭、貧血和骨病變。

多發性骨髓瘤可以基於由骨髓瘤細胞過量產生的免疫球蛋白被分類為不同類型。大多數骨髓瘤患者患有免疫球蛋白G（IgG）或免疫球蛋白A（IgA）骨髓瘤。罕見的亞型是免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）骨髓瘤。大約15%至20%的患者患有輕鏈骨髓瘤（Bence Jones骨髓瘤）。約1%至5%的患者患有非分泌性骨髓瘤。IgM骨髓瘤是一種非常罕見的亞型，其通常發生在華氏巨球蛋白血症（Waldenström's macroglobulinemia）中。

用於治療多發性骨髓瘤的藥物包括蛋白酶體抑制劑（proteasome inhibitor，PI）、免疫調節藥物（IMiD）、單株抗體（monoclonal antibodies，MAb）和皮質類固醇。二膦酸鹽也可用於管理骨髓瘤相關的骨疾病。

符合移植條件的患者的初始治療可以包括自體幹細胞移植（ASCT）之前的誘導或一線療法。誘導治療可以包括以下的組合：硼替佐米（bortezomib）、來那度胺和地塞米松（VRd）；卡非佐米（carfilzomib）、來那度胺和地塞米松；達雷木單抗、來那度胺、硼替佐米和地塞米松；伊沙佐米（ixazomib）、來那度胺和地塞米松；硼替佐米、環磷醯胺和地塞米松（VCD或CyBorD）；硼替佐米、多柔比星（doxorubicin）和地塞米松；卡非佐米、環磷醯胺和地塞米松；伊沙佐米、環磷醯胺和地塞米松；硼替佐米、沙利度胺和地塞米松（VTD）；環磷醯胺、來那度胺和地塞米松；來那度胺和地塞米松（RD）；硼替佐米和地塞米松（VD）；達雷木單抗和透明質酸酶；硼替佐米、黴法蘭（melphalan）和強體松；達雷木單抗和透明質酸酶、來那度胺和地塞米松；達雷木單抗和透明質酸酶、硼替佐米、沙利度胺和地塞米松；達雷木單抗、卡非佐米、來那度胺和地塞米松；達雷木單抗、環磷醯胺、硼替佐米和地塞米松；達雷木單抗、硼替佐米、沙利度胺和地塞米松；或地塞米松、沙利度胺、順鉑、多柔比星、環磷醯胺、依托泊苷（etoposide）和硼替佐米。

在已經實現對誘導治療的最大反應後，可以使用自體幹細胞移植（autologous stem cell transplant，ASCT），然後進行維持治療。維持治療可以包括來那度胺；伊沙佐米；硼替佐米；或者伴隨或不伴隨地塞米松的硼替佐米和來那度胺。

不符合移植條件的患者的初始治療可以包括硼替佐米、來那度胺和地塞米松；達雷木單抗、來那度胺和地塞米松；伊沙佐米、來那度胺和地塞米松；達雷木單抗、硼替佐米、黴法蘭和強體松；或達雷木單抗、環磷醯胺、硼替佐米和地塞米松。不符合移植條件的患者的維持治療可以包括來那度胺、伊沙佐米、硼替佐米或硼替佐米和來那度胺。

用於治療復發性多發性骨髓瘤的療法可以包括硼替佐米、來那度胺和地塞米松；卡非佐米、來那度胺和地塞米松；達雷木單抗、硼替佐米和地塞米松、達雷木單抗、卡非佐米和地塞米松；達雷木單抗、來那度胺和地塞米松；伊沙佐米、來那度胺和地塞米松；或艾薩妥昔單抗、卡非佐米和地塞米松。兩次先前多發性骨髓瘤療法後的治療可以包括伊沙佐米、泊馬度胺和地塞米松；泊馬度胺、硼替佐米和地塞米松；艾薩妥昔單抗、泊馬度胺和地塞米松；或達雷木單抗、泊馬度胺和地塞米松。

燜燃型多發性骨髓瘤（SMM）是多發性骨髓瘤的癌前形式，其通常占新診斷的多發性骨髓瘤病例的約15%。當在血液中發現低水平的M蛋白並且在骨髓中發現漿細胞數量略有增加時，診斷為所述疾病。許多患有SMM的患者無症狀，但是有些患者會經歷不嚴重的症狀，如輕度貧血或少許小的骨病變。許多（但不是全部）患有SMM的患者進展為多發性骨髓瘤。在診斷之後的前5年，進展的風險每年為約10%，在第5年與第10年之間為3%，在隨後的幾年中為約1%。 組合療法

在一些實施例中，將貝魯舒地爾與抗骨髓瘤劑（如抗CD38抗體或IMiD）組合投予。

在一些實施例中，將貝魯舒地爾與抗CD38抗體（例如，單株抗體）組合投予。抗CD38抗體的例子包括但不限於艾薩妥昔單抗、達雷木單抗、MOR202和邁澤妥單抗（TAK-079）。

「艾薩妥昔單抗」（一種指向CD38的溶細胞性抗體）是嵌合表面重修/人源化免疫球蛋白G1（IgG1）單株抗體（mAb）。可以使用補料分批生產方法從哺乳動物細胞株（中國倉鼠卵巢，CHO）產生艾薩妥昔單抗。艾薩妥昔單抗由兩條相同的免疫球蛋白κ輕鏈和兩條相同的免疫球蛋白γ重鏈構成，並且總分子量為大約148 kDa。

SARCLISA®（艾薩妥昔單抗）注射劑是一種無菌、不含防腐劑、澄清至略呈乳白色、無色至略呈黃色的溶液，基本上不含可見顆粒，位於用於靜脈內使用的單劑量小瓶中。每個小瓶含有100 mg/5 mL或500 mg/25 mL的艾薩妥昔單抗，濃度為20 mg/mL，pH為6.0。每mL的溶液含有20 mg的艾薩妥昔單抗、組胺酸（1.46 mg）、組胺酸鹽酸鹽一水合物（2.22 mg）、聚山梨醇酯80（0.2 mg）、蔗糖（100 mg）和注射用水。

艾薩妥昔單抗結合至在造血細胞和腫瘤細胞（包括多發性骨髓瘤細胞）的表面上表現的CD38。艾薩妥昔單抗誘導腫瘤細胞凋亡和免疫效應機制的啟動，所述免疫效應機制包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）和補體依賴性細胞毒性（CDC）。艾薩妥昔單抗抑制CD38的ADP-核糖基環化酶活性。艾薩妥昔單抗可以在不存在CD38陽性靶腫瘤細胞的情況下啟動自然殺傷（NK）細胞，並且抑制CD38陽性的調節性T細胞。艾薩妥昔單抗和泊馬度胺的組合在體外與單獨的艾薩妥昔單抗相比增強了ADCC活性和直接腫瘤細胞殺傷，並且在人類多發性骨髓瘤異種移植物模型中與單獨的艾薩妥昔單抗或泊馬度胺的活性相比增強了抗腫瘤活性。

在一些實施例中，抗CD38抗體是艾薩妥昔單抗，並且可以將其以10 mg/kg或20 mg/kg的劑量靜脈內投予於個體。在其他實施例中，可以將艾薩妥昔單抗以1000 mg或1400 mg的劑量皮下投予。

可以將抗CD38抗體以週期投予。在一些實施例中，抗CD38抗體是艾薩妥昔單抗（呈靜脈內或皮下形式）並且以28天週期投予。在第一個週期中，每週（QW）投予艾薩妥昔單抗一次，例如在所述週期的第1天、第8天、第15天和第22天投予。在隨後的週期中，可以每週兩次（Q2W）投予艾薩妥昔單抗，例如，在所述週期的第1天和第15天投予。在艾薩妥昔單抗投予12個月後，可以將艾薩妥昔單抗投予減少至每4週一次（Q4W），例如，在天投予，並且在第1天以10 mg/kg的劑量投予艾薩妥昔單抗（例如，Q4W），同時保持安全性和功效。

在一些實施例中，抗CD38抗體是達雷木單抗，並且可以將其以16 mg/kg的劑量靜脈內投予於個體。在其他實施例中，達雷木單抗可以以1800 mg的劑量皮下投予。達雷木單抗可以按符合已發佈的處方資訊（發佈於www.accessdata.fda.gov）的給藥方案投予，所述處方資訊用於靜脈內使用的達雷木單抗注射劑或分別用於靜脈內和皮下調配物的達雷木單抗和透明質酸酶-fihj。

在一些實施例中，將貝魯舒地爾與免疫調節藥物（在本文中有時稱為IMiD）組合投予。免疫調節藥物的例子包括但不限於泊馬度胺、來那度胺和沙利度胺。

「泊馬度胺」是沙利度胺類似物。化學名稱是(RS)-4-胺基-2-(2,6-二氧代-呱啶-3-基)-異吲哚啉-1,3-二酮，並且它具有以下化學結構：

泊馬度胺的經驗式為C ₁₃H ₁₁N ₃O ₄，並且克分子量是273.24。泊馬度胺是黃色固體粉末。它在有機溶劑中限於低溶解度，並且它在所有pH溶液中均具有低溶解度（約0.01 mg/mL）。泊馬度胺具有作為R(+)和S(-)對映異構體的外消旋混合物存在的手性碳原子。泊馬度胺可以用於口服投予的1 mg、2 mg、3 mg和4 mg膠囊獲得。每個膠囊含有作為活性成分的泊馬度胺和以下非活性成分：甘露糖醇、預膠化澱粉和硬脂醯富馬酸鈉。1 mg膠囊殼含有明膠、二氧化鈦、FD&C藍2，黃色氧化鐵、白色墨水和黑色墨水。2 mg膠囊殼含有明膠、二氧化鈦、FD&C藍2、黃色氧化鐵、FD&C紅3和白色墨水。3 mg膠囊殼含有明膠、二氧化鈦、FD&C藍2、黃色氧化鐵和白色墨水。4 mg膠囊殼含有明膠、二氧化鈦、FD&C藍1、FD&C藍2和白色墨水。

「地塞米松」是腎上腺皮質類固醇。化學名稱在化學上是9-氟-11β,17,21-三羥基-16α-甲基孕-1,4-二烯-3,20-二酮，並且它具有以下化學結構：

地塞米松的經驗式為C ₂₂H ₂₉FO ₅，並且克分子量是392.47。地塞米松是白色至幾乎白色、無味的結晶粉末，其在空氣中穩定，並且幾乎不溶於水。地塞米松也可作為用於靜脈內、肌內、關節內、軟組織或病變內使用的注射用磷酸酯鈉獲得。 實例 實例 1：貝魯舒地爾或泊馬度胺對多發性骨髓瘤（MM）細胞株的增殖的影響

在一組具有不同遺傳背景的MM細胞株（LP1、MM1R、MM1S、OPM2）中在體外評估貝魯舒地爾對MM增殖的影響。透過用DMSO標準化的CellTiter-Glo®發光細胞存活率測定來測量細胞存活率。用貝魯舒地爾或泊馬度胺處理細胞8天。如圖1A所示，用貝魯舒地爾處理8天以劑量依賴性方式導致MM細胞株生長抑制，IC ₅₀從1 mM至7 mM變化。如圖1B所示，泊馬度胺也在所有這些MM細胞株中顯示出生長抑制，除了LP1（其為已知的免疫調節藥物（IMiD）耐藥性細胞株）（Leukemia (2014) 28, 1129-1174）和KE97之外。貝魯舒地爾顯示出對LP1的生長抑制，這表明不存在對貝魯舒地爾和IMiD的交叉耐藥性。

與MM生長抑制一致，在LP1細胞中，貝魯舒地爾誘導C-myc蛋白（MM腫瘤的主要驅動因數）的急劇減少。相比之下，泊馬度胺顯示對LP1細胞中的C-myc蛋白非常溫和的影響。這些結果在圖2中示出。

總體而言，這些資料證明貝魯舒地爾誘導對大組MM細胞株的生長抑制作用。貝魯舒地爾與IMiD沒有交叉耐藥性，這表明貝魯舒地爾可以用於在IMiD治療後或與IMiD組合治療MM。 實例 2：MM細胞上的CD38表現以及MM細胞株和NK細胞的增殖/存活率

進行體外測定以評估：1) 貝魯舒地爾（單獨或與艾薩妥昔單抗組合）對MOLP-8 MM細胞上的CD38的表現的影響；2) 貝魯舒地爾（單獨或與艾薩妥昔單抗組合）對MOLP-8細胞的增殖/存活率的影響；3) 貝魯舒地爾對不同MM細胞株（LP1和RPMI8226）的增殖/存活率的影響；4) 貝魯舒地爾對健康供體來源的NK細胞（HD NK細胞）的增殖/存活率的影響。 方法

MM 細胞株：

將MOLP-8（DSMZ，#ACC569）維持在RPMI1640完全培養基（RPMI1640，補充有20% FBS - Eurobio #CVFSVF06-01和1% L-麩醯胺酸 - Gibco #25030-081）中，在使用前在37ºC和5% CO ₂下培育。

將LP1（DSMZ，#ACC41）維持在補充有20% FBS（Eurobio #CVFSVF06-01）和1% L-麩醯胺酸（Gibco #25030-081）的IMDM培養基中，在使用前在37ºC和5% CO ₂下培育。

將RPMI8226（ATCC，#CCL155）維持在RPMI1640完全培養基中，在使用前在37ºC和5% CO ₂下培育。

在處理之前，將MM細胞以300 g離心5分鐘，計數，並重懸於RPMI1640完全培養基中以具有50000個細胞/100 µl。

人類 HD NK 細胞分離：

健康供體膚色血球層由EFS Ile de France提供。在接收後立即將合格的膚色血球層在室溫下輕輕攪拌隔夜。第二天，透過Ficoll（Cytiva #17-1440-02）密度梯度離心來分離外周血單個核細胞（PBMC）。用來自Miltenyi Biotec的MACSXpress全血NK細胞分離套組（#130-127-695），使用手動磁性標記和MACSxpress分離器（Miltenyi Biotec #130-098-308），透過陰性選擇從PBMC純化人類NK細胞。然後，在補充有10%胎牛血清（FBS）（Eurobio #CVFSVF06-01）和1% L-麩醯胺酸（Gibco #25030-081）的RPMI1640培養基中培養純化的NK細胞。在使用之前，將細胞在37ºC和5% CO ₂下靜置隔夜。

細胞處理：

然後將化合物和細胞添加至Corning™ 96孔透明超低吸附微孔盤（Corning，#7007）的適當的孔中（每個孔的最終體積：200 µl）。

為了評估貝魯舒地爾和/或艾薩妥昔單抗對MOLP-8上的CD38的表現以及對MOLP-8的增殖/存活率的影響，按以下順序將化合物和細胞添加至適當的孔中：(1) 將艾薩妥昔單抗（或同種型對照）（預先在RPMI1640完全培養基中稀釋）添加至適當的孔中，使其最終濃度為20 µg/ml；(2) 將貝魯舒地爾（或媒劑對照-DMSO）添加至適當的孔中，使其最終濃度為1.1、3.3、10、20或25 µM；以及 (3) 然後將MOLP-8（50000個細胞/孔）添加至適當的孔中。

為了評估貝魯舒地爾對LP1、RPMI8226以及HD NK細胞的增殖/存活率的影響，按以下順序將化合物和細胞添加至適當的孔中：(1) 將貝魯舒地爾（或媒劑對照-DMSO）添加至適當的孔中，使其最終濃度為10、15、20、25和40 µM；(2) 然後將LP1或RPMI8226或HD NK細胞（50000個細胞/孔）添加至適當的孔中；以及 (3) 然後將板以100 g離心1分鐘，然後將其置於37ºC和5% CO ₂的培養箱中長達4天。

流式細胞儀：

在處理後，將細胞收集並且添加至U形底板中用於抗體標記。

然後，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的AutoMACS運行緩衝液（Miltenyi Biotec，#130-091-221）添加至每個孔中。所述過程重複兩次。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將100 µl的小鼠抗人類CD38一抗添加至孔中在4ºC下保持30 min。然後，添加100 µl的AutoMACS運行緩衝液，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的AutoMACS運行緩衝液添加至每個孔中。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將100 µl的AF488綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG二抗（Jackson Immuno Research #115-545-164）添加至孔中在4ºC下保持20 min。然後，添加100 µl的AutoMACS運行緩衝液，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的AutoMACS運行緩衝液添加至每個孔中。最後，將細胞再次以300 g離心5分鐘，並且重懸於80 µl的DPBS中。

為了另外評估細胞存活率，將DAPI（Miltenyi Biotec，#130-111-570）添加到每個孔中，然後透過流式細胞儀讀盤。然後用MACSQuant 16流式細胞儀（Miltenyi Biotec）分析樣品。使用圖3A至圖3D中示出的以下策略用FlowJo軟體分析資料：(A) 對不包括碎片的MOLP-8細胞進行圈選，隨後對單細胞進行圈選 (B)，從單細胞，對活DAPI ^neg細胞進行定量 (C)，並且從DAPI ^neg細胞，用FITC螢光染料對CD38的表現進行定量 (D)，並且表示為螢光強度的中值（MFI）。 結果

如圖4所示，與對照相比，單獨用艾薩妥昔單抗（20 µg/ml）處理3或4天後，MOLP-8細胞上的CD38表現降低。在處理3天和4天後，1.1 µM和3.3 µM的貝魯舒地爾與艾薩妥昔單抗（20 µg/ml）組合不影響MOLP-8細胞上的CD38表現。在處理3天和4天後，10 µM濃度的貝魯舒地爾誘導MOLP-8細胞表面上的CD38表現的增加。20 µM和25 µM的貝魯舒地爾也誘導MOLP-8上CD38表現的增加，但是與10 µM相比程度較低。重要的是，在處理3天和4天後，貝魯舒地爾（10、20和25 µM）與艾薩妥昔單抗（20 µg/ml）組合保存了MOLP-8細胞表面上的CD38表現。

如圖5A至圖5E所示，在低濃度（1.1和 3.3 µM）下未觀察到貝魯舒地爾處理對MOLP-8細胞存活率的影響（分別為圖5A和圖5B）。從處理後1天開始，在較高濃度（10、20和25 µM）下觀察到貝魯舒地爾對MOLP-8細胞存活率的有限影響（降低）（分別為圖5C、圖5D和圖5E）。

如圖6A至圖6C所示，在處理4天後，從10 µM開始，貝魯舒地爾顯著降低LP1和RPMI8226細胞（它們是已知的免疫調節藥物（IMiD）耐藥性細胞株）的存活率（Leukemia (2014) 28, 1129-1174; Blood. 2011; 117(19): 5157-5165）（圖6A和圖6B）。在處理4天後，貝魯舒地爾對HD NK細胞存活率沒有影響或影響非常有限（在高濃度25至40 µM下，最大降低10%）。 實例 3 ：MOLP-8 MM細胞的凋亡

體外評估了貝魯舒地爾（單獨或與艾薩妥昔單抗組合）對MOLP-8 MM細胞的促凋亡作用。 方法

MM 細胞株：

將MOLP-8（DSMZ，#ACC569）維持在RPMI1640完全培養基（RPMI1640，補充有20% FBS - Eurobio #CVFSVF06-01和1% L-麩醯胺酸 - Gibco #25030-081）中，在使用前在37ºC和5% CO ₂下培育。

在處理之前，將MM細胞以300 g離心5分鐘，計數，並重懸於RPMI1640完全培養基中以具有50000個細胞/100 µl。

細胞處理：

然後按以下順序將化合物和細胞添加至Corning™ 96孔透明超低吸附微孔盤（Corning，#7007）的適當的孔中（每個孔的最終體積：200 µl）：(1) 將艾薩妥昔單抗（或同種型對照）（預先在RPMI1640完全培養基中稀釋）添加至適當的孔中，使其最終濃度為20 µg/ml；(2) 將貝魯舒地爾（或媒劑對照-DMSO）添加至適當的孔中，使其最終濃度為1.1、3.3、10、20或25 µM；(3) 然後將MOLP-8（50000個細胞/孔）添加至適當的孔中；以及 (4) 然後將板以100 g離心1分鐘，然後將其置於37ºC和5% CO ₂的培養箱中長達4天。

流式細胞儀：

使用膜聯蛋白V細胞凋亡檢測套組eFluor450（Invitrogen，#88-8006-74）評估凋亡。

在處理後，將細胞收集並且添加至U形底板中用於抗體標記。

然後，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的D-PBS添加至每個孔中。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的1X緩衝液（來自膜聯蛋白V細胞凋亡檢測套組）添加至每個孔中。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將100 µl的膜聯蛋白V標記溶液（來自膜聯蛋白V細胞凋亡檢測套組）添加至孔中在4ºC下保持20 min（按照製造商的說明）。

然後，添加100 µl的1X緩衝液，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的1X緩衝液添加至每個孔中。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且重懸於80 µl的D-PBS中。

另外，將7-AAD（來自膜聯蛋白V細胞凋亡檢測套組）添加到每個孔中，然後通過流式細胞儀讀盤。然後用MACSQuant 16流式細胞儀（Miltenyi Biotec）分析樣品。在圖7A至圖7C中，使用以下策略用FlowJo軟體分析資料：對不包括碎片的MOLP-8細胞進行圈選 (A)，隨後對單細胞進行圈選 (B)。從單細胞，對早期凋亡的7-AAD ^neg和膜聯蛋白V-eFluor450 ^pos（C，Q1）和晚期凋亡的7-AAD ^neg和膜聯蛋白V-efluor450 ^pos（C，Q2）細胞進行定量 (C)。圖中顯示了早期和晚期凋亡細胞的百分比。 結果

如圖8所示，在處理2、3和4天後，10、20和25 µM的貝魯舒地爾以劑量依賴性的方式誘導MOLP-8的凋亡。在處理2、3和4天後，20和25 µM的貝魯舒地爾與艾薩妥昔單抗（20 µg/ml）組合以劑量依賴性的方式進一步增加MOLP-8 MM細胞的凋亡。 實例 4 ：針對LP-1 MM細胞的長期細胞毒性

在用艾薩妥昔單抗與貝魯舒地爾組合處理後，在健康供體（HD）來源的NK細胞（效應細胞）的存在下，評估針對LP-1 RFP多發性骨髓瘤細胞（靶細胞）的細胞毒性。透過Incucyte®活細胞成像和分析系統（Essen Bioscience）隨時間推移測量細胞毒性。 方法

RFP+ LP1 MM 細胞的生成：

透過用Incucyte® Nuclight Red慢病毒（Sartorius）感染LP-1細胞（DSMZ，#ACC41）以表現紅色螢光蛋白（RFP）來生成LP-1 RFP細胞。將LP-1 RFP細胞維持在補充有20%胎牛血清（FBS熱滅活，Biowest，#S181H-100）、1% L-麩醯胺酸（Gibco，#25030-024）的IMDM培養基（Gibco，#12440053）中，並且在37ºC和5% CO ₂下培育。將LP-1 RFP細胞以300 g離心5分鐘，重懸於RPMI1640完全培養基（RPMI1640，補充有10%胎牛血清 - FBS，Biowest，#S181H-100 -，1% L-麩醯胺酸 - Gibco，#25030-024）中，然後將其添加至Incucyte®板中（詳見下文）。

人類 HD NK 細胞分離：

健康供體膚色血球層由EFS Ile de France提供。在接收後立即將合格的膚色血球層在室溫下輕輕攪拌隔夜。第二天，透過Ficoll（Cytiva #17-1440-02）密度梯度離心來分離外周血單個核細胞（PBMC）。用來自Miltenyi Biotec的MACSXpress全血NK細胞分離套組（#130-127-695），使用手動磁性標記和MACSxpress分離器（Miltenyi Biotec #130-098-308），透過陰性選擇從PBMC純化人類NK細胞。然後，在補充有10%胎牛血清（FBS）（Eurobio #CVFSVF06-01）和1% L-麩醯胺酸（Gibco #25030-081）的RPMI1640培養基中培養純化的NK細胞。在使用之前，將細胞在37ºC和5% CO ₂下靜置隔夜。

通過 Incucyte® 進行細胞毒性測定：

使用Incucyte®活細胞分析系統評價細胞毒性，所述活細胞分析系統允許隨時間推移對活螢光靶細胞的數量進行定量。

按以下順序將化合物和細胞添加至Incucyte®板（聚D離胺酸處理的96孔平底微孔盤CellCoat™，Greiner Bio-One；#655946）的適當的孔中（每個孔的最終體積：200 µl）：(1) 將艾薩妥昔單抗（或同種型對照）（預先在RPMI1640完全培養基中稀釋）添加至適當的孔中，使其最終濃度為1、10、100或1000 ng/ml；(2) 然後將貝魯舒地爾（預先在RPMI1640完全培養基中稀釋）添加至適當的孔中，使其最終濃度為1.1、3.3和10 µM；(3) 然後將LP-1 RFP細胞（靶細胞，T）添加至每個孔中（以具有20000個LP1-RFP細胞/孔）；(4) 然後將HD NK細胞（效應細胞，E）添加至適當的孔中（添加60000個細胞，以具有3：1的E：T比率），在一些孔中不添加HD NK細胞，以測試貝魯舒地爾對LP-1 RFP細胞的直接作用。

然後將Incucyte®板以100 g離心1分鐘，然後置於Incucyte®（IncucyteS3，EssenBio）中，將其容納在37ºC和5% CO ₂的專用培養箱中。每4小時用10X物鏡和使用相位和紅色通道的標準掃描類型拍攝圖像（4個圖像/孔）。透過螢光成像監測LP-1 RFP靶細胞的生長長達90小時，並且使用IncucyteS3軟體對活靶細胞的數量進行定量，並相對於零時刻活靶細胞的數量進行標準化。 結果

如圖9和圖10所示，貝魯舒地爾隨時間推移以劑量依賴性方式誘導LP-1的殺傷，這與HD NK細胞的存在無關（圖9）。在HD NK細胞的存在下，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）與艾薩妥昔單抗（100 ng/ml）組合隨時間推移進一步增加LP-1細胞殺傷（圖10和圖14）。 實例 5：與泛ROCK抑制劑（Y27632）相比，貝魯舒地爾對多發性骨髓瘤（MM）細胞株和NK細胞的增殖/存活率的影響

評估了與泛ROCK抑制劑（Y27632）相比，貝魯舒地爾對不同MM細胞株（MOLP-8、LP-1和RPMI-8226）的增殖和/或存活率的影響，正如評估與泛ROCK抑制劑（Y27632）相比，貝魯舒地爾對健康供體來源的NK細胞（HD NK細胞）的增殖和/或存活率的影響一樣。 方法

MM 細胞株：

將MOLP-8（DSMZ，#ACC569）維持在RPMI1640完全培養基（RPMI1640，補充有20% FBS - Eurobio #CVFSVF06-01和1% L-麩醯胺酸 - Gibco #25030-081）中，在使用前在37ºC和5% CO ₂下培育。

將LP-1（DSMZ, #ACC41）維持在補充有20% FBS（Eurobio #CVFSVF06-01）和1% L-麩醯胺酸（Gibco #25030-081）的IMDM培養基中，在使用前在37ºC和5% CO ₂下培育。

將RPMI-8226（ATCC，#CCL155）維持在RPMI1640完全培養基中，在使用前在37ºC下用5% CO ₂培育。

在處理之前，將MM細胞以300 g離心5分鐘，計數，並重懸於RPMI1640完全培養基中以具有50000個細胞/100 µl。

人類 HD NK 細胞分離：

健康供體膚色血球層由EFS Ile de France提供。在接收後立即將合格的膚色血球層在室溫下輕輕攪拌隔夜。第二天，通過Ficoll（Cytiva #17-1440-02）密度梯度離心來分離外周血單個核細胞（PBMC）。用來自Miltenyi Biotec的MACSXpress全血NK細胞分離套組（#130-127-695），使用手動磁性標記和MACSxpress分離器（Miltenyi Biotec #130-098-308），通過陰性選擇從PBMC純化人類NK細胞。然後，在補充有10%胎牛血清（FBS）（Eurobio #CVFSVF06-01）和1% L-麩醯胺酸（Gibco #25030-081）的RPMI1640培養基中培養純化的NK細胞。在使用之前，將細胞在37ºC和5% CO ₂下靜置隔夜。

細胞處理：

然後將化合物和細胞添加至Corning™ 96孔透明超低吸附微孔盤（Corning，#7007）的適當的孔中（每個孔的最終體積：200 µl）。為了評估貝魯舒地爾或Y27632對MOLP-8、LP-1、RPMI-8226以及HD NK細胞的增殖和/或存活率的影響，按以下順序將化合物和細胞添加至適當的孔中：將貝魯舒地爾或Y27632（Merck，#688000）或媒劑對照（DMSO）添加至適當的孔中，使其最終濃度為5（僅針對LP-1細胞）、10、15、20、25和40 µM。然後將MOLP-8或LP-1或RPMI-8226或HD NK細胞（50000個細胞/孔）添加至適當的孔中。然後將板以100 g離心1分鐘，然後將其置於37ºC和5% CO ₂的培養箱中長達4天。

流式細胞儀：

在處理後，將細胞收集並且添加至U形底板中用於抗體標記。

然後，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的AutoMACS運行緩衝液（Miltenyi Biotec，#130-091-221）添加至每個孔中。所述過程重複兩次。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將100 µl小鼠抗人類CD38一抗（Sanofi內部產生）添加至孔中在4ºC下保持30 min（僅用於貝魯舒地爾處理的細胞）。然後，添加100 µl的AutoMACS運行緩衝液，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的AutoMACS運行緩衝液添加至每個孔中。然後將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將100 µl的AF488綴合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG二抗（Jackson Immuno Research #115-545-164）添加至孔中在4ºC下保持20 min。然後，添加100 µl的AutoMACS運行緩衝液，將細胞以300 g離心5分鐘，除去上清液，並且將200 µl的AutoMACS運行緩衝液添加至每個孔中。最後，將細胞再次以300 g離心5分鐘，並且重懸於80 µl的DPBS中。

為了另外評估細胞存活率，將DAPI（Miltenyi Biotec，#130-111-570）添加到每個孔中，然後透過流式細胞儀讀盤。然後用MACSQuant 16流式細胞儀（Miltenyi Biotec）分析樣品。

如圖3所示，用FlowJo軟體分析資料：（圖3A）對不包括碎片的MOLP-8細胞進行圈選，隨後對單細胞進行圈選（圖3B）。從單細胞，對活DAPI ^neg細胞進行定量（圖3C）。從DAPI ^neg細胞中，用FITC螢光染料對CD38的表現進行定量（僅用於貝魯舒地爾處理的細胞）（圖3D），並且表示為螢光強度的中值（MFI）。

結果

圖11A至圖11G的資料顯示，在處理4天後，從10 µM（對於LP-1為5 µM）開始，貝魯舒地爾降低MOLP-8、RPMI-8226和LP-1細胞的存活率（細胞數量和活細胞%二者）；在處理4天後，Y27632沒有影響MOLP-8、RPMI-8226的存活率（細胞數量或活細胞%二者）；並且在處理4天後，貝魯舒地爾和Y27632均不影響HD NK細胞存活率。 實例 6 ：針對RPMI-8226和MM.1R MM細胞株的長期細胞毒性

在用艾薩妥昔單抗與貝魯舒地爾組合處理後，在健康供體（HD）來源的NK細胞（效應細胞）的存在下，評估針對RPMI-8226 RFP和MM.1R RFP多發性骨髓瘤細胞（靶細胞）的細胞毒性。透過Incucyte®活細胞成像和分析系統（Essen Bioscience）隨時間推移測量細胞毒性。

RFP 陽性 RPMI-8226 和 MM.1R MM 細胞的生成：

透過用基於HIV的、VSV-G假型化慢病毒的、編碼RFP的第3代慢病毒（mKate2慢病毒試劑 - Sartorius ref #4625）感染RPMI-8226細胞（ATCC，#CCL 155）以表現紅色螢光蛋白（RFP），來生成RPMI-8226 RFP細胞。透過用基於HIV的、VSV-G假型化慢病毒的、編碼RFP的第3代慢病毒（mKate2慢病毒試劑 - Sartorius ref #4625）感染MM.1R細胞（ATCC，#CRL 2975）以表現紅色螢光蛋白（RFP），來產生MM.1R RFP細胞。

將RPMI-8226 RFP細胞或MM.1R RFP細胞維持在補充有20%胎牛血清（FBS熱滅活，Biowest，#S181H-100）、1% L-麩醯胺酸（Gibco，#25030-024）的IMDM培養基（Gibco，#12440053）中，並且在37ºC和5% CO ₂下培育。將RPMI-8226 RFP細胞以300 g離心5分鐘，重懸於RPMI1640完全培養基（補充有10%胎牛血清 - FBS，Biowest，#S181H-100-，1% L-麩醯胺酸 - Gibco，#25030-024的RPMI1640）中，然後將其添加至Incucyte®板中（詳見下文）。

人類 HD NK 細胞分離：

健康供體膚色血球層由EFS Ile de France提供。在接收後立即將合格的膚色血球層在室溫下輕輕攪拌隔夜。第二天，透過Ficoll（Cytiva #17-1440-02）密度梯度離心來分離外周血單個核細胞（PBMC）。用來自Miltenyi Biotec的MACSXpress全血NK細胞分離套組（#130-127-695），使用手動磁性標記和MACSxpress分離器（Miltenyi Biotec #130-098-308），透過陰性選擇從PBMC純化人類NK細胞。然後，在補充有10%胎牛血清（FBS）（Eurobio #CVFSVF06-01）和1% L-麩醯胺酸（Gibco #25030-081）的RPMI1640培養基中培養純化的NK細胞。在使用之前，將細胞在37ºC和5% CO ₂下靜置隔夜。

透過 Incucyte® 進行細胞毒性測定：

使用Incucyte®活細胞分析系統評價細胞毒性，所述活細胞分析系統允許隨時間推移對活螢光靶細胞的數量進行定量。按以下順序將化合物和細胞添加至Incucyte®板（聚D離胺酸處理的96孔平底微孔盤CellCoat™，Greiner Bio-One；#655946）的適當的孔中（每個孔的最終體積：200 µl）：將艾薩妥昔單抗（或同種型對照）（預先在RPMI1640完全培養基中稀釋）添加至適當的孔中，使其最終濃度為10、100或1000 ng/ml；然後將貝魯舒地爾（預先在RPMI1640完全培養基中稀釋）添加至適當的孔中，使其最終濃度為1.1和3.3 µM；然後將RFP陽性MM腫瘤細胞（靶細胞，T）添加至每個孔中（以具有20000個RFP陽性細胞/孔）；然後將HD NK細胞（效應細胞，E）添加至適當的孔中（添加60000個RPMI-8226 RFP細胞，以具有3：1的E：T比率；添加20000個MM.1R RFP細胞，以具有1：1的E：T比率）；在一些孔中不添加HD NK細胞，以測試貝魯舒地爾對RFP陽性腫瘤細胞的直接作用。

然後將Incucyte®板以100 g離心1分鐘，然後置於Incucyte®（IncucyteS3，EssenBio）中，將其容納在37ºC和5% CO ₂的專用培養箱中。每4小時用10X物鏡和使用相位和紅色通道的標準掃描類型拍攝圖像（4個圖像/孔）。透過螢光成像監測RFP陽性靶細胞的生長長達96小時，並且使用IncucyteS3軟體對活靶細胞的數量進行定量，並相對於零時刻活靶細胞的數量進行標準化。

結果

如圖12所示，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）隨時間推移誘導RPMI-8226 RFP細胞的殺傷。在HD NK細胞存在下，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）與艾薩妥昔單抗（10 ng/ml）組合隨時間推移進一步增加RPMI-8226 RFP細胞的殺傷。

如圖13所示，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）隨時間推移誘導MM.1R RFP細胞的殺傷。在HD NK細胞存在下，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）與艾薩妥昔單抗（10 ng/ml）組合隨時間推移進一步增加MM.1R RFP細胞的殺傷。

如圖14所示，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）隨時間推移誘導LP-1 RFP細胞的殺傷。在HD NK細胞存在下，貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）與艾薩妥昔單抗（10 ng/ml）組合隨時間推移進一步增加LP-1 RFP細胞的殺傷。 實例 7：在MM細胞中貝魯舒地爾和地塞米松的組合

方法 .

在第1天，使用預先用聚D離胺酸包被的384w盤（Costar，3765）以3,000個細胞/孔（50 ul）將細胞鋪盤，在室溫下以300 g旋轉沉降1 min，並且將其轉移到Incucyte S3中（37ºC；5% CO ₂；每2 h進行動力學讀數）。對於單藥，四（4）小時後，使用Tecan d300e在劑量反應中用ROCK 2抑制劑（SAR445761，貝魯舒地爾）或用地塞米松（SelleckChem；S1322）處理細胞。對於組合，在選定濃度的地塞米松的存在下使用貝魯舒地爾的劑量反應。在37ºC、5% CO ₂下，將細胞在Incucyte S3（Sartorius）中以相同的動力學讀數進一步培育另外的5至6天。最後，透過添加CellTiterGl（Promega）以評估細胞存活率或透過使用Incucyte隨時間推移測量細胞匯合度來測量增殖。將細胞生長相對於DMSO（100%）和星孢菌素（staurosporine）（Sigma；S6942）1 uM（0%）進行標準化。

透過synergy finder工具使用超過最大單藥反應（HSA）的過量來評價貝魯舒地爾與地塞米松之間的協同效應程度（Lanevski A等人，Nucleic Acids Research, 488-493, 2020, 第48卷 (doi: 10.1093/nar/gkaa216)）。

結果

分別如圖15A和圖15B所示，地塞米松和貝魯舒地爾顯示針對多發性骨髓瘤細胞株MM1S和LP1的單藥生長抑制活性。如圖16A、圖16C、圖17A和圖17C所示，在定義的濃度範圍內，貝魯舒地爾和地塞米松的組合在MM1S和LP1二者中顯示出改善的生長抑制作用。分別如圖16B和圖17B所示，使用synergy-finder（HSA）的統計分析突出顯示了MM1S的約1.76和LP-1的5.4的正協同作用得分。總體而言，這些資料表明，貝魯舒地爾和地塞米松的組合可能對多發性骨髓瘤患者具有治療益處。

儘管出於清楚和理解的目的，已經通過說明和例子的方式詳細地描述了本發明，但是描述和例子不應被解釋為限制本發明的範圍。在此引用的所有專利和科學文獻的公開內容均以其全文通過引用併入本文。

無

圖1A和圖1B示出了用貝魯舒地爾或泊馬度胺（pomalidomide）處理對多發性骨髓瘤細胞株的增殖的影響。

圖2示出了在用貝魯舒地爾或泊馬度胺處理LP1細胞24小時後C-Myc和b-肌動蛋白的蛋白質印跡。

圖3A、圖3B、圖3C和圖3D示出了流式細胞儀數據。使用以下策略用FlowJo軟體分析資料：(A) 對不包括碎片的MOLP-8細胞進行圈選，隨後對單細胞進行圈選 (B)，從單細胞，對活DAPI ^neg細胞進行定量 (C)，並且從DAPI ^neg細胞，用FITC螢光染料對CD38的表現進行定量 (D)，並且表示為螢光強度的中值（MFI）。

圖4示出了與媒劑對照（DMSO）相比，在用同種型對照（IC）加貝魯舒地爾、艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾或單獨的貝魯舒地爾處理3或4天後，MOLP-8細胞上的CD38表現。

圖5A、圖5B、圖5C、圖5D和圖5E示出了與媒劑對照（DMSO）相比，在用同種型對照（IC）加貝魯舒地爾、艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾或單獨的貝魯舒地爾處理後，MOLP-8細胞的存活率。

圖6A、圖6B和圖6C示出了與媒劑對照（DMSO）相比，在用貝魯舒地爾處理後，LP1、RPM18226和健康供體（HD）來源的NK細胞的存活率。

圖7A、圖7B和圖7C示出了流式細胞儀數據。在圖7A至圖7C中，使用以下策略用FlowJo軟體分析資料：對不包括碎片的MOLP-8細胞進行圈選 (A)，隨後對單細胞進行圈選 (B)。從單細胞，對早期凋亡的7-AAD ^neg和膜聯蛋白V-eFluor450 ^pos（C，Q1）和晚期凋亡的7-AAD ^neg和膜聯蛋白V-efluor450 ^pos（C，Q2）細胞進行定量 (C)。

圖8示出了與媒劑對照（DMSO）相比，在用同種型對照（IC）加貝魯舒地爾、艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾或單獨的貝魯舒地爾處理後2、3和4天，凋亡MOLP-8 MM細胞的百分比。

圖9示出了在用貝魯舒地爾處理後，在有或沒有HD NK細胞的情況下，LP-1 RFP細胞的細胞毒性。

圖10示出了在用同種型對照（IC，100 ng/ml）、艾薩妥昔單抗（100 ng/ml）、貝魯舒地爾（3.3 µM）、IC加貝魯舒地爾（分別為100 ng/ml和3.3 µM）或艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾（分別為100 ng/ml和3.3 µM）處理後，在有HD NK細胞的情況下，LP-1 RFP細胞的細胞毒性。

圖11A至圖11G示出了在用各種濃度的貝魯舒地爾和Y27632處理後，MOLP-8（圖11A和圖11E）、LP-1（圖11C和圖11G）和RPMI-8226（圖11B和圖11F）多發性骨髓瘤細胞株以及HD NK細胞（圖11D）的細胞存活率（表示為細胞的數量或活細胞的百分比）的圖。

圖12示出了在用同種型對照（IC，10 ng/ml）、艾薩妥昔單抗（10 ng/ml）、貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）、IC加貝魯舒地爾（分別為10 ng/ml和1.1或3.3 µM）或艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾（分別為10 ng/ml和1.1或3.3 µM）處理後，在有HD NK細胞的情況下，RPMI-8226 RFP細胞的細胞毒性。

圖13示出了在用同種型對照（IC，10 ng/ml）、艾薩妥昔單抗（10 ng/ml）、貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）、IC加貝魯舒地爾（分別為10 ng/ml和1.1或3.3 µM）或艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾（分別為10 ng/ml和1.1或3.3 µM）處理後，在有HD NK細胞的情況下，MM.1R RFP細胞的細胞毒性。

圖14示出了在用同種型對照（IC，100 ng/ml）、艾薩妥昔單抗（100 ng/ml）、貝魯舒地爾（1.1或3.3 µM）、IC加貝魯舒地爾（分別為100 ng/ml和1.1或3.3 µM）或艾薩妥昔單抗加貝魯舒地爾（分別為100 ng/ml和1.1或3.3 µM）處理後，在有HD NK細胞的情況下，LP-1 RFP細胞的細胞毒性。

圖15A和圖15B示出了作為單藥的貝魯舒地爾（Rezurock）在MM1S細胞（圖15A）和LP-1細胞（圖15B）中的生長抑制活性。

圖16A至圖16C示出了貝魯舒地爾和地塞米松（dexamethasone）的組合在MM1S細胞中的生長抑制活性。圖16A是示出在各種濃度的貝魯舒地爾和地塞米松下細胞生長抑制的熱圖；圖16B是圖16A中資料的三維圖，其在Z軸上顯示了協同效應；並且圖16C是單藥和組合隨時間而變化的匯合度的百分比的圖。

圖17A至圖17C示出了貝魯舒地爾和地塞米松的組合在LP-1細胞中的生長抑制活性。圖17A是示出在各種濃度的貝魯舒地爾和地塞米松下細胞生長抑制的熱圖；圖17B是圖17A中資料的三維圖，其在Z軸上顯示了協同效應；並且圖17C是單藥和組合隨時間而變化的匯合度的百分比的圖。

無。

Claims (33)

1. 一種治療多發性骨髓瘤的方法，該方法包括向有需要的受試者投予治療有效量的2-{3-[4-(1 H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}- N-(丙-2-基)乙醯胺或其醫藥上可接受的鹽（貝魯舒地爾，belumosudil）。
2. 如請求項1所述的方法，其中將貝魯舒地爾作為單一療法投予。
3. 如請求項1所述的方法，其中將貝魯舒地爾與抗CD38抗體組合投予。
4. 如請求項3所述的方法，其中該抗CD38抗體是達雷木單抗（daratumumab）、艾薩妥昔單抗（isatuximab）、MOR202或邁澤妥單抗（mezagitamab，TAK-079）。
5. 如請求項4所述的方法，其中該抗CD38抗體是艾薩妥昔單抗。
6. 如請求項5所述的方法，其中將該艾薩妥昔單抗以10 mg/kg或20 mg/kg的劑量靜脈內投予於該受試者。
7. 如請求項5所述的方法，其中將該艾薩妥昔單抗以1000 mg或1400 mg的劑量皮下投予。
8. 如請求項1至7中任一項所述的方法，其中將該艾薩妥昔單抗以28天週期投予。
9. 如請求項8所述的方法，其中在第一個28天週期中，每週投予該艾薩妥昔單抗一次。
10. 如請求項9所述的方法，其中在隨後的28天週期中，每週投予該艾薩妥昔單抗兩次。
11. 如請求項10所述的方法，其中在該艾薩妥昔單抗投予12個月後，每4週投予該艾薩妥昔單抗一次。
12. 如請求項1所述的方法，其中將該貝魯舒地爾與免疫調節藥物（immunomodulatory drug，IMiD）組合投予。
13. 如請求項12所述的方法，其中該IMiD選自泊馬度胺（pomalidomide）、來那度胺（lenalidomide）、沙利度胺（thalidomide）、伊伯度胺（iberdomide）和美齊度胺（mezigdomide）。
14. 如請求項13所述的方法，其中該IMiD是泊馬度胺。
15. 如請求項14所述的方法，其中從每個28天週期的第1天至第21天以4 mg的劑量每天向該受試者投予該泊馬度胺一次。
16. 如請求項14或15所述的方法，其中口服投予該泊馬度胺。
17. 如請求項1至16中任一項所述的方法，其中將該貝魯舒地爾以28天週期投予。
18. 如請求項1至17中任一項所述的方法，其中將該貝魯舒地爾每天以至多1000 mg的劑量投予於該受試者。
19. 如請求項18所述的方法，其中該劑量為每天200 mg。
20. 如請求項18所述的方法，其中該劑量為每天200 mg兩次。
21. 如請求項18所述的方法，其中該劑量為每天400 mg。
22. 如請求項18所述的方法，其中該劑量選自500 mg/天、600 mg/天、700 mg/天、800 mg/天、900 mg/天和1000 mg/天。
23. 如請求項1至22中任一項所述的方法，其中口服投予該貝魯舒地爾。
24. 如請求項1至23中任一項所述的方法，其中貝魯舒地爾是2-{3-[4-(1H-吲唑-5-基胺基)-2-喹唑啉基]苯氧基}-N-(丙-2-基)乙醯胺的甲磺酸鹽。
25. 如請求項1至24中任一項所述的方法，其中該受試者正在接受伴隨的皮質類固醇療法。
26. 如請求項25所述的方法，其中該伴隨的皮質類固醇療法選自地塞米松（dexamethasone）、強體松（prednisone）和甲基培尼皮質醇（methylprednisolone）。
27. 如請求項1所述的方法，該方法進一步包括投予艾薩妥昔單抗和地塞米松。
28. 如請求項1所述的方法，該方法進一步包括投予泊馬度胺和地塞米松。
29. 如請求項1至28中任一項所述的方法，其中該受試者已經接受用於治療該多發性骨髓瘤的先前療法。
30. 如請求項29所述的方法，其中該受試者患有復發性多發性骨髓瘤。
31. 如請求項28或29所述的方法，其中該受試者患有復發性和難治性多發性骨髓瘤。
32. 如請求項1至29中任一項所述的方法，其中該多發性骨髓瘤是燜燃型多發性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma）。
33. 如請求項1至32中任一項所述的方法，其中該治療克服了患有多發性骨髓瘤的該受試者的IMiD耐藥性。