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TW202436352A - 人類運鐵蛋白受體親和性肽 - Google Patents

人類運鐵蛋白受體親和性肽 Download PDF

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TW202436352A
TW202436352A TW113105149A TW113105149A TW202436352A TW 202436352 A TW202436352 A TW 202436352A TW 113105149 A TW113105149 A TW 113105149A TW 113105149 A TW113105149 A TW 113105149A TW 202436352 A TW202436352 A TW 202436352A
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TW
Taiwan
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amino acid
acid sequence
peptide
htfr
sequence number
Prior art date
Application number
TW113105149A
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English (en)
Inventor
小野内貴士
高橋健一
Original Assignee
日商Ｊｃｒ製藥股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本發明提供一種為了使應於中樞神經系統(CNS)中發揮功能之化合物(蛋白質、核酸、低分子化合物等)通過血腦障壁，能夠與該等化合物之任一者結合而使用之對人類運鐵蛋白受體具有親和性之肽及其用途。該肽例如為包含選自由序列編號4～6表示之胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列者或其變異體。

Description

人類運鐵蛋白受體親和性肽
本發明於一實施方式中，關於一種為了使應於中樞神經系統(CNS)中發揮功能之化合物(蛋白質、核酸、低分子化合物等)通過血腦障壁，與該等化合物結合而使用之對人類運鐵蛋白受體具有親和性之肽及其使用方法。
向除包含室周器(松果體、腦下垂體、極後區等)之一些區域以外之大部分腦組織供給血液之毛細血管不同於存在於肌肉等其他組織之毛細血管，形成其內皮之內皮細胞彼此經由牢固之細胞間鍵而緊密連接。因此，阻礙物質自血液向大腦之被動傳輸，儘管有例外，如脂溶性較高之物質、或分子量較小(200～500 Da以下)且於接近生理pH值時呈電中性之物質，但除此以外者難以自毛細血管向腦實質轉移。此種介由腦內毛細血管內皮之限制血液與腦組織液之間物質交換之機制被稱為血腦障壁(Blood Brain Barrier，BBB)。又，血腦障壁不僅針對大腦，亦限制包含腦及脊髓之中樞神經系統之組織液與血液之間的物質交換。
藉由血腦障壁之存在，中樞神經系統之大部分細胞不受血中激素、細胞激素等物質濃度變動之影響，從而保持其生理化學上之恆常性。但血腦障壁之存在於藥劑開發方面引起問題。例如，對於由缺乏艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶引起之遺傳性代謝疾病黏多糖貯積症II型(亨特氏症候群(Hunter's syndrome))，採取靜脈內投予重組艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之酶補充療法，但針對亨特氏症候群表現出之明顯之中樞神經系統(CNS)異常，由於艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶無法通過血腦障壁故有效性較低。另外，對於阿茲海默症、腦瘤等中樞神經系統疾病，需使藥劑到達中樞神經系統，但不能通過血腦障壁之藥劑無法發揮藥效。
業界已開發了多種用以使如應使其於中樞神經系統中發揮作用之蛋白質等高分子物質通過血腦障壁之方法。作為此種方法，報告有以與腦內毛細血管之內皮細胞上存在之膜蛋白質具有親和性之方式對高分子物質進行修飾之各種方法。作為腦內毛細血管之內皮細胞上存在之膜蛋白質，可例舉針對胰島素、運鐵蛋白、類胰島素生長因子(IGF-I、IGF-II)、LDL、瘦體素等化合物之受體。該等之中，關於針對運鐵蛋白受體之抗體，據報告能夠通過血腦障壁而向腦實質轉移，且藉由與應使其於中樞神經系統中發揮作用之藥劑結合，能夠將該藥劑轉移至腦內(專利文獻1～8)。
進而，使抗運鐵蛋白受體抗體與艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶結合以使其通過血腦障壁而能夠於中樞神經系統中發揮藥效之亨特氏症候群治療劑(IZCARGO(註冊商標))已於2021年上市(非專利文獻1)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：US2007/0082380 專利文獻2：US2008/0152645 專利文獻3：US2009/0053219 專利文獻4：US2011/0110935 專利文獻5：US2018/0171012 專利文獻6：US2018/0179291 專利文獻7：US2020/0317798 專利文獻8：US2020/0384061 [非專利文獻]
非專利文獻1：附件《IZCARGO點滴靜注用10 mg》2021年3月(第1版)
[發明所欲解決之問題]
於上述背景之下，本發明之目的之一在於提供一種為了使應於中樞神經系統(CNS)中發揮功能之化合物(蛋白質、核酸、低分子化合物等)能夠通過血腦障壁，可與該等化合物結合而使用之對人類運鐵蛋白受體具有親和性之肽及其使用方法。 [解決問題之技術手段]
著眼於上述目的，本發明者等人經過不斷努力，最終研究發現，藉由本說明書中詳述之製作法獲得之含有特異性識別人類運鐵蛋白受體(hTfR)之胞外區之抗hTfR重鏈抗體之可變區的對hTfR具有親和性之肽(抗hTfR重鏈抗體可變區肽)效率良好地通過血腦障壁，從而完成本發明。即，本發明包括以下者。再者，以下之1.～104.所揭示之發明中，人類運鐵蛋白受體親和性肽一詞可替換成含有重鏈抗體之可變區之肽，又，肽一詞亦可替換成蛋白質。 1.一種對人類運鐵蛋白受體具有親和性之肽(人類運鐵蛋白受體親和性肽)，其係選自由以下之(1)至(2)所組成之群，且包含具有CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區的重鏈抗體之可變區， (1)CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列者； (2)CDR1之胺基酸序列為序列編號13或序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15或序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17或序列編號18之胺基酸序列者。 2.一種人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係選自由以下之(1)至(3)所組成之群： (1)與序列編號4之胺基酸序列具有80%以上之胺基酸序列之同一性、且包含具有上述1記載之(1)所示之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區者； (2)與序列編號5之胺基酸序列具有80%以上之胺基酸序列之同一性、且包含具有上述1記載之(1)所示之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區者；及 (3)與序列編號6之胺基酸序列具有80%以上之胺基酸序列之同一性、且包含具有上述1記載之(2)所示之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區者。 3.如上述2記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為85%以上。 4.如上述2記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為90%以上。 5.如上述2記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為95%以上。 6.如上述1記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其包含選自由以下之(1)至(3)所組成之群中之胺基酸序列： (1)序列編號4之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，且該胺基酸序列之CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列； (2)序列編號5之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，且該胺基酸序列之CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列； (3)序列編號6之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，且該胺基酸序列之CDR1之胺基酸序列為序列編號13或序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15或序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17或序列編號18之胺基酸序列。 7.如上述6記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～5個。 8.如上述6記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～3個。 9.如上述1至8中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係對人類運鐵蛋白受體之胞外區及猴運鐵蛋白受體之胞外區兩者具有親和性者。 10.如上述9記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其與人類運鐵蛋白受體及猴運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數均為5×10 -11M~5×10 -7M。 11.如上述9記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數均為5×10 -11M～1×10 -8M。 12.如上述9記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其於將與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數之值設為1時，與猴運鐵蛋白受體之解離常數之值為1～10。 13.如上述9記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其於將與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數之值設為1時，與猴運鐵蛋白受體之解離常數之值為3～10。 14.一種人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係使複數個如上述1至13中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽結合而成者，選自由以下之(1)至(3)所組成之群中： (1)使2～10個如上述1至13中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合而成者； (2)使2或3個如上述1至13中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合而成者； (3)使2個如上述1至13中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合而成者。 15.如上述14記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該使複數個人類運鐵蛋白受體親和性肽結合之連接子分別為包含1～60個胺基酸之肽連接子。 16.如上述14記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列所組成之群。 17.如上述14記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。 18.如上述1記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其包含選自由序列編號4、序列編號5及序列編號6所組成之群中之胺基酸序列。 19.一種人類運鐵蛋白受體親和性肽，其包含選自由序列編號4、序列編號5及序列編號6所組成之群中之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列。 20.如上述19之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～5個。 21.如上述19之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～3個。 22.一種人類運鐵蛋白受體親和性肽-藥物複合體，其係如上述1至21中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽與藥物結合而成者。 23.如上述22記載之複合體，其中該藥物為其他蛋白質(A)、核酸或低分子化合物之任意者。 24.一種融合蛋白質，其係如上述1至21中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽與其他蛋白質(A)之融合蛋白質。 25.如上述24記載之融合蛋白質，其係該人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之C末端者。 26.如上述24記載之融合蛋白質，其係該人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之N末端者。 27.如上述25或26記載之融合蛋白質，其中使該人類運鐵蛋白受體親和性肽與該其他蛋白質(A)結合之連接子為包含1～60個胺基酸之肽連接子。 28.如上述27記載之融合蛋白質，其中使該人類運鐵蛋白受體親和性肽與該其他蛋白質(A)結合之肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列所組成之群。 29.如上述27記載之融合蛋白質，其中使該人類運鐵蛋白受體親和性肽與該其他蛋白質(A)結合之肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21之各胺基酸序列之胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。 30.如上述24至29中任一項記載之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係源自人類者。 31.如上述24至30中任一項記載之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為細胞激素、生長因子或抗體醫藥。 32.如上述24至30中任一項記載之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係選自由腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、溶酶體酶(lysosome enzyme)、睫狀神經滋養因子(CNTF)、神經膠細胞株神經滋養因子(GDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1、紅血球生成素、達貝泊汀(Darbepoetin)、活化素、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、PD-1配體、PD-L1、PD-L2、具有分解β-澱粉樣蛋白活性之酶、抗β-澱粉樣蛋白抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗HER2抗體、抗TNF-α抗體及抗CTLA-4抗體所組成之群。 33.如上述24至30中任一項記載之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為溶酶體酶，該溶酶體酶係選自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白質、β-胺基己糖苷酶A、β-胺基己糖苷酶B、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神經醯胺酶(galactosyl ceramidase)、鞘脂激活蛋白(saposin)C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶(fucosidase)、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶(Aspartyl glucosaminidase)、α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶、酸性神經鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶、乙醯輔酶Aα-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、棕櫚醯蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶(tripeptidyl peptidase)-1、玻尿酸酶-1、CLN1及CLN2所組成之群。 34.如上述24至33中任一項記載之融合蛋白質，其係結合有血清白蛋白者。 35.如上述24至33中任一項記載之融合蛋白質，其係結合有人IgG Fc區或其一部分者。 36.一種核酸，其編碼如上述1至21中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽。 37.一種核酸，其編碼如上述24至35中任一項記載之融合蛋白質。 38.一種表現載體，其係將如上述36或37記載之核酸組入而成。 39.一種細胞，其係經如上述38記載之表現載體轉形者。 40.如上述39記載之細胞，其中該細胞源自哺乳動物。 41.如上述1記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係選自由以下之(1)至(3)所組成之群： (1)與序列編號4之胺基酸序列具有80%以上之同一性、且CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列者； (2)與序列編號5之胺基酸序列具有80%以上之同一性、且CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列者； (3)與序列編號6之胺基酸序列具有80%以上之同一性、且CDR1之胺基酸序列為序列編號13或序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15或序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17或序列編號18之胺基酸序列者。 42.如上述41記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為85%以上。 43.如上述41記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為90%以上。 44.如上述41記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為95%以上。 45.一種人類運鐵蛋白受體親和性肽-藥物複合體，其係如上述37至44中任一項記載之人類運鐵蛋白受體親和性肽與藥物結合而成者。 46.如上述45記載之複合體，其中該藥物為其他蛋白質(A)、核酸或低分子化合物之任意者。 47.一種融合蛋白質，其係以存在於血管內皮細胞表面之分子作為抗原之人類運鐵蛋白受體親和性肽與其他蛋白質(A)之融合蛋白質，且該人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之C末端，或該人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之N末端。 48.如上述47記載之融合蛋白質，其中該連接子為包含1～60個胺基酸之肽連接子。 49.如上述48記載之融合蛋白質，其中該肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25所組成之群。 50.如上述48記載之融合蛋白質，其中該肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。 51.如上述46至50中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係源自人類者。 52.如上述46至51中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為細胞激素、生長因子或抗體醫藥。 53.如上述46至51中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係選自由腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、溶酶體酶、睫狀神經滋養因子(CNTF)、神經膠細胞株神經滋養因子(GDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1、紅血球生成素、達貝泊汀、活化素、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、PD-1配體、PD-L1、PD-L2、具有分解β-澱粉樣蛋白活性之酶、抗β-澱粉樣蛋白抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗HER2抗體、抗TNF-α抗體及抗CTLA-4抗體所組成之群。 54.如上述46至51中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為溶酶體酶，該溶酶體酶係選自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白質、β-胺基己糖苷酶A、β-胺基己糖苷酶B、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神經醯胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶、酸性神經鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶、乙醯輔酶Aα-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、棕櫚醯蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、玻尿酸酶-1、CLN1及CLN2所組成之群。 55.如上述46至54中任一項記載之融合蛋白質，其係進而結合有血清白蛋白者。 56.如上述46至54中任一項記載之融合蛋白質，其係進而結合有人IgG Fc區或其一部分者。 57.如上述45至56中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。 58.如上述45至57中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該存在於血管內皮細胞表面之分子係選自由運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦體素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F、有機陰離子轉運體、MCT-8及單羧酸轉運體所組成之群中，尤其為源自人類者。 59.如上述45至57中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該存在於血管內皮細胞表面之分子為運鐵蛋白受體(TfR)，尤其為源自人類者。 60.如上述45或46記載之複合體，其中該藥物經由選自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖類、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂質聚合物、甲殼素類、玻尿酸、生物素-鏈黴卵白素及該等之衍生物所組成之群中之連接子與該人類運鐵蛋白受體親和性肽結合。 61.如上述45至60中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該人類運鐵蛋白受體親和性肽為源自駝科動物之重鏈抗體或源自軟骨魚類之免疫球蛋白新抗原受體之全部或一部分。 62.如上述61記載之複合體或融合蛋白質，其中該重鏈抗體為單重鏈抗體。 63.如上述61或62記載之複合體或融合蛋白質，其中該重鏈抗體係選自由以下之(1)至(4)所組成之群中： (1)僅包含重鏈之可變區之全部或其一部分者； (2)包含重鏈之可變區之全部或其一部分與鉸鏈區之一部分者； (3)包含重鏈之可變區與鉸鏈區之全部者；及 (4)包含重鏈之可變區與鉸鏈區、以及恆定區之一部分者。 64.一種核酸，其編碼如上述47至59、61至63中任一項記載之融合蛋白質。 65.一種表現載體，其係將如上述64記載之核酸組入而成。 66.一種細胞，其係經如上述65記載之表現載體轉形者。 67.如上述66記載之細胞，其中該細胞源自哺乳動物。 68.一種醫藥組合物，其係含有如上述45至63中任一項記載之複合體或融合蛋白質作為有效成分而成者，尤其是該有效成分通過血腦障壁並於中樞神經中顯示藥效。 69.一種對人類運鐵蛋白受體具有親和性之重鏈抗體可變區肽，其包含CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區，該重鏈抗體可變區肽係選自由以下之(1)至(2)所組成之群中： (1)CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列者；此處，CDR1、CDR2及CDR3之各胺基酸序列之組合可為任意，但較佳為CDR1之胺基酸序列為序列編號7之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11之胺基酸序列者，或CDR1之胺基酸序列為序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號12之胺基酸序列者； (2)CDR1之胺基酸序列為序列編號13或序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15或序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17或序列編號18之胺基酸序列者；此處，CDR1，CDR2，及CDR3之各胺基酸序列之組合可為任意，但較佳為CDR1之胺基酸序列為序列編號13之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17之胺基酸序列者，或CDR1之胺基酸序列為序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號18之胺基酸序列者。 70.一種對人類運鐵蛋白受體具有親和性之重鏈抗體可變區肽，其係選自由以下之(1)至(3)所組成之群，且包含CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區， (1)含有與序列編號4表示之胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，且CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列為上述69之選項(1)所示者； (2)含有與序列編號5表示之胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，且CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列為上述69之選項(1)所示者， (3)含有與序列編號6表示之胺基酸序列具有80%以上之同一性之胺基酸序列，且CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列為上述69之選項(2)所示者。 71.一種重鏈抗體可變區肽，其係選自由如上述70之(1)至(3)所組成之群中，該同一性為85%以上。 72.一種重鏈抗體可變區肽，其係選自由如上述70之(1)至(3)所組成之群中，該同一性為90%以上。 73.一種重鏈抗體可變區肽，其係選自由如上述70之(1)至(3)所組成之群中，該同一性為95%以上。 74.一種對人類運鐵蛋白受體具有親和性之重鏈抗體可變區肽，其係選自由以下之(1)至(3)所組成之群，且包含CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區， (1)含有作為序列編號4表示之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成者的胺基酸序列，且CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列為上述69之選項(1)所示者； (2)含有作為序列編號5表示之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成者的胺基酸序列，且CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列為上述69之選項(1)所示者； (3)含有作為序列編號6表示之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成者的胺基酸序列，且CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列為上述69之選項(2)所示者。 75.一種重鏈抗體可變區肽，其係選自由如上述74之(1)至(3)所組成之群中，該經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～5個。 76.一種重鏈抗體可變區肽，其係選自由如上述74之(1)至(3)所組成之群中，該經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～3個。 77.如上述69至76中任一項記載之重鏈抗體可變區肽，其係對人類運鐵蛋白受體之胞外區及猴運鐵蛋白受體之胞外區兩者具有親和性者。 78.如上述77記載之重鏈抗體可變區肽，其與人類運鐵蛋白受體及猴運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數均為5×10 -11M～5×10 -7M。 79.如上述77記載之重鏈抗體可變區肽，其與人類運鐵蛋白受體及猴運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數均為5×10 -11M～1×10 -8M。 80.如上述77記載之重鏈抗體可變區肽，其於將與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數之值設為1時，與猴運鐵蛋白受體之解離常數之值為1～10。 81.如上述77記載之重鏈抗體可變區肽，其於將與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數之值設為1時，與猴運鐵蛋白受體之解離常數之值為3～10。 82.一種重鏈抗體可變區肽，其係使複數個如上述69至81中任一項記載之重鏈抗體可變區肽結合而成者，選自由以下之(1)至(3)所組成之群中： (1)使2～10個如上述69至81記載之重鏈抗體可變區肽直接或經由連接子結合而成者； (2)使2或3個如上述69至81記載之重鏈抗體可變區肽直接或經由連接子結合而成者； (3)使2個如上述69至81記載之重鏈抗體可變區肽直接或經由連接子結合而成者。 83.如上述82記載之重鏈抗體可變區肽，其中該使複數個重鏈抗體可變區肽結合之連接子分別為包含1～60個胺基酸之肽連接子。 84.如上述83之重鏈抗體可變區肽，其中該肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列所組成之群。 85.如上述83之重鏈抗體可變區肽，其中該肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21之各胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。 86.一種複合體，其係重鏈抗體可變區肽與藥物結合而成之重鏈抗體可變區肽-藥物複合體，該重鏈抗體可變區肽為如上述69至85中任一項記載者。 87.如上述86記載之複合體，其中該藥物為其他蛋白質(A)、核酸或低分子化合物之任意者。 88.一種融合蛋白質，其係重鏈抗體可變區肽與其他蛋白質(A)之融合蛋白質，該重鏈抗體可變區肽為如上述69至85中任一項記載者。 89.如上述88記載之融合蛋白質，其中該重鏈抗體可變區肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之C末端。 90.如上述88記載之融合蛋白質，其中該重鏈抗體可變區肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之N末端。 91.如上述89或90記載之融合蛋白質，其中該連接子為包含1～60個胺基酸之肽連接子。 92.如上述91記載之融合蛋白質，其中該肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列所組成之群。 93.如上述91記載之融合蛋白質，其中該肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21之各胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。 94.如上述87至93中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係源自人類者。 95.如上述87至94中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為細胞激素、生長因子或抗體醫藥。 96.如上述87至94中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)選自如上述35所示者之中。 97.如上述87至94中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為溶酶體酶，該溶酶體酶選自如上述36所示者之中。 98.如上述87至94中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其係結合有血清白蛋白者。 99.如上述87至94中任一項記載之複合體或融合蛋白質，其係結合有人IgG Fc區或其一部分者。 100.一種核酸，其編碼如上述69至85中任一項記載之重鏈抗體可變區肽。 101.一種核酸，其編碼如上述88至99中任一項記載之融合蛋白質。 102.一種表現載體，其係將如上述100或101記載之核酸組入而成。 103.一種細胞，其係經如上述102記載之表現載體轉形者。 104.如上述103記載之細胞，其中該細胞源自哺乳動物。 [發明之效果]
藉由使作為本發明一實施方式之對人類運鐵蛋白受體具有親和性之肽(hTfR親和性肽)與幾乎或完全無法通過血腦障壁之物質結合，而使該物質能夠通過血腦障壁，直至到達中樞神經系統，因此能夠於中樞神經系統中發揮該物質之功能。
包括人類、小鼠在內之多數哺乳動物之抗體之單體係以2條H鏈與2條L鏈經由雙硫鍵進行共價鍵結而成之異型四聚物的形式形成。各鏈之N末端存在不同抗體彼此之間胺基酸序列有差異之區域，稱之為可變區。H鏈之可變區存在對與抗原之特異性結合發揮主要作用之3個互補決定區。該等3個互補決定區自N末端起稱為CDR1、CDR2及CDR3。L鏈中亦同樣存在對與抗原之特異性結合發揮主要作用之3個互補決定區，該等3個互補決定區自N末端起稱為CDR1、CDR2及CDR3。
1條H鏈與1條L鏈成為一對，與抗原特異性結合。即，與抗原之特異性大體上由H鏈之3個CDR與L鏈之3個CDR共6個CDR之胺基酸序列來決定。多數哺乳動物之抗體之單體中存在兩組H鏈-L鏈對，因此一個抗體分子中具有2個可與抗原結合之區域。
可變區中除CDR以外之區域稱為架構區(FR)。H鏈與L鏈分別存在4個FR，自N末端起稱為FR1、FR2、FR3及FR4。存在於可變區中之CDR被FR隔開。
FR1係自重鏈抗體之可變區之N末端至與CDR1之N末端鄰接之胺基酸的區域。FR2係CDR1與CDR2之間的區域。FR3係CDR2與CDR3之間的區域。FR4係自與CDR3之C末端鄰接之胺基酸至重鏈抗體之可變區之C末端的區域。
相對於上述多數哺乳動物之抗體之單體(普通抗體)，亦存在僅包含重鏈而無L鏈之抗體(重鏈抗體)。例如，由駝科動物產生之重鏈抗體(hcIg)、由包括鯊魚在內之多數軟骨魚類產生之免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)即屬於此。駝科重鏈抗體(hcIg)為2條重鏈經由雙硫鍵進行共價鍵結而成之同源二聚物。各重鏈於N末端具有可變區，該可變區存在對與抗原之特異性結合發揮主要作用之3個互補決定區(CDR)。該等3個互補決定區自N末端起稱為CDR1、CDR2及CDR3。構成hcIg之各重鏈即便為單體，亦能夠與抗原特異性結合，因此一個hcIg分子中具有2個可與抗原結合之區域。至於可變區中除CDR以外之區域稱為架構區(FR)、以及該等之配置，hcIg亦與普通抗體相同。
與hcIg同樣地，IgNAR亦為2條重鏈經由雙硫鍵進行共價鍵結而成之同源二聚物。各重鏈於N末端具有可變區，該可變區存在對與抗原之特異性結合發揮主要作用之3個互補決定區(CDR)。該等3個互補決定區自N末端起稱為CDR1、CDR2及CDR3。構成IgNAR之各重鏈即便為單體，亦能夠與抗原特異性結合，因此一個IgNAR分子中具有2個可與抗原結合之區域。至於可變區中除CDR以外之區域稱為架構區(FR)、以及該等之配置，IgNAR亦與普通抗體相同。
hcIg或IgNAR之可變區中之架構區及CDR可於包含生殖細胞系列抗體基因序列之公共DNA資料庫等中特定。例如，人重鏈之可變區基因之生殖細胞系列DNA序列及胺基酸序列可自「VBase」人類生殖細胞系序列資料庫(可於網際網路上www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase獲得)中選擇。此外，亦可基於公開發表之文獻例如「Kabat EA. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國衛生及公共服務部, NIH Publication No.91-3242(1991)」、「Tomlinson IM. J. fol. Biol. 227. 776-98(1992)」、「Cox JPL. Eur. J Immunol. 24 : 827-836(1994)」等中記載之DNA序列及胺基酸序列而特定。例如，由於人重鏈之可變區基因與hcIg之可變區具有相似性，故亦可基於人重鏈之可變區基因之資訊而特定hcIg之架構區及CDR。架構區及CDR之特定方法並無特別限定。
但並不限定於此，於特定為FR區之各區域中，亦可將(1)包含自其N末端起1～5個胺基酸及/或C末端之1～5個胺基酸之區域、(2)包含自其N末端起1～3個胺基酸及/或C末端之1～3個胺基酸之區域、或者(3)包含自其N末端起1或2個胺基酸及/或C末端之1或2個胺基酸之區域不包括於FR區，而劃入CDR區。即便一般被視為FR之區域，只要其參與CDR之結構保持或與抗原之結合而認為實質上具有決定抗體互補性之功能，則於本發明中可劃入CDR之中。反之，於特定為CDR區之各區域中，亦可將(1)包含自其N末端起1～5個胺基酸及/或C末端之1～5個胺基酸之區域、(2)包含自其N末端起1～3個胺基酸及/或C末端之1～3個胺基酸之區域、或者(3)包含自其N末端起1或2個胺基酸及/或C末端之1或2個胺基酸之區域不包括於CDR區，而劃入FR區。即便一般被視為CDR之區域，只要其不參與CDR之結構保持或與抗原之結合而認為實質上不具有決定抗體互補性之功能，則於本發明中可劃入FR之中。
於重鏈抗體之可變區之C末端介隔鉸鏈區而存在恆定區。於IgNAR之可變區之C末端亦存在恆定區。該等恆定區基本上不參與重鏈抗體對抗原之特異性結合。
重鏈抗體為鉸鏈區中藉由雙硫鍵進行共價鍵結而成之同源二聚物。但重鏈抗體無需為了與抗原結合而為同源二聚物，構成重鏈抗體之各重鏈可單獨與抗原結合。
構成重鏈抗體之單獨之重鏈可藉由如下方式獲得：使重鏈之鉸鏈區之胺基酸序列中形成雙硫鍵之半胱胺酸殘基缺失、或置換為其他胺基酸。此種單獨之重鏈可採用基因重組技術以重組蛋白質之形式製造。本說明書中，將該重鏈稱為「單重鏈抗體」。單重鏈抗體只要能夠與原本之重鏈抗體之抗原結合，則包括於重鏈抗體之中。單重鏈抗體亦可採用將其串聯連結而成之形態。各單重鏈抗體例如於一個重鏈抗體之C末端直接或經由肽連接子結合另一重鏈抗體之N末端。連結之單重鏈抗體之個數為2～10個，例如2個。肽連接子之序列可適用本說明書中記載者。該複數個單重鏈抗體連結而成者亦包括於單重鏈抗體之中。
構成重鏈抗體之各重鏈之可變區即便不存在鉸鏈區或/及恆定區，亦能夠與抗原結合。此種包含可變區之蛋白質可藉由構建僅編碼重鏈抗體之重鏈之可變區之胺基酸序列之基因，將其組入至表現載體並導入至宿主細胞，而作為重組蛋白質製造。
於本說明書中，為方便起見，包括構成重鏈抗體之重鏈之可變區之一部分或全部在內，對抗原具有親和性者一律包括於重鏈抗體之中。又，除構成重鏈抗體之重鏈之可變區之一部分或全部以外，(1)包含鉸鏈區之一部分或全部者、(2)包含鉸鏈區以及重鏈之恆定區之一部分者亦包括於重鏈抗體之中。重鏈抗體存在源自hcIg者與源自IgNAR者。此種重鏈抗體之單體亦包括於單重鏈抗體之中。
作為源自hcIg之重鏈抗體，存在如下者：(1h)僅包含重鏈之可變區之全部或其一部分者；(2h)包含重鏈之可變區之全部或其一部分與鉸鏈區之一部分者；(3h)包含重鏈之可變區與鉸鏈區之全部者；(4h)包含重鏈之可變區與鉸鏈區以及恆定區之一部分者。此處，重鏈抗體所含之恆定區之一部分例如為相當於重鏈之C H2之一部分或全部的部分。作為源自IgNAR之重鏈抗體，存在如下者：(1I)僅包含重鏈之可變區之全部或其一部分者；(2I)包含重鏈之可變區與鉸鏈區之一部分者；(3I)包含重鏈之可變區與鉸鏈區之全部者；(4I)包含重鏈之可變區與鉸鏈區以及恆定區之一部分者。此處，重鏈抗體所含之恆定區之一部分例如為相當於重鏈之C H2之一部分或全部的部分。於本說明書中，將含有源自hcIg的重鏈抗體之可變區的(1h)～(4h)之蛋白質及含有源自IgNAR的重鏈抗體之可變區的(1I)～(4I)之蛋白質統稱為重鏈抗體可變域肽(重鏈抗體可變區肽)。因此，重鏈抗體可變區肽存在2條肽鏈經由雙硫鍵結合而成之具有2個抗原結合部位者及包含1條肽鏈之具有1個抗原結合部位者。
於本說明書中，重鏈抗體識別存在於血管內皮細胞尤其是腦血管內皮細胞表面之分子作為抗原。血管內皮細胞及腦血管內皮細胞之生物種類並無特別限制，較佳為人源細胞。存在於該等細胞表面之應被重鏈抗體識別為抗原之分子較佳為運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體(IR)、瘦體素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F、有機陰離子轉運體、MCT-8及單羧酸轉運體，更佳為TfR、胰島素受體，進而較佳為TfR。
對存在於血管內皮細胞尤其是腦血管內皮細胞表面之分子具有親和性之重鏈抗體可變區肽稱為血腦障壁重鏈抗體可變區肽(BBB重鏈抗體可變區肽)。又，BBB重鏈抗體可變區肽及自BBB重鏈抗體可變區肽衍生之對存在於血管內皮細胞表面之分子具有親和性之全部肽稱為BBB親和性肽。本說明書中，含有源自hcIg的重鏈抗體之可變區的上述(1h)或(2h)之蛋白質且包含1條肽鏈者稱為免疫球蛋白單可變域肽(免疫球蛋白單可變區肽)。BBB重鏈抗體可變區肽所含之免疫球蛋白單可變域肽亦可特別稱為BBB免疫球蛋白單可變域肽。於本發明中，VHH、VHH域、VHH抗體及奈米抗體(Ablynx N.V.公司之商標)包含於免疫球蛋白單可變域肽之中，根據上下文可換用。因此，例如對TfR具有親和性之VHH包含於BBB免疫球蛋白單可變域肽之中。
對hTfR具有親和性之重鏈抗體可變區肽稱為抗hTfR重鏈抗體可變區肽。又，抗hTfR重鏈抗體可變區肽及自抗hTfR重鏈抗體可變區肽衍生之對hTfR具有親和性之全部肽稱為hTfR親和性肽。對hTfR具有親和性之VHH尤其包含於hTfR親和性肽之中。對存在於該細胞表面之其他分子具有親和性之VHH亦同樣如此，例如對hIR具有親和性之VHH包含於hIR親和性肽之中。構成BBB親和性肽之胺基酸之個數無特別限制，構成肽之胺基酸通常為80～200個、較佳為80～150個、更佳為100～130個、進而較佳為110～125個。例如，BBB親和性肽由113個、115個、119個或120個胺基酸構成。再者，本說明書中「肽」一詞與「多肽」或「蛋白質」同義，彼此可適當換用。下文中以對人類運鐵蛋白受體(hTfR)具有親和性之重鏈抗體可變區肽為例，詳細說明其特性等，但該等說明基本上亦可適用於對存在於該細胞表面之其他分子具有親和性之重鏈抗體可變區肽。
抗體通常包含輕鏈與重鏈，另一方面，VHH包含1條重鏈，因此將其作為hTfR親和性肽，使之與其他蛋白質(A)結合而製造融合蛋白質時之步驟簡化。例如使用一般之抗體作為hTfR親和性肽之情形時，需使其表現兩種蛋白質，若為VHH，使之表現一種蛋白質即可。
對人類運鐵蛋白受體具有親和性之重鏈抗體可變區肽特別稱為抗hTfR重鏈抗體可變區肽。於本說明書中，含有源自hcIg的重鏈抗體之可變區的上述(1h)或(2h)之蛋白質且包含一條肽鏈者稱為免疫球蛋白單可變域肽。對人類運鐵蛋白受體(hTfR)具有親和性之免疫球蛋白單可變域肽特別稱為hTfR免疫球蛋白單可變域肽或人類運鐵蛋白受體親和性肽(hTfR親和性肽)。hTfR親和性肽為由較佳為100～130個、更佳為110～125個胺基酸構成之肽。例如hTfR親和性肽由113個、115個或119個胺基酸構成。又，對hTfR具有親和性之VHH、VHH域、VHH抗體及奈米抗體分別稱為hTfR-VHH、hTfR-VHH域、hTfR-VHH抗體及hTfR-奈米抗體。
再者，除了上述作為(1h)～(4h)、(1I)～(4I)所記載之類型者以外，對該等加以置換、缺失、附加等變異者只要對hTfR具有親和性，亦包含於hTfR親和性肽之中。又，除了作為(1h)或(2h)所記載之類型者以外，對其加以置換、缺失、附加等變異者只要對hTfR具有親和性，亦包含於hTfR免疫球蛋白單可變域肽之中。以下詳細說明hTfR免疫球蛋白單可變域肽之相關變異。
於本發明中，「人類運鐵蛋白受體」或「hTfR」一詞指包含序列編號1表示之胺基酸序列之膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體於其一實施方式中，與序列編號1表示之胺基酸序列中之自N末端第89位半胱胺酸殘基至C末端之苯丙胺酸的部分(hTfR之胞外區)特異性結合，但不限定於此。又，於本發明中，「猴運鐵蛋白受體」或「猴TfR」一詞尤指包含源自食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之序列編號2表示之胺基酸序列之膜蛋白質。又，於本發明中，「小鼠運鐵蛋白受體」或「小鼠TfR」一詞尤指包含源自小鼠之序列編號3表示之胺基酸序列之膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體於其一實施方式中，亦與序列編號2表示之胺基酸序列中之自N末端第89位半胱胺酸殘基至C末端之苯丙胺酸的部分(猴TfR之胞外區)及/或序列編號3表示之胺基酸序列中之自N末端第89位半胱胺酸殘基至C末端之苯丙胺酸的部分(小鼠TfR之胞外區)結合，但不限定於此。
亦可使複數個hTfR親和性肽直接或經由肽連接子結合。此時進行結合之複數個hTfR親和性肽可全部包含相同之胺基酸序列，又，亦可包含不同之胺基酸序列。進行結合之hTfR親和性肽之個數並無特別限制，例如為2～10個、2～5個、2個、3個等。藉由使複數個hTfR親和性肽結合，能夠賦予提高對hTfR之親和性等性質。於本說明書中，如此由複數個hTfR親和性肽連結而成者稱為串聯型hTfR親和性肽。再者，串聯型hTfR親和性肽包含於hTfR親和性肽之中。關於免疫球蛋白單可變域肽及抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦同樣如此。
hTfR親和性肽亦可藉由相同方法，以重組蛋白質之形式獲得。 (1a)將組入有hTfR基因之表現載體導入至細胞中，使用該細胞製作重組人類運鐵蛋白受體(rhTfR)。 (2a)使用rhTfR，對可產生hcIg之駝科動物、或鯊魚等可產生IgNAR之魚類尤其是軟骨魚類進行免疫。 (3a)自使用rhTfR免疫後之生物採集抗體產生細胞。此處，抗體產生細胞尤其存在於末梢血液、骨髓及脾臟等，因此，回收末梢血液中之細胞、源自骨髓之細胞、脾細胞等作為抗體產生細胞。 (4a)使用自抗體產生細胞提取之mRNA，藉由反轉錄反應合成cDNA。 (5a)以cDNA為模板進行PCR反應，擴增包含編碼重鏈抗體之可變區之基因的DNA片段。 (6a)將編碼重鏈抗體之可變區之DNA片段組入至表現載體，使用該表現載體使宿主細胞轉形，而獲得重鏈抗體之可變區之表現細胞。 (7a)自重鏈抗體之可變區之表現細胞之中選擇表現識別hTfR的重鏈抗體之可變區的細胞(抗hTfR重鏈抗體之可變區之表現細胞)。此處，亦可自所選擇之細胞，進行PCR反應使編碼識別hTfR的重鏈抗體之可變區的基因擴增後將其單離。 (8a)將抗hTfR重鏈抗體之可變區之表現細胞進行培養，於培養液中或細胞中使重組抗hTfR重鏈抗體可變區肽表現。 (9a)對所表現之重組抗hTfR重鏈抗體可變區肽進行純化。
上述取得識別hTfR之抗hTfR重鏈抗體之步驟(6a)中獲得的重鏈抗體之可變區之表現細胞未必表現識別hTfR的重鏈抗體之可變區。因此，自上述步驟(6a)中獲得的重鏈抗體之可變區之表現細胞之中選擇產生具有所需特性(對hTfR之親和性)的重鏈抗體之可變區之細胞之步驟，即，上述步驟(7a)變得必要。作為選擇產生抗hTfR重鏈抗體可變區肽之細胞之方法，以下詳細說明之方法有效。
將上述步驟(6a)中獲得的重鏈抗體之可變區之表現細胞以一孔中約含1個細胞之方式接種於96孔板進行培養，繼而，自各孔回收培養上清液。於培養板中添加重組hTfR，使其保持於培養板上，其後添加所回收之培養上清液，使培養上清液中所含之抗hTfR重鏈抗體之可變區與培養板上之重組hTfR結合。其次，自培養板中去除培養上清液，進而將培養板洗淨以去除未與重組hTfR結合之抗體。其次，測定保持於培養板上之抗體之量。根據該方法，於培養板中添加之抗體產生細胞之培養上清液所含之抗體對hTfR之親和性越高，則培養板上保持之抗體之量越多。因此，可測定培養板上保持之抗體之量，選擇保持有更多抗體之培養板所對應之細胞作為產生對hTfR具有相對較高之親和性之抗hTfR重鏈抗體可變區肽的細胞株。亦可使自藉由如上方式選擇之細胞株提取之mRNA進行反轉錄，以獲得之cDNA作為模板進行PCR反應，使包含編碼抗hTfR重鏈抗體可變區肽之基因的DNA片段擴增後將其單離。
作為以重組蛋白質之形式獲得抗hTfR重鏈抗體之其他方法，有包含以下步驟之方法。該方法包括如下步驟：使由編碼重鏈抗體之可變區之基因編碼的重鏈抗體之可變區呈現於噬菌體上，選擇呈現具有所需性質的重鏈抗體之可變區的噬菌體。該步驟稱作噬菌體呈現法，為記載於國際公開公報(WO1997/09436、WO1995/11317)等中之公知技術。應用噬菌體呈現法獲得作為重組蛋白質之識別hTfR之抗hTfR重鏈抗體之方法例如包括以下之(1b)至(11b)之步驟。亦可藉由相同方法以重組蛋白質之形式獲得hTfR親和性肽。 (1b)將組入有hTfR基因之表現載體導入至細胞中，使用該細胞製作重組人類運鐵蛋白受體(rhTfR)。 (2b)使用rhTfR，對可產生hcIg之駝科動物、或鯊魚等可產生IgNAR之魚類尤其是軟骨魚類進行免疫。 (3b)自經rhTfR免疫後之生物採集抗體產生細胞。此處，抗體產生細胞尤其存在於末梢血液、骨髓及脾臟等，因此，回收末梢血液中之細胞、源自骨髓之細胞、脾細胞等作為抗體產生細胞。 (4b)使用自抗體產生細胞提取之mRNA，藉由反轉錄反應合成cDNA。 (5b)以cDNA為模板進行PCR反應，擴增包含編碼重鏈抗體之可變區之基因的DNA片段。 (6b)將編碼重鏈抗體之可變區之DNA片段組入至噬菌粒(phagemid)，將該噬菌粒導入至宿主細胞中，繼而培養宿主細胞，使衣殼(capsid)表面具有重鏈抗體之可變區之噬菌體釋出至培養基中。 (7b)將所回收之包含噬菌體之溶液負載於填充了保持有rhTfR之載體之管柱上，以使衣殼表面具有對rhTfR具有親和性的重鏈抗體之可變區的噬菌體結合於管柱。將管柱洗淨後，自管柱洗脫與hTfR結合之噬菌體。或於保持有rhTfR之培養板中添加所回收之包含噬菌體之溶液，以使衣殼表面具有對rhTfR具有親和性的重鏈抗體之可變區的噬菌體結合於培養板。 (8b)僅回收保持於管柱或培養板上之呈現識別hTfR的重鏈抗體之可變區的噬菌體，以該噬菌體所含之噬菌粒作為模板，藉由PCR反應使編碼識別hTfR的重鏈抗體之可變區的基因擴增。 (9b)將擴增後之基因組入至表現載體，使用該表現載體使宿主細胞轉形，而獲得識別hTfR的重鏈抗體之可變區之表現細胞。 (10b)將抗hTfR重鏈抗體可變區肽之表現細胞進行培養，使培養液中或細胞中表現重組抗hTfR重鏈抗體可變區肽。 (11b)對所表現之重組抗hTfR重鏈抗體可變區肽進行純化。
於上述噬菌體呈現法之步驟(1b)～(3b)中，需自經rhTfR免疫後之生物採集抗體產生細胞。亦可採用如下操作代替上述操作：預先收集自可表現重鏈抗體之生物之抗體產生細胞獲得之mRNA、或以該mRNA為模板合成之DNA片段，將其作為模板，擴增包含編碼重鏈抗體之可變區之基因的DNA片段。根據噬菌體呈現法，例如一次可篩選1×10 10個噬菌體，因此，即便自非免疫動物之細胞之中，亦有能夠選出呈現識別hTfR的重鏈抗體之可變區的噬菌體之可能性。於該情形時，無需對生物進行免疫，且亦無需自生物採集抗體產生細胞。
上述步驟(7b)用於選擇呈現識別rhTfR的重鏈抗體之可變區的噬菌體。此處，藉由調整使噬菌體結合於管柱(或培養板)之條件、及/或清洗管柱(或培養板)之條件，能夠調整所選擇之噬菌體對rhTfR之親和性。此外，一面使該條件越來越嚴格一面反覆實施上述步驟(7b)，藉此，該步驟每重複一次，選擇之噬菌體對rhTfR之親和性越高，因此，亦能夠效率良好地僅選取呈現對rhTfR具有較高親和性的重鏈抗體之可變區的噬菌體。又，於複製噬菌體基因組之過程中，存在基因組中被導入變異之情況。藉此，由噬菌體基因組編碼的重鏈抗體之可變區對rhTfR之親和性會發生變化，因此，藉由反覆實施上述步驟(7)而隨機於基因組中導入變異，從而有獲得對rhTfR具有更高親和性之抗體之可能性。
再者，反覆實施上述步驟(7b)之情形時之步驟例如下述(7b')所示。 (7b')將所回收之包含噬菌體之培養液負載於填充了保持有rhTfR之載體之管柱上，以使呈現識別rhTfR的重鏈抗體之可變區的噬菌體結合於管柱。或於保持有rhTfR之培養板中添加所回收之包含噬菌體之溶液，以使衣殼表面具有對rhTfR具有親和性的重鏈抗體之可變區的噬菌體結合於培養板。將管柱或培養板洗淨後，自管柱或培養板洗脫呈現識別hTfR的重鏈抗體之可變區的噬菌體。使洗脫出之噬菌體感染宿主細胞後，培養宿主細胞，自培養液中回收表面呈現重鏈抗體之可變區之噬菌體。將包含該回收之噬菌體之培養液負載於填充了保持有rhTfR之載體之層析柱上、或添加於保持有rhTfR之培養板中。於該步驟(7b')中，亦可藉由使噬菌體接觸致變原、或藉由對被噬菌體感染之宿主細胞之培養液添加致變原，主動地於噬菌體基因組中導入變異。亦可藉由對噬菌體或被噬菌體感染之宿主細胞照射紫外線、γ射線等電磁波而主動地於噬菌體基因組中導入變異。
上述步驟(1a)～(9a)及上述步驟(1b)～(11b)之任一步驟中均可包含單離編碼抗hTfR重鏈抗體之可變區的基因之步驟。亦可將所單離之編碼抗hTfR重鏈抗體之基因之鹼基序列轉譯成包含抗hTfR重鏈抗體之可變區之胺基酸序列，人工合成編碼該胺基酸序列之DNA片段。於人工合成DNA片段之情形時，可選擇適用於使宿主細胞表現基因之密碼子進行合成。將組入有此種DNA片段之表現載體導入至宿主細胞，藉此能夠使宿主細胞中之抗hTfR重鏈抗體可變區肽之表現量增加。亦可藉由相同方式使rhTfR親和性肽之表現量增加。
又，作為上述步驟中用作宿主細胞之細胞，只要為藉由導入組入有編碼重鏈抗體之可變區之基因的表現載體而可表現包含重鏈抗體之可變區之肽的細胞，無論為原核細胞、真核細胞均無特別限定，尤佳為大腸桿菌、或者源自中國倉鼠卵巢之CHO細胞或源自小鼠骨髓瘤之NS/0細胞。又，用於組入編碼重鏈抗體之可變區之基因並使該基因表現之表現載體只要為於被導入至宿主細胞內時能夠表現包含該重鏈抗體之可變區之肽者，則可無特別限定地使用。組入至表現載體中之該基因被配置於能夠調節宿主細胞內基因轉印頻度之DNA序列(基因表現控制部位)之下游。作為本發明中可使用之基因表現控制部位，例如可例舉：源自巨細胞病毒之啟動子、SV40早期啟動子、人生長因子-1α(EF-1α)啟動子，人泛蛋白C啟動子等。
藉由上述步驟獲得之抗hTfR重鏈抗體可變區肽中之可變區之胺基酸序列基本上自N末端起包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4該四個FR與三個CDR之胺基酸序列。但並不限定於此，只要能夠與hTfR特異性結合，可變區之胺基酸序列亦可為缺失FR1之一部分或全部者、缺失FR4之一部分或全部者、缺失FR1之一部分或全部且缺失FR4之一部分或全部者。該等缺失FR區之一部分者亦包含於抗hTfR重鏈抗體之可變區之中。關於hTfR親和性肽亦同樣如此。
作為本發明之一實施方式中之較佳之抗hTfR重鏈抗體可變區肽，有包含hTfR親和性肽1～3之胺基酸序列者。hTfR親和性肽1～3分別包含序列編號4、5、6表示之胺基酸序列。序列編號4、5、6表示之胺基酸序列均為重鏈抗體之可變區之胺基酸序列。hTfR親和性肽1～3均自N末端起包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4該四個FR與三個CDR之胺基酸序列。hTfR親和性肽1～6全部包含於hTfR親和性肽之中。
作為hTfR親和性肽1，其CDR1為包含序列編號7或8之胺基酸序列之區域，其CDR2為包含序列編號9或10之胺基酸序列之區域，且其CDR3為包含序列編號11或12之胺基酸序列之區域。hTfR親和性肽1中，各CDR之胺基酸序列可任意組合。例如以下者：CDR1為包含序列編號7之胺基酸序列之區域、CDR2為包含序列編號9之胺基酸序列之區域、及CDR3為包含序列編號11之胺基酸序列之區域；CDR1為包含序列編號8之胺基酸序列之區域、CDR2為包含序列編號10之胺基酸序列之區域、及CDR3為包含序列編號12之胺基酸序列之區域。又，CDR2亦可為於序列編號10之C末端進而包含VKG之胺基酸序列者。又，各CDR均可為包含該等胺基酸序列者。
作為hTfR親和性肽2，其CDR1為包含序列編號7或8之胺基酸序列之區域，其CDR2為包含序列編號9或10之胺基酸序列之區域，且其CDR3為包含序列編號11或12之胺基酸序列之區域。hTfR親和性肽2中，各CDR之胺基酸序列可任意組合。例如以下者：CDR1為包含序列編號7之胺基酸序列之區域、CDR2為包含序列編號9之胺基酸序列之區域、及CDR3為包含序列編號11之胺基酸序列之區域；CDR1為包含序列編號8之胺基酸序列之區域、CDR2為包含序列編號10之胺基酸序列之區域、及CDR3為包含序列編號12之胺基酸序列之區域。又，CDR2亦可為於序列編號10之C末端進而包含VKG之胺基酸序列者。又，各CDR均可為包含該等胺基酸序列者。
作為hTfR親和性肽3，其CDR1為包含序列編號13或14之胺基酸序列之區域，其CDR2為包含序列編號15或16之胺基酸序列之區域，且其CDR3為包含序列編號17或18之胺基酸序列之區域。hTfR親和性肽3中，各CDR之胺基酸序列可任意組合。例如以下者：CDR1為包含序列編號13之胺基酸序列之區域、CDR2為包含序列編號15之胺基酸序列之區域、及CDR3為包含序列編號17之胺基酸序列之區域；CDR1為包含序列編號14之胺基酸序列之區域、CDR2為包含序列編號16之胺基酸序列之區域、及CDR3為包含序列編號18之胺基酸序列之區域。又，CDR2亦可為於序列編號16之C末端進而包含VKG之胺基酸序列者。又，各CDR均可為包含該等胺基酸序列者。
又，上述hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列只要能夠與hTfR特異性結合，亦可為對其施加變異者。於該施加變異之情形時，施加變異後之hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列與原先之胺基酸序列較佳為具有80%以上之同一性，更佳為具有85%以上之同一性，進而較佳為具有90%以上之同一性，進而更佳為具有95%以上之同一性，例如具有98%以上之同一性。
又，於對可變區之胺基酸序列施加變異之情形時，亦可不對CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列施加變異而僅對FR區施加變異。於該施加變異之情形時，施加變異後之可變區之胺基酸序列與原先之胺基酸序列較佳為具有85%以上之同一性，更佳為具有90%以上之同一性，進而較佳為具有95%以上之同一性，例如具有98%以上之同一性。又，於對可變區之胺基酸序列施加變異之情形時，亦可不對FR區之胺基酸序列施加變異而僅對CDR區施加變異。於該施加變異之情形時，施加變異後之可變區之胺基酸序列與原先之胺基酸序列較佳為具有90%以上之同一性，更佳為具有95%以上之同一性，例如具有98%以上之同一性。又，亦可對FR區與CDR區均施加變異。
原先之可變區之胺基酸序列與施加變異後之可變區的同一性可使用公知之計算相似性之演算法容易地算出。作為此種演算法，例如有BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))、Pearson及Lipman之類似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444(1988))、Smith及Waterman之局部相似性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。又，本說明書全文範圍內提及同一性時指採用該等演算法算出之同一性。再者，於本說明書中，胺基酸序列之相似性及胺基酸序列之同一性可相互換用。
以下詳細說明對hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列施加置換、缺失及附加之變異之情形。
於將hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列之胺基酸置換為其他胺基酸之情形時，置換之胺基酸之個數較佳為1～20個，更佳為1～15個，進而較佳為1～10個，進而更佳為1～5個，例如1個、2個或3個。於使可變區之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，缺失之胺基酸之個數較佳為1～20個，更佳為1～15個，進而較佳為1～10個，進而更佳為1～5個，例如1個、2個或3個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之變異。於對可變區附加胺基酸之情形時，於可變區之胺基酸序列中、或於N末端或C末端附加較佳為1～20個、更佳為1～15個、進而較佳為1～10個、進而更佳為1～5個胺基酸，例如附加1個、2個或3個胺基酸。亦可施加組合有該等胺基酸之附加、置換及缺失之變異。
於對hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列施加置換、缺失及附加之變異之情形時，亦可不對CDR區(CDR1、CDR2及CDR3)之胺基酸序列施加變異而僅對FR區施加變異。僅對FR區施加置換之情形時，置換之胺基酸之個數較佳為1～12個，更佳為1～10個，進而較佳為1～8個，進而更佳為1～4個，例如1個、2個或3個。又，僅使FR區之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，缺失之胺基酸之個數較佳為1～8個，更佳為1～4個，進而較佳為1～3個，進而更佳為1～2個，例如1個或2個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之變異。又，僅於FR區之胺基酸序列中附加胺基酸之情形時，於可變區之胺基酸序列中、或於N末端或C末端附加較佳為1～8個、更佳為1～4個、進而較佳為1～3個、進而更佳為1～2個胺基酸，例如附加1個或2個胺基酸。亦可施加組合有該等胺基酸之附加、置換及缺失之變異。
僅對FR區施加變異之情形時，已知有將hTfR親和性肽之FR區之胺基酸殘基置換為IgG型人抗體之可變區中之FR區對應之胺基酸殘基之方法。於本說明書中，將該方法稱為hTfR親和性肽之人源化。該方法例如揭示於Vincle C., et. Al., J biol Chem. 284. 3273-84(2009)。於原本之抗體為羊駝之抗體之情形時，向人類投予該抗體時存在被識別成抗原之可能性。相較於原本之抗體，人源化之抗體之抗原性有望較低。僅對FR區施加變異之情形時，人源化為較佳實施方式之一。於本說明書中，hTfR親和性肽亦包括人源化之hTfR親和性肽。於hTfR親和性肽為VHH之情形時，該人源化hTfR親和性肽亦包括該人源化VHH。
於對hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列施加置換、缺失及附加之變異之情形時，亦可不對FR區之胺基酸序列施加變異而僅對CDR區施加變異。僅對CDR區施加置換之情形時，置換之胺基酸之個數較佳為1～4個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，例如1個或2個。又，僅使CDR區之胺基酸序列中之胺基酸缺失之情形時，缺失之胺基酸之個數較佳為1～4個，更佳為1～3個，進而較佳為1～2個，例如1個或2個。又，亦可施加組合有該等胺基酸之置換與缺失之變異。又，僅於CDR區之胺基酸序列中附加胺基酸之情形時，於可變區之胺基酸序列中、或於N末端或C末端附加較佳為1～4個、更佳為1～3個、進而較佳為1～2個胺基酸，例如附加1個或2個胺基酸。亦可施加組合有該等胺基酸之附加、置換及缺失之變異。
於對hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列施加置換、缺失及附加之變異之情形時，亦可對該胺基酸序列施加組合有上述FR區之變異與CDR區之變異的變異。
上述可變區之胺基酸序列中之胺基酸被其他胺基酸置換例如發生於胺基酸之該等之側鏈及化學性質存在關聯性之胺基酸家族內。預測此種胺基酸家族內之置換不會引起抗hTfR重鏈抗體功能之較大變化(即保守性胺基酸置換)。作為該胺基酸家族，例如有以下者： (1)作為酸性胺基酸之天冬胺酸與穀胺酸； (2)作為鹼性胺基酸之組胺酸、離胺酸及精胺酸； (3)作為芳香族胺基酸之苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸； (4)作為具有羥基之胺基酸(羥基胺基酸)之絲胺酸與蘇胺酸； (6)作為中性親水性胺基酸之半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺及穀醯胺； (7)作為影響肽鏈取向之胺基酸之甘胺酸與脯胺酸； (8)作為醯胺型胺基酸(極性胺基酸)之天冬醯胺與穀醯胺； (9)作為脂肪族胺基酸之丙胺酸、白胺酸、異白胺酸及纈胺酸； (10)作為側鏈較小之胺基酸之丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及蘇胺酸； (11)作為側鏈特別小之胺基酸之丙胺酸與甘胺酸； (12)作為具有支鏈之胺基酸之纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。
上述保守性胺基酸置換亦適用於將人類血清白蛋白(HSA)等其他蛋白質之胺基酸序列中之胺基酸置換為其他胺基酸之情形。
再者，於可變區施加變異、於C末端或N末端附加胺基酸之情形時，於使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)融合時，該附加之胺基酸位於hTfR親和性肽與蛋白質(A)之間，此時，將該附加之胺基酸視為構成hTfR親和性肽之一部分者。下文詳細說明hTfR親和性肽與蛋白質(A)之融合蛋白質中之位於hTfR親和性肽與蛋白質(A)之間的連接子。再者，本說明書中提及之其他蛋白質(A)係指以與hTfR親和性肽結合之形態對人類投予而應於人體內發揮生理活性之蛋白質，且該蛋白質不同於hTfR親和性肽。
藉由上述步驟等選擇之hTfR親和性肽對hTfR具有固定之親和性。對於該hTfR親和性肽之可變區，藉由對其胺基酸序列導入置換、缺失、附加等變異，將其改變為具有所需特性之抗hTfR重鏈抗體之可變區。向抗hTfR重鏈抗體之可變區之胺基酸序列中之變異之導入亦可藉由對該胺基酸序列對應之基因施加變異而進行。
hTfR親和性肽之可變區可藉由對構成其之胺基酸序列施加置換、缺失、附加等變異而適當調整對hTfR之親和性。例如於hTfR親和性肽與抗原之親和性較高而於水性液中之解離常數明顯較低之情況下，將其投予至生物體內時，該可變區不與抗原解離，其結果存在引起功能上之不良情況之可能性。於此種情形時，藉由對可變區導入變異，將解離常數階段性地調整為原先之可變區之解離常數之2～5倍、5～10倍、10～100倍等，而可獲得契合目標之最佳之hTfR親和性肽。反之，亦可藉由該變異之導入，將解離常數階段性地調整為原先之可變區之解離常數之1/2～1/5倍、1/5～1/10倍、1/10～1/100倍等。
hTfR親和性肽與運鐵蛋白受體之結合親和性即解離常數例如可藉由採用生物膜干涉技術(BLI)之方法，具體而言，使用Octet系統進行測定。將源自適宜動物之運鐵蛋白受體之全部或一部分固定於感測器，以包含hTfR親和性肽之可變區之溶液作為試樣，測定結合速率常數(Kon)或解離速率常數(Koff)，根據其結果可算出解離常數。又，同樣地，亦可藉由採用表面電漿子共振(SPR)技術之方法，具體而言，藉由使用Biacore之方法算出解離常數。例如可良好地採用實施例7中記載之測定方法作為測定hTfR親和性肽與運鐵蛋白受體之結合親和性之方法。
可藉由如下方式於hTfR親和性肽之可變區之胺基酸序列中導入置換、缺失、附加等變異，例如以編碼抗hTfR重鏈抗體之可變區之基因作為模板，採用PCR等方法，於基因之鹼基序列之特定部位導入變異、或隨機導入變異。
目的在於調整hTfR親和性肽與hTfR之親和性的於hTfR親和性肽之胺基酸序列中之變異導入例如可藉由下述方式進行：將編碼hTfR親和性肽之基因組入至噬菌粒，使用該噬菌粒製作衣殼表面上表現hTfR親和性肽之噬菌體，使該噬菌體與致變原等發生作用。可一面利用致變原於編碼hTfR親和性肽之基因中導入變異一面使噬菌體增殖，採用上述方法於增殖後之噬菌體之中選擇表現具有所需解離常數之單鏈抗體之噬菌體。
藉由上述方法獲得之對hTfR具有相對較高親和性之hTfR親和性肽較佳為利用實施例7中記載之方法測定之與hTfR之解離常數(K D)較佳為5×10 -8M以下，更佳為2×10 -8M以下，例如1×10 -8M以下、5×10 -9M以下、1×10 -9M以下。作為較佳者，例如可例舉解離常數為5×10 -11M～1×10 -8M者、2×10 -11M～1×10 -8M者、1×10 -10M～1×10 -8M者、1.0×10 -9M～1.0×10 -8M者。
於藉由如上所述之方式獲得之hTfR親和性肽之中選擇對猴TfR具有親和性之hTfR親和性肽，藉此可獲得對人類及猴之TfR均具有親和性者。可藉由例如使用採用基因重組技術製作之重組猴TfR之ELISA法等選擇對猴TfR具有親和性之hTfR親和性肽。該ELISA法係使重組猴TfR於培養板上固相化後，使其接觸hTfR親和性肽，繼而自培養板中去除未與重組猴TfR結合者，測定培養板上保持之hTfR親和性肽之量。對重組猴TfR之親和性越高，保持於培養板上之hTfR親和性肽之量越多，因此，可選擇保持有更多hTfR親和性肽之培養板所對應之hTfR親和性肽作為對猴TfR具有親和性之hTfR親和性肽。再者，此處提及之「猴」較佳為屬於除人類以外之類人猿亞目者，更佳為屬於猴科者，進而較佳為屬於獼猴屬者，例如食蟹獼猴或普通獼猴，尤其是食蟹獼猴。食蟹獼猴在用於應用hTfR親和性肽之藥劑之藥效評估時情況較佳。關於抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦可藉由相同方式獲得對人類及猴之TfR均具有親和性者。
對人類及猴之hTfR均具有親和性之hTfR親和性肽存在可使用猴來觀察對人體投予時之體內藥物代謝動力的有利效果。例如於利用本發明之一實施方式之hTfR親和性肽開發醫藥之情形時，藉由使用猴來實施該醫藥之藥物代謝動力試驗等一部分非臨床試驗，能夠更準確地預測對人投予該肽時之藥物代謝動力等。藉此，能夠顯著促進該醫藥之開發。關於抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦同樣如此。
於本發明中，對hTfR具有相對較高之親和性、且對猴TfR亦具有親和性之hTfR親和性肽尤其是藉由實施例7中記載之方法測定時與人類及猴之TfR之解離常數為如下者： (a)與hTfR及猴TfR之解離常數均為5×10 -11M～5×10 -7M者； (b)與hTfR及猴TfR之解離常數均為5×10 -11M～1×10 -8M者； (c)與hTfR及猴TfR之解離常數均為5×10 -10M～1×10 -8M者； (d)與hTfR及猴TfR之解離常數均為1×10 -10M～5×10 -7M者。 上述(a)～(d)之中，尤佳為就與hTfR之解離常數和與猴TfR之解離常數的比而言，將與hTfR之解離常數之值設為1時，與猴TfR之解離常數之值較佳為1～10，例如3～10、5～10、3～5。
本發明之一實施方式中之hTfR親和性肽1～3由於與人類及猴之TfR之解離常數為上述(a)～(e)之任一者，故將該等對猴投予時之猴體內行為可謂近似於對人投予時之行為。因此，對於應用hTfR親和性肽1～3之藥物，藉由使用猴之試驗，可獲得更能反映對人投予時之行為之結果。因此，使用猴之試驗作為實施使用人之臨床試驗時之判斷材料，可獲得更有益之結果。尤其是hTfR親和性肽1及2，作為與hTfR之解離常數和與猴TfR之解離常數的比，將與hTfR之解離常數之值設為1時，與猴TfR之解離常數之值處於1～10之範圍，因此，根據猴體內行為可容易地推測人體內行為，從而較佳。
本發明之一實施方式中之hTfR親和性肽於藉由靜脈注射等將其投予至生物體內之情形時，能夠與存在於腦內毛細血管內皮細胞上之hTfR效率良好地結合。與hTfR結合之hTfR親和性肽藉由內噬作用、胞吐作用、胞吞轉送等機制，通過血腦障壁而被吸收至腦內。因此，藉由使應於腦內發揮功能之蛋白質、低分子化合物等與該等hTfR親和性肽結合，能夠使該等物質效率良好地通過血腦障壁而到達腦內。又，本發明之一實施方式中之hTfR親和性肽於通過血腦障壁後，到達大腦之腦實質、海馬區之神經樣細胞及小腦之腦實質等或到達至少該等任一部位。因此，藉由使應於該等組織或細胞發揮作用之藥物具體而言蛋白質、低分子化合物、核酸等與本發明之hTfR親和性肽結合，能夠使該藥物深入至該等組織或細胞。於本說明書中，如此由hTfR親和性肽與藥物結合而成者稱為hTfR親和性肽-藥物複合體。關於抗hTfR重鏈抗體可變區肽及hTfR免疫球蛋白單可變域肽(包括VHH)亦同樣如此。以下，詳細說明hTfR親和性肽之相關用途等，該用途等亦適用於抗hTfR重鏈抗體可變區肽、hTfR免疫球蛋白單可變域肽、hTfR-VHH等。
對於通常無法通過血腦障壁，故若靜脈內投予則幾乎或完全無法於腦內發揮生理、藥理作用之物質(蛋白質、低分子化合物、核酸等)，為了使其自血中到達腦內並於此發揮作用，使該物質與本發明之一實施方式中之hTfR親和性肽形成複合體可成為有效方法。尤其是本發明之hTfR親和性肽於通過血腦障壁後到達大腦之腦實質、海馬區之神經樣細胞、小腦之腦實質等或至少該等之任意者。因此，藉由將該等物質製成與本發明之hTfR親和性肽結合之形態，利用靜脈內投予等進行血中投予，藉此能夠使該等物質通過血腦障壁，到達中樞神經組織，並於中樞神經系統之組織或細胞中發揮或強化其生理活性。關於抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦同樣如此。
作為使hTfR親和性肽與此種物質(蛋白質、低分子化合物、核酸等)結合之方法，有經由非肽連接子或肽連接子結合之方法。關於抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦同樣如此。作為非肽連接子，可使用聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖類、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂質聚合物、甲殼素類及玻尿酸、或該等之衍生物、或該等之組合。肽連接子係由進行肽鍵結之1～60個胺基酸構成之肽鏈或其衍生物，其N末端與C末端分別與hTfR親和性肽或蛋白質、低分子化合物、核酸等任一者形成共價鍵，藉此使抗hTfR抗體與蛋白質、低分子化合物、核酸等結合。
使用PEG作為非肽連接子使本發明之hTfR親和性肽與所需之其他蛋白質(A)結合而成者特別稱為hTfR親和性肽-PEG-蛋白質。hTfR親和性肽-PEG-蛋白質可藉由如下方式製造：使hTfR親和性肽與PEG結合而製作hTfR親和性肽-PEG，繼而使hTfR親和性肽-PEG與其他蛋白質(A)結合。又，hTfR親和性肽-PEG-蛋白質亦可藉由如下方式製造：使其他蛋白質(A)與PEG結合而製作蛋白質-PEG，繼而使蛋白質-PEG與hTfR親和性肽結合。使PEG與hTfR親和性肽及其他蛋白質(A)結合時，可使用經碳酸酯、羰基咪唑、羧酸之活性酯、吖內酯(azlactone)、環狀醯亞胺硫酮、異氰酸酯、異硫氰酸酯、亞胺酸酯(imidate)或醛等官能基修飾之PEG。該等導入至PEG之官能基主要與hTfR親和性肽及其他蛋白質(A)分子內之胺基反應，藉此使PEG與hTfR親和性肽及其他蛋白質(A)進行共價鍵結。此時使用之PEG之分子量及形狀無特別限定，其平均分子量(MW)較佳為500～60000，更佳為500～20000。例如平均分子量約300、約500、約1000、約2000、約4000、約10000、約20000等之PEG可良好地用作非肽連接子。使hTfR親和性肽與所需之低分子化合物、核酸等結合之情形時亦同樣如此。
例如hTfR親和性肽-PEG可藉由下述方式獲得：將hTfR親和性肽與具有醛基作為官能基之聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)以ALD-PEG-ALD相對於該抗體之莫耳比為1:11、1:12.5、1:15、1:110、1:120等之方式混合，於其中添加NaCNBH 3等還原劑進行反應。其次，使hTfR親和性肽-PEG於NaCNBH 3等還原劑之存在下與其他蛋白質(A)反應，藉此獲得hTfR親和性肽-PEG-蛋白質。反之，先使其他蛋白質(A)與ALD-PEG-ALD結合而製作蛋白質-PEG，其次使蛋白質-PEG與hTfR親和性肽結合，藉此亦可獲得hTfR親和性肽-PEG-蛋白質。
亦可使hTfR親和性肽之C末端或N末端經由肽連接子或直接分別與其他蛋白質(A)之N末端或C末端進行肽鍵結，藉此使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)結合。於編碼hTfR親和性肽之cDNA之3'末端或5'末端直接或隔著編碼肽連接子之胺基酸序列之DNA片段，以框內(in frame)狀態配置編碼其他蛋白質(A)之cDNA，將得到之DNA片段組入至哺乳動物細胞、酵母等真核生物或大腸桿菌等原核生物細胞用之表現載體，對導入有該表現載體之宿主細胞進行培養，藉此能夠以重組蛋白質之形式獲得此種使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)結合而成之融合蛋白質。本說明書中，將該使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)結合而成之重組蛋白質稱為hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質。同理，將使免疫球蛋白單可變域肽與其他蛋白質(A)結合而成之重組蛋白質稱為免疫球蛋白單可變域肽-蛋白質(A)融合蛋白質。又，將使重鏈抗體可變區肽與其他蛋白質(A)結合而成之重組蛋白質稱為重鏈抗體可變區肽-蛋白質(A)融合蛋白質。於本說明書中，hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質、免疫球蛋白單可變域肽-蛋白質(A)融合蛋白質及重鏈抗體可變區肽-蛋白質(A)融合蛋白質根據上下文可相互換用。
此時，配置於hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)之間的肽連接子為由較佳為1～60或1～50個、更佳為1～17個、進而較佳為1～10個、進而更佳為1～5個胺基酸構成之肽鏈，可根據應與抗hTfR抗體結合之其他蛋白質(A)，將構成肽連接子之胺基酸之個數適當調整為1個、2個、3個、1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。此種肽連接子只要經由其連結之hTfR親和性肽具有與hTfR之親和性、且經由該肽連接子連結之其他蛋白質(A)可於生理條件下發揮所需生理活性，其胺基酸序列並無限定，較佳為由甘胺酸與絲胺酸構成者。
作為較佳之肽連接子，例如可例舉：含有1個胺基酸(例如甘胺酸或絲胺酸)者、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號19之胺基酸序列、序列編號20之胺基酸序列、序列編號21之胺基酸序列、序列編號22之胺基酸序列、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列。又，作為較佳之肽連接子，例如可例舉：包含選自由含有1個胺基酸(例如甘胺酸或絲胺酸)者、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號19之胺基酸序列、序列編號20之胺基酸序列及序列編號21之胺基酸序列所組成之群中之2～10個或2～5個胺基酸序列連接而成之序列者。該肽連接子包含含有2～50個胺基酸之序列，含有2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個或27個胺基酸之序列。例如可良好地使用包含胺基酸序列Gly-Ser者作為肽連接子。又，5個序列編號19之胺基酸序列連接而成之共包含25個胺基酸者亦可良好地用作肽連接子。
亦可使hTfR親和性肽與人IgG之Fc區(hIgG Fc區)結合。藉由使hTfR親和性肽與hIgG Fc區結合，能夠提高hTfR親和性肽於生物體內之穩定性，例如血中滯留性。作為該結合有hIgG Fc區之hTfR親和性肽，例如存在如下者：於hTfR親和性肽之C末端直接或經由肽連接子結合hIgG Fc區而成者；或於hTfR親和性肽之N末端直接或經由肽連接子結合hIgG Fc區而成者。對於由Fc區與hTfR親和性肽結合而成之結合體，可使其進而與由於通常無法通過血腦障壁故靜脈內投予時幾乎或完全無法於腦內發揮生理、藥理作用之物質(蛋白質、低分子化合物、核酸等)結合而形成複合體。可藉由上述方法，例如使用PEG之方法，使該物質結合於Fc區與hTfR親和性肽之結合體。預測於採用靜脈注射等向生物體內投予該複合體之情形時，可通過血腦障壁，並到達大腦之腦實質、海馬區之神經樣細胞、小腦之腦實質等。因此，藉由製成該結合體，能夠於該等中樞神經系統之組織或細胞中發揮該等物質之生理活性。又，該複合體與無hIgG Fc區者相比血中穩定性得以提高，故於投予至生物體內時能夠發揮更長期之藥效。與hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質一樣，由hTfR親和性肽與人IgG之Fc區結合而成之蛋白質可以重組蛋白質之形式獲得。
亦可使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)與hIgG Fc區結合。藉由結合hIgG Fc區，能夠提高該結合體於生物體內之穩定性，例如血中滯留性。作為該結合有Fc區之蛋白質，例如存在如下者：於其他蛋白質(A)之C末端直接或經由肽連接子結合hIgG Fc區，進而於該hIgG Fc區之C末端直接或經由肽連接子結合hTfR親和性肽而成者。又，亦存在如下者：於hTfR親和性肽之C末端直接或經由肽連接子結合hIgG Fc區，進而於該hIgG Fc區之C末端直接或經由連接子序列結合其他蛋白質(A)而成者。又，亦存在如下者：於hTfR親和性肽之C末端直接或經由肽連接子結合其他蛋白質(A)，進而於該其他蛋白質(A)之C末端直接或經由連接子序列結合hIgG Fc區而成者。又，亦存在如下者：於其他蛋白質(A)之C末端直接或經由肽連接子結合hTfR親和性肽，進而於該hTfR親和性肽之C末端直接或經由連接子序列結合hIgG Fc區而成者。又，亦存在如下者：於hIgG Fc區之C末端直接或經由肽連接子結合hTfR親和性肽，進而於該hTfR親和性肽之C末端直接或經由連接子序列結合其他蛋白質(A)而成者。亦存在如下者：於hIgG Fc區之C末端直接或經由肽連接子結合其他蛋白質(A)，進而於該其他蛋白質(A)之C末端直接或經由連接子序列結合hTfR親和性肽而成者。與hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質一樣，由hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)與hIgG Fc區結合而成之蛋白質可以重組蛋白質之形式獲得。如此獲得之重組蛋白質亦包含於hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質之中。作為此處可使用之肽連接子，可使用上述配置於hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)之間的肽連接子。
所結合之hIgG Fc區之IgG亞型並無特別限定，可為IgG1～IgG5之任一者。又，所導入之hIgG Fc區可為整個Fc區，亦可為其一部分。作為該hIgG Fc區之一較佳實施方式，可例舉包含作為人IgG1之Fc全區的序列編號26表示之胺基酸序列者。
亦可使hTfR親和性肽與人類血清白蛋白(HSA)結合。藉由使hTfR親和性肽與HSA結合，能夠提高hTfR親和性肽於生物體內之穩定性，例如血中滯留性。作為該結合有HSA之hTfR親和性肽，例如存在如下者：於hTfR親和性肽之C末端直接或經由肽連接子結合HSA而成者；或於hTfR親和性肽之N末端直接或經由肽連接子結合HSA而成者。對於由hTfR親和性肽與HSA結合而成之結合體，可使其進而與由於通常無法通過血腦障壁故靜脈內投予時幾乎或完全無法於腦內發揮生理、藥理作用之物質(蛋白質、低分子化合物、核酸等)結合而形成複合體。可藉由上述方法，例如使用PEG之方法，使該物質結合於HSA與hTfR親和性肽之結合體。預測於採用靜脈注射等向生物體內投予該複合體之情形時，可通過血腦障壁，並到達大腦之腦實質、海馬區之神經樣細胞、小腦之腦實質等。因此，藉由製成該結合體，能夠於該等中樞神經系統之組織或細胞中發揮該等物質之生理活性。又，該複合體與無HSA者相比血中穩定性得以提高，故於投予至生物體內時能夠發揮更長期之藥效。與hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質一樣，由hTfR親和性肽與HSA結合而成之蛋白質可以重組蛋白質之形式獲得。
亦可使hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質進而與HSA結合。作為該結合有HSA之蛋白質，例如存在如下者：於其他蛋白質(A)之C末端直接或經由肽連接子結合HSA，進而於該HSA之C末端直接或經由肽連接子結合hTfR親和性肽而成者。又，亦存在如下者：於hTfR親和性肽之C末端直接或經由肽連接子結合HSA，進而於該HSA之C末端直接或經由連接子序列結合其他蛋白質(A)而成者。又，亦存在如下者：於hTfR親和性肽之C末端直接或經由肽連接子結合其他蛋白質(A)，進而於該其他蛋白質(A)之C末端直接或經由連接子序列結合HSA而成者。又，亦存在如下者：於其他蛋白質(A)之C末端直接或經由肽連接子結合hTfR親和性肽，進而於該hTfR親和性肽之C末端直接或經由連接子序列結合HSA而成者。又，亦存在如下者：於HSA之C末端直接或經由肽連接子結合hTfR親和性肽，進而於該hTfR親和性肽之C末端直接或經由連接子序列結合其他蛋白質(A)而成者。又，亦存在如下者：於HSA之C末端直接或經由肽連接子結合其他蛋白質(A)，進而於該其他蛋白質(A)之C末端直接或經由連接子序列結合hTfR親和性肽而成者。與hTfR免疫球蛋白單可變域肽-蛋白質(A)融合蛋白質一樣，由hTfR免疫球蛋白單可變域肽與其他蛋白質(A)與HSA結合而成之蛋白質可以重組蛋白質之形式獲得。如此獲得之重組蛋白質亦包含於hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質之中。作為此處可使用之肽連接子，可使用上述配置於hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)之間的肽連接子。
上述HSA較佳為包含序列編號27表示之胺基酸序列之野生型HSA，但不限於此，只要能夠提高與其結合之物質之血中穩定性，亦可為於野生型HSA之胺基酸序列中進行置換、缺失、附加所得之變異型HSA。
亦可使用對白蛋白具有親和性之物質代替HSA。對白蛋白具有親和性之物質會於血中與白蛋白結合，故與使用HSA時一樣，能夠使投予至生物體內之抗hTfR重鏈抗體與其他蛋白質(A)之融合蛋白質等之血中半衰期延長。作為對白蛋白具有親和性之物質，例如可使用對包含序列編號28表示之胺基酸序列之源於鏈球菌菌株G418(Streptococcus strain G418)之蛋白質之白蛋白結合域(Alm T. Biotechnol J. 5. 605-17(2010))以使其顯示耐鹼性之方式進行改良所得之肽。
導入有白蛋白親和性肽之hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質與白蛋白之結合親和性於依據實施例7中記載之生物膜干涉法測定時，較佳為1×10 -7M以下，更佳為5×10 -7M以下，進而較佳為1×10 -8M以下，進而更佳為1×10 -9M以下。
亦可使複數個hTfR親和性肽直接或肽經由連接子結合。此時進行結合之複數個hTfR親和性肽可全部包含相同之胺基酸序列，又，亦可包含不同之胺基酸序列。進行結合之hTfR親和性肽之個數並無特別限制，例如為2～10個、2～5個、2個、3個等。藉由使複數個hTfR親和性肽結合，能夠賦予提高對hTfR之親和性等性質。於本說明書中，如此由複數個hTfR親和性肽連結而成者稱為串聯型hTfR親和性肽。再者，串聯型hTfR親和性肽包含於hTfR親和性肽之中。關於免疫球蛋白單可變域肽及抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦同樣如此。
用於使上述hTfR親和性肽與hIgG Fc區或HSA連結之肽連接子較佳為由1～60或1～50個胺基酸構成。此處，胺基酸之個數可適當調整為1～17個、1～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個、27個等。此種肽連接子只要經由其連結之hTfR親和性肽具有與hTfR之親和性、且經由該肽連接子連結之hIgG Fc區或HAS可於生理條件下發揮所需功能，其胺基酸序列並無限定，較佳為由甘胺酸與絲胺酸構成者。關於用於使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)與hIgG Fc區結合之肽連接子亦同樣如此。關於用於使hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)與HSA結合之肽連接子亦同樣如此。又，關於用於使複數個hTfR親和性肽結合之肽連接子亦同樣如此。
作為較佳之肽連接子，例如可例舉：含有1個胺基酸(例如甘胺酸或絲胺酸)者、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號19之胺基酸序列、序列編號20之胺基酸序列、序列編號21之胺基酸序列、序列編號22之胺基酸序列、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列。又，作為較佳之肽連接子，例如可例舉：包含選自由含有1個胺基酸(例如甘胺酸或絲胺酸)者、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列編號19之胺基酸序列、序列編號20之胺基酸序列及序列編號21之胺基酸序列所組成之群中之2～10個或2～5個胺基酸序列連接而成之序列者。該肽連接子包含含有2～50個胺基酸之序列，含有2～17個、2～10個、10～40個、20～34個、23～31個、25～29個或27個胺基酸之序列。例如可良好地使用包含胺基酸序列Gly-Ser者作為肽連接子。又，5個序列編號19之胺基酸序列連接而成之共包含25個胺基酸者亦可良好地用作肽連接子。
亦可藉由上述以外之方法使hTfR親和性肽及hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質於血中穩定化。例如該等蛋白質經過PEG修飾而能夠提高血中穩定性。該方法常用於蛋白質醫藥領域，經PEG化之紅血球生成素、干擾素等已作為醫藥品實現實用化。又，亦可藉由對hTfR親和性肽導入變異而使其穩定化。
應與hTfR親和性肽結合之其他蛋白質(A)為如下者：儘管能夠於生物體內發揮生理活性，尤其應使其到達腦內發揮功能，但由於無法直接通過血腦障壁，故無望藉由靜脈內投予來實現於腦內發揮功能之蛋白質，其並無特別限定。作為此種蛋白質，例如可例舉：艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、葡糖腦苷脂酶(GBA)、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白質、β-胺基己糖苷酶A、β-胺基己糖苷酶B、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶(LAMAN)、β-甘露糖苷酶、半乳糖神經醯胺酶(GALC)、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、α-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶、酸性神經鞘磷脂酶(ASM)、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)、乙醯肝素N-硫酸酯酶(SGSH)、α-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙醯輔酶Aα-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶(AC)、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、棕櫚醯蛋白硫酯酶-1(PPT-1)、三肽基肽酶-1(TPP-1)、玻尿酸酶-1、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、CLN1、CLN2等溶酶體酶。關於抗hTfR重鏈抗體可變區肽亦同樣如此。
與α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)結合之hTfR親和性肽可用作賀勒氏(Hurler)症候群或賀勒-施艾氏(Hurler-Scheie)症候群之治療劑；與艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)結合者可用作亨特氏症候群之治療劑；與葡糖腦苷脂酶(GBA)結合者可用作高雪氏症之治療劑；與β半乳糖苷酶結合者可用作1～3型GM1-神經節苷脂貯積症之治療劑；與GM2活化蛋白質結合者可用作AB變體GM2-神經節苷脂貯積症之治療劑；與β-胺基己糖苷酶A結合者可用作桑德霍夫(Sandhoff)病及戴薩克斯(Tay-Sachs)病之治療劑；與β-胺基己糖苷酶B結合者可用作桑德霍夫病之治療劑；與N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶結合者可用作I-Cell病之治療劑；與α-甘露糖苷酶(LAMAN)結合者可用作α-甘露糖苷貯積症之治療劑；與β-甘露糖苷酶結合者可用作β-甘露糖苷貯積症之治療劑；與半乳糖神經醯胺酶(GALC)結合者可用作克拉伯(Krabbe)病之治療劑；與鞘脂激活蛋白C結合者可用作高雪氏症樣貯積症之治療劑；與芳基硫酸酯酶A(ARSA)結合者可用作異染性腦白質退化症(metachromatic leukodystrophy)之治療劑；與α-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)結合者可用作岩藻糖苷貯積症之治療劑；與天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶結合者可用作天冬胺醯葡萄糖胺尿症之治療劑；與α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶結合者可用作神崎病及川崎病之治療劑；與酸性神經鞘磷脂酶(ASM)結合者可用作尼曼-匹克(Niemann-Pick)病之治療劑；與α-半乳糖苷酶A結合者可用作法布里(Fabry)病之治療劑；與β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)結合者可用作Sly症候群之治療劑；與乙醯肝素N-硫酸酯酶(SGSH)結合者可用作聖菲利柏氏(Sanfilippo)症候群A之治療劑；與α-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶(NAGLU)結合者可用作聖菲利柏氏症候群B之治療劑；分別與乙醯輔酶Aα-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶及N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶結合者可用作聖菲利柏氏症候群之治療劑；與酸性神經醯胺酶(AC)結合者可用作法伯(Farber)之治療劑；與澱粉-1,6-葡萄糖苷酶結合者可用作科里(Cori)病(福布斯科里(Forbes-Cori)病)之治療劑；與唾液酸酶結合者可用作唾液酸酶缺乏症中之中樞神經障礙治療劑，與棕櫚醯蛋白硫酯酶-1(PPT-1)結合者可用作神經元蠟樣脂褐質貯積症或桑塔沃里-哈爾蒂亞(Santavuori-Haltia)病之治療劑；與三肽基肽酶-1(TPP-1)結合者可用作神經元蠟樣脂褐質貯積症或Jansky-Bielschowsky病之治療劑；與玻尿酸酶-1結合者可用作玻尿酸酶缺乏症之治療劑；與酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)結合者可用作龐貝(Pompe)病之治療劑；分別與CLN1及2結合者可用作巴頓(Batten)病之治療劑。上述與溶酶體酶結合之hTfR親和性肽尤其可用作溶素體貯積症中之中樞神經障礙治療劑。例如與α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)結合之hTfR親和性肽可用作賀勒氏症候群或賀勒-施艾氏症候群中之中樞神經障礙治療劑。再者，醫藥用途並不限於該等疾病。
另外，作為使其與hTfR親和性肽結合而可發揮藥效之蛋白質，可例舉：生長因子、抗體醫藥、細胞激素、神經生長因子(NGF)、腦源性神經生長因子(BDNF)、睫狀神經滋養因子(CNTF)、神經膠細胞株由來神經滋養因子(GDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1、紅血球生成素、達貝泊汀、活化素、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子α受體(TNF-αR)、PD-1配體、PD-L1、PD-L2、具有分解β-澱粉樣蛋白活性之酶、抗β-澱粉樣蛋白抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗HER2抗體、抗TNF-α抗體及抗CTLA-4抗體。
與神經生長因子(NGF)結合之hTfR親和性肽可用作阿茲海默症之神經疾病治療藥；與腦源性生長因子(BDNF)結合者可用作亨爾頓氏舞蹈病、阿茲海默症等之神經疾病治療藥；與CNTF結合者可用作肌萎縮性側索硬化症之治療劑；與GDNF、神經滋養素3或神經滋養素4/5結合者分別可用作腦缺血之治療劑；與GDNF結合者可用作帕金森氏症之治療劑；與神經調節蛋白1結合者可用作精神分裂症之治療劑；與紅血球生成素或達貝泊汀結合者分別可用作腦缺血之治療劑；與bFGF或FGF2結合者分別可用作外傷性中樞神經系統障礙之治療劑，用於腦外科手術、脊椎外科手術之術後恢復；與具有分解β-澱粉樣蛋白活性之酶、抗β-澱粉樣蛋白抗體或抗BACE抗體結合者分別可用作阿茲海默症之治療劑；與抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗HER2抗體或抗CTLA-4抗體結合者分別可用作包括腦瘤在內之中樞神經系統腫瘤之治療劑；與TNFαR結合者可用作腦缺血及腦炎症性疾病之治療劑。
針對阿茲海默症、帕金森氏症、亨爾頓氏舞蹈病等神經退化疾病、精神分裂症、抑鬱症等精神障礙、多發性硬化症、肌萎縮性側索硬化症、包括腦瘤在內之中樞神經系統腫瘤、伴有腦損傷之溶素體貯積症、糖原貯積症、肌肉萎縮症、腦缺血、腦炎症性疾病、Prion病、外傷性中樞神經系統障礙等疾病之治療劑基本上可以成為應與hTfR親和性肽融合之其他蛋白質(A)。又，針對病毒性及細菌性之中樞神經系統疾病之治療劑亦基本上可以成為應與hTfR親和性肽融合之其他蛋白質(A)。進而，可用於腦外科手術、脊椎外科手術之術後恢復之藥劑亦基本上可以成為應與hTfR親和性肽融合之其他蛋白質(A)。
再者，本發明中用作治療劑者亦包括用於預防疾病之發病者。
上述作為應與hTfR親和性肽結合之其他蛋白質(A)所例舉之蛋白質通常為野生型。其中，構成該等野生型蛋白質之胺基酸中之1個或複數個胺基酸被置換成其他胺基酸、出現缺失等之變異體只要具有蛋白質原本之生理活性，則亦包含於該等蛋白質之中。此處，所謂該蛋白質具有原本之生理活性，意指具有相對於該蛋白質之野生型蛋白質之生理活性而言為20%以上之生理活性。相對於該蛋白質之野生型蛋白質之生理活性而言之生理活性更佳為40%以上，進而較佳為50%以上，進而更佳為80%以上，再進而更佳為90%以上。
變異型蛋白質之胺基酸序列與對應之野生型其他蛋白質(A)之胺基酸序列較佳為具有80%以上之同一性，更佳為具有85%以上之同一性，進而較佳為具有90%以上之同一性，進而更佳為具有95%以上之同一性，例如具有98%以上之同一性。
於將野生型其他蛋白質(A)之胺基酸序列中之胺基酸置換成其他胺基酸而成為變異型之情形時，置換之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。於使胺基酸缺失之情形時，缺失之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。又，亦可將該等胺基酸之置換與缺失加以組合而成為所需變異型。進而於野生型其他蛋白質(A)或其變異體之胺基酸序列中、或於N末端或C末端附加1個或複數個胺基酸者只要完全或部分具有作為該等蛋白質之功能，亦包含於該等蛋白質之中。此時附加之胺基酸之個數較佳為1～10個，更佳為1～5個，進而較佳為1～3個。亦可將該等胺基酸之附加、置換及缺失加以組合而成為所需變異型。
再者，於使該等其他蛋白質(A)發生變異、並於C末端或N末端附加胺基酸之情形時，該附加之胺基酸於該等蛋白質與hTfR親和性肽融合後，位於該等蛋白質與hTfR親和性肽之間，於此情況下，將該附加之胺基酸視為構成其他蛋白質(A)之一部分者。
作為其他蛋白質(A)為人IDS之情形時較佳之融合蛋白質，可例舉以下之(1)至(3)： (1)於包含序列編號4、序列編號5或序列編號6之胺基酸序列之hTfR親和性肽之C末端經由包含序列編號25之胺基酸序列之肽連接子結合有hIDS之N末端的融合蛋白質； (2)於包含序列編號5之胺基酸序列之hTfR親和性肽2之C末端經由包含序列編號25之胺基酸序列之肽連接子結合有hIDS之N末端的融合蛋白質； (3)於包含序列編號5之胺基酸序列之hTfR親和性肽2之C末端經由包含序列編號25之胺基酸序列之肽連接子結合有包含序列編號5之胺基酸序列之hTfR親和性肽2之N末端，進而於其C末端經由包含胺基酸序列GS之肽連接子結合有hIDS之N末端的融合蛋白質。
作為其他蛋白質(A)為人SGSH之情形時較佳之融合蛋白質，可例舉以下者。即， (1)於包含序列編號4、序列編號5或序列編號6之胺基酸序列之hTfR親和性肽之C末端經由包含序列編號25之胺基酸序列之肽連接子結合有hSGSH之N末端的融合蛋白質； (2)於包含序列編號7之胺基酸序列之hTfR親和性肽2之C末端經由包含序列編號25之胺基酸序列之肽連接子結合有hSGSH之N末端的融合蛋白質。
曲妥珠單抗係藉由與由人類癌基因HER2/neu(c-erbB-2)編碼之HER2特異性結合而發揮抗腫瘤效果之抗體醫藥。曲妥珠單抗包含重鏈與輕鏈，各自之胺基酸序列分別以序列編號29與30表示。
作為本發明中之hTfR親和性肽與其他蛋白質(A)之融合蛋白質之具體形態之一例，可例舉：於曲妥珠單抗之重鏈之C末端經由連接子結合有hTfR親和性肽1的hTfR親和性肽與曲妥珠單抗之融合蛋白質。hTfR親和性肽1與曲妥珠單抗之融合蛋白質例如可藉由如下方式製造：將於曲妥珠單抗之重鏈之C末端經由包含序列編號24之胺基酸序列之肽連接子結合有包含序列編號4之胺基酸序列之hTfR親和性肽1的包含序列編號31之胺基酸序列之蛋白質(hTfR親和性肽1-曲妥珠單抗重鏈融合蛋白質)之表現載體、與曲妥珠單抗輕鏈之蛋白質之表現載體導入至宿主細胞，培養該細胞。使用包含序列編號32之胺基酸序列之hTfR親和性肽2-曲妥珠單抗重鏈融合蛋白質、包含序列編號33之胺基酸序列之hTfR親和性肽3-曲妥珠單抗重鏈融合蛋白質之表現載體代替hTfR親和性肽1-曲妥珠單抗重鏈融合蛋白質之表現載體，藉此亦可製造其他形態之hTfR親和性肽與曲妥珠單抗之融合蛋白質。
曲妥珠單抗主要用作乳癌之治療劑，於採用靜脈注射之情形時，由於無法通過BBB，故無法對中樞神經系統之癌症發揮藥效。但藉由將曲妥珠單抗與抗hTfR重鏈抗體可變區肽結合而使其能夠通過BBB，故亦可對中樞神經系統之表現HER2之癌症發揮作用。乳癌有時會向中樞神經系統轉移，因此，TfR親和性肽與曲妥珠單抗之融合蛋白質有望對該由乳癌轉移之中樞神經系統之癌症具有效果。
曲妥珠單抗以外之抗體醫藥亦可藉由與曲妥珠單抗相同之方式製成與抗hTfR重鏈抗體可變區肽之融合蛋白質。於該情形時，抗hTfR重鏈抗體可變區肽可結合於作為抗體醫藥有效成分之抗體之重鏈之C末端，亦可結合於抗體之重鏈之N末端，亦可結合於抗體之輕鏈之C末端，亦可結合於抗體之輕鏈之N末端。
應與hTfR親和性肽結合而製成藥物複合體之藥物亦可為低分子化合物。此處，低分子化合物較佳為應通過BBB而於中樞神經系統中發揮作用之化合物，但不限於此，亦可為造影劑、螢光色素、或可成為脂質體之構成成分之磷脂質、可成為脂質奈米粒之構成成分之功能性脂質等。低分子化合物之分子量例如1～50 kD、0.5～20 kD、1～5 kD。包含5～20個胺基酸之肽、由5～20個單糖類脫水縮合而成之結構之多糖類亦包含於低分子化合物之中。
hTfR親和性肽與低分子化合物直接或經由連接子以共價鍵之方式結合。只要保持hTfR親和性肽對hTfR之結合親和性、且向生物體內投予hTfR親和性肽-藥物複合體時該藥劑於中樞神經系統中發揮藥效，hTfR親和性肽與低分子化合物之結合樣式並無特別限定。作為連接子，例如宜採用會被組織蛋白酶B切斷之包含纈胺酸-瓜胺酸或纈胺酸-丙胺酸之連接子、或包含半胱胺酸-半胱胺酸之連接子。此種連接子於投予至生物體內時，藉由生物體內之代謝機制例如可被酶切斷，因此，低分子化合物自hTfR親和性肽分離，從而能夠單獨發揮藥效。本說明書中，此種於生物體內可被切斷之連接子稱為生物降解性連接子。
於藉由生物降解性連接子使hTfR親和性肽與低分子化合物結合之情形時，該等之間除連接子以外亦可配置間隔子。藉由配置間隔子，切斷連接子之酶向複合體之可接近性(accessibility)提高。作為此種間隔子，宜使用對胺基胺基甲酸酯基/胺基甲酸酯基，但並不特別限定於該等。
hTfR親和性肽-藥物複合體中之藥物亦可為核酸。此處，核酸可為單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA及雙鏈RNA之任意者。為了防止核酸被生物體內之核酸酶分解，亦可對構成該等核酸之核苷酸進行修飾而製成具有核酸酶抗性之核酸。核酸之鏈長並無特別限定，例如為10 bp～1000 bp、10 bp～100 bp。該複合體中，hTfR親和性肽與核酸係直接或經由連接子以共價鍵之方式結合。只要保持hTfR親和性肽對hTfR之結合親和性、且向生物體內投予hTfR親和性肽-核酸複合體時該藥劑於中樞神經系統中發揮藥效，則免疫球蛋白單可變域與低分子化合物之結合樣式並無特別限定。作為連接子，較佳為採用生物降解性連接子。
於藉由生物降解性連接子使hTfR親和性肽與核酸結合之情形時，該等之間除連接子以外亦可配置間隔子。藉由配置間隔子，切斷連接子之酵素向複合體之可接近性提高。作為此種間隔子，宜使用對胺基胺基甲酸酯基/胺基甲酸酯基，但並不特別限定於該等。
應與hTfR親和性肽結合之核酸例如為用於治療中樞神經系統疾病之核酸。作為該核酸，為針對中樞神經系統中表現異常亢進之mRNA之反義核酸。此種反義核酸具有與異常表現之mRNA結合而抑制其轉譯為蛋白質之效果。
hTfR親和性肽-藥物複合體(包括hTfR親和性肽-蛋白質(A)融合蛋白質)可以包含其作為有效成分之藥劑(醫藥組合物)之形式，以冷凍乾燥品或水性液劑等形態向醫療機構供給。水性液劑之情形時，可採用將預先使hTfR親和性肽-藥物複合體溶解於含有穩定劑、緩衝劑、等張劑之溶液所得者封入小瓶或注射器內而成之製劑的形式供給。封入注射器內之製劑一般稱為預填充式注射器製劑。藉由製成預填充式注射器製劑，能夠便於患者自行投予藥劑。藥劑之投予可藉由非經口方式例如靜脈注射而進行。投予之藥劑通過血腦障壁而可於中樞神經系統中顯示藥效，例如可於大腦皮質、小腦、海馬區、中腦、腦橋、延髓、尾狀核、殼核(putamen)、蒼白球(globus pallidus)、視丘及下丘腦顯示藥效，尤其可於大腦皮質、小腦、海馬區及中腦顯示藥效。
hTfR親和性肽可用於修飾能夠封入藥物之囊泡之表面。作為囊泡，例如可例舉：脂質體、脂質奈米粒(Lipid Nanoparticle；LNP)。所謂脂質體指具有脂質雙層之球狀囊泡，一般為包含磷脂質、尤其是磷脂醯膽鹼作為構成成分者。脂質體亦可為進而包含卵黃磷脂醯乙醇胺等其他脂質作為構成成分者。脂質奈米粒指以直徑10 nm至1000 nm典型而言約未達200 nm之脂質作為主要成分之粒子，可內包疏水性(親油性)分子，主要之構成成分為三酸甘油酯、二酸甘油酯、一酸甘油酯、脂肪酸、類固醇等具有生物相容性之脂質。可將藥物封入至該等囊泡內。製作結合有hTfR親和性肽與脂質奈米粒之構成成分者，於脂質奈米粒之製造過程中添加該所製得者，藉此可製造表面經hTfR親和性肽修飾之脂質奈米粒。關於脂質體亦同樣如此。
若於生物體內投予封入有藥物之囊泡，則構成囊泡之膜與細胞膜融合而向細胞內釋出藥物。即，該等囊泡可用作藥物之載體。若於此種囊泡之表面配置hTfR親和性肽，則囊泡經由該肽與構成血腦障壁之腦血管內皮細胞上之hTfR結合，藉由囊泡與腦血管內皮細胞之細胞膜融合、或藉由內噬作用等將囊泡吞入細胞內，而可使被封入囊泡內之藥物釋出至小腦之腦實質等腦實質內。
本說明書中提及之囊泡，除上述脂質體及脂質奈米粒以外，亦包括聚合物奈米粒子、微胞、乳液、奈米乳液、微球(microsphere)、奈米球(nanosphere)、微膠囊、奈米膠囊、樹枝狀聚合物、奈米凝膠、金屬奈米粒子、其他可用作藥物遞送系統(DDS)之所有奈米粒子、微粒子。 [實施例]
以下，參照實施例對本發明進行更詳細之說明，但並非意在將本發明限定於實施例。
[參考例1]hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)表現載體之製作 藉由參考例1～2所示之方法製作公知之hTfR親和性肽與曲妥珠單抗之融合蛋白質，用作參照品。該融合蛋白質包含與國際專利公開公報WO2023/090409中作為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5所揭示者相同之胺基酸序列。
利用MluI與NotI消化pCI-neo哺乳動物表現載體(pCI-neo Mammalian Expression Vector)(Promega公司)。人工合成於包含序列編號44表示之鹼基序列之基因之5'側具有MluI位點、3'側具有NotI位點之DNA片段，該序列編號44表示之鹼基序列編碼包含序列編號43表示之胺基酸序列之蛋白質，該序列編號43表示之胺基酸序列係於包含序列編號29表示之胺基酸序列之曲妥珠單抗重鏈之C末端經由包含序列編號24表示之胺基酸序列之肽連接子結合有序列編號42表示之hTfR親和性肽5者。利用MluI與NotI消化上述DNA片段，組入至pCI-neo哺乳動物表現載體之MluI位點與NotI位點之間，而製作由hTfR親和性肽5與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質之表現載體。將該表現載體命名為pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(5)。
又，人工合成於包含序列編號35表示之鹼基序列之基因之5'側具有MluI位點、3'側具有NotI位點之DNA片段，該序列編號35表示之鹼基序列編碼包含序列編號30表示之胺基酸序列之曲妥珠單抗之輕鏈，利用MluI與NotI消化上述DNA片段，使其與先前製備之經過MluI與NotI消化之pCI-neo哺乳動物表現載體(Promega公司)連接(ligate)，而構建曲妥珠單抗輕鏈之表現載體。將該表現載體命名為pCI-neo-Trastuzumab(LC)。
[參考例2]hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)之製作 使用ExpiCHO表現系統(ThermoFisher Scientific公司)，按照隨附之操作說明，將參考例1中製作之pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(5)與pCI-neo-Trastuzumab(LC)同時導入至CHO-S細胞，而使CHO-S細胞內共表現由hTfR親和性肽5與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質、及曲妥珠單抗輕鏈。該細胞表現由hTfR親和性肽5與曲妥珠單抗融合而成之蛋白質，並將其分泌至培養液中。以下，將此融合蛋白質命名為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5。按照隨附之操作說明，於新黴素之存在下培養該細胞。具體而言，以使濃度為6×10 6個/mL之方式將CHO-S細胞懸浮於15 mL培養基中，將其移入容積150 mL之錐形瓶內，於37℃下、包含5%CO 2與95%空氣之濕潤環境中，以約120 rpm之攪拌速度培養1天。添加ExpiCHO表現系統隨附之Feed補料液與Enhancer增強液，於32℃下、包含5%CO 2與95%空氣之濕潤環境中，以約120 rpm之攪拌速度培養9天，而使表現hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5。培養結束後，對培養液進行離心(3000×g，5分鐘)，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)過濾經分離所得之上清液，回收作為培養上清液。
向填充有1 mL之MabSelect SuRe LX(Cytiva公司)之開口管柱內通入體積為管柱體積5倍之含50 mM NaCl之25 mM HEPES緩衝液(pH值7.5)進行平衡化。繼而，將培養上清液負載於管柱上，使hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5與樹脂結合。通入體積為管柱體積5倍之含50 mM NaCl之25 mM HEPES緩衝液(pH值7.5)將管柱洗淨後，通入含100 mM NaCl之150 mM甘胺酸(pH值3.0)將hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5洗脫。於包含hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5之洗脫液中添加相當於5%量之1 M Tris-HCl(pH值8.0)將pH值調整為中性。使用PD-10柱(Cyteva公司)進行緩衝液交換，將溶劑置換成PBS(-)。將所獲得之溶液作為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗5之純品，用作hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)。
[實施例1]hTfR表現用載體之構建 以人脾臟Quick Clone cDNA(Clontech公司)為模板，使用引子hTfR5'(序列編號36)及引子hTfR3'(序列編號37)，利用PCR使編碼人類運鐵蛋白受體(hTfR)之基因片段擴增。利用MluI與NotI消化經過擴增之編碼hTfR之基因片段，插入至pCI-neo載體(Promega公司)之MluI與NotI之間。將所獲得之載體命名為pCI-neo(hTfR)。其次，利用MluI與NotI消化該載體，將編碼hTfR之基因片段切離，組入至國際公開公報(WO2012/063799)中記載之表現載體pE-mIRES-GS-puro之MluI與NotI之間，藉此構建作為hTfR表現用載體之pE-mIRES-GS-puro(hTfR)。
[實施例2]重組hTfR之製作 藉由電穿孔法於CHO-K1細胞中導入pE-mIRES-GS-puro(hTfR)後，使用包含蛋胺酸亞碸亞胺(MSX)及嘌呤黴素之CD OPTICHO TM培養基(Invitrogen公司)進行細胞之選擇培養，而獲得重組hTfR表現細胞。將該重組hTfR表現細胞進行培養而製備重組hTfR(rhTfR)。
[實施例3]噬菌體庫之製作 使用實施例2中製備之rhTfR作為抗原對羊駝進行免疫。採集經過免疫之羊駝之血液，自血液單離末梢血液淋巴細胞。自末梢血液淋巴細胞提取RNA，使其反轉錄而獲得cDNA。以獲得之cDNA為模板，藉由PCR法使包含編碼重鏈抗體之可變區之鹼基序列之DNA片段擴增。將經過擴增之DNA片段以包裝成噬菌體時重鏈抗體之可變區呈現於噬菌體表面之方式組入至噬菌粒，藉由電穿孔法將該噬菌粒導入至大腸桿菌。使導入有噬菌粒之大腸桿菌進而感染輔助噬菌體(M13K07)後，培養大腸桿菌，使噬菌體釋出至培養液中。培養結束後，對培養基進行離心，回收包含噬菌體之培養上清液。將該回收之包含噬菌體之培養上清液作為噬菌體庫。噬菌體庫之濃度為3.36×10 13PFU/mL。
[實施例4]抗hTfR重鏈抗體表現噬菌體株(phage clone)之單離 藉由生物淘選法，自實施例3中製作之噬菌體庫選殖表現與hTfR特異性結合的重鏈抗體之可變區的噬菌體(抗hTfR重鏈抗體表現噬菌體)。大體上藉由如下所示之方式實施選殖。於微量滴定板之各孔中添加實施例2中製作之包含rhTfR之溶液，使rhTfR固定於培養板。其次，將各孔用0.05%PBST溶液清洗3次後，於各孔中添加封閉劑將各孔封閉。其次，將各孔用0.05%PBST溶液清洗3次，於其中添加經封閉劑稀釋之噬菌體庫。將培養板靜置，使表面具有抗hTfR重鏈抗體之噬菌體與rhTfR結合。其次，將各孔用0.05%PBST溶液清洗5次，去除未與rhTfR結合之噬菌體。其次，添加酸性洗脫液使與rhTfR結合之噬菌體自rhTfR解離，而以溶液之形式回收。
稀釋所回收之溶液，添加至包含大腸桿菌之溶液中，而使噬菌體感染大腸桿菌。使被噬菌體感染之大腸桿菌進而感染輔助噬菌體(M13K07)後，培養大腸桿菌，使噬菌體釋出至培養液中。使用PEG溶液純化噬菌體。
使純化之噬菌體感染大腸桿菌後，接種於瓊脂培養基上。採集於培養基上形成單菌落之大腸桿菌，進而於培養基中培養後，使其感染輔助噬菌體(M13K07)，使噬菌體釋出至培養液中。將釋出至培養液中之噬菌體作為抗hTfR重鏈抗體表現噬菌體株，分別回收至對培養液進行離心分離所得之培養上清液中。使用PEG溶液純化培養上清液中所含之各噬菌體株。
[實施例5]各抗hTfR重鏈抗體表現噬菌體株表現之抗hTfR重鏈抗體之可變區之胺基酸序列之確定 自實施例4所單離之抗hTfR重鏈抗體表現噬菌體之中選擇兩株，分別命名為株1及2。由各株純化噬菌粒，確定純化之各噬菌粒所編碼之抗hTfR重鏈抗體之可變區之鹼基序列，基於此確定各株表現之抗hTfR重鏈抗體之可變區之胺基酸序列。此處，將具有株1之抗hTfR重鏈抗體之可變區的肽命名為hTFR親和性肽1，又，將具有株2之抗hTfR重鏈抗體之可變區的肽命名為hTFR親和性肽3。又，關於hTFR親和性肽1，將包含其人源化胺基酸序列者命名為hTFR親和性肽2。hTFR親和性肽1～3之胺基酸序列示於表1。
[表1]
表1 hTFR親和性肽1～3之胺基酸序列
hTFR親和性肽 胺基酸序列
1 序列編號4
2 序列編號5
3 序列編號6
hTfR親和性肽1～3分別含有CDR1～3。再者，hTfR親和性肽1與hTfR親和性肽2之CDR之胺基酸序列相同。於表2中例示各CDR之胺基酸序列。
[表2]
表2 hTfR親和性肽1～3之CDR1～3所含之 胺基酸序列之序列編號(各CDR之胺基酸序列之例示)
名稱 胺基酸序列
CDR1 CDR2 CDR3
hTfR親和性肽1 7、8 9、10 11、12
hTfR親和性肽2 7、8 9、10 11、12
hTfR親和性肽3 13、14 15、16 17、18
[實施例6]hTfR親和性肽1及3之製作 人工合成包含編碼於N末端附加有序列編號41表示之肽標籤之hTfR親和性肽1的基因之DNA片段，將其組入至pCI-neo哺乳動物表現載體(Promega公司)之MluI位點與NotI位點之間，而製成hTfR親和性肽1表現載體。使用ExpiCHO表現系統(ThermoFisher Scientific公司)，按照隨附之操作說明，將該表現載體導入至CHO-S細胞，而使CHO-S細胞內表現hTfR親和性肽1。該細胞表現hTfR親和性肽1，並將其分泌至培養液中。按照隨附之操作說明，於新黴素之存在下培養該細胞。具體而言，以使濃度為6×10 6個/mL之方式將CHO-S細胞懸浮於15 mL培養基中，將其移入容積150 mL之錐形瓶內，於37℃下、包含5%CO 2與95%空氣之濕潤環境中，以約120 rpm之攪拌速度培養1天。添加ExpiCHO表現系統隨附之Feed補料液與Enhancer增強液，於32℃下、包含5%CO 2與95%空氣之濕潤環境中，以約120 rpm之攪拌速度培養9天，而使表現hTfR親和性肽1。培養結束後，對培養液進行離心(3000×g，5分鐘)，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)過濾經分離所得之上清液，回收作為培養上清液。藉由以下之方法自所回收之培養上清液中純化hTfR親和性肽1而獲得純品。
向Anti-FLAG M1瓊脂糖親和凝膠柱(Sigmα-Aldrich)內通入體積為管柱體積5倍之含150 mM NaCl與1 mM CaCl 2之50 mM Tris-HCl緩衝液(pH值7.5)作為平衡化溶液。其次，將培養上清液負載於管柱上，使hTfR親和性肽1吸附於親和柱。其次，用體積為管柱體積5倍之平衡化溶液將管柱洗淨。向柱內通入洗脫液(含150 mM NaCl之50 mM Tris-HCl緩衝液(pH值7.5))將hTfR親和性肽1洗脫。將洗脫之hTfR親和性肽1作為純品用於後續實驗中。關於hTfR親和性肽3，亦藉由與hTfR親和性肽1相同之方式獲得純品。
[實施例7]hTfR親和性肽1及3對人類TfR、猴TfR及小鼠TfR之結合活性之評估 hTfR親和性肽1及3對人類TfR(hTfR)、猴TfR及小鼠TfR之結合活性之測定係使用應用生物膜干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)之生物分子相互作用解析系統OctetRED96(Pall Corporation之子公司ForteBio)實施。簡單說明生物膜干涉法之基本原理。對固定於感測器晶片表面之生物分子之層(layer)投射特定波長之光時，自生物分子之層與作為內部參照之層該兩個表面反射光，而產生光之干涉波。藉由使測定試樣中之分子結合於感測器晶片表面之生物分子，感測器前端之層之厚度增加，干涉波出現波長位移。藉由測定該波長位移之變化，可即時進行固定於感測器晶片表面之生物分子所結合之分子數之定量及動力學解析。測定基本上按照OctetRED96隨附之操作指南實。作為人類TfR，使用N末端附加有組胺酸標籤之包含序列編號1表示之胺基酸序列中之自N末端第89位半胱胺酸殘基至C末端之苯丙胺酸即hTfR之胞外區之胺基酸序列的重組hTfR(rhTfR，Sino Biological公司)。作為猴TfR，使用N末端附加有組胺酸標籤之包含序列編號2表示之胺基酸序列中之自N末端第89位半胱胺酸殘基至C末端之苯丙胺酸即食蟹獼猴之TfR之胞外區之胺基酸序列的重組猴TfR(r猴TfR，Sino Biological公司)。作為小鼠TfR，使用N末端附加有組胺酸標籤之包含序列編號3表示之胺基酸序列中之自N末端第89位半胱胺酸殘基至C末端之苯丙胺酸即小鼠TfR之胞外區之胺基酸序列的重組小鼠TfR(r小鼠TfR)。
將實施例6中獲得之hTfR親和性肽1及3之純品分別利用HBS-P+(含150 mM NaCl、1%BSA、50 μM EDTA及0.05%界面活性劑P20之10 mM HEPES)進行稀釋，製備10～40 nM之三個階段濃度之溶液。將該溶液作為樣品溶液。將rhTfR、r猴TfR及r小鼠TfR分別利用HBS-P+進行稀釋，製備15 μg/mL之溶液，分別作為hTfR-ECD(Histag)溶液、猴TfR-ECD(Histag)溶液及小鼠TfR-ECD(Histag)。
將上述樣品溶液以200 μL/孔分注至黑色96孔板(greiner bio-one公司)。又，將上述製備之hTfR-ECD(Histag)溶液、猴TfR-ECD(Histag)溶液及小鼠TfR-ECD(Histag)分別以200 μL/孔分注至特定孔中。於基準線、解離用及清洗用之孔中分別以200 μL/孔分注HBS-P+。於再生用孔中以200 μL/孔分注10 mM 甘胺酸-HCl(pH值1.7)。於活化用孔中以200 μL/孔分注含1%BSA之0.5 mM NiCl 2溶液。將該培養板與生物感測器(Biosensor/Ni-NTA：Pall Corporation之子公司ForteBio)設置於OctetRED96之特定位置。
使OctetRED96於下述表3所示之條件下工作而取得資料後，應用OctetRED96隨附之解析軟體，將結合反應曲線擬合至1:1結合模型或2:1結合模型，測定各hTfR親和性肽與hTfR、猴TfR及小鼠TfR之會合速率常數(kon)及解離速率常數(koff)，算出解離常數(K D)。再者，於25～30℃之溫度下實施測定。
[表3]
表3 OctetRED96之工作條件
步驟 接觸時間(sec) 速度(rpm) 閾值
1 再生 5 1000 -
2 清洗 5 1000 -
反覆實施6次上述1～2之步驟。
3 活化 60 1000 1.0
4 基準線1 120 1000 -
5 負載 600 1000 -
6 基準線2 150 1000 -
7 會合 120 1000 -
8 解離 200 1000 -
反覆實施1～8之步驟直至全部樣品測定結束。
將hTfR親和性肽1及3對hTfR、猴TfR及小鼠TfR之解離常數(K D)示於表4。其結果，hTfR親和性肽1對hTfR、猴TfR及小鼠TfR之K D值經測定分別為9.32×10 -10M、8.24×10 -9M及5.31×10 -9M。又，hTfR親和性肽3對hTfR、猴TfR及小鼠TfR之K D值經測定分別為4.40×10 -9M、1.74×10 -8M及5.75×10 -9M。該等結果表明，各hTfR親和性肽與hTfR之K D值約為1.0×10 -9M～1.0×10 -8M，與猴TfR之K D值約為5.0×10 -9M～5.0×10 -8M，與小鼠TfR之K D值約為1.0×10 -9M～1.0×10 -8M。
[表4]
表4 hTfR親和性肽1及3對hTfR、猴TfR及小鼠TfR之親和性(K D值)
名稱 人類 猴 小鼠
hTfR親和性肽1 9.32×10 -10 8.24×10 -9 5.31×10 -9
hTfR親和性肽3 4.40×10 -9 1.74×10 -8 5.75×10 - 9
根據上述結果，算出將各hTfR親和性肽與hTfR之解離常數之值設為1時與猴TfR及小鼠TfR之解離常數之相對值(表5)。各hTfR親和性肽對猴TfR及小鼠TfR之親和性之相對值均處於1.0～10.0之範圍。該等結果表明，對hTfR之親和性分別近似於對猴TfR及小鼠TfR之親和性。因此，當然可預測該等hTfR親和性肽對猴或小鼠投予時之生物體內之藥物代謝動力極近似於對人類投予時之藥物代謝動力，故於應用該等開發醫藥之情形時，可使用猴或小鼠、或該兩者來實施該醫藥之藥物代謝動力試驗等一部分非臨床試驗，從而能夠顯著促進該醫藥之開發。
[表5]
表5 hTfR親和性肽1及3對猴TfR及小鼠TfR之親和性之相對值
名稱 相對值
猴 小鼠
hTfR親和性肽1 8.84 5.70
hTfR親和性肽3 3.95 1.31
[實施例8]hTfR親和性肽-曲妥珠單抗表現載體之製作 利用MluI與NotI消化pCI-neo哺乳動物表現載體(Promega公司)。人工合成於包含序列編號34表示之鹼基序列之基因之5'側具有MluI位點、3'側具有NotI位點之DNA片段，該序列編號34表示之鹼基序列編碼包含序列編號31表示之胺基酸序列之蛋白質，該序列編號31表示之胺基酸序列係於包含序列編號29表示之胺基酸序列之曲妥珠單抗重鏈之C末端經由包含序列編號24表示之胺基酸序列之肽連接子結合有hTfR親和性肽1者。利用MluI與NotI消化上述DNA片段，組入至pCI-neo哺乳動物表現載體之MluI位點與NotI位點之間，而製作由hTfR親和性肽1與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質之表現載體。將該表現載體命名為pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(1)。同樣地，對於hTfR親和性肽2，亦分別人工合成包含編碼由該等與曲妥珠單抗重鏈結合而成之各蛋白質之基因的DNA片段。利用MluI與NotI消化該等DNA片段，分別組入至pCI-neo哺乳動物表現載體之MluI位點與NotI位點之間，而製作由hTfR親和性肽2與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質之表現載體。將所製作之表現載體分別命名為pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(2)。同樣地，對於hTfR親和性肽3，亦分別人工合成包含編碼由該等與曲妥珠單抗重鏈結合而成之各蛋白質之基因的DNA片段。利用MluI與NotI消化該等DNA片段，分別組入至pCI-neo哺乳動物表現載體之MluI位點與NotI位點之間，而製作由hTfR親和性肽3與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質之表現載體。將所製作之表現載體分別命名為pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(3)。
又，人工合成於包含序列編號35表示之鹼基序列之基因之5'側具有MluI位點、3'側具有NotI位點之DNA片段，該序列編號35表示之鹼基序列編碼包含序列編號30表示之胺基酸序列之曲妥珠單抗之輕鏈，利用MluI與NotI消化上述DNA片段，使其與先前製備之經過MluI與NotI消化之pCI-neo哺乳動物表現載體(Promega公司)連接(ligate)，而構建曲妥珠單抗輕鏈之表現載體。將該表現載體命名為pCI-neo-Trastuzumab(LC)。
[實施例9]hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之製作 使用ExpiCHO表現系統(ThermoFisher Scientific公司)，按照隨附之操作說明，將實施例8中製作之pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(1)與pCI-neo-Trastuzumab(LC)同時導入至CHO-S細胞，而使CHO-S細胞內共表現由hTfR親和性肽1與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質、及曲妥珠單抗輕鏈。該細胞表現由hTfR親和性肽與曲妥珠單抗融合而成之蛋白質，並將其分泌至培養液中。以下，將此融合蛋白質命名為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1。按照隨附之操作說明，於新黴素之存在下培養該細胞。具體而言，以使濃度為6×10 6個/mL之方式將CHO-S細胞懸浮於15 mL培養基中，將其移入容積150 mL之錐形瓶內，於37℃下、包含5%CO 2與95%空氣之濕潤環境中，以約120 rpm之攪拌速度培養1天。添加ExpiCHO表現系統隨附之Feed補料液與Enhancer增強液，於32℃下、包含5%CO 2與95%空氣之濕潤環境中，以約120 rpm之攪拌速度培養9天，而使表現hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1。培養結束後，對培養液進行離心(3000×g，5分鐘)，利用0.22 μm過濾器(Millipore公司)過濾經分離所得之上清液，回收作為培養上清液。
向填充有1 mL之MabSelect SuRe LX(Cytiva公司)之開口管柱內通入體積為管柱體積5倍之含50 mM NaCl之25 mM HEPES緩衝液(pH值7.5)進行平衡化。繼而，將培養上清液負載於管柱上，使hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1與樹脂結合。通入體積為管柱體積5倍之含50 mM NaCl之25 mM HEPES緩衝液(pH值7.5)將管柱洗淨後，通入含100 mM NaCl之150 mM甘胺酸(pH值3.0)將hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1洗脫。於包含hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1之洗脫液中添加相當於5%量之1 M Tris-HCl(pH值8.0)將pH值調整為中性。使用PD-10柱(Cyteva公司)進行緩衝液交換，將溶劑置換成PBS(-)。將所獲得之溶液作為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1之純品用於後續實驗中。
對於pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(2)，亦與pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(1)同樣地，將其與pCI-neo-Trastuzumab(LC)同時導入至CHO-S細胞，而於CHO-S細胞內共表現由hTfR親和性肽2與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質、及曲妥珠單抗輕鏈。該細胞表現由hTfR親和性肽2與曲妥珠單抗融合而成之蛋白質，並將其分泌至培養液中。以下，將該細胞表現之融合蛋白質命名為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2。對於hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2，亦與hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1同樣地獲得純品。又，對於pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(3)，亦與pCI-neo-Trastuzumab(HC)-VHH(1)同樣地，將其與pCI-neo-Trastuzumab(LC)同時導入至CHO-S細胞，而於CHO-S細胞內共表現由hTfR親和性肽3與曲妥珠單抗重鏈結合而成之蛋白質、及曲妥珠單抗輕鏈。該細胞表現由hTfR親和性肽3與曲妥珠單抗融合而成之蛋白質，並將其分泌至培養液中。以下，將該細胞表現之融合蛋白質命名為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3。對於hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3，亦與hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1同樣地獲得純品。將hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1、2及3統稱為hTfR親和性肽-曲妥珠單抗。
[實施例10]hTfR親和性肽-曲妥珠單抗對小鼠TfR及hTfR之結合活性之評估 依據實施例7中記載之方法，測定實施例9中製作之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3對小鼠TfR之親和性。其結果，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3對小鼠TfR之親和性即解離常數(K D)經測定分別為4.03×10 -10M及3.44×10 -10M。該等結果表明，於hTfR親和性肽1及3之N末端融合有其他蛋白質之融合蛋白質均維持對小鼠TfR之親和性。又，依據實施例7中記載之方法，測定實施例9中製作之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2及3對hTfR之親和性。其結果，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2及3對hTfR之親和性即解離常數(K D)經測定分別為1.55×10 -10M及2.28×10 -10M。該等結果表明，於hTfR親和性肽2及3之N末端融合有其他蛋白質之融合蛋白質均維持對hTfR之親和性。
[實施例11]使用野生型小鼠之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之腦轉移性評估 其次，使用野生型小鼠(WT小鼠)來評估hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3於分別將其靜脈注射時能否通過BBB並轉移至腦內。
於各2隻雄性WT小鼠分別以5 mg/kg靜脈內投予實施例9中獲得之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3之純品。又，作為陰性對照，於2隻雄性WT小鼠以5 mg/kg靜脈內投予曲妥珠單抗。又，於各2隻雄性hTfR-KI小鼠分別以5 mg/kg靜脈內投予參考例2中製作之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)。投予6小時後使小鼠安樂死，採集末梢血液後，用生理鹽水進行全身灌流，採集腦(包括大腦與小腦之部分)。測定所摘取之腦之重量(濕重量)後，沿矢狀面進行切分，一部分用於組織中之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之濃度測定，另一部分用於免疫組織染色。
將濃度測定用腦組織於包含蛋白酶抑制劑混合物(Protease Inhibitor Cocktail)(Sigma-Aldrich公司)之T-PER(ThermoFisher Scientific公司)中勻漿化。對所獲得之勻漿進行離心(3000×g，5 min)，回收上清液。藉由以下之方法測定勻漿上清液中所含之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗、及曲妥珠單抗之量。首先，將SULFO-山羊抗人IgG(h+l)(Bethyl公司)(0.5 μg/mL)與山羊抗人Kappa輕鏈-生物素(IBL)(0.5 μg/mL)等量混合，以每孔25 μL分注至取樣培養板(BM6025測試培養板96孔、V底、大孔徑(wide well)，BM Equipment Co.,Ltd.)，使用微板混合機於室溫下振盪1小時而製成反應溶液。於金標記鏈黴親和素包被板(Streptavidin Gold plate)(Meso Scale Diagnostics公司)中以每孔150 μL添加SuperBlock(PBS)封閉緩衝液(SuperBlock blocking buffer in PBS)(37515，Thermo Scientific公司)，使用微板混合機於室溫下振盪1小時而將培養板封閉。用PBST洗淨後，每孔添加25 μL反應溶液，使用微板混合機於室溫下振盪1小時。繼而，於各孔中分別添加150 μL讀數緩衝液T(Read buffer T)(Meso Scale Diagnostics公司)，使用Sector TMImager 6000讀取儀測定各孔之發光量。根據已知濃度之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之標準試樣之測定值製作校準曲線，於其中內插各樣本之測定值，藉此算出腦每公克重量(濕重量)所含之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之量(腦組織中之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之濃度)。將其結果示於圖1。相較於曲妥珠單抗，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3於腦組織中之濃度分別為約26倍及約21倍。又，相較於hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)， hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3於腦組織中之濃度亦分別約為2.0倍及約1.6倍。該等結果表明，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3具有顯著之通過BBB並蓄積至腦組織中之性質。
腦組織中之hTfR親和性肽之免疫組織化學染色大體上按照如下程序進行。將所採集之用於免疫組織染色之腦組織浸漬於OCT複合物(Sakura Finetek Japan股份有限公司)中，使用Histo-Tek PINO(Sakura Finetek Japan股份有限公司)急速冷卻至-80℃，製作組織之冷凍塊。將該冷凍塊切成4 μm薄片後，貼附於MAS包被載玻片(松浪硝子股份有限公司)。將載玻片於4℃之4%多聚甲醛(和光純藥工業股份有限公司)中浸漬5分鐘使標本固定。繼而，將載玻片浸漬於包含1%BSA之PBS中進行封閉。繼而，對組織薄片滴加經適當稀釋之山羊抗hIgG-重鏈及輕鏈抗體(heavy and light chain Antibody)(Bethyl Laboratories公司)，反應1小時。繼而，對組織薄片滴加TSA-Plus螢光套組(PerkinElmer公司)所含之螢光素訊號放大用溶液(Fluorescein Amplification Working Solution)，遮光反應15分鐘。繼而，對組織薄片滴加CSA II無生物素酪醯胺訊號放大系統(CSA II Biotin-Free Tyramide Signal Amplification System)(Dako公司)所含之抗螢光素-HRP，反應15分鐘。繼而，使組織薄片與DAB受質(3,3'-二胺基聯苯胺，Vector Laboratories公司)反應而顯色。其次，使用Mayer蘇木精(Mayer's hematoxylin)(Merck公司)進行對比染色，脫水透明後封片，利用光學顯微鏡觀察。
圖2係投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗6小時後採集之組織之染色圖像。作為陰性對照之投予曲妥珠單抗之小鼠之小腦組織中未觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗未到達小腦之腦實質，且幾乎無背景染色(圖2(a))。另一方面，投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1之小鼠之小腦組織中於腦實質觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗1到達小腦之腦實質(圖2(b))。投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3之小鼠之小腦組織中亦於腦實質觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗3亦到達小腦之腦實質(圖2(c))。投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)之小鼠之小腦組織中亦於腦實質觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗(參照品)亦到達小腦之腦實質(圖2(d))。此處，若將投予曲妥珠單抗1及3任一者之小鼠之小腦組織之染色強度與投予曲妥珠單抗(參照品)之小鼠進行比較，可容易地確認投予曲妥珠單抗1及3任一者之小腦組織之染色強度明顯較高。該等結果表明，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1及3通過BBB並顯著到達小腦之腦實質。
[實施例12]使用hTfR敲入小鼠之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之腦轉移性評估1 可使用將編碼小鼠運鐵蛋白受體之胞外區之基因置換成編碼人類運鐵蛋白受體之胞外區之基因的hTfR敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，評估hTfR親和性肽-曲妥珠單抗於將其靜脈注射時能否經由與hTfR之結合而通過BBB並轉移至腦內。hTfR-KI小鼠大體上可藉由下述方法製作。
化學合成包含序列編號38表示之鹼基序列之DNA片段，該DNA片段係於編碼胞內區為小鼠TfR之胺基酸序列、胞外區為人類TfR之胺基酸序列之嵌合hTfR的cDNA之3'側配置有被loxP序列夾住之新黴素抗性基因者。藉由常規方法將該DNA片段組入至包含序列編號39表示之鹼基序列作為5'臂序列、包含序列編號40表示之鹼基序列作為3'臂序列之打靶載體，藉由電穿孔法將其導入至小鼠ES細胞。將基因導入後之小鼠ES細胞於新黴素之存在下進行選擇培養，選擇經過同源重組將打靶載體插入至染色體中之小鼠ES細胞。將所獲得之基因重組小鼠ES細胞注入至ICR小鼠之8細胞期胚胎(宿主胚胎)，移植至藉由與施以輸精管結紮之小鼠進行交配獲得之假孕小鼠(受體(recipient)小鼠)體內。對所產鼠仔(嵌合小鼠)進行毛色判定，分選ES細胞高效率參與生物體形成之個體，即，白色毛髮相對於整體毛髮所占之比率較高之個體。使該嵌合小鼠個體與ICR小鼠交配而得到F1小鼠。分選白色F1小鼠，對自尾部組織提取之DNA進行解析，將染色體上之小鼠運鐵蛋白受體基因被置換成嵌合hTfR之小鼠命名為hTfR-KI小鼠。
依據實施例11記載之方法，於hTfR-KI小鼠靜脈內投予實施例9中獲得之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之純品。其後，依據實施例11及實施例12記載之方法，對取自hTfR-KI小鼠之各組織進行評估，藉此可評估hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之純品是否向腦轉移。
[實施例13]使用食蟹獼猴之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之腦轉移性評估 可使用食蟹獼猴來評估hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之腦轉移性。於各1隻雄性食蟹獼猴(Macaca fascicularis)靜脈內以5 mg/kg單次投予實施例9中獲得之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之純品、曲妥珠單抗。又，作為對照組，於1隻雄性食蟹獼猴靜脈內投予同體積之生理鹽水。投予20分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時後採集末梢血液，藉由實施例11記載之方法測定末梢血液中所含之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗、及曲妥珠單抗之濃度，根據其測定值算出Cmax(μg/mL)、AUC0-8hr(μg/hr/mL)及t1/2β(hr)。
投予8小時後，使用生理鹽水對食蟹獼猴猴實施全身灌流。灌流後，摘取包括延髓之腦組織及各種臟器。藉由實施例11記載之方法測定該摘取之腦組織及各種臟器中所含之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗、及曲妥珠單抗之濃度。
對於腦組織，將其分解成大腦皮質、小腦、海馬區、中腦、腦橋、延髓、尾狀核、殼核、蒼白球、視丘、下丘腦、頸髓、胸髓及腰髓，分別進行測定。又，對於各種臟器，採集視網膜、肝臟、腎臟、心臟(左心室)、心臟(主動脈瓣)、肺、骨髓、脾臟、胸腺、睾丸、前列腺、股直肌、EDL、比目魚肌、三頭肌及橫膈膜，分別進行測定。
[實施例14]使用hTfR敲入小鼠之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗之腦轉移性評估2 使用將編碼小鼠運鐵蛋白受體之胞外區之基因置換成編碼人類運鐵蛋白受體之胞外區之基因的hTfR敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，評估hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2及3於分別將其靜脈注射時能否通過BBB並轉移至腦內。
於各2～3隻雄性hTfR-KI小鼠(20～26週齡)分別以5 mg/kg靜脈內投予實施例9中獲得之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2及3之純品。又，作為陰性對照，於2隻雄性野生型小鼠(WT小鼠)以5 mg/kg靜脈內投予曲妥珠單抗。投予6小時後使全部小鼠安樂死，採集末梢血液後，用生理鹽水進行全身灌流，採集腦(包括大腦與小腦之部分)。測定所摘取之腦之重量(濕重量)後，沿矢狀面進行切分，一部分用於組織中之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2及3之濃度測定，另一部分用於免疫組織染色。
將濃度測定用腦組織於包含蛋白酶抑制劑混合物(Sigmα-Aldrich公司)之T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)中勻漿化。對所獲得之勻漿進行離心(3000×g，5 min)，回收上清液。藉由以下之方法測定勻漿上清液中所含之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2或3、或者曲妥珠單抗之量。首先，將SULFO-山羊抗人IgG(h+l)(Bethyl公司)(0.5 μg/mL)與山羊抗人Kappa輕鏈-生物素(IBL)(0.5 μg/mL)等量混合，以每孔25 μL分注至取樣培養板(BM6025測試培養板96孔、V底、大孔徑，BM Equipment Co.,Ltd.)，使用微板混合機於室溫下振盪1小時而製成反應溶液。於金標記鏈黴親和素包被板(Meso Scale Diagnostics公司)中以每孔150 μL添加SuperBlock(PBS)封閉緩衝液(37515，Thermo Scientific公司)，使用微板混合機於室溫下振盪1小時而將培養板封閉。用PBST洗淨後，每孔添加25 μL反應溶液，使用微板混合機於室溫下振盪1小時。繼而，於各孔中分別添加150 μL讀數緩衝液T(Meso Scale Diagnostics公司)，使用Sector TMImager 6000讀取儀測定各孔之發光量。根據已知濃度之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2或3、或者曲妥珠單抗之標準試樣之測定值製作校準曲線，於其中內插各樣本之測定值，藉此算出腦每公克重量(濕重量)中所含之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2或3、或者曲妥珠單抗之量(腦組織中之hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2或3、或者曲妥珠單抗之濃度)。將其結果示於圖3。相較於曲妥珠單抗，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2及3於腦組織中之濃度分別為約16倍及約15倍。該等結果表明，hTfR親和性肽-曲妥珠單抗具有通過BBB並蓄積至腦組織中之性質。
其次，大體上按照如下程序進行腦組織中之hTfR親和性肽之免疫組織化學染色。將所採集之用於免疫組織染色之腦組織浸漬於OCT複合物(Sakura Finetek Japan股份有限公司)中，使用Histo-Tek PINO(Sakura Finetek Japan股份有限公司)急速冷卻至-80℃，製作組織之冷凍塊。將該冷凍塊切成4 μm薄片後，貼附於MAS包被載玻片(松浪硝子股份有限公司)。將載玻片於4℃之4%多聚甲醛(和光純藥工業股份有限公司)中浸漬5分鐘使標本固定。繼而，將載玻片浸漬於包含1%BSA之PBS中進行封閉。繼而，對組織薄片滴加經適當稀釋之山羊抗hIgG-重鏈及輕鏈抗體(Bethyl Laboratories公司)，反應1小時。繼而，對組織薄片滴加TSA-Plus螢光套組(PerkinElmer公司)所含之螢光素訊號放大用溶液，遮光反應15分鐘。繼而，對組織薄片滴加CSA II無生物素酪醯胺訊號放大系統(Dako公司)所含之抗螢光素-HRP，反應15分鐘。繼而，使組織薄片與DAB受質(3,3'-二胺基聯苯胺，Vector Laboratories公司)反應而顯色。其次，使用Mayer蘇木精(Merck公司)進行對比染色，脫水透明後封片，利用光學顯微鏡觀察。
將投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2或3、或者曲妥珠單抗6小時後採集之組織之染色圖像示於圖4。作為陰性對照之投予曲妥珠單抗之小鼠之小腦組織中未觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗未到達小腦之腦實質，且幾乎無背景染色(圖4(a))。另一方面，投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2之小鼠之小腦組織中於腦實質觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗1到達小腦之腦實質(圖4(b))。投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3之小鼠之小腦組織中亦於腦實質觀察到染色，表明靜脈注射之曲妥珠單抗3亦到達小腦之腦實質(圖4(c))。 [產業上之可利用性]
根據本發明之一實施方式，可提供一種由人類運鐵蛋白受體親和性肽與藥理活性物質結合而成之能夠通過血腦障壁而於中樞神經系統中發揮作用之藥劑。
1:血管 2:腦實質 [序列表非關鍵文字]
序列編號1：人類運鐵蛋白受體之胺基酸序列 序列編號2：食蟹獼猴運鐵蛋白受體之胺基酸序列 序列編號3：小鼠運鐵蛋白受體之胺基酸序列 序列編號4：hTfR親和性肽1之胺基酸序列 序列編號5：hTfR親和性肽2之胺基酸序列 序列編號6：hTfR親和性肽3之胺基酸序列 序列編號7：hTfR親和性肽1及2之CDR1之胺基酸序列1 序列編號8：hTfR親和性肽1及2之CDR1之胺基酸序列2 序列編號9：hTfR親和性肽1及2之CDR2之胺基酸序列1 序列編號10：hTfR親和性肽1及2之CDR2之胺基酸序列2 序列編號11：hTfR親和性肽1及2之CDR3之胺基酸序列1 序列編號12：hTfR親和性肽1及2之CDR3之胺基酸序列2 序列編號13：hTfR親和性肽3之CDR1之胺基酸序列1 序列編號14：hTfR親和性肽3之CDR1之胺基酸序列2 序列編號15：hTfR親和性肽3之CDR2之胺基酸序列1 序列編號16：hTfR親和性肽3之CDR2之胺基酸序列2 序列編號17：hTfR親和性肽3之CDR3之胺基酸序列1 序列編號18：hTfR親和性肽3之CDR3之胺基酸序列2 序列編號19：肽連接子1之胺基酸序列 序列編號20：肽連接子2之胺基酸序列 序列編號21：肽連接子3之胺基酸序列 序列編號22：肽連接子4之胺基酸序列 序列編號23：肽連接子5之胺基酸序列 序列編號24：肽連接子6之胺基酸序列 序列編號25：肽連接子7之胺基酸序列 序列編號26：人IgG之Fc區之胺基酸序列之一例 序列編號27：人類血清白蛋白之胺基酸序列 序列編號28：源於鏈球菌菌株G418之蛋白質之白蛋白結合域 序列編號29：曲妥珠單抗之重鏈之胺基酸序列 序列編號30：曲妥珠單抗之輕鏈之胺基酸序列 序列編號31：hTfR親和性肽1與曲妥珠單抗之重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號32：hTfR親和性肽2與曲妥珠單抗之重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號33：hTfR親和性肽3與曲妥珠單抗之重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號34：編碼hTfR親和性肽1與曲妥珠單抗之重鏈之融合蛋白質的DNA之鹼基序列、合成序列 序列編號35：編碼曲妥珠單抗之輕鏈的DNA之鹼基序列、合成序列 序列編號36：引子hTfR5'之鹼基序列、合成序列 序列編號37：引子hTfR3'之鹼基序列、合成序列 序列編號38：於編碼嵌合hTfR之cDNA之3'側配置有被loxP序列夾住之新黴素抗性基因的DNA之鹼基序列、合成序列 序列編號39：打靶載體之5'臂之鹼基序列、合成序列 序列編號40：打靶載體之3'臂之鹼基序列、合成序列 序列編號41：肽標籤 序列編號42：hTfR親和性肽5之胺基酸序列 序列編號43：hTFR親和性肽5與曲妥珠單抗之重鏈之融合蛋白質之胺基酸序列 序列編號44：編碼hTFR親和性肽5與曲妥珠單抗之重鏈之融合蛋白質的DNA之鹼基序列、合成序列
圖1係表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗及投予曲妥珠單抗6小時後之野生型小鼠之小腦中所含之該等物質之定量值的圖。(1)表示曲妥珠單抗之定量值，(2)表示hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1之定量值，(3)表示hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3之定量值，(4)表示hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)之定量值。縱軸表示每單位濕重量(g)所含之該等物質之量(μg)。 圖2係表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗6小時後之野生型小鼠之小腦之針對抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果的圖示代用照片。(a)表示投予曲妥珠單抗者，(b)表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗1者，(c)表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3者，(d)表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗(參照品)者。各照片係以倍率40X拍攝者。 圖3係表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗及投予曲妥珠單抗6小時後之hTfR敲入小鼠之小腦中所含之該等物質之定量值的圖。(1)表示曲妥珠單抗之定量值，(2)表示hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2之定量值，(3)表示hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3之定量值。縱軸表示每單位濕重量(g)所含之該等物質之量(μg)。 圖4係表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗6小時後之hTfR敲入小鼠之小腦之針對抗hTfR抗體之免疫組織化學染色之結果的圖示代用照片。(a)表示投予曲妥珠單抗者，(b)表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗2者，(c)表示投予hTfR親和性肽-曲妥珠單抗3者。各照片係以倍率40X拍攝者。
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Claims (40)

  1. 一種對人類運鐵蛋白受體具有親和性之肽(人類運鐵蛋白受體親和性肽)，其係選自由以下之(1)至(2)所組成之群，且包含具有CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區的重鏈抗體之可變區， (1)CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列者； (2)CDR1之胺基酸序列為序列編號13或序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15或序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17或序列編號18之胺基酸序列者。
  2. 一種人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係選自由以下之(1)至(3)所組成之群： (1)與序列編號4之胺基酸序列具有80%以上之胺基酸序列之同一性、且包含具有如請求項1之(1)所示之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區者； (2)與序列編號5之胺基酸序列具有80%以上之胺基酸序列之同一性、且包含具有如請求項1之(1)所示之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區者；及 (3)與序列編號6之胺基酸序列具有80%以上之胺基酸序列之同一性、且包含具有如請求項1之(2)所示之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3三處之互補決定區者。
  3. 如請求項2之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為85%以上。
  4. 如請求項2之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為90%以上。
  5. 如請求項2之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該胺基酸序列之同一性為95%以上。
  6. 如請求項1之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其包含選自由以下之(1)至(3)所組成之群中之胺基酸序列： (1)序列編號4之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，且該胺基酸序列之CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列； (2)序列編號5之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，且該胺基酸序列之CDR1之胺基酸序列為序列編號7或序列編號8之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號9或序列編號10之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號11或序列編號12之胺基酸序列； (3)序列編號6之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列，且該胺基酸序列之CDR1之胺基酸序列為序列編號13或序列編號14之胺基酸序列、CDR2之胺基酸序列為序列編號15或序列編號16之胺基酸序列、且CDR3之胺基酸序列為序列編號17或序列編號18之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～5個。
  8. 如請求項6之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～3個。
  9. 如請求項1至8中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係對人類運鐵蛋白受體之胞外區及猴運鐵蛋白受體之胞外區兩者具有親和性者。
  10. 如請求項9之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其與人類運鐵蛋白受體及猴運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數均為5×10 -11M～1×10 -8M。
  11. 如請求項9之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數均為5×10 -11M～5×10 -7M。
  12. 如請求項9之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其於將與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數之值設為1時，與猴運鐵蛋白受體之解離常數之值為1～10。
  13. 如請求項9之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其於將與人類運鐵蛋白受體之胞外區之解離常數之值設為1時，與猴運鐵蛋白受體之解離常數之值為3～10。
  14. 一種人類運鐵蛋白受體親和性肽，其係使複數個如請求項1至13中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽結合而成者，選自由以下之(1)至(3)所組成之群中： (1)使2～10個如請求項1至13中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合而成者； (2)使2或3個如請求項1至13中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合而成者； (3)使2個如請求項1至13中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合而成者。
  15. 如請求項14之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該使複數個人類運鐵蛋白受體親和性肽結合之連接子分別為包含1～60個胺基酸之肽連接子。
  16. 如請求項14之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列所組成之群。
  17. 如請求項14之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中該肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。
  18. 如請求項1之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其包含選自由序列編號4、序列編號5及序列編號6所組成之群中之胺基酸序列。
  19. 一種人類運鐵蛋白受體親和性肽，其包含選自由序列編號4、序列編號5及序列編號6所組成之群中之胺基酸序列中之1～10個胺基酸經置換、缺失或附加而成之胺基酸序列。
  20. 如請求項19之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～5個。
  21. 如請求項20之人類運鐵蛋白受體親和性肽，其中經置換、缺失或附加之胺基酸之個數為1～3個。
  22. 一種人類運鐵蛋白受體親和性肽-藥物複合體，其係如請求項1至21中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽與藥物結合而成者。
  23. 如請求項22之複合體，其中該藥物為其他蛋白質(A)、核酸或低分子化合物之任意者。
  24. 一種融合蛋白質，其係如請求項1至21中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽與其他蛋白質(A)之融合蛋白質。
  25. 如請求項24之融合蛋白質，其係該人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之C末端者。
  26. 如請求項24之融合蛋白質，其係該人類運鐵蛋白受體親和性肽直接或經由連接子結合於該其他蛋白質(A)之N末端者。
  27. 如請求項25或26之融合蛋白質，其中使該人類運鐵蛋白受體親和性肽與該其他蛋白質(A)結合之連接子為包含1～60個胺基酸之肽連接子。
  28. 如請求項27之融合蛋白質，其中使該人類運鐵蛋白受體親和性肽與該其他蛋白質(A)結合之肽連接子之胺基酸序列係選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20、序列編號21、序列編號22、序列編號23、序列編號24及序列編號25之胺基酸序列所組成之群。
  29. 如請求項27之融合蛋白質，其中使該人類運鐵蛋白受體親和性肽與該其他蛋白質(A)結合之肽連接子之胺基酸序列包含選自由1個胺基酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Ser-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、序列編號19、序列編號20及序列編號21之各胺基酸序列之胺基酸序列所組成之群中之胺基酸序列串聯2～10個而成之胺基酸序列。
  30. 如請求項24至29中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係源自人類者。
  31. 如請求項24至30中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為細胞激素、生長因子或抗體醫藥。
  32. 如請求項24至30中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)係選自由腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、溶酶體酶、睫狀神經滋養因子(CNTF)、神經膠細胞株神經滋養因子(GDNF)、神經滋養素3、神經滋養素4/5、神經滋養素6、神經調節蛋白1、紅血球生成素、達貝泊汀、活化素、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、纖維母細胞生長因子2(FGF2)、上皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、介白素6、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子α受體(TNF-α受體)、PD-1配體、PD-L1、PD-L2、具有分解β-澱粉樣蛋白活性之酶、抗β-澱粉樣蛋白抗體、抗BACE抗體、抗EGFR抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗HER2抗體、抗TNF-α抗體及抗CTLA-4抗體所組成之群。
  33. 如請求項24至30中任一項之融合蛋白質，其中該其他蛋白質(A)為溶酶體酶，該溶酶體酶係選自由α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、β-半乳糖苷酶、GM2活化蛋白質、β-胺基己糖苷酶A、β-胺基己糖苷酶B、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神經醯胺酶、鞘脂激活蛋白C、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯胺基葡萄糖苷酶、α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶、酸性神經鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶、乙醯輔酶Aα-胺基葡糖苷N-乙醯轉移酶、N-乙醯葡糖胺-6-硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、棕櫚醯蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、玻尿酸酶-1、CLN1及CLN2所組成之群。
  34. 如請求項24至33中任一項之融合蛋白質，其係結合有血清白蛋白者。
  35. 如請求項24至33中任一項之融合蛋白質，其係結合有人IgG Fc區或其一部分者。
  36. 一種核酸，其編碼如請求項1至21中任一項之人類運鐵蛋白受體親和性肽。
  37. 一種核酸，其編碼如請求項24至35中任一項之融合蛋白質。
  38. 一種表現載體，其係將如請求項36或37之核酸組入而成。
  39. 一種細胞，其係經如請求項38之表現載體轉形者。
  40. 如請求項39之細胞，其中該細胞源自哺乳動物。
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