TW202436358A

TW202436358A - Ｆａｐ／４－１ｂｂ／ｃｄ４０結合分子及其醫藥用途

Info

Publication number: TW202436358A
Application number: TW113107595A
Authority: TW
Inventors: 李丹; 陳思萌; 胡榕婷; 林�源; 廖成
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海盛迪醫藥有限公司
Priority date: 2023-03-01
Filing date: 2024-03-01
Publication date: 2024-09-16
Also published as: CN120958026A; WO2024179567A1; KR20250157389A

Abstract

本揭露涉及FAP/4-1BB/CD40結合分子及其醫藥用途。具體地，本揭露涉及FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子，編碼結合分子的多核苷酸、載體，醫藥組成物及其用於治療癌症的方法和相關製藥用途。

Description

FAP/4-1BB/CD40結合分子及其醫藥用途

本揭露要求2023年3月1日提交的中國專利申請202310186509.9的優先權，上述專利申請的全部內容藉由引用併入本文。

本揭露涉及生物醫藥領域，具體涉及FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子，編碼結合分子的多核苷酸、載體，醫藥組成物及其用於治療癌症的方法和相關製藥用途。

CD40(TNFRSF5)是一種跨膜磷酸化糖蛋白，屬於腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRS)成員。主要表達在DC細胞、巨噬細胞以及B細胞表面，同時也在血小板、內皮細胞等非免疫細胞上表達。其配體CD40L被限制為三聚體排列時，藉由受體的CD40信號傳遞呈現最佳狀態，從而加強CD40自身的聚集，以及隨後與TNF受體相關因子的募集和相互作用。CD40L與DC上的CD40結合，誘導DC成熟，表現為共刺激因子B7家族(CD80，CD86)的表達上調和促炎細胞因子如白細胞介素12(IL-12)的分泌增加。CD40和CD40L相互作用為T細胞激活提供共刺激信號，並促進DC細胞遞呈抗原給T細胞。

4-1BB(CD137，TNFRSF9)是一種跨膜蛋白，也屬於腫瘤壞死因子受體超家族。主要表達在活化的CD4+和CD8+ T細胞、活化的B細胞和自然殺傷(NK)細胞上。4-1BB在細胞表面以單體或二聚體形式表達，與其配體(4-1BBL)結合後藉由三聚體化以進行信號傳導。在T細胞上，4-1BB並非組成型表達，而是在T細胞受體(TCR)受到激活後被誘導表達的，來自其天然配體4-1BBL或抗體激動劑的刺激可以進一步上調4-1BB的表達。4-1BB胞內結構域被認為是藉由招募TRAF1、TRAF2發揮作用的，或者可能是藉由TRAF3介導的K63多泛素化反應的轉接蛋白。4-1BBL三聚體化導致4-1BB受體的聚集和TRAF介導的NF-κB和MAPK細胞內信號通路的激活，導致T細胞的增殖、成熟和存活延長，以及細胞因子的產生等結果。

成纖維細胞激活蛋白(Fibroblast activation protein，FAP)是腫瘤相關抗原，FAP在健康成年人的正常組織中表達量較低，選擇性地表達在93%的腫瘤組織中，其中30%為高表達，例如結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌和口腔鱗癌。目前，尚未有針對CD40、4-1BB、FAP的多特異性抗體上市。

因此，本領域亟需開發能藉由FAP介導針對腫瘤特異性的CD40和4-1BB激活，兼具良好的腫瘤治療效果和低毒性的多特異性抗體。本揭露提供了新型的抗FAP/4-1BB/CD40三特異性抗體，能藉由FAP介導針對腫瘤特異性的CD40和4-1BB激活，對APC(例如樹突細胞DC)和T細胞具有促成熟、激活作用，能去除肝毒性、外周血液毒性及其它外周毒性，具有優良的給藥窗口和成藥性，為臨床應用提供了解決方案。

本揭露提供了FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子及其編碼核酸、載體、宿主細胞、醫藥組成物，及其用於治療、緩解細胞增殖性疾病(例如腫瘤或癌症)的方法和相關製藥用途。

FAP結合分子

本揭露提供FAP結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域。在一些實施方案中，該第一抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：該VH包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或，該VL包含SEQ ID NO：2所示胺基酸序列中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。在一些具體的實施方案中，該CDR根據Kabat編號系統定義。

在一些實施方案中，該FAP結合分子包含如下所示的VH和/或VL：該VH包含分別如SEQ ID NO：3、4和5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含分別如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該FAP結合分子包含VH和VL，其中：該VH包含的任一HCDR與前述任一種HCDR相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，所示VL包含的任一LCDR與前述任一種LCDR相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變。

在一些具體的實施方案中，上述胺基酸突變為保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加。

在一些實施方案中，本揭露提供FAP結合分子，其包含前述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3中的任意一個或任意幾個(例如，2、3、4、5或6)的組合。

在一些實施方案中，該FAP結合分子包含VH和VL，其中：

該VH包含如SEQ ID NO：1所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和/或，

該VL包含如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，本揭露提供FAP結合分子，其包含前述VH、VL中的任意一個或2個的組合。

在一些實施方案中，該FAP結合分子進一步包含輕鏈恆定區，和/或重鏈恆定區。

在一些實施方案中，輕鏈恆定區來源於κ輕鏈、λ輕鏈或前述任一種的變體。例如，來源於人κ輕鏈、人λ輕鏈或前述任一種的變體。在一些具體的實施方案中，輕鏈恆定區來源於人κ輕鏈或其變體。

在一些實施方案中，重鏈恆定區來源於IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或前述任一種的變體。例如，來源於人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4或前述任一種的變體。

在一些實施方案中，該FAP結合分子包含Fab重鏈和Fab輕鏈，其中，該Fab重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH1)，該Fab輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)。

在一些具體的實施方案中，該FAP結合分子包含Fab重鏈和Fab輕鏈，其中：

該Fab重鏈包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和/或，該Fab輕鏈包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

在本揭露上下文中，“至少80%(序列)同一性”涵蓋至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性；“至少90%(序列)同一性”涵蓋至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%(序列)同一性。

在一些實施方案中，該FAP結合分子還包含人免疫球蛋白Fc區。一些具體實施方案中，該Fc區是人IgG1、IgG2、IgG4的Fc區。

在一些實施方案中，前述FAP結合分子還包含人免疫球蛋白Fc區；例如，該Fc區是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區。在一些實施方案中，該Fc區可以具有突變，示例性突變包括IgG1上的L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F、L234E/L235F/P329G，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG2或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S。還可使用雜合IgG2/4Fc域，例如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。在一些實施方案中，在Fc區引入突變，以降低或去除Fc區的效應器功能(例如，降低或消除ADCC效應)。

在一些具體的實施方案中，前述FAP結合分子包含人IgG1的Fc區，該人IgG1的Fc區具有至少一種如下所示突變：234A，235A，220A，297A或297Q，267E，328F。

示例性的，人IgG1的Fc區包含：234A/235A、234A/235A/297A、220A/234A/235A、220A/267E/328F、220A/234A/235A/297A、267E/328F或234A/235A/297A突變。在一些具體實施方案中，人IgG1的Fc區包含：L234A/L235A、L234A/L235A/N297A、C220A/L234A/L235A、C220A/267E/328F、C220A/L234A/L235A/N297A、S267E/L328F或L234A/L235A/N297A突變。

在一些具體的實施方案中，前述FAP結合分子包含人IgG4的Fc區，該人IgG4的Fc區具有至少一種如下所示突變：228P、234A、235A、447A。示例性的，人IgG4的Fc區包含S228P突變。

在本揭露中Fc區所包含的突變的上下文中，“/”表示“和”，例如，“L234A/L235A”表示“L234A和L235A，即，Fc中包含L234A和L235A突變；突變的胺基酸位置是根據EU編號系統編號的。

在一些實施方案中，該FAP結合分子包含重鏈(HC)和輕鏈(LC)，其中，

該重鏈包含如SEQ ID NO：9所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和/或，

該輕鏈包含如SEQ ID NO：10所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，本揭露提供FAP結合分子，其包含前述重鏈(HC)和輕鏈(LC)中的任意1個或2個的組合。

在一些實施方案中，前述FAP結合分子以

10^-7的K_D值與人FAP或其表位結合；前述FAP結合分子以10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M或更低的K_D結合FAP(例如人FAP)或其片段。

在一些實施方案中，該FAP結合分子為抗FAP抗體或其抗原結合片段；示例性地，該抗FAP抗體為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或人抗體。

在一些實施方案中，該FAP結合分子為人抗體或其抗原結合片段，或人源化抗體或其抗原結合片段。

在一些具體的實施方案中，該抗FAP抗體或其抗原結合片段包括但不限於：Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)₂、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)，例如抗FAP抗原結合片段為scFv、Fv、Fab或Fab’片段。

在一些實施方案中，提供抗FAP抗體或其抗原結合片段，其與前述抗FAP抗體或其抗原結合片段結合或競爭結合相同的FAP(例如人FAP)表位。

在一些實施方案中，提供抗FAP抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述抗FAP抗體或其抗原結合片段與FAP(例如人FAP)的結合。

在一些實施方案中，提供抗FAP抗體或其抗原結合片段，其與FAP(例如人FAP)的結合被前述抗FAP抗體或其抗原結合片段阻斷。

CD40結合分子

本揭露提供CD40結合分子，其包含特異性結合CD40的第二抗原結合結構域。在一些實施方案中，該第二抗原結合結構域包含至少一個與CD40特異性結合的免疫球蛋白單一可變結構域。

在一些實施方案中，該與CD40特異性結合的免疫球蛋白單一可變結構域包含如下任一項所示的CDR1、CDR2和CDR3：

1)如SEQ ID NO：11、15或32所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3；

2)CDR1包含如SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列，和/或，CDR2包含如SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，和/或，CDR3包含如SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；

3)分別如SEQ ID NO：12、13和14所示的CDR1、CDR2和CDR3。

上述CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。在一些具體的實施方案中，該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat編號系統定義的。

在一些實施方案中，本揭露提供與CD40特異性結合的免疫球蛋白單一可變結構域，其包含的CDR1與前述任一CDR1相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，該免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR2與前述任一CDR2相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，該免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR3與前述任一CDR3相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變。

在一些具體的實施方案中，CDR1、CDR2和/或CDR3中的胺基酸突變為保守性取代。

在一些實施方案中，本揭露提供免疫球蛋白單一可變結構域，其包含前述CDR1、CDR2、CDR3中的任意一個或任意幾個(例如，2或3)的組合。

在一些實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、降低與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的。

在一些具體的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是人源化改造的。示例性地，該人源化改造使用的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-48*03。

在一些具體的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是降低和/或去除與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的。示例性的，將免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列突變為“TVSAA”(SEQ ID NO：69)，以去除和/或降低4-1BB結合分子與pre-ADA的結合。在一些具體的實施方案中，免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列由“TVSS”(SEQ ID NO：68)突變為“TVSAA”(SEQ ID NO：69)。

在一些實施方案中，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：11、15或32中任一項所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述CD40結合分子中包含或為特異性結合CD40或其片段的抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段例如為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段例如為重組抗體或其片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段為線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。

在一些實施方案中，前述CD40結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域是VHH。

一些實施方案中，本揭露提供CD40結合分子，其包含一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8個)前述免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同或不同的，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其與前述抗CD40抗體或其抗原結合片段結合或競爭結合相同的表位。

在一些實施方案中，提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述抗CD40抗體或其抗原結合片段與CD40(例如人CD40)的結合。

在一些實施方案中，提供抗CD40抗體或其抗原結合片段，其與CD40(例如人CD40)的結合被前述抗CD40抗體或其抗原結合片段阻斷。

在一些實施方案中，前述CD40結合分子還包含人免疫球蛋白Fc區；例如，該Fc區是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區。在一些實施方案中，該Fc區可以具有突變。

示例性人IgG1的Fc區具有至少一種如下所示突變：234A，235A，220A，297A或297Q，267E，328F。在一些具體的實施方案中，人IgG1的Fc區包含：234A/235A、234A/235A/N297A、C220A/234A/235A、C220A/267E/L328F、C220A/L234A/L235A/N297A、S267E/L328F或L234A/L235A/N297A突變。

示例性地，人IgG4的Fc區具有至少一種如下所示突變：228P、234A、235A、447A。在一些具體的實施方案中，人IgG4的Fc區包含S228P突變。

在一些實施方案中，前述CD40結合分子中免疫球蛋白單一可變結構域與Fc區直接或藉由連接子連接。該連接子可以是長1-20個或更多個胺基酸、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。例如，該連接子是柔性連接子，例如G₄S、GS、GAP、(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄、(G₄S)₅、ASGS等。

4-1BB結合分子

本揭露提供4-1BB結合分子，其包含特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域。在一些實施方案中，該第三抗原結合結構域包含至少一個與4-1BB特異性結合的免疫球蛋白單一可變結構域。

在一些實施方案中，該第三抗原結合結構域中免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：28、23-26、18和33中任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。

該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。

在一些實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：19、30和31所示胺基酸序列的CDR1、CDR2 和CDR3。其中，SEQ ID NO：30所示胺基酸序列為DINSGGX₁STFYX₂DSVKG；其中X₁為E或Q，其中X₂為E或A；SEQ ID NO：31所示胺基酸序列為HPLTX₃TIATMNDYDY；其中X₃為F或Y。

在一些實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含：

如SEQ ID NO：19所示的CDR1，

如SEQ ID NO：20或29所示的CDR2，和

如SEQ ID NO：21或27所示的CDR3。

在一些實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如下任一項所示的CDR1、CDR2和CDR3：

a-1)分別如SEQ ID NO：19、29和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；

a-2)分別如SEQ ID NO：19、20和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；

a-3)分別如SEQ ID NO：19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3。

在一些實施方案中，本揭露提供的免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR1與前述任一CDR1相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，

該免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR2與前述任一CDR2相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變；和/或，

該免疫球蛋白單一可變結構域包含的CDR3與前述任一CDR3相比，具有0、1、2、3、4或5個胺基酸突變。

在一些具體的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是人源化改造的。示例性地，該人源化改造使用的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。例如，FR1來自IGHV3-64*04，FR2來自IGHV3-23*03，FR3來自IGHV3-74*01。

在一些具體的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是去除和/或減少T細胞表位(T-cell Epitope，TCE)改造的。藉由降低和/或去除CDR1、CDR3和CDR3中一個或多個中的TCE位點，能夠降低4-1BB結合分子的免疫原性。示例性的，去除T細胞表位改造的免疫球蛋白單一可變結構域包含如下的胺基酸突變：99Y，該突變是根據Kabat編號規則編號。

在一些具體的實施方案中，該免疫球蛋白單一可變結構域是去除和/或降低抗體的聚集改造的。示例性的，將免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列突變為“TQVTVSS”(SEQ ID NO：71)，以降低抗體發生聚集的風險。在一些具體的實施方案中，免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列由“TLVTVSS”(SEQ ID NO：70)突變為“TQVTVSS”(SEQ ID NO：71)。

在一些實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，包含如SEQ ID NO：18、23-26、28和33中任一項所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，前述4-1BB結合分子中包含或為特異性結合4-1BB或其片段的抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段例如為駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體或其抗原結合片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段例如為重組抗體或其片段。一些具體實施方案中，該抗體或其抗原結合片段為線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。

在一些實施方案中，前述4-1BB結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域是VHH。

在一些實施方案中，本揭露提供4-1BB結合分子，其包含一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8個)前述免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同或不同的，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，本揭露的前述4-1BB結合分子涵蓋變體，該變體與SEQ ID NO：18、23-26、28、33任一相比有一個或多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸突變；該胺基酸突變可以是保守的替換、取代或修飾，和/或不影響功能的缺失、添加；該胺基酸突變可以發生在CDR區和/或FR區。

在一些實施方案中，提供抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其與前述本揭露的4-1BB結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域結合或競爭結合相同的表位。

在一些實施方案中，提供抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述本揭露的4-1BB結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域與4-1BB(例如人4-1BB)的結合。一些具體實施方案中，該抗4-1BB抗體或其抗原結合片段也能激活T細胞和/或促T細胞增殖。

在一些實施方案中，提供抗4-1BB抗體或其抗原結合片段，其與4-1BB(例如人4-1BB)的結合被前述本揭露的4-1BB結合分子中的免疫球蛋白單一可變結構域阻斷。

在一些實施方案中，前述4-1BB結合分子還包含人免疫球蛋白Fc區；例如，該Fc區是人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區。在一些實施方案中，該Fc區可以具有突變。

在一些實施方案中，前述4-1BB結合分子中免疫球蛋白單一可變結構域與Fc區直接或藉由連接子連接。該連接子可以是長1-20個或更多個胺基酸、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。例如，該連接子是柔性連接子，例如G₄S、GS、GAP、(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄、(G₄S)₅、ASGS等。

在一些實施方案中，4-1BB結合分子進一步包含ii)特異性結合FAP的第一抗原結合結構域；其中，第一抗原結合結構域是本揭露提供的任意的FAP結合分子中的第一抗原結合結構域。

在一些實施方案中，4-1BB結合分子進一步包含iii)特異性結合CD40的第二抗原結合結構域。其中，第二抗原結合結構域是本揭露提供的任意的CD40結合分子中的第二抗原結合結構域。

在一些實施方案中，4-1BB結合分子包含特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域、特異性結合CD40的第二抗原結合結構域和Fc區。

一些具體的實施方案中，特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域位於Fc區的N端，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域位於Fc區的C端；或者，特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域位於Fc區的C端，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域位於Fc區的N端。

一些具體的實施方案中，4-1BB結合分子包含如下胺基酸序列所示的多肽：如SEQ ID NO：44所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。

FAP/4-1BB/CD40結合分子

本揭露提供FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域、特異性結合CD40的第二抗原結合結構域和特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域；能同時或分別特異性結合FAP、4-1BB和CD40。

在一些實施方案中，第三抗原結合結構域是前述本揭露提供的任意的4-1BB結合分子中特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域包含至少一個與4-1BB特異性結合的免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：28、23-26、18和33中任一所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。

該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。在一些具體的實施方案中，該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat編號系統定義的。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含分別如SEQ ID NO：19、30和31所示的CDR1、CDR2和CDR3。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，其中包含：

如SEQ ID NO：19所示的CDR1，

如SEQ ID NO：20或29所示的CDR2，和

如SEQ ID NO：21或27所示的CDR3。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，其包含如下任一項所示的CDR1、CDR2和CDR3：

a-1)分別如SEQ ID NO：19、29和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；

a-2)分別如SEQ ID NO：19、20和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；

a-3)分別如SEQ ID NO：19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、降低與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的。

示例性地，第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域是人源化改造的，該人源化改造使用的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。例如，FR1來自IGHV3-64*04，FR2來自IGHV3-23*03，FR3來自IGHV3-74*01。

示例性地，第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域是去除和/或減少T細胞表位(T-cell Epitope，TCE)改造的。例如，去除T細胞表位改造的免疫球蛋白單一可變結構域包含如下的胺基酸突變：99Y，該突變是根據Kabat編號規則編號。

示例性地，第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域是降低和/或去除與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的。例如，免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列由“TVSS”(SEQ ID NO：68)突變為“TVSAA”(SEQ ID NO：69)。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域是去除和/或降低抗體的聚集改造的。例如，免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列由“TLVTVSS”(SEQ ID NO：70)突變為“TQVTVSS”(SEQ ID NO：71)。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，包含如SEQ ID NO：18、23-26、28和33中任一項所示，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第三抗原結合結構域包含一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個等)前述免疫球蛋白單一可變結構域，任意兩個該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同或不同的，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，第二抗原結合結構域是前述本揭露提供的任意的CD40結合分子中特異性結合CD40的第二抗原結合結構域。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第二抗原結合結構域包含至少一個與CD40特異性結合的免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含如下任一項所示的CDR1、CDR2和CDR3：

1)分別如SEQ ID NO：11、15或32所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3；

3)分別如SEQ ID NO：12、13和14所示的CDR1、CDR2和CDR3。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、降低與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第二抗原結合結構域中免疫球蛋白單一可變結構域是人源化改造的，該人源化改造使用的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-48*03。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第二抗原結合結構域中免疫球蛋白單一可變結構域是降低和/或去除與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的。例如，免疫球蛋白單一可變結構域的C末端序列由“TVSS”(SEQ ID NO：68)突變為“TVSAA”(SEQ ID NO：69)。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域，包含如SEQ ID NO：11、15或32中任一項所示，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第二抗原結合結構域包含一個或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個等)前述免疫球蛋白單一可變結構域，任意兩個該免疫球蛋白單一可變結構域可以是相同或不同的，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，第一抗原結合結構域是前述本揭露提供的任意的FAP結合分子中特異性結合FAP的第一抗原結合結構域。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第一抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：該VH包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列中的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或，該VL包含SEQ ID NO：2所示胺基酸序列中的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第一抗原結合結構域包含如下所示的VH和/或VL：該VH包含分別如SEQ ID NO：3、4和5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該VL包含分別如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

示例性地，一些具體的實施方案中，其中：該VH包含如SEQ ID NO：1所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和/或，該VL包含如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第一抗原結合結構域進一步包含輕鏈恆定區，和/或重鏈恆定區。示例性地，輕鏈恆定區來源於人κ輕鏈、人λ輕鏈或前述任一種的變體。在一些具體的實施方案中，輕鏈恆定區來源於人κ輕鏈或其變體。示例性地，重鏈恆定區來源於人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4或前述任一種的變體。

示例性地，一些具體的實施方案中，該第一抗原結合結構域包含Fab重鏈和Fab輕鏈，其中，該Fab重鏈包含重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH1)，該Fab輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)。

示例性地，一些具體的實施方案中，該Fab重鏈包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和/或，該Fab輕鏈包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，或與之具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該FAP/4-1BB/CD40結合分子還包含Fc區。一些具體實施方案中，該Fc區是人IgG1、IgG2、IgG4的Fc區。

在一些實施方案中，Fc區包含胺基酸突變，示例性突變包括IgG1上的L234A/L235A、L234A/L235A/P329G、L234E、L234F、L234E/L235F、L234E/L235F/P329G，IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S，IgG4上的F234A/L235A，IgG4上的S228P/F234A/L235A，IgG2或IgG4上的N297A，IgG2上的V234A/G237A，IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M，IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S，IgG1上的S267E/L328F，IgG1上的L234F/L235E/D265A，IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S，IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S。還可使用雜合IgG2/4Fc域，例如具有來自IgG2的殘基117-260和來自IgG4的殘基261-447的Fc。

在一些具體的實施方案中，FAP/4-1BB/CD40結合分子包含人IgG1的Fc區，該人IgG1的Fc區具有至少一種如下所示突變：234A，235A，220A，297A或297Q，267E，328F。

在一些具體的實施方案中，FAP/4-1BB/CD40結合分子包含人IgG4的Fc區，該人IgG4的Fc區具有至少一種如下所示突變：228P、234A、235A、447A。示例性的，人IgG4的Fc區包含S228P突變。

在一些實施方案中，在Fc區引入突變，以降低或去除Fc區的效應器功能(例如，降低或消除ADCC效應)。

在一些實施方案中，在Fc區還可以引入使Fc區的兩個亞基(Fc1、Fc2)配對形成二聚體的突變。例如在CH3/CH3界面內，用一個或多個具有更大側鏈體積的胺基酸殘基突變Fc1的CH3域中的一個或多個胺基酸殘基，從而在Fc1的CH3域表面產生凸起(或杵，Knob)，Fc2的CH3域中與Fc1的CH3域相互作用的一個或多個、較佳兩個或三個胺基酸殘基，用具有更小側鏈體積的胺基酸殘基突變，從而在與Fc1的CH3域相互作用的Fc2的CH3域表面產生凹陷(或臼，Hole)。一些實施方案中，具有更大側鏈體積的輸入殘基是苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、精胺酸(R)或色胺酸(W)。一些實施方案中，具有更小側鏈體積的輸入殘基是絲胺酸(S)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)或蘇胺酸(T)。示例性地，杵(knob)突變包含T366W取代，臼(hole)突變選自T366S、L368A和Y407V中的至少一個、至少兩個或三個突變。

在一些實施方案中，該Fc區可以使該結合分子形成二聚體分子，同時延長該結合分子的體內半衰期。

在一些實施方案中，該FAP/4-1BB/CD40結合分子中，該第一抗原結合結構域包含Fab重鏈和Fab輕鏈，其中：

該Fab重鏈位於該Fc區的N端，該第三抗原結合結構域位於該Fc區的C端，該第二抗原結合結構域位於該第三抗原結合結構域的C端；

該Fab重鏈位於該Fc區的N端，該第三抗原結合結構域位於該Fc區的C端，該第二抗原結合結構域位於該Fab輕鏈的C端；

該Fab重鏈位於該Fc區的N端，該第二抗原結合結構域位於該Fc區的C端，該第三抗原結合結構域位於該第二抗原結合結構域的C端；

或者，

該Fab重鏈位於該Fc區的N端，該第二抗原結合結構域位於該Fc區的C端，該第三抗原結合結構域位於該Fab輕鏈的C端。

在一些實施方案中，特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域與特異性結合CD40的第二抗原結合結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域與Fc區可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域與Fc區可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域與特異性結合FAP的第一抗原結合結構有的Fab輕鏈可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域與特異性結合FAP的第一抗原結合結構有的Fab輕鏈可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個等的免疫球蛋白單一可變結構域。其中，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

在一些實施方案中，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個等的免疫球蛋白單一可變結構域。其中，任意兩個免疫球蛋白單一可變結構域之間可以直接連接或藉由連接子相連接。

示例性地，連接子包括但不限於如(G_mS_n)_h或(GGNGT)_h(SEQ ID NO：72)或(YGNGT)_h(SEQ ID NO：73)或(EPKSS)_h(SEQ ID NO：74)所示的胺基酸序列其中m，n各自獨立地選自1-8的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，h獨立地選自1-20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。

在一些實施方案中，連接子為(G_xS)_y連接子，其中，x選自1-5的整數(例如，1、2、3、4或5)，y選自1-6的整數(例如，1、2、3、4、5或6)；一些具體實施方案中，該連接子選自G₄S(SEQ ID NO：75)、GS、GAP、(G₄S)₂(SEQ ID NO：76)、(G₄S)₃(SEQ ID NO：77)、(G₄S)₄(SEQ ID NO：78)、(G₄S)₅(SEQ ID NO：79)、ASGS(SEQ ID NO：80)，例如為(G₄S)₂。

在一些實施方案中，當FAP/4-1BB/CD40結合分子中包含的連接子的數量為2個或以上時，任意兩個連接子可以相同，也可以不同。

在一些具體的實施方案中，FAP/4-1BB/CD40結合分子包含抗FAP抗體，該抗FAP抗體包含兩條重鏈(HC)和兩條輕鏈(LC)。其中一條HC的VH與一條LC的VL形成抗原結合部位，另一條HC的VH與另一條LC的VL形成抗原結合部位。

在一些具體的實施方案中，FAP/4-1BB/CD40結合分子中包含至少一個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8等)與CD40特異性結合的VHH，且包含至少一個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8等)與4-1BB特異性結合的VHH。

在一些具體的實施方案中，任意一個與CD40特異性結合的VHH可以連接於抗FAP抗體重鏈的C端，和/或，連接於抗FAP抗體輕鏈的C端。與CD40特異性結合的VHH的C端可以繼續連接一個或多個與CD40特異性結合的VHH，和/或，一個或多個與4-1BB特異性結合的VHH。

在一些具體的實施方案中，任意一個與4-1BB特異性結合的VHH可以連接於抗FAP抗體重鏈的C端，和/或，連接於抗FAP抗體輕鏈的C端。與4-1BB特異性結合的VHH的C端可以繼續連接一個或多個與4-1BB特異性結合的VHH，和/或，一個或多個與CD40特異性結合的VHH。

在一些實施方案中，FAP/4-1BB/CD40結合分子中，第一抗原結合結構域、該第二抗原結合結構域與該第三抗原結合結構域的價數比為(1-2)：(1-5)：(1-5)；在一些實施方案中，第一抗原結合結構域、該第二抗原結合結構域與該第三抗原結合結構域的價數比為1：(1-4)：(1-4)。在一些具體的實施方案中，價數比為1：2：2、1：2：4、1：1：1或1：1：2。

在本揭露中，“價數”描述為抗原結合分子(例如，抗原結合結構域)中所存在的抗原結合部分的數目。因此，單個結合分子可結合於目標分子上的大於一個結合位點。

在一些實施方案中，該FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中，從N末端向C末端方向，該FAP/4-1BB/CD40結合分子包含如下任一組或組合：

(I)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]-[連接子]b-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]；

(II)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]-[連接子]b-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；

(III)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]-[連接子]b-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]-[連接子]c-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；

(IV)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]-[連接子]b-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；和，

(V)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]-[連接子]b-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；

其中，-表示肽鍵，任意兩個連接子可以相同，也可以不同；a、b、c彼此獨立地選自0或1。

在一些實施方案中，連接子為(G_xS)_y連接子，其中，x選自1-5的整數(例如，1、2、3、4或5)，y選自1-6的整數(例如，1、2、3、4、5或6)；一些具體實施方案中，該連接子選自G₄S、GS、GAP、(G₄S)₂、(G₄S)₃、(G₄S)₄、(G₄S)₅、ASGS，例如為(G₄S)₂。

在一些實施方案中，前述FAP/4-1BB/CD40結合分子包含兩個及以上特異性結合FAP的第一抗原結合結構域，任意兩個特異性結合FAP的第一抗原結合結構域可以相同或不同，其選自本揭露提供的任意的第一抗原結合結構域；

在一些實施方案中，前述FAP/4-1BB/CD40結合分子包含兩個及以上特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，任意兩個特異性結合CD40的第二抗原結合結構域可以相同或不同，其選自本揭露提供的任意的第二抗原結合結構域；

在一些實施方案中，前述FAP/4-1BB/CD40結合分子包含兩個及以上特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域，任意兩個特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域可以相同或不同，其選自本揭露提供的任意的第三抗原結合結構域。

在一些實施方案中，該FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含如下任一項所示的第一多肽鏈和第二多肽鏈：

1)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

2)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

3)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

4)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

5)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

6)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

7)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

8)該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列，和該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列或與之具有80%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方案中，該FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈。一些具體的實施方案中，前述FAP/4-1BB/CD40結合分子具有兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。

在一些實施方案中，前述FAP/4-1BB/CD40結合分子具有至少一種如下所示特性：

a)與人FAP或其表位特異性結合；

b)與人4-1BB或其表位特異性結合；

c)與人CD40或其表位特異性結合；

d)未經FAP和CD40交聯時，對4-1BB信號通路弱激活或不激活；

e)經FAP和/或CD40交聯後，對4-1BB信號通路較強激活或強激活；例如，EC₅₀

1nM。示例性地，EC₅₀

0.9nM，EC₅₀

0.8nM，EC₅₀

0.7nM，EC₅₀

0.6nM，EC₅₀

0.5nM，EC₅₀

0.4nM，EC₅₀

0.3nM，EC₅₀

0.2nM，EC₅₀

0.1nM，EC₅₀

0.09nM，EC₅₀

0.08nM，EC₅₀

0.07nM，EC₅₀

0.06nM，EC₅₀

0.05nM，EC₅₀

0.04nM，EC₅₀

0.03nM，EC₅₀

0.02nM或更低；

f)未經FAP和4-1BB交聯時，對CD40信號通路弱激活或不激活；

g)經FAP和/或4-1BB交聯後，對CD40信號通路較強激活或強激活；例如，EC₅₀

1nM。示例性地，EC₅₀

0.9nM，EC₅₀

0.8nM，EC₅₀

0.7nM，EC₅₀

0.6nM，EC₅₀

0.5nM，EC₅₀

0.4nM，EC₅₀

0.3nM，EC₅₀

0.2nM，EC₅₀

0.1nM，EC₅₀

0.09nM，EC₅₀

0.08nM，EC₅₀

0.07nM，EC₅₀

0.06nM，EC₅₀

0.05nM，EC₅₀

0.04nM，EC₅₀

0.03nM，EC₅₀

0.02nM或更低；

h)激活T細胞和/或促進T細胞增殖；

I)促進APC(例如，樹突狀細胞DC)活化和/或促進APC(例如，樹突狀細胞DC)的增殖；

j)具有低免疫原性，和/或具有低的與預存抗藥抗體(pre-ADA)結合水平；

k)抑制腫瘤生長。

一些實施方案中，本揭露的前述FAP/4-1BB/CD40結合分子能夠抑制腫瘤生長至少約10%，例如至少約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%。

一些實施方案中，前述FAP/4-1BB/CD40結合分子為抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體或其抗原結合片段，該抗原結合片段包括但不限於：Fab、Fv、sFv、Fab’、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。

一些實施方案中，提供抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體或其抗原結合片段，其與前述本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子結合或競爭結合FAP、4-1BB和/或CD40，或，結合或競爭結合FAP、4-1BB和/或CD40的相同表位。

一些實施方案中，提供抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體或其抗原結合片段，其阻斷前述本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子結合FAP、4-1BB和/或CD40。

一些實施方案中，提供蛋白或分子，其包含前述本揭露任意的FAP/4-1BB/CD40結合分子。例如，該蛋白或分子為綴合物，該綴合物例如可包含任意可檢測標記。

本揭露提供的抗FAP/4-1BB/CD40多異性抗體，能藉由FAP介導針對腫瘤特異性的CD40和4-1BB激活，對APC(例如樹突細胞DC)和T細胞具有促成熟、激活作用，肝毒性、外周血液毒性及其它外周毒性低或無，具有優良的給藥窗口和成藥性，為臨床治療腫瘤提供了解決方案。

多核苷酸和載體

本揭露提供多核苷酸，其編碼本揭露提供的如下任一分子：4-1BB結合分子、FAP/4-1BB/CD40結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子。

在一些實施方案中，多核苷酸可為RNA、DNA或cDNA。根據本揭露的一些實施方案，本揭露的多核苷酸是基本上分離的核酸。

本揭露的核酸也可呈載體形式，可存在於載體中和/或可為載體的一部分，該載體例如質粒、黏端質粒、YAC或病毒載體。載體可尤其為表達載體，即可提供FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子體外和/或體內(即在適合宿主細胞、宿主有機體和/或表達系統中)表達的載體。該表達載體通常包含至少一種本揭露的核酸，其可操作地連接至一個或多個適合的表達調控元件(例如啟動子、增強子、終止子等)。針對在特定宿主中的表達對該元件及其序列進行選擇為所屬技術領中具有通常知識者的常識。對本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子的表達有用或必需的調控元件及其他元件例如為啟動子、增強子、終止子、整合因子、選擇標記物、前導序列、報告基因。

本揭露的核酸可基於本揭露的多肽的胺基酸序列的信息藉由已知的方式(例如藉由自動DNA合成和/或重組DNA技術)製備或獲得，和/或可從適合的天然來源加以分離。

宿主細胞

本揭露提供表達或能夠表達一種或多種本揭露的結合分子，和/或含有本揭露的核酸或載體的重組宿主細胞。結合分子包括如下至少一種：FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子。

一些實施方案中，宿主細胞為細菌細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞。

示例性地，細菌細胞例如包括革蘭氏陰性細菌菌株(例如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株、變形桿菌屬(Proteus)菌株及假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株)及革蘭氏陽性細菌菌株(例如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株、鏈黴菌屬 (Streptomyces)菌株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株及乳球菌屬(Lactococcus)菌株)的細胞。

示例性地，真菌細胞例如包括木黴屬(Trichoderma)、脈孢菌屬(Neurospora)及麴菌屬(Aspergillus)的物種的細胞；或者包括酵母屬(Saccharomyces)(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、畢赤酵母屬(Pichia)(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)及嗜甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica))及漢森酵母屬(Hansenula)的物種的細胞。

示例性地，哺乳動物細胞例如包括例如HEK293細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞等。

本揭露也可使用兩極類細胞、昆蟲細胞、植物細胞及本領域中用於表達異源蛋白的任何其他細胞。

本揭露的細胞不能發育成完成的植株或動物個體。

生產或製備方法

本揭露提供製備本揭露中任意的蛋白結合分子的方法。其中，蛋白結合分子包括如下至少一種：FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子。一些實施方案中，該方法包含以下步驟：

-在適合表達該抗體的條件下培養本揭露的宿主細胞；及

-從培養物回收由該宿主細胞表達的目的蛋白；及

-視需要的，包括進一步純化和/或修飾本揭露的目的蛋白。

本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子等可在如上所述細胞中以細胞內方式(例如在細胞質中、在周質中或在包涵體中)產生，接著從宿主細胞分離且視需要進一步純化；或其可以細胞外方式(例如在培養宿主細胞的培養基中)產生，接著自培養基分離且視需要進一步純化。

用於重組產生多肽的方法及試劑，例如特定適合表達載體、轉化或轉染方法、選擇標記物、誘導蛋白表達的方法、培養條件等在本領域中是已知的。類似地，適用於製造本揭露的結合分子或抗體等目的蛋白的分離及純化技術為所屬技術領中具有通常知識者所公知。生產和純化抗體的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。本揭露工程化的抗體也可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的株。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

然而，本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、FAP結合分子、CD40結合分子等也可以藉由本領域已知的其它產生蛋白質的方法獲得，例如化學合成，包括固相或液相合成。

組成物

本揭露提供組成物，包含如下任意一種或任意組合：本揭露提供的任意的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子，編碼FAP/4-1BB/CD40結合分子或4-1BB結合分子的多核苷酸，載體。

一些實施方案中，醫藥組成物含有對癌症治療、緩解或預防有效量的如上所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子或編碼核酸或載體。

一些實施方案中，醫藥組成物進一步包含至少一種可藥用的賦形劑、稀釋或載體。

在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的FAP/4-1BB/CD40結合分子；或醫藥組成物單位劑量中含FAP/4-1BB/CD40結合分子的量為0.1-2000mg；在一些具體實施方式中為1-1000mg。

在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的4-1BB結合分子；或醫藥組成物單位劑量中含4-1BB結合分子的量為0.1-2000mg；在一些具體實施方式中為1-1000mg。

在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的FAP/4-1BB/CD40結合分子和4-1BB結合分子；或醫藥組成物單位劑量中含FAP/4-1BB/CD40結合分子和4-1BB結合分子的量為0.1-2000mg；在一些具體實施方式中為1-1000mg。

一些實施方案中，提供製品或產品，包含前述FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、多核苷酸和/或載體。可選地，製品包含容器和標簽。容器例如瓶、注射器和試管。容器容納有效於治療病症的組成物。容器上或與容器相連的標簽表明該組成物用於治療所選病症。組成物中含有前述FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、多核苷酸和/或載體。

試劑盒和檢測

本揭露提供試劑盒，包含前述FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、多核苷酸、載體、組成物。本揭露還提供用於體內或體外檢測FAP、4-1BB、CD40的方法、系統或裝置，其包括用本揭露的前述結合分子、多核苷酸、載體、組成物處理樣品。

一些實施方案中，體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括：

(1)使樣品與FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、多核苷酸、載體或組成物接觸；

(2)檢測在前述結合分子、多核苷酸、載體和樣品之間形成的複合物；和/或

(3)使參比樣品(例如，對照樣品)與結合分子、多核苷酸接觸；和

(4)藉由與參比樣品比較，確定複合物形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比，樣品或受試者中複合物形成的變化(例如，統計學上的顯著變化)表示樣品中存在FAP、4-1BB、CD40。

另一些實施方案中，體內檢測方法、系統或裝置可以包括：

(1)向受試者施用前述結合分子、多核苷酸或載體；和

(2)檢測在結合前述結合分子、多核苷酸、載體和受試者之間複合物的形成。

檢測可以包括確定形成複合物的位置或時間。用可檢測物質對前述結合分子、核酸標記，藉由對該標記檢測以實現對能結合的蛋白、核酸的物質(例如FAP、4-1BB、CD40)的檢測。合適的可檢測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。可以藉由測量與FAP、4-1BB、CD40結合或不結合的物質或使其可視化，檢測結合分子、核酸與FAP、4-1BB、CD40的複合物形成。可以使用常規檢測測定法，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。出於檢測目的，本揭露的結合分子、核酸可以用螢光團發色團標記。一些實施方案中，還提供包含上述核酸、結合分子的診斷試劑，以及提供相關診斷用途。

一些實施方案中，還提供試劑盒，該試劑盒包含前述結合分子、多核苷酸，還可以包含診斷使用說明。試劑盒還可以含有至少一種額外的試劑，如標記物或額外的診斷劑。對於體內使用，該結合分子可以配製為醫藥組成物。

治療疾病的方法和製藥用途

本揭露提供的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、編碼多核苷酸、載體或醫藥組成物在預防、治療或緩解疾病或病症中用途和方法。

一些實施方案中，本揭露提供的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、或編碼多核苷酸、載體、醫藥組成物的如下至少一種用途：

1)在製備預防、治療或緩解疾病或病症的藥物中的應用；

2)用於預防、治療或緩解疾病或病症；

3)用於激活T細胞；

4)在製備用於激活T細胞的藥物中的應用；

5)用於促進DC細胞活化；

6)在製備用於促進DC細胞活化的藥物中的應用。

一些實施方案中，本揭露提供一種預防、治療或緩解疾病或病症的方法，包括給患者或受試者施用預防、治療或緩解疾病或病症的有效量的本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、或編碼多核苷酸、載體、醫藥組成物。

一些實施方案中，該疾病或病症為腫瘤或癌症。

一些具體的實施方案中，該腫瘤或癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、和血液系統癌症。

在一些實施方案中，本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子、4-1BB結合分子、或編碼多核苷酸、載體、醫藥組成物可以藉由本領域已知的任何合適的方法來施用，施用可以為全身性或局部的。

在一些實施方案中，可調整給藥方案以獲得最佳目的反應(例如治療或預防反應)。例如，可以單次給藥，可以在一段時間內多次給藥，或者可以隨治療情況的緊急程度按比例減少或增加劑量。

術語定義

為了更容易理解本揭露，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本揭露中另有明確定義，本揭露使用的所有其它技術和科學術語都具有本揭露所屬領域的具有通常知識者通常理解的含義。

本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

“CD40”和“CD40抗原”是指在正常和贅生性B細胞表面上表達的約48kD糖蛋白，其充當參與細胞增殖和分化的信號的受體(Ledbetter等人，1987,J.Immunol.138：788-785)。內源性表達CD40的細胞是特徵在於CD40的表面表達的任何細胞，包括但不限於正常和贅生性B細胞、交錯突細胞、基底上皮細胞、癌細胞、巨噬細胞、內皮細胞、濾泡樹突細胞、扁桃體細胞和骨髓來源的漿細胞。本揭露“CD40”指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物例如靈長類(例如人)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD40，除非另有說明。已從由伯基特氏淋巴瘤細胞系Raji製備的文庫中分離出編碼CD40的cDNA分子(Stamenkovic等人，1989,EMBO J.8：1403)。本揭露“CD40”涵蓋全長未加工的CD40以及源自細胞中的加工的任何形式的CD40，還涵蓋CD40的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。此外，也包括人工表達的形式、功能變體等。

“4-1BB”或“4-1BB抗原”又稱CD137、腫瘤壞死因子受體超家族9，是TNF受體超家族(TNFRSF)的成員，是表達在CD8⁺和CD4⁺T細胞、調節性T細胞(Tregs)、NK細胞和NKT細胞、B細胞和中性粒細胞等細胞表面的共刺激分子。4-1BB屬共刺激分子，在免疫細胞被激活後表達。人4-1BB蛋白在NCBI登錄號為NP_001552.2。本揭露中，“4-1BB”可以視需要地包括任何這類蛋白質或其片段、變體，包括(但不限於)如本揭露所述的已知或野生型4-1BB，以及任何天然產生的剪接變體、胺基酸變體或同工型。此外，也包括人工表達的形式、功能變體等。

“成纖維細胞激活蛋白(FAP)”和“FAP抗原”，也稱作脯胺醯內肽酶FAP或分離酶(Seprase)(EC 3.4.21)，指來自任何脊椎動物來源的任何天然FAP，包括哺乳動物，例如靈長類(例如人)，非人靈長類(例如食蟹猴)和齧齒類(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。本揭露“FAP”涵蓋全長未加工的FAP以及源自細胞中的加工的任何形式的FAP，還涵蓋FAP的天然發生變體，例如剪接變體或等位變體。此外，也包括人工表達的形式、功能變體等。

人FAP的胺基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登錄號Q12884，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2、GeneBank Accession NO.AAC51668中顯示。人FAP的細胞外結構域(ECD)自胺基酸位置26延伸至760。

術語“功能變體”包括但不限於野生型蛋白的同系物、片段、截短體、突變體、修飾物等，蛋白的功能變體與野生型蛋白相比，具有提高的、降低的或維持的蛋白活性。

“結合分子”涵蓋任何能夠特異性結合抗原(例如CD40、4-1BB或FAP)的蛋白、多肽或包含該蛋白或多肽的任何分子，包括但不限於針對如本揭露定義的抗體。

本揭露中“多肽”、“肽”或“蛋白”可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物，或多個胺基酸殘基聚合物的集合體。這些術語應用於其中的一個或多個胺基酸殘基為對應的天然存在的胺基酸的人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。多肽序列通常記述為多肽序列的左手端為胺基末端(N末端、N端)；多肽序列的右手端為羧基末端(C末端、C端)。

“抗體”涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、三特異性抗體)、全長抗體和抗體片段(或抗原結合片段，或抗原結合結構域)，只要它們展現出期望的抗原結合活性。

抗體可以指免疫球蛋白，是由兩條的重鏈和兩條的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。

本揭露的抗體可以是多株的、單株的、異種的、同種異體的、同基因的或其經過修飾的形式，其中單株抗體尤其適用於多個實施例中。一般來說，本揭露的抗體是重組抗體。如本文所用的“重組”泛指例如細胞或核酸、蛋白質或載體等產品，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已經藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而加以修飾，或該細胞來源於如此修飾的細胞。例如，重組細胞表達天然(非重組)細胞形式內不存在的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。

“抗原結合結構域”涵蓋Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二價或三價或四價抗體、Bis-scFv、diabody、tribody、triabody、tetrabody和上述任意一種的表位結合片段(參見例如Holliger and Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair and Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。產生和製備這些抗原結合片段的方法在本領域是公知的(參見例如Verma等人，1998,Journal ofImmunological Methods,216,165-181)。

“多特異性抗體”是指結合兩個或兩個以上不同目標抗原或不同抗原表位的抗體。術語“多特異性抗體”包括雙特異性、三特異性、四特異性、五特異性和六特異性。如本文所用，術語“三特異性抗體”是指結合三個不同抗原(例如，FAP、CD40或4-1BB)或三個不同表位的抗體。

對於CDR的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構來完成CDR的確定性描繪和包含抗體的結合位點的殘基的鑑定。這可藉由所屬技術領中具有通常知識者已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑑定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。

Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑑定CDR區域(參見例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia編號系統與Kabat編號系統類似，但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的計算機程序集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識數據庫和從頭開始方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。構象定義中，CDR的位置可鑑定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊，儘管根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，它們可縮短或延長。如本揭露使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。各種編號系統之間的對應關係是所屬技術領中具有通常知識者熟知的，示例性的，如下表1中所示。

表1. CDR編號系統之間的關係

本揭露的抗體的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號系統。

多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其它蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。

“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈的球形區域。免疫球蛋白結構域的特徵在於其維持抗體分子的折疊特徵。

“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”、“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”組成的免疫球蛋白結構域。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。

“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。

“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單株抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbs^TM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbs^TM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳的。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。

“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、V_HH結構域、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarhouch T， Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該可變結構域與存在於常規四肽鏈結構抗體中的VH以及VL進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(此與常規四肽鏈結構抗體中的VH或VL結構域相反，在該情況下表位由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“V_HH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”、“Nanobody®”以及''''Nanobody®結構域''''(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體體展示技術篩選獲得的。VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本揭露所述的目的。獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已揭露於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。

如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。其它的編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。

“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量非人蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該全人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。“人源化”的例子包括可將源自駱駝科的VHH結構域藉由以人常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列，且在一些具體實施方案中，可含IGHV3的人框架區序列。“人源化”的又一例子包括將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗體可變抗體反應。人源化方法例如蛋白表面胺基酸人源化(resurfacing)及抗體人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)，即將CDR“移植”於其它“支架”(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於該CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。

“預存ADA”(即pre-ADA)是已存在於受試者或個體中的ADA，該受試者或個體將被施用或給予藥物(例如蛋白或多肽類藥物，更例如抗體類藥物)。預存ADA可以存在於首次用於實驗的受試者或個體中(即，以前從未向其施用藥物的受試者或個體)。

通常，“特異性結合”、“選擇性結合”是指結合分子與抗原上的表位結合。本揭露的FAP/4-1BB/CD40結合分子將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10^-7至10^-10莫耳/升(M)、更佳10^-8至10^-10莫耳/升、甚至更佳10^-9至10^-10或更低的解離常數(K_D)，和/或以至少10^-7M、較佳至少10^-8M、更佳至少10^-9M，更佳至少10^-10M的締合常數(KA)結合所要結合的抗原(即FAP、CD40、4-1BB)或其表位。任何大於10^-4M的K_D值一般都視為指示非特異性結合。結合分子對抗原或表位的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本揭露所述的表面電漿共振術(SPR)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和/或流式細胞術分選(FACS)。

“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定表位與給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本揭露所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。

“結合親和力”或“親和力”在本揭露中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度。兩個分子之間的結合親和力可藉由確定解離常數(K_D)來量化。可藉由使用例如表面電漿共振(SPR)方法(Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定K_D。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或koff)。K_D藉由方程K_D=kd/ka與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定，並且甚至可藉由例如Caceci等人(1984，Byte 9：340-362)中所述的那些方法對於複雜混合物進行計算。例如，可使用雙重過濾硝化纖維素濾器結合測定如Wong&Lohman(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5428-5432)中揭露的那種來確定K_D。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和FACS、以及本揭露其它地方例舉的其它測定。抗體的結合動力學和結合親和力也可藉由本領域已知的標準測定，例如表面電漿共振(SPR)，例如藉由使用Biacore^TM系統或KinExA來評價。可藉由比較各個抗體/抗原複合物的K_D值來比較與不同分子相互作用相關的結合親和力，例如，不同抗體對於給定抗原的結合親和力的比較。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的K_D值與非目的相互作用(例如已知不結合FAP的對照抗體)的K_D值進行評價。

“保守性置換”指置換為具有與原始胺基酸殘基相似的特性的另一個胺基酸殘基。例如，賴胺酸、精胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有鹼性側鏈，並且天冬胺酸和谷胺酸具有相似的特性，在於它們具有酸性側鏈。此外，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸和色胺酸具有相似的特性，在於它們具有不帶電荷極性側鏈，並且丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、蘇胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸和甲硫胺酸具有相似的特性，在於它們具有非極性側鏈。另外，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和組胺酸具有相似的特性，在於它們具有芳族側鏈。因此，所屬技術領中具有通常知識者將顯而易見，甚至當置換如上文所述的顯示相似特性的組中的胺基酸殘基時，它將不顯示特性的特定變化。

“同源性”、“同一性”或“序列同一性”是指兩個核酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同核苷酸或胺基酸單體佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被相同核苷酸佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

“核酸”或“多核苷酸”在本文可互換使用，指的是單鏈或雙鏈的任何DNA分子或RNA分子以及在單鏈的情況下，它的互補序列的分子，較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入核酸插入片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本揭露的核酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。

術語“藥學可接受的輔料”或“藥學可接受的賦形劑”包括當與活性成分組合時，允許該成分保留生物學活性並且不與受試者的免疫系統反應的任何材料。例子包括但不限於任何標準藥物載體，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。在一些實施例中，用於氣霧劑或腸胃外施用的稀釋劑是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含此類載體的組成物藉由眾所周知的常規方法配製(參見例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro，編輯，Mack PublishingCo.，Easton，PA，1990；以及R Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing，2000)。

“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。

“阻止...的生長”或“生長抑制”是指抑制細胞的生長或增殖。

“增殖性疾病”指與一定程度的異常細胞增殖有關的病症。在一個實施方案中，增殖性病症指癌症。“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。“癌症”、“癌性”、“增殖性病症”和“腫瘤”在本揭露中提到時並不互相排斥。

“預防癌症”是指在受試者中延遲、抑制或防止癌症發作，該受試者中癌症發生或腫瘤發生的起始尚未得到證實，但是藉由例如遺傳篩查或其它方法確定，已鑑定了癌症易感性。該還包括治療具有癌變前病症的受試者以終止該癌變前病症向惡性腫瘤的進展或導致其消退。

“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸，例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，例如包含本揭露的任一種結合分子或其醫藥組成物作為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種增殖性疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本揭露的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本揭露的受試者可以是動物或人類受試者。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。“和/或”應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中的每一者具有或不具有另一者。因此，諸如本揭露中“A和/或B”的詞組中所用的術語“和/或”包括“A及B”、“A或B”、“A”(單獨)及“B”(單獨)。除非上下文另外清楚要求，否則在整個說明書和申請專利範圍中，應將詞語“包含”、“具有”、“包括”等理解為具有包含意義，而不是排他性或窮舉性意義；也即，“包括但不僅限於”的意義。

本揭露的“受試者”、“患者”意指哺乳動物，尤其靈長類動物，尤其是人。

圖1為待測抗體與人4-1BB抗原的FACS結合測試結果。

圖2為C5_V2，C5_V2-YTI以及C5_V2-YTIQ與HEK293細胞表面人4-1BB的結合。

圖3為抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體(圖3的a至e)以及抗4-1BB/CD40的結構示意圖(圖3的f)。

圖4A為待測抗體與CHOK1細胞表面人FAP結合的FACS檢測結果。圖4B為待測抗體與HEK293細胞表面人4-1BB結合的FACS檢測結果。圖4C為待測抗體與HEK293細胞表面人CD40結合的FACS檢測結果。

圖5A為待測抗體與CHOK1細胞表面人FAP結合的FACS檢測結果。圖5B為待測抗體與HEK293細胞表面人4-1BB結合的FACS檢測結果。圖5C為待測抗體與HEK293細胞表面人CD40結合的FACS檢測結果。

圖6A為待測抗體與CHOK1細胞表面人FAP結合的FACS檢測結果。圖6B為待測抗體與HEK293細胞表面人4-1BB結合的FACS檢測結果。圖6C為待測抗體與HEK293細胞表面人CD40結合的FACS檢測結果。

圖7A至圖7C為待測抗體FAP/CD40依賴的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果。其中，圖7A為交聯前，圖7B為FAP交聯後，圖7C為CD40交聯後。

圖8A至圖8C為待測抗體FAP/CD40依賴的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果。其中，圖8A為交聯前，圖8B為FAP交聯後，圖8C為CD40交聯後。

圖9A至圖9C為待測抗體FAP/CD40依賴的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果。其中，圖9A為交聯前，圖9B為FAP交聯後，圖9C為CD40交聯後。

圖10A至圖10C為待測抗體的FAP/4-1BB依賴的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果。其中，圖10A為交聯前，圖10B為FAP交聯後，圖10C為4-1BB交聯後。

圖11A至圖11C為待測抗體的FAP/4-1BB依賴的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果。其中，圖11A為交聯前，圖11B為FAP交聯後，圖11C為4-1BB交聯後。

圖12A至圖12C為待測抗體的FAP/4-1BB依賴的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果。其中，圖12A為交聯前，圖12B為FAP交聯後，圖12C為4-1BB交聯後。

圖13和圖14為待測抗體對供體1、供體2的T淋巴細胞的激活檢測結果。

圖15為待測抗體對供體1、供體2的CD3+T淋巴細胞的激活檢測結果，均採用RO7122290、MP0310、BNT312、同種型IgG1作為對照。

圖16、圖17和圖18為待測抗體對促DC細胞成熟檢測結果。

圖19為待測抗體交聯4-1BB/CD40表達細胞能力的檢測結果，採用BNT312、同種型IgG1作為對照。

圖20為待測抗體MLR的檢測結果，採用BNT312、同種型IgG1作為對照。

圖21為待測抗體對MC38-mFAP移植瘤的抑瘤效果檢測結果，採用溶媒、RO7122290、Ab10-A12V2-2作為對照。

圖22為給藥後第17天，待測抗體對小鼠ALT/AST的影響結果，採用溶媒、Ab10-A12V2-2、RO7211190作為對照。

圖23為待測抗體對小鼠體重的影響，採用溶媒、RO7122290、Ab10-A12V2-2作為對照。

圖24為待測抗體對小鼠中性粒細胞和血小板數目的影響，採用溶媒、RO7122290、Ab10-A12V2-2作為對照。

圖25為給藥後第8天，待測抗體對小鼠ALT/AST的影響結果，採用溶媒、Ab10-A12V2-2、BNT312作為對照。

實施例1. 抗FAP單株抗體的篩選和製備

1.1 篩選抗原、檢測抗原的序列和製備

人成纖維細胞激活蛋白(FAP；GeneBank登錄號AAC51668)是一種分子量約為170kDa的絲胺酸寡肽酶，是同源二聚體。本揭露使用的重組FAP蛋白序列、來源和用途如表2。

表2. 重組蛋白胺基酸序列來源

1.2 從人天然Fab噬菌體展示庫中篩選h-FAP特異性結合抗體片段

以h-FAP-biotin抗原為靶分子，採用表面帶有親和素的磁珠捕獲抗原特異性噬菌體，並用磁力架進行噬菌體的富集。用pH2.2的甘胺酸溶液沖提抗原特異性噬菌體。

經二輪篩選，隨機挑選284個株，採用噬菌體ELISA篩選陽性株，包括如下具體步驟：計數鋪皿生長菌落，共計284個，接種96孔板，每孔含有400μL培養液(2YT+Amp+0.2%葡萄糖)，37℃下250rpm振搖培養6h。用抗原h-FAP-His包板，100ng/100μL/孔，4℃過夜。第二天，洗滌封閉96孔板後，每孔加100μL過夜培養的菌液，37℃下孵育1h，洗滌，加二抗(HRP標記的抗人IgG-Fab的抗體)，37℃下孵育40min，洗滌，加顯色液，避光保存30min，酶標儀讀取OD600數值。測序經兩次篩選得到的共計122個陽性株，得到74個獨特的VH(構成了VH富集庫)、48個獨特的κ輕鏈(構成了KLC富集庫)和10個獨特的λ輕鏈(構成了LLC富集庫)。

1.3 構建CHO細胞表面全長抗體展示庫

1)構建全長抗體CHO細胞展示基因庫，包括：用三套引子分別PCR擴增VH富集庫、KLC富集庫和LLC富集庫。將三個富集庫經酶切後插入相應的組件載體，構建相應的組件庫。酶切KLC、LLC、VH組件庫，電泳分析純化酶切後的KLC片段庫、LLC片段庫和VH片段庫。酶切全長抗體細胞展示載體，純化載體片段。將酶切純化的載體片段、KLC片段庫、LLC片段庫、VH片段庫混合並連接。純化連接產物，電轉進入大腸桿菌，鋪皿，37℃培養過夜，計數菌落。經檢測，庫容達到3.6×10E6，是理論多樣性(74×58=4292)的800倍以上。收集全部菌落，提取載體DNA，得到全長抗體細胞展示基因庫。

2)構建h-FAP抗原特異性全長抗體細胞展示庫，包括：用全長抗體細胞展示基因庫載體DNA轉化，構建全長抗體CHO細胞展示庫。用潮黴素加壓篩選細胞庫。得到穩定轉化細胞庫，用PE標記的鼠抗人κ(或者λ)輕鏈抗體和FITC標記的h-FAP抗原雙染細胞庫，FACS分選PE和FITC雙陽性細胞，每孔一個細胞，κ輕鏈庫分選2塊96孔板，λ輕鏈庫分選1塊96孔板，潮黴素加壓培養。

3)FACS分析鑑定展示h-FAP抗原特異性抗體單細胞株，包括：潮黴素加壓培養14天，得到穩定轉化κ鏈單細胞株153個，λ鏈單細胞株50個。用0.5mM EDTA-PBS緩衝液消化細胞，用PE標記的鼠抗人κ(或者λ)輕鏈抗體和FITC標記的h-FAP抗原雙染單細胞株，經FACS分析，得到PE和FITC螢光雙陽性單細胞株138個。

4)選殖抗體基因，包括：藉由FACS檢測分析陽性株的親和力，決定對45個株進行抗體基因PCR擴增。離心收集陽性株，棄上清，提取細胞基因組DNA，PCR擴增VH和LC，電泳分離擴增片段，測序分析。其中抗人FAP單株抗體Ab10的可變區序列如下：

>VH

(SEQ ID NO：1)；

>VL

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPPAFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：2)；

其中CDR序列如下：

表3. 抗FAP抗體Ab10的CDR

1.4 抗FAP抗體的表達純化

將上述抗FAP抗體Ab10序列的重輕鏈可變區分別與恆定區人HC和LC進行連接，形成重鏈全長(SEQ ID NO：9)和輕鏈全長序列(SEQ ID NO：10)。構建質粒，瞬時轉染，表達並純化，獲得目的抗體。其中Ab10全長序列如下，下劃線為恆定區序列：

>Ab10重鏈全長

SEQ ID NO：9

>Ab10輕鏈全長

SEQ ID NO：10

>Fab重鏈

SEQ ID NO：66

>Fab輕鏈

SEQ ID NO：67

1.5 ELISA結合測試

直接包被帶His標簽的FAP重組蛋白，加入抗體後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗人IgG的抗體)和HRP受質TMB檢測抗體與抗原結合的活性。包括：用人FAP-His蛋白包被96孔酶標板，按0.5μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。充分洗滌，加入200μL/孔封閉液室溫孵育2h。充分洗滌，每孔加入100μL用稀釋液稀釋好的抗FAP待測抗體。室溫孵育1h，充分洗滌，每孔加入100μL用稀釋液按1：20000倍稀釋的HRP標記的羊抗人IgG二抗。室溫孵育1h，充分洗滌，每孔加入100μL TMB，避光反應15min。加入50μL/孔的0.16M硫酸。Thermo MultiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗FAP抗體Ab10的結合EC₅₀值為0.0920mg/mL。

1.6 表面電漿共振技術(surface plasmon resonance,SPR)結合測試

選用CM5傳感器芯片，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%表面活性劑P20)。抗人IgG(Fc)抗體用10mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)配製成30μg/mL溶液，進行胺基偶聯固定。用HBS-EP+緩衝溶液配製各待測抗體，藉由芯片通道上的抗人IgG(Fc)抗體進行捕獲。用HBS-EP+緩衝溶液配製h-FAP-His作為分析物，2倍梯度稀釋。將稀釋好的抗體在30μL/min的流速下流過實驗通道和參比通道，結合1min，解離15min。用10mM甘胺酸pH1.5作為再生緩衝液，10μL/min的流速下運行30秒。分析數據，表4結果顯示，與對照抗FAP抗體28H1(專利US9266938B2的序列219和序列233)相比較，Ab10與抗原FAP的親和力要高5.3倍。而本揭露同步篩選獲得的其它抗FAP抗體，例如Ab2、Ab4、Ab5(序列未出示)與抗原結合親和力則低於28H1。

表4. 抗FAP抗體的SPR親和力Ka、Kd及K_D值

1.7 FACS結合測試

用FACS實驗檢測抗FAP抗體在細胞上的結合特性。包括：構建過表達人FAP的CHO細胞系，鋪板(1E5/孔)。加入待測抗體，100μL/孔，最高濃度為100nM，5倍稀釋，共8個濃度，4℃孵育1h。加入抗hIgG Alexa Fluor- 647作為二抗，按1：500比例4℃孵育30min，利用FACS進行檢測。能結合FAP的抗體可以標記細胞。人FAP與抗體Ab10的結合EC₅₀值為0.0004320μg/mL。

實施例2. 抗CD40奈米抗體的篩選和製備

2.1 免疫抗原，篩選抗原的序列和製備

選擇帶His標簽的人CD40重組蛋白(h-CD40-His)，C端生物素標簽的人CD40重組蛋白(h-CD40-biotin)，C端帶His標簽的猴CD40重組蛋白(cyno-CD40-His)。序列和來源見表5。該蛋白試劑可用於下述各實施例實驗中。

表5. 重組蛋白胺基酸序列及來源

2.2 羊駝免疫流程及效價檢測

用h-CD40-his免疫羊駝，每兩週免疫一次，共免疫四次。首次免疫時，將0.5mg抗原與弗氏完全佐劑(CFA)1mL混勻皮下注射，後三次免疫將0.25mg抗原與弗氏不完全佐劑(IFA)1mL混勻皮下注射。免疫前採集空白血清，第3次免疫後一週和第4次免疫後一週分別採50mL外周血分離淋巴細胞，檢測血清效價。

2.3 效價檢測及噬菌體文庫構建

羊駝經四次免疫後檢測血清效價。效價合格後，分離PBMC，提取總RNA，檢測純度，反轉錄為DNA，兩輪巢式PCR後將純化載體與VHH目的片段酶切連接。電轉，挑選株，獲得噬菌體文庫A庫和B庫。

2.4 噬菌體文庫親和淘選及ELISA鑑定

以h-CD40抗原為靶分子，採用Gly-HCL酸沖提方法進行篩選，沖提特異噬菌體。經二輪篩選，從第一、二輪滴度測定平板隨機挑選384個株，採用噬菌體ELISA篩選陽性株，檢測450nm下光密度。根據測序結果，對序列進行序列比對和進化樹分析。其中A297的序列如下，下劃線為Kabat編號規則下的CDR：

>A297

(SEQ ID NO：11)；

其中CDR序列如下：

表6. 抗CD40抗體A297的CDR

2.5 抗CD40奈米抗體的人源化

在所獲得的奈米抗體A297的VHH典型結構的基礎上，將VHH可變區序列與抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。本揭露抗體A297較佳人種系模板均為IGHV3-48*03。再把CDR移植到人FR中，對影響抗體結構和功能的關鍵胺基酸進行回復突變，以恢復結合力和活性。其中A297V3的序列如下，下劃線為Kabat編號規則下的CDR：

>A297V3

(SEQ ID NO：15)

2.6 抗CD40奈米抗體與抗原的結合能力檢測

將上述抗CD40奈米抗體序列與帶有C220A，S267E和L328F突變(根據Eu系統編號)的人IgG1-Fc(SEQ ID NO：16)進行連接人IgG1-Fc進行連接。構建質粒，瞬時轉染，表達並純化，獲得目的抗體。採用9E5-SELFNS作為CD40激動劑陽性對照(參見WO2020108611A1的序列58和序列59)。

>IgG1-Fc

(SEQ ID NO：16)

採用FACS檢測人源化抗體與高表達人抗原蛋白CD40的細胞的結合能力。用CD40質粒(Sino Biological；HG10774-CF)瞬時轉染HEK293細胞，獲得高表達CD40的HEK293細胞，用流式染色液(PBS+2% FBS)重新懸浮，加入梯度稀釋後的不同濃度的待檢測抗體。冰上孵育1h後，PBS洗滌，400g離心5min。加入帶有螢光基團Alexa Fluor 647標記的羊抗人Fc抗體作為二抗，冰浴染色1h，PBS清洗兩遍後用FACS檢測細胞表面的螢光信號。EC₅₀值見表7。人源化抗體(A297V4序列未出示)對CD40高表達細胞株均有較高的親和力。

表7. 各人源化抗CD40抗體與人CD40高表達細胞株的親和力EC₅₀值

對HEK-BlueTM CD40L細胞的活化作用。藉由檢測CD40抗體在被FcγRIIb交聯的情況下對HEK-Blue^TMCD40L細胞的活化作用來評價CD40抗體的體外激動活性。人源化CD40抗體的Fc中帶有的S267E/L328F突變，增強了IgG1 Fc與FcγRIIb的親和力，因此也增強了FcγRIIb對抗體的交聯。藉由FcγRIIb介導的CD40抗體對HEK-Blue^TM CD40L細胞的活化作用模擬了CD40抗體在被完全交聯的情況下的激動劑活性。用FcγRIIb質粒(CD32B/Fcgr2b cDNA ORF Clone,Human,N-His tag；Sino Biological；HG10259-NH)瞬時轉染HEK293細胞，獲得高表達FcγRIIb的HEK293細胞。將HEK-Blue^TMCD40L細胞以5E4/孔鋪入96孔細胞培養板(培養基為DMEM，10% FBS，100μg/mL Normocin)，加入5E4/孔表達FcγRIIb的HEK293細胞，每孔加入100μL梯度稀釋的待測抗體，37℃過夜培養。將細胞離心，轉移20μL細胞上清到一個新96孔板中，加入180μL QUANTI-Blue受質溶液，避光孵育30min，用Envision酶標儀測定在620nm處的吸光度，計算EC₅₀值以及Emax值(相對無抗體組螢光強度)，以EC₅₀值來評價CD40抗體的體外細胞激動劑活性。EC₅₀值及Emax值(相對螢光強度)見表8，結果顯示，在上述報告基因細胞體系下，人源化CD40抗體在被FcγRIIb交聯的情況下，人源化CD40抗體的激動劑活性均較強。

表8. 各人源化抗CD40抗體對HEK-Blue^TMCD40L細胞的活化作用

實施例3. 抗4-1BB奈米抗體的製備和篩選

3.1 羊駝免疫、效價檢測和噬菌體文庫親和淘選

使用His標簽的人4-1BB重組蛋白(Acrobiosystems，41B-H5227)免疫羊駝，每兩週免疫一次，共免疫四次。首次免疫時，將0.5mg抗原與1mL的弗氏完全佐劑(CFA)混勻皮下注射，後三次免疫將0.25mg抗原與1mL的弗氏不完全佐劑(IFA)混勻皮下注射。免疫前採集空白血清，第3次免疫後一週和第4次免疫後一週分別採集50mL外周血，分離PBMC，提取總RNA，檢測純度，反轉錄為DNA，兩輪巢式PCR後將奈米抗體目的片段與噬菌體展示載體連接。電轉染，獲得噬菌體文庫。

>人4-1BB蛋白序列

(SEQ ID NO：17)

為獲得同時識別人和猴的抗4-1BB奈米抗體，採用兩輪人、猴抗原的交叉篩選的策略。第一輪和第二輪篩選抗原分別採用人4-1BB和猴4-1BB，或猴4-1BB和人4-1BB。每輪篩選均採用Gly-HCl酸沖提方法，沖提特異性結合4-1BB的噬菌體。從第一輪和第二輪滴度測定平板上分別隨機挑選96個株(共192個株)，採用噬菌體ELISA篩選陽性株，檢測450nm下的光密度。將陽性株進行測序。根據測序結果，進行序列比對和進化樹分析，篩選出14條獨特序列，包括H27、C5、C145等，其中C5序列如下所示。

>C5

(SEQ ID NO：18)；

其中CDR序列如下：

表9. 抗4-1BB奈米抗體C5的CDR(Kabat編號規則)

將C5的序列與帶有C220A，S267E和L328F突變(根據Eu系統編號)的人IgG1-Fc進行連接。連接後的VHH-Fc融合蛋白序列如下所示。以及，在人IgG1的Fc上引入L234A、L235A和N297A(根據Eu系統編號)等突變，以完全去除抗體FcγR介導的效應功能；在人IgG4的Fc上引入S228P(根據Eu系統編號)，以穩定抗體分子阻止半分子形成，這均是可選擇的IgG Fc。

示例性列出C5與IgG1-Fc(含有C220A，S267E，L328F突變)連接的抗體序列，如SEQ ID NO：22所示，下劃線為IgG1-Fc序列：

>C5-Fc

(SEQ ID NO：22)

構建質粒，瞬時轉染細胞，表達抗體，並純化。經檢測，獲得目的抗體。

3.2 抗4-1BB抗體的抗原結合活性及其激動劑活性的檢測

(1)與4-1BB抗原的結合能力檢測

用流式細胞儀檢測抗4-1BB單域抗體與人4-1BB蛋白的結合活性。HEK293-Hu4-1BB細胞由HEK293細胞(ATCC CRL-1573)瞬轉表達人4-1BB蛋白(CD137 cDNA ORF Clone，Human，C-OFPSpark tag；購自Sino Biological，Cat#HG10041-ACR)獲得，細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11995065)，含有10%胎牛血清。實驗培養基為無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清。用實驗培養基洗HEK293-Hu4-1BB細胞兩次，每孔1×10⁵個HEK293-Hu4-1BB細胞種於96孔U底板，加入不同濃度的待測抗4-1BB抗體VHH-Fc樣品，細胞4℃孵育1小時後，用實驗培養基洗兩次；隨後加入羊抗人IgG(H+L)Alexa Fluor 488抗體(Thermo，Cat#A11013)，洗兩次後，流式細胞儀讀取螢光信號值。使用Urelumab單抗為陽性對照，各抗體MFI值見圖1。結果顯示，涉及的抗4-1BB 抗體對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB具有不同程度的結合能力，其中，C5具有良好的細胞膜表面抗原結合活性。

(2)對4-1BB信號通路的激動劑活性檢測

使用4-1BB/NF-κB報告基因評估抗4-1BB抗體的激動劑活性。HEK293細胞(ATCC CRL-1573)瞬轉表達人4-1BB基因(CD137 cDNA ORF Clone，Human，C-OFPSpark tag；購自Sino Biological，Cat#HG10041-ACR)和NF-κB報告基因(pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector，購自Promega，Cat# E849A)，獲得HEK293-Hu4-1BB/NF-κB雙轉染細胞，可以藉由NF-κB信號通路的活化水平表徵4-1BB的激活。用FcγRIIb質粒(CD32B/Fcgr2b cDNA ORF Clone，Human，N-His tag；購自Sino Biological，Cat#HG10259-NH)瞬時轉染HEK293細胞，獲得高表達FcγRIIb的HEK293細胞。細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11995065)，含有10%胎牛血清。將HEK293-Hu4-1BB/NF-κB細胞(2×10⁶/mL)以50μL鋪入96孔細胞培養板，加入40μL培養基或者表達FcγRIIb的HEK293細胞(2.5×10⁶/mL)，每孔加入10×10μL梯度稀釋的待測抗4-1BB抗體，37℃培養6小時。取出細胞，每孔加入等體積Bio-Glo Luciferase Assay System試劑(Promega，Cat# G7940)，避光孵育5分鐘，用Envision酶標儀(PerkinElmer，2150)測定螢光信號，計算EC₅₀值以及Emax值(相對無抗體組螢光強度)，以EC₅₀值來評價抗4-1BB抗體的體外細胞激動劑活性。結果如表10所示。結果顯示，未加入FcγRIIb(即，CD32b)陽性交聯時，涉及的抗4-1BB抗體顯示對4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因信號通路的激活均遠弱於Urelumab對照，說明本揭露的抗4-1BB抗體的安全性更好；加入FcγRIIb交聯後，涉及的抗4-1BB抗體顯示對4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因信號通路的顯著激活，C5的激活能力最強且與 Urelumab對照相當。綜合活性結果，篩選出在FcγRIIb交聯前具有低本底激活，且在FcγRIIb交聯後具有更強激活活性的序列C5，並進行人源化。

表10. 抗4-1BB抗體對4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因的激動活性EC₅₀值

3.3 人源化改造

根據Kabat編號系統標識C5序列的CDR以及FR區(人框架區域，framework)的胺基酸編號，將FR1+CDR1序列，FR2+CDR2序列，FR3+CDR3序列分別於抗體種系數據庫進行配比，分別獲得同源性較高的FR人種系模板。FR1來自IGHV3-64*04，FR2來自IGHV3-23*03，FR3來自IGHV3-74*01。將以上各人種系FR區域分別替換插入原序列，以降低在人體中產生的免疫原性。對影響抗體結構和功能的關鍵胺基酸進行回復突變，以恢復結合力和活性。各人源化序列如下所示。

>C5_V1

(SEQ ID NO：23)；

>C5_V2

(SEQ ID NO：24)；

>C5_V3

(SEQ ID NO：25)；

(註釋：下劃線為CDR區)

將上述3條人源化序列分別與人IgG1-Fc(SEQ ID NO：16)進行連接。構建質粒，瞬時轉染，表達並純化。

3.4 人源化後抗4-1BB抗體的抗原結合活性及其激動劑活性的檢測

(1)與4-1BB抗原的結合能力檢測

人源化抗體使用如3.2所述的FACS檢測方法對抗原結合活性進行檢測。結果見表11。結果顯示，涉及的人源化抗4-1BB抗體對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB具有不同程度的結合能力，C5_V1、C5_V2、C5_V3均保持良好的結合活性。

表11. 人源化前/後抗4-1BB抗體與人4-1BB高表達細胞株的親和力EC₅₀值

(2)對4-1BB信號通路的激動劑活性檢測

人源化抗體使用如3.2所述的NF-κB螢光素酶報告基因實驗中檢測依賴於的4-1BB/NF-κB信號激活，結果見表12。結果顯示，加入FcγRIIb交聯後，涉及的人源化抗4-1BB抗體顯示對4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因信號通路的激活，C5、C5_V1、C5_V2、C5_V3的激活能力與Urelumab對照相當。

表12. 人源化前/後抗4-1BB抗體對NF-κB信號通路的激活作用

3.5 TCE位點的去除

隨後，我們對C5_V2序列進行了T細胞表位預測(T-cell Epitope，TCE)，根據預測結果對C5_V2的CDR3序列進行了改造，以減少TCE數目。將CDR3區域的F突變為Y(F99Y，根據Kabat編號系統)獲得了TCE優化版本的C5_V2序列，命名為C5_V2-YTI，其序列如下：

>C5_V2-YTI

(SEQ ID NO：26)；

即，按照Kabat編號系統，C5_V2-YTI中的CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示，CDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示，CDR3的胺基酸序列如HPLTYTIATMNDYDY(SEQ ID NO：27)所示。

將上述C5_V2-YTI序列與人IgG1-Fc(SEQ ID NO：16)進行連接。構建質粒，瞬時轉染，表達並純化，獲得目的抗體。

3.6 去除TCE後的人源化4-1BB抗體與抗原的結合能力檢測

對人源化抗體C5_V2進行去除TCE的優化，所獲得的抗體為C5_V2-YTI，使用如3.2所述的FACS檢測方法，比較了C5_V2與C5_V2-YTI對抗原結合的活性，結果見表13。結果顯示，涉及的C5_V2-YTI對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB保持良好的結合活性，與C5_V2相當。

表13. C5_V2，C5_V2-YTI與人4-1BB高表達細胞株的親和力EC₅₀值

3.7 降低抗體的聚集風險

我們發現C5_V2-YTI抗體的C端表面有較大的疏水性區域，會導致抗體發生聚集風險。藉由將TLVTVSS序列中的疏水性胺基酸Leu(L)突變為親水性胺基酸Gln(Q)，可以有效減少抗體C端疏水表面區域面積，降低抗體發生聚集的風險。進一步地，為優化該序列的pI值，將序列中的兩個酸性胺基酸Glu(E)分別突變為鹼性胺基酸Gln(Q)和中性胺基酸Ala(A)。改造後抗體命名為C5_V2-YTIQ，其序列如下：

>C5_V2-YTIQ

(SEQ ID NO：28)；

即，按照Kabat編號系統，C5_V2-YTIQ中的CDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示，CDR2的胺基酸序列如DINSGGQSTFYADSVKG(SEQ ID NO：29)所示，CDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：27所示。

也即，上述抗4-1BB奈米抗體有如下通式結構：

CDR1為SYAMS(SEQ ID NO：19)；

CDR2為DINSGGX₁STFYX₂DSVKG(SEQ ID NO：30)，其中X₁為E或Q，其中X₂為E或A；

CDR3為HPLTX₃TIATMNDYDY(SEQ ID NO：31)，其中X₃為F或Y。

3.8 經改造的抗4-1BB奈米抗體與抗原的結合能力檢測

將C5_V2-YTI、C5_V2-YTIQ與人IgG1-Fc(SEQ ID NO：16)進行連接。構建質粒，瞬時轉染，表達並純化，獲得目的抗體。

使用FACS檢測方法，比較了C5_V2，C5_V2-YTI以及C5_V2-YTIQ對抗原結合的活性，結果見圖2，表14，Urelumab為陽性對照。結果顯示，C5_V2，C5_V2-YTI以及C5_V2-YTIQ對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB均保持良好的結合活性。

表14. 抗4-1BB奈米抗體與人4-1BB高表達細胞株的親和力EC₅₀值

實施例4. 抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的設計和製備

4.1 抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的設計及表達純化

構建FAP、4-1BB與CD40的融合蛋白，其分子形式示意圖如圖3所示。

圖3中a所示的分子B977703中，將抗FAP單株抗體Ab10兩條重鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗4-1BB奈米抗體C5V2-YTI的N端連接， 2個抗4-1BB奈米抗體的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗CD40奈米抗體A297V3的N端連接。

圖3中b所示的分子B977704中，將抗FAP單株抗體Ab10兩條重鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗4-1BB奈米抗體C5V2-YTI的N端連接，抗FAP單株抗體Ab10兩條輕鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗CD40奈米抗體A297V3的N端連接。

圖3中c所示的分子B977707中，將兩個抗4-1BB奈米抗體C5V2-YTI藉由(G₄S)₂連接子首尾順次連接，再將其N端藉由連接子(G₄S)₂分別與抗FAP單株抗體Ab10兩條重鏈的C端連接；將抗FAP單株抗體Ab10兩條輕鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗CD40奈米抗體A297V3的N端連接。

圖3中d所示的分子B785502中，將抗FAP單株抗體Ab10兩條重鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗CD40奈米抗體A297V3的N端連接，2個抗CD40奈米抗體A297V3的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗4-1BB奈米抗體C5V2-YTI的N端連接。

圖3中e所示的分子B785503中，將抗FAP單株抗體Ab10兩條重鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗CD40奈米抗體A297V3的N端連接，抗FAP單株抗體Ab10兩條輕鏈的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗4-1BB奈米抗體C5V2-YTI的N端連接。

圖3中f所示的分子B785511是作為對照的特異性抗體4-1BB/CD40，其中兩個抗4-1BB奈米抗體C5V2-YTI藉由IgG1的重鏈鉸鏈區與Fc區的N端連接，Fc區的C端藉由(G₄S)₂連接子分別與抗CD40奈米抗體A297V3的N端連接。

圖3中a至f所示分子中Fc為人IgG1 Fc，其中帶有L234A和L235A的突變，以去除FcγR介導的效應功能。

4.2 抗EAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的改造設計及表達純化

為了降低的與預存抗藥物抗體(pre-ADA)或抗藥物抗體(ADA)的結合，對抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的C端的奈米抗體進行改造，將奈米抗體的C末端的TVSS突變為TVSAA。對A297V3優化的序列為A297V3_AA，C5_V2-YTI優化的序列為C5_V2-YTI_AA。

>A297V3_AA

(SEQ ID NO：32)

>C5_V2-YTI_AA

(SEQ ID NO：33)

將B977703中位於重鏈C端的抗CD40奈米抗體A297V3改造為A297V3_AA，得到B21326101；將B977704中位於輕鏈C端的抗CD40奈米抗體A297V3改造為A297V3_AA，B977704中位於重鏈C端的抗4-1BB奈米抗體C5_V2-YTI改造為C5_V2-YTI_AA，得到B21326102。具體的分子序列見表32。

4.3 降低抗體聚集的抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的改造設計及表達純化

為降低聚集，我們對B21326101進一步改造，將C5_V2-YTI替換成C5_V2-YTIQ(SEQ ID NO：28)，優化後的分子命名為B21546901。

4.4 對照分子

BNT312為CD40/4-1BB雙抗分子，Ab10-A12V2-2為FAP/CD40雙抗分子，RO7300490為FAP/CD40雙抗分子，RO7122290為FAP/4-1BBL雙抗分子，MP0310為FAP/4-1BB雙抗分子，均用作對照分子。

以上多特異性抗體序列，見表32。對照分子序列詳見表33。

4.5 表達與純化

瞬時轉染與表達：以30mL表達體系為例，將培養液稀釋60μL轉染試劑後與15μg質粒混勻，37℃孵育15分鐘後，將混合轉染液逐滴加入細胞液中，邊搖邊加，放置搖床培養表達一週，收集上清，8000rpm離心5分鐘。

抗體純化：首先平衡Protein A親和層析管柱，1×PBS，流速1mL/min，20mL；上樣流速為1mL/min；洗雜1×PBS，流速1mL/min，20mL；使用檸檬酸緩衝液(pH3.4)，1mL/min進行沖提，分管收集，使用NanoDrop儀讀取280nm吸光度值；最後將高濃度蛋白轉移至透析袋透析放1×PBS的燒杯中透析。經檢測，獲得目的抗體。

實施例5. 抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的抗原結合活性檢測

5.1 抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的抗原結合活性檢測

用FACS實驗檢測抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體與人FAP/4-1BB/CD40蛋白的結合活性。CHO-K1-HuFAP細胞由CHO-K1細胞穩轉表達人FAP蛋白獲得，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清和800μg/mL潮黴素B。HEK293-Hu4-1BB細胞和HEK293- HuCD40細胞分別由HEK293細胞過表達人4-1BB和人CD40蛋白獲得，細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11965092)，含有10%胎牛血清和100μg/mL潮黴素B。實驗培養基為無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清。用實驗培養基洗CHO-K1-HuFAP、HEK293-Hu4-1BB或HEK293-HuCD40細胞兩次，每孔1×10⁵個細胞種於96孔U底板，加入不同濃度的待測樣品，細胞4℃孵育1小時後，用實驗培養洗兩次；隨後加入Alexa Fluor 647-鼠抗人(IgG，Fcγ fragment specific)抗體(Jackson，Cat#209-605-098)，洗兩次後，流式細胞儀讀取螢光信號值。

表15、圖4A中FACS檢測結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對CHO-K1-HuFAP細胞表面的FAP具有強結合能力，和對照抗體RO7122290的結合能力相當，說明製備成多特異性抗體後，不影響抗體與FAP的結合。表16、圖4B結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB具有良好的結合能力。表17、圖4C結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-HuCD40細胞表面的CD40具有較好結合，說明製備成多特異性抗體後，不影響抗體與CD40的結合。

表15. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體結合CHO-K1-HuFAP細胞的結果

表16. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體結合HEK293-Hu4-1BB細胞的結果

表17. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體結合HEK293-HuCD40細胞的結果

5.2 抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的抗原結合活性檢測

採用實施例5.1提供的檢測方法，對FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B977703、B977704、B21326101、B21326102的抗原結合活性進行檢測，以RO7122290、Ab10-A12V2-2、BNT312、IgG1作為對照。

FACS檢測結果(表18-20、圖5A至圖5C)顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對CHO-K1-HuFAP細胞表面的FAP具有強結合能力(表18、圖5A)。表19、圖5B示出了FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB具有良好的結合能力，4-1BB序列改造後的多特異性抗體在 4-1BB結合上無差別，說明4-1BB序列修改對靶點結合無影響。表20、圖5C示出了FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-HuCD40細胞表面的CD40具有結合能力，說明CD40序列中去除pre-ADA改造對靶點結合沒有明顯的影響。

表18. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體結合CHO-K1-HuFAP細胞的結果

表19. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體結合HEK293-Hu4-1BB細胞的結果

表20. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體結合HEK293-HuCD40細胞的結果

5.3 抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的抗原結合活性檢測

採用實施例5.1提供的檢測方法，對FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B21546901、B21326102的抗原結合活性進行檢測，以RO7122290、RO7300490、BNT312、IgG1作為對照。

FACS檢測結果(表21-23、圖6A至圖6C)顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對CHO-K1-HuFAP細胞表面的FAP具有強結合能力，強於RO7300490，與對照抗體RO7122290的結合能力相當。表22示出了FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB具有良好的結合能力，說明4-1BB序列中降低抗體聚集風險改造對與4-1BB的結合未產生明顯影響。表23示出了FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-HuCD40細胞表面的CD40具有良好的結合能力。

表21. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體結合CHO-K1-HuFAP細胞的結果

表22. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體結合HEK293-Hu4-1BB細胞的結果

表23. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體結合HEK293-HuCD40細胞的結果

上述結果顯示：抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對CHO-K1-HuFAP細胞表面的FAP具有強結合能力，和對照抗體RO7122290的結合能力相當，說明製備成三特異性抗體後，不影響抗體與FAP的結合。抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-Hu4-1BB細胞表面的4-1BB具有良好的結合能力，B977704和改造後的B21326102在4-1BB結合上無差別，說明4-1BB序列修改對靶點結合無影響。抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對HEK293-HuCD40細胞表面的CD40具有結合能力，說明CD40序列修改對靶點結合沒有明顯的影響。

實施例6. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的螢光素酶報告基因檢測

6.1 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

使用4-1BB/NF-κB報告基因檢測實驗評估抗體的激動劑活性。HEK293細胞(ATCC CRL-1573)瞬轉表達人4-1BB基因(CD137 cDNA ORF Clone，Human，C-OFPSpark tag；Sino Biological，Cat#HG10041-ACR)和NF-κB基因組(pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]Vector，Promega，Cat# E849A)，獲得HEK293-Hu4-1BB/NF-κB雙轉染細胞，可以藉由NF-κB信號通路的活化水平表徵Hu4-1BB的激活。CHO-K1-HuFAP細胞由CHO-K1細胞穩轉表達人FAP蛋白獲得，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清和800μg/mL潮黴素B。HEK293-HuCD40細胞由HEK293細胞過表達人CD40蛋白獲得，細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11965092)，含有10%胎牛血清和100μg/mL潮黴素B。將HEK293-Hu4-1BB/NF-κB細胞(2×10⁶/mL)以50μL鋪入96孔細胞培養板，加入40μL培養基、表達FAP的CHO-K1-HuFAP 細胞或表達CD40的HEK293-HuCD40細胞(2.5×10⁶個/mL)，每孔加入10×10μL梯度稀釋的待測抗體，37℃培養6小時。取出細胞，每孔加入等體積Bio-Glo Luciferase Assay System試劑(Promega，Cat# G7940)，避光孵育5分鐘，用Envision酶標儀測定螢光信號，計算EC50值以及Emax值(相對無抗體組螢光強度)，並評價抗4-1BB抗體的體外細胞激動劑活性。

結果顯示(表24、圖7A至圖7C)，未交聯的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B977703、B977704抗體沒有4-1BB的本底激活，其他抗體均有一定的本底激活。FAP/4-1BB/CD40多功能抗體均有FAP或CD40交聯激活的4-1BB活性。

表24. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的FAP/CD40依賴的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果(未交聯、FAP交聯、CD40交聯)

6.2 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

藉由實施例6.1中提供的方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的4-1BB激動劑活性。結果見圖8A至圖8C，表25。

表25和圖8A結果顯示，無交聯的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體沒有4-1BB的本底激活。表25和圖8B結果顯示，藉由FAP進行交聯後抗體4-1BB的激動活性B977703、B977704和B21326101、B21326102激活能力相當，說明4-1BB序列改造對4-1BB激活活性無影響。表25和圖8C結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均有CD40交聯激活的4-1BB活性，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體藉由CD40進行交聯後抗體4-1BB的激動活性強於BNT312。

表25. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體的FAP/CD40依賴的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果

6.3 FAP/4-1BB/CD40多功能抗體的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

藉由實施例6.1中提供的方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的4-1BB激動劑活性。結果見圖9A至圖9C，表26。

表26和圖9A顯示，未交聯的B21546901和B21326102抗體沒有本底激活活性。表26和圖9B顯示，藉由FAP進行交聯後抗體4-1BB的激動活性與RO7122290激活能力相當。表26和圖9C顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均有CD40交聯激活的4-1BB活性，藉由CD40進行交聯後抗體4-1BB的激動活性強於BNT312。

表26. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體的FAP/CD40依賴的4-1BB/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果(未交聯、FAP交聯、CD40交聯)

上述結果顯示：未交聯的抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B977703、B977704、B21326101、B21326102、B21546901抗體沒有4-1BB的本底激活；藉由FAP進行交聯後的多個抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體4-1BB的激動活性無明顯差異，表明4-1BB序列改造對4-1BB激活活性無影響；藉由CD40進行交聯後的多個抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體4-1BB的激動活性相當，且CD40進行交聯後抗體4-1BB的激動活性強於BNT312。

實施例7. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的螢光素酶報告基因檢測

7.1 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

使用CD40/NF-κB報告基因評估抗體的激動劑活性。HEK-Blue^TMCD40L(InvivoGen，hkb-cd40)細胞，細胞培養基為DMEM(Gibco， Cat#11965092)，含有10%熱滅活胎牛血清100μg/ml Normocin^TM(InvivoGen，ant-nr-1)，可以藉由NF-κB信號通路的活化水平表徵HuCD40的激活。CHO-K1-HuFAP細胞由CHO-K1細胞穩轉表達人FAP蛋白獲得，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清和800μg/mL潮黴素B。HEK293-Hu4-1BB細胞由HEK293細胞過表達人4-1BB蛋白獲得，細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11965092)，含有10%胎牛血清和100μg/mL潮黴素B。將HEK-Blue^TMCD40L(1×10⁶個/mL)以100μL鋪入96孔細胞培養板，加入80μL培養基、表達FAP的CHO-K1-HuFAP細胞或表達4-1BB的HEK293-Hu4-1BB細胞(1.25×10⁶/mL)，每孔加入20×10μL梯度稀釋的待測抗體，37℃培養過夜。取出細胞，每孔取出20μL加入180μL QUANTI-Blue^TM(InvivoGen，re-qbs3)，避光，37℃孵育30分鐘，用Envision酶標儀測定OD655，計算EC50值以及Emax值(相對無抗體組讀值)，並評價抗CD40抗體的體外細胞激動劑活性。結果見圖10A至圖10C，表27。

表27和圖10B結果顯示，藉由FAP進行交聯後的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體CD40的激動活性，與RO7300490以及Ab10-A12V2-2分子激活能力相當。表27和圖10C結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均有4-1BB交聯激活的CD40活性。

表27. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的FAP/4-1BB依賴的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果(未交聯、FAP交聯、4-1BB交聯)

7.2 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

藉由實施例7.1中提供的方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的CD40激動劑活性。結果見圖11A至圖11C，表28。

表28和圖11B結果顯示，藉由FAP進行交聯後FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體CD40的激動活性與Ab10-A12V2-2分子激活能力相當，同時B977703、B977704和B21326101、B21326102激活能力相當，說明CD40序列改造對CD40激活活性無影響。表28和圖11C結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均有4-1BB交聯激活的活性，與BNT312激活活性相當。

表28. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體的FAP/4-1BB依賴的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果

7.3 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測實驗

藉由實施例7.1中提供的方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的CD40激動劑活性。結果見圖12A至圖12C，表29。

表29和圖12B結果顯示，藉由FAP進行交聯後涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體CD40的激動活性實驗中，與RO7300490以及Ab10-A12V2-2分子激活能力相當。表29和圖12C結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均有4-1BB交聯激活的活性，B21546901略弱於BNT312，而B21326102與BNT312相當。

表29. FAP/4-1BB/CD40多功能抗體的FAP/4-1BB依賴的CD40/NF-κB螢光素酶報告基因檢測結果(未交聯、FAP交聯、4-1BB交聯)

上述結果顯示：藉由FAP進行交聯後的多個抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體CD40的激動活性無明顯差異，與Ab10-A12V2-2分子激活能力相當，表明CD40序列改造對CD40激活活性無影響；藉由4-1BB交聯的抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均有CD40激活活性。

實施例8. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的T淋巴細胞激活檢測

8.1 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的T淋巴細胞激活實驗

使用T淋巴細胞激活實驗檢測抗體在FAP存在或者不存在的情況下，對T細胞的刺激能力。新鮮分離純化的PBMC重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，密度調整為1×10⁶個/mL。CHO-K1-HuFAP細胞由CHO-K1細胞穩轉表達人FAP蛋白獲得，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清和800μg/mL潮黴素B。復蘇後傳代調整細胞狀態，密度調整為1.25×10⁶個/mL。使用0.25μg/mL抗CD3抗體OKT3(Invitrogen，Cat#16-0037-85)包被96孔板，每孔100μL，37℃孵育2小時後使用PBS洗去殘餘抗體。隨後，每孔100μL PBMC細胞(1×105個/孔)與80μL培養基或CHO-K1-HuFAP細胞(1×10⁵個/孔)接種於OKT3包被後的96孔板，以20μL/孔的體積加入10×不同濃度的待測樣品，37℃，5% CO₂培養箱孵育3天。取出細胞培養板，離心(400g，5分鐘)收集細胞培養上清，採用人IL2檢測試劑盒(Cisbio，Cat#62HIL02PEG)檢測IL-2的水平。具體操作參考試劑說明書，結果見圖13。

圖13結果顯示，兩個供體中，涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B977707有一定的本底激活活性。在FAP交聯後，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均可以激活IL-2的分泌，對T淋巴細胞的激活活性明顯提高。

8.2 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的T淋巴細胞激活實驗

藉由實施例8.1提供的實驗方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體對T細胞的刺激能力。結果見圖14。

圖14結果顯示，兩個供體中，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B21326102和對照抗體BNT312均有一定本底T細胞激活活性。在FAP交聯後，涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均可以較好地激活T細胞分泌IL-2，對T細胞的激活能力明顯提高。

8.3 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的T淋巴細胞激活實驗

新鮮分離純化的PBMC重新懸浮於MACS Buffer(Miltenyi Biotec，Cat#130-091-221)，使用EasySepTM Human T Cell Isolation Kit(Stemcell，Cat#17951)分離CD3 T細胞，具體操作參考試劑盒說明書。分離純化的CD3 T細胞重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，密度調整為1×10⁶個/mL。CHO-K1-HuFAP細胞由CHO-K1細胞穩轉表達人FAP蛋白獲得，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清和800μg/mL潮黴素B。HEK293-HuCD40細胞由HEK293細胞過表達人CD40蛋白獲得，細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11965092)，含有10%胎牛血清和100μg/mL潮黴素B。復蘇後傳代調整細胞狀態，密度調整為1.25×10⁶個/mL。使用0.25μg/mL抗CD3抗體OKT3(Invitrogen，，Cat#16-0037-85)包被96孔板，每孔100μL，37℃孵育2小時後使用PBS洗去殘餘抗體。隨後，每孔100μL PBMC細胞(1×10⁵個/孔)與80μL培養基、CHO-K1-FAP細胞或HEK293-HuCD40(1×10⁵個/孔)接種於OKT3包被後的96孔板，以20μL/孔的體積加入10×不同濃度的待測樣品，37℃，5% CO₂培養箱孵育3天。取出細胞培養板，離心(400g，5分鐘)收集細胞培養上清，採用人IL-2檢測試劑盒(Cisbio，Cat#62HIL02PEG)檢測IL-2的水平。具體操作參考試劑說明書。結果見圖15。

圖15結果顯示，兩個供體中，在FAP交聯後，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均可以激活IL-2的分泌，強於MP0310。在CD40交聯後，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均可以激活IL-2的分泌，強於對照抗體BNT312。

實施例9. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的促DC成熟檢測

9.1 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的促DC成熟實驗

使用促DC成熟實驗來驗證抗體在FAP存在或不存在的情況下，促使DC成熟的能力。新鮮分離純化的PBMC重新懸浮於MACS Buffer(Miltenyi Biotec，Cat#130-091-221)，使用EasySep^TM Human Monocyte Isolation Kit(Stemcell，Cat#19359)分離單核細胞，具體操作參考試劑盒說明書。分離得到的單核細胞重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，50ng/mL GM-CSF(Peprotech，200-04)and 50ng/mL IL4(Peprotech，300-03)，密度調整為1×10⁶個/mL，每皿10ml放入100mm TC-treated Culture Dish(Corning，430167)，每2-3天換液培養5天得到iDC。400xg，10分鐘離心收集iDC，重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，密度調整為1×10⁶個/mL，每孔50μL。以50μL/孔的體積加入3×不同濃度的待測樣品。CHO-K1-HuFAP細胞由CHO-K1細胞穩轉表達人FAP蛋白獲得，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清和800μg/mL潮黴素B。CHO-K1-WT，細胞培養基為Ham’s F12+GlutaMAXTM-I(Gibco，Cat#31765035)，含有10%胎牛血清。300xg，5分鐘離心收集CHO-K1-HuFAP和CHO-K1-WT，無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)洗滌兩次，重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)中，密度調整為1×10⁶個/mL，加入10μg/mL Mitomycin C(Sigma，Cat#50-07-7)，37℃孵育45分鐘。孵育結束後PBS洗滌兩次，重新懸浮於無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)，密度調整為2×10⁶個/mL，加入5μM Cell Trace Violet(ThermoFisher，Cat#C345557 A)，37℃避光孵育10分鐘。10分鐘後加入等體積的RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有40%胎牛血清避光終止反應10分鐘，無菌PBS洗滌兩次，重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，密度調整為1×10⁶個/mL，每孔50μL，總體積150μL，37℃，5% CO₂培養箱孵育48小時。

48小時孵育結束後，DC轉移至新的96孔U底板。300xg，5分鐘離心洗滌兩次，每孔加入100μL FACS Buffer(無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清)含有0.1μL live/dead dye APC-efluor780(BD Pharmingen，Cat#565388)，室溫避光孵育15分鐘，300xg，5分鐘離心洗滌兩次。每孔加入50μL FACS Buffer(無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清)含有1μL Human Trustain FCXTM(Biolegend，Cat#422302)，室溫避光孵育10分鐘，加入50μL FACS Buffer(無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清)含有2.5μL PE Mouse Anti-Human CD86(BD Pharmingen，Cat#555658)，冰上避光孵育30分鐘，孵育結束後使用FACS Buffer離心洗滌兩次，重新懸浮於FACS Buffer中，流式細胞儀讀取螢光信號值。結果見圖16。

結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均沒有本底促DC細胞成熟活性。在FAP交聯後，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均可以促使DC細胞成熟，活性與Ab10-A12V2-2分子以及RO7300490相當。

9.2 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的促DC成熟實驗

藉由實施例8.1提供的實驗方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體促進DC成熟的活性。結果見圖17。

結果顯示，涉及的FAP/4-1BB/CD40多功能抗體均沒有本底激活DC細胞成熟活性。在FAP交聯後，FAP/4-1BB/CD40多功能抗體均可以促使DC細胞成熟，活性與Ab10-A12V2-2分子相當。

9.3 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的促DC成熟實驗

藉由實施例8.1提供的實驗方法，檢測FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體促進DC成熟的活性。結果見圖18。

結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均無本底促DC成熟活性。在FAP交聯後，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均促使DC細胞成熟，與Ab10-A12V2-2分子以及RO7300490相當。在4-1BB交聯後，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均促使DC細胞成熟，B21326102強於對照抗體BNT312，B21546901弱於對照抗體BNT312。

實施例10. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的4-1BB/CD40表達細胞交聯能力檢測

從BNT312的臨床結果來看，CD40-4-1BB在外周的交聯激活會引起嚴重的肝毒性。所以我們三抗分子需要藉由強的FAP結合能力達到腫瘤靶向作用，同時減弱CD40-4-1BB間的交聯能力來減少外周的激活，減少肝毒性的產生。用FACS實驗檢測FAP/4-1BB/CD40多功能抗體交聯4-1BB/CD40表達細胞的能力。HEK293-Hu4-1BB細胞和HEK293-HuCD40細胞分別由HEK293細胞過表達人4-1BB和人CD40蛋白獲得，細胞培養基為DMEM(Gibco，Cat#11965092)，含有10%胎牛血清和100μg/mL潮黴素B。實驗培養基為無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清。300xg，5分鐘離心收集HEK293-Hu4-1BB和HEK293-HuCD40細胞，無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)洗滌兩次，重新懸浮於無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)，密度調整為2×10⁶個/mL，加入5μM Cell Trace Violet(ThermoFisher，Cat#C345557 A)和5μM Cell Trace Far red(ThermoFisher，Cat#C34564 A)，37℃避光孵育10分鐘。10分鐘後加入等體積的RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有40%胎牛血清避光終止反應10分鐘，無菌PBS洗滌兩次，重新懸浮於FACS Buffer(無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，pH7.40)含有2%胎牛血清)，密度調整為2×10⁶個/mL，每孔加入HEK293-Hu4-1BB和HEK293-HuCD40細胞各50μL，以50μL/孔的體積加入3×不同濃度的待測樣品，總體積150μL，4℃孵育1小時。孵育結束後使用流式細胞儀讀取螢光信號值。結果見圖19。

結果顯示，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均可以交聯4-1BB/CD40表達細胞。交聯能力上，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均弱於對照抗體BNT312。

實施例11. FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的混合淋巴細胞培養檢測

使用混合淋巴細胞培養檢測三抗分子和對照分子BNT312的CD40/4-1BB交聯能力。凍存的PBMC重新懸浮於MACS Buffer(Miltenyi Biotec，Cat#130-091-221)，使用EasySep^TM Human Monocyte Isolation Kit(Stemcell，Cat#19359)分離單核細胞，具體操作參考試劑盒說明書。分離得到的單核細胞重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，50ng/mL GM-CSF(Peprotech，200-04)and 50ng/mL IL4(Peprotech，300-03)，密度調整為1×10⁶個/mL，每皿10ml放入100mm TC-treated Culture Dish(Corning，430167)，37℃每2-3天換液培養5天得到iDC。400xg，10分鐘離心收集iDC，重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，1ng/mL金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB，Toxin Technology，Cat#BT202)，密度調整為2×10⁵個/mL，每孔50μL。另一供體凍存的PBMC重新懸浮於MACS Buffer(Miltenyi Biotec，Cat#130-091-221)，使用人CD8 T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec，Cat#130-096-495)分離CD8 T細胞，具體操作參考試劑盒說明書。分離得到的人CD 8T重新懸浮於RPMI1640(Gibco，Cat#10491A-01)，含有10%胎牛血清，密度調整為1×10⁶個/mL，每孔50μL。以50μL/孔的體積加入3×不同濃度的待測樣品，總體積150μL，37℃孵育5天。取出細胞培養板，離心(400g，5分鐘)收集細胞培養上清，採用人IL-2檢測試劑盒(Cisbio，Cat#62HIL02PEG)檢測IL-2的水平。具體操作參考試劑說明書。結果見圖20。

結果顯示，對照抗體BNT312分泌的IL-2在兩個濃度上均高於涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體。

總結，FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體在交聯4-1BB/CD40表達細胞和刺激IL-2分泌實驗為對非FAP依賴的分子表徵。FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均弱於對照抗體BNT312的結果表明，在4-1BB端和CD40端同時發揮作用的情況下，非FAP依賴情況下的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的本底激活低。FAP/4-1BB/CD40特異性抗體具有FAP介導的腫瘤定位的能力，同時降低外周非FAP依賴的激活，可以降低毒性。

實施例12抗FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體的體內藥效和毒性研究

12.1 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體在小鼠結腸癌模型MC38-mFAP中的體內藥效

將MC38-mFAP細胞(公司內部構建)以2×10⁵個/100μL/隻接種於B-h4-1BB/CD40人源化小鼠(百奧賽圖公司提供)皮下，待腫瘤生長到大約110mm³時按腫瘤體積挑選48隻隨機分組，每組6隻，共8組，分別為：溶媒、B977703(6mg/kg)、B977703(2mg/kg)、B977704(6mg/kg)、B977704(2mg/kg)、B977707(2.28mg/kg)、RO7122290(1.76mg/kg)和Ab10-A12V2-2(1.72mg/kg)。一週給藥2次，給藥和觀察期間每週測量2次腫瘤體積，並記錄測量值。其中，B977703(2mg/kg)、B977704(2mg/kg)、B977707(2.28mg/kg)、RO7122290(1.76mg/kg)和Ab10-A12V2-2(1.72mg/kg)為等莫耳劑量給藥。

計算腫瘤體積(tumor volume，TV)，計算公式為TV=1/2×a×b₂，其中a，b分別代表測量腫瘤的長徑和短徑。

相對腫瘤增值率T/C%=(T-T0)/(C-C0)×100%；抑瘤率TGI%=1-T/C%。

CR%(腫瘤完全消退比例)=腫瘤完全消退(<110mm³)的小鼠數量/入組小鼠數量。

結果見圖21，表30。結果顯示，不同劑量的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B977703、B977704、B977707均具有良好的抗腫瘤活性，其抗腫瘤活性優於對照抗體RO7122290和Ab10-A12V2-2。

表30. 不同FAP/4-1BB/CD40多功能抗體對小鼠移植瘤的抑瘤作用

(P值：*為p<0.05，**P<0.01，***P<0.001)

12.2 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體在小鼠結腸癌模型MC38-mFAP中的肝毒性檢測

在12.1試驗中，第17天取血檢測穀草轉胺酶(AST)，穀丙轉胺酶(ALT)，結果見圖22；並一週2次測定體重，結果見圖23。

結果顯示，給藥過程中小鼠體重平穩，提示涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性能抗體沒有明顯的毒副作用(圖23)。第17天ALT/AST檢測結果顯示(圖22)，涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均未顯示明顯肝毒性。

12.3 FAP/4-1BB/CD40多功能抗體在小鼠結腸癌模型MC38-mFAP中的血液毒性檢測

在12.1試驗中，第一次給藥後24h取血檢測血常規。

結果顯示(圖24)，涉及的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體均沒有引起中性粒細胞(NEUT#)和血小板(PLT)的減少，無血液毒性。

12.4 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體在小鼠結腸癌模型MC38-mFAP中的體內藥效

將MC38-mFAP細胞(公司內部構建)以2×10⁵個/100μL/隻接種於B-h4-1BB/CD40人源化小鼠(百奧賽圖公司提供)皮下，待腫瘤生長到大約110mm³時按腫瘤體積挑選42隻隨機分組，每組6隻，共7組，分別為：溶媒、B21326101(6mg/kg)、B21326101(2mg/kg)、B21326101(0.5mg/kg)、Ab10-A12V2-2(0.43mg/kg)、BNT312(4.47mg/kg)和BNT312(1.49mg/kg)。B21326101(6mg/kg)、B21326101(2mg/kg)、BNT312(4.47mg/kg)和BNT312(1.49mg/kg)每3天給藥1次，給藥3次。其中，B21326101(6mg/kg)和BNT312(4.47mg/kg)為等莫耳計量給藥，B21326101(2mg/kg)和NT312(1.49mg/kg)為等莫耳計量給藥，B21326101(0.5mg/kg)和Ab10-A12V2-2(0.43mg/kg)為等莫耳計量給藥。B21326101(0.5mg/kg)、Ab10-A12V2-2(0.43mg/kg)每3天給藥1次，給藥4次。給藥和觀察期間每週測量2次腫瘤體積，並記錄測量值。在給藥後46天時，在CR小鼠對側皮下和Naïve B-h4-1BB/CD40人源化小鼠皮下接種MC38-mFAP細胞(2×10⁵個/100μL/隻)，繼續測量小鼠腫瘤體積，並記錄測量值。腫瘤體積(tumor volume，TV)、相對腫瘤增值率T/C%，抑瘤率TGI%，以及CR%(腫瘤完全消退比例)的計算方法見12.1。

結果見表31。結果顯示，涉及的不同劑量的FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體B21326101具有良好的抗腫瘤活性，優於對照抗體BNT312和Ab10-A12V2-2。

表31. 不同FAP/4-1BB/CD40多功能抗體對小鼠移植瘤的抑瘤作用

12.5 FAP/4-1BB/CD40多特異性抗體在小鼠結腸癌模型MC38-mFAP中的肝毒性檢測

在12.4試驗中，第8天取血檢測AST，ALT。

結果見圖25。第8天ALT/AST檢測結果顯示，涉及的FAP/4-1BB/CD40多功能抗體均未出現肝毒性，安全性較好。BNT312在高、低劑量均出現明顯肝毒性。

表32. 抗FAP/4-1BB/CD40三特異性抗體的胺基酸序列

表33. 對照抗體的胺基酸序列

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Claims

一種FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，和特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域；其中，該第三抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域；

該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：28、18、23-26和33中任一項所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。
如請求項1所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含分別如SEQ ID NO：19、30和31所示的CDR1、CDR2和CDR3；

較佳地，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如下任一項所示的CDR1、CDR2和CDR3：

a-1)分別如SEQ ID NO：19、29和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；

a-2)分別如SEQ ID NO：19、20和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；或

a-3)分別如SEQ ID NO：19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3。
如請求項1或2所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、降低與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的；

較佳地，該人源化改造的人種系基因的框架區模板來源於IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。
如請求項1至3中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第三抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：28、18、23-26和33中任一項所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第二抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：32、11或15所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。
如請求項5所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含分別如SEQ ID NO：12、13和14所示的CDR1、CDR2和CDR3；

較佳地，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域為人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低抗體異構化、降低與預存抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低與抗藥物抗體(ADA)結合改造的；

較佳地，該人源化改造的人種系基因的重鏈框架區模塊來源於IGHV3-48*03。
如請求項5或6所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：32、11或15所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1至7中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第一抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該VH包含分別如SEQ ID NO：3、4和5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；以及

該VL包含分別如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項8所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，

該重鏈可變區包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；和，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

較佳地，該第一抗原結合結構域選自Fab、Fab’、Fv或ScFv，更佳為Fab；

較佳地，該第一抗原結合結構域包含Fab重鏈和Fab輕鏈，其中，

該Fab重鏈包含如SEQ ID NO：66所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；和，

該Fab輕鏈包含如SEQ ID NO：67所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一種FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，和特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域；其中，該第一抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中，

該VH包含分別如SEQ ID NO：3、4和5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

該VL包含分別如SEQ ID NO：6、7和8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

較佳地，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：1所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；和，

該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：2所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

較佳地，該第一抗原結合結構域包含Fab重鏈和Fab輕鏈，其中，

該Fab重鏈包含如SEQ ID NO：66所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；和，

該Fab輕鏈包含如SEQ ID NO：67所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

較佳地，該第三抗原結合結構域如請求項1至4中任一項所定義；

較佳地，該第二抗原結合結構域如請求項5至7中任一項所定義。
一種FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含特異性結合FAP的第一抗原結合結構域，特異性結合CD40的第二抗原結合結構域，和特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域；其中，該第二抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變殼結構域，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含分別如SEQ ID NO：12、13和14所示的CDR1、CDR2和CDR3；

該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；

較佳地，該第二抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域包含如SEQ ID NO：11、15或32所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

較佳地，該第三抗原結合結構域如請求項1至4中任一項所定義；

較佳地，該第一抗原結合結構域如請求項8或9所定義。
如請求項1至11中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其進一步包含Fc區；

較佳地，該Fc區來源於人IgG1、IgG2或IgG4的Fc區；

更佳地，該人IgG1的Fc區具有如下所示突變的至少一種：234A，235A，220A，297A或297Q，267E，328F；

更佳地，該人IgG4的Fc區具有如下所示突變的至少一種：228P、234A、235A，447A；

上述突變根據EU編號規則編號。
如請求項1至12中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其進一步包含連接子，該連接子位於第一、第二和第三抗原結合結構域中的任意二者之間；

較佳地，該連接子為(G_xS)_y連接子，其中，x選自1-5的整數，y選自1-6的整數；

更佳地，x為4，y為1、2或3。
如請求項1至13中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其中，該第一抗原結合結構域、該第二抗原結合結構域與該第三抗原結合結構域的價數比為(1-2)：(1-5)：(1-5)；較佳為1：2：2、1：2：4、1：1：1或1：1：2。
一種FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含第一多肽鏈、和第二多肽鏈，其中，從N末端向C末端方向，該FAP/4-1BB/CD40結合分子包含如下任一組或組合：

(I)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]-[連接子]b-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]；

(II)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]-[連接子]b-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；

(III)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]-[連接子]b-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]-[連接子]c-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；

(IV)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]-[連接子]b-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]；

(V)第一多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab重鏈]-[Fc區]-[連接子]a-[特異性結合CD40的第二抗原結合結構域]；和，

第二多肽鏈：[特異性結合FAP的第一抗原結合結構域的Fab輕鏈]-[連接子]b-[特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域]；

其中，-表示肽鍵，任意兩個連接子可以相同，也可以不同；a、b、c彼此獨立地選自0或1；

較佳地，該連接子為(G_xS)_y連接子，其中，x選自1-5的整數，y選自1-6的整數；更佳地，該連接子彼此獨立地選自G₄S、(G₄S)₂、(G₄S)₃或(G₄S)₄；

較佳地，該特異性結合FAP的第一抗原結合結構域選自如請求項8或9所述的第一抗原結合結構域；

較佳地，該特異性結合CD40的第二抗原結合結構域選自如請求項5至7中任一項所述的第二抗原結合結構域；

較佳地，該特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域選自如請求項1至4中任一項所述的第一抗原結合結構域。
如請求項1至15中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，其包含如下任一項所示的第一多肽鏈和第二多肽鏈：

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：49和50所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：34和35所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：36和37所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：38和39所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：40和41所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：42和43所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：45和46所示的胺基酸序列；

該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別包含如SEQ ID NO：47和48所示的胺基酸序列；或，

與前述任一組的該第一多肽鏈和第二多肽鏈分別具有至少90%序列同一性的胺基酸序列組合。
一種4-1BB結合分子，其包含：

i)特異性結合4-1BB的第三抗原結合結構域；其中，該第三抗原結合結構域包含如SEQ ID NO：18、23-26、28和33中任一項所示胺基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3，該CDR是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；

較佳地，進一步包含：

ii)特異性結合FAP的第一抗原結合結構域；或者

iii)特異性結合CD40的第二抗原結合結構域；

更佳地，該第一抗原結合結構域如請求項8或9所定義；

更佳地，該第二抗原結合結構域如請求項5至7中任一項所定義。
如請求項17所述的4-1BB結合分子，其中，該第三抗原結合結構域包含分別如SEQ ID NO：19、30和31所示的CDR1、CDR2和CDR3；

較佳地，該第三抗原結合結構域包含如下任一項所示的CDR1、CDR2和CDR3：

a-1)分別如SEQ ID NO：19、29和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；

a-2)分別如SEQ ID NO：19、20和27所示的CDR1、CDR2和CDR3；或

a-3)分別如SEQ ID NO：19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3。
如請求項17或18所述的4-1BB結合分子，其中，該免疫球蛋白單一可變結構域是人源化、親和力成熟、去除T細胞表位、降低抗體脫醯胺、降低抗體聚集、降低與預先存在的抗藥物抗體(pre-ADA)的結合和/或降低抗體異構化改造的；

較佳地，該人源化改造的人種系基因的重鏈框架區模塊來源於IGHV3-64*04、IGHV3-23*03和/或IGHV3-74*01。
如請求項17至19中任一項所述的4-1BB結合分子，其包含如下胺基酸序列所示的免疫球蛋白單一可變結構域：

如SEQ ID NO：18、23-26、28和33任一項所示胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列；

視需要地，

該4-1BB結合分子包含：

如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，或與之具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1至16中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子，或編碼如請求項17至20中任一項所述的4-1BB結合分子。
一種載體，其包含如請求項21所述的多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項21所述的多核苷酸，或如請求項22所述的載體。
一種製備FAP/4-1BB/CD40結合分子或製備4-1BB結合分子的方法，包括如下所示步驟：

在宿主細胞中表達如請求項1至16中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子或如請求項17至20中任一項所述的4-1BB結合分子；以及，

從該宿主細胞中分離該FAP/4-1BB/CD40結合分子，或分離該4-1BB結合分子；

可選地，該方法進一步包含純化該FAP/4-1BB/CD40結合分子或該4-1BB結合分子的步驟。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至16中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子、如請求項17至20中任一項所述的4-1BB結合分子、如請求項21所述的多核苷酸或如請求項22所述的載體；較佳地，該醫藥組成物進一步包含一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或輔料。
一種如請求項1至16中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子、如請求項17至20中任一項所述的4-1BB結合分子、如請求項21所述的多核苷酸、如請求項22所述的載體或如請求項25所述的醫藥組成物在如下(1)-(3)任一項中的用途：

(1)用於預防或治療癌症，或製備用於預防或治療癌症的藥物；

(2)用於激活T細胞，或製備用於激活T細胞的藥物；

(3)用於促進DC細胞活化，或製備用於促進DC細胞活化的藥物；

較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、和血液系統癌症。
一種治療或緩解癌症的方法，該方法包括：向有需要的受試者施用如請求項1至16中任一項所述的FAP/4-1BB/CD40結合分子、如請求項17至20中任一項所述的4-1BB結合分子、如請求項21所述的多核苷酸、如請求項22所述的載體或如請求項25所述的醫藥組成物；

較佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、和血液系統癌症。