TW202434219A

TW202434219A - 使用乏氧激活化合物治療對parp抑制劑耐藥的患者的藥物及其製藥用途

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Publication number: TW202434219A
Application number: TW112106883A
Authority: TW
Inventors: 齊天陽; 劉星; 段建新; 繁英孟; 李安蓉
Original assignee: 大陸商深圳艾欣達偉醫藥科技有限公司
Priority date: 2023-02-24
Filing date: 2023-02-24
Publication date: 2024-09-01

Abstract

本發明提供乏氧激活化合物單藥或聯用治療對PARP抑制劑耐藥的患者的藥物及其製藥用途。

Description

使用乏氧激活化合物治療對PARP抑制劑耐藥的患者的藥物及其製藥用途

本發明涉及癌症的藥物，特別是治療對PARP抑制劑（PARPi）耐藥的癌症患者的藥物。

PARPi藥物奧拉帕利Olaparib的第一個人體臨床試驗，首次證實了PARPi可抑制攜帶BRCA1/2突變的腫瘤細胞的生長，這主要基於合成致死性理論（Ashworth, A., & Lord, C. J. (2018). Synthetic lethal therapies for cancer: what's next after PARP inhibitors?. Nature reviews. Clinical oncology, 15(9), 564–576. https://doi.org/10.1038/s41571-018-0055-6)：PARP抑制劑可以抑制PARP的DNA單鏈損傷修復功能，導致細胞內大量單鏈DNA損傷不能及時修復。未被修復的單鏈DNA損傷會引發複製叉崩解並由此產生雙鏈DNA損傷，具有較強細胞毒性的雙鏈DNA損傷在正常細胞內可通過BRCA1及BRCA2等蛋白共同參與介導的同源重組修復（HR）途徑進行修復，而在BRCA1/2缺陷的腫瘤細胞內，雙鏈DNA損傷無法修復，導致腫瘤細胞的最終死亡。PARPi最初開發用於放射治療和化療增敏，也有臨床前研究支持PARPi可以作為治療BRCA1/2基因缺陷癌症的單一藥物進行開發。由此，PARPi-BRCA假說驗證的初始目標人群選定為BRCA1/2胚系突變（gBRCA1/2）攜帶者。PARPi在卵巢癌中的最初研究入組人群均是既往已接受過鉑類化療，且研究發現鉑類敏感與PARPi回應有直接關聯（鉑類化療藥是DNA損傷劑，會導致DNA交聯，部分可由HR通路修復；因此DNA修復缺陷型腫瘤預期會對鉑類化療敏感）。另外兩個PARPi已在卵巢癌中獲批：尼拉帕利Niraparib和蘆卡帕利Rucaparib：FDA和EMA批准了尼拉帕利的維持治療方案（不管BRCA1/2狀態如何）；蘆卡帕利也被FDA和EMA登記為BRCA1/2突變相關卵巢癌患者，既往接受過兩線化療方案之後的可選治療方案；而他拉唑帕利現也得到了FDA的獲批，用於治療BRCA突變/HER-2陰性轉移性乳腺癌（Mateo, J., Lord, C. J., Serra, V., Tutt, A., Balmaña, J., Castroviejo-Bermejo, M., Cruz, C., Oaknin, A., Kaye, S. B., & de Bono, J. S. (2019). A decade of clinical development of PARP inhibitors in perspective. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology, 30(9), 1437–1447. https://doi.org/10.1093/annonc/mdz192）。

隨著PARPi在臨床的應用，PARPi耐藥即將成為其在臨床應用的不可避免的問題，有超過40%的BRCAm（BRCA突變）卵巢癌患者未能從PARPi獲益。現有的研究表明同源重組恢復（Homologous recombination repair restoration，HRR）、DNA複製叉保護、PARPi藥代動力學改變等是導致PARPi耐藥的主要原因。為了克服PARPi耐藥，增加PARPi藥物敏感性，多種的聯合治療手段正在被開發，其中許多聯合治療手段已經進入臨床階段。主要包括：PARPi-DNA烷化劑聯合；PARPi-單孢酵解性皰疹病毒（oHSVs）聯合；PARPi-離子輻射聯合；PARPi-免疫治療聯合；PARPi-HSP90抑制劑聯合；PARPi-WEE1/ATR抑制劑聯合；PARPi-DNMTi抑制劑聯合；PARPi-CDK抑制劑聯合等（He Li,Zhao-Yi Liu,Nayiyuan Wu,Yong-Chang Chen,Quan Cheng and Jing Wang.PARP inhibitor resistance: the underlying mechanisms and clinical implications.Mol Cancer,2020 Jun 20;19(1):107.2020. https://doi.org/10.1186/s12943-020-01227-0；Rose, M., Burgess, J. T., O'Byrne, K., Richard, D. J., & Bolderson, E. (2020). PARP Inhibitors: Clinical Relevance, Mechanisms of Action and Tumor Resistance. Frontiers in cell and developmental biology, 8, 564601. https://doi.org/10.3389/fcell.2020.564601）。

TH-302（Evofosfamide，埃夫索胺，cas號918633-87-1）是一種2-硝基咪唑引發的乏氧激活前藥（HAP）溴代異磷醯胺，由美國Threshold公司開發。在乏氧情況下，無活性TH-302前藥可釋放高毒性的Br-IPM。TH-302具有廣譜的體內外生物活性以及特異的乏氧選擇性激活活性以及誘導H2AX磷酸化、DNA交聯活性，從而導致細胞週期停滯，因而該化合物被多家製藥公司以及科研院所進行抗癌藥物的開發。

Meng F Y（孟繁英）等人發表的研究文章指出：TH-302對於各種腫瘤具有廣譜活性，並且具有優異的缺氧選擇性的活性增強效應。研究表明，缺氧條件下32個人癌細胞系中TH-302的體外細胞毒性均明顯強於常氧條件下的，顯示該化合物對於缺氧環境下的癌細胞具有選擇性的細胞毒性。使用單電子還原酶(POR)過表達的人源細胞證實了TH-302在乏氧條件下單電子還原酶依賴性的活性增強原理，如下反應式1：反應式1

細胞色素P450氧化還原酶將TH-302這個前藥進行還原，得到中間體自由基負離子，然後自由基負離子不穩定而被分解為具有細胞毒性的細胞毒素Br-IPM發揮作用。該步驟的關鍵步驟是單電子還原過程，研究證實氧氣的存在會使得單電子還原過程逆轉，也就是說，氧氣的存在會阻礙單電子還原過程，所以只有乏氧的環境下，TH-302才可還原產生具有更強的細胞毒性。進一步使用基於中國倉鼠卵巢細胞的DNA修復突變細胞系，包括缺乏鹼基切除、核苷酸切除，非同源末端連接修復的細胞系或同源末端連接修復的細胞系（該細胞系為缺乏同源依賴性修復的細胞系）檢測TH-302的體外細胞毒性。研究發現缺乏同源末端連接修復單獨缺損或與核苷酸切除共同修復缺損的細胞系，對TH-302缺氧敏感性明顯增強。但是單獨缺損鹼基切除、核苷酸切除或非同源末端連接修復的細胞系對TH-302敏感性無影響。與該發現一致的是，在缺乏BRCA1、BRCA2和FANCA的細胞體外實驗中也觀察到對TH-302的敏感性增強；並且在臨床試驗中也觀察到TH-302對於BRCA基因突變的患者具有更好的治療效果（Meng F, Evans J W, Bhupathi D, et al. Molecular and cellular pharmacology of the hypoxia-activated prodrug TH-302.[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2012, 11(3):740；Conroy, M., Borad, M. J., & Bryce, A. H. (2017). Hypoxia-Activated Alkylating Agents in BRCA1-Mutant Ovarian Serous Carcinoma. Cureus, 9(7), e1517. https://doi.org/10.7759/cureus.1517；WO2015013448A1，Treatment of pancreatic cancer with a combination of a hypoxia-acti vated prodrug and a taxane；WO2020007106A1，埃夫索胺的抗癌醫藥用途）。

這些關於TH-302的作用機理研究，特別是揭示的TH-302對於BRCA突變的特別敏感性事實啟發TH-302藥物可能通過聯用來克服PARPi的耐藥性缺陷。

然而在PCT/US2012/031677申請（公開號WO2012135757A2，Methods for treating cancer，申請人美國Threshold公司）中，Threshold的研究人員使用TH-302與PARPi候選藥物ABT-888（即Veliparib，CAS：912444-00-9）在體外進行了聯用研究；

不同癌細胞在常氧下用ABT-888預處理1h，然後在常氧或缺氧條件下與TH-302共同孵育另外的2h。在ABT-888存在下孵育3天之後，使用阿爾瑪藍確定細胞生活力。結果如下表：

H460細胞系（人大細胞肺癌細胞）結果：

HCT116細胞系（人結腸癌細胞）結果：

A375細胞系（人惡性黑色素瘤細胞）結果：

上述結果顯示在體外細胞實驗中，TH-302與ABT-888聯用沒有加合效應，即TH-302活性實質上不受ABT-888存在的影響。

然而在PCT/US2019/065065申請（公開號WO2020118251A2，發明名稱 Hypoxia targeting compositions and combinations thereof with a parp inhibitor and methods of use thereof）中則指出使用缺氧活化的藥物或其前藥（如apaziquone, AQ4N, etanidazole, evofosfamide（TH-302）, nimorazole, pimonidazole, porfiromycin, PR-104, tarloxotinib，tirapazamine（替拉紮明））與PARPi聯用有加合效應，特別的其還公開了替拉紮明與奧拉帕尼的動物體內聯合用藥試驗，結果顯示對比使用替拉紮明或PARPi的單一用藥方案，包含有缺氧活化抗癌前藥替拉紮明與一種PARPi奧拉帕尼的聯合給藥方案能顯著地延遲PDX動物模型中腫瘤的生長速率，即缺氧活化抗癌藥物與PARPi聯用具有加合效應。

即在不同研究的試驗中，對於缺氧活化抗癌前藥與PARPi聯用是否有加合效應仍然存在爭議，這顯示了加合效應的複雜性。

申請人的研究人員在藥效試驗中發現TH-302與PARPi聯用在部分動物體內腫瘤增殖抑制試驗中顯示加合效應，這與Threshold公司在2012年進行的體外細胞實驗結果完全不同，為此申請人進一步進行了研究，得到了進一步的出乎意料的結果：TH-302單藥既能對PARPi耐藥的癌症模型具有優異的治療效果！

基於實驗結果，本申請提供以下的治療癌症方法。

式（I）的乏氧激活化合物在製備用於單藥或聯用治療患者PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤的藥物中的用途：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO等離去官能團。

式（I）的乏氧激活化合物在製備用於聯用PARP抑制劑治療PARP抑制劑耐藥患者的癌症、腫瘤的藥物中的用途：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO等離去官能團。

關於本文所述藥物是指藥品或製劑，所製得的藥品包含特定劑量範圍的有效成分式（1）的乏氧激活化合物或其鹽或溶劑合物，和/或所製得的藥物為特定劑型、特定給藥方式施用。

所製得的藥品、藥物、製劑還可包含藥學上可接受的輔料或賦形劑。所述藥物可以為臨床施用的任何劑型，例如片劑、栓劑、分散片、腸溶片、咀嚼片、口崩片、膠囊、糖衣劑、顆粒劑、幹粉劑、口服溶液劑、注射用小針、注射用凍乾粉針或大輸液。根據具體劑型和施用方式，所述藥物中的藥學上可接受的輔料或賦形劑可以包括下述的一種或多種：稀釋劑、增溶劑、崩解劑、懸浮劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑、矯味劑、甜味劑、抗氧化劑、表面活性劑、防腐劑、包裹劑、和色素等。

與TH-302或其類似化合物相關的製劑包括口服製劑、凍乾製劑和濃縮注射液，並且相關處方、製備方法和臨床配伍、施用方法被Threshold公司的相關專利：WO2010048330A1、WO2012142520A2、WO2008083101A1所詳細說明並公開，在此本發明將上述申請文本的全文引入。

TH-302或其類似化合物是一個DNA烷化劑類抗癌藥，具有廣泛的癌症治療潛力，這些相關的癌症適應症實驗、臨床試驗被公開在相關的Threshold公司及其他製藥公司的專利申請文本中（比如 WO2016011195A2、WO2004087075A1、WO2007002931A1、WO2008151253A2、WO2009018163A1、WO2009033165A2、WO2010048330A2、WO2012142520A1、WO2008083101A2、WO2020007106A1、WO2020118251A1、WO2014169035A1、WO2013116385A1、WO2019173799A2、WO2016081547A1、WO2014062856A1、WO2015069489A1、WO2012006032A2、WO2018026606A2、WO2010048330A2、WO2015171647A1、WO2013096687A1、WO2013126539A2、WO2013096684A2、WO2012009288A2、WO2012145684A2、WO2016014390A2、WO2019055786A2、WO2012135757A2、WO2015013448A2、WO2016011328A2、WO2013177633A2、WO2016011195A2、WO2015051921A2）以及FDA登記的臨床試驗中（NCT02402062、NCT02020226、NCT02076230、NCT01381822、NCT02093962、NCT01440088、NCT02255110、NCT02342379、NCT01864538、NCT01149915、NCT02433639、NCT00743379、NCT01485042、NCT01721941、NCT02047500、NCT00742963、NCT01497444、NCT00495144、NCT01746979、NCT01144455、NCT01403610、NCT01522872、NCT01833546、NCT02598687、NCT03098160、NCT02496832、NCT02712567），在此本發明將上述相關申請文本以及臨床試驗資訊全部引入。

“癌症”是指可通過侵襲而局部擴展且通過轉移而全身擴展的潛在無限制生長的白血病、淋巴瘤、癌及其他惡性腫瘤(包括實體腫瘤）。

在此列舉TH-302或其類似化合物能治療的癌症的實例包括（但不限於）腎上腺、骨、腦、乳房、支氣管、結腸及/或直腸、膽囊、頭及頸、腎、喉、肝、肺、神經組織、胰臟、前列腺、副甲狀腺、皮膚、胃及甲狀腺的癌症。癌症的某些其他實例包括急性及慢性淋巴細胞及粒細胞腫瘤、腺癌、腺瘤、基底細胞癌、子宮頸上皮分化不良及原位癌、尤文氏肉瘤、表皮樣癌、巨細胞瘤、多型性神經膠母細胞瘤、毛細胞腫瘤、腸神經節細胞瘤、增生性角膜神經腫瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、白血病、淋巴瘤、惡性類癌瘤、惡性黑色素瘤、惡性高鈣血症、馬方樣體型腫瘤、髓樣上皮癌、轉移性皮膚癌、黏膜神經瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、骨原性及其他肉瘤、卵巢瘤、嗜鉻細胞瘤、真性紅血球增多症、原發性腦瘤、小細胞肺癌、潰瘍型及乳頭型二者的鱗狀細胞癌、增生、精原細胞瘤、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞腫瘤、局部皮膚病灶、網狀細胞肉瘤及威爾姆氏腫瘤。

PARP是一種酶，全稱叫聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶（Poly ADP-ribose Polymerase，PARP）。PARP是一種DNA修復酶，在DNA修復通路中起關鍵作用。DNA損傷斷裂時會激活PARP，它作為DNA損傷的一種分子感受器，具有識別、結合到DNA斷裂位置的功能，進而激活、催化受體蛋白的聚ADP核糖基化作用，參與DNA的修復過程。

PARP抑制劑通過抑制PARP酶的工作，讓這些相當於“修理工”的PARP酶沒法正常工作，DNA的損傷得不到修復，細胞就會死亡。因為細胞並不是只有PARP這一個“修理工”，所以即使PARP出問題，細胞的DNA損傷被帶到下一個工序中，還有另一個“修理工”在等著，仍然可以把DNA修復。BRCA基因負責產生的蛋白正是這另一個“修理工”的重要成員。正常細胞擁有這套雙重保險機制，即使PARP抑制劑破壞了其中一重保險，另一重仍然可以工作，所以細胞不會死亡。

但是在具有BRCA基因突變的卵巢癌或乳腺癌細胞中，BRCA這個“修理工”已經不能正常工作。當然，由於PARP班組還在繼續工作，所以癌細胞還不會死。

如果用PARP抑制劑特異性進入癌細胞，讓PARP酶活性被抑制無法正常發揮作用，癌細胞的DNA就無法被修復。這樣，PARP抑制劑就實現了只殺死癌細胞而不殺正常細胞的作用。

PARP抑制劑+BRCA基因突變同時發生，就會導致所謂的“合成致死(Synthetic Lethality)”，合成致死即當兩種不同的基因（BRCA）或蛋白（PRAP）同時發生變化時會導致細胞死亡，而這兩種基因／蛋白中如果只有一種異常則不會導致細胞死亡。

PARP抑制劑就是對PARP酶有抑制作用的化合物，即凡是能抑制PARP酶活性的物質均是PARP抑制劑。

選自已經上市銷售的5個藥物即奧拉帕利Olaparib、蘆卡帕利Rucaparib、尼拉帕利Niraparib、他拉唑帕利Talazoparib、氟唑帕利Fluzoparib以及進入臨床三期的藥物帕米帕利Pamiparib，顯然此處的PARP抑制劑實質是指含有PARP抑制劑活性成分的藥物。他拉唑帕利Talazoparib 尼拉帕利Niraparib 蘆卡帕利Rucaparib 奧拉帕利Olaparib 帕米帕利Pamiparib 氟唑帕利Fluzoparib

他拉唑帕利Talazoparib，適用於有害或疑似有害種系BRCA突變（gBRCAm）HER2陰性局部晚期或轉移性乳腺癌的成人。市售劑型為0.25mg/1mg的他拉唑帕利甲苯磺酸鹽膠囊，口服一次1毫克，每天1次，在不良反應的情況下考慮治療中斷或劑量減少：首次出現不良反應，口服劑量減少到0.75mg（三個0.25mg膠囊），每天1次；第二次出現不良反應，口服劑量減少到0.5mg（兩個0.25mg膠囊），每天1次；第三次出現不良反應，口服劑量減少到0.25mg（一個0.25mg膠囊），每天1次。

尼拉帕利Niraparib，用於鉑敏感的復發性上皮性卵巢癌、輸卵管癌或原發性腹膜癌成人患者在含鉑化療達到完全緩解或部分緩解後的維持治療。市售劑型為100mg的尼拉帕利甲苯磺酸鹽膠囊，每天一次口服300mg,直至出現疾病進展或不可耐受的不良反應，在不良反應的情況下考慮治療中斷或劑量減少：劑量下調首先從每天3粒膠囊(300mg)減少至每天2粒膠囊(200mg)；如果需要進一步下調劑量，可第二次下調劑量，從每天2粒膠囊(200mg)減少至每天1粒膠囊(100mg)；如果暫停給藥和下調劑量無法控制不良反應，建議停藥。

蘆卡帕利Rucaparib，用於腫瘤攜帶一種特定基因突變（有害的 BRCA），且已使用兩種或多種化療藥物治療過的晚期卵巢癌女性。市售劑型為片劑：200mg，250mg和300mg，三種規格。推薦劑量為600毫克，每日口服兩次，含或不含食物。繼續治療直至疾病進展或不可接受的毒性。對於不良反應，考慮中斷治療或減少劑量。

奧拉帕利Olaparib，用於攜帶胚系或體細胞BRCA突變的（gBRCAm或sBRCAm）晚期上皮性卵巢癌、輸卵管癌或原發性腹膜癌初治成人患者在含鉑化療達到完全緩解或部分緩解後的維持治療；鉑敏感的復發性上皮性卵巢癌、輸卵管癌或原發性腹膜癌成人患者在含鉑化療達到完全緩解或部分緩解後的維持治療。市售劑型為片劑：150mg和100mg，兩種規格。推薦劑量為300mg（2片150mg片劑），每日2次，相當於每日總劑量為600mg。100mg片劑用於劑量減少時使用：

為處理不良事件，比如噁心、嘔吐、腹瀉、貧血等，可考慮中斷治療或減量；如果需要減量，推薦劑量減至250mg（1片150mg片劑，1片100mg片劑），每日服用2次（相當於每日總劑量為500mg）；如果需要進一步減量，則推薦劑量減至200mg（2片100mg片劑），每日服用2次（相當於每日總劑量為400mg）。

氟唑帕利Fluzoparib，用於既往經過二線及以上化療的伴有胚系BRCA突變（gBRCAm）的鉑敏感復發性卵巢癌、輸卵管癌或原發性腹膜癌患者的治療。市售劑型膠囊劑：50mg規格。

其他在研的進入臨床的PARPi候選藥物參見網頁連結https://www.selleckchem.com/PARP.html及相關學術綜述文獻。

TH-302或其類似化合物治療癌症的推薦劑量可以參考Threshold公司及其他製藥公司的專利申請文本中（比如 WO2016011195A2、WO2004087075A1、WO2007002931A1、WO2008151253A2、WO2009018163A1、WO2009033165A2、WO2010048330A2、WO2012142520A1、WO2008083101A2、WO2020007106A1、WO2020118251A1、WO2014169035A1、WO2013116385A1、WO2019173799A2、WO2016081547A1、WO2014062856A1、WO2015069489A1、WO2012006032A2、WO2018026606A2、WO2010048330A2、WO2015171647A1、WO2013096687A1、WO2013126539A2、WO2013096684A2、WO2012009288A2、WO2012145684A2、WO2016014390A2、WO2019055786A2、WO2012135757A2、WO2015013448A2、WO2016011328A2、WO2013177633A2、WO2016011195A2、WO2015051921A2）以及FDA登記的臨床試驗中（NCT02402062、NCT02020226、NCT02076230、NCT01381822、NCT02093962、NCT01440088、NCT02255110、NCT02342379、NCT01864538、NCT01149915、NCT02433639、NCT00743379、NCT01485042、NCT01721941、NCT02047500、NCT00742963、NCT01497444、NCT00495144、NCT01746979、NCT01144455、NCT01403610、NCT01522872、NCT01833546、NCT02598687、NCT03098160、NCT02496832、NCT02712567）中的劑量： 120mg/m ²至460mg/m ²的日劑量來靜脈注射給藥； 480mg/m ²至大約670mg/m ²或者例如575mg/m ²的周劑量來靜脈注射給藥。

用於臨床試驗的TH-302(用於施用溶液的濃縮物)是TH-302的無菌液體製劑。用70%無水乙醇、25%二甲基乙醯胺和5%聚山梨酯80配製TH-302。它由發起人提供，在具有橡膠塞和flip-off封口的10mL玻璃小瓶中。TH-302藥物產品是澄清的、無色至淡黃色的溶液，基本上不含可見顆粒。對於標稱總量為650mg的TH-302，每個單次使用的小瓶含有標稱填充體積為6.5mL的TH-302藥物產品(相當於100mg/mL)，並且被清楚地貼上標籤，其公開了批號、施用途徑、所需的儲存條件、發起人的名稱和適用的規定所要求的適宜的預警標記。在施用前需要按照藥房手冊進行稀釋。

在施用前用可商購獲得的5%葡萄糖水溶液稀釋至總體積為500mL(對於≥1000mg的總劑量為1000mL)施用，以獲得所需的終濃度。用不含鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(無DEHP)的5％葡萄糖水溶液製備每劑TH-302，並使用不含DEHP的靜脈輸液施用裝置靜脈滴注。

當然也可以使用Threshold公司開發的凍乾製劑：將TH-302（100mg）和蔗糖（1g）的溶液（20mL）加入凍乾小瓶中並凍乾以產生TH-302的凍乾單位劑型，載藥量不到5mg/cm ³。為了人類施用的目的，將單位劑型溶解在的5%葡萄糖注射液中，並向患者施用適量的該溶液；後續人類患者TH-302的I期臨床試驗給藥方案使用凍乾製劑，在100mL玻璃小瓶中製備注射用TH-302凍乾製劑，載藥量為100mg/100ml，在2-8℃的受控條件下儲存，使用時注射到凍乾製劑瓶中250mL的5%葡萄糖注射液，並通過輸注泵在30分鐘內靜脈滴注。

單藥，即單藥治療。聯用，即聯合用藥治療。單藥治療是指在一個療程中僅使用一種抗癌藥物。聯合治療是指在一個療程中同時或先後使用兩種或兩種以上的抗癌藥物。

一般而言，聯合治療需要根據病情特點、聯用藥物種類探索不同的給藥劑量、給藥週期，只有根據上述情況，探索得到的聯合用藥治療方案才可能取得較單一用藥治療好的治療效果。

單藥和聯用治療方案的藥物給藥劑量、給藥週期均需要在參考上述TH-302及其類似化合物和PARPi的劑量、給藥方案通過臨床試驗探索得到。

進一步的，所述患者的DNA修復酶受損。根據相關研究文獻，DNA修復酶受損選自：同源重組DNA修復酶（homologous recombination repair）受損、核苷酸切除修復酶（nucleotide excision repair）受損、非同源末端連接酶受損（nonhomologous end joining）、鹼基切除修復酶（base excision repair）受損、錯配修復酶（mismatch repair）受損、范康尼貧血（Fanconi’s anemia）途徑修復酶受損中的一種或更多種。

優選為同源重組DNA修復酶受損、核苷酸切除修復酶受損、鹼基切除修復酶受損中的任意一種或更多種，更優選為單獨的同源重組DNA修復酶受損或同時具有同源重組DNA修復酶受損與核苷酸切除修復酶受損。

進一步，所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。

BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變可以通過市售的（伴隨）診斷試劑盒檢測得到：奧拉帕利Olaparib伴侶檢測試劑盒BRACAnalysisCDx，該基因檢測用於發現卵巢癌患者血樣中BRCA基因突變； BRCA1/2基因突變檢測試劑盒 (聯合探針錨定聚合測序法)，用於對臨床確診為卵巢癌及乳腺癌患者的BRCA1/2基因外顯子區以及鄰近內含子區的胚系變異進行定性檢測；人類BRCA1基因和BRCA2基因突變檢測試劑盒（可逆末端終止測序法），可用於PARP抑制劑奧拉帕利片的相關用藥指導。

BRCA1、BRCA2突變包括胚系突變(gBRCAm)和體系突變(sBRCAm)的BRCA1、BRCA2突變。

式（1）的乏氧激活化合物選自以下結構的化合物：即TH-302，以及和，特別的，優選TH-302。

進一步，所述癌症、腫瘤選自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌等，所述肺癌優選為非小細胞肺癌、小細胞肺癌。

治療方法，其使用含有下式的乏氧激活化合物的藥物單藥治療奧拉帕利Olaparib耐藥的卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌患者：，其中，所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。

治療方法，其使用含有下式的乏氧激活化合物的藥物聯用奧拉帕利Olaparib治療奧拉帕利Olaparib耐藥的卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌患者：，其中，所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。

治療方法，包括以下步驟：檢測PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤患者的BRCA1、BRCA2基因突變情況；如該患者具有BRCA1、BRCA2基因突變，則使用含有式（1）的乏氧激活化合物的藥物單藥或聯用PARP抑制劑進行治療：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO等離去官能團。

優選的，所述的基因突變的TMB（腫瘤基因突變負荷）水平為中。

式（1）的乏氧激活化合物在製備用於單藥或聯用PARP抑制劑治療患者癌症的藥物中用途：（I），其中，所述患者為PARP抑制劑耐藥的患者； R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO等離去官能團。

上述的製藥用途，所述患者的DNA修復酶受損；或所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。

上述的製藥用途，所述式（I）的乏氧激活化合物選自以下結構的化合物：；或所述PARP抑制劑選自奧拉帕利Olaparib、蘆卡帕利Rucaparib、尼拉帕利Niraparib、他拉唑帕利Talazoparib、氟唑帕利Fluzoparib、帕米帕利Pamiparib；或所述癌症、腫瘤選自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌；或所述的基因突變的TMB（腫瘤基因突變負荷）水平為中。

由於不同瘤種之間TMB（Tumor mutation load（burden）即腫瘤基因突變負荷）高低不同：一般認為，TMB超過20個突變/Mb（Mb代表的就是每百萬個鹼基），就是高；低於10個突變/Mb，就是低，處於中間的就是中。2017年世界肺癌大會上，施貴寶公司（BMS）公佈過一項名為CheckMate-032的臨床試驗結果。這是一項納入了401名一線治療失敗的晚期肺癌患者的II期臨床試驗，接受PD-1抑制劑單獨或聯合伊匹木治療。按照TMB高低劃分成TMB高、TMB中、TMB低三類病人，那麼在接受聯合治療的人群中，三組的有效率分別為62%、20%、23%，TMB高的人群有效率高3倍；而三組的中位總生存期，分別為：22.0個月、3.6個月、3.4個月——22.0個月與3.4個月，相差6倍！該試驗證明，對於不同的癌症治療藥物，不同的TMB水平對於藥物的療效有很大的影響。

本發明還提供了一種治療PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤患者的藥物，該藥物含有式（I）的乏氧激活化合物，該藥物可以單藥或聯用治療PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤患者：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO等離去官能團。

優選的，所述患者的DNA修復酶受損；或所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。

優選的，BRCA1、BRCA2突變包括胚系突變(gBRCAm)和體系突變(sBRCAm)的BRCA1、BRCA2突變。

特別地，上述藥物中，所述式（1）的乏氧激活化合物選自以下結構的化合物：；或所述PARP抑制劑選自奧拉帕利Olaparib、蘆卡帕利Rucaparib、尼拉帕利Niraparib、他拉唑帕利Talazoparib、氟唑帕利Fluzoparib、帕米帕利Pamiparib；或所述癌症、腫瘤選自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌；或所述的基因突變的TMB（腫瘤基因突變負荷）水平為中。

上述藥物除含有式（1）的乏氧激活化合物外，還應根據藥品、藥物、製劑的特點，添加藥學上可接受的輔料或賦形劑。所述藥物可以為臨床施用的任何劑型，例如片劑、栓劑、分散片、腸溶片、咀嚼片、口崩片、膠囊、糖衣劑、顆粒劑、幹粉劑、口服溶液劑、注射用小針、注射用凍乾粉針或大輸液。根據具體劑型和施用方式，所述藥物中的藥學上可接受的輔料或賦形劑可以包括下述的一種或多種：稀釋劑、增溶劑、崩解劑、懸浮劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑、矯味劑、甜味劑、抗氧化劑、表面活性劑、防腐劑、包裹劑、和色素等。

上述藥物在使用時，可以單用上述藥物或聯合PARPi藥物進行治療。

以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。

“患者”及“個體”可互換使用，是指需要癌症治療的哺乳動物。通常，患者是人類。通常，患者是診斷患有癌症的人類。在某些實施例中，“患者”或“個體”可指用於篩選、表徵及評估藥物及療法的非人類哺乳動物，例如非人類靈長類動物、狗、貓、兔、豬、小鼠或大鼠。

“前藥”是指投與或施用之後經新陳代謝或以其他方式轉化為關於至少一種性質的生物學活性或活性更高的化合物(或藥物）的化合物。相對於藥物，前藥以使其相對於藥物活性較低或無活性的方式化學修飾，但化學修飾使得在前藥投與之後通過代謝或其他生物過程產生相應藥物。前藥可相對於活性藥物具有改變的代謝穩定性或輸送特徵、較少副作用或較低毒性或經改良的風味。前藥可使用除相應藥物以外的反應物來合成。 “治療”或“治療患者”是指向患者投與、使用或施用本發明相關的治療有效量的藥物。

向患者“投與”或“施用”“使用”藥物是指直接投與或施用（其可由醫學專業人士向患者投與或施用或者可自投與或施用）及/或間接投與或施用，其可是開處藥物的行為。舉例而言，指示患者自投與或施用藥物及/或將藥物的處方提供給患者的醫師是向患者投與或施用藥物。

藥物的“治療有效量”是指當向患有癌症的患者投與或施用、使用時，將具有預期的治療效應(例如患者中一或多種癌症的臨床表現的緩和、改善、緩解或消除）的藥物的量。治療效應不必通過投與或施用一個劑量而出現，且可僅在投與或施用一系列劑量後出現。因此，治療有效量可以一或多次來投與或施用。

病況或患者的“治療”是指採取步驟以獲得有益或期望結果(包括臨床結果）。出於本發明的目的，有益或期望臨床結果包括(但不限於)一或多種癌症症狀的緩和或改善；疾病程度的減弱；疾病進展的延遲或減緩；疾病狀態的改善、緩解或穩定；或其他有益結果。在一些情形下，癌症的治療可使得部分反應或穩定疾病。

“腫瘤細胞”是指任何適當物種(例如，哺乳動物，例如鼠類、犬、貓、馬或人類)的腫瘤細胞。

以上對本發明具體實施方式的描述並不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明的申請專利範圍。

以下提供本發明的具體實驗。

本發明披露的試驗過程中動物實驗的試驗方案、任何修改、動物福利和使用均通過所在CRO（合同研究組織）IACUC委員會審核並批准通過。試驗過程中，動物福利和實驗操作均符合AAALAC的要求。

一、化合物 TH-302 在 BRCA 敲除和野生型的腫瘤細胞中的體外細胞毒性比較

TH-302是一種在乏氧條件下能夠被激活，並釋放出細胞毒素，進而殺傷腫瘤細胞和腫瘤組織的小分子前藥。為了評價在體外細胞水平TH-302與BRCA致病突變的相關性，我們選用人源結腸癌細胞系DLD1和敲除BRCA2蛋白的DLD1-BRCA2-/- 腫瘤細胞系，檢測在乏氧條件下，TH-302對上述兩種有或者無BRCA2 蛋白表達的腫瘤細胞系的殺傷能力是否有區別。

該克隆形成實驗使用IC ₉₀（90%抑制濃度）值作為評價化合物TH-302對細胞殺傷的能力。具體實驗方法如下：

（1）細胞培養 a）DLD1和DLD1-BRCA2-/-細胞培養於RPMI培養基中，加10% FBS和1%雙抗，置於37℃、5%CO ₂條件下培養。

（2）細胞鋪板 a）細胞常規培養至細胞飽和度為80%-90%，數量到達要求時，收取細胞。 b）用相應的培養基重懸，計數，配製成合適密度的細胞懸液。 c）將細胞懸液加入10 cm玻璃皿中，DLD1-BRCA2 ^-/-細胞密度為3.0 x 10 ⁵/皿、DLD1細胞密度為300 /皿。 d）細胞在37℃，5%CO ₂培養箱中培養2天。

（3）化合物的準備化合物按照實驗要求準備。

（4）化合物處理細胞 a）化合物在氧氣含量＜0.01% （乏氧）的條件下處理細胞3小時。 b）使用1 x PBS 洗細胞一次，利用胰酶消化細胞後，進行細胞計數。 c）用3 mL 培養基重懸細胞，接種於6孔培養板中，其中DLD1-BRCA2-/- 細胞密度為2000/孔、DLD1 細胞密度為300/孔。 d）將細胞板放置培養箱10天。 e）棄掉培養基，將細胞固定後，利用結晶紫染色40 min。 f）使用Colony Counter (VWR)進行細胞克隆計數並根據CalcuSyn 軟體(http://www.biosoft.com/w/calcusyn.htm)計算IC ₉₀值。

經過上述實驗方法測得的待測化合物TH-302在兩種細胞中的IC ₉₀值列示於下表1中。

表1：乏氧條件下化合物TH-302對2株腫瘤細胞抑制作用IC ₉₀數據

化合物	細胞系	IC ₉₀（nmol/L）	倍數差異
TH-302	DLD1	210	/
DLD1-BRCA2 ^-/-	3.01	70

實驗結論：化合物TH-302在被乏氧激活以後，對DLD1野生型和BRCA2 缺失的DLD1-BRCA2-/-細胞的體外細胞毒性有顯著差異。與DLD1-BRCA2-/-細胞相比較，野生型DLD1的體外IC ₉₀值增加了70倍。上述結果說明，在乏氧條件下，BRCA2蛋白的缺失，造成DLD1的細胞對TH-302的敏感程度顯著增強。

二、化合物 TH-302/tirapazamine （替拉紮明）對 Capan-1/BxPc-3 體外細胞增殖的影響實驗

申請人專門研究了缺氧活化抗癌前藥TH-302和替拉紮明分別在常氧和缺氧條件下、在Capan-1和BxPc-3細胞系的體外細胞增殖抑制實驗。Capan-1細胞系為BRCA突變型細胞系，BxPc-3細胞系為BRCA野生型，即非BRCA突變型細胞系。通過該實驗來驗證同為缺氧活化抗癌前藥的TH-302與替拉紮明對BRCA突變的敏感性差異。

實驗方法與實驗資料、結論如下所述。

實驗方法1) 將Capan-1/BxPc-3細胞懸液加入兩類24孔板中，每孔495μL，細胞密度為6×10 ⁴/孔。插有玻璃插板（glass inserts）的24孔板用於乏氧實驗，普通塑膠24孔板用於常氧實驗。 2) 細胞在37℃，5%CO ₂培養箱中培養過夜。 3) 化合物處理低氧條件：調節低氧工作站至乏氧環境 (O ₂＜0.01%)，並利用氧氣指示劑確認工作站中的乏氧情況。細胞鋪板24小時以後，將帶有玻璃插板（glass inserts）的24孔板送入低氧工作站。將24孔板放至在螺旋振盪器上，打開孔板蓋振盪，進行氣體交換5分鐘。單藥組每孔直接加入100倍測試濃度的化合物溶液。常氧條件：細胞鋪板24小時以後，每孔加入5 μL 100倍測試濃度的化合物溶液，每個實驗組3個複孔。單藥組每孔直接加入100倍測試濃度的化合物溶液。 4) 化合物處理3小時後，所有24孔板用完全培養基洗2次，每孔、每次500 µL。 5) Capan-1細胞培養板中每孔加入1000 µL完全培養基， BxPc-3細胞培養板中每孔加入500 µL完全培養基。 6) 放置37℃，5% CO ₂培養箱72小時。 7) Capan-1細胞每孔棄去800 µL培養基，BxPc-3細胞每孔棄去300 µL培養基，加入50 µL CTG，震盪混勻2min，室溫避光放置15分鐘。 8) 將培養基從24孔板中，每孔轉移100 μL至96孔白板中。 9) 用多功能酶標儀讀取化學發光信號值，讀值時間1000ms。 10) 用GraphPad Prism 5 software計算IC ₅₀，得到化合物的IC ₅₀值（半數抑制濃度）。

實驗資料

TH-302和替拉紮明在BRCA突變型Capan-1細胞系中，常氧與缺氧條件下的細胞增殖抑制實驗資料如表2和表3所示，IC ₅₀曲線如圖1所示。表2：TH-302在BRCA突變型Capan-1細胞系中的細胞增殖抑制實驗資料

化合物	IC ₅₀（µM）	比率（21% O ₂/0.01% O ₂）
TH-302，21% O ₂	93.45	-
TH-302，＜0.01% O ₂	0.82	113.96

表3：替拉紮明在BRCA突變型Capan-1細胞系中的細胞增殖抑制實驗資料

化合物	IC ₅₀（µM）	比率（21% O ₂/0.01% O ₂）
替拉紮明，21% O ₂	＞2000	-
替拉紮明，＜0.01% O ₂	29.06	＞68.82

TH-302和替拉紮明在BRCA野生型BxPc-3細胞系中，常氧與缺氧條件下的細胞增殖抑制實驗資料如表4和表5所示，IC ₅₀曲線如圖2所示。表4：TH-302在BRCA野生型BxPc-3細胞系中的細胞增殖抑制實驗資料

化合物	IC ₅₀（µM）	比率（21% O ₂/0.01% O ₂）
TH-302，21% O ₂	423.50	-
TH-302，＜0.01% O ₂	3.07	137.95

表5：替拉紮明在BRCA野生型BxPc-3細胞系中的細胞增殖抑制實驗資料

化合物	IC ₅₀（µM）	比率（21% O ₂/0.01% O ₂）
替拉紮明，21% O ₂	＞2000	-
替拉紮明，＜0.01% O ₂	33.23	＞60.19

實驗結論

上述實驗資料中，TH-302在乏氧條件下，在BRCA突變的Capan-1細胞系中的IC ₅₀為0.82 µM，在BRCA野生型的BxPc-3細胞系中IC ₅₀為3.07µM，兩者相差3.7倍，說明BRCA突變使得TH-302對腫瘤細胞系具有更強的增殖抑制活性，即BRCA突變將增強腫瘤細胞對TH-302藥物的敏感性。

而同為乏氧活化抗癌前藥的替拉紮明，在乏氧條件下，在BRCA突變的Capan-1細胞系中的IC ₅₀為29.06µM，在BRCA野生型的BxPc-3細胞系中IC ₅₀為33.23µM，相差1.1倍，無明顯的差異，這說明替拉紮明與BRCA突變無相關性，即BRCA突變並不明顯影響替拉紮明對腫瘤細胞系的增殖抑制活性，即BRCA突變並不能增強腫瘤細胞對替拉紮明藥物的敏感性。

三、 TH-302 在奧拉帕利 Olaparib 耐受的動物 CDX 、 PDX 模型中的藥效及安全性實驗

3.1 TH-302 在 Olaparib 耐受的胰腺癌 Capan-1 CDX 模型中的藥效及安全性評價

Capan-1 CDX模型是帶有BRCA2致病突變的Olaparib耐受模型。

每只BALB/c雌性裸鼠右側背部下方皮下接種5×10 ⁵Capan-1細胞，細胞重懸在1:1的PBS和基質膠中（0.1ml/只），共接種64只雌性小鼠。接種日期為2021年06月23日，待腫瘤平均體積140 mm ³時，根據腫瘤大小隨機分組。試驗分為測試藥Olaparib 100 mg/kg單藥組（Group 2）、TH-302 75 mg/kg和Olaparib 100 mg/kg聯合給藥組（Group 5）、TH-302 75 mg/kg單藥組（Group 7）以及10% 無水乙醇 +10% 聚氧乙烯（35）蓖麻油 +80%葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒對照組，共7組，每組6只小鼠。溶媒對照組、TH-302單藥及聯合用藥組均為尾靜脈給藥，每週給藥一次，共計給藥三周；測試藥Olaparib組，口服灌胃給藥，每天給藥一次，共給藥30天。根據相對腫瘤抑制率TGI（%）進行療效評價，根據動物體重變化和死亡情況進行安全性評價。

測試藥Olaparib 100 mg/kg（Group 2）治療組在腫瘤細胞接種後的第35天沒有抑瘤作用，相對腫瘤抑制率TGI(%)為-7.1%，相較對照組統計學上沒有顯著性差異（p＞0.05）。Olaparib 100 mg/kg和TH-302 75 mg/kg的聯合治療組（Group 5），在腫瘤細胞接種後的第35天有顯著的抑瘤作用，相較對照組統計學上有顯著性差異（p＜0.001），相對腫瘤抑制率TGI(%)為84.47%。TH-302 75 mg/kg單藥治療組(Group 7) 在腫瘤細胞接種後的第35天（Day 35）表現出顯著的抑瘤作用，相較對照組統計學上有顯著性差異（p＜0.001），相對腫瘤抑制率TGI(%)為87.66%。TH-302 單藥組與Olaparib 和TH-302的聯合治療組相比，抑瘤效果沒有顯著性差異（p＞0.05）。測試藥Olaparib 100 mg/kg 、TH-302 75 mg/kg單藥組與Olaparib 100 mg/kg和TH-302 75 mg/kg聯合給藥組小鼠體重均沒有明顯下降，耐受良好。

具體每一組的給藥方案下表6所示。表6：藥物在人源胰腺癌 Capan-1皮下動物治療模型實驗中各組別的給藥方案

組別	動物數	給藥組	劑量 (mg/kg)	給藥方式	給藥週期
1	6	10%無水乙醇+10%聚氧乙烯（35）蓖麻油+80% 葡萄糖注射液D5W（pH7.4）	-	i.v.	QW×3
2	6	Olaparib	100	p.o.	QD×30
5	6	TH-302	75	i.v.	QW×3
Olaparib	100	p.o.	QD×30
7	6	TH-302	75	i.v.	QW×3

分別在不同天數對不同組別的小鼠的腫瘤體積進行測量，並取得平均值，其結果如下表7所示。表7：人胰腺癌Capan-1模型中各組小鼠腫瘤體積隨治療時間的變化（單位mm ³）

實驗組及接種天數	第1組 10%無水乙醇+10%聚氧乙烯（35）蓖麻油+80% 葡萄糖注射液D5W（pH 7.4）	第2組 Olaparib,100 g/kg	第5組 TH-302,75 mg/kg, 聯用Olaparib,7100mg/kg	第7組 TH-302,775 mg/kg
細胞接種後第5天	140.15±12.35	140.69±13.31	140.09±11.54	141.29±13.45
細胞接種後第7天	211.60±32.78	255.26±56.18	243.11±27.79	240.00±28.16
細胞接種後第9天	257.42±44.31	288.46±52.25	284.67±48.75	272.65±29.49
細胞接種後第12天	333.44±61.23	406.96±81.71	318.67±64.40	280.18±23.72
細胞接種後第14天	412.38±79.84	482.18±88.80	305.16±67.67	250.13±18.31
細胞接種後第16天	433.99±69.21	534.69±95.62	281.13±69.23	216.81±15.63
細胞接種後第19天	494.74±69.69	652.86±114.19	250.26±69.38	186.76±25.72
細胞接種後第21天	635.79±77.63	716.59±145.84	254.94±75.89	170.43±16.07
細胞接種後第23天	689.93±101.71	709.38±163.04	227.48±80.51	162.42±15.97
細胞接種後第26天	790.81±133.21	787.78±164.59	213.51±73.21	149.66±15.68
細胞接種後第28天	918.85±158.54	870.02±198.09	195.29±69.19	132.20±12.63
細胞接種後第30天	999.61±152.57	1007.07±217.15	195.08±70.44	125.55±16.37
細胞接種後第33天	1104.13±160.17	1169.84±201.70	189.89±60.89	135.67±17.99
細胞接種後第35天	1175.78±150.36	1306.53±210.78	203.80±69.82	147.81±17.94

各治療組和對照組腫瘤生長情況見表7和圖3。藥效評估見表8。表8：在人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組藥效分析表

實驗組	細胞接種後的第 35 天（ 07/28/2021 ）
腫瘤體積（ ±S）	相對腫瘤體積（ ±S）	TGI (%)	T/C (%)	P Value （相較於對照組）
第1組 10%無水乙醇+10%聚氧乙烯（35）蓖麻油+80% 葡萄糖注射液D5W（pH7.4）	1175.78±150.36	8.61±1.08	-	-	-
第2組 Olaparib 100 mg/kg	1306.53±210.78	9.22±1.36	-7.1	107.1	1
第5組 TH-302,75 mg/kg,聯用 Olaparib100 mg/kg	203.80±69.82	1.34±0.38	84.47	15.53	＜0.001
第7組 TH-302,75 mg/kg	147.81±17.94	1.06±0.13	87.66	12.34	＜0.001

表8：相對腫瘤增殖率，T/C %，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。計算公式如下： T/C % = TRTV / CRTV × 100%（TRTV：治療組平均RTV ；CRTV：溶媒對照組平均RTV；RTV=Vt/V0，V0為分組時該動物的瘤體積，Vt為治療後該動物的瘤體積）；相對腫瘤抑制率，TGI（%），計算公式如下：TGI% =（1-T/C）× 100%。（T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的平均相對腫瘤體積（RTV）。表9：在人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組腫瘤的相對腫瘤抑制率

將上表製作為曲線圖，可以得到圖4。

分別在不同天數對不同組別的小鼠的體重進行測量，並取得平均值，其結果如下表10所示。表10：藥物在人源胰腺癌 Capan-1皮下動物治療模型實驗中不同接種天數小鼠的體重

將上表製作為曲線圖，可以得到圖5，即人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組小鼠體重曲線。

同理對表10的資料進行處理可以得到下表11。表11：藥物在人源胰腺癌 Capan-1皮下動物治療模型實驗中不同接種天數小鼠的體重變化百分比（% Group Mean Change = mean((T-T0)/T0) * 100，T表示current value，T0表示initial value）

將上表製作為曲線圖，可以得到圖6。

分析實驗資料可知，療效方面： 1、Capan-1 CDX 模型確實是Olaparib抵抗模型，Olaparib對該模型的腫瘤增長無抑制作用，即對Olaparib具有耐藥性； 2、TH-302單藥對Olaparib抵抗的胰腺癌有較好的治療效果（TGI為82.67%）； 3、TH-302聯用Olaparib對Olaparib抵抗的胰腺癌有較好的治療效果（TGI為87.43%）； 4、TH-302單藥組與Olaparib 和TH-302的聯合治療組相比，抑瘤效果稍好，但沒有顯著性差異（p＞0.05）；

分析實驗資料可知，測試藥Olaparib 100 mg/kg 、TH-302 75 mg/kg單藥組與Olaparib 100 mg/kg和TH-302 75mg/kg聯合給藥組小鼠體重均沒有明顯下降，耐受良好。

發明人對TH-302在Olaparib耐受的胰腺癌Capan-1 CDX模型進一步進行了深入的研究，發現：①TH-302單藥治療組表現出藥物抑瘤作用的劑量依賴性；②Olaparib與TH-302聯用的特定劑量組合可以顯示出抑瘤效果的協同作用。

發明人同時對TH-302在Olaparib耐受的肺癌LU6429 PDX模型、膀胱癌BL3325 PDX模型中的藥效和安全性進行了研究。

進一步的研究方案與實驗資料如下文所述。

3.2 進一步研究 TH-302 在 Olaparib 耐受的胰腺癌 Capan-1 CDX 模型中的藥效及安全性

方案：BALB/c裸小鼠皮下接種人源胰腺癌Capan-1細胞，建立人源胰腺癌皮下移植模型。試驗分為測試藥Olaparib 100 mg/kg單藥組（Group 2）、TH-302 50 mg/kg單藥組（Group 3，QD）、TH-302 100 mg/kg單藥組（Group 4）、TH-302 50 mg/kg單藥組（Group 5，QW）、TH-302 25 mg/kg單藥組（Group 6）、TH-302 25 mg/kg和Olaparib 100 mg/kg聯合給藥組（Group 7）以及10% 無水乙醇 +10% 聚氧乙烯（35）蓖麻油 +80%葡萄糖注射液D5W(pH7.4)溶媒對照組（Group 1），共7組，每組6只小鼠。溶媒對照組、TH-302各測試藥均為尾靜脈注射給藥。其中TH-302 50 mg/kg單藥組（Group 3，QD）每天給藥一次，連續給藥3天，休息4天，再休息兩周；再每天給藥，連續給藥3天。TH-302 100 mg/kg（Group 4，QW）、50 mg/kg（Group 5，QW）、25 mg/kg（Group 6，QW）單藥組以及TH-302 25 mg/kg和Olaparib 100 mg/kg聯合給藥組（Group 7）中的TH-302，均為每週給藥一次，共給藥三周。各組中測試藥Olaparib均為口服灌胃給藥，每天給藥一次，共給藥30天。具體人源胰腺癌Capan-1 動物模型中的給藥途徑、劑量及方案如表12所示。表12：人源胰腺癌Capan-1 動物模型中的給藥途徑、劑量及方案

組別	動物數	給藥組	劑量(mg/kg)	給藥方式	給藥週期
1	6	10%無水乙醇+10%聚氧乙烯（35）蓖麻油+80% 葡萄糖注射液D5W（pH7.4）	-	i.v.	QW×3
2	6	Olaparib	100	p.o.	QD×30
3	6	TH-302	50	i.v.	QD×3，4 days off，2 weeks off；QD×3
4	6	TH-302	100	i.v.	QW×3
5	6	TH-302	50	i.v.	QW×3
6	6	TH-302	25	i.v.	QW×3
7	6	TH-302	25	i.v.	QW×3
Olaparib	100	p.o.	QD×30

注：給藥體積為10μL/g。

在試驗不同天數記錄各治療組和對照組腫瘤生長情況，如表13所示，相應地各組小鼠腫瘤體積的生長曲線如圖7所示。根據相對腫瘤增殖率和相對腫瘤抑制率對療效進行評價，各組藥效分析如表14所示。記錄治療組和對照組給藥後體重變化，研究人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組的安全性，第43天小鼠體重變化率結果如表15所示，各治療組體重隨時間變化曲線圖如圖8所示。

相對腫瘤增殖率，T/C %，即在某一時間點，治療組和對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。計算公式如下： T/C % = T _RTV/ C _RTV× 100%（T _RTV：治療組平均RTV ；C _RTV：溶媒對照組平均RTV；RTV=V _t/V ₀，V ₀為分組時該動物的腫瘤體積，V _t為治療後該動物的腫瘤體積）；或T/C % = T _TW/ C _TW× 100% （T _TW：治療組實驗終結時平均瘤重；C _TW：溶媒對照組實驗終結時平均瘤重）。

相對腫瘤抑制率，TGI（%），計算公式如下：TGI% =（1-T/C）× 100%。（T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的相對腫瘤體積（RTV）或瘤重（TW））。表13：人胰腺癌Capan-1模型中各組小鼠腫瘤體積隨治療時間的變化（mm ³）

組別

接種後天數

Day 6

Day 9

Day 13

Day 16

Day 20

Day 23

Day 27

Day 30

Day 34

Day37

Day 41

Day 43

第1組

146.73±13.49

202.65±26.64

255.59±42.25

381.63±74.74

415.53±69.72

458.56±73.18

574.50±78.37

698.89±86.28

802.76±63.70

956.60±91.72

1225.58±50.19

1301.38±76.61

第2組

146.72±15.47

223.17±40.93

263.96±48.21

314.03±60.93

373.87±74.27

419.26±80.72

518.48±105.78

550.33±116.03

604.32±130.18

725.18±136.03

767.49±116.87

846.86±128.85

第3組

146.76±14.97

194.10±32.47

138.02±31.54

124.61±25.17

105.24±22.59

107.93±29.10

110.55±38.68

123.45±43.23

101.47±32.83

114.69±35.62

134.32±40.59

146.99±37.96

第4組

146.05±11.97

193.80±27.43

123.87±20.28

112.22±13.36

85.08±10.27

59.95±14.40

49.03±12.67

48.35±10.56

65.87±16.01

75.54±23.20

106.10±25.73

124.68±31.35

第5組

147.11±13.81

182.60±28.23

178.72±36.66

181.66±34.38

181.56±36.01

156.49±37.68

152.57±41.52

152.13±42.89

176.07±60.21

198.42±65.71

221.99±73.13

263.45±86.54

第6組

146.81±14.13

213.60±33.98

233.94±55.49

277.57±68.20

295.46±60.68

328.33±81.76

373.13±70.65

454.44±82.67

705.45±124.08

886.42±166.06

1344.26±301.53

1521.33±349.46

第7組

146.83±14.11

181.77±47.47

183.91±47.60

186.76±38.16

202.47±42.51

206.06±66.25

207.63±61.32

215.23±70.48

267.67±99.47

295.31±123.02

360.39±132.08

378.56±157.73

表14：在人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組藥效分析表

組別	細胞接種後的第43天
腫瘤體積（ ±S）	相對腫瘤體積（ ±S）	TGI (%)	T/C (%)	P Value （相較於對照組）	CR比例
第1組	1301.38±76.61	9.15±0.70	-	-	-
第2組	846.86±128.85	5.72±0.54	37.43	62.57	＞0.05	0/6
第3組	146.99±37.96	0.99±0.22	89.17	10.83	＜0.001	0/6
第4組	124.68±31.35	0.83±0.17	90.89	9.11	＜0.001	0/6
第5組	263.45±86.54	1.81±0.64	80.18	19.82	＜0.001	2/6
第6組	1521.33±349.46	11.12±3.31	-21.59	121.59	＞0.05	0/6
第7組	378.56±157.73	2.34±0.81	74.36	25.64	＜0.001	0/6

注：1. 資料以“平均值 ± 標準誤差”表示； 2. T/C % = TRTV / CRTV × 100%； 3. CR：腫瘤完全緩解，腫瘤消退到0。表15：在人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組體重變化情況

實驗組	動物數	平均體重g（ ±S）	體重變化率（%）	實驗終點
細胞接種後的第6天（Day 6）	細胞接種後的第43天（Day 43）	細胞接種後的第43天（Day 43）
第1組	6	21.2±0.4	24.8±0.3	17.25%±1.64%	細胞接種後的第43天即Day 43
第2組	6	21.9±0.4	24.2±0.4	10.95%±2.07%	細胞接種後的第43天即Day 43
第3組	6	22.1±0.4	24.5±0.3	10.74%±1.25%	細胞接種後的第43天即Day 43
第4組	6	21.8±0.5	24.2±0.7	11.04%±0.91	細胞接種後的第43天即Day 43
第5組	6	21.9±0.4	25.1±0.4	14.81%±0.62	細胞接種後的第43天即Day 43
第6組	6	22.0±0.5	26.4±0.7	20.46%±3.51	細胞接種後的第43天即Day 43
第7組	6	22.3±0.4	25.4±0.5	14.59%±1.74	細胞接種後的第43天即Day 43

上述資料表明：溶媒對照組小鼠在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為1301.38 mm ³。測試藥Olaparib 100 mg/kg（Group 2）治療組在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為846.86 mm ³，相對腫瘤抑制率TGI(%)為37.43%，相較對照組統計學上沒有顯著性差異（p＞0.05）。

測試藥TH-302 50 mg/kg治療組（Group 3，QD），在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為146.99 mm ³，相較對照組統計學上有顯著性差異（p＜0.001），相對腫瘤抑制率TGI(%)為89.17%。測試藥TH-302 100 mg/kg治療組（Group 4），在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為124.68 mm ³，相較對照組統計學上有顯著性差異（p＜0.001），相對腫瘤抑制率TGI(%)為90.89%。測試藥TH-302 50 mg/kg治療組（Group 5，QW），在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為263.45 mm ³，相較對照組統計學上有顯著性差異（p＜0.001），相對腫瘤抑制率TGI(%)為80.18%，腫瘤完全抑制率為33.3%。測試藥TH-302 25 mg/kg治療組（Group 6），在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為1521.33 mm ³，相較對照組統計學上沒有顯著性差異（p＞0.05），相對腫瘤抑制率TGI(%)為-21.59%。Olaparib 100 mg/kg和TH-302 25 mg/kg的聯合治療組（Group 7），在腫瘤細胞接種後的第43天（Day 43）平均腫瘤體積為378.56 mm ³，相較對照組統計學上有顯著性差異（p＜0.001），相對腫瘤抑制率TGI(%)為74.36%。

TH-302 100 mg/kg（Group 4）、50 mg/kg（Group 5，QW）和25 mg/kg（Group 6）單藥治療組表現出藥物抑瘤作用的劑量依賴性。TH-302 100 mg/kg（Group 4，QW）、50 mg/kg（Group 5，QW）單藥治療組相較TH-302 25 mg/kg單藥治療組（Group 6，QW）統計學上均有顯著性差異（p均＜0.001）。

Olaparib 100 mg/kg與TH-302 25 mg/kg的聯合治療組（Group 7）抗腫瘤作用優於Olaparib 100 mg/kg（Group 2）以及TH-302 25 mg/kg單藥組（Group 6），統計學上有顯著性差異（p＜0.05以及p＜0.001），Olaparib與TH-302聯用的特定劑量組合可以顯示出抑瘤效果的協同作用。

測試藥Olaparib 100 mg/kg（Group 2）、TH-302 25 mg/kg（Group 6）、 TH-302 50 mg/kg（Group 3，QD）、TH-302 50 mg/kg（Group 5，QW）、TH-302 100 mg/kg（Group 4）、Olaparib 100 mg/kg和TH-302 25 mg/kg聯合給藥組（Group 7）、溶媒對照組（Group 1）小鼠體重均沒有明顯下降，耐受良好。

3.3 TH-302 在 Olaparib 耐受的肺癌 LU6429 PDX 模型中的藥效及安全性評價

LU6429 PDX模型是帶有BRCA2致病突變的Olaparib耐受模型。

方案：Balb/c nude雌性小鼠皮下接種HuPrime®肺癌LU6429瘤塊，建立人肺癌皮下移植腫瘤模型。試驗分為測試藥Olaparib 50 mg/kg單藥組（Group 02），TH-302 80 mg/kg單藥組（Group 03），TH-302 40 mg/kg單藥組（Group 04），TH-302 20 mg/kg單藥組（Group 05），TH-302 40 mg/kg和Olaparib 50 mg/kg聯合給藥組（Group 06），以及葡萄糖注射液溶媒對照組（Group 01）。該研究共6組，每組6只小鼠，其中溶媒對照組和TH-302均為尾靜脈給藥，每週給藥1次，共計給藥3周；Olaparib為灌胃給藥，每天給藥1次，共計給藥28天。具體的HuPrime®肺癌LU6429動物模型中的給藥途徑、劑量及方案如表16所示。表16：HuPrime®肺癌LU6429動物模型中的給藥途徑、劑量及方案

組別	動物數	給藥組	劑量(mg/kg)	給藥方式	給藥週期
1	6	葡萄糖注射液	-	i.v.	QW×3
2	6	Olaparib	50	p.o.	QD×28
3	6	TH-302	80	i.v.	QW×3
4	6	TH-302	40	i.v.	QW×3
5	6	TH-302	20	i.v.	QW×3
6	6	Olaparib	50	p.o.	QD×28
TH-302	40	i.v.	QW×3

注：1. 給藥體積為 10 μL/g； 2. QD×28：每天給藥一次，連續給藥28天； 3. QW×3: 每週給藥1次，連續給藥3周。

在試驗不同天數記錄各治療組和對照組腫瘤生長情況，如表17所示，相應地各組小鼠腫瘤體積的生長曲線如圖9所示。根據相對腫瘤增殖率和相對腫瘤抑制率對療效進行評價，各組藥效分析如表18所示。記錄治療組和對照組給藥後體重變化，研究在HuPrime®肺癌LU6429皮下模型中各組的安全性，第25天小鼠體重變化結果如表19所示，各治療組體重隨時間變化曲線圖如圖10所示。表17：在HuPrime®肺癌LU6429模型中各組小鼠腫瘤體積隨治療時間的變化（mm ³）

組別	接種後天數
Day 0	Day 4	Day 7	Day 11	Day 14	Day 18	Day 21	Day 25	Day 27
第1組	102.44±2.49	259.87±13.67	382.98±34.24	572.10±66.56	1007.43±105.81	1337.22±162.19	1765.80±210.72	2256.82±271.40	2362.40±274.50
第2組	102.82±2.80	299.24±59.50	462.91±88.04	650.87±104.16	821.67±122.23	1169.82±161.72	1427.99±213.12	2019.59±304.46	2390.86±344.38
第3組	102.99±5.82	173.84±17.46	191.93±20.29	161.20±20.42	126.48± 9.07	82.07± 13.35	68.83± 15.37	60.67± 22.93	61.24± 25.30
第4組	103.27±3.02	227.95±23.82	273.49±31.36	347.62±50.22	324.71± 60.05	368.33± 73.32	351.06± 83.11	409.93± 113.60	466.06± 149.54
第5組	102.03±2.16	305.66±45.66	426.08±79.10	570.59±117.49	640.36± 126.52	812.62± 154.43	893.25± 147.28	1099.39±251.90	1297.75±289.08
第6組	103.88±6.10	215.29±29.95	252.34±38.00	297.51±43.70	312.63± 48.98	326.77± 46.47	297.24± 51.83	315.97± 58.35	344.27± 72.07

表18：在HuPrime®肺癌LU6429皮下模型中各組藥效分析表

實驗組	Day 25
腫瘤體積（ ±S）	相對腫瘤體積（ ±S）	TGI(%)	T/C (%)	P Value （相較於對照組）	腫瘤清除率 Day 27
第1組	2256.82± 271.40	21.82±2.15	-	-	-	0/6
第2組	2019.59± 304.46	19.69±3.02	9.74	90.26	＞0.05	0/6
第3組	60.67±22.93	0.61±0.22	97.19	2.81	＜0.001***	1/6
第4組	409.93± 113.60	3.99±1.15	81.69	18.31	＜0.001***	0/6
第5組	1099.39± 251.90	10.92±2.67	49.97	50.03	＜0.05*	0/6
第6組	315.97± 58.35	2.99±0.48	86.31	13.69	＜0.001***	0/6

注：資料以“平均值 ± 標準誤差”表示。表19：在HuPrime®肺癌LU6429皮下模型中各組體重變化情況

實驗組	動物數	平均體重g（ ±S）	體重變化率（%）	實驗終點
Day 0	Day 25	Day 25
第1組	6	20.6±0.2	25.2±0.3	22.43%±2.07%	Day 27
第2組	6	20.8±0.2	24.0±0.4	15.20%±2.31%	Day 27
第3組	6	21.5±0.3	23.2±0.2	7.94%±0.76%	Day 27
第4組	6	21.6±0.2	23.7±0.4	10.01%±1.19%	Day 27
第5組	6	20.8±0.2	23.2±0.4	11.72%±1.73%	Day 27
第6組	6	21.9±0.3	23.2±0.3	6.03%±0.78%	Day 27

上述資料表明： Olaparib單獨給藥組未產生抑瘤作用，顯示出肺癌LU6429 PDX模型對Olaparib的耐受。測試藥TH-302在80 mg/kg，40 mg/kg，20 mg/kg劑量單獨治療組，以及TH-302在40 mg/kg與Olaparib在50 mg/kg劑量下的聯合治療組，在本研究中，對HuPrime®肺癌LU6429皮下模型均具有顯著的抗腫瘤增殖作用。其中TH-302 80 mg/kg（Group 03）劑量治療組有1只小鼠的腫瘤被完全清除，清除率為16.7%。測試藥TH-302 80 mg/kg，40 mg/kg以及20 mg/kg治療組之間，統計學上有顯著差異（p＜0.05），顯示出劑量依賴性。TH-302 40 mg/kg與Olaparib 50 mg/kg的聯合治療效果顯著優於Olaparib 50 mg/kg單獨治療組，但與TH-302 40 mg/kg單獨治療組相比稍好，但差異較小不顯著。

各測試藥治療組小鼠在治療期間小鼠體重均沒有下降，耐受良好。

3.4 TH-302 在 Olaparib 耐受的膀胱癌 BL3325 PDX 模型中的藥效及安全性評價

BL3325 PDX模型是帶有BRCA2致病突變的Olaparib耐受模型。

方案：Balb/c nude雌性小鼠皮下接種HuPrime®膀胱癌BL3325瘤塊，建立人膀胱癌皮下移植腫瘤模型。試驗分為測試藥Olaparib 50 mg/kg單藥組（Group 02），TH-302 80 mg/kg單藥組（Group 03），TH-302 40 mg/kg單藥組（Group 04），TH-302 20 mg/kg單藥組（Group 05），TH-302 40 mg/kg和Olaparib 50 mg/kg聯合給藥組（Group 06），以及葡萄糖注射液溶媒對照組（Group 01）。該研究共6組，每組6只小鼠，其中溶媒對照組和TH-302均為尾靜脈給藥，每週給藥1次，共計給藥3周；Olaparib為灌胃給藥，每天給藥1次，共計給藥30天。具體的HuPrime®膀胱癌BL3325動物模型中的給藥途徑、劑量及方案如表20所示。表20：HuPrime®膀胱癌BL3325動物模型中的給藥途徑、劑量及方案

組別	動物數	給藥組	劑量(mg/kg)	給藥方式	給藥週期
1	6	葡萄糖注射液	-	i.v.	QW×3
2	6	Olaparib	50	p.o.	QD×30
3	6	TH-302	80	i.v.	QW×3
4	6	TH-302	40	i.v.	QW×3
5	6	TH-302	20	i.v.	QW×3
6	6	Olaparib	50	p.o.	QD×30
TH-302	40	i.v.	QW×3

注：1. 給藥體積為 10 μL/g；2. QD×30：每天給藥一次，連續給藥30天； 3. QW×3：每週給藥1次，連續給藥3周；4. i.v.為尾靜脈給藥，p.o.為灌胃給藥。

在試驗不同天數記錄各治療組和對照組腫瘤生長情況，如表21所示，相應地各組小鼠腫瘤體積的生長曲線如圖11所示。根據相對腫瘤增殖率和相對腫瘤抑制率對療效進行評價，各組藥效分析如表22所示。記錄治療組和對照組給藥後體重變化，研究HuPrime®膀胱癌BL3325皮下模型中各組的安全性，第35天小鼠體重變化結果如表23所示，各治療組體重隨時間變化曲線圖如圖12所示。表21：在HuPrime®膀胱癌BL3325模型中各組小鼠腫瘤體積隨治療時間的變化（mm ³）

組別	接種後天數
Day 0	Day 4	Day 7	Day 11	Day 14	Day 18	Day 21	Day 25	Day 28	Day 32	Day 35
第1組	128.05	247.09	366.61	590.94	769.51	1047.80	1309.89	1716.34	1961.01	2094.57	2506.70
第2組	127.83	225.23	303.42	410.99	525.97	661.65	854.15	1074.23	1267.11	1493.95	1717.98
第3組	127.79	179.28	221.96	201.30	197.43	140.80	137.34	119.36	103.28	83.34	103.73
第4組	127.95	190.31	251.91	298.71	294.43	276.26	268.83	259.33	260.51	342.45	464.64
第5組	127.71	180.20	238.31	281.67	303.57	332.09	389.03	439.74	595.95	786.73	1028.58
第6組	127.93	192.20	231.88	281.35	276.14	252.53	242.19	199.69	182.06	132.96	129.97

表22：在HuPrime®膀胱癌BL3325皮下模型中各組藥效分析表

實驗組	開始給藥後第36天Day 35
腫瘤體積（ ±S）	相對腫瘤體積（ ±S）	TGI (%)	T/C (%)	P Value （相較於對照組）	腫瘤清除率
第1組	2506.70±403.02	19.30±2.69	/	/	-	0/6
第2組	1717.98±129.57	13.43±0.40	30.42	69.58	＞0.05	0/6
第3組	103.73±38.44	0.76±20.26	96.05	3.95	＜0.001***	1/6
第4組	464.64±168.62	3.78±1.60	80.42	19.58	＜0.001***	0/6
第5組	1028.58±111.81	8.08±0.81	58.16	41.84	＜0.05**	0/6
第6組	129.97±9.59	1.03±0.09	94.66	5.34	＜0.001***	0/6

注：1. 資料以“平均值 ± 標準誤差”表示；2. T/C % = T _RTV/ C _RTV* 100%。表23：在HuPrime®膀胱癌BL3325皮下模型中各組體重變化情況

實驗組	動物數實驗開始/實驗結束	平均體重g（ ±S）	體重變化率（%）	實驗終點
Day 0	Day 35	Day 35
第1組葡萄糖注射液, 10µL/g, i.v., QW×3	6/6	21.5±0.4	22.2±0.5	3.19%±2.78%	Day 35
第2組 Olaparib,50mg/kg,10µL/g, p.o., QD×30	6/6	21.8±0.5	20.9±0.7	-4.24%±2.93%	Day 35
第3組 TH-302 80mg/kg,10µL/g, i.v., QW×3	6/6	21.7±0.4	23.8±0.6	9.46%±0.99%	Day 35
第4組 TH-302 40mg/kg,10µL/g, i.v., QW×3	6/6	21.5±0.3	23.2±0.2	7.88%±1.16%	Day 35
第5組 TH-302 20mg/kg,10µL/g, i.v., QW×3	6/6	21.6±0.3	23.0±0.5	6.30%±1.07%	Day 35
第6組 TH-302 40mg/kg,10µL/g, i.v., QW×3+Olaparib,50 mg/kg,10µL/g, p.o., QD×30	6/6	21.6±0.2	22.6±0.4	4.37%±0.98%	Day 35

注：1. 資料以“平均值 ± 標準誤差”表示。

上述資料表明：測試藥TH-302在80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg劑量單獨治療組，以及TH-302 40 mg/kg與Olaparib 50 mg/kg聯合治療組對HuPrime®膀胱癌BL3325皮下模型均具有顯著的抗腫瘤增殖作用，Olaparib 50 mg/kg單獨治療沒有顯著抑瘤作用。TH-302 80 mg/kg較20 mg/kg劑量組抑瘤作用存在統計學差異，表明TH-302抑制BL3325腫瘤生長具有劑量依賴性。其中TH-302 80 mg/kg治療組（Group 03）有1只小鼠腫瘤被完全清除，清除率為16.7%。TH-302 40 mg/kg與Olaparib 50 mg/kg的聯合治療效果顯著優於Olaparib 50 mg/kg單獨治療組，與TH-302 40 mg/kg單獨治療組相比更好，且差異顯著。

雖然本申請實施例中選用的PARP抑制劑為奧拉帕利Olaparib，但蘆卡帕利Rucaparib、尼拉帕利Niraparib、他拉唑帕利Talazoparib、氟唑帕利Fluzoparib、帕米帕利Pamiparib等同樣屬於PARP抑制劑，作用機理與奧拉帕利Olaparib類似，均是阻斷參與修復受損DNA酶發揮作用，因此，可以推定，蘆卡帕利Rucaparib、尼拉帕利Niraparib、他拉唑帕利Talazoparib、氟唑帕利Fluzoparib、帕米帕利Pamiparib等PARPi具有與上述實驗中的奧拉帕利Olaparib類似的腫瘤抑制療效。

TH-302為乏氧活化的DNA烷化劑，請求項1的通式化合物：（I），在相關專利申請中已被證明是與TH-302類似的機理，因此這類化合物具有與TH-302類似的效果是完全可以預測的。

無

圖1為化合物TH-302和替拉紮明（tirapazamine）在常氧和缺氧條件下對Capan-1細胞系的抑制率曲線，其中，con.Log（nM）表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，inhibition表示抑制率；

圖2為化合物TH-302和替拉紮明（tirapazamine）在常氧和缺氧條件下對BxPc-3細胞系的抑制率曲線，其中，con.Log（nM）表示nmol/L單位下濃度數值的以10為底數的對數值，inhibition表示抑制率；

圖3為人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組小鼠腫瘤體積的生長曲線圖；

圖4為人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組小鼠相對腫瘤抑制率曲線圖；

圖5為人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組小鼠體重曲線圖；

圖6為人源胰腺癌Capan-1皮下模型中各組小鼠體重變化百分比曲線圖；

圖7為胰腺癌Capan-1CDX模型中各組小鼠腫瘤體積的生長曲線圖；

圖8為胰腺癌Capan-1CDX模型中各治療組體重隨時間變化曲線圖；

圖9為肺癌LU6429 PDX模型中各組小鼠腫瘤體積的生長曲線圖；

圖10為肺癌LU6429 PDX模型中各治療組體重隨時間變化曲線圖；

圖11為膀胱癌BL3325 PDX模型中各組小鼠腫瘤體積的生長曲線圖；

圖12為膀胱癌BL3325 PDX模型中各治療組體重隨時間變化曲線圖。

Claims

一種式（I）的乏氧激活化合物在製備用於單藥或聯用治療患者PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤的藥物中的用途：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO。
如請求項1所述的用途，其中式（I）的乏氧激活化合物聯用PARP抑制劑。
如請求項1或2所述的用途，其中，所述患者的DNA修復酶受損；或所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。
如請求項3所述的用途，其中，BRCA1、BRCA2突變包括胚系突變(gBRCAm)和體系突變(sBRCAm)的BRCA1、BRCA2突變。
如請求項1或2所述的用途，其中，所述PARP抑制劑選自奧拉帕利(Olaparib)、蘆卡帕利(Rucaparib)、尼拉帕利(Niraparib)、他拉唑帕利(Talazoparib)、氟唑帕利(Fluzoparib)、帕米帕利(Pamiparib)；所述癌症、腫瘤選自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、膀胱癌，其中所述肺癌選自非小細胞肺癌、小細胞肺癌。
如請求項1或2所述的用途，其中，式（I）的乏氧激活化合物選自以下結構的化合物：。
一種下式的乏氧激活化合物在製備用於單藥治療奧拉帕利(Olaparib)耐藥的患者卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌的藥物中的用途：，其中，所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。
一種下式的乏氧激活化合物在製備用於聯用奧拉帕利(Olaparib)治療奧拉帕利(Olaparib)耐藥的患者卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌的藥物中的用途：，其中，所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。
一種式（I）的乏氧激活化合物在製備用於單藥或聯用PARP抑制劑治療具有BRCA1、BRCA2基因突變的患者的對PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤的藥物中的用途：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO。
如請求項3或4或7或8或9任一項所述的用途，其中，所述的基因突變的TMB（腫瘤基因突變負荷）水平為中。
一種式（I）的乏氧激活化合物在製備用於單藥或聯用PARP抑制劑治療患者癌症的藥物中的用途：（I），其中，所述患者為對PARP抑制劑耐藥的患者； R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO。
如請求項11所述的用途，其中，所述患者的DNA修復酶受損；或所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變。
如請求項12所述的用途，其中，所述BRCA1、BRCA2突變包括胚系突變(gBRCAm)和體系突變(sBRCAm)的BRCA1、BRCA2突變；所述基因突變的TMB（腫瘤基因突變負荷）水平為中。
如請求項11所述的用途，其中，式（I）的乏氧激活化合物選自以下結構的化合物：；或所述PARP抑制劑選自奧拉帕利(Olaparib)、蘆卡帕利(Rucaparib)、尼拉帕利(Niraparib)、他拉唑帕利(Talazoparib)、氟唑帕利(Fluzoparib)、帕米帕利(Pamiparib)；或所述癌症、腫瘤選自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、輸卵管癌、原發性腹膜癌、胃癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌。
一種治療對PARP抑制劑耐藥的癌症、腫瘤患者的藥物，該藥物含有式（I）的乏氧激活化合物：（I），其中，R各自獨立地選自H、-CH ₃、-CH ₂CH ₃，X各自獨立地選自Cl、Br、MsO、TsO。
如請求項15所述的藥物，其中，所述患者的DNA修復酶受損；或所述患者的腫瘤或癌組織被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變；或所述患者被檢測出具有BRCA1、BRCA2對應的基因中的任意一個基因突變或兩個基因突變，其中所述BRCA1、BRCA2突變包括胚系突變(gBRCAm)和體系突變(sBRCAm)的BRCA1、BRCA2突變。