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TW202434199A - 抑制蝦ehp感染之組成物及相關方法 - Google Patents

抑制蝦ehp感染之組成物及相關方法 Download PDF

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TW202434199A
TW202434199A TW112144262A TW112144262A TW202434199A TW 202434199 A TW202434199 A TW 202434199A TW 112144262 A TW112144262 A TW 112144262A TW 112144262 A TW112144262 A TW 112144262A TW 202434199 A TW202434199 A TW 202434199A
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oil
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哈里庫瑪 山帕斯
穆卡里爾 拉佳勒科席米
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美商開萌工業公司
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Abstract

本發明係有關一種投與包含瑞香草醌(thymoquinone)之組成物之方法，其量可以有效地使EHP孢子不活性化及降低EHP感染率，其中瑞香草醌可以源自蜂香薄荷( Monarda didyma)、管蜂香草( Monarda fistulosa)、或黑種草( Nigella sativa)。本發明進一步有關一種在農業上控制EHP繁殖之方法，明確言之，在蝦族群中控制EHP感染擴散之方法。本發明另一態樣係有關一種直接使EHP孢子不活性化，以控制細胞內EHP繁殖之方法，其係對蝦投與包含瑞香草醌之組成物，例如：包含黑種草籽油之組成物。本發明另一態樣係有關一種組成物，其包含黑種草籽萃取物，單獨或含於油中，在至少一項實施例中，係與蜂香薄荷油(monarda oil)、奧勒岡油(oregano oil)、丁香油(clove oil)及桂皮醛(cinnamic aldehyde)組合，以控制及抑制EHP感染的擴散及其相關疾病。

Description

抑制蝦EHP感染之組成物及相關方法
相關申請案之交互引用
本申請案主張2023年11月17日申請之印度臨時專利申請案案號202211065837，名稱為「抑制蝦EHP感染之組成物及相關方法(COMPOSITIONS FOR INHIBITING EHP INFECTION IN SHRIMP AND RELATED METHODS)」之優先權益，其完整內容已以全文引用方式併入本文中。
肝胰臟微孢子蟲症(Hepatopancreatic microsporidiosis，HPM)為由細胞內微孢子蟲寄生蟲肝胰微孢子蟲( Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)引起蝦的微孢子蟲感染。由於檢測該感染的方法有限，而且缺少控制EHP擴散的方法，因此蝦養殖業已因EHP感染而承受嚴重經濟損失。Thawatchai, C.等人(2021), The shrimp microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei(EHP): Biology, pathology, diagnostics and control, Journal of Invertebrate Pathology, 186:107458；Thitamadee S.等人(2016), Review of current disease threats for cultivated penaeid shrimp in Asia, Aquaculture,452: 69–87；Chao Ma等人(2021), Rapid detection of Enterocytozoon hepatopenaeiinfection in shrimp with a Real-Time isothermal recombinase polymerase amplification assay, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, Vol. 11, 1-8。
蝦肝胰臟(hepatopancreas，HP)為分泌消化酵素、吸收、及儲存營養素的中樞器官。EHP為新興病原體，主要感染HP的管上皮細胞，造成蝦的嚴重生長遲滯及體型大小變異。EHP亦與其中細菌疾病有關，其中已發現感染到EHP的蝦極容易受到弧菌( Vibrio)感染，導致大量死亡。參見Han, J.L.等人(2019), Molecular detection of Enterocytozoon hepatopenaeiand Vibrioparahaemolyticus-associated acute hepatopancreatic necrosis disease in Southeast Asian Penaeus vannameishrimp imported into Korea, Aquaculture, 517:734812。目前，EHP成為全球蝦生產永續性的限制因素，因為該疾病仍然在養殖蝦的國家中擴散，沒有有效控制擴散的解決方法。
本發明係有關一種在水產養殖中控制EHP繁殖的組成物，明確言之，有能力在蝦族群中控制EHP擴散的組成物。本發明一項態樣係有關一種可以控制及抑制EHP感染擴散及其相關疾病之組成物，其包含黑種草( N. sativa)籽萃取物/油，單獨或組合使用精油(蜂香薄荷油(monarda oil)、奧勒岡油(oregano oil)、丁香油(clove oil)及桂皮醛(cinnamic aldehyde))。根據至少一項實施例，本發明組成物係作為飼料添加物投與蝦。
本發明另一態樣係有關一種造成直接使EHP孢子不活性化之方法，以便防止或降低蝦的感染。本發明另一態樣係有關投與組成物，諸如：動物飼料添加物，其係包括在動物飼料中，其量可以有效控制EHP擴散。本發明另一態樣係有關對蝦經口投與組成物，其量可以在蝦族群中有效抑制 EHP繁殖，且對蝦投與該組成物，其量可以有效控制HPM。
本發明者已發現可以滅活EHP極管擠出機制(polar tube extrusion mechanism)(附著機制(adhesive mechanism))的組成物，其係控制感染的第一步(亦即轉移EHP孢子原生質至宿主細胞內，其係附著機制)的可靠發展。
此外，本發明者已發現可以滅活EHP轉譯後修飾酵素甲硫胺酸胺基肽酶2 (MetAP2)之組成物，其仍然可以在細胞階段可靠地控制EHP的倍增。本發明者驚人地發現有效抑制EHP繁殖的組成物，並且認為其可安全地經口投與蝦，例如：透過補充飼料。
由植物衍生之組份為抗細微生物化學型態的潛在永續來源，且仍舊為控制病原體的潛在未開發解決方案。本發明者已驚人地發現，黑種草( Nigella sativa)萃取物/油單獨、或與精油，諸如：蜂香薄荷油、奧勒岡油、丁香油及肉桂油組合之飼料補充物，已證實可在統計上顯著降低蝦的EHP感染。本發明者亦證實艾威霸(Aquavibra™)(Kemin Industries, Inc.)，係一種桂皮醛與奧勒岡油之組合，可以達成顯著降低EHP感染。
黑種草為一種屬於毛茛科(Ranunculaceae family)之一年生草本植物。黑種草籽富含萜烯化合物，包括瑞香草醌、對傘花烴(p-cymene)、γ-萜品烯(γ-terpinene)、β-蒎烯(β-pinene)、香芹酚(carvacrol)、萜品烯-4-醇(terpinen-4-ol)及長葉烯(longifolene)。
本發明係有關一種可在農業上控制EHP繁殖之包含黑種草籽油之組成物，明確言之，其量可以在蝦族群中控制EHP感染擴散。根據本發明至少一項實施例，該組成物進一步包含至少一種精油，包括(但不限於)：彼等選自：黑種草籽油/萃取物、桂皮醛、奧勒岡油、肉桂油、丁香油、蜂香薄荷油、或其組合。較佳實施例中，組成物包含黑種草籽油與奧勒岡油、蜂香薄荷油、丁香油及桂皮醛之組合。另一項實施例中，本發明組成物可包括瑞香草醌、瑞香草氫醌(thymohydroquinone)、二瑞香草醌(dithymoquinone)、對傘花烴、香芹酚、萜品醇(terpineol)、瑞香草酚(thymol)、及其組合。
某些實施例中，本發明組成物包含黑種草籽油，其含量範圍在約0.1至100重量百分比，例如：1至95重量百分比，或5至95重量百分比。某些實施例中，組成物進一步包含含量範圍在約0至99.9重量百分比之奧勒岡油、含量範圍在約0至99.9重量百分比之蜂香薄荷油、含量範圍在約0至約50重量百分比之丁香油、及含量範圍在約0至約50重量百分比之桂皮醛。某些實施例中，組成物可視需要包括瑞香草醌、瑞香草氫醌、二瑞香草醌、對傘花烴、香芹酚、萜品醇、及/或瑞香草酚，其中此等可視需要選用之成份之含量範圍在約0.1至約50重量百分比。
本發明另一態樣係有關直接使EHP孢子不活性化，以便藉由改變轉譯後修飾來控制黏附機制及細胞內繁殖。有些實施例中，經口投與包含有效量黑種草籽油之組成物 ，會造成EHP感染降低約0至100百分比之範圍，例如：使感染降低5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100百分比。
本發明另一態樣係有關一種可以降低EHP感染之包含有效量黑種草籽油之組成物，諸如：作為動物飼料之補充物或添加物，其中組成物係包括在動物飼料中，其量可以有效控制EHP擴散。根據至少一項實施例，包括在飼料中之本發明組成物之含量範圍為約0.1至20 g/kg飼料，例如：約0.5至10 g/kg飼料。
本發明另一態樣係有關對蝦投與抑制蝦族群中EHP有效量之組成物及對蝦投與控制HPM有效量之組成物。
本發明另一態樣係有關可以滅活涉及極管擠出(黏附機制)之EHP感染之組成物。例如：有些實施例中，蝦族群中之EHP感染率降低，而EHP孢子持續繁殖。
本發明另一態樣係有關有效抑制EHP繁殖之組成物，其同時可以安全投與蝦，例如：透過補充在動物飼料中。另一項實施例中，該組成物可以加至水源中。或者又一項實施例中，該組成物可以施用至含有EHP孢子之水或土壤沉積物。
本發明另一態樣係有關投與有效量之組成物，以使存在於蝦養殖水及蝦池土壤沉積物中之EHP孢子去活性化。
下列實例係對本發明加以說明，且並不具有限制性。 實例 實例 1
對選定之生物活性化合物(香芹酚、α-萜品醇、瑞香草醌、桂皮醛及丁香油酚)及陽性對照物(煙黴素(Fumagillin)及阿苯達唑(Albendazole))，使用微孢子蟲藥物標靶：甲硫胺酸胺基肽酶2(MetAP2)進行之電腦分子嵌合及分子動態(MD)模擬綜合說明於表1。相較於對照組之結合能結果顯示，三種前導化合物：香芹酚、α-萜品醇、及瑞香草醌具有對抗MetAP2之可靠抑制潛力。採用廣義玻恩及表面積溶劑化(generalized Born and surface area solvation (MM/GBSA))及泊松-波爾茲曼表面積(Poisson-Boltzmann surface area)(MM/PBSA)計算之分子力學顯示該等化合物與MetAP2具有熱動力學上穩定之結合能。已證明該等化合物在熱動力學上有利於對MetAP2之結合及抑制，如表2及表3之綜合說明。 表 1.生物活性分子及陽性對照組對胺基酸之結合親合力
前導 -CID 結構式 結合親合力 (kCal/mol) 胺基酸 & 鍵結
H 鍵 π 鍵 凡得瓦 烷基
香芹酚(Carvacrol)_結構式2D_CID_10364 -7 Asp130 Phe97 Asp141 His210 Gln337 Glu339 Fe452 Ile217
煙黴素(Fumagillin)_結構式2D_CID_6917655 -6.8 Asp130 Thr290 (碳氫鍵) Asp141 His210 Fe452 Phe97 His109 Ile217 Val263 Tyr267 Pro292 Tyr324
α萜品醇(Alpha Terpineol)_結構式2D_CID_17100 -6.5 (π δ) Phe97 Tyr324 Ile217 His261 Phe262 His109 Val263 Pro292
丁香油酚(Eugenol)_結構式2D_CID_3314 -6.4 His210 Glu243 Phe97 His109 Fe451 Ile217 His218 His261 Tyr324
桂皮醛(Cinnamic aldehyde)_結構式2D_CID_637511 -6.4 His109 Phe97 His210 Ile217 Pro292
阿苯達唑(Albendazole)_結構式2D_CID_2082 -6.4 His208 Glu243 His109 His210 (π 陰離子) Fe451 (π 硫) Phe97 Ile217 His261 Pro292 Tyr324
瑞香草醌(Thymoquinone)_結構式2D_CID_10281 -6.3 Pro98 His261 Phe97 (πδ) Phe97 Tyr324 His210 Phe262 Val263 Ile217 Pro292
表 2 ：前導化合物及陽性對照組與3FMQ (標靶)之複合物採用MM-GBSA方法計算之熱動力學參數
化合物    總 δ (kCal/mol) SD SEM
MetAPs-香芹酚 -13.9848 1.7991 0.0804
MetAPs-α-萜品醇 -9.9831 2.4031 0.1074
MetAPs-瑞香草醌 -1.3723 2.7601 0.1233
MetAPs-煙黴素 -28.2391 6.9002 0.3083
MetAPs-阿苯達唑 -14.5590 2.5104 0.1122
表 3.前導化合物及陽性對照組與MetAP2 (3FMQ)之複合物採用MM-PBSA方法計算之熱動力學參數
複合物 凡得瓦能 (kCal/mol) 靜電能 (kCal/mol) 極性溶劑化能 (kCal/mol) SASA 能 (kCal/mol) 結合能 (kCal/mol)
MetAP2-香芹酚 -20.29 ± 1.55 -14.91 ± 2.89 30.43 ±2.93 -16.57 ± 0.72 -21.34 ± 4.46
MetAP2-α-萜品醇 -21.42 ± 1.93 -3.81 ± 6.80 18.14 ±7.68 -24.39 ± 1.00 -12.64 ± 10.48
MetAP2-瑞香草醌 -2.93 ± 4.46 -0.79 ± 2.70 2.80 ±4.68 -2.20 ± 4.27 -3.12 ± 8.20
MetAP2-煙黴素 -35.44 ± 3.33 -41.70 ± 12.05 59.46 ± 8.50 -32.36 ± 2.66 -50.05 ± 15.35
MetAP2-阿苯達唑 -19.68 ± 2.25 -9.18 ± 3.08 18.92 ± 3.18 -14.35 ± 1.51 -24.30 ± 5.19
所有數值均以平均值±SD表示。 實例 2
EHP感染機制涉及極管之擠出(黏附機制)。在活體外試驗中，使用所選擇之活性成份，亦即瑞香草醌、桂皮醛、丁香油酚、及香芹酚測試對EHP孢子之極管擠出之滅活作用。於二甲亞碸(DMSO)中製備生物活性分子之儲液，進一步使用1X無菌磷酸鹽緩衝鹽水(1XPBS)製備操作溶液。
從來自高鹽水蝦養殖系統(第1批)及低鹽水蝦養殖系統(第2批) 之感染蝦HP中單離及純化EHP孢子。純化的孢子隨後與試驗分子，依所需濃度，在37°C下培養2小時。洗滌後之孢子再經過鹼性劑誘發極管擠出。在放大100X之光學顯微鏡下測定擠出之孢子極管，從總數100個孢子中計算擠出之孢子數量，並將該數量換算成擠出%。
在第1批孢子的結果中，10 ppm及100 ppm之瑞香草醌顯示極管擠出率顯著下降，分別為43.92 %及6.34%，如圖4所示。於第2批孢子試驗中重覆類似結果，並在第1批及第2批兩種結果中均觀察到瑞香草醌之劑量依賴性效應。相較於2%及20% DMSO對照組之86.47%及88.32 擠出%，與10及100 ppm 瑞香草醌培養後僅分別得到40.31%及0.31%，如圖1及2所示。第1批及第2批試驗在微鏡檢查下之極管擠出-EHP孢子顯微影像示於圖3。結果清楚地證實，該包含瑞香草醌之組成物藉由其抑制極管擠出之能力，可以成為控制蝦中EHP感染之可靠候選物。諸如：桂皮醛、香芹酚、及丁香油酚之其他生物活性分子在較高之100 ppm 濃度下，相較於DMSO對照組，則稍微降低EHP孢子極管擠出(p＞0.05)。
統計分析。在經過生物活性分子處理之孢子與對應DMSO對照組之極管擠出 %之間進行單向變方分析(ANOVA)及t-試驗，測定95%可信區間下之差異顯著性。該等分析法係採用STATGRAPHICS centurion執行。 實例 3
在未感染及感染之對照組及兩種實驗組(treatment group)之蝦中進行活體內試驗(40天)。實驗組包括：0.5%黑種草萃取物(原型1)；及桂皮醛與奧勒岡油之組合(原型2)。在實驗設計中，每一組包括3個重覆，及每一個重覆包括15隻蝦。每兩天完成換水(20-30 %)。水槽維持建議溫度(28 - 30°C)及溶氧量(＞5 mg/L)。以佔體重3至3.5 %的實驗飼料餵養蝦，一天3次，連續40天。
採用PCR試驗法篩檢蝦的EHP及其他蝦病原體。選出EHP陽性但沒有其他感染的動物作為感染組及實驗組。以EHP及其他感染均陰性的相同年齡的蝦作為未感染對照組。
數據收集。收集數據來考量： (1) 蝦免疫狀態 。在置於顯微鏡下之一滴抗凝血劑與血淋巴之混合物中計算細胞數，量測總血球數(THC)。 (2) 肝胰臟健康酶標記物 。採用光度計法量測蝦血淋巴中之天門冬胺酸轉胺酶(AST)及鹼性磷酸酶(AP)。 (3) EHP 之定量 。在無菌下解剖蝦肝胰臟，抽出DNA，及採用qPCR定量EHP感染。
結果。實驗組顯示總血球數顯著(p＜0.05)高於對照組，表示蝦的健康狀態已加強，如圖4所示。血淋巴中肝酶標記物含量升高表示HP之急性損傷。從第20天起，實驗組之酶標記物：AST及AP顯著(p＜0.05)低於感染對照組，如圖5及6所示。採用qPCR定量EHP DNA顯示，從第0天至第40天，實驗組之週期數閥值相較於感染對照組逐漸增加。0.5%內含率(inclusion rate)之原型-1顯示EHP DNA複本數較低之週期數閥值顯著增加(表4)。 表 4.肝胰臟之EHP定量 – RT PCR
組別 第 1 天 第 10 天 第 20 天 第 30 天 第 40 天
EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數
感染對照組 21.6 6048 21.8 2870 22.13 1811 23.2 1647 23.4 1615
原型1 (0.5%黑種草萃取物) 21.6 6048 23.5 1600 25.9 1244 30.4 571 31.5 407
原型2 (艾威霸) 21.6 6048 24 1526 25.2 1347 27.6 990 29.1 762
實例 4
在未感染及感染對照組及三種實驗組的蝦中進行活體內試驗(40天)。實驗組包括：0.5%黑種草籽油(原型1)；及依兩種不同內含率(佔飼料0.5重量%及1重量%)之組合組(原型2)。製備包含黑種草油、奧勒岡油、丁香油及桂皮醛之組合原型。在實驗設計中，每一組有4個重覆，每一個重覆維持40隻蝦。每2天完成換水(20-30 %)。水槽維持建議溫度(28 - 30°C)及溶氧量(＞5 mg/L)。以佔體重3至3.5 %的實驗飼料餵養蝦，一天3次，連續40天。飼養試驗後，動物接受LD 30劑量之副溶血弧菌( Vibrio parahaemolyticus)攻毒。
實驗時，採用PCR試驗法篩檢蝦的EHP及其他蝦病原體。選出EHP陽性但沒有其他感染的動物作為感染組及實驗組。以EHP及其他感染均陰性的相同年齡的蝦作為未感染對照組。
數據收集。收集數據來考量： (1) 蝦免疫狀態 。依10天間隔，分析總血球數(THC)、原酚氧化酶活性(proPO)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。在置於顯微鏡下之一滴抗凝血劑與血淋巴之混合物中計算細胞數，量測THC。以光度計量測ProPO活性，其量測從L-二羥基苯基丙胺酸(L-dopa)形成之多巴色素(dopachrome)。以光度計法，基於腎上腺素抗氧化作用來量測SOD。 (2) 免疫基因表現 。採用qRT-PCR探討對蝦素3a(penaedin 3a)、抗菌肽(crustin)、抗脂多醣因子、類鐸受體、及β-肌動蛋白(管家基因)之免疫基因表現型態。qRT-PCR係進行三重覆，採用Ct值分析相對定量值。每一個樣本，從標靶基因之Ct值扣除管家基因(β-肌動蛋白)之數值，以校正基因之相對表現程度，達成ΔCt值。從試驗樣本(感染對照組及實驗組) 之ΔCt值扣除校正樣本(未感染對照組)之ΔCt值，達成ΔΔCt值。 (3) 肝胰臟健康酶標記物 。採用光度計法量測蝦血淋巴中丙胺酸轉胺酶(ALT)、天門冬胺酸轉胺酶(AST)及鹼性磷酸酶(AP)。 (4) EHP 之定量。 在無菌下解剖蝦肝胰臟，抽出DNA，及採用qPCR定量EHP。 (5) 使用副溶血弧菌之實驗浸泡式攻毒 。飼養試驗後，蝦移至攻毒槽(容量100 L及60 L水)，並遵循類似鹽度、曝氣度及個別飼料。每一槽放入30隻蝦，適應40小時。採用副溶血弧菌之田野分離株用於浸泡式攻毒試驗。適應期完成後，蝦浸入LC30劑量(2.6×10 3CFU/mL)之副溶血弧菌懸浮液中，而未感染組則改用無菌海水代替該細菌懸浮液。每6小時記錄蝦的死亡率，直到浸泡後5天。
結果。隨著疾病演進，感染對照組之總血球數顯示，從第20天起顯著低於實驗組。實驗組顯示初始之下降直到第20天，並加強THC含量，如圖7所示。所有實驗組之THC均從第20天起顯示顯著(p＜0.05)高於感染對照組。所有實驗組從第1天至第10天之ProPO及SOD活性程度均顯示逐漸下降，如圖8及9所示。感染對照組從第10天至第40天之ProPO及SOD活性程度均顯示顯著高於未感染對照組及實驗組。
免疫基因表現。所有實驗組之對蝦素-3a表現均比初始程度降低。而感染對照組顯示之對蝦素-3a表現則高於初始程度，並在第40天時之表現程度顯著高於其他實驗組，如圖10所示。抗菌肽(crustin)之表現則在不同間隔下變化。所有實驗組在第40天時之抗菌肽表現程度均顯示低於感染對照組。實驗組之間，組合組(原型2)之抗菌肽表現程度顯示逐漸降低，如圖11所示。原型1之ALF及TLR表現則分別自第20天及第30天起顯著(p＜0.05)高於感染對照組及其他實驗組。組合組(原型2)在第40天之ALF含量顯著低於其他組，如圖12所示。原型1之TLR表現則自第30天起顯著高於其他組，如圖13所示。
肝胰臟健康酶標記物。感染組及實驗組之血淋巴中，第1天之天門冬胺酸轉胺酶、丙胺酸轉胺酶及鹼性磷酸酶含量均高於未感染組。到了第10天時，所有實驗組之含量均顯著(p＜0.05)低於感染對照組。在整個試驗期間，感染對照組均具有高量酶標記物。從第10天起，組合組(原型2)之AST及ALT含量 均顯著低於感染對照組及其他實驗組，如圖14及15所示。第40天時，組合組之AP含量顯著(p＜0.05)低於感染對照組及其他實驗組，如圖16所示。
EHP 之定量法。實驗組顯示其C T值相較於感染對照組逐漸提高。所有實驗組均顯示第40天之複本數低於感染對照組(表5)。處理之間，原型2(5g/kg飼料之組合組)顯示複本數(35)顯著低於其他組。 表 5.肝胰臟中之EHP定量  – RT PCR (數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05))
處理 第 1 天 第 10 天 第 20 天 第 30 天 第 40 天
EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數 EHP 週期 複本數
感染對照組 23.3 ab±0.2 4706 22.5 c±0.4 5241 22.5 c±0.4 4982 22.2 d±0.7 5516 22.1 d±0.6 5605
0.5%原型1 23.4 ab±0.2 4462 24.9 b±0.4 3434 24.9 b±0.4 3395 26.1 c±0.3 2065 26.5 c±0.3 1717
0.5%原型2 23.63 a±0.2 4280 26.33 a±0.4 1886 26.33 a±0.4 743 28.93 a±0.5 154 30.06 a±0.5 35
1%原型2 23.4 ab±0.3 4462 25.46 ab±0.4 2683 25.46 ab±0.4 1797 27.3 bc±0.4 1035 28.5 b±0.6 197
使用副溶血弧菌之實驗浸泡式攻毒。感染對照組顯示之最終存活率顯著低於未感染對照組及實驗組，如圖17所示。實驗組之間沒有顯著差異，然而，組合組(原型2)顯示比其他實驗組改善之存活。
研究者觀察到實驗組改善之免疫狀態。血球為無脊椎動物涉及先天免疫力關鍵活性之血液細胞。實驗組中初始下降之血球數顯示有改善，代表疾病的抵抗力提升。原酚氧化酶(proPO)級聯反應為無脊椎動物中對抗微生物感染的重要先天免疫反應。抗氧化酵素超氧化物歧化酶(SOD)轉化此微生物代謝物成為可以自由通過膜之過氧化氫。感染對照組維持初始的proPO及SOD活性程度，而實驗組之活性則逐漸下降，表示已從感染中恢復。
抗微生物肽(AMP)為宿主防禦系統的重要第一線反應的一部份。對蝦中之陽離子性AMP係由對蝦素(penaeidin)、抗菌肽(crustin)、及抗脂多醣因子構成，且包括多種類型或同型，並針對不同菌株之細菌、真菌及套膜病毒具有抗細菌及抗真菌活性。對蝦素主要作用在對抗格蘭陽性細菌及絲狀真菌，係由富含脯胺酸殘基之N-末端結構域及包含6個半胱胺酸形成三個二硫橋鍵之C-末端結構域構成。所有實驗組之對蝦素-3a表現均從初始程度逐漸下降，表示感染下降。同樣地，組合組之ALF及抗菌肽表現下降，證實蝦中之細菌及真菌感染減少。類鐸受體(TLR)為一種在先天免疫系統中扮演關鍵角色之蛋白質。其等為單一、跨膜、非催化性受體，可以辨識微生物所衍生保留結構之分子。在黑種草單獨及組合組中，TLR之高度相對表現證實黑種草籽/油及其與精油之組合中所含生物活性化合物之免疫調控效應。
實驗組顯示顯著降低之肝胰臟健康酶標記物，如：AST、ALT及AP，其指示肝胰臟上皮細胞從EHP感染所引起損傷中恢復。過去有實驗支持血淋巴中AST及ALT含量升高係與肝胰臟細胞因嚴重感染EHP而壞死及廣泛損傷有關，並可在自然及實驗的感染EHP的蝦中觀察到。Santhoshkumar, S.等人(2017)，Biochemical changes and tissue distribution of Enterocytozoon hepatopenaei(EHP) in naturally and experimentally EHP-infected white leg shrimp, Litopenaeus vannamei, J. Fish Dis. 40(4):529-539。
HP健康酶標記物減少產生的結果與EHP DNA定量結果一致。qPCR結果顯示，實驗組從第0天至第40天之週期數閥值比感染對照組逐漸增加。組合組(原型2)之EHP DNA複本數顯著(p＜0.05)降低，咸了解感染EHP的蝦對弧菌( Vibrio)相關疾病具有較高易感性。Luis, F. A.等人，(2017)， Enterocytozoon hepatopenaei(EHP) is a risk factor for acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) and septic hepatopancreatic necrosis (SHPN) in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei, Aquaculture, 471, 37-42。在實驗組對抗副溶血弧菌攻毒上，觀察到較高存活率，表示對弧菌感染具有較低易感性。 實例 5
成熟EHP孢子具感染性，並普遍存在於從蝦苗養育至成長池的蝦養殖系統中。因此健康蝦曝露到成熟孢子並遭受感染的機率很高。該原型為一種植物萃取物之掺合物，其在共棲攻毒模式中測試，以分析該補充物在連續及大量曝露到感染蝦所分泌成熟EHP孢子之環境中之效應。
透過在白對蝦( Litopenaeus vannamei)中之共棲攻毒所進行之活體內試驗(40天)，探討原型(黑種草油、管蜂香草油、奧勒岡油、丁子香( Syzygium aromaticum)(丁香)油及桂皮醛)補充物對抗肝胰微孢子蟲( Enterocytozoon hepatopenaei)之效力。該試驗設計由四組組成，包括兩個對照組(未感染對照組及感染對照組)，及係依0.3%及0.5%劑量鋪在飼料表面上之原型，每一組有八個重覆。感染對照組、原型組之每一個重覆中，感染EHP的蝦均圈養籠內，而健康蝦則養在同一槽的籠外(圖18A)。未感染組係依循類似的設計，但籠內及籠外均為健康蝦(圖18B)。實驗組的詳細說明述於表6。在不同時間間隔下量測生長參數及EHP感染率。所有槽均維持在建議溫度範圍28 – 30°C及溶氧量超過5 mg/L。以實驗飼料，依其等體重的3 – 3.5%餵養蝦，一天三次，連續40天。 表 6.實驗組之詳細說明
組 EHP 攻毒 共棲 補充物及劑量
未感染對照組 無 籠內：健康蝦 籠外：健康蝦 籠內及籠外蝦：基礎飼料
感染對照組 有 籠內：EHP感染蝦 籠外：健康蝦 籠內及籠外蝦：基礎飼料
0.3% 原型 有 籠內蝦：基礎飼料 籠外 蝦：基礎飼料+ 0.3% 原型
0.3% 原型 有 籠內蝦: 基礎飼料 籠外 蝦: 基礎飼料+ 0.5% 原型
選擇實驗動物。感染動物之選擇標準為其等經檢測為EHP陽性及其他蝦病原體為陰性。針對所有疾病檢測均為陰性的動物則選擇作為健康蝦。
數據收集。(1). 記錄籠外蝦的生長效能參數，包括每週體重增量、飼料轉換比率(FCR)、比生長率(SGR)、及存活率。(2). EHP之定量 – 從每一隻代表性的籠外蝦樣本取蝦肝胰臟個別在無菌下解剖。每個重覆取出一隻蝦，抽出DNA，使用qPCR定量EHP。
統計分析。採用單向ANOVA，使用STATGRAPHICS centurion 軟體計算實驗組之間在顯著水準(p-值 ＜ 0.05)之統計差異性。
結果。研究者在所有間隔下觀察到，原型補充組之每週體重增量顯著高於(p＜0.05)感染對照組(圖19)。第40天時，0.5%原型組之最終體重增量(11±1.96 g)，相當於未感染對照組(12.75±1.57 g)。此外，相較於感染對照組，原型補充物造成FCR下降及SGR %提高，如圖20所示。原型補充組之存活率(＞80%)比感染對照組(70%)顯著改善(p＜0.05)(圖21)。
感染對照組在攻毒後的5天期間顯示顯著較高的肝胰微孢子蟲( Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) DNA複本數(8650/µL)，此高度感染程度(具有較高EHP DNA複本數)持續出現在感染對照組。反之，原型補充組在攻毒後的5天期間顯示陰性PCR結果，並在整個40天攻毒期間，EHP複本數維持顯著低於感染對照組。第40天時，0.5%原型補充組之EHP複本數下降倍數(67倍)高於0.3%原型補充組(12倍)，如圖22所示。此點證實原型補充物可在嚴重攻毒條件下延緩EHP感染並顯著降低感染率。
結果顯示，本試驗中之原型，係包含黑種草油、管蜂香草精油、丁子香油、奧勒岡油及桂皮醛之組成物，可以成為蝦飼料中之功能性成份，以提高對抗EHP感染的抵抗力，並作為對抗EHP感染所引起蝦產量損失之保護工具。 實例 6
研究者探討原型(黑種草油、管蜂香草油、丁子香油、奧勒岡油及桂皮醛之組合)補充物在對抗養殖在泥池蝦養殖系統中之白對蝦肝胰微孢子蟲( Enterocytozoon hepatopenaei)之效應。以qPCR證實初始EHP感染率。由原型使用合適結合劑鋪在市售飼料表面上，並依內含率0.5%及1%含在其等飼料中，投與感染蝦，持續30天。依規律間隔量測感染率。經過第一段30天期後，停止補充原型，以對照飼料餵養蝦持續20天，以評估再感染率。此作法為採用qPCR定量蝦肝胰臟中之EHP DNA複本數。亦記錄生長參數，包括生質量產量、FCR、SGR及存活率，並與相鄰的未感染EHP的蝦養殖系統(對照組)比較。 表 7.採用qPCR定量EHP感染
原型 補充期 (DOC 49 – 81) 觀察期 (DOC 82-99)
組別 第 0 天 第 7 天 第 14 天 第 21 天 第 28 天 第 46 天
Ct 值 複本數 Ct 值 複本數 Ct 值 複本數 Ct 值 複本數 Ct 值 複本數 Ct 值 複本數
對照組 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
1% 原型 20.5 7312 21.1 6587 25.7 2421 ND ND ND ND ND ND
0.5% 原型 21.8 5731 27.3 1035 ND ND ND ND ND ND ND ND
本發明者觀察到，原型補充池中之EHP感染顯著下降，如表7所示。使用原型補充物時，生長、存活及飼料效率均比對照池改善，如圖23及24所示。此外，原型補充組蝦的尺寸變異減小，如圖25所示。
如本揭示內容全文所說明，本發明者已驚人地發現，黑種草籽萃取物/油單獨或與一或多種精油(包括(但不限於)：奧勒岡油、蜂香薄荷油、丁香油及桂皮醛)組合，在控制及抑制EHP感染擴散及其相關疾病上造成協同效應。
至少一項實施例中，本發明者已驚人地發現一種控制蝦的EHP感染擴散及相關疾病的方法，其包括對蝦經口投與有效降低EHP感染率的量之包含瑞香草醌之組成物。某些實施例中，瑞香草醌係以至少100 ppm的量存在，例如：200 ppm、300 ppm、400 ppm、或500 ppm。某些實施例中，瑞香草醌係源自蜂香薄荷、管蜂香草、或黑種草。
至少一項實施例中，本發明組成物進一步包含一或多種選自下列各物所組成群中之精油：蜂香薄荷油、奧勒岡油、丁香油及桂皮醛。在非限制性實例下，至少一項實施例中，本發明組成物包含含量範圍在約0.01至約100重量%之瑞香草醌、含量範圍在約0至約70重量%之香芹酚、含量範圍在約0至約70重量%之α-萜品醇、含量範圍在約0至約30重量%之桂皮醛、及含量範圍在0至約30重量%之丁香油酚。
至少一項實施例中，本發明組成物之投與係添加該組成物至動物飼料中，例如：組成物係作為動物飼料添加物添加至蝦的飼料。例如：添加至飼料中之組成物係依佔飼料約至少0.1重量百分比，及某些實施例中，約0.1至約2重量百分比之含量範圍。
或者其他實施例中，組成物係添加至水中或池中，其中組成物係以有效地使存在於蝦養殖水及蝦池土壤沉積中之EHP孢子不活性化之量來投與。
本發明者亦已發現一種使EHP孢子不活性化之方法，其包括對蝦經口投與使EHP孢子不活性化及有效降低EHP感染率的量之包含瑞香草醌之組成物，例如：該組成物包含黑種草籽萃取物/油及一或多種精油/萃取物。某些實施例中，本發明組成物進一步包含一或多種精油，包括(但不限於)：蜂香薄荷油、奧勒岡油、丁香油及桂皮醛/肉桂油(cinnamon oil)。至少一項實施例中，本發明組成物包含含量範圍在約0.01至約100重量%之瑞香草醌、含量範圍在約0至約70重量%之香芹酚、含量範圍在約0至約70重量%之α-萜品醇、含量範圍在約0至約30重量%之桂皮醛、及含量範圍在0至約30重量%之丁香油酚。
本發明另一項實施例係有關一種飼料添加物組成物，其包含滅活EHP孢子及有效降低EHP感染率的量之瑞香草醌。某些實施例中，瑞香草醌係源自蜂香薄荷、管蜂香草、或黑種草。某些實施例中，飼料添加物包含黑種草萃取物或油。至少一項實施例中，飼料添加物進一步包含一或多種精油，包括(但不限於)：蜂香薄荷油、奧勒岡油、丁香油及桂皮醛/肉桂油。例如：至少一項實施例中，本發明組成物包含含量範圍在約0.01至約100重量%之瑞香草醌、含量範圍在約0至約70重量%之香芹酚、含量範圍在約0至約70重量%之α-萜品醇、含量範圍在約0至約30重量%之桂皮醛、及含量範圍在0至約30重量%之丁香油酚。
某些實施例中，飼料添加物係作為動物飼料添加物添加至蝦飼料中，例如：其含量為佔飼料至少約0.1重量百分比，及至少一項實施例中，其含量範圍為佔飼料約0.1至約2重量百分比。或者其他實施例中，飼料添加物係添加至水中或池中，其中組成物係以有效地使存在於蝦養殖水及蝦池土壤沉積物中之EHP孢子不活性化之量來投與。
本發明已參考特定組成物、有效性理論、等等說明，彼等習此相關技藝者咸了解，本發明無意受到此等例示性實施例或機制的限制，且可在不偏離附錄之申請專利範圍界定之本發明範圍或精神下進行修飾。所有此等明顯修飾及變化均計畫包括在如附錄之申請專利範圍界定之本發明範圍內。申請專利範圍意指涵蓋所主張之組份及依任何順序之步驟，其係有效符合所計畫之目的，除非內文另有明確的相反說明。
應進一步了解，本文所說明組成物之劑量與調配物及範圍可以微幅修飾且仍在本發明範圍及精神內。
亦應了解，附圖所例示之調配物及製程及後續說明僅單純為附錄之申請專利範圍所界定本發明觀念之例舉實施例。因此，與本文所揭示實施例相關之明確維度及其他物理特性不應視為有限制性，除非申請專利範圍另有其他說明。若提供數值的範圍，則應了解每一個介於其間的數值(除非文中另有其他清楚說明，否則直到下限單位的十分之一)、該範圍的上限與下限之間、及該所述範圍中任何其他指明或介於其間的數值均涵括在本揭示範圍內。此等較小範圍的上限及下限均分別獨立包括在該較小範圍內，且亦涵括在本揭示範圍內，但取決於所述範圍中任何明確排除的限值。若所述範圍包括一或兩個限值時，該不包括彼等所包括一或兩個限值之範圍亦包括在本揭示範圍內。咸了解本文所揭示所有範圍及參數，包括(但不限於)：百分比、份數、及比率涵括本文推論及歸納的任何及所有小範圍，及終點之間每一個數字。例如：說明「1至10」範圍應視為包括從最小值1或較大值開始及以最大值10或較小值結束之間的任何範圍及任何小範圍(例如：1至6.1、或2.3至9.4)，及包括在該範圍內的每一個整數(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)。本說明書及附錄之申請專利範圍中，單數型式之「一」、「一種」、及「該」包括複數型參考物，除非內文另有其他清楚說明。本文所採用所有方法步驟或製程步驟之組合均可依任何順序執行，除非提及該組合之內文中另有其他說明或顯然有相反的提示。
本說明書或申請專利範圍所採用術語 「包括(includes或including)」或「具有(have或having)」意欲以類似術語「包含(comprising)」用在申請專利範圍中作為過渡詞之方式為涵括性。此外，所採用之術語「或」(例如：A或B)係意指「A」或「B」或「A」及「B」二者。當本申請案計畫指「僅A或B，但非二者」時，則將會採用術語「僅A或B，但非二者」或類似結構。因此本文所採用術語「或」係涵括性，不為排外性的用法。此外，本說明書或申請專利範圍所採用術語「其中(in)」或「其內(into)」計畫額外意指「其上(on或onto)」。本說明書或附錄之申請專利範圍中，單數型式之「一」、「一種」、及「該」包括複數型參考物，除非內文另有其他清楚指示。
上述說明已呈現例示及說明的目的。其無意成為羅列的清單或讓本發明限制在所揭示之精確型式上。彼等習此相關技藝者可考慮的其他替代性製程及方法顯然可視為包括在本發明內。該說明僅為例舉的實施例。咸了解，可以在所揭示之計畫精神及範圍內進行任何修飾、取代、及/或添加。從上述可見，本揭示之例舉態樣至少完成所有計畫的目的。
無
圖1出示生物活性分子對第1批孢子之極管擠出之效應。所有數據均以平均值±SD表示，N=3。星號指示相較於二甲亞碸(DMSO)對照組，在擠出%上有顯著差異性(p=0.002)。
圖2出示生物活性分子對第2批孢子之極管擠出之效應。所有數據均以平均值±SD表示，N=3。星號指示相較於DMSO對照組，在擠出%上有顯著差異性(p=0.002)。
圖3A及3B為極管擠出之EHP孢子在顯微鏡檢視(100X)下之顯微影像。來自100 ppm瑞香草醌(thymoquinone)實驗組(BAM1)及對照組之第2批孢子之代表性影像。
圖4出示在不同時間間隔下之總血球數。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖5出示在不同時間間隔下之天門冬胺酸轉胺酶(AST)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖6出示在不同時間間隔下之鹼性磷酸酶(AP)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖7出示在不同時間間隔下之總血球數。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖8出示在不同時間間隔下之原酚氧化酶(prophenoloxidase)(ProPO)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖9出示在不同時間間隔下之超氧化物歧化酶(superoxide dismutase) (SOD)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖10出示在不同時間間隔下之對蝦素-3a(penaeidin-3a)基因相對表現。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖11出示在不同時間間隔下之抗菌肽(crustin)基因相對表現。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖12出示在不同時間間隔下之抗脂多醣(ALF)因子基因相對表現。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖13出示在不同時間間隔下之類鐸受體(toll like receptor，TLR)基因相對表現。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖14出示在不同時間間隔下之丙胺酸轉胺酶(ALT)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖15出示在不同時間間隔下之天門冬胺酸轉胺酶(AST)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖16出示在不同時間間隔下之鹼性磷酸酶(AP)活性。數據以平均值±SD表示：N=3 (p＜0.05)。
圖17出示使用副溶血弧菌( V. parahaemolyticus)，在2.6×10 3CFU/ml 下對蝦進行細菌攻毒120 h後之存活率(%)。所有數值均以平均值 ± SD表示，其中n=4 (每次重複為30隻蝦) (p＜0.05)。
圖18出示共棲攻毒模式(cohabitation challenge model) (Salachan等人，2016)。A – 感染對照組及實驗組之模式。B – 未感染對照組之模式。
圖19出示在不同時間間隔下每週體重增量。所有數據均以平均值±SD表示，n=20 (每次重覆有5隻蝦 ) (p＜0.05)。
圖20出示不同實驗組之最終體重增量、飼料轉換比率、及比生長率(specific growth rate)。數據以平均值±SD表示；n=4 (每個重覆有25隻蝦 )：(P ＜0.05)。
圖21出示不同實驗組之最終存活率(%)。數據以平均值±SD表示； n=4 (每次重覆有25隻蝦 )：(P ＜0.05)。
圖22出示採用qPCR定量EHP。所有數值均以平均值±SD表示，其中n=4 (P＜0.05)。
圖23出示實驗池之最終生質產量及飼料轉換比率。
圖24出示實驗池之最終存活及比生長率。
圖25出示對照組與實驗池之間之最終尺寸變異。
無

Claims (25)

  1. 一種控制對蝦的EHP感染及相關疾病擴散之方法，其包括對蝦投與有效降低EHP感染率的量之包含瑞香草醌(thymoquinone)之組成物。
  2. 如請求項1之方法，其中該瑞香草醌係以至少100 ppm的量存在。
  3. 如請求項1之方法，其中該瑞香草醌係源自蜂香薄荷( Monarda didyma)、管蜂香草( Monarda fistulosa)、或黑種草( Nigella sativa)。
  4. 如請求項1之方法，其進一步包括一或多種選自下列各物所組成群中之精油：蜂香薄荷油(monarda oil)、奧勒岡油(oregano oil)、丁香油(clove oil)及桂皮醛(cinnamic aldehyde)。
  5. 如請求項1之方法，其中組成物包含含量範圍在約0.01至約100 重量%之瑞香草醌、含量範圍在約0至約70重量%之香芹酚(carvacrol)、含量範圍在約0至約70 重量%之α-萜品醇(terpineol)、含量範圍在約0至約30重量%之桂皮醛、及含量範圍在0至約重量30%之丁香油酚(eugenol)。
  6. 如請求項1之方法，其中該組成物係作為動物飼料添加物添加至蝦的飼料中。
  7. 如請求項1之方法，其中該組成物係添加至水中或池中，其中該組成物係以有效地使存在於蝦養殖水及蝦池土壤沉積物中之EHP孢子不活性化之量來投與。
  8. 如請求項1之方法，其中該組成物係添加至飼料，其量佔飼料約0.1至約2重量百分比之間。
  9. 如請求項1之方法，其中該組成物係添加至飼料，其量佔飼料至少約0.1重量百分比。
  10. 一種使EHP孢子不活性化之方法，其包括對蝦投與使EHP孢子不活性化及有效降低EHP感染率的量之組成物，該組成物包含黑種草籽萃取物/油及一或多種精油/萃取物。
  11. 如請求項10之方法，其中一或多種精油係選自下列各物所組成群中：蜂香薄荷油、奧勒岡油、丁香油及桂皮醛/肉桂油(cinnamon oil)。
  12. 如請求項10之方法，其中該組成物包含含量範圍在約0.01至約100重量%之瑞香草醌、含量範圍在約0至約70重量%之香芹酚、含量範圍在約0至約70重量%之α-萜品醇、含量範圍在約0至約30重量%之桂皮醛、及含量範圍在0至約30重量%之丁香油酚。
  13. 如請求項10之方法，其中該瑞香草醌係源自蜂香薄荷、管蜂香草、或黑種草。
  14. 如請求項10之方法，其中該組成物係作為動物飼料添加物添加至蝦的飼料中。
  15. 如請求項10之方法，其中該組成物係添加至水中或池中，其中組成物係以有效地使存在於蝦養殖水及蝦池土壤沉積物中之EHP孢子不活性化之量來投與。
  16. 如請求項10之方法，其中該組成物係添加至飼料，其量佔飼料約0.1至約2重量百分比之間。
  17. 如請求項10之方法，其中該組成物係添加至飼料，其量佔飼料至少約0.1重量百分比。
  18. 一種飼料添加物組成物，其包含使EHP孢子不活性化及有效降低EHP感染率的量之瑞香草醌。
  19. 如請求項18之飼料添加物，其中該瑞香草醌係源自蜂香薄荷、管蜂香草、或黑種草。
  20. 如請求項18之飼料添加物，其中該添加物包含黑種草萃取物或油。
  21. 如請求項18之飼料添加物，其進一步包括一或多種選自下列各物所組成群組中之精油：蜂香薄荷油、奧勒岡油、丁香油及桂皮醛/肉桂油。
  22. 如請求項18之飼料添加物，其中該組成物包含含量範圍在約0.01至約100重量%之瑞香草醌、含量範圍在約0至約70重量%之香芹酚、含量範圍在約0至約70重量%之α-萜品醇、含量範圍在約0至約30重量%之桂皮醛、及含量範圍在0至約30重量%之丁香油酚。
  23. 如請求項18之飼料添加物，其中該組成物係作為動物飼料添加物添加至蝦飼料中。
  24. 如請求項18之飼料添加物，其中該組成物係添加至水中或池中，其中組成物係以有效地使存在於蝦養殖水及蝦池土壤沉積物中之EHP孢子不活性化之量來投與。
  25. 如請求項18之飼料添加物，其中該組成物係添加至飼料，其量佔飼料至少約0.1重量百分比。
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