TW202423959A - 用於治療法布瑞氏症(fabry disease)之組成物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示用於治療法布瑞氏症之新穎組成物及方法，其包括具有增強之α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性的治療性蛋白及經編輯以表現用於治療法布瑞氏症之經修飾治療性蛋白的經工程改造之B細胞。本文亦揭示用於製造所揭示之治療性蛋白及經工程改造之B細胞的方法，以及其用於治療法布瑞氏症的方法。

Description

用於治療法布瑞氏症(FABRY　DISEASE)之組成物及方法

法布瑞氏症(Fabry disease)為無法治癒的進行性溶酶體貯積症，其特徵在於GLA基因中之突變，導致編碼α-半乳糖苷酶A (α-GAL)酶缺失或功能減退，使得球形三醯神經醯胺(Globotriaosylceramide，Gb3)在全身蓄積。該疾病的典型表現始於在壽命之前十年至二十年出現疼痛，之後逐漸累及腎臟、心臟、神經、GI及皮膚。典型的感染患者通常在其50多歲時死於該疾病。

經口伴隨蛋白療法可用於部分具有可符合性GLA突變之患者；然而，大部分患者用酶替代療法(enzyme replacement therapy，ERT)治療：每兩週輸注一次重組α-GAL。α-GALERT療法為一項終身性治療投入，通常需要可持續若干小時的輸注，常常造成急性輸注反應，由於α-GAL半衰期短而引起血漿α-GAL濃度高度可變，且給醫療保健系統內的財政及其他資源帶來巨大負擔。由於此等難題，長期依從性具有一定困難。仍需要新穎且更普遍的法布瑞氏症之治療。

本文揭示用於治療法布瑞氏症之新穎組成物及方法。

在各種實施例中，本發明係關於一種治療性蛋白，其包含經修飾之人類α-GAL蛋白，其中經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾：缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。

在各種實施例中，信號肽為重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，信號肽為輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。

在各種實施例中，本發明係關於包含治療性蛋白之經工程改造之人類B細胞，其中治療性蛋白包含經修飾之人類GLA，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾：缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。

在各種實施例中，經工程改造之B細胞進一步包含編碼該治療性蛋白之核酸序列，且其中該核酸序列已插入至AAVS1或人類ROSA26基因座中。在各種實施例中，信號肽為重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，信號肽為輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 2-4之核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。

在各種實施例中，基因已插入至人類AAVS1基因座中。在各種實施例中，基因已插入至人類ROSA26基因座中。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中至少20%之細胞群體表現該治療性蛋白。在各種實施例中，該B細胞為CD20+。在各種實施例中，該B細胞為CD20-。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。在各種實施例中，該B細胞為漿母細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。在各種實施例中，該細胞為漿細胞。在各種實施例中，細胞群體包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。

在各種實施例中，本發明係關於一種產生表現治療性蛋白之經工程改造之B細胞的方法，該方法包含向人類B細胞遞送：RNA嚮導之核酸酶；靶向人類基因體上之基因座的gRNA；及包含編碼治療性蛋白之核酸序列的構築體，其中治療性蛋白包含人類α-GAL蛋白。

在各種實施例中，將RNA嚮導之核酸酶及gRNA以RNP遞送至B細胞。在各種實施例中，將RNA嚮導之核酸酶及gRNA以奈米粒子遞送至B細胞。在各種實施例中，經由電穿孔將RNA嚮導之核酸酶及gRNA遞送至B細胞。在各種實施例中，使用病毒載體將構築體遞送至B細胞。在各種實施例中，將構築體以雙股DNA遞送至B細胞。在各種實施例中，RNA嚮導之核酸酶包含SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 24之胺基酸序列。在各種實施例中，RNA嚮導之核酸酶包含SEQ ID NO. 15之胺基酸序列。在各種實施例中，靶向構築體包含選自由SEQ ID NO. 9-13、18-19及25-29組成之群的核酸序列。

在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為CD20-。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為CD20+。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20-。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20+。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為漿母細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為漿細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。

在各種實施例中，本發明係關於一種產生表現治療性蛋白之經工程改造之B細胞的方法，該方法包含向人類B細胞遞送：RNA嚮導之核酸酶；靶向AAVS1基因之gRNA，其中gRNA包含SEQ ID NO. 14、15或24之核酸序列；以及包含編碼治療性蛋白之核酸序列及左右同源臂的構築體；其中構築體包含選自由SEQ ID NO. 9-13及18-19組成之群的核酸序列，其中該經工程改造之B細胞表現該治療性蛋白。

在各種實施例中，本發明係關於一種治療有需要之患者的方法，其包含向該患者投與經工程改造之人類B細胞，其中經工程改造之人類B細胞已經編輯以表現編碼人類α-GAL蛋白之治療性蛋白。在各種實施例中，治療性蛋白包含經修飾之人類α-GAL蛋白，其中人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基已缺失；且GLA信號肽已經免疫球蛋白(Ig)信號肽置換。在各種實施例中，信號肽為重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，信號肽為輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。

在各種實施例中，編碼治療性蛋白之基因已插入至人類AAVS1基因座中。在各種實施例中，編碼治療性蛋白之基因已插入至人類ROSA26基因座中。在各種實施例中，至少20%之細胞群體表現該治療性蛋白。在各種實施例中，該細胞群體包含呈CD20+之細胞。在各種實施例中，該細胞群體包含呈CD20+之細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個如技術方案54至64中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個如技術方案54至64中任一項之經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為漿母細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為漿細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。

在各種實施例中，本發明係關於一種治療有需要之患者的方法，其包含向該患者投與經工程改造之人類B細胞，其中該人類B細胞包含由基因編碼之治療性蛋白，其中治療性蛋白包含經修飾之人類α-GAL蛋白，其中人類GLA蛋白質之兩個羧基端白胺酸殘基已缺失；且GLA信號肽已經免疫球蛋白(Ig)信號肽置換。

在各種實施例中，編碼該治療性蛋白之核酸序列已插入至AAVS1或人類ROSA26基因座中。在各種實施例中，信號肽為重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，信號肽為輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。

在各種實施例中，基因已插入至人類AAVS1基因座中。在各種實施例中，基因已插入至人類ROSA26基因座中。在各種實施例中，至少20%之經工程改造之B細胞群體表現該治療性蛋白。在各種實施例中，該細胞群體包含呈CD20+之細胞。在各種實施例中，該細胞群體包含呈CD20-之細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為漿母細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。在各種實施例中，該經工程改造之B細胞為漿細胞。在各種實施例中，本發明係關於一種細胞群體，其包含複數個經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。

在各種實施例中，本發明係關於一種治療有需要之患者的方法，其包含向該患者投與包含經修飾之人類α-GAL蛋白之治療性蛋白，其中兩個羧基端白胺酸殘基已缺失；且GLA信號肽已經免疫球蛋白(Ig)信號肽置換。

在各種實施例中，信號肽為重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，信號肽為輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白包含選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。

相關申請案之交互參考

本申請案主張2022年8月24日申請之美國臨時申請案第63/400,664號及2023年2月13日申請之美國臨時申請案第63/484,668號的權利及優先權，該等案中之各者的內容以全文引用之方式併入本文中。

本文揭示用於治療法布瑞氏症之新穎方法。本文所揭示之各種實施例提供已經基因編輯以表現功能性α-GAL蛋白的自體人類B細胞且將提供活體內酶之長期穩定表現。此類細胞療法之優勢包括：(i)降低輸注頻率(例如每12個月而非每兩週)；(ii)降低急性輸注反應之速率及嚴重程度；(iii)提高酶之穩態表現，其可減小免疫原性風險且實現較佳臨床結果；(iv)可能提高患者順應性且因此得到更佳臨床結果。 I.   定義

本文所用之章節標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所描述之主題。在本申請案中所引用之所有文獻或文獻之部分(包括但不限於專利、專利申請案、文章、書籍及論文)在此出於任何目的明確地以全文引用之方式併入。除非另外規定，否則依根據本發明使用之以下術語應理解為具有以下含義：

在本申請案中，除非另外陳述，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及其他形式，諸如「包括(includes)」及「包括(included)」，不具限制性。此外，除非另外具體說明，否則諸如「要素」或「組分」之術語涵蓋包含一個單位之要素及組分以及包含多於一個子單位之要素及組分兩者。

術語「聚核苷酸」、「核苷酸」或「核酸」包括單股及雙股核苷酸聚合物兩者。包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型之核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯(phosphoro-diselenoate)、苯胺硫代磷酸酯(phosphoro-anilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)及磷醯胺酸酯(phosphoroamidate)。

術語「寡核苷酸」係指包含200個或更少核苷酸的聚核苷酸。寡核苷酸可為例如用於構築突變基因的單股或雙股寡核苷酸。寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括標記，包括放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記，以用於偵測分析。寡核苷酸可例如用作PCR引子、選殖引子或雜交探針。

術語「控制序列」係指可影響其所接合之編碼序列之表現及加工的聚核苷酸序列。此類控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括包含一個或複數個轉錄因子識別位點之啟動子、轉錄強化子序列及轉錄終止序列。控制序列可包括前導序列(信號肽)及/或融合搭配物序列。

依本文所用，「可操作地連接」意謂該術語所應用之組分呈允許其在適合條件下執行其固有功能之關係。

術語「載體」意謂用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。術語「表現載體」或「表現構築體」係指適於轉形宿主細胞且含有引導及/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接之一或多個異源編碼區之表現的核酸序列之載體。表現構築體可包括但不限於影響或控制與其可操作地連接之編碼區之轉錄、轉譯且若存在內含子，則影響該編碼區之RNA剪接的序列。

術語「宿主細胞」係指已經用或能夠用核酸序列轉形且從而表現相關基因的細胞。該術語包括母細胞之子代，無論子代之形態或基因構成是否與原始母細胞一致，只要存在相關基因即可。

術語「轉形」係指細胞基因特徵的變化，且當細胞已經修飾以含有新穎DNA或RNA時，細胞已經轉形。舉例而言，當細胞藉由轉染、轉導或其他基因工程改造技術引入新穎基因物質而自其天然狀態經基因修飾時，細胞經轉形。在轉染或轉導之後，轉形DNA可藉由物理整合至細胞之染色體中而與細胞之DNA重組，或可以游離型元件形式短暫維持而不複製，或可以質體形式獨立複製。當轉形DNA隨細胞分裂一起複製時，細胞被視為已經「穩定轉形」。

術語「轉染」係指細胞對外來或外源DNA之攝取。多種轉染技術為此項技術中所熟知且揭示於本文中。參見例如Graham等人,1973, Virology, 1973, 52:456；Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, 前述；Davis等人, Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier；Chu等人, 1981, Gene, 13:197。

術語「轉導」係指其中經由病毒載體將外來DNA引入至細胞中的過程。參見例如Jones等人, Genetics: Principles and Analysis, 1998, Boston: Jones & Bartlett Publ。

術語「多肽」或「蛋白質」係指具有蛋白質之胺基酸序列，包括天然序列之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代的大分子。術語「多肽」及「蛋白質」尤其涵蓋具有抗原結合蛋白質之一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代的抗原結合分子、抗體或序列。術語「多肽片段」係指與全長天然蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失的多肽。與天然蛋白質相比，此類片段亦可含有經修飾胺基酸。適用多肽片段包括抗原結合分子的免疫功能片段。

多肽(例如抗原結合分子)的「變異體」包含胺基酸序列，其中相對於另一多肽序列，該胺基酸序列中插入、缺失及/或取代一或多個胺基酸殘基。變異體包括融合蛋白質。

術語「一致性」係指兩種或更多種多肽分子或兩種或更多種核酸分子之序列之間的關係，以比對及比較該等序列測定。「一致性百分比」意謂所比較分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基之百分比，且基於所比較之最小分子之大小來計算。對於此等計算，較佳地利用特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來處理比對中之空隙(若存在)。

為計算一致性百分比，通常以提供序列之間的最大匹配之方式比對所比較之序列。可用於測定一致性百分比之電腦程式的一個實例為GCG程式包，其包括GAP (Devereux等人, Nucl . Acid Res ., 1984, 12, 387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)。使用電腦演算法GAP來比對待測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。比對序列以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度(matched span)」，以演算法測定)。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(參見例如，對於PAM 250比較矩陣，Dayhoff等人, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352；對於BLO-SUM 62比較矩陣，Henikoff等人, 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . U . S . A ., 89, 10915-10919)。

依本文所用，二十種習知的(例如天然存在的)胺基酸及其縮寫遵循習知用途。參見例如Immunology A Synthesis (第2版, Golub及Green, 編, Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991))，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。二十種習知胺基酸的立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如α-胺基酸、α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸)及其他非習知胺基酸亦可為適用於本發明之多肽的組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基-麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、0-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸以及其他類似胺基酸及亞胺酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所用的多肽符號中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向而右手方向為羧基端方向。

保守胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成來併入。此等胺基酸殘基包括肽模擬物及胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。天然存在之殘基可基於常見側鏈特性分成以下類別： a)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c)酸性：Asp、Glu； d)鹼性：His、Lys、Arg； e)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及 f)芳族：Trp、Tyr、Phe。

舉例而言，非保守取代可涉及此等類別中之一者之成員與另一類別之成員的交換。

根據某些實施例，在對抗原結合分子、經工程改造之B細胞的共刺激或活化域作出改變時，可考慮胺基酸之親水指數。已基於疏水性及電荷特徵指定各胺基酸之親水指數。其如下：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。參見例如Kyte等人, 1982, J . Mol . Biol ., 157, 105-131。已知某些胺基酸可經具有類似親水指數或評分之其他胺基酸取代且仍保持類似生物活性。此項技術中亦應理解，類似胺基酸的取代可基於親水性有效地進行，特定言之當由此產生的生物學功能性蛋白質或肽意欲用於免疫學實施例中時，依在本發明的情況下。例示性胺基酸取代闡述於表1中。 表 1

原始殘基	例示性取代基	較佳取代基
Ala	Val、Leu、Ile	Val
Arg	Lys、Gin、Asn	Lys
Asn	Gln	Gln
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser、Ala	Ser
Gln	Asn	Asn
Glu	Asp	Asp
Gly	Pro、Ala	Ala
His	Asn、Gln、Lys、Arg	Arg
Ile	Leu、Val、Met、Ala、Phe、正白胺酸	Leu
Leu	正白胺酸、Ile、Va、Met、Ala、Phe	Ile
Lys	Arg、1, 4二胺基-丁酸、Gin、Asn	Arg
Met	Leu、Phe、Ile	Leu
Phe	Leu、Val、Ile、Ala、Tyr	Leu
Pro	Ala	Gly
Ser	Thr、Ala、Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr、Phe	Tyr
Tyr	Trp、Phe、Thr、Ser	Phe
Val	Ile、Met、Leu、Phe, Ala、正白胺酸	Leu

術語「衍生物」係指包括除胺基酸(或核酸)之插入、缺失或取代外之化學修飾的分子。在某些實施例中，衍生物包含共價修飾，包括但不限於與聚合物、脂質或其他有機或無機部分化學鍵結。在某些實施例中，經化學修飾之抗原結合分子可具有比未經化學修飾之抗原結合分子更長的循環半衰期。在一些實施例中，衍生的抗原結合分子經共價修飾以包括一或多個水溶性聚合物連接，包括但不限於聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。

肽類似物常在醫藥產業中用作特性類似於模板肽之特性的非肽藥物。此等類型之非肽化合物稱為「肽模擬物(peptide mimetic)」或「肽模擬物(peptidomimetic)」。Fauchere, J. L., 1986, Adv . Drug Res ., 1986, 15, 29; Veber, D. F.及Freidinger, R. M., 1985, Trends in Neuroscience, 8, 392-396；及Evans, B. E., 等人, 1987, J . Med . Chem ., 30, 1229-1239，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。

術語「治療有效量」係指足以在個體中達成所需治療效果或反應之藥劑(例如治療性細胞組成物、免疫細胞或其他治療劑)的數量或量。此類治療有效量容易由一般熟習此項技術者確定。

術語「患者」及「個體」可互換使用且包括人類及非人類動物個體以及患有經正式診斷之病症的個體、未患有經正式認定之病症的個體、接受醫療照顧的個體、處於罹患病症之風險下的個體等。

術語「治療(treat)」及「治療(treatment)」包括治療性治療、防治性治療及其中減小個體將罹患病症之風險或其他風險因素的應用。治療不需要完全治癒病症且涵蓋治療減少症狀或潛在風險因素的實施例。術語「預防」並不需要100%消除事件之可能性。實際上，其表示在化合物或方法存在下，事件發生的可能性已降低。

標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養與轉形(例如電穿孔、脂質體轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商說明書或依在此項技術中通常所實行或依本文所描述進行。前述技術及程序一般可根據此項技術中熟知及依在本說明書通篇中引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述之習知方法進行。參見例如Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的以引用的方式併入本文中。

依本文所用，術語「實質上」或「基本上」係指與參考數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度相比，約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%更高的數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。在一個實施例中，術語「基本上相同」或「實質上相同」係指與參考數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度大約相同的數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之範圍。

依本文所用，術語「實質上不含」與「基本上不含」可互換使用，且當用於描述組成物時，諸如細胞群體或培養基，係指不含規定物質，諸如95%不含、96%不含、97%不含、98%不含、99%不含規定物質或以習知手段量測不可偵測的組成物。在參考不存在組成物的特定物質或組分的情況下，類似含義可應用於術語「不存在」。

依本文所用，術語「可觀的」係指可容易地藉由一或多種標準方法偵測到的數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之範圍或事件。術語「不可觀(not-appreciable)」及「不可觀(not appreciable)」及其等效物係指藉由標準方法不易於偵測或不可偵測的數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之範圍或事件。在一個實施例中，若事件出現少於5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.001%或更少時間，則事件不可觀。

在整個本說明書中，除非上下文另有要求，否則字組「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」應理解為意味著包括所陳述步驟或要素或步驟或要素之群組，但不排除任何其他步驟或要素或其他步驟或要素之群組。在特定實施例中，術語「包括」、「具有」、「含有」及「包含」同義地使用。

依本文所用，「由……組成」意謂包括且限於在片語「由……組成」中間的任何事物。因此，片語「由……組成」指示所列要素為所需或必選的，且不可存在其他要素。

「基本上由……組成」意謂包括該片語中間所列之任何要素，且限於不干擾或促進所列要素在本發明中所指定之活性或作用的其他要素。因此，片語「基本上由……組成」指示所列舉的要素為所需或必選的，但沒有其他要素為視情況選用的且視其是否影響所列舉要素的活性或作用而定，可存在或可不存在。

在整個本說明書中，提及「一個實施例」、「實施例」、「特定實施例」、「相關實施例」、「某一在本說明書通篇中，對「一個實施例」、「一實施例」、「特定實施例」、「相關實施例」、「某一實施例」、「額外實施例」或「另一實施例」或其組合之參考意謂結合實施例所描述之特定特性、結構或特徵包括於本發明之至少一個實施例中。例」、「額外實施例」或「另一實施例」或其組合意謂結合實施例描述的特定特點、結構或特徵包括於本發明的至少一個實施例中。因此，在本說明書通篇各處出現上述片語未必皆指代相同實施例。另外，可在一或多個實施例中以任何適合的方式組合特定特點、結構或特徵。

依本文所用，術語「約」或「大致」係指相對於參考數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多達30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%的數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度。在特定實施例中，當在數值之前時，術語「約」或「大致」指示值加上或減去15%、10%、5%或1%範圍，或其任何中間範圍。

依本文所用，術語「引入」係指包含使細胞與聚核苷酸、多肽或小分子接觸的過程。引入步驟亦可包含將聚核苷酸或多肽顯微注射至細胞中；使用脂質體將聚核苷酸或多肽遞送至細胞中；或將聚核苷酸或多肽融合至細胞滲透性部分以將其引入細胞中。 II.用於治療法布瑞氏症的治療性蛋白

在各種實施例中，經工程改造之B細胞包含待遞送至有需要之患者的治療性蛋白。依本文所用，術語「治療性蛋白」意謂可促成患者之疾病或病症之治療、症狀減少、預防或治癒的任何蛋白質。在某些實施例中，治療性蛋白可適用於治療罕見疾病或孤兒病(orphan disease)，其中該療法可藉由替代特定蛋白質及/或酶來達成。治療性蛋白可包括但不限於酶、配位體、天然存在、經工程改造及/或嵌合受體、細胞介素或趨化介素。

在各種實施例中，該治療性蛋白為用於治療法布瑞氏症的蛋白質。在各種實施例中，治療性蛋白為α-半乳糖苷酶(α-GAL)。在各種實施例中，治療性蛋白為人類α-GAL。在各種實施例中，治療性蛋白包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白與SEQ ID NO. 1之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含SEQ ID NO. 5之核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含與SEQ ID NO. 5之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致之序列的核酸序列編碼。

在各種實施例中，治療性蛋白包含人類α-GAL蛋白，其中羧基端之兩個白胺酸殘基已缺失。在各種實施例中，治療性蛋白包含SEQ ID NO. 2之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白與SEQ ID NO. 2之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含SEQ ID NO. 6之核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含與SEQ ID NO. 6之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致之序列的核酸序列編碼。

在各種實施例中，治療性蛋白為人類α-GAL蛋白，其中羧基端之兩個白胺酸殘基已缺失，且天然人類GLA信號肽已經免疫球蛋白(Ig)信號肽置換。包括Ig信號肽之修飾將α-GAL酶導向分泌路徑，由此促進所表現之治療性蛋白的分泌。

在各種實施例中，使用重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，治療性蛋白包含SEQ ID NO. 3之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白與SEQ ID NO. 3之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含SEQ ID NO. 7之核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含與SEQ ID NO. 7之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致之序列的核酸序列編碼。

在各種實施例中，使用κ輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，治療性蛋白包含SEQ ID NO. 4之胺基酸序列。在各種實施例中，治療性蛋白與SEQ ID NO. 4之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含SEQ ID NO. 8之核酸序列編碼。在各種實施例中，治療性蛋白係由包含與SEQ ID NO. 8之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致之序列的核酸序列編碼。 III. 用於治療法布瑞氏症的細胞療法

在各種實施例中，治療性蛋白係藉由工程改造B細胞群體以表現該治療性蛋白來表現。依本文所用，術語「B細胞」係指表現B細胞受體(BCR)或產生抗體之免疫細胞(例如白血球(white blood cell)或白血球(leukocyte))。依本文所用，術語「B細胞」包括衍生自B細胞(包括記憶B細胞、漿細胞(PC)及漿母細胞(PB))之任何B細胞譜系細胞類型。漿母細胞為在活化B細胞分化期間產生之中間轉變階段細胞類型。其為血漿細胞之直接前驅體。漿母細胞及漿細胞均為抗體分泌細胞，但成熟漿細胞以較高水平產生且分泌抗體。漿細胞為由B細胞分化產生之終末完全分化形式。漿細胞之主要功能為抗體之穩固合成及分泌。漿細胞具有高度發展之分泌系統以支持高水平的蛋白質合成及分泌。儘管一些漿細胞壽命較短，但其他漿細胞可持續更久。抗原誘導之B細胞活化及分化亦可產生記憶B細胞，其可持續數年。在與相同抗原第二次相遇後，記憶B細胞亦可增殖且分化成漿細胞。藉由經工程改造之B細胞遞送治療性蛋白，本文所揭示之實施例提供活體內酶之長期穩定表現。本文所揭示之實施例利用B細胞之內源蛋白質分泌機制及其活體內長壽命以表現用於治療包括法布瑞氏症之多種疾病的治療性蛋白。

在各種實施例中，本發明係關於包含經工程改造之人類B細胞的細胞群體，其中人類B細胞表現其中基因已插入至人類AAVS1或人類ROSA26基因座中之治療性蛋白，其中治療性蛋白包含人類GLA蛋白質。

在各種實施例中，該細胞群體用於治療患有法布瑞氏症之患者。在各種實施例中，細胞群體表現作為α-半乳糖苷酶(a-GAL)之治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現作為野生型人類a-GAL之治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現包含SEQ ID NO. 1之胺基酸序列的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現與SEQ ID NO. 1之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由包含SEQ ID NO. 5之核酸序列編碼的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由核酸序列編碼之治療性蛋白，該核酸序列包含與SEQ ID NO. 5之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。

在各種實施例中，細胞群體表現包含人類α-GAL蛋白之治療性蛋白，其中羧基端之兩個白胺酸殘基已缺失。在各種實施例中，細胞群體表現包含SEQ ID NO. 2之胺基酸序列的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現與SEQ ID NO. 2之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由包含SEQ ID NO. 6之核酸序列編碼的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由核酸序列編碼之治療性蛋白，該核酸序列包含與SEQ ID NO. 6之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。

在各種實施例中，細胞群體表現包含人類α-GAL蛋白之治療性蛋白，其中羧基端之兩個白胺酸殘基已缺失，且天然人類α-GAL信號肽已經免疫球蛋白(Ig)信號肽置換。包括Ig信號肽之修飾將α-GAL酶導向分泌路徑，由此促進所表現之治療性蛋白的分泌。

在各種實施例中，使用重鏈Ig信號肽。在各種實施例中，細胞群體表現包含SEQ ID NO. 3之胺基酸序列的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現與SEQ ID NO. 3之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由包含SEQ ID NO. 7之核酸序列編碼的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由核酸序列編碼之治療性蛋白，該核酸序列包含與SEQ ID NO. 7之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。

在各種實施例中，使用κ輕鏈Ig信號肽。在各種實施例中，細胞群體表現包含SEQ ID NO. 4之胺基酸序列的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現與SEQ ID NO. 4之胺基酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由包含SEQ ID NO. 8之核酸序列編碼的治療性蛋白。在各種實施例中，細胞群體表現由核酸序列編碼之治療性蛋白，該核酸序列包含與SEQ ID NO. 8之核酸序列至少75%、80%、85%、90%或95%一致的序列。

在各種實施例中，視所用編輯方案而定，一定百分比之細胞群體將表現該治療性蛋白。在各種實施例中，至少20%之細胞群體表現該治療性蛋白。在各種實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%之細胞群體表現該治療性蛋白。 IV. 工程改造B細胞的方法

基因編輯(包括基因體編輯)為一種類型的基因工程改造，其中在DNA序列中，諸如靶細胞之基因體中插入、缺失及/或取代核苷酸/核酸。靶向基因編輯實現標細胞之基因體中(例如靶向基因或靶向DNA序列中)的經預先選擇之位點處的插入、缺失及/或取代。當例如藉由缺失、插入或取代核苷酸/核酸來編輯內源基因之序列時，包含受影響序列之內源基因可由於序列改變而經基因剔除(knock-out)或阻斷基因表現(knock-down)。因此，靶向編輯可用於破壞內源基因表現。「靶向整合」係指涉及具有或不具有插入位點處內源序列缺失的情況下插入一或多個外源序列的過程。靶向整合可由在含有外源序列的供體模板存在時的靶向基因編輯產生。依本文所用，「經破壞之基因」係指相對於內源基因包含插入、缺失或取代，使得減少或抑制來自內源基因之功能性蛋白質之表現的基因。依本文所用，「破壞基因」係指一種在內源基因中插入、缺失或取代至少一個核苷酸/核酸，使得來自內源基因之功能性蛋白質之表現減少或抑制的方法。破壞基因之方法為熟習此項技術者已知的且描述於本文中。

靶向編輯可經由核酸酶非依賴性方法或經由核酸酶依賴性方法達成。在核酸酶非依賴性靶向編輯方法中，經由宿主細胞的酶促機制，藉由側接待引入至內源序列中之外源聚核苷酸的同源序列來嚮導同源重組。外源聚核苷酸可在內源序列中引入核苷酸缺失、插入或置換。

替代地，核酸酶依賴性方法可藉由特定稀切核酸酶(例如核酸內切酶)經由特異性引入雙股斷裂(double strand break，DSB)來以更高頻率達成靶向編輯。此類核酸酶依賴性靶向編輯亦利用DNA修復機制，例如非同源末端接合(non - homologous end joining，NHEJ)，其回應於DSB而進行。藉由NHEJ的DNA修復通常引起少數內源核苷酸的無規插入或缺失(插入/缺失(indel))。與NHEJ介導之修復相比，修復亦可藉由同源定向修復(homology directed repair，HDR)進行。當存在含有側接一對同源臂之外源基因物質的供體模板時，外源基因物質可藉由HDR引入至基因體中，此引起外源基因物質的靶向整合。

能夠引入特異性及靶向DSB的可用核酸內切酶包括但不限於鋅指核酸酶(ZFN)、大範圍核酸酶、類轉錄活化因子效應子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)及RNA嚮導之CRISPR Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；規律間隔重複短回文序列簇相關(Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats Associated) 9)。另外，利用phiC31及Bxb1整合酶的雙重整合酶卡匣交換(dual integrase cassette exchange，DICE)系統亦可用於靶向整合。

ZFN為包含融合至鋅指DNA結合域(ZFBD)之核酸酶的靶向核酸酶，該鋅指DNA結合域為以序列特異性方式結合DNA之多肽域。鋅指為鋅指結合域內約30個胺基酸的域，其結構經由鋅離子的配位而穩定。鋅指之實例包括但不限於C2H2鋅指、C3H鋅指及C4鋅指。經設計之鋅指域為在自然界中不存在之域，其設計/組成主要依據例如應用替代規則及電腦化演算法之合理準則來處理儲存現有ZFP設計資訊及結合資料之資料庫中的資訊。參見例如美國專利第6,140,081號；第6,453,242號；及第6,534,261號；亦參見WO98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536及WO 03/016496。所選擇之鋅指域為自然界中未發現之域，其產生主要依據經驗過程，諸如噬菌體呈現、相互作用陷阱或混合式選擇。ZFN更詳細地描述於美國專利第7,888,121號及第7,972,854號中。ZFN的最公認實例為Fokl核酸酶與鋅指DNA結合域的融合。

TALEN為靶向核酸酶，包含與TAL效應子DNA結合域融合的核酸酶。「類轉錄活化因子效應子DNA結合域」、「TAL效應子DNA結合域」或「TALE DNA結合域」為TAL效應蛋白質的多肽域，其負責TAL效應蛋白質與DNA之結合。TAL效應蛋白質係在感染期間由黃單孢菌屬(genus Xanthomonas)的植物病原體分泌。此等蛋白質進入植物細胞核，經由其DNA結合域結合效應子特異性DNA序列，且經由其反式活化域活化此等序列處之基因轉錄。TAL效應子DNA結合域特異性視不完全的34個胺基酸重複序列的效應子可變數目而定，其在稱為重複可變雙殘基(repeat variable diresidues，RVD)的所選重複位置處包含多形現象。TALEN更詳細地描述於美國專利申請案第2011/0145940號中。在此項技術中，TALEN的最公認實例為Fokl核酸酶與TAL效應子DNA結合域的融合多肽。

適合依本文所提供使用之靶向核酸酶的額外實例包括但不限於Bxbl、phiC31、R4、PhiBT1及WB/SPBc/TP901-1，無論單獨地或組合使用。

靶向核酸酶的其他非限制性實例包括天然存在之核酸酶及重組核酸酶，例如CRISPR/Cas9、限制性核酸內切酶、大範圍核酸酶、復位核酸內切酶及其類似核酸酶。 1.  CRISPR-Cas9基因編輯

CRISPR-Cas9系統為原核生物中已重新設置為用於基因編輯的RNA嚮導之DNA靶向平台的天然存在之防禦機制。其依賴於DNA核酸酶Cas9及兩種非編碼RNA (crisprRNA ((CrRNA)及反式活化RNA (tracrRNA))以靶向DNA的裂解。CRISPR為規律間隔重複短回文序列簇的縮寫，細菌及古菌之基因體中發現的DNA序列家族，該等DNA序列含有與先前暴露於細胞的外來DNA (例如藉由感染或攻擊原核生物的病毒)具有相似度的DNA片段(間隔DNA)。原核生物使用此等DNA片段，以在例如在後續攻擊期間自類似病毒再引入時偵測及破壞類似外來DNA。CRISPR基因座的轉錄引起形成包含間隔序列的RNA分子，該RNA分子與能夠識別及切割外來外源DNA之Cas (CRISPR相關)蛋白質締合且靶向該等蛋白質。已描述許多類型及類別的CRISPR/Cas系統(參見例如Koonin等人, (2017) Curr Opin Microbiol 37:67-78)。

crRNA經由通常與目標DNA中的20個核苷酸(nt)序列的華特生-克里克(Watson - Crick)鹼基配對來驅動CRISPR-Cas9複合物的序列識別及特異性。改變crRNA中之5 ' 20nt的序列允許CRISPR-Cas9複合物靶向特異性基因座。若目標序列之後為被稱為原間隔序列相鄰模體(protospacer adjacent motif，PAM)的特異性短DNA模體(具有序列NGG)，則CRISPR-Cas9複合物僅結合含有與crRNA，單嚮導RNA (sgRNA)的前20 nt匹配之序列的DNA序列。

TracrRNA與crRNA的3'端雜交以形成RNA雙螺旋結構，其結合Cas9核酸內切酶以形成催化活性CRISPR-Cas9複合物，該複合物隨後可裂解目標DNA。

一旦CRISPR-Cas9複合物在目標位點處結合於DNA，Cas9酶內的兩個獨立核酸酶域各自裂解PAM位點上游的DNA股中之一者，留下雙股斷裂(DSB)，其中DNA的兩個股皆以鹼基對(鈍端)封端。

在特異性目標位點處CRISPR-Cas9複合物結合於DNA且形成位點特異性DSB之後，下一關鍵步驟為DSB之修復。細胞使用兩種主要DNA修復路徑修復DSB：非同源末端接合(NHEJ)及同源定向修復(HDR)。

NHEJ為在大部分細胞類型(包括非分裂細胞)中呈現高活性的穩固修復機制。NHEJ係易錯的且可通常導致在DSB位點處移除或添加一個與數百個之間的核苷酸，但此類修飾通常＜ 20 nt。所得插入及缺失(插入/缺失)可破壞基因的編碼區或非編碼區。替代地，HDR使用以內源或外源方式提供之一長段同源供體DNA來以高保真度修復DSB。HDR僅在分裂細胞中具活性，且在大部分細胞類型中以相對較低頻率出現。在本發明的許多實施例中，NHEJ用作修復劑。

在一些實施例中，CRISPR相關蛋白質9 (Cas9)核酸內切酶來自化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)，但可使用其他Cas9同源物。應理解，可使用野生型Cas9或可使用Cas9的經修改版本(例如Cas9的進化版本或Cas9直系同源物或變異體)，依本文所提供。在一些實施例中，Cas9可經另一RNA嚮導之核酸內切酶，諸如(第II類CRISPR/Cas系統的) Cpf1取代。

在一些實施例中，CRISPR/Cas系統包含衍生自1型、II型或III型系統的組分。CRISPR/Cas基因座的更新分類方案定義1類及2類CRISPR/Cas系統，其具有I至V或VI型(Makarova等人, (2015) Nat Rev Microbiol, 13(11):722-36；Shmakov等人, (2015)) Mol Cell, 60:385-397)。2類CRISPR/Cas系統具有單個蛋白質效應子。II型、V型及VI型Cas蛋白質為單蛋白質，RNA嚮導之核酸內切酶，在本文中稱為「2類Cas核酸酶」。2類Cas核酸酶包括例如Cas9蛋白質、Cpf1蛋白質、C2c1蛋白質、C2c2蛋白質及C2c3蛋白質。Cpfl核酸酶(Zetsche等人, (2015) Cell 163: 1-13)與Cas9同源且含有類RuvC核酸酶域。

在一些實施例中，Cas核酸酶來自II型CRISPR/Cas系統(例如來自CRISPR/Cas9系統的Cas9蛋白質)。在一些實施例中，Cas核酸酶來自2類CRISPR Cas系統(單蛋白Cas核酸酶，諸如Cas9蛋白質或Cpf1蛋白質)。蛋白質之Cas9及Cpfl家族為具有DNA核酸內切酶活性之酶，且其可藉由設計適當嚮導RNA而經引導以裂解所需核酸目標，依本文中進一步描述。

在一些實施例中，Cas核酸酶可包含多於一個核酸酶域。舉例而言，Cas9核酸酶可包含至少一個類RuvC核酸酶域(例如Cpf1)及至少一個類HNH核酸酶域(例如Cas9)。在一些實施例中，Cas9核酸酶將DSB引入目標序列中。在一些實施例中，Cas9核酸酶經修飾以僅含一個功能性核酸酶域。舉例而言，Cas9核酸酶經修飾以使得核酸酶域中之一者發生突變或完全或部分缺失以減少其核酸裂解活性。在一些實施例中，Cas9核酸酶經修飾以不含有功能性類RuvC核酸酶域。在其他實施例中，Cas9核酸酶經修飾以不含有功能性類HNH核酸酶域。在核酸酶域中之僅一者為功能性的一些實施例中，Cas9核酸酶為能夠將單股斷裂(「切口(nick)」)引入目標序列中之切口酶(nickase)。在一些實施例中，Cas9核酸酶域內的保守胺基酸經取代以減少或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶切口酶包含類RuvC核酸酶域中的胺基酸取代。類RuvC核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於化膿性鏈球菌( S . pyogenes) Cas9核酸酶)。在一些實施例中，切口酶包含類HNH核酸酶域中的胺基酸取代。類HNH核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於化膿性鏈球菌Cas9核酸酶)。

在一些實施例中，Cas核酸酶來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶為I型CRISPR/Cas系統的級聯複合物的組分。舉例而言，Cas核酸酶為Cas3核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶衍生自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶衍生自IV型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶衍生自V型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶衍生自VI型CRISPR/Cas系統。 2.  嚮導RNA

本發明提供一種靶向基因體的核酸，其可將相關多肽(例如定點多肽)之活性引導至目標核酸內之特定目標序列。靶向基因體的核酸可為RNA。靶向基因體的RNA本文中稱為「嚮導RNA」或「gRNA」。嚮導RNA包含至少與相關目標核酸序列雜交的間隔序列及CRISPR重複序列。在II型系統中，gRNA亦包含稱為tracrRNA序列的第二RNA。在II型gRNA中，CRISPR重複序列及tracrRNA序列彼此雜交以形成雙螺旋體。在V型gRNA中，crRNA形成雙螺旋體。在兩種系統中，雙螺旋體結合定點多肽，使得嚮導RNA及定點多肽形成複合物。在一些實施例中，靶向基因體的核酸藉助於其與定點多肽締合而提供對複合物的目標特異性。因此，靶向基因體的核酸引導定點多肽的活性。

依一般熟習此項技術者所瞭解，各嚮導RNA經設計以包括與其基因體目標序列互補的間隔序列。參見Jinek等人, Science, 337, 816-821 (2012)及Deltcheva等人, Nature, 471, 602-607 (2011)。

在一些實施例中，靶向基因體的核酸(例如gRNA)為雙分子嚮導RNA。在一些實施例中，靶向基因體的核酸(例如gRNA)為單分子嚮導RNA。

雙分子嚮導RNA包含兩股RNA。第一股在5'至3'方向上包含視情況選用之間隔延伸序列、間隔序列及最小CRISPR重複序列。第二股包含最小tracrRNA序列(與最小CRISPR重複序列互補)、3' tracrRNA序列及視情況選用之tracrRNA延伸序列。

II型系統中之單分子嚮導RNA (被稱為「sgRNA」)在5'至3'方向上包含視情況選用之間隔延伸序列、間隔序列、最小CRISPR重複序列、單分子嚮導連接子、最小tracrRNA序列、3' tracrRNA序列及視情況選用之tracrRNA延伸序列。視情況選用之tracrRNA延伸可包含向嚮導RNA貢獻額外功能性(例如穩定性)之元件。單分子嚮導連接子連接最小CRISPR重複與最小tracrRNA序列以形成髮夾(hairpin)結構。視情況選用之tracrRNA延伸包含一或多個髮夾。

V型系統中之單分子嚮導RNA在5'至3'方向上包含最小CRISPR重複序列及間隔序列。

在一些實施例中，sgRNA包含sgRNA序列之5'端處的20個核苷酸間隔序列。在一些實施例中，sgRNA包含sgRNA序列之5'端處的小於20個核苷酸間隔序列。在一些實施例中，sgRNA包含sgRNA序列之5'端處的大於20個核苷酸間隔序列。

在一些實施例中，sgRNA不包含sgRNA序列之3'端處的尿嘧啶。在一些實施例中，sgRNA包含sgRNA序列之3'端處的一或多個尿嘧啶。舉例而言，sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的1個尿嘧啶(U)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的2個尿嘧啶(UU)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的3個尿嘧啶(UUU)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的4個尿嘧啶(UUUU)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的5個尿嘧啶(UUUUU)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的6個尿嘧啶(UUUUUU)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的7個尿嘧啶(UUUUUUU)。sgRNA可包含sgRNA序列之3'端處的8個尿嘧啶(UUUUUUUU)。

sgRNA可未經修飾或經修飾。舉例而言，經修飾之sgRNA可包含一或多個2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸。

藉助於說明，用於CRISPR/Cas/Cpf1系統的嚮導RNA或其他較小RNA可易於藉由化學方式合成，依下文所示及此項技術中所描述。雖然化學合成程序持續擴展，但藉由諸如高效液相層析(HPLC，其避免使用凝膠，諸如PAGE)的程序純化此類RNA往往會變得更具有挑戰性，因為聚核苷酸長度顯著增加超過一百個左右的核苷酸。一種用於產生更大長度之RNA的方法為產生兩個或更多個接合在一起之分子。更易於以酶方式產生更長RNA，諸如編碼Cas9或Cpf1核酸內切酶的RNA。可在化學合成及/或酶產生RNA期間或之後引入各種類型的RNA修飾，例如增強穩定性、降低先天性免疫反應的可能性或程度及/或增強其他屬性的修飾，依此項技術中所描述。

在一些實施例中，可使用TIDE分析測定插入/缺失頻率(編輯頻率)，該分析可用於鑑別高效gRNA分子。在一些實施例中，高效gRNA產生高於80%的基因編輯頻率。舉例而言，若gRNA產生至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%的基因編輯頻率，則gRNA被視為高效的。

在一些實施例中，基因破壞可藉由使用兩種嚮導RNA使基因體序列缺失而發生。使用CRISPR-Cas基因編輯技術在細胞中產生基因體缺失(例如基因剔除細胞中之基因)的方法為已知的(Bauer D E等人， Vis . Exp .2015; 95;e52118)。 3.  間隔序列

在一些實施例中，gRNA包含間隔序列。間隔序列為界定相關目標核酸之目標序列(例如DNA目標序列，諸如基因體目標序列)的序列(例如20個核苷酸序列)。在一些實施例中，間隔序列為15至30個核苷酸。在一些實施例中，間隔序列為15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，間隔序列為20個核苷酸。

「目標序列」鄰接於PAM序列且為藉由RNA嚮導之核酸酶(例如Cas9)修飾的序列。「目標核酸」為雙股分子：一股包含目標序列且稱為「PAM股」，且另一互補股稱為「非PAM股」。熟習此項技術者識別出gRNA間隔序列與目標序列之反向互補序列雜交，該反向互補序列位於相關目標核酸之非PAM股中。因此，gRNA間隔序列為目標序列的RNA等效物。舉例而言，若目標序列為5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'，則gRNA間隔序列為5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'。gRNA之間隔子經由雜交(亦即，鹼基配對)以序列特異性方式與相關目標核酸相互作用。因此，間隔子之核苷酸序列視相關目標核酸之目標序列而變化。

在本文中的CRISPR/Cas系統中，間隔序列經設計以與目標核酸中位於該系統中所使用之Cas9酶的PAM之5'處的區域雜交。間隔子可與目標序列完美匹配或可具有錯配。各Cas9酶具有其在目標DNA中所識別的特定PAM序列。舉例而言，化膿性鏈球菌識別目標核酸中包含序列5'-NRG-3'的PAM，其中R包含A或G，其中N為任何核苷酸且N緊鄰間隔序列所靶向之目標核酸序列的3'。

在一些實施例中，目標核酸序列包含20個核苷酸。在一些實施例中，目標核酸包含小於20個核苷酸。在一些實施例中，目標核酸包含大於20個核苷酸。在一些實施例中，目標核酸包含至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多個核苷酸。在一些實施例中，目標核酸包含至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多個核苷酸。在一些實施例中，目標核酸序列包含緊鄰PAM之第一核苷酸之5'的20個鹼基。舉例而言，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'之序列中，目標核酸包含對應於N的序列，其中N為任何核苷酸，且帶下劃線的NRG序列為化膿性鏈球菌PAM。 4.  製造gRNA的方法

本發明之gRNA藉由此項技術中可用之適合方式產生，包括但不限於活體外轉錄(IVT)、合成及/或化學合成方法或其組合。利用酶(IVT)、固相、液相、組合合成方法、小區域合成及接合方法。在一個實施例中，使用IVT酶合成方法製得gRNA。藉由IVT製得聚核苷酸之方法為此項技術中已知的且描述於國際申請案PCT/US2013/30062中。因此，本發明亦包括聚核苷酸，例如DNA、構築體及載體用以活體外轉錄本文所描述之gRNA。

在一些實施例中，在合成期間或合成之後，將非天然經修飾核鹼基引入至聚核苷酸，例如gRNA中。在某些實施例中，修飾係關於核苷間鍵聯、嘌呤或嘧啶鹼基或糖。在一些實施例中，在聚核苷酸的末端處引入修飾；藉由化學合成或藉由聚合酶。經修飾之核酸及其合成的實例揭示於PCT申請案第PCT/US2012/058519號中。經修飾之聚核苷酸的合成亦描述於Verma及Eckstein, Annual Review of Biochemistry, 第76卷, 99-134 (1998)中。

在一些實施例中，酶或化學接合方法用於使聚核苷酸或其區域與不同功能部分結合，該等功能部分諸如靶向或遞送劑、螢光標記、液體、奈米粒子等。聚核苷酸及經修飾之聚核苷酸的結合物綜述於Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 第1(3)卷, 165-187 (1990)中。

本發明之某些實施例亦提供編碼本文所描述之gRNA的核酸，例如載體。在一些實施例中，核酸為DNA分子。在其他實施例中，核酸為RNA分子。在一些實施例中，核酸包含編碼crRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼crRNA之核苷酸序列包含側接來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分的間隔子。在一些實施例中，核酸包含編碼tracrRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，crRNA及tracrRNA係由兩個分離核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及tracrRNA係由單一核酸編碼。在一些實施例中，crRNA及tracrRNA係由單一核酸的相對股編碼。在其他實施例中，crRNA及tracrRNA係由單一核酸的相同股編碼。

在一些實施例中，本發明提供之gRNA藉由此項技術中所描述之任何方式化學合成(參見例如WO/2005/01248)。雖然化學合成程序持續擴展，但藉由諸如高效液相層析(HPLC，其避免使用凝膠，諸如PAGE)的程序純化此類RNA往往會變得更具有挑戰性，因為聚核苷酸長度顯著增加超過一百個左右的核苷酸。一種用於產生更大長度之RNA的方法為產生兩個或更多個接合在一起之分子。

在一些實施例中，本發明提供之gRNA藉由酶促方法(例如活體外轉錄，IVT)合成。

可在化學合成及/或酶產生RNA期間或之後引入各種類型的RNA修飾，例如增強穩定性、降低先天性免疫反應的可能性或程度及/或增強其他屬性的修飾，依此項技術中所描述。

在某些實施例中，可藉由CRISPR/Cas核酸酶系統使用超過一個嚮導RNA。各嚮導RNA可含有不同靶向序列，使得CRISPR/Cas系統裂解超過一個目標核酸。在一些實施例中，一或多個嚮導RNA可在Cas9 RNP複合物內具有相同或不同特性，諸如活性或穩定性。在使用超過一個嚮導RNA之情況下，各嚮導RNA可在相同或不同載體上編碼。用於驅動超過一個嚮導RNA之表現的啟動子係相同或不同的。

嚮導RNA可經由crRNA之靶向序列(例如間隔序列)靶向任何相關序列。在一些實施例中，嚮導RNA之靶向序列與目標核酸分子上之目標序列之間的互補程度為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，嚮導RNA之靶向序列與目標核酸分子上之目標序列100%互補。在其他實施例中，嚮導RNA之靶向序列與目標核酸分子上之目標序列可含有至少一個錯配。舉例而言，嚮導RNA之靶向序列與目標核酸分子上之目標序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個錯配。在一些實施例中，嚮導RNA之靶向序列與目標核酸分子上之目標序列可含有1-6個錯配。在一些實施例中，嚮導RNA之靶向序列與目標核酸分子上之目標序列可含有5或6個錯配。

靶向序列的長度可取決於所使用之CRISPR/Cas9系統及組分。舉例而言，來自不同細菌物種的不同Cas9蛋白質具有不同的最佳靶向序列長度。因此，靶向序列的長度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或大於50個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列的長度可包含18-24個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列的長度可包含19-21個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列的長度可包含20個核苷酸。

在本發明之一些實施例中，CRISPR/Cas核酸酶系統包括至少一個嚮導RNA。在一些實施例中，嚮導RNA及Cas蛋白質可形成核糖核蛋白質(RNP)，例如CRISPR/Cas複合物。嚮導RNA可將Cas蛋白質嚮導至目標核酸分子(例如基因體DNA分子)上之目標序列，其中Cas蛋白質裂解該目標核酸。在一些實施例中，CRISPR/Cas複合物為Cpf1/嚮導RNA複合物。在一些實施例中，CRISPR複合物為II型CRISPR/Cas9複合物。在一些實施例中，Cas蛋白質為Cas9蛋白質。在一些實施例中，CRISPR/Cas9複合物為Cas9/嚮導RNA複合物。 5.  嚮導RNA及核酸酶的遞送

在一些實施例中，同時或依序將gRNA及RNA嚮導之核酸酶分別遞送至細胞。在一些實施例中，將gRNA及RNA嚮導之核酸酶一起遞送至細胞。在一些實施例中，gRNA及RNA嚮導之核酸酶預複合在一起以形成核糖核蛋白質(RNP)。

RNP適用於基因編輯，至少因為其使富含核酸之細胞環境中之混雜相互作用的風險降至最低且保護RNA免於降解。用於形成RNP之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，將含有RNA嚮導之核酸酶(例如Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶)及靶向相關基因之gRNA的RNP遞送至細胞(例如：T細胞)。在一些實施例中，藉由電穿孔將RNP遞送至T細胞。

依本文所用，「 靶向 RNP 之 AAVS1 或 ROSA26」係指靶向與RNA嚮導之核酸酶預複合之 AAVS1 或 ROSA26基因的gRNA。在一些實施例中，將靶向RNP之 AAVS1 或 ROSA26遞送至細胞。在一些實施例中，將超過一個RNP遞送至細胞。在一些實施例中，超過一個RNA分別遞送至細胞。在一些實施例中，超過一個RNP同時遞送至細胞。

在一些實施例中，在表現RNA嚮導之核酸酶的DNA載體、編碼RNA嚮導之核酸酶的RNA或蛋白質中將RNA嚮導之核酸酶遞送至細胞。在一些實施例中，將靶向基因之gRNA以RNA或表現gRNA之DNA載體遞送至細胞。

可使用已知方法，例如電穿孔或化學轉染經由直接注射或細胞轉染來遞送RNA嚮導之核酸酶、gRNA及/或RNP。可使用其他細胞轉染方法。 6.  組分的多峰或差分遞送

熟習此項技術者應瞭解基因體編輯系統之不同組分可一起或分開且同時或非同時遞送。基因體編輯系統組分的分開及/或非同步遞送可能特別期望提供對於基因體編輯系統之功能的時間或空間控制及限制由其活性所引起的某些效果。

依本文所使用的不同或差分模式係指賦予例如RNA嚮導之核酸酶分子、gRNA、模板核酸或有效負載的本發明組分分子以不同藥效學或藥物動力學特性的遞送模式。舉例而言，遞送模式可例如在所選隔室、組織或器官中產生不同組織分佈、不同半衰期或不同暫態分佈。

例如藉由細胞中或細胞子代中存留之核酸載體進行之遞送(例如藉由自主複製或向細胞核酸中之插入)的一些遞送模式引起組分更持久之表現及存在。實例包括例如AAV或慢病毒的病毒遞送。

舉例而言，例如RNA嚮導之核酸酶及gRNA的基因體編輯系統之組分可藉由在身體或特定隔室、組織或器官中所遞送組分的所得半衰期或持久性方面不同的模式來遞送。在一實施例中，gRNA可藉由此類模式來遞送。RNA嚮導之核酸酶分子組分可藉由引起較低持久性或更少其對身體或特定隔室或組織或器官的暴露之模式來遞送。

更一般而言，在一實施例中，使用第一遞送模式以遞送第一組分，且使用第二遞送模式以遞送第二組分。第一遞送模式賦予第一藥效學或藥物動力學特性。第一藥效學特性可為例如組分或編碼該組分之核酸在身體、隔室、組織或器官中之分佈、持久性或暴露。第二遞送模式賦予第二藥效學或藥物動力學特性。第二藥效學特性可為例如組分或編碼該組分之核酸在身體、隔室、組織或器官中之分佈、持久性或暴露。

在某些實施例中，例如分佈、持久性或暴露的第一藥效學或藥物動力學特性相比於第二藥效學或藥物動力學特性而言更加受限。

在某些實施例中，選擇第一遞送模式以使例如分佈、持久性或暴露的藥效學或藥物動力學特性最佳化，例如減至最少。

在某些實施例中，選擇第二遞送模式以使例如分佈、持久性或暴露的藥效學或藥物動力學特性最佳化，例如達到最大。

在某些實施例中，第一遞送模式包含使用相對持久性元件，例如核酸，例如質體或病毒載體，例如AAV、腺病毒或慢病毒。因此，載體為相對持久性的，自其轉錄的產物應為相對持久性的。

在某些實施例中，第二遞送模式包含相對短暫性元件，例如RNA或蛋白質。

在某些實施例中，第一組分包含gRNA，且遞送模式為相對持久性的，例如gRNA係自例如AAV、腺病毒或慢病毒的質體或病毒載體轉錄。此等基因的轉錄應具有極少生理學結果，此係因為基因不編碼蛋白質產物，且gRNA不能起分離作用。第二組分RNA嚮導之核酸酶分子係以短暫性方式，例如作為編碼蛋白質的mRNA或作為蛋白質遞送，確保完整RNA嚮導之核酸酶分子/gRNA複合物係僅存在的且在短時間週期內為活性的。

此外，組分可以不同分子形式或與彼此互補以增強安全性及組織特異性之不同遞送載體一起遞送。

使用差分遞送模式可增強效能、安全性及/或功效，例如可減小最終脫靶修飾的可能性。當來自細菌衍生之Cas酶的肽藉由WIC分子在細胞表面上展現時，藉由較低持久性模式進行之例如Cas9分子之免疫原性組分的遞送可降低免疫原性。雙部分遞送系統可改善此等缺點。

可使用差分遞送模式以遞送組分至不同但重疊之目標區域。在目標區域之重疊外部將形成活性複合物減至最少。因此，在一實施例中，例如gRNA之第一組分係藉由產生第一空間(例如組織)分佈之第一遞送模式遞送。例如RNA嚮導之核酸酶分子的第二組分係藉由產生第二空間(例如組織)分佈之第二遞送模式遞送。在一實施例中，第一模式包含選自脂質體、奈米粒子(例如聚合奈米粒子)及核酸(例如病毒載體)之第一元件。第二模式包含選自該群組之第二元件。在一實施例中，第一遞送模式包含第一靶向元件，例如細胞特異性受體或抗體，且第二遞送模式不包括該元件。在某些實施例中，第二遞送模式包含第二靶向元件，例如第二細胞特異性受體或第二抗體。

當在病毒遞送載體、脂質體或聚合奈米粒子中遞送RNA嚮導之核酸酶分子時，有可能遞送至多個組織及在多個組織中具有治療活性，此時可能需要僅靶向單一組織。雙部分遞送系統可解決此挑戰且增強組織特異性。若將gRNA及RNA嚮導之核酸酶分子封裝於具有相異但重疊之組織向性的經分離遞送媒劑中，則僅在由兩種載體靶向之組織中形成全功能複合物。 V.  治療方法

在本發明之各種態樣中，經工程改造之B細胞將作為治療劑遞送至有需要之患者。在各種實施例中，經工程改造之B細胞將能夠治療或預防與法布瑞氏症相關之各種疾病或病症。

在一些方面中，本發明包含一種醫藥組成物，其包含經基因編輯之B細胞群體，該經基因編輯之B細胞群體包含至少一種依本文所描述之治療性蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組成物進一步包含額外活性劑。

在一個態樣中，根據本發明之醫藥組成物以足以達成治療效果之劑量投與個體。依本文所用，「治療」效果或作用包括本發明之醫藥組成物的效果或作用，其旨在治癒、緩解、治療或預防疾病、病症或病狀或使其進展穩定，或影響個體身體之結構或任何功能。應瞭解，適當劑量及給藥時程可根據個體及預期治療效果而變化，且可視諸如以下之因素而定：所治療之疾病、病症或病狀，及個體之一般健康、年齡、體重、性別或相關基因組成。此類適當劑量及給藥時程可由保健提供者視需要確定。另外，可根據本發明提供多次劑量的經工程改造之B細胞。

在一些實施例中，經工程改造之B細胞的經擴增群體為自體B細胞。在一些實施例中，經工程改造之B細胞為同種異體B細胞。在一些實施例中，經工程改造之B細胞為異源B細胞。在一些實施例中，本申請案之經工程改造之B細胞係藉由活體內轉染或活體內轉導製備。在其他實施例中，經工程改造之細胞係藉由轉染或轉導離體製備。

依本文所用，術語「個體(subject)」或「患者」意謂個體(individual)。在一些態樣中，個體為哺乳動物，諸如人類。在一些態樣中，個體可為非人類靈長類動物。非人類靈長類動物包括狨、猴、黑猩猩、大猩猩、紅毛猩猩及長臂猿，僅舉幾例。術語「個體」亦包括家養動物，諸如貓、狗等；家畜(例如駱馬、馬、牛)、野生動物(例如鹿、麋鹿(elk)、駝鹿(moose)等)、實驗室動物(例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)及禽類物種(例如雞、火雞、鴨等)。較佳地，個體為人類個體。更佳地，個體為人類患者。

在額外實施例中，包含經基因編輯之B細胞的組成物可與抗炎劑一起投與。抗炎劑或藥物包括但不限於類固醇及糖皮質激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氫化可體松(hydrocortisone acetate)、氫化可體松(hydrocortisone)、氫化可體松、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、普賴蘇穠(prednisolone)、普賴松(prednisone)、曲安西龍(triamcinolone))；非類固醇抗炎藥(NSAIDS)，包括阿司匹靈(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、來氟米特(leflunomide)、抗TNF藥品、環磷醯胺及黴酚酸酯(mycophenolate)。例示性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑制劑及唾液酸化物。例示性鎮痛劑包括乙醯胺苯酚、羥考酮(oxycodone)、鹽酸丙氧芬(proporxyphene hydrochloride)之曲馬多(tramadol)。例示性糖皮質激素包括可體松(cortisone)、地塞米松、氫化可體松、甲基普賴蘇穠、普賴蘇穠或普賴松。例示性生物反應調節劑包括針對細胞表面標記物之分子(例如CD4、CD5等)、細胞介素抑制劑(諸如TNF拮抗劑(例如依那西普(etanercept) (ENBREL®)、阿達木單抗(adalimumab) (HUMIRA®)及英利昔單抗(infliximab) (REMICADE®))、趨化介素抑制劑及黏附分子抑制劑。生物反應調節劑包括單株抗體以及重組形式之分子。例示性DMARD包括硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢靈(cyclosporine)、甲胺喋呤、青黴胺、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、羥基氯奎、金製劑(Gold) (經口(金諾芬(auranofin))及肌肉內)及二甲胺四環素。

在某些實施例中，本文所描述之組成物與細胞介素結合投與。依本文所用，「細胞介素」意指由一種細胞群體釋放的作為細胞間介體作用於另一細胞之蛋白質。細胞介素之實例為淋巴介質、單核球激素及傳統多肽激素。細胞介素中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如激濾泡素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體素(LH)；肝生長因子(HGF)；纖維母細胞生長因子(FGF)；促乳素；胎盤催乳激素；苗勒氏管(mullerian)抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子(NGF)，諸如NGF-β；血小板生長因子；轉型生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；類胰島素生長因子-I及類胰島素生長因子-II；紅血球生成素(EPO)；骨性誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF (M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF (GM-CSF)；及粒細胞-CSF (G-CSF)；介白素(Il)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體(kit ligand，KL)。依本文所用，術語細胞介素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質，及天然序列細胞介素之生物活性等效物。

在一些態樣中，該方法進一步包含向個體投與至少第二療法。在各種實施例中，該方法進一步包含用於治療法布瑞氏症之第二療法。在某些態樣中，其中療法為經口伴隨蛋白療法。在一些實施例中，第二療法為Galafold® (米加司他(migalastat))。在各種實施例中，第二療法為酶替代療法。在各種實施例中，酶替代療法為重組a-GAL之輸注。在各種實施例中，第二療法為受質減少療法。在各種實施例中，第二療法為藉由阻斷其產生所需之其他酶來減少Gb3之量的療法。 實例

儘管已出於清楚理解之目的藉由說明及實例相當詳細地描述前述發明，但根據本發明之教示，對於一般技術者將顯而易見，可在不背離隨附申請專利範圍之精神或範疇下對其進行某些變化及修改。以下實例僅以說明而非作為限制的方式提供。熟習此項技術者將容易地認識到可改變或修改以產生基本上相似之結果的多種非關鍵性參數。 實例1. B細胞的靶向編輯

使用磁珠自健康供體分離人類B細胞且使用CD40配位體及IL21活化。使用編碼α-GAL蛋白之rAAV6及AAVS1特異性或ROSA26特異性RNP來對B細胞進行工程改造。參見圖1A (AAVS1)及圖1B (ROSA26)。B細胞經編輯以表現WT人類α-GAL蛋白(1137，SEQ ID No. 9)、具有人類α-GAL蛋白之羧基端LL截短的α-GAL蛋白(1138，SEQ ID No. 10)或具有羧基端LL截短且添加重鏈信號肽的α-GAL蛋白(1139，SEQ ID No. 13)或具有羧基端LL截短且添加輕鏈信號肽的α-GAL蛋白(1140，SEQ ID No. 11)。作為對照，B細胞僅在無RNP電穿孔情況下用rAAV6轉導以測定B細胞中來自AAV6游離型表現之α-GAL活性的含量(參見例如圖2A至圖2B「游離型」)。

人類 B 細胞分離、活化及擴增。來自健康供體的白血球層係獲自斯坦佛血液中心(Stanford Blood Center) (Menlo Park, CA, USA)。使用Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chicago, IL)自白血球層分離PBMC。使用EASYSEP™人類B細胞分離套組根據製造商的說明書(STEMCELL Technologies Inc., Cambridge, MA, USA)分離初代人類B細胞。自健康供體之周邊血液分離B細胞且在活化混合液(CD40L、CpG、IL2、IL10、IL15及IL21)中培養3天。在第3天，使用經由電穿孔及AAV6轉導遞送之Cas9/sgRNA進行基因編輯。在基因編輯之後，將B細胞在活化培養基中再培養6天。

AAVS1 、 ROSA26sgRNA 及 CRISPR 工程改造。靶向 AAVS1 或 ROSA26之經化學修飾之sgRNA寡聚物係藉由整合DNA技術(Integrated DNA Technologies，IDT；Coralville, Iowa, USA)製造。重組化膿性鏈球菌Cas9酶係購自整合DNA技術(IDT，Coralville, Iowa, USA)。Cas9與sgRNA一起在室溫下以1:1.6之莫耳比培育10分鐘，隨後與B細胞混合。藉由程式CM-137 (Lonza, Basel, Switzerland)在P3核轉染溶液中使用AMAXA™ 4D-NUCLEOFACTOR™進行初代人類B細胞之工程改造。使用100 pmol RNP對呈20 µl體積的1百萬個活化人類B細胞進行電穿孔。緊接在電穿孔之後，B細胞用rAAV6供體以100,000個病毒基因體(vg)/μl之感染倍率(MOI)轉導以使轉導效率最大化。

α - GAL 活性的量測。隨後量測來自分化成PB或PC之經基因編輯之人類B細胞的分泌之α-GAL形式的活性。在基因編輯之後第6、9及12天，收集來自經編輯之人類B細胞的上清液。使用α半乳糖苷酶活性分析套組根據製造商的說明(Abcam，ab239716)量測Α-GAL比活性。

結果。依圖2A及圖2B中所示，當人類GLA基因插入至AAVS1或ROSA26基因座中時，自此等經編輯之B細胞得到的上清液相較於對照顯示出增加之α-GAL活性。此指示經編輯之細胞展現人類α-GAL蛋白之增加的表現及分泌。用hGLA編輯之B細胞(具有羧基端LL截短及添加重鏈信號肽(SEQ ID No. 3)或輕鏈信號肽(SEQ ID No. 4))顯示α-GAL活性之最大增加。 實例2. 分化之血漿母細胞及漿細胞中的Α-GAL活性

接下來，在AAVS1基因座處編輯自周邊血液分離之人類B細胞以再次表現WT hα-GAL蛋白(SEQ ID No. 1)、具有hα-GAL蛋白之羧基端LL截短的α-GAL蛋白(SEQ ID No. 2)或具有羧基端LL截短且添加重鏈信號肽的α-GAL蛋白(SEQ ID No. 3)或具有羧基端LL截短且添加輕鏈信號肽的α-GAL蛋白(SEQ ID No. 4)。作為對照，B細胞僅用rAAV6載體轉導，無RNP核轉染(「游離型」)。B細胞接下來分化為PB或PC，且使用實例1中所描述之方案來量測α-GAL活性。

分化成 PB 及 PC 。人類B細胞活化及擴增之B細胞在含有IL2、IL6、IL10、IL15、IL21之培養基中培養3天。此過程產生漿母細胞與B細胞之混合物。B細胞經由在含有IL6、IL15、IL21及INF-a之培養基中的3天培育進一步分化成B細胞、漿母細胞及漿細胞之混合物。

在培養基更換之後三天，量測來自活化B細胞及分化PB及PC之上清液的α-GAL活性。使用實例1中所描述之方案量測a-Gal活性。

結果。依圖3中所示，相較於經AAV轉導之對照，分化成PB及PC之周邊血液B細胞顯示出更大α-GAL活性，指示GLA轉殖基因之整合產生α-GAL酶之高表現/分泌。經工程改造以表現hα-GAL的B細胞 (具有羧基端LL截短及添加重鏈信號肽(SEQ ID No. 3)或輕鏈信號肽(SEQ ID No. 4))顯示α-GAL活性之最大增加。 實例3.  經編輯之人類漿母細胞中的α-GAL活體外表現

接下來，自五個不同供體(供體A-E)之周邊血液分離的人類B細胞分化成人類漿母細胞且在AAVS1基因座處經編輯以表現WT hα-GAL蛋白(「經編輯之野生型GLA供體A」，1137，SEQ ID NO. 9)或截短型α-GAL (「經編輯之WFT 2AA-trunc-GLA供體」A至E，1140，SEQ ID NO.11)。作為對照，B細胞僅用rAAV6載體(1137或1140)轉導，無RNP核轉染(未經編輯之細胞供體A)。使用實例1中所描述之方案量測α-GAL活性。依圖4中所示，相較於未經編輯之細胞，經編輯之B細胞/漿母細胞顯示顯著增強之α-GAL活性。 實例4.來自漿母細胞及漿細胞之上清液中的α-半乳糖苷酶活性

接下來，在經修飾之條件下量測經編輯之細胞中的α-GAL表現。對於此實驗，IFNa2b濃度自1.5 ng/ml增加至15 ng/ml。細胞密度維持在0.6 M/mL且細胞擴增九天而非七天。依圖5中所示，在此等條件下，分化成PB及PC的經編輯之周邊血液細胞在用截短型α-GAL編輯(「經編輯之GLA (1140)」)時顯示類似的活性α-GAL之分泌。 實例5. 經編輯之人類漿母細胞中的活性α-GAL。

接下來，自周邊血液分離、分化成人類漿母細胞之人類B細胞且在AAVS1基因座處經編輯以再次表現各種α-GAL形式(1140 =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA (SEQ ID No. 11)；1159 =具有LL截短及輕鏈信號肽之GLA (SEQ ID No. 12)；1501=具有C端處4個胺基酸截短及重鏈信號肽之GLA；1509 (SEQ ID No. 16 (GLA nt序列)，18 (構築體))、1510 (SEQ ID No. 19)、1511 (SEQ ID No. 23) =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA序列的3種不同密碼子最佳化。作為對照，B細胞僅用rAAV6載體轉導，無RNP核轉染(「AAV」)。使用實例1中所描述之方案量測α-GAL活性。依圖6中所示，經編輯之B細胞/漿母細胞在與AAV對照相比時顯示增加之α-GAL活性。此外，當與用對應非經密碼子最佳化之序列(1140、1159)編輯之B細胞/漿母細胞相比時，編碼具有LL截短及重鏈或輕鏈信號肽之GLA (1509、1510)的經密碼子最佳化之構築體顯示改善之α-GAL活性。其他密碼子最佳化研究顯示於圖20之兩個供體中：供體1 (圖20A)及供體2 (圖20B)。當與游離型(AAV)表現相比時，B細胞經編輯以表現人類GLA (在圖2中標記為「經GLA編輯」，且在圖20A及圖20B中標記有「編輯(Edit)」，隨後為構築體編號)顯示顯著增強之α-GAL活性。構築體1482為原始cDNA序列(SEQ ID NO. 4)。在五個經密碼子最佳化之構築體(1588 (SEQ ID No. 26)、1598 (SEQ ID No. 27)、1599 (SEQ ID No. 28)、1600 (SEQ ID No. 29)及1606 (SEQ ID No. 25))中，構築體1606及1599在與活化B細胞相比且與構築體1482相比時顯示B細胞/PB細胞中增強之α-GAL活性。 實例6. 法布瑞氏症患者纖維母細胞中細胞內α-GAL含量的恢復

法布瑞氏症之特徵在於身體缺乏產生α-GAL酶之能力。在健康細胞中，磷酸化α-GAL結合M6P受體(M6P-R)且內化於溶酶體中。參見例如圖7A。在此實驗中，將纖維母細胞自患有法布瑞氏症之患者分離且作為初代細胞培養物生長。纖維母細胞隨後與來自表現/分泌WT α-GAL或具有羧基端LL截短且添加重鏈信號肽之α-GAL (SEQ ID No. 3)的HEK293之上清液共培養。

結果。依圖7B中所示，WT纖維母細胞表現hα-GAL，而來自法布瑞氏症患者之纖維母細胞不表現hα-GAL。當來自法布瑞氏症患者之纖維母細胞與來自表現/分泌α-GAL之HEK 293細胞的上清液共培養時，α-GAL活性顯著增加(高3倍)。所測試之α-GAL形式均能夠內化且恢復法布瑞氏症患者衍生之纖維母細胞中的細胞內a-GAL活性。 實例7. 來自經編輯之B細胞的α-GAL蛋白針對法布瑞氏症之活體內表現

活體內檢測來自經編輯之B細胞的α-GAL活性及hα-GAL蛋白之表現。給小鼠注射30×10 ⁶個未經編輯或經編輯之活化B細胞以及3×10 ⁶個CD4 ⁺T細胞。由於缺乏額外的人類免疫組分及細胞介素，人類B細胞在NSG中之移植及存活較差。CD4 ⁺T細胞在B細胞之存活及功能中起重要作用。已證實，CD4 ⁺T細胞之共轉移支持NSG小鼠中之人類B細胞的存活及功能。參見例如Ishikawa, Y., 等人, 2014, Eur. J. Immunol., 44:3453-3463；Luo B.等人, 2020, Cell Death and Disease, 11:973。α-GAL活性(圖9A)經102天量測且蛋白質表現(圖9B)經22天之時程量測。

經編輯之 B 細胞的授受性轉移。依實例1中所描述經編輯且培養之人類B細胞基因在編輯之後的D6採集且在PBS中洗滌。隨後，B細胞以30×10 ⁶個細胞/300 μl再懸浮且經由靜脈內尾靜脈注射轉移至NSG小鼠中。在B細胞轉移之前五天，使用相同程序將總共3×10 ⁶個CD4 ⁺T細胞轉移至NSG小鼠中。

自 NSG 小鼠分離血漿。將小鼠暴露於熱燈以誘導血管擴張。一旦側尾靜脈明顯擴張，則束縛住小鼠且在尾尖處剪斷。將80 - 90 µL血液收集於外加有EDTA之血漿管中。將收集之血液樣品在處理前置於冰上。隨後，血液樣品在8,000 RPM下旋轉5分鐘，且收集約45 - 50 µl血漿，且保持在-20℃下冷凍直至用於α-GAL活性含量分析。α-GAL活性係自依上文實例1中所描述之經分離血漿量測。

量測 α - Gal 蛋白。使用α半乳糖苷酶活性分析套組根據製造商的說明(Abcam，ab239716)量測NSG小鼠之血漿中的α-GAL比活性。使用人類GLA/α半乳糖苷酶(Sandwich ELISA) (LS Bio，LS-F10765)評估α-GAL蛋白濃度。 實例8. 評估sgRNA效率及特異性以及密碼子最佳化對α-GAL表現的作用。

此處描述一種靶向AAV1基因座之高效、特異性且安全的基因編輯策略。使用上文所描述之方法，使用基於CRISPR/Cas之基因體編輯自周邊血液分離健康供體B細胞且經工程改造以表現α-GAL。使用上文所描述且依圖13A及圖13B中所示之實驗方法擴增及培養經工程改造之B細胞。提取基因體DNA以使用數位PCR分析來量測位點特異性突變之效率(圖9A)及靶向整合頻率(n = 3個健康供體) (圖9B)。

使用實例1中所描述之技術編輯人類B細胞且使用各種 GLA - cDNA序列(圖10A (SEQ ID NO. 14)及FIG. 10B (SEQ ID NO. 24))培養12天。在第9天及第12天，收集細胞培養物上清液，評估細胞計數及存活率。使用活性分析在上清液中定量功能性、分泌之α-GAL，且將結果標準化至細胞計數。

將靶向AAV1基因座之RNP經由核轉染遞送至B細胞中，且提取基因體DNA以使用數位PCR分析序列量測位點特異性突變之效率(圖11A (SEQ ID NO. 11)及圖11B (SEQ ID NO. 25) n=3個健康供體)。

對自經AAV1特異性RNP處理之人類B細胞分離的基因體DNA進行嚮導-SEQ分析。藉由併入雙股寡去氧核苷酸(dsODN)來鑑別中靶/脫靶位點(圖12)。 實例9. 活體外調節之後B細胞譜系的評估。

在活體外調節之後，在經工程改造之B細胞中評估B細胞表型。

流式細胞量測術。藉由流式細胞量測術進行B細胞之表型分析。細胞在細胞染色緩衝液(Biolegend)中染色且人類TruStain FcX™ (Fc受體阻斷溶液；Biolegend)用於避免FcR介導之非特異性抗體結合。細胞用以下抗體-螢光染料組合進行染色：IgD-AF488 (Biolegend)、CD20- BV711 (Biolegend)、CD38-PE (Biolegend)、CD27-BV605 (Biolegend)、CD138-BV421 (Biolegend)。

發現活體外調節促進B細胞分化成表現高含量的經工程改造之α-GAL的類漿細胞表型。B細胞譜系在活體外調節之後。使用流式細胞量測術監測記憶B細胞(CD27+IgD-)、漿母細胞(PB) (CD27+CD38+ CD20-)、漿細胞(PC) (CD27+CD38+ CD20- CD138+)群體(圖14A)。B細胞中GLA轉錄物之PrimeFlow分析顯示CD27+CD38+ CD20-細胞群體表現比CD27-細胞群體更高含量之GLA轉錄物(圖14B)。 實例10. 經基因工程改造之B細胞的活體內授受性轉移。

活體內檢測來自經編輯之B細胞的α-GAL活性蛋白質。給小鼠注射30×10 ⁶個未經編輯或經編輯之活化B細胞以及3×10 ⁶個依以上實例7中所描述之CD4 ⁺T細胞。依實例1中所描述經編輯且培養之人類B細胞基因在編輯之後的D6採集且在PBS中洗滌。隨後，B細胞以30×10 ⁶個細胞/300 μl再懸浮且經由靜脈內尾靜脈注射轉移至NSG小鼠中。在B細胞轉移之前五天，使用相同程序將總共3×10 ⁶個CD4 ⁺T細胞轉移至NSG小鼠中。自依上文實例7中所描述之NGS小鼠分離血漿，且自依上文實例1中所描述之經分離血漿量測α-GAL活性。

經由對血漿樣品之酶活性分析(n= 2個健康供體)每7-10天監測循環α-GAL含量。在NSG小鼠中移植之經工程改造之B細胞產生持續的超生理α-GAL血漿含量(圖15)。螢光素酶成像顯示經工程改造之細胞在骨髓中之早期移植(圖16A)。自多個鼠類組織分離出移植之B細胞且使用流式細胞量測術使用實例8中所描述之方法評估細胞表型(n=4隻小鼠) (圖16B)。 實例11.  藉由輸註記憶CD4+細胞減少GvHD症狀。

在NSG小鼠中，在不存在來自額外人類免疫組分或細胞介素之支持的情況下，B細胞移植極其不良(Luo 2020；Cheng 2022)。在人類B細胞顯著增加B細胞活體內移植及存活的能力之前或與此同時，NSG小鼠經由自體總人類CD4+ T細胞之授受性轉移進行人源化(Levy 2016)。

使用T細胞來對宿主進行「人源化」之研發人源化小鼠模型的挑戰之一係罹患移植物抗宿主疾病(GVHD)，此限制了研究期，因為出於道德原因必須處死小鼠。已顯示，NSG小鼠中記憶CD4+ T細胞(CD4+CD45RO+)之授受性轉移顯著降低GvHD發病及嚴重程度(Anderson 2003)，同時支持人類B細胞移植及功能(Ishikawa 2014)。

在另一活體內授受性轉移研究中，記憶CD4+ T細胞(CD4+CD45RO+)可減少GvHD之發病率且延遲其發作。活體內檢測來自經編輯之B細胞的α-GAL活性及hα-GAL蛋白之表現。給小鼠注射25×10 ⁶個未經編輯或經編輯之活化B細胞以及3×10 ⁶個依以上實例7中所描述之CD4 ⁺T細胞。依實例1中所描述經編輯且培養之人類B細胞基因在編輯之後的D6採集且在PBS中洗滌。隨後，B細胞以25×10 ⁶個細胞/300 μl再懸浮且經由靜脈內尾靜脈注射轉移至NSG小鼠中。在B細胞轉移之前五天，使用相同程序將總共3×10 ⁶個CD4 ⁺T細胞轉移至NSG小鼠中。自依上文實例7中所描述之NGS小鼠分離血漿，且自依上文實例1中所描述之經分離血漿量測α-GAL活性。

經由對血漿樣品之酶活性分析每7-10天監測循環α-GAL含量。在NSG小鼠中移植之經工程改造之B細胞產生持續的超生理α-GAL血漿含量(圖18)。針對體重及GVHD症狀(例如毛髮減少、耳朵/四肢發紅、駝背姿勢)，對依圖18中所描述經人源化的NSG小鼠進行評估。與用生理鹽水處理之小鼠相比(圖19A)，輸注有記憶CD4+ T細胞以及經編輯之B細胞(1140，SEQ ID NO. 11)的小鼠(圖19B)相比於生理鹽水對照未顯示體重或GVHD症狀之差異。相比之下，輸注有總CD4+ T細胞以及經編輯之B細胞(1140，SEQ ID NO. 11)的小鼠顯示體重降低及/或表現出GVHD症狀。(圖19C)。 實例12. 法布瑞氏症患者B細胞中功能性GLA cDNA的基因編輯

接下來，自法布瑞氏症患者之周邊血液分離之人類B細胞活化且在AAVS1基因座處經編輯以再次表現構築體1606 (SEQ ID NO. 25)。B細胞經由CD19+正向選擇自法布瑞氏症患者之PBMC分離，且在含有CD40L、CpG、IL-2、IL-10、IL-15及IL-21之培養基中活化3天。在分離之後的第3天，使用經由電穿孔遞送之Cas9/sgRNA，接著經由AAV6 GLA載體(1606，SEQ ID No. 25)轉導進行基因編輯。經工程改造之B細胞在上文描述之相同培養基中再擴增7天。

吾人能夠隨時間推移在活體外擴增經編輯之法布瑞氏症B細胞(圖17A)。經編輯之法布瑞氏症B細胞證實每100個細胞大致60個複本之中靶整合，以數位PCR量測(圖17B)。最終，經編輯之法布瑞氏症B細胞分泌活性α-GAL酶，其中未經編輯之細胞並不分泌(圖17C)。 序列表

序列 ID 編號	描述	序列
1	WT - aa序列	MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKDLL
2	2L-del - aa序列	MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKD
3	2L-del; SP-H - aa序列	MGSTAILALLLAVLQGVCALDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKD
4	2L-del; SP-K - aa序列	METPAQLLFLLLLWLPDTTGLDNGLARTPTMGWLHWERFMCNLDCQEEPDSCISEKLFMEMAELMVSEGWKDAGYEYLCIDDCWMAPQRDSEGRLQADPQRFPHGIRQLANYVHSKGLKLGIYADVGNKTCAGFPGSFGYYDIDAQTFADWGVDLLKFDGCYCDSLENLADGYKHMSLALNRTGRSIVYSCEWPLYMWPFQKPNYTEIRQYCNHWRNFADIDDSWKSIKSILDWTSFNQERIVDVAGPGGWNDPDMLVIGNFGLSWNQQVTQMALWAIMAAPLFMSNDLRHISPQAKALLQDKDVIAINQDPLGKQGYQLRQGDNFEVWERPLSGLAWAVAMINRQEIGGPRSYTIAVASLGKGVACNPACFITQLLPVKRKLGFYEWTSRLRSHINPTGTVLLQLENTMQMSLKD
5	WT - nt序列(1002)	ATGCAGCTGAGAAACCCAGAGTTGCATCTGGGATGCGCCCTGGCACTTCGATTTCTCGCCCTCGTATCTTGGGACATCCCTGGCGCGCGCGCACTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACCTCCTCTAG
6	2L-del - nt序列(1077)	ATGCAGCTGAGAAACCCAGAGTTGCATCTGGGATGCGCCCTGGCACTTCGATTTCTCGCCCTCGTATCTTGGGACATCCCTGGCGCGCGCGCACTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGA
7	2L-del; SP-H - nt序列(1067)	ATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGA
8	2L-del; SP-K - nt序列(1069)	ATGGAAACACCTGCCCAACTGCTGTTCTTGCTGCTGCTCTGGTTGCCGGACACTACTGGTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGA
9	WT -構築體序列(1137)	tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcaggTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagtgCCACCATGCAGCTGAGAAACCCAGAGTTGCATCTGGGATGCGCCCTGGCACTTCGATTTCTCGCCCTCGTATCTTGGGACATCCCTGGCGCGCGCGCACTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACCTCCTCTAGAGGCTAGGTGGAGGCTCAGTGgtttaaaccgctgatcactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggcccgggcacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
10	2L-del -構築體序列(1138)	tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcaggTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagtgCCACCATGCAGCTGAGAAACCCAGAGTTGCATCTGGGATGCGCCCTGGCACTTCGATTTCTCGCCCTCGTATCTTGGGACATCCCTGGCGCGCGCGCACTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGAgtttaaaccgctgatcactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggcccgggcacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
11	2L-del; SP-H -構築體序列(1140)	tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcaggTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagttgCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGAgtttaaaccgctgatcactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggcccgggcacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
12	2L-del; SP-K -構築體序列(1159)	tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcaggTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagttgCCACCATGGAAACACCTGCCCAACTGCTGTTCTTGCTGCTGCTCTGGTTGCCGGACACTACTGGTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGAgtttaaaccgctgatcactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggcccgggcacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
13	1139 (2L-del; SP-K -構築體序列)	tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcaggTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagtgCCACCATGGAAACCGATACACTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGATCTACCGGTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGAAGGACTGAgtttaaaccgctgatcactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggcccgggcacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctctg
14	嚮導RNA - AAVS1	GGGGCCACTAGGGACAGGAT
15	嚮導RNA - Rosa26	GATGACGAGATCACGCGAGG
16	1509	GCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTCTCGATAACGGGCTCGCCAGAACCCCGACTATGGGGTGGTTGCACTGGGAACGCTTCATGTGCAACCTGGACTGCCAAGAAGAGCCTGACTCTTGCATTAGTGAAAAGCTCTTTATGGAAATGGCGGAACTTATGGTGTCAGAAGGGTGGAAAGACGCCGGATACGAATACCTGTGTATTGACGATTGCTGGATGGCTCCCCAGCGCGACAGCGAAGGAAGGCTGCAGGCCGATCCTCAGCGCTTTCCCCACGGGATACGTCAGCTGGCTAATTATGTGCACTCTAAGGGTCTGAAACTTGGCATCTACGCGGACGTAGGGAATAAGACGTGCGCAGGCTTTCCCGGCTCCTTCGGTTACTACGATATTGATGCTCAGACTTTTGCTGATTGGGGCGTGGATCTTCTCAAGTTTGACGGCTGTTACTGTGATTCCCTGGAGAATCTTGCCGATGGCTACAAGCACATGTCTCTGGCCTTGAACCGCACCGGCCGGAGCATTGTCTACAGCTGCGAGTGGCCGTTGTATATGTGGCCCTTCCAAAAGCCTAATTACACAGAAATACGACAGTATTGCAACCACTGGCGAAATTTTGCCGATATTGATGACTCCTGGAAATCCATCAAGAGCATCCTGGACTGGACTTCATTCAATCAGGAGCGTATCGTGGACGTGGCTGGTCCTGGCGGATGGAACGACCCTGATATGCTTGTCATCGGGAATTTTGGATTATCCTGGAACCAGCAAGTGACACAAATGGCCCTGTGGGCCATTATGGCTGCACCACTGTTCATGAGCAACGATCTTCGACATATCAGCCCGCAGGCTAAGGCTCTGCTGCAGGACAAGGATGTGATCGCCATCAACCAGGATCCCCTGGGCAAACAGGGCTACCAGCTCAGGCAAGGTGACAATTTCGAGGTGTGGGAGCGGCCATTGTCCGGGTTAGCGTGGGCCGTGGCCATGATTAACCGCCAGGAGATCGGGGGCCCGAGGTCATATACCATCGCAGTCGCCTCCCTGGGGAAAGGTGTTGCTTGTAATCCCGCCTGCTTCATCACTCAGCTGCTTCCTGTTAAACGGAAATTGGGTTTTTACGAGTGGACTAGCCGATTGAGATCCCATATCAATCCCACAGGGACAGTACTCCTTCAGTTAGAGAACACTATGCAAATGTCTCTCAAGGATTGA
17	1510	GCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTTTGGATAATGGATTAGCAAGGACTCCTACCATGGGGTGGTTACATTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTGGACTGTCAGGAGGAGCCTGACAGTTGTATAAGCGAGAAGCTGTTCATGGAGATGGCCGAGCTTATGGTTTCAGAGGGATGGAAAGACGCTGGCTACGAATACCTCTGTATAGATGACTGTTGGATGGCTCCGCAGAGGGATTCAGAAGGGCGGCTCCAGGCCGATCCTCAAAGGTTCCCACATGGGATTCGCCAGCTGGCCAATTACGTTCACAGTAAGGGACTGAAACTCGGGATCTACGCCGATGTTGGTAACAAAACCTGCGCGGGGTTCCCTGGAAGCTTTGGCTATTACGACATTGACGCTCAGACCTTCGCCGACTGGGGCGTGGACTTACTGAAGTTTGACGGGTGTTACTGCGATTCTCTGGAAAACTTAGCTGATGGATACAAACATATGTCCCTGGCCCTGAACCGGACTGGACGCTCTATCGTGTATTCCTGCGAGTGGCCCTTGTATATGTGGCCTTTTCAGAAGCCAAATTACACTGAAATTCGCCAGTACTGTAATCACTGGCGGAATTTTGCCGACATCGATGATAGTTGGAAGAGCATAAAGAGCATTTTGGATTGGACCTCCTTTAATCAGGAACGTATTGTAGATGTTGCTGGACCCGGCGGGTGGAATGATCCTGACATGCTGGTGATCGGCAACTTCGGACTGAGTTGGAATCAGCAGGTAACCCAGATGGCACTGTGGGCGATTATGGCCGCTCCTCTCTTTATGTCTAACGATCTGCGGCACATTTCTCCTCAAGCGAAGGCTCTGCTTCAGGATAAGGATGTGATTGCTATAAACCAGGATCCACTGGGAAAGCAGGGGTACCAACTCCGGCAGGGAGACAACTTCGAGGTGTGGGAACGCCCACTCAGCGGTCTCGCTTGGGCCGTGGCAATGATTAATCGACAGGAGATTGGCGGACCAAGATCCTACACCATTGCTGTGGCTTCCTTGGGCAAAGGAGTTGCTTGTAATCCCGCCTGCTTTATTACTCAGCTGCTCCCTGTGAAGAGAAAGCTCGGTTTCTACGAATGGACCTCCCGGCTGCGGTCACACATCAACCCAACAGGTACCGTACTCCTGCAGTTGGAAAATACCATGCAGATGTCCTTGAAAGATTGA
18	1509 (LL-del; SP-K -構築體序列)	TgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcaggTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagtt GCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTCTCGATAACGGGCTCGCCAGAACCCCGACTATGGGGTGGTTGCACTGGGAACGCTTCATGTGCAACCTGGACTGCCAAGAAGAGCCTGACTCTTGCATTAGTGAAAAGCTCTTTATGGAAATGGCGGAACTTATGGTGTCAGAAGGGTGGAAAGACGCCGGATACGAATACCTGTGTATTGACGATTGCTGGATGGCTCCCCAGCGCGACAGCGAAGGAAGGCTGCAGGCCGATCCTCAGCGCTTTCCCCACGGGATACGTCAGCTGGCTAATTATGTGCACTCTAAGGGTCTGAAACTTGGCATCTACGCGGACGTAGGGAATAAGACGTGCGCAGGCTTTCCCGGCTCCTTCGGTTACTACGATATTGATGCTCAGACTTTTGCTGATTGGGGCGTGGATCTTCTCAAGTTTGACGGCTGTTACTGTGATTCCCTGGAGAATCTTGCCGATGGCTACAAGCACATGTCTCTGGCCTTGAACCGCACCGGCCGGAGCATTGTCTACAGCTGCGAGTGGCCGTTGTATATGTGGCCCTTCCAAAAGCCTAATTACACAGAAATACGACAGTATTGCAACCACTGGCGAAATTTTGCCGATATTGATGACTCCTGGAAATCCATCAAGAGCATCCTGGACTGGACTTCATTCAATCAGGAGCGTATCGTGGACGTGGCTGGTCCTGGCGGATGGAACGACCCTGATATGCTTGTCATCGGGAATTTTGGATTATCCTGGAACCAGCAAGTGACACAAATGGCCCTGTGGGCCATTATGGCTGCACCACTGTTCATGAGCAACGATCTTCGACATATCAGCCCGCAGGCTAAGGCTCTGCTGCAGGACAAGGATGTGATCGCCATCAACCAGGATCCCCTGGGCAAACAGGGCTACCAGCTCAGGCAAGGTGACAATTTCGAGGTGTGGGAGCGGCCATTGTCCGGGTTAGCGTGGGCCGTGGCCATGATTAACCGCCAGGAGATCGGGGGCCCGAGGTCATATACCATCGCAGTCGCCTCCCTGGGGAAAGGTGTTGCTTGTAATCCCGCCTGCTTCATCACTCAGCTGCTTCCTGTTAAACGGAAATTGGGTTTTTACGAGTGGACTAGCCGATTGAGATCCCATATCAATCCCACAGGGACAGTACTCCTTCAGTTAGAGAACACTATGCAAATGTCTCTCAAGGATTGACTACTCTGGCGTCGATGAGGGAgtttaaaccgctgatcaCtgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
19	1510 (LL-del; SP-K -構築體序列)	TgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcagTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagtt GCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTTTGGATAATGGATTAGCAAGGACTCCTACCATGGGGTGGTTACATTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTGGACTGTCAGGAGGAGCCTGACAGTTGTATAAGCGAGAAGCTGTTCATGGAGATGGCCGAGCTTATGGTTTCAGAGGGATGGAAAGACGCTGGCTACGAATACCTCTGTATAGATGACTGTTGGATGGCTCCGCAGAGGGATTCAGAAGGGCGGCTCCAGGCCGATCCTCAAAGGTTCCCACATGGGATTCGCCAGCTGGCCAATTACGTTCACAGTAAGGGACTGAAACTCGGGATCTACGCCGATGTTGGTAACAAAACCTGCGCGGGGTTCCCTGGAAGCTTTGGCTATTACGACATTGACGCTCAGACCTTCGCCGACTGGGGCGTGGACTTACTGAAGTTTGACGGGTGTTACTGCGATTCTCTGGAAAACTTAGCTGATGGATACAAACATATGTCCCTGGCCCTGAACCGGACTGGACGCTCTATCGTGTATTCCTGCGAGTGGCCCTTGTATATGTGGCCTTTTCAGAAGCCAAATTACACTGAAATTCGCCAGTACTGTAATCACTGGCGGAATTTTGCCGACATCGATGATAGTTGGAAGAGCATAAAGAGCATTTTGGATTGGACCTCCTTTAATCAGGAACGTATTGTAGATGTTGCTGGACCCGGCGGGTGGAATGATCCTGACATGCTGGTGATCGGCAACTTCGGACTGAGTTGGAATCAGCAGGTAACCCAGATGGCACTGTGGGCGATTATGGCCGCTCCTCTCTTTATGTCTAACGATCTGCGGCACATTTCTCCTCAAGCGAAGGCTCTGCTTCAGGATAAGGATGTGATTGCTATAAACCAGGATCCACTGGGAAAGCAGGGGTACCAACTCCGGCAGGGAGACAACTTCGAGGTGTGGGAACGCCCACTCAGCGGTCTCGCTTGGGCCGTGGCAATGATTAATCGACAGGAGATTGGCGGACCAAGATCCTACACCATTGCTGTGGCTTCCTTGGGCAAAGGAGTTGCTTGTAATCCCGCCTGCTTTATTACTCAGCTGCTCCCTGTGAAGAGAAAGCTCGGTTTCTACGAATGGACCTCCCGGCTGCGGTCACACATCAACCCAACAGGTACCGTACTCCTGCAGTTGGAAAATACCATGCAGATGTCCTTGAAAGATTGACTACTCTGGCGTCGATGAGGGAgtttaaaccgctgatcaCtgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
20	1501	GCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGTAG
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22	1501 (構築體)	TgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggctggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcccaaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccctgcagTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAgtactactagtt GCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTCTGGACAACGGACTGGCTAGGACCCCCACCATGGGTTGGTTACACTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTCGACTGTCAGGAAGAACCGGACTCTTGTATCTCAGAAAAATTGTTTATGGAGATGGCAGAACTGATGGTGTCAGAGGGGTGGAAAGATGCTGGGTACGAATACCTCTGCATAGATGACTGTTGGATGGCGCCCCAGCGTGACAGCGAGGGACGCCTGCAGGCTGATCCTCAGAGATTCCCACATGGGATTCGACAGCTCGCTAATTACGTGCACTCAAAAGGCCTGAAACTGGGGATCTATGCCGACGTCGGGAACAAAACCTGTGCAGGATTCCCTGGAAGTTTCGGGTACTACGACATCGACGCCCAAACCTTTGCAGACTGGGGCGTTGATCTGCTGAAGTTTGACGGATGTTATTGTGACAGCCTGGAGAACCTTGCCGACGGCTATAAGCATATGAGCTTGGCATTGAACCGCACCGGACGAAGCATAGTGTACTCTTGCGAGTGGCCTCTCTATATGTGGCCTTTTCAGAAACCAAACTACACGGAAATACGGCAATACTGCAATCATTGGAGGAACTTCGCCGATATTGACGATTCTTGGAAATCCATCAAAAGCATATTAGACTGGACCAGTTTCAATCAGGAAAGAATCGTGGACGTTGCTGGTCCAGGAGGTTGGAACGATCCAGACATGCTGGTGATTGGGAACTTCGGCCTCAGTTGGAATCAGCAGGTCACACAAATGGCGCTGTGGGCTATCATGGCTGCACCGCTGTTTATGTCAAACGACCTGCGACACATCAGCCCTCAGGCTAAGGCATTGTTGCAAGATAAGGATGTAATAGCAATAAACCAGGACCCCCTCGGTAAGCAGGGCTATCAGTTACGCCAGGGCGATAACTTTGAAGTGTGGGAACGACCGTTGTCCGGCCTGGCCTGGGCTGTGGCCATGATAAACCGACAAGAGATTGGAGGGCCCAGGTCTTATACTATCGCTGTGGCAAGTCTTGGAAAAGGAGTGGCTTGCAACCCAGCATGCTTCATTACTCAGTTGCTCCCAGTCAAAAGAAAGCTCGGCTTTTACGAGTGGACTAGTCGACTTCGGAGTCATATTAATCCAACCGGCACCGTCTTACTTCAGCTGGAGAATACAATGCAGATGTCCCTGTAGgtttaaaccgctgatca Ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggccgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccctacaggggttcctggctctgctct
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29	1600	GCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTCCTGCAGGTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGATAGCTGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACCAAACCAAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGGCGGGTACATGAAAATAGCTAACGTTGGGCCAAACAGGATATCTGCGGTGAGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGGGGCCAAGAACAGATGGTCACCGCAGTTTCGGCCCCGGCCCGAGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATATGGCCCAACCCTCAGCAGTTTCTTAAGACCCATCAGATGTTTCCAGGCTCCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGCGCCTTATTTGAATTAACCAATCAGCCTGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTTCCCGAGCTCTATAAAAGAGCTCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCTGATCAGTACTACTAGTTGCCACCATGGGGTCCACGGCCATCCTTGCTCTGCTTCTAGCAGTTCTGCAAGGTGTCTGTGCTTTGGATAATGGATTAGCAAGGACTCCTACCATGGGGTGGTTACATTGGGAACGGTTTATGTGTAATCTGGACTGTCAGGAGGAGCCTGACAGTTGTATAAGCGAGAAGCTGTTCATGGAGATGGCCGAGCTTATGGTTTCAGAGGGATGGAAAGACGCTGGCTACGAATACCTCTGTATAGATGACTGTTGGATGGCTCCGCAGAGGGATTCAGAAGGGCGGCTCCAGGCCGATCCTCAAAGGTTCCCACATGGGATTCGCCAGCTGGCCAATTACGTTCACAGTAAGGGACTGAAACTCGGGATCTACGCCGATGTTGGTAACAAAACCTGCGCGGGGTTCCCTGGAAGCTTTGGCTATTACGACATTGACGCTCAGACCTTCGCCGACTGGGGCGTGGACTTACTGAAGTTTGACGGGTGTTACTGCGATTCTCTGGAAAACTTAGCTGATGGATACAAACATATGTCCCTGGCCCTGAACCGGACTGGACGCTCTATCGTGTATTCCTGCGAGTGGCCCTTGTATATGTGGCCTTTTCAGAAGCCAAATTACACTGAAATTCGCCAGTACTGTAATCACTGGCGGAATTTTGCCGACATCGATGATAGTTGGAAGAGCATAAAGAGCATTTTGGATTGGACCTCCTTTAATCAGGAACGTATTGTAGATGTTGCTGGACCCGGCGGGTGGAATGATCCTGACATGCTGGTGATCGGCAACTTCGGACTGAGTTGGAATCAGCAGGTAACCCAGATGGCACTGTGGGCGATTATGGCCGCTCCTCTCTTTATGTCTAACGATCTGCGGCACATTTCTCCTCAAGCGAAGGCTCTGCTTCAGGATAAGGATGTGATTGCTATAAACCAGGATCCACTGGGAAAGCAGGGGTACCAACTCCGGCAGGGAGACAACTTCGAGGTGTGGGAACGCCCACTCAGCGGTCTCGCTTGGGCCGTGGCAATGATTAATCGACAGGAGATTGGCGGACCAAGATCCTACACCATTGCTGTGGCTTCCTTGGGCAAAGGAGTTGCTTGTAATCCCGCCTGCTTTATTACTCAGCTGCTCCCTGTGAAGAGAAAGCTCGGTTTCTACGAATGGACCTCCCGGCTGCGGTCACACATCAACCCAACAGGTACCGTACTCCTGCAGTTGGAAAATACCATGCAGATGTCCTTGAAAGATTGACTACTCTGGCGTCGTGAGGGAGTTTAAACCGCTGATCACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGCCCGGGCAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCCGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCAGCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGTCCCCAGTGCTATCTGGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGGCAAGCCCAGGAGAGGCGCTCAGGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCTCTTCAGACTGAG

圖1顯示按照本發明之某些實施例的用於靶向整合之兩個插入位點的示意圖。圖1A顯示染色體19上人類AAVS1基因座處GLA基因之插入。此靶向構築體之插入物大小大致為3700 bp。圖1B顯示染色體3上人類ROSA26基因座處GLA基因之插入。

圖2顯示使用Cas9-AAV6介導之整合編輯以表現a-GAL蛋白型式的人類B細胞基因之α-GAL活性(1137 =野生型(WT) GLA (SEQ ID No. 9))；1138 =具有羧基端兩種白胺酸(LL)截短之GLA (SEQ ID No. 10)；1139 =具有LL截短及免疫球蛋白κ鏈(可變3-5)信號肽之GLA (SEQ ID No. 13)；1140 =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA (SEQ ID No. 11))。圖2A顯示在AAVS1基因座處插入之後的α-GAL活性。圖2B顯示在ROSA26基因座處插入之後的α-GAL活性。在所用培養條件下，周邊血液B細胞經活化且一些分化成漿母細胞(PB)及漿細胞(PC)。當與游離型AAV表現相比時，經編輯以表現人類GLA之周邊血液B細胞顯示顯著增強之α-GAL活性，指示整合。

圖3顯示經編輯以表現α-GAL蛋白之各種型式的活化B細胞以及分化成PB及PC之周邊血液細胞的α-GAL活性(1137 =野生型(WT) GLA (SEQ ID No. 9)；1138 =具有羧基端兩種白胺酸(LL)截短之GLA (SEQ ID No. 10)；1140 =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA (SEQ ID No. 11)；1159 =具有LL截短及輕鏈信號肽之GLA)。

圖4顯示經編輯以表現α-GAL蛋白之兩種型式的來自五個不同健康供體(供體A-E)之分化成PB的周邊血液細胞中之α-GAL活性，(供體A，1137 =經編輯之野生型GLA (SEQ ID No. 9)；供體A-E，1140 =具有LL截短及重鏈信號肽的經編輯之GLA (SEQ ID No. 11))。

圖5顯示活化B細胞以及分化成PB及PC之周邊血液細胞中的α-GAL活性。人類B細胞在含有CD40L、CpG、IL2、IL10、IL15及IL21之培養基中活化3天。在分離後第3天進行基因編輯(1140 =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA (SEQ ID No. 11))且細胞在相同培養基中再擴增6天。隨後，擴增之B細胞在含有IL2、IL6、IL10、IL15、IL21之培養基中培養3天以獲得漿母細胞與B細胞之混合物。為了促進PC分化，細胞在補充有IL6、IL15、IL21及IFNa2b之培養基中培養3天。對於此實驗，IFNa2b濃度為15 ng/ml且細胞密度維持在0.6 M/mL。在此等條件下，當與經編輯之活化B細胞及未經編輯之模擬物及AAV轉導細胞相比，α-GAL活性在分化成PB及PC的經編輯之周邊血液細胞之間類似。

圖6顯示分化成PB的經編輯之人類周邊血液細胞中的α-GAL活性。當與游離型(AAV)表現相比時，經編輯以表現人類GLA之B細胞(在圖6中標記為「經編輯」，之後為構築體編號)顯示顯著增強之α-GAL活性。經密碼子最佳化之構築體1509 (SEQ ID No. 18)及1510 (SEQ ID No. 19)顯示與其他人類α-GAL表現構築體相比顯著增強之α-GAL活性(1501 =具有C端處4個胺基酸截短及重鏈信號肽之GLA；1509 (SEQ ID No. 18)、1510 (SEQ ID No. 19)、1511 (SEQ ID No. 23) =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA序列的3種不同密碼子最佳化)。

圖7A顯示α-GAL進入細胞之機制。磷酸化α-GAL結合M6P受體(M6P-R)且內化於溶酶體中。圖7B顯示來源於法布瑞氏症患者之纖維母細胞中之細胞內α-GAL含量的恢復。當與單獨的WT纖維母細胞及法布瑞氏症纖維母細胞兩者相比時，用來自分泌WT (1002，SEQ ID No. 5) α-GAL或截短α-GAL (1067，SEQ ID No. 7)之293細胞之濃縮上清液培養的纖維母細胞顯示增加之α-GAL活性。

圖8顯示來自經編輯之B細胞的α-GAL蛋白之活體內表現。NSG小鼠經由3×10 ⁶個總CD4+ T細胞之授受性轉移進行人源化。CD4+ T細胞轉移後五天，將30×10 ⁶活化之經編輯B細胞(1140 =具有LL截短及重鏈信號肽之GLA (SEQ ID No. 11))輸注至人源化小鼠中。圖8A顯示自B細胞轉移之後3天及每10天直至100天收集之血漿樣品量測的α-GAL酶活性。圖8B顯示使用ELISA自取自第3天、第10天及第20天之相同NSG小鼠之血漿的α-GAL蛋白表現。

圖9顯示在使用靶向AAV1基因座之核糖核蛋白質(RNP)經由核轉染遞送至B細胞且經由重組AAV6 (rAAV6)轉導遞送至GLA cDNA而編輯的周邊血液人類B細胞基因中的基因編輯效率(圖9A)及中靶(on-target) GLA整合(圖9B)。使用下文所描述之方法培養經工程改造之B細胞，且提取基因體DNA以使用數位PCR分析量測位點特異性突變之效率(圖9A)及靶向整合頻率(圖9B) (n=3個健康供體)。

圖10顯示經最佳化之單嚮導RNA在無脫靶(off-target)事件之情況下介導有效的中靶基因編輯。經由核轉染將靶向AAV1基因座之RNP遞送至B細胞中，且提取基因體DNA以使用數位PCR分析來量測位點特異性突變之效率。效率係使用最初設計之sgRNA (圖10A，n=4，SEQ ID No. 14 GGGGCCACTAGGGACAGGAT)及經最佳化之sgRNA (圖10B，n= 3，SEQ ID No. 24，CCTCTAAGGTTTGCTTACGA)來量測。

圖11顯示密碼子最佳化對活體外α-GAL活性之影響。使用各種GLA-cDNA序列(圖11A (SEQ ID No. 11)及圖11B (SEQ ID No. 25))編輯人類B細胞且培養12天。在第9天及第12天，收集細胞培養物上清液，且評估細胞計數及存活率。使用活性分析定量功能性、分泌之α-GAL且將結果標準化至細胞計數。

圖12顯示對自人類B細胞分離之基因體DNA的嚮導-SEQ分析。對自經安全港(safe harbor)特異性RNP處理之人類B細胞分離的基因體DNA進行嚮導-SEQ分析。藉由併入雙股寡去氧核苷酸(dsODN)來鑑別中靶/脫靶位點。

圖13A顯示各種離體B細胞工程改造及培養程序之概述。圖13B顯示每2天監測之未經編輯之B細胞數目的動力學(n= 4個健康供體)。

圖14顯示活體外調節之後的B細胞譜系。圖14A顯示使用流式細胞量測術監測之各種細胞群體，記憶B細胞(CD27+IgD-)、漿母細胞(PB) (CD27+CD38+ CD20-)及漿細胞(PC) (CD27+CD38+ CD20- CD138+)群體。圖14B顯示對B細胞群體中之GLA轉錄物的PrimeFlow分析。

圖15顯示活體內持續的超生理α-GAL血漿含量。人類B細胞按所描述經工程改造及培養。將經GLA編輯之B細胞授受性轉移至NSG小鼠中，該等小鼠在經GLA編輯之B細胞的授受性轉移之前，用CD4+ T細胞之授受性轉移進行預調節。經由對血漿樣品之酶活性分析(n= 2個健康供體)每7-10天監測循環α-GAL含量。

圖16顯示活體內將授受性轉移之經基因工程改造之B細胞移植於小鼠中。將經工程改造之人類B細胞授受性轉移至CD4+ T細胞人源化NSG小鼠中。代表性螢光素酶影像顯示經工程改造之細胞最初在骨髓中之早期移植(圖16A)。自多個鼠類組織分離出移植之B細胞且使用流式細胞量測術評估細胞表型且繪製相對比例(n=4隻小鼠) (圖16B)。

圖17顯示對來自法布瑞氏症患者之PBMC的患者衍生之經工程改造之B細胞進行編輯之影響的特徵。B細胞經由CD19+正向選擇(positive selection)自法布瑞氏症患者之PBMC分離，且在含有CD40L、CpG、IL-2、IL-10、IL-15及IL-21之培養基中活化3天。在培養之第3天，使用經由電穿孔遞送之Cas9/sgRNA及藉由活性酶GLA (1606)之AAV6轉導進行基因編輯，接著再培養7天。經工程改造之B細胞在上文描述之相同培養基中再擴增7天。圖17A顯示法布瑞氏症經編輯之B細胞能夠擴增及生長。圖17B顯示法布瑞氏症B細胞具有成功整合。圖17C顯示在與未經編輯之對照物相比時，經GLA編輯之法布瑞氏症細胞顯示α-GAL活性酶之增加之分泌。

圖18顯示總CD4+及記憶CD4+ T細胞兩種小鼠模型中隨時間推移之α-GAL增加的全身性含量。NSG小鼠經由總人類CD4+細胞或記憶人類CD4+細胞以及經編輯之B細胞(1140，SEQ ID No. 11)之授受性轉移進行人源化，且評估α-GAL活性。當與注射生理鹽水之小鼠相比時，經編輯以表現人類GLA之周邊血液B細胞在兩種小鼠模型(記憶CD4+及總CD4+)中顯示顯著增強之α-GAL活性。

圖19顯示記憶CD4+ T細胞小鼠模型並不顯示GvHD之任何症狀。針對體重及GVHD症狀(例如毛髮減少、耳朵/四肢發紅、駝背姿勢)，對依圖18中所描述經人源化的NSG小鼠進行評估。與經生理鹽水處理之小鼠(圖19A)相比，輸注有記憶CD4+ T細胞以及經編輯之B細胞(1140，SEQ ID No. 11)的小鼠(圖19B)顯示無體重或GVHD症狀之差異。相比之下，輸注有總CD4+ T細胞以及經編輯之B細胞(1140，SEQ ID No. 11)的小鼠顯示體重降低及/或表現出GVHD症狀(圖19C)。

圖20顯示在供體1 (圖20A)及供體2 (圖20B)中使用活化B細胞及分化成PB之周邊血液細胞中的各種經密碼子最佳化之構築體編輯之人類PB中的α-GAL活性。當與游離型(AAV)表現相比時，經編輯以表現人類GLA之B細胞(「經編輯」)顯示顯著增強之α-GAL活性。構築體1482為原始cDNA序列(1140，SEQ ID No. 11)。在五個經密碼子最佳化之構築體(1588、1598、1599、1600及1606)中，與活化B細胞相比及與構築體1482相比，構築體1606及1599在PB細胞中顯示增強之α-GAL活性。

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Claims (112)

1. 一種治療性蛋白，其包含經修飾之人類α-GAL蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾： a. 缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及 b. 用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。
2. 如請求項1之治療性蛋白，其中該信號肽為重鏈Ig信號肽。
3. 如請求項1之治療性蛋白，其中該信號肽為輕鏈Ig信號肽。
4. 如請求項1之治療性蛋白，其中該治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列。
5. 如請求項1之治療性蛋白，其中該治療性蛋白包含與選自SEQ ID NO: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。
6. 如請求項1之治療性蛋白，其中該治療性蛋白包含與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
7. 如請求項1之治療性蛋白，其中該治療性蛋白包含選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列。
8. 如請求項1之治療性蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
9. 如請求項1之治療性蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
10. 如請求項1之治療性蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
11. 如請求項1之治療性蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。
12. 一種包含治療性蛋白之經工程改造之人類B細胞，其中該治療性蛋白包含經修飾之人類GLA，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾： a. 缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及 b. 用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。
13. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經工程改造之B細胞進一步包含編碼該治療性蛋白之核酸序列，且其中該核酸序列已插入至AAVS1或人類ROSA26基因座中。
14. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該信號肽為重鏈Ig信號肽。
15. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該信號肽為輕鏈Ig信號肽。
16. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
17. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
18. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
19. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 2-4之核酸序列編碼。
20. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
21. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
22. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
23. 如請求項12之經工程改造之B細胞，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。
24. 如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中基因已插入至人類AAVS1基因座中。
25. 如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中基因已插入至人類ROSA26基因座中。
26. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中至少20%之該細胞群體表現該治療性蛋白。
27. 如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中該B細胞為CD20+。
28. 如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中該B細胞為CD20-。
29. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。
30. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。
31. 如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中該B細胞為漿母細胞。
32. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。
33. 如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中該細胞為漿細胞。
34. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項12至22中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。
35. 一種產生表現治療性蛋白之經工程改造之B細胞的方法，該方法包含向人類B細胞遞送： a. RNA嚮導之核酸酶； b. 靶向人類基因體上之基因座的gRNA；及 c. 包含編碼治療性蛋白之核酸序列的構築體，其中該治療性蛋白包含經修飾之人類α-GAL蛋白。
36. 如請求項35之方法，其中將該RNA嚮導之核酸酶及gRNA以RNP遞送至該B細胞。
37. 如請求項35之方法，其中將該RNA嚮導之核酸酶及gRNA以奈米粒子遞送至該B細胞。
38. 如請求項35之方法，其中經由電穿孔將該RNA嚮導之核酸酶及gRNA遞送至該B細胞。
39. 如請求項35之方法，其中使用病毒載體將該構築體遞送至該B細胞。
40. 如請求項35之方法，其中將該構築體以雙股DNA遞送至該B細胞。
41. 如請求項35之方法，其中該RNA嚮導之核酸酶包含SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 24之胺基酸序列。
42. 如請求項35之方法，其中該RNA嚮導之核酸酶包含SEQ ID NO. 15之胺基酸序列。
43. 如請求項35之方法，其中靶向構築體包含選自由SEQ ID NO. 9-13、18-19及25-29組成之群的核酸序列。
44. 如請求項35至43中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為CD20-。
45. 如請求項35至43中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為CD20+。
46. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項35至43中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。
47. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項35至43中任一項之經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。
48. 如請求項35至43中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為漿母細胞。
49. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項35至43中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。
50. 如請求項35至43中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為漿細胞。
51. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項35至43中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。
52. 如請求項35至45中任一項之方法，其中該細胞群體包含漿母細胞、漿細胞或漿母細胞及漿細胞兩者。
53. 一種產生表現治療性蛋白之經工程改造之B細胞的方法，該方法包含向人類B細胞遞送： a. RNA嚮導之核酸酶； b. 靶向AAVS1基因之gRNA，其中該gRNA包含SEQ ID NO. 14、15或24之核酸序列；及 c. 包含編碼治療性蛋白之核酸序列以及左同源臂及右同源臂之構築體；其中該構築體包含選自由SEQ ID NO. 9-13及18-19組成之群的核酸序列， 其中該經工程改造之B細胞表現該治療性蛋白。
54. 一種治療有需要之患者的方法，其包含向該患者投與經工程改造之人類B細胞，其中該經工程改造之人類B細胞已經編輯以表現編碼人類α-GAL蛋白之治療性蛋白。
55. 如請求項54之方法，其中該治療性蛋白包含經修飾之人類GLA，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾： a. 缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及 b. 用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。
56. 如請求項55之方法，其中該信號肽為重鏈Ig信號肽。
57. 如請求項55之方法，其中該信號肽為輕鏈Ig信號肽。
58. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
59. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
60. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
61. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 2-4之核酸序列編碼。
62. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
63. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
64. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
65. 如請求項55之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。
66. 如請求項55至65中任一項之方法，其中編碼該治療性蛋白之基因已插入至人類AAVS1基因座中。
67. 如請求項55至65中任一項之方法，其中編碼該治療性蛋白之基因已插入至人類ROSA26基因座中。
68. 如請求項55至65中任一項之方法，其中至少20%之該細胞群體表現該治療性蛋白。
69. 如請求項55至65中任一項之方法，其中該細胞群體包含呈CD20+之細胞。
70. 如請求項55至65中任一項之方法，其中該細胞群體包含呈CD20-之細胞。
71. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項55至65中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。
72. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項55至65中任一項之經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。
73. 如請求項55至65中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為漿母細胞。
74. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項55至65中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。
75. 如請求項55至65中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為漿細胞。
76. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項55至65中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。
77. 如請求項55至65中任一項之方法，其中該細胞群體包含漿母細胞、漿細胞或漿母細胞及漿細胞兩者。
78. 一種治療有需要之患者的方法，其包含向該患者投與經工程改造之人類B細胞，其中該人類B細胞包含由基因編碼之治療性蛋白，其中該治療性蛋白包含經修飾之人類α-GAL蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾， a. 缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及 b. 用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。
79. 如請求項78之方法，其中編碼該治療性蛋白之核酸序列已插入至AAVS1或人類ROSA26基因座中。
80. 如請求項78之方法，其中該信號肽為重鏈Ig信號肽。
81. 如請求項78之方法，其中該信號肽為輕鏈Ig信號肽。
82. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
83. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
84. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
85. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白包含選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列。
86. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
87. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
88. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
89. 如請求項78之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。
90. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該基因已插入至人類AAVS1基因座中。
91. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該基因已插入至人類ROSA26基因座中。
92. 如請求項78至89之方法，其中至少20%之經工程改造之B細胞群體表現該治療性蛋白。
93. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該細胞群體包含呈CD20+之細胞。
94. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該細胞群體包含呈CD20-之細胞。
95. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項78至89中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為CD20+。
96. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項78至89中任一項之經工程改造之B細胞，其中大於80百分比之該等細胞為CD20-。
97. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為漿母細胞。
98. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項78至89中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿母細胞。
99. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該經工程改造之B細胞為漿細胞。
100. 一種細胞群體，其包含複數個如請求項78至89中任一項之經工程改造之B細胞，其中大部分該等細胞為漿細胞。
101. 如請求項78至89中任一項之方法，其中該細胞群體包含漿母細胞、漿細胞或漿母細胞及漿細胞兩者。
102. 一種治療有需要之患者的方法，其包含向該患者投與包含經修飾之人類α-GAL蛋白之治療性蛋白，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白已藉由以下方式修飾， a. 缺失野生型人類α-GAL蛋白之兩個羧基端白胺酸殘基；及 b. 用免疫球蛋白(Ig)信號肽置換該野生型人類α-GAL蛋白之信號肽。
103. 如請求項102之方法，其中該信號肽為重鏈Ig信號肽。
104. 如請求項102之方法，其中該信號肽為輕鏈Ig信號肽。
105. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
106. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
107. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
108. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白包含選自SEQ ID No: 2-4之胺基酸序列。
109. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少85%一致的核酸序列編碼。
110. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。
111. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由與選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列至少95%一致的核酸序列編碼。
112. 如請求項102之方法，其中該經修飾之人類α-GAL蛋白係由選自SEQ ID No: 6-8、16-17或20-21之核酸序列編碼。