TW202423455A

TW202423455A - 用於靜默紡錘體微管（ｓｐｉｎｄｌｅｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ）組裝因子（ａｓｓｅｍｂｌｙｆａｃｔｏｒ）轉錄變異體１的多核苷酸及其應用

Info

Publication number: TW202423455A
Application number: TW112138618A
Authority: TW
Inventors: 蔡坤志
Original assignee: 臺北醫學大學
Priority date: 2022-10-08
Filing date: 2023-10-06
Publication date: 2024-06-16
Also published as: CN120712095A; WO2024076781A1; JP2025535734A; WO2024076781A9; TWI883585B; EP4598545A1

Abstract

本發明係關於抑制包括Wnt、Hedgehog及Notch路徑之發育相關路徑的活性及惡性細胞之侵襲能力以治療原發性或繼發性實體腫瘤的多核苷酸及方法。

Description

用於靜默紡錘體微管(SPINDLE　MICROTUBULE)組裝因子(ASSEMBLY　FACTOR)轉錄變異體1的多核苷酸及其應用

本發明係關於癌症治療領域。特定言之，本發明提供靜默紡錘體微管組裝因子(ASPM)之多核苷酸及其在治療癌症中之用途。

發育信號傳導路徑，包括Wnt、Notch及Hedgehog，調節成人組織中之幹細胞穩態，且在惡性轉化過程中經常失調，導致腫瘤之幹性特性。典型的Wnt信號傳導如β-連環蛋白藉由維持幹細胞增殖及遷移而參與上皮組織穩態，尤其在腸道、乳腺及皮膚中。愈來愈多的證據表明，組織祖細胞及幹細胞中Wnt調節之自體更新過程被癌細胞篡奪以促進惡性進展。一致地，現在有令人信服的資料支持Wnt/β-連環蛋白信號傳導路徑在維持實體腫瘤之癌症幹細胞(CSC)表型中之作用。愈來愈多的證據表明Wnt信號傳導在癌細胞之轉移拓殖中發揮重要作用，且此等實驗研究強調微環境因素與CSC之間的相互作用。舉例而言，基質細胞衍生之細胞外基質(ECM)蛋白骨膜蛋白募集Wnt配位體，從而活化乳癌轉移拓殖中CSC中之Wnt信號傳導。

癌症侵襲性及遠端轉移為患者死亡之主要原因，且瞭解其對於改善實體腫瘤患者之預後至關重要。侵襲性偽足(Invadopodia)或足體(podosome)為存在於免疫細胞及某些癌細胞上之基於肌動蛋白之暫態突起，其藉由蛋白酶之局部蛋白水解活性介導細胞外基質(ECM)之局灶性降解。除直接降解ECM以外，侵襲性偽足亦藉由啟動與ECM之串擾且向周圍基質施加物理力以打開微米尺寸之通道來促進癌細胞侵襲( Iizuka , S ., Leon , R . P ., Gribbin , K . P ., Zhang , Y ., Navarro , J ., Smith , R ., Devlin , K ., Wang , L . G ., Gibbs , S . L ., Korkola , J . 等人 , ( 2020 ). Crosstalk between invadopodia and the extracellular matrix . Eur J Cell Biol 99 , 151122)。侵襲性偽足已被證明存在於活體內，且因此推測其藉由促進內滲及外滲過程在遠端轉移之建立中發揮關鍵作用。根據此等觀察結果，一系列功能研究表明，抑制侵襲性偽足調節因子，包括SRC、PDGFR-α、TKS-5或MENA之特定變異體(MENA ^INV)，可抑制各種癌症模型中之轉移( Eckert, M.A., Lwin, T.M., Chang, A.T., Kim, J., Danis, E., Ohno-Machado, L. 及 Yang, J. (2011). Twist1-induced invadopodia formation promotes tumor metastasis. Cancer Cell 19, 372-386 ； Weidmann, M.D., Surve, C.R., Eddy, R.J., Chen, X., Gertler, F.B., Sharma, V.P. 及 Condeelis, J.S. (2016). Mena(INV) dysregulates cortactin phosphorylation to promote invadopodium maturation. Sci Rep 6, 36142)。

因此，需要用於治療及預防癌症及其轉移之藥物及方法。

本發明提供一種多核苷酸，其包含與具有SEQ ID NO:1中所示之核苷酸序列的ASPM基因之mRNA互補的核苷酸序列；或b)包含與SEQ ID NO: 1互補之核苷酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%序列一致性的連續區段的核苷酸序列。

在一個實施例中，多核苷酸包含與具有SEQ ID NO: 3中所示之核苷酸序列的由人類ASPM基因轉錄變異體1之外顯子18編碼的mRNA互補的核苷酸序列，或包含與SEQ ID NO: 3互補之核苷酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%序列一致性的連續區段的核苷酸序列。

在一些實施例中，如本文所描述之多核苷酸為RNAi。RNAi之實例包括但不限於shRNA、siRNA或dsRNA。

本發明之多核苷酸的某些實施例為siRNA分子，其中該siRNA分子包含：(a)雙螺旋體區；及(b)無懸垂物區或至少一個懸垂物區，其中各懸垂物區含有六個或更少核苷酸，其中該雙螺旋體區由有義區及反義區組成，其中該有義區及該反義區一起形成該雙螺旋體區且該反義區及該有義區各自長度為15-30個核苷酸，且該反義區包含與選自SEQ ID NO: 3、5、7或9之序列互補的序列。

在一些實施例中，如本文所描述之siRNA分子具有反義區及有義區，其各自長度為15-25、15-20或15-18個鹼基。

在一些實施例中，siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 3、5、7或9之序列互補的序列。

在一些實施例中，本文所描述之siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 4相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 5相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。

在某一實施例中，siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 4中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 5中所示之核苷酸序列。

在一些實施例中，本文所描述之siRNA分子包含形成另一雙股RNA二聚體之有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 6相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 7相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。

在某一實施例中，siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 6中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 7中所示之核苷酸序列。

在一些實施例中，本文所描述之siRNA分子包含形成另一雙股RNA二聚體之有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 8相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 9相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。

在某一實施例中，siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 8中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 9中所示之核苷酸序列。

在一些實施例中，siRNA分子具有至少一個懸垂物區或不具有懸垂物區。

在一些實施例中，有義股及反義股中之一或兩者可進一步修飾為經修飾之siRNA。經修飾之核苷酸的實例包括但不限於經2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟胺基磷酸酯、3'端去氧胸腺嘧啶核苷酸、包含非天然鹼基之核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基團之核苷酸及與膽固醇基衍生物及十二烷酸雙癸醯胺基團連接之末端核苷酸。

在一些其他實施例中，經修飾之siRNA之雙股區中約10%至約30%的核苷酸為2'-O-甲基(2'OMe)核苷酸，或經修飾之siRNA之兩股中約10%至約30%的核苷酸為2'-O-甲基(2'OMe)核苷酸。

本發明提供siRNA分子池，其中該池包含一或多個第一siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第二siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第三siRNA分子或其經修飾之siRNA分子及第四siRNA分子或其經修飾之siRNA分子，其中該第一siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 3之序列互補的序列；該第二siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 5之序列互補的序列；該第三siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 7之序列互補的序列；及該第四siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 9之序列互補的序列。

在一些實施例中，池中之siRNA分子包含一或多個第二siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第三siRNA分子或其經修飾之siRNA分子及第四siRNA分子或其經修飾之siRNA分子。

在一些實施例中，池中之siRNA分子包含形成另一雙股RNA二聚體之有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 4、6或8相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 3、5或9相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。

在另一實施例中，池中之siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 4中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 5中所示之核苷酸序列。

在另一實施例中，池中之siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 6中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 7中所示之核苷酸序列。

在另一實施例中，池中之siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 8中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 9中所示之核苷酸序列。

本發明提供一種醫藥組合物，其包含至少一種本文所描述之多核苷酸及醫藥載劑、稀釋劑及/或佐劑。

本發明提供一種奈米粒子，其包含本文所描述之多核苷酸或其任何混合物及脂質奈米粒子(LNP)、脂質體、微胞、病毒體或核酸複合物。

本發明亦提供一種用於抑制個體之惡性腫瘤之生長、局部區域擴散及遠端轉移及/或治療個體之實體腫瘤及/或腫瘤轉移的方法，其包含向該個體投與本文所描述之多核苷酸或其任何混合物、本文所描述之siRNA分子池、本文所描述之醫藥組合物或本文所描述之奈米粒子。

在一些實施例中，人類實體癌為乳癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、PDAC、胃腺癌之硬化亞型及結腸直腸癌(CRC)之「幹/鋸齒狀/間質(SSM)」分子亞型。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2022年10月08日申請之美國臨時申請案第63/414461號之權益，該臨時申請案之揭示內容出於所有目的特此以全文引用之方式併入。

除非另外說明，否則以下術語及片語具有下文提供之含義。

術語「核糖核苷酸」及片語「核糖核酸」(RNA)係指包含至少一個核糖核苷酸單元之經修飾或未經修飾之核苷酸或多核苷酸。核糖核苷酸單元包含連接至核糖基部分之2'位置的羥基，該核糖基部分具有以N-糖苷鍵連接在核糖基部分之1'位置處的含氮鹼基，及允許與另一核苷酸鍵聯或排除鍵聯之部分。

如本文所用，術語「干擾RNA」或「RNAi」或「干擾RNA序列」係指當干擾RNA與目標基因在同一細胞中時，靶向(亦即，靜默、減少或抑制)目標基因表現(亦即，藉由介導與干擾RNA序列互補之mRNA降解)的雙股RNA (亦即，雙螺旋體RNA)。因此，干擾RNA係指由兩個互補股或由單個自互補股形成之雙股RNA。特定言之，RNAi分子係指如本文所揭示之shRNA、siRNA或dsRNA。小髮夾RNA (shRNA)為一種形成剛性髮夾轉角之RNA序列，其可用於藉由RNA干擾來靜默基因表現。shRNA可使用DNA質體、病毒載體或細菌載體遞送至目標細胞。雙股RNA (dsRNA)包含一大類病毒。小干擾RNA (siRNA)為一類雙股RNA分子，其包括兩個獨立股之雙螺旋體，以及可形成包含雙螺旋體區之髮夾結構的單股。siRNA較短(長度一般為約18-30個鹼基對)。siRNA可用於藉由RNA干擾來靜默基因表現。此外，siRNA之長度可有所不同且含有與其反義股中之目標mRNA不同程度的互補性。一些但並非全部siRNA在有義股及/或反義股之5'或3'端具有未配對的懸垂鹼基。

如本文所用，術語「互補核苷酸序列」係指與目標突變基因之mRNA轉錄本區(亦即，目標基因之「對應核苷酸序列」)互補的互補RNA。

如本文所用，賦形劑為醫藥組合物中之非活性成分。賦形劑之實例包括填充劑或稀釋劑、界面活性劑、黏合劑、滑動劑、潤滑劑、崩解劑及其類似物。

如本文所用，術語「實質上一致性」係指在嚴格條件下與參考序列雜交之序列，或在參考序列之指定區域具有指定一致性百分比之序列。

如本文所用，片語「嚴格雜交條件」係指探針通常在核酸之複雜混合物中與其目標子序列雜交，但不與其他序列雜交之條件。嚴格條件與序列相關，且將隨情況不同而不同。較長序列在較高溫度下特異性雜交。關於核酸雜交之詳盡指南見於Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assay」 (1993)。一般而言，嚴格條件經選擇以比特定序列在規定離子強度pH下之熱熔點(Tm)低約5-10℃。Tm為50%與目標互補之探針在平衡時與目標序列雜交的溫度(在規定離子強度、pH及核酸濃度下) (由於目標序列過量存在，在Tm時，50%之探針在平衡時被佔據)。嚴格條件亦可藉由添加去穩定化劑(諸如甲醯胺)來實現。對於選擇性或特異性雜交，正信號為背景之至少兩倍，較佳為背景雜交之10倍。

如本文所用，在兩個或更多個核酸之上下文中，術語「實質上一致」或「實質上一致性」係指使用以下序列比較演算法中之一者或藉由人工比對及目視檢查量測，在比較窗口或指定區域上進行比較及比對以獲得最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比之核苷酸相同(亦即，在指定區域上至少約60%，較佳65%、70%、75%，較佳80%、85%、90%、或95%一致性)。當上下文指出時，此定義亦類似地指代序列之互補序列。較佳地，實質上一致性存在於長度為至少約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75或100個核苷酸之區域上。

術語「轉染」係指將藥劑引入細胞之過程。

片語「抑制目標基因之表現」係指本發明之siRNA分子靜默、減少或抑制目標基因表現之能力。為了檢查基因靜默之程度，使測試樣品(例如，來自表現目標基因之所關注生物體的生物樣品或表現目標基因之培養物中的細胞樣品)與靜默、減少或抑制目標基因表現之siRNA接觸。將測試樣品中目標基因之表現與未與siRNA接觸之對照樣品中目標基因之表現進行比較。對照樣品賦值為100%。當測試樣品相對於對照樣品之測試值為約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或10%時，達成目標基因表現之靜默、抑制或減少。適合的分析法包括例如使用熟習此項技術者已知的技術檢查蛋白質或mRNA含量，諸如點狀墨點、北方墨點、原位雜交、ELISA、免疫沉澱、酶功能以及熟習此項技術者已知的表型分析法。

術語「治療(treatment)」及「治療(treating)」包含對已出現該病況、特別是呈顯性形式之患者的治療性治療。治療性治療可為對症治療，以緩解特定適應症之症狀，或因果治療，以逆轉或部分逆轉適應症之病況或停止或減緩疾病之進展。因此，本發明之組合物及方法可用作例如一段時間內之治療性治療以及用於長期治療。

術語「預防性治療(prophylactically treating)」、「預防性治療(preventively treating)」及「預防」可互換使用且包含治療處於罹患上文所提及之病況風險下的患者，從而降低該風險。

ASPM已被鑑別為Wnt信號傳導路徑之關鍵調節因子。發現在胰臟癌細胞及前列腺癌細胞中，ASPM表現對於細胞對典型Wnt配位體(諸如Wnt-3a)之反應為必不可少的。機理研究表明，ASPM與β-連環蛋白之上游活化因子相互作用，包括散亂蛋白(Dvl)-2或Dvl-3、軸蛋白及蛋白酶活化受體-1 (PAR-1)，且抑制Dvl蛋白之蛋白酶體依賴性降解，從而增加β-連環蛋白之蛋白質豐度水平且加強對其致癌作用重要的典型Wnt信號傳導。ASPM主要經由Dvl之蛋白質穩定化以及DVL在典型及非典型Wnt信號傳導中之作用表現出其致癌及Wnt活化作用，表明ASPM亦可在腺癌細胞或CSC中充當非典型Wnt信號傳導活化劑。發現ASPM及其結合搭配物DVL在各種類型癌細胞之CSC中極大地上調，包括胰臟癌、乳癌、非小細胞肺癌、前列腺癌及肝細胞癌(HCC)。

已預測，正常及惡性人類組織中可能存在ASPM轉錄本之數種推定剪接變異體，其分別編碼由3477個胺基酸(同功異型物1)、1892個胺基酸(同功異型物2)、1389個胺基酸(同功異型物3)及1062個胺基酸(同功異型物4)組成之蛋白質同功異型物 ( Kouprina , N ., Pavlicek , A ., Collins , N . K ., Nakano , M ., Noskov , V . N ., Ohzeki , J ., Mochida , G . H ., Risinger , J . I ., Goldsmith , P ., Gunsior , M . 等人 , ( 2005 ). The microcephaly ASPM gene is expressed in proliferating tissues and encodes for a mitotic spindle protein . Hum Mol Genet 14 , 2155 - 2165)。ASPM同功異型物1之特異性上調以及其預後顯著性使得此同功異型物成為癌症中理想且潛在安全的治療目標。

在一個態樣中，本發明提供一種多核苷酸，其包含與具有SEQ ID NO: 1中所示之核苷酸序列的ASPM基因之mRNA互補的核苷酸序列；b)包含與a)中所示之多核苷酸具有至少70%、至少80%或至少90%序列一致性的連續區段的核苷酸序列。

本發明之多核苷酸可為RNAi分子，諸如shRNA、siRNA、miRNA、dsRNA或反義寡核苷酸(ASO)或其任何衍生物，其與ASPM基因(SEQ ID NO: 1)之mRNA的編碼或非編碼區互補且由此誘導其特異性降解或減少其量。

本發明之多核苷酸亦可與SEQ ID NO: 3中所示之由人類ASPM基因之外顯子18編碼的mRNA互補，使得該多核苷酸僅誘導ASPM之轉錄變異體1之降解或減少其量，但不誘導其他轉錄本變異體之降解或減少其量。

特定言之，本發明之多核苷酸為長度為約15-60、15-50、15-50或15-40個(雙螺旋體)核苷酸，更通常長度為約15-30或15-25個(雙螺旋體)核苷酸且較佳長度為約20-24、21-22或21-23個(雙螺旋體)核苷酸之siRNA(例如，雙股siRNA之各互補序列長度為約15-60、15-50、15-50、15-40、15-30或15-25個核苷酸，較佳長度為約20-24、21-22或21-23個核苷酸，且雙股siRNA之長度為約15-60、15-50、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25個鹼基對，較佳長度為約20-24、21-22或21-23個鹼基對)。siRNA雙螺旋體可包含約1至約4個核苷酸、較佳約2至約3個核苷酸之3'懸垂物及5'磷酸末端。siRNA之實例包括但不限於由兩個獨立的寡核苷酸組裝之雙股多核苷酸分子，其中一股為有義股且另一股為互補反義股；由單個寡核苷酸組裝之雙股多核苷酸分子，其中有義區及反義區藉由基於核酸或基於非核酸之連接子連接；具有髮夾二級結構之雙股多核苷酸分子，該髮夾二級結構具有自互補的有義區及反義區；及具有兩個或更多個環結構及具有自互補的有義區及反義區之莖的環狀單股多核苷酸分子，其中環狀多核苷酸可活體內或活體外加工以產生活性雙股siRNA分子。

在本發明之一個實施例中，siRNA可為雙股的且可包含至少一個平端。舉例而言，siRNA可為兩端均為平端之siRNA；一端為平端且另一端包含5' 2個核苷酸之懸垂物的siRNA；一端為平端且另一端包含3' 2個核苷酸之懸垂物的siRNA；及/或其組合。或者，在此實施例中，引入細胞中之siRNA可為雙股的且各端包含5' 2個核苷酸之懸垂物。在一特定實施例中，懸垂物可包含約1個核苷酸至約5個核苷酸。在另一實施例中，siRNA可為雙股的且包含至少2個懸垂物。懸垂物可包含約1個核苷酸至約5個核苷酸。在一特定實施例中，至少2個懸垂物中之各者包含2個核苷酸。在本發明之此實施例中，siRNA可為兩個3'端均包含2個核苷酸之懸垂物的siRNA；一端包含3' 2個核苷酸之懸垂物且另一端包含5' 2個核苷酸之懸垂物的siRNA；及/或其組合。

siRNA可經修飾以含有合成、天然存在及非天然存在之主鏈殘基或鍵聯以形成類似物，其具有與參考核酸類似的結合特性，且以與參考核苷酸類似之方式代謝。siRNA可根據常識中已知的方法進行修飾，且修飾包括在一或多個核苷酸鹼基中置換或添加一或多個原子或基團。可包含相對於鹼基部分經修飾之核苷酸之修飾類型的一些實例包括但不限於單獨或組合的烷基化、鹵化、硫醇化、胺化、醯胺化或乙醯化鹼基。某些實例包括例如2-丙基腺嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-胺基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷及在5位具有修飾之其他核苷酸、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、5-(2-胺基)丙基尿苷、5-鹵胞苷、5-鹵尿苷、4-乙醯基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鳥苷、7-甲基鳥苷、2,2-二甲基鳥苷、5-甲基胺乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、去氮核苷酸諸如7-去氮-腺苷、6-偶氮基尿苷、6-偶氮基胞苷、6-偶氮基胸苷、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫代鹼基(諸如2-硫代尿苷及4-硫代尿苷及2-硫代胞苷)、二氫尿苷、假尿苷、Q核苷、古嘌苷、萘基及經取代之萘基、任何O-烷基化嘌呤及嘧啶及N-烷基化嘌呤及嘧啶(諸如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮)、苯基及經修飾之苯基(諸如胺基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯)、經修飾之胞嘧啶(其充當G形夾核苷酸)、8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤、5-取代之尿嘧啶及胸嘧啶、氮雜嘧啶、羧基羥基烷基核苷酸、羧基烷基胺基核苷酸及烷基羰基烷基化核苷酸。此類類似物之其他特定實例包括但不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸及肽核酸(PNA)。除非另外指明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指明之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由生成一或多個選定(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來達成。

siRNA之化學修飾包含使結合物連接至siRNA分子。結合物可經由共價連接(諸如可生物降解連接子)連接在siRNA之有義股及/或反義股的5'及/或3'端。結合物亦可例如經由胺基甲酸酯基或其他連接基團連接至siRNA。在某些情況下，結合物為促進siRNA遞送至細胞中之分子。適合於連接至siRNA之結合物分子之實例包括但不限於類固醇(諸如膽固醇)、二醇(諸如聚乙二醇(PEG))、人類血清白蛋白(HSA)、脂肪酸、類胡蘿蔔素、萜烯、膽汁酸、葉酸鹽(例如葉酸、葉酸類似物及其衍生物)、糖(例如半乳糖、半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、葡萄糖、甘露糖、果糖、海藻糖等)、磷脂、肽、能夠介導細胞吸收之細胞受體的配位體及其組合。

siRNA可化學合成或可由質體編碼(例如，轉錄為自動摺疊成具有髮夾環之雙螺旋體的序列)。siRNA亦可藉由用大腸桿菌RNA酶III或切丁酶裂解較長dsRNA (例如長度大於約25個核苷酸之dsRNA)生成。此等酶將dsRNA加工成具有生物活性的siRNA。

實質上一致性係指在嚴格條件下與參考序列雜交之序列，或在參考序列之指定區域具有指定一致性百分比之序列。

對於序列比較，通常一個序列充當參考序列，與測試序列進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較演算法隨後基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。用於比較之序列比對方法為此項技術中眾所周知的。可進行用於比較之序列的最佳比對。

適合於確定序列一致性百分比及序列相似性百分比之演算法的較佳實例為BLAST及BLAST 2.0演算法。BLAST及BLAST 2.0與本文所描述之參數一起使用以確定本發明之核酸及蛋白質之序列一致性百分比。用於執行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開獲得。

一旦鑑別出潛在siRNA序列，就可使用此項技術中已知的多種準則分析該序列。熟習此項技術者應瞭解，可選擇具有前述特徵中之一或多者的序列作為潛在siRNA序列進行進一步分析及測試。亦可設計與siRNA目標部位互補的siRNA序列。

本發明之多核苷酸可操作地連接於控制序列或基因啟動子，其指導該多核苷酸在特定組織及/或細胞類型中之表現。此類控制序列為此項技術中眾所周知的且可藉由熟習此項技術者已知的多種方式中之任一者來構築。

適用於本發明以測定ASPM mRNA之表現的方法包含選自由以下組成之群的分析法：北方墨點法、反轉錄聚合酶鏈反應(PCR)、RNA酶保護分析法、cDNA或寡核苷酸微陣列分析、核苷酸定序或基於探針之數位mRNA剖析技術，諸如NanoString nCounter基因表現系統( Geiss , G . K ., Bumgarner , R . E ., Birditt , B ., Dahl , T ., Dowidar , N ., Dunaway , D . L ., Fell , H . P ., Ferree , S ., George , R . D ., Grogan , T . 等人 , ( 2008 ). Direct multiplexed measurement of gene expression with color - coded probe pairs . Nat Biotechnol 26 , 317 - 325)。

適用於本發明以測定ASPM蛋白之表現的方法包含選自由以下組成之群的分析法：西方墨點法、ELISA、免疫沉澱、麩胱甘肽-S-轉移酶融合蛋白下拉、螢光各向異性、螢光偏振、螢光共振能量轉移、分析型超速離心、表面電漿子共振及等溫滴定量熱法。

在一個實施例中，本發明提供至少一種siRNA之池或套組，較佳呈套組或治療試劑形式，其中各siRNA之一股，即有義股包含與目標mRNA內之序列實質上類似的序列。相反股，即反義股，將較佳包含與目標mRNA之序列實質上互補的序列。更佳地，各siRNA之一股將包含與目標mRNA中所含之序列一致的序列。最佳地，各siRNA之長度為15-25、15-20或15-18個鹼基對，且各siRNA之一股將與目標mRNA之一部分100%互補。藉由使用池或套組增加針對特定目標之siRNA的數目，吾人能夠增加包括至少一種具有令人滿意的功能的siRNA的可能性，以及受益於累加或協同效應。此外，當針對單個基因之兩種或更多種siRNA單獨不具有令人滿意的功能水平時，若組合，則其可令人滿意地促進目標信使RNA之降解且成功地抑制轉譯。

前述siRNA池或套組內之siRNA雙螺旋體可對應於特定mRNA內之重疊序列或mRNA之非重疊序列。然而，較佳地，其對應於非重疊序列。此外，可隨機選擇各siRNA，或可根據上文所論述之準則選擇一或多種siRNA以最大化siRNA之有效性。

在本發明之一實施例中，抗腫瘤試劑或組合物可藉由直接轉染或經由表現載體轉染及表現而遞送至細胞、惡性腫瘤或個體。適當的表現載體包括哺乳動物表現載體及病毒載體，其中已選殖編碼敏化試劑之多核苷酸與包括啟動子之適當調控序列，使得該敏化試劑在細胞或惡性腫瘤中表現。適合的啟動子可為組成性或發育特異性啟動子。轉染遞送可藉由此項技術中已知的脂質體轉染試劑(例如，Xtreme轉染試劑，Roche, Alameda, CA；Lipofectamine調配物，Invitrogen, Carlsbad, CA)來達成。由陽離子脂質體介導之遞送及直接遞送為高效的。另一種可能的遞送模式為使用針對目標細胞之細胞表面標記的抗體進行靶向遞送。

對於轉染，包含一或多種核酸分子(在載體內或無載體)之組合物可包含用於向個體投與之遞送媒劑(包括脂質體)、載劑及稀釋劑及其鹽，及/或可存在於醫藥學上可接受之調配物中。siRNA分子之遞送亦描述於若干美國專利公開案中，包括例如2006/0019912、2006/0014289、2005/0239687、2005/0222064及2004/0204377，其各自的揭示內容特此以引用之方式併入本文中。核酸分子可藉由熟習此項技術者已知的多種方法投與細胞，包括但不限於囊封在脂質體中、藉由離子導入療法、藉由電穿孔或藉由併入其他媒劑中，包括可生物降解聚合物、水凝膠、環糊精(參見例如Gonzalez等人, 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074；Wang等人, 國際PCT公開案第WO 03/47518號及第WO 03/46185號)、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)及PLCA微球體(參見例如美國專利第6,447,796號及美國專利申請公開案第2002/130430號)、可生物降解奈米膠囊及生物黏附微球體，或藉由蛋白質載體(O'Hare及Normand, 國際PCT公開案第WO 00/53722號)。在另一實施例中，本發明之核酸分子亦可與聚乙亞胺及其衍生物調配或複合，諸如聚乙亞胺-聚乙二醇-N-乙醯半乳胺糖(PEI-PEG-GAL)或聚乙亞胺-聚乙二醇-三-N-乙醯半乳胺糖(PEI-PEG-triGAL)衍生物。

本發明使用之脂質體轉染試劑之實例包括例如：CellFectin，陽離子脂質N,NI,NII,NIII-四甲基-N,NI,NII,NIII-四棕櫚醯-精胺及二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE) (GIBCO BRL)之1:1.5 (M/M)脂質體調配物；Cytofectin GSV，陽離子脂質及DOPE (Glen Research)之2:1 (M/M)脂質體調配物；DOTAP (N-[1-(2,3-二油醯氧基)-N,N,N-三甲基-甲基硫酸銨) (Boehringer Manheim)；Lipofectamine，聚陽離子脂質DOSPA及中性脂質DOPE (GIBCO BRL)之3:1 (M/M)脂質體調配物；及(5) siPORT (Ambion)；HiPerfect (Qiagen)；X-treme GENE (Roche)；RNAicarrier (Epoch Biolabs)及TransPass (New England Biolabs)。

許多類型之人類實體癌，諸如乳癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、PDAC、胃腺癌之硬化亞型及結腸直腸癌(CRC)之「幹/鋸齒狀/間質(SSM)」分子亞型，以稱為「促結締組織增生反應」之明顯基質反應為特徵( Isella , C ., Terrasi , A ., Bellomo , S . E ., Petti , C ., Galatola , G ., Muratore , A ., Mellano , A ., Senetta , R ., Cassenti , A ., Sonetto , C . 等人 , ( 2015 ). Stromal contribution to the colorectal cancer transcriptome . Nat Genet 47 , 312 - 319)，其構成癌症治療劑高效轉運至腫瘤中之主要障礙。最近，兩種奈米粒子調配之化學療法，包括白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)及脂質體囊封型伊立替康，已被證明延長晚期PDAC患者之存活期。兩種試劑均可顯著增加所治療腫瘤中化學治療劑之含量( Wang - Gillam , A ., Li , C . P ., Bodoky , G ., Dean , A ., Shan , Y . S ., Jameson , G ., Macarulla , T ., Lee , K . H ., Cunningham , D ., Blanc , J . F . 等人 , ( 2016 ). Nanoliposomal irinotecan with fluorouracil and folinic acid in metastatic pancreatic cancer after previous gemcitabine - based therapy ( NAPOLI - 1 ): a global , randomised , open - label , phase 3 trial . Lancet 387 , 545 - 557)，表明奈米粒子調配物為一種經臨床驗證之改善促結締組織增生癌症之治療功效的方法。在肝臟疾病中，非經腸投與脂質奈米粒子(LNP)調配之對運甲狀腺素蛋白具有特異性之siRNA (Patisiran, Alnylam Pharmaceuticals, MA, USA)已被證明減少遺傳性運甲狀腺素蛋白介導之澱粉樣變性患者肝臟產生之高達86.8%的運甲狀腺素蛋白，且因此成為第一個經臨床批准之RNAi藥物 ( Adams , D ., Gonzalez - Duarte , A ., O ' Riordan , W . D ., Yang , C . C ., Ueda , M ., Kristen , A . V ., Tournev , I ., Schmidt , H . H ., Coelho , T ., Berk , J . L . 等人 , ( 2018 ). Patisiran , an RNAi Therapeutic , for Hereditary Transthyretin Amyloidosis . N Engl J Med 379 , 11 - 21)。此外，奈米粒子遞送之siRNA療法，諸如攜帶靶向核糖核苷酸還原酶M2 (RRM2)之siRNA的基於環糊精聚合物之奈米粒子及攜帶靶向VEGF-A及驅動蛋白紡錘體蛋白(KSP)之siRNA的脂質奈米粒子，已顯示出有前景的藥效學及耐受性以及在1期臨床試驗中在一些經治療患者中之抗腫瘤功效。此外，靶向腫瘤驅動基因諸如BCR-ABL之siRNA的全身遞送在肝細胞癌(HCC)鼠類正位模型中亦顯示出顯著的治療功效( Tabernero , J ., Shapiro , G . I ., LoRusso , P . M ., Cervantes , A ., Schwartz , G . K ., Weiss , G . J ., Paz - Ares , L ., Cho , D . C ., Infante , J . R ., Alsina , M . 等人 , ( 2013 ). First - in - humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement . Cancer Discov 3 , 406 - 417)。與微小RNA不同，siRNA僅靜默一個mRNA目標，因此其基因及生物作用具有高度特異性且與較少脫靶效應相關，如最近批准的靶向遺傳性澱粉樣變性患者之運甲狀腺素蛋白的同類第一個脂質體siRNA所例示( Adams , D ., Gonzalez - Duarte , A ., O ' Riordan , W . D ., Yang , C . C ., Ueda , M ., Kristen , A . V ., Tournev , I ., Schmidt , H . H ., Coelho , T ., Berk , J . L . 等人 , ( 2018 ). Patisiran , an RNAi Therapeutic , for Hereditary Transthyretin Amyloidosis . N Engl J Med 379 , 11 - 21)。在諸如人類惡性腫瘤之複雜的多基因疾病中，實施基於siRNA之療法需要鑑別充當疾病病理之關鍵調節因子的「驅動」基因。

治療性基因遞送至腫瘤細胞或惡性組織中可藉由使用非病毒媒劑(諸如基於脂質及聚合材料)來達成。舉例而言，一種稱為scL之腫瘤靶向免疫脂質體奈米複合物，其中治療性分子有效負載囊封於陽離子脂質體內，其表面裝飾有抗運鐵蛋白受體(TfR)單鏈抗體片段，經設計以經由其表面上高度表現之TfR靶向腫瘤細胞。一系列研究表明，scL奈米複合物可活體外及活體內將包括質體DNA、siRNA及小分子之各種有效負載特異性遞送至原發性及轉移性腫瘤細胞及甚至癌症幹細胞。在諸如乳癌、惡性神經膠質瘤、頭頸癌及胰臟癌之各種人類腫瘤的臨床前模型中，用稱為TfRscFv-Lip p53或「SGT-53」之scL免疫脂質體奈米粒子囊封之p53質體DNA的全身性投與已被證明誘導外源性p53之腫瘤特異性表現，且由此增強化學療法及放射療法之功效。重要的是，SGT-53之臨床適用性已在最近的1期臨床試驗中得到證明，該試驗表明研究參與者在所測試之治療劑量下具有良好的耐受性。值得注意的是，腫瘤組織之PCR分析揭示外源性p53轉殖基因之明確存在，為scL奈米粒子作為有效的全身遞送媒劑以將治療性基因有效地遞送至人類腫瘤提供堅實的支持。

AlCana Technologies (Vancouver, BC)採用合理設計方法生成一種適用於活體內向肝臟或腫瘤組織遞送諸如siRNA之寡核苷酸的脂質奈米粒子(LNP) ( Jayaraman , M ., Ansell , S . M ., Mui , B . L ., Tam , Y . K ., Chen , J ., Du , X ., Butler , D ., Eltepu , L ., Matsuda , S ., Narayanannair , J . K . 等人 , ( 2012 ). Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo . Angew Chem Int Ed Engl 51 , 8529 - 8533)。該LNP調配物由四種脂質組分組成，包括與siRNA複合之可離子化陽離子胺基脂質DLin-MC3-DMA、兩性磷脂二硬脂醯-磷脂醯膽鹼(DSPC)、膽固醇及包覆脂質聚(乙二醇)脂質1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-甲氧基(聚(乙二醇)) (DMG-PEG)，以50:10:38.5:1.5之莫耳比混合。DLin-MC3-DMA LNP之粒徑在70-90 nm範圍內( Jayaraman , M ., Ansell , S . M ., Mui , B . L ., Tam , Y . K ., Chen , J ., Du , X ., Butler , D ., Eltepu , L ., Matsuda , S ., Narayanannair , J . K . 等人 , ( 2012 ). Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo . Angew Chem Int Ed Engl 51 , 8529 - 8533)，此與延長的循環時間相關且允許其經由滲漏的內皮細胞窗孔(估計孔徑為380-780 nm)滲漏至腫瘤組織中，此現象稱為「增強滲透及滯留(EPR)」效應( Agarwal , R . 及 Roy , K . ( 2013 ). Intracellular delivery of polymeric nanocarriers : a matter of size , shape , charge , elasticity and surface composition . Ther Deliv 4 , 705 - 723)。

基於DLin-MC3-DMA之LNP形成已用於Alnylam Pharmaceuticals開發的第一個經FDA批准之siRNA藥物帕替斯喃(patisiran) (Onpattro)。其亦用於全身遞送靶向腫瘤驅動基因諸如BCR-ABL、VEGF-A及驅動蛋白紡錘體蛋白(KSP)之siRNA，其在慢性骨髓白血病(CML)小鼠模型或肝細胞癌(HCC)鼠類正位模型中顯示出顯著的治療功效。使用基於DLin-MC3-DMA之LNP囊封之siRNA的全身遞送在I期臨床試驗中已被證明是安全的，且除了一些輸注相關反應及短暫的促炎性細胞介素誘導之外，總體上耐受性良好( Tabernero , J ., Shapiro , G . I ., LoRusso , P . M ., Cervantes , A ., Schwartz , G . K ., Weiss , G . J ., Paz - Ares , L ., Cho , D . C ., Infante , J . R ., Alsina , M . 等人 , ( 2013 ). First - in - humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement . Cancer Discov 3 , 406 - 417)。

最近，已描述下一代基於LNP之遞送媒劑，其含有以60:40:1之莫耳比混合的高度可生物降解的可離子化陽離子脂質CL4H6、膽固醇及1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油,甲氧基乙二醇2000醚(PEG-DMG2000) ( Sato , Y ., Hashiba , K ., Sasaki , K ., Maeki , M ., Tokeshi , M . 及 Harashima , H . ( 2019 ). Understanding structure - activity relationships of pH - sensitive cationic lipids facilitates the rational identification of promising lipid nanoparticles for delivering siRNAs in vivo . J Control Release 295 , 140 - 152)。CL4H6係基於pH敏感性陽離子脂質之親水性頭基及疏水性尾部的結構-活性關係研究而系統衍生，且在小鼠因子VII模型中具有比基準脂質DLin-MC3-DMA更高的活體內基因靜默活性(50%有效劑量(ED50)：0.0025 mg/kg與0.005 mg/kg) ( Jayaraman , M ., Ansell , S . M ., Mui , B . L ., Tam , Y . K ., Chen , J ., Du , X ., Butler , D ., Eltepu , L ., Matsuda , S ., Narayanannair , J . K . 等人 , ( 2012 ). Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo . Angew Chem Int Ed Engl 51 , 8529 - 8533 ； Sato , Y ., Hashiba , K ., Sasaki , K ., Maeki , M ., Tokeshi , M . 及 Harashima , H . ( 2019 ). Understanding structure - activity relationships of pH - sensitive cationic lipids facilitates the rational identification of promising lipid nanoparticles for delivering siRNAs in vivo . J Control Release 295 , 140 - 152)。儘管DLin-MC3-DMA被用於Alnylam Pharmaceuticals開發的第一個經FDA批准之siRNA藥物帕替斯喃(Onpattro)，但當以高劑量範圍(＞ 3 mg/kg)給與小鼠時，其可導致肝毒性及顯著的體重減輕 ( Jayaraman , M ., Ansell , S . M ., Mui , B . L ., Tam , Y . K ., Chen , J ., Du , X ., Butler , D ., Eltepu , L ., Matsuda , S ., Narayanannair , J . K . 等人 , ( 2012 ). Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo . Angew Chem Int Ed Engl 51 , 8529 - 8533)。相比之下，CL4H6在其疏水性尾部中含有可生物降解的酯鍵，且其在肝臟或脾臟中含量在24小時後迅速下降。CL4H6之高度可生物降解性實質上降低誘導肝臟或組織毒性之可能性，尤其在治療癌症所需的重複給藥時程中。

siRNA或寡核苷酸可藉由使用諸如NanoAssemblrTM系統(Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canada)之微流體儀器，在0.5 ml/min之流動速率及1:3之流動速率比率(脂質:siRNA = 0.125 ml/min:0.375 ml/min)下，將溶解於10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)中之siRNA或寡核苷酸與溶解於乙醇中之LNP混合而被LNP囊封。注射泵(Harvard Apparatus, MA, USA)可用於控制流動速率。隨後使用Spectra/Por 4透析膜(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA)將所得LNP/siRNA混合物溶液相對於磷酸鹽緩衝鹽水進行透析。隨後使用Amicon Ultra-15裝置(MWCO 50 kDa, Merch Millipore, Burlington, MA, USA)藉由超濾濃縮LNP囊封之siRNA溶液。藉由Zetasizer Nano ZS ZEN3600儀器(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)量測LNP之尺寸(數量加權平均直徑)及ζ電位。使用Quanti-iTTM RiboGreen RNA試劑及套組(Invitrogen, Waltham, MA, USA)量測siRNA之囊封效率及總濃度。

基於脂質之奈米粒子的腫瘤靶向亦可藉由使用CXCR-4拮抗劑AMD-3100作為靶向部分來達成。在肝細胞癌(HCC)經靶向藥劑索拉非尼治療後，CXCR-4上調，且因此經AMD修飾之奈米粒子可將VEGF siRNA高效遞送至HCC中，與索拉非尼協同誘導抗血管生成作用且抑制腫瘤生長及轉移 ( Liu , J . Y ., Chiang , T ., Liu , C . H ., Chern , G . G ., Lin Ts , T ., Gao , D . Y . 及 Chen , Y . ( 2015 ). Delivery of siRNA Using CXCR4 - targeted Nanoparticles Modulates Tumor Microenvironment and Achieves a Potent Antitumor Response in Liver Cancer . Mol Ther 23 , 1772 - 1782)。有趣的是，即使沒有特異性腫瘤靶向部分，仍發現兩性脂質體或中性脂質乳液諸如MaxSuppressorTM (BIOO Scientific, TX, USA)或SMARTICLES (Marina Biotech, WA, USA)能夠將RNAi劑有效遞送至腫瘤中。大多數基於脂質之遞送系統含有陽離子脂質且具有許多可歸因於電荷之缺點。相比之下，此等中性或兩性脂質體在中性及較高pH下為中性或陰離子性，而在低pH下為陽離子性。在pH為7-7.5之生物流體中，奈米粒子呈現輕微的陰離子特徵，可防止與內皮及其他組織中之細胞膜的負電荷發生不必要的相互作用。出於同樣的原因，此等脂質體之毒性可能低於含有陽離子脂質之彼等脂質體。由於腫瘤區域之pH往往較低，因此該等粒子可能在此等區域變成陽離子性且黏附至腫瘤細胞。SMARTICLES調配物已用於將腫瘤抑制性miRNA (諸如miR-34a及let-7)遞送至HCC、前列腺癌及肺癌動物模型之腫瘤中，從而導致腫瘤顯著消退及存活期延長( Cortez , M . A ., Valdecanas , D ., Niknam , S ., Peltier , H . J ., Diao , L ., Giri , U ., Komaki , R ., Calin , G . A ., Gomez , D . R ., Chang , J . Y . 等人 , ( 2015 ). In Vivo Delivery of miR - 34a Sensitizes Lung Tumors to Radiation Through RAD51 Regulation . Mol Ther Nucleic Acids 4 , e270)。

或者，使用組合化學合成，鑑別出一種稱為7C1之低分子量聚胺及脂質化合物，將siRNA遞送至肺內皮而不會顯著轉染免疫細胞或肝細胞。在KrasG12Dp53flox/flox轉殖基因肺腺癌模型中，使用7C1奈米粒子用microRNA34模擬物及靶向致癌基因Kras之siRNA治療荷瘤小鼠減少K-Ras基因表現及MAPK信號傳導，抑制腫瘤生長，與化學療法協同作用以延長存活期。

本發明亦關於一種醫藥組合物，其包含如本文所定義之抗腫瘤試劑，視情況與醫藥載劑、稀釋劑及/或佐劑組合。任何適合的醫藥學上可接受之稀釋劑、佐劑、載劑或賦形劑均可用於本發明之組合物中(參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (編者) Mack Publishing Company, 1997年4月)。較佳的醫藥形式將與無菌生理鹽水、右旋糖溶液或緩衝溶液或其他醫藥學上可接受之無菌流體組合。或者，可使用固體載劑，諸如微載劑珠粒。此類組合物包括足以提供所需治療或預防效果之有效量的抗腫瘤試劑，及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。「有效量」包括治療有效量或預防有效量。

對於基因療法載體，待投與之劑量可在很大程度上視所治療個體之病況及體型以及治療調配物、治療頻率及投與途徑而定。持續療法之方案，包括劑量、調配物及頻率可藉由初始反應及臨床判斷來指導。注射至血管或組織間質空間中之非經腸途徑可為較佳的，但在特定投與中可能需要其他非經腸途徑，諸如吸入氣溶膠調配物。在一些方案中，將包含基因及基因遞送系統於水性載劑中之調配物以適量注射至組織中。序列表 SEQ ID NO: 1列出人類ASPM轉錄本轉錄變異體1之核苷酸序列(NCBI參考序列：NM_018136.4)。 ATTGGTGGAGGCGGCAAGTTTAAACAGAGTCAAAACGCCATACTTGTTTGGCTCCTCTTTTTAATTTGCGAGTTTATTGGGCTTGTTTTCTGTTTTCTAGGGAGTAGGTTAGTGGAAAAGAAAAAGGGCCGAATTCACTCCCACGACCTCTACAGCCGCCCCTGAGGGGAAGCGGTCAGCGTAAGTCCCGGATCCCCGCTCCGGAGCCGCCTCGTGGGAGCGGGGCAAGGAGATCCAGGAGGGGTCTCGAATCTGCCATGGCGAACCGGCGAGTGGGGCGAGGCTGCTGGGAAGTGAGCCCGACCGAGCGGAGGCCGCCCGCGGGGCTGCGGGGCCCCGCGGCCGAGGAGGAGGCGTCTTCCCCGCCGGTCCTGTCTCTCAGCCACTTCTGCAGGTCTCCTTTCCTTTGCTTCGGGGACGTTCTCCTGGGAGCCTCACGGACGCTGTCTCTGGCCCTAGACAACCCTAACGAGGAGGTGGCAGAAGTGAAGATCTCCCACTTCCCGGCCGCGGACCTGGGCTTCAGTGTGTCGCAGCGCTGTTTCGTGTTGCAGCCTAAAGAGAAAATTGTTATTTCTGTTAACTGGACACCACTCAAAGAAGGCCGAGTAAGAGAGATTATGACATTTCTTGTAAATGATGTTCTGAAACACCAAGCTATATTACTAGGAAATGCAGAAGAGCAGAAAAAGAAAAAGAGGAGTCTTTGGGATACCATTAAAAAGAAGAAAATTTCAGCCTCTACAAGTCACAACAGAAGGGTTTCAAATATTCAGAATGTTAATAAAACATTTAGTGTTTCCCAAAAAGTTGACAGAGTTAGGAGCCCACTACAAGCTTGTGAAAACTTGGCTATGAATGAAGGCGGTCCCCCAACAGAAAACAATTCTTTAATACTTGAAGAAAATAAAATACCCATATCACCTATTAGCCCTGCTTTCAATGAATGCCATGGTGCAACTTGCTTGCCACTCTCTGTACGTCGATCTACTACCTACTCATCTCTTCATGCATCAGAAAATAGGGAACTATTAAATGTACACAGTGCCAACGTTTCAAAAGTTTCTTTTAATGAGAAAGCTGTAACTGAAACTTCCTTTAATTCCGTAAATGTTAATGGCCAAAGAGGAGAGAATAGTAAACTTAGTCTTACCCCCAACTGTTCTTCAACTTTGAACATTACACAAAGCCAAATACATTTTCTAAGTCCAGATTCTTTTGTAAATAATAGTCATGGAGCTAATAATGAACTAGAATTAGTAACATGTCTTTCATCAGATATGTTTATGAAAGATAATTCACAGCCTGTGCATTTGGAATCAACAATTGCACATGAAATTTATCAGAAAATTTTAAGTCCAGATTCTTTCATAAAAGATAATTATGGACTAAATCAGGATCTAGAATCAGAGTCAGTTAATCCTATTTTATCCCCTAATCAATTTTTAAAAGATAACATGGCATATATGTGTACATCTCAGCAAACATGTAAAGTACCATTATCAAATGAAAATTCTCAAGTCCCACAGTCTCCTGAAGATTGGAGAAAAAGTGAAGTTTCGCCACGTATTCCTGAATGTCAGGGTTCAAAATCTCCCAAAGCTATTTTTGAAGAACTAGTAGAAATGAAGTCAAATTACTACAGTTTTATAAAACAAAATAATCCTAAATTTTCTGCAGTTCAGGATATTTCTAGTCATAGCCACAATAAACAACCTAAGAGACGTCCAATACTTTCTGCCACTGTTACTAAAAGGAAGGCCACCTGTACCAGAGAAAACCAAACTGAGATTAATAAACCAAAAGCAAAAAGATGTCTCAACAGTGCAGTGGGTGAACATGAAAAAGTAATAAATAATCAAAAGGAAAAAGAAGATTTTCATTCTTATCTTCCAATTATAGATCCAATATTAAGTAAATCTAAGAGTTATAAAAACGAGGTAACACCCTCTTCGACAACAGCTTCAGTTGCTCGGAAAAGAAAGAGCGATGGAAGCATGGAAGATGCAAATGTGAGAGTTGCAATTACAGAACATACAGAAGTGCGAGAAATCAAAAGAATCCATTTTTCTCCCTCAGAGCCTAAAACATCAGCTGTTAAGAAAACAAAAAATGTGACAACACCCATCTCAAAACGTATTAGCAACAGAGAGAAATTAAACCTGAAGAAGAAAACTGATTTATCAATATTCAGAACTCCAATTTCTAAAACAAACAAAAGGACAAAACCCATTATCGCTGTGGCACAGTCCAGTTTGACCTTCATAAAACCATTAAAAACAGATATTCCCAGACACCCGATGCCATTTGCTGCAAAAAACATGTTTTATGATGAACGCTGGAAGGAAAAGCAGGAACAGGGCTTCACTTGGTGGTTAAA 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SEQ ID NO: 2列出人類ASPM基因同功異型物1之胺基酸序列(NCBI參考序列：NP_060606.3)。 MANRRVGRGCWEVSPTERRPPAGLRGPAAEEEASSPPVLSLSHFCRSPFLCFGDVLLGASRTLSLALDNPNEEVAEVKISHFPAADLGFSVSQRCFVLQPKEKIVISVNWTPLKEGRVREIMTFLVNDVLKHQAILLGNAEEQKKKKRSLWDTIKKKKISASTSHNRRVSNIQNVNKTFSVSQKVDRVRSPLQACENLAMNEGGPPTENNSLILEENKIPISPISPAFNECHGATCLPLSVRRSTTYSSLHASENRELLNVHSANVSKVSFNEKAVTETSFNSVNVNGQRGENSKLSLTPNCSSTLNITQSQIHFLSPDSFVNNSHGANNELELVTCLSSDMFMKDNSQPVHLESTIAHEIYQKILSPDSFIKDNYGLNQDLESESVNPILSPNQFLKDNMAYMCTSQQTCKVPLSNENSQVPQSPEDWRKSEVSPRIPECQGSKSPKAIFEELVEMKSNYYSFIKQNNPKFSAVQDISSHSHNKQPKRRPILSATVTKRKATCTRENQTEINKPKAKRCLNSAVGEHEKVINNQKEKEDFHSYLPIIDPILSKSKSYKNEVTPSSTTASVARKRKSDGSMEDANVRVAITEHTEVREIKRIHFSPSEPKTSAVKKTKNVTTPISKRISNREKLNLKKKTDLSIFRTPISKTNKRTKPIIAVAQSSLTFIKPLKTDIPRHPMPFAAKNMFYDERWKEKQEQGFTWWLNFILTPDDFTVKTNISEVNAATLLLGIENQHKISVPRAPTKEEMSLRAYTARCRLNRLRRAACRLFTSEKMVKAIKKLEIEIEARRLIVRKDRHLWKDVGERQKVLNWLLSYNPLWLRIGLETTYGELISLEDNSDVTGLAMFILNRLLWNPDIAAEYRHPTVPHLYRDGHEEALSKFTLKKLLLLVCFLDYAKISRLIDHDPCLFCKDAEFKASKEILLAFSRDFLSGEGDLSRHLGLLGLPVNHVQTPFDEFDFAVTNLAVDLQCGVRLVRTMELLTQNWDLSKKLRIPAISRLQKMHNVDIVLQVLKSRGIELSDEHGNTILSKDIVDRHREKTLRLLWKIAFAFQVDISLNLDQLKEEIAFLKHTKSIKKTISLLSCHSDDLINKKKGKRDSGSFEQYSENIKLLMDWVNAVCAFYNKKVENFTVSFSDGRVLCYLIHHYHPCYVPFDAICQRTTQTVECTQTGSVVLNSSSESDDSSLDMSLKAFDHENTSELYKELLENEKKNFHLVRSAVRDLGGIPAMINHSDMSNTIPDEKVVITYLSFLCARLLDLRKEIRAARLIQTTWRKYKLKTDLKRHQEREKAARIIQLAVINFLAKQRLRKRVNAALVIQKYWRRVLAQRKLLMLKKEKLEKVQNKAASLIQGYWRRYSTRQRFLKLKYYSIILQSRIRMIIAVTSYKRYLWATVTIQRHWRAYLRRKQDQQRYEMLKSSTLIIQSMFRKWKQRKMQSQVKATVILQRAFREWHLRKQAKEENSAIIIQSWYRMHKELRKYIYIRSCVVIIQKRFRCFQAQKLYKRRKESILTIQKYYKAYLKGKIERTNYLQKRAAAIQLQAAFRRLKAHNLCRQIRAACVIQSYWRMRQDRVRFLNLKKTIIKFQAHVRKHQQRQKYKKMKKAAVIIQTHFRAYIFAMKVLASYQKTRSAVIVLQSAYRGMQARKMYIHILTSVIKIQSYYRAYVSKKEFLSLKNATIKLQSTVKMKQTRKQYLHLRAAALFIQQCYRSKKIAAQKREEYMQMRESCIKLQAFVRGYLVRKQMRLQRKAVISLQSYFRMRKARQYYLKMYKAIIVIQNYYHAYKAQVNQRKNFLQVKKAATCLQAAYRGYKVRQLIKQQSIAALKIQSAFRGYNKRVKYQSVLQSIIKIQRWYRAYKTLHDTRTHFLKTKAAVISLQSAYRGWKVRKQIRREHQAALKIQSAFRMAKAQKQFRLFKTAALVIQQNFRAWTAGRKQCMEYIELRHAVLVLQSMWKGKTLRRQLQRQHKCAIIIQSYYRMHVQQKKWKIMKKAALLIQKYYRAYSIGREQNHLYLKTKAAVVTLQSAYRGMKVRKRIKDCNKAAVTIQSKYRAYKTKKKYATYRASAIIIQRWYRGIKITNHQHKEYLNLKKTAIKIQSVYRGIRVRRHIQHMHRAATFIKAMFKMHQSRISYHTMRKAAIVIQVRCRAYYQGKMQREKYLTILKAVKVLQASFRGVRVRRTLRKMQTAATLIQSNYRRYRQQTYFNKLKKITKTVQQRYWAMKERNIQFQRYNKLRHSVIYIQAIFRGKKARRHLKMMHIAATLIQRRFRTLMMRRRFLSLKKTAILIQRKYRAHLCTKHHLQFLQVQNAVIKIQSSYRRWMIRKRMREMHRAATFIQSTFRMHRLHMRYQALKQASVVIQQQYQANRAAKLQRQHYLRQRHSAVILQAAFRGMKTRRHLKSMHSSATLIQSRFRSLLVRRRFISLKKATIFVQRKYRATICAKHKLYQFLHLRKAAITIQSSYRRLMVKKKLQEMQRAAVLIQATFRMYRTYITFQTWKHASILIQQHYRTYRAAKLQRENYIRQWHSAVVIQAAYKGMKARQLLREKHKASIVIQSTYRMYRQYCFYQKLQWATKIIQEKYRANKKKQKVFQHNELKKETCVQAGFQDMNIKKQIQEQHQAAIIIQKHCKAFKIRKHYLHLRATVVSIQRRYRKLTAVRTQAVICIQSYYRGFKVRKDIQNMHRAATLIQSFYRMHRAKVDYETKKTAIVVIQNYYRLYVRVKTERKNFLAVQKSVRTIQAAFRGMKVRQKLKNVSEEKMAAIVNQSALCCYRSKTQYEAVQSEGVMIQEWYKASGLACSQEAEYHSQSRAAVTIQKAFCRMVTRKLETQKCAALRIQFFLQMAVYRRRFVQQKRAAITLQHYFRTWQTRKQFLLYRKAAVVLQNHYRAFLSAKHQRQVYLQIRSSVIIIQARSKGFIQKRKFQEIKNSTIKIQAMWRRYRAKKYLCKVKAACKIQAWYRCWRAHKEYLAILKAVKIIQGCFYTKLERTRFLNVRASAIIIQRKWRAILPAKIAHEHFLMIKRHRAACLIQAHYRGYKGRQVFLRQKSAALIIQKYIRAREAGKHERIKYIEFKKSTVILQALVRGWLVRKRFLEQRAKIRLLHFTAAAYYHLNAVRIQRAYKLYLAVKNANKQVNSVICIQRWFRARLQEKRFIQKYHSIKKIEHEGQECLSQRNRAASVIQKAVRHFLLRKKQEKFTSGIIKIQALWRGYSWRKKNDCTKIKAIRLSLQVVNREIREENKLYKRTALALHYLLTYKHLSAILEALKHLEVVTRLSPLCCENMAQSGAISKIFVLIRSCNRSIPCMEVIRYAVQVLLNVSKYEKTTSAVYDVENCIDILLELLQIYREKPGNKVADKGGSIFTKTCCLLAILLKTTNRASDVRSRSKVVDRIYSLYKLTAHKHKMNTERILYKQKKNSSISIPFIPETPVRTRIVSRLKPDWVLRRDNMEEITNPLQAIQMVMDTLGIPY SEQ ID NO: 3列出由人類ASPM基因之外顯子18編碼之mRNA的核苷酸序列，其對應於ASPM轉錄變異體1之核苷酸4323至核苷酸9077 (NCBI參考序列：NM_018136.4)。 GGATATTGGAGAAGATATTCCACTAGACAAAGATTTCTGAAATTGAAATATTATTCAATCATCCTGCAATCTAGGATAAGAATGATAATTGCTGTTACATCTTATAAACGATATCTTTGGGCTACAGTTACAATTCAGAGGCATTGGCGTGCTTATTTAAGAAGAAAACAAGATCAACAAAGATATGAAATGCTAAAATCATCAACTCTTATAATCCAATCTATGTTCAGAAAATGGAAGCAACGTAAAATGCAATCACAAGTAAAAGCTACAGTAATATTGCAAAGAGCTTTTAGAGAATGGCATTTAAGAAAACAAGCTAAAGAAGAAAATTCTGCTATTATCATACAATCATGGTATAGAATGCATAAAGAATTACGGAAATATATTTATATTAGATCTTGTGTTGTTATCATTCAGAAAAGATTTCGGTGCTTTCAAGCCCAAAAGTTATATAAAAGAAGAAAAGAGTCCATACTAACCATCCAGAAGTACTACAAAGCATATCTGAAAGGAAAGATTGAGCGCACCAACTATTTGCAGAAACGAGCTGCAGCCATTCAATTACAAGCTGCTTTTAGGAGACTGAAAGCTCATAATTTATGTAGACAAATTAGAGCTGCTTGTGTTATTCAGTCATACTGGAGAATGAGACAAGACAGAGTTCGATTTTTAAACCTTAAGAAGACTATTATCAAATTTCAGGCACATGTAAGAAAACATCAACAACGACAGAAATATAAGAAGATGAAGAAAGCAGCTGTTATAATTCAGACTCATTTCCGAGCTTATATTTTTGCCATGAAAGTTCTAGCATCTTACCAGAAAACACGCTCTGCTGTCATTGTGCTGCAGTCTGCATATAGAGGGATGCAAGCCAGGAAAATGTATATTCACATCCTCACATCTGTTATAAAGATTCAATCATATTATCGTGCTTATGTTTCTAAAAAGGAATTTTTGAGCCTAAAAAATGCTACAATAAAATTGCAGTCAACTGTTAAGATGAAACAAACACGTAAACAATATTTGCATTTAAGAGCAGCTGCACTATTTATCCAGCAATGTTACCGTTCCAAAAAAATAGCTGCACAAAAGAGAGAAGAGTATATGCAGATGCGGGAATCTTGTATCAAACTGCAAGCATTTGTTAGAGGATACCTTGTCCGAAAGCAGATGAGGTTACAAAGAAAAGCTGTTATTTCACTACAGTCTTATTTCAGAATGAGAAAGGCTCGGCAGTATTATCTGAAAATGTATAAAGCAATTATTGTCATTCAGAATTACTATCATGCATACAAAGCACAGGTCAATCAGAGGAAGAACTTCTTGCAAGTCAAAAAAGCAGCTACTTGCTTGCAAGCAGCTTACAGAGGTTATAAAGTACGCCAGCTAATCAAACAACAATCTATAGCTGCTCTTAAAATTCAGTCTGCTTTTAGAGGCTATAATAAAAGGGTAAAATATCAATCTGTGCTTCAATCTATAATAAAGATTCAGAGATGGTACAGGGCGTACAAGACTCTTCATGATACAAGAACACATTTTTTGAAGACAAAGGCAGCTGTGATTTCCCTCCAGTCTGCTTATCGTGGCTGGAAGGTTCGGAAACAGATTAGAAGGGAACATCAAGCTGCCTTGAAGATTCAGTCTGCTTTTAGAATGGCCAAGGCCCAGAAACAGTTTAGATTGTTTAAAACAGCAGCATTAGTCATCCAGCAAAATTTCAGAGCATGGACTGCAGGAAGGAAGCAATGTATGGAGTATATTGAACTCCGTCATGCGGTACTGGTGCTTCAATCTATGTGGAAGGGAAAAACACTGAGAAGACAGCTTCAAAGGCAACATAAATGTGCTATCATCATACAGTCATACTATAGAATGCATGTGCAACAAAAGAAGTGGAAAATCATGAAAAAAGCTGCTCTTCTGATTCAAAAGTATTATAGGGCTTACAGTATTGGAAGAGAACAGAATCATTTATATTTGAAAACAAAAGCAGCTGTAGTAACTTTACAGTCAGCTTATCGTGGTATGAAAGTGAGAAAAAGAATAAAGGATTGCAACAAAGCAGCAGTCACTATACAGTCTAAATACAGAGCTTACAAAACCAAAAAGAAATATGCAACCTATAGAGCTTCAGCTATTATAATTCAGAGATGGTATCGAGGTATTAAAATTACAAACCATCAGCATAAGGAGTATCTTAATTTGAAGAAGACAGCAATTAAAATCCAATCTGTTTATAGAGGTATTAGAGTTAGAAGACATATTCAACACATGCACAGGGCAGCCACTTTTATTAAAGCCATGTTTAAAATGCATCAGTCAAGAATAAGTTACCATACAATGAGAAAAGCAGCTATTGTTATTCAAGTAAGATGTAGAGCATATTATCAAGGTAAAATGCAGCGTGAAAAGTACCTGACAATTTTGAAAGCTGTTAAAGTCCTTCAGGCAAGTTTTAGAGGAGTAAGAGTTAGACGGACTCTTAGAAAGATGCAGACTGCAGCAACACTCATTCAGTCAAACTACAGAAGATACAGACAGCAAACATACTTTAATAAGTTAAAGAAAATAACAAAAACAGTACAGCAAAGATACTGGGCAATGAAAGAAAGAAACATACAATTTCAAAGGTATAACAAACTGAGGCATTCTGTAATATACATTCAGGCTATTTTTAGGGGAAAGAAAGCTAGAAGACATTTAAAAATGATGCATATAGCCGCAACTCTCATTCAGAGGAGATTTAGAACTCTAATGATGAGAAGAAGATTCCTCTCTCTCAAGAAAACTGCTATTTTGATTCAGAGAAAATATCGGGCACATCTTTGTACAAAGCATCACTTACAGTTCCTTCAGGTACAAAATGCAGTTATTAAAATCCAGTCATCATACAGAAGATGGATGATAAGGAAAAGGATGCGAGAGATGCACAGGGCTGCTACTTTCATCCAGTCTACTTTCAGAATGCACAGATTACATATGAGATATCAGGCTTTGAAACAGGCCTCCGTTGTGATCCAACAGCAATACCAAGCAAATAGAGCTGCAAAACTGCAGAGGCAGCATTATCTCAGACAAAGACACTCTGCTGTGATCCTTCAGGCTGCATTCAGGGGTATGAAAACTAGAAGACATTTGAAGAGTATGCATTCCTCTGCAACCCTTATTCAGAGTAGGTTTAGATCATTACTGGTGAGGAGAAGATTCATTTCCCTCAAAAAAGCTACTATTTTTGTTCAGAGGAAATATCGAGCCACCATTTGTGCCAAACATAAATTGTACCAATTCTTGCACTTAAGAAAGGCAGCCATTACAATACAGTCATCTTACAGAAGACTGATGGTAAAGAAGAAGTTACAAGAAATGCAAAGGGCTGCAGTTCTCATTCAGGCTACTTTCAGGATGTACAGAACATATATTACATTTCAGACTTGGAAACATGCTTCAATTCTAATTCAGCAACATTATCGAACATATAGAGCTGCAAAATTACAAAGAGAAAATTATATCAGACAATGGCATTCTGCTGTGGTTATTCAGGCTGCATATAAAGGAATGAAAGCAAGACAACTTTTAAGGGAAAAACACAAAGCTTCTATCGTAATACAAAGCACCTACAGAATGTATAGGCAGTATTGTTTCTACCAAAAGCTTCAGTGGGCTACAAAAATCATACAAGAAAAATATAGAGCAAATAAAAAGAAACAGAAAGTATTTCAACACAATGAACTTAAGAAAGAGACTTGTGTTCAGGCAGGTTTTCAGGACATGAACATAAAAAAACAGATTCAGGAACAGCACCAGGCTGCCATTATTATTCAGAAGCATTGTAAAGCCTTTAAAATAAGGAAGCATTATCTCCACCTTAGAGCAACAGTAGTTTCTATTCAAAGAAGATACAGAAAACTAACTGCAGTGCGTACCCAAGCAGTTATTTGTATACAGTCTTATTACAGAGGCTTTAAAGTACGAAAGGATATTCAAAATATGCACCGGGCTGCCACACTAATTCAGTCATTCTATCGAATGCACAGGGCCAAAGTTGATTATGAAACAAAGAAAACTGCAATTGTGGTTATACAGAATTATTATAGGTTGTATGTTAGAGTAAAAACAGAAAGAAAAAACTTTTTAGCAGTTCAGAAATCTGTACGAACTATTCAGGCTGCTTTTAGAGGCATGAAAGTTAGACAAAAATTGAAAAATGTATCAGAGGAAAAGATGGCAGCCATTGTTAACCAATCTGCACTCTGCTGTTACAGAAGTAAAACTCAGTATGAAGCTGTTCAAAGTGAAGGTGTTATGATTCAAGAGTGGTATAAAGCTTCTGGCCTTGCTTGTTCACAGGAAGCAGAGTATCATTCTCAAAGTAGGGCTGCAGTAACAATTCAAAAAGCTTTTTGTAGAATGGTCACAAGAAAACTGGAAACACAGAAATGTGCTGCCCTACGGATTCAGTTCTTCCTTCAGATGGCTGTGTATCGGAGAAGATTTGTTCAGCAGAAAAGAGCTGCTATCACTTTACAGCATTATTTTAGGACGTGGCAAACCAGAAAACAGTTTTTACTATATAGAAAAGCAGCAGTGGTTTTACAAAATCACTACAGAGCATTTCTGTCTGCAAAACATCAAAGACAAGTCTATTTACAGATCAGAAGCAGTGTTATCATTATTCAAGCTAGAAGTAAAGGATTTATACAGAAACGGAAGTTTCAGGAAATTAAAAATAGCACCATAAAAATTCAG SEQ ID NO: 4列出ASPM-v1靶向siASPM-v1.4822之有義股的核苷酸序列，其對應於ASPM轉錄變異體1之核苷酸4822至核苷酸4840。 GCGCACCAACUAUUUGCAG SEQ ID NO: 5列出ASPM-v1靶向siASPM-v1.4822之反義股的核苷酸序列，其與SEQ ID NO: 4中所示之有義股互補。 CUGCAAAUAGUUGGUGCGC SEQ ID NO: 6列出ASPM-v1靶向siASPM-v1.7636之有義股的核苷酸序列，其對應於ASPM轉錄變異體1之核苷酸7636至核苷酸7654。 CAGAAGACUGAUGGUAAAG SEQ ID NO: 7列出ASPM-v1靶向siASPM-v1.7636之反義股的核苷酸序列，其與SEQ ID NO: 6中所示之有義股互補。 CUUUACCAUCAGUCUUCUG SEQ ID NO: 8列出ASPM-v1靶向siASPM-v1.4360之有義股的核苷酸序列，其對應於ASPM轉錄變異體1之核苷酸4360至核苷酸4378。 CCUGCAAUCUAGGAUAAGA SEQ ID NO: 9列出ASPM-v1靶向siASPM-v1.4360之反義股的核苷酸序列，其與SEQ ID NO: 8中所示之有義股互補。 GGACGUUAGAUCCUAUUCU 實例

除非另外規定，否則以下實例僅出於說明之目的給出且不意欲為限制性的。熟習此項技術者應瞭解，以下實例中所揭示之技術表示由本發明人發現在本發明之實踐中運行良好之技術，且因此可視為構成其實踐之較佳模式。熟習此項技術者應瞭解，在不脫離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例作出許多改變且仍獲得相同或類似結果。

實例 1 ASPM 鑑別為與癌症轉移相關之排名最高的 Wnt 相關基因

吾等根據基因本體論術語聚焦於327個Wnt相關基因之清單。當根據其預後顯著性(Cox回歸P值)降序排列時，轉錄本含量與較短無復發存活期(亦即，復發及/或轉移之機率最高)相關性最好的基因為ASPM (P ＜ 0.0001；圖 1A)。一致地，吾等在對患者群組之大型統合分析中發現，ASPM表現與無遠端轉移存活期呈負相關(總數n = 2422；P ＜ 0.0001；圖 1B)。

前述臨床相關分析提出ASPM可在乳癌侵襲性及轉移中發揮功能性作用的可能性。實際上，MDA-MB-436及HCC-1954乳癌細胞中小髮夾RNA (shRNA)介導之ASPM表現減弱(knockdown)完全消除其經由重組基底膜侵襲之能力( 圖 2)。為了驗證活體內ASPM表現之功能重要性，人類乳癌MDA-MB-436細胞及MDA-MB-231細胞以及胰臟癌AsPC-1細胞經慢病毒轉導GFP及螢火蟲螢光素酶(FF-Luc)融合載體(UBC-EGFP-T2A-Luc；System Biosciences)，且藉由FACS富集GFP陽性細胞。將經慢病毒感染有對照或ASPM特異性shRNA (對照減弱或ASPM減弱)之MDA-MB-436-FF-Luc或MDA-MB-231-FF-Luc細胞(10 ⁶個細胞)經由27號針頭經由尾靜脈注射至免疫缺陷NOD/SCID小鼠體內。根據製造商的建議(IVIS Imaging System, Caliper Life Sciences)，自細胞接種後3週開始，每週藉由生物發光成像(BLI)觀察所得肺轉移腫瘤。如圖 3所示，對照減弱乳癌細胞在細胞注射後3週或8週內導致轉移性肺腫瘤之發生。相比之下，減弱ASPM表現幾乎完全消除遠端轉移。吾等在胰臟癌遠端轉移模型中進一步驗證結果。簡言之，將AsPC-1-FF-Luc細胞經1分鐘注射至NOD/SCID小鼠之脾髓中，隨後進行脾切除術及脾靜脈結紮。藉由BLI監測肝臟及/或轉移性腹膜腫瘤之出現。與前述在乳癌中之結果一致，對照減弱胰臟癌AsPC-1細胞在細胞接種後3週迅速播散至肝臟及腹膜中，而減弱ASPM表現實質上廢除癌細胞之促轉移能力。

與提出轉移性拓殖係由具有獨特特性之罕見腫瘤細胞播種的流行理論 ( Lawson , D . A ., Bhakta , N . R ., Kessenbrock , K ., Prummel , K . D ., Yu , Y ., Takai , K ., Zhou , A ., Eyob , H ., Balakrishnan , S ., Wang , C . Y . 等人 , ( 2015 ). Single - cell analysis reveals a stem - cell program in human metastatic breast cancer cells . Nature 526 , 131 - 135)相一致，吾等試圖藉由建立乳癌患者來源之異種移植(PDX)模型且分析微轉移病灶中之ASPM表現來證實此發現。簡言之，將來源於兩種人類TNBC腫瘤之PDX乳房腫瘤植入NOD/Shi-scid/IL2Rγ ^null(NOG)小鼠(BR1282及BR1474, CrownBio)之乳腺脂肪墊中，每週對腫瘤進行測徑以監測生長動力學。當腫瘤達到2 mm ³時，自荷瘤小鼠採集肺組織，此時藉由平行實驗確認肺微轉移之出現。隨後消化切除的組織，且用人類乳癌細胞之特異性表面標記APC-抗CD298 (Lawson等人, 2015) (BioLegend 341706)標記細胞，隨後固定以用PE-抗ASPM (Santa Cruz, sc-48883)進行後續標記，且藉由螢光活化細胞分選(FACS)進行分析。實際上，與親代腫瘤中之癌細胞相比，自攜帶PDX之小鼠肺部微轉移微環境分離的癌細胞表現高含量的ASPM ( 圖 4)。總之，此等活體外及活體內研究結果均支持ASPM作為癌症侵襲性及轉移之重要且不可或缺的因素。

實例 2 惡性腫瘤中 ASPM 蛋白同功異型物 1 之特異性上調表現

正常及惡性人類組織中存在ASPM轉錄本之數種剪接變異體，其分別編碼由3477個胺基酸殘基(同功異型物1；ASPM-i1)、1892個胺基酸殘基(同功異型物2；ASPM-i2)、1389個胺基酸殘基(同功異型物2I)及1062個胺基酸殘基(同功異型物1V)組成之蛋白質同功異型物 ( Kouprina , N ., Pavlicek , A ., Collins , N . K ., Nakano , M ., Noskov , V . N ., Ohzeki , J ., Mochida , G . H ., Risinger , J . I ., Goldsmith , P ., Gunsior , M . 等人 , ( 2005 ). The microcephaly ASPM gene is expressed in proliferating tissues and encodes for a mitotic spindle protein . Hum Mol Genet 14 , 2155 - 2165)。重要的是，三種較短的ASPM同功異型物(同功異型物2-4)缺乏全長同功異型物1蛋白質之多個功能域，諸如IQ (異白胺酸及麩醯胺酸)模體及鈣調理蛋白同源(CH)域，從而提高此等ASPM同功異型物可在正常細胞及惡性細胞中發揮不同作用的可能性。值得注意的是，編碼全長ASPM蛋白(ASPM同功異型物1或ASPM-i1；NCBI RefSeq：NP_060606.3)之轉錄變異體1 (ASPM-v1；NCBI RefSeq：NM_018136.4)及編碼缺乏外顯子18攜帶之67個IQ域之截短蛋白質(ASPM-i1；NCBI RefSeq：NP_001193775.1)的變異2 (NCBI RefSeq：NM_001206846)為胰臟癌細胞中偵測到的兩種主要轉錄本(Hsu等人, 2019a)。在數種類型之癌症中，ASPM藉由正向調節關鍵的上游Wnt介體(包括散亂(DVL)蛋白及β-連環蛋白)來加強典型Wnt信號傳導 (Wang, W.Y., Hsu, C.C., Wang, T.Y., Li, C.R., Hou, Y.C., Chu, J.M., Lee, C.T., Liu, M.S., Su, J.J., Jian, K.Y. 等人 , (2013). A gene expression signature of epithelial tubulogenesis and a role for ASPM in pancreatic tumor progression. Gastroenterology 145, 1110-1120)。有趣的是，在胰臟癌中，使用位於人類ASPM基因(ASPM-v1及ASPM-i1獨有)之外顯子18編碼之片段內的肽抗原決定基產生的兔多株抗體，證明僅ASPM-i1與DVL2相關且調節其在癌細胞中之蛋白質穩定性。相比之下，ASPM之蛋白質同功異型物2與細胞週期素E相互作用且由此調節癌細胞之細胞週期進程。因此，ASPM-i1而非ASPM-同功異型物2有助於諸如胰臟癌之癌細胞的Wnt活性及致瘤性( Hsu , C . C ., Liao , W . Y ., Chan , T . S ., Chen , W . Y ., Lee , C . T ., Shan , Y . S ., Huang , P . J ., Hou , Y . C ., Li , C . R . 及 Tsai , K . K . ( 2019a ). The differential distributions of ASPM isoforms and their roles in Wnt signaling , cell cycle progression , and pancreatic cancer prognosis . J Pathol 249 , 498 - 508)。此等結果表明，不同的ASPM同功異型物在癌細胞中具有不同的功能及致病作用。

此前，ASPM-i1已被證明在胰臟癌細胞之細胞質中特異性表現，而ASPM-i2主要在細胞核中表現(Hsu等人, 2019a)。重要的是，對人類胰臟癌或胃癌組織之組織微陣列(TMA)的免疫組織化學(IHC)分析表明，ASPM-i1在腫瘤細胞中表現上調，而在正常胰管上皮細胞中其染色很少呈陽性(資料未展示)。為了將此等觀察結果擴展至非胃腸(GI)道惡性腫瘤，對人類乳癌組織及相匹配的鄰近正常組織(BR084b, US Biomax, Inc., Rockville, MD, USA)進行TMA分析。將組織切片去石蠟，水合且浸入檸檬酸鹽緩衝液pH 6.0中，以便在微波中進行抗原決定基修復。內源性過氧化物酶活性在3%過氧化氫酶中淬滅15分鐘，且隨後用10%正常馬血清培育載玻片以阻斷非特異性免疫反應性。吾等製備針對ASPM-i1或ASPM-i2特異性免疫原之兔多株抗體(1:1600)。染色強度在單細胞水平上進行量化，每個腫瘤至少計數300個腫瘤細胞(每個腫瘤3個組織切片；每個切片至少計數100個腫瘤細胞)。

如圖 6A所示，正常人類乳房組織中之一小部分(約9.3%)上皮細胞在細胞質中呈現弱(1+) ASPM-i1染色強度，而ASPM-i2在一小部分乳房上皮細胞之細胞質(10.5%)或細胞核(9.3%)中表現(≥1+)。與前述在胰臟癌中之發現一致，ASPM-i1之表現在乳癌組織之惡性細胞的細胞質中明顯上調。相比之下，ASPM-i2之表現主要保留在乳癌細胞之細胞核中。特定言之，在同一腫瘤中，平均約21.1%之腫瘤細胞呈現ASPM-i1之弱(1+)染色，約5.0%之腫瘤細胞呈現中度(2+)染色且約2.2%之腫瘤細胞呈現強(3+)染色。相比之下，平均分別有9.4%、0.3%及0.3%之腫瘤細胞在細胞質中分別呈現ASPM-i2之弱、中度及強染色( 圖 6B)。為了進一步檢查ASPM-i1在乳癌中之表現模式，吾等在3名乳癌患者之全腫瘤組織切片中重複其IHC染色。有趣且重要的是，吾等注意到乳癌組織中ASPM-i1之表現量存在顯著的區域異質性，其在癌症侵襲前沿之表現量高於其他區域( 圖 6C及圖 6D)。此觀察結果提出ASPM-i1可與乳癌侵襲性及/或轉移有關的可能性。

已證明ASPM同功異型物之表現異質性，吾等接下來試圖確定ASPM之表現模式，尤其ASPM-i1在癌細胞之細胞質中的特異性上調是否可推廣至其他類型的人類癌症。此前，ASPM之轉錄本含量已被證明在66%之人類HCC組織中增加且與HCC患者之5年存活期短及早期腫瘤復發相關( Lin , S . Y ., Pan , H . W ., Liu , S . H ., Jeng , Y . M ., Hu , F . C ., Peng , S . Y ., Lai , P . L . 及 Hsu , H . C . ( 2008 ). ASPM is a novel marker for vascular invasion , early recurrence , and poor prognosis of hepatocellular carcinoma . Clin Cancer Res 14 , 4814 - 4820)。為了在蛋白質水平上研究ASPM-i1在人類正常及惡性肝組織中之表現模式，吾等對由24個正常肝組織、10個肝炎肝組織、50個肝硬化肝組織及111個HCC組織組成之兩個組織微陣列(LVN241a及LV805b, US Biomax, Inc., Rockville, MD, USA)進行ASPM-i1之IHC染色。與其在乳癌組織中之表現模式一樣，ASPM-i1主要在正常肝組織之一部分(平均28.3%)正常肝細胞的細胞質中表現(≥1+) ( 圖 6E)，且具有弱(1+) ASPM-i1染色之上皮細胞的百分比在肝炎、肝硬化及HCC組織中顯著增加。重要的是，HCC組織中大量上皮細胞表現中度(2+；平均24.3%)或強(3+；平均3.43%)的ASPM-i1染色強度。相比之下，在正常肝臟、肝炎及肝硬化肝組織中，ASPM-i1在細胞核中之表現可忽略。在HCC組織中，僅一小部分腫瘤細胞在其細胞核中表現弱(1+；平均13.5%)或中度(2+；平均4.7%)的ASPM-i1染色。

與肝組織中ASPM-i1之染色模式相反，正常肝臟中之大部分肝細胞在細胞質中表現ASPM-i2 (≥ 1+) (76.0%)，且很大一部分肝細胞在細胞核中亦表現ASPM-i2 (44.1%) ( 圖 6E)。有趣的是，ASPM-i2之表現在HCC組織中適度上調，其中大約三分之二的腫瘤細胞在細胞質(64.0%)或細胞核(67.5%)中呈現中度至強(≥ 2+)的ASPM-i2染色強度( 圖 6F)。

總體而言，ASPM-i1在正常上皮組織中之表現頻率非常低，連同其在癌細胞中之特異性上調，支持其作為癌細胞特異性目標，在癌症治療中具有良好的安全概況。

實例 3 ASPM 同功異型物 1 ( ASPM - i1 ) 特異性促進侵襲性癌細胞中 PAR 平面細胞極性複合物之組裝及侵襲性偽足形成

吾等之前關於ASPM在癌細胞侵襲及癌症轉移中之重要作用的發現，以及ASPM-i1在Wnt活性及腫瘤發生中之特定作用，促使吾等在機理上深入瞭解其如何調節癌細胞中之Wnt相關侵襲性。為此，吾等使用改良的博伊登室侵襲分析法(Transwell inserts; BD Biosciences)分離侵襲性乳癌MDA-MB-436細胞。Transwell插片塗佈有一層薄薄的生長因子減少的重組基底膜(rBM; BD Biosciences)，且使細胞跨越rBM侵襲12小時。分別收集侵襲穿過插入膜之細胞及停留在膜上之細胞。吾等隨後使用高通量MicroWestern陣列分析篩選107個經註釋之人類Wnt蛋白(http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/)之清單 ( Ciaccio , M . F ., Wagner , J . P ., Chuu , C . P ., Lauffenburger , D . A . 及 Jones , R . B . ( 2010 ). Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays . Nat Methods 7 , 148 - 155)，用於與侵襲性乳癌中之ASPM-i1相互作用。PAR平面細胞極性(PCP)蛋白質複合物中之若干成員，包括Par-6家族細胞極性調節因子α (PAR6α)、PAR6β、散亂蛋白2 (DVL2)、CDC42及SMURF1與ASPM-i1強烈相互作用( 圖 7)。

由於非典型Wnt-PCP信號傳導將組織模式化資訊轉譯給個別細胞，在個別細胞中其經由調節細胞極性及侵襲性偽足來控制細胞的形態發生行為亦侵襲性行為( Luga , V ., Zhang , L ., Viloria - Petit , A . M ., Ogunjimi , A . A ., Inanlou , M . R ., Chiu , E ., Buchanan , M ., Hosein , A . N ., Basik , M . 及 Wrana , J . L . ( 2012 ). Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt - PCP signaling in breast cancer cell migration . Cell 151 , 1542 - 1556)，吾等考慮ASPM-i1可協調PAR-PCP蛋白以調節侵襲性偽足動力學且因此調節癌細胞侵襲性之可能。因此，吾等如先前所述( Eckert , M . A ., Lwin , T . M ., Chang , A . T ., Kim , J ., Danis , E ., Ohno - Machado , L . 及 Yang , J . ( 2011 ). Twist1 - induced invadopodia formation promotes tumor metastasis . Cancer Cell 19 , 372 - 386)，藉由將乳癌MDA-MB-436細胞塗鋪至明膠基質(Sigma-Aldrich)上來誘導該等細胞之侵襲性偽足形成。將細胞接種於明膠上3小時或更長時間，隨後用抗皮層肌動蛋白及Alexa Fluor 647蠅虎蕈鹼(F-肌動蛋白染色)進行免疫染色，且使用共焦成像分析評估染色模式。自細胞向下突出的皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺結構視為侵襲性偽足。如圖 8A所示，共焦成像分析表明，ASPM-i1與DVL2、PAR6β、CDC42及皮層肌動蛋白共定位於侵襲性癌細胞之侵襲性偽足中。為了證實ASPM-i1與PAR/PCP蛋白相互作用，特別是在侵襲性偽足中，吾等自塗鋪於明膠基質上3小時以誘導侵襲性偽足形成之細胞中分離侵襲性偽足蛋白。自盤表面剪下細胞體，留下包埋於明膠中之侵襲性偽足。隨後將侵襲性偽足蛋白及細胞體蛋白質級分溶解於IP緩衝液中。對於co-IP，藉由非變性溶解緩衝液(1 mM PMSF、1 mM Na3VO4、1 μg/ml胃酶抑素、20 mM NaF、磷酸酶抑制劑混合液、0.5% NP-40及10%甘油之PBS溶液)溶解細胞，且藉由與50%蛋白質A-瓊脂糖珠粒漿液一起培育來澄清(1 mg)溶解物，之後將1 mL澄清的溶解物與抗體結合之50%蛋白質A-瓊脂糖珠粒及10 μL 10% BSA在4℃下培育隔夜。珠粒用洗滌緩衝液(0.5% NP-40、0.1% Triton X-100、1 mM PMSF及1 mM Na ₃VO ₄之PBS溶液)洗滌三次。蛋白質在SDS/PAGE及用指定抗體進行免疫墨點法後顯露。對自侵襲性乳癌MDA-MB-436細胞分級分離之侵襲性偽足蛋白的免疫墨點分析證實，ASPM與侵襲性偽足中之DVL2、PAR6β、CDC42及N-WASP相互作用，但不與其他DVL同功異型物或SMURF1相互作用( 圖 8 B)。

已證明ASPM-i1與PAR/PCP複合物特異性相互作用及其在癌細胞之侵襲性偽足中組裝，吾等接下來試圖在功能上深入瞭解其在侵襲性偽足生物發生及癌症侵襲性中之作用。為此，吾等藉由使用BLOCK-iT ^TMRNAi Designer (Invitrogen)合成四種電腦模擬預測的ASPM-v1 (SEQ ID NO: 3)特異性小髮夾RNA (shRNA)寡核苷酸來穩定減弱ASPM轉錄變異體1 (ASPM-v1)之表現，該等寡核苷酸具有在由ASPM基因之外顯子18 (ASPM.e18)編碼之mRNA區內隔開的21個核苷酸的目標序列。吾等藉由接合含有有義股及反義股之shRNA序列來構築表現此等ASPM-v1靶向siRNA中之各者的慢病毒載體，該等有義股及反義股由9 bp環區分隔以用於定向選殖至pGLV2-U6-Puro中。吾等用慢病毒載體中之各者感染MDA-MB-436細胞，且測試其下調ASPM-i1之轉錄本及蛋白質豐度水平的各別功效。在後續實驗中使用非目標siRNA (NT siRNA; SHC002V; Sigma-Aldrich)作為對照。

如圖 9A所示，用兩種ASPM.e18特異性shRNA (包括ASPM.e18 shRNA#1及ASPM.e18 shRNA#4)感染乳癌MDA-MB-436細胞可顯著下調ASPM-i1之蛋白質豐度水平，而不影響ASPM同功異型物2之蛋白質豐度水平。重要的是，使用ASPM.e18.#4 shRNA特異性減弱ASPM-v1表現極大地減弱PAR-PCP蛋白(包括DVL2、PAR6β及CDC42)及膜型基質金屬蛋白酶(MT1-MMP；代表侵襲性偽足上之功能蛋白)募集至侵襲性偽足( 圖 9B)，證實ASPM-i1在侵襲性偽足特異性PAR6-PCP複合物組裝中的功能作用。補充此等分子分析，減弱ASPM-i1大大消除癌細胞中皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺侵襲性偽足之形成且由此抑制其侵襲能力( 圖 9C)。此等資料共同表明，ASPM-i1藉由促進新穎DVL2/PAR6β/CDC42/N-WASP蛋白質複合物在侵襲性偽足中之組裝調控侵襲性偽足生物發生及癌症侵襲性。

實例 4 ASPM - i1 調節 癌細胞中多個發育及幹性相關路徑

ASPM已被鑑別為Wnt信號傳導路徑之關鍵調節因子。發現在胰臟癌細胞及前列腺癌細胞中，ASPM表現對於細胞對典型Wnt配位體(諸如Wnt-3a)之反應為必不可少的。機理研究表明，ASPM與β-連環蛋白之上游活化因子相互作用，包括散亂蛋白2 (DVL2)或DVL3、軸蛋白及蛋白酶活化受體1 (PAR1)，且抑制DVL蛋白之蛋白酶體依賴性降解，從而增加β-連環蛋白之蛋白質豐度水平且加強對其致癌作用重要的典型Wnt信號傳導。一致地，儘管減弱ASPM表現導致癌細胞中Wnt報導子活性急劇下降，但提高此等細胞中之DVL表現可恢復其Wnt活性及幹性，表明DVL可在功能上挽救ASPM缺陷且充當Wnt信號傳導相關癌症幹性之關鍵調節因子。

ASPM在神經元發育中之重要作用及其在正常或惡性幹細胞中之特異性表現，以及其在有絲分裂調節、細胞週期及發育路徑中之多效性作用，提出其在其他發育信號傳導路徑中潛在作用的有趣可能性。為此，吾等使用商業報導子陣列(Cignal Finder Stem Cell & Differentiation 10-Pathway Reporter Array; Qiagen, Germany)量測一組標誌性發育及幹性相關路徑之活性。簡言之，使用慢病毒介導之shRNA，使用ASPM.e18.#4減弱高度可轉染的人類胚胎腎293T細胞(HEK293T)之ASPM-v1表現。使用Lipofectmine LTX試劑(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)對細胞進行報導子構築體的孔內轉染，之後藉由使用雙螢光素酶分析系統(Promega, Madison, WI, USA)在SpectraMax ®光度計(Molecualer Device, Waltham, MA USA)上量測螢火蟲及海腎螢光素酶活性。結果表示為螢火蟲螢光素酶(Fluc)活性與海腎螢光素酶(Rluc)活性之比率。

如圖 10所示，吾等驗證在減弱ASPM-v1表現之HEK293T細胞中，Wnt信號傳導路徑活性顯著降低。值得注意且重要的是，資料顯示減弱ASPM-v1表現亦顯著降低Notch及Hedgehog (Hh)信號傳導路徑以及幹性相關轉錄因子OCT4及KLF4之活性。總之，此等資料表明ASPM-i1不僅調節Wnt信號傳導，且亦調節癌細胞中之其他發育及/或幹性相關路徑，突顯其在癌症幹性及進展中之關鍵作用。

實例 5 ASPM - v1 靶向 siRNA 之 電腦模擬及實驗篩選

為了利用ASPM-i1作為治療目標經由侵襲性偽足形成來治療癌症生長及癌症侵襲性，吾等試圖開發siRNA療法來特異性抑制ASPM-i1在癌細胞中之表現。為了便於對ASPM轉錄變異體1 (ASPM-v1；NCBI RefSeq：NM_018136.4；編碼ASPM-i1)靶向siRNA療法進行臨床前功效測試及靈長類動物毒性研究，吾等搜尋同時靶向人類ASPM-v1及食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之ASPM基因之外顯子18(ASPM-v1獨有；「ASPM-v1.e18」)所編碼之mRNA區的siRNA序列。吾等旨在設計靶向ASPM-v1之外顯子18之mRNA上之不同區域的siRNA；吾等將人類ASPM-v1之外顯子18均勻分為四個長度相似的區段，且使用NCBI BLAST搜尋將其與食蟹獼猴基因上之相應區域進行比對。發現此等區段中之各者在人類序列與靈長類動物序列之間的一致性很高(96%-98%) ( 表 1)。表 1. 由人類及食蟹獼猴ASPM基因之外顯子18編碼的四個高度同源的mRNA區

片段	物種	ASPM-v1上之核苷酸位置(起點)	ASPM-v1上之核苷酸位置(終點)	比對一致性
ASPM-v1.e18.F1	智人	4066	5253	97%
	食蟹獼猴	4066	5253
ASPM-v1.e18.F2	智人	5254	6441	97%
	食蟹獼猴	5254	6441
ASPM-v1.e18.F3	智人	6442	7629	96%
	食蟹獼猴	6442	7629
ASPM-v1.e18.F4	智人	7630	8820	98%
	食蟹獼猴	7630	8820

吾等隨後搜尋位於四個ASPM-v1.e18區段中之各者內的各種一致子區段(資料未展示)，且基於懷特黑德生物醫學研究所(Whitehead Institute for Biomedical Research)之siRNA選擇伺服器(http://sirna.wi.mit.edu/home.php)為此等子區段中之各者設計siRNA。吾等應用以下三個選擇準則來選擇候選siRNA：(1) GC含量為40-60%，(2)5'端有義股與5'端反義股之結合能之間的差為負(ΔΔG)，(3)脫靶評分大於10。siRNA之脫靶評分係藉由使用NCBI BLAST針對人類mRNA序列對該siRNA進行同源性搜尋，隨後提取該siRNA上之非種子區、種子區以及裂解位點區的錯配數目用於計算評分來確定，如先前所述(美國專利8,809,292 B2)，及(4)缺乏已知免疫刺激模體，包括(5'至3')「GUCCUUCAA」及「UGUGU」(Fedorov等人, 2006；Judge等人, 2005)。使用此等準則，吾等鑑別出42個滿足此等選擇準則之候選siRNA ( 步驟 1)。為了驗證ASPM-v1靶向siRNA (siASPM-v1)之基因靜默減弱功效，吾等合成與所選序列相對應的雙股siRNA (Dharmacon)，且使用Lipofectamine LTX試劑(ThermoFisher Scientific)將其中之各者轉染至高度可轉導的人類胚胎腎HEK293T細胞中。亦合成siRNA (siASPM-v1.8602；5'-GAGCUGCUAUCACUUUACAGC-3')，先前已驗證其對ASPM-v1表現之減弱作用，且作為陽性對照包括在內(Hsu等人, 2019b)。合成非目標對照siRNA (5'-UGGUUUACAUGUCGACUAAUU-3'；Dharmacon)且作為陰性對照包括在內。吾等使用LightCycler FastStart DNA MASTERPLUS SYBR Green I套組及LightCycler系統(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)，使用定量即時PCR (qRT-PCR)量測ASPM-v1之轉錄本含量。寡核苷酸引子係使用Primer Bank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)設計。所有轉導實驗均一式三份地執行，以便進行統計分析。吾等根據42個候選siRNA各自對ASPM-v1轉錄本含量之基因靜默作用對其進行排序。值得注意的是，並非所有此等電腦模擬設計的siASPM-v1可有效地減弱ASPM-v1之表現，其中三者在轉導至HEK293細胞中後並不影響ASPM-v1之轉錄本含量。使用學生t檢驗，吾等自此等42個候選siRNA鑑別出30個siRNA之清單，其在轉導至HEK293K細胞中時，可顯著(P值小於0.05)減少ASPM-v1之表現。

為了驗證上文設計之siRNA的減弱作用，吾等合成與所選序列相對應的雙股siRNA (Dharmacon)，且使用Lipofectamine LTX試劑(ThermoFisher Scientific)將其中之各者轉染至高度可轉導的人類胚胎腎HEK293T細胞中。亦合成siRNA (siASPM-v1.8602；5'-GAGCUGCUAUCACUUUACAGC-3')，先前已驗證其對ASPM-v1表現之基因靜默作用，且作為陽性對照包括在內( Hsu , C . C ., Liao , W . Y ., Chan , T . S ., Chen , W . Y ., Lee , C . T ., Shan , Y . S ., Huang , P . J ., Hou , Y . C ., Li , C . R . 及 Tsai , K . K . ( 2019b ). The differential distributions of ASPM isoforms and their roles in Wnt signaling , cell cycle progression , and pancreatic cancer prognosis . J Pathol)。合成非目標對照siRNA (NT siRNA；5'-UGGUUUACAUGUCGACUAAUU-3'；Dharmacon)且作為陰性對照包括在內。吾等使用LightCycler FastStart DNA MASTERPLUS SYBR Green I套組及LightCycler系統(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)，使用定量即時PCR (qRT-PCR)量測ASPM-v1之轉錄本含量。寡核苷酸引子係使用Primer Bank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)設計。吾等隨後根據45個候選siRNA各自對ASPM-v1之轉錄本含量的減弱作用對其進行排序，且隨後自如表 1所示之四個人類-猴同源片段中之各者選擇兩種排名最高的siRNA序列( 步驟 2)。為了進一步選擇排名最高的siRNA，吾等用自步驟 2中選出之八個siRNA轉導乳癌MDA-MB-436細胞，且根據其各自的減弱作用對其進行排序( 步驟 3)。吾等隨後選擇三個排名最高的siRNA序列用於後續分析，其包括siASPM-v1.F2#1、siASPM-v1.F3#1及siASPM-v1.F4#1 ( 步驟 4)。

為了比較三種選定的siRNA中之各者或其組合減弱ASPM-v1表現之功效，吾等用三種siRNA中之各者或其不同組合轉導MDA-MB-436細胞，且使用qRT-PCR分析各自的減弱作用。有趣的是，吾等發現兩種siRNA (包括siASPM-v1.F3#1及siASPM-v1.F4#1)之1:1混合物以及單一siRNA siASPM-v1.F2#1在不同組合中實現對ASPM-v1之最佳基因靜默作用( 圖 11)。值得注意且重要的是，出於以下考慮，選擇siASPM-v1.F3#1與siASPM-v1.F4#1之1:1混合物而非單一siASPM-v1.F2#1進行後續開發：(1) siASPM-v1.F3#1及siASPM-v1.F4#1之目標mRNA序列位於ASPM基因之外顯子18上的不同片段(亦即，分別為片段3及4)，且因此使用siRNA混合物同時靶向可避免由染色質構形引起之減弱功效的潛在變化，及(2) siRNA混合物由單一siRNA之一半量的各siRNA組成，由此可理論上減輕潛在毒性，諸如脫靶靜默及免疫刺激作用。

實例 6 脂質奈米粒子調配之 ASPM - v1 靶向 siRNA 對活體外癌細胞之生物作用

許多類型之人類實體癌，諸如乳癌、非小細胞肺癌、胰管腺癌(PDAC)、胃腺癌之硬化亞型及結腸直腸癌之「幹/鋸齒狀/間質」分子亞型，以稱為「促結締組織增生反應」之明顯基質反應為特徵，其構成癌症治療劑高效轉運至腫瘤中之主要障礙。最近，兩種奈米粒子調配之化學療法，包括白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel)及脂質體囊封型伊立替康，已被證明延長晚期PDAC患者之存活期。兩種試劑均可顯著增加所治療腫瘤中化學治療劑之含量，表明奈米粒子調配物為一種經臨床驗證之改善促結締組織增生癌症之治療功效的方法。在肝臟疾病中，非經腸投與脂質體囊封之對運甲狀腺素蛋白具有特異性之siRNA (Patisiran, Alnylam)已被證明減少遺傳性運甲狀腺素蛋白介導之澱粉樣變性患者肝臟產生之高達86.8%的運甲狀腺素蛋白，且因此成為第一個經臨床批准之RNAi藥物( Adams , D ., Gonzalez - Duarte , A ., O ' Riordan , W . D ., Yang , C . C ., Ueda , M ., Kristen , A . V ., Tournev , I ., Schmidt , H . H ., Coelho , T ., Berk , J . L . 等人 , ( 2018 ). Patisiran , an RNAi Therapeutic , for Hereditary Transthyretin Amyloidosis . N Engl J Med 379 , 11 - 21)。此外，奈米粒子遞送之siRNA療法，諸如攜帶靶向核糖核苷酸還原酶M2 (RRM2)之siRNA的基於環糊精聚合物之奈米粒子及攜帶靶向VEGF-A及驅動蛋白紡錘體蛋白(KSP)之siRNA的脂質奈米粒子，已顯示出有前景的藥效學及耐受性以及在1期臨床試驗中在一些經治療患者中之抗腫瘤功效( Davis , M . E ., Zuckerman , J . E ., Choi , C . H ., Seligson , D ., Tolcher , A ., Alabi , C . A ., Yen , Y ., Heidel , J . D . 及 Ribas , A . ( 2010 ). Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles . Nature 464 , 1067 - 1070)。最近，在晚期肝細胞癌患者之Ib期研究中，靜脈內注射脂質體奈米粒子(LNP)囊封之小活化RNA，其經設計以活化CEBPA基因之轉錄，顯示出可接受的安全概況及與酪胺酸激酶抑制劑之潛在協同功效 ( Sarker , D ., Sodergren , M ., Plummer , E . R ., Basu , B ., Meyer , T ., Huang , K . W ., Evans , T . R . J ., Spalding , D ., Ma , Y . T ., Palmer , D . H . 等人 , ( 2020 ). First - in - human phase I trial of small activating RNA ( saRNA ) oligonucleotide MTL - CEBPA in combination with sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma ( HCC ). Journal of Clinical Oncology 38)。此等臨床進展以及ASPM-i1在侵襲性偽足生物發生及癌症侵襲性中之關鍵作用，促使吾等開發奈米粒子調配及ASPM-v1靶向siRNA基因療法，用於治療侵襲性及轉移性癌症。

未經修飾之siRNA易受血清外切核酸酶及內切核酸酶的影響，導致血清半衰期短，且可經由干擾素及促炎性細胞介素誘導免疫反應( Watts , J . K ., Deleavey , G . F . 及 Damha , M . J . ( 2008 ). Chemically modified siRNA : tools and applications . Drug Discov Today 13 , 842 - 855)。因此，已探索許多化學修飾來提高siRNA之穩定性且使siRNA之免疫原性降低( Hassler , M . R ., Turanov , A . A ., Alterman , J . F ., Haraszti , R . A ., Coles , A . H ., Osborn , M . F ., Echeverria , D ., Nikan , M ., Salomon , W . E ., Roux , L . 等人 , ( 2018 ). Comparison of partially and fully chemically - modified siRNA in conjugate - mediated delivery in vivo . Nucleic Acids Res 46 , 2185 - 2196)。為了避免此等siRNA之潛在免疫原性且增加其在血清中之穩定性，吾等在反義股之UA或CA位點及有義股之所有嘧啶處添加2'-O-甲基化修飾，因為所選siRNA之siRNA的2'-O-甲基化修飾與全身投與時較少的免疫活化相關 ( Adami , R . C ., Seth , S ., Harvie , P ., Johns , R ., Fam , R ., Fosnaugh , K ., Zhu , T ., Farber , K ., McCutcheon , M ., Goodman , T . T . 等人 , ( 2011 ). An amino acid - based amphoteric liposomal delivery system for systemic administration of siRNA . Mol Ther 19 , 1141 - 1151)。為了增強血清穩定性，吾等另外添加兩個具有硫代磷酸酯鍵之去氧胸苷3'懸垂物至有義股及反義股。

雙股且經部分化學修飾之siASPM-v1.F3#1、siASPM-v1.F4#1及經類似修飾之非目標雙股寡核苷酸(有義股：5'-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3'；非目標對照siRNA)係由Dharmacon (Horizon Discovery Ltd., Waterbeach, UK)合成。UU二核苷酸作為懸垂物添加至兩個寡核苷酸股之3'端。其中之各者與基於脂質奈米粒子(LNP)之遞送媒劑一起調配，該遞送媒劑包含與siRNA複合之可離子化陽離子胺基脂質DLin-MC3-DMA (MC3)、兩性磷脂二硬脂醯-磷脂醯膽鹼(DSPC)、膽固醇及包覆脂質聚(乙二醇)脂質1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-甲氧基(聚(乙二醇)) (DMG-PEG)，以50:10:38.5:1.5之莫耳比混合 ( Adams , D ., Gonzalez - Duarte , A ., O ' Riordan , W . D ., Yang , C . C ., Ueda , M ., Kristen , A . V ., Tournev , I ., Schmidt , H . H ., Coelho , T ., Berk , J . L . 等人 , ( 2018 ). Patisiran , an RNAi Therapeutic , for Hereditary Transthyretin Amyloidosis . N Engl J Med 379 , 11 - 21 )。選擇此基於MC3之LNP作為吾等ASPM靶向siRNA療法之遞送媒劑的理由有三重。首先，相同的LNP調配物用於Alnylam Pharmaceuticals開發的第一個經FDA批准之siRNA藥物帕替斯喃(Onpattro)。其次，此LNP調配物已用於全身遞送靶向腫瘤驅動基因諸如BCR-ABL、VEGF-A及驅動蛋白紡錘體蛋白(KSP)之siRNA，其在慢性骨髓白血病(CML)小鼠模型(Jyotsana, N., Sharma, A., Chaturvedi, A., Budida, R., Scherr, M., Kuchenbauer, F., Lindner, R., Noyan, F., Suhs, K.W., Stangel, M.等人, (2019). Lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery for safe targeting of human CML in vivo. Ann Hematol 98, 1905-1918)或肝細胞癌(HCC)正位鼠類模型( Tabernero , J ., Shapiro , G . I ., LoRusso , P . M ., Cervantes , A ., Schwartz , G . K ., Weiss , G . J ., Paz - Ares , L ., Cho , D . C ., Infante , J . R ., Alsina , M . 等人 , ( 2013 ). First - in - humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement . Cancer Discov 3 , 406 - 417)中顯示出顯著的治療功效。第三，基於此LNP調配物之siRNA的全身遞送在I期臨床試驗中被證明是安全的，且除了一些輸注相關反應及短暫的促炎性細胞介素誘導之外，總體上耐受性良好。基於MC3之LNP的粒徑在70-90 nm範圍內(Jayaraman等人, 2012)，此與延長的循環時間相關且允許其經由滲漏的內皮細胞窗孔(估計孔徑為380-780 nm)滲漏至腫瘤組織中，此現象稱為「增強滲透及滯留(EPR)」效應(Agarwal及Roy, 2013；Jain及Stylianopoulos, 2010)。

吾等合成DLin-MC3-DMA且購買DSPC (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA)、膽固醇(Sigma-Aldrich)及DMG-PEG (NOF America Corporation, White Plains, NY, USA)。吾等將上述siASPM-v1.F3.#1與siASPM-v1.F4.#1之混合物的經化學修飾之調配物囊封於內部設計的微流體設備中，以0.5 ml/min之流動速率及1:3之流動速率比率(脂質:siRNA = 0.125 ml/min:0.375 ml/min)控制混合條件。藉由Zetasizer Nano ZS ZEN3600儀器(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)量測LNP之尺寸(數量加權平均直徑)及ζ電位。使用Quanti-iT ^TMRiboGreen RNA試劑及套組(Invitrogen, Waltham, MA, USA)量測siRNA之囊封效率及總濃度。所得基於MC3之LNP囊封的經化學修飾之siASPM-v1.F3#1與siASPM-v1.F4#1之1:1混合物命名為「LNP-siASPM-v1」。

吾等首先驗證用LNP-siASPM-v1處理MDA-MB-436細胞可以劑量依賴性方式降低ASPM-v1之轉錄本含量，50%抑制濃度(IC50)為0.43 nM ( 圖 12A)。一致地，免疫墨點分析證實，治療劑量依賴性地降低ASPM-i1之蛋白質豐度水平( 圖 12B)。相比之下，處理並不影響ASPM轉錄變異體2之轉錄本含量(資料未展示)或ASPM-i2之蛋白質豐度水平( 圖 12B)，再次證實其對ASPM-v1表現之特異性減弱作用。與對ASPM-i1之減弱作用一致，用siASPM-v1處理癌細胞大大消除皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺侵襲性偽足之形成( 圖 13A)以及其侵襲能力( 圖 13B)。

此前，ASPM，特別是ASPM-i1，已被證明有助於各種類型之癌症(諸如胰臟癌、前列腺癌及肝細胞癌(HCC))中之典型Wnt活性、幹性及腫瘤發生(Hsu, C.C., Liao, W.Y., Chan, T.S., Chen, W.Y., Lee, C.T., Shan, Y.S., Huang, P.J., Hou, Y.C., Li, C.R.及Tsai, K.K. (2019a). The differential distributions of ASPM isoforms and their roles in Wnt signaling, cell cycle progression, and pancreatic cancer prognosis. J Pathol 249, 498-508)。因此，吾等試圖評估ASPM-v1靶向siRNA對癌細胞之Wnt活性及幹性的影響。為此，吾等用LNP-siASPM-v1處理HCC HuH-1細胞，且驗證其可實質上降低HuH-1細胞中WNT3A刺激之Wnt特異性TEF/LEF報導子活性( 圖 14A)。一致地，其亦可減少醛去氫酶(ALDH)陽性細胞之數目，已知該等細胞在HCC中含有豐富的幹細胞樣細胞( 圖 14B)。在功能層面上，用LNP-ASPM-v1 siRNA轉導HuH-1細胞可實質上抑制其在無血清及超低附著培養條件下形成腫瘤球的能力( 圖 14C)。此等發現共同支持LNP調配之ASPM-v1靶向siRNA的Wnt及幹性抑制功能。

實例 7 脂質奈米粒子調配之 ASPM - v1 靶向 siRNA 療法的藥效學研究

為了確定全身性LNP-siASPM-v1療法在所治療腫瘤細胞中之藥效學活性，三陰性乳癌(TNBC) MDA-MB-436細胞經慢病毒轉導GFP及螢火蟲螢光素酶(FF-Luc)融合載體(UBC-EGFP-T2A-Luc; System Biosciences)，且使用BD Influx ^TM細胞分選儀(BD Biosciences)分選GFP陽性細胞。隨後將細胞正位注射至免疫缺陷NOD/SCID小鼠之乳腺脂肪墊中。細胞接種後十天，當腫瘤可藉由生物發光(BLI)偵測到時，荷瘤小鼠接受劑量為每隻小鼠100 μg (約4 mg/kg)之LNP-siASPM-v1的靜脈內(IV)注射。三天後重複處理，且在第二次注射後24小時移出腫瘤。將腫瘤酶促解離成單細胞，且使用FACSAria ^TMIII細胞分選儀(BD Biosciences)分選GFP ⁺癌細胞用於後續分析( 圖 15A)。

如圖 15B所示，自經LNP-siASPM-v1處理之小鼠分離之大部分(平均88.7%) GFP ⁺腫瘤細胞在處理完成後24小時呈Cy5陽性，證實其成功地經siRNA轉導。隨時間推移，經siRNA轉導之細胞的百分比逐漸下降，估計半衰期為4.8天。

接下來，為了確定LNP-siASPM-v1在腫瘤細胞中之積聚，將經siRNA處理之小鼠體內移出的腫瘤組織在液氮中急凍，且切片用蠅虎蕈鹼(肌動蛋白絲染色劑)進行免疫螢光染色，以標記細胞輪廓。如圖 15C所示，共焦成像顯示，在正位TNBC模型中，全身性投與之siRNA成功地遞送至腫瘤細胞之細胞質中。

最後，為了確定全身性LNP-siASPM-v1療法對所治療腫瘤細胞中ASPM-i1之蛋白質豐度水平的減弱作用，收集自所治療腫瘤新鮮分選之GFP ⁺腫瘤細胞的蛋白質溶解物，且用ASPM-i1特異性兔多株抗體進行墨點法(Hsu等人, 2019a)。如所預期，與未處理腫瘤相比，siRNA療法實質上降低ASPM-i1之蛋白質豐度水平( 圖 15D)，證實全身性siASPM-v1療法確實特異性抑制所治療腫瘤細胞中ASPM-i1之表現。

實例8 ASPM-v1靶向siRNA療法在三陰性乳癌(TNBC)中之抗腫瘤及抗轉移作用

已證明LNP-ASPM-v1 siRNA對癌細胞之侵襲性偽足形成及侵襲能力的預期抑制作用，吾等接下來試圖研究其活體內治療效果。吾等使用正位乳癌進展模型探索全身性LNP-siASPM-v1是否可發揮抗轉移功效。將實例 7中建立之表現GFP及FF-Luc之TNBC MDA-MB-436細胞(10 ⁶個細胞)正位注射至NOD/SCID小鼠之乳腺脂肪墊中。細胞接種後十天，當藉由BLI可偵測到腫瘤時，荷瘤小鼠接受LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA)之重複靜脈內(IV；每3天每隻小鼠100 μg [約4 mg/kg]；共10次劑量)注射。根據製造商的建議(IVIS Imaging System, Caliper Life Sciences)，每週藉由生物發光成像(BLI)觀測所得原發性或轉移性肺腫瘤( 圖 16A)。結果顯示，不同劑量水平(每次注射2 mg/kg或4 mg/kg)之IV LNP-siASPM-v1療法可以劑量依賴性方式顯著降低原發性腫瘤之生長，高劑量水平之腫瘤控制率為81.2% ( 圖 16B)。如所預期，全身基因療法可完全預防肺部遠端轉移腫瘤之發生( 圖 16C)，突顯ASPM-v1靶向siRNA療法之強抗腫瘤及抗轉移功效。

儘管輔助化學療法取得進展，但約40%接受手術移除原發性腫瘤之乳癌患者會復發且最終死於轉移性疾病( Weigelt , B ., Peterse , J . L . 及 van ' t Veer , L . J . ( 2005 ). Breast cancer metastasis : markers and models . Nat Rev Cancer 5 , 591 - 602)。目前的輔助化學療法僅使乳癌患者之15年存活率提高3%-10%，突顯開發比化學療法更安全且更有效的抗轉移療法之迫切需要。沿著此條線，奈米粒子改善運載藥物之組織穿透及腫瘤吸收的能力，以及其將多種治療功能組合至單個平台中之潛力，使奈米粒子治療劑成為治療轉移性癌症之一種非常有前景的策略( Schroeder , A ., Heller , D . A ., Winslow , M . M ., Dahlman , J . E ., Pratt , G . W ., Langer , R ., Jacks , T . 及 Anderson , D . G . ( 2011). Treating metastatic cancer with nanotechnology. Nat Rev Cancer 12, 39-50)。由於ASPM-v1靶向siRNA療法在正位乳癌模型中顯示出顯著的抗轉移療效，因此吾等推測此奈米基因療法在預防轉移性疾病方面亦將具有極大效用。針對此可能性，吾等經由NOD/SCID小鼠之尾靜脈注射MDA-MB-436細胞。細胞接種後二十四小時，小鼠接受LNP-siASPM-v1之IV注射(每3天每隻小鼠4 mg/kg；共6次劑量) ( 圖 17A)。實際上，該療法完全預防遠端轉移之發生，尤其在肺部( 圖 17B及圖 17C)，支持ASPM-v1靶向siRNA療法在輔助環境下的治療潛力。

實例 9 ASPM - v1 靶向 siRNA 療法在肝細胞癌 ( HCC ) 中之抗腫瘤功效

吾等之前的發現表明，ASPM-v1靶向siRNA療法抑制癌細胞之侵襲性偽足形成及侵襲性以及其Wnt活性及幹性特性( 圖 14)。一致地，在前述正位乳癌模型中，瘤內(IT)注射LNP-siASPM-v1可減小原發性腫瘤之體積。此等發現，加上最近FDA批准脂質體囊封之siRNA療法用於肝病運甲狀腺素蛋白介導之澱粉樣變性(Patisiran, Alnylam)以及ASPM基因在HCC致瘤性及進展中之關鍵作用，促使吾等評估ASPM-v1靶向siRNA療法治療局部及/或晚期HCC之治療潛力。因此，吾等在皮下異種移植小鼠模型中經由IT注射將LNP-siASPM-v1投與已建立之HCC中，伴有或不伴有同時經口投與索拉非尼，一種常規用於晚期HCC之一線治療的多激酶抑制劑，其亦具有Wnt抑制作用 ( Lachenmayer , A ., Alsinet , C ., Savic , R ., Cabellos , L ., Toffanin , S ., Hoshida , Y ., Villanueva , A ., Minguez , B ., Newell , P ., Tsai , H . W . 等人 , ( 2012 ). Wnt - pathway activation in two molecular classes of hepatocellular carcinoma and experimental modulation by sorafenib . Clin Cancer Res 18 , 4997 - 5007 )。在此模型中，HuH-1細胞經慢病毒轉導GFP及螢火蟲螢光素酶融合載體，且如上文所描述分選GFP陽性細胞。將含細胞(1 × 10 ⁶個細胞)之100 μl (1:1基質膠:細胞)皮下接種至8週齡NOD/SCID小鼠之側腹中或正位接種至其左肝葉中，且藉由BLI評估腫瘤質量及分佈。

如圖 18A所示，瘤內注射LNP-siASPM-v1 (每3天0.8 mg/kg或2 mg/kg，共3次劑量)以劑量依賴性方式顯著減弱腫瘤生長。值得注意的是，該治療顯著減少原發性腫瘤的生長，2 mg/kg劑量水平之平均腫瘤控制率為92.8%。雖然LNP-siASPM-v1療法在0.8 mg/kg劑量水平下的抗腫瘤功效較不顯著，但其可明顯增強標準HCC治療劑索拉非尼之抗腫瘤功效，此意味著LNP調配之ASPM-v1靶向siRNA與索拉非尼在治療HCC方面具有潛在的協同作用( 圖 18B)。

接下來，吾等試圖將吾等研究結果進一步擴展至臨床上更相關的情境。由於影像引導之局部治療諸如消融術及經導管腫瘤療法為早期HCC患者廣泛接受的治療選項，因此吾等在HCC之正位小鼠模型中進行超音波引導之LNP調配之ASPM-v1靶向siRNA的注射( 圖 19A)。在超音波引導下，將人類HCC HuH-1細胞注射至NOD/SCID小鼠肝臟之左葉中。細胞接種後三週，在超音波引導下將LNP-siASPM-v1直接注射至腫瘤中。值得注意的是，將低劑量水平(0.8 mg/kg)之LNP-siASPM-v1注射至正位HuH-1腫瘤中可實質上減弱其生長( 圖 19B)，支持瘤內ASPM-v1靶向siRNA療法作為一種臨床上可行的方式來治療呈現可接近病灶之早期HCC患者。

全身性投與多激酶抑制劑或免疫檢查點抑制劑為晚期HCC患者之治療選項，但其與非常有限的存活益處或反應率相關。因此，吾等研究LNP調配之ASPM-v1靶向siRNA的全身性投與是否亦在正位HCC模型中發揮抗腫瘤功效。簡言之，將含表現FF-Luc之HuH-1細胞(1 × 10 ⁶個細胞)的100 μl (1:1基質膠:細胞)皮下接種至8週齡NOD/SCID小鼠之側腹中或正位接種至其左肝葉中。腫瘤建立後兩週，經由尾靜脈注射投與LNP-siASPM-v1 (每3天每隻小鼠100 μg [約4 mg/kg]；共6次劑量)或LNP-非目標對照siRNA ( 圖 20A)。如圖 20B所示，全身性投與LNP-siASPM-v1可有效轉導正位建立之HCC中的腫瘤細胞。重要的是，全身性LNP-siASPM-v1療法能夠明顯減弱腫瘤進展，平均腫瘤控制率為57.5% ( 圖 20C及圖 20D)；因此，接受該療法之小鼠存活時間顯著長於接受對照治療之彼等小鼠( 圖 20E)。

實例 10 有效下調各種類型之人類癌症中 ASPM - v1 之 表現的 siRNA 之組合

吾等之前在實例 5中的發現表明，ASPM-v1特異性siRNA之基因靜默作用在不同類型的惡性細胞諸如HEK293T細胞及乳癌MDA-MB-436細胞中差異很大( 圖 11)。由於吾等試圖選擇可有效靜默ASPM-v1在各種類型癌症中表現的siRNA，因此吾等開始重新選擇可在不同惡性細胞中實現最佳減弱功效的siRNA。

為此，吾等首先自實例 5中所描述之三十個siRNA中選擇十個可對HEK293T細胞中ASPM-v1之表現實現大於80%之減弱作用的siRNA。吾等隨後獲得合成的雙股siRNA (Dharmacon)，且使用Lipofectamine LTX試劑(ThermoFisher Scientific)將其中之各者轉導至HEK293T細胞、TNBC株MDA-MB-436細胞及HCC株HuH-1細胞中。先前已驗證對ASPM-v1表現之減弱作用的siRNA (siASPM-v1.8602；5'-GAGCUGCUAUCACUUUACAGC-3')作為陽性對照包括在內 (Hsu等人, 2019b)，且非目標對照siRNA (NT siRNA；5'-UGGUUUACAUGUCGACUAAUU-3'；Dharmacon)作為陰性對照包括在內。吾等使用LightCycler FastStart DNA MASTERPLUS SYBR Green I套組及LightCycler系統(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)，使用定量即時PCR (qRT-PCR)量測ASPM-v1之轉錄本含量。寡核苷酸引子係使用Primer Bank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)設計，且包括正向引子：GCG AAG AGT CTT AGC ACA G及反向引子：GTG GAA TAT CTT CTC CAA TAT CCC。吾等對13個siRNA中之各者在各株中之減弱功效進行平均，且相應地對其效能進行排序，從而鑑別出在所有3個株中可一致地實現大於80%之減弱功效的排名最高的siRNA。

為了開發本發明之吾等較佳實施例中之siRNA治療劑的活性醫藥成分(API)，吾等推斷(1)靶向ASPM-v1之mRNA之外顯子18上的不同片段的siRNA可避免由染色質構形引起之減弱功效的潛在變化，及(2) siRNA混合物由單一siRNA之一半量的各siRNA組成，由此可理論上減輕潛在毒性，諸如脫靶靜默及免疫刺激作用。因此，吾等選擇siASPM-v1.4822 (有義股：SEQ ID NO: 4；反義股：SEQ ID NO: 5)，其靶向外顯子18上之片段1 (ASPM-v1.e18.F1)；及siASPM-v1.7636 (有義股：SEQ ID NO: 6；反義股：SEQ ID NO: 7)，其靶向外顯子18上之片段3 (ASPM-v1.e18.F3)。吾等使用其1:1組合作為ASPM-v1靶向siRNA治療劑之API進行後續開發。

為了避免此等siRNA之潛在免疫原性且增加其在血清中之穩定性，吾等在反義股之UA或CA位點及有義股之所有嘧啶處添加2'-O-甲基化修飾，因為用LNP調配之siRNA的2'-O-甲基化修飾與全身投與時較少的免疫活化相關( Adami , R . C ., Seth , S ., Harvie , P ., Johns , R ., Fam , R ., Fosnaugh , K ., Zhu , T ., Farber , K ., McCutcheon , M ., Goodman , T . T . 等人 , ( 2011 ). An amino acid - based amphoteric liposomal delivery system for systemic administration of siRNA . Mol Ther 19 , 1141 - 1151)。為了增強血清穩定性，吾等另外添加兩個具有硫代磷酸酯鍵之去氧胸苷3'懸垂物至有義股及反義股( 表 2)。表 2siASPM-v1.7636 (siASPM-v1.m7635)及siASPM-v1.4822 (siASPM-v1.m4822)之化學修飾

序列ID	股	原始序列5'-3'	序列ID	經部分修飾之序列5'-3' ¹
siASPM-v1.4822	有義	GCGCACCAACUAUUUGCAG (SEQ ID NO: 4)	siASPM-v1.m4822	G mCG mCA mCmCAA mCmUA mUmUmUG mCAG dT*dT
	反義	CUGCAAAUAGUUGGUGCGC (SEQ ID NO: 5)		CUG mCAAA mUAGUUGGUGCGC dT*dT
siASPM-v1.7636	有義	CAGAAGACUGAUGGUAAAG (SEQ ID NO: 6)	siASPM-v1.m7636	mCAGAAGA mCmUGA mUGG mUAAAG dT*dT
	反義	CUUUACCAUCAGUCUUCUG (SEQ ID NO: 7)		CUU mUAC mCAU mCAGUCUUCUG dT*dT
非目標對照siRNA	有義	UGGUUUACAUGUCGACUAA	mNT siRNA	mUGG mUmUmUA mCA mUG mUmCGA mCmUAA dT*dT
	反義	UUAGUCGACAUGUAAACCA		U mUAGUCGA mCAUG mUAAAC mCA dT*dT

m，2'-O-甲基RNA；*，硫代磷酸酯鍵。 ¹加下劃線的為經修飾之核苷酸。

為了比較及驗證兩種新選擇之siRNA及其混合物的減弱功效，吾等使用Lipofectamine LTX試劑以具有或不具有化學修飾之siASPM-v1.7636、siASPM-v1.4822、其1:1混合物或非目標對照siRNA (NT siRNA)轉導MDA-MB-436細胞48小時，之後分離RNA且使用qRT-PCR量測ASPM-v1之轉錄本含量。如圖 21A所示，除了未經修飾之siASPM-v1.7636以外，所有測試的siRNA針對所有測試序列均可達成大於70%之相當的減弱功效。除了經化學修飾之siASPM-v1.7636產生的減弱功效大於未經修飾之siASPM-v1.7636之外，經化學修飾之siASPM-v1.7636及siASPM-v1.4822可達成與未經修飾之siRNA相當的減弱功效。吾等使用相同的轉導方法驗證經化學修飾之siRNA在HuH-01細胞中之減弱功效。如圖 21B所示，除了siASPM-v1.4822 (平均減弱功效= 68.6%)以外，所有測試序列均可達成大於75%的減弱功效。集體資料證實，用此等siRNA轉導在TNBC及HCC細胞中均可達成令人滿意的減弱功效，且其效能不會因引入化學修飾而受到影響。

已證實siASPM-v1.7636及siASPM-v1.4822之1:1混合物(下文稱為siASPM-v1 API)的基因靜默功效，吾等將其用作ASPM-v1靶向siRNA治療劑之API，作為本發明中之較佳實施例。為了驗證siASPM-v1 API抑制癌細胞侵襲性偽足形成、侵襲及發育路徑活性之作用，吾等使用Lipofectamine LTX試劑以100 nM之siASPM-v1 API或經化學修飾之非目標對照siRNA (NT siRNA)轉導HuH-01或MDA-MD-436細胞48小時，之後如先前所述(Eckert等人, 2011)將細胞塗鋪於明膠基質(Sigma-Aldrich, G1393)上。將細胞接種於明膠上6小時或更長時間，隨後用抗皮層肌動蛋白(4F11；Abcam, Cambridge, UK)或Alexa Fluor 647蠅虎蕈鹼(F-肌動蛋白染色；Invitrogen)進行免疫染色，且使用Leica TCS SP5共焦顯微鏡系統(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)使用共焦成像分析評估染色模式。在共焦顯微鏡下看到的皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺斑點代表自細胞體向下突出的侵襲性偽足的橫截面。如圖 22所示，與用NT siRNA處理之細胞相比，用siASPM-v1 API預處理HhH-1及MDA-MB-436細胞可顯著減少侵襲性偽足之數目，平均減少64.8% (HuH-01) ~63.7% (MDA-MB-436)。

已證實siASPM-v1 API對HCC及TNBC細胞之侵襲性偽足形成的抑制作用，吾等研究其是否可有效地抑制癌細胞之侵襲能力。使用Lipofectamine LTX試劑以100 nM之siASPM-v1 API轉導HuH-1細胞或MDA-MB-436細胞48小時，之後將細胞在10% FBS存在下接種於具有一層薄薄的I型膠原蛋白(BD Biosciences)之Transwell插片(BD Biosciences, San Jose, CA)上且使其跨越膠原蛋白侵襲12小時。將侵襲穿過插入膜之細胞固定，用SYTOX Green (Invitrogen)染色，且使用螢光顯微鏡計數。如圖 23所示，與對侵襲性偽足之抑制作用一致，用siASPM-v1 API轉導細胞可實質上降低HuH-1 (平均降低89.2%)及MDA-MB-436細胞(與用NT siRNA處理之彼等細胞相比，平均降低75.3%)之侵襲能力。

如吾等之前在實例 4中之發現所描述，ASPM-i1有助於癌細胞中之多個發育信號傳導路徑的活性，包括Wnt、Hedgehog及Notch。為了證實用siASPM-v1 API轉導細胞抑制其功能可抑制癌細胞中此等發育相關信號傳導路徑之活性，吾等用攜帶Wnt、Hedgehog (Hh)及Notch三重螢光素酶報導子(pMuLE_EXPR_CMV-eGFP_TOP-NLuc1.1_12GLI-FLuc_CBF-GLuc；Addgene質體#113862)之慢病毒載體感染HuH-1或MDA-MB-436細胞(Maier等人, 2019)。在單獨的實驗中，為了進一步刺激此等路徑之活性，細胞用重組人類WMT3A (250 ng/ml，16小時；R&D Systems, Minneapolis, MN)、重組人類音蝟因子(SHH；3 µg/ml，24小時；Sigma-Aldrich) (Liu等人, 2006)、重組人類JAG1-Fc (5 µg/ml，24小時；Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) (Dees等人, 2011)或媒劑處理。隨後分別使用Nano-Glo ^®螢光素酶分析系統、ONE-Glo ^®螢光素酶分析系統及Renilla-Glo ^®螢光素酶分析系統(Promega, Madison, WI)量測未受刺激或受刺激細胞之Wnt、Hedgehog及Notch報導子活性。

如圖 24所示，用siASPM-v1 API轉導HuH-1細胞明顯降低Wnt、Hedgehog及Notch報導子活性，此在配位體刺激之細胞中甚至更為明顯。類似地，用siASPM-v1 API轉導亦明顯抑制未受刺激及配位體刺激之MDA-MB-436細胞中的Wnt/Hedgehog/Notch報導子活性。集體資料證實，藉由siASPM-v1 API抑制ASPM-v1之表現確實可有效抑制不同類型癌細胞中之此等致癌發育路徑。

吾等擴展上述siRNA選擇策略，在ASPM-v1靶向siRNA之設計中納入其他高等哺乳動物物種。吾等選擇家犬(犬)，因為其ASPM基因與人類基因具有高一致性百分比(82.69%)，僅次於猴的直系同源物(99.52%)。吾等使用NCBI BLAST搜尋比對人類、犬及猴ASPM基因之外顯子18序列，從而鑑別出保守序列長度超過25個核苷酸之十個一致子區段。值得注意的是，此等子區段之序列在人類、犬及食蟹獼猴基因中為一致的，允許在後續毒性及臨床前測試中靈活選擇相關物種。吾等使用如上文所描述之準則設計及選擇候選siRNA。

為了比較候選ASPM-v1靶向siRNA (siASPM-v1)之基因靜默作用，吾等獲得合成的雙股siRNA (Dharmacon)且使用Lipofectamine LTX試劑(ThermoFisher Scientific)各自轉導至HuH-1肝細胞癌(HCC)細胞或HCT-116結腸直腸癌(CRC)細胞中。如上文所描述，吾等使用qRT-PCR量測ASPMv1之轉錄本含量。吾等對其效能進行排序且由此鑑別出兩種排名最高的siRNA，包括siASPM-v1.4360 (有義股：SEQ ID NO: 8；反義股：SEQ ID NO: 9)及siASPM-v1.4822 (有義股：SEQ ID NO: 4；反義股：SEQ ID NO: 5)，其在HuH-1細胞及HCT-116細胞中均可一致地達成大於75%之減弱功效。吾等驗證用該兩種siASPM-v1轉導犬A-72纖維母細胞(Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan, #60480)產生ASPM-v1表現之令人滿意的(＞ 75%) KD。為了開發所選siASPM-v1作為ASPM-v1靶向siRNA藥物之活性醫藥成分(API)對肝外癌症之潛在效用，吾等在MDA-MB-436三陰性乳癌(TNBC)細胞以及NCI-H209及NCI-H146小細胞肺癌(SCLC)細胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)中測試其對ASPM-v1之基因靜默作用。吾等使用Lipofectamine LTX試劑(ThermoFisher Scientific)以候選siASPM-v1轉導各細胞株，且如上文所描述使用qRT-PCR量測ASPM-v1之轉錄本含量。吾等驗證自HCC及CRC細胞中選出之兩種排名最高的siASPM-v1，包括siASPM-v1.4360及siASPM-v1.4822，為在MDA-MB-436 TNBC細胞中效果最好的siRNA，減弱功效分別為96.71%及83.95%。同樣，用該兩種siASPM-v1轉導NCI-H209及NCI-H146 SCLC細胞亦對ASPM-v1達成優異的基因靜默作用，在NCI-H209細胞中分別達成84.49%及86.31%之減弱作用，在NCI-H146細胞中分別達成81.37%及83.77%之減弱作用。此等高度一致且穩健的資料支持納入該兩種siASPM-v1用於後續開發不同癌症之ASPM-v1靶向siRNA治療劑。

siASPM-v1.4360及siASPM-v1.4822靶向外顯子18上之不同mRNA子區段，且因此吾等將其1:1組合指定為LNP囊封之si ASPM-v1之API的另一種型式(si ASPM-v1 API_V2)。此外，為了避免此等siRNA之潛在免疫原性且增加其在血清中之穩定性，吾等在反義股之UA或CA位點及有義股之所有嘧啶處添加2'-O-甲基化修飾，因為用LNP調配之siRNA的2'-O-甲基化修飾與全身投與時較少的免疫活化相關( Adami , R . C ., Seth , S ., Harvie , P ., Johns , R ., Fam , R ., Fosnaugh , K ., Zhu , T ., Farber , K ., McCutcheon , M ., Goodman , T . T . 等人 , ( 2011 ). An amino acid - based amphoteric liposomal delivery system for systemic administration of siRNA . Mol Ther 19 , 1141 - 1151)。為了增強血清穩定性，吾等添加兩個具有硫代磷酸酯鍵之去氧胸苷3'懸垂物至有義股及反義股。經化學修飾之siRNA分別命名為「si ASPM-v1.m4360-4378」及「si ASPM-v1.m4822-4840」，其中「m」指示「經修飾」( 表 3)。表 3siASPM-v1.4360 (siASPM-v1.m4360)之化學修飾

序列ID	股	原始序列5'-3'	序列ID	經部分修飾之序列5'-3' ¹
si ASPM-v1 .4360	有義	CCUGCAAUCUAGGAUAAGA (SEQ ID NO: 8)	si ASPM-v1 .m4360	m C m C m UG m CAA m U m C m UAGGA m UAAGA dT*dT
	反義	GGACGUUAGAUCCUAUUCU (SEQ ID NO: 9)		GGACGU mUAGAUCC mUAUUCU dT*dT

為了比較及驗證基因靜默功效，吾等使用Lipofectamine LTX試劑以具有或不具有如表2及表3中所示之化學修飾的siASPM-v1.m4360、siASPM-v1.m4822、其1:1混合物(siASPM-v1 API_V2)或非目標siRNA (siNT)轉導Huh-1及HCT-116細胞48小時，之後分離RNA且使用qRT-PCR量測ASPM-v1之轉錄本含量。如以下所示

圖 25A，在HuH-1 HCC細胞中，所有測試的siRNA對ASPM-v1可達成約70%之基因靜默功效。值得注意的是，經化學修飾之siRNA可達成比未經修飾之siRNA略微更佳的減弱功效(約75%)。同樣，在HCT-116 CRC細胞中(

圖 25B)，所有測試序列達成82.26%之平均減弱功效。此等資料表明，siASPM-v1.m4360-4378、siASPM-v1.m4822-4840或其1:1混合物(亦即siASPM-v1 API_V2)在HCC及CRC細胞中均可對ASPM-v1達成令人滿意的基因靜默作用，且其效能不會因引入化學修飾而受到影響。

接下來，吾等對si ASPM-v1 API_V2在其抑制癌細胞侵襲性偽足形成、侵襲及發育相關路徑活性之功效方面進行功能表徵。首先，吾等使用Lipofectamine LTX試劑以100 nM之si ASPM-v1 API_V2或經化學修飾之非目標siRNA (m-siNT)轉導HuH-1或HCT-116細胞48小時，之後將細胞塗鋪於明膠基質(Sigma-Aldrich, G1393)上。將細胞接種於明膠上12小時，隨後用侵襲性偽足標誌物TKS5 (抗TKS5；1:200；純系13H6.3, Merck, Burlington MA)或抗Col1-3/4C (I型膠原蛋白裂解位點；1:25，ImmunoGlobe Antikörpertechnik GmbH, Himmelstadt, Germany)進行免疫染色，且使用Leica TCS SP5共焦顯微鏡系統(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)使用共焦成像分析評估染色模式。在共焦顯微鏡下看到的TKS5 ⁺Col1-3/4C ⁺斑點代表自細胞體向下突出且降解周圍膠原蛋白1基質之功能性侵襲性偽足的橫截面。如圖 26所示，與用siNT處理之細胞相比，用siASPM-v1 API_V2預處理HhH-1及HCT-116細胞可顯著減少侵襲性偽足之數目，在HuH-1細胞中平均減少90.69%且在HCT-116細胞中平均減少81.31%。

已證實si ASPM-v1 API_V2對癌細胞之侵襲性偽足形成的抑制作用，吾等接下來研究其是否可有效地抑制癌細胞之侵襲能力。為此，使用Lipofectamine LTX試劑以100 nM之si ASPM-v1 API_V2轉導HuH-1或HCT-116細胞48小時，之後將細胞在10% FBS存在下接種於具有一層薄薄的I型膠原蛋白(BD Biosciences)之Transwell插片(BD Biosciences, San Jose, CA)上且使其跨越膠原蛋白侵襲12小時。將侵襲穿過插入膜之細胞固定，用SYTOX Green (Invitrogen)染色，且使用螢光顯微鏡計數。如圖 27所示，與對侵襲性偽足之抑制作用一致，與用m-siNT處理之細胞相比，用si ASPM-v1 API_V2轉導細胞可實質上降低HuH-1 (平均降低69.1%)及HCT-116細胞(平均降低77.7%)之侵襲能力。

ASPM-iI已被證明嚴格控制多個發育相關及致癌信號傳導路徑之活性，包括Wnt、Hedgehog (Hh)及Notch路徑。吾等最近發現，ASPM-i1亦增加癌細胞中Yes相關蛋白(YAP)及PDZ結合模體(TAZ)之穩定性，兩者均為TEAD轉錄因子之共活化因子。為了證實藉由用si ASPM -v1 API_V2轉導細胞抑制其功能可抑制癌細胞中前述此等發育及幹性相關路徑之活性，吾等用攜帶Wnt、Hh及Notch三重螢光素酶報導子(pMuLE_EXPR_CMV-eGFP_TOP-NLuc1.1_12GLI-FLuc_CBF-GLuc；Addgene質體#113862) (Maier等人, 2019)或Hippo路徑轉錄因子TEAD (BPS Bioscience #79833, San Diego, CA)之慢病毒載體感染HuH-1或HCT-116細胞。細胞分別用重組人類WNT3A (250 ng/ml，16小時；R&D Systems, Minneapolis, MN)、重組人類音蝟因子(SHH；3 µg/ml，24小時；Sigma-Aldrich)、重組人類JAG1-Fc (5 µg/ml，24小時；Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)處理，以刺激Wnt、Hh或Notch路徑之活性。隨後使用Nano-Glo ®螢光素酶分析系統(Wnt報導子)、ONE-Glo ®螢光素酶分析系統(Hh及TEAD報導子)及Renilla-Glo ^®螢光素酶分析系統(Notch報導子) (Promega, Madison, WI)量測未受刺激或受刺激之細胞的Wnt、Hh、Notch及TEAD報導子活性。如圖 28所示，用si ASPM -v1 API_V2轉導HuH-1細胞明顯降低所有測試路徑之報導子活性，包括Wnt、Hh、Notch及TEAD，證實藉由si ASPM -v1 API_V2抑制 ASPM -v1之表現可有效地抑制癌細胞中之多個致癌及發育相關路徑。

在無血清及非錨定依賴性條件下形成大型三維球樣結構或「腫瘤球」之能力反映癌細胞之致瘤潛力。鑒於減弱ASPM-v1表現顯著抑制發育及幹性相關Wnt、Hh及Notch路徑以及YAP/TEAD之轉錄活性，吾等研究用siASPM-v1 API_V2處理癌細胞是否可抑制其腫瘤球形成能力。使用Lipofectamine LTX試劑以100 nM之siASPM-v1 API_V2或m-siNT轉導HuH-1肝細胞癌細胞或HCT-116結腸直腸癌細胞48小時，之後將細胞以限制稀釋度(每孔10000、1000、100及10個細胞)塗鋪於24孔非黏附培養盤中。十天後評估腫瘤球之存在。使用ELDA軟體(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)分析及繪製限制稀釋分析法之資料。如圖 29所示，用siASPM-v1 API_V2轉導HhH-1或HCT-116細胞明顯抑制HuH-1或HCT-116細胞之腫瘤球形成能力，突顯其在肝細胞癌及結腸直腸癌中之治療潛力。

圖 1(A)及(B)顯示ASPM表現與乳癌轉移相關。(A)顯示，在Pawitan等人的資料集中，ASPM為與乳癌轉移相關的排名最高的Wnt相關因子。(B)顯示Kaplan-Meier存活曲線，比較根據KM Plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service)及SurvExpress (http://bioinformatica.mty.itesm.mx:8080/Biomatec/SurvivaX.jsp)查詢之ASPM表現量分層的乳癌患者之無遠端轉移存活期。P值係使用對數秩檢驗計算。

圖 2(A)及(B)顯示ASPM表現之基因減弱(減弱)降低乳癌細胞之侵襲能力。使用慢病毒介導之減弱穩定地下調HCC-1954及MDA-MB-436乳癌細胞之ASPM-v1表現。使用改良的博伊登室侵襲分析法(Boyden chamber invasion assay)檢查對照或ASPM減弱的癌細胞跨重組基底膜的侵襲能力。(A)顯示侵襲細胞之代表性免疫螢光影像，其中細胞核用CYTOX-green染色。比例尺=100 µm。(B)顯示(A)中侵襲細胞之數目。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。

圖 3(A)及(B)包括與ASPM表現之基因減弱(減弱)對乳癌及胰臟癌遠端轉移之影響相關的數幅圖。(A)顯示在細胞接種後指定時間(週；wk)的轉移性肺腫瘤的代表性生物發光(BLI)。(B)顯示(A)中之BLI信號，顯示為隨時間變化的正規化光子計數。資料顯示為平均值± SEM (n = 5隻小鼠/組)。與對照IgG相比，**P ≤ 0.01。

圖 4(A)及(B)包括與乳癌進展之患者來源之異種移植(PDX)模型中微轉移癌症之ASPM表現量升高相關的數幅圖。(A)顯示代表性流動式細胞測量術圖，顯示原發性腫瘤及肺微轉移中CD298陽性癌細胞之ASPM染色模式。(B)顯示兩個PDX模型(BR1282及BR1474)之微轉移病灶中CD298陽性癌細胞之ASPM表現升高。資料為平均值±SEM。**P ＜ 0.01。

圖 5顯示人類ASPM同功異型物1及同功異型物2蛋白質之推定域架構。CH，鈣調理蛋白同源；ARM，犰狳；IQ，異白胺酸及麩醯胺酸。突出顯示由外顯子18編碼之區域，其攜帶67個IQ域。

圖 6(A)至(F)包括與正常及癌症組織中ASPM同功異型物之表現模式相關的數幅圖。(A)顯示代表性人類乳癌組織及正常乳房組織中ASPM同功異型物1 (ASPM-i1)及ASPM同功異型物2 (ASPM-i2)之免疫組織化學(IHC)染色模式。比例尺，50 µm。(B)顯示ASPM-i1及ASPM-i2之單細胞染色強度(1+至3+)分佈的條形圖。資料為平均值±SEM (n = 40)。***P ＜ 0.001。(C)顯示代表性人類乳癌組織之侵襲前沿中ASPM-i1的IHC染色模式。比例尺，100 µm。(D)顯示具有ASPM-i1中度(2+)至高度(3+)染色強度之癌細胞百分比的條形圖。資料為平均值±SEM (n = 46)。***P ＜ 0.001。(E)顯示代表性正常、肝炎及肝硬化肝組織及HCC組織中ASPM-i1及ASPM-i2之IHC染色模式。比例尺，50 µm。(F)顯示正常肝組織(n = 24)、肝炎肝組織(n = 10)、肝硬化肝組織(n = 50)及HCC組織(n = 111)中ASPM-i1及ASPM-i2之單細胞染色強度(1+至3+)分佈的條形圖。資料為平均值±SEM。與正常肝臟相比，**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 7顯示在侵襲性乳癌MDA-MB-436細胞中，ASPM同功異型物1 (ASPM-i1)與PAR平面細胞極性蛋白，包括PAR-6α、PAR-6β、散亂蛋白-2 (DVL2)、CDC42及SMURF1免疫沉澱。非侵襲癌細胞作為對照包括在內。

圖 8(A)及(B)包括與癌細胞侵襲性偽足中ASPM同功異型物1 (ASPM-i1)與PAR/PCP蛋白DVL2、PAR6β及CDC42之特異性相互作用相關的數幅圖。(A)顯示共聚焦成像，其顯示乳癌MDA-MB-436細胞之侵襲性偽足中ASPM-i1 (紅色)、DVL2、PAR6β、CDC42或N-WASP (藍色)及侵襲性偽足標誌物皮層肌動蛋白(綠色)的共定位。比例尺，10 μm。(B)顯示在侵襲性MDA-MB-436細胞之侵襲性偽足中，ASPM-i1與DVL2、PAR6β、CDC42及N-WASP特異性免疫沉澱。皮層肌動蛋白及TKS5作為侵襲性偽足標記物包括在內。

圖 9(A)至(C)包括與ASPM變異1 (ASPM-v1；其編碼「ASPM同功異型物1」或「ASPM-i1」)表現之基因減弱(減弱)對乳癌細胞之侵襲性偽足形成及侵襲能力之影響相關的數幅圖。乳癌MDA-MB-436細胞用特異性靶向ASPM基因轉錄變異體1之小髮夾RNA (shRNA) (ASPM-v1 shRNA)進行慢病毒轉導，以減弱ASPM-v1之表現。(A)顯示ASPM-v1 shRNA之特異性同功異型物(包括ASPM.e18 shRNA #1及ASPM.e18 shRNA #4)對MDA-MB-436細胞中ASPM-i1蛋白質豐度水平之影響。(B)顯示ASPM-v1表現之減弱減少DVL2、PAR6β、CDC42及膜型基質金屬蛋白酶(MT1-MMP)向MDA-MB-436細胞之侵襲性偽足的募集。顯示用對照shRNA或ASPM.e18 shRNA #4進行慢病毒轉導之MDA-MB-436細胞的侵襲性偽足溶解物中指定蛋白質之免疫墨點。(C)顯示ASPM-v1表現之減弱降低MDA-MB-436細胞之侵襲能力，此係使用改良的博伊登室侵襲分析法檢查。左圖，侵襲細胞之代表性免疫螢光影像，其中細胞核用CYTOX-green染色。比例尺，50 µm。右圖，侵襲細胞之定量。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。

圖 10顯示ASPM變異1 (ASPM-v1)表現之基因減弱(減弱)影響多個發育及幹性相關路徑。使用慢病毒介導之ASPM.18 shRNA#4轉導減弱ASPM-v1的293T細胞或感染對照shRNA慢病毒且用Cignal Finder幹細胞與分化10路徑報導子陣列中各別的報導子構築體轉導的彼等細胞中指定發育及幹性相關信號傳導路徑的相對螢光素酶報導子活性(每組n = 3)。與對照shRNA相比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 11包括與選擇靶向ASPM變異1 (ASPM-v1)之最佳化siRNA相關的兩幅圖。顯示使用qRT-PCR分析的用等總量(所有siRNA為50 nM)的步驟4中所描述之三種排名最高的siRNA或其不同組合轉導之MDA-MB-436細胞中ASPM-v1之轉錄本含量(平均值±SEM；n = 3)。與NT siRNA相比，*P ＜ 0.5；**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 12(A)及(B)包括與特異性靶向ASPM變異1之外顯子18之mRNA區的脂質奈米粒子(LNP)調配之小干擾RNA混合物(siRNA) (LNP-siASPM-v1)之作用相關的兩幅圖。(A)顯示用增加濃度(0-50 nM)之LNP-ASPM-v1 siRNA處理乳癌MDA-MB-436細胞可劑量依賴性降低ASPM-v1之轉錄本含量。(B)顯示用LNP-siASPM-v1處理MDA-MB-436細胞劑量依賴性降低ASPM同功異型物1 (ASPM-i1)之蛋白質豐度水平，但不會降低ASPM蛋白同功異型物2 (ASPM-i2)之蛋白質豐度水平。NT siRNA，非目標siRNA。

圖 13(A)及(B)顯示LNP-siASPM-v1對癌細胞之侵襲性偽足形成及侵襲能力的影響。(A)顯示LNP調配之ASPM-v1特異性siRNA (LNP-siASPM-v1)對癌細胞之侵襲性偽足形成的抑制作用。左圖顯示用LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA) (均為100 nM × 72小時)處理之MDA-MB-436細胞中皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺斑點(黃色)的共焦視圖，其代表向下突出的侵襲性偽足的橫截面。右圖，每個細胞的皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺侵襲性偽足之數目。比例尺，10 µm。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001(B)顯示對MDA-MB-436細胞之處理實質上抑制細胞之侵襲能力，此係使用雙室侵襲分析法檢查。左圖顯示侵襲細胞之代表性免疫螢光影像，其中細胞核用CYTOX-green (綠色)染色。比例尺=500 μm。右圖，侵襲細胞之數目。資料為平均值±SEM。**P ＜ 0.01。

圖 14(A)至(C)包括與LNP調配之ASPM變異1特異性siRNA (LNP-siASPM-v1)對Wnt活性以及肝細胞癌(HCC)細胞之幹性特性及致瘤性之影響相關的數幅圖。(A)顯示用LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA) (均為100 nM × 72小時)處理且隨後用WNT3A (250 ng/ml × 16小時)處理之HuH-1細胞中Wnt特異性螢光素酶表現的倍數。(B)顯示如(A)中用LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA處理之HuH-1細胞中醛去氫酶(ALDH)陽性細胞群(代表HCC中之癌症幹性)的百分比。資料顯示為平均值± SEM (n = 3)。與(A)及(B)中之LNP-NT siRNA相比，***P ≤ 0.001。(C)顯示LNP-siASPM-v1對HCC細胞腫瘤球形成能力之抑制作用。如(A)中用LNP-siASPM-v1或LNP NT siRNA處理HuH-1細胞。隨後將細胞在無血清及非附著培養盤中培養十天。顯示所得腫瘤球之代表性位相差影像。比例尺，50 µm。右圖，限制稀釋分析法證明細胞之腫瘤球形成功效。資料為平均值± SEM (各組中n = 4)。

圖 15(A)至(D)包括與全身性LNP調配之ASPM變異1靶向siRNA療法LNP-siASPM-v1在三陰性乳癌(TNBC)正位小鼠模型中之藥效學研究相關的數幅圖。(A)顯示將表現GFP及螢火蟲螢光素酶(FF-Luc)之乳癌MDA-MB-436細胞正位注射至免疫缺陷NOD/SCID小鼠之乳腺脂肪墊中。細胞接種後十天，當腫瘤可藉由生物發光(BLI)偵測時，荷瘤小鼠每三天接受經Cy5標記之LNP-siASPM-v1 (每隻小鼠100 μg [約4 mg/kg])的靜脈內注射，共2次劑量。在第二次注射後的指定時間移出腫瘤進行細胞解離，且分選GFP ⁺癌細胞進行後續分析。(B)顯示代表性FACS圖，其顯示(A)中描述之癌細胞的GFP及Cy5染色模式，且顯示Cy5 ⁺GFP ⁺細胞群之頻率。右圖，在處理完成後不同時間Cy5 ⁺癌細胞之百分比。T ₁ _/ ₂，半衰期。(C)代表性共焦成像，顯示靜脈內LNP-ASPM-v1 siRNA處理後乳房腫瘤細胞之細胞質中經Cy5 (紅色)標記之siRNA的積聚。藉由用蠅虎蕈鹼(綠色)對F-肌動蛋白進行染色來標記細胞質。細胞核用DAPI (藍色)複染。比例尺，5 μm。(D)代表性免疫墨點，其顯示全身性LNP-siASPM-v1療法對所治療腫瘤中ASPM-同功異型物1 (ASPM-i1)之蛋白質豐度水平的特異性減弱效應。右圖，用LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA)或LNP-siASPM-v1處理之荷瘤小鼠中ASPM-i1之相對蛋白質豐度水平。資料為平均值± SEM (各組中n = 3)。*P ＜ 0.05。

圖 16(A)至(C)包括與ASPM變異1 (ASPM-v1)靶向siRNA療法在三陰性乳癌(TNBC)正位小鼠模型中之抗轉移功效相關的數幅圖。(A)顯示將穩定表現螢火蟲螢光素酶(FF-Luc)之TNBC MDA-MB-436細胞正位注射至免疫缺陷NOD/SCID小鼠之乳腺脂肪墊中。細胞接種後兩週，當腫瘤可藉由BLI偵測時，荷瘤小鼠接受LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA)之靜脈內(IV；每三天2 mg/kg或4 mg/kg；共6次劑量)注射。(B)顯示在(A)中之處理開始後指定時間的原發性或轉移性腫瘤(肺窗口)的代表性BLI。(C)顯示(B)中之腫瘤體積，其量化為隨時間變化的BLI正規化光子計數。資料顯示為平均值± SEM (n = 5隻小鼠/組)。與LNP-NT siRNA相比，**P ≤ 0.01；***P ≤ 0.001。

圖 17(A)至(C)包括與全身性ASPM變異1 (ASPM-v1)靶向siRNA療法在三陰性乳癌(TNBC)之遠端轉移中之抗轉移作用相關的數幅圖。(A)顯示NOD/SCID小鼠尾靜脈注射表現螢火蟲螢光素酶(FF-Luc)之MDA-MB-436細胞。細胞接種後二十四小時，小鼠接受LNP-siASPM-v1 (每三天每隻小鼠100 μg [約4 mg/kg]；共6次劑量)或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA)之靜脈內注射，且藉由BLI監測轉移性腫瘤之分佈。(B)顯示在細胞接種後指定時間的轉移性腫瘤的代表性BLI。(C)顯示(B)中之BLI信號，顯示為隨時間變化的正規化光子計數。資料顯示為平均值± SEM (n = 5隻小鼠/組)。與LNP-NT siRNA相比，**P ≤ 0.01。

圖 18(A)及(B)包括與瘤內ASPM變異1 (ASPM-v1)靶向siRNA療法在肝細胞癌(HCC)之小鼠異種移植模型中之抗腫瘤功效相關的數幅圖。(A)顯示將穩定表現GFP及螢火蟲螢光素酶(FF-Luc)之HuH-1細胞皮下注射至免疫缺陷NOD/SCID小鼠之側腹中。向荷瘤小鼠投與LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA；每三天每次腫瘤內注射劑0.8 mg/kg或2 mg/kg寡核苷酸；共3次劑量)，伴有或不伴有同時腹膜內(IP)注射索拉非尼(15 mg/kg/天，連續十天)或媒劑。顯示在細胞接種後指定時間的腫瘤的代表性生物發光(BLI)。(B)顯示(A)中描述之荷瘤小鼠的腫瘤體積，其量化為隨時間變化的BLI正規化光子計數。資料顯示為平均值± SEM (n = 8隻小鼠/組)。與LNP-NT siRNA相比，*P ≤ 0.05。資料顯示為平均值± SEM (n = 3隻小鼠/組)。

圖 19(A)及(B)包括與超音波引導之瘤內ASPM變異1 (ASPM-v1)靶向siRNA療法在肝細胞癌(HCC)之正位小鼠異種移植模型中之抗腫瘤功效相關的數幅圖。(A)顯示將HuH-1細胞注射至NOD/SCID小鼠之肝臟左葉中。細胞接種後兩週，荷瘤小鼠接受超音波引導之LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA；每三天0.8 mg/kg；共3次注射)之腫瘤內注射。(B)顯示(A)中之腫瘤在研究終點時的代表性照片。右圖，隨時間推移繪製的腫瘤體積。資料顯示為平均值± SEM (n = 5隻小鼠/組)。與LNP-NT siRNA相比，**P ≤ 0.01。

圖 20(A)至(E)包括與全身性ASPM變異1 (ASPM-v1)靶向siRNA在肝細胞癌(HCC)之正位小鼠模型中之抗腫瘤功效相關的數幅圖。(A)顯示將表現GFP及FF-Luc之HuH-1細胞注射至免疫缺陷NOD/SCID小鼠之肝臟左葉中。細胞接種後兩週，荷瘤小鼠隨後接受LNP-siASPM-v1或LNP-非目標對照siRNA (NT siRNA；每三天4 mg/kg；共六次劑量)之重複靜脈內注射。(B)顯示siRNA在經處理小鼠之肝腫瘤中積聚。在連續兩次注射LNP-siASPM-v1 (每隻小鼠每次注射100 µg)後三天移出(A)中建立之腫瘤進行細胞解離，且對細胞進行FACS分析。顯示自LNP調配及經Cy5標記之siASPM-v1分離之GFP陽性腫瘤細胞或來自未處理腫瘤之彼等腫瘤細胞中Cy5的代表性FACS圖。(C)顯示在(A)中之處理開始後指定時間的腫瘤的代表性BLI。(D)顯示(C)中之腫瘤體積，其量化為隨時間變化的BLI正規化光子計數。資料顯示為平均值± SEM (n = 7隻小鼠/組)。與LNP-NT siRNA相比，*P ≤ 0.05。(E)顯示(D)中描述之小鼠隨時間變化的存活百分比。箭頭：siRNA注射。

圖 21(A)及(B)包括與未經修飾及經化學修飾之siASPM-v1.7636及siASPM-v1.4822在癌細胞中之基因靜默功效相關的數幅圖。(A)顯示使用qRT-PCR分析所分析的如表5中所描述用具有或不具有化學修飾之siASPM-v1.7636、siASPM-v1.4822或其1:1混合物轉導之乳癌MDA-MB-436細胞中ASPM變異1 (ASPM-v1)的轉錄本含量(平均值±SEM；n = 3)。(B)顯示如(A)中所描述用未經修飾或經化學修飾之siASPM-v1.7636、siASPM-v1.4822或其1:1混合物轉導之肝細胞癌HuH-1細胞中ASPM-v1的轉錄本含量(平均值±SEM；n = 3)。與經化學修飾之非目標(NT) siRNA (NT siRNA)相比，***P ＜ 0.001。

圖 22(A)及(B)包括與siASPM-v1活性醫藥成分(API)對癌細胞侵襲性偽足形成之影響相關的數幅圖。(A)顯示siASPM-v1 API對HCC HuH-1細胞侵襲性偽足形成之抑制作用。左圖展示使用Lipofectamine LTX試劑轉導有siASPM-v1 API或經化學修飾之非目標對照siRNA (NT siRNA；均為100 nM × 72小時)之HuH-1細胞中皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺斑點(黃色)的共焦視圖，其代表向下突出的侵襲性偽足的橫截面。右圖，每個細胞的皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺(代表侵襲性偽足)之數目。比例尺，10 µm。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。(B)顯示siASPM-v1 API對TNBC MDA-MB-436細胞之侵襲性偽足形成的抑制作用。左圖展示使用Lipofectamine LTX試劑轉導有siASPM-v1 API或非目標對照siRNA (NT siRNA；均為100 nM × 72小時)之HuH-1細胞中皮層肌動蛋白 ⁺F-肌動蛋白 ⁺斑點(黃色)的共焦視圖，其代表向下突出的侵襲性偽足的橫截面。右圖，每個細胞的侵襲性偽足之數目。比例尺，10 µm。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。

圖 23顯示用siASPM-v1活性醫藥成分(API)轉導抑制肝細胞癌HuH-1或乳癌MDA-MB-436細胞之侵襲能力。左圖顯示侵襲細胞之代表性免疫螢光影像，其中細胞核用CYTOX-green (綠色)染色。比例尺=100 µm。右圖，侵襲細胞之數目。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。

圖 24(A)及(B)包括與siASPM-v1活性醫藥成分(API)對癌細胞中Wnt、Hedgehog及Notch路徑活性之影響相關的數幅圖。使用Lipofectamine LTX試劑用100 nM siASPM-v1 API或非目標對照siRNA (NT siRNA)轉導攜帶三重螢光素酶報導子以量測Wnt、Hh及Notch路徑活性之HuH-1肝癌細胞(A)或MDA-MB-436乳癌細胞(B) 48小時。隨後分別用SHH (3 μg/ml × 24小時)、WNT3A (250 ng/ml × 16小時)、JAG1-Fc (5 µg/ml × 24小時)或媒劑刺激細胞24小時，接著量測各別報導子活性。與對照相比，**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 25(A)及(B)包括與未經修飾及經化學修飾之siASPM-v1.4360及siASPM-v1.4822在癌細胞中之基因靜默功效相關的數幅圖。(A)顯示使用qRT-PCR分析所分析的用100 nM siASPM-v1.4360及siASPM-v1.4822或其1:1混合物(命名為「siASPM-v1活性醫藥成分型式2」或「siASPM-v1 API_V2」)或其經化學修飾之型式轉導(48小時)之HuH-1肝癌細胞中ASPM-v1的轉錄本含量(平均值±SEM；n = 3)。siNT，非目標siRNA。(B)顯示如(A)中用未經修飾或經化學修飾之siRNA轉導之HCT-116結腸直腸癌細胞中ASPM-v1的轉錄本含量(平均值±SEM；n = 3)。與siNT相比，***P ＜ 0.001。

圖 26(A)及(B)包括與siASPM-v1活性醫藥成分型式2 (API_V2)對癌細胞侵襲性偽足形成之抑制作用相關的數幅圖。(A)顯示siASPMv1 API_V2對HuH-1肝癌細胞侵襲性偽足形成之抑制作用。左圖顯示用siASPM-v1 API_V2或經化學修飾之非目標對照siRNA (m-siNT；均為100 nM × 72小時)轉導之HuH-1細胞中TKS5 ⁺Col1-3/4C ⁺斑點(黃色)的共焦視圖，其代表向下突出的侵襲性偽足的橫截面。右圖，每個細胞的TKS5 ⁺Col1-3/4C ⁺(代表功能性侵襲性偽足)之數目。比例尺，10 µm。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。(B)顯示siASPM-v1 API_V2對HCT-116結腸直腸癌細胞之侵襲性偽足形成的抑制作用。左圖顯示用siASPM-v1 API_V2或m-siNT (均為100 nM × 72小時)轉導之HCT-116細胞中TKS5 ⁺Col1-3/4C ⁺斑點(黃色)的共焦視圖，其代表向下突出的侵襲性偽足的橫截面。右圖，每個細胞的侵襲性偽足之數目。比例尺，10 µm。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。

圖 27(A)及(B)包括與siASPM-v1活性醫藥成分型式2 (API_V2)對癌細胞侵襲能力之抑制作用相關的數幅圖。(A)顯示用經化學修飾之非目標siRNA (m-siNT)或siASPM-v1 API_V2處理之侵襲HhH-1肝細胞癌細胞或HCT-116結腸直腸癌細胞的代表性免疫螢光影像，其中細胞核用CYTOX-green (綠色)染色。比例尺=100 µm。(B)顯示侵襲細胞之數目。資料為平均值±SEM。***P ＜ 0.001。

圖 28顯示siASPM-v1活性醫藥成分型式2 (API_V2)對癌細胞中Wnt、Hedgehog (Hh)及Notch路徑以及TEAD活性之抑制作用。HuH-1肝細胞癌細胞(左)或HCT-116大腸直腸細胞(右)用Wnt、Hh、Notch信號傳導路徑或TEAD轉錄活性之報導子構築體進行慢病毒感染。隨後使用Lipofectamine LTX試劑用100 nM經化學修飾之非目標siRNA (m-siNT)或siASPM-v1 API_V2轉導細胞48小時，之後分別用SHH (3 μg/ml × 24小時)、WNT3A (250 ng/ml × 16小時)、JAG-Fc (5 µg/ml × 24小時)刺激細胞24小時。與m-siNT相比，**P ＜ 0.01；***P ＜ 0.001。

圖 29(A)及(B)包括與siASPM-v1活性醫藥成分型式2 (API_V2)對癌細胞之腫瘤球形成能力之抑制作用相關的數幅圖。(A)顯示用經化學修飾之非目標siRNA (m-siNT)或siASPM-v1 API_V2轉導之HuH-1肝細胞癌或HCT-116結腸直腸癌細胞形成之腫瘤球的代表性位相差影像。比例尺，100 mm。(B)顯示限制稀釋分析法，其證明用m-siNT或siASPM-v1 API_V2轉導之HuH-1或HCT-116細胞的腫瘤球形成功效(1/n)。n = 8個獨立實驗。具有95%信賴區間之最大似然估計。***P ＜ 0.001；似然比檢驗及卡方檢驗。

Claims

一種多核苷酸，其包含與具有SEQ ID NO:1中所示之核苷酸序列的ASPM基因之mRNA互補的核苷酸序列；或2)包含與SEQ ID NO: 1互補之核苷酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%序列一致性的連續區段的核苷酸序列。
如請求項1之多核苷酸，其包含與具有SEQ ID NO: 3中所示之核苷酸序列的由人類ASPM基因轉錄變異體1之外顯子18編碼的mRNA互補的核苷酸序列，或包含與SEQ ID NO: 3互補之核苷酸序列具有至少70%、至少80%或至少90%序列一致性的連續區段的核苷酸序列。
如請求項1或2之多核苷酸，其中該多核苷酸為shRNA、siRNA或dsRNA。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸為siRNA分子，其中該siRNA分子包含：(a)雙螺旋體區；及(b)無懸垂物區或至少一個懸垂物區，其中各懸垂物區含有六個或更少核苷酸，其中該雙螺旋體區由有義區及反義區組成，其中該有義區及該反義區一起形成該雙螺旋體區且該反義區及該有義區各自長度為15-30個核苷酸，且該反義區包含與選自SEQ ID NO: 3之序列互補的序列。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子具有該反義區及該有義區，其各自長度為15-25個鹼基。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 3、5、7或9之序列互補的序列。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 4相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 5相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 4中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 5中所示之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子包含形成另一雙股RNA二聚體之有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 6相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 7相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 6中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 7中所示之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子包含形成另一雙股RNA二聚體之有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO: 8相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO: 9相差不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 8中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 9中所示之核苷酸序列。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該siRNA分子具有至少一個懸垂物區或不具有懸垂物區。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該有義股及該反義股中之一或兩者可進一步修飾為經修飾之siRNA。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中經修飾之核苷酸包括經2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟胺基磷酸酯、3'端去氧胸腺嘧啶核苷酸、包含非天然鹼基之核苷酸、包含5'硫代磷酸酯基團之核苷酸及與膽固醇基衍生物及十二烷酸雙癸醯胺基團連接之末端核苷酸。
如前述請求項中任一項之多核苷酸，其中該經修飾之siRNA之雙股區中約10%至約30%的核苷酸為2'-O-甲基(2'OMe)核苷酸，或該經修飾之siRNA之兩股中約10%至約30%的核苷酸為2'-O-甲基(2'OMe)核苷酸。
一種siRNA分子池，其中該池包含一或多個第一siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第二siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第三siRNA分子或其經修飾之siRNA分子及第四siRNA分子或其經修飾之siRNA分子，其中該第一siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 3之序列互補的序列；該第二siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 5之序列互補的序列；該第三siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 7之序列互補的序列；及該第四siRNA分子為化學合成的雙股siRNA分子，其中：(a)該雙股siRNA分子之各股的長度為15至30個核苷酸；及(b)該siRNA分子之一股包含與選自SEQ ID NO: 9之序列互補的序列。
如請求項17之池，其中該池包含一或多個第二siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第三siRNA分子或其經修飾之siRNA分子及第四siRNA分子或其經修飾之siRNA分子。
如請求項17之池，其中該池包含一或多個第二siRNA分子或其經修飾之siRNA分子、第三siRNA分子或其經修飾之siRNA分子及第四siRNA分子或其經修飾之siRNA分子；其中該第二siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 4中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 5中所示之核苷酸序列；該第三siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 6中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 7中所示之核苷酸序列；及該第四siRNA分子包含有義股及反義股，其中該有義股包含如SEQ ID NO: 8中所示之核苷酸序列且該反義股包含如SEQ ID NO: 9中所示之核苷酸序列。
一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之多核苷酸及醫藥載劑、稀釋劑及/或佐劑。
一種奈米粒子，其包含如前述請求項中任一項之多核苷酸及脂質奈米粒子(LNP)、脂質體、微胞、病毒體、核酸複合物及其任何混合物。
一種用於抑制個體之惡性腫瘤之生長、局部區域擴散及遠端轉移及/或治療個體之實體腫瘤及/或腫瘤轉移的方法，其包含向該個體投與如前述請求項中任一項之多核苷酸、如請求項17或18中任一項之池、如請求項20之醫藥組合物或如請求項21之奈米粒子。
如請求項22之方法，其中該實體癌為肝細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、胰臟癌、胃癌及肺癌。