TW202424195A

TW202424195A - 抗病毒核酸及組合物

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Publication number: TW202424195A
Application number: TW112139588A
Authority: TW
Inventors: 凱文Ｖ摩里斯
Original assignee: 澳洲葛瑞菲斯大學
Priority date: 2022-10-17
Filing date: 2023-10-17
Publication date: 2024-06-16
Also published as: EP4605533A1; WO2024082003A1; JP2025534045A; CN120092089A; KR20250089530A; AU2023366039A1

Abstract

本發明大體上係關於用於抑制冠狀病毒複製及治療由冠狀病毒感染所致之疾病的組合物及方法。更特定言之，本發明提供能夠抑制冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)複製之核酸及該等核酸用於治療經該病毒感染患者之用途。

Description

抗病毒核酸及組合物

本發明大體上係關於用於抑制冠狀病毒複製及治療由冠狀病毒感染所致之疾病的組合物及方法。更特定言之，本發明提供能夠抑制冠狀病毒(例如SARS-CoV-2)複製之核酸及該等核酸用於治療經該病毒感染患者的用途。

SARS-CoV-2係在人類及其他動物中具傳染性的正義單股RNA病毒，其係2019冠狀病毒疾病(COVID-19)之病因，已嚴重影響全球範圍內的人類。截至2022年9月，據保守估計，自當前大流行開始以來，SARS-CoV-2感染人數超過6.1億，其中超過650萬人死於COVID-19疾病(參見WHO冠狀病毒(COVID-19)儀錶板)。

在人類中，SARS-CoV-2感染導致一系列結果，許多人經歷極輕微或幾乎無法辨別的症狀，而其他人則表現為中度至重度之疾病，估計全球範圍內死亡率為大約1%。雖已將大量資源及精力用於經由疫苗研發採取之預防措施，但眾所周知的是，治療措施對於降低發病率及死亡率極為重要。特定言之，適合於在疾病早期階段期間向患者投與之抗病毒劑提供減少病毒複製且由此抑制嚴重疾病發作之機會，尤其在高風險類別(例如免疫功能不全者、老年人等)之人群中。

需要有效的治療性治療以對抗COVID-19疾病，包括能夠在COVID-19疾病早期階段期間抑制病毒複製之彼等治療。

本發明藉由提供能夠抑制SARS-CoV-2表現之核酸，滿足了COVID-19疾病治療性治療領域的需求。

本發明之各種態樣係關於能夠抑制冠狀病毒(諸如SARS-CoV-2)複製之核酸。此等核酸及包括其之組合物可用於治療由冠狀病毒感染(包括COVID-19)引起之疾病。

在一些實施例中，提供一種核酸，該核酸包含15至30個核苷酸且能夠與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 27中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交，或能夠與該SARS-CoV-2序列之片段雜交。核酸可包含以下或由以下組成：15至25個核苷酸；15至23個核苷酸；15至22個核苷酸；15至21個核苷酸；15至20個核苷酸；15至19個核苷酸；19個核苷酸；20個核苷酸；21個核苷酸、22個核苷酸或23個核苷酸。

在其他實施例中，提供一種核酸，其與以下序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性： SEQ ID NO: 2或24中定義之序列，其中核酸能夠與SEQ ID NO: 23中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交；或 SEQ ID NO: 4或26中定義之序列，其中核酸能夠與SEQ ID NO: 25中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交；或 SEQ ID NO: 6或28中定義之序列，其中核酸能夠與SEQ ID NO: 27中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交。

在其他實施例中，提供本發明之核酸之片段，其中片段長度為10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸。

在另其他實施例中，提供一種用於抑制SARS-CoV-2表現之雙股核酸，其包含有義股及反義股，其中：有義股包含SEQ ID NO: 1或23中定義之序列或其變體或片段，且反義股包含SEQ ID NO: 2或24中定義之序列或其變體或片段；或有義股包含SEQ ID NO: 3或25中定義之序列或其變體或片段，且反義股包含SEQ ID NO: 4或26中定義之序列或其變體或片段；或有義股包含SEQ ID NO: 5或27中定義之序列或其變體或片段，且反義股包含SEQ ID NO: 6或28中定義之序列或其變體或片段。

在其他實施例中，本發明之核酸可包含：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸；2'-去氧修飾之核苷酸；鎖核苷酸；無鹼基核苷酸；2'-胺基修飾之核苷酸；2'-烷基修飾之核苷酸；嗎啉基核苷酸；包含非天然鹼基之核苷酸；2'-O-甲基修飾之核苷酸；2'O-甲氧基乙氧基修飾之核苷酸；2'氟修飾之核苷酸；5-甲基修飾之胞苷；假尿苷；包含5'-硫代磷酸酯基之核苷酸及與膽固醇基衍生物或十二酸雙癸醯胺基連接之末端核苷酸；包含胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦醯基羧酸、膦醯基羧酸酯、膦醯基乙酸、膦醯基甲酸、膦酸甲酯、膦酸硼酯或O-甲基胺基亞磷酸酯之核苷酸；或包含去氧核糖之核苷酸。

在其他實施例中，本發明之核酸可與配位體結合。

在其他實施例中，本發明之核酸可為RNA、反義RNA或siRNA。

本發明之其他態樣提供包含本文所描述之核酸之細胞、包含編碼本文所描述之RNA、反義RNA或siRNA之核酸序列的載體、包含本文所描述之核酸及/或載體的脂質奈米粒子以及包含本文所描述之核酸、載體及/或脂質奈米粒子的醫藥組合物。

在一些實施例中，本發明之脂質奈米粒子可包含以下中之任何一或多者：非陽離子脂質、陽離子脂質、用於防止奈米粒子聚集之經結合脂質。

在其他實施例中，醫藥組合物可為用於靜脈內投與之液體或用於鼻內投與之氣溶膠。

本發明之其他態樣提供用於抑制細胞中冠狀病毒複製的方法、用於治療個體之冠狀病毒感染的方法及用於治療個體之COVID-19疾病的方法。

在一些實施例中，提供一種用於抑制細胞中冠狀病毒複製的方法，該方法包含向細胞投與本文所描述之核酸、載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物，由此引起細胞中冠狀病毒mRNA分子之降解且抑制冠狀病毒之該複製。

在其他實施例中，提供一種用於治療個體之冠狀病毒感染的方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本文所描述之核酸、載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物，由此抑制冠狀病毒之複製且治療該感染。

在其他實施例中，提供一種用於治療個體之COVID-19疾病之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本文所描述之核酸、載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物，由此抑制冠狀病毒之複製且治療該COVID-19疾病。

在一些實施例中，冠狀病毒為SARS-CoV-2。

本發明之其他態樣提供本文所描述之各種核酸、載體、脂質奈米粒子及醫藥組合物的藥劑製備方法及醫療用途。

在一些實施例中，提供本文所描述之核酸、載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物的用途，其用於製備供抑制細胞中冠狀病毒之複製、治療個體之冠狀病毒感染或治療個體之COVID-19疾病的藥劑。

在其他實施例中，提供本文所描述之核酸、載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物，其用於抑制細胞中冠狀病毒之複製、治療個體之冠狀病毒感染或治療個體之COVID-19疾病。

在一些實施例中，冠狀病毒為SARS-CoV-2。

定義除非上下文另外明確規定，否則本申請案中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。舉例而言，除非另行說明，否則術語「細胞」亦包括多個細胞。

如本文中所使用，術語「包含」意謂非詳盡意義上之「包括」。字語「包含(comprising)」之變化形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」具有相應改變的含義。因此，例如，「包含」給定組分A之組合物可排他性地僅由組分A組成，或可包括一或多種額外組分，諸如組分B。類似地，「包含」給定核酸之醫藥組合物可包括一或多種額外組分，例如醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑及/或載劑。

如本文中所使用，術語「約」用於提及所列舉之數值時，包括所列舉之數值及在所列舉數值加或減百分之十內的數值。

如本文中所使用，術語「SARS-CoV-2」係指重度急性呼吸道症候群相關之冠狀病毒2。

如本文中所使用，術語「核酸」係指核苷酸及核苷酸聚合物。所涵蓋之核苷酸包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其經修飾之形式及其組合。核苷酸之聚合物可呈單股形式或雙股形式，包括單股及雙股RNA、單股及雙股DNA以及雙股RNA/DNA雜合體。核酸之非限制性實例包括所有形式之RNA，諸如例如siRNA、mRNA、miRNA、shRNA反義RNA、嚮導RNA及dicer基質RNA及siRNA。所有此等形式之RNA可在功能上靶向及抑制病毒。「核酸」之其他非限制性實例包括所有形式之DNA，諸如例如基因體DNA、互補DNA (cDNA)、微環DNA及質體DNA。術語「核酸」之範疇內亦包括包含核苷酸類似物、經修飾之主鏈鍵聯或殘基及其類似者的核酸，該等核酸具有與DNA或RNA分子或殘基相關之物理結構，且該等核酸能夠與DNA或RNA殘基或其類似物形成氫鍵(亦即該等核酸能夠與DNA或RNA殘基或其類似物雜交而形成鹼基對)，因此該等核酸與其結構上相關之核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸殘基(亦即鹼基核苷酸)具有類似的結合特性，且該等核酸可以與鹼基核苷酸類似之方式代謝。核酸類似物之非限制性實例包括甲基化、碘化、溴化或生物素化殘基及糖組分或磷酸二酯主鏈經改變的殘基。所涵蓋之核酸類似物亦包括(但不限於)核苷酸鹼基經修飾(諸如假尿苷、2'氟、2'O-甲基、5-甲基胞苷、2'O-甲氧基乙氧基)的核酸類似物及具有肽核酸主鏈及鍵聯的核酸類似物。其他類似物核酸包括具有經修飾之糖(例如去氧核糖)、非離子主鏈、陽性主鏈及非核糖主鏈(例如鎖核酸或磷醯二胺嗎啉基寡核苷酸)的核酸。

如本文中所使用，術語「RNA干擾」係指一種導入哺乳動物細胞中的作用機制，其可以序列特異性及強效方式特異性切斷細胞中蛋白質之產生。在該過程中，RNA分子經由轉譯或轉錄抑制來參與雙股RNA對基因表現的序列特異性抑制。舉例而言，RNA干擾可經由引入小干擾RNA (siRNA，15-30 bp之雙股RNA)來啟動，該等小干擾RNA經由序列互補特異性靶向mRNA，導致該等mRNA隨後降解。另外，小髮夾RNA (shRNA)亦可抑制轉錄物及基因表現。

如本文中所使用，「反義」核酸或序列係與特定目標核酸之至少一個組分互補的核酸或序列，此互補有助於與目標核酸雜交(例如在生理條件下)，從而抑制涉及目標核酸之生物活性，非限制性實例包括抑制目標核酸之轉譯、改變轉錄物剪接及其類似者。反義核酸將與核酸目標特異性雜交，此意謂與其他非目標核酸相比，反義核酸例如在生理條件下與其核酸目標雜交的傾向性更大。反義核酸可包括包含核苷酸類似物、經修飾之主鏈鍵聯或殘基及其類似者的彼等核酸。

如本文中所使用，術語「siRNA」及「小干擾RNA」係指單股或雙股RNA (核糖核酸)，其存在於包含目標核酸之細胞中時，能夠藉由與目標核酸雜交來抑制給定目標核酸之表現且由此抑制其標準生物活性(例如，其轉譯成蛋白質)。靶核酸可為單股或雙股RNA、單股或雙股DNA，且非限制性實例包括信使RNA (mRNA)及啟動子序列。單股或雙股siRNA之長度通常可為15至50個核苷酸。siRNA可在功能上靶向且抑制病毒。

如本文中所使用，術語「shRNA」及「短髮夾RNA」係指具有緊密髮夾環之人工RNA分子，其可用於經由RNA干擾(RNAi)使目標基因表現靜默。shRNA包含配對之反義股及有義股的莖區，該等反義股及有義股由未配對的構成環之核苷酸連接，類似於內源性微RNA。技術人員應瞭解，shRNA一旦遞送至細胞，即可負載至RNA誘導沉默複合物(RISC)中，此降解隨從有義股。反義(嚮導)股將RISC引導至具有互補序列之mRNA以進行降解。因此，shRNA可在功能上靶向且抑制病毒且在功能上等效於siRNA。

如本文中所使用，術語「環」或「環區」係接合兩個互補核酸股的序列。在某些實施例中，環區之長度為4至20個核苷酸，諸如長度為15至19個核苷酸。環區之0%至50%可與環區之另一部分互補。技術人員將充分瞭解，環區之核苷酸序列可變化且可為例如(5'-GCAA-3')、(5'-GCGC-3')或(5'-TTGC-3')或其他序列。如本文中所使用，術語「雜交(hybridise/hybridisation)」係指核酸股藉由互補鹼基配對之結合，且包括基於部分互補或基於完全互補之結合的情況。如一般熟習此項技術者已知，兩個核酸股之間的雜交程度可受諸如溫度、鹽濃度及其類似者之參數影響，且兩個互補或部分互補的核酸股將以特定方式雜交且避免與其他潛在結合搭配物雜交的條件可使用標準最佳化容易地確定。

如本文中所使用，術語「變體」係指基本上類似的核酸或多肽序列。一般而言，序列變體具有共同的定性生物活性。此外，此類序列變體可與參考序列之全長或與參考序列之指定區域共有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。術語「變體」之含義內亦包括同源物，其通常為來自不同物種的多肽或核酸，但與本文中所揭示之相應多肽或核酸共有實質上相同的生物功能或活性。

如本文中所使用，「序列一致性」百分比應理解為對兩個序列進行比較而得出，其中該等序列經比對得出序列之間的最大相關性。此可包括在一或兩個序列中插入「間隙」以增強比對程度。隨後可在所比較之各序列長度或其部分內測定序列一致性百分比。舉例而言，核苷酸序列(「目標序列」)與另一核苷酸序列(「查詢序列」)具有至少95%「序列一致性」意欲意謂目標序列與查詢序列一致，不同之處在於目標序列較查詢序列每100個核苷酸可包括至多五個核苷酸改變。換言之，為獲得與查詢序列具有至少95%序列一致性之核苷酸序列，目標序列中至多5% (亦即，100個中有5個)核苷酸可插入另一核苷酸或經另一核苷酸取代或缺失。兩個序列之間的序列一致性之百分比可藉由在比較窗內比較兩個最佳比對序列來確定。相比於不包含缺失或添加之參考序列(例如衍生自另一物種之參考序列)，比較窗中之序列之一部分可例如包含缺失或添加(亦即間隙)，以便最佳地比對兩個序列，或反之亦然。接著可藉由如下步驟計算序列一致性百分比：測定兩個序列中存在之一致核苷酸的位置數，得到匹配位置數，將匹配位置數除以比較窗中之總位置數且將結果乘以100，得到序列一致性百分比。在兩個或更多個核酸序列之情形下，序列一致性百分比係指使用以下序列比對演算法中之一者或藉由手動比對及目視檢查所量測，在比較窗或指定區域內針對最大對應性進行比較及比對時，在指定區域(或在未指定時，在整個序列)內相同核苷酸之指定百分比。對於序列比較，通常一個序列充當與測試序列比較之參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。接著，序列比較演算法基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。用於比較之序列比對方法係此項技術中已知的。可使用已知電腦程式以習知方式實現序列之最佳配對以測定序列一致性，該等已知電腦程式包括(但不限於)：PC/Gene程式中之CLUSTAL (可獲自Intelligenetics, Mountain View, California)；ALIGN程式(第2.0版)及GCG Wisconsin Genetics Software Package第10版中之GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA (可獲自Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA)。使用此等程式之比對可使用預設參數來執行。用於測定查詢序列與目標序列之間的最佳整體匹配的另一種方法(亦稱為全域序列比對)可使用FASTDB電腦程式基於Brutlag及同事(Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990))之演算法來測定。

如本文中所使用，關於核酸之術語「片段」係指彼核酸之成分。通常，片段具有與核酸相同之定性生物活性，其可包含例如與另一目標核酸雜交，使得目標核酸之表現降低、受抑制及其類似行為。片段可來源於本發明之核酸或替代地可藉由一些其他方式(例如化學合成)合成。

如本文中所使用，術語「經分離」在核酸或其他生物實體之情形下應理解為意謂經分離之核酸或其他生物實體至少部分不含且在一些情況下不含或基本上不含核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他物質，該等物質通常在經分離之核酸或其他生物實體之天然/原生狀態下所發現而伴隨其出現。「經分離」之核酸或其他生物實體可經純化以便與其他多種生物實體部分或完全分離，該等多種生物實體通常在經分離之核酸或其他生物實體之天然/原生狀態下所發現而伴隨其出現。

如本文中所使用，術語「治療(treat/treating/treatment)」及其類似術語係指減少或改善病症/疾病及/或與其相關的症狀。應瞭解，雖然不排除，但治療病症或病況並不一定要求病症、病況或與其相關之症狀完全消除。然而，經考慮，病症、病況或與其相關之症狀與治療開始之前相比應得到改善。

如本文中所使用，術語「個體」包括任何具有經濟、社會或研究意義之動物，包括牛類、馬類、綿羊類、靈長類、禽類及嚙齒類物種。因此，「個體」可為哺乳動物，諸如例如人類或非人類哺乳動物。

如本文中所使用，向個體投與之給定組合物或類似物之「治療有效量」應理解為足以部分或完全改善正在經治療之病況或疾病的量，包括例如減少病況或疾病之症狀(諸如藉由降低症狀之嚴重程度或次數)或消除症狀。舉例而言，相對於給定症狀，治療有效量可使得症狀減少至少5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或100%。實際「治療有效量」將視所投與之特定組合物、正在經治療之病況或疾病、正在經治療之個體之年齡及健康狀況等而定。此類參數係用於評估之常規參數，且可由一般熟習此項技術者容易地測定。

以下實施方式充分詳細地傳達本發明之例示性實施例，以使一般熟習此項技術者能夠實踐本發明。所描述之各種實施例之特徵或侷限性未必限制本發明之其他實施例或整個本發明。因此，以下實施方式並不限制本發明之範疇，本發明之範疇僅由申請專利範圍界定。

一般熟習此項技術者應瞭解，在不脫離廣義描述之本發明之精神或範疇的情況下，可對特定實施例中所揭示之本發明進行許多變化及/或修改。因此，本發明實施例應被視為在所有方面均為說明性而非限制性的。

抑制性核酸本發明提供經設計以抑制目標基因之表現及/或抑制非轉譯目標序列(例如調節序列)之生物活性的核酸。

在不受限制之情況下，由本文所描述之抑制性核酸靶向之基因及調節序列可來源於感染宿主生物體後導致疾病或病況的病原體。舉例而言，病原體可為能夠感染哺乳動物個體(包括人類)之病毒。

病毒可為RNA病毒，諸如例如冠狀病毒。非限制性實例包括：α冠狀病毒，包括人類冠狀病毒HCoV-229E及HCoV-NL63；及β冠狀病毒，包括人類冠狀病毒SARS-CoV-1 (導致嚴重急性呼吸道症候群)、SARS-CoV-2 (導致2019冠狀病毒病/COVID-19)、MERS-CoV (導致中東呼吸症候群)、HCoV-HKU1及HCoV-OC43。

本文所描述之抑制性核酸可抑制病毒蛋白，包括冠狀病毒蛋白之表現。藉助於非限制性實例，抑制性核酸可抑制結構冠狀病毒蛋白(例如刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白或核衣殼蛋白)之表現。蛋白質可為病毒複製所必需的，諸如例如解旋酶蛋白。另外或替代地，抑制性核酸可抑制非結構冠狀病毒蛋白之表現。另外或替代地，抑制性核酸可抑制ORF1ab及/或聚合酶基因之表現。

本文所描述之抑制性核酸可抑制病毒基因體之非轉譯區段之生物活性。舉例而言，該等抑制性核酸可抑制冠狀病毒之5'或3'非轉譯區(亦即5'UTR或3'UTR)中的莖環結構(例如冠狀病毒5'UTR之莖環5 (SL5))之生物活性。

本文所描述之抑制性核酸可為單股或雙股的(包括(但不限於)髮夾結構)。

本文所描述之抑制性核酸之長度可在以下之間：15與30個核苷酸、15與25個核苷酸、15與20個核苷酸、18與25個核苷酸或25與30個核苷酸或18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。

雙股抑制性核酸可以雙螺旋之各股長度相同或長度不同的形式提供。雙股抑制性核酸可因此包含一或多個單股突出物(overhang)，該一或多個單股突出物具有至少1、2、3或4個核苷酸、1至2個核苷酸、1至4個核苷酸、2至4個核苷酸、2至5個核苷酸、1至10個核苷酸、2至10個核苷酸或5至10個核苷酸。突出物可提供於有義股之5'及/或3'端、反義股之5'及/或3'端、有義股之5'端及反義股之5'端或有義股之3'端及反義股之3'端處。

本文所描述之抑制性核酸(例如抑制性核酸之變體)可含有一或多個與目標序列之失配(例如1、2、3、4或5個失配核苷酸，或小於5、小於4或小於3個失配核苷酸)。失配可位於核酸中心部分之5'及/或3'處，包括例如在其3'及/或5'末端之6、5、4、3或2個核苷酸內。舉例而言，在由SEQ ID NO: 1至20或23至42中之任一者定義之核酸序列的情況下，與其各別目標序列之失配可不存在於SEQ ID NO: 1至20或23至42之中心9、10、11、14、15、16、17或18個核苷酸中。基於本文所描述之方法及此項技術中之公共常識，一般技術者可容易地確定含有與其目標序列失配之核苷酸的本文所描述之抑制性核酸之給定變體是否仍可有效抑制目標基因之表現及/或非轉譯目標序列(例如調節序列)之生物活性。另外，一般技術者應瞭解，由不同突出物形成之siRNA在效能方面不存在實質性差異，且突出物之組合物似乎並不在目標mRNA識別及裂解中起重要作用。siRNA可具有dTdT突出物，但同樣可具有UU或AA突出物或另一突出物，諸如與mRNA序列互補之突出物，或可能不存在突出物。

本文所描述之抑制性核酸可包含一或多個修飾，諸如例如經修飾之主鏈、核苷間鍵之取代、糖組分之取代、核鹼基及其類似者。通常，且雖然並不要求，但修飾可改善核酸之一或多個效能參數(例如穩定性、與目標序列之雜交強度，提供更簡單/更節省成本的製造)。此項技術中一般技術者熟知可獲得之各種核酸修飾、其益處及如何將其引入參考序列中。

本文所描述之抑制性核酸可使用此項技術中已知之標準方法製造，包括例如描述於「 Current protocols in nucleic acid chemistry 」 ,Beaucage, S. L.等人(編), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA中之方法，該文獻之全部內容以交叉引用之方式併入本文中。用於產生無修飾之核酸的適合且非限制性化學合成方法包括利用常見核酸，諸如在3'末端處之胺基亞磷酸酯及在5'末端處之二甲氧基三苯甲基的程序(描述於例如Usman等人, 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845；Scaringe等人, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433中)。以抑制性核酸(例如siRNA)為特定實例，非限制性方法包括涉及合成、脫除保護基及分析之方法，其闡述於例如美國專利第6,649,751號、第6,673,918號、第6,686,463號、第6,989,442號及第6,995,259號中。替代地，該等抑制性核酸可單獨合成且在合成後例如藉由連接組合在一起(參見Bellon等人, 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951；Bellon等人, 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204；國際PCT公開案第WO 93/23569號；Shabarova等人, 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247；Moore等人, 1992, Science 256, 9923)或藉由合成及/或脫除保護基後進行雜交而組合在一起。其亦可依美國專利第5,889,136號、第6,008,400號及第6,111,086號中所描述而合成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列或SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 1中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列或SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，核酸包含SEQ ID NO: 3或25中所定義之序列或SEQ ID NO: 3或25中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 3或25中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 3或25中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列或SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 5或27中所定義之序列或SEQ ID NO: 5或27中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 5或27中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 5或27中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列或SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列或SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列或SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 9或31中所定義之序列或SEQ ID NO: 9或31中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 9或31中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 9或31中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 10或32中所定義之序列或SEQ ID NO: 10或32中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 10或32中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 10或32中定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列或SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 12或34中所定義之序列或SEQ ID NO: 12或34中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 12或34中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 12或34中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列之變體或片段。該變體可包含與SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 14或36中所定義之序列或SEQ ID NO: 14或36中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 14或36中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 14或36中定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列或SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 16或38中所定義之序列或SEQ ID NO: 16或38中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 16或38中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 16或38中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 17或39中所定義之序列或SEQ ID NO: 17或39中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 17或39中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 17或39中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列或SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之某些態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列或SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，該核酸包含SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列或由其組成，或包含SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列之變體或片段。該變體可包含與SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

在本發明之其他態樣中，提供抑制性核酸，其包含藉由互補鹼基配對而雜交之第一核酸股及第二核酸股或由其組成。在一些實施例中，第一股及第二股可呈髮夾結構。在其他實施例中，第一股及第二股不呈髮夾結構(亦即其各自在其5'末端及3'末端處分開地終止)。任一股或兩股可在其3'端處具有未雜交之核苷酸突出物(例如1、2、3、4或5個未雜交之核苷酸)。替代地，任一股上可均不存在突出序列。任一個或兩個股之5'端可磷酸化及/或任一或兩個股之3'端可羥化。

第一股可包含SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列或SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 1或23中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列或SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 2或24中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 3中定義之序列或SEQ ID NO: 3或25中定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 3或25中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 3或25中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列或SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 4或26中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 5中定義之序列或SEQ ID NO: 5或27中定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 5或27中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 5或27中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列或SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 6或28中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列或SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 7或29中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列或SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 8或30中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 9或31中所定義之序列或SEQ ID NO: 9或31中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 9或31中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 9或31中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 10或32中定義之序列或SEQ ID NO: 10或32中定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 10或32中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 10或32中定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列或SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 11或33中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 12或34中定義之序列或SEQ ID NO: 12或34中定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 12或34中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 12或34中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列或SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 13或35中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 14或36中所定義之序列或SEQ ID NO: 14或36中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 14或36中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 14或36中定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列或SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 15或37中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 16或38中定義之序列或SEQ ID NO: 16或38中定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 16或38中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 16或38中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 17或39中定義之序列或SEQ ID NO: 17或39中定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 17或39中定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 17或39中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列或SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 18或40中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

替代地，第一股可包含SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列或SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 19或41中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。第二股可包含SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列或SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列之變體或片段或由其組成。該變體可包含與SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性之序列或由其組成。在指定突出物的地方時，該變體可能包括不同的突出物。該等片段可包含SEQ ID NO: 20或42中所定義之序列之10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸片段或由其組成。

醫藥組合物、劑量及投與途徑本發明之抑制性核酸可以併入至醫藥組合物中。該等醫藥組合物可使用本領域中一般熟習此項技術者已知之方法製備。適合方法之非限制性實例描述於Gennaro等人(編), (1990), 「 Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA中。

醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或稀釋劑。本文中所涵蓋之「醫藥學上可接受」之載劑、賦形劑及/或稀釋劑係當投與至特定接受體(諸如人類或非人類動物)時不產生不良反應之物質。醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及稀釋劑一般亦與組合物之其他成分相容。適合賦形劑、稀釋劑及載劑之非限制性實例可見於「 Handbook of Pharmaceutical Excipients」第4版, (2003)Rowe等人(編), The Pharmaceutical Press, London, American Pharmaceutical Association, Washington。醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及稀釋劑之非限制性實例包括脫礦質水或蒸餾水；生理鹽水溶液；植物油，諸如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油；聚矽氧油，包括聚矽氧烷，諸如甲基聚矽氧烷、苯基聚矽氧烷及甲基苯基聚矽氧烷；揮發性聚矽氧；礦物油，諸如液體石蠟、軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物，諸如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級烷醇，例如乙醇或異丙醇；低級芳烷醇；低級聚伸烷二醇或低級烷二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或丙三醇；脂肪酸酯，諸如棕櫚酸異丙酯、十四烷酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯啶酮；瓊脂；角叉菜膠；黃蓍膠或阿拉伯膠；及石油膏。通常，一或多種載劑將形成10重量%至99.9重量%之組合物。

醫藥組合物可呈適合於注射投與之形式，呈適合於口服攝取之調配物形式(諸如膠囊、錠劑、囊片、酏劑)，呈適合於局部投與之膏劑、霜劑或洗劑形式，呈適合於作為滴眼劑遞送之形式，呈適合於吸入(諸如鼻內吸入或經口吸入)投與之氣溶膠形式，或呈適合於非經腸投與(亦即皮內、皮下、肌內或靜脈內注射)之形式。可注射溶液或懸浮液可採用無毒非經腸可接受之稀釋劑或載劑，諸如例如林格氏溶液(Ringer's solution)、等張生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇及1,2丙二醇。

醫藥組合物可包括任何適合之界面活性劑，諸如陰離子型、陽離子型或非離子型界面活性劑，諸如脫水山梨糖醇酯或其聚氧化乙烯衍生物。亦可包括懸浮劑，諸如天然膠、纖維素衍生物或無機材料，諸如矽質二氧化矽，及其他成分，諸如羊毛蠟。

在一個實施例中，本文所描述之抑制性核酸係在無與分子共價或非共價結合之遞送系統的情況下投與，即作為裸siRNA投與。

在一個實施例中，本文所描述之抑制性核酸為受保護之醫藥組合物，例如藉由囊封或與配位體結合而受保護。醫藥組合物可以脂質體形式投與。脂質體通常衍生自磷脂或其他脂質物質，且由分散於水性介質中之單或多層狀之含水液晶形成。可使用能夠形成脂質體之任何無毒、生理上可接受且可代謝之脂質。脂質體形式之醫藥組合物可含有穩定劑、防腐劑、賦形劑及其類似物。較佳脂質為天然與合成之磷脂及磷脂醯膽鹼(卵磷脂)。形成脂質體之方法係此項技術中已知的，且與此有關之特定參考為：Prescott編, Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), 第33頁等多頁。

醫藥組合物可調配為脂質奈米粒子。可使用一般熟習此項技術者已知之任何適合之液體奈米粒子遞送系統。舉例而言，本文所描述之抑制性核酸可使用脂質奈米粒子組合物調配，該脂質奈米粒子組合物包含例如呈40/48/2/10比之陽離子型脂質/膽固醇/PEG-DMG/DSPC，或例如呈40/48/2/10比之陽離子型脂質/膽固醇/PEG-C-DMA/DSPC。陽離子型脂質可例如為CLinDMA或DLinDMA。PEG可例如為PEG-DMG。其他適合且非限制性之脂質奈米粒子遞送系統包括以下中所描述的彼等系統：本申請案之實例；Idris等人 2021, 「 A SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19 」, Molecular Therapy, 第29卷, 第7期, 第2219-2226頁；Wu等人 2008, 「 Development of a Novel Method for Formulating Stable siRNA-Loaded Lipid Particles for In vivo Use 」, Pharmaceutical Research, 第26卷, 第3期, 第512-522頁；及美國專利第7514099號、第9061063號、第10369226號、第11071784號及第11382979號。

醫藥組合物可以胞泌體形式投與。如本文中所使用，術語「胞泌體」係指細胞衍生之小(直徑在20至300 nm之間，直徑更佳在40至200 nm之間)囊泡，其包含包封內部空間之膜，且其係藉由直接質膜出芽或藉由晚期核內體與質膜之融合自該細胞中產生。胞泌體包含脂質或脂肪酸及多肽且進一步包含本文中描述為有效負載之抑制性核酸。胞泌體可來源於生產細胞，且基於其尺寸、密度、生物化學參數或其組合自生產細胞中分離。胞泌體可藉由電穿孔、脂質體轉染、音波處理及與氯化鈣接觸直接負載外源性核酸或藥物。替代地，經純化之胞泌體可藉由例如電穿孔離體負載。

本發明之胞泌體可由活體外生長之細胞或個體體液產生。當胞泌體由活體外細胞培養產生時，可使用各種生產細胞，例如HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或間葉幹細胞(MSC)。

醫藥組合物亦可藉由將本文所描述之抑制性核酸併入腺病毒或腺相關病毒(AAV)中來調配，與細胞穿透肽、慢病毒載體、聚合物、樹枝狀聚合物一起調配，或製備為siRNA生物結合物，諸如GalNAc-siRNA結合物遞送平台。

若使用胞泌體或載體作為媒劑以遞送siRNA，則候選siRNA作為shRNA遞送。siRNA及shRNA兩者均可靶向且抑制病毒，且在功能上等效。當候選siRNA作為shRNA遞送時，其來源於細胞系統且封裝入胞泌體或載體(AAV或慢病毒載體)中，依上文所描述。

shRNA可提供於表現卡匣中，該表現卡匣含有與本文所描述之siRNA連續連接的啟動子。在實施例中，啟動子為polII或polIII啟動子，諸如U6啟動子(例如小鼠U6啟動子)或H1啟動子。在實施例中，表現卡匣另外含有標記基因。在實施例中，啟動子為polII啟動子。在實施例中，啟動子為組織特異性啟動子。在實施例中，啟動子為誘導型啟動子。在實施例中，啟動子為polIII啟動子。在實施例中，啟動子為U6或H1啟動子。

亦提供含有本文所描述之表現卡匣的載體。適當載體之實例包括腺病毒、慢病毒、腺相關病毒(AAV)、脊髓灰白質病毒、單純疱疹病毒(HSV)或鼠類莫洛尼基(Maloney-based)病毒載體。在一實施例中，載體為腺相關病毒(AAV)載體。

shRNA分子包含配對RNA序列及位於配對RNA序列之間以便形成髮夾之環部分。環之長度可不同。在一些實施例中，環之長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在某些實施例中，環之長度為18個核苷酸。髮夾結構亦可含有3'及/或5'突出物部分。在一些實施例中，突出物係長度為0、1、2、3、4或5個核苷酸的3'及/或5'突出物。技術人員將充分瞭解，環區之核苷酸序列可變化且可為例如(5'-GCAA-3')、(5'-GCGC-3')或(5'-TTGC-3')或其他序列。

本文所描述之醫藥組合物之投與劑量可足以抑制正在治療中之細胞、組織或生物體中目標基因之表現或非轉譯目標序列(例如調節序列)之生物活性。投與給定個體之本文所描述之抑制性核酸之具體劑量將視諸如投與途徑及個體之身體特徵(包括健康狀況)等之因素而定。舉例而言，包含本文所描述之抑制性核酸之給定醫藥組合物的適當劑量可視多種因素而定，該等因素包括(但不限於)個體之身體特徵(例如年齡、體重、性別)、給定冠狀病毒感染之進展(亦即病理學狀態)及熟習此項技術者容易識別之其他因素。在確定適當劑量時可考慮的各種一般考慮描述於例如以下中：Gennaro等人(編), (1990), 「 Remington's Pharmaceutical Sciences 」, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA；及Gilman等人(編), (1990), 「 Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics 」, Pergamon Press。本文所描述之抑制性核酸之適合劑量的非限制性實例包括如下範圍內之劑量：0.01至200毫克/公斤接受體體重/天、1至50毫克/公斤體重/天、1至40毫克/公斤體重/天、1至30毫克/公斤體重/天、1至20毫克/公斤體重/天、1至10毫克/公斤體重/天、1至5毫克/公斤體重/天、1至3毫克/公斤體重/天、1至2毫克/公斤體重/天、0.1至1毫克/公斤體重/天、0.1至0.9毫克/公斤體重/天、0.1至0.8毫克/公斤體重/天、0.1至0.7毫克/公斤體重/天、0.1至0.6毫克/公斤體重/天、0.1至0.5毫克/公斤體重/天、0.1至0.4毫克/公斤體重/天、0.1至0.3毫克/公斤體重/天、0.1至0.2毫克/公斤體重/天、0.01至0.1毫克/公斤體重/天、0.01至0.05毫克/公斤體重/天、0.01至0.02毫克/公斤體重/天及0.005至0.01毫克/公斤體重/天。

一般熟習此項技術者將能夠藉由常規實驗確定本文所描述之醫藥組合物及/或抑制性核酸之有效無毒量，該量可包括在一劑量或一系列劑量中達成所需治療結果。

通常，在治療應用中，治療將持續感染、疾病病狀或病況之持續時間。此外，對於一般熟習此項技術者顯而易見的是，個別劑量之最佳數量及間隔將藉由所治療之感染、疾病病狀或病況之性質及程度，投與形式、途徑及部位以及所治療之特定個體之性質確定。此類最佳條件亦可使用習知技術確定。

在許多情況下，需要數次或多次投與本文所描述之醫藥組合物。舉例而言，可投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次該醫藥組合物。投與可為約一週至約十二週間隔，且在某些實施例中為約一週至約四週間隔。在反覆暴露於由本文所描述之醫藥組合物靶向之特定病原體的情況下，可能需要週期性再投與。

對於一般熟習此項技術者亦將顯而易見的是，最佳療程可使用習知的療程確定測試來確定。

將本文所描述之抑制性核酸引入細胞、組織及生物體中的適合技術包括各種載劑系統、載體及試劑。非限制性實例包括脂質奈米粒子(LNP)、微胞、核酸-脂質粒子、脂質體複合體、脂質體、核酸聚合物、單一化學實體結合物、病毒體、病毒樣粒子(VLP)及其混合物。

本發明之醫藥組合物可以任何適合之方式投與，諸如例如靜脈內、經頰、非經腸、鼻內、經口、舌下或局部。因此，投與可為局部、肺部(例如藉由吸入或吹入氣溶膠或粉末(包括用噴霧器))、鼻內、氣管內、表皮、經皮、經口或非經腸。非經腸投與包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或顱內(例如腦實質內、鞘內或腦室內)投與。

在一實施例中，醫藥組合物經調適用於鼻內投與。當本發明之醫藥組合物經鼻內遞送時，可在感染SARS-COV-2之小鼠之肺及鼻腔內達成顯著的抗病毒靶向作用。

在一實施例中，本發明之醫藥組合物經調配為直接作用之鼻用噴霧。在一實施例中，可在定點護理站自行投與鼻用噴霧。

治療方法一般而言，本文所描述之抑制性核酸經證明可抑制、減少或預防冠狀病毒之複製。

因此，本發明之各種態樣提供在有需要之個體中抑制冠狀病毒複製之方法、治療冠狀病毒感染之方法及治療由冠狀病毒感染引起之病況及疾病的方法。

在一些實施例中，提供一種抑制細胞中冠狀病毒複製之方法，該方法包含向細胞投與本文所描述之抑制性核酸(其可包括在載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物中)，由此引起細胞中冠狀病毒mRNA分子之降解且抑制冠狀病毒之複製。

在其他實施例中，提供一種治療個體之冠狀病毒感染之方法，該方法包含投與本文所描述之抑制性核酸(其可以包括在載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物中)，由此抑制冠狀病毒之複製且治療感染。

在其他實施例中，提供一種治療個體之COVID-19疾病之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之本文所描述之抑制性核酸(其可包括在載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物中)，由此抑制冠狀病毒之複製且治療該COVID-19疾病。

在其他實施例中，提供本文所描述之抑制性核酸(其可包括在載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物中)之用途，其用於製備供抑制細胞中冠狀病毒之複製、治療個體之冠狀病毒感染或治療個體之COVID-19疾病用之藥物。

在其他實施例中，提供本文所描述之抑制性核酸(其可包括在載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物中)，其用於抑制細胞中冠狀病毒之複製、治療個體之冠狀病毒感染或治療個體之COVID-19疾病。

在一實施例中，投與係鼻內投與。當本發明之醫藥組合物經鼻內遞送時，在經感染SARS-COV-2之小鼠的肺及鼻腔內達到顯著的抗病毒靶向作用。儘管不希望受理論束縛，但咸信經鼻內遞送之抗SARS-CoV-2 siRNA抗病毒劑可改善鼻腔中之病毒複製且預防呼吸道病毒之氣溶膠傳播。在一實施例中，囊封之siRNA係經鼻內遞送。

在一實施例中，投與係藉助於直接作用之鼻用噴霧。在一實施例中，可在定點護理站自行投與鼻用噴霧。

對於包括SARS-CoV-2之多種呼吸道病毒，鼻腔係疾病早期呼吸道病毒複製的主要目標物及經由氣溶膠擴散之病毒的關鍵來源。RNAi具有成本效益、可擴展且可容易經程式化以靶向任何病毒RNA。此方法可帶來一種全新的、具有成本效益的可程式化RNA平台技術及可自行投與之IN遞送平台，且亦可提供適用於任何新出現之關注的RNA呼吸道病毒的首創RNA藥物。

個體可為任何具有經濟、社會或研究意義之動物，包括牛類、馬類、綿羊類、靈長類、禽類及嚙齒類物種。因此，個體可為哺乳動物，諸如例如人類或非人類哺乳動物(例如豬、貓、犬、牛、馬或綿羊)。個體可為實驗室動物(例如嚙齒類動物，諸如小鼠、大鼠或天竺鼠；兔及其類似動物)、鳥(例如家禽)、魚類或甲殼類動物。

治療方法可用於經α冠狀病毒(例如HCoV-229E及HCoV-NL63)或β冠狀病毒(例如SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-HKU1或HCoV-OC43)感染之個體。

治療方法可用於治療經診斷患有由冠狀病毒感染引起之病況或疾病的個體，該等病況或疾病包括(但不限於)嚴重急性呼吸道症候群、2019冠狀病毒病(COVID-19)及中東呼吸道症候群。

藉由本文所描述之方法鑑別需要治療之個體可包含藉由冠狀病毒感染測試鑑別之個體及/或藉由症狀評估鑑別之個體。

冠狀病毒感染陽性之個體可使用此項技術中已知之標準技術加以鑑別，該等標準技術包括例如CT掃描、基於PCR之方法(例如循環臨限(CT)值、qRT-PCR)、定序、CRISPR、ELISA、LFA、RT-LAMP、膠體金免疫側流層析法。

冠狀病毒感染之症狀不同，且在許多情況下難以偵測。另外，與其他獨立來源引起之症狀也存在重疊的症狀。因此，在一些實施例中，可以評定個體症狀與冠狀病毒感染之一致性，隨後進行診斷測試以確認或否認由冠狀病毒感染引起之症狀。由冠狀病毒感染引起之症狀之非限制性實例包括(但不限於)發熱、咳嗽、疲勞、味覺或嗅覺喪失、喉嚨痛、頭痛、肌肉或關節疼痛、噁心或食慾不振、腹瀉、嘔吐、呼吸困難或呼吸短促、言語或活動能力喪失、意識模糊及/或胸部疼痛。

本文所描述治療方法之功效可使用一般熟習此項技術者已知之標準方法評定。舉例而言，用於在療法期間或之後來評定冠狀病毒載量之基於PCR的技術(例如qRTPCR)可用於評定本文所描述治療方法的有效性。能夠評定本文所描述治療方法之功效的通用技術包括活體外溶菌斑檢定法及使用活體內小鼠模型。另外或替代地，用於診斷冠狀病毒感染之技術(包括CRISPR、ELISA、LFA、RT-LAMP、膠體金免疫側流層析法)可用於評定治療功效，尤其在經調適可提供定量資料之情況下。

實例現在本發明將以參考特定實例加以描述，但該等實例不應視為以任何方式限制本發明。

實例一 ：靶向 SARS-CoV 之 siRNA 材料及方法 (a) siRNA 設計使用一演算法(https://weinbergmorrislab.wixsite.com/ weinbergmorrislab/tgs-algorithm-format；亦參見Ackley等人. 2013, 「 An Algorithm for Generating Small RNAs Capable of Epigenetically Modulating Transcriptional Gene Silencing and Activation in Human Cells 」, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e104)開發出了若干候選siRNA，該演算法可基於目標RNA中之嘌呤束選擇性地找到siRNA種子序列。選擇病毒基因體中具有超強保守性且極易被siRNA靶向且含有4-6bp嘌呤束的區域。此等非化學修飾之siRNA係針對SARS-CoV-2基因體中之各種保守位點，包括5'非轉譯區(5'UTR)保守莖、解螺旋酶區及RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)基因中之保守區設計的。

(b) 干擾素篩選使用Fugene 6用指定之siRNA將THP-1 DUAL細胞(一種公認的量測免疫刺激之標準)轉染24小時，隨後量化(A) IRF及(B) NFkB基因報導子表現量。2'3'-cGAMP (20 μg/ml)及LPS (100 ng/ml)分別用作IRF及NFkB路徑刺激之陽性對照。

(c) 溶菌斑檢定法使用溶菌斑檢定法評定各種siRNA抑制SARS-CoV-2 (Vic-1；Wuhan)之能力。在用250PFU之Wuhan (祖先) SARS-CoV-2感染之前，VeroE6細胞未經處理(病毒)、未用(Lipo+病毒)或用30 nM與脂染胺2000複合之目標siRNA預處理24小時。最佳的新候選siRNA亦用250PFU之α、β、κ、δ或ο變體SARS-CoV-2感染。處理後，4天後對病毒溶菌斑進行計數。自重複三次處理收集資料。

(d) qRTPCR 篩選在用250PFU之SARS-CoV-2感染之前，VeroE6細胞未用(僅Lipo)或用與脂染胺2000複合之siRNA預處理24小時。選擇siRNA組合，以等莫耳比混合至最終濃度30 nM，且在4 dpi時藉由針對N基因之微滴式數字PCR測定病毒拷貝數。資料表示重複兩次處理之平均值的範圍。

(e) δ 變體抑制之劑量反應評估設計且選擇病毒基因及系統發生保守區(靶向候選siRNA)以用於針對SARS-CoV-2感染細胞進行篩選。在用250PFU之δ變體SARS-CoV-2感染之前，VeroE6細胞未用(Lipo+病毒)或用與脂染胺2000複合之目標siRNA之七種稀釋液(30、20、10、5、2.5、1或0.1 nM)預處理24小時。處理後，4天後對病毒溶菌斑進行計數。自重複三次處理收集資料。

(f) siRNA 之脂質奈米粒子 (LNP) 遞送經5×10 ⁴個活δ SARS-CoV-2變體感染之K18hACE2小鼠每天(-1至2 dpi)接受siRNA-LNP (1 mg/kg)之防治性靜脈內(後眼眶)處理。展示3 dpi時之肺病毒組織計數/g。各點表示來自一隻小鼠之資料。將先前發現之抑制SARS-COV-2之siRNA Hel2與新siRNA siHelUP2進行對比。

結果存在若干製備siRNA之方法，諸如化學合成、活體外轉錄、siRNA表現載體及PCR表現卡匣。在化學合成中，商業供應商提供具有dTdT 3'突出物之siRNA。作為替代方案，突出物可為UU或其他突出物。技術人員應瞭解，由dTdT或UU突出物形成之siRNA在效能方面不存在實質性差異，且突出物之組合物似乎並不在目標mRNA識別及裂解中起重要作用。突出物並非mRNA中目標位點之一部分，但可用於其他目的，例如Ago-2及切割子活性且裝載至複合體中。

所開發之候選siRNA展示於表 1中。表1中之siRNA具有dTdT突出物且以此形式裝載至LNP中，但可同樣具有UU突出物或另一突出物，諸如與mRNA序列互補之突出物，或可不存在突出物。表 1.靶向SARS-CoV-2病毒中之各種基因座的siRNA。siRNA包括dTdT突出物。表現最佳之siRNA用粗體/下劃線突出顯示。

siRNA	有義 RNA 序列 (5'-3')	反義 RNA 序列 (5'-3')
SL5_si1 (siCoV_9)	AGAUGGAGAGCCUUGUCCCtt (SEQ ID NO: 1)	GGGACAAGGCUCUCCAUCUtt (SEQ ID NO: 2)
siHELUp1 (siCoV_4)	CGUGGUAAGAGAAUUCCUUtt (SEQ ID NO: 3)	AAGGAAUUCUCUUACCACGtt (SEQ ID NO: 4)
siHELUp2 (siCoV_1)	GAGAAAAGCUGUCUUUAUUtt (SEQ ID NO: 5)	AAUAAAGACAGCUUUUCUCtt (SEQ ID NO: 6)
siUC7TGS-1 (siCoV_10)	CUUACUAAAGGACCUCAUGtt (SEQ ID NO: 7)	CAUGAGGUCCUUUAGUAAGtt (SEQ ID NO: 8)
siUC7_TGS-2 (siCoV_8)	AUUAUCAAAACAAUGUUUUtt (SEQ ID NO: 9)	AAAACAUUGUUUUGAUAAUtt (SEQ ID NO: 10)
siUC7_TGS-3 (siCoV_7)	AUGUCUGAAGCAAAAUGUUtt (SEQ ID NO: 11)	AACAUUUUGCUUCAGACAUtt (SEQ ID NO: 12)
siHEL_TGS-1 (siCoV_6)	UUUUGGGACUACCAACUCAtt (SEQ ID NO: 13)	UGAGUUGGUAGUCCCAAAAtt (SEQ ID NO: 14)
siHEL_TGS-2 (siCoV_5)	CCUCAAAGAUUUUGGGACUtt (SEQ ID NO: 15)	AGUCCCAAAAUCUUUGAGGtt (SEQ ID NO: 16)
siHELdwn1 (siCoV_3)	UGACUAUGUCAUAUUCACUtt (SEQ ID NO: 17)	AGUGAAUAUGACAUAGUCAtt (SEQ ID NO: 18)
siHELdwn2 (siCoV_2)	ACCACUGAAACAGCUCACUtt (SEQ ID NO: 19)	AGUGAGCUGUUUCAGUGGUtt (SEQ ID NO: 20)
N367 (對照)	CUGACCUUUGGAUGGUGCUtt (SEQ ID NO: 21)	AGCACCAUCCAAAGGUCAGtt (SEQ ID NO: 22)

表 2.表1之siRNA的目標位點。未展示dTdT突出物。

siRNA	有義 RNA 序列 (5'-3')	反義 RNA 序列 (5'-3')
SL5_si1 (siCoV_9)	AGAUGGAGAGCCUUGUCCC (SEQ ID NO: 23)	GGGACAAGGCUCUCCAUCU (SEQ ID NO: 24)
siHELUp1 (siCoV_4)	CGUGGUAAGAGAAUUCCUU (SEQ ID NO: 25)	AAGGAAUUCUCUUACCACG (SEQ ID NO: 26)
siHELUp2 (siCoV_1)	GAGAAAAGCUGUCUUUAUU (SEQ ID NO: 27)	AAUAAAGACAGCUUUUCUC (SEQ ID NO: 28)
siUC7TGS-1 (siCoV_10)	CUUACUAAAGGACCUCAUG (SEQ ID NO: 29)	CAUGAGGUCCUUUAGUAAG (SEQ ID NO: 30)
siUC7_TGS-2 (siCoV_8)	AUUAUCAAAACAAUGUUUU (SEQ ID NO: 31)	AAAACAUUGUUUUGAUAAU (SEQ ID NO: 32)
siUC7_TGS-3 (siCoV_7)	AUGUCUGAAGCAAAAUGUU (SEQ ID NO: 33)	AACAUUUUGCUUCAGACAU (SEQ ID NO: 34)
siHEL_TGS-1 (siCoV_6)	UUUUGGGACUACCAACUCA (SEQ ID NO: 35)	UGAGUUGGUAGUCCCAAAA (SEQ ID NO: 36)
siHEL_TGS-2 (siCoV_5)	CCUCAAAGAUUUUGGGACU (SEQ ID NO: 37)	AGUCCCAAAAUCUUUGAGG (SEQ ID NO: 38)
siHELdwn1 (siCoV_3)	UGACUAUGUCAUAUUCACU (SEQ ID NO: 39)	AGUGAAUAUGACAUAGUCA (SEQ ID NO: 40)
siHELdwn2 (siCoV_2)	ACCACUGAAACAGCUCACU (SEQ ID NO: 41)	AGUGAGCUGUUUCAGUGGU (SEQ ID NO: 42)
N367 (對照)	CUGACCUUUGGAUGGUGCU (SEQ ID NO: 43)	AGCACCAUCCAAAGGUCAG (SEQ ID NO: 44)

出於比較目的而提及的序列展示於表3及表4中。表3.由Idris等人(2021)製備且被包括以用於比較之siRNA。siRNA包括dTdT突出物。

siRNA	有義 RNA 序列 (5'-3')	反義 RNA 序列 (5'-3')
UC7_as1 (siCoV_1as)	GACAUAAAAACAUUGUUUUtt (SEQ ID NO: 45)	AAAACAAUGUUUUUAUGUCtt (SEQ ID NO: 46)
UC7_as2 (siCoV_2as)	AAACAUUGUUUUGAUAAUAtt (SEQ ID NO: 47)	UAUUAUCAAAACAAUGUUUtt (SEQ ID NO: 48)
UC7_as3 (siCoV_3as)	GUAUGUUGAGAGCAAAAUUtt (SEQ ID NO: 49)	AAUUUUGCUCUCAACAUACtt (SEQ ID NO: 50)
UC7_as4 (siCoV_4as)	UAAUCAUCACCCUGUUUAAtt (SEQ ID NO: 51)	UUAAACAGGGUGAUGAUUAtt (SEQ ID NO: 52)
UC7_as5 (siCoV_5as)	AUUUUGCUUCAGACAUAAAtt (SEQ ID NO: 53)	UUUAUGUCUGAAGCAAAAUtt (SEQ ID NO: 54)
UTR5_as (siCoV_6as)	CUACAAGAGAUCGAAAGUUtt (SEQ ID NO: 55)	AACUUUCGAUCUCUUGUAGtt (SEQ ID NO: 56)
Hel4_as (siCoV_7as)	CUGUUUCAGUGGUUUGAGUtt (SEQ ID NO: 57)	ACUCAAACCACUGAAACAGtt (SEQ ID NO: 58)
Hel5_as (siCoV_8as)	GGUUUGAGUGAAUAUGACAtt (SEQ ID NO: 59)	UGUCAUAUUCACUCAAACCtt (SEQ ID NO: 60)

表4.由Idris等人(2021)製備且被包括以用於比較之siRNA之目標位點。未展示dTdT突出物。

siRNA	有義 RNA 序列 (5'-3')	反義 RNA 序列 (5'-3')
UC7_as1 (siCoV_1as)	GACAUAAAAACAUUGUUUU (SEQ ID NO: 61)	AAAACAAUGUUUUUAUGUC (SEQ ID NO: 62)
UC7_as2 (siCoV_2as)	AAACAUUGUUUUGAUAAUA (SEQ ID NO: 63)	UAUUAUCAAAACAAUGUUU (SEQ ID NO: 64)
UC7_as3 (siCoV_3as)	GUAUGUUGAGAGCAAAAUU (SEQ ID NO: 65)	AAUUUUGCUCUCAACAUAC (SEQ ID NO: 66)
UC7_as4 (siCoV_4as)	UAAUCAUCACCCUGUUUAA (SEQ ID NO: 67)	UUAAACAGGGUGAUGAUUA (SEQ ID NO: 68)
UC7_as5 (siCoV_5as)	AUUUUGCUUCAGACAUAAA (SEQ ID NO: 69)	UUUAUGUCUGAAGCAAAAU (SEQ ID NO: 70)
UTR5_as (siCoV_6as)	CUACAAGAGAUCGAAAGUU (SEQ ID NO: 71)	AACUUUCGAUCUCUUGUAG (SEQ ID NO: 72)
Hel4_as (siCoV_7as)	CUGUUUCAGUGGUUUGAGU (SEQ ID NO: 73)	ACUCAAACCACUGAAACAG (SEQ ID NO: 74)
Hel5_as (siCoV_8as)	GGUUUGAGUGAAUAUGACA (SEQ ID NO: 75)	UGUCAUAUUCACUCAAACC (SEQ ID NO: 76)

選擇病毒基因體中具有超強保守性且極易被siRNA靶向且含有4-6bp嘌呤束的區域且針對任何干擾素活化進行篩選( 圖 1A- 圖 1B)。siRNA中無一者誘發任何顯著的干擾素活化，此表明其為非免疫原性的。隨後，為確定各種siRNA抑制SARS-CoV-2的能力，轉染Vero細胞且隨後用SARS-COV-2感染。若干候選物似乎強效抑制SARS-COV-2，該等候選物包括siHelUP2ps、siHELdwn3s、SL5-si1S，其係由溶菌斑檢定法( 圖 2)及qRT-PCR ( 圖 3)所測定。

隨後，將此等新演算法候選siRNA之有效性與先前公佈之可見會強效抑制Wuhan SARS-COV-2變體之siRNA進行對比(參見Idris等人, 2021, 同上) ( 圖 4)。最佳候選siRNA似乎對特定區域保守，而先前研究亦發現對於該等特定區域的強效siRNA候選物，包括解螺旋酶基因座(例如siHel2)、RNA依賴性RNA聚合酶(例如siUC7)及5'UTR (例如siUTR3) (參見Idris等人, 2021, 同上) ( 圖 4)

SARS-COV-2存在若干變體，包括α、β、κ及δ。對於針對各種病毒變體之有效性，篩選最佳候選siRNA，包括先前所公開之彼等siRNA。發現所有經測試之siRNA (包括演算法產生之siRNA)在抑制各種病毒變體時均有效( 圖 5)。SARS-COV-2病毒在病毒生命週期中經歷負RNA股合成。對siRNA靶向病毒生命週期之此步驟的有效性進行了研究，且觀測到在δ變體之負股靶向後，病毒表現逐漸受到一定程度的抑制( 圖 6)。為了確定siRNA之組合(有義股及負股靶向siRNA)抑制SARS-COV-2之能力及此類組合是否存在額外益處，將用病毒攻擊之單一處理細胞及雙重處理細胞進行對比，且觀測到siRNA之組合並不大大增強或減弱所觀測到之抑制( 圖 7)。隨後，針對δ變體之活體外抑制，對前三個候選siRNA進行了劑量反應測試( 圖 8)。亦評定前三個siRNA在SARS-CoV-2之新ο變體中的siRNA目標位點，且觀測到所有siRNA均含有與新ο變體100%之序列靶向同源性。最後，選擇最佳候選siRNA，即siHelUP2，且將其與先前報導之活體內抑制δ SARS-CoV-2病毒之siHEL2進行對比(參見Idris等人, 2021, 同上)。值得注意地，siHelUP2與siHel2一樣能活體內抑制SARS-CoV-2 ( 圖 9)，表明siHelUP2亦為廣泛抑制SARS-CoV-2之良好候選siRNA。

隨後對於針對各種SARS-CoV-2 VOC之有效性，篩選siHELUp2 (siCoV_1) (其靶向SARS-CoV-2之解螺旋酶基因區中之保守位點)，且發現其在所有經測試之VOC (包括ο變體)中皆為等效的( 圖 10)。在生物資訊學評定siHELUp2在ο變體中之siRNA目標位點後，吾人確認此siRNA顯示出與此變體100%之序列靶向同源性，進一步強調了此siRNA之超保守設計。相比於siControl，siHELUp2針對SARS-CoV-2之劑量反應顯示3.99 nM之IC ₅₀(IC ₅₀=1.3×10 ¹²nM) ( 圖 11)。SARS-CoV-2在其病毒生命週期中經歷負RNA股合成。

總體而言，此等資料強調，演算法定義之siRNA在抑制SARS-COV-2之所有變體中起作用，且前三個候選siRNA全部起到同樣好的作用，且可作為COVID-19之治療劑用於基於LNP之遞送方法。

實例二 ∶ 鼻內投與 材料及方法 在異氟醚麻醉下，使用IN滴注技術用10 ⁵個溶菌斑形成單位(PFU) (20 μL總體積)之活δ SARS-CoV-2 VOC鼻內(IN)感染小鼠。隨後，當在異氟醚麻醉下時，用後眼眶(IV) (100 μL總體積)或IN (20 μL總體積)投與之與sLNP或dmLNP複合之siRNA處理小鼠。對於在感染當天(感染後第0天(dpi))給藥siRNA，在小鼠感染SARS-CoV-2前2小時投與siRNA。每日監測小鼠進行稱重及臨床評分。吾人採用與先前在感染SARS-CoV-2之K18-hACE2小鼠中使用基於LNP之siRNA遞送所採取相同的防治性治療策略(Supramaniam等人) ( 圖 12A)。

結果觀測到，當在「隱形LNP」 (sLNP)中調配時，IV遞送之siHELUp2 (siCoV_1)抑制了經感染小鼠之肺中之SARS-CoV-2 ( 圖 12B)。隨後，吾人在dmLNP中調配siHELUp2，該dmLNP係一種肺靶向LNP，其顯示可在鼻腔中生物分佈且保留siRNA (Supramaniam等人)。值得注意的是，IN遞送之siHELUp2-LNP不僅顯著降低肺病毒載量，且亦減少鼻腔病毒載量。此係首次展示靶向下呼吸道及上呼吸道兩者之抗SARS-CoV-2 siRNA。總體而言，此等資料強調，演算法定義之siRNA，即siHELUp2，在抑制SARS-COV-2之所有變體中起作用，且其可用於基於LNP之遞送以減少小鼠之肺及鼻腔中之病毒負載量。

實例 3 - shRNA若使用胞泌體或載體作為媒劑以遞送siRNA，則候選siRNA作為shRNA遞送。siRNA及shRNA兩者均可靶向且抑制病毒，且在功能上等效。當候選siRNA作為shRNA遞送時，其來源於細胞系統且封裝入胞泌體或載體(AAV或慢病毒載體)中。其不具有dtdT突出物，而僅具有展示於表2中之序列。

shRNA提供於表現卡匣中，該表現卡匣含有與siRNA連續連接之啟動子。可使用雙shRNA表現卡匣(圖13)表現封裝至EV中之siHelUP2及siHelUP1。H1啟動子及U6啟動子兩者均展示於圖13中，但各啟動子及shRNA可單獨表現，或如此處情況以組合形式表現。技術人員將充分理解，環區之核苷酸序列為(5'-GCAA-3')，但亦可為(5'-GCGC-3')或(5'-TTGC-3')或其他序列。

圖13中所示之插入片段之序列如下： 5'-gaaaaaaGAGAAAAGCTGTCTTTATT GCAAAATAAAGACAGCTTTTCTCcggatcttcgtcctttccacaagatatataaagccaagaaatcgaaatactttcaagttacggtaagcatatgatagtccattttaaaacataattttaaaactgcaaactacccaagaaattattactttctacgtcacgtattttgtactaatatctttgtgtttacagtcaaattaattccaattatctctctaacagccttgtatcgtatatgcaaatatgaaggaatcatgggaaataggccctcactagtatcaattcgaacgctgacgtcatcaacccgctccaaggaatcgcgggcccagtgtcactaggcgggaacacccagcgcgcgtgcgccctggcaggaagatggctgtgagggacaggggagtggcgccctgcaatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttggatttgggaatcttataagttctgtatgagaccacagatctagCGTGGTAAGAGAATTCCTT ttgcAAGGAATTCTCTTACCACGtttttt-3' (SEQ ID NO: 77)

參考文獻以下文獻之內容以引用之方式併入本文中： Wang H, Paulson KR, Pease SA, Watson S, Comfort H, Zheng P等人. Estimating excess mortality due to the COVID-19 pandemic: a systematic analysis of COVID-19-related mortality, 2020–21. The Lancet. 2022;399(10334):1513-36。 Meganck RM, Baric RS. Developing therapeutic approaches for twenty-first-century emerging infectious viral diseases. Nature Medicine. 2021;27(3):401-10。 Cao Z, Gao W, Bao H, Feng H, Mei S, Chen P等人. VV116 versus Nirmatrelvir-Ritonavir for Oral Treatment of Covid-19. New England Journal of Medicine. 2022;388(5):406-17。 Fischer W, Eron JJ, Holman W, Cohen MS, Fang L, Szewczyk LJ等人. Molnupiravir, an Oral Antiviral Treatment for COVID-19. medRxiv. 2021。 Takashita E, Kinoshita N, Yamayoshi S, Sakai-Tagawa Y, Fujisaki S, Ito M等人. Efficacy of Antibodies and Antiviral Drugs against Covid-19 Omicron Variant. N Engl J Med. 2022;386(10):995-8。 Idris A, Davis A, Supramaniam A, Acharya D, Kelly G, Tayyar Y等人. A SARS-CoV-2 targeted siRNA-nanoparticle therapy for COVID-19. Mol Ther. 第29卷, 第7期, 2219-2226. 2021。 Zhang X, Goel V, Robbie GJ. Pharmacokinetics of Patisiran, the First Approved RNA Interference Therapy in Patients With Hereditary Transthyretin-Mediated Amyloidosis. The Journal of Clinical Pharmacology. 2020;60(5):573-85。 To KK, Tsang OT, Leung WS, Tam AR, Wu TC, Lung DC等人. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. Lancet Infect Dis. 2020;20(5):565-74。 Chang Y-C, Yang C-F, Chen Y-F, Yang C-C, Chou Y-L, Chou H-W等人. A siRNA targets and inhibits a broad range of SARS-CoV-2 infections including Delta variant. EMBO Molecular Medicine.n/a(n/a):e15298。 Supramaniam A, Tayyar Y, Clarke DTW, Kelly G, Acharya D, Morris KV等人. Prophylactic intranasal administration of lipid nanoparticle formulated siRNAs reduce SARS-CoV-2 and RSV lung infection. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2023。 Amarilla AA, Modhiran N, Setoh YX, Peng NYG, Sng JDJ, Liang B等人. An Optimized High-Throughput Immuno-Plaque Assay for SARS-CoV-2. Front Microbiol. 2021;12:625136。 Khaitov M, Nikonova A, Shilovskiy I, Kozhikhova K, Kofiadi I, Vishnyakova L等人. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021;76(9):2840-54。 Bowden-Reid E, Ledger S, Zhang Y, Di Giallonardo F, Aggarwal A, Stella AO等人. Novel siRNA therapeutics demonstrate multi-variant efficacy against SARS-CoV-2. Antiviral Research. 2023;217:105677。 Ackley A, Lenox A, Stapleton K, Knowling S, Lu T, Sabir KS等人. An Algorithm for Generating Small RNAs Capable of Epigenetically Modulating Transcriptional Gene Silencing and Activation in Human Cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2013;2。 McCaskill JL, Marsh GA, Monaghan P, Wang LF, Doran T, McMillan NA. Potent inhibition of Hendra virus infection via RNA interference and poly I:C immune activation. PLoS One. 2013;8(5):e64360。 Brutlag等人 Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)。 Usman等人, 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845。 Scaringe等人, 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433。 Bellon等人, 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951。 Bellon等人, 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204。 Shabarova等人, 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247。 Moore等人, 1992, Science 256, 9923。 Wu等人. 2008, 「 Development of a Novel Method for Formulating Stable siRNA-Loaded Lipid Particles for In vivo Use 」, Pharmaceutical Research, 第26卷, 第3期, 512-522。

現將僅藉助於實例且參考隨附圖式描述本發明之較佳實施例，在該等圖式中：圖 1A 及圖 1B展示對於靶向SAR-COV-2之新候選siRNA的干擾素篩選結果。誤差條表示重複三次處理之SEM。圖 2提供對於用於活體外抑制SARS-CoV-2之新候選siRNA的溶菌斑檢定法篩選及評估結果。以重複三次處理之平均值之標準誤差展示資料，且藉由單因子ANOVA分析(Dunnett事後檢定)所測定，與N3675 (對照)比較時，∗p ＜ 0.05、∗∗∗p ＜ 0.001及∗∗∗∗p ＜ 0.001視為在統計學上顯著的。圖 3展示候選新siRNA之qRTPCR篩選結果。圖 4提供對於用於活體外抑制SARS-CoV-2之新候選siRNA的溶菌斑檢定法篩選及評估結果。所示資料為相對於單獨病毒之針對各處理之平均溶菌斑計數之溶菌斑抑制%。圖 5提供對於用於活體外抑制α、β、κ、δ或ο變體SARS-CoV-2 VOC之選定候選siRNA的另一溶菌斑檢定法篩選及評估的結果。自重複三次處理收集資料，且以重複三次處理之平均值之標準誤差展示資料，且藉由單因子ANOVA分析(Dunnett事後檢定)所測定，與N3675 (對照)比較時，∗p ＜ 0.05、∗∗∗p ＜ 0.001及∗∗∗∗p ＜ 0.001視為在統計學上顯著的。圖 6展示對於用於活體外抑制SARS-CoV-2 δ變體之新候選負股靶向siRNA的另外的溶菌斑檢定法篩選及評估的結果。自重複三次處理收集資料，且以重複三次處理之平均值之標準誤差展示資料，且藉由單因子ANOVA分析(Dunnett事後檢定)所測定，與N3675 (對照)比較時，∗p ＜ 0.05、∗∗∗p ＜ 0.001及∗∗∗∗p ＜ 0.001視為在統計學上顯著的。圖 7提供對於用於活體外抑制SARS-CoV-2 Wuhan及δ變體之新候選負股及正股靶向siRNA組合的額外溶菌斑檢定法篩選及評估的結果。自重複三次處理收集資料，且以重複三次處理之平均值之標準誤差展示資料，且藉由單因子ANOVA分析(Dunnett事後檢定)所測定，與N3675 (對照)比較時，∗p ＜ 0.05、∗∗∗p ＜ 0.001及∗∗∗∗p ＜ 0.001視為在統計學上顯著的。亦展示siRNA造成之病毒溶菌斑抑制%。圖 8(A) 至圖 8(D)提供對於用於活體外抑制δ變體之前三個候選siRNA的劑量反應評估結果。自重複三次處理收集資料，且以各條形圖上反映的重複三次處理之平均值之標準誤差展示資料。圖 9提供A)自第-1天至第3天之病毒感染、接著處理之時刻表，其中以1 mg/kg siRNA之每日劑量自第0天在各日投與，且在第3天宰殺所有小鼠；及B)活體內評估由隱形LNP遞送之HelUP2 siRNA。展示3 dpi時之肺病毒組織計數/g。各點表示來自一隻小鼠之資料。** p＜0.005，單因子ANOVA。圖 10展示一項實驗結果，其中Vero E6細胞用與脂染胺2000複合之siControl及siCoV_1 (30 nM)轉染24小時，之後用250溶菌斑形成單位(PFU)之δ SARS-CoV-2 VOC感染。感染後4天(dpi)對感染性病毒溶菌斑進行計數。資料表示為相對於單獨病毒(對照)之平均溶菌斑抑制百分比，且表示重複三次處理之平均值之標準誤差(SEM)。進行單因子ANOVA (Dunnett事後檢定)且與siControl比較。圖 11展示一項實驗結果，其中Vero E6細胞用濃度增加(0.1-30 nM)之與脂染胺2000複合之siControl及siCoV_1轉染24小時，之後用250 PFU之δ SARS-CoV-2 VOC感染。在4 dpi時對感染性病毒溶菌斑進行計數。資料表示為平均溶菌斑計數及重複三次處理之平均值之標準誤差(SEM)。進行單因子ANOVA (Dunnett事後檢定)且與siControl比較。圖 12提供A)活體內測試方法及siRNA處理方案之示意性概述及B)經1×10 ⁵活δ SARS-CoV-2 VOC感染之K18h-ACE2小鼠每天(-1至2 dpi)接受siRNA-LNP (1 mg/kg)之每日靜脈內(IV) (後眼眶，sLNP)或鼻內(IN，dmLNP)處理。此處所使用之對照siRNA為siN367 (siControl)。展示3 dpi時之組織病毒組織計數/g。各點表示來自一個小鼠之資料，且條表示平均值。對siControl進行單因子ANOVA (Dunnett事後檢定)。每天對小鼠進行稱重，且資料點表示平均體重增加百分比且誤差條表示SEM。在各時間點對siControl進行雙因子ANOVA。圖 13係描繪雙shRNA表現卡匣之示意圖，該表現卡匣用於表現待封裝於EV中之SARS-COV-2 shRNA。此處展示H1及U6啟動子兩者，但U6或H1啟動子及shRNA可單獨表現或如此處情況以組合形式表現。

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Claims

一種經分離核酸，其包含15至30個核苷酸且能夠與SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 27中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交，或能夠與該SARS-CoV-2序列之片段雜交。
如請求項1之經分離核酸，其包含以下或由以下組成：15至25個核苷酸；15至23個核苷酸；15至22個核苷酸；15至21個核苷酸；15至20個核苷酸；15至19個核苷酸；19個核苷酸；20個核苷酸；21個核苷酸、22個核苷酸或23個核苷酸。
一種經分離核酸，其與以下序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少97%序列一致性： SEQ ID NO: 2或24中定義之序列，其中該核酸能夠與SEQ ID NO: 23中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交；或 SEQ ID NO: 4或26中定義之序列，其中該核酸能夠與SEQ ID NO: 25中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交；或 SEQ ID NO: 6或28中定義之序列，其中該核酸能夠與SEQ ID NO: 27中定義之SARS-CoV-2序列特異性雜交。
一種如請求項1至3中任一項之經分離核酸的經分離片段，其中該片段之長度為10、11、12、13、14、15、16、17或18個核苷酸。
一種用於抑制SARS-CoV-2之表現的經分離雙股核酸，其包含有義股及反義股，其中：該有義股包含SEQ ID NO: 1或23中定義之序列或其變體或片段，且該反義股包含SEQ ID NO: 2或24中定義之序列或其變體或片段；或該有義股包含SEQ ID NO: 3或25中定義之序列或其變體或片段，且該反義股包含SEQ ID NO: 4或26中定義之序列或其變體或片段；或該有義股包含SEQ ID NO: 5或27中定義之序列或其變體或片段，且該反義股包含SEQ ID NO: 6或28中定義之序列或其變體或片段。
如請求項1至3中任一項之經分離核酸、如請求項4之經分離片段或如請求項5之經分離雙股核酸，其等包含：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸；2'-去氧修飾之核苷酸；鎖核苷酸；無鹼基核苷酸；2'-胺基修飾之核苷酸；2'-烷基修飾之核苷酸；嗎啉基核苷酸；包含非天然鹼基之核苷酸；2'-O-甲基修飾之核苷酸；2'O-甲氧基乙氧基修飾之核苷酸；2'氟修飾之核苷酸；5-甲基修飾之胞苷；假尿苷；包含5'-硫代磷酸酯基之核苷酸及與膽固醇基衍生物或十二酸雙癸醯胺基連接之末端核苷酸；包含胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦醯基羧酸、膦醯基羧酸酯、膦醯基乙酸、膦醯基甲酸、膦酸甲酯、膦酸硼酯或O-甲基胺基亞磷酸酯之核苷酸；或包含去氧核糖之核苷酸。
如請求項1至3或6中任一項之經分離核酸、如請求項4或請求項6之經分離片段或如請求項5或請求項6之經分離雙股核酸，其等與配位體結合。
一種細胞，其包含如請求項1至3、6或7中任一項之經分離核酸、如請求項4、6或7中任一項之經分離片段或如請求項5至7中任一項之經分離雙股核酸。
如請求項1至3或6至8中任一項之經分離核酸、如請求項4、6、7或8中任一項之經分離片段或如請求項5至8中任一項之經分離雙股核酸，其等為RNA、反義RNA或siRNA。
一種載體，其包含編碼如請求項9之RNA、反義RNA或siRNA的核苷酸序列。
一種脂質奈米粒子，其包含以下中之任一或多者：如請求項1至3、6、7或9中任一項之經分離核酸；如請求項4或6、7或9中任一項之經分離片段；如請求項5至7或9中任一項之經分離雙股核酸；如請求項10之載體。
如請求項11之脂質奈米粒子，其中該脂質包含以下中之任何一或多者：非陽離子脂質、陽離子脂質、用於防止該奈米粒子聚集之經結合脂質。
一種醫藥組合物，其包含以下中之任何一或多者：如請求項1至3、6、7或9中任一項之經分離核酸；如請求項4、6、7或9中任一項之經分離片段；如請求項5至7或9中任一項之經分離雙股核酸；如請求項10之載體；如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
如請求項13之醫藥組合物，其中如請求項1至3、6、7或9中任一項之經分離核酸，如請求項4、6、7或9中任一項之經分離片段或如請求項5至7或9中任一項之經分離雙股核酸係經保護。
如請求項14之醫藥組合物，其包含脂質體、AAV或胞泌體。
如請求項14之醫藥組合物，其包含如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子。
如請求項13之醫藥組合物，其包含裸siRNA。
如請求項13之醫藥組合物，其包含shRNA。
如請求項13至18中任一項之醫藥組合物，其為用於靜脈內投與之液體。
如請求項13至18中任一項之醫藥組合物，其為用於鼻內投與之氣溶膠。
一種用於抑制細胞中冠狀病毒複製之方法，該方法包含向該細胞投與如請求項1至3、6、7或9中任一項之核酸，如請求項4、6、7或9中任一項之片段，如請求項5至7或9中任一項之雙股核酸，如請求項10之載體，如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子或如請求項13至20中任一項之醫藥組合物，由此引起該細胞中冠狀病毒mRNA分子之降解且抑制該冠狀病毒之該複製。
一種用於治療個體之冠狀病毒感染的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至3、6、7或9中任一項之核酸，如請求項4、6、7或9中任一項之片段，如請求項5至7或9中任一項之雙股核酸，如請求項10之載體，如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子或如請求項13至20中任一項之醫藥組合物，由此抑制該冠狀病毒之複製且治療該感染。
一種用於治療個體之COVID-19疾病的方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至3、6、7或9中任一項之核酸，如請求項4、6、7或9中任一項之片段，如請求項5至7或9中任一項之雙股核酸，如請求項10之載體，如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子或如請求項13至20中任一項之醫藥組合物，由此抑制該冠狀病毒之複製且治療該COVID-19疾病。
一種如請求項1至3、6、7或9中任一項之核酸，如請求項4、6、7或9中任一項之片段，如請求項5至7或9中任一項之雙股核酸，如請求項10之載體，如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子或如請求項13至20中任一項之醫藥組合物的用途，其用於製備供抑制細胞中冠狀病毒之複製、治療個體之冠狀病毒感染或治療個體之COVID-19疾病用的藥劑。
如請求項1至3、6、7或9中任一項之核酸，如請求項4、6、7或9中任一項之片段，如請求項5至7或9中任一項之雙股核酸，如請求項10之載體，如請求項11或請求項12之脂質奈米粒子或如請求項13至20中任一項之醫藥組合物，其用於抑制細胞中冠狀病毒之複製、治療個體之冠狀病毒感染或治療個體之COVID-19疾病。
如請求項21至23中任一項之方法，如請求項24之用途或如請求項25之核酸、雙股核酸、載體、脂質奈米粒子或醫藥組合物，其中該冠狀病毒為SARS-CoV-2。