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TW202404647A - 抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途 - Google Patents

抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途 Download PDF

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TW202404647A
TW202404647A TW112126287A TW112126287A TW202404647A TW 202404647 A TW202404647 A TW 202404647A TW 112126287 A TW112126287 A TW 112126287A TW 112126287 A TW112126287 A TW 112126287A TW 202404647 A TW202404647 A TW 202404647A
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TW
Taiwan
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seq
antibody
sequence
whose sequence
drug conjugate
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Application number
TW112126287A
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肖亮
家強 蔡
薛彤彤
Original Assignee
大陸商蘇州宜聯生物醫藥有限公司
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Abstract

本公開涉及生物活性物偶聯物及其製備方法和用途，具體公開了式XV所示的抗體藥物偶聯物、其製備方法，以及其在預防和/或治療與細胞活動異常相關的疾病，包括但不限於在預防和/或治療腫瘤疾病中的用途

Description

抗體藥物偶聯物及其製備方法和用途
本公開屬於醫藥技術領域，涉及多種抗體，抗體藥物偶聯物及其製備方法，以及其在預防和/或治療與細胞活動異常相關的疾病，包括但不限於在預防和/或治療腫瘤疾病中的用途。
利用細胞毒的化療一度是癌症的標準療法，但高殺傷力的細胞毒素分子會殺傷正常細胞，引起嚴重的毒副作用。標靶抗腫瘤藥物由於同時具有標靶性和抗腫瘤活性，已成為當今腫瘤研究領域的熱點，但經常由於標靶藥物的靶點選擇性問題產生比較大的毒副作用，從而限制了標靶藥物的治療效果。生物大分子藥物，如抗體或抗體片段，雖然標靶性強，但對實體瘤的治療效果有限，或者根本不具有治療效果。ADC是抗體和小分子藥物的偶聯體，融合了抗體的標靶作用和生物活性分子的活性，成為一種生物導彈，具有非常可期待的療效和安全性優勢。抗體引導ADC結合到靶細胞，隨後被細胞內化，小分子藥物在細胞內通過特定酶作用下發生的酶解釋放，治療疾病。
ADC藥物近幾年發展非常迅速，已經上市的ADC有14種。在很多靶點的ADC中，如標靶NaPi2b的抗體/ADC藥物均處於臨床研究階段。對很多靶點而言，開發具有差異性的、更優質的、安全性更佳的單抗或ADC藥物，可以為腫瘤患者提供更廣更優的用藥選擇，也具有廣闊的市場前景。
為了改進抗體藥物偶聯物 (ADC)的治療效果，降低藥物毒副作用，提高治療視窗，本公開提供一種式 (XV)所示的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其含有生物活性分子 (藥物分子)、連接體和標靶部分，所述標靶部分通過活性基團 (例如巰基)與所述連接體連接形成抗體藥物偶聯物。本公開還開發了包含抗Napi2b的可變輕鏈結構域 (VL)和/或可變重鏈(VH)結構域，所述可變輕鏈結構域和/或可變重鏈結構域抗體來自人源化抗體。
為此，在本公開的第一方面，本公開提供了式XV所示的抗體藥物偶聯物， 式XV 或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中：Tb為抗NaPi2b的抗體或其抗原結合片段；q為藥物抗體偶聯比；D為生物活性分子片段；L 1為延伸單元；L 2不存在或為連接單元；L 3選自胺基酸殘基或由2-10個胺基酸殘基組成的短肽；L 4不存在或存在，L 4存在時，L 4選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與L 3相連，2位與D相連。
另外，還需要說明的是，對於「L 1的1位通過S原子與Tb相連」，本領域具通常知識者可以理解的是，L 1的1位是與打開二硫鍵 (例如，通過還原劑TCEP還原二硫鍵可以打開二硫鍵，生成巰基-SH)後的Tb (如抗體)自身所含有巰基進行連接，也就是說，L 1與Tb之間的-S-並非另外再外接的硫原子。例如， 中，-S-並非另外外接的硫原子， 而是打開雙硫鍵後的Tb自身所含有巰基與L 1例如 的1位進行連接後形成的-S-。
延伸單元為抗體藥物偶聯物或藥物連接體偶聯物或連接子的組分，其作用是將和靶點結合的抗體藥物偶聯物的其餘部分或連接子的其餘部分相連。延伸單元能夠將Tb單元連接於L 2(如果存在)或L 3，具體實例包括但不限於(其中1位與靶點結合的抗體部分相連、2位元與L 2或L 3相連)： 、 、 、 、 、 、 、 。
在一些實施方案中，L 1選自： ，各Z獨立地選自直接鍵、碳碳三鍵、碳碳雙鍵、C6-10芳基、5-10元雜芳基、醯胺基、磺醯胺基、亞胺基和CF 2；Rx和Ry獨立地選自H和C1-4烷基；各m獨立地選自0、1、2、3、4、5和6；y1、y2、y3和y4獨立地選自0-20之間的任意整數；1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連。
連接單元為抗體藥物偶聯物或藥物連接體偶聯物或連接子的組分，其作用是用來結合延伸單元與胺基酸殘基或由1-10個胺基酸殘基組成的片段或短肽。連接單元存在時能夠將L 1連接於L 3。具體實例包括但不限於(其中1位元與延伸單元相連、2位元與L 3相連)： 、 、 、 、 和 。 在一些實施方案中，L 2不存在或存在，L 2存在時，L 2選自： ， y1、y2、y3和y4獨立地選自0-20之間的任意整數，1位元與L 1相連，2位與L 3相連。
在一些實施方案中，L 1為 。
在一些實施方案中，L 1選自 、 、 、 、 、 、 和 ，各Z獨立地選自直接鍵、碳碳三鍵、碳碳雙鍵、C6-10芳基、5-10元雜芳基和醯胺基 (優選選自直接鍵、碳碳三鍵、碳碳雙鍵)；Rx、Ry獨立地選自H和C1-4烷基；各m獨立地選自0、1、2、3、4、5和6；y1選自1-6之間任意整數 (如4、5、6)；各y2獨立地選自0-15 (如6-15)之間任意整數；各y3獨立地選自1、2和3；各y4獨立地選自0和1；1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連。
在一些實施方案中，L 1選自 、 、 、 、 、 和 ，m選自2、3、4，y1選自1-6之間任意整數 (如4、5、6)，各y2獨立地選自0-10 (如6-10)之間任意整數，各y3獨立地選自1或2，1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連。
在一些實施方案中，L 1選自 、 、 、 、 、 、 。
在一些實施方案中，L 1選自 和 ，1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連。
在一些實施方案中，L 2不存在或存在，L 2存在時，L 2選自 、 、 、 、 、 、 和 ，y1選自1-6之間任意整數 (如4、5、6)，各y2獨立地選自0-10 (如6-10)之間任意整數，各y3獨立地選自1或2，各y4獨立地選自0或1，1位與L 1相連，2位與L 3相連。
在一些實施方案中，L 2不存在或存在，L 2存在時，L 2選自 、 、 、 、 和 ，1位與L 1相連，2位與L 3相連。
在一些實施方案中，L 2不存在。
在一些實施方案中，L 2選自 。
在一些實施方案中，L 3選自胺基酸殘基或由2-10個胺基酸殘基組成的短肽；所述的胺基酸殘基選自天然胺基酸殘基、非天然胺基酸殘基、或選自AA 1所示胺基酸殘基或其立體異構體。
在一些實施方案中，L 3選自胺基酸殘基Val、D-Val、Cit、Phe、Lys、Lys(Ac)、Leu、 Gly、Ala、Asn、Asp、Ar g、AA 1或由2-10個選自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、 Gly、Ala、Asn、Asp、AA 1的胺基酸殘基組成的短肽。
在一些實施方案中，L 3選自Val、Cit、Phe、Lys、D-Val、Leu、 Gly、Ala、Asn、AA 1、Val-Cit、Cit-Val、Cit-Ala、Val-Ala、Lys-Val、Val-Lys(Ac)、Phe-Lys、Phe-Lys(Ac)、Ala-Ala、Val-AA 1、Ala-AA 1、 Gly-AA 1、AA 1- Gly、Ala-Ala-Ala、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Asp、Val-AA 1- Gly、Ala-AA 1- Gly、 Gly-AA 1- Gly、Lys-Ala-Ala-Asn、Lys-Ala-Ala-Asp、 Gly-Phe- Gly、 Gly- Gly-Phe- Gly、D-Val-Leu-Lys、 Gly- Gly-Ar g、Ala-Ala-Asn、 Gly- Gly-Phe、Val-Lys- Gly、Val-Lys- Gly- Gly、Val-Lys和Lys-Ala-Asn。
在一些實施方案中，L 3選自AA 1、AA 1- Gly、Val-Cit、Val-AA 1- Gly、AA 1-Ala-Asn和 Gly- Gly-Phe- Gly。
在一些實施方案中，L 3選自AA 1和Val-AA 1- Gly。
在一些實施方案中，L 3選自Val-AA 1- Gly。
在一些實施方案中，L 3選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，X -選自鹵素離子、羧酸根離子、硫酸根離子、硫酸氫根離子和OH －，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或D相連。
在一些實施方案中，L 3選自 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或D相連。
在一些實施方案中，L 3選自 、 、 、 、 、 和 ，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或D相連。
在一些實施方案中，AA 1所示胺基酸殘基的結構如下所示， AA 1其中： R a、R b各自獨立地選自H、 、 和 ，且R a、R b不同時為H；或者，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成4-10元雜環，所述4-10元雜環任選地被一個或多個R 0所取代；r、r 1各自獨立地選自0到20的任意整數；R m1、R n1各自獨立地選自H、C1-6烷基、C3-6環烷基和-COOR x1；R x1選自C1-6烷基；或者，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成4-10元雜環，所述4-10元雜環任選地被一個或多個R 0’所取代；R z選自C1-6烷基；R 0、R 0’各自獨立地選自C1-6烷基、C3-6環烷基、-NR m2R n2和任選被C1-6烷基取代的4-10元雜環基；R m2、R n2各自獨立地選自H和C1-6烷基。
在一些實施方案中，R a、R b中，任一個為H，另一個選自 、 和 。
在一些實施方案中，R a、R b中，任一個為H，另一個選自 和 。
在一些實施方案中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的5-6元雜環。
在一些實施方案中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的呱啶環或呱嗪環。
在一些實施方案中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的呱啶環。
在一些實施方案中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成 、 或 ，1號碳原子為與R a和R b共同相連的碳原子。
在一些實施方案中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成 或 ，1號碳原子為與R a和R b共同相連的碳原子。
在一些實施方案中，r、r 1各自獨立地選自0、1、2、3、4和5。
在一些實施方案中，r、r 1各自獨立地選自0和4。
在一些實施方案中，r、r 1中，任一個為0，另一個為4。
在一些實施方案中，R m1、R n1各自獨立地選自H、甲基、乙基、正丙基、正丁基、-COOCH 3、-COOCH 2CH 3、-COOCH 2CH 2CH 3、-COOCH(CH 3) 2、-COOC(CH 3) 3和-COOCH 2CH 2CH 2CH 3。
在一些實施方案中，R m1、R n1各自獨立地選自H、C1-6烷基、C3-6環烷基和叔丁氧羰基。
在一些實施方案中，R m1、R n1各自獨立地選自H和C1-6烷基。
在一些實施方案中，R m1、R n1各自獨立地選自H、甲基、乙基和正丙基。
在一些實施方案中，r、r 1中，r為4，r 1為0時，R m1、R n1各自獨立地選自H、C1-6烷基 (如H、甲基)；r為0，r 1為4時，R m1、R n1各自獨立地選自C1-6烷基 (如甲基、乙基、正丙基)，優選選自C2-6烷基 (如乙基、正丙基)。
在一些實施方案中，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成任選被R 0’取代的5-6元雜環。
在一些實施方案中，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成任選被R 0’取代的呱啶環或呱嗪環。
在一些實施方案中，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成 、 、 、 ，1號氮原子為與R m1和R n1共同相連的氮原子。
在一些實施方案中，R z為甲基。
在一些實施方案中，R 0、R 0’各自獨立地選自C1-6烷基、-NR m2R n2和任選被C1-6烷基取代的5-6元雜環基。
在一些實施方案中，R 0選自C1-6烷基和被C1-6烷基取代的5-6元雜環基，所述5-6元雜環基選自呱啶基和呱嗪基。
在一些實施方案中，R 0選自甲基、乙基和被甲基取代的5-6元雜環基，所述5-6元雜環基為呱啶基。
在一些實施方案中，R 0選自甲基和被甲基取代的5-6元雜環基，所述5-6元雜環基為呱啶基。
在一些實施方案中，R 0選自甲基、乙基和 。
在一些實施方案中，R 0選自甲基和 。
在一些實施方案中，R 0’選自C1-6烷基和-NR m2R n2。
在一些實施方案中，R 0’選自甲基和-NR m2R n2。
在一些實施方案中，R m2、R n2為甲基。
在一些實施方案中，AA 1所示胺基酸殘基選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，AA 1所示胺基酸殘基選自 、 、 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，AA 1所示胺基酸殘基選自 、 、 、 、 、 和 。
在一些實施方案中，L 4不存在或存在，L 4存在時，L 4為 或 ，1位與L 3相連，2位與D相連。
在一些實施方案中，L 4不存在。
在一些實施方案中，L 4選自 和 ，1位與L 3相連，2位與D相連。
在一些實施方案中，L 4選自 ，1位與L 3相連，2位與D相連。
在一些實施方案中， 的結構選自以下結構片段：
。
在一些實施方案中，q選自0.1-16.0之間的任意數值；在優選的實施方案中，q選自0.1-16.0之間的任意整數。
在一些實施方案中，q選自0.1-8.0之間的任意數值，在優選的實施方案中，q選自0.1-8.0之間的任意整數。
在一些實施方案中，q選自2-8之間的任意數值。
在一些實施方案中，q選自3-8之間的任意數值。
在一些實施方案中，q選自4-8之間的任意數值。
在一些實施方案中，q選自6-8之間的任意數值。
在一些實施方案中，q選自2-8之間的任意整數。
在一些實施方案中，q選自3-8之間的任意整數。
在一些實施方案中，q選自4-8之間的任意整數。
在一些實施方案中，q選自6-8之間的任意整數。
在一些實施方案中，q選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
在一些實施方案中，q選自2、4、6和8。
本公開中，所述的生物活性分子片段是指本領域中均知的，抗體-藥物偶聯物 (或稱抗體偶聯藥物 (antibody-dru g conju gate, ADC))中，在腫瘤組織間或腫瘤細胞內連接子裂解/降解/酶切後，能夠形成具有生物活性的藥物 (例如小分子細胞毒藥物，所述藥物包括其失去一個原子或原子團後的基團)或其衍生物 (例如其前體)的部分 (片段或基團)。為了避免歧義，「藥物」並非僅指已獲得醫藥監管部門審批的「藥品」，還包括臨床中，或者研發和學術研究中任何有潛在治療生物活性的分子。
在一些實施方案中，D為具有抗腫瘤生物活性分子片段。
在一些實施方案中，D為具有抗腫瘤生物活性分子片段，其中所述的生物活性分子選自細胞毒性劑或其衍生物，例如DNA拓撲異構酶抑制劑 (例如喜樹堿類生物活性分子，例如喜樹堿、DXD、取代基被修飾的喜樹堿或取代基被修飾的DXD)或微管蛋白抑制劑(例如：MMAF類微管蛋白抑制劑，MMAE類微管蛋白抑制劑)。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I所式結構： 其中，R 1、R 2各自獨立地選自H、鹵素、-OH、任選取代的C1-6烷基和任選取代的C1-6烷氧基，或者，R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成5-7元碳環或5-7元雜環，所述雜環含有1個或多個O，S，N，羰基，亞碸基或碸基或其任意組合；R 3選自H、鹵素、-OH、-NH 2、任選取代的C1-6烷基和任選取代的C1-6烷氧基，或者，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成5-7元碳環或5-7元雜環，所述雜環含有1個或多個O，S，N，羰基，亞碸基或碸基或其任意組合，或者，R 3和R 2和與其相連的碳原子一起形成5-7元碳環或5-7元雜環，所述雜環含有1個或多個O，S，N，羰基，亞碸基或碸基或其任意組合；W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與X相連，2位與L 4或L 3相連；X選自直接鍵，任選取代的-O-(CH 2) n3-、-N(R 4)-(CH 2) n3-、-S-(CH 2) n3-、羰基-(CH 2) n3、-SO 2-(CH 2) n3-、 、 、 、-(CH 2) n1-、C3-6環烷基、C6-10芳基、5-10元雜芳基和4-10元雜環基，1位和母環相連，2位和W或L 4相連；所述取代基選自一個或多個C1-4烷基、C3-6環烷基，或者多個C1-4烷基和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基；各M獨立地選自直接鍵和-CR 5aR 5b-；R 4、R 5、R 5a、R 5b、R 6、R 7各自獨立地選自H、任選取代的C1-4烷基、任選取代的C1-4烷氧基和任選取代的C3-6環烷基；n、n’、n1、n2、n3各自獨立地選自0到6之間的任意整數；L 4不存在或存在，L 4存在時，L 4選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ，1位與L 3相連，2位與W或X相連。
Tb、L 1、L 2、L 3和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，R1、R2各自獨立地選自H、鹵素和C1-4烷基。
在一些實施方案中，R1和R2和與其相連的碳原子一起形成5-6元雜環，所述雜環含有1個、2個或3個O，S或N或其任意組合。
在一些實施方案中，R1選自H和鹵素，R2選自H和C1-4烷基。
在一些實施方案中，R 1和R 2和與其相連的碳原子形成 、 、 或 ，虛線表示所述雜環與苯環稠合的位置。
在一些實施方案中，R 1為H或F，R 2為H或甲基。
在一些實施方案中，R 1為F，R 2為甲基或R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成 。
在一些實施方案中，R 1為F，R 2為甲基。
在一些實施方案中，R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成 。
在一些實施方案中，R 3選自H和C1-4烷基。
在一些實施方案中，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成5-6元碳環。
在一些實施方案中，R 3為H或R 3和X和與其相連的碳原子一起形成 ，虛線表示所述碳環與苯環和吡啶環稠合的位置。
在一些實施方案中，R 3為H。
在一些實施方案中，W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與X相連，2位與L 4或L 3相連。
在一些實施方案中，W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 、 、 和 ，1位與X相連，2位與L 4或L 3相連。
在一些實施方案中，W選自-O-、-NR 4-和 ，1位X相連，2位與L 4或L 3相連。
在一些實施方案中，W選自-O-和-NR 4-，1位X相連，2位與L 4或L 3相連。
在一些實施方案中，X選自任選取代的-(CH 2) n1-、 、 、 、C6-10芳基、5-10元雜芳基和4-10元雜環基，1位和母環相連，2位和W或L 4相連；所述取代基選自1個或2個C1-4烷基，或者2個C1-4烷基和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基。
在一些實施方案中，X選自任選取代的 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W或L 4相連；所述取代基選自1個或2個C1-4烷基 (如甲基)，或者2個C1-4烷基 (如甲基)和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基 (如環丙基)。
在一些實施方案中，X選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W或L 4相連。
在一些實施方案中，X選自 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W相連。
在一些實施方案中，W不存在時，X選自 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和L 4相連；W存在時，X選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W相連。
在一些實施方案中，W選自-O-、-NR 4-和 ，1位X相連，2位與L 4或L 3相連；X選自 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W相連。
在一些實施方案中，R 4、R 5各自獨立地選自H、C1-4烷基和C3-6環烷基。
在一些實施方案中，各R 4獨立地選自H、C1-4烷基和C3-6環烷基，R 5為H。
在一些實施方案中，各R 4獨立地選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基和環丙基，R 5為H。
在一些實施方案中，R 5a、R 5b各自獨立地選自H和C1-4烷基。
在一些實施方案中，R 5a、R 5b各自獨立地選自H和甲基。
在一些實施方案中，各R 7獨立地選自H和C1-4烷基。
在一些實施方案中，R 7為H。
在一些實施方案中，n選自1、2和3。
在一些實施方案中，n為1。
在一些實施方案中，n1選自1、2、3和4。
在一些實施方案中，n2為1。
在一些實施方案中，n3為0。
在一些實施方案中，L 3選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，X －選自鹵素離子、羧酸根離子、硫酸根離子、硫酸氫根離子和OH －，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或W相連。
在一些實施方案中，L 3選自 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或W相連。
在一些實施方案中，L 3選自 、 、 、 、 和 ，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或W相連。
在一些實施方案中，L 4不存在或存在，L 4存在時，L 4為 或 ，1位與L 3相連，2位與W或X相連。
在一些實施方案中，L 4不存在。
在一些實施方案中，L 4選自 和 ，1位與L 3相連，2位與W或X相連。
在一些實施方案中，L 4選自 ，1位與L 3相連，2位與W或X相連。
需要說明的是，如前所述，W不存在或存在，由此，W不存在時，L 4的1位與L 3相連，2位與X相連；W存在時，L 4的1位與L 3相連，2位與W相連。以下關於L 4的連接關係可參照前述內容進行理解。
在一些實施方案中， 的結構選自以下結構片段：
其中，1位與Tb相連，2位與W相連。
在一些實施方案中，D為 所示的結構片段；1位與L 3或L 4連接；例如 、 、 。
在一些實施方案中， 的結構選自以下結構片段： 其中，1位與L 4相連；當L 4不存在時，1位與L 3相連。
在一些實施方案中，W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 和 ；例如不存在、-O-、-NR 4-或 ；R 4和R 5各自獨立地選自H和C1-4烷基；n獨立地選自0、1、2、3和4；X選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ；R 1選自H、鹵素，R 2選自H、C1-4烷基，或，R 1和R 2和與其相連的碳原子形成 、 、 或 ，虛線表示所述雜環與苯環稠合的位置；R 3選自H和C1-4烷基，或，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成5-6元碳環；優選地，W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-NR 4- (例如-NH-、-N(CH 3)-、-N(C 2H 5)-)、 和 ；R 4獨立地選自H、甲基、乙基、異丙基、正丙基、叔丁基和環丙基；W不存在時，X選自 、 、 和 ，1位和母環相連；W存在時，X選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ；AA 1 中，r選自0、1、2、3、4和5；R a、R b中，任一個為H，另一個選自 ；或者，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的5-6元雜環；R 1選自H、鹵素，R 2選自H、C1-4烷基，或，R 1和R 2和與其相連的碳原子形成 ；R 3選自H和C1-4烷基，或，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成R 3和X和與其相連的碳原子一起形成 ；更優選地，W選自-O-和-NR 4-，1位X相連，2位與L 4或L 3相連；X選自 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W相連； 為 ，例如 、 、 、 、 、 、 、 、 ；R 1為F，R 2為甲基或R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成 ；R 3為H。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-1所式結構： ， 其中，Tb、L 1、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-1A或I-1B所式結構： 其中，Tb、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-2所式結構： 其中，Tb、L 1、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-2A或I-2B所式結構： 、 其中，Tb、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-3所式結構： 其中，Tb、L 1、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、n和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-3A或I-3B所式結構： 、 ， 其中，Tb、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-A所式結構： ， 其中，Tb、X、R 1、R 2、R 3、R a、R b和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，抗體藥物偶聯物具有式I-B所式結構： ， 其中，Tb、X、R 1、R 2、R 3、R a、R b和q具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
在一些實施方案中，所述抗體藥物偶聯物選自以下：
。
在一些實施方案中，Tb為抗NaPi2b抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段以及單株抗體或其抗原結合片段包括：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv (例如，scFv)、dAb、互補決定區片段、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、全人抗體、前抗 (Probody)、單株抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
在一些實施方案中，Tb為具有內吞, 沒有內吞活性的或內吞較弱的抗Napi2b的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，Tb為具有內吞活性的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，Tb為沒有內吞活性的、或內吞活性弱的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，Tb為抗NaPi2b抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，抗Napi2b抗體為非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、全人抗體。
在一些實施方案中，抗Napi2b抗體為單株抗體，雙特異性抗體或多特異性抗體。
在一些實施方案中，抗Napi2b抗體或其抗原結合片段為單株抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述抗NaPi2b抗體或其抗原結合片段選自：lifastuzumab 或其抗原結合片段，upifitamab或其抗原結合片段，抗體C1。
在一些優選地實施方案中，所述抗NaPi2b抗體選自：16 G5B3、60A12B3、22H9C4、66C12D12和34F2A10鼠源抗體,或它們的人源化的抗體。
在一些優選地實施方案中，其中所述抗NaPi2b抗體選自：60A12B3-hz1抗體、22H9C4-hz1抗體、66C12D12-hz1抗體和34F2A10-hz1抗體。
所述Tb的抗體或其抗原結合的片段可以本領域已知的各種方法來製備，例如通過基因工程重組技術來獲得。例如，通過化學合成或PCR擴增獲得編碼本公開抗體的重鏈和輕鏈基因的DNA分子。將所得DNA分子插入表達載體內，然後轉染宿主細胞。然後，在特定條件下培養轉染後的宿主細胞，並表達本公開的抗體。
在一些優選實施方案中，在所述的抗體-藥物偶聯物中， Tb為第二方面所述的抗體Napi2b抗體或其抗原結合片段。
第二方面，本公開提供一種抗Napi2b抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含如下的互補決定區 (CDR)：SEQ ID NO： 1、17、19、34、36、52、54、71、73、74或33所示的重鏈可變區 (VH)中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體、以及HCDR3或其序列的變體；和/或SEQ ID NO： 2、18、20、35、37、53、55、72、75或51所示的輕鏈可變區 (VL)中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體、以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 1或17所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO：2或18所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 19或34所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 20或35所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 36或52所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 37或53所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 54、71或73所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 55或72所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 74或33所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 75或51所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 17所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO：18所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 34所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 35所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 52所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 53所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 71或73所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 72所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 33所示的VH中含有的HCDR1或其序列的變體、HCDR2或其序列的變體以及HCDR3或其序列的變體；和/或 SEQ ID NO： 51所示的VL中含有的LCDR1或其序列的變體、LCDR2或其序列的變體以及LCDR3或其序列的變體。
在某些優選實施方案中，所述序列的變體為與其來源CDR相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的CDR。
在某些優選實施方案中，所述的置換為保守置換。
在某些實施方案中，所述CDR根據AbM、Chothia、Kabat或IMGT編號系統定義。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含下述重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)，其中CDR按Kabat編號系統定義：(a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 3或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 4或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 6或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 7或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 9或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 3或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 5或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 6或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 8或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 9或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 21或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 22或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO：24或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 25或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 26或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(d) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 21或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 23或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 24或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 25或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 26或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(e) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 38或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 39或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 41或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 42或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 44或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(f) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 38或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 40或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 41或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 42或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 44或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；( g) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 56或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 57或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO：60或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 61或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(h) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 56或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 58或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 62或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；或(i) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO：56或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO：59或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 62或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個、2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含下述重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)，其中CDR按Kabat編號系統定義：(a) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 3的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 4的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 6的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 7的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 9的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3；(b) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 3的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 5的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 6的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 8的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 9的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3；(c) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 21的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 22的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 24的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 25的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 26的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3；(d) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 21的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 23的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 24的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 25的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 26的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3；(e) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 38的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 39的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 41的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 42的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 44的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3；(f) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 38的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 40的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 41的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 43的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 44的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3；( g) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 56的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 57的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 61的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3；(h) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 56的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 58的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 62的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3；或(i) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 56的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 59的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 62的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含下述重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)，其中CDR按IMGT編號系統定義：(a) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 11或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 12或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 14或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 15或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為WAS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(b) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 11或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 13或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 14或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 15或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為WAS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(c) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 28或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 29或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 31或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 32或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為YTS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(d) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 28或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 30或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 31或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 32或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為YTS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(e) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 46或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 47或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 49或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 50或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SAS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(f) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 46或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 48或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 49或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 50或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為SAS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；( g) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 65或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 66或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 68或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 69或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為WAS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；(h) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 65或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 67或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 68或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 69或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為WAS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3；或(i) 包含如下3個CDR的重鏈可變區 (VH)：序列為SEQ ID NO： 76或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 77或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 78或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的HCDR3；和/或，包含如下3個CDR的輕鏈可變區 (VL)：序列為SEQ ID NO： 79或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR1，序列為HTS或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 16或與其相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加)的序列的LCDR3。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含下述重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)，其中CDR按IMGT編號系統定義：(a) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 11的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 12的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 14的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 15的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3；(b) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 11的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 13的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 14的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 15的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3；(c) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 28的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 29的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 31的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 32的LCDR1，序列為YTS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3；(d) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 28的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 30的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 31的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 32的LCDR1，序列為YTS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3；(e) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 46的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 47的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 49的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 50的LCDR1，序列為SAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3；(f) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 46的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 48的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 49的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 50的LCDR1，序列為SAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3；( g) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 65的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 66的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 68的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 69的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3；(h) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 65的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 67的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 68的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 69的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3；或(i) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 76的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 77的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 78的HCDR3；和/或，所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 79的LCDR1，序列為HTS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 16的LCDR3。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含下述重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)，其中，與前述Kabat編號系統或IMGT編號系統定義的CDR相比，所述重鏈可變區 (VH)和/或輕鏈可變區 (VL)中至少一個CDR含有突變，所述突變為一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如1個，2個或3個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)，且仍具有結合Napi2b活性。
在某些優選地實施方案中，本公開所述的置換為保守置換。
在某些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段結合人Napi2b、猴Napi2b和/或大鼠Napi2b。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段的VH包含來源於人免疫球蛋白的重鏈可變區 (VH)的構架區 (FR)，和/或所述抗體或其抗原結合片段的VL包含來源於人免疫球蛋白的輕鏈可變區 (VL)的構架區 (FR)。因此，在某些實施方案中，本公開的抗體或其抗原結合片段是全人源的。在某些實施方案中，本公開的抗體或其抗原結合片段是人源化的。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：(a) 人免疫球蛋白的重鏈構架區或其變體，所述變體與其所源自的胚系抗體基因編碼的胺基酸序列相比具有至多20個胺基酸的保守置換 (例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸的保守置換)；和/或(b) 人免疫球蛋白的輕鏈構架區或其變體，所述變體與其所源自的胚系抗體基因編碼的胺基酸序列相比具有至多20個胺基酸的保守置換 (例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的保守置換)。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段的人源化程度為至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：(a)      重鏈可變區 (VH)，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(i) SEQ ID NO： 1、17、19、34、36、52、54、71、73、74或33所示的序列；(ii)與SEQ ID NO： 1、17、19、34、36、52、54、71、73、74或33所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(iii) 與SEQ ID 1、17、19、34、36、52、54、71、73、74或33所示的序列相比具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；和/或(b)  輕鏈可變區 (VL)，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(iv)  SEQ ID NO： 2、18、20、35、37、53、55、72、75或51所示的序列；(v)   與SEQ ID NO： 2、18、20、35、37、53、55、72、75或51所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(vi)與SEQ ID NO： 2、18、20、35、37、53、55、72、75或51所示的序列相比具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 1或17所示的VH，和/或 SEQ ID NO： 2或18所示的VL。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 19或34所示的VH，和/或 SEQ ID NO： 20或35所示的VL。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 36或52所示的VH，和/或 SEQ ID NO： 37或53所示的VL。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 54、71或73所示的VH，和/或 SEQ ID NO： 55或72所示的VL。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 74或33所示的VH，和/或 SEQ ID NO： 75或51所示的VL。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含上述5個方案組中，任一組的VH相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的VH；和/或，與該組VL相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的VL；或者在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含上述5個方案組中，任一組的VH相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合的VH；和/或，與該組VL具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合的VL；在某些優選地實施方案中，所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：(a)      SEQ ID NO： 1所示序列的VH和SEQ ID NO： 2所示序列的VL；(b)SEQ ID NO： 17所示序列的VH和SEQ ID NO： 18所示序列的VL；(c)SEQ ID NO： 19所示序列的VH和SEQ ID NO： 20所示序列的VL；(d)  SEQ ID NO： 34所示序列的VH和SEQ ID NO： 35所示序列的VL；(e)      SEQ ID NO： 36所示序列的VH和SEQ ID NO： 37所示序列的VL；(f)   SEQ ID NO： 52所示序列的VH和SEQ ID NO： 53所示序列的VL；( g)      SEQ ID NO： 54所示序列的VH和SEQ ID NO： 55所示序列的VL；(h) SEQ ID NO： 71所示序列的VH和SEQ ID NO： 72所示序列的VL；(i)   SEQ ID NO： 73所示序列的VH和SEQ ID NO： 72所示序列的VL；(j)     SEQ ID NO： 74所示序列的VH和SEQ ID NO： 75所示序列的VL；(k)   SEQ ID NO： 33所示序列的VH和SEQ ID NO： 51所示序列的VL；(l)   重鏈可變區 (VH)和輕鏈可變區 (VL)，其中所述重鏈可變區 (VH)和輕鏈可變區 (VL)獨立地與(a)至(k)任一組中所述的VH和VL相比分別具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性；或(m)重鏈可變區 (VH)和輕鏈可變區 (VL)，其中所述重鏈可變區 (VH)和輕鏈可變區 (VL)與(a)至(k)任一組中所述的VH和VL分別相比，獨立地具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)。在某些優選地實施方案中，所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體是嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體。在某些實施方案中，本公開的抗體或其抗原結合片段選自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段例如scFv或二硫鍵連接的Fv(dsFv)、雙抗體(diabody) 和多特異性抗體。在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體是scFv。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段的重鏈包含人免疫球蛋白的重鏈恒定區 (CH)或其變體，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有至多50個胺基酸的保守置換 (例如至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個或10個胺基酸的保守置換)。在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段的輕鏈包含人免疫球蛋白的輕鏈恒定區 (CL)或其變體，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有至多50個胺基酸的保守置換 (例如至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的保守置換)。
在一些實施方案中，恒定區被改變，例如被突變，以修飾抗Napi2b抗體分子的性質 (例如改變下列中的一個或多個特性：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基的數目、效應細胞功能或補體功能)。可以通過將抗體恒定區中的至少一個胺基酸殘基替換為不同殘基，產生功能改變，例如，改變抗體對效應子配體 (如FcR或補體C1q)的親和力，從而改變效應子功能 (例如降低)。抗體的Fc區介導幾種重要的效應子功能，例如ADCC、吞噬作用(ADCP)、CDC等。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段具有重鏈恒定區 (CH)，其選自例如I g G1、I g G2、I g G3、I g G4、I gM、I gA1、I gA2、I gD和I gE的重鏈恒定區；特別地選自例如I g G1、I g G2、I g G3和I g G4的重鏈恒定區，更特別地選自I g G1 (例如是人I g G1)的重鏈恒定區。在一些實施方案中，人I g G1重鏈恒定區如SEQ ID NO： 70所示。在一些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段具有輕鏈恒定區，其選自例如κ或λ輕鏈恒定區，優選κ輕鏈恒定區 (例如人κ輕鏈恒定區)。在一些實施方案中，輕鏈恒定區具有如SEQ ID NO： 80所示的序列。
在一些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 70所示的CH或其變體，所述變體與SEQ ID NO： 70相比具有至多20個胺基酸的保守置換 (例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的保守置換)，或者與SEQ ID NO： 70相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性。
在一些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含輕鏈恒定區或其變體。在一些實施方案中，所述輕鏈恒定區包含κ輕鏈恒定區。在一些實施方案中，所述輕鏈恒定區包含SEQ ID NO： 80所示的輕鏈恒定區 (CL)或其變體，所述變體與SEQ ID NO： 80相比具有至多20個胺基酸的保守置換 (例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的保守置換)，或者與SEQ ID NO： 80相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性。
在一些實施方案中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 70所示的重鏈恒定區 (CH)和SEQ ID NO： 80所示的輕鏈恒定區 (CL)。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：(a)      重鏈，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(i)   包含SEQ ID NO： 71所示的VH序列和SEQ ID NO： 70所示的CH序列的序列；(ii)   與(i)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(iii)與(i)所示的序列相比具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；以及(b)      輕鏈，其包含選自下列的胺基酸序列：(iv) 包含SEQ ID NO： 72所示的VL序列和 SEQ ID NO： 80所示的CL序列的序列；(v)     與(iv)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(vi)  與(iv)所示的序列相比具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列。
在某些實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：(a)      重鏈，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(i)   包含SEQ ID NO： 73所示的VH序列和SEQ ID NO： 70所示的CH序列的序列；(ii)   與(i)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(iii)與(i)所示的序列相比具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；以及(b)      輕鏈，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(iv) 包含SEQ ID NO： 72所示的VL序列和 SEQ ID NO： 80所示的CL序列的序列；(v)與(iv)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(vi)    與(iv)所示的序列相比具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列。
在某些實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含：(a)      重鏈，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(i)   包含SEQ ID NO： 17所示的VH序列和SEQ ID NO： 70所示的CH序列的序列；(ii)   與(i)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(iii)與(i)所示的序列相比具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；以及(b)      輕鏈，其包含選自下列的胺基酸序列或由其組成：(iv) 包含SEQ ID NO： 18所示的VL序列和 SEQ ID NO： 80所示的CL序列的序列；(v)與(iv)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(vi)    與(iv)所示的序列相比具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列。
在某些實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含或由下述序列組成：(i) SEQ ID NO： 81所示的序列；(ii) 與(i)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(iii) 與(i)所示的序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；和所述輕鏈包含或由下述序列組成：(iv) SEQ ID NO： 82所示的序列；(v) 與(iv)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(vi) 與(iv)所示的序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列;在某些優選地實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含重鏈和輕鏈，所述重鏈包含或由下述序列組成：(i) SEQ ID NO： 83所示的序列；(ii) 與(i)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(iii) 與(i)所示的序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；和所述輕鏈包含或由下述序列組成：(iv) SEQ ID NO： 84所示的序列；(v) 與(iv)所示的序列相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合 (例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合)的序列；或(vi) 與(iv)所示的序列具有至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的序列；在某些優選地實施方案中，(ii)或(v)中所述的置換是保守置換。
在某些實施方案中，所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體包含選自以下組的重鏈和輕鏈：(a)      包括SEQ ID NO： 71所示的VH和SEQ ID NO： 70所示的CH的重鏈，和包括SEQ ID NO： 72所示的VL和SEQ ID NO： 80所示的CL的輕鏈；(b)包括SEQ ID NO： 73所示的VH和SEQ ID NO：70所示的CH的重鏈，和，包括SEQ ID NO： 72所示的VL和 SEQ ID NO：80所示的CL的輕鏈；優選包括SEQ ID NO： 81所示的重鏈和SEQ ID NO： 82所示的輕鏈；(c)包括SEQ ID NO： 17所示的VH和SEQ ID NO： 70所示的CH的重鏈，和，包括SEQ ID NO： 18所示的VL和 SEQ ID NO： 80所示的CL的輕鏈。優選包括SEQ ID NO： 83所示的重鏈和SEQ ID NO： 84所示的輕鏈；在某些實施方案中，本公開提供的抗體是一種多特異性抗體，其結合Napi2b以及一種或多種其他抗原。在某些優選地實施方案中，所述多特異性抗體是雙特異性抗體或三特異性抗體或四特異性抗體。在 一些實施方案中，本公開的多特異性抗體包含上述所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，和另外的抗體或其片段或抗體類似物。 本公開抗體衍生物
本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段可進行衍生化，例如被連接至另一個分子 (例如另一個多肽或蛋白)。通常，抗體或其抗原結合片段的衍生化 (例如，標記)不會對其與Napi2b的結合產生不利影響。因此，本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段還意欲包括此類衍生化的形式。例如，可以將本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段連接 (通過化學偶合、基因融合、非共價連接或其它方式)於一個或多個其它分子基團，例如另一個抗體 (例如，形成雙特異性抗體)，檢測試劑，藥用試劑，和/或能夠介導抗體或其抗原結合片段與另一個分子結合的蛋白或多肽 (例如，抗生物素蛋白或多組胺基酸標籤)。
一種類型的衍生化抗體 (例如，雙特異性抗體)是通過交叉連接2個或更多個抗體 (屬於同一類型或不同類型)而產生的。獲得雙特異性抗體的方法是本領域公知的，其實例包括但不限於，化學交聯法、細胞工程法 (雜交瘤法)或基因工程法。
另一種類型的衍生化抗體是標記的抗體。例如，可以將本公開的抗體或其抗原結合片段連接至可檢測的標記。本公開所述的可檢測的標記可以是可通過螢光、光譜、光化學、生物化學、免疫學、電學、光學或化學手段檢測的任何物質。這類標記是本領域熟知的，其實例包括但不限於，酶 (例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素 (例如，3H、125I、35S、14C或32P)、螢光染料 (例如，異硫氰酸螢光素 (FITC)、螢光素、異硫氰酸四甲基羅丹明 (TRITC)、藻紅蛋白 (PE)、德克薩斯紅、羅丹明、量子點或花菁染料衍生物 (例如Cy7、Alexa 750))、吖啶酯類化合物、磁珠 (例如，Dynabeads®)、測熱標記物例如膠體金或有色玻璃或塑膠 (例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠，等)珠、以及用於結合上述標記物修飾的親和素 (例如，鏈黴親和素)的生物素。教導該標記物的使用的專利包括，但不限於，美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；及4,366,241 (全部通過引用併入本文)。如上所述的可檢測的標記可通過本領域已知的方法檢測。例如，放射性標記可使用攝影膠片或閃爍計算器檢測，螢光標記物可使用光檢測器檢測，以檢測發射的光。酶標記物一般通過給酶提供底物及檢測通過酶對底物的作用產生的反應產物來檢測，及測熱標記物通過簡單視覺化著色標記物來檢測。在某些實施方案中，此類標記能夠適用於免疫學檢測 (例如，酶聯免疫測定法、放射免疫測定法、螢光免疫測定法、化學發光免疫測定法等)。在某些實施方案中，可通過不同長度的接頭 (linker)將如上所述的可檢測的標記連接至本公開的抗體或其抗原結合片段，以降低潛在的位阻。
此外，本公開的抗體或其抗原結合片段還可以用化學基團進行衍生，例如聚乙二醇 (PEG)，甲基或乙基，或者糖基。這些基團可用於改善抗體的生物學特性，例如增加血清半衰期。 抗體的製備
本公開的抗體可以本領域已知的各種方法來製備，例如通過基因工程重組技術來獲得。例如，通過化學合成或PCR擴增獲得編碼本公開抗體的重鏈和輕鏈基因的DNA分子。將所得DNA分子插入表達載體內，然後轉染宿主細胞。然後，在特定條件下培養轉染後的宿主細胞，並表達本公開的抗體。
本公開的抗原結合片段可以通過水解完整的抗體分子獲得 (參見Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24：107-117 (1992) and Brennan et al., Science 229：81 (1985))。另外，這些抗原結合片段也可以直接由重組宿主細胞產生 (reviewed in Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11： 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21： 364-370 (2000))。比如，Fab’片段可以直接從宿主細胞中獲得；可以將Fab’片段化學偶聯形成F(ab’)2片段(Carter et al., Bio/Technolo gy, 10：163-167 (1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接從重組宿主細胞培養液中直接分離得到。本領域的普通技術人員完全知曉製備這些抗原結合片段的其它技術。
協力廠商面，本公開提供一種分離的核酸分子，其包含編碼本公開的第二方面抗體或其抗原結合片段、或其重鏈可變區和/或輕鏈可變區、或其一個或多個CDR的核苷酸序列；在某些實施方案中，所述核苷酸序列是可以根據密碼子簡並性進行替換的。在某些實施方案中，所述核苷酸序列是密碼子最優化的。
在某些實施方案中，本公開所述分離的核酸分子包含： (i) 分別編碼本公開的第二方面的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區的第一核酸和第二核酸，或 (ii) 分別編碼本公開的第二方面的抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和重鏈恒定區的第一核酸，和輕鏈可變區和輕鏈恒定區的第二核酸，或 (iii) 分別編碼本公開的第二方面的抗體或其抗原結合片段的重鏈和輕鏈的第一核酸和第二核酸。在某些實施方案中，所述第一核酸和第二核酸包含與上述 (i) - (iii) 中任一第一核酸和第二核酸的簡並序列或基本上相同序列的核酸。在某些實施方案中，所述簡並序列或基本上相同序列指與 (i)- (iii)中所述核酸分子相比具有至少大約85 %、90 %、95 %、99 %或更高序列同一性的序列或具有一個或更多個核苷酸取代的序列，或相差不超過3、6、15、30或45個核苷酸的序列。
第四方面，提供了一種載體 (例如複製載體或表達載體)，其包含本公開協力廠商面的分離的核酸分子。在某些實施方案中，本公開的載體是複製載體或表達載體。在某些實施方案中，本公開的載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，慢病毒等。在某些實施方案中，所述載體能夠在受試者 (例如哺乳動物，例如人)體內表達本公開的抗體或其抗原結合片段。
第五方面，提供了一種宿主細胞，其包含本公開協力廠商面的分離的核酸分子或本公開的第四方面載體。宿主細胞可以是真核細胞 (例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞)或原核細胞 (例如大腸桿菌)。合適的真核細胞包括但不限於NS0細胞、SP2/0細胞、Vero細胞、Hela細胞、COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、BHK細胞、和MDCKII細胞。適宜的昆蟲細胞包括但不限於Sf9細胞。在某些實施方案中，本公開的宿主細胞是哺乳動物細胞，例如CHO (例如CHO-K1、CHO-S、CHO DXB11、CHO D G44)。
第六方面，提供了製備本公開的第二方面抗體或其抗原結合片段，或本公開的多特異性抗體的方法，其包括，在允許所述抗體或其抗原結合片段、或所述多特異性抗體表達的條件下，培養本公開的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收所述抗體或其抗原結合片段。 抗體 - 藥物偶聯物
第七方面，提供一種抗Napi2b抗體-藥物偶聯物、其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中抗體為上述結合Napi2b的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述抗體藥物偶聯物選自： 其中，Tb 1為抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，例如： lifastuzumab 、upifitamab、60A12B3-hz1、22H9C4-hz1、66C12D12-hz1、34F2A10-hz1、C1、16 G5B3-hz2和16 G5B3-hz1抗體。
q選自0.1-16.0之間的任意數值，優選2-8之間的任意數值。在一些實施方案中，q為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些優選地實施方案中，q為2、4、6或8。 抗體 - 藥物偶聯物製備
在本公開的第八方面，本公開提供了製備前述抗體藥物偶聯物的方法，其包括：將Tb與式III所示的藥物連接體偶聯物 式III 在合適的溶劑和條件下進行偶聯反應；其中：Tb具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義；R 1、R 2、R 3、X、W、L 1、L 2、L 3、L 4具有上文以及本文具體敘述的任何實施方案中所提供的含義。
Lg為離去基團，Lg選自鹵素、碸基、三級胺鹽基 (Me 3N +、Et 3N +)、重氮鹽基、-OMs、MeSO 2-、CF 3SO 3-。
在一些實施方案中，L g選自F、Cl、MeSO2-。
在一些實施方案中，L g選自F、MeSO2-。
在一些實施方案中，所述方法包括將Tb與式III所示的藥物連接體偶聯物 在合適的溶劑和條件下進行偶聯反應形成C-S鍵的步驟。
在一些實施方案中，所述Tb與所述藥物連接體偶聯物的物質的量的比為1： (1-20)，如1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：12、1：14、1：16、1：18、1： (10-20)、1： (12-20)、1： (14-20)、1： (16-20)或1： (18-20)。
在一些實施方案中，所述偶聯反應在水和/或有機溶劑中進行。
在一些實施方案中，所述有機溶劑選自N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、N-甲基吡咯烷酮、腈類(例如乙腈)、醇類(例如甲醇、乙醇)或其任意組合。
在一些實施方案中，所述方法進一步包括將偶聯產物進行純化的步驟。
在一些實施方案中，通過層析方法對所述偶聯產物進行純化。
在一些實施方案中，所述層析方法包括離子交換層析、疏水層析、反相層析或親和層析中的一種或多種。
在本公開的第九方面，本公開提供了一種抗體藥物偶聯物的群，其包含本公開上前述的抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中所述的抗體藥物偶聯物具有一種，兩種或多種q值。
在一些實施方案中，當所述群中的的抗體藥物偶聯物具有一種q值時，q值和DAR值相等。
在一些實施方案中，當所述群中的的抗體藥物偶聯物具有兩種或多種q值時，其中一個特定q值的抗體藥物偶聯物中占群中所有抗體藥物偶聯物的比例大於50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %。
在一些實施方案中，所述群中抗體藥物偶聯物中的藥物與抗體的比例 (DAR)選自1-10中的整數或小數。
在一些實施方案中，所述群的藥物與抗體的比例 (DAR)選自1.5-2.5、3.5-4.5、5.5-6.5和7.5-8.5；在一些實施方案中，所述群的藥物與抗體的比例 (DAR)選自約2.0、4.0、6.0和8.0；在一些實施方案中，所述群中抗體藥物偶聯物中的藥物與抗體的比例 (DAR)選自2、2.5、3、3.5、4、4.5,5、5.5、6、6.5、7、7.2、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.7、8.9和9。
在一些實施方案中，所述的群含有具有1至8的DAR的分佈的ADC，例如，1.5、2、4、6、和8(即，1.5、2、4、6、 和8的載藥種類)。值得注意的是，可以產生降解產物，使得所述的群中也可以包含1、3、5和7的DAR。此外，所述的群也可具有大於8的DAR。所述的抗體藥物偶聯物由鏈間二硫化物還原然後偶聯 產生。在一些實施方案中，所述的抗體藥物偶聯物包含如下兩者：DAR為4或更低(即，載藥種類為4或更低) 的所述的抗體藥物偶聯物以及DAR為6或更高(即，載藥種類為6或更高)的所述的抗體藥物偶聯物。
在本公開的第十方面，本公開提供了一種藥物組合物，其包含上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第二方面抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，協力廠商面所述核酸，第四方面所述載體，第五方面所述宿主細胞，或者第九方面的抗體藥物偶聯物群，以及任選的一種或多種藥用輔料。
在某些實施方案中，所述藥物組合物包含的上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第二方面抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，協力廠商面所述核酸，第四方面所述載體，第五方面所述宿主細胞，或者第九方面的抗體藥物偶聯物群的劑量均為治療有效量的。
在某些實施方案中，所述藥物組合物包含的上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
在某些實施方案中，本公開的藥物組合物包含第九方面的抗體藥物偶聯物群，及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。在某些優選地實施方案中，本公開的藥物組合物包含上述抗體藥物偶聯物群，或包含抗體藥物偶聯物群和緩沖劑。 在某些進一步優選地實施方案中，本公開的藥物組合物還包括賦形劑和/或表面活性劑。
在某些實施方案中，本公開的藥物組合物包含本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。在某些優選的實施方案中，本公開的藥物組合物包含抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，和緩沖劑。在某些進一步優選的實施方案中，本公開的藥物組合物還包括賦形劑和/或表面活性劑。
在一些實施方案中，所述緩衝劑為組胺酸緩衝液。在某些優選的實施方案中，所述緩衝劑為pH為6.0的20 mM組胺酸緩衝液。
在某些實施方案中，本公開的藥物組合物包含本公開的宿主細胞，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑，其中所述宿主細胞包含如前所述的分離的核酸分子或載體。
在某些實施方案中，本公開的藥物組合物包含本公開的多特異性抗體，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
在一些實施方案中，所述藥物組合物中藥物與抗體的比例 (DAR)選自1-10中的整數或小數。
在一些實施方案中，所述藥物組合物中藥物與抗體的比例 (DAR)選自1.5-2.5、3.5-4.5、5.5-6.5和7.5-8.5；在一些實施方案中，所述藥物組合物中藥物與抗體的比例 (DAR)選自約2.0、4.0、6.0和8.0；在一些實施方案中，所述藥物組合物中抗體藥物偶聯物中的藥物與抗體的比例 (DAR)選自2、2.5、3、3.5、4、4.5,5、5.5、6、6.5、7、7.2、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.7、8.9和9。
在第十一方面，提供了本公開的抗體或其抗原結合片段在製備試劑盒中的用途，所述試劑盒用於檢測Napi2b在樣品中的存在或其水準。在另一個方面，本公開提供了診斷性或治療性試劑盒，其包括一個或多個以下物質：本公開所述的抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞、多特異性抗體、抗體藥物偶聯物，抗體藥物偶聯物群或者藥物組合物。可選地，所述診斷性或治療性試劑盒還包括使用說明書。
在本公開的第十二方面，本公開提供了前述的抗體藥物偶聯物組合物或者前述的藥物組合物在製備治療和/或預防與細胞活動異常相關的疾病 (例如癌症疾病)的藥物中的用途。所述的抗體藥物偶聯物組合物或者前述的藥物組合物可為治療有效量的。
在一些實施例中，提供本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞，或者多特異性抗體在製備藥物中的用途，所述藥物用於調整 (抑制或阻斷)Napi2b的活性。
在一些實施例中，提供本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞，或者多特異性抗體在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防與Napi2b的活性有關的疾病。
在一些實施例中，提供本公開的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段、核酸、載體、宿主細胞、抗體藥物偶聯物，或者多特異性抗體在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防與Napi2b的活性有關的腫瘤。
在一些實施例中，提供本公開的上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第二方面抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，協力廠商面所述核酸，第四方面所述載體，第五方面所述宿主細胞，第九方面的抗體藥物偶聯物群，或第十方面的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防腫瘤。
在一些實施例中，提供本公開的上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第九方面的抗體藥物偶聯物群，或第十方面的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防與Tb的靶點相關的腫瘤。
在一些實施例中，提供本公開的上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第九方面的抗體藥物偶聯物群，或第十方面的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防與NaPi2b相關的腫瘤。
在一些優選地實施例中，提供本公開的上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第二方面抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，協力廠商面所述核酸，第四方面所述載體，第五方面所述宿主細胞，第九方面的抗體藥物偶聯物群，第十方面的藥物組合物在製備藥物中的用途，所述藥物用於治療或預防與Napi2b相關的腫瘤。
在本公開的第十三方面，本公開提供了一種將上述第一方面或第七方面抗體藥物偶聯物，其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，第二方面抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，協力廠商面所述核酸，第四方面所述載體，第五方面所述宿主細胞，第九方面的抗體藥物偶聯物群，或第十方面的藥物組合物，用於治療和/或預防與細胞活動異常相關的疾病 (例如腫瘤)的方法。
在上述第十二和十三方面的中，所述腫瘤選自食管癌 (例如食管腺癌和食管鱗狀細胞癌)、腦瘤、肺癌 (例如小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌或肺腺癌)、鱗狀上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結腸癌 (例如人結腸腺癌)、直腸癌、結直腸癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、表皮癌、非霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤 (例如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤或肉瘤)、前列腺癌或甲狀腺癌。
在一些實施方案中，所述腫瘤與NaPi2b相關的腫瘤。
在一些實施方案中，所述腫瘤為與Napi2b相關的腫瘤。
在本公開中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域具通常知識者所通常理解的含義。並且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本公開，下面提供相關術語的定義和解釋。
如本文所使用，術語「藥學上可接受的鹽」的例子是由形成藥學上可以接受的陰離子的有機酸形成的有機酸加合鹽，包括但不限於甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、苯甲酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、α-酮戊二酸鹽、α-甘油磷酸鹽、烷基磺酸鹽或芳基磺酸鹽；優選地，所述烷基磺酸鹽為甲基磺酸鹽或乙基磺酸鹽；所述芳基磺酸鹽為苯磺酸鹽或對甲苯磺酸鹽。也可形成合適的無機鹽，包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、碳酸氫鹽和碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽等。
如本文所使用的，術語「藥學上可接受的載體和/或賦形劑」是指在藥理學和/或生理學上與受試者和活性成分相容的載體和/或賦形劑，其是本領域公知的(參見例如Remin gton's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania： Mack Publishin g Company, 1995)，並且包括但不限於：pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑，稀釋劑，維持滲透壓的試劑，延遲吸收的試劑，防腐劑。
藥學上可接受的鹽可使用本領域熟知的標準程式獲得，例如，通過將足量的鹼性化合物和提供藥學上可以接受的陰離子的合適的酸反應。
本公開中，所述藥用輔料是指生產藥品和調配處方時，使用的賦形劑和附加劑，是指除活性成分外，在安全性方面已進行了合理的評估，並且包含在藥物製劑中的物質。藥用輔料除了賦型、充當載體、提高穩定性外，還具有增溶、助溶、緩控釋等重要功能，是可能會影響到藥品的品質、安全性和有效性的重要成分。根據其來源可分為天然物、半合成物和全合成物。根據其作用與用途可分為：溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、潤滑劑、濕潤劑、滲透壓調節劑、穩定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、助懸劑、包衣材料、芳香劑、抗黏著劑、抗氧劑、螯合劑、滲透促進劑、pH調節劑、緩衝劑、增塑劑、表面活性劑、發泡劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保濕劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑、助濾劑、釋放阻滯劑等；根據其給藥途徑可分為口服、注射、黏膜、經皮或局部給藥、經鼻或口腔吸入給藥和眼部給藥等。同一藥用輔料可用於不同給藥途徑的藥物製劑，且有不同的作用和用途。
所述藥物組合物可根據給藥途徑製成各種適宜的劑型。例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服溶液劑、口服混懸劑、口服乳劑、散劑、酊劑、糖漿劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、乳膏劑、糊劑、眼用製劑、丸劑、植入劑、氣霧劑、粉霧劑、噴霧劑等。其中，所述的藥物組合物或適宜的劑型可以含有0.01 mg至1000 mg的本公開的化合物或其藥學上可接受的鹽或偶聯物，適宜含有0.1 mg至800 mg，優選含有0.5-500 mg，優選含有0.5至350 mg，特別優選1-250 mg。
所述藥物組合物可以注射劑形式用藥，包括注射液、注射用無菌粉末與注射用濃溶液。其中，可使用的載體和溶劑包括水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，滅菌的非揮發油也可用作溶劑或懸浮介質，如單甘油酯或二甘油酯。
本文使用的術語「治療」一般是指獲得需要的藥理和/或生理效應。該效應根據完全或部分地預防疾病或其症狀，可以是預防性的；和/或根據部分或完全穩定或治癒疾病和/或由於疾病產生的副作用，可以是治療性的。本文使用的「治療」涵蓋了對患者疾病的任何治療，包括：(a) 預防易感染疾病或症狀但還沒診斷出患病的患者所發生的疾病或症狀；(b) 抑制疾病的症狀，即阻止其發展；或(c) 緩解疾病的症狀，即，導致疾病或症狀退化。
在本公開中，術語「個體」包括人或非人動物。示例性人個體包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人個體(稱為患者)或正常個體。本公開中術語「非人動物」包括所有脊椎動物，例如非哺乳動物(例如鳥類、兩棲動物、爬行動物)和哺乳動物，例如非人靈長類、家畜和/或馴化動物(例如綿羊、犬、貓、奶牛、豬等)。
本公開中，術語「有效劑量」指被給藥後會在一定程度上緩解所治療病症的一種或多種症狀的化合物的量。
本公開中，術語「生物活性物」、「生物活性分子」或「藥物分子」指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質，在本公開的部分實施方案中，偶聯物中的生物活性物、生物活性分子或藥物分子為具有抗腫瘤生物活性的分子。例如：放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素；金屬配合物，例如金屬鉑配合物、金屬金配合物，奧沙利鉑等；糖肽類抗生素，例如博來黴素、平陽黴素；DNA拓撲異構酶抑制劑，例如拓撲異構酶I抑制劑，喜樹堿、羥基喜樹堿、9-胺基喜樹堿、SN-38、伊立替康、拓撲替康、貝洛替康、盧比替康，拓撲異構酶II抑制劑，放線菌素D、阿黴素、多柔比星、多卡米星，柔紅黴素、米托蒽醌、鬼臼毒素、依託泊苷等；干擾DNA合成藥物，例如甲胺蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他濱、巰嘌呤、噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、奈拉濱等；作用於結構蛋白的藥物，例如微管蛋白抑制劑，長春花生物鹼類、長春新堿、長春堿、紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽等；腫瘤訊號通路抑制劑，例如絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、天門冬胺酸激酶抑制劑或組胺酸激酶抑制劑等；還包括蛋白酶體抑制劑、組蛋白去乙醯化酶抑制劑、腫瘤新生血管生成抑制劑、細胞週期蛋白抑制劑、美登素衍生物、卡裡奇黴素衍生物、奧瑞他汀衍生物、Pyrrolobenzodiazepines (PBD)衍生物、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、或其它抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡和壞死的活性物質；酶及其片段，諸如核溶酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或者細菌、真菌、植物或動物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體；生長抑制劑；藥物模組。術語「毒素」指能夠對細胞的生長或增殖產生有害效果的物質。
本公開中，術語「連接體」是指將生物活性分子 (藥物分子)與標靶部分連接起來的片段。
本公開中，術語「標靶部分」是指偶聯物中能夠與細胞表面的靶標 (或靶標的部分)特異性結合的部分。通過標靶部分與靶標的相互作用，偶聯物可以被遞送至特定的細胞群。
本公開中，抗體或其抗原結合片段包括衍生化的抗體或其抗原結合片段，例如具有巰基的抗體或其抗原結合片段，其中所述衍生化使得抗體具有與藥物連接體偶聯物反應的基團或能力。所述巰基-SH可以打開二硫鍵 (例如，通過還原劑TCEP還原)衍生獲得。
本文中使用的術語「癌症」和「腫瘤」以相同的含義使用。
本文中使用的術語「基因」不僅包括DNA，而且包括其mRNA、其cDNA和其cRNA。
本文中使用的術語「多核苷酸」以與核酸相同的含義使用，並且還包括DNA、RNA、探 針、寡核苷酸和引物。
本文中使用的術語「多肽」和「蛋白」無區別地使用。
本文中使用的術語「細胞」也包括動物個體內的細胞和培養的細胞。
本公開中所述的抗Napi2b抗體中涉及的Napi2b可為本領域常規的Napi2b，當然還表示Napi2b變體。
術語「NaPi2b」， NaPi2b由SLC34A2基因編碼，由690個胺基酸組成，結構上8次跨膜，存在4個胞外環。鈉離子依賴性磷酸轉運蛋白2B (NaPi2b)通過選擇性轉運二價Pi (HPO42-)以維持體內Pi內穩態。人NaPi2b與大鼠同源性為85.3 %，與食蟹猴同源性為95.8 %。NaPi2b與該家族NaPi2a/2c胺基酸序列相似度高 (和NaPi2a同源性為51.29 %，和NaPi2c同源性為44.64 %)，特別在跨膜區同源性＞80 %。
KD指獲得自Kd(具體結合分子-靶蛋白相互作用的解離速率)與Ka(具體結合分子-靶蛋白相互作用的結合速率)之比(或Kd/Ka，以摩爾濃度(M)表示)的解離常數。可使用本領域充分建立的方法測定KD值。測定結合分子的KD的優選方法是通過使用表面等離子共振，例如生物感測器系統，如Biacore TM( GE Healthcare Life Sciences)系統。
如本文所用，兩個胺基酸序列之間的百分比同源性等於兩個序列之間的百分比同一性(identity)。兩個序列之間的序列百分比同一性是序列共用的相同位置的數目的函數(即，％同源性＝相同位置的數目/位置總數目X100)，其中考慮缺口( gap)的數目和每一缺口的長度，需要將其引入用於兩個序列的最優對比。可用本領域通常所知的方法進行序列比較和確定序列間的百分比同一性，可用數學演算法實現這種序列比較和百分比同一性的確定。例如，可用Meyers和Miller，1988Comput.Appl.Biosci.4：11-17的演算法(已整合入ALI GN程式(版本2.0))來確定胺基酸序列之間和/或核苷酸序列之間的百分比同一性。此外，可用從Accelrys線上獲得的 GC G套裝軟體中的 GAP程式(使用其缺省參數)來確定胺基酸序列之間或核苷酸序列之間的百分比同一性。在一個實施方案中，所述兩個序列是等長的。
術語「表位」是指在動物體優選哺乳動物體內具有抗原性或免疫原性活性的抗原多肽或蛋白的一部分。本公開的抗體或其抗原結合片段的表位可以通過現有技術測定，例如合成肽法，免疫資訊學預測，多肽活性的測定，表位元肽掃描法，噬菌體展示技術，X射線衍射和核磁共振分析，抗體同源建模蛋白對接預測法。本文中使用的短語「結合相同表位的抗體」表示，結合共同表位的不同抗體。如果 第二抗體結合第一抗體所結合的部分肽或部分三級結構，那麼可以確定，所述第一抗體和 所述第二抗體結合相同表位。
本公開中，術語「抗體」取其最廣義的解釋，包括完整的單株抗體、多株抗體以及由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，只要它們具有所需的生物學活性。在本公開中，「抗體」和「免疫球蛋白」可以互換使用。如本文所述的「抗體分子」或「抗體」指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結合抗原的抗原結合位點的分子。因此，術語抗體廣義上不僅涵蓋完整抗體分子，還包括所述抗體的片段以及所述抗體和抗體片段的變體(包括衍生物)。當「抗體分子」或「抗體」與抗原結合片段在同一語境下使用時，「抗體分子」或「抗體」指完整抗體分子或全長抗體。在本說明書中所述術語抗體分子例如包括但非限於單鏈Fv(scFv)，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2，二硫鍵連接的Fv(sdFv)，Fv，及完整抗體或全長抗體。術語「單鏈Fv」或「scFv」是指一種多肽，其包含與抗體VH結構域連接的抗體的VL結構域。例如免疫特異性結合Napi2b的抗體可以與其它抗原發生交叉反應。優選地，免疫特異性結合Napi2b的抗體與其它抗原不發生交叉反應。免疫特異性結合可以例如通過免疫測定或其它本領域技術人員已知的方法鑒別。「完整」抗體或「全長」抗體指包含兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的蛋白，所述重鏈和輕鏈通過二硫鍵相互連接，所述蛋白包含：(1)就重鏈而言，包含可變區(本文縮寫為「VH」)和含有三個結構域CH1、CH2、CH3的重鏈恒定區；和(2)就輕鏈而言，包含輕鏈可變區(本文縮寫為″VL″)和含有一個結構域CL的輕鏈恒定區。本公開的抗體包括但非限於單株，多特異性，人或嵌合抗體，單鏈抗體，Fab片段，F(ab′)片段，抗獨特型(抗-Id)抗體(包括例如本公開抗體的抗-Id抗體)，和上述任何抗體的表位結合片段。本公開的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白的任何類型(例如I g G，I gE，I gM，I gD，I gA和I gY)，類別(例如I g G1，I g G2，I g G3，I g G4，I gA1和I gA2)或亞類。優選地，本公開的抗體包含或由具有序列及其具體資訊表所述任一胺基酸序列或其片段或變體的VH結構域，VH CDR (本文中多用HCDR表示)，VL結構域，或VL CDR (本文中多用LCDR表示)組成。
在本公開中，術語「單株抗體」指抗體來自一群基本均一的抗體，即構成該集群的各抗體完全相同，除了可能存在的少量天然突變。單株抗體具有針對抗原的一個決定簇(表位)的高特異性，而與其相對的多株抗體則包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體。除了特異性之外，單株抗體的優點還在於合成時可以不受其他抗體的污染。此處修飾語「單株」表示該抗體的特徵在於來自一個基本均一的抗體群，而不應理解成需由特殊方法制得。
在本公開的部分實施方案中，單株抗體還特別包括嵌合抗體，即重鏈和/或輕鏈的一部分與某種、某類或某亞類抗體相同或同源，其餘部分則與另一種、另一類或另一亞類抗體相同或同源，只要它們具有所需的生物學活性(參見例如US 4,816,567；和Morrison等人，1984，PNAS，81： 6851-6855)。可用於本公開的嵌合抗體包括靈長類化(primatized)抗體，其包含來自非人靈長類(例如古猴、猩猩等)的可變區抗原結合序列和人恒定區序列。
術語「抗原結合片段」是指抗體的一部分，優選是抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、Fv、dAb和互補決定區片段，二抗體(diabody)，線性抗體和單鏈抗體分子。本文中使用的術語「抗原結合片段」表示抗體的具有抗原結合活性的部分片段，其 中所述片段具有抗體的完全或部分功能，包括非限於單鏈Fv(scFv)，Fab，Fab’，F(ab’)2，二硫鍵連接的Fv(sdFv)，Fv，di-scFv等。該術語也包括Fab’，其 為在還原條件下處理F(ab’)2得到的抗體的可變區的單價片段。但是，該術語不限於這些分 子，只要所述片段具有與抗原的結合親和力即可。此外，這些功能片段不僅包括用適當的酶 處理抗體蛋白的全長分子得到的片段，而且包括使用遺傳修飾的抗體基因在適當宿主細胞 中生產的蛋白。
本文中使用的術語「Fab’」表示如上所述在還原條件下處理F(ab’)2得到的抗體的 可變區的單價片段。但是，本公開的Fab’也包括使用遺傳修飾的抗體基因生產的Fab’。
如本文中所使用的，術語「scFv」是指，包含VL和VH結構域的單個多肽鏈，其中所述VL和VH通過接頭 (linker)或直接相連 (參見，例如, Bird等人, Science 242：423-426 (1988)；Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883 (1988)；和Pluckthun，The Pharmacolo gy of Monoclonal Antibodies，第113卷， Rosebur g 和Moore 編，Sprin ger-Verla g，紐約，第269-315頁(1994))。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的 G G G GS胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列( G G G GS)4的接頭，但也可使用其變體 (Holli ger等人(1993)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein En g. 8：725-731，Choi等人(2001)，Eur. J. Immunol. 31： 94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res. 56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J. Mol. Biol. 293： 41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。在一些情況下，scFv的VH與VL之間還可以存在二硫鍵。如本文中所使用的，術語「di-scFv」是指，由兩個scFv連接形成的抗體片段。
如本文所用，在所述抗體或其抗原結合片段中的即使含有變體、胺基酸的置換、缺失或添加，也仍然具有結合所述抗原的活性。
術語「雙特異性抗體」亦稱為「雙功能抗體偶聯物」，是指由第一抗體(片段)和第二抗體(片段)通過偶聯臂所形成的偶聯物，該偶聯物保留了各自抗體的活性，故具有雙功能和雙特異性。
術語「多特異性抗體」包括例如三特異性抗體和四特異性抗體，前者是具有三種不同抗原結合特異性的抗體，而後者是具有四種不同抗原結合特異性的抗體。
術語「完整抗體」或「全長抗體」指包含抗原結合可變區和輕鏈恒定區(CL)、重鏈恒定區(CH1、CH2和CH3)的抗體。恒定區可以是天然序列(例如人天然恒定區序列)或其胺基酸序列變體。完整抗體優選是具有一種或多種效應功能的完整抗體。
術語「前抗 (Probody)」是一種修飾的抗體，包括一種抗體或一種抗體片段，能專門與其靶點結合，能夠與掩蔽基團耦合，其中掩蔽基團指對抗體或抗體片段與其靶點的結合能力的裂解常數比沒有耦合掩蔽基團的抗體或抗體片段與其靶點的結合能力的裂解常數至少大100倍或1000倍、或者10000倍。
在本公開中，非人(例如鼠)抗體的「人源化」形式指包含最少量非人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。大多數人源化抗體是人接受者免疫球蛋白的超變區殘基被置換成具有所需特異性、親和力和功能的非人(例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類)超變區殘基(供者抗體)。在一些實施方案中，人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基也被置換成非人殘基。而且，人源化抗體還可以包含受者抗體或供者抗體中沒有的殘基。這些修飾是為了進一步優化抗體的性能。人源化抗體一般包含至少一個，通常是兩個可變區，其中所有或幾乎所有超變環(hypervanable loops)與非人免疫球蛋白的相對應，而FR則完全或幾乎完全是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區(Fc，通常是人免疫球蛋白Fc)的至少一部分。有關細節參見例如Jones等人，1986，Nature，321： 522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332： 323-329；和Presta，1992，Curr Op Struct Bwl 2： 593-596。
完整抗體可根據重鏈恒定區的胺基酸序列分為不同的「類」。主要的五類是I gA、I gD、I gE、I g G和I gM，其中幾類還可以分為不同的「亞類」(同種型)，例如I g G1、I g G2、I g G3、I g G4、I gA1和I gA2。抗體不同類的重鏈恒定區分別稱為α、β、ε、γ和 µ。免疫球蛋白不同類的亞基結構和三維構型是本領域中公知的。
在本文中，本公開的抗體或其抗原結合片段含有的CDR可根據本領域已知的各種編號系統確定。在某些實施方案中，本公開的抗體或其抗原結合片段含有的CDR優選地通過Kabat、Chothia或，AbM或IMGT編號系統確定。
如本文中所使用的，術語「構架殘基區」或「FR殘基」是指，抗體可變區中除了如上定義的CDR殘基以外的那些胺基酸殘基。
如本文中所使用的，術語「胚系抗體基因」是非淋巴細胞表達的免疫球蛋白的編碼基因，它沒有經歷導致表達特異免疫球蛋白的遺傳學重排及成熟的成熟過程。本公開的各種實施方案所提供的一個優點來源於一種認識，那就是胚系抗體基因編碼的胺基酸序列比成熟抗體基因編碼的胺基酸序列更多地保留了動物物種個體的特徵性的重要胺基酸序列結構。因此當被治療性應用于該物種時，更少地被該物種識別為外源物質。
作為胺基酸取代，在本說明書中，保守的胺基酸取代是優選的。保守的胺基酸取代 表示，在與胺基酸側鏈有關的胺基酸集合內發生的取代。優選的胺基酸集合如下：酸性集合 (天門冬胺酸和麩胺酸)；鹼性集合(賴胺酸、精胺酸和組胺酸)；非極性集合(丙胺酸、纈胺酸、 白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蛋胺酸和色胺酸)；和不帶電荷的極性家族(甘胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸)。更優選的胺基酸集合如下：脂族羥基(絲胺酸和蘇胺酸)；含有醯胺的集合(天門冬醯胺和麩醯胺酸)；脂族集合(丙胺酸、纈胺 酸、白胺酸和異白胺酸)；和芳族集合(苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸)。這樣的胺基酸取代優選地在不會損害具有原始胺基酸序列的物質的性能的集合內進行。
此外，已知的是，缺失在培養的哺乳動物細胞中生產的抗體的重鏈的羧基端的賴胺酸殘基(Journal of Chromato graphy A, 705： 129-134 (1995))，還已知的是，缺失在 培養的哺乳動物細胞中生產的抗體的重鏈的羧基端的2個胺基酸殘基(甘胺酸和賴胺酸)，並且新位於羧基端處的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry, 360： 75-83 (2007))。但是，重鏈序列的這樣的缺失和修飾不會影響抗體的抗原結合親和力和效應子功能(補體的活化、抗體依賴性的細胞的細胞毒性等)。
本文涉及的二十個常規胺基酸的編寫遵循常規用法。參見例如，Immunolo gy-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates , Sunderland, Mass. (1991))，其以引用的方式併入本文中。在本文中，術語「多肽」和「蛋白質」具有相同的含義且可互換使用。並且在本公開中，胺基酸通常用本領域公知的單字母和三字母縮寫來表示。例如，丙胺酸可用A或Ala表示；精胺酸可用R或Ar g表示；甘胺酸可用 G或 Gly表示；麩醯胺酸可用Q或 Gln表示。
如本文中所使用的，術語「預防」是指，為了阻止或延遲疾病或病症或症狀 (例如，腫瘤和傳染病)在受試者體內的發生而實施的方法。如本文中所使用的，術語「治療」是指，為了獲得有益或所需臨床結果而實施的方法。為了本公開的目的，有益或所需的臨床結果包括但不限於，減輕症狀、縮小疾病的範圍、穩定 (即，不再惡化)疾病的狀態，延遲或減緩疾病的發展、改善或減輕疾病的狀態、和緩解症狀 (無論部分或全部)，無論是可檢測或是不可檢測的。此外，「治療」還可以指，與期望的存活期相比 (如果未接受治療)，延長存活期。
如本文中使用的，術語「受試者」是指哺乳動物，例如靈長類哺乳動物，例如非人靈長類哺乳動物或人。在某些實施方式中，所述受試者 (例如人)腫瘤和傳染病，或者，具有患有上述疾病的風險。
如本文中所使用的，術語「有效量」是指足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預防疾病 (例如，腫瘤和傳染病)有效量是指，足以預防，阻止，或延遲疾病 (例如，腫瘤和傳染病)的發生的量；治療疾病有效量是指，足以治癒或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其併發症的量。測定這樣的有效量完全在本領域技術人員的能力範圍之內。例如，對於治療用途有效的量將取決於待治療的疾病的嚴重度、患者自己的免疫系統的總體狀態、患者的一般情況例如年齡，體重和性別，藥物的施用方式，以及同時施用的其他治療等等。
如本文中所使用的，術語「效應子功能 (effector function)」是指，那些可歸因於抗體Fc區 (天然序列Fc區或胺基酸序列變體Fc區)的生物學活性，且其隨抗體同種型而變化。
術語「藥學上可接受的」指當分子本體、分子片段或組合物適當地給予動物或人時，它們不會產生不利的、過敏的或其他不良反應。可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體示例包括糖類 (如乳糖)、澱粉、纖維素及其衍生物、植物油、明膠、多元醇 (如丙二醇)、海藻酸等。
術語「抗體藥物偶聯物群」是指一組或一群本發明的抗體-藥物偶聯物、其立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽、其互變異構體、或其藥學上可接受的溶劑合物組成的混合物，其中抗體藥物偶聯物的q可以相同或不同。另外，也可將其稱為「抗體藥物偶聯物混合物」。
使用實驗動物可以確定抗體和抗體-藥物偶聯物對癌症的體內治療效果，例如，將抗體施用給植入了表達Napi2b的腫瘤細胞系的裸鼠，並測量癌細胞的任何變化。
在本公開中，儘管大多數情況下抗體中的胺基酸取代是被L-胺基酸取代，但也不限於此。在一些實施方案中，抗體肽鏈中可以包括一個或多個D-胺基酸。包含D-胺基酸的肽在口腔、腸道或血漿中比僅包含L-胺基酸的肽更加穩定而不易降解。
本公開所用的單株抗體可以由許多方法生產。例如，用於本公開的單株抗體可以通過雜交瘤方法，使用許多物種(包括小鼠、倉鼠、大鼠和人的細胞)獲得(參見例如Kohler等人，1975，Nature，256： 495)，或者通過重組DNA技術制得(參見例如US 4,816,567)，或者從噬菌體抗體庫中分離得到(參見例如Clackson等人，1991，Nature，352： 624-628；和Marks等人，1991，Journal of Molecular Biolo gy，222： 581-597)。
本文中，除非以其他方式明確指出，在本文中通篇採用的描述方式「各…獨立地選自」和「…各自獨立地選自」可以互換，均應做廣義理解，其既可以是指在不同基團中，相同或不同的符號之間所表達的具體選項之間互相不影響，也可以表示在相同的基團中，相同或不同的符號之間所表達的具體選項之間互相不影響。
本文中，術語「直接鍵」表示其兩側的基團直接相連，例如，式II所示的化合物 中，若X為直接鍵，則其結構式為 。其餘直接鍵可參照前述內容進行理解。
本文中，術語「不存在」表示該基團不存在，例如，式II所示的化合物 中，若W不存在，則其結構式為 。
式II所示的化合物 中，R 1和R 2和與其相連的碳原子形成 、 、 或 ，「虛線」鍵表示所述雜環與苯環稠合的位置，例如，形成 、 、 或 。
本文中，式III所示的藥物連接體偶聯物 中，L 4為 時，其中的標號1、2表示L 4與其餘基團的連接位置，具體地，1位與L 3相連，2位與藥物分子即 相連時，形成 。其餘標號1、2可參照前述內容進行理解。
本文中，式II所示的化合物 中，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成 ，虛線表示所述碳環與苯環和吡啶環稠合的位置，形成 。
本文中，X的定義例如為，「X選自任選取代的 ，所述取代基選自1個或2個C1-4烷基 (如甲基)」，則X例如可以為 或 。X其餘類似的定義可參照前述內容進行理解。
本文中，X的定義例如為，「X選自任選取代的 ，所述取代基選自2個C1-4烷基 (如甲基)和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基 (如環丙基)」，則X例如可以為 。X其餘類似的定義可參照前述內容進行理解。
AA 1所示胺基酸殘基的結構 中，若r為0，則本領域技術人員可以理解的是，AA 1所示胺基酸殘基的結構將變為 。
AA 1所示胺基酸殘基的結構 中，若R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成4-10元雜環，所述4-10元雜環任選地被一個或多個R 0所取代，其中，術語「所述4-10元雜環任選地被一個或多個R 0所取代」的含義為，所述4-10元雜環可以不被取代，也可以被一個或多個R 0所取代，且所述多個R 0中，各R 0的定義可以相同，也可以不同。其餘類似的定義可以參照前述內容進行理解。
本文中，例如，L 3選自Lys、Val-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Ala-Asp、 Gly- Gly-Phe- Gly、Val-Lys- Gly、Val-Ala、Lys-Ala-Asn時，「所述賴胺酸 (Lys)的遠端胺基任選地被1個、2個或3個選自叔丁氧羰基、C1-6烷基 (優選甲基)、O的取代基所取代」的含義為，所述L 3各選項中的Lys的遠端胺基任選地被1個、2個或3個選自叔丁氧羰基、C1-6烷基 (優選甲基)、O的取代基所取代。其中，「Lys的遠端胺基」指的是賴胺酸殘基 中裸露的胺基-NH 2。「所述賴胺酸 (Lys)的遠端胺基任選地被1個、2個或3個選自叔丁氧羰基、C1-6烷基 (優選甲基)、O的取代基所取代」表示所述賴胺酸 (Lys)的遠端胺基可以不被取代，也可以被1個、2個或3個選自叔丁氧羰基、C1-6烷基 (優選甲基)、O的取代基所取代，例如，可以被1個叔丁氧羰基取代，即變為 ，或者，可以被2個甲基取代，即變為 ，或者被2個甲基和1個O同時取代，即變為 。需要說明的是，「所述賴胺酸 (Lys)的遠端胺基被O取代」指的是所述賴胺酸 (Lys)的遠端胺基被氧代，即變為 ，若該遠端胺基進一步被兩個甲基所取代，則其變為 。
在本說明書的各部分，本公開化合物的取代基按照基團種類或範圍公開。特別指出，本公開包括這些基團種類和範圍的各個成員的每一個獨立的次級組合。例如，術語「C1-6烷基」特別指獨立公開的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
在本文中，術語「C1-6烷基」表示直鏈或支鏈的含有1-6個碳原子的烷基，包括例如 「C1-3烷基」或 「C1-4烷基」，甲基，乙基等，具體實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基。
在本文中，術語「C 1-4烷基」表示直鏈或支鏈的含有1-4個碳原子的烷基，包括例如 「C 1-3烷基」，甲基，乙基等，具體實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基。
在本文中，術語「C 2-6烯基」是指含有至少一個雙鍵且碳原子數為2-6的直鏈、支鏈或環狀的烯基，包括例如「C 2-4烯基」等。其實例包括但不限於：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,4-己二烯基、環戊烯基、1,3-環戊二烯基、環己烯基、1,4-環己二烯基等。
在本文中，術語「C 2-6炔基」是指含有至少一個三鍵且碳原子數為2-6的直鏈或支鏈的炔基，包括例如「C 2-4炔基」等。其實例包括但不限於：乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-甲基-2-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、5-甲基-2-己炔基等。
在本文中，術語「鹵素」包括氟、氯、溴、碘。
在本文中，術語「3-6元環烷基」或「C 3-6環烷基」是指含有3-6個碳原子的飽和環狀烷基，包括環丙烷基 (即環丙基)、環丁烷基 (即環丁基)、環戊烷基 (即環戊基)、環己基。
在本文中，術語「3-7元碳環烷基」或「C 3-7環烷基」是指含有3-7個碳原子的飽和環狀烷基，包括環丙烷基、環丁烷基、環戊烷基、環己基、環庚基。
在本文中，術語「C1-6烷氧基」是指通過氧原子連接至母體分子部分的如上文所定義的烷基。具體實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。
在本文中，術語「C1-4烷氧基」是指通過氧原子連接至母體分子部分的如上文所定義的烷基。具體實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基等。
在本文中，術語「4-10元雜環基」是指含有4-10個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環狀基團。術語「4-6元雜環基」是指含有4-6個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環狀基團。任選地，環狀結構中的環原子 (例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。「4-8元雜環基」包括例如「4-8元含氮雜環基」、「4-8元含氧雜環基」、「4-7元雜環基」、「4-7元含氧雜環基」、「4-7元雜環基」、「4-6元雜環基」、「5-7元雜環基」、「5-6元雜環基」、「5-6元含氮雜環基」，包括但不限於氧代環丁烷基、吡咯烷基、四氫呋喃基、呱啶基、呱嗪基、四氫吡喃基、高呱嗪基等。
在本文中，術語「4-10元雜環」是指含有4-10個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環。術語「5-6元雜環」是指含有5-6個環原子(其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子)的環，包括但不限於吡咯烷、四氫呋喃、呱啶、呱嗪、四氫吡喃等環。
在本文中，術語「芳基」是指具有芳香性的單環或多環烴基，例如6-10元芳基、5-8元芳基等。具體的實例包括但不限於苯基、萘基、蒽基、菲基等。所述「6-10元芳基」是指含有6-10個環原子的芳基。所述「C6-10芳基」 是指含有6-10個碳原子的芳基。
在本文中，術語「雜芳基」是指具有芳香性的環狀基團，其中至少一個環原子為雜原子，例如氮原子、氧原子或硫原子。任選地，環狀結構中的環原子 (例如碳原子、氮原子或硫原子)可以被氧代。具體實例包括但不限於5-10元雜芳基、5-6元雜芳基、5-10元含氮雜芳基、6-10元含氧雜芳基、6-8元含氮雜芳基、5-8元含氧雜芳基等，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、噁唑基、異噁唑基、噁二唑基、咪唑基、吡唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、嘧啶基、1,4-二氧雜環己二烯基、2H-1,2-噁嗪基、4H-1,2-噁嗪基、6H-1,2-噁嗪基、4H-1,3-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、4H-1,4-噁嗪基、噠嗪基、吡嗪基、1,2,3-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氮雜環庚三烯基、1,3-二氮雜環庚三烯基、氮雜環辛四烯基等。
本文用波浪線「~~」表示的結構式中的鍵意在表示，該結構表示順式或反式異構體，或任意比例的順式和反式異構體的混合物。
術語「藥物與抗體比」或「DAR」是指在群(或混合物)或組合物或ADC分子中藥物和抗體的比例，例如，與ADC的抗體附接的小分子毒素。ADC的DAR可以在1到16的範圍內，但是取決於抗體上的連接位點的數量，更高的負 載(例如20)也是可能的。提及負載到單個抗體上的藥物的數量時，或可替代地，提及一組 ADC的平均或均值DAR時，可以使用術語DAR。應當理解，後者通常稱為平均DAR。在質譜法測定DAR值的過程中，抗體已經被還原為分離的重輕鏈，DAR1代表包含輕鏈或重鏈偶聯1個毒素分子的偶聯物；DAR2代表包含輕鏈或重鏈偶聯2個毒素分子的偶聯物；DAR3代表包含輕鏈或重鏈偶聯3個毒素分子的偶聯物。 發明的有益效果
本公開通過大量研究多個靶點抗體偶聯藥物 (ADC)，實現對腫瘤微環境的富集、連接子特有的體內酶切特性以及與標靶部分的偶聯方式、結合大量體內體外藥效的篩選驗證，獲得一類新穎的抗體生物活性分子偶聯物。利用上述方式獲得的偶聯物，能夠實現多種下述的驚奇的技術效果：根據上述方式得到的偶聯物具有更好的溶解度和優異的化學穩定性，如不發生傳統ADC中馬來醯亞胺連接方式引起的可逆Michael加成反應，因此可以獲得高藥物-抗體比，在一些實施方案中，所述偶聯物的DAR值能夠達到6-8；具有極高的偶聯效率，在一些實施方案中，所述偶聯效率能夠達到或超過90 %；通過大量研究發現了一類具有高血漿穩定性，但同時又能在腫瘤微環境中 (腫瘤細包內和腫瘤細胞外均可)裂解的連結子，因此可以在抗原低表達或者抗原不表達腫瘤中產生好的抗腫瘤效果；根據上述方式得到的偶聯物 (ADC)通過對連接子和整體ADC分子的理化性質的調整，提高了整個ADC分子在相對酸性腫瘤環境中的暴露量，因而ADC具有更好的腫瘤組織標靶性，即在腫瘤微環境中的富集能力，增加了生物活性分子在瘤內和血液濃度比，降低了ADC分子的機理相關的毒性 (ADC結合非腫瘤組織中細胞表面抗原並內吞後產生的毒性，或者又叫「on-target毒性」)，因此具有更高的治療指數；根據上述方式得到的偶聯物具有很高的在體內迴圈中的穩定性，減少了藥物分子在非靶組織中的脫落，減少了非靶組織中毒素脫落引起的「off-tar get」毒性；所述偶聯物的生物活性分子具有更高的抗腫瘤細胞活性，因此具有優異的旁觀者效應 (by-stander effect)，ADC能夠更有效地殺死抗原高表達腫瘤細胞以及腫瘤組織中抗原低表達或抗原不表達的腫瘤細胞；本公開的毒素-連接子，利用其連接子在腫瘤微環境中的胞外裂解能力，可以和沒有細胞內吞能力的抗體組成抗體偶聯藥物，這類抗體偶聯藥物依然具有高抗腫瘤活性；本公開的毒素-連接子，利用其連接子在腫瘤微環境中的胞外裂解能力以及其在腫瘤微環境中的富集能力，可以和沒有細胞內吞能力的抗體以及沒有腫瘤細胞外抗原結合能力的抗體組成抗體偶聯藥物，這類抗體偶聯藥物依然具有高抗腫瘤活性；本公開提供的抗Napi2b抗體具有極高的人源化程度或者全人源抗體，從而可安全地施用給人受試者，而不引發免疫原性反應。
綜上，本發明ADC具有重大的臨床價值。
以下通過具體實施方式的描述對本公開作進一步說明，但這並非是對本公開的限制。本領域技術人員根據本公開的教導，可以做出各種修改或改進，而不脫離本公開的基本思想和範圍。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
本公開中的縮寫具有以下含義：
OMs 甲磺酸酯基 FA 甲酸
OTs 對甲苯磺酸酯基 ACN 乙腈
OTf 三氟甲磺酸酯基 CCK8試劑 2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽
TBS 叔丁基二甲基矽基 FBS 胎牛血清
MMT 對甲氧基苯基二苯甲基 DMSO 二甲基亞碸
PB/PBS 磷酸鹽緩液 HBTU O-苯並三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽
HOBT 1-羥基苯並三唑 HATU 2-(7-氮雜苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽
NBS N-溴代琥珀醯亞胺 TFA 三氟乙酸
PPTS 吡啶對甲苯磺酸鹽 DCM 二氯甲烷
THF 四氫呋喃 DMF N,N-二甲基甲醯胺
EDC 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 I g G 免疫球蛋白 G
CDR 免疫球蛋白可變區中的互補決定區 HRP 辣根過氧化物酶
FR 抗體構架區：抗體可變區中除CDR殘基以外的胺基酸殘基 hFc 人I g G抗體Fc段
VH 抗體重鏈可變區 KD 平衡解離常數
VL 抗體輕鏈可變區 HCDR1 免疫球蛋白重鏈可變區中的互補決定區1
AbM AbM CDR定義方式來源於Martin的相關研究 (Martin ACR, Cheetham JC, Rees AR (1989) Modellin g antibody hypervariable loops： A combined al gorithm. Proc Natl Acad Sci USA 86：9268–9272)，此定義方法整合了Kabat及Chothia兩者的部分定義。 HCDR2 免疫球蛋白重鏈可變區中的互補決定區2
Kabat 由Elvin A. Kabat提出的免疫球蛋白比對及編號系統 (參見，例如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunolo gical Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)。 HCDR3 免疫球蛋白重鏈可變區中的互補決定區3
Chothia 由Chothia等人提出的免疫球蛋白編號系統，其是基於結構環區的位置鑒定CDR區邊界的經典規則(參見，例如Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196：901-917; Chothia等人 (1989) Nature 342：878-883)。 LCDR1 免疫球蛋白輕鏈可變區中的互補決定區1
IMGT 基於由Lefranc等人發起的國際免疫遺傳學資訊系統 (The international ImMuno GeneTics information system ® (IMGT))的編號系統，可參閱Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27：55-77, 2003。 LCDR2 免疫球蛋白輕鏈可變區中的互補決定區2
mAb 單株抗體 LCDR3 免疫球蛋白輕鏈可變區中的互補決定區3
EC50 產生50 %功效或結合的濃度 SEC-HPLC 分子排阻高效液相層析
ELISA 酶聯免疫吸附測定 HC 疫球蛋白重鏈
PCR 聚合酶鏈式反應 LC 疫球蛋白輕鏈
序列及其具體資訊：
SEQ ID No. 名稱 序列
1 66C12D12 VH QIQLVQS GAELVRP GASVKMSCKTS GYTFTTYNVHWVKQTPRQ GLEWI GAISP GN GLTSYTQKFKAKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAR G GFRL GSMDYW GQ GTSVTVSS
2 66C12D12 VL DIVMTQSHKFMSTSV GDRVSVTCKASQNV GTSVAWYQQRP GQSPKELIYWASNRFT GVPDRFT GS GS GTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYSSPPLTF GA GTKLELK
3 66C12D12/66C12D12-hz1 Kabat HCDR1 TYNVH
4 66C12D12 Kabat HCDR2 AISP GN GLTSYTQKFKA
5 66C12D12 hz1 Kabat HCDR2 AISP GS GLTSYAQKFQ G
6 66C12D12/66C12D12-hz1 Kabat HCDR3  G GFRL GSMDY
7 66C12D12 Kabat LCDR1 KASQNV GTSVA
8 66C12D12 hz1 Kabat LCDR1 SASQNV GTSVA
9 66C12D12/66C12D12-hz1 Kabat LCDR2 WASNRFT
10 66C12D12/66C12D12-hz1 Kabat/ IMGT LCDR3 QQYSSPPLT
11 66C12D12/66C12D12-hz1 IMGT HCDR1  GYTFTTYN
12 66C12D12 IMGT HCDR2 ISP GN GLT
13 66C12D12 hz1 IMGT HCDR2 ISP GS GLT
14 66C12D12/66C12D12-hz1 IMGT HCDR3 AR G GFRL GSMDY
15 66C12D12/66C12D12-hz1 IMGT LCDR1 QNV GTS
/ 66C12D12/66C12D12-hz1 IMGT LCDR2 WAS
16 60A12B3/60A12B3 hz1 IMGT LCDR3 QHYSKLPLT
17 66C12D12-hz1 VH QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKTS GYTFTTYNVHWVRQAP GQ GLEWMGAISP GS GLTSYAQKFQ GRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR G GFRL GSMDYW GQ GTLVTVSS
18 66C12D12-hz1 VL DIQMTQSPSFLSASV GDRVTITCSASQNV GTSVAWYQQKP GQSPKELIYWASNRFT GVPSRFS GS GS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSPPLTF GQ GTKVEIK
19 34F2A10 VH QAYLQQS GADLVRP GASVKMSSKAS GSSFTTYIIHWIKQTP GQ GLEWI GAIYP GN GYTSYNQKFK GKATLTVDKSYNTAYIQLSSLSSEDSAVYFCAR GNY GNYE GFTYW GQ GTLVTVSA
20 34F2A10 VL DIQMTQTTSSLSVSL GDRITISCSASQAIYKYLNWYQQKPD GTVKLLIYYTSTLHS GVPSRFS GS GS GTDYSLTISNLEPEDIASYYCQQYNKFPFTF GS GTKLEIK
21 34F2A10/34F2A10-hz1 Kabat HCDR1 TYIIH
22 34F2A10 Kabat HCDR2 AIYP GN GYTSYNQKFK G
23 34F2A10-hz1 Kabat HCDR2 AIYP GS GYTSYAQKFQ G
24 34F2A10/34F2A10-hz1 Kabat HCDR3  GNY GNYE GFTY
25 34F2A10/34F2A10-hz1 Kabat LCDR1 SASQAIYKYLN
26 34F2A10/34F2A10-hz1 Kabat LCDR2 YTSTLHS
27 34F2A10/34F2A10-hz1 Kabat/IMGT LCDR3 QQYNKFPFT
28 34F2A10/34F2A10-hz1 IMGT HCDR1  GSSFTTYI
29 34F2A10 IMGT HCDR2 IYP GN GYT
30 34F2A10-hz1 IMGT HCDR2 IYP GS GYT
31 34F2A10/34F2A10-hz1 IMGT HCDR3 AR GNY GNYE GFTY
32 34F2A10/34F2A10-hz1 IMGT LCDR1 QAIYKY
/ 34F2A10/34F2A10-hz1 IMGT LCDR2 YTS
33 60A12B3-hz1 VH QVQLVES GP GLVQPSETLSLTCTVS GFSLTNY GVHWVRQPP GK GLEWI GVIWS G GRTNYNPSLQSRVTISKDNSTNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKRD GIY GDYW GQ GTLVTVSS
34 34F2A10-hz1 VH QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKAS GSSFTTYIIHWIRQAP GQ GLEWMGAIYP GS GYTSYAQKFQ GRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR GNY GNYE GFTYW GQ GTLVTVSS
35 34F2A10-hz1 VL DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSASQAIYKYLNWYQQKP GQAPKLLIYYTSTLHS GVPSRFS GS GS GTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYNKFPFTF GQ GTKVEIK
36 22H9C4 VH QVQLQQS GAELVRP GASVKMSCKAS GYTFTSNNLHWVKLTPRQ GLEWI GAVYP GN GDTSYTQKFK GKATLTVDKSSSIAYMQLSSPTSEDSAVYFCAR GLPYL GAMDYW GQ GTSVTVSS
37 22H9C4 VL DIVMTQSQRFMSTTV GDRVSITCKASQNV GIFVTWYQQKP GQSPKLLIYSASSRYT GVPDRFT GS GS GTDFTLTISNMQSEDLADYFCQQYSRSPLSF GA GTKLELK
38 22H9C4/22H9C4-hz1 Kabat HCDR1 SNNLH
39 22H9C4 Kabat HCDR2 AVYP GN GDTSYTQKFK G
40 22H9C4-hz1 Kabat HCDR2 AVYP GS GDTSYSQKFQ G
41 22H9C4/22H9C4-hz1 Kabat HCDR3  GLPYL GAMDY
42 22H9C4 Kabat LCDR1 KASQNV GIFVT
43 22H9C4-hz1 Kabat LCDR1 SASQNV GIFVT
44 22H9C4/22H9C4-hz1 Kabat LCDR2 SASSRYT
45 22H9C4/22H9C4-hz1 Kabat/IMGT LCDR3 QQYSRSPLS
46 22H9C4/22H9C4-hz1 IMGT HCDR1  GYTFTSNN
47 22H9C4 IMGT HCDR2 VYP GN GDT
48 22H9C4-hz1 IMGT HCDR2 VYP GS GDT
49 22H9C4/22H9C4-hz1 IMGT HCDR3 AR GLPYL GAMDY
50 22H9C4/22H9C4-hz1 IMGT LCDR1 QNV GIF
/ 22H9C4/22H9C4-hz1 IMGT LCDR2 SAS
51 60A12B3-hz1 VL DIQMTQSPSSLSASV GDRVTITCSASQDI GTYLNWYQQKP GQAPKLLIYHTSRLHS GVPSRFS GS GS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYSKLPLTF GQ GTKVEIK
52 22H9C4-hz1 VH QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKAS GYTFTSNNLHWVRQAP GQ GLEWMGAVYP GS GDTSYSQKFQ GRVTLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR GLPYL GAMDYW GQ GTLVTVSS
53 22H9C4-hz1 VL DIQMTQSPSFLSASV GDRVTITCSASQNV GIFVTWYQQKP GQSPKLLIYSASSRYT GVPSRFS GS GS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSRSPLSF GQ GTKVEIK
54 16 G5B3 VH QVQLQQS GAELVRP GASVKMSCKAS GYTFASYNMHWVKKTPRQ GLEWI GAIYP GN GNTSYNQKFK GKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCVR G GR GL GTMDYW GQ GTSVTVSS
55 16 G5B3 VL DIVMTQSHKFMSTSV GDRVSITCKASQDV GSSVAWYQQKP GQSPKLLIYWASTRHT GVPDRFT GS GS GTDFTLTISNVQSEDLADYFCQHYRNIPLTF GA GTKLELK
56 16 G5B3/16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 Kabat HCDR1 SYNMH
57 16 G5B3 Kabat HCDR2 AIYP GN GNTSYNQKFK G
58 16 G5B3-hz1 Kabat HCDR2 AIYP GS GNTSYSQKFQ G
59 16 G5B3-hz2 Kabat HCDR2 AIYP GS GNT GYSQKFQ G
60 16 G5B3/16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 Kabat HCDR3  G GR GL GTMDY
61 16 G5B3 Kabat LCDR1 KASQDV GSSVA
62 16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 Kabat LCDR1 SASQDV GSSVA
63 16 G5B3/16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 Kabat LCDR2 WASTRHT
64 16 G5B3/16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 Kabat/IMGT LCDR3 QHYRNIPLT
65 16 G5B3/16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 IMGT HCDR1  GYTFASYN
66 16 G5B3 IMGT HCDR2 IYP GN GNT
67 16 G5B3-Hz1/ 16 G5B3-Hz2 IMGT HCDR2 IYP GS GNT
68 16 G5B3/16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 IMGT HCDR3 VR G GR GL GTMDY
69 16 G5B3/16 G5B3 hz1/16 G5B3 hz2 IMGT LCDR1 QDV GSS
/ 16 G5B3/16 G5B3 hz1/16 G5B3 hz2 IMGT LCDR2 WAS
70 I g G1 CH重鏈恆定區 ASTK GPSVFPLAPSSKSTS G GTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTS GVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL G GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
71 16 G5B3-hz1 VH QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKAS GYTFASYNMHWVRQAP GQ GLEWMGAIYP GS GNTSYSQKFQ GRVTLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCVR G GR GL GTMDYW GQ GTLVTVSS
72 16 G5B3-hz1/16 G5B3-hz2 VL DIQMTQSPSFLSASV GDRVTITCSASQDV GSSVAWYQQKP GQSPKLLIYWASTRHT GVPSRFS GS GS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYRNIPLTF GQ GTKVEIK
73 16 G5B3-hz2 VH QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKAS GYTFASYNMHWVRQAP GQ GLEWMGAIYP GS GNT GYSQKFQ GRVTLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCVR G GR GL GTMDYW GQ GTLVTVSS
74 60A12B3 VH QVQLKES GPVLVAPSQSLSITCTVS GFSLTNY GVHWVRQPP GK GLEWL GVIWS G GRTNYNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAKRD GIY GDYW GQ GTSVTVSS
75 60A12B3 VL DIQMTQTTSSLSASL GDRVTISCRASQDI GTYLNWYQQKPD GTVTLLIYHTSRLHS GVPSRFS GS GS GTDFSLTISSLEPEDIATYYCQHYSKLPLTF GA GTKLELK
76 60A12B3/60A12B3 hz1 IMGT HCDR1  GFSLTNY G
77 60A12B3/60A12B3 hz1 IMGT HCDR2 IWS G GRT
78 60A12B3/60A12B3 hz1 IMGT HCDR3 AKRD GIY GDY
79 60A12B3/60A12B3 hz1 IMGT LCDR1 QDI GTY
/ 60A12B3/60A12B3 hz1 IMGT LCDR2 HTS
80 Kappa CL輕鏈恆定區 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNR GEC
81 16 G5B3-hz2 HC重鏈 QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKAS GYTFASYNMHWVRQAP GQ GLEWMGAIYP GS GNT GYSQKFQ GRVTLTVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCVR G GR GL GTMDYW GQ GTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTS G GTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTS GVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL G GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
82 16 G5B3-hz2 LC輕鏈 DIQMTQSPSFLSASV GDRVTITCSASQDV GSSVAWYQQKP GQSPKLLIYWASTRHT GVPSRFS GS GS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYRNIPLTF GQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNR GEC
83 66C12D12-hz1 HC重鏈 QVQLVES GAEVKQP GESVKVSCKTS GYTFTTYNVHWVRQAP GQ GLEWMGAISP GS GLTSYAQKFQ GRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR G GFRL GSMDYW GQ GTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTS G GTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNS GALTS GVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL G GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
84 66C12D12-hz1 LC 輕鏈 DIQMTQSPSFLSASV GDRVTITCSASQNV GTSVAWYQQKP GQSPKELIYWASNRFT GVPSRFS GS GS GTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSPPLTF GQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNR GEC
85 hFc PKSSDKTHTCPPCPAPELL G GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPP VLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
86 mFc  G G G GSPR GPTIKPCPPCKCPAPNLL G GPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDD PDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMS GKEFKCKVNNKDLPA PIERTISKPK GSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNN GKTELN YKNTEPVLDSD GSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHE GLHNHHTTKSFSRTP GK
現參照下列意在舉例說明本公開(而非限定本公開)的實施例來描述本公開。
除非特別指明，本公開中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參照J. Sambrook等人，分子複製：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989，以及F. M. Ausubel等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John Wiley & Sons, Inc.，1995中所述的方法進行。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描述本公開，且不意欲限制本公開所要求保護的範圍。 製備方案
以下的實施例中記載的化合物的結構通過核磁共振( 1H NMR)或質譜(MS)來確定。
核磁共振( 1H NMR)的測定儀器使用Bruker 400 MHz核磁共振儀；測定溶劑為氘代甲醇(CD 3OD)、氘代氯仿(CDCl 3)或六氘代二甲基亞碸(DMSO-d 6)；內標物質為四甲基矽烷(TMS)。
實施例中使用的核磁共振(NMR)圖譜中的縮寫示於以下。
s：單峰(sin glet)、d：二重峰(doublet)、t：三重峰(triplet)、q：四重峰(quartet)、dd：雙二重峰(double doublet)、qd：四二重峰(quartet doublet)、ddd：雙雙二重峰(double double doublet)、ddt：雙雙三重峰(double double triplet)、dddd：雙雙雙二重峰(double double double doublet)、m：多重峰(multiplet)、br：寬峰(broad)、J：偶合常數、Hz：赫茲、DMSO-d 6：氘化二甲基亞碸。δ值用ppm值表示。
質譜(MS)的測定儀器使用Agilent (ESI)質譜儀，型號為Agilent 6120B。 一、生物活性分子和合成「藥物 - 連接體化合物」過程使用的中間體的合成
A 、生物活性分子的合成
實施例 A1.1： (S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-11-(1H-吡唑-4-基)-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7] 吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.1)的合成
步驟一： 4-溴-1-(四氫-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑 (4.6 g)溶于無水四氫呋喃中 (50 ml)，上述溶液在氮氣保護下乾冰-丙酮冷卻到-78 oC，然後滴加正丁基鋰 (12 ml，2 M), 反應液在-78 oC攪拌20分鐘，然後加入 2-胺基-4-氟-5-甲基苯甲酸甲酯 (1.83 g), 加完後，反應自然升至室溫，並連續攪拌反應5小時。反應甲甲醇 (3 ml)猝滅後加入乙酸乙酯 (200 ml)，溶液用水洗 (100 ml x 3)，有機相乾燥後除去有機溶劑，用矽膠柱層析分離得到目標產物 (2-胺基-4-氟-5-甲基苯基)(1-(四氫-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)甲酮，ESI-MS (m/z)： 304 [M+H] +。
步驟二： (S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃[3,4-f]中氮茚並-3,6,10(4H)-三酮 (2.63 g), (2-胺基-4-氟-5-甲基苯基)(1-(四氫-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)甲酮 (3.03 g), 對甲苯磺酸 (1.74 g)溶於二氯甲烷 (50 ml)中，然後除去溶劑，混合物在氮氣保護下加熱至120 oC反應4小時。混合物溶於乙酸乙酯 (300 ml)，有機相水洗 (100 ml x 2)，乾燥後除去有機溶劑，殘留物用矽膠柱層析分離得到目標產物 (S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-11-(1H-吡唑-4-基)-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7] 吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.1)。 ESI-MS (m/z)： 447 [M+H] +。
實施例 A1.2： (S)-7-乙基-7-羥基-14-(1H-吡唑-4-基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7] 吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.2)的合成
用實施例A1.1相同的方法和反應條件，用6-胺基苯並[d][1,3]二氧環戊烷-5-羧酸甲酯代替2-胺基-4-氟-5-甲基苯甲酸甲酯，得到目標產物 (S)-7-乙基-7-羥基-14-(1H-吡唑-4-基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.2)。ESI-MS (m/z)： 459 [M+H] +。
實施例 A1.3：(S)-14-(3-胺基苯基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.3)的合成
化合物 (A1.3-A) (1.4 g)，化合物 (A1.3-B) (2.2 g)，Pd 2(DBA) 3(300 mg), 三環己基磷 (300 mg)，醋酸鉀 (1.1 g)依次加入二氧六環 (30 ml)和水 (5 ml)的混合溶劑中，混合物在氮氣保護下100 oC加熱攪拌反應12小時。冷卻後加入乙酸乙酯 (200 ml)，水洗 (100 ml)，乾燥後，矽膠柱層析分離得到目標產物 (S)-14-(3-胺基苯基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.3)。ESI-MS (m/z)： 484 [M+H] +。
實施例 A1.4：(S)-14-(4-胺基苯基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.4)的合成
化合物 (A1.4-A) (1.4 g)，化合物 (A1.4-B) (2.2 g)，Pd 2(DBA) 3(300mg), 三環己基磷 (300mg)，醋酸鉀 (1.1 g)依次加入二氧六環 (30 ml)和水 (5 ml)的混合溶劑中，混合物在氮氣保護下100 oC加熱攪拌反應12小時。冷卻後加入乙酸乙酯 (200 ml)，水洗 (100 ml)，乾燥後，矽膠柱層析分離得到目標產物 (S)-14-(4-胺基苯基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.4)。
ESI-MS (m/z)： 484 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.56 (s, 1H), 7.34 (d, J= 8.0 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.89 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 6.26 (s, 2H), 5.40 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 1.96 – 1.78 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
實施例 A1.5：(S)-14-(3-胺基丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮  (A1.5)的合成
步驟一：(S)-14-(3-氯丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮的合成 冰浴條件下，向化合物 ( S) 7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]茚並[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (A1.5-A，500 mg)的75 %硫酸溶液 (5 ml)中加入七水合硫酸亞鐵 (570 mg七水合硫酸亞鐵溶于1 ml水中)，和4,4-二甲氧基氯丁烷 (3.89 g)，反應液攪拌三分鐘後滴加雙氧水 (29 %，2.5 ml)。反應液在0 oC下攪拌反應5分鐘後升至室溫，並攪拌反應3小時。反應液加入水 (50 ml)稀釋，乙酸乙酯 (80 ml×2)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗產品，粗產品用C18柱 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液：5 %-60 %)進一步純化得到目標化合物 (黃色固體，400 mg，產率：67 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：468.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.65 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 3.81 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 3.22 (s, 2H), 1.98 (d, J= 6.7 Hz, 4H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
步驟二：(S)-14-(3-疊氮基丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮的合成 向化合物(S)-14-(3-氯丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (200 mg)的N, N-二甲基甲醯胺溶液 (3 ml)中，加入疊氮化鈉 (284 mg)，反應液在100 ℃下攪拌反應1小時。向反應液中加入水 (30 ml)，乙酸乙酯 (60 ml×2)萃取，有機相用經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到目標化合物(S)-14-(3-疊氮基丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (黃色固體，180 mg ，產率：88 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：476； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.65 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 3.53 – 3.49 (m, 2H), 3.16 – 3.12 (m, 2H), 1.93 – 1.80 (m, 4H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
步驟三：(S)-14-(3-胺基丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮的合成 向化合物(S)-14-(3-疊氮基丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮的合成 (130 mg，0.274  mmol)的四氫呋喃 (3 ml)和水 (1 ml)混合溶液中加入三苯基膦 (108 mg，0.411  mmol)，在55 ℃下反應16小時。LCMS顯示反應完全。向反應液中加入水 (5 ml)，用2N鹽酸 (3 ml)調至酸性，用乙酸乙酯 (10 ml)萃取。水相經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %甲酸的水溶液)得到目標化合物(S)-14-(3-胺基丙基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮的合成 (A1.5，黃色固體，15 mg，產率：12 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：449.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.72 (s, 3H), 7.53 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 3.15 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 3.03 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 1.96 – 1.81 (m, 4H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例 A1.6：(S)-N-乙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基乙醯胺 (A1.6)的合成
步驟一： (S) -2- (乙基 (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧醇[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)胺基)-2-氧乙基乙酸酯 (A1.6-B)的製備： 將化合物 (S) -7-乙基-14- (2- (乙胺基)乙基)-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (A1.6-A，50 mg)，乙醯氧基乙醯氯， (73 mg)，三乙胺 (50 mg)依次加入二氯甲烷 (5 ml)中，室溫攪拌反應1小時。反應液旋蒸除去溶劑，得到粗品油狀化合物75 mg。
LCMS (ESI) [M+H] +：564.2。
步驟二：(S)-N-乙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基乙醯胺 (A1.6)的合成
將粗品化合物 (S)-2- (乙基 (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧醇[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)胺基)-2-氧乙基乙酸酯  (75mg，0.13  mmol)溶在濃鹽酸和無水乙醇混合溶液 (體積比為1/2，3 ml)中，然後反應液85 ℃回流反應1小時。LCMS顯示反應完成。反應液濃縮，粗產品經製備層析(0.01 % 三氟乙酸的水溶液，乙腈)純化得到目標化合物(S)-N-乙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基乙醯胺 (A1.6) (15 mg，產率：26 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] +：522.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.92 (s, 1H), 7.53 (m, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.31 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.34 (m, 2H), 4.65 (m, 1H), 4.07 (m, 2H), 3.52 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 2.00 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 1.16 – 1.04 (m, 3H), 0.89 – 0.83 (m, 3H)。
實施例 A1.7：(S)-N-甲基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基乙醯胺 (A1.7)的合成
步驟一：化合物甲基苄基 (3- (6-硝基苯並[d][1,3]二氧雜環-5-基)-3-氧丙基)胺基甲酸酯的製備 將化合物1- (6-硝基苯並[ d][1,3]二噁英-5-基)乙烷-1-酮 (A1.7-A，500 mg)，甲胺鹽酸鹽 (1.6 g)和多聚甲醛 (714 mg)溶在乙醇 (8 ml)中，100°C下悶罐反應16小時。反應液降至室溫並減壓濃縮，所得殘渣用二氯甲烷 (80 ml)溶解，有機相經水 (50 ml × 3)萃取。所得水相用碳酸氫鈉調至pH=9，然後加入氯甲酸苄酯 (513 mg, 3.0  mmol)，在室溫下反應16小時。反應液用乙酸乙酯 (30 ml × 3)萃取，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濃縮得到粗產品，粗產品經C18分離純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸=5~95 %)得到目標化合物 (A1.7-B，180 mg，產率23 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：387.1； 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.56 (s, 1H), 7.35 (m, 5H), 7.32 (m, 1H), 6.17 (s, 2H), 5.13 (s, 2H), 3.71 (m, 2H), 3.03 (m, 3H), 2.99 – 2.86 (m, 2H)。
步驟二：化合物苄基 (3- (6-胺基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)-3-氧丙基) (甲基)胺基甲酸酯 (A1.7-C)的製備 將化合物A1.7-B甲基苄基 (3- (6-硝基苯並[d][1,3]二氧雜環-5-基)-3-氧丙基)胺基甲酸酯 (180 mg, 0.47  mmol)溶於飽和氯化銨水溶液 (8 ml)和乙醇 (8 ml)混合溶液中，然後向反應液中加入鐵粉 (130 mg)，反應在80°C下攪拌2小時。將反應液過濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經TLC分離純化 (石油醚：乙酸乙酯=2/1)得到目標化合物 A1.7-C (76 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：357.0。
步驟三：苄基 (S)- (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧基-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (甲基)胺基甲酸酯 (A1.7-D)的製備 室溫下，將化合物A1.7-C苄基 (3- (6-胺基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)-3-氧丙基) (甲基)胺基甲酸酯 (38 mg)，化合物 (S) -4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10 (4H)-三酮 (29 mg) 和對甲苯磺酸 (23 mg)溶於二氯甲烷 (5 ml)溶液中，溶液澄清混勻後減壓濃縮，用油泵抽至真空，反應在120°C真空下反應2小時。將反應液降至室溫，加入水 (30 ml)並用二氯甲烷 (30 ml × 3)萃取。合併有機相依次經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物A1.7-D (50 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 584.0。
步驟四： (S) 7-乙基-7-羥基-14- (2- (甲胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (A1.7-E)的製備 室溫下，將化合物A1.7-D苄基 (S)- (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧基-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (甲基)胺基甲酸酯 (50 mg)溶於二氯甲烷 (5 ml)溶液中，於0°C下加入三甲基碘矽烷 (51 mg，0.26  mmol)，反應3小時。將反應液濃縮除去溶劑，經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到褐色固體化合物A1.7-E (15 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：450.0。
步驟五：化合物 (S) -2- ( (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧醇[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (甲基)胺基)-2-氧乙基乙酸酯 (A1.7-F)的製備 將化合物A1.7-E (S) 7-乙基-7-羥基-14- (2- (甲胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (15 mg)和三乙胺 (15 mg)溶於二氯甲烷 (5 ml)溶液中，於0°C下加入乙醯氧基乙醯氯 (20 mg)反應1小時。將反應液濃縮除去溶劑得到粗產品，所得固體直接用於下一步，未做進一步純化。
LCMS (ESI) [M5+H] += 550.1。
步驟六：化合物 (S) -N- (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基-N-甲基乙醯胺 (A1.7)的製備 將化合物A1.7-F (S) -2- ( (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧醇[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (甲基)胺基)-2-氧乙基乙酸酯 (15 mg)溶於乙醇 (5 ml)溶液中，加入濃鹽酸 (1.5 ml)，於80°C下反應2小時。將反應液濃縮除去溶劑，經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到白色固體化合物A1.7 (1.6 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：508.2。
實施例 A1.8：(S)-N-異丙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基乙醯胺 (A1.8)的合成
步驟一：化合物異丙基苄基 (3- (6-硝基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)-3-氧丙基)胺基甲酸酯 (A1.8-B)的製備 向化合物 (A1.8-A)3- (異丙胺基)-1- (6-硝基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)丙-1-酮 (900 mg)的二氯甲烷溶液 (10 ml)中，依次加入三乙胺 (1.8 g)和苄氧基碳醯氯 (734 mg，4.3  mmol)，在室溫下反應2小時。反應液加水 (50 ml)稀釋，用二氯甲烷 (50 ml×3)萃取，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗產品，粗產品經柱層析分離純化 (石油醚：乙酸乙酯=3/1)得到目標化合物 (A1.8-B) (600 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：414.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.72 (s, 1H), 7.34 (br s, 6H), 6.31 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 4.14 – 4.10 (m, 1H), 3.48 (d, J= 7.9 Hz, 2H), 3.03 (s, 2H), 1.13 - 1.11 (m, 6H)。
步驟二：化合物苄基 (3- (6-胺基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)-3-氧丙基) (異丙基)胺基甲酸酯 (A1.8-C)的製備 將化合物 (A1.8-B)異丙基苄基 (3- (6-硝基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)-3-氧丙基)胺基甲酸酯 (200 mg, 0.48  mmol)溶於飽和氯化銨 (3 ml)和乙醇 (3 ml)混合溶液中，然後向反應液中加入鐵粉 (135 mg)，反應在室溫下攪拌2小時。將反應液過濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經柱層析分離純化 (石油醚：乙酸乙酯=3/1)得到目標化合物 (A1.8-C) (65 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：395.2。
步驟三： (S) 7-乙基-7-羥基-14- (2- (異丙胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (A1.8-D)的製備 室溫下，將化合物 (A1.8-C)苄基 (3- (6-胺基苯並[d][1,3]二噁英-5-基)-3-氧丙基) (異丙基)胺基甲酸酯 (65 mg)，化合物 (S) -4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10 (4H)-三酮 (45 mg)和對甲苯磺酸 (33 mg，0.17  mmol)溶於二氯甲烷 (10 ml)溶液中，溶液澄清混勻後減壓濃縮，用油泵抽至真空，反應在120°C真空下反應2小時。將反應液降至室溫，加入水 (50 ml)，用二氯甲烷 (30 ml×3)萃取，合併有機相依次並無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮，粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷/甲醇=10/1)得到目標化合物 (A1.8-D) (40 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：478.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.46 (s, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.33 (s, 2H), 5.44 (s, 2H), 5.35 (s, 2H), 3.41 (br s, 2H), 3.23 (br s, 3H), 1.94 – 1.78 (m, 2H), 1.25 (d, J= 6.4 Hz, 6H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
步驟四：化合物 ( (S) -2- ( (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (異丙基)胺基)-2-氧代乙酸乙酯 (A1.8-E)的製備 冰浴下，向化合物 (S) -7-乙基-7-羥基-14- (2- (異丙胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (A1.8-D) (40 mg)的二氯甲烷溶液 (2 ml)中加入三乙胺 (35 mg)，2-氯-2-氧乙基乙酸酯 (57 mg)，在零度下反應30分鐘。將反應液減壓濃縮得到化合物A1.8-E，直接應用於下一步。
LCMS (ESI) [M+H] +：578.0。
步驟五：化合物 (S) -N- (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧並[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基-N-異丙基乙醯胺 (A1.8)的製備
向化合物 (S) -2- ( (2- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)乙基) (異丙基)胺基)-2-氧代乙酸乙酯 (A1.8-E，50 mg)的乙醇溶液 (3 ml)中，加入濃鹽酸 (0.5 ml)，在70°C下反應1小時。將反應液濃縮得到粗產品。再經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %甲酸的水溶液)得到目標化合物 (A1.8，3 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：464.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.99 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.31 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.99 – 3.94 (m, 1H), 3.44 (dd, J= 16.7, 7.8 Hz, 2H), 3.33 – 3.21 (m, 2H), 1.95 – 1.79 (m, 2H), 1.19 (dd, J= 16.4, 5.8 Hz, 6H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
實施例 A1.9：(S)-7-乙基-7-羥基-14-(3-羥基丙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮  (A1.9)的合成
將化合物(S)-7-乙基-7-羥基-14-(3-氯丙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (100 mg，0.213  mmol)溶於10 %硫酸 (5 ml)溶液中，反應在110°C下反應48小時。向反應液中加入飽和碳酸氫鈉 (30 ml)溶液，用二氯甲烷 (10 ml X 5)萃取，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到粗產品。經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到(S)-7-乙基-7-羥基-14-(3-羥基丙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.9，1.78 mg)。
LCMS (ESI) [M+H]+：451.0；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.63 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.47 – 5.37 (m, 2H), 5.32 – 5.19 (m, 2H), 3.51 – 3.46 (m, 2H), 3.17 – 3.13 (m, 2H), 1.92 – 1.76 (m, 4H), 0.90 – 0.84 (m, 3H)。
實施例 A1.10：(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-羥基丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.10)的合成
步驟一： 0°C下，向化合物A1.10-A (10 g )的1,2-二氯乙烷 (200 ml)溶液，滴加1mol/L三氯化硼 (96 ml)，4-氯丁腈 (9.9 g)。80 ℃下攪拌反應2小時。反應液降至室溫，加入2 mol/L 鹽酸 (90 ml)並在80 ℃下回流攪拌0.5 小時。反應液降至室溫, 加入少量水稀釋，用二氯甲烷 (200 ml X 3)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濃縮得到粗產品，粗產品經柱層析分離純化 (石油醚：乙酸乙酯=10/1)得到目標化合物A1.10-B (4 g)。
LCMS (ESI) [M+H]+：230.0。
步驟二： 向化合物A1.10-B (50 mg)中加入 (S) -4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10 (4H)-三酮 (35 mg)，一水合對甲苯磺酸 (41.4 mg), 溶於二氯甲烷 (30 ml)溶液中，溶液澄清混勻後減壓濃縮，用油泵抽至真空，反應在120°C真空下反應3小時。LCMS顯示反應完全。將反應液降至室溫，加入水 (20 ml)，用二氯甲烷 (20 ml X 3)萃取。合併有機相依次並無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮得到粗產品。粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷比甲醇=20比1)得到目標化合物A1.10-C (80 mg)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H]+：457.0。
步驟三： 將化合物A1.10-C (75 mg)溶於六甲基磷醯三胺，加入純水 (0.8 ml)反應液在100 oC下攪拌72小時。LCMS檢測反應完成。經製備層析(0.01 % TFA in water，MeCN)純化得到目標化合物 (10 mg)。
LCMS (ESI) [M+H]+：439.2；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.67 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 3.55 – 3.47 (m, 2H), 3.28 – 3.20 (m, 2H), 2.51 (s, 3H), 1.93 – 1.81 (m, 4H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
實施例 A1.11：(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-胺基丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.11)的合成
步驟一： 向A1.10-C (395 mg)的N’N-二甲基甲醯胺 (10 ml)溶液中加入疊氮化鈉 (432 mg)，反應液80 oC反應16小時，然後冷卻至室溫，加入水 (50 ml)稀釋，用乙酸乙酯 (80 ml*3)萃取，合併有機相，無水硫酸鈉乾燥，抽濾濃縮得到目標產物A1.11-A (290 mg)。
LCMS (ESI) [M+H]+：464.0。
步驟二： 將化合物A1.11-A (93 mg)溶於四氫呋喃 (5 ml)中，加入三苯基膦 (78 mg)，室溫反應4小時。然後向反應液中加入鹽酸 (4M，1 ml)，反應液升至55 oC反應16小時，LCMS監測反應完全。反應液直接濃縮，粗產品經過反相柱 (流動相A為0.05 %甲酸水溶液，B為乙腈)提純得到目標產物A1.11 (28 mg，產率：36 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H]+：438.4；1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 8.52 (s, 1H), 8.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.76 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 5.49 (ABq, J = 78.9, 16.3 Hz, 2H), 5.31 (br s, 2H), 3.35 – 3.32 (m, 2H), 3.22 – 3.10 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.13 – 2.11 (m, 2H), 1.96 – 1.94 (m, 2H), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H)。
實施例A1.12：(S,E)-14-(3-胺基-1-丙烯-1-基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮  (A1.12)的合成
步驟一： 將化合物A1.12-A (200 mg，0.39  mmol)，化合物A1.12-B (112 mg，0.39  mmol)，氟化銫 (152 mg，0.975  mmol)和四三苯基膦鈀 (45 mg，0.039  mmol)加入1,4-二氧六環溶液 (8 ml)。在氮氣氣氛下120oC微波反應0.5小時。LCMS顯示反應完全。向反應液加入二氯甲烷 (20 ml)和甲醇 (10 ml)混合溶液稀釋，過濾。濾液濃縮，粗產品通過製備TLC純化 (二氯甲烷：甲醇=30：1)得到目標化合物 (S,E)-14-(3-((叔丁氧羰基)胺基)-1-丙烯-1-基)-7-乙基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-7-基 乙酸酯 (A1.12-C，60 mg，產率：26 %)為棕色固體。LCMS (ESI) [M+H]+ = 590.3；
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.63 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.09 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 6.93 (s, 1H), 6.45 (d, J = 16.6 Hz, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 5.34 – 5.24 (m, 2H), 3.94 (s, 2H), 2.21 (br s, 3H), 2.03 – 1.96 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 0.91 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
步驟二： 向化合物(S,E)-14-(3-((叔丁氧羰基)胺基)-1-丙烯-1-基)-7-乙基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-7-基 乙酸酯 (A1.12-C ，50 mg，0.085  mmol)的甲醇溶液 (15 ml)和加入甲醇鈉 (9.2 mg，0.17  mmol)，在50℃下攪拌反應2小時。LCMS顯示反應完全。將反應液濃縮得到目標化合物(S,E)-14-(3-((叔丁氧羰基)胺基)-1-丙烯-1-基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.12-D，50 mg)粗產品為棕色固體。LCMS (ESI) [M+H]+ = 548。
步驟三： 向化合物(S,E)-14-(3-((叔丁氧羰基)胺基)-1-丙烯-1-基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.12-D，50 mg，0.091  mmol)的二氯甲烷溶液 (2 ml)中，加入三氟乙酸 (1 ml)，在室溫下攪拌反應30分鐘。LCMS顯示反應完全。將反應液濃縮，粗產品經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %甲酸的水溶液)得到目標化合物(S,E)-14-(3-胺基-1-丙烯-1-基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮  (A1.12) (8.1 mg，產率21 %)為棕色固體。
LCMS (ESI) [M+H]+ = 448.3；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.20 (s, 2H), 7.72 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.40 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 7.27 (s, 1H), 6.52 – 6.46 (m, 2H), 6.31 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.27 (s, 2H), 3.86 (br s, 2H), 1.90 – 1.83 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。
實施例 A1.13：(S,E)-14-(3-羥基-1-丙烯-1-基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮  (A1.13)的合成
步驟一： 將化合物A1.9 (200 mg， 0.444  mmol) 溶在二甲亞碸 (2 ml) 中，加入IBX (311 mg,，1.11  mmol)，室溫下攪拌2小時，然後補加入IBX (186 mg,，0.666 mmol) 於反應液中，再向反應液中加入四氫吡咯 (6.3 mg,，0.089  mmol)和乙腈 (3 ml),反應液在室溫下攪拌過夜。LCMS檢測反應完成, 用乙酸乙酯萃取 (20 ml x 3)，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋幹，得到粗產品，粗產品通過矽膠柱純化(DCM ： MeOH = 50 ： 1 to 10 ： 1) 得到目標化合物(S,E)-14-(3-氧代-1-丙烯-1-基)-7-乙基-7-羥基-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮 (A1.13-A，100 mg, 純度50.0 %, 產率25.0 %) 為黃色固體。LCMS (ESI) [M+H]+ = 447.1。
步驟二： 將化合物A1.13-A (40 mg，0.09  mmol) 溶在四氫呋喃 (1 ml) 中,然後向反應液中加入氰基硼氫化鈉( 28 mg， 0.448 mmol), 在室溫下攪拌過夜。LCMS顯示反應完成。將反應液濃縮得粗產品，粗產品純化通過prep-HPLC (HCl in water/MeCN) 得目標化合物 (3.56 mg, 純度93.6 %, 產率9.0 %) 為淡黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H]+ = 449.2；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.61 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.20 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 6.69 – 6.59 (m, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 5.16 (br s, 1H), 4.34 (br s, 2H), 1.93 – 1.81 (m, 2H), 0.88 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
實施例 A1.14：(S,E)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-羥基-1-丙烯-1-基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉--3,14(4H)-二酮 (A1.14)的合成 步驟一： 向25 ml的單口瓶中加入化合物 (S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11- (3-羥丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚並[1,2-b]喹啉-3,14 (4H)-二酮 (A1.10，100 mg， 0.228  mmol)，DMSO(0.5 ml)和乙腈(0.75 ml)，依次加入IBX(160 mg， 0.571  mmol)和( R)-二苯基(吡咯烷-2-基)甲醇 (12 mg，0.047  mmol)，室溫下繼續攪拌反應16小時，然後向反應液中加入甲醇和二氯甲烷混合溶劑 (200 ml) (DCM：MeOH=10：1)，飽和食鹽水(300 ml)萃取，合併有機相，水洗、乾燥、過濾，濾液減壓蒸幹溶劑得粗產品，粗產品用快速Flash純化 (DCM：MeOH=10：1)得到目標化合物 (S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11- (3-氧代丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚並[1,2-b]喹啉-3,14 (4H)-二酮 (A1.14-A, 40 mg，產率40 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 435.1.
步驟二： 向50 ml的三口瓶中加入化合物 (S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11- (3-氧代丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚並[1,2-b]喹啉-3,14 (4H)-二酮 (A1.14-A, 40 mg， 0.228  mmol)，無水THF(5 ml)，N 2保護下降溫至-78℃，緩慢滴加三仲丁基硼氫化鋰的THF溶液(0.11 ml，1N)，保持-78℃繼續攪拌1小時。反應完成後加入飽和氯化銨水溶液淬滅反應，升至室溫，用飽和食鹽水稀釋(50 ml)，用乙酸乙酯萃取(20 ml X 3)，合併有機相水洗、乾燥、過濾，減壓蒸幹溶劑得到(S,E)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-羥基-1-丙烯-1-基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉--3,14(4H)-二酮 (A1.14，28 mg)為類白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 437.1。
實施例 A1.15：(S)-7-乙基-7-羥基-14-(2-(正丙基胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-8,11(7H)-二酮  (A1.15a)和(S)-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)-2-羥基-N-正丙基乙醯胺 (A1.15b)的合成
步驟一： 將化合物A1.15-A (5.0 g，23.9  mmol)，丙基胺鹽酸鹽 (22.8 g，239  mmol)和多聚甲醛 (7.18 g，239  mmol)溶在乙醇 (100 ml)中，110 °C下悶罐反應12小時。LCMS檢測反應完全。反應液降至室溫並減壓濃縮，向反應固體中加入二氯甲烷 (100 ml)，用水 (80 ml X 3)洗滌，水相用碳酸氫鈉調至pH = 9。向水溶液中加入苄氧基碳醯氯 (3.7 g，21.8  mmol)，在室溫下反應2小時。LCMS檢測反應完全。用二氯甲烷 (100 ml X 3)萃取，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濃縮得到粗產品，粗產品經柱層析分離純化 (石油醚：乙酸乙酯=10/1)得到目標化合物A1.15-B (1.5 g，產率20.1 %)為黃色油狀液體。
LCMS (ESI) [M+H] += 415.1；1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.56 (s, 1H), 7.35 (m, 6H), 6.18 (s, 2H), 5.17 – 5.12 (m, 2H), 3.69 – 3.67 (m, 2H), 3.32 – 3.30 (m, 2H), 3.09 – 2.90 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 0.90 (m, 3H)。
步驟二： 將化合物A1.15-B (1.5 g, 3.63  mmol)溶在飽和氯化銨 (20 ml)和乙醇 (20 ml)混合溶液中，然後向反應液中加入鐵粉 (1.02 g，18.1  mmol)，反應在80°C下攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。將反應液過濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品用C18柱反相分離純化(乙腈/0.05 %FA的水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物A1.15-C (600 mg, 產率43.0 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 385.2, t R= 1.329 min。
步驟三： 室溫下，將化合物A1.15-C (350 mg，0.91  mmol)，化合物 (S) -4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]吲哚嗪-3,6,10 (4H)-三酮 (A1.15-D，218 mg，0.83  mmol)和對甲苯磺酸 (170 mg，0.87  mmol)溶於二氯甲烷 (5 ml)溶液中，溶液澄清混勻後減壓濃縮，用油泵抽至真空，反應在120°C真空下反應2小時。LCMS顯示反應完全。將反應液降至室溫，加入水 (50 ml)，用二氯甲烷 (30 ml X 3)萃取，合併有機相依次並無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮得到化合物A1.15-E (390 mg，產率76 %)為褐色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 612.0。
步驟四： 室溫下，將化合物A1.15-E (390 mg，0.638  mmol)溶於二氯甲烷 (5 ml)溶液中，0°C氮氣保護下滴加三甲基碘矽烷 (510 mg，2.55  mmol)，反應體系室溫攪拌2 小時。向反應液中加入乙醚 (2 ml)和濃鹽酸 (4 ml)，攪拌30分鐘，用飽和碳酸氫鈉將反應體系調至H = 9，用二氯甲烷 (50 ml X 5)萃取，合併有機相經無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮得到粗產品。經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到化合物A1.15a (200 mg，產率66.1 %)為米白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 478.2；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.30 (s, 1H, HCO 2H), 7.67 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.62 – 6.41 (m, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 3.27 – 3.25 (m, 2H), 2.91 – 2.79 (m, 2H), 2.58 – 2.56 (m, 2H), 1.91 – 1.79 (m, 2H), 1.44 – 1.42 (m, 2H), 0.90 – 0.84 (m, 6H)。
步驟五： 室溫下，將化合物A1.15a (120 mg，0.251  mmol)溶於二氯甲烷 (5 ml)中，0°C下滴加化合物乙醯氧基乙醯氯 (167 mg，1.25  mmol)和三乙胺 (133 mg，1.25  mmol)，反應在0°C下攪拌反應30分鐘。LCMS檢測反應完全。將反應液減壓濃縮得到粗品化合物A1.15-F (120 mg，產率82.8 %)為黃色固體。LCMS (ESI) [M+H] += 578.3。
步驟六： 室溫下，將化合物A1.15-F (120 mg，0.207  mmol)溶於乙醇 (4 ml)中，然後向反應液中加入濃鹽酸 (2 ml)，反應在70°C下攪拌反應1小時。LCMS檢測反應完全。向反應液加入水 (20 ml)，用二氯甲烷 (30 ml X 5)萃取，合併有機相依次並無水硫酸鈉乾燥、過濾，濾液減壓濃縮得到粗產品。經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到化合物A1.15b (20 mg，產率18.1 %)為米白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 536.2；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.93 (s, 0.7H), 7.69 (s, 0.3H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.35 (s, 1.5H), 5.29 (s, 0.5H), 4.65 – 4.62 (m, 1H), 4.13 - 3.97 (m, 2H), 3.51 – 3.49 (m, 2H), 3.33 – 3.30 (m, 2H), 3.24 – 3.20 (m, 2H), 1.86 – 1.84 (m, 2H), 1.60 – 1.52 (m, 2H), 0.89 – 0.86 (m, 6H)。
實施例 A1.16：(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-異丙基胺基丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.16)的合成
向A1.10-C (200 mg，0.439  mmol)和異丙基胺 (50 mg，0.877  mmol)的DMF溶液 (10 ml)中加入二異丙基乙胺 (170 mg，1.32  mmol)和碘化鈉 (99 mg，0.659  mmol)，反應在50°C 封管下反應2小時。向反應液中加入乙酸乙酯，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到粗產品。粗產品經pre-TLC分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10：1)後得到黃色固體，化合物繼續經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到目標化合物(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-異丙基胺基丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.16，2.03 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 480.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.28 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.27 (s, 1H, HCO2H) 7.92 (d, J= 11.0 Hz, 1H), 7.33 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.45 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 33.30 – 3.22 (m, 3H), 3.18 – 3.10 (m, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.06 – 1.94 (m, 2H), 1.93 – 1.80 (m, 2H), 1.26 – 1.20 (m, 6H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例 A1.17：(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-環丙基胺基丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.17)的合成 向A1.10C (200 mg，0.439  mmol)和環丙基胺 (52 mg，0.881  mmol)的DMF溶液 (10 ml)中加入二異丙基乙胺 (165 mg，1.28  mmol)和碘化鈉 (96 mg，0.640  mmol)，反應在50°C 封管下反應2小時。 LCMS監測反應完全。向反應液中加入乙酸乙酯，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到粗產品。粗產品經TLC分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10：1)後繼續經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到目標化合物(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(3-環丙基胺基丙基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.17，5.12 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 478.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.22 (br s, 2H, one is HCO2H), 7.86 (br s, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 3.24 – 3.19 (m, 2H), 2.75 – 2.68 (m, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.16 – 2.09 (m, 1H), 1.95 – 1.76 (m, 4H), 0.91 – 0.83(t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.43 – 0.33 (m, 2H), 0.31 – 0.21 (m, 2H)。
實施例 A1.18 ：(S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(4-胺基苯基)-9-甲基-1,12-二氫-14H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-3,14(4H)-二酮 (A1.18)的合成
步驟一： 氮氣保護下，將3-氟-4-甲基苯胺 (A1.18A，2.0 g，16.3  mmol) 溶在1,2-二氯乙烷 (40 ml) 中，在0 oC下向其中滴加三氯化硼 (19.2 ml， 19.2  mmol ) 後，再緩慢加入對硝基苯腈 (2.8 g， 19.2  mmol)，加入完畢將反應液升至80 oC攪拌過夜。將反應液冷卻至室溫向其中加入鹽酸 (40 ml,，2M)，後升溫至80 oC繼續攪拌30分鐘，經LCMS 檢測反應完全後，向反應液中加入水 (80 ml)，用二氯甲烷萃取 (100 ml ⅹ 3)，合併有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋幹，粗產品經矽膠柱層析(PE：EA=10：1) 純化得目標化合物 (A1.18B，2.0 g， 產率46.5 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 275.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.34 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 7.77 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 7.39 (s, 2H), 7.11 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 6.63 (d, J= 12.4 Hz, 1H), 2.00 (s, 3H)。
步驟二： 將化合物A1.18B (620 mg，2.28  mmol)，(S)-4-乙基-4-羥基-7,8-二氫-1H-吡喃並[3,4-f]中氮茚-3,6,10(4H)-三酮 (600 mg， 2.28  mmol)， 對甲苯磺酸(560 mg， 2.96  mmol) 加入到反應瓶中， 用二氯甲烷將其溶解均勻，將二氯甲烷旋幹，抽真空，在真空狀態下將其加熱到120 ℃，在此溫度下保持六個小時，經LCMS檢測反應完成後，向體系中加入甲醇 (10 ml)，再加入水 (80 ml) 有大量沉澱析出，沉澱過濾後乾燥得到目標化合物 (A1.18C，800 mg， 產率80.0 %) 為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 502.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.52 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 8.13 – 7.89 (m, 3H), 7.64 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 13.4 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.06 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 1.94 – 1.84 (m, 2H), 0.87 (m, 3H)。
步驟三： 將雷尼鎳 (609 mg， 10.5  mmol) 加入到化合物A1.18C (1.0 g，2.1  mmol) 的甲醇  (25 ml) 和四氫呋喃 (50 ml) 混合溶液中，反應液在室溫氫氣氛圍下攪拌5小時。LCMS檢測反應完全，將反應液過濾，濾液旋幹得到目標化合物 (S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-11-(4-胺基苯基)-9-甲基-1，12-二氫-14H-吡喃並[3'，4'：6，7]吲哚嗪並[1，2-b]喹啉-3，14(4H)-二酮 (A1.18，650 mg，產率67 %) 為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 472.3； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.93 – 7.81 (m, 2H), 7.40 – 7.25 (m, 3H), 6.81 (d, J= 8.2 Hz, 2H), 6.51 (s, 1H), 5.62 (s, 2H), 5.41 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 2.41 (s, 3H), 1.93 – 1.80 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
B 、含生物活性分子片段中間體的合成
實施例 B1.1：(S)-2-胺基-N-((4-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丁氧基)甲基)乙醯胺 (B1.1)的合成
化合物 (B1.1-A) (368 mg)，化合物 (B1.1-B) (452 mg)和對甲苯磺酸吡啶鹽 (PPTS) (25mg)在二氯甲烷 (20 ml)中回流20小時，然後用碳酸氫鈉水溶液和鹽酸水溶液分別洗滌，減壓除去有機溶劑，殘留物溶於DMF (5 ml)，加入呱啶 (1 ml)，化合物攪拌20分鐘，溶於減壓除去大部分低沸點組分，殘留物製備HPLC分離得到目標產物 (S)-2-胺基-N-((4-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丁氧基)甲基)乙醯胺 (B1.1)。
ESI-MS (m/z)： 539 [M+H] +。
實施例 B1.2：(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-乙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)乙醯胺 (B1.2)的合成
步驟一： 依次將化合物B1.2-A (274 mg)，二異丙基乙胺 (334 mg)和HBTU (369 mg)加入N,N-二甲基甲醯胺 (10 ml)中，隨後加入化合物B1.2-B (300 mg)。反應液在室溫下攪拌2小時。向反應液中加入乙酸乙酯 (50 ml)，用飽和食鹽水 (30 ml X 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10/1)得到目標化合物B1.2-C (300 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：830.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.74 (s, 1H), 7.91 – 7.84 (m, 2H), 7.80 – 7.67 (m, 2H), 7.65 – 7.54 (m, 2H), 7.53 – 7.46 (m, 1H), 7.45 – 7.37 (m, 2H), 7.36 – 7.27 (m, 2H), 7.25 – 7.23 (m, 1H), 6.57 – 6.44 (m, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.50 – 5.19 (m, 4H), 4.71 – 4.57 (m, 2H), 4.32 – 3.97 (m, 7H), 3.80 – 3.53 (m, 4H), 3.20 – 3.14 (m, 2H), 1.92 – 1.80 (m, 2H), 1.28 – 1.22 (m, 3H), 0.87 – 0.82 (m, 3H)。
步驟二： 向化合物B1.2-C (300 mg)的N,N-二甲基甲醯胺 (4 ml)溶液加入呱啶 (1 ml)，反應液在室溫下攪拌20分鐘。反應液除去低沸點組分後得到目標產物，直接用於下步合成。
LCMS (ESI) [M+H] += 608.0。
實施例 B1.3：(S)-2-胺基-N-((2-(((4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)甲基)胺基)-2-氧代乙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.3)的合成
用實施例B1.1相同的方法和反應條件，用化合物 (B1.3-A)代替 (B1.2-B)，得到目標產物 (S)-2-胺基-N-((2-(((4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)甲基)胺基)-2-氧代乙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.3)。
ESI-MS (m/z)： 554 [M+H] +。
實施例 B1.4： (S)-2-胺基-N-((4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)甲基)乙醯胺 (B1.4)的合成
向化合物 (B1.4-A) (175 mg)，化合物 (B1.3-A) (409 mg)的DMF (5 ml) 溶液中加入DIPEA (200 ul), HBTU (420 mg)。化合物室溫小攪拌反應20小時，混合物加入乙酸乙酯 (100 ml), 水洗 (100 ml x 3)，減壓除去有機溶劑，然後向殘留物中加入1：1 DCM/TFA (10 ml), 室溫放置20分鐘。減壓除去低沸點組分，殘留物用製備HPLC分離得到目標產物 (S)-2-胺基-N-((4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)甲基)乙醯胺 (B1.4)。
ESI-MS (m/z)： 467 [M+H] +。
實施例 B1.5：(S)-2-胺基-N-((7-乙基-7-羥基-8,11-二氧-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)乙醯胺 (B1.4)的合成
將B1.5-A (200 mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (5 ml)中，依次加入N,N-二異丙基乙胺 (154.80 mg)，2, 5-二氧吡咯烷-1-基 (叔丁氧羰基)甘胺酸(157mg)於反應液中，反應液在25 ℃下攪拌60分鐘。向反應液中加入水 (30 ml)，抽濾，乾燥濾餅得到白色固體產物 (ESI-MS (m/z)： 579.4 [M+H] +)。將上述白色固體產物溶於三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液(體積比為1：3；4 ml)中, 反應液室溫下攪拌1小時。 然後將反應液濃縮得粗產品，粗產品用C18柱反相分離純化(乙腈/0.05 %甲酸水溶液： 5 %到50 %) 得到目標產物 (S)-2-胺基-N-((7-乙基-7-羥基-8,11-二氧-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)乙醯胺 (B1.5，110mg)。
ESI-MS (m/z)： 479.3 [M+H] +。
實施例 B1.6：(S)-2-胺基-N-((4-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)乙醯胺 (B1.6)的合成
用實施例B1.1相同的方法和反應條件，用化合物 (B1.6-A)代替化合物 (B1.1-B)，得到目標產物(S)-2-胺基-N-((4-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-1H-吡唑-1-基)甲基)乙醯胺 (B1.6)。
ESI-MS (m/z)： 545 [M+H] +。
實施例 B1.7：(S)-2-胺基-N-((2-(((7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.7)的合成
用實施例B1.2相同的方法和反應條件，用化合物 (B1.5-A)代替化合物 (B1.2-B)，得到含目標產物 (S)-2-胺基-N-((2-(((7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.7)的混合物，上述混合物直接用於下面合成反應。
ESI-MS (m/z)： 566 [M+H] +。
實施例 B1.8：(S)-2-胺基-N-(3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)乙醯胺 (B1.8)的合成
用實施例B1.4相同的方法和反應條件，用化合物 (A1.3)代替化合物 (B1.3-A)，得到目標產物(S)-2-胺基-N-(3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]-二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)乙醯胺 (B1.8)。
ESI-MS (m/z)： 541 [M+H] +。
實施例 B1.9：(S)-2-胺基-N-(4-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)乙醯胺 (B1.9)的合成
用實施例B1.4相同的方法和反應條件，用化合物 (A1.4)代替化合物 (B1.3-A)，得到目標產物(S)-2-胺基-N-(4-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]-二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)乙醯胺 (B1.9)。或者採用下列反應條件得到目標產物。
將化合物A1.4 (60 mg，0.12  mmol) 溶在N,N-二甲基甲醯胺 (3 ml)，依次加入 (叔丁氧羰基)甘胺酸 (26 mg，0.15  mmol)、HATU (56 mg, 0.15  mmol)，N,N-二異丙基乙胺 (48 mg， 0.37  mmol)，室溫下攪拌1小時，TLC檢測反應完成。然後直接向上述反應液中加入 TFA(1.0 ml)。在室溫下繼續攪拌1小時，LCMS檢測反應完成，將反應液濃縮除去三氟乙酸得粗產物，粗產物經製備層析 (0.01 % 三氟乙酸水溶液, 乙腈) 純化得到目標產物(S)-2-胺基-N-(4-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]-二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)乙醯胺 (B1.9) (26.3 mg，產率38 %)為黃色固體。
ESI-MS (m/z)： 541 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.71 (s, 1H), 8.16 (s, 2H), 7.86 (d, J= 8.6 Hz, 2H), 7.67-7.58 (m, 3H), 7.29 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.40 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.87 (s, 2H), 1.93-1.81 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例 B1.10：(S)-2-胺基-N-(3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]-二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基)乙醯胺 (B1.10)的合成
步驟一： 室溫下，向化合物A1.5 (200 mg)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (5 ml)中加入三乙胺 (67 mg)和2,5-二氧吡咯烷-1-基 (叔丁氧羰基)甘胺酸 (182 mg)，在室溫下反應1小時。反應液加入水 (30 ml)稀釋，乙酸乙酯 (30 ml×2)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗產品，粗產品用C18柱 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液：5 %-60 %)進一步純化得到目標化合物 (B1.10-A，100 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：607。
步驟二： 向化合物B1.10-A (100 mg)的二氯甲烷溶液 (4 ml)中，加入三氟乙酸 (2 ml)，在室溫下攪拌反應1小時。將反應液濃縮，粗產品加入N,N-二甲基甲醯胺溶液 (3 ml)，用C18柱 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液：5 %-60 %)進一步純化得到目標化合物(S)-2-胺基-N-(3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]-二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基)乙醯胺 (B1.10，80 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：507； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.26 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.31 (s, 2H), 3.30 – 3.27 (m, 2H), 3.13 – 3.07 (m, 2H), 2.04 – 1.76 (m, 4H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例 B1.11：(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-異丙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)乙醯胺 (B1.11)的合成
步驟一： 將化合物1- (9H-芴-9-基)-3,6-二氧-2,9-二氧-4,7-二氮雜環-11-甲酸  (242 mg)，二異丙基乙胺 (330 mg)和N,N,N`,N`-四甲基脲六氟磷酸酯 (359 mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (10 ml)溶液中。隨後加入化合物 (S)-7-乙基-7-羥基-14- (2- (異丙胺基)乙基)-10,13-二氫-11H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-8,11 (7H)-二酮 (300 mg)，反應在室溫下反應2小時。向反應液中加入乙酸乙酯 (50 ml)，用飽和食鹽水 (30 ml X 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10/1)得到目標化合物化合物B1.11B (220 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：844.0。
步驟二：(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-異丙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)乙醯胺的製備 向化合物B1.11B (220 mg，0.261  mmol)的N,N-二甲基甲醯胺 (4 ml)溶液中加入呱啶 (1 ml)，反應在室溫下攪拌20分鐘。LCMS檢測反應反應完全。反應液減壓濃縮得到目標化合物 (220 mg)為褐色固體，上述產物未經純化直接用於下步合成。
LCMS (ESI) [M+H] +：622.1。
實施例 B1.12：(S)-2-胺基-N-((4-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.12)的合成
步驟一： 將化合物A1.10 (160 mg， 0.365  mmol) 溶在N,N-二甲基甲醯胺 (3 ml) 中，加入(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯 ( (B1.1-A，672 mg，1.83 mmol)，然後加入鹽酸乙酸乙酯 (0.073 ml， 3M) 於反應液中，反應液在室溫下攪拌過夜。LCMS檢測反應完成。該反應液直接經反相層析 (乙腈/0.05 %FA的水溶液： 5 %到50 %) 純化後得目標化合物(80 mg， 產率29.0 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 747.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.74 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.28 – 8.17 (m, 1H), 7.99 – 7.88 (m, 3H), 7.73 (d, J= 7.3 Hz, 2H), 7.63 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 7.44 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 7.35 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 6.58 (s, 1H), 5.48 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.66 (d, J= 6.3 Hz, 2H), 4.32 (d, J= 6.9 Hz, 2H), 4.26 (d, J= 6.1 Hz, 1H), 3.71 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 3.57 (t, J= 5.7 Hz, 2H), 3.29 – 3.20 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.00 – 1.86 (m, 4H), 0.93 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
步驟二：B1.12-A  (240 mg)溶於DMF (5 ml)，加入呱啶 (1 ml)，化合物攪拌20分鐘，溶於減壓除去低沸點組分，殘留物直接用於下步合成。
ESI-MS (m/z)： 525.2 [M+H] +。
少量粗產物經反相層析 (乙腈/0.05 %FA的水溶液： 5 %到50 %) 純化後得目標化合物。
ESI-MS (m/z)： 525.1 [M+H] +; 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.13 (t, J= 6.6 Hz, 1H), 8.21 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 8.02 (brs, 2H), 7.89 (d, J= 10.8 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.66 (d, J= 6.5 Hz, 2H), 3.64 (s, 2H), 3.53 (t, J= 6.1 Hz, 2H), 3.25-3.18 (m, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.98-1.84 (m, 4H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例 B1.13：(S)-2-胺基-N-(3-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)乙醯胺 (B1.13)的合成
步驟一： 室溫下，向化合物A1.11 (200 mg)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (5 ml)中加入三乙胺 (67 mg)和2,5-二氧吡咯烷-1-基 (叔丁氧羰基)甘胺酸 (182 mg)，在室溫下反應1小時。反應液加入水 (30 ml)稀釋，乙酸乙酯 (30 ml×2)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到粗產品，粗產品用C18柱 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液：5 %-60 %)進一步純化得到目標化合物 (B1.13-A，104 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：595。
步驟二： 向化合物B1.13-A (100 mg)的二氯甲烷溶液 (4 ml)中，加入三氟乙酸 (2 ml)，在室溫下攪拌反應1小時。將反應液濃縮，粗產品加入N,N-二甲基甲醯胺溶液 (3 ml)，用C18柱 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液：5 %-60 %)進一步純化得到目標化合物(S)-2-胺基-N-(3-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)乙醯胺 (B1.13，88 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：495。
實施例 B1.14： (S)-2-胺基-N-((3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.14)的合成
步驟一：化合物 (B1.1-A) (368 mg)，化合物 (A1.9) (440 mg)和對甲苯磺酸吡啶鹽 (PPTS) (25 mg)在二氯甲烷 (20 ml)中回流20小時，然後用碳酸氫鈉水溶液和鹽酸水溶液分別洗滌，減壓除去有機溶劑，得到粗產物，粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10/1)得到目標化合物化合物B1.14A (240 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：759.5。
步驟二：B1.14-A  (240mg)溶於DMF (5 ml)，加入呱啶 (1 ml)，化合物攪拌20分鐘，溶於減壓除去低沸點組分，殘留物直接用於下步合成。少量粗產物經反相層析 (乙腈/0.05 %FA的水溶液： 5 %到50 %) 純化後得目標化合物。
ESI-MS (m/z)： 537.4 [M+H] +； 1H NMR (400 MHz, MSO-d6) δ 9.13 (t, 1H)，8.04 (br, 2H), 7.58 (s，1H)，7.51 (s，1H)，7.25 (s，1H)，6.29 (s，2H)，5.43 (S，2H)，5.21 (s, 2H)，4.65 (d，2H)，3.63 (m，2H)，3.53 (m，2H)，3.11 (m，2H)，1.87 (m，4H)，0.88 (t，3H)。
實施例 B1.15：(S,E)-2-胺基-N-(3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)乙醯胺
步驟一： 室溫下，向化合物A1.12 (200 mg，0.447  mmol)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (5 ml)中加入三乙胺 (135 mg，1.341  mmol)和N-羥基-2,5-二氧吡咯烷 叔丁氧羰基甘胺酸酯 (183 mg，0.671  mmol)，在室溫下反應1小時。LCMS顯示反應完全。向反應液中加入水 (20 ml)，用乙酸乙酯 (20 ml×3)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到目標化合物B1.15A (130 mg ，產率：48 %)為棕色固體。
LCMS (ESI) [M+H] +=605.6。
步驟二： 室溫下，將化合物B1.15-A (130 mg，0.215 mmol)用鹽酸1，4-二氧六環溶液 (5 ml)溶解，在室溫下反應30分鐘。LCMS顯示反應完全。反應液通過反向純化得到目標化合物 (60 mg，產率：52 %)為棕色固體。
LCMS (ESI) [M+H] +=505.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.85 (s, 1H), 8.15 (s, 2H), 7.70 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.21 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 6.51 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 6.31 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.19 (s, 2H), 1.86 – 1.82 (m, 4H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
實施例 B1.16：(S,E)-2-胺基-N-(((3-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)氧基)甲基)乙醯胺
步驟一： 在氮氣保護下，將原料A1.13 (150 mg， 0.335  mmol) 溶在甲苯 (3 ml) 中，加入(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯 (B1.1-A，308 mg，0.84 mmol)，然後將醋酸鋅 (123 mg，0.67  mmol) 加入到反應液中，反應液在100 oC下攪拌過夜。LCMS檢測反應完成。該反應液直接經反相層析 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液： 5 %到50 %) 純化後得目標化合物 (9H-芴-9-基)甲基 (S，E)- (2- ( ( (3- (7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環[4,5- g]吡喃[3'，4'：6,7]吲哚嗪[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基甲酸酯 (B1.16-A，80 mg, 產率31 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 757.4。
步驟二： 將化合物B1.16-A (80 mg, 0.11  mmol) 溶在N,N-二甲基甲醯胺 (2 ml) 中,然後向反應液中加入呱啶(0.05 ml)，在室溫下攪拌1小時。LCMS顯示反應完成。將反應液濃縮得粗產品，粗產品用C18柱反相分離純化(乙腈/0.05 %胺水的水溶液： 5 %到50 %)得到目標化合物(35 mg， 產率62 %)為棕色固體。
LCMS (ESI) [M+H]+ = 535.2，t R= 1.070 min。
實施例 B1.17：(S,E)-2-胺基-N-(((3-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)乙醯胺
步驟一： 將化合物A1.14 (80 mg, 0.183  mmol)和化合物(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯 (B1.1-A，135 mg, 0.367  mmol)溶於甲苯 (4 ml), 加入醋酸鋅 (190 mg, 1.03 mmol)，反應液在100攝氏度下攪拌48小時。冷卻至室溫，向其中加入水 (10 ml)，用乙酸乙酯 (10 ml×3) 萃取。合併有機相經無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮得到粗產物，粗產物經反相層析 (0.05 % FA的水溶液/乙腈： 5 %到100 %) 純化後得到目標化合物(S,E)-2- (Fmoc胺基)-N-(((3-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)乙醯胺 (B1.17-A，30mg)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 745.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.82 (m 1H), 8.21 (m, 1H), 7.89 (m, 2H), 7.84 (d, J= 7.8 Hz, 2H), 7.68 (m, 1H), 7.61 (m, 1H), 7.42 (m, 1H), 7.37 (m, 1H), 7.33 – 7.28 (m, 4H), 6.72 – 6.55 (m, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.75 (m, 2H), 4.34 (m, 2H), 4.28 – 4.24 (m, 2H), 4.20 (m, 1H), 3.70 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 2.47 (s, 3H), 1.90 – 1.82 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H)。
步驟二： 將化合物4 (25 mg, 0.034  mmol)， 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (2 ml)中, 然後加入二乙胺(0.2 ml)，加畢，反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液直接減壓蒸幹溶劑得到粗品目標化合物(S,E)-2-胺基-N-(((3-(4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)乙醯胺為黃色粘稠狀產品。
LCMS (ESI) [M+H]+ = 523.2；LCMS (ESI) [M+H] += 523.1, t R= 0.446 min， 1.311 min。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.26 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 8.23 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 8.06 (s, 2H), 7.91 (m, 1H), 7.40 (d, J= 16.3 Hz, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.70 – 6.60 (m, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.35 (s, 2H), 4.80 (d, J= 6.6 Hz, 2H), 4.38 (d, J= 3.9 Hz, 2H), 3.68 (d, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.90 – 1.84 (m, 2H), 0.88 (m, 3H)。
C 、含偶聯連接段分子片段中間體的合成
實施例 C1.1：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸  (化合物C1.1)
步驟一： 29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯
向26-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜-26-烷-1-醇 (4.39 g)的DMF (40 ml)溶液中加入NaH (0.6 g，60 %)。上述混合物攪拌30分鐘後，加入溴乙酸叔丁酯 (2.4 g)。混合物在乾燥條件下攪拌20小時。然後向混合物中加入乙酸乙酯 (200 ml)和水 (200 ml，開始時慢慢加入)，有機相水洗 (100 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，減壓除去溶劑，殘留物經過矽膠柱層析分離得到目標產物，29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯。
ESI-MS ( m/z)： 554 [M + H] +。
步驟二：29-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯
向29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯 (1.16 g) 的乙酸乙酯 (20 ml)溶液中加入鈀碳催化劑 (Pd/C，10 %，100mg)。上述溶液在氫氣氣氛下攪拌5小時，然後濾去鈀碳後，減壓除去溶劑得到目標產物。
ESI-MS ( m/z)： 528 [M + H] +。
步驟三：1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷酸
29-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯 (527mg)和2-甲硫基-嘧啶-5-羧酸 (170 mg)加入乾燥DMF (10 ml), 然後在冰浴冷卻下向上述溶液中依次加入DIPEA (0.2 ml)，HBTU (420 mg)。上述混合物室溫小攪拌20小時。然後用乙酸乙酯 (100 ml)稀釋，水洗 (100 ml x 4),有機相無水硫酸鈉乾燥後，減壓除去有機溶劑，殘留物溶於DCM (10 ml)，然後加入TFA (10 ml),混合物室溫下攪拌1小時，然後減壓除去低沸點組分，殘留物經過製備HPLC分離得到1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷酸。
ESI-MS ( m/z)： 624 [M + H] +。
步驟四：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸
1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷酸 (623 mg)溶於DMF (10 ml)，0 oC下加入DIPEA (300ul)，HBTU  (420 mg)。混合物攪拌30分鐘，然後加入纈胺酸- (Boc)賴胺酸二肽化合物 (345 mg)。反應攪拌20小時，然後加入乙酸乙酯 (100 ml)，稀鹽酸 (20 ml x 3)洗，有機相乾燥後減壓除去有機溶劑，粗產物通過製備HPLC分離得到目標化合物 N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.1)。
ESI-MS ( m/z)： 951 [M + H] +。
實施例 C1.2：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.2)
步驟一：29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯
29-疊氮基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯  (1.7 g)，2-甲硫基-5-乙炔基嘧啶 (450mg)溶于DMSO-水 (20 ml，4：1)中，向混合物中加入溴化亞銅 (50mg)。反應液室溫下攪拌2小時，然後加入乙酸乙酯 (100 ml)，水洗 (100 ml x 3)，乾燥後減壓除去有機溶劑，粗產物用矽膠柱層析分離得到目標產物29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯。
MS ( m/z)： 704 [M + H] +。
步驟二：29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸
29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸叔丁酯 (1 g)溶於二氯甲烷 (10 ml)，然後加入TFA (5 ml)。混合物室溫靜置1小時，然後減壓除去低沸點組分得到目標產物29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸。
MS ( m/z)： 648 [M + H] +。
步驟三：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸
29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷酸 (647 mg)溶於DMF (10 ml)，0 oC下加入DIPEA (300 ul)，HBTU  (420 mg)。混合物攪拌30分鐘，然後加入纈胺酸-賴胺酸二肽化合物 (345mg)。反應攪拌20小時，然後加入乙酸乙酯 (100 ml)，稀鹽酸 (20 ml x 3)洗，有機相乾燥後減壓除去有機溶劑，粗產物通過製備HPLC分離得到目標化合物 N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-29-烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.2)。
ESI-MS ( m/z)： 975 [M + H] +。
實施例 C1.3：(1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷醯基)-甘胺酸-甘胺酸-L-苯丙胺酸 (化合物C1.3)
用實施例C1.1步驟四相同的方法和反應條件，用相應的原料，得到目標產物 (1-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧雜-2-氮雜-31-烷醯基)-甘胺酸-甘胺酸-L-苯丙胺酸 (化合物C1.3)。
ESI-MS (m/z)： 885 [M+H] +。
實施例 C1.4：(36-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-31-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-30-氮雜-三十六-(35-炔)-醯基)甘胺酸甘胺酸苯丙胺酸 (化合物C1.4)
用實施例C1.1步驟四相同的方法和反應條件，用反應式所示的原料，得到目標產物(36-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-31-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-30-氮雜-三十六-(35-炔)-醯基)甘胺酸甘胺酸苯丙胺酸 (化合物C1.4)。
ESI-MS (m/z)： 951 [M+H] +。
實施例 C1.5：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((36-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-31-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-30-氮雜-三十六-(35-炔)-醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.5)
用實施例C1.1步驟四相同的方法和反應條件，用反應式所示的化合物作為原料，得到目標產物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((36-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-31-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜-30-氮雜-三十六-(35-炔)-醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.5)。
ESI-MS (m/z)： 1017 [M+H] +。
實施例C1.6：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.6)
將6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸  (920mg)和N-羥基丁二醯亞胺 (537 mg)溶於二氯甲烷 (50 ml)中，然後加入二環己基碳二亞胺 (963 mg)。反應液室溫攪拌1小時，然後減壓除去二氯甲烷，殘留物溶於N,N-二甲基甲醯胺 (50 ml)，然後加入N 2-L-纈胺酸-N 6-(Boc)-L-賴胺酸 (1.5 g)，反應液室溫下攪拌反應16小時，將反應液倒入200 ml水中，用飽和碳酸氫鈉溶液調節pH至11，上述水溶液用乙酸乙酯萃取兩次，棄掉有機相，將水相用檸檬酸調節pH到4-5，用乙酸乙酯 (100 ml x 3)萃取三次，有機相用飽和食鹽水 (100 ml)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋蒸，得到粗產品2.8 g，粗產品用快速層析法分離純化(DCM ： MeOH = 30 ： 1 )得到目標化合物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (1.0 g)  (化合物C1.6)。
ESI-MS (m/z)： 564.3 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 12.45 (s, 1H), 8.68 (s, 2H), 8.12 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.88 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 6.76 (s, 1H), 4.27 – 4.19 (m, 1H), 4.11 (d, J= 4.9 Hz, 1H), 2.88 (d, J= 7.9 Hz, 3H), 2.73 (s, 1H), 2.59 (s, 1H), 2.52 (s, 4H), 2.40 – 2.24 (m, 3H), 2.03 – 1.88 (m, 2H), 1.77 (d, J= 3.2 Hz, 2H), 1.68 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 1.60 – 1.49 (m, 1H), 1.36 (s, 15H), 0.85 (dd, J= 14.8, 6.7 Hz, 7H)。
實施例 C1.7：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.7)
向化合物C1.6 (260 mg)的四氫呋喃 (3 ml)和水 (3 ml)混合溶液中加入過氧單磺酸鉀 (1.414 g)，在室溫下攪拌反應1小時。將反應液過濾，濾液用C18柱 (乙腈/0.05 %甲酸的水溶液：5 %-60 %)純化得到目標化合物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.7) (120 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +： 596;
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.48 (s, 1H), 9.13 (s, 2H), 8.14 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 7.90 (d, J= 9.1 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 4.24 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 4.12 (br s, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.89 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 2.43 – 2.29 (m, 2H), 2.03 – 1.93 (m, 2H), 1.82 (br s, 2H), 1.63 – 1.60 (m, 4H), 1.37 (s, 12H), 0.88 – 0.83 (m, 6H)。
實施例 C1.8：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醯胺基)己醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.8)
用實施例C1.6相同的方法和反應條件，用反應式所示的已知化合物作為原料，得到目標產物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醯胺基)己醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.8)。
ESI-MS (m/z)： 611 [M+H] +。
實施例 C1.9：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.9)
步驟一：6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸
室溫下，將2-甲硫基-5-乙炔基嘧啶 (1.5 g)、6-疊氮基己酸甲酯 (1.71 g)溶于叔丁醇與水的混合溶劑 (20 ml/25 ml)中，加入維生素C鈉 (5.7 g), 溴化亞銅 (2.9 g)攪拌反應10 h。反應加入乙酸乙酯 (200 ml)，水洗 (100 ml x 5)，乾燥後除去有機溶劑，矽膠柱層析得到6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸甲酯  (2.8 g)，ESI-MS (m/z)： 321.9[M+H] +。上述產物溶於四氫呋喃 (100 ml), 加入氫氧化鋰 (1M，20 ml)，混合物攪拌3小時，然後加入鹽酸至反應液pH 2，然後加入乙酸乙酯 (200 ml)，水洗 (100 ml x 3)，乾燥，除去有機溶劑得到目標產物6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸。ESI-MS (m/z)： 308.4 [M+H] +。
步驟二：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸
將化合物6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸 (370 mg,)和N-羥基丁二醯亞胺 (152 mg) 溶在二氯甲烷 (5 ml)中攪拌，再加入二環乙基碳二亞胺 (273 mg)，然後反應液在室溫下攪拌1小時。向反應液中加入10 ml水，用乙酸乙酯萃取 (20 ml x 2)，有機相用飽和食鹽水洗，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮得到粗產品。將此粗產品溶解在N,N-二甲基甲醯胺(10 ml)攪拌，加入化合物N 2-L-纈胺酸-N 6-(Boc)-L-賴胺酸，反應液在室溫下反應16小時，向反應液中緩慢加入檸檬酸將PH調至5左右，加入水，再用乙酸乙酯萃取(3 x 10 ml)，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到目標產物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (化合物C1.9，400 mg)。
ESI-MS (m/z)： 635.3 [M+H] +；
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.46 (s, 1H), 9.06 (s, 2H), 9.06 (s, 1H), 8.70 (s, 1H), 8.07 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 6.76 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.41 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 4.19 (dd, J= 8.9, 7.0 Hz, 1H), 4.14 – 4.05 (m, 1H), 2.92 – 2.85 (m, 2H), 2.56 (s, 3H), 2.24 – 2.10 (m, 2H), 1.97 – 1.81 (m, 3H), 1.71 – 1.64 (m, 1H), 1.61 – 1.50 (m, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.28 – 1.22 (m, 6H), 0.88 – 0.76 (m, 6H)。
實施例 C1.10：(6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-(5-炔)-醯基)甘胺酸甘胺酸-L-苯丙胺酸 (化合物C1.10)
用實施例C1.6相同的方法和反應條件，上述反應式所示的已知原料，得到目標產物 (6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)甘胺酸甘胺酸-L-苯丙胺酸 (化合物C1.10)。ESI-MS (m/z)： 498 [M+H] +。
用實施例C1.6相同的方法和反應條件，利用不同的反應原料，得到下表中目標產物。
化合物 化學結構 化學名稱 ESI-MS ( m/z)： [M + H] +
C1.11 (6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-甲醯胺基)己醯基) 甘胺酸甘胺酸-L-苯丙胺酸 545
C1.12 (6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基) 甘胺酸甘胺酸-L-苯丙胺酸 569
實施例 C1.13：(29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜29烷醯基) 甘胺酸甘胺酸-L-苯丙胺酸 (化合物C1.13)
用實施例C1.1步驟四相同的方法和反應條件，利用已知原料，得到目標產物 (29-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜29烷醯基)甘胺酸甘胺酸-L-苯丙胺酸 (化合物C1.13)。
ESI-MS (m/z)： 909 [M+H] +。
實施例 C1.14：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((39-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-5,34-二氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧雜-6,33-二氮雜三十九烷-38-炔醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.14)
步驟一： 將化合物C1.14-A (336mg)溶於二氯甲烷 (5 ml)中，加入N-羥基丁二醯亞胺 (98 mg，0.85  mmol)，二環己基碳二亞胺 (175 mg，0.85  mmol)室溫攪拌反應1小時， 然後將化合物N 2-L-纈胺酸-N 6-(Boc)-L-賴胺酸 (230 mg)加入反應液，室溫攪拌反應過夜。濃縮除去溶劑得到粗產品，粗產品用C18柱反相分離純化 (乙腈/0.01 %FA的水溶液： 5 %-50 %)得到無色油狀目標化合物 (C1.14B，290 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 882.3。
步驟二： 將化合物C1.14-B (300 mg)溶于無水甲醇 (5 ml)中，加入Pd/C (10 %, 60 mg)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應過夜，抽濾，濃縮得到目標化合物C1.14-C (293 mg)為無色油狀物。
LCMS (ESI) [M+H] +：856.1。
步驟三： 將6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (84 mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (3 ml)中，然後依次加入N,N-二異丙基乙胺  (61 mg)，HATU  (108 mg)。反應液室溫攪拌20分鐘，然後加入化合物C1.14-C (196 mg)，40 oC攪拌反應3小時，粗產品用C18柱反相分離純化 (乙腈/0.01 %FA的水溶液： 5 %-65 %)得到目標化合物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((39-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-5,34-二氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧雜-6,33-二氮雜三十九烷-38-炔醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.14) (170 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1074.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.68 (s, 2H), 8.23 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.13 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.99 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.43 (d, J= 6.5 Hz, 1H), 6.69 (s, 1H), 4.09 (dd, J= 8.8, 6.5 Hz, 1H), 4.02 (s, 2H), 3.98 (d, J= 2.9 Hz, 2H), 3.74 – 3.70 (m, 1H), 3.50 (s, 30H), 3.45 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 3.39 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 3.26 (d, J= 6.1 Hz, 2H), 3.20 (q, J= 5.9 Hz, 2H), 2.81 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.24 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.12 – 2.06 (m, 1H), 1.79 – 1.74 (m, 2H), 1.67 – 1.59 (m, 1H), 1.50 (d, J= 5.3 Hz, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.24 (s, 2H), 1.20 – 1.09 (m, 2H), 0.85 (t, J= 6.3 Hz, 6H)。
實施例 C1.15：N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((32-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧雜-6-氮雜三十二烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.15)
將化合物C1.14-B (130 mg)，5-乙炔基-2-甲硫基嘧啶 (44 mg)，維生素C鈉 (3 mg)和硫酸銅 (5 mg)加入到叔丁醇 (2 ml)和水 (2 ml)的混合溶液中，反應在室溫氮氣下反應3小時。向反應液中加入水 (10 ml)，用二氯甲烷 (30 ml×3)萃取，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濃縮得到粗產品，粗產品TLC分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10比1)得到目標化合物N 6-(叔丁氧基羰基)-N 2-((32-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧雜-6-氮雜三十二烷醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.15) (90 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +=1032.3。
實施例 C1.16：N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸
步驟一： 向化合物C1.16-A (10.0 g)加入氯化氫-二氧六環 (100 ml)溶液，在室溫下反應2小時。反應液減壓濃縮得到白色固體目標化合物C1.16-B (8.0 g)。
LCMS (ESI) [M+H] +：380.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.18 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.40 – 7.30 (m, 5H), 7.26 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 5.08 – 4.99 (m, 2H), 4.23 – 4.11 (m, 1H), 3.94 – 3.88 (m, 1H), 2.78 – 2.73 (m, 2H), 2.03 – 1.94 (m, 1H), 1.77 – 1.51 (m, 4H), 1.44 – 1.31 (m, 2H), 0.87 (dd, J= 17.3, 6.6 Hz, 6H)。
步驟二： 將化合物C1.16-B (3.0 g)和醋酸鈉 (1.90 g)溶在甲醇 (100 ml)溶液中，室溫下反應10分鐘，向反應液中加入多聚甲醛 (2.8 g)，室溫下攪拌反應30分鐘，再向反應液中加入氰基硼氫化鈉 (1.0 g)，反應在室溫下攪拌反應16小時。反應液過濾後濾液用C18柱反向分離純化(乙腈比0.05 %的甲酸水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物C1.16-C (1.70 g)。
LCMS (ESI) [M+H] +：408.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.86 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.40 – 7.26 (m, 6H), 5.03 (s, 2H), 4.08 – 4.06 (m, 1H), 3.90 – 3.85 (m, 1H), 2.50 – 2.45 (m, 2H), 2.35 (s, 6H), 2.05 – 1.93 (m, 1H), 1.73 – 1.55 (m, 2H), 1.51 – 1.40 (m, 2H), 1.33 – 1.22 (m, 2H), 0.85 (dd, J= 16.5, 6.8 Hz, 6H)。
步驟三： 室溫下，將化合物C1.16-C (1.6 g)溶於甲醇 (80 ml)中，然後向反應液中加入Pd/C (10 %，0.16 g)，氫氣下室溫下攪拌反應12小時。將反應液過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物C1.16-D (680 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：274.2。
步驟四： 將6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (944 mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (30 ml)中，然後依次加入N,N-二異丙基乙胺  (1.3 g)，2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU，1.8 g)。反應液室溫攪拌20分鐘，然後加入化合物C1.16-D (1.1 g)，40 oC攪拌反應3小時，粗產品用C18柱反相分離純化 (乙腈/0.01 %甲酸的水溶液： 5 %-65 %)得到白色固體目標化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸C1.16 (1.2 g)。
LCMS (ESI) [M+H] +：492.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.68 (s, 2H), 8.00 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.91 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 4.20 (t, 1H), 4.08 (dd, J= 12.7, 7.7 Hz, 1H), 2.47 – 2.40 (m, 4H), 2.37 – 2.31 (m, 2H), 2.30 (s, 6H), 2.01 – 1.92 (m, 1H), 1.82 – 1.73 (m, 2H), 1.71 – 1.56 (m, 2H), 1.49 – 1.37 (m, 2H), 1.33 – 1.23 (m, 2H), 0.88 – 0.82 (m, 6H)。
實施例 C1.17：N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸C1.17
將6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (268 mg), 化合物C1.16-D (328 mg)， 三乙胺 (322 mg) 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (5 ml)。然後再加入1-羥基苯並三唑(HOBT，162 mg)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI，229 mg)。
反應液室溫攪拌16小時，反應液直接經過C18柱反相 (乙腈和0.05 %的甲酸水溶液體系)提純得到目標化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.17 ，白色固體，327 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：524.4。
1H NMR (400 MHz, ) δ 9.13 (s, 2H), 7.95 (t, J= 8.8 Hz, 2H), 4.21 (dd, J= 8.8, 6.9 Hz, 1H), 4.08 – 4.03 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.55 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.42 – 2.32 (m, 4H), 2.27 (s, 6H), 1.98 (dd, J= 13.6, 6.8 Hz, 1H), 1.86 – 1.77 (m, 2H), 1.74 – 1.55 (m, 2H), 1.47 – 1.37 (m, 2H), 1.31 – 1.23 (m, 2H), 0.85 (dd, J= 12.8, 6.8 Hz, 6H)。
實施例 C1.18：N 2-(叔丁氧基羰基)-N 6-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸
步驟一： 化合物C1.18-B (3 g)溶於二氯甲烷 (30 ml)，加入DIPEA (4 ml)，然後加入化合物C1.18-A (3.48 g)，混合物室溫下攪拌反應20小時。向反應液中加入乙酸乙酯 (200 ml)，混合物依次用鹽酸 (0.1M, 30 ml x 3)、水 (30 ml x 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮後得到目標混合物C1.18-C (4.7 g)。
步驟二： 室溫下，將化合物C1.18-C (4.7 g)溶於甲醇 (80 ml)中，然後向反應液中加入Pd/C (10 %，0.6 g)，在氫氣下室溫下攪拌反應12小時。將反應液過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物C1.18-D (3.4 g)。LCMS (ESI) [M+H] +：346.2。
步驟三： 將6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (2.68 g), 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (50 ml), 然後再加入三乙胺 (3 ml), HBTU (3.8 g), 混合物室溫下攪拌10分鐘，然後加入乙酸乙酯 (200 ml)，混合物用飽和碳酸氫鈉 (20 ml x 2)，鹽酸 (0.1M，50 ml x 2)，水 (50 ml x 2)洗，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得到粗產物中間體，上述粗產物溶於DMF  (30 ml)，加入DIPEA (1.6 ml)，然後加入C1.18-D (3.4 g)， 反應液室溫攪拌3小時，然後加入乙酸乙酯 (200 ml)，用鹽酸 (0.1M，50 ml x 2)，水 (50 ml x 2)洗，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮得到粗產物，經矽膠柱層析分離提純得到目標化合物N 2-(叔丁氧基羰基)-N 6-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.18 ，白色固體，3.8 g)。
LCMS (ESI) [M+H] +：596.4。
實施例 C1.19：N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸
步驟一： 將化合物6-(4-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸 (1.0 g， 3.3  mmol)溶在四氫呋喃和水 (40 ml，3：1)混合溶液中，加入過氧單磺酸鉀 (10.0 g，16.3 mmol)。室溫攪拌反應3小時，LCMS檢測反應完成。反應液過濾，濾餅用DMSO洗滌，合併濾液。經反相純化 (C18、乙腈：0.1 %、甲酸=5 %-55 %)純化，得到6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸 (750 mg，產率67.9 %)白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 340.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.48 (s, 2H), 8.95 (s, 1H), 4.49 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 3.45 (s, 3H), 2.22 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.95 – 1.84 (m, 2H), 1.61 – 1.50 (m, 2H), 1.36 – 1.26 (m, 2H)。
步驟二： 將化合物6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸 (300 mg，0.88 mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (6 ml)，加入HATU (337 mg，0.88  mmol)，DIPEA (286 mg，2.21 mmol)，室溫攪拌反應30分鐘，然後加入二肽 C1.16-D (243 mg，0.88  mmol)，室溫攪拌反應2小時。LCMS檢測反應完成，反應液通過C18柱分離純化 (乙腈/0.01 %FA的水溶液：5 %-50 %)得到目標化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (300 mg，產率57 %)白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 595.5， t R= 2.024 min。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.49 (s, 2H), 9.01 (s, 1H), 7.85 (br s, 1H), 7.84 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 4.48 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 4.17 – 4.15 (m, 1H), 4.02 (br s, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.42 (br s, 2H), 2.30 (s, 6H), 2.18 – 2.14 (m, 2H), 1.99 – 1.96 (m, 1H), 1.88 (dd, J= 14.6, 7.1 Hz, 2H), 1.67 (br s, 1H), 1.59 – 1.53 (m, 2H), 1.43 (br s, 2H), 1.28 – 1.26 (m, 5H), 0.83 – 0.89 (m, 6H)。
實施例 C1.20：N 6,N 6-二乙基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸
步驟一： 將化合物C1.16-B (5.0 g, 12.05  mmol)溶在二氯甲烷 (100 ml)中，向反應液中加入乙醛 (3.2 g, 72.3  mmol)，室溫下攪拌反應10分鐘，再向反應液中加入三乙醯氧基硼氫化鈉 (12.8 g, 60.25 mmol)，反應在室溫下攪拌反應1小時。LCMS顯示反應完全。向反應液中加入氯化銨飽和水溶液攪拌一個小時，旋幹，過濾後濾液用C18柱反向分離純化(乙腈比0.05 %的甲酸水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物C1.20-A (4.57 g, 產率82.0 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 436.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.70 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 7.38 – 7.26 (m, 5H), 5.08 – 4.99 (m, 2H), 4.00 (dd, J= 12.6, 6.5 Hz, 1H), 3.86 (dd, J= 8.6, 6.8 Hz, 1H), 2.74 (dd, J= 14.0, 6.9 Hz, 4H), 2.64 – 2.54 (m, 2H), 2.05 – 1.94 (m, 1H), 1.72 – 1.52 (m, 2H), 1.52 – 1.38 (m, 2H), 1.38 – 1.18 (m, 2H), 1.04 (t, J= 7.1 Hz, 6H), 0.87 – 0.81 (m, 6H)。
步驟二： 室溫下，將化合物C1.20-A (1.6 g，3.68 mmol)溶於甲醇 (80 ml)中，然後向反應液中加入Pd/C (0.16 g)，氫氣下室溫下攪拌反應12小時。LCMS顯示反應完成。將反應液過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物C1.20-B (900 mg，產率82 %)為米白色固體。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.04 (br s, 1H), 4.02 – 3.99 (m, 1H), 3.10 (d, J= 4.5 Hz, 1H), 2.65 (q, J= 7.1 Hz, 4H), 2.55 – 2.51 (m, 2H), 2.06 – 1.93 (m, 1H), 1.73 – 1.54 (m, 2H), 1.47 – 1.38 (m, 2H), 1.30 – 1.21 (m, 2H), 1.01 (t, J= 7.1 Hz, 6H), 0.89 (d, J= 6.9 Hz, 3H), 0.79 (d, J= 6.8 Hz, 3H)。
步驟三： 將化合物6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (268 mg, 1 mmol)溶於DMF (8 ml)中，依次加入HATU (380 mg, 1 mmol)和三乙胺 (322 mg, 2.5 mmol)，室溫攪拌20分鐘後加入化合物C1.20-B (301 mg, 1 mmol)，室溫繼續攪拌30分鐘。LCMS檢測反應完成後，反應液直接經過C18柱反相 (乙腈和0.05 %的甲酸水溶液體系)提純得到目標化合物 (280 mg，產率51 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 552.3； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.13 (s, 2H), 7.95 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.86 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 4.18 (dd, J= 8.8, 6.8 Hz, 1H), 4.02 (dd, J= 12.8, 7.2 Hz, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.74 – 2.69 (m, 4H), 2.62 – 2.52 (m, 4H), 2.44 – 2.29 (m, 2H), 2.04 – 1.94 (m, 1H), 1.86 – 1.77 (m, 2H), 1.72 – 1.54 (m, 2H), 1.51 – 1.39 (m, 2H), 1.33 – 1.23 (m, 2H), 1.02 (t, J= 7.2 Hz, 6H), 0.87 – 0.82 (m, 6H)。
實施例 C1.21：N 6,N 6-二乙基-N 2-((6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸
將化合物6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸 (500 mg, 1.475  mmol)，溶於N, N-二甲基甲醯胺 (10 ml)，然後加入HATU (560 mg,，1.475  mmol)，N,N-二異丙基乙胺 (476 mg，3.688  mmol)，攪拌30分鐘，然後加入化合物C1.20-B (444 mg，1.475  mmol)，反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，反應液直接經過C18柱反相 (乙腈和0.05 %的甲酸水溶液體系)提純得到目標化合物N 6,N 6-二乙基-N 2-((6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (330 mg，產率34 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 623.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.49 (s, 2H), 9.04 (s, 1H), 7.84 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.80 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 4.47 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 4.14 (dd, J= 8.8, 6.6 Hz, 1H), 4.06 – 3.95 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.67 – 2.64 (m, 4H), 2.55 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.21 – 2.10 (m, 2H), 2.02 – 1.94 (m, 1H), 1.92 – 1.84 (m, 2H), 1.72 – 1.63 (m, 1H), 1.72 – 1.63 (m, 3H), 1.59 – 1.54 (m, 2H), 1.32 – 1.21 (m, 4H), 1.01 (t, J= 7.1 Hz, 6H), 0.81 (dd, J= 9.6, 6.8 Hz, 6H)。
實施例 C1.22：N 6,N 6-二丙基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸
步驟一： 將化合物C1.16-B (5.0 g，12 mmol)溶在二氯甲烷 (100 ml)中，向反應液中加入正丙醛 (4.2 g， 72.3 mmol)，室溫下攪拌反應10分鐘，再向反應液中加入三乙醯氧基硼氫化鈉 (12.8 g， 60.25 mmol)，反應在室溫下攪拌反應1小時。LCMS顯示反應完全。向反應液中加入氯化銨飽和水溶液攪拌一個小時，旋幹，過濾後濾液用C18柱反向分離純化(乙腈比0.05 %的甲酸水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物C1.22-A (4.57 g, 產率82.0 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 464.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.81 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.38 – 7.28 (m, 5H), 5.04 (d, J= 1.7 Hz, 2H), 4.12 – 4.02 (m, 1H), 3.94 – 3.82 (m, 1H), 2.65 – 2.52 (m, 6H), 2.06 – 1.94 (m, 1H), 1.76 – 1.64 (m, 1H), 1.64 – 1.53 (m, 1H), 1.52 – 1.40 (m, 6H), 1.34 – 1.18 (m, 2H), 0.92 – 0.80 (m, 12H)。
步驟二： 室溫下，將化合物C1.22-A (2.0 g，4.32 mmol)溶於甲醇 (80 ml)中，然後向反應液中加入Pd/C (0.16 g)，氫氣下室溫下攪拌反應12小時。LCMS顯示反應完成。將反應液過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物C1.22-B (1.2 g，產率85.5 %)為白色固體。
步驟三： 將化合物6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (100 mg，0.373 mmol)， 溶於N， N-二甲基甲醯胺 (1 ml)， 然後加入HATU (142 mg， 0.373  mmol)，N，N-二異丙基乙胺 (120 mg， 0.93  mmol)，該體系攪拌30分鐘，然後加入化合物C1.22-B (122 mg，0.371  mmol)，反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，反應液直接經過C18柱反相 (乙腈和0.05 %的甲酸水溶液體系)提純得到目標化合物N 6，N 6-二丙基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸(50 mg，產率28 %)為淡黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 580.0； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.24 (s, 2H), 7.98 – 7.93 (m, 2H), 4.24 – 4.16 (m, 1H), 4.10 (d, J= 5.2 Hz, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.79 – 2.64 (m, 6H), 2.55 (t, J= 7.1 Hz, 2H), 2.45 – 2.26 (m, 2H), 2.06 – 1.91 (m, 1H), 1.89 – 1.78 (m, 2H), 1.76 – 1.66 (m, 1H), 1.64 – 1.57 (m, 1H), 1.57 – 1.42 (m, 6H), 1.37 – 1.24 (m, 2H), 0.93 – 0.78 (m, 12H)。
實施例 C1.23：N 6,N 6-二丙基-N 2-((6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸
將化合物6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己酸 (500 mg， 1.475  mmol)， 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (10 ml)， 然後加入HATU (560 mg， 1.475  mmol)， N,N-二異丙基乙胺 (476 mg， 3.688  mmol)，該體系攪拌30分鐘，然後加入化合物C1.22-B (485 mg，1.475 mmol)，反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，反應液直接經過C18柱反相 (乙腈和0.05 %的甲酸水溶液體系)提純得到目標化合物N 6,N 6-二丙基-N 2-((6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (320 mg，產率33 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 651.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.49 (s, 2H), 9.00 (s, 1H), 7.95 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.79 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 4.47 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 4.21 – 4.11 (m, 1H), 4.09 – 4.01 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.45 – 2.35 (m, 6H), 2.23 – 2.09 (m, 2H), 1.97 – 1.86 (m, 3H), 1.72 – 1.64 (m, 1H), 1.61 – 1.50 (m, 3H), 1.43 – 1.34 (m, 6H), 1.32 – 1.22 (m, 4H), 0.86 – 0.77 (m, 12H)。
實施例 C1.24：(S)-(6-((4-(羥甲基)苯基)胺基)-5-(6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-6-氧代己基)胺基甲酸叔丁酯
步驟一： 將化合物C1.24-A (3.70 g，15.7  mmol)，二異丙基乙胺 (11.0 ml， 62.8  mmol)和HBTU (8.90 g， 23.6  mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (30 ml)中，反應在室溫下反應30分鐘。隨後加入化合物Boc保護的賴胺酸 (3.86 g，15.7  mmol)，反應在室溫下反應2小時。LCMS檢測反應完全。向反應液中加入檸檬酸水溶液 (30 ml)調至PH = 5，用二氯甲烷 (50 ml X 3)萃取水溶液，合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到目標化合物C1.24-B (7.0 g， 粗產品)為黃色油狀物。LCMS (ESI) [M+H] += 465.1，t R= 1.751 min。
步驟二： 將化合物C1.24-B (7.00 g，5.60  mmol)，二異丙基乙胺 (10.7 ml， 60.4  mmol)和HBTU (8.60 g， 22.7  mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (100 ml)中，隨後加入對胺基苄醇 (3.71 g，30.2  mmol)，反應在室溫下反應2小時。LCMS檢測反應完全。向反應液中加入乙酸乙酯 (300 ml)，用飽和食鹽水 (100 ml X 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10/1)得到目標化合物(S)-(6-((4-(羥甲基)苯基)胺基)-5-(6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-6-氧代己基)胺基甲酸叔丁酯 (6.00 g， 產率：69.9 %)為黃色油狀物。
LCMS (ESI) [M+H] += 570.1； 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.24 (s, 1H), 8.46 (s, 2H), 7.51 – 7.47 (m, 2H), 7.31 – 7.23 (m, 3H), 7.02 – 6.95 (m, 1H), 4.83 (br s, 1H), 4.63 – 4.60 (m, 2H), 3.19 – 2.96 (m, 4H), 2.57 (s, 3H), 2.52 – 2.48 (m, 2H), 2.47 – 2.41 (m, 2H), 1.99 – 1.92 (m, 2H), 1.87 – 1.77 (m, 2H), 1.76 – 1.63 (m, 2H), 1.43 (s, 9H)。
實施例 C1.25： (S)-(6-((4-(羥甲基)苯基)胺基)-5-(6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)- 6-氧代己基)胺基甲酸叔丁酯
步驟一： 將化合物C1.25-A (1.60 g，5.21 mmol)，二異丙基乙胺 (2.68 ml， 20.8 mmol)和HBTU (2.97 g， 7.82 mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (30 ml)，反應在室溫下反應30分鐘。隨後加入Boc保護的賴胺酸 (1.28 g，5.21 mmol)，反應在室溫下反應2小時。LCMS檢測反應完全。向反應液中加入檸檬酸水溶液 (30 ml)調至PH = 5，用二氯甲烷 (50 ml X 3)萃取水溶液，合併有機相並用無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到目標化合物C1.25-B (3.0 g， 粗產品)為黃色油狀物。
LCMS (ESI) [M+H] += 536.0。
步驟二： 將化合物C1.25-B (3.00 g，5.60 mmol)，二異丙基乙胺 (2.89 g， 22.4 mmol)和HBTU (3.19 g， 8.40 mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (30 ml)。隨後加入對胺基苄醇 (1.38 g，11.2 mmol)，反應在室溫下反應2小時。LCMS檢測反應完全。向反應液中加入乙酸乙酯 (200 ml)，用飽和食鹽水 (80 ml X 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經柱層析分離純化 (二氯甲烷：甲醇=10/1)得到目標化合物(S)-(6-((4-(羥甲基)苯基)胺基)-5-(6-(2-(甲硫基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)- 6-氧代己基)胺基甲酸叔丁酯 (2.90 g)為黃色油狀物。
LCMS (ESI) [M+H] += 641.1； 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 9.13 (s, 1H), 8.95 (s, 2H), 7.94 (s, 1H), 7.47 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 6.83 – 6.77 (m, 1H), 4.93 – 4.80 (m, 1H), 4.64 – 4.58 (m, 2H), 4.40 – 4.29 (m, 2H), 3.12 – 2.97 (m, 4H), 2.60 (s, 3H), 2.31 – 2.23 (m, 2H), 1.96 – 1.83 (m, 4H), 1.76 – 1.61 (m, 4H), 1.41 (s, 9H), 1.37 – 1.29 (m, 4H)。
實施例 C1.26：N 6,N 6-二丁基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸
步驟一： 將化合物C1.16-B (10.0 g)溶在二氯甲烷 (200 ml)溶液中，向反應液中加入正丁醛 (10.4 g)，室溫下攪拌反應10分鐘，再向反應液中分批次加入三乙醯氧基硼氫化鈉 (25.6 g)，反應在室溫下攪拌反應1小時。LCMS顯示反應完全。向反應液中加入氯化銨飽和水溶液攪拌一個小時，旋幹，過濾後濾液用C18柱反向分離純化(乙腈比0.05 %的甲酸水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物C1.26-A (4.9 g)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 492.7； 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 – 7.30 (m, 5H), 5.14 – 5.08 (m, 2H), 4.33 – 4.30 (m, 1H), 4.14 – 4.12 (m, 1H), 2.94 – 2.80 (m, 6H), 2.13 – 2.11 (m, 1H), 1.85 – 1.82 (m, 2H), 1.58 – 1.55 (m, 4H), 1.40 – 1.22 (m, 8H), 0.98 – 0.87 (m, 12H)。
步驟二： 室溫下，將化合物C1.26-A (5.0 g)溶於甲醇 (100 ml)溶液中，然後向反應液中加入Pd/C (10 %，1 g)，氫氣下攪拌反應12小時。LCMS顯示反應完成。將反應液過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物C1.26-B (3.68 g)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 358.3。
步驟三： 將化合物6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (1.0 g) 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (15 ml), 然後依次加入N,N-二異丙基乙胺 (1.2 g)，HATU (1.4 g)，反應攪拌30分鐘，然後加入化合物C1.26-B (1.3 g)，反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，反應液，反應液直接經製備層析 (0.01 % 三氟乙酸水溶液，乙腈)純化得到目標化合物N 6,N 6-二丁基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)- L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (C1.26，500 mg)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 608.7； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.37 (s, 1H), 9.13 (s, 2H), 8.19 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 4.25 – 4.20 (m, 1H), 4.20 – 4.13 (m, 1H), 3.42 (s, 3H), 3.06 – 2.99 (m, 6H), 2.57 – 2.53 (m, 2H), 2.41 – 2.30 (m, 2H), 1.99 – 1.95 (m, 2H), 1.87 – 1.79 (m, 2H), 1.78 – 1.71 (m, 1H), 1.62 – 1.56 (m, 4H), 1.34 – 1.32 (m, 8H), 0.94 – 0.85 (m, 12H)。
實施例 C1.27：(S)-1-乙基-4-(3-甲基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)丁醯胺基)呱啶-4-羧酸
步驟一： 將化合物C1.27-A (5.0 g，20.49 mmol)溶在DMF (100 ml)中，向反應液中加入N- ( (苄氧基)羰基)-L-纈胺酸2,5-二氧吡咯烷-N-羥基酯 (7.13 g，20.49 mmol)，100℃下攪拌反應48小時。LCMS顯示反應完全。反應液用C18柱反向分離純化(乙腈比0.05 %的甲酸水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物C1.27-B (1.3 g, 產率13.3 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M-boc] += 378.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.38 – 7.33 (m, 5H), 7.32 – 7.27 (m, 1H), 7.20 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 5.14 – 5.02 (m, 2H), 3.97 – 3.87 (m, 1H), 3.70 – 3.59 (m, 2H), 3.08 – 2.95 (m, 2H), 2.04 – 1.97 (m, 1H), 1.95 – 1.87 (m, 2H), 1.76 – 1.69 (m, 2H), 1.40 (s, 9H), 0.91 – 0.84 (m, 6H)。
步驟二： 室溫下，將化合物C1.27-B (1.3 g，2.71 mmol)溶於乙酸乙酯中 (10 ml)溶液中，然後向反應液中加入二氧六環-HCl (3N，10 ml)，室溫下攪拌反應1小時。LCMS顯示反應完成。將反應液減壓濃縮得到目標化合物C1.27-C (1.06 g， 產率94.4 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 378.4。
步驟三： 將化合物C1.27-C (1.06 g，2.81 mmol)溶在二氯甲烷 (10 ml)中，向反應液中加入乙醛 (0.75 g，16.87  mmol)，室溫下攪拌反應10分鐘，再向反應液中發批次加入三乙醯氧基硼氫化鈉 (3 g，14.05  mmol)，反應在室溫下攪拌反應1小時。LCMS顯示反應完全。向反應液中加入氯化銨飽和水溶液攪拌一個小時，減壓蒸餾除去二氯甲烷，剩餘水相經反相分離 (乙腈比0.05 %的甲酸水溶液： 5 %到55 %)得到目標化合物C1.27-D (1.13 g， 產率99.23 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 406.1； 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.42 – 7.25 (m, 5H), 5.22 – 5.06 (m, 2H), 3.91 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 3.52 – 3.36 (m, 2H), 3.25 – 2.93 (m, 4H), 2.66 – 2.54 (m, 1H), 2.47 – 2.36 (m, 1H), 2.27 – 2.14 (m, 2H), 2.13 – 2.06 (m, 1H), 1.35 – 1.29 (m, 4H), 0.98 – 0.90 (m, 6H)。
步驟四： 室溫下，將化合物C1.27-D (1.13 g，2.78 mmol)溶於甲醇 (20 ml)溶液中，然後向反應液中加入Pd/C (0.5 g)，氫氣下攪拌反應12小時。LCMS顯示反應完成。將反應液過濾，濾液減壓濃縮得到目標化合物C1.27-E  (0.58 g， 產率76.18 %)為白色固體。LCMS (ESI) [M+H] += 272.4。
步驟五： 將化合物6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔酸 (1 g， 3.73 mmol)， 溶於N， N-二甲基甲醯胺 (5 ml)， 然後依次加入N,N-二異丙基乙胺 (1.2 g， 9.32  mmol)，HATU (1.42 g， 3.73 mmol)，反應液攪拌30分鐘，然後加入化合物C1.27-E (1.01 g，3.73  mmol)，反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，反應液直接經製備層析 (0.01 % 三氟乙酸水溶液， 乙腈)純化得到目標化合物(S)-1-乙基-4-(3-甲基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)丁醯胺基)呱啶-4-羧酸 (C1.27，500 mg， 產率28.7 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 522.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.12 (s, 2H), 8.08 (s, 1H), 7.88 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 4.28 – 4.25 (m, 1H), 3.41 (s, 3H), 2.89 – 2.78 (m, 2H), 2.57 – 2.52 (m, 4H), 2.45 – 2.30 (m, 4H), 2.07 – 2.01 (m, 2H), 1.99 – 1.96 (m, 1H), 1.95 – 1.88 (m, 2H), 1.85 – 1.79 (m, 2H), 1.04 (t, J= 7.1 Hz, 3H), 0.88 – 0.83 (m, 6H)。 二、藥物 - 連接體化合物合成
實施例 2.1：N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺  (DL-001)
步驟一： 將化合物C1.6 (50 mg， 0.10 mol), 化合物B1.5 (71 mg， 0.12 mol)， N,N-二異丙基乙胺 (39 mg,，0.30 mol) 溶於DMF (5 ml)。然後依次加入1-羥基苯並三唑(16 mg, 0.12 mmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(23 mg,，0.12  mmol), 上述反應液室溫攪拌16小時，加入50 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到粗產品，粗產品用快矽膠柱層析分離純化(DCM ： MeOH = 100 ： 0 到 90 ： 10)得到目標化合物2.1A， (62 mg，黃色固體，產率58 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1024.8。
步驟二： 將化合物2.1A (40 mg， 0.04  mmol)溶於四氫呋喃和水的混合溶液 (體積比為1/1；4 ml)中，加入過氧單磺酸鉀(246 mg， 0.4  mmol)，反應液在室溫下攪拌5小時，加入30 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到目標化合物 2.1B (30 mg，黃色固體，產率74 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1055.9。
步驟三： 將化合物2.1B (30 mg, 0.03 mmol) 溶於三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液(體積比為1：3：4 ml)中, 反應液在室溫下攪拌1小時。然後減壓濃縮得粗產品，粗產品經製備層析(0.01 % TFAin water, MeCN)純化得到目標化合物 N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (9 mg， 白色固體，產率33 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：955.8； 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 9.09 (s, 2H), 8.54 (s, 1H), 8.15 (m, 2H), 7.84 (m, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.64 (br s, 3H), 7.53 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.30 (d, J= 2.9 Hz, 2H), 5.59 – 5.46 (m, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.87 – 4.78 (m, 1H), 4.70 – 4.60 (m, 1H), 4.17 – 4.03 (m, 2H), 3.82 – 3.58 (m, 2H), 3.41 (s, 3H), 2.80 – 2.70 (m, 2H), 2.40 – 2.22 (m, 2H), 1.93 – 1.68 (m, 6H), 1.65 – 1.57 (m, 1H), 1.56 – 1.45 (m, 3H), 1.36 – 1.22 (m, 2H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.80 (d, J= 5.2 Hz, 6H)。
用實施例2.1相同的方法和反應條件，用所示的不同起始原料，得到下表中實施例2.2 到實施例2.8所示的目標產物。
實施例 化合物 名稱 (m/z)： [M+H] +
實施例2.2 DL-002 原料：C1.2，B1.5 N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代-己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代-丁-2-基)-29-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九烷醯胺 1366.9
實施例2.3 DL-003 原料：C1.2，B1.4 N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b] 喹啉-11-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-己)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-29-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九烷醯胺 1354.9
實施例2.4 DL-004 原料：C1.1，B1.4 N-((7S,10S)-7-(4-胺基丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-10-異丙基-3,6,9,12-四氧代-14,17,20,23,26,29,32,35,38-九氧雜-2,5,8,11-四氮雜四十烷-40-基)-2-(甲磺醯基)嘧啶-5-甲醯胺 1330.9
實施例2.5 DL-005 原料：C1.1，B1.5 N-((7S,10S)-7-(4-胺基丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)- 10-異丙基-3,6,9,12-四氧代-14,17,20,23,26,29,32,35,38-九氧雜-2,5,8,11-四氮雜四十烷-40-基)-2-(甲磺醯基)嘧啶-5-甲醯胺 1342.8
實施例2.6 DL-006 原料：C1.5，B1.5 N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-29-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧雜二十九烷醯胺 1408.5
實施例2.7 DL-007 原料：C1.7，B1.8 N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-己)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔-醯胺 1017.9
實施例2.8 DL-008 原料：C1.7，B1.9 N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((4-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)苯基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 1017.8
實施例 2.9：(S)-6-胺基-N-(2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-009)
步驟一： 將化合物B1.5 (30 mg)，化合物C1.9 (48 mg)， N,N-二異丙基乙胺 (23 mg) 溶於DMF (5 ml)。向上述溶液中加入1-羥基苯並三唑(9 mg)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(13 mg)，反應室溫攪拌16小時， 加入50 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到粗產品，粗產品用快速層析法分離純化(DCM ： MeOH = 100 ： 0 to 90 ： 10)得到目標化合物2.9A (35 mg，淡黃色固體，產率43 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1095.8。
步驟二： 將化合物2.9A (35 mg)溶於四氫呋喃和水的混合溶液 (體積比為1/1；4 ml)中，加入過氧單磺酸鉀(184 mg)，反應液室溫下攪拌5小時，加入30 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到目標化合物 2.9B (25 mg，淡黃色固體，產率71 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1126.9。
步驟三： 將化合物2.9B (25 mg) 溶於三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液(體積比為1：3；4 ml)中, 反應液在室溫下攪拌1小時。液濃縮得粗產品，經prep-HPLC (0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物 (S)-6-胺基-N-(2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 三氟乙酸鹽 (5.1 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1026.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 8.91 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.11 – 8.10 (m, 1H), 7.79 (s, 1H), 7.73 – 7.72 (m, 1H), 7.63 (s, 3H), 7.53 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.29 (m, 2H), 5.61 – 5.46 (m, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.85 – 4.83 (m, 1H), 4.63 – 4.60 (m 1H), 4.44 (s, 2H), 4.06 – 4.03 (m, 3H), 2.75 (s, 2H), 2.12 – 2.10 (m, 2H), 1.89 – 1.85 (m, 6H), 1.56 – 1.53 (m, 8H), 1.24 (br s, 4H), 0.87 – 0.84 (m, 3H), 0.77 (d, J= 6.1 Hz, 6H).
實施例 2.10：N-((7S,10S)-7-(4-胺基丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-10-異丙基-3,6,9,12,16-五氧代-14,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧雜-2,5,8,11,17-五氮雜四十三烷-43-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-010)
步驟一： 將化合物C1.14 (112 mg)溶在N,N-二甲基甲醯胺  (2 ml)中，依次加入三乙胺 (32 mg，0.31  mmol)，1-羥基苯並三唑(17 mg，0.13 mmol)，1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (24 mg，0.13 mmol)，攪拌20分鐘，然後將化合物B1.5 (50 mg) 加入於反應液中，反應液在40 oC下攪拌過夜。向反應液中加入10 ml水，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，旋幹得到粗產品。粗產品用C18柱反相分離純化 (乙腈/0.01 %FA的水溶液： 0 %-55 %)得到白色固體目標化合物2.10A (75 mg，產率46 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1534.0。
步驟二： 將化合物2.10A (75 mg)溶在四氫呋喃和水 (8 ml，1：1)溶液中，加入過氧單磺酸鉀 (211 mg)室溫攪拌反應10小時。向反應液中加入10 ml二氯甲烷，萃取，分液，無水硫酸鈉乾燥，抽濾旋幹得到目標產物2.10B (50 mg，產率65 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1566.2。
步驟三： 將化合物2.10B (50 mg)溶在三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液 (體積比為1：2；4 ml)中，然後反應液在室溫下攪拌1小時。將反應液濃縮得粗產品，粗產品經製備層析 (0.01 % TFAin water，MeCN)得到目標化合物 N-((7S,10S)-7-(4-胺基丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-10-異丙基-3,6,9,12,16-五氧代-14,20,23,26,29,32,35,38,41-九氧雜-2,5,8,11,17-五氮雜四十三烷-43-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (10.5 mg，產率21 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1466.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.12 (s, 2H), 8.62 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.26 – 8.11 (m, 2H), 8.03 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 7.93 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 7.85 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.79 (d, J= 5.6 Hz, 1H), 7.61 (s, 3H), 7.54 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.31 (d, J= 1.7 Hz, 2H), 5.46 (d, J= 17.2 Hz, 4H), 4.76 (dt, J= 14.8, 8.7 Hz, 2H), 4.20 – 4.15 (m, 4H), 4.00 (s, 3H), 3.95 (d, J= 5.5 Hz, 3H), 3.72 – 3.67 (m, 2H), 3.50 (d, J= 3.9 Hz, 30H), 3.41 (s, 3H), 3.25 – 3.19 (m, 4H), 2.76 (d, J= 5.6 Hz, 2H), 2.56 (t, J= 4.9 Hz, 2H), 2.27 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.90 (dd, J= 16.1, 7.4 Hz, 2H), 1.84 – 1.78 (m, 2H), 1.63 (s, 1H), 1.53 – 1.48 (m, 2H), 1.30 (d, J= 7.7 Hz, 2H), 0.87 – 0.84 (m, 4H), 0.78 – 0.75 (m, 6H)。
實施例 2.11：N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-011)
步驟一： 向化合物B1.10 (75 mg)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (3 ml)中依次加入化合物C1.7 (107 mg)，三乙胺 (45 mg)，HOBT (25 mg)和EDCI (35 mg)，在35 ℃下反應4小時。向反應液中加入水 (30 ml)，乙酸乙酯 (30 ml×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到目標化合物2.11A (60 mg ，產率：37 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1084。
步驟二： 向化合物2.11A (60 mg)的二氯甲烷溶液 (4 ml)中加入三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液 (體積比為1：2；4 ml)，在室溫下攪拌反應1小時。將反應液濃縮，粗產品經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %甲酸的水溶液)得到目標化合物N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (9 mg，產率18 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：983.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.08 (s, 2H), 8.34 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.19 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 8.00 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.49 (d, J= 2.8 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.28 (d, J= 1.9 Hz, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.25 – 4.07 (m, 2H), 3.74 – 3.70 (m, 3H), 3.25 (d, J= 12.4 Hz, 3H), 3.08 (d, J= 7.6 Hz, 2H), 2.73 (s, 2H), 2.40 – 2.19 (m, 3H), 2.01 – 1.64 (m, 10H), 1.52 (br s, 4H), 1.34 (br s, 2H), 0.87 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.83 – 0.75 (m, 6H)。
實施例 2.12：(S)-6-胺基-N-(2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-2-異丙基-35-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五醯胺)己醯胺 (DL-012)
步驟一： 將化合物C1.15 (80 mg), 化合物B1.5 (37 mg)，三乙胺 (23 mg，0.231 mo,) 溶於DMF (5 ml)。然後再加入1-羥基苯並三唑(12 mg)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(17 mg)，反應液室溫攪拌16小時，加入50 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到粗產品，粗產品用快速層析法分離純化(DCM ：MeOH = 100 ： 0 到 90 ： 10)得到目標化合物2.12A (75 mg，產率65 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1492.0。
步驟二： 將化合物2.12A (50 mg)溶於四氫呋喃和水的混合溶液 (體積比為1/1；4 ml)中，加入過氧單磺酸鉀(202 mg)，反應液在室溫下攪拌5小時，加入30 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到目標化合物 2.12B (40 mg，產率80 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1524.1。
步驟三： 將化合物2.12B (30 mg)溶在三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液(體積比為1比3；4 ml)中,然後反應液在室溫下攪拌1小時。將反應液濃縮得粗產品，粗產品經prep-HPLC(水含0.01 % 三氟乙酸, 乙腈)純化得到目標化合物(S)-6-胺基-N-(2-((((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-2-異丙基-35-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五醯胺)己醯胺 (9 mg，產率30 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1423.9。
實施例 2.13：N-((13S,16S)-13-(4-(二甲基胺基)丁基)-3-乙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-17-甲基-4,9,12,15-四氧代-6-氧雜-3,8,11,14-四氮雜十八烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-013)
將化合物C1.17 (50 mg)， 化合物B1.2 (58 mg)，三乙胺 (24 mg) 溶於N,N-二甲基甲醯胺 (2 ml)。然後依次加入1-羥基苯並三唑(16 mg)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(22 mg)，反應液室溫攪拌16小時。反應液直接經製備層析(0.01 % 甲酸水溶液， 乙腈)純化得到目標化合物 (21 mg， 產率10 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1113.0； 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.93 (s, 2H), 8.40 – 8.33 (m, 1H), 8.30 – 8.25 (m, 1H), 8.25 – 8.21 (m, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.22 (s, 2H), 5.47 (dd, J= 78.6, 16.4 Hz, 2H), 5.28 – 5.13 (m, 2H), 4.73 – 4.59 (m, 2H), 4.30 – 4.05 (m, 4H), 3.94 – 3.82 (m, 2H), 3.70 – 3.57 (m, 2H), 3.54 – 3.44 (m, 1H), 3.34 (s, 6H), 3.16 – 3.08 (m, 2H), 2.90 (s, 6H), 2.58 – 2.40 (m, 4H), 2.04 – 1.83 (m, 6H), 1.80 – 1.68 (m, 3H), 1.54 – 1.36 (m, 2H), 1.24 – 1.15 (m, 3H), 1.03 – 0.86 (m, 9H)。
實施例 2.14： N-((13S,16S)-13-(4-(N-氧代-N,N-二甲基胺基)丁基)-3-乙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-17-甲基-4,9,12,15-四氧代-6-氧雜-3,8,11,14-四氮雜十八烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-014)
步驟一： 將化合物C1.16 (49 mg), 化合物B1.2 (71 mg)， N,N-二異丙基乙胺 (39 mg) 溶於DMF (5 ml)。然後依次加入1-羥基苯並三唑(16 mg)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(23 mg), 加完後反應液室溫攪拌16小時，加入50 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到粗產品，粗產品用快矽膠柱層析分離純化(DCM ： MeOH = 100 ： 0 到 90 ： 10)得到目標化合物2.14A (61 mg，產率60 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1081.6。
步驟二： 將化合物2.14A (40 mg)溶於四氫呋喃和水的混合溶液 (體積比為1/1；4 ml)中，加入過氧單磺酸鉀(227 mg，0.37  mmol)，反應液在室溫下攪拌5小時，LCMS顯示反應完畢, 加入30 ml乙酸乙酯稀釋，有機相用水洗滌三次 (25 ml x 3)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮除去乙酸乙酯得到粗品化合物 ，粗產品經製備層析(0.01 % 甲酸水溶液, 乙腈)純化得到目標化合物N-((13S,16S)-13-(4-(N-氧代-N,N-二甲基胺基)丁基)-3-乙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-17-甲基-4,9,12,15-四氧代-6-氧雜-3,8,11,14-四氮雜十八烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (9 mg，產率33 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1129.0。
實施例 2.15： N-((13S,16S)-13-(4-(N,N-二甲基胺基)丁基)-3-異丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-17-甲基-4,9,12,15-四氧代-6-氧雜-3,8,11,14-四氮雜十八烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-015)
向化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (42 mg，C1.17)和化合物(S)-2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-異丙基-N-(2-(7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)乙醯胺 (50 mg，B1.11)，的N,N-二甲基甲醯胺 (10 ml)溶液中，依次加入HBTU (31 mg)和二異丙基乙胺 (21 mg)。反應在室溫下攪拌2小時。反應液過濾後經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %三氟乙酸)得到目標化合物N-((13S,16S)-13-(4-(N,N-二甲基胺基)丁基)-3-異丙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-17-甲基-4,9,12,15-四氧代-6-氧雜-3,8,11,14-四氮雜十八烷-16-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (15.2 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1127.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.73 (t, J= 8.7 Hz, 1H), 8.23 – 8.17 (m, 1H), 8.10 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.97 – 7.93 (m, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.36 (s, 2H), 4.66 (d, J= 6.6 Hz, 2H), 4.33 – 4.21 (m, 4H), 4.20 – 4.13 (m, 2H), 3.76 – 3.74 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.40 – 3.38 (m, 1H), 3.30 – 3.21 (m, 2H), 3.04 – 2.95 (m, 2H), 2.76 (s, 3H), 2.74 (s, 3H), 2.39 – 2.31 (m, 2H), 2.00 – 1.74 (m, 6H), 1.68 – 1.49 (m, 4H), 1.37 – 1.27 (m, 2H), 1.23 – 1.16 (m, 6H), 0.89 – 0.82 (m, 9H)。
實施例 2.16： N-((10S,13S)-10-(4-( N,N-二甲基胺基)丁基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de] 吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-14-甲基-1,6,9,12-四氧代-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十五烷-13-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-016)
將化合物N6，N6-二甲基-N2- ( (6- (2- (甲磺醯基)嘧啶-5-基)十六烷基-5-炔醯基)-L-丙醯基)-L-賴胺酸 (C1.17，52.3 mg) 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (2 ml)，然後再依次加入HBTU (38 mg， 0.10 mmol)和N,N-二異丙基乙胺 (26 mg，0.20 mmol)，加完後反應液室溫攪拌30分鐘，然後加入化合物2-胺基-N- ( (2- ( ( (1S，9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H，12H-苯並[de]吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-氧代乙氧基)甲基)乙醯胺 (2.16A，根據CN104755494A中第147-148頁報導的相同方法製備的，63 mg), LCMS檢測反應完成後，反應液直接經製備層析(0.01 % 三氟乙酸水溶液, 乙腈)純化得到目標化合物N-((10S,13S)-10-(4-( N,N-二甲基胺基)丁基)-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de] 吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-14-甲基-1,6,9,12-四氧代-3-氧雜-5,8,11-三氮雜十五烷-13-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (8.1 mg,，產率7 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1085.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.31 (s, 1H), 9.11 (s, 2H), 8.72 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 8.51 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 8.19 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 8.10 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 7.91 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.79 (d, J= 10.9 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.63 – 5.54 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.68 – 4.58 (m, 2H), 4.26 – 4.12 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.73 (d, J= 5.4 Hz, 2H), 3.20 – 3.10 (m, 2H), 3.05 – 2.95 (m, 2H), 2.76 (d, J= 4.7 Hz, 6H), 2.55 – 2.53 (m, 2H), 2.42 – 2.28 (m, 6H), 2.21 – 2.13 (m, 2H), 2.02 – 1.77 (m, 6H), 1.76 – 1.62 (m, 2H), 1.62 – 1.51 (m, 3H), 1.37 – 1.21 (m, 2H), 0.90 – 0.80 (m, 9H)。
實施例 2.17： 叔丁基 ((S)-3-乙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-13-((S)-3-甲基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)丁醯胺基)-4,9,12-三氧代-6-氧雜-3,8,11-三氮雜十七烷-17-基)胺基甲酸酯 (DL-017)
將化合物C1.7 (90.0 mg)，二異丙基乙胺 (68.0 mg)和HATU (100 mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (5 ml)中。隨後加入化合物B1.2 (80 mg)，室溫下反應2小時。LCMS檢測反應完全。向反應液中加入乙酸乙酯 (50 ml)，用飽和食鹽水 (30 ml X 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，濾液減壓濃縮成固體，粗產品經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到黃色固體化合物叔丁基 ((S)-3-乙基-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-13-((S)-3-甲基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)丁醯胺基)-4,9,12-三氧代-6-氧雜-3,8,11-三氮雜十七烷-17-基)胺基甲酸酯 (2.06 mg，產率10.6 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1184.9。
實施例 2.18： N-((11S,14S)-11-(4-(二甲基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-018)
將化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (126 mg) (C1.17)，B1.12 (150 mg)，1-羥基苯並三唑 (49 mg)， 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (69 mg)和二異丙基乙胺 (156 mg， 1.2  mmol)溶在N,N-二甲基甲醯胺 (10 ml)溶液中，反應在40 °C下攪拌12小時。LCMS顯示反應完成。反應液過濾經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到黃色固體化合物N-((11S,14S)-11-(4-(二甲基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-018) (12 mg，產率6.0 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1030.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.62 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.23 – 8.13 (m, 2H), 8.07 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.95 – 7.83 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.64 – 4.53 (m, 2H), 4.28 – 4.20 (m, 1H), 4.19 – 4.11 (m, 1H), 3.76 – 3.69 (m, 2H), 3.50 (t, J= 5.7 Hz, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.23 – 3.19 (m, 2H), 2.67 – 2.62 (m, 2H), 2.57 – 2.54 (m, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.42 – 2.26 (m, 3H), 2.02 – 1.77 (m, 6H), 1.68 – 1.66 (m, 1H), 1.58 – 1.45 (m, 3H), 1.36 – 1.25 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.82 (t, J= 6.3 Hz, 6H)。
實施例 2.19： N-((11S,14S)-11-(4-(二甲基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-019)
將化合物B1.14 (100 mg， 0.186  mmol), 化合物N 6,N 6-二甲基-N 2-((6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)-L-纈胺酸)-L-賴胺酸 (100 mg， 0.191  mmol) 溶於DMF (2 ml)。然後再加入1-羥基苯並三唑(38 mg， 0.280  mmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(53 mg， 0.280  mmol)， 然後再加入三乙胺 (56 mg， 0.559 mmol) 加完後反應液室溫攪拌16小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物N-((11S,14S)-11-(4-(二甲基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (20 mg， 產率10 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1042.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.28 (s, 1H, TFA), 9.10 (s, 2H), 8.64 (br s, 1H), 8.19 (br s, 1H), 8.09 (d, J= 6.4 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.67 – 4.52 (m, 2H), 4.30 – 4.10 (m, 2H), 3.74 (br s, 2H), 3.50 (br s, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.17 – 3.07 (m, 2H), 3.04 – 2.91 (m, 2H), 2.75 (s, 6H), 2.46 – 2.24 (m, 3H), 2.04 – 1.66 (m, 9H), 1.63 – 1.46 (m, 3H), 1.32 – 1.29 (m, 2H), 0.87 – 0.82 (m, 9H)。
實施例 2.20：N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-020)
步驟一： 向化合物B1.13 (75 mg)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (3 ml)中依次加入化合物C1.7 (107 mg)，三乙胺 (45 mg)，HOBT (25 mg)和EDCI (35 mg)，在35 ℃下反應4小時。向反應液中加入水 (30 ml)，乙酸乙酯 (30 ml×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到目標化合物2.20A (76 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1072.5。
步驟二： 向化合物2.20A (60 mg， 0.06  mmol)的二氯甲烷溶液 (2 ml)中，加入三氟乙酸 (1 ml)，在室溫下攪拌反應1小時。LCMS顯示反應完全。將反應液濃縮，經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物N-((S)-1-(((S)-6-胺基-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (43 mg，產率80 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] +：972.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.09 (s, 2H), 8.24 – 8.17 (m, 2H), 8.12 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 7.99 – 7.93 (m, 1H), 7.88 – 7.84 (m, 2H), 7.64 (s, 3H, NH2-TFA), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.25 – 4.18 (m, 1H), 4.15 – 4.11 (m, 1H), 3.76 – 3.71 (m, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.32 – 3.26 (m, 2H), 3.21 – 3.17 (m, 1H), 2.79 – 2.70 (m, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.40 – 2.24 (m, 3H), 1.94 – 1.82 (m, 7H), 1.80 – 1.73 (m, 2H), 1.58 – 1.49 (m, 3H), 1.36 – 1.31 (m, 1H), 1.18 – 1.14 (m, 1H), 0.87 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.80 – 0.76 (m, 6H)。
實施例 2.21：N-((S)-1-(((S)-5-胺基-6-((2-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3] 二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-6-氧代己基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺
步驟一： 將化合物C1.18 (430 mg)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (5 ml)中，然後加入EDCI (160 mg)，HOBT (115 mg )和三乙胺  (214 mg)。加完畢後反應液室溫攪拌20分鐘，然後加入化合物B1.10 (314 mg)，室溫攪拌反應3小時，LCMS檢測反應完全，加水稀釋，乙酸乙酯萃取，有機相濃縮的粗產品2.21A (350 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1084.3。
步驟二： 向化合物2.21A (350 mg)的二氯甲烷溶液 (4 ml)中加入三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液 (體積比為1：2；4 ml)，在室溫下攪拌反應1小時。將反應液濃縮，粗產品經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %甲酸的水溶液)得到目標化合物N-((S)-1-(((S)-5-胺基-6-((2-((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-6-氧代己基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (100 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：984.4； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.69 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 8.14 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 8.08 (s, 3H, NH2-TFA), 7.95 (t, J= 4.9 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 8.9 Hz, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.09 (t, J= 8.1 Hz, 1H), 3.83 (d, J= 5.7 Hz, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.33 – 3.27 (m, 2H), 3.15 – 3.06 (m, 3H), 2.97 – 2.94 (m, 1H), 2.57 – 2.53 (m, 2H), 2.43 – 2.28 (m, 3H), 1.95 – 1.68 (m, 9H), 1.46 – 1.28 (m, 4H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.82 (d, J= 6.7 Hz, 6H)。
實施例 2.22：N-((S)-1-(((S)-5-胺基-6-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基) 丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-6-氧代己基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 DL-022)
步驟一： 將化合物C1.18 (136 mg，0.23  mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (5 ml)中，然後加入EDCI (48 mg，0.25  mmol)，HOBT (34 mg, 0.25  mmol )和三乙胺  (64 mg, 0.63  mmol)。加完畢後反應液室溫攪拌20分鐘，然後加入化合物B1.13 (3105 mg，0.19  mmol)，室溫攪拌反應3小時，LCMS檢測反應完全，加水稀釋，乙酸乙酯萃取，有機相濃縮的粗產品。所得化合物溶於二氯甲烷 (4 ml)中， 然後加入三氟乙酸  (2 ml)，反應1小時後，濃縮，粗產品經製備提純得目標化合物 N-((S)-1-(((S)-5-胺基-6-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基) 丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-6-氧代己基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺  (DL-022) (88 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 972.9； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.72 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 8.23 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 8.17 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 8.11 (s, 3H, NH2-TFA), 7.97 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.93 – 7.86 (m, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.14 – 4.02 (m, 2H), 3.85 – 3.83 (m, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.32 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 3.24 – 3.16 (m, 2H), 3.11 – 2.94 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.35 – 2.30 (m, 3H), 1.92 – 1.69 (m, 10H), 1.43 – 1.29 (m, 4H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.82 (d, J= 6.7 Hz, 6H)。
實施例 2.23：(S)-6-胺基-N-(2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基) 丙基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-2-異丙基-35-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)己醯胺 (DL-023)
步驟一： 向化合物B1.13 (46 mg)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (3 ml)中依次加入化合物2.23A (100 mg)，三乙胺 (50 ul)，HOBT (16 mg)和EDCI (23 mg)，在35 ℃下反應4小時。向反應液中加入水 (30 ml)，乙酸乙酯 (30 ml×2)萃取，有機相用無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到目標化合物2.23B (105 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] +：1358.4。
步驟二： 化合物2.23B  (105 mg)，2-甲磺醯基-5-乙炔基嘧啶 (45 mg)溶於DMSO-水 (2 ml，4：1)中，向混合物中加入溴化亞銅 (50 mg)。反應液室溫下攪拌2小時，然後加入乙酸乙酯 (100 ml)，水洗 (100 ml x 3)，乾燥後減壓除去有機溶劑，粗產物用矽膠柱層析分離得到目標產物2.23C (84 mg)，MS ( m/z)： 1540.8 [M + H] +。
步驟三： 將化合物2.23C溶在三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液 (體積比為1：2；4 ml)中，然後反應液在室溫下攪拌30分鐘。LCMS顯示反應完成。將反應液濃縮得粗產品，粗產品經製備層析 (0.01 % TFA in water, MeCN)得到目標化合物(S)-6-胺基-N-(2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基) 丙基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-2-異丙基-35-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧雜-3,9-二氮雜三十五烷醯胺基)己醯胺 (DL-023, 8 mg，三氟乙酸鹽，產率5 %)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1440.8； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.49 (s, 2H), 8.91 (s, 1H), 8.24 – 8.18 (m, 3H), 8.01 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.96 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 7.90 – 7.84 (m, 2H), 7.63 (s, 3H, TFA salt), 7.32 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.66 (t, J= 5.1 Hz, 2H), 4.21 (dd, J= 15.2, 7.9 Hz, 2H), 3.97 (s, 2H), 3.93 (s, 2H), 3.89 (t, J= 5.1 Hz, 2H), 3.75 – 3.72 (m, 2H), 3.56 – 3.54 (m, 2H), 3.54 – 3.38 (m, 30H), 3.33 – 3.13 (m, 5H), 2.75 (d, J= 7.1 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 2.02 – 1.94 (m, 1H), 1.91 – 1.81 (m, 3H), 1.71 – 1.65 (m, 1H), 1.58 – 1.46 (m, 3H), 1.38 – 1.29 (m, 2H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.81 – 0.75 (m, 6H)。
實施例 2.24：N-((S)-1-(((S)-6-(二甲基胺基)-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-024)
向化合物B1.13 (40 mg，0.081  mmol)和化合物C1.17 (42 mg，0.081 mmol)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (2 ml)溶解中依次加入PyBOP (41 mg，0.081)，DIPEA (20 mg，0.16  mmol)，反應液在室溫下攪拌2小時。LCMS顯示反應完全。反應液經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %三氟乙酸的水溶液)得到化合物N-((S)-1-(((S)-6-(二甲基胺基)-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (11.54 mg，產率14 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] +=1000.6; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.42 (s, 1H), 9.08 (s, 2H), 8.27 – 8.18 (m, 2H), 8.14 (d, J= 6.9 Hz, 1H), 7.96 (t, J= 6.9 Hz, 1H), 7.91 – 7.77 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.15 – 4.12 (m, 1H), 3.81 – 3.65 (m, 3H), 3.41 (s, 3H), 3.33 – 3.25 (m, 2H), 3.22 – 3.15 (m, 2H), 3.03 – 2.95 (m, 2H), 2.77 – 2.71 (m, 6H), 2.38 – 2.23 (m, 3H), 1.92 – 1.81 (m, 7H), 1.78 – 1.73 (m, 2H), 1.62 – 1.56 (m, 3H), 1.38 – 1.29 (m, 2H), 0.92 – 0.84 (m, 3H), 0.84 – 0.72 (m, 6H)。
實施例 2.25：N-((S)-1-(((S)-6-(二乙基胺基)-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-025)
將化合物C1.20 (30 mg, 0.054  mmol), 化合物B1.13 (27 mg，0.054  mmol) 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (2 ml)。然後再依次加入HBTU (22 mg, 0.054  mmol)以及N,N-二異丙基乙胺 (17 mg, 0.135  mmol，加完畢後反應液室溫攪拌30分鐘。LCMS檢測反應完成後，反應液直接經製備層析(0.01 % 三氟乙酸水溶液, 乙腈)純化得到目標化合物N-((S)-1-(((S)-6-(二乙基胺基)-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (23 mg， 產率42 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1028.5； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.08 (s, 2H), 9.02 (s, 1H), 8.21 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 8.13 (d, J= 7.1 Hz, 1H), 7.97 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J= 10.6 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.28 – 4.18 (m, 1H), 4.14 (t, J= 7.7 Hz, 1H), 3.80 – 3.65 (m, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.31 – 3.24 (m, 2H), 3.22 – 3.15 (m, 2H), 3.12 – 3.06 (m, 4H), 3.02 – 2.91 (m, 2H), 2.36 – 2.23 (m, 2H), 1.95 – 1.68 (m, 9H), 1.68 – 1.49 (m, 4H), 1.38 – 1.28 (m, 2H), 1.13 (t, J= 7.2 Hz, 6H), 0.86 (t, J= 7.2 Hz, 3H),0.79 – 0.76 (m, 6H)。
實施例 2.26：N-((S)-1-(((S)-6-(二丙基胺基)-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-026)
將化合物C1.22 (31 mg， 0.054  mmol, 化合物B1.13 (27 mg，0.054  mmol) 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (2 ml)。然後再依次加入HBTU (22 mg， 0.054  mmol)以及N,N-二異丙基乙胺 (17 mg， 0.135  mmol，反應液室溫攪拌30分鐘。LCMS檢測反應完成後，反應液直接經製備層析 (0.01 % 三氟乙酸水溶液，乙腈)純化得到目標化合物N-((S)-1-(((S)-6-(二丙基胺基)-1-((2-((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (25 mg， 產率45 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1056.6；H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.09 (s, 2H), 8.27 – 8.19 (m, 2H), 8.13 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.97 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 7.91 – 7.84 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.24 (d, J= 6.7 Hz, 1H), 4.13 (t, J= 7.8 Hz, 1H), 3.73 (dd, J= 14.7, 5.9 Hz, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.28 (d, J= 6.4 Hz, 2H), 3.19 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.99 (br, 6H), 2.33 – 2.27 (m, 2H), 1.95 – 1.70 (m, 9H), 1.62 – 1.57 (m, 8H), 1.33 – 1.30 (m, 2H), 0.96 – 0.82 (m, 9H), 0.82 – 0.73 (m, 6H)。
實施例 2.27：N-((S)-1-(((S)-6-(二乙基胺基)-1-((2-(((E)-3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺
向化合物B1.15 (40 mg，0.074  mmol)和化合物C1.20 (40 mg，0.072  mmol)的N,N-二甲基甲醯胺溶液 (4 ml)溶解中依次加入HBTU (30 mg，0.079  mmol)、DIPEA (26 mg，0.2  mmol)。反應液室溫下反應1小時。LCMS顯示反應完全。反應液經高效液相製備純化 (乙腈/ 0.05 %三氟乙酸水溶液)得到化合物N-((S)-1-(((S)-6-(二乙基胺基)-1-((2-(((E)-3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)胺基)-2-氧代乙基)胺基)-1-氧代己-2-基)胺基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺  (11.1 mg，產率14 %)。
LCMS (ESI) [M+H] +=1038.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 9.02 (s, 1H, TFA), 8.33 – 8.25 (m, 2H), 8.12 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.68 (d, J= 4.1 Hz, 1H), 7.52 (d, J= 2.8 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.15 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 6.52 – 6.50 (m, 2H), 6.30 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.28 – 5.24 (m, 2H), 4.27 (d, J= 6.2 Hz, 2H), 4.12 (br s, 2H), 3.81 (br s, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.11 – 3.07 (m, 6H), 2.97 (br s, 2H), 2.53 – 2.50 (m, 1H), 2.39 – 2.24 (m, 4H), 1.85 – 1.79 (m, 8H), 1.16 (t, J= 6.4 Hz, 6H), 0.88 (t, J= 6.4 Hz, 3H), 0.78 (d, J= 6.4 Hz, 6H)。
實施例 2.28：(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物C1.19  (40mg，0.06 mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (1.5 ml)，依次加入HBTU (26 mg，0.06  mmol)、B1.14 (36 mg，0.06 mmol)和DIPEA (66 mg，0.17  mmol，室溫攪拌反應1小時。LCMS檢測反應完成，反應液通過製備 (乙腈/ 0.05 %三氟乙酸水溶液)分離純化得到目標化合物(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (13.88 mg，TFA salt產率16 %)為米黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1113.7； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.46 (s, 2H), 9.29 (s, 1H, TFA salt), 8.92 (s, 1H), 8.63 (t, J= 6.6 Hz, 1H), 8.18 (br s, 1H), 8.03 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.64 – 4.55 (m, 2H), 4.46 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 4.28 – 4.20 (m, 1H), 4.15 – 4.09 (m, 1H), 3.76 – 3.71 (m, 4H), 3.53 – 3.48 (m, 4H), 3.44 (s, 3H), 3.10 – 3.08 (m, 2H), 2.97 – 2.95 (m, 2H), 2.75 (d, J= 4.9 Hz, 6H), 2.20 – 2.09 (m, 2H), 1.92 – 1.83 (m, 5H), 1.68 – 1.65 (m, 1H), 1.63 – 1.50 (m, 5H), 0.90 – 0.74 (m, 9H)。
實施例 2.29：(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物C1.21 (58 mg， 0.09 mmol)， 化合物B1.14 (50 mg， 0.09  mmol)溶於DMF (1 ml)，然後再加入HBTU (35 mg， 0.09 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(30 mg， 0.23 mmol), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFAin water, MeCN)純化得到目標化合物(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (14 mg， 產率13 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1141.7；1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 8.98 (s, 1H, TFA), 8.93 (s, 1H), 8.64 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 8.18 (d, J= 5.7 Hz, 1H), 8.03 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.50 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 4.62 – 4.55 (m, 2H), 4.46 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 4.27 – 4.23 (m, 1H), 4.11 – 4.09 (m, 1H), 3.74 (d, J= 5.8 Hz, 2H), 3.49 (t, J= 5.8 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.13 – 3.06 (m, 6H), 3.01 – 2.93 (m, 2H), 2.22 – 2.07 (m, 2H), 1.91 – 1.83 (m, 6H), 1.70– 1.51 (m, 5H), 1.33 – 1.21 (m, 6H), 1.16 (t, J= 7.2 Hz, 6H), 0.87 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.82 – 0.76 (m, 6H)。
實施例 2.30：(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物C1.23 (61 mg, 0.09 mmol)， 化合物B1.14 (50 mg， 0.09  mmol)溶於DMF (1 ml)，然後再加入HBTU (35 mg， 0.09 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(30 mg， 0.23 mmol), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液濃縮得粗產品，粗產品經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (21 mg， 產率19 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1169.8； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 9.01 (s, 1H, TFA), 8.93 (s, 1H), 8.64 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.19 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 8.02 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 4.60 – 4.58 (m, 2H), 4.46 (t, J= 6.9 Hz, 2H), 4.24 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 4.13 – 4.09 (m, 1H), 3.74 (d, J= 5.7 Hz, 2H), 3.49 (t, J= 5.8 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.10 (br s, 2H), 3.02 – 2.95 (m, 6H), 2.19 – 2.15 (m, 2H), 1.88 – 1.86 (m, 6H), 1.71 – 1.69 (m, 1H), 1.61 – 1.56 (m, 8H), 1.28 – 1.26 (m, 6H), 0.88 – 0.83 (m, 9H), 0.81 – 0.78 (m, 6H)。
實施例 2.31：(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物C1.19 (113 mg， 0.19  mmol)， 化合物B1.12 (100 mg， 0.19  mmol)溶於DMF (1 ml)， 然後加入HBTU (72 mg， 0.19  mmol)和N,N-二異丙基乙胺(61 mg， 0.48  mmol)， 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA的水溶液，乙腈)純化得到目標化合物(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (16 mg， 產率8 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1101.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 8.93 (s, 1H), 8.63 (t, J= 6.3 Hz, 1H), 8.20 – 8.28 (m, 2H), 8.04 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.88 (d, J= 10.8 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.63 – 4.54 (m, 2H), 4.46 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 4.29 – 4.19 (m, 1H), 4.15 – 4.08 (m, 1H), 3.73 (d, J= 6.9 Hz, 2H), 3.50 (t, J= 5.8 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.24 – 3.14 (m, 2H), 3.01 – 2.91 (m, 2H), 2.72 (s, 6H), 2.53 (s, 3H), 2.23 – 2.07 (m, 2H), 1.93 – 1.84 (m, 6H), 1.72 – 1.64 (m, 1H), 1.61 – 1.45 (m, 6H), 1.34 – 1.22 (m, 4H), 0.87 (t, J= 7.4 Hz, 3H), 0.82 – 0.76 (m, 6H)。
實施例 2.32：(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物C1.21 (59 mg， 0.10 mmol)， 化合物B1.12 (50 mg， 0.10  mmol)，溶於DMF (1 ml)， 然後再加入HBTU (36 mg， 0.10 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(31 mg, 0.24  mmol), 加完後反應液室溫攪拌1小時，LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % 甲酸溶液， 乙腈)純化得到目標化合物(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (33.8 mg， 產率32 %)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1129.7； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 8.93 (s, 1H), 8.61 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.24 – 8.15 (m, 2H), 8.00 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.85 (d, J= 10.5 Hz, 2H), 7.31 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 4.63 – 4.55 (m, 2H), 4.46 (t, J= 6.8 Hz, 2H), 4.23 – 4.18 (m, 1H), 4.11 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 3.77 – 3.69 (m, 2H), 3.50 (t, J= 5.9 Hz, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.17 – 3.15 (m, 3H), 2.61 (q, J= 6.7 Hz, 4H), 2.22 – 2.10 (m, 2H), 1.92 – 1.84 (m, 6H), 1.68 (d, J= 6.7 Hz, 1H), 1.57 – 1.48 (m, 3H), 1.39 (d, J= 5.9 Hz, 2H), 1.30 – 1.22 (m, 4H), 0.97 (t, J= 6.9 Hz, 6H), 0.88 (t, J= 7.3 Hz, 3H), 0.82 – 0.77 (m, 6H)。
實施例 2.33：(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物C1.23 (62 mg， 0.10  mmol)， 化合物B1.12 (50 mg， 0.10  mmol)溶於DMF (1 ml)， 然後加入HBTU (36 mg， 0.10  mmol)和N,N-二異丙基乙胺(31 mg， 0.24  mmol)， 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析 (0.01 % TFAin water, MeCN) 純化得到目標化合物(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙基氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (35.2 mg， 產率32 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1157.8； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.46 (s, 2H), 9.05 (s, 1H, TFA), 8.93 (s, 1H), 8.64 (t, J= 6.7 Hz, 1H), 8.20 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 8.03 (d, J= 7.2 Hz, 1H), 7.88 (d, J= 10.8 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.62 – 4.55 (m, 2H), 4.46 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 4.24 (m, 1H), 4.13 – 4.07 (m, 1H), 3.74 (m, 2H), 3.50 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.23 – 3.16 (m, 2H), 3.01 – 2.95 (m, 6H), 2.50 (s, 3H), 2.22 – 2.09 (m, 2H), 1.95 – 1.84 (m, 8H), 1.67 – 1.56 (m, 9H), 1.33 – 1.23 (m, 6H), 0.91 – 0.86 (m, 9H), 0.82 – 0.77 (m, 6H)。
實施例 2.34：N-((11S,14S)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-034)
將化合物 (S) -2-胺基-N- ( (3- (4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚並[1,2-b]喹啉-11-基)丙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.12，30 mg, 0.057  mmol), N6，N6-二乙基-N2- ( (6- (2- (甲磺醯基)嘧啶-5-基)十六烷基-5-炔醯基)-L-丙醯基)-L-賴胺酸(C1.20，31 mg， 0.057 mmol)溶於DMF (1 ml)中。然後依次加入HBTU (22 mg， 0.057 mmol)以及N，N-二異丙基乙胺 (18 mg， 0.143  mmol)，加完畢後反應液室溫攪拌一小時。 LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % 的三氟乙酸水溶液， 乙腈)純化得到目標化合物三氟乙酸鹽N-((11S,14S)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (3.18 mg， 產率5 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1058.7；1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.65 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 8.21 - 8.19 (m, 2H), 8.09 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J= 10.8 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.64 – 4.56 (m, 2H), 4.29 – 4.22 (m, 1H), 4.15 (t, J= 7.4 Hz, 1H), 3.74 (d, J= 4.6 Hz, 2H), 3.51 – 3.49 (m, 2H), 3.24 – 3.18 (m, 2H), 3.13 – 3.07 (m, 4H), 3.01 – 2.95 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.40 – 2.31 (m, 3H), 1.99 – 1.74 (m, 8H), 1.65 – 1.49 (m, 4H), 1.38 – 1.25 (m, 2H), 1.16 (t, J= 7.2 Hz, 6H), 0.89 - 0.79 (m, 9H)。
實施例 2.35：N-((11S,14S)-11-(4-(二丙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-035)
將化合物 (S) -2-胺基-N- ( (3- (4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧基-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3'，4'：6,7]吲哚並[1,2-b]喹啉-11-基)丙氧基)甲基)乙醯胺 (B1.12，30 mg， 0.057  mmol)， N2- ( (6- (2- (甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯基)-L-丙醯基)-N6，N6-二丙基-L-賴胺酸 (C1.22，33 mg， 0.057  mmol)溶於DMF (1 ml)中。然後再依次加入HBTU (22 mg， 0.057  mmol)以及N,N-二異丙基乙胺 (18 mg， 0.143  mmol)，加完畢後反應液室溫攪拌一小時。 LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % 的三氟乙酸水溶液， 乙腈)純化得到目標化合物N-((11S,14S)-11-(4-(二丙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-035) (10. 65 mg， 產率16 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1086.7； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.65 (t, J= 6.2 Hz, 1H), 8.28 – 8.16 (m, 2H), 8.08 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J= 10.9 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.63 – 4.52 (m, 2H), 4.31 – 4.19 (m, 1H), 4.19 – 4.08 (m, 1H), 3.74 (d, J= 4.9 Hz, 2H), 3.50 (t, J= 5.2 Hz, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.24 – 3.18 (m, 2H), 3.03 – 2.94 (m, 6H), 2.55 (s, 3H), 2.46 – 2.24 (m, 3H), 2.05 – 1.67 (m, 8H), 1.66 – 1.51 (m, 8H), 1.36 – 1.22 (m, 4H), 0.91 – 0.80 (m, 15H)。
實施例 2.36：N-((11S,14S)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-036)
將化合物C1.20 (40 mg， 0.075  mmol)， 化合物B1.14 (41 mg， 0.075  mmol) 溶於DMF (1 ml)，然後再加入HOBt (15.2 mg， 0.113  mmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (21.5 mg， 0.113  mmol)，然後再加入三乙胺 (23 mg， 0.225 mmol) 加完後反應液室溫攪拌16小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液濃縮得粗產品，粗產品經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN) 純化得到目標化合物N-((11S,14S)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (16 mg， 產率20 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1070.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.13 – 9.08 (m, 2H), 9.01 (s, 1H), 8.64 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 8.20 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.09 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.65 – 4.53 (m, 2H), 4.26 (d, J= 6.5 Hz, 1H), 4.20 – 4.10 (m, 1H), 3.74 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 3.50 (t, J= 5.8 Hz, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.14 – 3.07 (m, 6H), 2.98 (s, 2H), 2.55 (d, J= 7.3 Hz, 2H), 2.41 – 2.29 (m, 2H), 2.03 – 1.89 (m, 2H), 1.89 – 1.77 (m, 7H), 1.61 – 1.56 (m, 2H), 1.32 (s, 2H), 1.16 (t, J= 7.2 Hz, 6H), 0.91 – 0.78 (m, 9H)。
實施例 2.37：N-((11S,14S)-11-(4-(二正丙基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-037)
將化合物C1.22 (43 mg， 0.074  mmol), 化合物B1.14 (40 mg，0.075  mmol)，溶於N, N-二甲基甲醯胺 (1 ml)，然後依次加入HBTU (28 mg, 0.075  mmol)， N,N-二異丙基乙胺 (24 mg， 0.187  mmol)， 反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，反應液直接經製備層析(0.01 % 三氟乙酸水溶液， 乙腈)純化得到目標化合物的三氟乙酸鹽 (8.5 mg， 產率10 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1098.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 9.03 (s, 1H), 8.64 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.19 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.08 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.92 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.49 (s, 1H), 6.29 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.66 – 4.52 (m, 2H), 4.31 – 4.21 (m, 1H), 4.19 – 4.10 (m, 1H), 3.74 (d, J= 5.5 Hz, 2H), 3.49 – 3.48 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.15 – 3.06 (m, 2H), 3.02 – 2.95 (m, 6H), 2.59 – 2.52 (m, 3H), 2.41 – 2.29 (m, 2H), 2.05 – 1.90 (m, 2H), 1.91 – 1.77 (m, 6H), 1.63 – 1.57 (m, 6H), 1.31 – 1.29 (m, 2H), 0.92 – 0.80 (m, 15H)。
採用本實施例中同樣的操作，反應液直接經製備層析(0.1 % 甲酸水溶液，乙腈)純化，凍幹，得到目標化合物的甲酸鹽 (32.6 mg，產率39 %)，為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1098.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.09 (s, 2H), 8.56 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.14 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 7.97 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.89 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.58 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.48 – 5.35 (m, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.64 – 4.54 (m, 2H), 4.23 – 4.07 (m, 2H), 3.79 – 3.66 (m, 2H), 3.50 (t, J= 5.9 Hz, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.14 – 3.08 (t, J= 8.2 Hz, 2H), 2.59 – 2.52 (m, 2H), 2.36 – 2.27 (m, 8H), 2.00 – 1.76 (m, 7H), 1.72– 1.62 (m, 1H), 1.58– 1.48 (m, 1H), 1.40 – 1.20 (m, 8H), 0.88 – 0.77 (m, 15H)。
取DL-037甲酸鹽 (16mg)，通過製備HPLC純化 (0.1 % 碳酸氫銨水，乙腈)，凍幹，得游離態的目標化合物 (DL-037，10mg，產率65 %)，為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1098.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 9.10 (s, 2H), 8.61 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.21 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 8.04 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.95 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.22 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.26 (s, 2H), 5.48 – 5.35 (m, 2H), 5.16 (s, 2H), 4.63 – 4.51 (m, 2H), 4.25 – 4.10 (m, 2H), 3.82 – 3.63 (m, 2H), 3.49 (t, J= 5.8 Hz, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.06 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 2.56 – 2.51 (m, 2H), 2.41 – 2.23 (m, 8H), 1.96 – 1.76 (m, 7H), 1.71 – 1.57 (m, 1H), 1.57 – 1.48 (m, 1H), 1.37 – 1.21 (m, 8H), 0.88 – 0.78 (m, 15H)。
實施例 2.38：(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺
將化合物B1.16 (30 mg， 0.06 mmol)， 化合物C1.23 (37 mg，0.06  mmol)溶於DMF (1 ml)。然後再加入HBTU (21 mg， 0.06 mmol)和N,N-二異丙基乙胺(16 mg， 0.12 mmol), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (4 mg， 產率6 %)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1167.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.45 (s, 2H), 8.98 (s, 1H, TFA), 8.92 (s, 1H), 8.74 (t, J= 6.8 Hz, 1H), 8.25 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 8.05 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.82 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.26 (d, J= 12.0 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 6.58 – 6.52 (m, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.30 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.31 (s, 2H), 4.74 – 4.67 (m, 2H), 4.46 (m, 2H), 4.30 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.77 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.01 – 2.95 (m, 8H), 2.23 – 2.18 (m, 1H), 2.13 (m, 1H), 2.00 (m, 2H), 1.90 – 1.84 (m, 6H), 1.63 – 1.57 (m, 9H), 0.88 (m, 9H), 0.81 – 0.78 (m, 6H)。
實施例 2.39：4-((S)-6-胺基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺)己醯胺基)苄基 N-乙基-N-(2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)胺基甲酸酯
步驟一： 在0°C 冰浴條件下，向C1.24 (150 mg，0.264 mmol)和 三乙胺 (89 mg，0.88 mmol)的二氯甲烷 (10 ml)溶液中加入N，N-琥珀醯亞胺基碳酸酯 (DSC，90 mg，0.352  mmol)，反應在0°C 氮氣下反應30分鐘，隨後滴加化合物A1.6-A (82 mg，0.176  mmol)，反應在室溫下反應12小時。LCMS監測反應完全。反應液減壓濃縮成粗產品，經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到黃色油狀化合物DL-039-A (27 mg，產率：14.4 %)為黃色油狀物。
LCMS (ESI) [M+H] += 1059.2。
步驟二： 向化合物DL-039-A (60 mg，0.057  mmol)的四氫呋喃 (5 ml)和水 (1 ml)的混合溶液中加入過氧單磺酸鉀 (Oxone，349 mg，0.567 mmol)，反應在室溫下攪拌12小時。TLC檢測反應完全。向反應液中加入水 (10 ml)，用二氯甲烷 (10 ml X 3)萃取，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到目標化合物DL-039-B (60 mg，粗產品)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1091.0。
步驟三： 將化合物DL-039-B (60 mg， 0.055 mmol)溶在二氯甲烷 (1 ml)溶液中，0°C下向反應液中加入二氯乙酸 (1 ml)，反應在室溫下攪拌3小時。LCMS顯示反應完成。濾液減壓濃縮成粗產品，經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %三氟乙酸)得到黃色固體化合物4-((S)-6-胺基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺)己醯胺基)苄基 N-乙基-N-(2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)胺基甲酸酯 (2.44 mg，產率3.69 %)。
LCMS (ESI) [1/2M+H] += 496.3， t R= 2.252 min。
實施例 2.40：4-((S)-6-胺基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)己醯胺基)苄基 N-ethyl-N-(2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)胺基甲酸酯(DL-040)
步驟一： 在0°C 冰浴條件下，向C1.25 (300 mg，0.469 mmol)和 三乙胺 (126 mg，1.25 mmol)的二氯甲烷 (10 ml)中加入N，N-琥珀醯亞胺基碳酸酯 (DSC，160 mg，0.626  mmol)，反應在0°C反應30分鐘，隨後滴加化合物A1.6-A (145 mg，0.313  mmol)，然後反應在室溫下反應12小時。LCMS監測反應完全。反應液減壓濃縮成粗產品，經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %甲酸)得到黃色油狀化合物DL-040-A (70 mg，產率：19.8 %)為黃色油狀物。LCMS (ESI) [M+H] += 1130.1。
步驟二： 向化合物DL-040-A (70 mg，0.062 mmol)的四氫呋喃 (5 ml)和水 (1 ml)的混合溶液中加入過氧單磺酸鉀 (Oxone，381 mg，0.619 mmol)，反應在室溫下攪拌12小時。TLC檢測反應反應完全。向反應液中加入水 (10 ml)，用二氯甲烷 (10 ml x 3)萃取，有機相經飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，抽濾，減壓濃縮得到目標化合物DL-040-B (70 mg，粗產品)為黃色固體。LCMS (ESI) [M+H] += 1162.6， t R= 1.710 min。
步驟三： 將化合物DL-040-B (70 mg， 0.060  mmol)溶在二氯甲烷 (1 ml)溶液中，0°C下向反應液中加入二氯乙酸 (1 ml)，反應在室溫下攪拌3小時。LCMS顯示反應完成。濾液減壓濃縮成粗產品，經高效液相製備純化 (乙腈/水含0.05 %三氟乙酸)得到黃色固體化合物4-((S)-6-胺基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)己醯胺基)苄基 N-ethyl-N-(2-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)乙基)胺基甲酸酯 (5.54 mg，產率8.66 %)。
LCMS (ESI) [1/2M+H] += 1062.5, t R= 4.052 min； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.22 (br s, 1H), 9.46 (s, 2H), 8.93 (s, 1H), 8.22 – 8.03 (m, 1H), 7.85 (br s, 3H, NH2-TFA), 7.61 – 7.45 (m, 3H), 7.32 – 7.26 (m, 1H), 7.26 – 7.17 (m, 2H), 6.54 (s, 1H), 6.35 (s, 2H), 5.91 (s, 2H), 5.47 (s, 2H), 5.37 – 5.30 (m, 1H), 5.27 – 5.20 (m, 1H), 5.10 – 5.00 (m, 1H), 4.97 – 4.78 (m, 1H), 4.52 – 4.26 (m, 3H), 3.56 – 3.46 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 2.83 – 2.71 (m, 2H), 2.21 – 2.11 (m, 2H), 1.98 – 1.78 (m, 4H), 1.67 – 1.48 (m, 6H), 1.37 – 1.22 (m, 4H), 1.09 – 0.96 (m, 3H), 0.93 – 0.78 (m, 3H)。
實施例 2.41：(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺(DL-041)
將化合物B1.17 (30 mg), 化合物C1.19 (37 mg)溶於DMF (1 ml)。然後再加入HBTU (21 mg)和N,N-二異丙基乙胺(16 mg), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (11 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1099.5。
實施例 2.42：(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺(DL-042)
將化合物B1.17 (30 mg), 化合物C1.21 (37 mg)溶於DMF (1 ml)。然後再加入HBTU (21 mg)和N,N-二異丙基乙胺(16 mg), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (7 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1127.5。
實施例 2.43：(S)-6-(二丙基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺(DL-043)
將化合物B1.17 (17.5 mg， 0.033 mmol)和化合物C1.23 (22 mg， 0.034  mmol)溶於N, N-二甲基甲醯胺 (2 ml)中，然後依次加入HOBT (7 mg， 0.051 mmol)，EDCI (10 mg， 0.051 mmol)，DIPEA (9 mg， 0.068  mmol)，加畢，反應液室溫攪拌1小時，反應液直接經製備高效液相層析 (0.01 % 三氟乙酸水溶液, 乙腈)純化，製備液冷凍乾燥得到目標化合物(S)-6-(二乙基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (7 mg， 產率18 %)為淡黃色固體產品。
LCMS (ESI) [M+H] += 1155.5。
實施例 2.44：N-((11S,14S,E)-11-(4-(二甲基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(DL-044)
將化合物B1.17 (60 mg)， 化合物C1.17 (80 mg)溶於DMF (2 ml)。然後再加入HBTU (45 mg)和N,N-二異丙基乙胺(35 mg), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物N-((11S,14S,E)-11-(4-(二甲基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (21 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1028.5。
實施例 2.45：N-((11S,14S,E)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(DL-045)
將化合物B1.17 (60 mg)， 化合物C1.20 (80 mg)溶於DMF (2 ml)。然後再加入HBTU (45 mg)和N,N-二異丙基乙胺(35 mg)， 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物N-((11S,14S,E)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (29 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1056.5。
實施例 2.46：N-((11S,14S,E)-11-(4-(二丙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺(DL-046)
將化合物B1.17 (60 mg)， 化合物C1.22 (80 mg)溶於DMF (2 ml)。然後再加入HBTU (45 mg)和N,N-二異丙基乙胺(35 mg)， 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % TFA in water, MeCN)純化得到目標化合物N-((11S,14S,E)-11-(4-(二乙基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (30 mg)。
LCMS (ESI) [M+H] += 1084.2； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.09 (s, 2H), 8.73 (d, J= 6.3 Hz, 1H), 8.30 – 8.24 (m, 2H), 8.05 (m, 1H), 7.94 – 7.88 (m, 2H), 7.38 - 7.33 (m, 2H), 6.67 – 6.60 (m, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.37 (s, 2H), 4.73 (t, J= 6.2 Hz, 2H), 4.34 (d, J= 4.2 Hz, 2H), 4.26 – 4.20 (m, 1H), 4.17 – 4.13 (m, 1H), 3.86 – 3.69 (m, 4H), 3.40 (s, 3H), 2.41 – 2.30 (m, 8H), 2.02 – 1.94 (m, 2H), 1.89 – 1.85 (m, 2H), 1.82 – 1.77 (m, 2H), 1.74 – 1.63 (m, 2H), 1.60 – 1.50 (m, 2H), 1.47 – 1.39 (m, 8H), 0.90 – 0.86 (m, 6H), 0.85 – 0.80 (m, 9H)。
實施例 2.47： N-((11S,14S,E)-11-(4-(二丙基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-047)
將化合物B1.16 (45 mg, 0.08  mmol)， 化合物C1.22 (49 mg， 0.08  mmol)， 溶於DMF (1 ml)。然後再加入HBTU (32 mg， 0.08  mmol)和N,N-二異丙基乙胺 (27 mg， 0.2  mmol), 加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析(0.01 % 三氟乙酸的水溶液， 乙腈)純化得到目標化合物N-((11S,14S,E)-11-(4-(二丙基胺基)丁基)-1-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)-15-甲基-7,10,13-氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-1-烯-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-047，10 mg)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1096.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.10 (s, 2H), 9.05 (s, 1H, TFA), 8.75 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 8.26 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 8.11 (d, J= 7.6 Hz, 1H), 7.93 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.53 (s, 1H), 7.26 – 2.24 (m, 2H), 6.65 – 6.43 (m, 2H), 6.30 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.30 (s, 2H), 4.74 – 4.69 (m, 1H), 4.31 – 4.29 (m, 2H), 4.26 - 424 (m, 1H), 4.19 – 4.12 (m, 1H), 3.79 – 2.76 (m, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.02 – 2.95 (m, 8H), 2.55 (m, 2H), 2.39 – 2.32 (m, 2H), 2.01 – 1.93 (m, 2H), 1.92 – 1.77 (m, 5H), 1.62 – 1.58 (m, 6H), 1.36 – 1.30 (m, 2H), 0.91 – 0.83 (m, 15H)。
實施例 2.48：N-((11S,14S)-11-(4-(二丁基胺基)丁基)-1-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)-15-甲基-7,10,13-三氧代-4-氧雜-6,9,12-三氮雜十六烷-14-基)-6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺 (DL-048)
將化合物C1.26  (50 mg，0.08 mmol)，化合物B1.12 (43 mg，0.08 mmol)溶於N,N-二甲基甲醯胺 (1.5 ml)，然後依次加入DIPEA (26mg，0.21 mmol)，HBTU (31 mg，0.08 mmol)，室溫攪拌反應1小時。LCMS檢測反應完成，反應液直接通過高效製備 (0.01 % 三氟乙酸的水溶液, 乙腈)分離純化得到目標化合物 (13.57 mg)為黃色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1114.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.09 (s, 2H), 9.05 (s, 1H, TFA), 8.64 (t, J= 7.2 Hz, 1H), 8.23 – 8.16 (m, 2H), 8.07 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 7.93 – 7.85 (m, 2H), 7.32 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.44 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.61 - 4.59 (m, 2H), 4.24 – 4.22 (m, 1H), 4.19 – 4.10 (m, 1H), 3.73 – 3.70 (m, 2H), 3.50 (s, 3H), 3.21 – 3.18 (m, 6H), 3.00 – 2.98 (m, 8H), 2.54 (s, 3H), 1.97 – 1.78 (m, 7H), 1.56 – 1.52 (m, 8H), 1.36 – 1.25 (m, 6H), 0.93 – 0.78 (m, 15H)。
實施例 2.49：(S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-049)
將化合物B1.16 (45 mg， 0.08 mmol), 化合物C1.19 (50 mg， 0.08  mmol), 溶於DMF (1 ml)。然後依次加入N,N-二異丙基乙胺 (27 mg， 0.2 mmol)，HBTU (32 mg， 0.08  mmol)， 加完後反應液室溫攪拌1小時，LCMS檢測反應完成後，將反應液直接經製備層析 (0.01 % 的甲酸水溶液，乙腈)純化得到目標化合物 (S)-6-(二甲基胺基)-N-(2-(((((E)-3-((S)-7-乙基-7-羥基-8,11-二氧代-7,8,11,13-四氫-10H-[1,3]二氧雜環戊烷並[4,5- g]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-14-基)烯丙基)氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-049，3 mg)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1111.1； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.45 (s, 2H), 8.92 (s, 1H), 8.69 (t, J= 6.6 Hz, 1H), 8.25 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H, FA), 7.99 (d, J= 7.0 Hz, 1H), 7.83 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.27 (m, 2H), 6.59 – 6.48 (m, 2H), 6.29 (s, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.31 (s, 2H), 4.74 – 4.67 (m, 2H), 4.44 (m, 2H), 4.30 (d, J= 4.8 Hz, 2H), 4.21 (m, 1H), 4.12 (m, 1H), 3.83 – 3.70 (m, 4H), 3.43 (s, 3H), 2.25 (m, 2H), 2.15 (s, 6H), 2.04 – 1.97 (m, 2H), 1.90 – 1.85 (m, 4H), 1.55 – 1.51 (m, 3H), 1.39 – 1.34 (m, 6H), 0.90 – 0.83 (m, 3H), 0.80 (t, J= 7.2 Hz, 6H)。
實施例 2.50： 1-乙基-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-4-((S)-3-甲基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)丁醯胺基)呱啶-4-甲醯胺 (DL-050)
將化合物B1.12 (50 mg， 0.10  mmol)， 化合物C1.27 (50 mg，0.10  mmol)， 溶於DMF (1 ml)。然後依次加入N,N-二異丙基乙胺(30 mg， 0.24  mmol)和HBTU (36 mg， 0.10  mmol)，加完後反應液室溫攪拌1小時， LCMS檢測反應完成後，將反應液經製備層析 (0.01 % FA in water, MeCN)純化得到目標化合物 1-乙基-N-(2-(((3-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)丙氧基)甲基)胺基)-2-氧代乙基)-4-((S)-3-甲基-2-(6-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)己-5-炔醯胺基)丁醯胺基)呱啶-4-甲醯胺 (DL-050，10 mg)為白色固體。
LCMS (ESI) [M+H] += 1028.6； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.08 (s, 2H), 8.42 (s, 1H, FA), 8.18 – 8.15 (m, 4H), 7.98 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 7.86 (d, J= 10.9 Hz, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.72 – 4.63 (m, 1H), 4.53 – 4.45 (m, 1H), 4.07 – 4.06 (m, 1H), 3.79 – 3.69 (m, 1H), 3.58 – 3.55 (m, 2H), 3.55 – 3.48 (m, 5H), 3.21 – 3.16 (m, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.66 – 2.64 (m, 2H), 2.40 – 2.26 (m, 5H), 1.99 – 1.71 (m, 12H), 0.96 (t, J= 7.1 Hz, 3H), 0.93 – 0.85 (m, 9H)。
實施例 2.51： (R)-6-(二甲基胺基)-N-(4-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)苯基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-051)和 (S)-6-(二甲基胺基)-N-(4-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)苯基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-052)
將化合物 A1.18 (40 mg，0.08  mmol)和C1.19 (71 mg，0.12  mmol) 溶於N, N-二甲基甲醯胺 (3 ml)。再加入T 3P (254 mg， 0.40  mmol， 50 %w/w 乙酸乙酯的混合物)，將反應液於室溫下攪拌1小時。LCMS檢測反應完成後，反應液直接經製備層析 (0.01 % 三氟乙酸水溶液， 乙腈) 純化得到目標化合物(R)-6-(二甲基胺基)-N-(4-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)苯基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-051，8.1 mg)和 (S)-6-(二甲基胺基)-N-(4-((S)-4-乙基-8-氟-4-羥基-9-甲基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-11-基)苯基)-2-((S)-3-甲基-2-(6-(4-(2-(甲磺醯基)嘧啶-5-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)己醯胺基)丁醯胺基)己醯胺 (DL-052，8.8 mg)均為白色固體。
DL-051：LCMS (ESI) [M+H] += 1048.2, t R= 1.258 min； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.12 (s, 1H), 9.40 (s, 2H), 8.84 (s, 1H), 8.55 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.05 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.99 – 7.89 (m, 3H), 7.73 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.57 (d, J= 8.7 Hz, 2H), 7.36 (s, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 4.40 (m, 3H), 4.22 – 4.10 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.30 – 2.25 (m, 2H), 2.24 – 2.20 (m, 2H), 2.19 – 2.15 (m, 6H), 2.03 – 1.93 (m, 2H), 1.92 – 1.78 (m, 6H), 1.72 – 1.66 (m, 1H), 1.61 – 1.54 (m, 2H), 1.48 – 1.42 (m, 2H), 1.30 – 1.26 (m, 2H), 0.91 – 0.86 (m, 9H)。
DL-052：LCMS (ESI) [M+H] += 1048.2, t R= 1.283 min； 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.34 (s, 1H), 9.45 (s, 2H), 8.94 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.99 – 7.85 (m, 4H), 7.75 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.59 (m, 2H), 7.36 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 4.52 – 4.42 (m, 3H), 4.25 – 4.17 (m, 1H), 3.44 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.30 – 2.13 (m, 8H), 2.05 – 1.97 (m, 2H), 1.95 – 1.81 (m, 7H), 1.60 – 1.55 (m, 2H), 1.50 – 1.44 (m, 2H), 1.33 – 1.28 (m, 4H), 0.95 – 0.83 (m, 9H)。 三、抗體製備與鑒定
實施例 3 、抗 Napi2b 抗體製備
3.1 抗原的製備
(1) 抗原製備：人Napi2b (h.Napi2b)的胺基酸序列參考UniProt蛋白資料庫中的O95436，其第二個胞外環為234 aa-362 aa；人Napi2a的胺基酸序列參考UniProt蛋白資料庫中的Q06495；人Napi2c的胺基酸序列參考UniProt蛋白資料庫中的Q8N130。食蟹猴Napi2b (c.Napi2b)的胺基酸序列參考UniProt蛋白資料庫中的A0A2K5UHY1，其第二個胞外環為234 aa-362 aa。大鼠Napi2b (r.Napi2b)的胺基酸序列參考UniProt蛋白資料庫中的Q9JJ09，其第二個胞外環為235 aa -363 aa。以上胺基酸序列經由密碼子優化，全長序列合成於慢病毒載體pLVX上或者pCDNA3.4載體上，第二個胞外環序列合成於pTT5-hFc(hFc：SEQ ID No：85)及pTT5-mFc(mFc：SEQ ID No：86)上。
將包含第二個胞外環的pTT5-hFc或pTT5-mFc質粒通過PEImax (Polysciences，24765-1)暫態轉染HEK293-EBNA細胞，表達7天后通過ProA填料 ( GE，Mabselect XL)純化獲得人 (h.)Napi2b-mFc/Napi2b-hFc、食蟹猴 (c.)Napi2b-mFc/Napi2b-hFc及大鼠 (r.)Napi2b-mFc/Napi2b-hFc抗原。
(2) 細胞系構建：通過慢病毒包裝系統製備病毒，獲得病毒後感染CHO細胞、HT29細胞或HEK293T細胞，通過嘌呤黴素篩選，獲得分別過表達人Napi2a/b/c的穩定細胞系，分別為CHO-h.Napi2b細胞、HT29-h.Napi2b細胞、HEK293T-h.Napi2a細胞、HEK293T-h.Napi2c細胞。
3.2 小鼠免疫及免疫效價檢測
選用CD1 (維通利華)、KM (維通利華)、Balb/c (集萃藥康)品系各 4只小鼠，均為雌性，6周齡左右入組。採用CHO-h.Napi2b細胞及pCDNA3.4-h.Napi2b質粒進行一次初始免疫和兩次加強免疫，結束後對小鼠眼眶靜脈采血。
2次加強免疫過後，通過ELISA檢測血清效價。檢測方法如下：實驗前一晚用CBS包被液包被人Napi2b-hFc抗原，包被濃度1 u g/ ml，體積100 ul，4℃包被過夜；第二天去除包被液，每孔用300 ul PBS洗一次，每孔加入100 ul 2 % BSA  (Biotopped，A6020) (in PBS)，37℃封閉2小時；用2 % BSA (in PBS)稀釋血清，500倍起始，3倍稀釋，11個濃度點，稀釋後取100 ul加入板中，37℃孵育2小時；去除上清，每孔用300 ul PBST洗三次，每孔加入100 ul抗小鼠HRP二抗 (Jackson，115-035-003) (in 2 % BSA)，37℃孵育1小時；去除二抗，每孔用300 ul PBST洗五次，隨後每孔加入100 ul TMB底物 (湖州英創，TMB-S-004)，顯色5-20分鐘；每孔加入50 ul 2N HCl終止反應，微量盤檢測儀 (廠家：MD，型號：SpectraMax)讀取OD450nM讀數，導入到 GraphPad軟體進行擬合，根據檢測結果對CD1、KM、Balb/c各選取一隻小鼠進行雜交瘤融合。
3.3 雜交瘤融合篩選
雜交瘤融合：取小鼠脾臟、淋巴結製備細胞懸液，與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞1：1比例進行混合，採用細胞電融合緩衝液進行重懸，使用BTX-ECM2001進行電融合反應。完全融合培養基 (RPMI160+15 %FBS +1×HAT)重懸，2萬-2.5萬每孔分至96孔細胞培養板中，37℃、5 % CO2培養7天后進行篩選。共進行2輪融合，第一輪融合85板，第二輪融合40板。
母株篩選：通過人Napi2b-hFc蛋白進行ELISA初篩，實驗方法如上所述，初篩後挑選出陽性雜交瘤株。通過包被人、食蟹猴、大鼠Napi2b-hFc進行ELISA複篩，並採用Napi2b陽性腫瘤細胞OVCAR3進行細胞ELISA複篩。最後選出陽性株用於亞株。通過上述方法，第一輪融合選出22個母株進行亞株，第二輪融合選出16個母株進行亞株。
亞株篩選：先後通過包被人、食蟹猴、大鼠Napi2b-hFc進行ELISA篩選及通過進行細胞ELISA篩選，實驗方法如上文所述。每板選取1-3個共43個陽性株用無血清培養基放大培養。
3.4 鼠源抗體評價和序列釣取
採用無血清培養基培養雜交瘤細胞，收集的單株上清，通過ProA填料進行純化，獲得鼠源抗體。先後通過包被人Napi2b-hFc、食蟹猴Napi2b-hFc、大鼠Napi2b-hFc及OVCAR3進行ELISA和細胞ELISA評價，實驗方法如上文所述，鼠源抗體按照10 ug/ ml起始，3倍稀釋，11個濃度點，共評價39個鼠源抗體。部分高親和力的單株鼠源抗體進行Elisa和細胞親和力測定結果如表1所示。 表1.部分鼠源抗體的親和力測定
株號 h.Napi2b-hFc EC50 (ng/ ml) c.Napi2b-hFc EC50 (ng/ ml) r.Napi2b-hFc EC50 (ng/ ml) OVCAR3 細胞ELISA EC50 (ng/ ml)
16 G5B3 11.69 5.14 8.63 13.46
60A12B3 5.89 3.12 5.44 14.23
22H9C4 4.28 4.09 7.72 10.48
66C12D12 3.01 1.70 2.71 6.80
34F2A10 7.11 6.35 7.02 15.80
對選取親和力高的單株釣取序列，方法為：候選雜交瘤細胞收集約1×10 5個，通過Trizol提取RNA，然後使用PrimeScript RT rea gent試劑盒通過PolyA進行反轉錄獲得cDNA；分別於重鏈、輕鏈上游設計上游引物，重鏈CH1區域、輕鏈CL區域設計下游引物。通過PCR擴增產物，通過瓊脂糖膠回收試劑盒進行片段回收；送樣北京擎科生物技術有限公司進行測序。其中5株號為16 G5B3、60A12B3、22H9C4、66C12D12和34F2A10，對它們的鼠源抗體16 G5B3、60A12B3、22H9C4、66C12D12和34F2A10分別測序，鼠源抗體可變區及CDR具體序列見序列資訊表。
3.5 抗體人源化
採用CDR grafting的方法，首先將通過常規BLAST方法，找到同原始鼠源序列同源性最高的人 germline序列，作為範本；將鼠源抗體的CDR移植到人源範本上，構建成嵌合體；根據結構分析鼠源抗體中能保留其原始構象的FR胺基酸，將嵌合體中相應的胺基酸回復突變為鼠源胺基酸以保持原有親和力；將構建的人源化抗體進行計算及免疫原性分析，找到高免疫原性片段，進行低免疫原性片段的替換。對鼠源抗體16 G5B3進行人源化獲得人源化可變區16 G5B3-hz1和16 G5B3-hz2。對鼠源抗體60A12B3、22H9C4、66C12D12和34F2A10分別進行人源化獲得人源化可變區60A12B3-hz1、22H9C4-hz1、66C12D12-hz1和34F2A10-hz1。各人源化抗體可變區及CDR具體序列見序列資訊表，其中CDR按IMGT和Kabat定義方式提供。
3.6 抗 Napi2b 人源化抗體表達
將各人源化抗體的重鏈可變區分別與重鏈I g G1恒定區 (SEQ NO：70)連接，各人源化抗體的輕鏈可變區分別與Kappa恒定區 (SEQ NO： 80)連接，抗體C1 (簡稱C1，重、輕可變區序列來自於IMGT，ID：478)的重輕鏈可變區分別與I g G1恒定區 (SEQ NO：70)、Kappa恒定區 (SEQ NO： 80)連接)，連接獲得的胺基酸序列提交給通用生物進行基因合成，進行密碼子優化後，構建到PTT5載體上，質粒合成好後，通過PEImax轉染HEK293E細胞，表達7天左右，離心收集上清。上清採用ProA填料進行純化。純化好的抗體全部超濾到PBS緩衝液，測定濃度，-20度保存。
人源化可變區16 G5B3-hz1、16 G5B3-hz2，60A12B3-hz1、22H9C4-hz1、66C12D12-hz1和34F2A10-hz1連接後表達獲得的抗體分別命名為16 G5B3-hz1抗體、16 G5B3-hz2抗體，60A12B3-hz1抗體、22H9C4-hz1抗體、66C12D12-hz1抗體和34F2A10-hz1抗體。各人源化抗體恒定區及重輕鏈序列見序列資訊表。
實施例 4 、抗 Napi2b 抗體的鑒定
4.1 人源化抗體 ELISA 親和力評價
(1) ELISA法：按1 u g/ ml用CBS包被抗原蛋白h.Napi2b-mFc、r.Napi2b-mFc及c.Napi2b-mFc，2 % BSA (in PBS)37°C封閉2小時，加入梯度稀釋的抗體 (10 u g/ ml起始，3倍稀釋，11個濃度點)，37°C孵育2小時，加入HRP標記的抗人二抗 (Jackson，109-035-088)，37°C孵育1小時，加入TMB底物顯色，用2M HCl終止後上機讀取450 nM吸光值。
(2) 細胞ELISA法：胰酶消化離心收集OVCAR3細胞，培養基重懸細胞，每孔5^10 4個細胞鋪至96孔板中過夜，4 %多聚甲醛固定細胞，2 % BSA (in PBS)37°C封閉2小時，加入梯度稀釋的抗體 (10 u g/ ml起始，3倍稀釋，11個濃度點)，37°C孵育2小時，加入HRP標記的抗人二抗 (Jackson，貨號109-035-088)，37°C孵育1小時，加入TMB底物顯色，用2M HCl終止後上機讀取450 nM吸光值。
實驗結果如表2所示，16 G5B3-hz2抗體、22H9C4-hz1抗體、66C12D12-hz1抗體與人、大鼠、食蟹猴Napi2b蛋白及內源性表達Napi2b的OVCAR3細胞均具有較高親和力。 表2. 人源化抗體ELISA親和力評價
抗體 h. Napi2b EC50 (ng/ ml) c.Napi2b EC50 (ng/ ml) r.Napi2b EC50 (ng/ ml) OVCAR3 細胞ELISA EC50(ng/ ml)
60A12B3-hz1 結合弱 / / /
16 G5B3-hz1 結合弱 2748 3685 結合弱
16 G5B3-hz2 53.99 57.63 27.07 49.89
22H9C4-hz1 44.76 40.96 22.74 30.86
34F2A10-hz1 90.24 結合弱 1575 65.56
66C12D12-hz1 64.7 109.5 47.3 20.83
C1 54.23 291.8 結合弱 240.7
*：/代表未檢測
4.2 人源化抗體流式親和力評價胰酶消化離心收集OVCAR3細胞，預冷PBS洗三次，1 %BSA (in PBS)重懸細胞，每孔1^10 5個細胞鋪至96孔尖底板中，加入梯度稀釋抗體 (20 ug/ ml起始，4倍稀釋，8個濃度點)，4℃孵育1小時，預冷PBS洗三次後每孔加入1 ul抗人APC螢光二抗 (BioLegend，貨號410712)，4℃孵育0.5小時，預冷PBS洗三次後重懸細胞流式細胞儀 (Sony，LE-SA3800 GA)檢測。
實驗結果如圖1所示，16 G5B3-hz2抗體、66C12D12-hz1抗體與OVCAR3細胞均具有較高親和力，EC50分別為560.9 ng/ ml和957.9 ng/ ml，且均優於C1抗體。
4.3 人源化抗體動態親和力評價
通過ForteBio測定人源化抗體的動態親和力。實驗步驟如下：1. 感測器準備：取出ProA感測器，用PBST稀釋液 (PH7.4)將感測器預濕10min；2. 樣品稀釋：將需要固化的抗體用生物素標記後稀釋至5 ug/ ml，抗原h.Napi2b-mFc和c. Napi2b-mFc從500 nM起始，2倍稀釋，5個濃度點，設置0濃度點；3. 設置程式，放入感測器板和樣品板，開始程式，感測器用20 mM 甘胺酸溶液 (pH 1.7)再生；4. 使用Octet分析軟體分析資料，實驗結果如表3所示，16 G5B3-hz2抗體、66C12D12-hz1抗體與人、猴Napi2b均有較高親和力。 表3. 人源化抗體動態親和力檢測
抗體 h.Napi2b-mFc c. Napi2b-mFc
KD (M) ka (1/Ms) kdis (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kdis (1/s)
16 G5B3-hz2 1.44E-11 2.46E+04 3.56E-07 4.11E-09 5.35E+04 2.20E-04
66C12D12-hz1 8.54E-10 2.66E+04 2.27E-05 1.59E-08 3.09E+04 4.91E-04
C1 8.54E-10 2.66E+04 2.27E-05 6.55E-08 1.99E+04 1.30E-03
4.4 人源化抗體非特異性評價
胰酶消化離心收集HEK293T-h.Napi2a、HEK293T-h.Napi2c細胞，預冷PBS洗三次，1 %BSA (in PBS)重懸細胞，每孔3^10 5個細胞鋪至96孔尖底板中，加入50 ug/ ml待檢測抗體4℃孵育1小時，預冷PBS洗三次後每孔加入1 ul抗人APC螢光二抗，4℃孵育0.5小時，預冷PBS洗三次後重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。
實驗結果如表4所示，16 G5B3-hz2抗體、22H9C4-hz1抗體及66C12D12-hz1抗體均不會非特異識別人Napi2a、Napi2c。 表4.人源化抗體非特異性結合檢測
抗體 HEK293T-h.Napi2a HEK293T-h.Napi2c
陽性率 APC-Mean APC-Median 陽性率 APC-Mean APC-Median
空白對照 0.10 % 955.9 765.7 0.39 % 812.3 715.1
16 G5B3-hz2 0.19 % 1144.6 916.2 0.54 % 927.9 822.2
22H9C4-hz1 0.19 % 1634.1 1382.6 0.46 % 1045.9 951.3
66C12D12-hz1 0.30 % 1405.1 1186.4 1.17 % 1262.5 1148.2
C1 0.59 % 1443.3 1117.5 0.14 % 1071.6 972.1
4.5 人源化抗體內吞活性評價
胰酶消化離心收集HCC4006細胞 (南京科佰)，用濃度為10 u g/ ml的待檢測抗體4℃孵育1小時，PBS洗3次，用RPMI 1640+10 % FBS重懸細胞，分成3份分別在37℃孵育0、2、4小時，PBS洗三次後加入1 ul抗人APC螢光二抗，4℃孵育0.5小時，PBS洗三次後重懸細胞上機。按照以下公式計算內吞率：內吞率 (%)=｛1－ (該時間點檢測樣品平均螢光值－該時間點陰性對照樣品平均螢光值)/ (0小時檢測樣品平均螢光值－0小時陰性對照樣品平均螢光值)｝*100。
實驗結果如表5和圖2所示，16 G5B3-hz2抗體、66C12D12-hz1抗體有很強的內吞活性，並且隨著時間延長，內吞率也增加。 表5. 人源化抗體內吞率檢測
   時間 抗體 0h 2h 4h
16 G5B3-hz2 0 90.4 % 94.8 %
66C12D12-hz1 0 92.3 % 94.6 %
4.6 人源化抗體血清穩定性評價
(1) 樣品處理：用人血清將人源化候選抗體16 G5B3-hz2、66C12D12-hz1稀釋至20 u g/ ml，0.22um濾器過濾除菌，每個候選設置3個時間點分別為第1天、8天、15天，每管500ul，封口膜封口後置於37℃培養箱，分別於第1天、8天、15天收樣至-80℃冰箱保存。
(2) ELISA法：按1u g/ ml用CBS包被抗原蛋白h.Napi2b-mFc，2 % BSA (in PBS)37°C封閉2小時，加入梯度稀釋的抗體，37°C孵育2小時，加入HRP標記的抗人二抗，37°C孵育1小時，加入TMB底物顯色，用2M HCl終止後上機讀取450nM吸光值。
實驗結果如圖3A和3B所示，16 G5B3-hz2抗體與66C12D12-hz1在血漿中第1天、8天、15天親和力無明顯變化，具有良好的血清穩定性。 四、包含細胞生物活性分子和連接體的化合物與抗體的偶聯
實施例 5 ： Napi2b-ADC 的製備
實施例 5.1 Napi2b-ADC-07 的製備
其中Tb為Napi2b抗體 (包括下述的66C12D2-hz1，16 G5B3-hz2，C1等)，q為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
5.1.1. Napi2b -ADC-07 (DAR8) 樣品製備
將抗Napi2b抗體66C12D2-hz1 30 mg，用稀釋液 (20 mM PB，pH 7.5)稀釋，加入終濃度為1mM的依地酸鈉溶液，混勻；加入抗體5.75倍當量的TCEP溶液，混勻，室溫放置90分鐘；向上述溶液體系加入抗體12倍當量的溶解於二甲基亞碸中的DL-037，混勻，室溫靜置2小時，得到偶聯後樣品，反應結束後使用30KDa的超濾管將樣品置換到pH為6.0的20mM組胺酸緩衝液中並去除低分子物質，最後將樣品濃縮以獲得含有抗 Napi2b抗體66C12D2-hz1 ADC組合物的溶液 66C12D2-hz1- ADC07(DAR8)。利用質譜法測定DAR值，層析條件：層析管柱：PLRP-S，2.1*50mm，5 µm；流動相A：0.1 %FA /H 2O; 流動相B：0.1 %FA/ACN ；柱溫：30℃ 樣品室溫度：8℃ 流速：0.6 ml/min 進樣量：2 ul。 表6.流動相梯度
時間 (min) 1 5 5.1 7 10
流動相A 90 40 10 90 90
流動相B 10 60 90 10 10
樣品處理：分別取樣品50 µg，加入1M DTT 2 ul，加超純水至50 ul稀釋至約1.0 mg/ ml濃度，混勻，室溫還原30 min。
LC/MS型號：A gilent 1290-6545XT Q-TOF。
質譜條件： Gas temp：320℃，Dryin g Gas： Nebulizer ：35 psi；Sheath Gas Temp ：350℃；sheath Gas Flow ：11 l/min；m/z 500~3000。
結果如下所示： 表7 66C12D2-hz1- ADC07(DAR8) 理論分子量及實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3
LC 理論值 23379.91 24397.31 NA NA
實測值 未檢出 24394 未檢出 未檢出
HC 理論值 50280.5 51297.9 52315.3 53332.7
實測值 未檢出 51297 52312 35328
表中，mAb表示未偶聯的單株抗體；LC代表抗體輕鏈；HC代表抗體重鏈；DAR1代表包含輕鏈或重鏈偶聯1個毒素分子的偶聯物；DAR2代表包含輕鏈或重鏈偶聯2個毒素分子的偶聯物；DAR3代表包含輕鏈或重鏈偶聯3個毒素分子的偶聯物；其中，單抗理論分子量以 G0F糖型計算。下文中mAb、LC、HC、DAR1、DAR2、DAR3如上說明。
66C12D2-hz1- ADC07(DAR8)樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子 (LC，DAR1比例分別為0 %，100 %)、重鏈偶聯0~3個毒素分子 (mAb、DAR1、DAR2、DAR3的比例分別為0 %，1 %，1 %，98 %)，由此計算66C12D2-hz1- ADC07(DAR8)樣品偶聯比 (DAR值)為8.0。根據重輕鏈偶聯不同個數毒素分子的情況可推知，q可為4,5,6,7,8。
利用上述相同的方法，將66C12D2-hz1替換為16 G5B3-hz2，獲得含有抗 Napi2b抗體16 G5B3-hz2 ADC組合物的溶液 16 G5B3-hz2- ADC07(DAR8)。
5.1.2 Napi2b -ADC-07 (DAR6) 樣品製備
將抗Napi2b抗體16 G5B3-hz2 30 mg，用稀釋液 (20 mM PB，pH 7.5)稀釋，加入終濃度為1mM的依地酸鈉溶液，混勻；加入抗體5.75倍當量的TCEP溶液，混勻，室溫放置90分鐘；向上述溶液體系加入抗體7.0倍當量的溶解於二甲基亞碸中的DL-037，混勻，室溫靜置2小時，得到偶聯後樣品，反應結束後使用30 KDa的超濾管將樣品置換到pH為6.0的20 mM組胺酸緩衝液中並去除低分子物質，最後將樣品濃縮以獲得含有抗 Napi2b抗體16 G5B3-hz2 ADC組合物的溶液16 G5B3-hz2- ADC07(DAR6)。採用7.1.1中相同質譜法測定結果如下 表8. 16 G5B3-hz2- ADC07(DAR6)理論分子量及實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3
LC 理論值 23449.1 24466.5 NA NA
實測值 23445 24463 未檢出 未檢出
HC 理論值 50207.4 51224.8 52242.2 53259.6
實測值 未檢出 51218 52237 53255
16 G5B3-hz2- ADC07(DAR6)樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子 (LC，DAR1比例分別為18 %，82 %)、重鏈偶聯0~3個毒素分子 (mAb、DAR1、DAR2、DAR3的比例分別為0 %，11 %，28 %，60 %)，由此計算16 G5B3-hz2- ADC07(DAR6)樣品DAR值為6.6。根據重輕鏈偶聯不同個數毒素分子的情況可推知，q可為2,3,4,5，6,7,8。
利用上述相同的方法，將16 G5B3-hz2替換為66C12D2-hz1，獲得含有抗 Napi2b抗體66C12D2-hz1 ADC組合物的溶液 66C12D2-hz1-ADC07(DAR6)。
5.1.3 Napi2b -ADC-07 (DAR1) 樣品製備
將抗Napi2b抗體16 G5B3-hz2 30 mg，用稀釋液 (20 mM PB，pH 7.5)稀釋，加入終濃度為1mM的依地酸鈉溶液，混勻；加入抗體5.75倍當量的TCEP溶液，混勻，室溫放置90分鐘；向上述溶液體系加入抗體1.5倍當量的溶解於二甲基亞碸中的DL-037，混勻，室溫靜置2小時，得到偶聯後樣品，反應結束後使用30 KDa的超濾管將樣品置換到pH為6.0的20 mM組胺酸緩衝液中並去除低分子物質，最後將樣品濃縮以獲得含有抗 Napi2b抗體16 G5B3-hz2 ADC組合物的溶液16 G5B3-hz2- ADC07 (DAR1)。採用7.1.1中相同質譜法測定結果如下： 表9 16 G5B3-hz2- ADC07 (DAR1)理論分子量及實測分子量
肽鏈 mAb DAR1 DAR2 DAR3
LC 理論值 23449.1 24466.5 NA NA
實測值 23445 未檢出 未檢出 未檢出
HC 理論值 50207.4 51224.8 52242.2 53259.6
實測值 50200 51218 52237 未檢出
16 G5B3-hz2- ADC07 (DAR1)樣品輕鏈偶聯0~1個毒素分子 (LC，DAR1比例分別為0 %，100 %)、重鏈偶聯0~3個毒素分子 (mAb、DAR1、DAR2、DAR3的比例分別為56 %，32 %，12 %，0 %)，由此計算16 G5B3-hz2- ADC07 (DAR1)樣品偶聯比 (DAR值)為1.1。根據重輕鏈偶聯不同個數毒素分子的情況可推知，q可為2、3、4、5、6、7、8。
利用上述相同的方法，將16 G5B3-hz2替換為66C12D2-hz1，獲得含有抗 Napi2b抗體66C12D2-hz1 ADC組合物的溶液 66C12D2-hz1- ADC07(DAR1)。
實施例 5.2 ： Napi2b-ADC-04 的製備
其中Tb為Napi2b抗體，q為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
利用5.1.1相同的方法，將DL-037替換為DL-019，製備有抗 Napi2b抗體-ADC組合物的溶液。
實施例 5.3 ： Napi2b-ADC-06 的製備
其中Tb為Napi2b抗體，q為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
利用5.1.1相同的方法，將DL-037替換為DL-036，製備有抗 Napi2b抗體-ADC組合物的溶液。 五、生物活性分子體外生物活性測定
實施例 6.1 ：生物活性分子對體外細胞活性的抑制活性檢測一
首先培養腫瘤細胞；將本公開的生物活性分子與腫瘤細胞進行共培養，然後添加CCK8試劑 (東仁化學科技有限公司，Cat：CK04, Lot：JJ744)，用微量盤檢測儀 (廠家：Molecular Devices, 型號：SpectraMax M2)讀數 (檢測波長為450 nm)，檢測線粒體內的脫氫酶的活性，以評價生物活性分子對細胞增殖的抑制作用。腫瘤細胞來源見表10。 表10
細胞名稱 腫瘤類型 來源
NCl-H358 人非小細胞肺癌 ATCC，CRL-5807
HT29 人結腸癌細胞 ATCC，HTB-38
LS174T 人結腸腺癌細胞 ATCC，CL-187
NCl-H322M 人非小細胞肺癌 ATCC
PANC-1 人胰腺癌腫瘤細胞 ATCC，CRL-1469
HCC1806 乳腺癌 南京科佰生物
體外細胞活性檢測方法：用對應檢測培養基 (含2 % FBS)稀釋生物活性分子 (12個濃度梯度)。使用胰酶通過常規方法對腫瘤細胞進行消化，收集管細胞數，用對應的檢測培養基 (含2 % FBS)重懸。將稀釋的生物活性分子加入96孔板中，再加入細胞。然後每孔加入CCK8試劑20μL，反應至4小時，微量盤檢測儀讀數 (檢測波長為450nm)。實驗結果如表11.1,11.2,11.3,11.4,11.5和11.6所示。
參照CN104755494B製備獲得DXD，具體結構如下， 表11.1 生物活性分子對NCl-H358細胞殺傷結果
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.10 NCl-H358 8.11
DXD 39.02
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.8D NCl-H358 7.919
A1.15a 3.882
DXD 21.43
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.4 NCl-H358 29.91
A1.8 296.4
A1.9 60.79
A1.11 202.9
A1.12 167.1
A1.13 49.19
A1.14 122.6
DXD 148.45±10.87 (n=4)
表11.2 生物活性分子對HT29細胞殺傷結果
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.10 HT29 5.965
DXD 49.47
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.15a HT29 3.574
A1.15b 47.52
DXD 64.84
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.4 HT29 29.45
A1.8 367.1
A1.9 57.5
A1.11 284.5
A1.12 211.8
A1.13 96.85
A1.14 155.9
DXD 301.875±69.00 (n=4)
表11.3 生物活性分子對LS174T細胞殺傷結果
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.15a LS174T 19.49
A1.15b 44.62
DXD 82.05
表11.4 生物活性分子對NCl-H322M細胞殺傷結果
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.9 NCl-H322M 30.45
DXD 76.89
表11.5 生物活性分子對PANC-1細胞殺傷結果
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.9 PANC-1 94.54
DXD 966
表11.6 生物活性分子對HCC1806細胞殺傷結果
名稱 細胞名稱 EC 50(nM)
A1.9 HCC1806 (7500細胞/孔，3天) 1.9
Dxd 37
測試結果表明，本公開的生物活性分子具有腫瘤細胞殺傷作用。
實施例 6.2 ：生物活性分子對體外細胞活性的抑制活性檢測二
首先培養腫瘤細胞NUC G-4，PC-9，HT29，NCI-H358，KYSE520，A431和A549；將本公開的生物活性分子或片段與腫瘤細胞進行共培養，然後添加CCK8試劑 (東仁化學科技有限公司，Cat：CK04, Lot：JJ744)，用微量盤檢測儀 (廠家：Molecular Devices, 型號：SpectraMax M2)讀數 (檢測波長為450nm)，檢測線粒體內的脫氫酶的活性，以評價生物活性分子對細胞增殖的抑制作用。腫瘤細胞來源見表12。 表12.腫瘤細胞來源
細胞名稱 腫瘤類型 來源
NUC G-4 胃癌 南京科佰
PC-9 肺腺癌 ATCC
HT29 結腸癌 ATCC，HTB-38
NCI-H358 非小細胞肺癌 ATCC，CRL-5807
KYSE520 食管癌 ATCC
A431 人皮膚鱗狀癌 (人表皮癌)細胞 ATCC
A549 非小細胞肺癌 ATCC
體外細胞活性檢測方法：使用胰酶通過常規方法對腫瘤細胞進行消化，收集管細胞數，用對應的檢測培養基 (含2 % FBS)重懸，將5000-10000細胞/孔加至96孔板。用DMSO稀釋的生物活性分子，加入100ul至96孔板，濃度從10 μM開始，3倍稀釋 (12個濃度梯度)，37℃ 5 %CO2培養3-4天，然後每孔加入CCK8試劑20μL，反應至2-6小時，微量盤檢測儀讀數 (檢測波長為450 nm)。生物活性分子及其檢測結果如表13所示。 表13 A1.9和B1.14的活性測定
細胞 A1.9 EC 50nM B1.14EC 50nM DXD EC 50nM
NUC G-4 8.73 184.8 43.32
PC-9 2.06 34.32 16.69
HT29 20.32 367.9 210.5
NCI-H358 46.2 581.2 261.6
A431 5.71 67.97 25.08
A549 65.86 252.3 262.2
測試結果表明，生物活性分子A1.9和B1.14具有腫瘤細胞殺傷作用，其中A1.9在多個腫瘤細胞中均具有強於Dxd的腫瘤殺傷作用。A1.9在KYSE520的體外細胞活性的抑制活性檢測中，EC50為49.62 nM，具有殺傷KYSE520的作用。
實施例 7 ： 抗 Napi2b 抗體藥物偶聯物體內活性測試
7.1 Napi2b 抗體藥物偶聯物對 HT29 人結腸癌移植瘤藥效測試
為驗證抗人Napi2b ADC藥物的體內藥效，評價受試藥物在皮下異種移植雌性Balb/c Nude小鼠模型中的抗腫瘤作用，購買5-6周齡的雌性Balb/c Nude小鼠 (維通利華)，將生長至對數生長期的HT29-h.Napi2b細胞採用EDTA消化及PBS重懸，每只小鼠皮下接種5*10 6細胞，待腫瘤生長至100-200 m 3大小，採用靜脈給藥，每週一次，每次1 mg/kg或3 mg/kg，具體方案如下表。本實驗的主要觀察指標為：1) T GI ( %)，計算公式為：T GI ( %)= (1-T/C)× 100 % (T和C分別為治療組和對照組在某一特定時間點的相對腫瘤體積)2) 試驗終點腫瘤體積大小照片、腫瘤重量。
實驗結果如表14、圖4所示，16 G5B3-hz2-ADC07(DAR8)和66C12-hz1-ADC07(DAR8)，在小鼠體內均有良好的抑瘤效果，3 mg/kg劑量下T GI與C1-ADC07(DAR8)相當，1 mg/k g劑量下兩者均優於C1-ADC07(DAR8)，其中66C12-hz1--ADC07(DAR8)在1 mg/k g下T GI達到了97.83 %，明顯優於另外兩者。小鼠體重變化情況如圖5所示，表明整個給藥過程中2個ADC對小鼠體重無影響。 表14. 抗人Napi2b ADC體內藥效-HT29-h.Napi2b CDX模型
分組 小鼠數量 樣品 劑量 (mg/k g) 給藥方式 給藥頻率 T GI ( %) P值
1 5 生理鹽水 / i.v. QW*3 / /
2 5 I g G-ADC07(DAR8) 3 i.v. QW*3 21.71 0.735
3 5 C1-ADC07(DAR8) 1 i.v. QW*3 37.46 0.226
4 5 C1-ADC07(DAR8) 3 i.v. QW*3 96.91 ＜0.001
5 5 16 G5B3-hz2- ADC07(DAR8) 1 i.v. QW*3 51.12 0.049
6 5 16 G5B3-hz2- ADC07(DAR8) 3 i.v. QW*3 99.34 ＜0.001
7 5 66C12D12-hz1- ADC07(DAR8) 1 i.v. QW*3 97.83 ＜0.001
8 5 66C12D12-hz1- ADC07(DAR8) 3 i.v. QW*3 100.00 ＜0.001
7.2 Napi2b 抗體藥物偶聯物對 I GR-OV1 人源卵巢癌移植瘤藥效測試
用相似的方法評價測試藥物66C12D2-hz1- ADC07(DAR8)在人源卵巢癌I GR-OV1 細胞株皮下異種移植雌性BALB/c 裸小鼠動物模型中的抗腫瘤作用。實驗結果如表15、圖6所示， 66C12D2-hz1- ADC07(DAR8)在小鼠體內有良好的抑瘤效果，3 mg/k g劑量下TGI與C1- ADC07(DAR8)相當，1 mg/k g劑量下均優於C1- ADC07(DAR8)。小鼠體重變化情況如圖7所示，表明整個給藥過程中66C12D2-hz1- ADC07(DAR8)對小鼠體重無影響。 表15. 抗人Napi2b ADC體內藥效- I GR-OV1 CDX模型
分組 小鼠數量 樣品 劑量 (mg/k g) 給藥方式 給藥頻率 T GI ( %) P值
1 5 生理鹽水 / i.v. QW*3 / /
2 5 C1- ADC07(DAR8) 1 i.v. QW*3 22.73 0.646
3 5 C1- ADC07(DAR8) 3 i.v. QW*3 63.76 ＜0.001
4 5 66C12D2-hz1- ADC07(DAR8) 1 i.v. QW*3 48.88 0.079
5 5 66C12D12-hz1- ADC07(DAR8) 3 i.v. QW*3 64.59 ＜0.001
從而本公開ADC有更寬的治療指數和治療效果。儘管本公開的具體實施方式已經得到詳細的描述，但本領域具通常知識者將理解：根據已經公佈的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，並且這些改變均在本公開的保護範圍之內。本公開的保護範圍由所附請求項及其任何等同物給出。
無
圖1. 抗Napi2b人源化抗體流式親和力評價。 圖2. 抗Napi2b人源化抗體內吞活性檢測。 圖3A. 66C12D12-hz1抗體在血清中的親和力檢測。 圖3B. 16 G5B3-hz2抗體在血清中的親和力檢測。 圖4. 抗人Napi2b ADC在HT29-h.Napi2b CDX模型中體內藥效測試。 圖5. 抗人Napi2b ADC在 HT29-h.Napi2b CDX模型給藥過程中小鼠體重變化。 圖6. 抗人Napi2b ADC在I GR-OV1 CDX模型中體內藥效測試。 圖7. 抗人Napi2b ADC在I GR-OV1 CDX模型給藥過程中小鼠體重變化。
無
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Claims (42)

  1. 一種式XV所示的抗體藥物偶聯物， 式XV 或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中： Tb為抗NaPi2b的抗體或其抗原結合片段； q為藥物抗體偶聯比； D為生物活性分子片段； L 1為延伸單元； L 2不存在或為連接單元； L3選自Val-AA 1- Gly、Val-AA 1、Ala-AA 1、 Gly-AA 1、AA 1- Gly、Ala-AA 1- Gly、 Gly-AA 1- Gly、AA 1-Ala-Asn、AA 1；所述AA 1所示胺基酸殘基的結構如下所示， AA 1其中：R a、R b各自獨立地選自H、 、 和 ，且R a、R b不同時為H； 或者，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成4-10元雜環，所述4-10元雜環任選地被一個或多個R 0所取代； r、r 1各自獨立地選自0到20的任意整數； R m1、R n1各自獨立地選自H、C1-6烷基、C3-6環烷基和-COOR x1； R x1選自C1-6烷基； 或者，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成4-10元雜環，所述4-10元雜環任選地被一個或多個R 0’所取代； R z選自C1-6烷基； R 0、R 0’各自獨立地選自C1-6烷基、C3-6環烷基、-NR m2R n2和任選被C1-6烷基取代的4-10元雜環基； R m2、R n2各自獨立地選自H和C1-6烷基； L 4不存在或存在，L 4存在時，L 4選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與L 3相連，2位與D相連。
  2. 如請求項1所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1) Tb所述抗體或其抗原結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互補決定區片段、非人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、全人抗體、前抗、單株抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體； (2) q選自0.1-16.0之間的任意數值； (3) D為具有抗腫瘤生物活性分子片段。
  3. 如請求項2所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1)q選自0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和之間的任意數值； (2) 所述的生物活性分子片段中，所述的生物活性分子為DNA拓撲異構酶抑制劑或微管蛋白抑制劑； (3) L 1選自 、 、 、 、 、 、 和 ，各Z獨立地選自直接鍵、碳碳三鍵、碳碳雙鍵、C6-10芳基、5-10元雜芳基和醯胺基；Rx、Ry各自獨立地選自H和C1-4烷基；各m獨立地選自0、1、2、3、4、5和6；y1選自1-6之間任意整數；各y2獨立地選自0-15之間任意整數；各y3獨立地選自1、2和3；各y4獨立地選自0和1；1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連； (4) L 2不存在或存在，L 2存在時，L 2選自 、 、 、 、 、 、 和 ，y1選自1-6之間任意整數，各y2獨立地選自0-10之間任意整數，各y3獨立地選自1和2，各y4獨立地選自0和1，1位與L 1相連，2位與L 3相連； (5)AA 1的胺基酸殘基中，R a、R b中，任一個為H，另一個選自 、 和 ； 或者，AA 1的胺基酸殘基中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的5-6元雜環； (6) AA 1的胺基酸殘基中，r、r 1各自獨立地選自0、1、2、3、4和5； (7) AA 1的胺基酸殘基中，R m1、R n1各自獨立地選自H、甲基、乙基、正丙基、正丁基、-COOCH3、-COOCH2CH3、-COOCH2CH2CH3、-COOCH(CH3)2、-COOC(CH3)3和-COOCH2CH2CH2CH3；或者，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成被R 0’取代的5-6元雜環； (8)AA 1的胺基酸殘基中，R z為甲基； (9)AA 1的胺基酸殘基中，R 0、R 0’各自獨立地選自C1-6烷基、-NR m2R n2和任選被C1-6烷基取代的5-6元雜環基。
  4. 如請求項3所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1) q選自0.1、1、2、3、4、5、6、7、8和之間的任意數值； (2) 當所述的生物活性分子片段中的生物活性分子為DNA拓撲異構酶抑制劑時，所述的DNA拓撲異構酶抑制劑為喜樹堿類生物活性分子； (3) 當所述的生物活性分子片段中的生物活性分子為微管蛋白抑制劑時，所述的微管蛋白抑制劑為MMAF類微管蛋白抑制劑，MMAE類微管蛋白抑制劑； (4) L 1中，各Z獨立地選自直接鍵、碳碳三鍵和碳碳雙鍵； (5) L 1中，y1為4、5或6； (6) L 1中，各y2獨立地選自6-10之間任意整數； (7) L 2不存在或存在，L 2存在時，L 2選自 、 、 、 、 和 ，1位與L 1相連，2位與L 3相連； (8) AA 1所示胺基酸殘基中，R a、R b中，任一個為H，另一個選自 和 ；或，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的5-6元雜環為被R 0取代的呱啶環或呱嗪環； (9) AA 1的胺基酸殘基中，r、r 1各自獨立地選自0和4； (10) AA 1的胺基酸殘基中，R m1、R n1各自獨立地選自H、C1-6烷基、C3-6環烷基和叔丁氧羰基；或者，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成被R 0’取代的呱啶環或呱嗪環； (11) AA 1的胺基酸殘基中，R 0選自C1-6烷基和被C1-6烷基取代的5-6元雜環基，所述5-6元雜環基選自呱啶基和呱嗪基； (12) AA 1的胺基酸殘基中，R 0’選自C1-6烷基和-NR m2R n2； (13) AA 1的胺基酸殘基中，R m2、R n2為甲基； (14) L 4不存在或存在，L 4存在時，L 4為 或 ，1位與L 3相連，2位與D相連。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1)q選自2、3、4、5、6、7、8和之間的任意數值； (2)L 1選自 、 、 、 、 、 和 ，m選自2、3和4，y1選自1-6之間任意整數，各y2獨立地選自0-10之間任意整數，各y3獨立地選自1或2，1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連； (3) L 3選自AA 1、AA 1- Gly、Val-AA 1- Gly、AA 1-Ala-Asn； (4) AA 1所示胺基酸殘基中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成被R 0取代的5-6元雜環為被R 0取代的呱啶環； (5) AA 1的胺基酸殘基中，r、r 1中，任一個為0，另一個為4； (6) AA 1的胺基酸殘基中，R m1、R n1各自獨立地選自H和C1-6烷基；或，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成被R 0’取代的呱啶環； (7) AA 1的胺基酸殘基中，R 0選自甲基、乙基和被甲基取代的5-6元雜環基，所述5-6元雜環基為呱啶基；優選地，R 0選自甲基、乙基和 。 (8) AA 1的胺基酸殘基中，R 0’選自甲基和-NR m2R n2； (9) 當所述的生物活性分子片段中的生物活性分子為DNA拓撲異構酶抑制劑、所述的DNA拓撲異構酶抑制劑為喜樹堿類生物活性分子時，所述的喜樹堿類生物活性分子為喜樹堿、DXD、取代基被修飾的喜樹堿或取代基被修飾的DXD。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1) q選自3、4、5、6、7、8和之間的任意數值；優選地，q選自4、5、6、7、8和之間的任意數值；優選地，q選自6、7、8和之間的任意數值； (2) L 1選自 和 ，1位通過S原子與Tb相連，2位與L 2或L 3相連； (3) L 2不存在或 ； (4) L 3選自AA 1、Val-AA 1- Gly；優選地，L 3選自Val-AA 1- Gly； (5) AA 1所示胺基酸殘基中，R a與R b和與它們共同相連的碳原子一起，形成 或 ，1號碳原子為與R a和R b共同相連的碳原子； (6) r、r 1中，r為4，r 1為0時，R m1、R n1各自獨立地選自H和C1-6烷基；r為0，r 1為4時，R m1、R n1各自獨立地選自C1-6烷基，或，R m1與R n1和與它們共同相連的氮原子一起，形成 、 或 ，1號碳原子為與R a和R b共同相連的碳原子。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， AA 1所示胺基酸殘基選自 、 、 、、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ； 最優選地，AA 1所示胺基酸殘基選自 、 、 、 、 和 。
  8. 如請求項1-7中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， L 3選自 、 、 、 、 、 、 、 、、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，X -選自鹵素離子、羧酸根離子、硫酸根離子、硫酸氫根離子和OH -，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或D相連； 最優選地，L 3選自 、 、 、 、 和 ，1位與L 1或L 2相連，2位與L 4或D相連。
  9. 如請求項1-8中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， 的結構選自以下結構片段：
    ； 優選地， 的結構選自以下：
    其中，1位與Tb相連，2位與D相連。
  10. 如請求項1-9中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物， 其中，所述抗體藥物偶聯物具有式I所式結構： 式I 其中：Tb、L1、L2、L3、L4和q的定義如請求項1-9中任一項所述； R 1、R 2各自獨立地選自H、鹵素、-OH、任選取代的C1-6烷基和任選取代的C1-6烷氧基，或者， R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成5-7元碳環或5-7元雜環，所述雜環含有1個或多個O，S，N，羰基，亞碸基或碸基或其任意組合； R 3選自H、鹵素、-OH、-NH 2、任選取代的C1-6烷基和任選取代的C1-6烷氧基，或者， R 3和X和與其相連的碳原子一起形成5-7元碳環或5-7元雜環，所述雜環含有1個或多個O，S，N，羰基，亞碸基或碸基或其任意組合，或者， R 3和R 2和與其相連的碳原子一起形成5-7元碳環或5-7元雜環，所述雜環含有1個或多個O，S，N，羰基，亞碸基或碸基或其任意組合； W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與X相連，2位與L 4或L 3相連； X選自直接鍵，任選取代的-O-(CH 2) n3-、-NR 4-(CH 2) n3-、-S-(CH 2) n3-、羰基-(CH 2) n3-、-SO 2-(CH 2) n3-、-(CH 2) n1-、 、 、 、C3-6環烷基、C6-10芳基、5-10元雜芳基和4-10元雜環基，1位和母環相連，2位和W或L 4相連；所述取代基選自一個或多個C1-4烷基、C3-6環烷基，或者多個C1-4烷基和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基； 各M獨立地選自直接鍵和-CR 5aR 5b-； R 4、R 5、R 5a、R 5b、R 6、R 7各自獨立地選自H、任選取代的C1-4烷基、任選取代的C1-4烷氧基和任選取代的C3-6環烷基； n、n’、n1、n2、n3各自獨立地選自0到6之間的任意整數； 1位與喜樹堿母核相連，2位與W或L 4相連。
  11. 如請求項10所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1) R 1、R 2各自獨立地選自H、鹵素、C1-4烷基；或者，R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成5-6元雜環，所述雜環含有1個、2個或3個O，S或N或其任意組合； (2) R 3選自H、C1-4烷基；或，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成5-6元碳環； (3) W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位與X相連，2位與L 4或L 3相連； (4) X選自任選取代的-(CH 2) n1-、 、 、 、C6-10芳基、5-10元雜芳基和4-10元雜環基，1位和母環相連，2位和W或L 4相連；所述取代基選自1個或2個C1-4烷基，或者2個C1-4烷基和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基； (5) R 4、R 5各自獨立地選自H、C1-4烷基和C3-6環烷基； (6) R 5a、R 5b各自獨立地選自H和C1-4烷基； (7) 各R 7獨立地選自H和C1-4烷基； (8) n選自1、2和3； (9) n1選自1、2、3和4； (10) n2為1； (10) n3為0。
  12. 如請求項10或11所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1) R 1選自H和鹵素，R 2選自H和C1-4烷基；或，R 1和R 2和與其相連的碳原子形成 、 、 或 ，虛線表示所述雜環與苯環稠合的位置； (2) R 3為H；或，R 3和X和與其相連的碳原子一起形成 ，虛線表示所述碳環與苯環和吡啶環稠合的位置； (3) W不存在或存在，W存在時，W選自-O-、-S-、-NR 4-、 、 、 和 ，1位與X相連，2位與L 4或L 3相連； (4) 各R 4獨立地選自H、C1-4烷基和C3-6環烷基，R 5為H； (5) R 5a、R 5b各自獨立地選自H和甲基； (6) R 7為H； (7) n為1。
  13. 如請求項10-12中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其滿足如下條件中的一個或多個： (1) R 1為H或F，R 2為H或甲基；或，R 1和R 2和與其相連的碳原子一起形成 ，虛線表示所述雜環與苯環稠合的位置； (2) W選自-O-、-NR 4-和 ，1位X相連，2位與L 4或L 3相連； (3) 各R 4獨立地選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基和環丙基，R 5為H； (4) X選自任選取代的 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W或L 4相連；所述取代基選自1個或2個C1-4烷基，或者2個C1-4烷基和與它們同時相連的碳原子一起形成C3-6環烷基；所述的C1-4烷基如甲基；所述的C3-6環烷基如環丙基。
  14. 如請求項10-13中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， (1) W選自-O-和-NR 4-； (2) X選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W或L 4相連。
  15. 如請求項10-14中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， W不存在時，X選自 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和L 4相連；W存在時，X選自 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 和 ，1位和母環相連，2位和W相連。
  16. 如請求項10-15中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， 的結構選自以下： 其中，1位與L 4相連；當L 4不存在時，1位與L 3相連。
  17. 如請求項10-16中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，所述的抗體藥物偶聯物具有式I-1、式I-2或式I-3所式結構： 、 其中，Tb、L 1、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4和q如請求項1-16中任一項所定義； 其中，Tb、L 1、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3和q如請求項1-16中任一項所定義； 其中，Tb、L 1、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4、R 5、n和q如請求項1-16中任一項所定義。
  18. 如請求項10-17中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，所述抗體藥物偶聯物具有式I-1A、式I-1B、式I-2A、式I-2B、式I-3A或式I-3B所式結構： 、 其中，Tb、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4和q如請求項1-16中任一項所定義； 、 其中，Tb、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3和q如請求項1-16中任一項所定義； 、 其中，Tb、L 2、L 3、L 4、X、R 1、R 2、R 3、R 4和q如請求項1-16中任一項所定義。
  19. 請求項10-18中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其中，所述的抗體藥物偶聯物具有式I-A或式I-B所式結構： 其中，Tb、X、R 1、R 2、R 3、R a、R b和q如請求項1-16中任一項所定義； 其中，Tb、X、R 1、R 2、R 3、R a、R b和q如請求項1-16中任一項所定義。
  20. 如請求項1-19中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，所述的抗體藥物偶聯物選自以下：
    。
  21. 如請求項1-20任一所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中， Tb為抗Napi2b抗體或其抗原結合片段；優選地，所述的抗Napi2b的抗體為lifastuzumab ，upifitamab   ，60A12B3-hz1、22H9C4-hz1、66C12D12-hz1、34F2A10-hz1、C1，16 G5B3-hz2和16 G5B3-hz1抗體或其抗原結合片段。
  22. 一種抗Napi2b的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包含如下的互補決定區CDR： (a) SEQ ID NO： 1、17、19、34、36、52、54、71、73、74或33所示的重鏈可變區VH中含有的HCDR1、HCDR2、以及HCDR3;和/或 (b) SEQ ID NO： 2、18、20、35、37、53、55、72、75或51所示的輕鏈可變區VL中含有的LCDR1、LCDR2，以及LCDR3。
  23. 如請求項22所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段包含： (1) VH和/或VL，其中按IMGT編號系統定義： (a) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 11的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 12的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 14的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 15的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3； (b) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 11的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 13的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 14的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 15的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3； (c) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 28的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 29的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 31的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 32的LCDR1，序列為YTS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3； (d) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 28的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 30的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 31的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 32的LCDR1，序列為YTS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3； (e) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 46的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 47的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 49的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 50的LCDR1，序列為SAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3； (f) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 46的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 48的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 49的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 50的LCDR1，序列為SAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3； ( g) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 65的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 66的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 68的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 69的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3； (h) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 65的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 67的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 68的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 69的LCDR1，序列為WAS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3； 或 (i) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 76的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 77的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 78的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 79的LCDR1，序列為HTS的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 16的LCDR3； (2) VH和/或VL，其中按 kabat編號系統定義： (a) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 3的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 4的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 6的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 7的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 9的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3； (b) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 3的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 5的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 6的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 8的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 9的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 10的LCDR3； (c) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 21的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 22的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 24的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 25的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 26的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3； (d) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 21的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 23的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 24的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 25的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 26的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 27的LCDR3； (e) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 38的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 39的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 41的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 42的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 44的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3； (f) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 38的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 40的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 41的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 43的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 44的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 45的LCDR3； ( g) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 56的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 57的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 61的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3； (h) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 56的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 58的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 62的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3；或 (i) 所述VH包含：序列為SEQ ID NO： 56的HCDR1，序列為SEQ ID NO： 59的HCDR2，序列為SEQ ID NO： 60的HCDR3；和/或， 所述VL包含：序列為SEQ ID NO： 62的LCDR1，序列為SEQ ID NO： 63的LCDR2，序列為SEQ ID NO： 64的LCDR3； 優選地，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段結合人Napi2b、猴Napi2b和/或大鼠Napi2b。
  24. 如請求項22或23所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含： (a) SEQ ID NO： 1或17所示的VH，和/或，SEQ ID NO： 2或18所示的VL； (b) SEQ ID NO： 19或34所示的VH，和/或，SEQ ID NO： 20或35所示的VL； (c) SEQ ID NO： 36或52所示的VH，和/或，SEQ ID NO： 37或53所示的VL； (d) SEQ ID NO： 54、71或73所示的VH，和/或，SEQ ID NO： 55或72所示的VL； (e) SEQ ID NO： 74或33所示的VH，和/或，SEQ ID NO： 75或51所示的VL； (f)  與(a)- (e)中的任一VH相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的VH；和/或，與(a)中的任一VL相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性的VL；或者 (g) 與(a)-(e)中的任一VH相比具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合的VH；和/或，與(a)中的任一VL具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合的VL；優選地，所述的置換是保守置換。
  25. 請求項22-24任一項抗Napi2b所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段包含： (a) SEQ ID NO： 1所示序列的VH和SEQ ID NO： 2所示序列的VL； (b) SEQ ID NO： 17所示序列的VH和SEQ ID NO： 18所示序列的VL； (c) SEQ ID NO： 19所示序列的VH和SEQ ID NO： 20所示序列的VL； (d) SEQ ID NO： 34所示序列的VH和SEQ ID NO： 35所示序列的VL； (e) SEQ ID NO： 36所示序列的VH和SEQ ID NO： 37所示序列的VL； (f)  SEQ ID NO： 52所示序列的VH和SEQ ID NO： 53所示序列的VL； (g) SEQ ID NO： 54所示序列的VH和SEQ ID NO： 55所示序列的VL； (h) SEQ ID NO： 71所示序列的VH和SEQ ID NO： 72所示序列的VL； (i)  SEQ ID NO： 73所示序列的VH和SEQ ID NO： 72所示序列的VL； (j)  SEQ ID NO： 74所示序列的VH和SEQ ID NO： 75所示序列的VL； (k) SEQ ID NO： 33所示序列的VH和SEQ ID NO： 51所示序列的VL； (l)  VH和VL，與(a)至(k)任一組中的VH和VL相比，其VH具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性；和/或，其VL具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性；或者 (m)VH和VL，與(a)至(k)任一組中的VH和VL相比，其VH具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；和/或，其VL具有一個或幾個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；優選地，所述的置換是保守置換。
  26. 請求項22-25任一項所述抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段是嵌合抗體、人源化抗體或全人源抗體； 可選地，所述抗體或其抗原結合片段選自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、二硫鍵連接的Fv(dsFv)、雙抗體 (diabody)和多特異性抗體； 例如，所述多特異性抗體是雙特異性抗體或三特異性抗體或四特異性抗體。
  27. 請求項22-26任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體或其抗原結合片段進一步包含： (a) 人免疫球蛋白的重鏈恒定區CH或其變體；和/或 (b) 人免疫球蛋白的輕鏈恒定區CL或其變體， 其中，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性；或者，所述變體與其所源自的野生型序列相比具有一個或多個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合例如至多50個、至多45個、至多40個、至多35個、至多30個、至多25個、至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的置換、缺失或添加或其任意組合；優選地，所述的置換是保守置換； 優選地，所述重鏈恒定區是I g G重鏈恒定區，例如I g G1、I g G2、I g G3或I g G4重鏈恒定區；和/或，所述輕鏈恒定區是κ或λ輕鏈恒定區； 更優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含人I g G1重鏈恒定區；和/或所述抗體或其抗原結合片段包含人κ輕鏈恒定區。
  28. 請求項27所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其中， 所述重鏈恒定區包括SEQ ID NO： 70所示的CH或其變體，所述變體與SEQ ID NO： 70相比具有至多20個胺基酸的保守置換例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的保守置換；或者與SEQ ID NO： 70相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性；和/或 所述輕鏈恒定區包括SEQ ID NO： 80所示的CL或其變體，所述變體與SEQ ID NO： 80相比具有至多20個胺基酸的保守置換例如至多20個、至多15個、至多10個或至多5個胺基酸的保守置換，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸的保守置換，或者與SEQ ID NO： 80相比具有至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性； 優選地，所述抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO： 70所示的重鏈恒定區CH和SEQ ID NO： 80所示的輕鏈恒定區CL。
  29. 請求項22-28任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗體包括： (a) 包括SEQ ID NO： 71所示的VH和SEQ ID NO： 70所示的CH的重鏈，和，包括SEQ ID NO： 72所示的VL和SEQ ID NO： 80所示的CL的輕鏈； (b) 包括SEQ ID NO： 73所示的VH和SEQ ID NO： 70所示的CH的重鏈，和，包括SEQ ID NO： 72所示的VL和SEQ ID NO： 80所示的CL的輕鏈；優選包括SEQ ID NO： 81所示的重鏈和SEQ ID NO： 82所示的輕鏈； (c) 包括SEQ ID NO： 17所示的VH和SEQ ID NO： 70所示的CH的重鏈，和，包括SEQ ID NO： 18所示的VL和 SEQ ID NO： 80所示的CL的輕鏈；優選包括SEQ ID NO： 83所示的重鏈和SEQ ID NO： 84所示的輕鏈。
  30. 如請求項1-21任一所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，Tb選自請求項22-29任一所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，
  31. 請求項1-21、30中任一項所述的抗體藥物偶聯物或所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物，其中，其中，所述抗體藥物偶聯物選自： 其中，Tb 1為lifastuzumab ，upifitamab，60A12B3-hz1、22H9C4-hz1、66C12D12-hz1、34F2A10-hz1、C1，16 G5B3-hz2和16 G5B3-hz1抗體；q選自0.1-16.0之間的任意數值，優選2-8之間的任意數值，更優選地，q為2、4、6或8。
  32. 製備請求項1-21、30、31中任一項所述的抗體藥物偶聯物的方法，其包括： 將Tb與式III所示的藥物連接體偶聯物 在合適的溶劑和條件下進行偶聯反應； 其中： L 1、L 2、L 3、L 4、Tb如請求項1-21中任一項所定義； R 1、R 2、R 3、X、W如請求項1-21所定義； L g為離去基團，L g選自鹵素、碸基、三級胺鹽基 (Me3N+、Et3N+)、重氮鹽基、-OMs、MeSO2-、CF3SO3-。
  33. 請求項32的方法，其中，所述方法包括將Tb與式III所示的藥物連接體偶聯物 在合適的溶劑和條件下進行偶聯反應形成C-S鍵的步驟； 優選地，所述Tb與所述藥物連接體偶聯物的物質的量的比為1： (1-20)； 優選地，所述偶聯反應在水和/或有機溶劑中進行；優選地，所述有機溶劑選自N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、N-甲基吡咯烷酮、腈類(例如乙腈)、醇類(例如甲醇、乙醇)或其任意組合；所述的腈類可為乙腈，所述的醇類可為甲醇、乙醇； 優選地，所述方法進一步包括將偶聯產物進行純化的步驟；優選地，通過層析方法對所述偶聯產物進行純化；優選地，所述層析方法包括離子交換層析、疏水層析、反相層析或親和層析中的一種或多種。
  34. 一種分離的核酸分子，其編碼請求項22-29任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段。
  35. 一種載體，其包含請求項34所述的分離的核酸分子；優選地，所述載體為複製載體或表達載體。
  36. 一種宿主細胞，其包含請求項34所述的分離的核酸分子或請求項35所述的載體。
  37. 一種製備請求項22-29任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段的方法，其包括，在允許所述抗體或其抗原結合片段表達的條件下，培養請求項36所述的宿主細胞，和從培養的宿主細胞培養物中回收所述抗體或其抗原結合片段。
  38. 一種抗體-藥物偶聯物，其中抗體為請求項22-29任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段，其通過接頭與偶聯部分連接，所述偶聯部分選自：可檢測的標記、放射性同位素、螢光物質、發光物質、有色物質、酶、聚乙二醇、核素、核酸、小分子毒素、具有結合活性多肽、蛋白、受體、配體，以及其它抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡或壞死的活性物質。
  39. 一種抗體藥物偶聯物的群，其包含請求項1-21、30、31、38中任一項所述的抗體藥物偶聯物，所述的抗體藥物偶聯物具有一種、兩種或多種q值；
  40. 一種藥物組合物，其包含請求項1-21、30、31、38中任一項所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物、或請求項22-29任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片，或如請求項34所述的核酸分子、或如請求項35所述的載體、或如請求項36所述的宿主細胞、或如請求項39所述的抗體藥物偶聯物的群；優選還包括藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
  41. 請求項39所述的群或請求項40所述的藥物組合物，其中，藥物與抗體的比例 (DAR)選自1-10中的整數或小數； 優選地，所述群的藥物與抗體的比例 (DAR)選自1.5-2.5、3.5-4.5、5.5-6.5和7.5-8.5； 優選地，所述群的藥物與抗體的比例 (DAR)選自約2.0、4.0、6.0和8.0； 優選地，所述群的藥物與抗體的比例 (DAR)選自2、2.5、3、3.5、4、4.5,5、5.5、6、6.5、7、7.2、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.7、8.9和9。
  42. 一種請求項1-21、30、31、38中任一項所述抗體藥物偶聯物的立體異構體、其前藥、其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的溶劑合物、或請求項22-2,9任一項所述的抗Napi2b抗體或其抗原結合片段、或如請求項34所述的核酸分子、或如請求項35所述的載體、或如請求項36所述的宿主細胞、或如請求項39所述的抗體藥物偶聯物的群，或者請求項40所述的藥物組合物在製備治療和/或預防與細胞活動異常相關的疾病的藥物中的用途； 可選地；所述的與細胞活動異常相關的疾病可為癌症疾病； 優選地，所述癌症疾病選自食管癌、腦瘤、肺癌、鱗狀上皮細胞癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、腹膜癌、胰腺癌、乳腺癌、頭頸癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、肝癌、腎癌、尿路上皮癌、表皮癌、非霍奇金淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤、前列腺癌或甲狀腺癌；所述的食管癌例如食管腺癌或食管鱗狀細胞癌；所述的肺癌例如小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌或肺腺癌；所述的中樞神經系統腫瘤例如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、膠質瘤或肉瘤；所述結腸癌例如人結腸腺癌； 優選地，所述癌症疾病選自結腸癌，結直腸癌，結腸腺癌，小細胞肺癌，卵巢癌； 更優選地，所述癌症疾病為與Napi2b相關的癌症疾病。
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