TW202345899A

TW202345899A - 多特異性抗體及其用途(三)

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Publication number: TW202345899A
Application number: TW112108927A
Authority: TW
Inventors: 桑加亞辛格; 丹青楊; 比迪莎達斯古普塔; 盧佩西納加達; 亞當茲沃拉克; 威爾森艾德華茲; 布萊恩德羅薩里歐; 湯瑪斯凱莉
Original assignee: 比利時商健生藥品公司
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2023-03-10
Publication date: 2023-12-01
Also published as: EP4490185A1; JP2025512732A; MX2024011083A; IL315540A; WO2023170295A1; CN119173530A; US20250136672A1; KR20240161964A; AU2023232448A1; CA3254615A1

Abstract

提供多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含能夠特異性結合至焦麩胺酸類澱粉蛋白β之至少一個第一抗原結合區、能夠特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR)之第二抗原結合區、及能夠特異性結合至成對螺旋絲(PHF)-tau之第三抗原結合區。亦提供治療或偵測神經病症之方法、及/或跨血腦障壁遞送治療劑或診斷劑之方法。亦描述編碼該等抗體之核酸、包含該等核酸之載體、包含該等核酸及/或載體之重組宿主細胞、及產生該等多特異性抗體或其抗原結合片段之方法。

Description

多特異性抗體及其用途(三)

電子提交序列表之參照

本申請案含有序列表，其係電子提交。電子序列表之內容（065768-123WO1_Sequence Listing.xml；大小：53,761位元組；及建立日期：2023年3月2日）全文係以引用方式併入本文中。 相關申請案之交互參照

本申請案主張於2022年3月11日申請之美國臨時專利申請案第63/269,208號之優先權，其揭露全文以引用方式併入本文中。

本申請案係關於抗成對螺旋絲tau/抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β/抗轉鐵蛋白受體(TfR)多特異性抗體、抗體接合物、編碼該等抗體之核酸及表現載體、含有該等表現載體之重組細胞、及包含該等抗體之組成物。亦提供製作該等抗體之方法、使用該等抗體治療包括神經病症（例如類澱粉蛋白相關病症）之病況的方法、及使用該等抗體診斷神經病症的方法。

阿茲海默症(Alzheimer's disease, AD)是一種在臨床上藉由下列表徵的退化性腦部病症：逐漸喪失記憶、認知、推理、判斷及情緒穩定性，其逐漸導致極度心智退化(profound mental deterioration)而最終死亡。阿茲海默症是老年人漸進式心智衰退（失智症）的常見原因。阿茲海默症已在全世界經過觀察，而代表著主要公共衛生議題。目前評估，單是在美國，該疾病就會影響多於五百萬個人。該疾病目前無法治癒，而且並無有效預防AD或逆轉其症狀或進程的治療。

患有AD之個體腦部展現出特有病灶，其稱為類澱粉蛋白斑塊、類澱粉血管病變（類澱粉蛋白沉積於血管中）、及神經纖維纏結。大量此等病灶、特別是類澱粉蛋白斑塊及神經纖維纏結係通常發現於腦部之對記憶及認知功能很重要的數個區域。類澱粉蛋白斑塊及類澱粉血管病變亦係患有三染色體21（唐氏症）、瀰漫性路易氏體病(diffuse Lewy body disease)、及荷蘭型遺傳性大腦出血伴類澱粉沉積症(hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis of the Dutch-type, HCHWA-D)之個體腦部的特徵。

類澱粉蛋白斑塊之主要成分係藉由β類澱粉前驅蛋白(APP)裂解產生的各種類澱粉蛋白β (Aβ)肽。腦部中之Aβ肽沉積係假設為在導致AD之疾病級聯中之早期且必要的階段。在類澱粉前驅蛋白及早老素基因中鑑定出導致改變Aβ產生及造成家族性早發性AD之突變提供有力證據證明，改變的類澱粉蛋白代謝係構成疾病基礎之致病過程中的重要事件。

在第三殘基處具有焦麩胺酸之類澱粉蛋白β肽(3pE Aβ)係沉積在AD患者腦部中的主要物種。3pE Aβ存在於AD中幾乎所有的瀰漫性及成熟斑塊中，在代謝上係穩定的，且可在斑塊播種(seeding)及穩定兩者中發揮作用(Cynis et al., Molecular Neurodegeneration, 2016; 11:48)。尚未報導過在CSF或血漿中有可偵測量的3pE Aβ，因此意味著目標肽具有病理特異性(DeMattos et al., Neuron, 2012; 76:1-13)。選擇性結合至3pE Aβ之抗體可用於免疫療法。

當前AD治療情形僅包括經核准治療患有失智症之患者之認知症狀的療法。不存在改變或減慢AD進展之經核准療法。潛在的疾病調節劑係抗類澱粉抗體，包括Eli Lilly的多納單抗(Donanemab)，一種識別Aβ(p3-42)（一種Aβ的焦麩胺酸形式）之人源化IgG1單株抗體；及阿杜坎單抗(aducanumab)，一種針對Aβ上發現的構型表位之人類IgG1單株抗體。此等療法及未來十年中可能推出之大部分其他潛在疾病調節劑靶向Aβ（類澱粉蛋白斑塊之主要組分，類澱粉蛋白斑塊係AD之兩種「標誌性(hallmark)」病理徵象之一）。

神經纖維纏結（AD之第二標誌性病理徵象）主要係由過度磷酸化(hyper-phosphorylated) tau蛋白之聚集物所構成。tau之主要生理功能係微管聚合及穩定。tau與微管之結合係藉由在tau之微管結合區中之正電荷與微管晶格(lattice)上之負電荷之間的離子交互作用而發生(Butner and Kirschner, J Cell Biol. 115(3):717-30, 1991)。tau蛋白含有85個可能的磷酸化位點，並且許多這些位點處之磷酸化干擾tau之主要功能。結合至軸突微管網格之tau處於低磷酸化狀態，而AD中聚集的tau是超磷酸化的，其提供不同於生理活性的taut池之獨特表位。

已描述tau蛋白病(tauopathy)傳播及蔓延假說，且係基於人類腦部中tau蛋白病進展之Braak分期及臨床前tau模型中tau聚集物注射之後之tau蛋白病蔓延(Frost et al., J Biol Chem. 284:12845-52, 2009; Clavaguera et al., Nat Cell Biol. 11:909-13, 2009)。

開發預防或清除tau聚集之治療劑多年來一直受到關注，且候選藥物（包括抗聚集化合物及激酶抑制劑）已進入臨床測試(Brunden et al., Nat Rev Drug Discov.8:783-93, 2009)。已公開多個研究，其顯示基因轉殖小鼠模型中主動及被動tau免疫兩者之有益的治療效應(Chai et al., J Biol Chem.286:34457-67, 2011; Boutajangout et al., J Neurochem.118:658-67, 2011; Boutajangout et al., J Neurosci.30:16559-66, 2010; Asuni et al., J Neurosci.27:9115-29, 2007)。已報導在磷酸化定向抗體及非磷酸化定向抗體兩者之情況下的活性(Schroeder et al., J Neuroimmune Pharmacol.11(1):9-25, 2016)。因此，選擇性預防tau聚集及tau蛋白病進展之抗體可用以治療tau蛋白病（諸如AD）及其他神經退化性疾病。

雖然血腦障壁(blood-brain barrier, BBB)防止有害物質進入腦部且對腦內恆定(brain homeostasis)至關重要，但其亦對將藥物有效率遞送至腦部造成難以克服的障礙。大分子（諸如單株抗體及其他生物治療劑）具有治療/偵測中樞神經系統(central nervous system, CNS)中之病理的極大治療/診斷潛力。然而，BBB防止其等進入腦部之途徑。先前研究已說明，僅極小百分比（大約0.1%）的注入血流中之IgG能夠穿透BBB進入CNS隔室中(Felgenhauer, Klin.Wschr.52: 1158-1164, 1974))。由於抗體在CNS內之低濃度，此將限制任何藥理效應。

已研究許多方法以改善治療性單株抗體(mAb)之腦部遞送，包括使用受體介導之胞吞轉送(receptor-mediated transcytosis, RMT)。RMT利用BBB管腔側上大量表現的受體以用於透過腦內皮細胞進行轉運。先前為了產生用於將治療性mAb遞送至腦中的臨床上可行平台的努力一直專注於抗體工程改造上以增加胞吞轉送的效率，通過觀察結合價、pH依賴性、及親和力取得增益（綜述於Goulatis et al., 2017, Curr Opin Struct Biol45: 109-115）。然而，轉用於NHP及臨床上已受限於目標介導之藥物處置(TMDD)所致之快速周邊清除及急性網狀紅血球耗盡所致之安全性(Gadkar, 2016, Eur J Pharm Biopharm. 2016 Apr;101:53-61)。轉鐵蛋白受體(TfR)、特別是TfR1介導載鐵轉鐵蛋白(Tf)自血液轉運至腦部、及鐵耗盡Tf返回血液(Kawabata, Free Radical Biology & Medicine,133, 46–54, 2019)。已將抗TfR1單株抗體用以將藥物遞送至腦部(Burkhart, et al. Progress in neurobiology,181, 101665, 2019)。然而，抗TfR1單株抗體之安全性責任及不良藥物動力學(pharmacokinetics, PK)已妨礙其作為BBB載劑之臨床開發。

因此，需要可用以跨BBB及靶向3pE Aβ及/或PHF-tau以用於免疫療法之抗成對螺旋絲(PHF) tau/抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β/抗TfR抗體或其抗原結合片段。

如所實施且完整描述，本發明係關於結合至在第三殘基處具有焦麩胺酸之類澱粉蛋白β (3pE Aβ)、結合至轉鐵蛋白受體(TfR)、及結合至成對螺旋絲(PHF)-tau之多特異性抗體及其抗原結合片段；產生結合至3pE Aβ、TfR、及PHF-tau之多特異性抗體或其抗原結合片段之方法；使用此類多特異性抗體或其抗原結合片段之檢定方法；及本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段用於製造藥劑之用途，該藥劑係用於治療神經病症（諸如例如阿茲海默症及其他β類澱粉蛋白相關疾病）之至少一種病變或症狀、延緩其發作、或使其逆轉。

在一個一般態樣中，本申請案係關於一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含能夠特異性結合至焦麩胺酸類澱粉蛋白β之至少一個第一抗原結合區、能夠特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR)之第二抗原結合區、及能夠特異性結合至成對螺旋絲(PHF)-tau之第三抗原結合區。在某些實施例中，(a)第一抗原結合區包含(i)第一重鏈可變區(VH1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 8或16、9或17、及10之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及(ii)第一輕鏈可變區(VL1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 11、12、及13之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；(b)第二抗原結合區包含(i)第二重鏈可變區(VH2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 1、2、及3之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及(ii)第二輕鏈可變區(VL2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 4、5、及6之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；且(c)第三抗原結合區包含(i)第三重鏈可變區(VH3)，其包含分別包含SEQ ID NO:28、29、及30之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及(ii)第三輕鏈可變區(VL3)，其包含分別包含SEQ ID NO:31、32、及33之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。

在某些實施例中，該VH1包含與SEQ ID NO:14至少90%同一的胺基酸序列；且該VL1包含與SEQ ID NO:15至少90%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，該VH1包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；且該VL1包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。

在某些實施例中，第二抗原結合區包含單鏈可變片段(scFv)抗體或其抗原結合片段，該scFv或其抗原結合片段包含VH2及VL2。scFv可例如包含與SEQ ID NO:7至少90%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，scFV包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。

在某些實施例中，多特異性抗體或其抗原結合片段可例如包含(i)包含VH3及VL3之第一重鏈(HC1)、包含第一Fc區(Fc1)之第一重鏈恆定區、及scFv；(ii)包含VH1之第二重鏈(HC2)、及包含第二Fc區(Fc2)之第二重鏈恆定區；及(iii)各自包含VL1之第一輕鏈(LC)、及輕鏈恆定區。

在某些實施例中，scFv係經由連接子、更具體而言為包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的連接子連接至第一重鏈恆定區之羧基端。

在某些實施例中，相較於野生型Fc區，Fc1及Fc2各自包含一或多個異二聚體突變，諸如分別為第一及第二經修飾之異二聚體CH3域；具體而言，該Fc1在位置T350、L351、F405、及Y407處包含胺基酸修飾，且該Fc2在位置T350、T366、K392、及T394處包含胺基酸修飾，其中在位置T350處之胺基酸修飾係T350V、T350I、T350L、或T350M；在位置L351處之胺基酸修飾係L351Y；在位置F405處之胺基酸修飾係F405A、F405V、F405T、或F405S；在位置Y407處之胺基酸修飾係Y407V、Y407A、或Y407I；在位置T366處之胺基酸修飾係T366L、T366I、T366V、或T366M，在位置K392處之胺基酸修飾係K392F、K392L、或K392M，且在位置T394處之胺基酸修飾係T394W，且其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引，更具體而言，該Fc1包含胺基酸修飾T350V、L351Y、F405A、及Y407V，且該Fc2包含胺基酸修飾T350V、T366L、K392L、及T394W。

在某些實施例中，Fc1及Fc2中之至少一者包含增強多特異性抗體或其抗原結合片段與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的一或多個突變，較佳地一或多個突變增強在酸性pH下之結合，更佳地Fc1及Fc2中之至少一者具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。

在某些實施例中，Fc1及Fc2中之至少一者包含一或多個突變，該一或多個突變降低或消除效應功能，較佳地Fc1及Fc2中之至少一者在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329處具有一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。

本申請案亦提供一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈，該第一重鏈包含與SEQ ID NO:24至少90%同一的胺基酸序列；及第一輕鏈，該第一輕鏈包含與SEQ ID NO:25至少90%同一的胺基酸序列；及第二重鏈，該第二重鏈包含與SEQ ID NO:26至少90%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第一重鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列，第一輕鏈包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，且第二重鏈包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。

本申請案之另一個一般態樣係關於一種經分離核酸，其編碼本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段。本申請案亦提供一種包含本申請案之經分離核酸之載體、一種包含本申請案之核酸或載體之宿主細胞。

本申請案之另一個一般態樣係關於一種產生本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段之方法。該方法包含在產生多特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養本申請案之宿主細胞、及自細胞或細胞培養物回收多特異性抗體或其抗原結合片段。

進一步提供一種醫藥組成物，其包含本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。

本申請案之另一個一般態樣係關於一種治療或偵測有需要對象之神經病症的方法，其包含向該對象投予有效量的本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或醫藥組成物。較佳地，神經病症係選自由下列所組成之群組：神經退化性疾病（諸如路易氏體病(Lewy body disease)、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多重系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病(tauopathy)（諸如阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（諸如牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群(Creutz-feldt-Jakob syndrome)、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性癱瘓、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症(nervous system heterodegenerative disorder)（諸如Canavan病、亨丁頓舞蹈症(Huntington's disease)、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群(Cockayne syndrome)、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病(lafora disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（諸如匹克症(Pick's disease)及脊髓小腦性失調症）、及CNS及/或腦部之癌症（諸如身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。

亦提供治療有需要對象中與形成含β類澱粉蛋白斑塊相關之病況的方法。該方法包含向有需要對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。病況可例如係阿茲海默症。病況可例如選自由下列所組成之群組：與三染色體21（唐氏症）相關之失智症、瀰漫性路易氏體病、包涵體肌炎、大腦類澱粉血管病變、及荷蘭型遺傳性大腦出血伴類澱粉沉積症(HCHWA-D)。

亦提供在有需要對象中減少與阿茲海默症相關之斑塊的方法。該方法包含向有需要對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。

亦提供在有需要對象中預防3pE Aβ之播種活性(seeding activity)的方法。該方法包含向有需要對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。

亦提供在有需要對象中阻斷tau播種的方法。該方法包含向有需要對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。

亦提供治療有需要對象中tau蛋白病的方法。該方法包含向有需要對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。

亦提供減少有需要對象中病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法。該方法包含向有需要對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。在某些實施例中，tau蛋白病係選自由下列所組成之群組：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症(tangle only dementia)、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多重系統萎縮、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌肉失養症、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

本發明之其他態樣、特徵、及優點自以下揭露（包括本發明之實施方式及其較佳實施例、及隨附之申請專利範圍）將為顯而易見的。

各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書中引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或類似者的論述，其目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。

除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本發明有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所定之意義。在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，如同在本文中完整陳述。

必須注意的是，本文及隨附之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確規定。

除非另外指示，否則在一系列元件之前的用語「至少(at least)」應理解為指系列中之每一元件。所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明的特定實施例的許多等效物。該等等效物意欲涵蓋於本發明中。

除非另有說明，在本文中描述之任何數值（諸如濃度或濃度範圍）應理解為在所有情況下皆受到用語「約(about)」之修飾。因此，數值一般包括記載值之± 10%。例如，10 mg之劑量包括9 mg至11 mg。如本文中所使用，數值範圍之使用明確包括所有可能的子範圍、在該範圍內之所有個別數值，包括在此類範圍內之整數及該等值之分數，除非上下文另有明確指示。

如本文中所使用，用語「包含(comprises/comprising)」、「包括(includes/including)」、「具有(has/having)」、或「含有(contains/containing)」或其等之任何其他變體將理解為隱含包括所述整體或整體之群，但不排除任何其他整體或整體之群，且意欲為非排他性或開放式的。例如，包含元件清單之組成物、混合物、程序、方法、物品、或設備不一定僅限於該等元件，但可包括未明確列示或為此組成物、混合物、程序、方法、物品、或設備固有之其他元件。再者，除非明示相反說明，「或(or)」係指包括性的「或」而非排他性的「或」。例如，下列任一者皆滿足條件A或B：A為真（或存在）且B為偽（或不存在）、A為偽（或不存在）且B為真（或存在）、及A及B兩者皆為真（或存在）。

如本文中所使用，多個所述元件之間的連接用語「及/或(and/or)」係理解為涵蓋個別及組合選項兩者。例如，其中兩個元件係藉由「及/或」連接時，第一選項係指第一元件在沒有第二元件的情況下之適用性。第二選項係指第二元件在沒有第一元件的情況下之適用性。第三選項係指第一元件及第二元件一起之適用性。這些選項之任一者應理解為落入該含義內，並因此滿足如本文中所使用之用語「及/或」之要求。該等選項之多於一者的並行適用性亦應理解為落入該含義內，並因此滿足用語「及/或」之要求。

當在本文中使用時，「由…所組成(consisting of)」排除申請專利範圍要件中未指明之任何元件、步驟、或成分。當在本文中使用時，「基本上由…組成(consisting essentially of)」不排除不實質上影響申請專利範圍之基本及新穎特性之材料或步驟。當任何前述用語「包含(comprising)」、「含有(containing)」、「包括(including)」、及「具有(having)」在本文中用於本發明之態樣或實施例之上下文中時，可用用語「由……所組成(consisting of)」或「基本上由……所組成(consisting essentially of)」置換，以改變本揭露之範疇。

否則用語「抗體(antibody)」在本文中係以最廣泛的意義使用，且具體包括全長單株抗體、多株抗體、及抗原結合片段（除非上下文中另有說明或牴觸）、抗體變體、及其多特異性分子，只要其等展現出所欲生物活性。通常而言，全長抗體係一種醣蛋白，其包含由雙硫鍵互連之至少兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈、或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區（在本文中縮寫為VH）及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域CH1、CH2、及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區（在本文中縮寫為VL）及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域CL。VH區及VL區可進一步細分成多個高度變異區（稱為互補決定區(CDR)），其間穿插更加保守之區（稱為架構區(framework region, FR)）。各VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，以下列順序自胺基至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原交互作用之結合域。與抗體產生相關之抗體分子結構及各種技術的一般原理係提供於例如Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)。

取決於其重鏈之恆定域之胺基酸序列，可將全長抗體指派至不同「類別(class)」。全長抗體有五大類別：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，且其中數種可進一步分為「子類別(subclass)」（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及IgA2。對應於不同類別的抗體之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ、及µ。不同類別的免疫球蛋白之次單元結構及三維構形係熟知的。

「抗體」亦可係重鏈上之單一可變域(VHH)抗體，亦稱為僅重鏈抗體(HcAb)，其不含輕鏈且可藉由駱駝或鯊魚自然形成。HcAb之抗原結合部分包含VHH片段。

如本文中所使用，用語「重組抗體(recombinant antibody)」係指由包含編碼該抗體之核酸的重組宿主細胞表現的抗體（例如嵌合、人源化、或人類抗體或其抗原結合片段）。用於產生重組抗體之「宿主細胞(host cell)」之實例包括：(1)哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤細胞（包括YO及NSO細胞）、幼倉鼠腎臟(BHK)、Hela、及Vero細胞；(2)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、及Tn5；(3)植物細胞，例如屬於菸草屬(genus Nicotiana)之植物（例如菸草( Nicotiana tabacum)）；(4)酵母細胞，例如屬於酵母屬（例如啤酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae)）或麴菌屬（例如黑麴菌( Aspergillus niger)）者；(5)細菌細胞，例如大腸桿菌( Escherichia, coli)細胞或枯草桿菌( Bacillus subtilis)細胞等。

抗體之「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係包含全長抗體之能夠與抗原可偵測地結合之部分的分子，一般包含至少VH區之一或多個部分。抗原結合片段包括多價分子（包含抗體之一、二、三、或更多個抗原結合部分）及單鏈構築體，其中VL區及VH區（或其所選部分）係藉由合成連接子或藉由重組方法連接，以形成功能性、抗原結合分子。抗原結合片段亦可係單域抗體(sdAb)（亦稱為奈米抗體(nanobody)），其係由單一單體可變抗體域(VHH)所組成之抗體片段。雖然抗體之一些抗原結合片段可藉由較大抗體分子（例如酶切割）之實際碎斷而獲得，但大多數一般係藉由重組技術產生。本發明之抗體可製備為全長抗體或其抗原結合片段。抗原結合片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab) ₂、F(ab') ₂、F(ab) ₃、Fv（一般為抗體之單臂之VL域及VH域）、單鏈Fv（scFv，參見例如Bird et al., Science 1988; 242:423-426；及Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883）、dsFv、Fd（一般為VH域及CH1域）、及dAb（一般為VH域）片段；VH域、VL域、VHH域、及V-NAR域；包含單一VH及單一VL鏈之單價分子；微抗體(minibody)、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、及κ抗體(kappa body)（參見例如Ill et al., Protein Eng 1997; 10:949-57）；駱駝IgG；IgNAR；以及一或多種分離CDR或功能性互補位(paratope)，其中該分離CDR或抗原結合殘基或多肽可締合或連接在一起以便形成功能性抗體片段。各種類型的抗體片段已描述或綜述於例如Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23:1126-1136；WO2005040219、及已公開之美國專利申請案20050238646及20020161201。抗體片段可使用習知重組或蛋白質工程改造技術獲得，且該等片段可以與完整抗體相同之方式針對抗原結合或其他功能進行篩選。

已針對抗體片段之生產開發出各種技術。傳統上，此等片段係經由全長抗體之蛋白水解消化衍生（參見例如Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992)；及Brennan et al., Science, 229:81 (1985)）。然而，這些片段現在可直接由重組宿主細胞生產。替代地，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌( E. coli)回收並經化學偶合，以形成F(ab')2片段(Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992))。根據另一方法，F(ab')2片段可直接自重組宿主細胞培養物中分離出來。在其他實施例中，選用之抗體係單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 1993/16185；美國專利第5,571,894號；及美國專利第5,587,458號。例如，抗體片段亦可係「線性抗體(linear antibody)」，例如美國專利第5,641,870號中所述。此類線性抗體片段可係單特異性或雙特異性的。

如本文中所使用，用語「抗體衍生物(antibody derivative)」係指包含全長抗體或其抗原結合片段之分子，其中一或多個胺基酸經化學修飾或取代。可用於抗體衍生物之化學修飾包括例如烷化、聚乙二醇化(PEGylation)、醯化、酯形成或醯胺形成、或類似者，例如用於將抗體連接至第二分子。例示性修飾包括聚乙二醇化（例如半胱胺酸聚乙二醇化）、生物素化、放射性標示、及與第二劑（諸如細胞毒性劑）之接合。

本文中之抗體包括抗原結合或生物活性經改變之「胺基酸序列變體」。此類胺基酸改變之實例包括對抗原具有增強親和力之抗體（例如「親和力成熟(affinity matured)」抗體）及具有經改變Fc區（若存在）之抗體，例如具有經改變（增加或減少）之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)（參見例如Presta, L.之WO 00/42072及Iduosogie等人之WO 99/51642）；及/或經增加或減少之血清半衰期（參見例如Presta, L.之WO00/42072）。

「多特異性分子」包含一種抗體、或其抗原結合片段，其係與至少一個其他功能性分子（例如，另一個肽或蛋白質，諸如另一個抗體或受體之配體）締合或連接，藉以形成與至少兩種不同結合位點或目標分子結合之分子。例示性多特異性分子包括雙特異性抗體及連接至可溶受體片段或配體之抗體。

如本文中所使用，用語「人類抗體(human antibody)」意欲包括具有可變區之抗體，其中架構及CDR區兩者皆衍生自（亦即，同一或基本上同一於）人類生殖系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦「衍生自」人類生殖系免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體可包括非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如，藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入之突變）。然而，如本文中所使用，用語「人類抗體」並不意欲包括其中衍生自另一哺乳動物物種諸如小鼠之生殖系之CDR序列已移植至人類架構序列上之抗體。

「人源化」抗體係含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的人類/非人類嵌合抗體。在大多數情況下，人源化抗體係人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接受者之高度變異區的殘基被來自具有所欲特異性、親和力、及能力的非人類物種（供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔、或非人類靈長類）之高度變異區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基經對應的非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含在接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改善抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含實質上所有至少一個（及典型地兩個）可變域，其中所有或實質上所有高度變異迴圈對應非人類免疫球蛋白之高度變異環，並且所有或實質上所有FR殘基係人類免疫球蛋白序列之FR殘基。人源化抗體亦可任選地包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，一般為人類免疫球蛋白之恆定區。關於進一步細節，參見例如Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及Presta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-596 (1992)、WO 92/02190、美國專利申請案20060073137、及美國專利第6,750,325號、第6,632,927號、第6,639,055號、第6,548,640號、第6,407,213號、第6,180,370號、第6,054,297號、第5,929,212號、第5,895,205號、第5,886,152號、第5,877,293號、第5,869,619號、第5,821,337號、第5,821,123號、第5,770,196號、第5,777,085號、第5,766,886號、第5,714,350號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,530,101號、第5,585,089號、及第5,225,539號。

當用於本文中時，用語「高度變異區(hypervariable region)」係指抗體負責抗原結合之胺基酸殘基。高度變異區通常包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基（輕鏈可變域中之殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、及89-97 (L3)，及重鏈可變域中之殘基31-35 (H1)、50-65 (H2)、及95-102 (H3)；(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)）及/或來自「高度變異環(hypervariable loop)」之殘基（輕鏈可變域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、及91-96 (L3)，及重鏈可變域中之殘基26-32 (H1)、53-55 (H2)、及96-101 (H3)；Chothia and Lesk, J.Mol. Biol. 1987; 196:901-917）。一般而言，此區中之胺基酸殘基的編號係藉由上述Kabat et al.中所述之方法執行。諸如「Kabat位置」、「如Kabat中之可變域殘基編號」、及「根據Kabat」之片語在本文中係指用於重鏈可變域或輕鏈可變域之此編號系統。使用Kabat編號系統，肽之實際線性胺基酸序列可含有較少或額外的對應於可變域之FR或CDR的縮短或插入之胺基酸。例如，重鏈可變域可包括CDR H2之殘基52後的單一胺基酸插入（根據Kabat之殘基52a）及重鏈FR殘基82後的插入殘基（例如，根據Kabat之殘基82a、82b、及82c等）。給定抗體之Kabat殘基編號可藉由比對抗體序列之同源性區與「標準」Kabat編號序列來判定。

「架構區」或「FR」殘基係本文中所定義之CDR以外的VH或VL殘基。

「表位(epitope)」或「結合位點(binding site)」係抗原結合肽（諸如抗體）特異性結合之抗原上的區域或區。蛋白質表位可包含直接涉及結合之胺基酸殘基（亦稱為表位之免疫優勢(immunodominant)組分）及其他非直接涉及結合之胺基酸殘基（諸如被特異性抗原結合肽有效阻斷之胺基酸殘基（換言之，該胺基酸殘基係在特異性抗原結合肽之「溶劑排除表面(solvent-excluded surface)」及/或「足跡(footprint)」內））。

「互補位(paratope)」係抗體之特異性結合抗原之抗原結合部分的區域或區。除非上下文中另有說明或明顯牴觸，否則互補位可包含直接涉及表位結合之胺基酸殘基（其中數個一般係在CDR中）及其他非直接涉及結合之胺基酸殘基（諸如被特異性結合抗原有效阻斷之胺基酸殘基（換言之，該胺基酸殘基係在特異性結合抗原之「溶劑排除表面」及/或「足跡」內））。

作為參考抗體之「結合至相同表位之抗體」係指在競爭檢定中阻斷參考抗體與其抗原之結合達50%或更多的抗體，且相反地，參考抗體在競爭檢定中阻斷抗體與其抗原之結合達50%或更多。

「經分離」抗體係已與其自然環境之組分分離者。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳（例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳）或層析（例如，離子交換或逆相HPLC）所判定。關於抗體純度評估方法之綜述，參見例如Flatman et al, J.Chromatogr.B 848:79-87 (2007)。

與本發明之方法有關的用語「投予(administering)」意指藉由使用本發明之接合物或其形式、組成物、或藥劑來治療性地或疾病預防性地預防、治療、或改善如本文所述之症候群、病症、或疾病的方法。此類方法包括在療程期間的不同時間、或以組合形式並行投予有效量的該抗體、其抗原結合片段、或接合物、或其形式、組成物、或藥劑。本發明之方法應被理解為包括所有習知的治療性治療方案。

目標抗體「阻斷」目標分子與天然目標配體之結合的能力，意指該抗體（在使用可溶或細胞-表面相關目標及配體分子之檢定中）可以劑量依賴性方式可偵測地降低目標分子與配體之結合，其中目標分子於該抗體不存在下會可偵測地結合至配體。

「血腦障壁」或「BBB」係指周邊循環與腦及脊髓之間的生理障壁，由腦微血管內皮細胞膜內之緊密接合點形成，產生限制分子轉運進入腦中之緊密障壁。BBB可限制甚至非常小的分子，諸如尿素（60道耳頓），進入腦中之轉運。BBB之實例包括腦中之BBB、脊髓內之血液脊髓障壁、及視網膜內之血液-視網膜障壁，其等所有均係在CNS內之連續微血管障壁。BBB亦涵蓋血液-CSF障壁（脈絡叢），其中障壁包含室管膜細胞而非微血管內皮細胞。

「血腦障壁受體」（本文中縮寫為「R/BBB」）係一種在腦內皮細胞上表現的細胞外膜連接受體蛋白，其能夠跨BBB轉運分子或用於轉運外源性投予之分子。R/BBB之實例包括但不限於轉鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、類胰島素生長因子受體(IGF-R)、低密度脂蛋白受體（包括但不限於低密度脂蛋白受體相關蛋白1 (LRP1)及低密度脂蛋白受體相關蛋白8 (LRP8)）、及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)。本文中之例示性R/BBB係轉鐵蛋白受體(TfR)。

「中樞神經系統(central nervous system)」或「CNS」係指控制身體功能之神經組織之複合體，且包括腦部及脊髓。

如本文中所使用，「接合物(conjugate)」係指共價連接至一或多個異源分子（包括但不限於治療性肽或蛋白質、抗體、標示、或神經病症藥物）之蛋白質。

如本文中所使用，用語「偶合(coupled)」係指將二或更多個物件接合或連接在一起。當用於化學或生物化合物時，偶合可指二或更多個化學或生物化合物之間的共價連接。舉非限制性實例來說，本發明之抗體可與受到關注的肽偶合以形成抗體偶合肽。可通過特定化學反應形成抗體偶合肽，化學反應經設計以將抗體接合至肽。在某些實施例中，本發明之抗體可與本發明之肽經由連接子共價偶合。連接子可例如先共價連接至抗體或肽，接著再共價連接至肽或抗體。

藥劑（例如醫藥配方）之「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指有效達到所欲治療或疾病預防結果所需之劑量及時間段的量。

如本文中所使用，「連接子(linker)」係指共價連接兩個不同實體之化學連接子或單鏈肽連接子。連接子可用以連接本發明之抗體或其片段、血腦障壁穿梭劑(shuttle)、融合蛋白、及接合物中之任兩者。連接子可連接例如scFv中之VH及VL、或抗體或其抗原結合片段與治療性分子（諸如第二抗體）。在一些實施例中，若單價結合實體包含針對TfR（較佳地huTfR1）之scFv，且治療性分子包含針對至少一種CNS目標（諸如焦麩胺酸類澱粉蛋白β及/或PHF-tau）之抗體，則連接子可將scFv連接至針對焦麩胺酸類澱粉蛋白β或PHF-tau之抗體。可使用包含由肽鍵連接之1至25個胺基酸（諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個胺基酸）的單鏈肽連接子。在某些實施例中，胺基酸係選自二十個天然存在的胺基酸。在某些其他實施例中，胺基酸之一或多者係選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、及離胺酸。亦可使用化學連接子，諸如烴連接子、聚乙二醇(PEG)連接子、聚丙二醇(PPG)連接子、多醣連接子、聚酯連接子、由PEG及嵌入式雜環所組成之混成連接子、及烴鏈。

如本文中所使用，「神經病症」係指影響CNS及/或在CNS中具有病因之疾病或病症。例示性CNS疾病或病症包括但不限於神經病變、類澱粉沉積症、癌症、眼部疾病或病症、病毒或微生物感染、發炎、缺血、神經退化性疾病、癲癇、行為障礙、及溶體儲積症。為了本申請案之目的，CNS將理解為包括眼睛，其正常係由血視網膜障壁而與身體其他地方隔離。神經病症之具體實例包括但不限於神經退化性疾病（包括但不限於路易氏體病、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多重系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病（包括但不限於阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（包括但不限於牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性癱瘓、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症（包括但不限於Canavan病、亨丁頓舞蹈症、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病、妥瑞氏症候群、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病、雷特氏症候群、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（包括但不限於匹克症及脊髓小腦性失調症）、癌症（例如CNS及/或腦部之癌症，包括身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。

「神經病症藥物」係可用於治療或改善一或多種神經病症之效應的藥物或治療劑。本發明之神經病症藥物包括但不限於小分子化合物、抗體、肽、蛋白質、一或多種CNS目標之天然配體、一或多種CNS目標之天然配體的經修飾版本、適體(aptamer)、抑制性核酸（亦即小型抑制性RNA (siRNA)及短髮夾RNA (shRNA)）、核酶(ribozyme)、或任何前述者之活性片段。本文描述本發明之例示性神經病症藥物，且包括但不限於：抗體、適體、蛋白質、肽、抑制性核酸、及小分子、及任何前述者之活性片段，其等本身或特異性識別且/或作用於（亦即抑制、活化、或偵測）CNS抗原或目標分子，諸如但不限於類澱粉前驅蛋白或其部分、類澱粉蛋白β、β-分泌酶、γ-分泌酶、tau、α-突觸核蛋白、parkin、亨丁頓蛋白、DR6、早老素、ApoE、神經膠質瘤或其他CNS癌症標記、及神經營養因子。神經病症藥物之非限制性實例及其對應病症可用以治療：腦源性神經營養因子(BDNF)、慢性腦損傷（神經新生）、纖維母細胞生長因子2 (FGF-2)、抗表皮生長因子受體腦癌、(EGFR)抗體、神經膠質細胞系衍生神經因子巴金森氏症、(GDNF)、腦源性神經營養因子(BDNF)肌萎縮性脊髓側索硬化症、抑鬱、腦部之溶小體酶溶小體儲積症、睫狀神經營養因子(CNTF)肌萎縮性脊髓側索硬化症、神經調節蛋白1思覺失調症、抗HER2抗體（例如曲妥珠單抗(trastuzumab)）HER2陽性癌症之腦轉移。

用語「醫藥配方(pharmaceutical composition)」係指一種製劑，其呈允許其中所含有的活性成分的生物活性有效之形式，且該製劑不含有對該配方所投予之對象具有不可接受之毒性的額外組分。

如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑或稀釋劑(pharmaceutically acceptable carrier or diluent)」意指適合於向個體投予之任何物質。例如，醫藥上可接受之載劑可係無菌水溶液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或注射用水(water-for-injection)。

如本文中所使用，「醫藥上可接受之鹽(pharmaceutically acceptable salts)」意指化合物的生理及醫藥上可接受之鹽，諸如寡聚化合物或寡核苷酸，即保留親本化合物的所欲生物活性且不會對其產生非所欲之毒理作用的鹽。

用於本發明中之醫藥上可接受之酸性/陰離子性鹽包括但不限於：乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣(calcium edetate)、樟腦磺酸鹽(camsylate)、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、二氫氯化物、依地酸鹽(edetate)、乙二磺酸鹽(edisylate)、丙酸酯十二烷硫酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate)、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽(glyceptate)、葡萄糖酸鹽(gluconate)、麩胺酸鹽(glutamate)、羥乙醯胺基苯砷酸鹽(glycollylarsanilate)、己基間苯二酚鹽(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氫溴酸鹽、氫氯酸鹽、羥基萘甲酸鹽(hydroxynaphthoate)、碘化物、2-羥乙磺酸鹽(isethionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、苯乙醇酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、黏酸鹽(mucate)、萘磺酸鹽(napsylate)、硝酸鹽、巴摩酸鹽(pamoate)、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽(teoclate)、甲苯磺酸鹽以及三碘化物。有機或無機酸亦包括但不限於：氫碘酸、過氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羥乙基磺酸、草酸、2-萘磺酸、對甲苯磺酸、環己磺醯胺酸、醣酸或三氟乙酸。醫藥上可接受之鹼性/陽離子性鹽包括且不限於鋁、2-胺基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇（亦稱為參(羥基甲基)胺基甲烷、托美滇(tromethane)或「TRIS」）、氨、苯札辛(benzathine)、三級丁胺、鈣、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、環己胺、二乙醇胺、乙二胺、鋰、L-離胺酸、鎂、美古明(meglumine)、N-甲基-D-還原葡糖胺、哌啶、鉀、普魯卡因(procaine)、奎寧、鈉、三乙醇胺、或鋅。

「多肽(polypeptide)」或「蛋白質(protein)」意指包含至少二個以肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。少於50個胺基酸的小型多肽可稱為「肽(peptide)」。

當用於指稱胺基酸序列時，用語「序列同一性(sequence identity)」、或「序列同一性百分比(%) (percent (%) sequence identity)」、或「同一性% (% identity)」、或「與...%同一(% identical to)」描述相較於構成胺基酸序列總長度的胺基酸殘基數目，二或更多個經比對胺基酸序列之同一胺基酸的匹配（「命中(hit)」）數目。換言之，使用比對，針對二或更多個序列，當比較該等序列並對其進行比對以獲得最大對應性（如使用所屬技術領域中已知的序列比較演算法所測量）時，或當手動比對且目視檢查時，可判定相同胺基酸殘基之百分比（例如，在胺基酸序列之全長上有90%、91%、92%、93%、94%、95%、97%、98%、99%、或100%同一性）。判定序列同一性所比較的序列可能因胺基酸的（多個）取代、（多個）添加、或（多個）缺失而不同。用於比對蛋白質序列之合適程式係所屬技術領域中具有通常知識者所習知。例如，蛋白質序列之序列同一性百分比可用諸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA、或BLAST之程式，例如使用NCBI BLAST演算法判定(Altschul SF, et al (1997), Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。

在兩個胺基酸序列之上下文中，用語「實質上同一(substantially identical)」意指序列當最佳比對時（諸如藉由程式GAP或BESTFIT使用預設間隙權重）共享至少約50百分比序列同一性。一般而言，實質上同一之序列將展現至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約95、至少約98、或至少約99百分比序列同一性。

「特異性結合(specific binding/specifically bind)」或「結合(bind)」係指抗體以較對其他抗原更大的親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般而言，抗體以下列解離常數(K _D)結合至抗原或抗原內之表位：約1×10 ^-8M或更低、例如約1×10 ^-9M或更低、約1×10 ^-10M或更低、約1×10 ^-11M或更低、或約1×10 ^-12M或更低，一般以較其結合至非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）之K _D低至少一百倍的K _D結合。K _D係抗體與其抗原之間的平衡解離常數，即k _off/k _on之比率。K _D與親和力逆相關。「結合速率(on-rate)」(k _on)係用以表徵抗體與其目標結合的速度之常數。「解離速率(off-rate)」(k _off)係用以表徵抗體與其目標解離的速度之常數。解離常數K _D可使用標準程序測量。例如，抗體之K _D可藉由使用表面電漿共振（諸如藉由使用生物感測器系統，例如Biacore ^®系統）、或藉由使用生物層干涉技術（諸如Octet RED96系統）判定。抗體之K _D值越小，抗體結合至目標抗原之親和力越高。然而，特異性結合至抗原或抗原內之表位之抗體可對其他相關抗原具有交叉反應性，例如對來自其他物種（諸如人類或猴，例如食蟹獼猴( Macaca fascicularis, cynomolgus, cyno)、黑猩猩( Pan troglodytes, chimpanzee, chimp)、或狨( Callithrix jacchus, common marmoset, marmoset)）之相同抗原（同源物(homolog)）具有交叉反應性。當單特異性抗體特異性結合一種抗原或一種表位時，雙特異性抗體特異性結合二種不同的抗原或二種不同的表位。

如本文中所使用，用語「對象(subject)」係指哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物（例如牛、綿羊、貓、狗、及馬）、靈長類（例如人類及非人類靈長類，諸如猴）、兔、及嚙齒動物（例如小鼠及大鼠）。在某些實施例中，個體或對象係人類。當對象係人類，其亦可稱為「患者(patient)」。

如本文中所使用，用語「轉鐵蛋白受體(transferrin receptor)」或「TfR」係指藉由受體介導之胞吞作用過程進行之細胞鐵吸收所必需的細胞表面受體。轉鐵蛋白之載體蛋白。TfR涉及脊椎動物之鐵吸收，並回應於胞內鐵濃度而調控。通過受體介導之胞吞作用將轉鐵蛋白-鐵複合物內化來導入鐵。已表徵人類中之兩種轉鐵蛋白受體，轉鐵蛋白受體1、及轉鐵蛋白受體2。此兩種受體均為跨膜醣蛋白。TfR1係一種高親和力的普遍表現受體。TfR2以低於TfR1之25至30倍的親和力結合至轉鐵蛋白。TfR2之表現僅限於某些細胞類型且不受胞內鐵濃度影響。在一個實施例中，TfR係人類TfR，其例如包含如Schneider et al. Nature 311: 675-678 (1984)中之胺基酸序列。其可具有約180,000道耳頓之分子量，並具有兩個子單元其各自之表觀分子量為約90,000道耳頓。較佳地，TfR係人類TfR1。

如本文中所使用，「目標抗原(target antige)」或「腦部目標(brain target)」係指表現於CNS（包括腦部）中之抗原及/或分子，其可用抗體或小分子加以靶向。此類抗原及/或分子之實例包括不限於：β-分泌酶1 (BACE1)、類澱粉蛋白β (Aβ)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、Tau、載脂蛋白E4 (ApoE4)、α-突觸核蛋白、CD20、亨丁頓蛋白、普里昂蛋白(PrP)、富白胺酸重複激酶2 (LRRK2)、parkin、早老素1、早老素2、γ分泌酶、死亡受體6 (DR6)、類澱粉前驅蛋白(APP)、p75神經營養因子受體(p75NTR)、及凋亡蛋白酶6。在一些實施例中，目標抗原係BACE1。在一些實施例中，目標抗原係類澱粉蛋白β，特別是焦麩胺酸類澱粉蛋白β。

如本文中所使用，用語「tau」或「tau蛋白(tau protein)」係指具有多種異構體之豐富的中樞神經及周邊神經系統蛋白。在人類中樞神經系統(CNS)中，由於選擇性剪接而存在大小範圍在長度為352至441個胺基酸之六種主要的tau異構體(Hanger et al., Trends Mol Med.15:112-9, 2009)。異構體因調控地包括0至2個N端插入及3或4個串聯排列之微管結合重複序列而彼此不同，且稱為0N3R、1N3R、2N3R、0N4R、1N4R、及2N4R。如本文中所使用，用語「對照tau (control tau)」係指不含磷酸化及其他轉譯後修飾之2N4R tau異構體。如本文中所使用，用語「tau」包括包含突變之蛋白質，該等突變例如全長野生型tau之點突變、片段、插入、缺失、及剪接變體。用語「tau」亦涵蓋tau胺基酸序列之轉譯後修飾。轉譯後修飾包括但不限於磷酸化。如本文中所使用，片語「tau蛋白之磷酸化S433」及類似片語係指在全長野生型tau蛋白之某一位置處之磷酸化胺基酸，例如在位置433之絲胺酸。

tau結合微管且調控貨物(cargo)穿過細胞之運輸，其係可以藉由tau磷酸化而調節之過程。在AD及相關病症中，tau之異常磷酸化是普遍的且認為先於及/或觸發tau聚集成原纖維，其稱為成對螺旋絲(PHF)。PHF之主要組分是超磷酸化tau。如本文中所使用，用語「成對螺旋絲-tau (paired helical filament-tau)」或「PHF-tau」係指呈成對螺旋絲之形式的tau聚集物。PHF結構中之兩個主要區域在電子顯微鏡下係明顯的，即毛被(fuzzy coat)及核心絲(core filament)；毛被對蛋白水解敏感且位於絲之外，且絲之蛋白酶抗性核形成PHF之骨架(Wischik et al. Proc Natl Acad Sci USA.85:4884-8, 1988)。

如本文中所使用，「tau蛋白病(tauopathy)」涵蓋涉及tau在腦內之病理性聚集的任何神經退化性疾病。除了家族性及偶發性AD之外，其他例示性tau蛋白病係連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵體肌炎、庫賈氏病、多重系統萎縮、C型尼曼匹克症、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌肉失養症、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、及慢性創傷性腦病變（諸如拳擊手型失智症（拳擊疾病））(Morris et al., Neuron,70:410-26, 2011)。

如本文中所使用，「治療(treatment)」（及其英文文法變化型，諸如「treat」或「treating」）係指試圖改變受治療個體之自然病程的臨床介入，且可出於疾病預防或在臨床病理病程期間執行。所欲治療效應包括但不限於預防疾病發生或再發、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態、及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體係用以延緩疾病發展或減慢疾病進展。

可將抗體或免疫球蛋白指派至五大類別，即IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，此取決於重鏈恆定域胺基酸序列。IgG係五種免疫球蛋白中最穩定的一種，在人類的血清半衰期約為23天。IgA及IgG係進一步細分為同型IgA ₁、IgA ₂、IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、及IgG ₄。四種IgG子類別之各者具有不同的生物功能稱為效應功能。此等效應功能通常通過與Fc受體(FcγR)之交互作用及/或藉由結合C1q及固定補體來介導。與FcγR結合可導致抗體依賴性細胞介導之細胞裂解或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，而與補體因子結合可導致補體介導之細胞裂解或補體依賴性細胞毒性(CDC)。本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段、或待接合或融合至多特異性抗體或其抗原結合片段之治療性或診斷性抗體可不具有或可具有最小效應功能，但仍保留其結合FcRn之能力，該結合可係抗體藉以具有延長之體內半衰期的主要手段。

FcγR或補體（例如C1q）與抗體之結合係由所謂的Fc部分結合位點處界定的蛋白質-蛋白質交互作用引起。此類Fc部分結合位點係所屬技術領域中已知的。此類Fc部分結合位點包括例如以胺基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329（編號根據Kabat之EU索引）為特徵。在一些實施例中，本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段、或待接合或融合至多特異性抗體或其抗原結合片段之治療性或診斷性抗體在一或多個Fc部分結合位點中含有一或多個取代以消除效應功能。例如，本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段、或待接合或融合至多特異性抗體或其抗原結合片段之治療性或診斷性抗體可含有Fc區，該Fc區含有下列取代中之一或多者：在殘基233處用脯胺酸取代麩胺酸、在殘基234處用丙胺酸或纈胺酸取代苯丙胺酸、及在殘基235處用丙胺酸或麩胺酸取代白胺酸（EU編號，Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, Md., NIH Publication no. 91-3242）。較佳地，所關注之抗體含有L234A、L235A、及P331S（EU編號，Kabat）之一、二、或三個突變。

子類別IgG1、IgG2、及IgG3之抗體常顯示包括C1q及C3結合之補體活化，而IgG4不活化補體系統且不結合C1q及/或C3。人類IgG4 Fc區相較於其他IgG亞型具有減少之結合FcγR及補體因子的能力。較佳地，本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段、或待接合或融合至多特異性抗體或其抗原結合片段之治療性或診斷性抗體包含衍生自人類IgG4 Fc區之Fc區。更佳地，Fc區含有具有消除效應功能之取代的人類IgG4 Fc區。例如，藉由以Ala取代殘基297處（EU編號）之Asn移除IgG4 Fc區中之N-連結的醣化位點係另一種確保消除殘基效應活性之方法。多特異性抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β/抗轉鐵蛋白受體(TfR)/抗成對螺旋絲(PHF)-tau抗體及其抗原結合片段抗焦麩胺酸類澱粉蛋白 β結合區 /抗焦麩胺酸類澱粉蛋白 β抗體及其抗原結合片段

抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β抗體及其抗原結合片段係先前揭示於WO2020/193644中，其全文以引用方式併入本文中。在一個一般態樣中，本申請案係關於一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含基於先前所述之抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β抗體及其抗原結合片段之抗原結合區。

如本文中所使用，「焦麩胺酸類澱粉蛋白β」,「AβpE3」、或「3pE Aβ」係指與Aβ42寡聚合並沉積於阿茲海默症(AD)腦部中之經修飾之Aβ肽。焦麩胺酸類澱粉蛋白β可作用為錯誤摺疊Ab之種子，此為AD中之主要階段。焦麩胺酸類澱粉蛋白β係所屬技術領域中已知的，參見例如Perez-Garmendia et al., Curr.Neuropharma.11(5):491-8 (2013)；Wittnam et al., JBC 287(11):8154-62 (2012)；及Wang et al., Alzheimer's Dement 12:e12029 (2020)。抗 TfR抗原結合區 /抗 TfR抗體及其抗原結合片段

抗TfR抗體及其抗原結合片段係先前揭示於WO2021/0205358中，其全文以引用方式併入本文中。在一個一般態樣中，本申請案係關於一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含基於先前所述之抗TfR抗體及其抗原結合片段之抗原結合區。抗TfR抗原結合區能夠結合至靈長類TfR，諸如人類TfR或猴TfR，且可最佳化抗原結合區，以將藥劑遞送至有需要對象之腦部。抗TfR抗體與TfR之結合親和力與胞吞轉送效率之間的關係先前已在WO2021/0205358中（其全文以引用方式併入本文中）描述為隨著對TfR之親和力降低，胞吞轉送有所改善(Yu, Zhang et al. 2011, Sci Transl Med 3(84): 84ra44)，令人驚訝地發現，在結合速率及解離速率兩者皆影響腦部濃度的作用下，親和力與胞吞轉送效率之間較先前已描述者更細微的關係。具體而言，需要不會太快或太慢的中性解離速率以獲得藥劑（諸如mAb）之最佳腦部PK及PD，以藉由抗TfR抗體或其抗原結合片段有效遞送。

較佳地，本申請案之抗TfR抗原結合區係pH敏感的，例如其在不同pH下對TfR具有不同結合親和力。例如，本申請案之抗TfR抗原結合區可在中性pH（諸如生理pH（例如pH 7.4））下以高親和力結合至細胞表面TfR，但在內化至內體隔室(endosomal compartment)後，在酸性pH（諸如相對較低的pH（pH 5.0至6.0））下自TfR解離。親和力係兩個部分（例如抗體及抗原）之間結合強度的量度。親和力可以數種方式表示。一種方式係根據交互作用的解離常數(K _D)。K _D可藉由常規方法測量，包括平衡透析或藉由直接測量抗原-抗體解離及締合之速率，分別為k _off(kd或k _dis)及k _on(或ka)速率（參見例如 Nature,1993 361:186-87）。k _off/k _on之比率消去所有與親和力無關之參數，且等於解離常數K _D（大致上參見Davies et al., Annual Rev Biochem,1990 59:439-473）。因此，愈小的K _D意指愈高的親和力。親和力之另一表現係K _a，其為K _D之倒數、或k _on/k _off。因此，愈高的K _a意指愈高的親和力。例如，用於本申請案之組成物及/或方法中之抗TfR抗原結合區可係在中性pH（例如pH 6.8至7.8）（諸如生理pH（例如pH 7.4））下以1奈莫耳(nM, 10 ^-9M)或更高之K _D結合至TfR、且在酸性pH（例如pH 4.5至6.0）（諸如pH5.0）下以10 ^-4sec ^-1或更高之k _dis自TfR解離的抗TfR抗原結合區。

因此，本申請案之一般態樣係關於一種用於將藥劑遞送至有需要對象之腦部的抗TfR抗原結合區，其中該抗TfR抗原結合區在中性pH下以至少1 nM（較佳地1 nM至500 nM）之解離常數K _D、且在酸性pH（較佳地pH 5）下以至少10 ^-4sec ^-1（較佳地10 ^-4至10 ^-1sec ^-1）之解離速率常數k _d結合至轉鐵蛋白受體(TfR)（較佳地人類TfR1）。

在一個實施例中，本申請案之抗TfR抗原結合區在中性pH下具有2 × 10 ^-2至2 × 10 ^-4sec ^-1之解離速率常數k _d，諸如2 × 10 ^-2、1 × 10 ^-2、9 × 10 ^-3、8 × 10 ^-3、7 × 10 ^-3、6 × 10 ^-3、5 × 10 ^-3、4 × 10 ^-3、3 × 10 ^-3、2 × 10 ^-3、1 × 10 ^-3、9 × 10 ^-4、8 × 10 ^-4、7 × 10 ^-4、6 × 10 ^-4、5 × 10 ^-4、4 × 10 ^-4、3 × 10 ^-4、2 × 10 ^-4sec ^-1、或其間之任何值。抗 PHF-tau抗原結合區 /抗 PHF-tau抗體及其抗原結合片段

抗PHF-tau抗體及其抗原結合片段係先前揭示於2021年3月26日申請之美國臨時專利申請案第63/166,254號中，其全文以引用方式併入本文中。在一個一般態樣中，本申請案係關於一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含基於先前所述之抗成對螺旋片段(PHF)-tau抗體及其抗原結合片段之抗原結合區。

在某些實施例中，抗PHF-tau抗原結合區或其抗原結合片段結合PHF-tau。此類抗PHF-tau抗原結合區可具有結合PHF-tau上之磷酸化表位或結合至PHF-tau上之非磷酸化表位的性質。抗PHF-tau抗原結合區可用作治療劑，且用作偵測生物樣本中（例如組織或細胞中）之PHF-tau的研究或診斷試劑。

根據一具體態樣，抗PHF-tau抗原結合區或其抗原結合片段在tau蛋白之C端域中之表位處結合至tau蛋白。在一些實施例中，抗PHF-tau抗原結合區或其抗原結合片段在具有SEQ ID NO:36之胺基酸序列或在該胺基酸序列內之tau蛋白之表位處結合至tau蛋白，其中抗原結合區或其抗原結合片段結合PHF-tau、較佳地人類PHF-tau。較佳地，抗PHF-tau抗原結合區或其抗原結合片段在由SEQ ID NO:36之胺基酸序列所組成或在該胺基酸序列內之tau蛋白之表位處結合至tau蛋白，其中抗原結合區或其抗原結合片段結合PHF-tau、較佳地人類PHF-tau。

在一些實施例中，tau蛋白之表位包含tau蛋白之磷酸化T427、磷酸化S433、及磷酸化S435中之一或多者，但不包含所有的磷酸化T427、磷酸化S433、及磷酸化S435。多特異性抗體及其抗原結合片段

在某些實施例中，多特異性抗體或其抗原結合片段包含能夠特異性結合至焦麩胺酸類澱粉蛋白β之第一抗原結合區、能夠特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR)之第二抗原結合區、及能夠特異性結合至成對螺旋絲(PHF)-tau之第三抗原結合區。在某些實施例中，(a)第一抗原結合區包含(i)第一重鏈可變區(VH1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 8或16、9或17、及10之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及(ii)第一輕鏈可變區(VL1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 11、12、及13之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；(b)第二抗原結合區包含(i)第二重鏈可變區(VH2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 1、2、及3之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及(ii)第二輕鏈可變區(VL2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 4、5、及6之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；且(c)第三抗原結合區包含(i)第三重鏈可變區(VH3)，其包含分別包含SEQ ID NO:28、29、及30之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及(ii)第三輕鏈可變區(VL3)，其包含分別包含SEQ ID NO:31、32、及33之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。

在某些實施例中，多特異性抗體或其抗原結合片段可例如包含(i)包含VH3及VL3之第一重鏈(HC1)、包含第一Fc區(Fc1)之第一重鏈恆定區、及scFv；(ii)包含VH1之第二重鏈(HC2)、及包含第二Fc區(Fc2)之第二重鏈恆定區；及(iii)包含VL1之第一輕鏈(LC)、及輕鏈恆定區。

較佳地，抗TfR抗原結合區係單鏈可變片段(scFv)，該scFv包含經由可撓性連接子共價連接至輕鏈可變區(L _V)之重鏈可變區(H _V)。儘管移除恆定區及引入連接子，scFv可保持原始免疫球蛋白之特異性。在scFv中，域之順序可係H _V-連接子- L _V、或L _V-連接子-H _V。接頭可從頭( de novo)設計或衍生自已知的蛋白質結構，以在橋接scFv之可變結構域時提供可相容的長度及構形，而沒有嚴重的空間干擾。連接子可具有10至約25個胺基酸長度。較佳地，連接子係在可變域之羧基端與其他域之胺基端之間橫跨約3.5 nm (35Å)之肽連接子，而不影響域摺疊並形成完整抗原結合位點的能力（Huston et al., Methods in Enzymology, vol. 203, pp. 46–88, 1991，其全文以引用方式併入本文中）。連接子較佳地包含親水性序列，以避免在整個蛋白質摺疊之可變域內或在可變域之間嵌入肽(Argos, Journal of Molecular Biology, vol. 211, no. 4, pp. 943–958, 1990)。例如，連接子可包含Gly及Ser殘基及/或與帶電殘基諸如Glu、Thr、及Lys一起散佈以增強溶解度。在一個實施例中，連接子具有SEQ ID NO: 27 (GGAGGA)之胺基酸序列。鑑於本揭露，亦可使用任何其他合適的連接子。在某些實施例中，scFv係經由連接子、更具體而言為包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的連接子連接至第一重鏈恆定區之羧基端。

根據另一具體態樣，本發明係關於一種本發明之經分離多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該多特異性抗體或其抗原結合片段係嵌合。

根據另一具體態樣，本發明係關於一種本發明之經分離多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該多特異性抗體或其抗原結合片段係人類或經人源化。

在另一個一般態樣中，本發明係關於一種經分離核酸，其編碼本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段。所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解的是，可以改變（例如，置換、刪除、插入等）蛋白質之編碼序列而不改變該蛋白質之胺基酸序列。因此，所屬技術領域中具有通常知識者將理解的是，可改變編碼本發明之單株抗體或其抗原結合片段之核酸序列而不改變該等蛋白質之胺基酸序列。

在另一個一般態樣中，本發明係關於一種載體，其包含編碼本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段之經分離核酸。鑒於本揭露，可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何載體，諸如質體、黏質體、噬菌體載體、或病毒載體。在一些實施例中，載體是重組表現載體，諸如質體。該載體可包括建立表現載體之習知功能的任何元件，例如啟動子、核糖體結合元件、終止子、增強子、篩選標記、及複製起點。啟動子可係組成型、誘導型、或阻抑型啟動子。許多能夠將核酸遞送至細胞之表現載體是所屬技術領域中已知的，且可在本文中用於在細胞中生產抗體或其抗原結合片段。習知選殖技術或人工基因合成可以用於生成根據本發明之實施例的重組表現載體。

在另一個一般態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含編碼本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段之經分離核酸。鑒於本揭露，所屬技術領域中具有通常知識者已知之任何宿主細胞可以用於重組表現本發明之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，宿主細胞係大腸桿菌TG1或BL21細胞（用於表現例如scFv或Fab抗體）、CHO-DG44或CHO-K1細胞、或HEK293細胞（用於表現例如全長IgG抗體）。根據具體實施例，重組表現載體係藉由習知方法（諸如化學轉染、熱休克、或電穿孔）轉形至宿主細胞中，其中重組表現載體被穩定地整合至宿主細胞基因體中，使得有效表現重組核酸。腦部穿梭構築體

經最佳化之RMT腦部遞送平台係使用轉鐵蛋白受體(TfR)藉由下列方式開發：提高內在胞吞轉送效率，擴展周邊藥物動力學，且針對可接受之安全性概況進行工程改造同時維持治療性mAb之功效。對人類TfR敲入小鼠中胞吞轉送受體親和力與腦部濃度之間的相互影響進行研究。結合動力學之徹底研究證實，為了獲得mAb之最佳腦部PK及PD，需要不會太快或太慢的中性解離速率。在小鼠中觀察到的增強腦部遞送在食蟹獼猴中獲得證實。

亦發現，與新生兒Fc受體(FcRn)之結合增加的經工程改造之抗體恆定區會導致周邊清除降低及腦部濃度提升。

引入額外Fc突變以除去與Fcγ受體(FcγR)之結合並避免效應功能介導之毒性。當與高親和力抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β結合mAb及高親和力抗PHF-tau結合mAb偶合時，此等突變通過小神經膠質細胞攝取及目標降解之新穎非FcγR機制防止周邊的效應功能介導之毒性，同時維持抗體依賴性吞噬作用(ADP)。此機制取決於通過TfR受體之內化，且在促進目標降解上較傳統FcγR介導之ADP更有效，而不刺激促發炎細胞介素之分泌。

在某些實施例中，Fc1及Fc2中之至少一者包含一或多個突變，該一或多個突變增強多特異性抗體或其抗原結合片段與新生兒Fc受體(FcRn)之結合，較佳地，一或多個突變增強在酸性pH下之結合，更佳地Fc1及Fc2中之至少一者具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。

因此，在一個一般態樣中，本申請案係關於一種抗體靶向腦部遞送系統，其包含本申請案之抗TfR抗原結合區。抗TfR抗原結合區可用以將治療劑或診斷劑遞送至細胞（例如癌細胞）或BBB系統中。可遞送之藥劑包括任何神經病症藥物或可用以偵測或分析神經病症藥物之藥劑。例如，此類藥劑可係神經營養因子，包括但不限於神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、神經膠質細胞系神經營養因子(GDNF)、及類胰島素生長因子(IGF)；神經肽，包括但不限於物質P、神經肽Y、血管活性腸肽(VIP)、γ-胺基丁酸(GABA)、多巴胺、膽囊收縮素(CCK)、腦內啡(endorphin)、腦啡肽(enkephalin)、及促甲狀腺素釋放激素(TRH)；細胞介素；抗焦慮劑；抗痙攣劑；多核苷酸及轉殖基因，包括例如小干擾RNA及/或反義寡核苷酸；或結合至腦部目標之抗體或其抗原結合片段。本申請案之抗hTfR抗原結合區可係增强所關注之藥劑自血液遞送至腦部並在腦部發揮功能的有效手段。

具體而言，所關注之藥劑可以組合形式、或連接至本申請案之抗TfR抗原結合區腸胃外（例如靜脈內）遞送。例如，藥劑可非共價附接至抗TfR抗原結合區。藥劑亦可共價附接至抗TfR抗原結合區以形成接合物。在某些實施例中，接合係藉由構築蛋白質融合（亦即，藉由基因融合編碼抗TfR抗原結合區及神經病症藥物之兩種基因並表現為單一蛋白質）。可鑑於本揭露使用已知方法將藥劑連接至抗體或其抗原結合片段。參見例如Wu et al., Nat Biotechnol., 23(9):1137-46, 2005；Trail et al., Cancer Immunol Immunother., 52(5):328-37, 2003；Saito et al., Adv Drug Deliv Rev., 55(2):199-215, 2003；Jones et al., Pharmaceutical Research, 24(9):1759-1771, 2007。

在一些實施例中，待遞送至腦部之治療劑或診斷劑及抗TfR抗原結合區可經由非肽連接子或肽連接子共價連接在一起（或接合）。非肽連接子之實例包括但不限於聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇及丙二醇之共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、右旋糖酐、聚乙烯醚、生物可降解聚合物、聚合脂質、幾丁質、及玻尿酸、或其衍生物、或其組合。肽連接子可係由藉由肽鍵連接之1至50個胺基酸所組成之肽鏈或其衍生物，其N端及C端可共價連接至抗TfR抗原結合區。

在某些實施例中，本申請案之接合物係一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含結合焦麩胺酸類澱粉蛋白β之第一抗原結合區,結合TfR之第二抗原結合區、及結合PHF-tau之第三抗原結合區。用於製造多特異性抗體之技術包括但不限於兩種具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現（參見Milstein and Cuello, Nature305: 537, 1983、WO 93/08829、及Traunecker et al, EMBO J.10: 3655, 1991）及「鈕扣(knob-in-hole)」工程改造（參見例如美國專利第5,731,168號）。多特異性抗體亦可藉由下列製成：工程改造靜電轉向效應(electrostatic steering effect) (WO 2009/089004A1)；交聯二或更多個抗體或片段（參見例如美國專利第4,676,980號、及Brennan et al, Science, 229: 81, 1985）；使用白胺酸拉鏈（參見例如Kostelny et al, J.Immunol., 148(5): 1547-1553,1992)）；使用「雙鏈抗體(diabody)」技術（參見例如Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448, 1993)）；使用單鏈Fv (sFv)二聚體（參見例如Gruber et al, J.Immunol, 152:5368 (1994)）；及製備三特異性抗體，如描述於例如Tutt et al. J.Immunol.147: 60, 1991。本申請案之多特異性抗體亦涵蓋具有三或更多個功能性抗原結合位點之抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」或「雙可變域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin)」(DVD)（參見例如US 2006/0025576A1及Wu et al. Nature Biotechnology, 25(11):1290-7, 2007）。本申請案之多特異性抗體亦涵蓋「雙重作用Fab (Dual Acting Fab)」或「DAF」，其包含結合至TfR以及PHF-tau之抗原結合區（例如參見US 2008/0069820）。在一個實施例中，抗體係抗體片段，各種此類片段揭示於本文中。

在一個實施例中，本申請案之多特異性抗體係融合構築體，其包含共價連接（或融合）至第二抗原結合區或其抗原結合片段之本申請案之抗TfR抗原結合區。較佳地，第二抗原結合區或其抗原結合片段結合至如本文所述之腦部目標，諸如PHF-tau。抗TfR抗原結合區可直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈及/或重鏈之羧基及/或胺基端。

在一個實施例中，抗TfR抗原結合區係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈之羧基端。

在另一實施例中，抗TfR抗原結合區係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之輕鏈之胺基端。

在另一實施例中，抗TfR抗原結合區係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之重鏈之羧基端。

在另一實施例中，抗TfR抗原結合區係直接或經由連接子融合至第二抗體或其抗原結合片段之重鏈之胺基端。

在一較佳實施例中，本申請案之融合構築體包含本申請案之抗TfR抗原結合區、較佳地抗huTfR1 VHH或scFv片段，其經由連接子共價連接至結合至PHF-tau之第二抗原結合區或其抗原結合片段之重鏈之羧基端。較佳地，連接子具有SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。

為了促進在兩個重鏈（例如，一個具有抗TfR抗原結合區之融合且一個不具有融合，或一個含有抗TfR臂之Fc且一個含有抗PHF-tau臂之Fc）之間形成異二聚體，將異二聚體突變引入兩個重鏈之Fc中。此類Fc突變之實例包括但不限於Zymework突變（參見例如US 10,457,742）及「鈕扣(knob in hole)」突變（參見例如Ridgway et al., Protein Eng., 9(7): 617-621, 1996）。其他異二聚體突變亦可用於本發明中。在一些實施例中，如本文所述之經修飾之CH3係用以促進在兩個重鏈之間形成異二聚體。

除了異二聚體突變之外，亦可引入其他突變。在一些實施例中，融合構築體或雙特異性抗體之Fc區進一步包含一或多個改變（增加或減少）、較佳地消除ADCC/CDC的突變（諸如本文所述之AAS突變），及/或一或多個改變（增加或減少）、較佳地增加融合構築體或雙特異性抗體與FcRn之結合的突變（諸如本文所述之YTE突變）。在一些實施例中，融合構築體或雙特異性抗體中之一或多個半胱胺酸殘基經其他胺基酸取代，諸如絲胺酸。

可鑑於本揭露藉由任何所屬技術領域中已知的數種技術產生本申請案之接合物，諸如多特異性抗體或融合構築體。例如，其可表現自重組宿主細胞，其中藉由標準技術將編碼融合構築體或多特異性抗體之重鏈及輕鏈的（多個）表現載體轉染至宿主細胞中。宿主細胞可係原核或真核宿主細胞。

在一例示性系統中，藉由轉染或電穿孔將編碼本申請案之融合構築體的異二聚體兩個重鏈及輕鏈之一或多個重組表現載體引入宿主細胞中。培養所選之轉形體(transformant)宿主細胞，以允許重鏈及輕鏈在足以產生融合構築體之條件下表現，並自培養基中回收融合構築體。使用標準分子生物學技術製備重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉形體，培養宿主細胞，並自培養基中回收蛋白質構築體。醫藥組成物及相關方法

本發明亦關於醫藥組成物、其製備方法及使用其之方法。

在另一個一般態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段亦可用於製造用於本文所提及之治療性應用之藥劑。醫藥上可接受之載劑可係任何合適的賦形劑、稀釋劑、填料、鹽、緩衝劑、穩定劑、助溶劑、油、脂質、含脂質囊泡、微球、微脂體包封(liposomal encapsulation)、或其他所屬技術領域中熟知用於醫藥配方中之材料。將理解載劑、賦形劑或稀釋劑之特徵將取決於特定應用之投予途徑而定。

因此，在一個實施例中，本申請案係關於一種跨血腦障壁(BBB)轉運治療劑或診斷劑之方法，其包含使偶合至該治療劑或診斷劑之本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段暴露於該血腦障壁，使得該多特異性抗體或其抗原結合片段跨該血腦障壁轉運偶合至其之藥劑。在一個實施例中，藥劑係神經病症藥物。在另一實施例中，藥劑係顯影劑或用於偵測神經病症之藥劑。較佳地，多特異性抗體或其抗原結合片段不損害TfR與其天然配體轉鐵蛋白之結合。抗體以其不抑制TfR與轉鐵蛋白之結合的方式特異性結合至TfR。在一些實施例中，BBB係在哺乳動物中、較佳地靈長類，諸如人類、更佳地患有神經病症之人類。在一個實施例中，神經病症係選自由下列所組成之群組：阿茲海默症(AD)、中風、失智症、肌肉失養症(MD)、多發性硬化症(MS)、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、囊腫纖維化、Angelman氏症候群、Liddle氏症候群、巴金森氏症、匹克症、柏哲德氏症(Paget's disease)、癌症、及創傷性腦損傷。

在一個實施例中，本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段係用以在症狀發作之前偵測神經病症及/或評估疾病或病症之嚴重性或持續時間。多特異性抗體或其抗原結合片段允許神經病症之偵測及/或造影，包括藉由放射線攝影術、斷層掃瞄、或磁振造影(magnetic resonance imaging, MRI)來造影。

在另一實施例中，多特異性抗體或其抗原結合片段係用於治療神經病症（例如阿茲海默症），其包含向需要治療之對象投予有效量的多特異性抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該方法進一步包含向對象投予有效量的至少一種額外治療劑。

在另一實施例中，本發明係關於一種用於預防、改善、治療、及/或減少在類澱粉蛋白β相關病況中之類澱粉蛋白β沉積的方法，其包含向有需要對象以治療有效量投予如本文所揭示之多特異性抗體或其抗原結合片段。本發明之額外態樣包括一種用於預防、改善、治療、及/或減少在類澱粉蛋白β相關病況中之類澱粉蛋白沉積的醫藥組成物，其包含如本文所揭示之抗體或其抗原結合片段。本發明之方法包含向有需要對象投予有效量的一或多種如本文中所述之抗體或其抗原結合片段。

在一個態樣中，本發明係關於預防、改善、治療、及/或減少在人類之由含β類澱粉蛋白斑塊形成所表徵的病況中之類澱粉蛋白β沉積的方法，該方法包含向有此治療需要之人類投予（較佳地周邊投予）治療或疾病預防有效量的根據本發明之多特異性抗體或其免疫反應性片段，該多特異性抗體特異性結合至人類Aβ3pE。在另一態樣中，本發明係關於在人類中抑制類澱粉蛋白斑塊形成之方法、及/或清除類澱粉蛋白斑塊之方法，該方法包含向需要此抑制或清除之人類對象投予有效量的根據本發明之多特異性抗體，其中該多特異性抗體螯合(sequester)腦部中之Aβ3pE肽並誘導腦部中Aβ3pE清除之改變。

有需要對象係罹患或傾向罹患由含β類澱粉蛋白斑塊形成所表徵的病況之人類。在一個實施例中，該病況係阿茲海默症。在其他實施例中，病況係與三染色體21（唐氏症）相關之失智症、瀰漫性路易氏體病、包涵體肌炎、大腦類澱粉血管病變、或荷蘭型遺傳性大腦出血伴類澱粉沉積症(HCHWA-D)。

在本發明之一實施例中，本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段結合至斑塊沉積中之3pE Aβ。藉由結合至斑塊沉積中之3pE Aβ，多特異性抗體或其抗原結合片段可誘導斑塊移除。可藉由活化斑塊周圍的微膠質細胞，及藉由移除穩定Aβ形式使斑塊不穩定，誘導斑塊移除。此外，本發明之抗體或其抗原結合片段可預防3pE Aβ之斑塊播種活性。相較於血管類澱粉蛋白，斑塊中之3pE Aβ的潛在富集可增加免疫療法之治療安全窗。

在另一個一般態樣中，本申請案係關於一種治療或減少有需要對象之疾病、病症、或病況（諸如tau蛋白病）之症狀的方法，其包含向該對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。

在另一個一般態樣中，本申請案係關於一種減少有需要對象中病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，其包含向該對象投予本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段、或本申請案之醫藥組成物。

根據具體實施例，待治療之疾病、病症、或病況是tau蛋白病。根據更具體實施例，待治療之疾病、病症、或病況包括但不限於家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵體肌炎、庫賈氏病、多重系統萎縮、C型尼曼匹克症、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌肉失養症、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、或拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

tau蛋白病相關之行為表型包括但不限於認知障礙、早期人格改變及抑制解除、冷漠、意志缺失、緘默症、失用症、持續言語(perseveration)、刻板動作/行為、口部過度活動(hyperorality)、紊亂(disorganization)、不能計劃或組織順序的任務、自私/麻木、反社會型特質、缺乏同理心、猶豫不決、失語法型言語伴隨頻繁的言語錯亂但相對保留理解力、受損理解力及詞彙提取不足、緩慢進行性步態不穩、後退步態(retropulsion)、僵硬、頻繁跌倒、非左旋多巴反應性軸向僵直(non-levodopa responsive axial rigidity)、核上性凝視麻痺症、方形波痙攣(square wave jerk)、緩慢垂直掃視運動、假性延髓麻痺症(pseudobulbar palsy)、肢體失用症(limb apraxia)、緊張不足、皮質性感覺喪失(cortical sensory loss)、及震顫。

適於治療之患者包括但不限於處於AD或其他tau蛋白病風險之無症狀個體、以及目前展示出症狀之患者。適於治療之患者包括具有已知AD遺傳風險之個體，諸如AD家族病史或在基因體中存在遺傳風險因子。例示性風險因子是類澱粉前驅蛋白(APP)中之突變，尤其是在位置717以及位置670及671處（分別是Hardy及Swedish突變）。其他風險因子是早老素基因PS1及PS2中以及ApoE4中之突變、高膽固醇血症或動脈粥樣硬化之家族病史。目前罹患AD之個體可以藉由以上所述之風險因子之存在自特徵性失智症識別。另外，許多診斷測試可用於鑒別患有AD之個體。此等包括測量腦脊髓液tau及Aβ 42水平。升高的tau及降低的Aβ 42水平表示存在AD。罹患AD之個體亦可藉由AD及相關病症協會(AD and Related Disorders Association)標準來診斷。

本申請案之包含抗PHF-tau抗原結合區或其抗原結合片段之多特異性抗體或其抗原結合片段適合作為用於治療或預防涉及tau之病理性聚集之神經退化性疾病（諸如AD或其他tau蛋白病）的治療劑及疾病預防劑兩者。在無症狀患者中，治療可在任何年齡（例如，約10、15、20、25、30歲）開始。然而，通常，直到患者達到約40、50、60、或70歲才有必要開始治療。治療一般在一個時間段內需要多個劑量。治療可藉由隨時間推移檢定抗體、或經活化T細胞或B細胞對治療劑之反應來監測。若反應降低，可以指示追加劑量。

在預防性應用中，向易患AD或以其他方式處於AD風險之患者投予醫藥組成物或藥劑，其量足以消除或減少該風險、減輕嚴重性、或延遲疾病之發作，包括疾病之生化、組織學及/或行為症狀、其併發症及在疾病發展期間存在之中間病理表型。在治療性應用中，向易患、或已經罹患此一疾病之患者投予組成物或藥劑，其量足以減少、阻止、或延遲該疾病之任何症狀（生化、組織學、及/或行為）。治療劑之投予可以減少或消除尚未發展特徵性阿茲海默氏病理之患者之輕度認知障礙。

根據具體實施例，用於治療tau蛋白病之組成物可以與其他有效治療相關神經退化性疾病之藥劑組合使用。在AD之情況下，本申請案之多特異性抗體可與減少或預防類澱粉蛋白β (Aβ)之沉積的藥劑組合投予。PHF-tau及Aβ病理可能是協同的。因此，同時靶向PHF-tau及Aβ兩者之清除、及Aβ相關病理之組合療法可較個別靶向各者更有效。在巴金森氏症及相關神經退化性疾病之情況下，清除α-突觸核蛋白之聚集形式的免疫調節亦是新出現的療法。同時靶向tau及α-突觸核蛋白兩者之清除的組合療法可比個別靶向任一蛋白更有效。

在另一實施例中，本申請案係關於本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段於製造或製備藥劑之用途。在一個實施例中，藥物係用於治療神經疾病或病症。在進一步實施例中，藥物係用於治療神經疾病或病症之方法，該方法包含向患有神經疾病或病症之個體投予有效量之藥物。

本申請案之另一個一般態樣係關於一種在有需要對象中誘導抗體依賴性吞噬作用(ADP)而不刺激促發炎細胞介素之分泌的方法，其包含向該對象投予包含偶合至（較佳地共價接合至）本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段之治療性抗體或其抗原結合片段的複合物，其中該治療性抗體或其抗原結合片段不具有效應功能。例如，治療性抗體或其抗原結合片段可包含降低或消除效應功能（諸如ADCC或CDC）之一或多個胺基酸修飾，諸如降低或除去與Fcγ受體之結合的突變。此類突變可在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329處，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。在一個實施例中，治療性抗體或其抗原結合片段特異性結合至tau聚集物。

在一些實施例中，該方法進一步包含向對象投予有效量的至少一種額外治療劑。在某些實施例中，額外治療劑係有效治療與多特異性抗體或其抗原結合片段所用以治療之神經病症相同或不同的神經病症之治療劑。例示性額外治療劑包括但不限於：上述各種神經藥物、膽鹼酯酶抑制劑（諸如多奈派齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)、雷斯替明(rovastigmine)、及塔克寧(tacrine)）、NMDA受體拮抗劑（諸如美金剛(memantine)）、類澱粉蛋白β肽聚集抑制劑、抗氧化劑、γ-分泌酶調節劑、神經生長因子(NGF)模擬物或NGF基因療法、PPARy促效劑、HMS-CoA還原酶抑制劑（斯他汀(statin)）、安帕金(ampakine)、鈣通道阻斷劑、GABA受體拮抗劑、肝醣合成酶激酶抑制劑、靜脈注射免疫球蛋白、蕈毒鹼受體促效劑、菸鹼型受體調節劑、主動或被動類澱粉蛋白β肽免疫、磷酸二酯酶抑制劑、血清素受體拮抗劑、及抗類澱粉蛋白β肽抗體。在某些實施例中，至少一種額外治療劑因其減輕神經藥物之一或多種副作用之能力而經選擇。額外治療劑可以相同或分開的配方投予，且與多特異性抗體或其抗原結合片段一起或分開投予。本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段可在投予額外治療劑及/或佐劑之前、同時、及/或之後投予。本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段亦可與其他介入療法組合使用，諸如但不限於放射療法、行為療法、或所屬技術領域中已知且適用於待治療或預防之神經病症的其他療法。

本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段（及任何額外治療劑）可藉由任何適合手段投予，包括腸胃外、肺內、及鼻內，且若需要局部治療，則包括病灶內投予。腸胃外輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內、或皮下投予，其部分取決於投予係短期或長期的。本文設想各種給藥排程，包括但不限於在各種時間點之單次或多次投予、大劑量(bolus)投予、及脈衝輸注。

為了預防或治療疾病，本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段（當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時）之適當劑量將取決於各種因素，諸如待治療之疾病類型、抗體或接合物之類型、疾病之嚴重性及病程、多特異性抗體或其抗原結合片段係出於預防或治療目的而投予、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應、對象之生理狀態（包括例如年齡、體重、健康狀況）、及主治醫師之判斷。最佳化滴定治療劑量以最佳化安全性及功效。多特異性抗體或其抗原結合片段係一次性或經過一系列的治療而合適地投予至患者。。

根據具體實施例，治療有效量係指足以達成一、二、三、四、或更多個下列效應之療法之量：(i)減少或改善待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的嚴重性；(ii)減少待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的持續時間；(iii)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的進展；(iv)引起待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的回歸；(v)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的發展或發作；(vi)預防待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀的復發；(vii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的住院；(viii)減少患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的住院長度；(ix)增加患有待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀之對象的存活率；(xi)抑制或減少對象之待治療之疾病、病症、或病況、或與其相關之症狀；及/或(xii)增強或改善另一療法的（多種）疾病預防或治療效應。診斷方法及套組

在另一態樣中，本申請案係關於一種製品（諸如套組），其含有適可用於治療、預防、及/或診斷上述病症之材料。製品包含容器及標籤或於容器上或與容器相關聯之藥品仿單(package insert)。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納組成物（單獨組成物或與有效治療、預防、及/或診斷病況之另一組成物組合），且可具有無菌出入孔（例如，容器可係靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子之小瓶）。組成物中之至少一種活性劑係本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段。標籤或藥品仿單指示組成物係用於治療所選擇之病況。此外，製品可包括(a)其中含有組成物之第一容器，其中該組成物包含本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段；及(b)其中含有組成物之第二容器，其中該組成物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包括藥品仿單，其指示組成物可用以治療特定病況。可選地，製品可進一步包含第二（或第三）容器，其包含醫藥上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(bacteriostatic water for injection, BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、及右旋糖溶液。其可進一步包括商業及使用者觀點所欲之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭、及注射器。體外方法

應理解的是，所有採用多特異性抗體或其抗原結合片段的免疫檢定方式皆設想根據本案較佳實施例使用，包括其中多特異性抗體或其抗原結合片段係結合至固態的檢定、及其中抗體係於液體介質中的檢定。可用以使用體現本發明特徵之多特異性抗體而偵測分析物的免疫檢定方法包括但不限於競爭型（試劑限制性）檢定，其中經標示之分析物（分析物類似物）與樣本中之分析物針對抗體進行競爭；及單位點免疫測定檢定，其中多特異性抗體經標示；及類似者。

根據本發明之多特異性抗體或其抗原結合片段可用於習知免疫技術中，以用於在肽可能出現之處偵測Aβ3pE、TfR、或PHF-tau，包括生物樣本及來自細胞培養物之條件培養基。合適的免疫技術對所屬技術領域中具有通常知識者而言係熟知的，且包括例如ELISA、西方墨點分析、競爭型或三明治免疫檢定、及類似者，且其另外所熟知的是，其等皆取決於抗原-抗體免疫複合物之形成，其中出於檢定之目的，抗體或其抗原結合片段可用例如放射、酶、發光、或螢光標示可偵測地標示，或可將其可固定於不溶性載劑上。因此，本發明之一目的係提供用於判定或偵測樣本中之Aβ3pE、TfR、及/或PHF-tau或其片段的免疫檢定，該方法包含使該樣本與根據本發明之針對Aβ3pE、TfR、及/或PHF-tau或其片段之抗體或其抗原結合片段接觸、及判定免疫複合物是否在該抗體或其抗原結合片段與該Aβ3pE、TfR、及/或PHF-tau或其片段之間形成。此等方法可對組織樣本或體液樣本執行且通常包含自對象體內獲得樣本；使該樣本與顯影有效量(imaging effective amount)的經可偵測地標示之根據本發明之抗體或其抗原結合片段接觸；及偵測該標示以確定該樣本中Aβ3pE及/或TfR或其片段之存在。使用本發明之抗體或其抗原結合片段之測量方法並未特別受限。只要對應於待測量溶液中之抗原之量（具體而言係Aβ3pE及/或TfR或其片段之量）的抗體、抗原、或抗原-抗體複合物之量係藉由化學或物理手段偵測，並自標準曲線（藉由使用含有已知量的抗原之標準溶液製備）計算，即可使用任何測量方法。例如，適合使用濁度測定法、競爭方法、免疫測定方法、三明治方法。關於敏感性及特異性，特別較佳的是使用三明治方法。

在三明治方法中，使測試溶液與不溶性抗體（諸如本發明之不溶性多特異性抗體）反應（第一反應），接著使經標示之二級抗體反應（第二反應）；接著，對在不溶性載劑上之標示劑之活性進行檢定，可藉此判定測試溶液中Aβ3pE、TfR、及/或PHF-tau或其片段之量。第一反應及第二反應可同時或依序進行。

在測量方法中，標示物質、放射性同位素、酶、螢光物質、發光物質等係作為標示劑使用。放射性同位素之實例包括 ¹²⁵1、 ¹³¹I、 ³H、及 ¹⁴C。酶常藉由接合適當受質（其繼而催化可偵測的反應）而為可偵測的。其實例包括：例如，β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、鹼性磷酸酶、過氧化酶、及蘋果酸去氫酶，較佳的是辣根過氧化酶。發光物質包括：例如，發光胺(luminol)、發光胺衍生物、螢光素、水母素、及螢光素酶。此外，卵白素-生物素系統亦可用於標示本發明之抗體及免疫原。當免疫原或抗體係不溶時，常使用物理吸附或化學結合以用於蛋白質之不溶化或固定，或可採用酶。載劑之實例包括：不溶性多醣，諸如瓊脂糖、右旋糖酐(dextran)、及纖維素；合成樹脂，諸如聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、及聚矽氧聚合物；及玻璃。

在用於偵測或診斷β類澱粉蛋白相關疾病、tau相關疾病、及/或其他神經疾病或病況之進一步實施例中，含有包括組織、體液（諸如腦脊髓液(CSF)、血液、血漿、血清、尿液、及類似者）之生物樣本，並使生物樣本與合適量的第一抗體接觸以產生免疫複合物。該接觸一般涉及添加樣本至經第一抗體塗佈的固體基質。由使樣本與第一抗體接觸產生之複合物係藉由洗提而自樣本分離。然而，可採用其他回收方法。使所回收之複合物與至少一種第二抗體接觸，第二抗體係針對抗原上之抗原決定位且能夠結合複合物中之抗原。由於抗原實體之多表位本質，第二抗體所針對之抗原決定位可與第一抗體所針對之抗原決定位為同一個。可使用上述任何標示使第一抗體或第二抗體為可偵測的。在一較佳實施例中，使第二抗體為可偵測的。可使用所屬技術領域中已知的技術，容易地偵測結合至複合物（由結合至第一抗體及第二抗體之抗原所組成）之可偵測抗體的存在。藉由將生物樣本中所獲得的結果與對照樣本所獲得的結果進行比較，可判定改變的Aβ3pE、TfR、及/或PHF-tau或其片段的存在或水平。實施例

本發明亦提供以下非限制性實施例。

實施例1係一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含能夠特異性結合至焦麩胺酸類澱粉蛋白β之至少一個第一抗原結合區、能夠特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR)之第二抗原結合區、及能夠特異性結合至成對螺旋絲(PHF)-tau之第三抗原結合區，其中： a. 該第一抗原結合區包含： i. 第一重鏈可變區(VH1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 8或16、9或17、及10之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及 ii. 第一輕鏈可變區(VL1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 11、12、及13之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；及 b. 該第二抗原結合區包含： i. 第二重鏈可變區(VH2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 1、2、及3之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及 ii. 第二輕鏈可變區(VL2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 4、5、及6之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；及 c. 該第三抗原結合區包含： i. 第三重鏈可變區(VH3)，其包含分別包含SEQ ID NO:28、29、及30之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及 ii. 第三輕鏈可變區(VL3)，其包含分別包含SEQ ID NO:31、32、及33之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。

實施例2係如實施例1之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含與SEQ ID NO:14至少90%同一的胺基酸序列；且該VL1包含與SEQ ID NO:15至少90%同一的胺基酸序列。

實施例3係如實施例1之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；且該VL1包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。

實施例4係如實施例1至3中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該第二抗原結合區包含單鏈可變片段(scFv)抗體或其抗原結合片段，該scFv抗體或其抗原結合片段包含該VH2及VL2。

實施例5係如實施例4之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含與SEQ ID NO:7至少90%同一的胺基酸序列。

實施例6係如實施例5之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該scFV包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。

實施例7係如實施例1至6中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： (i) 包含該VH3及該VL3之第一重鏈(HC1)、包含第一Fc區(Fc1)之第一重鏈恆定區、及該scFv (ii) 包含該VH1之第二重鏈(HC2)、及包含第二Fc區(Fc2)之第二重鏈恆定區； (iii) 包含該VL1之第一輕鏈(LC)、及輕鏈恆定區。

實施例8係如實施例7之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該scFv係經由連接子、更具體而言為包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的連接子連接至該第一重鏈恆定區之羧基端。

實施例9係如實施例7或8之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中相較於野生型Fc區，該Fc1及Fc2各自包含一或多個異二聚體突變，諸如分別為第一及第二經修飾之異二聚體CH3域；具體而言，該Fc1在位置T350、L351、F405、及Y407處包含胺基酸修飾，且該Fc2在位置T350、T366、K392、及T394處包含胺基酸修飾，其中在位置T350處之胺基酸修飾係T350V、T350I、T350L、或T350M；在位置L351處之胺基酸修飾係L351Y；在位置F405處之胺基酸修飾係F405A、F405V、F405T、或F405S；在位置Y407處之胺基酸修飾係Y407V、Y407A、或Y407I；在位置T366處之胺基酸修飾係T366L、T366I、T366V、或T366M，在位置K392處之胺基酸修飾係K392F、K392L、或K392M，且在位置T394處之胺基酸修飾係T394W，且其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引，更具體而言，該Fc1包含胺基酸修飾T350V、L351Y、F405A、及Y407V，且該Fc2包含胺基酸修飾T350V、T366L、K392L、及T394W。

實施例10係如實施例7至9中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該Fc1及該Fc2中之至少一者包含一或多個突變，該一或多個突變增強該多特異性抗體或其抗原結合片段與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合，較佳地，該一或多個突變增強在酸性pH下之該結合，更佳地該Fc1及該Fc2中之至少一者具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。

實施例11係如實施例7至10中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該Fc1及該Fc2中之至少一者包含一或多個突變，該一或多個突變降低或消除效應功能，較佳地該Fc1及該Fc2中之至少一者在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329處具有一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。

實施例12係一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈，該第一重鏈包含與SEQ ID NO:24至少90%同一的胺基酸序列；及第一輕鏈，該第一輕鏈包含與SEQ ID NO:25至少90%同一的胺基酸序列；及第二重鏈，該第二重鏈包含與SEQ ID NO:26至少90%同一的胺基酸序列。

實施例13係如實施例12之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該第一重鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列，該第一輕鏈包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，且該第二重鏈包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。

實施例14係一種經分離核酸序列，其編碼如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段。

實施例15係一種載體，其包含如實施例14之經分離核酸。

實施例16係一種宿主細胞，其包含如實施例14之經分離核酸或如實施例15之載體。

實施例17係一種產生多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含在產生該多特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養如實施例16之宿主細胞、及回收該多特異性抗體或其抗原結合片段。

實施例18係一種醫藥組成物，其包含如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。

實施例19係一種治療或偵測有需要對象之病症、較佳地神經病症之方法，其包含向該對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或抗原結合片段、或如實施例18之醫藥組成物，較佳地該神經病症係選自由下列所組成之群組：神經退化性疾病（諸如路易氏體病、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多重系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病（諸如阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（諸如牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性癱瘓、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症（諸如Canavan病、亨丁頓舞蹈症、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病、妥瑞氏症候群、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病、雷特氏症候群、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（諸如匹克症及脊髓小腦性失調症）、及CNS及/或腦部之癌症（諸如身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。

實施例20係一種治療有需要對象中與形成含β類澱粉蛋白斑塊相關之病況的方法，該方法包含向該有需要對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如實施例18之醫藥組成物。

實施例21係如實施例20之方法，其中該病況係阿茲海默症。

實施例22係如實施例20之方法，其中該病況係選自由下列所組成之群組：與三染色體21（唐氏症）相關之失智症、瀰漫性路易氏體病、包涵體肌炎、大腦類澱粉血管病變、及荷蘭型遺傳性大腦出血伴類澱粉沉積症(HCHWA-D)。

實施例23係一種在有需要對象中減少與阿茲海默症相關之斑塊的方法，該方法包含向該有需要對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如實施例18之醫藥組成物。

實施例24係一種在有需要對象中預防3pE Aβ之播種活性的方法，該方法包含向該有需要對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如實施例18之醫藥組成物。

實施例25係一種在有需要對象中阻斷tau播種的方法，其包含向該對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、或向該有需要對象投予如實施例18之醫藥組成物。

實施例26係一種治療有需要對象中tau蛋白病的方法，其包含向該對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、或向該有需要對象投予如實施例18之醫藥組成物。

實施例27係一種減少有需要對象中病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，其包含向該對象投予如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段、或向該有需要對象投予如實施例18之醫藥組成物。

實施例28係如實施例26或27之方法，其中該tau蛋白病係選自由下列所組成之群組：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病、哈勒沃登-施帕茨病、包涵體肌炎、庫賈氏病、多重系統萎縮、C型尼曼匹克症、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌肉失養症、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。

實施例29係一種產生包含如實施例1至13中任一者之多特異性抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物之方法，該方法包含將該多特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。

本發明的下列實例是要進一步說明本發明的本質。應理解的是，下列實例不會對本發明造成限制，且本發明之範疇係由隨附之申請專利範圍決定。實例實例1：創建抗Aβ/抗轉鐵蛋白受體(TfR)表現構築體

細胞系開發(CLD)程序併入ATUM之Leap-In Transposase ^®技術及Horizon中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞系之使用。ATUM Leap-In Transposase ^®系統經工程改造自熱帶爪蟾( Xenopus tropicalis, western clawed frog)。在此系統中，將合成轉位子選殖至單個質體中，該單個質體含有可選標記及在Leap-In反向末端重複序列(Inverted Terminal Repeat, ITR)之間的預期生物治療性基因。各基因皆置於其自身調控元件的控制下，其包括啟動子及多腺苷酸化序列。

編碼抗PHF tau/抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β/抗TfR抗體之DNA係在ATUM (CA, USA)，藉由Golden Gate組裝使用IIS型限制酶 BsaI及 SapI，合成並次選殖至Leap-In Transposase ^®麩醯胺酸合成酶表現載體骨架pD2546ht+_n中。質體係設計為質體1 [輕鏈、重鏈1]及質體2 [輕鏈、重鏈2]。

整個質體在NeoGenomics Laboratories (CA, USA)雙向序列確認。

重鏈1、輕鏈、及重鏈2基因之初級轉錄本核苷酸序列係列示於下。重鏈1、輕鏈、及重鏈2基因之預測胺基酸序列係列示於下。應注意的是，輕鏈基因在質體1及質體2中係同一的。

質體1之重鏈1之核苷酸序列(SEQ ID NO:18)，其中信號肽加底線： atggccaggaagtccgctctgctcgctctggcacttctgcttctgggatttggacctgcttgggctgacatcgtgatgacccagacacctctgagcagccccgttacattgggccagcctgcctccatctcctgccggtcctctaagtccctgctgtacaaggacggcaagacctacctgaactggttccagcagaggcctggctgctctcccagactgctgatctacctgatgtccaccagagcctctggcgtgcccgatagattttctggctctggcgctggcaccgacttcaccctgaagatctctagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgtcagcagctggtggactaccctctgacctttggccagggcaccaagctggaaatcaagggcggaggttctggtggatctggcggatgtcctccttgtggtggaagcggcggacaggttcagctggttcagtctggagccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtcaaggtgtcctgcaaggcttccggctacacctttaccagctactggatcacctgggtccgacagaggcctggacaaggactcgaatggatgggcgacatccatcctggcagaggctccactaagtacgcccagaaactgcagggcagagtgaccatgaccaccgacacctctacctccaccgcctacatggaactgcggtccctgagatctgacgacaccgccgtgtactactgcgccagaagatggggcttcgactactggggctgtggcacactggtcaccgtttcttctgagcccaaatctagcgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgccgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctctacatcacccgggagcctgaggtcacatgcgtggtggtgagcgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagatggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagtctctctccctgtctccgggaaaaggcggagctggtggtgctgaggttcagctgctcgagtctggcggaggattggttcagcctggcggctctctgagactgtcttgtgccgactccggcttcaccttctccagctacgccatgaactgggtccgacaggctcctggctgtggactggaatgggtgtccggcatttctggctctggcggccacacctactacgccgattctgtgaagggcagattcaccgtgtctcgggacaactccaagaacaccctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgtgctagagagggctacgactcctccggctacaacccctttgattactggggccagggcacccaagtgaccgtttcttctggcggaggttctggtggatctggcggatgtcctccttgtggtggaagcggcggatcctacgagctgacccagcctccttccgtgtctgtgtctcctggccagaccgcctccatcacctgttctggcgataagctgggcgataagtacgcctcctggtatcagcagaagcccggccagtctcctgtgctggtcatctaccaggactccaagcggccttctggcatccctgagagattctccggctccaactccggcaataccgccacactgaccatctctggcacacaggccatggacgaggccgactactattgtcaggcctgggactcctccaccgtggtgtttggctgtggcaccaagctgacagtgctgcac

質體1之輕鏈之核苷酸序列(SEQ ID NO:19)，其中信號肽加底線： atggccaggaagtccgctctgctcgctctggcacttctgcttctgggatttggacctgcttgggctgacgtggtcatgacacagagccctctgagcctgcctgtgacattgggacagcctgcctccatctcctgcaagtcctctcagtccctgctggactccagagccaagacctatctgacctggctgcagcagaggcctggccagtctcctagaaggctgatctacctggtgtccaagctggactctggcgtgcccgatagattctccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaagatctccagagtggaagccgaggacgtgggcgtgtactactgttggcagggcacccactttccatacaccttcggccagggcacaaagctggaaatcaagcgtactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

質體2之重鏈2之核苷酸序列(SEQ ID NO:20)，其中信號肽加底線： atggccaggaagtccgctctgctcgctctggcacttctgcttctgggatttggacctgcttgggctcaggttcagctggttcagtctggagccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggcttctggccacgtgttcaccagctacgacatgtactgggtccgacaggctcctggacagggacttgagtggatcggctacatcgactccgactccggcgacacctcctacaaccagaaattcaagggcagagtgaccctgaccgtggacacctctacctccaccgtgtacatggaactgtccagcctgagatccgaggacaccgccgtgtactactgcgcctactacagatacgccatggactactggggccagggcacactggttaccgtttcttctgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgccgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctctacatcacccgggagcctgaggtcacatgcgtggtggtgagcgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtgtcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagatggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagtctctctccctgtctccgggaaaa

質體1之重鏈1之胺基酸序列(SEQ ID NO:21)，其中信號肽加底線。重鏈1在位置1之Asp ( D)殘基構成成熟鏈之N端。 marksallalallllgfgpawa divmtqtplsspvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfqqrpgcsprlliylmstrasgvpdrfsgsgagtdftlkisrveaedvgvyycqqlvdypltfgqgtkleikgggsggsggcppcggsggqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywitwvrqrpgqglewmgdihpgrgstkyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycarrwgfdywgcgtlvtvssepkssdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvsvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggaggaevqllesggglvqpggslrlscadsgftfssyamnwvrqapgcglewvsgisgsgghtyyadsvkgrftvsrdnskntlylqmnslraedtavyycaregydssgynpfdywgqgtqvtvssgggsggsggcppcggsggsyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyaswyqqkpgqspvlviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdsstvvfgcgtkltvlh

質體1之輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO:22)，其中信號肽加底線。輕鏈在位置1之Asp ( D)殘基構成成熟鏈之N端。 marksallalallllgfgpawa dvvmtqsplslpvtlgqpasisckssqslldsraktyltwlqqrpgqsprrliylvskldsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycwqgthfpytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

質體2之重鏈2之胺基酸序列(SEQ ID NO:23)，其中信號肽加底線。重鏈在位置1之Gln ( Q)殘基構成成熟鏈之N端。 marksallalallllgfgpawa qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasghvftsydmywvrqapgqglewigyidsdsgdtsynqkfkgrvtltvdtststvymelsslrsedtavyycayyryamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvsvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

質體1之重鏈1之成熟胺基酸序列(SEQ ID NO:24)： divmtqtplsspvtlgqpasiscrssksllykdgktylnwfqqrpgcsprlliylmstrasgvpdrfsgsgagtdftlkisrveaedvgvyycqqlvdypltfgqgtkleikgggsggsggcppcggsggqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsywitwvrqrpgqglewmgdihpgrgstkyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycarrwgfdywgcgtlvtvssepkssdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvsvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgkggaggaevqllesggglvqpggslrlscadsgftfssyamnwvrqapgcglewvsgisgsgghtyyadsvkgrftvsrdnskntlylqmnslraedtavyycaregydssgynpfdywgqgtqvtvssgggsggsggcppcggsggsyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyaswyqqkpgqspvlviyqdskrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqawdsstvvfgcgtkltvlh

質體1之輕鏈1之成熟胺基酸序列(SEQ ID NO:25)： dvvmtqsplslpvtlgqpasisckssqslldsraktyltwlqqrpgqsprrliylvskldsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycwqgthfpytfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

質體2之重鏈2之成熟胺基酸序列(SEQ ID NO:26)： qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasghvftsydmywvrqapgqglewigyidsdsgdtsynqkfkgrvtltvdtststvymelsslrsedtavyycayyryamdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlyitrepevtcvvvsvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

產生表現抗PHF tau/抗焦麩胺酸類澱粉蛋白β/抗TfR構築體之細胞系。

實例2：藉由表面電漿共振之結合表徵

測試物品對重組人類全長重組tau (2N4R; PT1W1.ECO1)、β類澱粉蛋白肽(3pE-28)、及人類轉鐵蛋白受體(TfR; TFRW2)之結合交互作用係藉由SPR使用Biacore 8k儀器，在25℃下用補充有3 mM EDTA及0.05% Tween 20之pH 7.4或pH 5.0緩衝劑研究。簡言之，使用供應商建議之胺偶合化學之規程，藉由將抗人類IgG Fcg片段特異性抗體偶合至C1感測器晶片之表面來製備生物感測器表面（＞400個反應單元(RU)）。偶合緩衝劑係10 mM乙酸鈉(pH 4.5)。將測試物品稀釋於運行緩衝劑中，並在抗人類IgG上注射，以獲得足夠的捕捉以偵測抗原結合。捕捉測試物品後，在單循環動力學模式下以不同濃度系列注射三種重組抗原（2N4R為3倍稀釋之30 nM至1.1 nM系列，TfR為3倍稀釋之300 nM至11.1 nM系列，3pE-28為2倍稀釋之12 nM至0.8 nM系列）。分別（針對2N4R及3pE-28抗原）監測締合及解離3分鐘及60 min，並以50 µL/min流速針對TfR抗原監測2分鐘及5分鐘。在pH 7.4及pH 5.0兩者下測量TfR之解離概況。用0.85% H ₃PO ₄執行感測器表面之再生。結合感測圖係使用1:1 Langmuir結合模型進行擬合，以獲得結合速率、解離速率、及親和力。包括針對Tau及β類澱粉蛋白之親本雙價抗體作為對照。

所屬技術領域中具有通常知識者將領會的是，能夠對以上所述的實施例進行變更而不違背其廣義的發明概念。因此，應了解本發明不限於所揭示之特定實施例，而是意欲涵蓋如隨附之申請專利範圍所定義的本發明之精神及範疇內的修改。

無

前述發明內容以及下文實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。出於說明本發明之目的，圖式中顯示目前較佳的實施例。然而應理解的是，本發明並不限於圖式中所示之確切實施例。

［圖1］係本申請案之多特異性抗體或其抗原結合片段之圖示。

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Claims

一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含能夠特異性結合至焦麩胺酸類澱粉蛋白β之第一抗原結合區、能夠特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR)之第二抗原結合區、及能夠特異性結合至成對螺旋絲(PHF)-tau之第三抗原結合區，其中： a. 該第一抗原結合區包含： i. 第一重鏈可變區(VH1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 8或16、9或17、及10之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及 ii. 第一輕鏈可變區(VL1)，其包含分別包含SEQ ID NO: 11、12、及13之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3； b. 該第二抗原結合區包含： i. 第二重鏈可變區(VH2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 1、2、及3之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及 ii. 第二輕鏈可變區(VL2)，其包含分別包含SEQ ID NO: 4、5、及6之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3；及 c. 該第三抗原結合區包含： i. 第三重鏈可變區(VH3)，其包含分別包含SEQ ID NO:28、29、及30之胺基酸序列的重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2、及HCDR3；及 ii. 第三輕鏈可變區(VL3)，其包含分別包含SEQ ID NO:31、32、及33之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2、及LCDR3。
如請求項1所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含與SEQ ID NO:14至少90%同一的胺基酸序列；且該VL1包含與SEQ ID NO:15至少90%同一的胺基酸序列。
如請求項1所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該VH1包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；且該VL1包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該第二抗原結合區包含單鏈可變片段(scFv)抗體或其抗原結合片段，該scFv抗體或其抗原結合片段包含該VH2及VL2。
如請求項4所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該scFv包含與SEQ ID NO:7至少90%同一的胺基酸序列。
如請求項5所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該scFV包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列。
如請求項1至6中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含： (j) 包含該VH3及該VL3之第一重鏈(HC1)、包含第一Fc區(Fc1)之第一重鏈恆定區、及該scFv； (iv) 包含該VH1之第二重鏈(HC2)、及包含第二Fc區(Fc2)之第二重鏈恆定區； (v) 包含該VL1之第一輕鏈(LC)、及輕鏈恆定區。
如請求項7所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該scFv係經由連接子、更具體而言為包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列的連接子連接至該第一重鏈恆定區之羧基端。
如請求項7或8所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中相較於野生型Fc區，該Fc1及該Fc2各自包含一或多個異二聚體突變，諸如分別為第一及第二經修飾之異二聚體CH3域；具體而言，該Fc1在位置T350、L351、F405、及Y407處包含胺基酸修飾，且該Fc2在位置T350、T366、K392、及T394處包含胺基酸修飾，其中在位置T350處之胺基酸修飾係T350V、T350I、T350L、或T350M；在位置L351處之胺基酸修飾係L351Y；在位置F405處之胺基酸修飾係F405A、F405V、F405T、或F405S；在位置Y407處之胺基酸修飾係Y407V、Y407A、或Y407I；在位置T366處之胺基酸修飾係T366L、T366I、T366V、或T366M，在位置K392處之胺基酸修飾係K392F、K392L、或K392M，且在位置T394處之胺基酸修飾係T394W，且其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引，更具體而言，該Fc1包含胺基酸修飾T350V、L351Y、F405A、及Y407V，且該Fc2包含胺基酸修飾T350V、T366L、K392L、及T394W。
如請求項7至9中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該Fc1及該Fc2中之至少一者包含一或多個突變，該一或多個突變增強該多特異性抗體或其抗原結合片段與該新生兒Fc受體(FcRn)之結合，較佳地，該一或多個突變增強在酸性pH下之該結合，更佳地該Fc1及該Fc2中之至少一者具有M252Y/S254T/T256E (YTE)突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
如請求項7至10中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該Fc1及該Fc2中之至少一者包含一或多個突變，該一或多個突變降低或消除效應功能，較佳地該Fc1及該Fc2中之至少一者在位置L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及P329處具有一或多個胺基酸修飾，諸如L234A、L235A、及P331S中之一、二、或三個突變，其中胺基酸殘基之編號係根據如Kabat中所闡述之EU索引。
一種多特異性抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈，該第一重鏈包含與SEQ ID NO:24至少90%同一的胺基酸序列；及第一輕鏈，該第一輕鏈包含與SEQ ID NO:25至少90%同一的胺基酸序列；及第二重鏈，該第二重鏈包含與SEQ ID NO:26至少90%同一的胺基酸序列。
如請求項12所述之多特異性抗體或其抗原結合片段，其中該第一重鏈包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列，該第一輕鏈包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，且該第二重鏈包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列。
一種經分離核酸序列，其編碼如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其包含如請求項14所述之經分離核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項14所述之經分離核酸或如請求項15所述之載體。
一種產生多特異性抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包含在產生該多特異性抗體或其抗原結合片段之條件下培養如請求項16所述之宿主細胞、及回收該多特異性抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、及醫藥上可接受之載劑。
一種治療或偵測有需要對象之病症、較佳地神經病症之方法，其包含向該對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或抗原結合片段、或如請求項18所述之醫藥組成物，較佳地該，神經病症係選自由下列所組成之群組：神經退化性疾病（諸如路易氏體病(Lewy body disease)、脊髓灰質炎後症候群、Shy-Draeger症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮、巴金森氏症、多重系統萎縮、紋狀體與黑質體退化症、脊髓小腦性失調症、脊髓性肌萎縮）、tau蛋白病(tauopathy)（諸如阿茲海默症及核上神經麻痺症）、普里昂疾病（諸如牛海綿狀腦病、羊搔癢症、庫賈氏症候群(Creutz-feldt-Jakob syndrome)、庫魯病、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗病、及致死性家族性失眠症）、延髓性癱瘓、運動神經元疾病、及神經系統異退化性病症(nervous system heterodegenerative disorder)（諸如Canavan病、亨丁頓舞蹈症(Huntington's disease)、神經元蠟樣脂褐質儲積症、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、Menkes氏捲髮症候群、柯凱因氏症候群(Cockayne syndrome)、Halervorden-Spatz氏症候群、拉弗拉病(lafora disease)、雷特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、Lesch-Nyhan氏症候群、及Unverricht-Lundborg氏症候群）、失智症（諸如匹克症(Pick's disease)及脊髓小腦性失調症）、及CNS及/或腦部之癌症（諸如身體其他地方之癌症所致的腦部轉移）。
一種治療有需要對象中與形成含β類澱粉蛋白斑塊相關之病況的方法，該方法包含向該有需要對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如請求項18所述之醫藥組成物。
如請求項20所述之方法，其中該病況係阿茲海默症。
如請求項20所述之方法，其中該病況係選自由下列所組成之群組：與三染色體21（唐氏症）相關之失智症、瀰漫性路易氏體病(diffuse Lewy body disease)、包涵體肌炎、大腦類澱粉血管病變、及荷蘭型遺傳性大腦出血伴類澱粉沉積症(HCHWA-D)。
一種在有需要對象中減少與阿茲海默症相關之斑塊的方法，該方法包含向該有需要對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如請求項18所述之醫藥組成物。
一種在有需要對象中預防3pE Aβ之播種活性(seeding activity)的方法，該方法包含向該有需要對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或如請求項18所述之醫藥組成物。
一種在有需要對象中阻斷tau播種的方法，其包含向該對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或向該有需要對象投予如請求項18所述之醫藥組成物。
一種治療有需要對象中tau蛋白病的方法，其包含向該對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或向該有需要對象投予如請求項18所述之醫藥組成物。
一種減少有需要對象中病理性tau聚集或tau蛋白病蔓延的方法，其包含向該對象投予如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段、或向該有需要對象投予如請求項18所述之醫藥組成物。
如請求項26或27所述之方法，其中該tau蛋白病係選自由下列所組成之群組：家族性阿茲海默症、偶發性阿茲海默症、連鎖於染色體17之額顳葉失智症伴隨巴金森氏症(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17, FTDP-17)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核退化症、匹克症、進行性皮質下膠質增生、僅纏結失智症(tangle only dementia)、瀰漫性神經纖維纏結伴隨鈣化、嗜銀顆粒性失智症、肌萎縮性脊髓側索硬化症/巴金森氏症-失智複合症、唐氏症、吉斯曼-史特斯勤-先克病(Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵體肌炎、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多重系統萎縮、C型尼曼匹克症(Niemann-Pick disease type C)、普里昂蛋白大腦類澱粉血管病變、亞急性硬化性全腦炎、強直性肌肉失養症、非關島運動神經元病伴隨神經纖維纏結、腦炎後巴金森氏症、慢性創傷性腦病變、及拳擊手型失智症（拳擊疾病）。
一種產生包含如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物之方法，該方法包含將該多特異性抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑組合以獲得該醫藥組成物。