TW202333701A - ２－吡啶酮衍生物於製備預防或治療發炎性肺部疾病之藥物的用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露提供在有其需要的個體中預防或治療發炎性肺部疾病或異常的方法，其包含向該個體投予有效量之FJU-C28或其鹽類。本揭露亦提供FJU-C28化合物或其鹽類在製備預防或治療發炎性肺部疾病或異常的藥物之用途。
Description
本揭露關於在有其需要的個體中治療發炎性肺部疾病或病症的方法，尤其是治療急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome，ARDS)及肺部纖維化(lung fibrosis)的方法。
儘管支持性療法有顯著的進步，但因病毒或細菌感染誘發直接或間接肺部損傷引起的過度發炎反應而導致的急性呼吸窘迫症(ARDS)，死亡率仍然很高。該發炎反應為重要的宿主防禦機制，可防止感染並將受損組織恢復為正常生理狀態。巨噬細胞在調節發炎過程的先天性免疫反應中扮演關鍵角色。脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)活化巨噬細胞釋出多種發炎介質及發炎細胞因子。惟，由巨噬細胞長期生成發炎介質可造成發炎反應，引發多種血管及細胞危險訊息的釋放，從而導致宿主的損傷且對多種發炎疾病的病理有所貢獻。
肺纖維化(PF)為ARDS公認之後遺症。儘管對PF之病理生理學的瞭解不斷增長，但病患的預後依然不佳。PF為不可逆的，且當前沒有任何療法可停止或顯著延緩該疾病的進展。通常，PF的治療策略目標為改善生活品質(即緩解疾病徵兆/症狀)或試圖進一步地限制發炎及結瘢。縱使缺乏對長期存活率
有益的證據，仍會使用包括皮質類固醇及細胞毒性劑的抗發炎藥物。吡非尼酮(Pirfenidone)及尼達尼布(nintedanib)為兩種FDA核可之IPF管理藥物。據報導，吡非尼酮及尼達尼布兩者都可在一定程度上減少肺纖維化病患肺部的纖維化組織，但該治療遠不及最佳治療。現在迫切需要更有效且更具耐受性的新一代療法或治療，即便無法治癒及改善病患整體生活品質(QoL)，也能顯著延緩肺纖維化的進展。
由於病毒或細菌感染誘發直接或間接肺部損傷而引起的過度發炎反應，導致急性呼吸窘迫症(ARDS)或肺纖維化死亡率仍然很高。因此，本領域仍然迫切需要新的治療方法以治療此類發炎性肺部疾病或病症。
2-吡啶酮(2-Pyridones)為一種用於治療革蘭陰性菌引起的細菌感染之強效抗菌劑；這類藥物是針對促發炎細胞因子(proinflammatory cytokines)之早期釋放的有效治療方法，可用於預防及/或治療與白血球浸潤相關的發炎。
本揭露涉及一種名為FJU-C28的化合物在治療急性呼吸窘迫症(ARDS)或肺纖維化的方法，該FJU-C28衍生自2-吡啶酮化合物。在本揭露的某些實施態樣中，於體外分析FJU-C28對發炎介質表現的抗發炎作用，並透過體內動物模型評估FJU-C28於改善ALI中肺功能的功效。在某些實施態樣中，藉由使用細胞因子蛋白陣列鑑定LPS誘發發炎之巨噬細胞中的細胞因子概況，接著利用體外細胞模型來操控主要細胞因子(包含IL-6及RANTES)在ARDS進展中的分子機制。
在一個方面，本揭露提供一種用於預防或治療發炎性肺部疾病或
病症的方法，包括向有其需要的個體投予醫藥組成物，其中，該醫藥組成物包括有效量的下式(I)化合物(即FJU-C28)或其鹽類：
在本揭露的至少一個實施態樣中，該發炎性肺部疾病或病症是由於病毒或細菌感染引起的過度發炎反應所導致。
在某些實施態樣中，該發炎性肺部疾病為急性呼吸窘迫症或肺纖維化。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類用於抑制該個體中iNOS之mRNA或蛋白質表現。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類用於抑制該個體中COX2之mRNA或蛋白質表現。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類用於抑制該個體中促發炎細胞因子之mRNA或蛋白質表現。在某些實施態樣中，該促發炎細胞因子可為RANTES、TIMP1、IL-6或IL-10。在某些實施態樣中，該促發炎細胞因子為RANTES或IL-6。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量介於0.1至10μM，如0.5至10μM、1至5μM或2至7μM。在某些實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量為約0.1μM、0.2μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、
6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.5μM、9μM、9.5μM、9.6μM、9.7μM、9.8μM、9.9μM或10μM。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量介於5至50mg/kg，如10至40mg/kg、20至40mg/kg或5至30mg/kg。在某些實施態樣中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量為約5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg、22.5mg/kg、25mg/kg、27.5mg/kg、30mg/kg、32.5mg/kg、35mg/kg、37.5mg/kg、40mg/kg、42.5mg/kg、45mg/kg、47.5mg/kg或50mg/kg。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該醫藥組成物還包括藥學上可接受的載劑。在某些實施態樣中，該藥學上可接受的載體劑選自由填充劑、黏合劑、防腐劑、崩解劑、潤滑劑、懸浮劑、潤濕劑、調味劑、增稠劑、酸、生物相容性溶劑、界面活性劑、錯合劑及其任意之組合所組成的群組，但本揭露不以此為限。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該醫藥組成物為選自由注射劑、乾粉劑、錠劑、口服液、植入劑(wafer)、膜劑、含片、膠囊、顆粒、丸劑、凝膠、洗劑、油膏、乳化劑、糊劑、霜劑、滴眼液及軟膏所組成的群組之形式，但本揭露不以此為限。
在本揭露的至少一個實施態樣中，該醫藥組成物以靜脈內、皮下、皮內、口服、鞘內(intrathecally)、腹膜內、鼻內、肌內、胸膜內、外用或透過霧化施用於該個體，但本揭露不以此為限。
在另一個方面，本揭露亦提供下列式(I)化合物(即FJU-C28)或其鹽類的用途，其係用於製備在有其需要的個體中預防或治療發炎性肺部疾病或
病症之藥物。
在本揭露中提供基於2-吡啶酮的合成化合物FJU-C28，以降低患有發炎性肺部疾病或病症的個體之間質中的嗜中性球浸潤、肺損傷及循環中之IL-6及RANTES量。FJU-C28擁有抗發炎活性，能藉由抑制JNK、p38 MAPK及NF-Kb之訊息傳遞路徑調降包括IL-6及RANTES之促發炎細胞因子，以防止內毒素誘發之肺功能衰退及肺損傷。
藉由閱讀下列實施態樣之說明並參照附圖，可更充分地理解本揭露。
圖1A至1E為說明FJU-C28在LPS誘發的RAW264.7巨噬細胞活化之作用的圖。
圖2A至2D為說明FJU-C28在LPS誘發促發炎細胞因子及發炎介質轉錄上之抑制作用的圖。
圖3為說明來自以多種化合物處理之RAW264.7巨噬細胞條件培養基中，細胞因子表現圖譜之陣列數據的圖。
圖4A至4D為說明FJU-C28抑制RAW264.7巨噬細胞中LPS誘發細胞因子表現的圖。
圖5A及5B為說明以多種訊號傳遞路徑中介的LPS誘發之IL-6及RANTES分泌的圖。
圖6A至6D為說明FJU-C28在LPS誘發之MAP激酶磷酸化及NF-κB轉位上之作用的圖。
圖7為說明MAPK抑制劑及FJU-C28在STAT3活化上之作用的圖。
圖8為說明FJU-C28在STAT3蛋白上之作用的圖。
圖9為說明FJU-C28藉由抑制LPS/TLR 4及IL-6/STAT3兩者之訊息傳遞以調節促發炎反應所提出之模型的圖。
圖10A至10C為說明FJU-C28在抑制STAT3及smad3、TGF1β誘發之alpha-SMA及纖連蛋白(fibronectin)上之作用的圖。
圖11A至11F為說明FJU-C28在預防內毒素誘發之全身性發炎小鼠中的肺功能衰退上之作用的圖。
圖12A及12B為說明FJU-C28在降低全身性發炎小鼠中之肺損傷及循環中之IL-6及RANTES量的圖。
下列實施例用於說明本揭露。基於說明書的揭露，所屬技術領域中具有通常知識者可輕易地瞭解本揭露的益處及效用。本揭露亦可如不同實施例所述的加以實現或應用。對於不同的方面和應用，可在不悖離本揭露所揭示的範圍下修改或變更用於實施本揭露的下列實施例。
如本文中所用，單數形式「一個」、「一種」及「該」除非明確地且肯定地限於一個指示物，否則包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則術語「或」與術語「及/或」可交替使用。
如本文中所用，術語「包括(comprising/comprises)」、「包含(include/including)」、「具有(have/having)」、「含有(contain/containing)」及其任何其他變化意欲涵蓋排他性的包含。例如，當描述物體「包括」某限制時，除非另有指明，其可額外包含其他成分、元件、成分、結構、區域、配件、裝置、系統、步驟或連接等，且不應排除其他限制。
如本文中所用，術語「病患」及「個體」可交替使用。該術語「個體」指人或其他動物。該個體的實例包含但不限於人、猴、小鼠、大鼠、土撥鼠、雪貂、兔、倉鼠、牛、馬、豬、鹿、狗、貓、狐狸、狼、雞、鴯鶓、鴕鳥及魚。在本揭露的一些實施例中，該個體是哺乳動物，例如，靈長類如人。
如本文中所用，術語「投予(administering)」或「給藥(administration)」指以透過使至少一部分的活性劑位於所需部位以產生所欲之效果的方法或途徑，將活性劑置於個體體內。本文所述的活性劑可藉由本領域已知的任何適當途徑投予。例如，以口服將本揭露的醫藥組成物給藥至個體。
本文中所用之數值範圍為包含性且可合併的，且落在本文中的數值範圍內之任何數值，都可作為最大值或最小值以自其衍生次範圍。例如，「0.1至10μM」之數值範圍應理解為包括最小值0.1μM至
最大值10μM之間的任何次範圍，如由0.1μM至5μM、由1.0μM至10μM、由0.5μM至8μM等次範圍。除此之外，本文中的多個數值可選擇性地選為衍生數值範圍之最高及最低值。譬如，數值0.1μM、5μM及10μM可衍生出數值範圍0.1μM至5μM、0.1μM至10μM及5μM至10μM。
如本文中所用，術語「約」通常意指包含給定值或範圍±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或±0.1%差異的數值。該數值的差異可發生於，例如，實驗誤差、在製作化合物、組成物、濃縮物或配方時測量或處理程序常見的誤差、用於本揭露的來源、製備或起始物或原料的純度的差異或類似考量。另外，術語「約」係指在所屬領域中通常知識者認可的平均值標準誤差中。除非另有明確指明，本文中揭露的所有數值範圍、量、值及百分比在所有情況中皆應理解為以術語「約」修飾。例如用於物質的量、時間的長度、溫度、操作條件、量的比率等的數值範圍、量、值及百分比。
許多的細胞因子與纖維化的發病機制有關，包含但不限於轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、類胰島素生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、內皮素1(endothelin-1，ET-1)及介白素(interleukins)、介白素1(interleukin-1，IL-1)、介白素6(interleukin-6，IL-6)、介白素8(interleukin-8，IL-8)及介白素17(interleukin-17，IL-17)。白血球趨化因子化學吸引因子(chemokine leukocyte chemoattractants)，包含活化調節之正常T細胞表現及
分泌(Regulated upon Activation in Normal T-cells,Expressed and Secreted，簡稱RANTES)因子，亦被認為扮演重要角色。在周邊血液中促發炎細胞因子量的升高被發現與特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)病患的死亡率、無肺移植存活率及疾病進展相關，該等細胞因子例如介白素8(interleukin 8，IL-8)及相關的下游細胞黏著分子(CAMs)如細胞間黏著分子1(cell adhesion molecules，ICAM-1)和血管細胞黏著分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases)如基質金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)及訊息傳遞分子如S100鈣結合蛋白A12(S100 calcium-binding protein A12，簡稱S100A12，亦稱為鈣顆粒蛋白C(calgranulin C))。
IL-6為主要促發炎因子，可誘發急性期反應、嚴重氣喘及發炎性肺部疾病。IL-6為訊息轉換因子及轉錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的主要活化劑，可在發炎過程中阻擋細胞凋亡，讓這些細胞在有毒環境中存活。多項證據顯示，IL-6為多效性細胞因子，在由先天性免疫轉換到後天性免疫的轉變過程中，可防止發炎期間嗜中性球分泌的蛋白酶及活性氧的積累所致的組織損傷增加。研究顯示，包含核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)及有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)訊息傳遞路徑在內的多種訊息傳遞路徑在急性肺損傷的動物模型中被調升。NF-κB透過調節促發炎細胞因子、黏著分子、趨化因子、生長因子及可誘發酵素(inducible enzymes)，於免疫及發炎反應中扮演關鍵角色。近期報告顯示，p38 MAPK為LPS誘發之IL-6分泌的助力。
研究顯示，刺激p38 MAPK及NF-κB兩者之訊息傳遞路徑可誘發IL-6基因的表現及釋放。
RANTES(亦稱為CCL5)為一種C-C趨化因子，其在募集白血球(包括T淋巴球、巨噬細胞、嗜伊紅細胞及嗜鹼性球)至發炎部位方面發揮重要作用。由病毒引起的數種感染性疾病，包含登革熱病毒、呼吸道融合病毒及A型流感病毒能引起呼吸道發炎，且在人類及動物模型中顯著地誘發RANTES的分泌及表現。此外，SARS冠狀病毒(SARS-CoV)及呼吸道融合病毒(RSV)可在細胞模型中誘發高IL-6及RANTES(CCL5)。於初次呼吸道融合病毒感染後，高表現量的RANTES與呼吸道疾病惡化相關；以抗RANTES抗體治療RSV感染的動物後顯示，其呼吸道高反應性(airway hyperreactivity，AHR)有顯著降低。RANTES的表現與CD45陽性發炎性細胞的浸潤有關，後者會造成肺動脈高血壓。數種ARDS動物模型顯示LPS或藍皮素(caerulein)誘發的RANTES表現量升高會導致全身性發炎反應及遠端肺損傷(distant lung injury)。以Met-RANTES治療該藍皮素誘發的小鼠胰臟炎可減少肺損傷。除此之外，阻止該RANTES受器CC趨化因子受器5型(CC-chemokine receptor type 5)可降低及預防補體成分5a(complement component 5a)誘發之急性肺損傷中的肺損傷。是以，RANTES可能參與多種生理病理性過程，因此可藉由干擾此趨化因子結合至其蛋白多醣受器，作為新治療策略之目標。
促發炎細胞因子在細胞訊息傳遞及促發全身性發炎中係重要者；細胞因子主要由活化的巨噬細胞產生，並參與發炎反應的調升。
如TNFα及IL-6的促發炎細胞因子調節細胞訊息傳遞並促發全身性發炎。據近期報導，替代的抗發炎藥用化合物吡非尼酮為一種吡啶酮相關化合物，可於體外及體內抑制TNFα生成，並預防敗血性休克及隨後的死亡。本揭露證實，新合成的吡啶酮相關化合物FJU-C28能顯著降低LPS誘發的RANTES及IL-6之表現。
在某些實施態樣中，FJU-C28藉由抑制該NF-κB及MAPK路徑而對預防發炎性疾病有潛在益處。MAPK及NF-κB在中介胞外訊息傳遞至細胞核及活化發炎性細胞因子及介質表現中扮演重要角色。在某些實施態樣中，FJU-C28能藉由調控NF-κB、p38 MAPK及JNK訊息傳遞路徑而顯著地抑制促發炎細胞因子IL-6之表現及STAT3之活化。NF-κB為一種無活性型式，由細胞質內的抑制蛋白IκBα穩定，且在如促發炎細胞因子、感染或生理壓力的多種刺激下產生反應而活化。活化的NF-κB由細胞質轉位至細胞核並調節促發炎性的及抗細胞凋亡的基因表現。此路徑亦可因正向NF-κB自調節迴路的發炎反應而被放大，並增加慢性發炎的持續時間。
發現TNFα及IL-6分泌、小鼠肺部嗜中性球的積累和蛋白質滲漏係依賴p38 MAPK之訊息傳遞。p38 MAPK由廣泛的受質活化，且歸因於此類磷酸化事件的下游活動常為具細胞類型專一性者，包括發炎反應、細胞分化、細胞凋亡、細胞因子生成及RNA剪接的調節。以MAPK活化STAT3磷酸化，且這些途徑在促發炎細胞因子生成及下游訊息傳遞事件中發揮調節作用，導致發炎介質在轉錄與轉譯層面上的合成。成功地抑制IL-6並抑制NF-κB、ERK、JNK及p38 MAPK的活性
可能在發炎介導的疾病中具有潛在治療價值，包含急性期反應、慢性發炎、自體免疫、內皮細胞功能異常及纖維化。
在某些實施態樣中，LPS誘發之IL-6生成係以FJU-C28透過抑制NF-κB、p38及JNK訊息路徑活化加以抑制，且IL-6/STAT3訊息傳遞的活性亦藉由降低STAT3蛋白的水平加以抑制，暗示降低的STAT3蛋白量可能是由於蛋白降解所致。惟，該等數據顯示該合成化合物FJU-C28為一種潛在發炎治療劑，用於治療由IL-6/STAT3訊息傳導介導之發炎介導疾病，包括氣喘及發炎性肺部疾病。
AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是能量代謝和自噬的調節劑，其介導能量恆定，包含碳水化合物、脂質及蛋白質的代謝。近期研究顯示，抑制AMPK的活化會增強LPS誘發的發炎反應，包含加重ALI的嚴重程度；反之，再活化的AMPK於體外及體內發揮有效的抗發炎作用並減輕LPS誘發的急性肺損傷。Zhao等人表明RANTES/CCL5透過該AMPK途徑活化自噬，且自噬作用增加遷移，其係以AMPK抑制劑實驗獲得證實。在某些實施態樣中，已證實在體外及體內LPS誘發發炎之情況下，IL-6及RANTES的分泌調升。現有數據顯示RANTES可能參與急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症(ARDS)病患中的與過度分解代謝(hypercatabolism)相關的促發炎反應。此一發現表明，IL-6及RANTES可能在患有全身性發炎反應的小鼠之能量代謝中扮演重要角色。在本揭露中，發現FJU-C28為LPS活化的巨噬細胞及內毒血症小鼠中阻斷IL-6及RANTES分泌的強效化合物。在某些實施態樣中，動物實驗亦顯示以FJU-C28治療能阻止LPS誘發的肺功能衰退，包含肺活量、肺順應性(lung compliance)
及用力肺活量(forced vital capacity)。此一證據有力地表明，FJU-C28為一種有高度前景的治療發炎性肺損傷的治療藥劑，其可透過RANTES及IL-6/STAT3訊息傳遞路徑為中介，改善病毒誘發或內毒素誘發的全身性發炎反應所致的肺功能衰退。
實施例
材料與方法
下列實施例1至7使用的材料與方法於下方詳述。本揭露所用但在本文中未註記的材料皆為商購購得。
(1)細胞培養
RAW264.7細胞(小鼠類單核球/巨噬細胞細胞)購自生物資源保存及研究中心(台灣新竹)。該細胞保存於含有10%胎牛血清(HyClone,Logan,UT,USA)、MEM非必需胺基酸(HyClone)、100mM丙酮酸鈉(HyClone)及青黴素/鏈黴素(HyClone)的DMEM(HyClone,Logan,UT,USA)中。該細胞於37℃在5% CO2及95%空氣的加濕大氣中培養。
(2)化學品
本研究使用之FJU-C類化合物由台灣天主教輔仁大學化學系合成。脂多醣(LPS)(大腸桿菌0111：B4；目錄編號：L4391)購自Sigma-Aldrich(Saint Louis,MO,USA)。BAY11-7082(NF-κB抑制劑)、PD98059(ERK1/2抑制劑)、SB203580(p38 MAPK抑制劑)及SP600125(JNK抑制劑)購自Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY,USA)。雷帕黴素(Rapamycin)(mTOR抑制劑)及渥曼青黴素
(Wortmannin)(磷脂酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase)抑制劑)購自Abcam Biotechnology(Cambridge,UK)。CLI-095(TLR4訊息傳遞抑制劑)購自InvivoGen(San Diego,CA)。
(3)細胞因子蛋白陣列分析
細胞因子陣列分析依據Raybio小鼠細胞因子抗體陣列4(RayBiotech,Inc.Peachtree Corners,GA)建議程序執行。此細胞因子蛋白陣列用於同時判定單一樣本中40種不同細胞因子、趨化因子及急性期蛋白的相對多寡。各樣本使用100μl的細胞培養基。該細胞因子蛋白陣列膜上的訊號強度利用ImageJ軟體測量且利用MultiExperiment Viewer(MeV V.4.9.0)軟體所繪熱圖呈現。
(4)定量實時PCR
RNA利用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)如前所述由細胞單離。該單離的RNA濃度利用Epoch微量盤分光光度計(BioTek,Winooski,VT,USA)測量。以隨機引子及MMLV RT套組(Epicenter Biotechnologies,Madison,WI,USA)反轉錄1g RNA成cDNA。該混和物(2μl)加至PCR試劑以透過特定引子(表1)測量該目標mRNA水平。依照我們之前所述方法，所有及時PCR在含有10μl實時PCR SYBR綠色主混和液(Real-time PCR SYBR Green master mix)(Toyobo,Osaka,Japan)的20μl容量中利用PikoReal 96實時PCR系統(Thermo Fisher Scientific Inc.)執行。使用β肌動蛋白作為RNA定量的內部控制組。
表1即時PCR引子
(5)酵素免疫吸附分析法(ELISA)
細胞培養基及小鼠血清的RANTES(RayBiotech)、IL-1β及IL-6(eBioscience,San Diego,CA,USA)濃度係依製造商之指示，利用ELISA套組加以測量。利用Epoch微量盤分光光度計(BioTek,Winooski,VT,USA)於450nmol/L測量該盤。該樣本中RANTES、IL-1β及IL-6的濃度以標準曲線判定。
(6)西方墨點法
簡而言之，以10% SDS-PAGE分離細胞溶胞產物並轉印至PVDF膜(HybondTM-P,Amersham,Piscataway,NJ,USA)。該墨點之抗p38(目錄編號：8690P)、抗p-p38(Thr180/Tyr182；目錄編號：4511P)、抗ERK44/42(目錄編號：4695P)、抗p-ERK44/42(Thr202/Tyr204；目錄編號：4370P)、抗JNK(目錄編號：9258P)、抗p-JNK(Thr183/Tyr185；目錄編號：4668P)、抗p65(目錄編號：8242S)、抗STAT3(目錄編號：12640S)、抗p-STAT3(Tyr705；目錄編號：
9145S)及抗RANTES(目錄編號：2989S)抗體探針由Cell Signaling Technology,Inc.(Danvers,MA,USA)提供。抗核纖層蛋白A/C(anti-Lamin A/C)(目錄編號：101127)抗體由GeneTex,Inc.(San Antonio,TX,USA)取得。抗β肌動蛋白(目錄編號：SC-47778)及抗COX2(目錄編號：SC-1746)抗體由Santa Cruz Biotechnology,Inc.(Dallas,Texas,USA)取得。抗iNOS(目錄編號：610329)抗體由BD transduction Lab.(San Jose,CA,USA)取得。結合的抗體以電化學發光染色(electrochemical luminescence staining)(Western Lighting Plus ECL；PerkinElmer,Wellesley,MA,USA)、利用FUJI醫用X光底片(Fuji Corporation,Kofu,Yamanashi,Japan)之自動放射顯影術或MultiGel-21多功能顯影系統(科光生物，台灣新北市)視覺化。該西方墨點條帶強度以ImageJ軟體定量。該定量的免疫墨點數據以內部控制組蛋白標準化，並以對照組相對於控制組的比例表示。該數據代表至少3獨立重複實驗的平均±S.D.。
(7)分析細胞存活
RAW264.7巨噬細胞依指示以FJU-C類(0至10μM)預處理30分鐘並接著用/不用LPS(100ng/ml)刺激24小時。餘下的細胞以溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)測定評估。含有甲蠟結晶(formazan crystals)的細胞溶於DMSO(Merck,Darmstadt,Germany)中並利用分光光度計(BioTek Instruments,Inc.Winooski,Vermont,USA)於波長595nm定量。各實驗至少重複3次。
(8)動物模型
本研究使用樂斯科生物科技(台灣台北市)10周齡C57BL/6公小鼠。該小鼠保存於如前研究所述之標準實驗室環境中。全部動物程序由天主教輔仁大學實驗動物照護及使用委員會核可(IACUC核可字號：A10508)。確認所有實驗亦在符合ARRIVE指引下執行。所有手術皆在麻醉下執行且盡所有努力以最小化動物之疼痛及不適。該小鼠隨機分配至3組中：對照組(n=7)、LPS(n=7)及LPS加C28(n=8)。將有/無FJU-C28(5mg/kg)之DMSO/PBS緩衝液注射至該些小鼠，且在1小時後，以腹膜內注射溶於PBS緩衝液之LPS(7.5mg/kg)刺激該些小鼠。於LPS刺激的24小時後，將該些小鼠以氯胺酮(100mg/kg)(Pfizer,New York,US)及賽拉嗪(xylazine)(10mg/kg)(Bayer,Leverkusen,Germany)腹腔內注射加以麻醉，將呼吸道導管插管至氣管內並連接至強制肺部操作系統(forced pulmonary maneuver system)(Buxco Research System；Buxco Electronics,Wilmington,NC)。本程序的細節以如之前研究描述之方式執行。利用Buxco研究系統測量包含C弦(C chord)(肺順應性)、IC(吸氣容量)、VC(肺活量)、FEV100(100ms用力吐氣量)及FVC(用力肺活量)之肺功能值。在肺功能測定後，犧牲該實驗小鼠並以心臟穿刺收集血液。該肺葉藉由導管以緩衝的4%三聚甲醛充氣。以光學顯微鏡分析蘇木精及伊紅染色的5μm厚的肺樣本切片。
(9)統計分析
三次重複的實驗數據以平均值及標準誤差表示。所有的統計分析皆以單因子ANOVA接著以Tukey多重比較事後檢定(Tukey’s
multiple comparison post hoc test)執行分析。p<0.05的值認定為顯著。
實施例1：FJU-C28對活化LPS誘發之RAW264.7巨噬細胞的效用
為比較新合成化合物FJU-C28(圖1A)相對於母化合物FJU-C4對LPS活化的鼠類巨噬細胞之抗發炎效用，將RAW264.7巨噬細胞以多種濃度的FJU-C類預處理30分鐘，接著使用或不使用LPS刺激24小時。FJU-C28保護RAW264.7巨噬細胞免受LPS誘發之細胞死亡，並展現出較10μM FJU-C4更低的細胞毒性(圖1B)。LPS刺激改變巨噬細胞的形狀，造成細胞質內有數個液泡的類樹突細胞，而未處理的細胞則圓而小。FJU-C28以濃度依存形式明顯地抑制這些形態上的改變，且該型態相似於未處理細胞(圖1C)。此效用與細胞毒性測定發現一致。此結果表明，FJU-C28可在RAW264.7巨噬細胞中抑制由LPS誘發之發炎反應。此外，FJU-C28在高於5μM的劑量抑制iNOS及COX2的表現(圖1D)。該定量免疫墨點數據示於圖1E。
實施例2：FJU-C28對發炎介質及促發炎細胞因子轉錄調控之抑制效用
利用定量實時RT-PCR分析FJU-C28對巨噬細胞促發炎細胞因子及發炎後期介質基因表現的功效(圖2)。結果顯示，iNOS及COX2的mRNA量以濃度依存形式下調。當FJU-C28濃度低於10μM時，促發炎細胞因子IL-6及IL-1β mRNA量以濃度依存下降。當FJU-C28劑量高於5μM時，其明顯地抑制IL-6及iNOS的基因表現。這些結果表明，FJU-C28顯著地降低包含IL-6及IL-1β促發炎細胞因子在LPS誘發之RAW264.7巨噬細胞中的轉錄。
實施例3：多種條件培養基中細胞因子表現概況
為區分在LPS誘發發炎上多種FJU-C類的功效，收集以多種條件處理的RAW264.7巨噬細胞細胞培養基，並利用小鼠細胞因子抗體陣列分析(圖
3左欄)。該陣列膜上的訊號強度以密度測定法定量，且以熱圖呈現不同細胞因子的改變(圖3右欄)。相較於未處理細胞的培養基，結果顯示，包含IL-10、IL-6、GCSF、伊紅趨素(Eotaxin)、TNFα、IL-17、IL-1β、瘦素、sTNF RII及RANTES的多種細胞因子在LPS刺激下增強至少5倍。而且，FJU-C28處理明顯地抑制RANTES、TIMP1、IL-6及IL-10細胞因子的分泌。雖然FJU-C4處理亦抑制LPS誘發之TIMP1、IL-6及IL-10分泌，RANTES的表現量並未受FJU-C4處理改變(表2)。
表2蛋白陣列分析
實施例4：FJU-C28抑制LPS誘發的RANTES及IL-6表現
為確認FJU-C28是否可抑制RAW264.7巨噬細胞中RANTES的表現，收集經過各種條件處理的RAW264.7巨噬細胞的細胞培養基及細胞溶胞產物產物以進行ELISA及西方墨點分析。ELISA結果顯示，在LPS處理的細胞之細胞培養基及細胞溶胞產物中，RANTES的表現增強；FJU-C28明顯地抑制LPS誘發的RANTES表現；但FJU-C4無法在6小時或24小時降低LPS誘發的RANTES表現(圖4A)。此外，西方墨點分析亦確認FJU-C28在6小時明顯地抑制該LPS誘發的RANTES蛋白表現，但FJU-C4並未降低被處理的細胞RANTES蛋白表現(圖4B)。在細胞培養基中促發炎細胞因子如IL-6及IL-1β的分泌亦以ELISA進行分析(圖4C及4D)。結果顯示，FJU-C28明顯地降低LPS處理的巨噬細胞中RANTES、IL-6及IL-1β的生成。
實施例5：FJU-C28在LPS誘發MAP激酶磷酸化及NF-κB轉位的功效
為鑑定調節LPS刺激所誘發的IL-6及RANTES分泌的潛在訊息傳遞路徑，以多種激酶抑制劑預處理RAW264.7巨噬細胞30分鐘，然後使用/不使用100ng/ml LPS刺激24小時；收集該細胞培養基以進行ELISA測定。結果顯示，LPS誘發的IL-6及RANTES表現被CLI-095(TLR4抑制劑)、BAY11-7082(IkB-α 抑制劑)、SB203580(p38 MAPK抑制劑)及SP600125
(JNK抑制劑)抑制，但不被PD98059(ERK抑制劑)、雷帕黴素(mTOR抑制劑)及渥曼青黴素(磷脂酸肌醇3-激酶抑制劑)抑制(圖5A及5B)。其表明LPS係透過NF-kB、p38及JNK訊息傳遞路徑活化刺激TLR4之訊息傳遞以誘發IL-6及RANTES表現，但不透過ERK、PI3K或mTOR訊息傳遞路徑。我們進一步調查FJU-C28於LPS刺激的巨噬細胞中MAPK活化上之潛在抑制作用。以5μM及10μM FJU-C28處理，明顯地抑制巨噬細胞中LPS誘發的p-ERK、p-p38及p-JNK MAP激酶量(圖6A)。圖6B中顯示定量免疫墨點數據。為調查FJU-C28是否可中介NF-κB(p65)的轉錄活性，在LPS刺激的巨噬細胞中檢驗NF-κB p65的轉位。結果顯示，核萃取中NF-κB p65的量在LPS刺激的細胞中相較未處理細胞明顯上升。隨投予LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞的FJU-C28劑量增加，核NF-κB(p65)減少；反之，NF-κB(p65)累積在胞質液萃取中(圖6C)。此結果表明，FJU-C28可在濃度依存形式下阻止LPS誘發的NF-κB由胞質液至細胞核之轉位以抑制NF-κB轉錄活性。
實施例6：FJU-C28在IL-6/STAT3訊息傳遞上的功效
為調查FJU-C28在LPS誘發的巨噬細胞發炎之IL-6/STAT3訊息傳遞上的抑制作用，將LPS刺激的細胞以FJU-C28或多種MAPK抑制劑處理，且將細胞溶胞產物以西方墨點法分析。結果顯示，FJU-C28濃度依存地抑制LPS誘發的RAW264.7巨噬細胞的STAT3磷酸化。此外，包含SB203580(p38 MAPK抑制劑)及SP600125(JNK抑制劑)的MAPK抑制劑抑制RAW264.7巨噬細胞中LPS誘發的STAT3磷酸化，但PD98059(ERK抑制劑)僅稍微抑制STAT3磷酸化。整體而言，這些發現顯示FJU-C28在以抑制JNK及p38 MAPK活化抑制LPS誘發的IL-6/STAT3之訊息傳遞活化中扮演重要的角色，JNK及p38 MAPK
介導RAW264.7巨噬細胞中LPS誘發的IL-6表現(圖6D)。此外，SP600125的抑制作用較SB203580佳，這是因為SP600125亦有助於IL-6刺激誘發之STAT3磷酸化的抑制作用(圖7)。有趣的是，FJU-C28可透過不只p38及JNK去活化而且減少STAT3蛋白量，而明顯地抑制LPS誘發的IL-6/STAT3訊息傳遞(圖8)。圖9說明了所提出的關於FJU-C28抑制IL-6/STAT3之作用機制。
更進一步地，對FJU-C28及FDA核可藥物吡非尼酮(Pirfenidone)在STAT3抑制、smad3活化、TGF1β所誘發的alpha-SMA及纖連蛋白表現之功效進行比較。結果顯示於圖10A、10B及10C之定量免疫墨點數據中。如圖10A、10B及10C所示，FJU-C28在抑制STAT3、smad3、TGF1β誘發的alpha-SMA及纖連蛋白表現的作用上較吡非尼酮更為顯著。
實施例7：FJU-C28在LPS誘發系統性發炎小鼠肺功能的效用
為評估FJU-C28在內毒素誘發之系統性發炎小鼠肺功能的保護效用，向C57BL/6公小鼠投予LPS(7.5mg/kg)，且使用/不使用FJU-C28(5mg/kg)處理24小時；之後，利用Buxco肺功能測試系統測量肺功能參數。結果顯示，相較於正常對照組小鼠，LPS誘發全身性發炎之小鼠具有顯著衰退的肺吸氣容量(IC)、肺活量(VC)、肺順應性(C弦)、100ms用力吐氣量(FEV100)及用力肺活量(FVC)。然而，相較於LPS處理的小鼠，FJU-C28治療恢復了LPS誘發的肺功能衰退，包括VC(p<0.05)、C弦、FEV100(p<0.05)及FVC(p<0.05)(圖11)。為確認LPS誘發肺損傷小鼠的狀態，以H&E染色執行肺樣本的組織檢查。結果顯示，相較於對照組的小鼠，LPS刺激組的小鼠肺泡結構被破壞、增厚、不規則，且嗜中性球在肺間質中浸潤及累積。相較於LPS刺激組，在LPS+FJU-C28治療組中，FJU-C28治療減少了間質中的嗜中性球浸潤，並維持了小鼠肺組織中大部
分肺泡結構(圖12A)。為確立目標細胞因子及肺損傷間的關聯性，以ELISA檢測血清細胞因子。結果顯示，相較於對照組小鼠，IL-6及RANTES於循環中的量在LPS誘發全身性發炎小鼠中顯著升高。FJU-C28治療顯著抑制了IL-6及RANTES的分泌(圖12B)。此發現表明，FJU-C28可藉由抑制包含IL-6及RANTES的促發炎細胞因子，而在LPS誘發的全身性發炎中減輕肺損傷。
本揭露出乎預期地發現FJU-C28擁有抗發炎活性。藉由抑制JNK、p38 MAPK及NF-κB訊息傳遞路徑調降包括IL-6及RANTES的促發炎細胞因子，以預防內毒素誘發之肺功能衰退及肺損傷。本揭露提供了對於肺部發炎性疾病的機制的額外洞見，以及治療干預的新契機。
儘管上文已詳述了本揭露的一些實施例，對於所屬技術領域內具有通常知識者，可對所示的實施例進行多種修改和變更而基本上不悖離本揭露的教導和益處。此等修改和變更包含在如所附申請專利範圍中闡述的本揭露範圍內。
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Claims (20)
- 一種預防或治療發炎性肺部疾病或病症的方法，包括向有其需要的個體投予醫藥組成物，其中，該醫藥組成物包括有效量的下式(I)化合物或其鹽類：
- 如請求項1所述之方法，其中，該發炎性肺部疾病為急性呼吸窘迫症或肺纖維化。
- 如請求項1所述之方法，其中，該式(I)化合物或其鹽類係用於抑制該個體中iNOS之mRNA或蛋白質表現。
- 如請求項1所述之方法，其中，該式(I)化合物或其鹽類係用於抑制該個體中COX2之mRNA或蛋白質表現。
- 如請求項1所述之方法，其中，該式(I)化合物或其鹽類係用於抑制該個體中促發炎細胞因子之mRNA或蛋白質表現。
- 如請求項5所述之方法，其中，該促發炎細胞因子為選自由IL-10、IL-6、GCSF、伊紅趨素、TNFα、IL-17、IL-1β、瘦素、sTNFRII、RANTES、IL-12 p-40 p70、GM-CSF、Fas配體、I-TAC、SDF1、伊紅趨素-2、TIMP-1、MCP-1、IL-2、弗拉塔凱、CD30 L、IL-1α、IL-3、TIMP-2、INF gamma、sTNFRI、BLC、淋巴細胞趨化因子、MCSF、TECK、MIP-1α、TCA-3、KC、IL-4、IL-12 p70、LIX、IL-9、MIP-1γ、IL-13、MIG及其組合所組成的群組。
- 如請求項6所述之方法，其中，該促發炎細胞因子為選自由RANTES、TIMP1、IL-6、IL-10及其組合所組成的群組。
- 如請求項7所述之方法，其中，該促發炎細胞因子為RANTES或IL-6。
- 如請求項1所述之方法，其中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量介於0.1至10μM。
- 如請求項1所述之方法，其中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量介於5至50mg/kg。
- 一種下式(I)化合物或其鹽類之用途，其係用於製備在有其需要之個體中預防或治療發炎性肺部疾病或病症之藥物：
- 如請求項11所述之用途，其中，該發炎性肺部疾病為急性呼吸窘迫症或肺纖維化。
- 如請求項11所述之用途，其中，該式(I)化合物或其鹽類係用於抑制該個體中iNOS之mRNA或蛋白質表現。
- 如請求項11所述之用途，其中，該式(I)化合物或其鹽類係用於抑制該個體中COX2之mRNA或蛋白質表現。
- 如請求項11所述之用途，其中，該式(I)化合物或其鹽類係用於抑制該個體中促發炎細胞因子之mRNA或蛋白質表現。
- 如請求項14所述之用途，其中，該促發炎細胞因子為選自由IL-10、IL-6、GCSF、伊紅趨素、TNFα、IL-17、IL-1β、瘦素、sTNFRII、RANTES、IL-12 p-40 p70、GM-CSF、Fas配體、I-TAC、SDF1、伊紅趨素-2、TIMP-1、MCP-1、IL-2、弗拉塔凱、CD30 L、IL-1α、IL-3、TIMP-2、INF gamma、sTNFRI、BLC、淋巴細胞趨化因子、MCSF、TECK、MIP-1α、TCA-3、KC、IL-4、IL-12 p70、LIX、IL-9、MIP-1γ、IL-13、MIG及其組合所組成的群組。
- 如請求項16所述之用途，其中，該促發炎細胞因子為選自由RANTES、TIMP1、IL-6、IL-10及其組合組成的組。
- 如請求項17所述之用途，其中，該促發炎細胞因子為RANTES或IL-6。
- 如請求項11所述之用途，其中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量介於0.1至10μM。
- 如請求項19所述之用途，其中，該式(I)化合物或其鹽類的有效量介於5至50mg/kg。
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