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TW202330915A - 用於無模板ｒｎａ合成的核酸聚合酶變體、試劑套組及方法 - Google Patents

用於無模板ｒｎａ合成的核酸聚合酶變體、試劑套組及方法 Download PDF

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TW202330915A TW111136857A TW111136857A TW202330915A TW 202330915 A TW202330915 A TW 202330915A TW 111136857 A TW111136857 A TW 111136857A TW 111136857 A TW111136857 A TW 111136857A TW 202330915 A TW202330915 A TW 202330915A
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呈堯 陳
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Abstract

本發明所提供內容係關於核酸聚合酶變體及包含該核酸聚合酶變體的套組，其中該核酸聚合酶變體可利用核糖核苷酸 (rNTP) 以耐熱方式執行無模板核酸合成，故具有更理想的功能及活性。

Description

用於無模板RNA合成的核酸聚合酶變體、試劑套組及方法
本發明係關於一種聚合酶變體以及包含其的試劑套組，具體而言係關於用於酶催化核酸新生合成 ( de novoenzymatic nucleic acid synthesis)的聚合酶變體及包含該變體的試劑套組；然而本發明並不以此為限。
不論在學術或工業領域，寡核苷酸的合成對於生物技術研究的各種面向而言都至關重要。然而，過去數十年所發展的傳統化學合成方法存在著許多侷限；尤其是核糖核酸 (以下簡稱 RNA) 新生合成 ( de novoRNA synthesis) 更是如此，因此對於那些大舉投資以推進基因體工程技術及利用RNA的診斷、治療、定序技術、核酸資訊儲存甚至生物計算的人而言，此技術顯然仍遙不可及。RNA的化學合成深受冗長的反應步驟所困，且該些反應步驟皆需要較為苛刻的化學試劑及生物不相容的有機溶劑；此等反應條件往往會導致核苷酸鹼基去嘌呤 (depurination)、整體序列發生意外插入 (insertion) 或者自序列中缺失，以及過早發生不可逆的寡核苷酸加帽 (irreversible capping)，導致無用的截短產物。這些問題皆大幅增加了RNA合成的整體錯誤率，並限制了RNA寡核苷酸的合成長度 (小於120個核苷酸)，且需要更長的生產時間才能獲得差強人意的預期產物產率。除此之外，RNA寡核苷酸的化學合成具有毒性且勞力密集。據此，克服當前RNA寡核苷酸合成的種種侷限實為重要的課題。
由酶催化的核酸新生合成為一種新興且無毒的方法，用以替代已有數十年歷史，運用亞磷醯胺且有毒性的化學核酸合成方法。所有生命體都依賴核酸聚合酶有效地複製其核酸。依據複製核酸的機制，絕大多數的核酸聚合酶都需要模板來引導核苷酸合成以及將核苷酸併入增長中的核酸鏈內。在依賴模板的核酸合成方式中，聚合酶必須與引子-模板核酸結合，隨後聚合酶才能將核苷酸添加至引子的3'端。
然而，與大多數複製性的核酸聚合酶不同，X族末端去氧核苷酸轉移酶 (Terminal deoxynucleotidyl Transferase；Tdt) 係一類獨特的嗜中溫酶 (mesophilic enzyme)，其在合成核酸期間並不依賴模板添加核苷酸。Tdt僅需要一段短的起始DNA或引子來引導核苷酸的合成，以及將核苷酸併入增長中的起始DNA或引子中。先前的研究表明，Tdt可結合去氧核糖核苷酸 (dNTP) 及核糖核苷酸 (rNTP) 且對兩者的區別不大(Boulé, J B等人， The Journal of biological chemistry(2001))。然而，Tdt僅能延長形成最多約4到5個核糖核苷酸的新合成RNA鏈，可見實務上Tdt在使用核糖核酸或核糖核酸/去氧核糖核酸混合受質進一步合成的併入功效並不理想；故，Tdt並不適用於RNA新生合成之反應。
由於上述多樣化的結構-功能關係，自然中用以複製的核酸聚合酶恐無法輕易地將核糖核苷酸 (rNTP) 用作核糖核酸新生合成之受質。因此，特製化、經修飾的核酸聚合酶實為往後各種核酸合成應用得以發揮的必要先決條件。
本發明人在B族DNA聚合酶變體的胺基酸序列中發現了一些新位置/區域，該些位置/區域在賦予所述聚合酶的模板非依賴性 (template independence) 以及增強該聚合酶對於核糖核苷酸的受質結合親和力上有關鍵的作用，進而為無模板RNA合成方法提供了新的可能性。
具體而言，本發明一方面提供一種所謂的RNA聚合酶變體，其包含：A模體及B模體，分別對應於共通序列(SEQ ID NO：1)之位置706至730以及位置843至855；以及至少一個胺基酸取代，此取代係位於A模體、B模體或其組合中的位置；其中該RNA聚合酶變體具有減弱或缺失的3'至5'核酸外切酶活性。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係由野生型B族DNA聚合酶修飾而成，且該野生型B族DNA聚合酶的胺基酸序列包含選自於SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17之胺基酸序列。
根據本發明之一實施例，該野生型B族DNA聚合酶係柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)、鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)、嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶(9°N)、激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)、海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)、嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)、冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)、硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)、海沼甲烷球菌 ( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶 (Mma) 、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元 (hPOLD)、釀酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元 (ScePOLD)、綠膿桿菌 ( Pseudomonas aeruginosa) DNA聚合酶II (Pae)、大腸桿菌 ( Escherichia. coli) DNA聚合酶II (Eco)、大腸桿菌噬菌體RB69 DNA聚合酶 (RB69)、大腸桿菌噬菌體T4 DNA聚合酶 (T4) 或芽孢桿菌噬菌體 Phi29 DNA聚合酶 (Phi29)。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體包含對應於共通序列(SEQ ID NO：1)之位置349至位置364的Exo I模體，且該RNA聚合酶變體在該Exo I模體中的位置具有至少一胺基酸取代。較佳地，根據本發明之一實施例，該RNA聚合酶變體之中，對應於SEQ ID NO：1位置715之胺基酸L或M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，所選之RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：2之柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)，且其中：在SEQ ID NO：2位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：2位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：2位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO： 2之柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)，且其中：在SEQ ID NO：2位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：2位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：2位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO： 2位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)，且其中：在SEQ ID NO：3位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：3位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：3位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)，且其中：在SEQ ID NO：3位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：3位置409之胺基酸Y保持不變或由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：3位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：3位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有含野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)，且其中：在SEQ ID NO： 4位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：4位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：4位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶(9°N)，且其中：在SEQ ID NO：4位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：4位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：4位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：4位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)，且其中：在SEQ ID NO：5位置409之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：5位置410之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：5位置411之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)，且其中：在SEQ ID NO：5位置409之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：5位置410之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：5位置411之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：5位置486之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)，且其中：在SEQ ID NO：6位置411之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：6位置412之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：6位置413之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶(Vent)，且其中：在SEQ ID NO：6位置411之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：6位置412之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：6位置413之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：6位置488之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：7之嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)，且其中：在SEQ ID NO：7位置485之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：7位置486之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：7位置487之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：7之嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)，且其中：在SEQ ID NO：7位置485之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：7位置486之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：7位置487之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：7位置565之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)，且其中：在SEQ ID NO：8位置426之胺基酸M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：8位置427之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：8位置428之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)，且其中：在SEQ ID NO：8位置426之胺基酸M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：8位置427之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：8位置428之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO： 8位置508之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：9之硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)，且其中：在SEQ ID NO：9位置518之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：9位置519之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：9位置520之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。所取代
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：9之硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)，且其中：在SEQ ID NO：9位置518之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代；在SEQ ID NO：9位置519之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；在SEQ ID NO：9位置520之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及在SEQ ID NO：9位置601之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體表現出一無模板核酸合成活性，係藉由將至少一核苷酸添加至一可延長的起始子，以無模板方式合成核酸，其中該至少一核苷酸選自由天然存在的核苷酸、核苷酸類似物及其混合物。
根據本發明之一實施例，該可延長的起始子包括一單股寡核苷酸起始子、平末端 (blunt-end) 雙股寡核苷酸起始子或其混合物。
根據本發明之一實施例，該可延長的起始子係在液相中反應之游離態核酸。
根據本發明之一實施例，該可延長的起始子係固定在固相載體上，其中該固相載體包括粒子、珠粒、載玻片、陣列表面、膜、流通池、孔、微孔、奈米孔、腔室、微流體腔室、通道或微流體通道。
根據本發明之一實施例，前述之至少一種核苷酸與一可偵測標記連接。
根據本發明之一實施例，前述之至少一種核苷酸包括一核糖。
根據本發明之一實施例，代表性RNA聚合酶變體介於在10℃至100℃之間的反應溫度下表現該無模板核酸合成活性。
本發明另一方面提供一種用於執行酶催化核酸新生合成的試劑套組，其包含源自野生型B族DNA聚合酶修飾之RNA聚合酶變體，該野生型B族DNA聚合酶之胺基酸序列包含選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17之一胺基酸序列；其中該RNA聚合酶變體表現出一無模板核酸合成活性，係藉由將至少一種核苷酸添加至可延長的起始子以合成所需的核酸序列，其中該至少一種核苷酸選自由天然存在的核苷酸、核苷酸類似物及其混合物的群組。
本發明另一方面進一步提供一種無模板合成RNA寡核苷酸的方法，其包括：(a)提供起始寡核苷酸；(b)提供RNA聚合酶變體；(c)在足以將至少一種核苷酸添加至該起始寡核苷酸的3'端的條件下，聯合起始寡核苷酸、RNA聚合酶變體及至少一種核苷酸合成前述之RNA寡核苷酸。其中，特定RNA聚合酶變體包含：分別對應於共通序列(SEQ ID NO：1)之位置706至730以及位置843至855的A模體及B模體；以及至少一胺基酸取代，位於A模體、B模體或其組合中的位置；其中RNA聚合酶變體具有減弱或缺失的內生性3'至5'核酸外切酶活性。
據此，本發明係關於一種特定的RNA聚合酶變體，其在不具核酸模板的情況下，可於各種反應溫度下改善核酸合成過程中併入多種核苷酸的效能。具體而言，藉由前述RNA聚合酶變體可廣泛運用多樣的核苷酸及核苷酸類似物之特性，得以有效率地執行RNA新生合成方法。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年9月29日申請之美國臨時專利申請案第US63/249,819號的優先權，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案係與電子格式之序列表一併申請。該序列表名稱為P222338TW-序列表.XML，其基於2022年9月28日提交之外文本P222338US_ sequence_listing.XML所建立，且大小為 34kb。該序列表中的相關資訊係以全文引用之方式併入本文中。 定義
本說明書中所使用的術語廣泛涵蓋於本發明的範圍內，且每個術語的具體背景與其在相關領域的一般含義相同。在本說明書中，說明本發明時所使用的具體術語，將於下文或本說明書的其他處說明，以幫助業界人士理解本發明的相關說明。在相同上下文中，同一術語具有相同的範圍和含義。此外，由於表達同一事物的方式不止一種；因此，本說明書中所討論的術語可以用替代術語和同義詞替換，而且在本說明書中無論是否指定或討論某一術語，皆不表示任何特殊含義。本說明書雖然提供一些術語的同義詞，但是使用一或多個同義詞並不表示排除其他同義詞的使用。
於本說明書中，除上下文另有明確說明外，術語「一」和「該」也可解釋為複數。又，於本說明書中，除上下文另有明確說明外，術語「或」可與術語「及/或」互換使用。
再者，於本說明書中，當物或方法分別「包括」或「包含」成分或步驟時，除非有與之相反的特定描述，否則該物或方法可以進一步包括而非排除其他成分或其他步驟。除此之外，說明書為便於閱讀可能附有標題和副標題，但這些標題並不影響本發明的範圍。
如本說明書中所使用的「胺基酸」係指可併入肽、多肽或蛋白質中的任何單體單元。如本說明書中所使用的術語「胺基酸」包括以下二十種天然或基因編碼的α-胺基酸：丙胺酸 (Ala或A)、精胺酸 (Arg或R)、天門冬醯胺酸 (Asn或N)、天門冬胺酸 (Asp或D)、半胱胺酸 (CyS或C)、麩醯胺酸 (Gln或Q)、麩胺酸 (Glu或E)、甘胺酸 (Gly或G)、組胺酸 (His或H)、異白胺酸 (Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸 (Lys或K)、甲硫胺酸 (Met或M)、苯丙胺酸 (Phe或F)、脯胺酸 (Pro或P)、絲胺酸 (Ser或S)、蘇胺酸 (Thr或T)、色胺酸 (Trp或W)、酪胺酸 (Tyr或Y)和纈胺酸 (Val或V)。當未清楚定義「X」殘基情況下，這些胺基酸應定義為「任一種胺基酸」。
術語「功能等效」或「等效」用於描述特異性B族DNA聚合酶 (PolB) 變體及本文所提供任何衍生RNA聚合酶變體。根據序列比對或參考序列研判，此衍生RNA聚合酶變體帶有之特定胺基酸位置的取代或突變，視同發生在其他PolB或PolB變體中對等胺基酸位置的取代或突變，且這些等效位置在酶中具有相同的功能或結構作用。等效位置可以根據同源物、保守模體 (conserved motif)、使用者定義或衍生取得的共通序列加以定義。
一般而言，同源PolB具有相似或相同的胺基酸序列及功能結構，因此不同PolB之間的等效胺基酸取代突變通常發生在同源胺基酸位置處。基於蛋白質序列或結構比對而言，無論發生突變的胺基酸的實際功能為何，本文所用的術語「功能等效」或「等效」亦涵蓋與特定突變「同源」或「位置上等效」的突變。實務上而言，可以根據蛋白質序列或結構比對識別不同聚合酶的「功能等效」、「同源」及/或「位置上等效的」胺基酸殘基。據此，圖1呈現針對多種野生型PolB進行跨物種比對的結果，並將共通序列 (SEQ ID NO： 1) 用作位置參考序列。
舉例而言，在野生型鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1) 之胺基酸序列的位置141用丙胺酸 (A) 取代天門冬胺酸(D)(簡述為D141A)，將視為功能上等效於在野生型大腸桿菌噬菌體 RB69 DNA聚合酶 (RB69) 之胺基酸序列的保守殘基位置114用A取代D (簡述為D114A)。當使用位置參考序列來描述該等等效胺基酸取代時，Kod1之位置141的胺基酸殘基及RB69之位置114的胺基酸殘基為功能等效位置，且兩者的功能等效位置皆對應於共通序列 (SEQ ID NO： 1) 之位置354。
術語「保守」則係指在不同來源之不同PolB的同源或等效位置上，其聚合酶片段具有相同的胺基酸殘基。術語「半保守」係指在不同來源之不同PolB的同源或等效位置上，其聚合酶片段具有特性相似的胺基酸殘基或相同的胺基酸殘基。
術語「核酸」、「核酸序列」、「寡核苷酸」、「多核苷酸」及「核酸片段」係指單股或雙股形式的核糖核酸 (RNA) 或去氧核糖核酸 (DNA) 序列，該序列的來源及長度在本文中不做限制；且通常包括天然存在的核苷酸或人工化學模擬物。如本文所用的術語「核酸」可與包括天然或非天然「寡核苷酸」、「多核苷酸」、「DNA」、「RNA」、「基因」、「互補DNA」(cDNA)及「信使RNA」(mRNA)在內的術語互換。
本文所用的「核酸」、「寡核苷酸」或「多核苷酸」係指可對應於核糖核酸 (RNA) 或去氧核糖核酸 (DNA) 聚合物的聚合物或其類似物。此包括核苷酸 (諸如RNA及DNA) 的聚合物，以及其合成形式、修飾 (如化學或生物化學修飾體) 形式，以及混合聚合物 (如包括RNA和DNA次單元)。例示修飾包括甲基化、以類似物取代一或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，例如產生不帶電荷鍵聯 (如甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺甲酸酯等)、懸垂部分 (如多肽)、嵌入劑 (如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷基化劑和已修飾鍵聯 (如α變旋異構核酸等)。除此之外亦包括有能力模擬多核苷酸經由氫鍵和其他化學交互作用鍵結指定序列的合成分子。雖然核酸的合成形式可包含其他鍵聯 (如Nielsen等人所述的肽核酸(Science 254:1497-1500,1991))，不過通常情況下的核苷酸單體均經由磷酸二酯鍵鍵聯。核酸可以是或包括如染色體或染色體片段、載體 (如表現載體)、表現匣、裸露的DNA或RNA聚合物、聚合酶鏈鎖反應 (PCR)的產物、寡核苷酸、探針和引子。核酸可以是單股、雙股或三股，不限於任何特定長度。除另有說明外，特定的核酸序列除了明確指定的序列外，還可任意包含或編碼互補序列。
如上所述，本說明書所用的「核酸」亦包括「核酸類似物」，其描述在功能或結構上等效於與天然存在的RNA及DNA的化合物或人工核酸。核酸類似物可以具有經修飾核苷酸的一或多個組成部分 (磷酸骨架、戊糖及核鹼基)。核苷酸上的該等修飾改變了核酸的結構及幾何形狀以及其與核酸聚合酶的交互作用。核酸類似物亦涵蓋新興的人工核酸，如XNA，其經設計具有新穎的糖骨架。
核酸類似物的實例包括但不限於：通用鹼基，諸如肌苷、3-硝基吡咯及5-硝基吲哚，其可以與所有四種典型鹼基 (canonical base) 形成鹼基對；磷酸-糖骨架類似物，諸如肽-核酸 (PNA)，其影響核酸的骨架特性；化學連接子或螢光團 (fluorophore) 附接的類似物，諸如胺反應性胺基烯丙基 (amine-reactive aminoallyl) 核苷酸、含硫醇的核苷酸、生物素連接的核苷酸、羅丹明 (rhodamine) 連接的核苷酸及花青色素 (cyanine) 連接的核苷酸；螢光鹼基類似物，諸如2-胺基嘌呤 (2-aminopurine，2-AP)、3-甲基異黃蝶呤 (3-methylisoxanthopterin，3-MI)、6-甲基異黃蝶呤 (6-MI)、4-胺基-6-甲基異黃蝶呤 (4-amino-6-methylisoxanthopterin，6-MAP) 及4-二甲胺基吡啶 (4-dimethylaminopyridine，DMAP)；用於各種遺傳應用的核酸探針，諸如與螢光報導染料綴合的寡核苷酸 (ALEXA、FAM、TET、TAMRA、CY3、CY5、VIC、JOE、HEX、NED、PET、ROX、Texas Red等) 及/或螢光淬滅劑 (BHQ)；分子信標 (MB)，其係單股核酸探針，含有莖環結構以及雙螢光團及淬滅劑 (fluorophore-and-quencher) 標記；及核酸適體。
通常，本說明書中所使用的術語「模板」是指包含所需或未知的目標核苷酸序列的多核苷酸或多核苷酸模擬物。在一些情況下，術語「目標序列」、「模板多核苷酸」、「目標核酸」、「目標多核苷酸」、「核酸模板」、「序列模板」及其變體用語可互換使用。具體而言，術語「模板」是指一股核酸 (或核酸鏈)，係用以供模板依賴性或模板導引性的核酸聚合酶進行複製，從核苷酸或核苷酸類似物合成一互補的複製品。在習知定義中，位在核酸雙股螺旋中的模板股係描繪形容成「底」股。同樣地，非模板股係經常描繪形容成「頂」股。「模板」股也可稱為「有義」或「正」股，非模板股則稱為「反義」或「負」股。
本說明書中所使用的術語「起始子(initiator)」係指單核苷、單核苷酸及寡核苷酸、多核苷酸或其經修飾的類似物，核酸聚合酶以其為起始物開始進行核酸新生 ( de novo) 合成。術語「起始子」亦可指異種核酸 (XNA) 或具有3'-羥基基團的肽核酸 (PNA)。
本說明書中所使用的術語「核苷酸併入」、「類似物併入」、「併入核苷酸」和「併入類似物」係熟悉該項技術領域人士已知，且係用於說明核酸合成的流程或反應。因此，本說明書中所使用的術語「併入」可知係靈活地指在核酸起始子或引子的3'-羥基末端添加一或多個核苷酸或任何特定的核酸前驅物。
進一步地，本說明書中所使用的術語「核苷酸類似物」為熟悉該項技術領域人士所知，用來說明屬於典型核苷酸結構模擬物的化學修飾核苷酸或人工核苷酸。這些核苷酸類似物可以作為核酸聚合酶合成核酸的受質。核苷酸類似物可具有核苷酸的一或多個改變的組成部分(如磷酸骨架、戊糖和核鹼基)，這些改變的組成部份不僅會改變核苷酸的結構和配置，並影響它們與其他核鹼基和核酸聚合酶的交互作用。舉例來說，核苷酸類似物如具有一改變的核鹼基時，可以賦予DNA或RNA其他鹼基配對和鹼基堆疊的特性以供選擇。再舉例來說，在鹼基處進行修飾的話，可產生各種核苷，例如肌苷、甲基-5-去氧胞苷、去氧尿苷、二甲胺基-5-去氧尿苷、二胺基-2,6-嘌呤或溴-5-去氧尿苷及其他任何允許雜交的類似物等。在其他例示實施態樣中，這些修飾可發生於核醣的部位 (例如以類似物替代去氧核醣) 和/或磷酸官能基層級 (例如硼酸鹽、烷基膦酸鹽 (alkylphosphonate) 或硫代磷酸鹽衍生物)。核苷酸類似物單體的磷酸官能基係可選自於單磷酸、二磷酸、三磷酸、四磷酸、五磷酸和六磷酸。
其他核苷酸類似物案例還包括具有可移除保護基部分 (blocking mooiety) 的核苷酸。可移除保護基部分的案例包括但不限於3'-O-保護基部分、鹼基保護基部分及其組合。3'-O-保護基部分的案例包括但不限於O-疊氮基 (O-N 3)、O-疊氮甲基、O-胺基、O-烯丙基、O-苯氧基乙醯基、O-甲氧基乙醯基、O-乙醯基、O-(p-甲苯)磺酸鹽、O-磷酸鹽、O-硝酸鹽、O-[4-甲氧基]-四氫噻喃基、O-四氫噻喃基、O-[5-甲基]-四氫呋喃基、O-[2-甲基，4-甲氧基]-四氫吡喃基、O-[5-甲基]-四氫吡喃基、O-四氫噻吩基、O-2-硝基芐基、O-甲基和O-醯基。鹼基保護基部分的案例可以是可逆染料終止子。可逆染料終止子的案例包括但不限於：Illumina MiSeq的可逆染料終止子、Illumina HiSeq的可逆染料終止子、Illumina Genome Analyzer IIX的可逆染料終止子、Helicos Biosciences Heliscope的可逆染料終止子以及LaserGen Lightning Terminator的可逆染料終止子。
本說明書中所使用的「B族DNA聚合酶 (PolB)」是指所有生命域和眾多DNA病毒中最常見的模板依賴性核酸聚合酶或複製酶。天然PolB與大多數核酸聚合酶一樣，催化核苷酸轉移酶反應將核苷酸添加到引子末端的3'-羥基 (3'-OH) 時，必須有雙股引子模板DNA且引子末端處帶有游離3'-羥基官能基、所有四種核苷三磷酸 (dATP、dTTP、dCTP和dGTP) 以及催化用二價陽離子 (Mg 2+或Mn 2+等)。PolB酶，如細菌Pol II和古菌B族DNA聚合酶，是複製型和修復型聚合酶，它們本質上包含著聚合酶催化域 (catalytic polymerase domain) 及3'→5'核酸外切域 (exonucleolytic domain，或稱為校對域)，用於在核酸複製過程中，從不斷增長的引子股中移除錯誤併入的核苷酸。術語「3'→5'核酸外切域」(簡稱 Exo 域) 係指一種聚合酶的胺基酸序列區域，該區域的功能在於發揮核酸降解活性，從引子或多核苷酸鏈的3'末端開始降解核酸。同等的術語「聚合酶催化域」亦指一種聚合酶的胺基酸序列區域，該區域的功能在於發揮DNA/RNA聚合酶催化活性，將核苷酸添加到引子或多核苷酸鏈的3'末端。
目前已知的PolB聚合酶催化域皆類似於人類右手的形狀，其中關鍵功能區域分別界定為手指、手掌和拇指子域。其中最保守的手掌子域包含催化用的必需殘基。在源自不同界 (kingdom) 之生命體和DNA病毒的各種B族DNA聚合酶之間進行蛋白質序列比對，結果顯示PolB聚合酶一般帶有六個半保守或保守的模體 (I-VI)，用於發揮基本的核酸外切酶和聚合酶功能。前三個序列模體 (Exo I、Exo II、Exo III)位於3'→5'核酸外切域，而另三個模體 (分別稱為A、B及C模體) 則位於聚合酶域 (1999年Hopfner等人發表於Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3600–3605)。在本發明的一些實施例中，不受任何理論所限制，該等B族DNA聚合酶模體中有一些新穎的位置/區域修飾，而聚合酶可以藉此作為無模板 (即非模板依賴性) RNA聚合酶，有效地催化RNA新生合成。基於後天獲得之RNA新生合成活性，該等經修飾的B族DNA聚合酶稱為無模板RNA聚合酶變體。換言之，這些RNA聚合酶變體能夠在受阻的反應條件下於起始寡核苷酸的3'末端處併入核糖核苷酸，諸如rATP、rUTP、rCTP及rGTP。
本發明當中上下文中所使用的術語「突變體」(mutant) 係指一種通常為重組的多肽，其中包含一或多個相對於對應功能性DNA聚合酶的胺基酸取代。
本發明當中上下文中所使用的「對應於另一序列」(如區域、片段、核苷酸或胺基酸位置等) 之描述係基於核苷酸或胺基酸位置編號的編號慣例，然後按照序列一致性 (identity) 百分比最大化之原則進行序列比對所獲得之對應結果。胺基酸「對應於特定序列的位置X」之類的描述，是指針對所關注的多肽與特定序列比對後，得知該多肽中某一胺基酸對應於特定序列中位置X的等效胺基酸。通常如本說明書所述，可使用比對演算法 (如BLAST等) 及其他執行胺基酸序列比對的工具方法確定某一胺基酸對應於聚合酶的位置。因為既定「對應區域」內的所有位置不盡然必須與關注的序列位置完全相配，故對應區域內與關注的序列不相配的位置也可視為或定義為「對應位置」。故，如本說明書中所提及「與特定DNA聚合酶的胺基酸位置X對應的胺基酸位置」，其係指根據比對而知某一胺基酸位置本身與其他DNA聚合酶、結構同源物和同族物中胺基酸位置X相互對應之等效位置。
如本說明書中所使用的術語「SEQ ID NO：1共通序列」係指包含跨物種B族DNA聚合酶之保守或半保守胺基酸的參考序列。SEQ ID NO：1共通序列係一虛擬序列，其係經由比對以下16種野生型B族DNA聚合酶而產生，以獲得其中的保守胺基酸：柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)、鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)、嗜熱球菌屬 ( Thermococcus sp.)(菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)、激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu)、海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)、海沼甲烷球菌 ( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶(Mma)、嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元 (hPOLD)、釀酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元 (ScePOLD)、冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)、硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)、綠膿桿菌DNA聚合酶II (Pae)、大腸桿菌DNA聚合酶II (Eco)、大腸桿菌噬菌體 ( Escherichia coliphage) RB69 DNA聚合酶 (RB69)、大腸桿菌噬菌體 T4 DNA聚合酶 (T4) 和芽孢桿菌噬菌體 ( Bacillusphage) Phi29 DNA聚合酶 (Phi29)。將該等PolB之序列進行比對，以獲得比對序列作為功能等效位置的參考。
本發明所指 Exo I模體、Exo II模體、Exo III模體、A模體、B模體及C模體的位置係由發明人使用本發明SEQ ID NO：1共通序列所定義；因此，應注意本發明中所定義的模體位置並不完全等同於文獻或先前技術中所述之位置。 目的
本發明人經過實驗後發現一種PolB變體，其在運用典型的核苷酸、核苷酸類似物及起始子進行無模板的多核苷酸合成上，具有更佳的功能及活性。該等PolB變體可以在不存在模板的情況下有效地將典型核苷酸或核苷酸類似物添加至起始子，以合成具有隨機或限定序列的多核苷酸。
更具體而言，本發明人發現PolB變體可以在不存在模板的情況下，有效地催化使天然核糖核苷酸 (rNTP)，如rATP、rUTP、rCTP及rGTP添加至單股核酸起始子或平末端 (blunt end) 雙股核酸起始子的3'-OH末端，以生成具有所需核酸序列的多核苷酸。此外，本發明之PolB變體通常具有更廣泛的受質特異性，此意謂PolB變體不僅可以利用天然存在的核苷酸，更能利用多種經修飾的核苷酸及核酸類似物來進行核酸新生合成。據此，經修飾的核苷酸可以進一步設計用於併入起始子以生成特定的功能性多核苷酸。是以，對於用在合成具有所需序列及特徵的多核苷酸之無模板酶催化核酸合成反應，本發明之PolB變體提供了更廣的應用範圍及更高的實用性。 B 族 DNA 聚合酶的蛋白質序列比對
圖1呈現了本發明人所採用的16種不同野生型B族DNA聚合酶 (PolB) 之胺基酸序列比對結果，且經比對取得共通序列 (SEQ ID NO：1) 的結果列於底部。用於比對的16種野生型PolB分別為柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo，SEQ ID NO：2)、鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶(Kod1，SEQ ID NO：3)、嗜熱球菌屬 ( Thermococcus sp.)(菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N，SEQ ID NO：4)、激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu，SEQ ID NO：5)、海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent，SEQ ID NO：6)、嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac，SEQ ID NO：7)、冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶(Pis，SEQ ID NO：8)、硫磺礦硫化葉菌( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso，SEQ ID NO：9)、海沼甲烷球菌( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶 (Mma，SEQ ID NO：10)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元 (hPOLD，SEQ ID NO：11)、釀酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元 (ScePOLD，SEQ ID NO：12)、綠膿桿菌DNA聚合酶II (Pae，SEQ ID NO：13)、大腸桿菌DNA聚合酶II (Eco，SEQ ID NO：14)、大腸桿菌噬菌體 ( Escherichiaphage) RB69 DNA聚合酶 (RB69，SEQ ID NO：15)、大腸桿菌噬菌體T4 DNA聚合酶 (T4，SEQ ID NO：16) 及芽孢桿菌噬菌體 Phi29 DNA聚合酶 (Phi29，SEQ ID NO：17)。
如圖1所示，該些例示野生型PolB中具有呈現高度保守的各種序列區域，亦有其他可變的區塊。本領域技藝人士當能理解，除了本文特別指出及描述的突變之外，在不改變或不實質上改變聚合酶活性的情形下，亦可以在該些可變區域中進行其他突變。類似地，可以在不改變或不實質上改變經突變的酶的聚合酶活性的情況下，在任何PolB的保守殘基/位置處進行保守突變。基於其他功能上相關的酶或同系物 (homolog) 的結構比較分析的酵素工程乃分子生物學領域中的實用技術，令本發明人得以合理地預測特定突變對酶催化活性的影響。基於本文所使用的胺基酸序列、結構資料集和物理特性，本領域技藝人士可以在不改變或不實質上改變酶的關鍵、固有特徵的情況下使酶 (諸如本發明所涵蓋的DNA聚合酶) 突變。
除此之外，本發明聚焦於模體Exo I、Exo II、Exo III、A、B及C，其分別對應於共通序列SEQ ID NO：1之位置349至364、位置450至476、位置590至608、位置706至730、位置843至855及位置940至956。更具體地，本發明中的聚合酶變體係基於對應該等模體中的一或多個殘基處的取代突變所建立。 RNA 聚合酶變體
基於上述內容，本發明所提供之聚合酶變體係以共通序列的胺基酸序列 (SEQ ID NO：1) 為基礎描述該聚合酶變體。比較SEQ ID NO：1共通序列可知，該聚合酶變體在一或多個殘基處出現取代突變現象，且取代突變可發生在與該序列相同的位置或功能等效的位置。本案所屬技術領域具有通常知識者當能理解本說明書所述之聚合酶變體並非天然存在。因此，本文所述的聚合酶變體係以SEQ ID NO：1共通序列為基礎，進而依據個別的野生型聚合酶再包括一或多個殘基處的取代突變。在一實施例中，取代突變是發生在與SEQ ID NO：1共通序列的胺基酸功能等效的位置。「功能等效」係指該聚合酶變體在SEQ ID NO：1共通序列中的胺基酸位置發生胺基酸取代，而前述胺基酸取代在共通序列和聚合酶變體兩者上均具有相同功能或結構作用。
通常而言，兩個或更多不同聚合酶中的功能等效取代突變係發生在該些聚合酶胺基酸序列中的同源胺基酸位置。因此，不論突變胺基酸的特定功能是否已知，只要該突變屬於「位置等效」或「同源」時，即可歸類為「功能等效」。在序列比對和/或分子建模的基礎上，可識別兩個或更多不同聚合酶的胺基酸序列中功能等效和位置等效的胺基酸殘基位置。例如，可將來自不同生命領域的例示性16種野生型B族DNA聚合酶的胺基酸序列比對用於鑒定位置上等效及/或功能上等效的殘基，該等PolB之間的蛋白質序列比對結果示於圖1。因此，Tgo、Kod1、9°N、Pfu和Vent 聚合酶的例示殘基141、Pis聚合酶的殘基171、Sso聚合酶的殘基231和Mac DNA聚合酶的殘基198即屬於功能上和位置上等效。同理，Tgo、Kod1、9°N、Pfu和Vent DNA聚合酶的例示殘基143 、Pis聚合酶的殘基173、Sso聚合酶的殘基233和Mac聚合酶的殘基200即屬於功能上和位置上等效。本案所屬技術領域具有通常知識者亦能容易地識別其他聚合酶中功能等效的殘基。
根據本發明的一些實施例，本發明之RNA聚合酶變體包含：分別對應於一共通序列 (SEQ ID NO：1) 之位置706至730以及位置843至855的A模體及B模體；以及至少一胺基酸取代 (一個或多個胺基酸取代、或胺基酸取代的組合)，位於A模體、B模體或其組合中的一位置；其中RNA聚合酶變體具有減弱或缺失的3'至5'核酸外切酶活性。所述3'至5'核酸外切酶活性缺失可藉由任意適當的方式達成；例如，可藉由修飾聚合酶的3'至5'核酸外切域以生成具有減弱、缺失或失活之3'至5'核酸外切酶活性的聚合酶。較佳地，修飾3'至5'核酸外切域的方法可以採用胺基酸取代的方式。換言之，本發明所提供的RNA聚合酶變體亦可包含在Exo I、Exo II、Exo III或其組合中的至少一個胺基酸取代。例如，PolB變體可在SEQ ID NO：1的Exo I模體中功能等效或位置等效的位置354以A取代原生D (D354A) 及位置356以A取代E(E356A)，進而導致3'-5'核酸外切酶缺失。
根據本發明的一些實施例，RNA聚合酶變體係由野生型B族DNA聚合酶修飾而成，且該野生型B族DNA聚合酶之胺基酸序列係選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所組成的群組，分別源自下列野生型B族DNA聚合酶：柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 ( Thermococcus sp.)(Tgo)、鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)、嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)、激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu)、海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)、嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)、冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis) 、硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)、海沼甲烷球菌 ( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶 (Mma)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元 (hPOLD)、釀酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元 (ScePOLD)、綠膿桿菌DNA聚合酶II (Pae)、大腸桿菌DNA聚合酶II (Eco)、大腸桿菌噬菌體 RB69 DNA聚合酶 (RB69)、大腸桿菌噬菌體 T4 DNA聚合酶 (T4) 或芽孢桿菌噬菌體 Phi29 DNA聚合酶 (Phi29)。
根據本發明之一些實施例， RNA聚合酶變體包含對應於該共通序列 (SEQ ID NO：1) 之位置349至位置364的一Exo I模體，且該RNA聚合酶變體在該Exo I模體中的一位置具有至少一胺基酸取代。較佳地，對應於SEQ ID NO：1位置715之胺基酸L或M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代；對應於SEQ ID NO：1位置716之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及對應於SEQ ID NO：1位置717之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：2之柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶(Tgo)，且其中：在SEQ ID NO：2位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：2位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：2位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：2之柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)，且其中：在SEQ ID NO：2位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：2位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：2位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：2位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之鹿兒島嗜熱球菌( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)，且其中：在SEQ ID NO：3位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：3位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：3位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)，且其中：在SEQ ID NO：3位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：3位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：3位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：3位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)，且其中：在SEQ ID NO：4位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：4位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：4位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例， RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)，且其中：在SEQ ID NO：4位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：4位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：4位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：4位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之激烈火球菌( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu)，且其中：在SEQ ID NO：5位置409之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO： 5位置410之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：5位置411之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)，且其中：在SEQ ID NO：5位置409之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：5位置410之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：5位置411之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：5位置486之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)，且其中：在SEQ ID NO：6位置411之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：6位置412之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：6位置413之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)，且其中：在SEQ ID NO：6位置411之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：6位置412之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：6位置413之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：6位置488之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：7之嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)，且其中：在SEQ ID NO：7位置485之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：7位置486之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：7位置487之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：7之嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)，且其中：在SEQ ID NO：7位置485之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：7位置486之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：7位置487之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：7位置565之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)，且其中：在SEQ ID NO：8位置426之胺基酸M係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：8位置427之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：8位置428之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶(Pis)，且其中：在SEQ ID NO：8位置426之胺基酸M係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：8位置427之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：8位置428之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：8位置508之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：9之硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)，且其中：在SEQ ID NO：9位置518之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：9位置519之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；以及在SEQ ID NO：9位置520之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：9之硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)，且其中：在SEQ ID NO：9位置518之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代，較佳地係由Y所取代；在SEQ ID NO：9位置519之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代，較佳地係由A所取代；在SEQ ID NO：9位置520之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代，較佳地係由G所取代；以及在SEQ ID NO：9位置601之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代，較佳地係由E或L所取代。
根據一些實施例，RNA聚合酶變體表現出無模板核酸合成活性，可藉由將至少一種核苷酸添加至可延長的起始子，並且以無模板方式合成核酸，其中使用的至少一種核苷酸選自由天然存在的核苷酸、核苷酸類似物及其混合物的群組。
根據一些實施例，前述可延長的起始子包括一段單股寡核苷酸起始子、一段平末端(blunt-ended)雙股寡核苷酸起始子或其混合物。根據一些實施例，可延長的起始子係在液相中反應之游離態核酸。
根據一些實施例，前述可延長的起始子係固定在固相載體上，其中該固相載體包括粒子、珠粒、載玻片、陣列表面、膜、流通池、孔、微孔、奈米孔、腔室、微流體腔室、通道或微流體通道。
根據一些實施例，前述至少一種核苷酸包括核糖。除此之外，前述核苷酸與可偵測標記連接；而可偵測標記為諸如螢光團 (fluorophore)、酶、放射性磷酸鹽、洋地黃毒苷 (digoxygenin) 或生物素。
根據本發明之一些實施例，RNA聚合酶變體在10℃至100℃之間的反應溫度下表現上述無模板核酸合成活性。例如，反應溫度介於10℃與20℃之間、介於20℃與30℃之間、介於30℃與40℃之間、介於40℃與50℃之間、介於50℃與60℃之間、介於60℃與70℃之間、介於70℃與80℃之間、介於80℃與90℃之間、介於90℃與95℃之間、介於95℃與100℃之間，或者係由上限15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、或100℃及下限10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃限定的範圍內的任何反應溫度。 生成聚合酶變體
在本文說明之內容中，可任意使用各種類型的誘發突變之技術，例如利用修改聚合酶來產生本發明的變體，或使用隨機或半隨機突變法。一般可取得的誘發突變 (mutagenesis；以下簡稱誘變) 程序均可用於製備聚合酶變體，其包括可任意就一種或多種關注活性來選擇修改過的核酸和多肽。可使用的程序包括但不限於：位點導引位點誘變、隨機位點誘變、體外或體內同源重組 (活體外DNA分子演化技術 (DNA shuffling) 和組合重疊PCR (combinatrorial overlap PCR))、使用含有尿嘧啶的模板進行誘變、寡核苷酸導引誘變、硫代磷酸酯 (phosphorothioate) 修飾的DNA誘變、使用有缺口的雙股DNA誘變、位點錯配修復 (point mismatch repair)、使用修復功能缺陷的宿主菌株誘變、限制性選擇 (restriction-selection) 和限制性純化 (restriction-purification)、缺失誘變、利用全基因合成誘變、簡併式 (degenerate) PCR、雙股斷裂修復，以及本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的眾多其他方法。 執行無模板核酸合成的試劑套組
本發明一方面亦提供了一種試劑套組，其用於執行無模板酶催化核酸新生合成反應，其內容包括：本發明上述之RNA聚合酶變體，此RNA聚合酶變體表現出無模板核酸合成活性，係藉由將至少一種核苷酸添加至可延長的起始子，進而產生所需的核酸序列；其中核苷酸選自由天然存在的核苷酸、核苷酸類似物及其混合物的群組。
可選地，上述試劑套組亦包括其他試劑，諸如RNA聚合酶變體及核苷酸溶液所需的緩衝液及溶液；經裝配或包裝成分的使用說明通常但不必然地亦包括在內。 RNA 聚合酶變體之 使用方法及用途
根據一些實施例，本發明之RNA聚合酶變體可使用無模板合成方式將天然核糖核苷酸 (rNTP)(諸如rATP、rUTP、rCTP及rGTP) 添加至單股或平末端雙股核酸起始子的3'-羥基 (3'-OH) 末端，以產生具有所需序列的多核苷酸。
在一些實施例中，本發明之RNA聚合酶變體可用於將天然核糖核苷酸 (rNTP)(諸如rATP、rUTP、rCTP及rGTP) 添加至成簇的單股或平末端雙股核酸起始子的陣列之3'-OH端；如前所述，該等陣列受固定或物理性限制於固相載體上，亦可從固相載體分離；且較佳地，該固相載體由玻璃製成並以矽晶圓的形式實施。因此，可以執行多重、並行的核酸新生合成以合成大量具有不同序列的各種多核苷酸或核酸。
在一些實施例中，本文所述的RNA聚合酶變體可使用無模板合成方式，將核苷酸綴合物 (nucleotide conjugates，先前所定義的核苷酸類似物其中一類)併入至核酸起始子的3'端，其核苷酸綴合物係與酶、抗體、化學基團 (如生物素、脫硫生物素) 或位在核苷酸的鹼基、磷酸基團或戊糖上的螢光團共價連接。
在核酸合成期間藉由RNA聚合酶變體將前述核苷酸類似物併入核酸中，並據此同時以鹼基特異性、位點特異性或序列特異性的形式連帶將所需成分 (諸如連接的酶、抗體或化學基團) 添加至新合成的核酸。本領域中用於標記或生成核酸探針及綴合物的常用成分包括但不限於經放射性標記的核苷酸及核苷酸類似物、經修飾的連接子 (諸如生物素、硫醇、疊氮基或胺基基團)、螢光團、酶及抗體。
或者，在其他實施例中，為了標記或生成核酸探針，可以藉由在所合成的核苷酸的鹼基、磷酸基團或戊糖上，藉由共價或非共價連接經修飾的連接子與酶、抗體、化學基團或螢光團耦合 (coupling) 來達成核酸的合成後修飾。因此，所需成分可以與特定鹼基共價或非共價結合，或者連接至新合成之核酸的5'端或3'端。
在一些實施例中，藉由RNA聚合酶變體併入經連接子修飾的核苷酸類似物可促進新合成的多核苷酸或核酸附著、固定或物理性限制在各種固體表面上。在其他實施例中，具有獨特標籤、標記或螢光團的新合成之序列特異性核酸可用於各種基於核酸的分子偵測，其包括但不限於螢光原位雜交 (FISH)、TaqMan即時PCR (RT-PCR)、即時螢光連接酶鏈式反應 (RT-LCR)、即時螢光重組酶-聚合酶擴增 (RPA) 測定及即時螢光恆溫環狀擴增測定。
本案進一步提供了一種用於RNA寡核苷酸的無模板合成方法，其包括：(a) 提供起始寡核苷酸；(b) 提供RNA聚合酶變體；以及(c) 在足以將至少一種核苷酸添加/併入至起始寡核苷酸的3'端的條件下，聯合起始寡核苷酸、RNA聚合酶變體及核苷酸進行反應，以合成該RNA寡核苷酸。
一旦前述核苷酸併入至起始寡核苷酸，就可以接著添加一或多種額外的核苷酸以合成所需的RNA寡核苷酸。據此，在某些實施例中，該方法進一步包括將一或多種天然或經修飾的核苷酸添加至反應獲得的RNA寡核苷酸 (亦即在步驟 (c) 中形成的RNA寡核苷酸) 之3'端，直至獲得所需的RNA序列。在某些實施例中，此方法進一步包括：(d) 重複步驟 (a) 至 (c)，直至獲得所需的RNA序列。
在一些實施例中，在一或多種額外的酶的存在下進行步驟 (c)。在某些實施例中，在兩種或更多種不同酶的混合物的存在下進行步驟 (c)。前述酶的混合物可包含多於一種不同的RNA聚合酶變體 (例如，2種或3種RNA聚合酶變體)。
在一些實施例中，步驟 (c) 除了使用RNA聚合酶變體之外，亦使用一或多種額外的酶 (亦即輔助酶)(諸如特異性磷酸酶)。在一些實施例中，步驟 (c) 除了使用RNA聚合酶變體之外，亦使用酵母無機焦磷酸酶 (PPi酶)。
在一些實施例中，步驟 (c) 中的反應係在一或多種額外添加劑的存在下進行。在一些實施例中，步驟 (c) 使用擁擠劑 (crowding agent)。在某些實施例中，擁擠劑係聚乙二醇 (PEG) 或Ficoll。在某些特定實施例中，擁擠劑係聚乙二醇 (PEG)。在一些實施例中，步驟 (c) 使用RNA酶抑制劑。在某些實施例中，步驟 (c) 在不可水解的核苷酸的存在下進行。 實施例
在本節中，將透過以下實施例來詳細說明本發明的內容。這些案例僅作為說明之用，而本案所屬技術領域具有通常知識者得以容易知悉各種修改例和變化例。因此，下面將詳細說明本發明的各種實施例，然而本發明並不限於本說明書中列出的各種實施例。 實施例 1 ：製備 RNA 聚合酶變體
根據本說明書所揭露之可選的PolB保守和半保守區域中保守/共通胺基酸的特性，採用基因合成法和誘變技術創造例示的RNA聚合酶變體。例如，採用本領域所熟知的位點導引誘變法，分別改變例示性野生型PolB的保守Exo I模體、Exo II模體、Exo III模體、A模體、B模體及模體C區域中的胺基酸殘基。
在一些實施例中，獲得所述RNA聚合酶變體的程序通常分為三個步驟，包括步驟1：野生型PolB及其3'至5'核酸外切酶缺陷型(Exo -)突變體的基因合成；步驟2：在期望區域內構建RNA聚合酶變體；以及步驟3：野生型PolB、Exo -突變體及RNA聚合酶變體的表現及純化。更詳細描述如下文，在其程序中使用的技術為本領域技藝人士所熟知。
在步驟1中，用以表現野生型無內含子的PolB之密碼子改良的基因片段係由臺灣新北市的基龍米克斯生物科技股份有限公司所合成；3'至5'核酸外切酶缺陷型 (稱為Exo -) PolB亦由同一供應商提供。本文所使用的位在任何一種PolB縮寫名稱後方的上標「Exo -」係指指定的野生型PolB已藉由修飾消除內生性的3'至5'核酸外切酶活性，此標示表明該PolB係3'至5'核酸外切酶缺陷型PolB。根據一些較佳實施例，Exo -意謂分別在對應於SEQ ID NO：1的D354 位置 (由丙胺酸殘基取代 (D354A))及SEQ ID NO：1的E356 位置 (由丙胺酸殘基取代 (E356A)) 帶有組合突變的PolB變體。
在步驟2中，透過側接的NdeI及NotI限制酶位點將合成的野生型PolB基因及Exo -PolB基因經由次選殖分別置入pET28b載體中，並以藉由DNA定序確認重組質體的序列。執行位點導引誘變，針對PolB Exo -蛋白質架構上的所需模體區域產生RNA聚合酶變體。簡而言之，使用來自麻塞諸塞州伊普斯威奇 (Ipswich, MA) 的新英格蘭生物實驗室公司 (New England Biolabs) 的Q5位點導引誘變試劑套組，搭配重組質體執行位點導引誘變PCR，以導入胺基酸取代。首先藉由1%瓊脂糖凝膠分析產物以確認擴增子大小，隨後在37℃下用DpnI處理剩餘的PCR反應混合物達一小時。將混合物於70℃進一步培養10 分鐘，以使DpnI功能失活。然後藉由凱杰公司 (Qiagen)的QIAquick PCR純化試劑套組(麻塞諸塞州沃特曼(Whatman, MA))純化經DpnI處理的PCR反應混合物。用T4 PNK酶與T4 DNA連接酶的混合物處理經純化的DNA片段。將重新環化的經PCR擴增的DNA轉形回大腸桿菌細胞中。接續，使用凱杰公司的質體微型套組 (Qiagen Plasmid Mini Kit) 從大腸桿菌細胞中抽取質體DNA。藉由DNA定序確認聚合酶變體中所需模體區域或特定區域的突變序列。
在步驟3中，將帶有特定聚合酶變體基因的質體DNA的大腸桿菌Acella細胞，在37°C下以內含0.5%葡萄糖和50 μg/ml羧芐青黴素 (carbenicillin) 的2公升LB培養基進行培養。當細胞密度在OD 600nm波長檢測出吸光值達到約0.6-0.8時，添加1 mM的異丙基-β-D-1-硫代半乳糖哌喃糖苷 (IPTG) 以誘導蛋白表現。在37℃下讓細胞再生長4小時，隨後於4℃以7,000×g離心10 分鐘收集細胞。使用含有1 mM鹽酸苯甲脒 (benzamidine hydrochloride) 的緩衝液A [50 mM 三羥甲基胺基甲烷 (Tris-HCl)(pH7.5)、300 mM 氯化鈉 (NaCl)、0.5 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)、1 mM 二硫蘇糖醇 (DTT)、5% (體積百分比，v/v) 甘油] 重新懸浮細胞沉澱物。將細胞與50 mg溶菌酶一起在冰上培養1小時，接著再進行超音波處理，即可完成細胞裂解。於4℃以18,000 ×g離心25分鐘來澄清細胞裂解物；再將澄清的細胞粗萃取物於70℃下培養30分鐘，之後冷卻至4℃。在4℃下以18,000 xg離心25分鐘來進一步澄清經熱處理的細胞萃取物。在離心後，取上清液用不含NaCl的緩衝液A稀釋，並上樣到ÄKTA液相層析系統 [美國麻塞諸塞州馬爾伯勒思拓凡公司 (Cytiva Life Sciences)]，以緩衝液A預平衡的HiTrap (思拓凡公司) 管柱進行分析。使用緩衝液B [50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 M NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、5% (v/v)甘油]，以100 mM至1 M NaCl線性梯度沖提蛋白質。接著使用10% SDS-PAGE分析管柱餾分。將含有所需蛋白質的餾分匯合後，於4°C下以儲存緩衝液 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、250 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、5% (v/v) 甘油] 進行隔夜透析。使用Amicon過濾器 (分子量截止值50,000) 濃縮含有目標蛋白質的透析蛋白質餾分匯合液。將濃縮的蛋白質匯合液分裝並儲存於-20℃。用與上述相同的程序純化每種突變的聚合酶變體。以牛血清白蛋白作為標準品，使用Bio-Rad蛋白質定量試劑套組 (美國加州Hercules) 進行Bradford反應 (Bradford，1976) 以確定最終蛋白質濃度。
於此實施例，選擇若干例示性Exo -RNA聚合酶變體為實例，用於下文所述之各項檢測，針對A模體及/或B模體中的功能取代或位置取代說明其結果，並總結列於表1。 表1：例示性RNA聚合酶變體中的胺基酸取代列表
PolB酶類型 SEQ ID NO 對應於共通序列 (SEQ ID NO：1) 的A模體及/或B模體中的等效取代
位置 715 (A模體 ) 位置 716 (A模體 ) 位置 717 (A模體 ) 位置 854 (B模體 )
Tgo 2 L408A, L408C, L408D, L408F, L408G, L408H, L408K, L408M, L408N, L408Q, L408S, L408W, L408Y Y409A, Y409C, Y409D, Y409G, Y409N, Y409S, Y409T, Y409V P410A, P410C, P410G, P410I, P410L, P410M, P410N, P410S, P410T, P410V A485C, A485D, A485E, A485F, A485G, A485H, A485I, A485K, A485L, A485M, A485N, A485P, A485Q, A485R, A485T, A485V, A485W, A485Y
Kod1 3 L408A, L408C, L408D, L408F, L408G, L408H, L408K, L408M, L408N, L408Q, L408S, L408W, L408Y Y409A, Y409C, Y409D, Y409G, Y409N, Y409S, Y409T, Y409V P410A, P410C, P410G, P410I, P410L, P410M, P410N, P410S, P410T, P410V A485C, A485D, A485E, A485F, A485G, A485H, A485I, A485K, A485L, A485M, A485N, A485P, A485Q, A485R, A485T, A485V, A485W, A485Y
9°N 4 L408A, L408C, L408D, L408F, L408G, L408H, L408K, L408M, L408N, L408Q, L408S, L408W, L408Y Y409A, Y409C, Y409D, Y409G, Y409N, Y409S, Y409T, Y409V P410A, P410C, P410G, P410I, P410L, P410M, P410N, P410S, P410T, P410V A485C, A485D, A485E, A485F, A485G, A485H, A485I, A485K, A485L, A485M, A485N, A485P, A485Q, A485R, A485T, A485V, A485W, A485Y
Pfu 5 L409A, L409C, L409D, L409F, L409G, L409H, L409K, L409M, L409N, L409Q, L409S, L409W, L409Y Y410A, Y410C, Y410D, Y410G, Y410N, Y410S, Y410T, Y410V P411A, P411C, P411G, P411I, P411L, P411M, P411N, P411S, P411T, P411V A486C, A486D, A486E, A486F, A486G, A486H, A486I, A486K, A486L, A486M, A486N, A486P, A486Q, A486R, A486T, A486V, A486W, A486Y
Vent 6 L411A, L411C, L411D, L411F, L411G, L411H, L411K, L411M, L411N, L411Q, L411S, L411W, L411Y Y412A, Y412C, Y412D, Y412G, Y412N, Y412S, Y412T, Y412V P413A, P413C, P413G, P413I, P413L, P413M, P413N, P413S, P413T, P413V A488C, A488D, A488E, A488F, A488G, A488H, A488I, A488K, A488L, A488M, A488N, A488P, A488Q, A488R, A488T, A488V, A488W, A488Y
Mac 7 L485A, L485C, L485D, L485F, L485G, L485H, L485K, L485M, L485N, L485Q, L485S, L485W, L485Y Y486A, Y486C, Y486D, Y486G, Y486N, Y486S, Y486T, Y486V P487A, P487C, P487G, P487I, P487L, P487M, P487N, P487S, P487T, P487V A565C, A565D, A565E, A565F, A565G, A565H, A565I, A565K, A565L, A565M, A565N, A565P, A565Q, A565R, A565T, A565V, A565W, A565Y
Pis 8 M426A, M426C, M426D, M426F, M426G, M426H, M426K, M426M, M426N, M426Q, M426S, M426W, M426Y Y427A, Y427C, Y427D, Y427G, Y427N, Y427S, Y427T, Y427V P428A, P428C, P428G, P428I, P428L, P428M, P428N, P428S, P428T, P428V A508C, A508D, A508E, A508F, A508G, A508H, A508I, A508K, A508L, A508M, A508N, A508P, A508Q, A508R, A508T, A508V, A508W, A508Y
Sso 9 L518A, L518C, L518D, L518F, L518G, L518H, L518K, L518M, L518N, L518Q, L518S, L518W, L518Y Y519A, Y519C, Y519D, Y519G, Y519N, Y519S, Y519T, Y519V P520A, P520C, P520G, P520I, P520L, P520M, P520N, P520S, P520T, P520V A601C, A601D, A601E, A601F, A601G, A601H, A601I, A601K, A601L, A601M, A601N, A601P, A601Q, A601R, A601T, A601V, A601W, A601Y
實施例 2 ：無模板 RNA 合成測定
以無模板 (或稱非模板依賴性) 之RNA合成方法評估本發明之RNA聚合酶變體。為了進一步確定RNA聚合酶變體的相關活性 (併入天然核糖核苷酸的效能)，本文使用了正常rNTP及單股DNA起始子或平末端雙股DNA起始子進行測定。除此之外，將該方法的反應溫度設定為55℃，以評估實施例RNA聚合酶變體的耐熱性。
在此實例中，以下列合成寡核苷酸係作為起始子，用以測定RNA聚合酶變體的無模板RNA合成活性。
測定模式 I 的 FAM-45 單元 (mer) 單股 DNA(ssDNA) 起始子：具有5'-CTCGGCCTGGCACAGGTCCGTTCAGTGCTGCGGCGACCACCGAGG-3'   (SEQ ID NO： 18) 序列的單股DNA。此單股寡核苷酸在5'端帶有發螢光的螢光素亞磷醯胺 (FAM) 染料標記 (以下稱 FAM-45單元ssDNA)。
測定模式 II 的平末端雙股 DNA 起始子：由上述FAM-45單元ssDNA以及與其互補的單股45單元DNA所黏合 (Annealing) 構成的雙股DNA。
該平末端雙股DNA起始子係利用將FAM-45單元ssDNA起始子引子與互補的45單元DNA以1:1.5的莫耳比率在含有100 mM NaCl的1x TE緩衝液 [10 mM Tris-HCl (pH 8.0)及1 mM EDTA]中所黏合形成。DNA黏合反應係在Bio-Rad熱循環儀 (Hercules, CA) 中藉由先將樣品混合物加熱至98℃達3分鐘，再逐漸將其冷卻(5℃/30秒)至4℃所執行。黏合反應後的產物中不具懸垂端(overhang) 者係用作平末端雙股DNA起始子。
無模板RNA合成反應係在含有100 nM FAM-45單元ssDNA起始子 (測定模式I) 或平末端雙股DNA起始子 (測定模式II)、0.25 mM氯化錳 (MnCl 2)、及200 nM的實施例RNA聚合酶變體的反應混合物 (10 μl) 中執行。藉由添加100 μM的rNTP啟動酶催化RNA新生合成反應，並使反應進行特定的時間 (例如，對於測定模式I為2分鐘，而對於測定模式II為10分鐘)，隨後在特定的反應溫度下 (例如，測定模式I測定或測定模式II皆為55℃) 添加10 μl的2x猝滅溶液 (95%去離子的甲醯胺及25 mM EDTA) 終止反應。在測定模式I或測定模式II的反應後，首先將樣品混合物於95℃變性10 min並藉由含有8M尿素的20%聚丙烯醯胺凝膠電泳 (尿素-PAGE) 進行分析。隨後藉由在Amersham Typhoon雷射掃描儀 (Cytiva Life Sciences)上對凝膠進行成像以將酶催化RNA新生合成反應之產物視覺化。
基於上述測定，對每種變體的相對無模板RNA合成活性進行評分並用符號「+」的數字予以表示。每種變體的總活性得分分成4個不同的級別：1)「+++」表示與受質對照的條帶強度及位置相比，起始子完全延長至各種長度的新合成RNA；故，該變體可視為具有100%的RNA合成活性；2)「++」表示與受質對照的條帶強度及位置相比，約50%至100%起始子延長至各種長度的新合成RNA；故，該變體視為具有50%至100%的RNA合成活性；3)「+」表示與受質對照的條帶強度及位置相比，約10%至50%起始子延長至各種長度的新合成RNA；故，該變體視為具有10%至50%的RNA合成活性；4)「+/-」表示與受質對照的條帶強度及位置相比，小於10%起始子延長至各種長度的新合成RNA；故，該變體視為具有＜10%的RNA合成活性。本案通篇之活性相關評分運用此原則，並將所得資料列出在對應的表格中。 實施例 3 ： RNA 聚合酶變體將 rNTP 併入 FAM-45 單元 ssDNA 起始子及平末端雙股 DNA 起始子的催化活性
於此，特定的核酸外切酶缺陷型RNA聚合酶變體 (例如，Tgo exo-、Kod1 exo-、9°N exo-、Pfu exo-、Vent exo-、Mac exo-及Sso exo-) 經修飾以包含在每種蛋白質中不同保守區域或模體中的一或多個胺基酸取代。
此外，在初步篩選中，本發明人發現該等核酸外切酶缺陷型RNA 聚合酶變體的保守模體在功能及位置上等效於本文所定義的共通序列 (SEQ ID NO： 1) 的模體A中L715、Y716及P717，該保守模體主要可能與RNA新生合成功能相關。更具體而言，該保守模體可能係無模板RNA合成活性的必要位點。此外，模體B中功能及位置上等效於共通序列 (SEQ ID NO： 1) 的保守殘基A854，其作用在於增強無模板RNA合成活性的可增強位點 (資料未示出)。
實施例3.1：Vent變體的無模板RNA合成活性
在此實施例中，例示性地使用源自Vent (SEQ ID NO：6) 的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成活性的影響。另外，美國發明專利第US11136564B2號揭示了一種AAI模體，其用於取代一些古細菌DNA聚合酶中對應的保守模體，以改善進行模板依賴性DNA合成反應 (亦即DNA定序) 時核苷酸類似物的併入。保守模體AAI在功能及位置上等效於共通序列 (SEQ ID NO：1) 的L715、Y716及P717；因此，該保守模體亦在功能及位置上等效於野生型Vent (SEQ ID NO：6) A模體中的L411、Y412及P413。據此，有鑒於AAI模體對於需模板引導之核苷酸併入的影響，AAI模體取代亦在此一併進行比較。除此之外，在此實施例中，亦評估了同時取代共通序列B模體中的A854 (其在功能及位置上等效於於野生型Vent之B模體中的A488) 的組合效應。
在此實施例中，使用上述測定模式I及測定模式II評估從Vent Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表2.1及圖2A，而測定模式II之結果呈現於表2.2及圖2B，其中圖式表示的「S」代表受質 (FAM-45單元ssDNA起始子或平末端雙股DNA起始子) 並作為空白DNA對照。此外，為簡潔起見，在圖2A及圖2B中僅呈現了代表性Vent變體的例示性結果。 表2.1：藉由測定模式I來確定例示性Vent變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
V01 D141A + E143A -
V02 D141A + E143A + A488L -
V03 D141A + E143A + P413E +/-
V04 D141A + E143A + L411Y +/-
V05 D141A + E143A + L411A + A488L +/-
V06 D141A + E143A + L411C + A488L +/-
V07 D141A + E143A + L411D + A488L +/-
V08 D141A + E143A + L411F + A488L ++
V09 D141A + E143A + L411G + A488L +/-
V10 D141A + E143A + L411H + A488L ++
V11 D141A + E143A + L411K + A488L +/-
V12 D141A + E143A + L411M + A488L +/-
V13 D141A + E143A + L411Q + A488L +/-
V14 D141A + E143A + L411Y + A488L ++
V15 D141A + E143A + Y412A + A488L +
V16 D141A + E143A + Y412C + A488L +/-
V17 D141A + E143A + Y412G + A488L +
V18 D141A + E143A + Y412N + A488L +/-
V19 D141A + E143A + Y412S + A488L +
V20 D141A + E143A + P413S + A488L ++
V21 D141A + E143A + L411A + Y412A + P413G + A488L ++
V22 D141A + E143A + L411C + Y412A + P413G + A488L +++
V23 D141A + E143A + L411D + Y412A + P413G + A488L +
V24 D141A + E143A + L411E + Y412A + P413G + A488L +
V25 D141A + E143A + L411F + Y412A + P413G + A488L +++
V26 D141A + E143A + L411G + Y412A + P413G + A488L +
V27 D141A + E143A + L411H + Y412A + P413G + A488L +++
V28 D141A + E143A + L411I + Y412A + P413G + A488L +
V29 D141A + E143A + L411K + Y412A + P413G + A488L +++
V30 D141A + E143A + Y412A + P413G + A488L +
V31 D141A + E143A + L411M + Y412A + P413G + A488L +++
V32 D141A + E143A + L411N + Y412A + P413G + A488L ++
V33 D141A + E143A + L411Q + Y412A + P413G + A488L +++
V34 D141A + E143A + L411S + Y412A + P413G + A488L ++
V35 D141A + E143A + L411T + Y412A + P413G + A488L +
V36 D141A + E143A + L411V + Y412A + P413G + A488L +
V37 D141A + E143A + L411W + Y412A + P413G + A488L ++
V38 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488L ++
V39 D141A + E143A + L411Y + Y412C + P413G + A488L +
V40 D141A + E143A + L411Y + Y412D + P413G + A488L ++
V41 D141A + E143A + L411Y + Y412F + P413G + A488L +
V42 D141A + E143A + L411Y + Y412G + P413G + A488L ++
V43 D141A + E143A + L411Y + Y412H + P413G + A488L +
V44 D141A + E143A + L411Y + Y412I + P413G + A488L +
V45 D141A + E143A + L411Y + Y412L + P413G + A488L +
V46 D141A + E143A + L411Y + Y412M + P413G + A488L +
V47 D141A + E143A + L411Y + Y412N + P413G + A488L ++
V48 D141A + E143A + L411Y + Y412Q + P413G + A488L +
V49 D141A + E143A + L411Y + Y412S + P413G + A488L ++
V50 D141A + E143A + L411Y + Y412T + P413G + A488L ++
V51 D141A + E143A + L411Y + Y412V + P413G + A488L ++
V52 D141A + E143A + L411Y + P413G + A488L ++
V53 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413A + A488L ++
V54 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413C + A488L ++
V55 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413D + A488L +
V56 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413E + A488L +
V57 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413F + A488L +
V58 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413H + A488L +
V59 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413I + A488L ++
V60 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413K + A488L +
V61 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413L + A488L ++
V62 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413M + A488L ++
V63 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413N + A488L ++
V64 D141A + E143A + L411Y + Y412A + A488L ++
V65 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413Q + A488L +
V66 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413S + A488L ++
V67 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413T + A488L ++
V68 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413V + A488L ++
V69 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413W + A488L +
V70 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413Y + A488L +
V71 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488A +
V72 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488C ++
V73 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488D ++
V74 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488E ++
V75 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488F ++
V76 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488G ++
V77 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488H ++
V78 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488I ++
V79 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488K ++
V80 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488M ++
V81 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488N ++
V82 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488P +
V83 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488Q ++
V84 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488R ++
V85 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488T ++
V86 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488V ++
V87 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488W ++
V88 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488Y ++
表2.2：藉由測定模式II來確定例示性Vent變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
V02 D141A + E143A + A488L -
V05 D141A + E143A + L411A + A488L +++
V06 D141A + E143A + L411C + A488L +++
V07 D141A + E143A + L411D + A488L +++
V08 D141A + E143A + L411F + A488L +++
V09 D141A + E143A + L411G + A488L -/+
V10 D141A + E143A + L411H + A488L ++
V11 D141A + E143A + L411K + A488L -/+
V12 D141A + E143A + L411M + A488L ++
V13 D141A + E143A + L411Q + A488L ++
V14 D141A + E143A + L411Y + A488L +++
V16 D141A + E143A + Y412C + A488L +++
V17 D141A + E143A + Y412G + A488L +++
V18 D141A + E143A + Y412N + A488L +++
V19 D141A + E143A + Y412S + A488L +++
V20 D141A + E143A + P413S + A488L +++
V38 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488L +++
V21 D141A + E143A + L411A + Y412A + P413G + A488L +++
V22 D141A + E143A + L411C + Y412A + P413G + A488L +++
V23 D141A + E143A + L411D + Y412A + P413G + A488L +++
V24 D141A + E143A + L411E + Y412A + P413G + A488L +++
V25 D141A + E143A + L411F + Y412A + P413G + A488L +++
V26 D141A + E143A + L411G + Y412A + P413G + A488L +++
V27 D141A + E143A + L411H + Y412A + P413G + A488L +++
V28 D141A + E143A + L411I + Y412A + P413G + A488L +++
V29 D141A + E143A + L411K + Y412A + P413G + A488L +++
V30 D141A + E143A + Y412A + P413G + A488L +++
V31 D141A + E143A + L411M + Y412A + P413G + A488L +++
V32 D141A + E143A + L411N + Y412A + P413G + A488L +++
V33 D141A + E143A + L411Q + Y412A + P413G + A488L +++
V34 D141A + E143A + L411S + Y412A + P413G + A488L +++
V35 D141A + E143A + L411T + Y412A + P413G + A488L +++
V36 D141A + E143A + L411V + Y412A + P413G + A488L +++
V37 D141A + E143A + L411W + Y412A + P413G + A488L +++
V52 D141A + E143A + L411Y + P413G + A488L +++
V39 D141A + E143A + L411Y + Y412C + P413G + A488L +++
V40 D141A + E143A + L411Y + Y412D + P413G + A488L +++
V41 D141A + E143A + L411Y + Y412F + P413G + A488L +++
V43 D141A + E143A + L411Y + Y412H + P413G + A488L +++
V44 D141A + E143A + L411Y + Y412I + P413G + A488L +++
V45 D141A + E143A + L411Y + Y412L + P413G + A488L +++
V46 D141A + E143A + L411Y + Y412M + P413G + A488L +++
V47 D141A + E143A + L411Y + Y412N + P413G + A488L +++
V48 D141A + E143A + L411Y + Y412Q + P413G + A488L +++
V49 D141A + E143A + L411Y + Y412S + P413G + A488L +++
V50 D141A + E143A + L411Y + Y412T + P413G + A488L +++
V51 D141A + E143A + L411Y + Y412V + P413G + A488L +++
V64 D141A + E143A + L411Y + Y412A + A488L +++
V53 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413A + A488L +++
V54 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413C + A488L +++
V55 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413D + A488L +++
V56 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413E + A488L +++
V57 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413F + A488L +++
V58 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413H + A488L +++
V59 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413I + A488L +++
V60 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413K + A488L +++
V61 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413L + A488L +++
V62 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413M + A488L +++
V63 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413N + A488L +++
V65 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413Q + A488L +++
V66 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413S + A488L +++
V67 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413T + A488L +++
V68 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413V + A488L +++
V69 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413W + A488L +++
V70 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413Y + A488L +++
V72 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488C +++
V73 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488D +++
V74 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488E +++
V75 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488F +++
V77 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488H +++
V78 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488I +++
V79 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488K +++
V80 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488M +++
V81 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488N +++
V82 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488P +++
V83 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488Q +++
V84 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488R +++
V85 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488T +++
V86 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488V +++
V87 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488W +++
V88 D141A + E143A + L411Y + Y412A + P413G + A488Y +++
如表2.1、表2.2、圖2A及圖2B所示，帶有位於Exo I模體、A模體及/或B模體 (A488L) 的胺基酸取代之變體在測定模式I及測定模式II中均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成活性。更具體而言，對於無模板酶催化RNA合成的催化活性，較佳的取代組合出現在A模體中，例如：L411A + Y412A + P413G (AAG)、L411C + Y412A + P413G (CAG)、L411F + Y412A + P413G (FAG)、L411H + Y412A + P413G (HAG)、L411K + Y412A + P413G (KAG)、L411M + Y412A + P413G (MAG)、L411Q + Y412A + P413G (QAG) 及L411Y + Y412A + P413G (YAG)。
實施例3.2：Pfu變體的無模板RNA合成活性
在此實施例中，例示性地使用源自Pfu (SEQ ID NO：5) 的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成活性的影響。
具體而言，使用如上所述的測定模式I及II評估從Pfu Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表3.1及圖3A中，而測定模式II之結果呈現於表3.2及圖3B中，其中圖中表示的「S」代表受質 (FAM-45單元ssDNA起始子或平末端雙股DNA起始子) 並作為空白DNA對照。此外，為簡潔起見，在此實例僅呈現了代表性Pfu變體的例示性結果。 表3.1：藉由測定模式I來確定例示性Pfu變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
P01 D141A + E143A -
P02 D141A + E143A + A486L +/-
P03 D141A + E143A + L409Y + Y410A + P411G +
P04 D141A + E143A + L409Y + Y410A + P411G + A486L +++
P05 D141A + E143A + L409A + Y410A + P411I + A486L +++
表3.2：藉由測定模式II來確定例示性Pfu變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
P01 D141A + E143A -
P02 D141A + E143A + A486L +/-
P03 D141A + E143A + L409Y + Y410A + P411G +++
P04 D141A + E143A + L409Y + Y410A + P411G + A486L +++
P05 D141A + E143A + L409A + Y410A + P411I + A486L +++
如圖3A、圖3B、表3.1及表3.2所示，帶有位於Exo I模體及A模體的胺基酸取代之變體，諸如變體P03、P04及P05，在測定模式I及測定模式II均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成催化活性。此外，帶有位於Exo I模體、A模體及B模體中的胺基酸取代組合之變體，諸如變體P04及P05，進一步增強了該催化活性。
實施例3.3：Kod1變體的無模板RNA合成活性
在此實例中，例示性地使用源自Kod1 (SEQ ID NO：3) 的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成活性的影響。
具體而言，使用如上所述的測定模式I及II評估從Kod1 Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表4.1及圖4A中，而測定模式II之結果呈現於表4.2及圖4B中，其中圖中表示的「S」代表受質 (FAM-45單元ssDNA起始子或平末端雙股DNA起始子) 並作為空白DNA對照。此外，為簡潔起見，在此實例僅呈現了代表性Kod1變體的例示性結果。 表4.1：藉由測定模式I來確定例示性Kod1變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
K01 D141A + E143A -
K02 D141A + E143A + A485L +
K03 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G ++
K04 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G + A485L +++
K05 D141A + E143A + L408A + Y409A + P410I + A485L ++
表4.2：藉由測定模式II來確定例示性Kod1變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
K01 D141A + E143A -
K02 D141A + E143A + A485L +
K03 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G +++
K04 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G + A485L +++
K05 D141A + E143A + L408A + Y409A + P410I + A485L +++
如圖4A、圖4B、表4.1及表4.2所示，帶有位於Exo I模體、A模體及/或B模體的胺基酸取代之變體，諸如變體K02、K03、K04及K05，在測定模式I及測定模式II均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成催化活性。此外，帶有位於Exo I模體、A模體及B模體中的胺基酸取代組合之變體，諸如變體K04及K05，進一步增強了該催化活性。
實施例3.4：Mac變體的無模板RNA合成活性
在此實施例中，例示性地使用源自Mac (SEQ ID NO：7) 的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成活性的影響。
具體而言，使用如上所述的測定模式I及II評估從Mac Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表5.1及圖5A中，而測定模式II之結果呈現於表5.2及圖5B中，其中圖中表示的「S」代表受質 (FAM-45單元ssDNA起始子或平末端雙股DNA起始子) 並作為空白DNA對照。此外，為簡潔起見，在此實例僅呈現了代表性Mac變體的例示性結果。 表5.1：藉由測定模式I來確定例示性Mac變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
M01 D198A + E200A -
M02 D198A + E200A + L485Y + Y486A + P487G +/-
M03 D198A + E200A + L485Y + Y486A + P487G + A565L +
表5.2：藉由測定模式II來確定例示性Mac變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
M01 D198A + E200A -
M02 D198A + E200A + L485Y + Y486A + P487G +++
M03 D198A + E200A + L485Y + Y486A + P487G + A565L +++
如圖5A、圖5B、表5.1及表5.2所示，帶有位於Exo I模體及A模體的胺基酸取代之變體，例如變體M02，在測定模式I及測定模式II均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成催化活性。此外，帶有位於Exo I模體、A模體及B模體中的胺基酸取代組合之變體，如變體M03，進一步增強了該催化活性。
實施例3.5：Tgo變體的無模板RNA合成活性
在此實例中，例示性地使用源自Tgo (SEQ ID NO：2) 的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成活性的影響。
具體而言，使用如上所述的測定模式I及II評估從Tgo Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表6.1及圖6A中，而測定模式II之結果呈現於表6.2及圖6B中，其中圖中表示的「S」代表受質 (FAM-45單元ssDNA起始子或平末端雙股DNA起始子) 並作為空白DNA對照。此外，為簡潔起見，在此實例僅呈現了代表性Tgo變體的例示性結果。 表6.1：藉由測定模式I來確定例示性Tgo變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
T01 D141A + E143A + L408A + Y409A + P410A + A485L +++
T02 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G + A485L +++
表6.2：藉由測定模式II來確定例示性Tgo變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
T01 D141A + E143A + L408A + Y409A + P410A + A485L +++
T02 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G + A485L +++
如圖6A、圖6B、表6.1及表6.2所示，帶有位於Exo I模體、A模體及B模體的胺基酸取代之變體，諸如變體T01及T02，在測定模式I及測定模式II均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成催化活性。
實施例3.6：Sso變體的無模板RNA合成活性
在此實例中，例示性地使用源自Sso (SEQ ID NO：9) 的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成的活性。
具體而言，使用如上所述的測定模式I及II評估從Sso Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表7.1中，而測定模式II之結果呈現於表7.2中。為簡潔起見，省略了此實例中的尿素-PAGE圖像結果。 表7.1：藉由測定模式I來確定例示性Sso變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
S01 D231A + E233A -
S03 D231A + E233A + L518Y + Y519A + P520G +++
S06 D231A + E233A + L518Y + Y519A + P520G + A601L +++
表7.2：藉由測定模式II來確定例示性Sso變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
S01 D231A + E233A -
S03 D231A + E233A + L518Y + Y519A + P520G +++
S06 D231A + E233A + L518Y + Y519A + P520G + A601L +++
如表7.1及表7.2所示，帶有位於Exo I模體、A模體及/或B模體的胺基酸取代之變體，諸如變體S03及S06，在測定模式I及測定模式II均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成催化活性。
實施例3.7：9°N變體的無模板RNA合成活性
在此實例中，例示性地使用源自9°N (SEQ ID NO： 4)的RNA聚合酶變體，以評估帶有位在Exo I模體、A模體及B模體中的取代組合對於無模板RNA合成的活性。
具體而言，使用如上所述的測定模式I及II評估從9°N Exo-骨架修飾而成的變體；其中測定模式I之結果呈現於表8.1中，而測定模式II之結果呈現於表8.2中。為簡潔起見，省略了此實例中的尿素-PAGE圖像結果。 表8.1：藉由測定模式I來確定例示性9°N變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
N02 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410E + A485V ++
N03 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410F + A485V ++
N04 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G + A485V +++
N05 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410H + A485V +++
N06 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410T + A485V +++
N07 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410V + A485V +++
N08 D141A + E143A + L408Y + Y409C + P410G + A485V ++
N09 D141A + E143A + L408Y + Y409G + P410G + A485V ++
N10 D141A + E143A + L408Y + Y409I + P410G + A485V ++
N11 D141A + E143A + L408Y + Y409K + P410G + A485V +/-
N12 D141A + E143A + L408Y + Y409L + P410G + A485V +/-
N13 D141A + E143A + L408Y + Y409Q + P410G + A485V +/-
N14 D141A + E143A + L408Y + Y409Y + P410G + A485V +++
N15 D141A + E143A + L408A + Y409A + P410G + A485V ++
N16 D141A + E143A + L408S + Y409A + P410G + A485V ++
N17 D141A + E143A + L408V + Y409A + P410G + A485V +++
表8.2：藉由測定模式II來確定例示性9°N變體的胺基酸取代及RNA合成活性得分列表
變體名稱 取代 活性得分
N02 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410E + A485V +++
N03 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410F + A485V +++
N04 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410G + A485V +++
N05 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410H + A485V +++
N06 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410T + A485V +++
N07 D141A + E143A + L408Y + Y409A + P410V + A485V +++
N08 D141A + E143A + L408Y + Y409C + P410G + A485V +++
N09 D141A + E143A + L408Y + Y409G + P410G + A485V +++
N10 D141A + E143A + L408Y + Y409I + P410G + A485V +++
N11 D141A + E143A + L408Y + Y409K + P410G + A485V +++
N12 D141A + E143A + L408Y + Y409L + P410G + A485V +++
N13 D141A + E143A + L408Y + Y409Q + P410G + A485V +++
N14 D141A + E143A + L408Y + Y409Y + P410G + A485V +++
N15 D141A + E143A + L408A + Y409A + P410G + A485V +++
N16 D141A + E143A + L408S + Y409A + P410G + A485V +++
N17 D141A + E143A + L408V + Y409A + P410G + A485V ++
如表8.1及表8.2所示，帶有位於Exo I模體、A模體及/或B模體的胺基酸取代之變體在測定模式I及測定模式II均表現出顯著的無模板酶催化RNA合成催化活性。
綜上所得結果，本發明提供的RNA聚合酶變體及試劑套組已在各種情況下證明得以有效且高效地使用rNTP進行酶催化RNA新生合成。除此之外，該等RNA聚合酶變體亦證明可在涵蓋從大氣溫度至高溫條件的較廣泛反應溫度下成功發揮無模板RNA合成功能，展現出更高的耐熱性。因此，本文範疇內的RNA聚合酶變體及試劑套組可拓展無模板酶催化核酸合成在不同反應條件下的各種應用範圍。
本發明具體實施例已經揭露，但並非旨在限制本發明。本案所屬技術領域具有通常知識者均能夠理解，在未偏離本發明原理和精神的情況下，可以做出各種變更例和修飾例，因此本發明的保護範圍應當以隨附的專利申請範圍中所限定的範圍為基礎。
無
為使本發明上述及其他目的、特徵、優點及實施例更加明顯易懂，因此針對圖式說明如下：
圖1係本發明相關的野生型B族DNA聚合酶 (PolB) 胺基酸序列比對結果及其共通序列。
圖2A及圖2B係本發明實例3.1之RNA合成反應結果圖。
圖3A及圖3B係本發明實例3.2之RNA合成反應結果圖。
圖4A及圖4B係本發明實例3.3之RNA合成反應結果圖。
圖5A及圖5B係本發明實例3.4之RNA合成反應結果圖。
圖6A及圖6B係本發明實例3.5之RNA合成反應結果圖。
無。
TW202330915A_111136857_SEQL.xml

Claims (30)

  1. 一種RNA聚合酶變體，其包含： 一A模體，及一B模體，分別對應於一共通序列 (SEQ ID NO：1) 之位置706至730以及位置843至855；以及 至少一胺基酸取代，位於該A模體、該B模體或其組合中的一位置； 其中該RNA聚合酶變體具有一減弱或缺失的3'至5'核酸外切酶活性。
  2. 如請求項1所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係由一野生型B族DNA聚合酶修飾而成，且該野生型B族DNA聚合酶包含選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所組成群組之一胺基酸序列。
  3. 如請求項2所述之RNA聚合酶變體，其中該野生型B族DNA聚合酶係柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)、鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)、嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)、激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)、海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)、嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)、冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)、硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)、海沼甲烷球菌 ( Methanococcus maripaludis) DNA聚合酶 (Mma)、人類DNA聚合酶δ催化p125次單元 (hPOLD)、釀酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) DNA聚合酶δ催化次單元 (ScePOLD)、綠膿桿菌 ( Pseudomonas aeruginosa) DNA聚合酶II (Pae)、大腸桿菌 ( Escherichia. coli) DNA聚合酶II (Eco)、大腸桿菌噬菌體RB69 DNA聚合酶 (RB69)、大腸桿菌噬菌體T4 DNA聚合酶 (T4) 或芽孢桿菌噬菌體 Phi29 DNA聚合酶 (Phi29)。
  4. 如請求項1所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體包含對應於該共通序列 (SEQ ID NO：1) 位置349至位置364的一Exo I模體，且該RNA聚合酶變體在該Exo I模體中的一位置具有至少一胺基酸取代。
  5. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中： i. 對應於SEQ ID NO：1位置715之胺基酸L或M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 對應於SEQ ID NO：1位置716之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 對應於SEQ ID NO：1位置717之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  6. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO： 2之柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)，且其中： i. 在SEQ ID NO：2位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：2位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：2位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  7. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：2之柳珊瑚嗜熱球菌 ( Thermococcus gorgonarius) DNA聚合酶 (Tgo)，且其中： i. 在SEQ ID NO：2位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：2位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：2位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：2位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  8. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)，且其中： i. 在SEQ ID NO：3位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：3位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：3位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  9. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：3之鹿兒島嗜熱球菌 ( Thermococcus kodakarensis) DNA聚合酶 (Kod1)，且其中： i. 在SEQ ID NO：3位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：3位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：3位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：3位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  10. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)，且其中： i. 在SEQ ID NO：4位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：4位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：4位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  11. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：4之嗜熱球菌屬 (菌株9°N-7) DNA聚合酶 (9°N)，且其中： i. 在SEQ ID NO：4位置408之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：4位置409之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：4位置410之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：4位置485之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  12. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)，且其中： i. 在SEQ ID NO：5位置409之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：5位置410之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：5位置411之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  13. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：5之激烈火球菌 ( Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶 (Pfu)，且其中： i. 在SEQ ID NO：5位置409之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：5位置410之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：5位置411之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：5位置486之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  14. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)，且其中： i. 在SEQ ID NO：6位置411之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：6位置412之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：6位置413之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  15. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：6之海濱嗜熱球菌 ( Thermococcus litoralis) DNA聚合酶 (Vent)，且其中： i. 在SEQ ID NO：6位置411之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：6位置412之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：6位置413之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：6位置488之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  16. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：7之嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)，且其中： i. 在SEQ ID NO：7位置485之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：7位置486之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：7位置487之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  17. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：7之嗜乙酸甲烷八疊球菌 ( Methanosarcina acetivorans) DNA聚合酶 (Mac)，且其中： i. 在SEQ ID NO：7位置485之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：7位置486之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：7位置487之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：7位置565之胺基酸係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  18. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)，且其中： i. 在SEQ ID NO：8位置426之胺基酸M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：8位置427之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：8位置428之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  19. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：8之冰島熱棒菌 ( Pyrobaculum islandicum) DNA聚合酶 (Pis)，且其中： i. 在SEQ ID NO：8位置426之胺基酸M係由A、C、D、F、G、H、K、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：8位置427之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：8位置428之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：8位置508之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  20. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：9之硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)，且其中： i. 在SEQ ID NO：9位置518之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：9位置519之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代；以及 iii. 在SEQ ID NO：9位置520之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代。
  21. 如請求項4所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體係源自具有野生型胺基酸序列SEQ ID NO：9之硫磺礦硫化葉菌 ( Sulfolobus solfataricus) DNA聚合酶 (Sso)，且其中： i. 在SEQ ID NO：9位置518之胺基酸L係由A、C、D、F、G、H、K、M、N、Q、S、W或Y所取代； ii. 在SEQ ID NO：9位置519之胺基酸Y保持不變或係由A、C、D、G、N、S、T或V所取代； iii. 在SEQ ID NO：9位置520之胺基酸P保持不變或係由A、C、G、I、L、M、N、S、T或V所取代；以及 iv. 在SEQ ID NO：9位置601之胺基酸A係由C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y所取代。
  22. 如請求項1所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體表現出一無模板核酸合成活性，係藉由將至少一核苷酸添加至一可延長的起始子，以無模板方式合成核酸，其中該至少一核苷酸選自由天然存在的核苷酸、核苷酸類似物及其混合物的群組。
  23. 如請求項22所述之RNA聚合酶變體，其中該可延長的起始子包括一單股寡核苷酸起始子、平末端 (blunt-end) 雙股寡核苷酸起始子或其混合物。
  24. 如請求項22所述之RNA聚合酶變體，其中該可延長的起始子係在液相中反應之一游離態核酸。
  25. 如請求項22所述之RNA聚合酶變體，其中該可延長的起始子係固定在一固相載體上，其中該固相載體包括一粒子、珠粒、載玻片、陣列表面、膜、流通池、孔、微孔、奈米孔、腔室、微流體腔室、通道或微流體通道。
  26. 如請求項22所述之RNA聚合酶變體，其中該至少一核苷酸與一可偵測標記連接。
  27. 如請求項22所述之RNA聚合酶變體，其中該至少一核苷酸包括一核糖。
  28. 如請求項22所述之RNA聚合酶變體，其中該RNA聚合酶變體在介於10℃至100℃之間的反應溫度下表現該無模板核酸合成活性。
  29. 一種用於執行酶催化核酸新生合成的試劑套組，其包含源自一野生型B族DNA聚合酶修飾之一RNA聚合酶變體，該野生型B族DNA聚合酶包含選自於由SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所組成群組之一胺基酸序列；其中該RNA聚合酶變體表現出一無模板核酸合成活性，係藉由將至少一核苷酸添加至一可延長的起始子以合成一所需的核酸序列，其中該至少一核苷酸選自由天然存在的核苷酸、核苷酸類似物及其混合物的群組。
  30. 一種無模板合成RNA寡核苷酸的方法，其包括： (a)提供一起始寡核苷酸； (b)提供一RNA聚合酶變體； (c)在足以將至少一核苷酸添加至該起始寡核苷酸的3'端的條件下，聯合該起始寡核苷酸、該RNA聚合酶變體及該至少一核苷酸合成該RNA寡核苷酸； 其中該RNA聚合酶變體包含： 一A模體，及一B模體，分別對應於一共通序列(SEQ ID NO：1)之位置706至730以及位置843至855；以及 至少一胺基酸取代，位於該A模體、該B模體或其組合中的一位置； 其中該RNA聚合酶變體具有一減弱或缺失的3'至5'核酸外切酶活性。
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