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TW202321462A - 寡核苷酸與聚合物之光活化耦合 - Google Patents

寡核苷酸與聚合物之光活化耦合 Download PDF

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TW202321462A
TW202321462A TW111128601A TW111128601A TW202321462A TW 202321462 A TW202321462 A TW 202321462A TW 111128601 A TW111128601 A TW 111128601A TW 111128601 A TW111128601 A TW 111128601A TW 202321462 A TW202321462 A TW 202321462A
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TW
Taiwan
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polymer
integer
substrate
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oligonucleotides
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TW111128601A
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English (en)
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席偉賢
譚美 共
洪薩恩基
亞歷山卓 塞姆約諾夫
Original Assignee
美商伊路米納有限公司
英商伊路米納劍橋有限公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供一種使寡核苷酸與聚合物耦合之方法的各種實例。該方法可包括用光選擇性地照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分，而不照射該聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分，以在該聚合物之該一或多個第一區域中產生第一活性部分。該方法亦可包括使該等第一活性部分與第一寡核苷酸耦合。該方法可進一步包括用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分以在該聚合物之該一或多個第二區域中產生第二活性部分。該方法亦可包括使該等第二活性部分與第二寡核苷酸耦合。

Description

寡核苷酸與聚合物之光活化耦合
本發明係關於寡核苷酸與聚合物之光活化耦合。 相關申請案之交互參考
本申請案主張2021年7月30日申請之美國臨時專利申請案第63/227,776號之優先權，其以全文引用的方式併入本文中。
簇擴增為一種擴增聚核苷酸，例如用於基因定序之方法。目標聚核苷酸由耦合至流量槽中之基板表面之引子(例如，P5及P7引子)捕獲，且在表面上之無規位置處形成「種子」。執行擴增循環以在各種子周圍之表面上形成簇。該等簇包括種子聚核苷酸之複本及互補複本。在一些情況下，基板經圖案化以限定結合不同簇之區，諸如可填充有各別簇之孔。
經由提供一種使寡核苷酸與聚合物耦合之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：用光選擇性地照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分，而不照射該聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分，以在該聚合物之該一或多個第一區域中產生第一活性部分；使該等第一活性部分與第一寡核苷酸耦合；用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分以在該聚合物之該一或多個第二區域中產生第二活性部分；及使該等第二活性部分與第二寡核苷酸耦合。
在方法之一些實例中，第一非活性部分及第二非活性部分中之一者或兩者包含保護基，其中該保護基係選自具有選自以下之結構的鄰硝基苯甲基：
Figure 02_image001
及
Figure 02_image003
，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，及 具有以下結構之苯并哌喃酮
Figure 02_image005
，其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br，Z包含烷烴，該包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-且R 1為與聚合物之主鏈的鍵聯。
在方法之一些實例中，第一活性部分及第二活性部分中之一者或兩者包含三唑：
Figure 02_image007
，其中Z包含烷烴，該包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且Y包含選自胺及硫醇之主鏈反應性基團。
在方法之一些實例中，主鏈反應性基團包含胺。
在方法之一些實例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團係選自與該胺反應以形成具有以下結構之耦合的N-羥基丁二醯亞胺酯、羧酸及鄰醯基異脲：
Figure 02_image009
，其中Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且R 6包含第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在方法之一些實例中，主鏈反應性基團包含硫醇。
在方法之一些實例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團為與硫醇反應以形成具有以下結構之耦合的乙烯基碸：
Figure 02_image011
，其中Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且R 6包含第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在方法之一些實例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團為與硫醇反應以形成具有以下結構之耦合的順丁烯二醯亞胺：
Figure 02_image013
，其中Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且R 6包含第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在方法之一些實例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團為與硫醇反應以形成具有以下結構之耦合的丙烯醯胺：
Figure 02_image015
，其中Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且R 6包含第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
經由提供一種使寡核苷酸與聚合物耦合之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：在存在光引發劑之情況下用光選擇性地照射聚合物之一或多個第一區域中的第一部分，而不照射該聚合物之一或多個第二區域中的第二部分，以使第一活性部分與第一寡核苷酸耦合；及用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二部分以使第二活性部分與第二寡核苷酸耦合，其中第一寡核苷酸及第二寡核苷酸中之一者或兩者包含硫醇基。
在方法之一些實例中，第一非活性部分及第二非活性部分中之一者或兩者包含具有以下結構之烯烴：
Figure 02_image017
，其中Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數。
在方法之一些實例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸與聚合物反應性基團耦合，且該等聚合物反應性基團為與硫醇基反應以形成具有以下結構之耦合的烯烴：
Figure 02_image019
，其中Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且R 6包含第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在方法之一些實例中，光引發劑係選自以下中之一或多者：苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：在存在光引發劑之情況下用光選擇性地照射第一共聚單體，其中該等第一共聚單體中之一或多者包含第一寡核苷酸，而不照射第二共聚單體，其中該等第二共聚單體中之一或多者包含第二寡核苷酸，以使該等第一共聚單體聚合形成該聚合物之一或多個第一區域；且在存在該光引發劑之情況下照射該等第二共聚單體以使該等第二共聚單體聚合形成該聚合物之一或多個第二區域。
在方法之一些實例中，使第一共聚單體及第二共聚單體中之一者或兩者聚合包含形成聚合物網路的光誘發性反應：
Figure 02_image021
Figure 02_image023
，其中R包含第一寡核苷酸或第二寡核苷酸，且Z包含烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(CH 2-) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數。
在方法之一些實例中，光引發劑係選自以下中之一或多者：苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
在方法之一些實例中，第一寡核苷酸包含缺乏切除部分之第一引子及含有切除部分之第二引子的混合物。
在方法之一些實例中，第二寡核苷酸包含含有切除部分之第三引子及缺乏切除部分之第四引子的混合物。
在方法之一些實例中，第一引子及第三引子具有除切除部分以外彼此相同的序列，且其中第二引子及第四引子具有除切除部分以外彼此相同的序列。
在方法之一些實例中，第一引子及第二引子之序列彼此正交，且其中第三引子及第四引子之序列彼此正交。
在方法之一些實例中，聚合物之一或多個第一區域包含複數個第一子區域，且其中聚合物之一或多個第二區域包含複數個第二子區域。
在方法之一些實例中，複數個第一子區域各自包含相鄰的第一子區域且複數個第二子區域各自包含第二相鄰的子區域，其中各相鄰的第一子區域與相鄰的第二子區域中的對應者相鄰。
在方法之一些實例中，該方法包括基板，其中該基板包含複數個奈米孔，且該複數個奈米孔中之一或多者含有相鄰的子區域及相對應的相鄰第二子區域。
經由聚合物可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述此聚合物之各種實例，且該聚合物（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該聚合物包含：具有選自以下之結構的聚(鄰硝基苯甲基遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image025
及
Figure 02_image027
，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，X係選自-S及-N(H)-，Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image029
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由聚合物可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述此聚合物之各種實例，且該聚合物（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該聚合物包含：具有以下結構之聚(苯并哌喃酮遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image031
，其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br，X係選自-S及-N(H)-，Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由聚合物可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述此聚合物之各種實例，且該聚合物（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該聚合物包含：具有以下結構之聚(胺基三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image035
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由聚合物可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述此聚合物之各種實例，且該聚合物（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該聚合物包含：具有以下結構之聚(硫代三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image037
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：光誘發性反應：
Figure 02_image039
Figure 02_image041
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：光誘發性反應：
Figure 02_image043
Figure 02_image045
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：光誘發性反應：
Figure 02_image048
Figure 02_image050
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：光誘發性反應：
Figure 02_image053
Figure 02_image055
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：光誘發性反應：
Figure 02_image057
Figure 02_image059
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由提供一種製備聚合物之方法可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述方法之各種實例，且該方法（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該方法包含：光誘發性反應：
Figure 02_image060
Figure 02_image062
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
經由聚合物可克服先前技術之缺點且可實現如本揭示案中稍後描述之益處及優勢。下文描述此聚合物之各種實例，且該聚合物（包括及不包括下文列舉之額外實例，以任何組合（限制條件為此等組合無不一致））克服此等缺點。該聚合物包含：具有以下結構之聚(烯基三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image064
，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image066
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，聚合物接觸基板之頂側上的複數個表面，且用光照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分以在聚合物之一或多個第一區域中產生第一活性部分及用光照射聚合物之一或多個第二區域中的一或多個第二非活性部分以在聚合物之一或多個第二區域中產生第二活性部分中的一者或兩者包含照射複數個表面中的至少一個表面。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，複數個表面包含奈米孔之表面且用光照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分及用光照射聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分中的一者或兩者包含用紫外輻射照射基板之底側。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，複數個表面包含奈米孔之表面且奈米孔之表面之一部分包含波導。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分及聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分中的一者或兩者係藉由波導照射。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，基板進一步包含對紫外輻射具有低透明度之材料。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，複數個表面包含多深度奈米孔之表面且多深度奈米孔包含深部及淺部，其中聚合物之一或多個第一區域接觸深部且聚合物之一或多個第二區域接觸淺部，且照射第一非活性部分包含：照射基板之底側，且照射第二非活性部分包含：照射基板之頂側。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，複數個表面包含多深度奈米孔之表面且多深度奈米孔包含深孔及淺孔，其中聚合物之一或多個第一區域接觸深孔之底表面且聚合物之一或多個第二區域接觸淺部之底部，且：照射第一非活性部分包含照射基板之底側，且照射第二非活性部分包含照射基板之頂側。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，該方法進一步包含：拋光基板以移除過量的活化部分。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，基板之一部分包含金屬氧化物，其中金屬氧化物部分限定深孔之高度及寬度及淺孔之高度及寬度。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，該方法進一步包含在照射之前，使複數個表面之一部分上的金屬氧化物圖案化，其中基於圖案化，複數個表面包含攪拌表面及金屬氧化物表面；且使基板表面接觸聚合物之一或多個第一區域及使金屬氧化物表面接觸聚合物之一或多個第二區域。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，用光照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分包含照射基板之底側；且用光照射聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分包含照射基板之頂側。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，該方法包括拋光基板以移除過量的活性部分。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，該方法包括：在照射之前，將波導圖案化至基板上。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分包含用波導照射；且照射聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分包含照射基板之頂側。
在本文描述的用於使寡核苷酸與聚合物耦合之方法中之一或多者的一些實例中，該方法包括：拋光基板以移除過量的非活性部分。
經由本文中所描述之技術實現額外特徵。本文中詳細描述其他實例及態樣且將其視為所主張態樣之部分。自本發明之各種態樣的結合附圖進行的以下詳細描述，本發明的此等及其他目標、特徵及優勢將變得顯而易見。
應瞭解，前述態樣及下文更詳細論述之額外概念的所有組合（限制條件為此等概念並不彼此不一致）經涵蓋作為發明主題的部分且達成本文中所揭示之優勢。
本文提供之實例係關於聚合物、製備聚合物之方法、使寡核苷酸與聚合物耦合之方法及將所得聚合物接枝至基板的方法。
可能需要使用官能化聚合物執行合成定序（SBS）以確定簇中目標聚核苷酸之序列。圖1示意性地示出在基板上擴增聚核苷酸之實例，該聚核苷酸包括基板之第一區域及第二區域中的不同寡核苷酸。基板可包括第一區域101及第二區域102，其可經官能化以便以諸如參考圖2A所描述之方式包括不同於彼此的寡核苷酸。可能需要例如藉由在區域101中沿第一方向且在區域102中沿相反方向對擴增子執行SBS讀段，且隨後使用軟體比對結果（該等結果應彼此互補且因此指示彼此相同的序列）來對區域101、102兩者中之相同目標聚核苷酸之擴增子執行同步成對末端讀段以便增強讀段之可靠性。如圖1所示，對基板區域102（或等效地基板區域101）上之種子111（目標聚核苷酸）之捕獲及擴增可得到實質上覆蓋第一區域121及第二區域122且可容易地用於同步成對末端讀段的單株簇。
以不同方式（諸如在基板之不同區域提供不同寡核苷酸）使基板之不同區域官能化可促進製備適用於同步成對末端讀段的靶核苷酸簇。舉例而言，圖2A至圖2D示意性地示出用於在基板之第一區域及第二區中使用不同寡核苷酸擴增聚核苷酸的製程流程中之實例組合物及操作。首先參考圖2A，組合物2000包括基板200及與其耦合的複數個寡核苷酸，諸如引子。在此實例中，基板200包括第一區域201及第二區域202，其可與其間之界面203彼此鄰接。第一區域201及第二區域202可以不同方式官能化，更特定言之具有與其耦合之不同捕獲引子。舉例而言，捕獲引子231可與基板200之第一區域201耦合，且捕獲引子241可與基板200之第二區域202耦合。捕獲引子231及241可具有彼此相同的序列，但捕獲引子241可包括可以下文參考圖2D所描述的方式使用之切除部分243。正交捕獲引子232可與基板200之第一區域201耦合，且正交捕獲引子242可與基板之第二區域202耦合。正交捕獲引子232及242可具有彼此相同的序列，但正交捕獲引子232可包括可以下文參考圖2D所描述之方式使用的切除部分233。切除部分233、243可沿任何適合引子之長度位於任何適合位置處且可(但不必一定)為彼此相同類型之切除部分。
如圖2A所示，組合物2000進一步可包括流體220，其包括目標聚核苷酸251，例如待擴增且最終定序之聚核苷酸。目標聚核苷酸251可包括與正交捕獲引子232、242互補之第一轉接子254，及與捕獲引子231、241互補之第二轉接子255。捕獲引子（例如，正交捕獲引子232及242）中之一或多者可包括切除部分，諸如可以如參考圖2D所描述之方式裂解的8-側氧基-G。
如圖2B中所示，目標聚核苷酸251之轉接子254可與區域201中之捕獲引子232隨機雜交，但等效地可與區域202中之捕獲引子242雜交。在此初始雜交之後，第一目標聚核苷酸251可使用諸如本領域中已知之方法擴增，例如使用表面結合聚合酶鏈反應（PCR）、橋式擴增或可稱為ExAmp之股侵入方法，從而形成圖2C中所示之擴增子251'。若重複擴增操作直至第一基板區域201及第二基板區域202經實質上填滿，則所得擴增子之兩個轉接子可能未必與對應捕獲引子或正交捕獲引子雜交，且因此擴增子可線性地延伸遠離基板，如圖2C中所示。接著可藉由使適合之酶或試劑與切除部分233反應來移除正交捕獲引子232之部分，且可藉由使適合之酶或試劑與切除部分243反應來移除捕獲引子241之部分。同切除部分233一起使用之酶或試劑可與同切除部分243一起使用之酶或試劑相同或不同。如圖2D中所示，切除部分233之反應移除第一基板區域201中之一個定向的聚核苷酸，且切除部分234之反應移除第二基板區域202中之另一定向的聚核苷酸，使得可在兩個基板區域中執行同步成對末端讀段。
本申請案提供使不同寡核苷酸（例如，不同引子）與彼此不同之聚合物區域耦合之方法的非限制性實例，例如用於形成參考圖1描述之區域101及102或用於形成參考圖2描述之區域201及202，且亦提供聚合物及形成此類聚合物之方法。
首先，將簡要解釋本文中所使用之一些術語。接著，將描述用於使寡核苷酸與聚合物耦合之一些實例方法及所得組合物，接著描述用於形成聚合物之一些實例方法及所得聚合物。
術語
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如一般技術者通常理解相同之含義。術語「包括（including）」以及諸如「包括（include/includes/included）」之其他形式的使用不具限制性。術語「具有（having）」以及諸如「具有（have/has/had）」之其他形式的使用不具限制性。如在本說明書中所使用，無論在申請專利範圍之過渡片語或主體中，術語「包含（comprise/comprising）」應理解為具有開放式含義。亦即，上述術語將與片語「至少具有」或「至少包括」同義地解譯。舉例而言，當在方法之情形下使用時，術語「包含」意謂該方法至少包括所敍述步驟，但可包括額外步驟。當用於化合物、組合物或裝置之情形下時，術語「包含」意謂該化合物、組合物或裝置至少包括所敍述之特徵或組分，但亦可包括額外特徵或組分。
本說明書通篇所使用之術語「實質上」、「大約」及「約」用於描述且解釋諸如歸因於處理變化之較小波動。舉例而言，該等較小波動可指小於或等於±10%，諸如小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%，諸如小於或等於±1%，諸如小於或等於±0.5%，諸如小於或等於±0.2%，諸如小於或等於±0.1%，諸如小於或等於±0.05%。
如本文中所使用，「光引發劑」用於意指當暴露於輻射時形成反應性物種（自由基、陽離子或陰離子）之分子的光引發劑。光引發劑之非限制性實例包括苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
如本文中所使用，「雜交」欲意謂使第一聚核苷酸與第二聚核苷酸沿彼等聚合物之長度非共價締合以形成雙股「雙螺旋體」。舉例而言，兩個DNA聚核苷酸股可經由互補鹼基配對締合。第一聚核苷酸與第二聚核苷酸之間的締合強度隨彼等聚核苷酸內之核苷酸序列之間的互補性而增加。聚核苷酸之間的雜交強度可由解鏈溫度（Tm）表徵，在該解鏈溫度下，50%雙螺旋體具有彼此解離之聚核苷酸股。彼此「部分」雜交之聚核苷酸意謂其具有彼此互補之序列，但此類序列沿其長度之僅一部分彼此雜交以形成部分雙螺旋體。「不能」雜交之聚核苷酸包括彼此實體上分離，使得其不足數目之鹼基可以使得彼此雜交之方式彼此接觸之聚核苷酸。
如本文中所使用，術語「核苷酸」欲意謂包括糖及至少一個磷酸酯基且在一些實例中亦包括核鹼基之分子。缺乏核鹼基之核苷酸可稱為「無鹼基」。核苷酸包括去氧核糖核苷酸、經修飾去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核糖核苷酸、肽核苷酸、經修飾肽核苷酸、經修飾磷酸酯糖主鏈核苷酸及其混合物。核苷酸之實例包括單磷酸腺苷（AMP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、單磷酸胸苷（TMP）、二磷酸胸苷（TDP）、三磷酸胸苷（TTP）、單磷酸胞苷（CMP）、二磷酸胞苷（CDP）、三磷酸胞苷（CTP）、單磷酸鳥苷（GMP）、二磷酸鳥苷（GDP）、三磷酸鳥苷（GTP）、單磷酸尿苷（UMP）、二磷酸尿苷（UDP）、三磷酸尿苷（UTP）、單磷酸去氧腺苷（dAMP）、二磷酸去氧腺苷（dADP）、三磷酸去氧腺苷（dATP）、單磷酸去氧胸苷（dTMP）、二磷酸去氧胸苷（dTDP）、三磷酸去氧胸苷（dTTP）、二磷酸去氧胞苷（dCDP）、三磷酸去氧胞苷（dCTP）、單磷酸去氧鳥苷（dGMP）、二磷酸去氧鳥苷（dGDP）、三磷酸去氧鳥苷（dGTP）、單磷酸去氧尿苷（dUMP）、二磷酸去氧尿苷（dUDP）及三磷酸去氧尿苷（dUTP）。
如本文中所使用，術語「核苷酸」亦意欲涵蓋為與天然存在之核苷酸相比包括經修飾核鹼基、糖及/或磷酸酯部分之核苷酸類型的任何核苷酸類似物。實例經修飾核鹼基包括肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、2-胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、2-胺基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鳥嘌呤、2-丙基鳥嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-鹵基尿嘧啶、15-鹵基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-鹵基腺嘌呤或鳥嘌呤、8-胺基腺嘌呤或鳥嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鳥嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤或鳥嘌呤、8-羥基腺嘌呤或鳥嘌呤、經5-鹵基取代之尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥嘌呤、8-氮腺嘌呤、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鳥嘌呤、3-去氮腺嘌呤或類似者。如本領域中所已知，某些核苷酸類似物不可併入至聚核苷酸中，例如核苷酸類似物，諸如5'-磷醯硫酸腺苷。核苷酸可包括任何適合數目之磷酸酯，例如三種、四種、五種、六種或超過六種磷酸酯。
如本文所使用之術語「聚核苷酸」係指包括彼此結合之核苷酸序列之分子。聚核苷酸為聚合物之一個非限制性實例。聚核苷酸之實例包括去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）及其類似物。聚核苷酸可為諸如RNA或單股DNA之單股核苷酸序列、諸如雙股DNA之雙股核苷酸序列，或可包括單股核苷酸序列與雙股核苷酸序列之混合物。雙股DNA（dsDNA）包括基因體DNA以及PCR及擴增產物。單股DNA（ssDNA）可轉化為dsDNA，且反之亦然。聚核苷酸可包括非天然存在之DNA，諸如對映異構DNA。聚核苷酸中之精確核苷酸序列可為已知或未知的。以下為聚核苷酸之實例：基因或基因片段（例如，探針、引子、經表現序列標籤（EST）或基因表現系列分析（SAGE）標籤）、基因體DNA、基因體DNA片段、外顯子、內含子、信使RNA（mRNA）、轉移RNA、核糖體RNA、核糖核酸酶、cDNA、重組聚核苷酸、合成聚核苷酸、分支鏈聚核苷酸、質體、載體、具有任何序列之經分離DNA、具有任何序列之經分離RNA、核酸探針、引子或前述任一者之經擴增複本。
如本文中所使用，「聚合酶」欲意謂具有藉由將核苷酸聚合為聚核苷酸來裝配聚核苷酸之活性位點的酶。聚合酶可結合經引發單股目標聚核苷酸，且可將核苷酸依序添加至生長引子以形成具有與目標聚核苷酸之序列互補之序列的「互補複本」聚核苷酸。另一聚合酶或相同聚合酶接著可藉由形成彼互補複本聚核苷酸之互補複本來形成目標核苷酸之複本。此類複本中之任一者在本文中可稱為「擴增子」。DNA聚合酶可結合於目標聚核苷酸，且接著向下移動目標聚核苷酸，從而將核苷酸依序添加至生長聚核苷酸股（生長擴增子）之3'端處的游離羥基。DNA聚合酶可自DNA模板合成互補DNA分子，且RNA聚合酶可自DNA模板合成RNA分子（轉錄）。聚合酶可使用短RNA或DNA股（引子）來開始股生長。一些聚合酶可使位點上游之股移位，其中其將鹼基添加至鏈。此類聚合酶可稱為股移位，意謂其具有自模板股移除由聚合酶讀段之互補股的活性。具有股移位活性之實例聚合酶包括而不限於Bst（嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus））聚合酶、外切克列諾聚合酶（exo-Klenow polymerase）或定序級T7外切聚合酶之大片段。一些聚合酶將其前面的股降解，有效地用後面的生長鏈替換該股（5'外切核酸酶活性）。一些聚合酶具有降解其後面之股的活性(3'外切核酸酶活性)。一些適用的聚合酶已藉由突變或其他方式進行修飾，以降低或消除3'及/或5'外切核酸酶活性。
如本文所使用，術語「引子」定義為可經由游離3' OH基團添加核苷酸之聚核苷酸。引子可包括阻止聚合直至嵌段經移除之3'嵌段。引子可包括5'端處之修飾以允許耦合反應或將引子耦合至另一部分。引子可包括可在適合的條件下，諸如UV光、化學物質、酶或類似物下裂解之一或多個部分。引子長度可為任何適合數目之鹼基長度且可包括天然核苷酸與非天然核苷酸之任何適合組合。目標聚核苷酸可包括與引子雜交(具有與引子互補之序列)的「轉接子」，且可經擴增以便藉由將核苷酸添加至引子之游離3' OH基團來產生互補複本聚核苷酸。「捕獲引子」欲意謂耦合至基板且可與目標聚核苷酸之第二轉接子雜交的引子，而「正交捕獲引子」欲意謂耦合至基板且可與彼目標聚核苷酸之第一轉接子雜交的引子。第一轉接子可具有與正交捕獲引子之序列互補之序列，且第二轉接子可具有與捕獲引子之序列互補之序列。捕獲引子與正交捕獲引子可具有彼此不同且獨立的序列。另外，捕獲引子與正交捕獲引子可在至少一種其他特性方面彼此不同。舉例而言，捕獲引子與正交捕獲引子可具有彼此不同的長度；捕獲引子或正交捕獲引子可包括捕獲引子或正交捕獲引子中的另一者不具有的非核酸部分（諸如封端基團或切除部分）；或此類特性之任何適合組合。
如本文所用，術語「基板」係指用作本文所描述之組合物之支撐物的材料。實例基板材料可包括玻璃、二氧化矽、塑膠、石英、金屬、金屬氧化物、有機矽酸鹽（例如多面體有機倍半矽氧烷（POSS））、聚丙烯酸酯、氧化鉭、互補金屬氧化物半導體（CMOS）或其組合。POSS之實例可為Kehagias等人, Microelectronic Engineering 86 (2009),第776-778頁中所述之POSS，該參考文獻以全文引用的方式併入本文中。在一些實例中，本申請案中所使用之基板包括基於二氧化矽之基板，諸如玻璃、熔融二氧化矽或其他含二氧化矽材料。在一些實例中，基板可包括矽、氮化矽或氫化矽酮。在一些實例中，本申請案中所使用之基板包括塑膠材料或組分，諸如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、耐綸、聚酯、聚碳酸酯及聚(甲基丙烯酸甲酯)。實例塑膠材料包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯及環烯烴聚合物基板。在一些實例中，基板為或包括基於二氧化矽之物質或塑膠材料或其組合。在特定實例中，基板具有包含玻璃或基於矽之聚合物之至少一個表面。在一些實例中，基板可包括金屬。在一些此類實例中，金屬為金。在一些實例中，基板具有包含金屬氧化物之至少一個表面。在一個實例中，表面包含氧化鉭或氧化錫。丙烯醯胺、烯酮或丙烯酸酯亦可用作基板材料或組分。其他基板材料可包括但不限於砷化鎵、磷化銦、鋁、陶瓷、聚醯亞胺、石英、樹脂、聚合物及共聚物。在一些實例中，基板及/或基板表面可為或包括石英。在一些其他實例中，基板及/或基板表面可為或包括諸如GaAs或ITO之半導體。前述清單意欲說明但不限制本申請案。基板可包含單種材料或複數種不同材料。基板可為複合物或層壓物。在一些實例中，基板包含有機矽酸鹽材料。基板可為平坦、圓形、球形、棒狀或任何其他適合形狀。基板可為剛性或可撓性的。在一些實例中，基板為珠粒或流量槽。
在一些實施例中，基板包括圖案化表面。「圖案化表面」係指基板之暴露層中或暴露層上之不同區域的排列。舉例而言，區域中之一或多者可為其中存在一或多個捕獲引子之特徵。該等特徵可藉由其中不存在捕獲引子之間隙區域隔開。在一些實例中，圖案可為呈列及行形式的x-y格式之特徵。在一些實例中，圖案可為特徵及/或間隙區域之重複排列。在一些實例中，圖案可為特徵及/或間隙區域之隨機排列。在一些實施例中，基板包括在表面中之孔（凹陷）陣列。孔可藉由實質上豎直的側壁提供。孔可利用多種技術如此項技術中一般所已知來製造，該等技術包括但不限於光微影、衝壓技術、模製技術及微蝕刻技術。如熟習此項技術者將瞭解，所用技術將視陣列基板之組成及形狀而定。
基板之圖案化表面中的特徵可包括在玻璃、矽、塑膠或具有諸如本文所提供之圖案化聚合物的其他適合之材料上呈孔（例如，微孔或奈米孔）陣列形式的孔。在一個實例中，聚合物包括共價連接之凝膠，諸如聚(N-(5-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)（PAZAM）。圖案化可提供可用於定序之聚合物襯墊，該等聚合物襯墊在具有多個循環之定序操作內可為穩定的。在一些實例中，聚合物與孔之共價連接可有助於在多次使用期間在結構化基板之整個使用壽命中維持結構化特徵（例如，孔）中之聚合物。然而，在一些實例中，聚合物不必共價連接至孔。
在特定實例中，結構化基板可藉由以下製造：以孔（例如微孔或奈米孔）圖案化由適合之材料形成之基板；用聚合物材料塗佈基板材料；及例如經由化學或機械拋光來拋光聚合物塗佈材料之表面，從而將聚合物保持在孔中，但自孔之間的結構化基板之表面上的間隙區域將實質上所有之聚合物移除或不活化。引子可例如以諸如本文所提供之方式連接至聚合物材料。接著可使包括複數種目標聚核苷酸（例如，片段化人類基因體或其部分）之溶液與經拋光之基板接觸，使得個別目標聚核苷酸將經由與連接至聚合物材料之引子相互作用而接種個別孔；然而，歸因於聚合物材料之不存在或不活化，目標聚核苷酸將不佔據間隙區域。目標聚核苷酸之擴增可受限於孔，此係因為間隙區域中聚合物之不存在或不活化可能抑制生長簇向外遷移。製程可方便地製造，為可調且利用習知微米或奈米製造方法。
圖案化基板可包括例如蝕刻成載片或晶片之孔。該等孔之蝕刻圖案及幾何形狀可呈多種不同形狀及大小，且此類特徵可在實體上或功能上彼此分離。尤其適用的具有此類結構特徵之基板包括可選擇固體粒子（諸如微球粒）之大小的圖案化基板。具有此等特性之實例圖案化基板為與珠粒陣列技術（BEAD ARRAY technology）（Illumina公司, San Diego, Calif.）結合使用的經蝕刻基板。
在一些實例中，本文所描述之基板形成流量槽之至少一部分或位於流量槽中或耦合至流量槽。流量槽可包括分為複數個單向通道或複數個扇區之流量腔室。可用於本文中所闡述之方法及組合物中的實例流量槽及用於製造流量槽之基板包括但不限於可商購自Illumina公司（San Diego, CA）之流量槽及基板。
如本文所使用，當參考覆蓋基板之表面的層使用的術語「直接」欲意謂該等層覆蓋基板之表面而無明顯中間層，諸如黏著層或聚合物層。直接覆蓋表面之層可經由任何化學或物理相互作用，包括共價鍵或非共價黏附而連接至此表面。
如本文所使用，當參考聚核苷酸使用時之術語「固定」欲意謂經由共價或非共價鍵直接或間接連接至基板。在某些實例中，可使用共價連接或任一其他適合之連接，其中在意欲在例如聚核苷酸擴增或定序中使用基板的條件下聚核苷酸保持固定或連接至基板。待用作捕獲引子或目標聚核苷酸之聚核苷酸可經固定，使得3'端可用於酶促延伸且序列之至少一部分能夠與互補序列雜交。固定可經由與表面連接之寡核苷酸雜交而發生，在此情況下，固定之寡核苷酸或聚核苷酸可呈3'-5'定向。替代地，固定可藉由除鹼基配對雜交以外之手段，諸如共價連接發生。
如本文所使用，術語「陣列」係指可根據相對位置彼此區分的基板區域群。位於陣列之不同區域處之不同分子（諸如聚核苷酸）可根據區域在陣列中之位置而彼此區分。陣列之個別區可包括一或多個特定類型的分子。舉例而言，基板區可包括具有特定序列之單一目標聚核苷酸，或基板區可包括具有相同序列（或其互補序列）之若干聚核苷酸。陣列之區可分別包括同一基板上之彼此不同的特徵。例示性特徵包括（但不限於）基板中之孔、基板中或基板上之珠粒（或其他顆粒）、基板之凸起、基板之脊線或基板中之通道。陣列之區域可分別包括不同基板上之彼此不同的區。連接至各別基板之不同分子可根據基板在與基板相關的表面上之位置或根據基板在液體或凝膠中之位置來鑑別。各別基板位於表面上之例示性陣列包括（但不限於）在孔中具有珠粒的陣列。
如本文中所使用，術語「複數個」欲意謂兩個或更多個不同成員之群體。複數個之大小可介於較小、中等、較大至極大之範圍內。較小複數個之大小可介於例如幾個成員至數十個成員之範圍內。中等大小之複數個可介於例如數十個成員至約100個成員或數百個成員之範圍內。較大複數個可介於例如約數百個成員至約1000個成員、至數千個成員且至多數萬個成員之範圍內。極大複數個可介於數萬個成員至約數十萬、百萬、數百萬、數千萬且至多或大於數億個成員之範圍內。因此，複數個之大小可介於兩個至遠超一億個成員之範圍內，以及如藉由成員數目所量測的在以上實例範圍之間且大於以上實例範圍的所有大小。實例聚核苷酸複數個包括例如約1×10 5個或更多個、5×10 5個或更多個或1×10 6個或更多個不同聚核苷酸之群體。因此，術語之定義意欲包括大於二的所有整數值。複數個之上限可例如藉由樣本中之聚核苷酸序列的理論多樣性來設定。
如本文所使用，當參考聚核苷酸使用的術語「雙股」欲意謂聚核苷酸中之全部或實質上全部核苷酸為結合至互補聚核苷酸中之各別核苷酸的氫。
如本文所使用，當參考聚核苷酸使用的術語「單股」欲意謂聚核苷酸中基本上無一者為結合至互補聚核苷酸中之各別核苷酸的氫。
如本文中所使用，術語「目標聚核苷酸」欲意謂為分析或作用之目標的聚核苷酸。分析或作用包括使聚核苷酸經歷擴增、定序及/或其他程序。目標聚核苷酸可包括待分析之目標序列以外的核苷酸序列。舉例而言，目標聚核苷酸可包括一或多個轉接子，包括充當引子結合位點、側接待分析之目標聚核苷酸序列的轉接子。與捕獲引子雜交之目標聚核苷酸可包括以使得並非所有目標聚核苷酸能夠延伸之方式延伸超出捕獲寡核苷酸的5'或3'端之核苷酸。在特定實例中，目標聚核苷酸可具有彼此不同的序列，但可具有彼此相同的第一區域及第二銜接子。可側接特定目標聚核苷酸序列之兩個轉接子可具有彼此相同的序列或彼此互補的序列，或兩個轉接子可具有不同序列。因此，多種目標聚核苷酸中之物質可包括側接待藉由例如定序（例如SBS）評估之未知序列區的已知序列區。在一些實例中，目標聚核苷酸在單一端處攜載轉接子，且此類轉接子可位於3'端或5'端目標聚核苷酸處。目標聚核苷酸可在無任何轉接子的情況下使用，在此情況下，引子結合序列可直接來自目標聚核苷酸中發現的序列。
術語「聚核苷酸」與「寡核苷酸」在本文中可互換使用。除非另外特定指示，否則不同術語並不意欲表示大小、序列或其他特性之任何特定差異。為了描述清楚起見，當描述包括若干聚核苷酸物種之特定方法或組合物時，該等術語可用於區分一種聚核苷酸物種與另一種聚核苷酸物種。
如本文所使用，當參考聚核苷酸使用時的術語「擴增子」欲意謂複製聚核苷酸之產物，其中該產物具有與聚核苷酸之至少一部分核苷酸序列大體上相同或大體上互補的核苷酸序列。「擴增（Amplification）」及「擴增（amplifying）」係指製得聚核苷酸之擴增子的過程。目標聚核苷酸之第一擴增子可為互補複本。額外擴增子為在第一擴增子產生之後由目標聚核苷酸或由第一擴增子產生的複本。後續擴增子可具有與目標聚核苷酸大體上互補或與目標聚核苷酸大體上一致的序列。將理解，當產生彼聚核苷酸之擴增子時，可能發生聚核苷酸之少數突變（例如，歸因於擴增偽影）。
如本文中所使用，術語「非活性部分」欲意謂在指定條件設定下實質上與第二化學實體不具反應性的第一化學實體。如本文中所使用，術語「活性部分」欲意謂在指定條件設定下與第二化學實體具有反應性的第三化學實體。第一化學實體可轉化成第三化學實體，因此將非活性部分轉化成活性部分。
如本文中所使用，用光「選擇性地照射」要素之一部分欲意謂實質上僅要素之彼部分用光照射，而要素之其他部分不用光照射。用光選擇性地照射要素之一部分的方式之非限制性實例為遮罩待照射之要素的其他部分，且隨後照射整個要素或其包括將選擇性照射之部分的任何合適部分。用光選擇性地照射要素之一部分的方式之另一非限制性實例為視情況與一或多個諸如光耦合光柵的其他元件組合使用光聚焦光學件，以諸如PCT公開案第WO 2021/028815號且名稱為「用於圖案化流量槽基板之系統及方法（System and Method for Patterning Flow Cell Substrates）」中所描述之方式，該公開案之全部內容以引用之方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「遮罩」欲意謂抑制光透射至實體之光學組件，而術語「無遮罩」欲意謂移除此光學組件以便允許光透射至該實體。
如本文中所使用，術語「光」係指在電磁頻譜內之電磁輻射的任何波長，包括由人類眼睛可察覺以及不可察覺的電磁輻射。光之類型包括但不限於可見光、紅外光及/或紫外光（UV）。
使寡核苷酸與引子耦合之方法
本文所提供之一些實例係關於提供在聚合物之產生簇之一或多個區域中具有所選特性的捕獲引子。本文中之實例尤其較適合於產生用於同步成對末端讀段中的簇，其中在聚合物之第一區中使用SBS對擴增之聚核苷酸序列進行讀段，且彼此並行地在聚合物之第二區中使用SBS對該聚核苷酸之互補序列進行讀段，但應理解該等實例通常適用於任何類型的簇，且實際上適用於可能需要耦合任何類型的寡核苷酸的任何聚合物。
舉例而言，圖3A至圖3M示意性地示出用於使不同寡核苷酸與安置於基板上之聚合物之第一區域及第二區域耦合的製程流程中之實例組合物及操作。在一實例中，圖3A中所示之組合物3000包括基板310及包括安置於（例如，固定於）基板310上之主鏈311及與主鏈311之非活性部分312耦合的聚合物。以諸如圖3A中所示之方式，聚合物之第一區域321中的非活性部分312可用光（如藉由向下箭頭所指示）選擇性地照射，而不照射聚合物之第二區域322中的非活性部分312。舉例而言，可使用遮罩360（如藉由阻斷向下箭頭之遮罩所指示）遮罩第二區域322。以諸如圖3B中所示之方式，光可在聚合物之第一區域中產生第一活性部分313，例如可將聚合物之第一區域中的非活性部分312轉化成活性部分。就此而言，光可具有適用於執行此類轉化之波長及強度，例如可在約365 nm至約450 nm範圍內以便具有足夠高頻率以進行轉化而實質上不破壞寡核苷酸。本文中其他處提供耦合至可使用光轉化成活性部分之非活性部分的聚合物主鏈之非限制性實例。視情況，在用光選擇性地照射區域321之前，光阻劑可沈積於此區域上方且可增加照射區域321而保持不照射區域233的準確度。接著在使聚合物與流體320接觸之前，可例如使用適合之溶劑移除光阻劑。在一些實例中，自第一區域321移除經照射光阻劑且以彼此不同的步驟或以彼此共用的步驟自第二區域322移除未照射之光阻劑。
第一活性部分313接著可與第一寡核苷酸耦合。舉例而言，以諸如圖3C中所示之方式，第一活性部分313及非活性部分312可與流體320接觸。在所示之實例中，流體320包括對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸231的寡核苷酸331及對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸232的寡核苷酸332的混合物。寡核苷酸332可包括切除部分333，而寡核苷酸331可缺乏切除部分。各寡核苷酸331、332可包括可與第一活性部分313反應且實質上可不與非活性部分312反應的反應性基團323。因此，以諸如圖3D中所示之方式，寡核苷酸331、332之混合物可變成與區域321內之聚合物耦合，而寡核苷酸可變成不與區域322內之聚合物耦合。本文其他處提供可用於與活性部分反應且實質上不與非活性部分反應的反應性基團之非限制性實例。
儘管可預期區域321內之實質上所有第一活性基團313與反應性基團323完全反應且因此變得不可用於任何後續反應，但可視情況進行額外「封端」反應，其中任何剩餘的第一活性基團313與額外試劑接觸，與此類第一活性基團反應且因此變得不可用於任何後續反應。說明性地，「封端」反應可包括添加單官能疊氮基分子，諸如聚乙二醇-疊氮化物（PEG-疊氮化物）、1-疊氮基己烷、3-疊氮基丙酸、3-疊氮基丙-1-醇或類似者，或添加與諸如1-己烯-6-醇或5-己烯酸之烯烴反應的活性基團。
接著可照射聚合物之第二區域322。舉例而言，以諸如圖3E中所示之方式，可不遮罩聚合物之第二區域322，且聚合物之第二區域中的非活性部分312可用光照射以在聚合物之第二區域中產生第二活性部分314，諸如圖3F中所示。第二活性部分314可與第一活性部分313在化學上一致，但在聚合物之不同區域322中。在一些實例中，區域321可與區域322同時用光照射，例如因為區域321中之任何非活性部分312已轉化成活性部分313且實質上與反應性基團323或視情況選用之封端試劑完全反應。然而，應瞭解可選擇性地照射區域322，例如可視情況遮罩區域321而用光照射區域322，例如以抑制光降解寡核苷酸331、332。另外或可替代地，光之波長可經選擇以便抑制寡核苷酸之光誘發性降解，例如可在約365 nm至約450 nm範圍內。
第二活性部分314接著可與第二寡核苷酸耦合。舉例而言，以諸如圖3C中所示之方式，第二活性部分314以及寡核苷酸331、332可與流體320'接觸。在所示之實例中，流體320'包括對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸241的寡核苷酸341及對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸242的寡核苷酸342的混合物。寡核苷酸342可包括切除部分343，而寡核苷酸341可缺乏切除部分。各寡核苷酸341、342可包括可與第二活性部分314反應且可為與圖3C中所示之操作期間所使用相同類型之反應性基團的反應性基團323。因此，以諸如圖3H中所示之方式，寡核苷酸341、342之混合物可變成與區域322內之聚合物耦合，而寡核苷酸331、332可保持與區域321內之聚合物耦合。圖3H中所示之所得組合物3001可包括對應於參考圖1所描述之聚合物區域101及參考圖2A所描述之聚合物區域201的聚合物區域301，及對應於參考圖1所描述之聚合物區域102及參考圖2A所描述之聚合物區域202的聚合物區域302，且可用於以如參考圖1及圖2A至圖2D所描述的類似方式擴增目標聚核苷酸。
在另一實例中，圖3J中所示之組合物3000包括基板310及包括安置於（例如，固定於）基板310上之主鏈311及與主鏈311之部分315耦合的聚合物。以諸如圖3J中所示之方式，聚合物之第一區域321中的部分315可用光（如藉由向下箭頭所指示）選擇性地照射，而不照射聚合物之第二區域322中的部分315。舉例而言，可使用遮罩360（如藉由阻斷向下箭頭之遮罩所指示）遮罩第二區域322。在照射期間，聚合物之第一區域321中及聚合物之第二區域322中的部分315可與流體330接觸。在所示之實例中，流體330包括對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸231的寡核苷酸331及對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸232的寡核苷酸332的混合物。寡核苷酸332可包括切除部分333，而寡核苷酸331可缺乏切除部分。流體330亦包括光引發劑。各寡核苷酸331、332可包括在存在光引發劑及具有適當波長及強度之照射的情況下可與部分315反應的反應性基團324，諸如在聚合物照射時之活性區域321中但實質上不在聚合物之非活性區域322中（當不照射聚合物之非活性區域322時，諸如遮罩時）。
就此而言，光可具有適用於進行此類轉化之波長及強度，例如可在約245 nm至約400 nm範圍內以便具有足夠高頻率以引起寡核苷酸332之反應性基團324與聚合物之活性區域321之間的反應但實質上不引起寡核苷酸332之反應性基團324與聚合物之活性區域322之間的反應。本文其他處提供耦合至在存在光引發劑之情況下、在存在光及此類光引發劑之情況下可與反應性基團324反應的部分315的聚合物主鏈之非限制性實例。視情況，在用光選擇性地照射區域321之前，光阻劑可沈積於此區域上方且可增加照射區域321而不照射非活性區域322的準確度。接著在使聚合物與流體330接觸之前，可例如使用適合之溶劑移除光阻劑。在一些實例中，自第一區域321移除經照射之光阻劑且以彼此不同的步驟或以彼此共用的步驟自第二區域322移除未照射之光阻劑。因此，以諸如圖3K中所示之方式，寡核苷酸331、332之混合物可變成與區域321內之聚合物耦合，而寡核苷酸可變成不與區域322內之聚合物耦合。
接著可照射聚合物之第二區域322。舉例而言，以諸如圖3L中所示之方式，可不遮罩聚合物之第二區域322，且可用光照射聚合物之第二區域322中的部分315。在照射期間，聚合物之第一區域322中及聚合物之第二區域322中的部分315可與流體330'接觸。在所示之實例中，流體330'包括對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸241的寡核苷酸341及對應於參考圖2A所描述之寡核苷酸232的寡核苷酸342的混合物。寡核苷酸342可包括切除部分343，而寡核苷酸341可缺乏切除部分。流體330'亦包括光引發劑。各寡核苷酸341、342可包括在存在光引發劑及適當波長及強度之照射（諸如在根據圖3L的聚合物照射時之區域322中）的情況下可與部分315反應的反應性基團324。
流體330中包括之光引發劑可與流體330'中包括之光引發劑相同，或各流體330、330'可包括未包括在其他流體330、330'中之光引發劑。在一些實例中，聚合物之第二區域322中的部分315'(圖中未示）可不同於聚合物之第一區域321中的部分315。在一些實例中，流體330之寡核苷酸331及332之反應性基團324可不同於流體330'之寡核苷酸341及342之反應性基團324'（圖中未示）。在一些實例中，流體330之寡核苷酸331及332之反應性基團324可在照射時在存在流體330之光引發劑之情況下但實質上不暴露於流體330'之光引發劑時與聚合物之部分315反應。在一些實例中，流體330'之寡核苷酸341及342之反應性基團324'（圖中未示）可在照射時在存在流體330'之光引發劑之情況下但實質上不暴露於流體330之光引發劑時與聚合物之部分315'（圖中未示）反應。
在一些實例中，區域321可與區域322同時用光照射，例如因為區域321中之任何部分315已實質上與反應性基團324完全反應。然而，應瞭解可選擇性地照射區域322，例如可視情況遮罩區域321而用光照射區域322，例如以抑制光降解寡核苷酸331、332。另外或可替代地，光之波長可經選擇以便抑制寡核苷酸之光誘發性降解，例如可在約245 nm至約400 nm範圍內。因此，以諸如圖3M中所示之方式，寡核苷酸341、342之混合物可變成與區域322內之聚合物耦合，而寡核苷酸331、332可保持與區域321內之聚合物耦合。圖3H中所示之所得組合物3001可包括對應於參考圖1所描述之聚合物區域101及參考圖2A所描述之聚合物區域201的聚合物區域301，及對應於參考圖1所描述之聚合物區域102及參考圖2A所描述之聚合物區域202的聚合物區域302，且可用於以如參考圖1及圖2A至圖2D所描述的類似方式擴增目標聚核苷酸。
可使用可以諸如參考圖3A至圖3B所描述之方式在存在光引發劑之情況下與反應性基團324反應且以諸如參考圖3E至圖3F所描述之方式於活性部分314反應的任何適合之部分315。例示性地，非活性部分312可包括具有以下結構之鄰硝基苯甲基：
Figure 02_image068
，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-且R 1為與聚合物之主鏈之鍵聯。用紫外（UV）光（例如，約365 nm及適合之強度）照射引起鄰硝基苯甲基損失以形成活性部分三唑：
Figure 02_image007
，其中Y包括選自胺及硫醇之主鏈反應性基團。
在一實例中，Y包括胺。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為N-羥基丁二醯亞胺酯（NHS），諸如具有結構
Figure 02_image071
，或羧酸，或羧酸與碳化二亞胺，諸如1-乙基-3-(-3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC）反應以形成鄰醯基異脲，諸如具有結構
Figure 02_image072
。NHS或羧酸或鄰醯基異脲可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image009
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為乙烯基碸。
乙烯基碸可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image011
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為順丁烯二醯亞胺。
順丁烯二醯亞胺可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image013
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為丙烯醯胺。
丙烯醯胺可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image015
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
例示性地，非活性部分312可包括具有以下結構之鄰硝基苯甲基：
Figure 02_image003
，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-且R 1為與聚合物之主鏈之鍵聯。用紫外（UV）光（例如，約365 nm及適合之強度）照射引起鄰硝基苯甲基損失以形成活性部分三唑：
Figure 02_image007
，其中Y包括選自胺及硫醇之主鏈反應性基團。
在一實例中，Y包括胺。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為N-羥基丁二醯亞胺酯（NHS），諸如具有結構
Figure 02_image071
，或羧酸，或羧酸與碳化二亞胺，諸如1-乙基-3-(-3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC）反應以形成鄰醯基異脲，諸如具有結構
Figure 02_image072
。NHS或羧酸或鄰醯基異脲可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image009
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為乙烯基碸。
乙烯基碸可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image011
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為順丁烯二醯亞胺。
順丁烯二醯亞胺可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image013
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為丙烯醯胺。
丙烯醯胺可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image015
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
例示性地，非活性部分312可包括具有以下結構之苯并哌喃酮：
Figure 02_image005
，其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-且R 1為與聚合物之主鏈之鍵聯。用紫外（UV）光（例如，約365 nm及適合之強度）照射引起苯并哌喃酮損失以形成活性部分三唑：
Figure 02_image007
，其中Y包括選自胺及硫醇之主鏈反應性基團。
在一實例中，Y包括胺。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為N-羥基丁二醯亞胺酯（NHS），諸如具有結構
Figure 02_image071
，或羧酸，或羧酸與碳化二亞胺，諸如1-乙基-3-(-3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC）反應以形成鄰醯基異脲，諸如具有結構
Figure 02_image072
。NHS或羧酸或鄰醯基異脲可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image009
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為乙烯基碸。
乙烯基碸可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image011
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為順丁烯二醯亞胺。
順丁烯二醯亞胺可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image013
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，Y包括硫醇。以諸如上文參考圖3C所描述之方式與流體320中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團323，以及以諸如參考圖3G所描述之方式與流體320'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團323可為丙烯醯胺。
丙烯醯胺可與胺反應以形成結構：
Figure 02_image015
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
例示性地，部分315可包括具有以下結構之烯烴：
Figure 02_image017
，其中Z包括烷烴，該烷烴包括CH 2-、(CH 2)m及(-CH 2-O-)n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且R 1為與聚合物之主鏈的鍵聯，且反應性基團324可包括硫醇。以諸如上文參考圖3J所描述之方式與流體330中之寡核苷酸331、332耦合的反應性基團，以及以諸如參考圖3L所描述之方式與流體330'中之寡核苷酸341、342耦合的反應性基團324可為硫醇基。在存在光引發劑之情況下用紫外（UV）光（例如，約245 nm至約400 nm，處於適合之強度）照射可引起反應性硫醇基324與活性部分315之烯烴反應以形成結構：
Figure 02_image019
，其中R 6表示寡核苷酸，由此使寡核苷酸與聚合物耦合。
在一實例中，光引發劑可選自以下中之一或多者：苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
前述實例說明在基板之頂側上的照射。如本文進一步揭示，在一些實例中，可照射基板之底側。前述實例什麼遮罩聚合物之區域。如本文進一步揭示，在一些實例中，可照射基板之底側且基板之一部分可減少或防止照射聚合物之一部分。如本文進一步揭示，在一些實例中，照射基板之底側之實例可適用於替代照射基板之頂表面而遮罩聚合物之區域。
可包括可諸如以上例示使用光轉化成活性部分之非活性部分的聚合物之非限制性實例及製備此類聚合物之方法更詳細地提供於本文中之其他處。
儘管參考圖3A至圖3M所描述之實例可表明使用具有彼此鄰接之第一區域及第二區域的平坦基板，但應清楚可使用更複雜的基板。舉例而言，圖4A至圖4E示意性地示出用於使不同寡核苷酸與安置於基板上之聚合物之第一區域及第二區域陣列耦合的製程流程中之實例組合物及操作。可以與參考圖3A至圖3M所描述之彼等類似的方式製備且使用諸如參考圖4A至圖4E所描述之組合物。
在圖4A中之平面視圖中所示之實例中，其部分以截面視圖展示於圖4B中，基板450可包括複數個豎直側壁403，從而提供其各者內可安置聚合物的孔451之陣列，例如包括諸如參考圖3A至圖3M所描述及如本文中其他處所例示之主鏈411及非活性部分412。孔451之陣列內之聚合物可經遮罩，或另外以任何適合方式選擇性地照射以便僅照射各孔內之聚合物之一部分。舉例而言，複數個平行細長的遮罩460可延伸跨越多個孔451且因此遮罩多個孔之區域，同時以諸如圖4C中所示之方式使區域421暴露於照射。接著可進行諸如參考圖3A至圖3M所描述之製程以便獲得孔451之陣列，諸如圖4D中之平面視圖所示，其部分以橫截面視圖展示於圖4E中。各孔451內可安置可與參考圖1、圖2A至圖2D及圖3H各別描述之聚合物區域101、201及301類似組態的第一聚合物區域401，及可與參考圖1、圖2A至圖2D及圖3H各別描述之聚合物區域102、202及302類似組態且使用的聚合物區域402。因此，可認為聚合物之第一區域包括複數個第一子區域401，且可認為聚合物之第二區域包括複數個第二子區域402。以諸如圖4D中所示之方式，第一子區域401中之各者可與第二子區域402中之對應者相鄰。另外，以諸如圖4D中所示之方式，第一子區域401中之各者及與第一子區域相連的第二子區域402中之對應者位於孔451內。
圖5示出用於使不同寡核苷酸與聚合物之第一區域及第二區域耦合的方法中的實例操作流程。圖5中所示之方法500可包括用光選擇性地照射聚合物之第一區域中的非活性部分，而不照射該聚合物之第二區域中的非活性部分，以在該聚合物之該第一區域中產生第一活性部分（操作510）。參考圖3A至圖3M及圖4C描述此選擇性照射之非限制性實例。圖5中所示之方法500亦可包括使第一活性部分與第一寡核苷酸耦合（操作520）。圖5中所示之方法500亦可包括用光照射聚合物之第二區域中的非活性部分以在聚合物之第二區域中產生第二活性部分（操作530）。參考圖3E至圖3F描述此照射之非限制性實例。圖5中所示之方法500亦可包括使第二活性部分與第二寡核苷酸耦合（操作540）。如所描述，其他實例可包括用於使寡核苷酸與聚合物之區域在存在光引發劑之情況下在空間上選擇性耦合的選擇性照射。
聚合物及製備聚合物之方法
上文參考圖3A至圖3M提供可使用光轉化成活性部分之非活性部分及可與此活性部分反應以使寡核苷酸與聚合物耦合或在存在光引發劑及光之情況下與部分反應以使寡核苷酸與聚合物耦合的反應性基團的非限制性實例。現將描述形成包括此類部分（包括非活性部分）之聚合物之方法及所得聚合物的一些非限制性實例。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚(鄰硝基苯甲基遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image088
，
其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，X係選自-S及-N(H)-，Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image029
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。應注意，鄰硝基苯甲基遮罩之三唑可具有任何適合之結構，諸如上文進一步描述以形成鄰硝基苯甲基遮罩之三唑官能性單體的任何適合共聚物，且不限於此特定實例。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚(苯并哌喃酮遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image027
，
其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，X係選自-S及-N(H)-，Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image029
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。應注意，鄰硝基苯甲基遮罩之三唑可具有任何適合之結構，諸如上文進一步描述以形成鄰硝基苯甲基遮罩之三唑官能性單體的任何適合共聚物，且不限於此特定實例。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚(苯并哌喃酮遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image031
，
其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br，X係選自-S及-N(H)-，Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。應注意，苯并哌喃酮遮罩之三唑可具有任何適合之結構，諸如上文進一步描述以形成苯并哌喃酮遮罩之三唑官能性單體的任何適合共聚物，且不限於此特定實例。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚(胺基三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image035
，
Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚(硫代三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image037
，
Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，製備聚合物之方法包括光誘發性反應：
Figure 02_image039
Figure 02_image041
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，製備聚合物之方法包括光誘發性反應：
Figure 02_image043
Figure 02_image045
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，製備聚合物之方法包括光誘發性反應：
Figure 02_image048
Figure 02_image041
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，製備聚合物之方法包括光誘發性反應：
Figure 02_image053
Figure 02_image045
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，製備聚合物之方法包括光誘發性反應：
Figure 02_image057
Figure 02_image059
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，製備聚合物之方法包括光誘發性反應：
Figure 02_image060
Figure 02_image062
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image033
，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚(烯基三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
Figure 02_image064
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image066
，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
在本發明包括之所有實例中，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，獨立地m可為0至50之整數，諸如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在本發明包括之所有實例中，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，獨立地n可為0至50之整數，諸如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。Z之所有前述實例獨立地可包括(-CH 2-) n、(-CH 2-O-) n中之多於一者或兩者。舉例而言，Z可包括(-CH 2-O-) n在兩個(-CH 2-) n之間、或(-CH 2-) n在兩個(-CH 2-O-) n之間，或一或多個(-CH 2-) n及一或多個(-CH 2-O-) n的其他組合。前述實例之所有排列涵蓋且明確地包括於本發明中。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之共聚物：
Figure 02_image111
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image066
，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數，且R包括選自鄰硝基苯甲基、苯并哌喃酮或烯烴之部分。
此類聚合物可以包括丙烯醯胺-共-丙烯醯胺與官能化炔烴（
Figure 02_image114
）之點擊化學反應的方法製成：
Figure 02_image116
Figure 02_image118
Figure 02_image111
，其中
Figure 02_image114
係選自
Figure 02_image120
，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-，
Figure 02_image122
，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-，
Figure 02_image124
，其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br，Z包括烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且X係選自-S及-N(H)-，及
Figure 02_image126
，其中Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數。
以上點擊化學反應之左側上的聚合物可使用與本文其他處所描述類似的自由基誘發之聚合來製備。光可用於根據本發明將聚合物之鄰硝基苯甲基或苯丙酮遮罩之三唑轉化成活性部分，或使烯烴與寡核苷酸在存在光引發劑之情況下耦合。
可將炔烴添加至鄰硝基苯甲基、苯并哌喃酮或烯烴中以附接至根據本發明之態樣的聚合物主鏈之疊氮基。作為一非限制性實例，可將烯烴（或例如炔烴封端之香豆素，或烯烴封端之炔烴)添加至鄰硝基苯甲基中以根據以下反應附接至聚合物主鏈：
Figure 02_image128
，其中Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
Figure 02_image066
，X 1及X 2係選自各別地-NH 2及-N(H)-，或各別地-SH及-S-，且W係選自
Figure 02_image130
及
Figure 02_image132
其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3。
Figure 02_image134
之非限制性實例包括但不限於
Figure 02_image136
、
Figure 02_image138
、
Figure 02_image140
、
Figure 02_image142
、
Figure 02_image144
及
Figure 02_image146
，其中n為1至50之整數。
在本發明包括之所有實例中，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，獨立地m可為0至50之整數，諸如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在本發明包括之所有實例中，Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，獨立地n可為0至50之整數，諸如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。Z之所有前述實例獨立地可包括(-CH 2-) n、(-CH 2-O-) n中之多於一者或兩者。舉例而言，Z可包括(-CH 2-O-) n在兩個(-CH 2-) n之間、或(-CH 2-) n在兩個(-CH 2-O-) n之間，或一或多個(-CH 2-) n及一或多個(-CH 2-O-) n的其他組合。前述實例之所有排列涵蓋且明確地包括於本發明中。
在一些實例中，聚合物包括具有以下結構之聚合物網路：
Figure 02_image023
，其中R為第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。第一寡核苷酸可對應於參考圖2A描述之寡核苷酸231，且第二寡核苷酸可對應於參考圖2A描述之寡核苷酸232。第一寡核苷酸可包括切除部分，而第二寡核苷酸。聚合物網路可在如本文所揭示之基板上藉由在存在光引發劑之情況下的光誘發性反應來聚合：
Figure 02_image021
Figure 02_image023
， 其中Z包括烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數。一種方法可包括在存在光引發劑之情況下用光選擇性地照射第一共聚單體，其中第一共聚單體中之一或多者包括第一寡核苷酸，而不照射第二共聚單體，其中第二共聚單體中之一或多者包括第二寡核苷酸，以使第一共聚單體聚合形成聚合物之一或多個第一區域；且在存在光引發劑之情況下照射第二共聚單體以使第二共聚單體聚合形成聚合物之一或多個第二區域。
光引發劑可選自以下中之一或多者：苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
聚合物網路可具有不同結構。作為一非限制性實例，聚合物網路可包括結構：
Figure 02_image151
應瞭解，可基於本文中之教示設想具有許多不同類型之光可活化部分及其他部分的許多不同聚合物。本發明聚合物中之任一者可為嵌段共聚物，可為隨機分佈之共聚物，或二者之任何適合組合。另外，應瞭解，任何適合之反應性基團，包括但不限於炔烴可與部分或非活性部分耦合以便使該部分或非活性部分與聚合物耦合。
應瞭解，本發明聚合物、組合物及方法可用於任何適合之應用，諸如擴增模板聚核苷酸中。舉例而言，儘管本發明組合物可用於進行「橋式擴增」或「表面結合聚合酶鏈反應」，但應瞭解，本發明組合物可容易適合於與其他擴增模態一起使用。一種此類擴增模態為「排除擴增」或ExAmp。排除擴增方法可允許擴增每個基板區之單一目標聚核苷酸及在基板區中產生實質上單株的擴增子群體。舉例而言，第一捕獲目標聚核苷酸在基板區內之擴增速率可相對於目標聚核苷酸在基板區處之顯著較慢轉運及捕獲速率更快速。因而，基板區中捕獲之第一目標聚核苷酸可經快速擴增且填充整個基板區，因此抑制捕獲相同基板區中之額外目標聚核苷酸。替代地，在第二目標聚核苷酸連接至第一聚核苷酸之後的相同基板區的情況下，第一目標聚核苷酸之相對快速擴增可充分填充基板區以產生足夠強以藉由合成來執行定序之信號（例如基板區可為至少官能性單株的）。使用排除擴增亦可產生單株基板區之超泊松分佈；亦即，為官能性單株的呈陣列形式之基板區的分率可超出由泊松分佈預測之分率。
增加適用簇之超泊松分佈係有用的，此係由於更多官能性單株基板區可產生較高品質信號，且因此改良SBS；然而，將目標聚核苷酸接種至基板區中可遵循空間泊松分佈，其中用於增加所佔據基板區之數目的取捨增加了多株基板區的數目。獲得較高超柏松分佈之一種方法為快速發生接種，隨後在經接種目標聚核苷酸當中延遲。由於被認為係經由生物化學反應動力學出現之延遲，稱為「動力學延遲」產生較另一接種目標較早開始之一種經接種目標聚核苷酸。排除擴增藉由使用重組酶促進引子（例如連接至基板區之引子）在重組酶介導序列匹配時侵入雙股DNA（例如目標聚核苷酸）來起作用。本發明組合物及方法可適合與重組酶一起使用，以促進本發明捕獲引子及正交捕獲引子在重組酶介導序列匹配時侵入本發明目標聚核苷酸中。實際上，本發明組合物及方法可經調適以與任何基於表面之聚核苷酸擴增方法一起使用，諸如熱PCR、化學變性PCR及酶介導之方法（其亦可稱為重組酶聚合酶擴增（RPA）或ExAmp）。
將活性部分接枝至基板之方法
如本文所論述，在本文中之一些實例中，寡核苷酸至少部分藉由用光照射聚合物之區域中之非活性部分而不用光照射此區域外部之某些其他非活性部分來與聚合物耦合。在此過程期間，在照射之區域中，該等部分將變得具有活性。儘管單個區域用作一實例，但可照射一或多個區而不照射某些其他一或多個區，由此在一或多個照射區域中產生活性部分。在一些實例中，聚合物接觸基板之前側上的至少一個表面，如此基於其是否經照射，其中部分為活性或無活性的區域為此聚合物與基板之前側之部分接觸的部分。基板可或可不包括奈米孔。圖6為一般示出照射聚合物之某些區域的工作流程600，其中該聚合物與基板之前側上的至少一個表面接觸。圖7至圖13描述某些更特定但非排他性實例以示出可與圖6之方法一起使用的不同類型的基板。如將圖6中示出，照射方法以及某些區域之佈置可基於基板之多種特性而變化或不變化，該等特性包括但不限於基板之形狀及/或基板之材料特性。圖6中所示之方法之態樣可用以在包括一或多個奈米孔之基板中（包括當奈米孔包括具有不同深度之孔時）使聚合物與基板接觸之區域中的部分選擇性地光活化。因此，圖7至圖11B示出適用於具有均勻深度之奈米孔的基板實例的此方法之態樣，而圖12至圖13示出適用於具有多深度奈米孔之基板實例的此方法之態樣。
參考圖6，在本發明之一些具體實例中，工作流程600包括使寡核苷酸與聚合物耦合，其中聚合物與基板之前側上的一或多個表面接觸（610）。如將在圖7至圖13中更詳細地論述，構成基板之材料可變化且用以照射聚合物之多個區以在彼等區域中產生活性部分，而不在其他區域中產生活性部分的技術。如上文所提及，在一些實例中，此等一或多個表面為奈米孔之表面。舉例而言，基板可或可不包含以下中之一或多者：具有紫外（UV）光透明度特性之透明材料（例如，熔融矽石、玻璃等）、阻斷UV輻射之材料（例如，一或多種金屬、金屬氧化物（例如，二氧化鈦（TiO2）、氧化鋅（ZnO）等）、氮化硼（BN）等），及/或可黏附聚(N-(10-疊氮基乙醯胺基戊基)丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)（PAZAM）之材料。如本文所說明，在圖6之工作流程600中使用的一些基板可或可不包括波導（例如，氧化鈦（TaOx））。
返回至圖6，在一些實例中，工作流程600包括用光照射基板上之聚合物之一或多個區域中的非活性部分之某些區域以活化聚合物之一或多個區域中的部分（620）。舉例而言，基板之頂表面上的聚合物可包括至少兩個不同區域。此照射可包括照射此等區域中之一或多者使得聚合物之經照射的一或多個區域在照射後，光會在經照射的一或多個區域中產生活性部分。在一些實例中，由於聚合物之某些區未經照射，所以不會在聚合物之此等區域中產生活性部分。為照射聚合物之選擇區，且因此以選擇性地在聚合物之經照射範圍內產生活性部分，經照射區域所暴露之光源可在相對於基板之不同位置中。舉例而言，光源可經定位以自高於此表面之位置直接地或間接地照射前側表面。替代地，及/或另外，光源可經定位經由基板之一部分，亦即自低於基板之底側的位置（又稱基板之背側）照射前側表面。在一些實例中，替代地或另外，基板中之波導可用以自基板外部之位置將光導引至所需一或多個區域。另外，如圖7至圖13中所示，工作流程600之照射部分（620）可基於與聚合物接觸之基板的結構變化或不變化。在所說明之實例中之至少一些中，UV輻射用以照射聚合物之一或多個區域以產生活性部分。
返回至圖6，基於活化，將聚合物之一或多個區域中的當前活性部分接枝至與聚合物之一或多個區域接觸的基板之一部分（630）。如將針對圖7及圖9至13說明，光用以選擇性地使具有單一深度之基板及/或具有多深度奈米孔之基板兩者接枝有光活化分子。
儘管圖7至圖11B為適用於具有一或多個均勻深度之奈米孔之基板的本文所描述之方法的所有態樣實例，圖7至圖9為其中照射奈米孔之底部處的所有或幾乎所有表面以使聚合物中之活性部分塗佈所有或幾乎所有表面，而在圖10至圖11B中，此表面之第一部分塗佈有具有第一類型之光活化分子的聚合物，而此表面之第二部分塗佈有具有第二類型之光活化分子的聚合物。因此，在圖10至圖11B中，所得基板包括接枝有不同種類之光活化分子的奈米孔。
圖7示出一實例，其包括示出在包括UV輻射吸收奈米孔圖案之基板710上選擇性光活化聚合物區域709的工作流程700。在此實例中，基板710經由背側788暴露而經受光，且基板710包含均勻或大部分均勻深度之一或多個奈米孔。參考圖7，提供工作流程700，其包括在工作流程700中之各個階段中示出基板710。在此實例中，基板710為奈米孔。如圖7中所示，聚合物（與寡核苷酸耦合）709用於塗佈基板710之部分以使得聚合物709之部分與基板710之前側789上的一或多個表面720a至720e接觸（705）。基板710之背側788暴露於光730以在某些表面（例如，表面720c）上產生活性部分（715）。在此實例中，基板710係由具有UV輻射透明度之材料（例如，熔融矽石、玻璃等）構成，以使得用來自位於基板之背側788（亦即，提供暴露於基板之背側788）的光源的光730照射基板，在經受較高暴露之表面720c上的聚合物之區域722c中產生活性部分721且不在與較低暴露於光源之表面720a至720b、720d至720e接觸的聚合物區域722a至722b、722d至722e內產生活性部分。
如圖7中所示，基於暴露更直接且穿過基板710之較薄部分750，與奈米孔之孔740底部處之表面720c接觸的聚合物722c將經受比其他聚合物塗佈表面722a至722b、722d至722e更高水準之暴露（例如，較高劑量之UV輻射）。在一非限制性實例中，僅出於說明之目的而提供大約1000 nm厚的奈米壓印微影（NIL）聚合物層吸附約30%的輻射（亦即，波長= 365 nm）。在一些實例中，此大致厚度防止形成活性部分。在其它實例中，大於約1000 nm之厚度防止形成活性部分，而在一些實例中，小於此大致厚度之厚度能夠形成活性部分。與某些表面720b、720d接觸的聚合物722b、722d，沿奈米孔之側壁的彼等聚合物不直接藉由光源照射。與奈米孔之壁頂上的某些頂表面720a、720e接觸的聚合物部分722a、722e不藉由光源充分照射以在此等部分722a、722e中產生活性部分，此係由於基板在光源與此等表面720a、720e之間較厚，所以達至此等表面720a、720e的UV輻射之劑量較小且因此不足以在此等表面720a、720e上之聚合物塗層722a、722e中產生活性部分。活化後，將活化部分接枝760至基板710（725）。
現參看圖8，如上文所論述，在一些實例中，聚合物之一或多個區可利用基板810上經圖案化（例如，利用微影)或以其他方式整合至基板810中的波導870活化。為此，圖8類似於圖7為圖示之工作流程800，但圖8描繪了使用波導870選擇性光活化基板上之聚合物區域的實例。類似於圖7，且圖8之基板810包含具有均勻或大部分均勻深度之一或多個奈米孔。在此實例中，圖8中之基板810係由阻斷UV輻射之材料（例如，一或多種金屬、金屬氧化物（例如，TiO2、ZnO、BN等）等）構成。如將在圖9中所示，使用波導選擇性光活化基板上之聚合物區域可利用阻斷UV輻射且對其為透明的基板來實現，但出於說明之目的，圖8示出在對UV輻射不為透明的基板之聚合物區中產生活性部分。作為對比實例，圖9（其亦將在本文中論述）描繪了對UV輻射為部分透明的基板。
如圖8中所示，基板810之前側889上的一或多個表面820a至820e塗佈有聚合物（已與寡核苷酸耦合）809以使得聚合物809與一或多個表面820a至820e接觸（805）。如前述，圖8中之基板810係由至少部分阻斷UV輻射之材料（例如，TiO2、ZnO等）等）構成。基板810中之奈米孔814之底部處的表面820c藉由聚合物809塗佈。因此，聚合物809之區域822c鄰近於經圖案化（例如，利用微影）或以其他方式整合至基板810中的波導870。波導870暴露於光源（未描繪），使得波導870可傳導光且將聚合物809之區域822c暴露於輻射以在聚合物809之與波導870接觸的區域822c中產生活性部分821（815）。聚合物之與基板之某些其他表面820a至820b、820d至820e接觸的其他區域822a至822b、822d至822e中的分子未活化，此係由於波導870不直接地或間接地與此等區域822a至822b、822d至822e接觸且來自波導870之輻射藉由構成基板810之材料阻斷。如同圖7中之實例，將活化部分接枝860至基板810（825）。
參考圖9，另外示出工作流程900，類似於圖8，基板910包括波導970，但與圖8相反，基板910對於UV輻射為部分透明的（例如，由熔融矽石、玻璃等構成）。如圖7至8之基板710、810的情況，圖9之基板910亦包含具有均勻或大部分均勻深度之奈米孔。另外，此基板910包括阻斷及/或實質上阻斷UV輻射912之區域及對於UV輻射913為透明的及/或顯著透明的部分。基板910中之奈米孔914之底部處由聚合物909塗佈之表面920c鄰近於經圖案化（例如，利用微影）或以其他方式整合至基板910中的波導970。在一些實例中，聚合物塗層與波導970接觸。
在圖9中所示之工作流程900中，基板910之前側上的一或多個表面920a至920e塗佈有聚合物（已與寡核苷酸耦合）909，使得聚合物909與一或多個表面920a至920e接觸（905）。波導970暴露於光源（未描繪），使得波導可傳導光且將聚合物之與鄰近表面920c接觸的區域922c暴露於輻射以在聚合物之區域922c中產生活性部分921（915）。因為基板910之一部分係由對UV輻射913為透明的及/或顯著透明的材料構成，在此實例中，波導可暴露於光源且其將導引來自基板910之背側988處的來源的光930以活化部分。然而，阻斷或實質上阻斷UV輻射912之基板部分防止波導970活化與剩餘塗佈表面920a至920b、920d至920e接觸的部分聚合物區域922a至922b、922d至922e。活化部分經接枝960至基板910（925）。
圖10及圖11A至圖11B示出在具有均勻深度之奈米孔的基板1010、1110上進行的工作流程1000、1100，但其中與基板1010、1110接觸之聚合物之不同區域中的分子經個別地活化。為示出此態樣，在圖10及圖11A至圖11B中，此等奈米孔1010、1110之底部1014、1114包括不同區域（例如，第一區域1016、1116，及第二區域1017、1117）。因此，藉由不需要配向之此方法，可將不同化學物質在奈米孔之不同區域（諸如此等區域）中圖案化。如本文中所使用，術語「配向」係指在幾何學上限定之圖案中用UV照射基板所藉由的方法。舉例而言，幾何學上限定之圖案存在於光遮罩（例如，外部硬體）上。當利用配向過程時，光遮罩在指定容限內與基板上之特徵物理地配向。圖11A至圖11B中之實例避免此配向過程，此係由於基板1110具有建置於其中之光遮罩且因此不需要配向。在圖11A至圖11B中，淺孔部分1152（亦即，表面上經圖案化之具有不透光材料的部分）用作光遮罩。圖10之實例亦避免配向過程，此係由於基板1010為不透光的且具有建置於其中之波導1070（亦即，光管道）。因此，在圖10中，藉由波導1070限定幾何圖案，如此不利用外部光遮罩且因此不發生配向。
既定基板上之各別活化區域可接枝有相同或不同的光活化分子。在一些實例中，奈米孔之底部1014、1114之第一區域1016、1116及奈米孔之底部1014、1114之第二區域1017、1117各自佔奈米孔之底部1014、1114處的整個表面的一半。在此等實例中，塗佈第一區域1016、1116及第二區域1017、1117的聚合物之部分各自藉由不同光源照射。光源可包括但不限於背側光源（相對於基板）、前側光源（相對於基板）及/或基板上圖案化或以其他方式內嵌於基板中的波導。
在圖10中，用以活化基板之不同部分上之聚合物部分的光源包括波導1070及來自基板1010之前側1089之方向的光源（未經描繪）的光1032。如同圖8，圖10之基板1010包括基板1010上經圖案化（例如，利用微影）或以其他方式整合至基板1010中的波導1070。但在此實例中，波導1070僅圖案化或以其他方式整合至基板1010中奈米孔之孔底部1014之第一區域1016中。與奈米孔之底部1014之第二區域1017接觸的聚合物中的分子未藉由此波導1070活化。波導1070與聚合物1009之其他區域直接或間接接觸不足以活化此等區域中之分子，此係由於圖10中之基板1010係由阻斷UV輻射之材料（例如，一或多種金屬、金屬氧化物（例如，TiO2、ZnO、BN等）等）構成。
在此工作流程1000中，基板1010之前側上的一或多個表面1020a至1020e塗佈有聚合物（已與寡核苷酸耦合）1009，使得聚合物1009與一或多個表面1020a至1020e接觸（1005）。波導1070暴露於光，使得波導將於表面1020c之一部分（亦即，奈米孔之底部1014之第一區域1016）接觸的聚合物之鄰近區域1022c暴露於輻射以在與奈米孔之底部1014之第一區域1016接觸的聚合物1022c之部分中產生活性部分1021（1015）。與第一區域1016接觸的聚合物1022c之此部分中的活化部分經接枝1060至基板1010（1025）。在第一區域1016中接枝1060聚合物1022c之此初始部分之後，其中分子尚未活化且與基板1010之前側上的一或多個表面1020a至1020e接觸的聚合物1022a至1022e之部分經由前側1089暴露（背側1088暴露由於構成基板之材料將為無效的）於光（例如，UV輻射）（1035）而曝光。在先前未活化及接枝的聚合物1022a至1022e之此等部分中產生活性部分1021。前側1089曝光使聚合物之尚未活化區域中的部分活化且使基板1010接枝有新的光活化分子1061，從而產生第二接枝表面1061（1045）。第二接枝表面1061形成於基板1010上。拋光基板自奈米孔頂上之表面1020a、1020e移除第二接枝表面1061（未經描繪）。
雖然圖10在奈米孔之部分中包括波導1070以活化聚合物之一些區域中的部分而不活化聚合物之其他區域中的部分（聚合物1009為與基板之多個表面1020a至1020e接觸的聚合物），但圖11中所示之工作流程1100包括用對UV輻射為不透光的金屬氧化物（例如，TiO2、ZnO、BN等）將基板圖案化。
在圖11A至圖11B中，用以活化基板之不同部分上的聚合物部分的光源包括來自基板1110之背側1188方向的光源（未經描繪）之光1130及來自基板1110之前側1189方向的光源（未經描繪）的光1132。因此，圖11A至圖11B示出工作流程1100，其中基板1110中奈米孔之孔底部1114的第一區域1116及奈米孔之底部1114之第二區域1117包括經各別光活化之部分區域。與圖10中之基板1010相比，在此實例中，基板1110係由具有UV輻射透明度特性之透明材料中之一或多者（例如，熔融矽石、玻璃等）形成。另外，在圖11A至圖11B中，奈米孔之底部1114之第二區域1117，以及相鄰奈米孔壁表面1120d及鄰近於壁之頂部處的此壁表面之表面1120e（平行於奈米孔1114之底部）全部用對UV輻射為不透光的材料圖案化（1101）。此材料對於可見光可為或可不為透明的。在一些實例中，材料為金屬氧化物（例如，TiO2、ZnO、BN等）。對UV輻射不透光之材料在基板1117之某些表面1120d、1120e上經圖案化（例如，使用光微影術），孔1140包括淺孔部分1152（亦即，表面上經圖案化之具有不透光材料的部分）及深孔部分1151。藉由使不透光材料圖案化（1105），形成不透光材料層1147，基板1110現包括至少一個多深度奈米孔。因此，額外的兩個表面（新的豎直表面1120f及新的水平表面1120g）形成於孔1140內。額外的豎直表面1120f為在深孔部分之底表面1116（孔表面1120c之部分，其並未部分覆蓋有不透光層1147）與淺孔部分之底表面1117（孔表面1120c之部分，其現在部分覆蓋有不透光層1147）之間延伸一定距離的較短壁表面。豎直表面1120h自淺孔部分之底表面1117延伸至不透光層1147之最高點以形成淺孔之豎直邊界。水平表面1120i形成於垂直於豎直表面之奈米孔壁1120h的水平部分上。
返回至圖11A至圖11B中之工作流程1100，基板1110之前側上的表面1120a-i中之一或多者塗佈有聚合物（已與寡核苷酸耦合）1109，使得聚合物1109與一或多個表面1120a-i接觸（1105）。基板1110之背側1188暴露於光1130以在某些表面（例如，表面1120a至1120b及1120c之未覆蓋有不透光層的部分）上產生活性部分（1115）。因為基板1110係由具有UV透明度之材料（例如，熔融矽石、玻璃等）構成，用來自位於基板之背側1188的光源（未經描述）的光1130照射基板（亦即，提供暴露於基板之背側），在塗佈奈米孔之底部1114之第一區域1116的聚合物1127之區域以及未覆蓋有不透光層1147之某些其他上表面1120a至1120b中產生活性部分1121。具有不透光層1147之聚合物1109之區域經照射不足以活化某些區域1120f至1120i中聚合物中之部分，此係由於不透光材料層1147阻斷光1130（亦即，背側UV輻射暴露）。活化部分（亦即，活化部分經接枝1160至基板1110（1125）。為照射聚合物1109之其餘部分中的尚未接枝至基板的部分，將基板1110之前側1189暴露於光1132以在此等表面（例如，表面1120f至1120i）上之聚合物1109之部分中產生活性部分1121（1135）。活化部分1121（亦即，活化部分經接枝1161至基板1110（1145）。在一些實例中，接枝至奈米孔壁上之水平表面1120a、1120i的材料經拋光且移除（1155）。
雖然圖10及圖11A至圖11B展示本文所論述之技術之實例態樣如何可用以藉由在孔中產生兩個不同區域而有效地將具有單一深度奈米孔之基板轉化成多深度奈米孔，但圖12及圖13A至圖13B將技術態樣應用於具有一或多個多深度孔之基板1210、1310。NIL樹脂之厚度在多深度奈米孔下不同，且此差異可用於將一或多個多深度奈米孔選擇性地接枝有光活化分子。可藉由不需要配向之此方法將不同化學物質圖案化在多深度奈米孔之不同區域中。圖12示出工作流程1200，其具有在包括一或多個具有UV吸收樹脂之多深度孔的基板1210上進行的態樣。工作流程1200包括使該基板暴露於來自背側1288及前側1289兩者的光（例如，UV輻射）。如將在下文更詳細地論述，在此工作流程中，與基板1210（基板表面）耦合之引子（例如，P5及P7引子）在基板1210之表面上的位置處形成「種子」以使與聚合物耦合之寡核苷酸耦合至種子。同時，在圖13A至圖13B中，工作流程1300示出一種方法之態樣，該方法涉及具有一或多個具有UV吸收金屬氧化物之多深度孔的基板1310以及背側1388及前側1389兩者暴露於光（例如，UV輻射）。
首先參考圖12，在此工作流程中，基板1210包括為多深度奈米孔的孔1240，包括淺孔部分1252及深孔部分1251。孔1240裝填有矽烷（包括藉由與對應官能基反應而與丙烯醯胺共聚物連接的官能基）及丙烯醯胺共聚物（例如，PAZAM）1284之組合（1205）。光活性分子1286接枝於丙烯醯胺共聚物（1215）上且因此，光活性分子亦存在於孔1240中。基板1210之背側1288暴露於來自基板1210之背側1288的光1230（例如，UV輻射）以在孔1240之深孔部分1251內產生活性部分1221（1225）。淺孔部分1252內之分子1286未活化，而深孔部分1251中之分子1263，此係由於未充分照射光源（未經描繪）與淺孔部分1252中之分子1286之間的包含吸收樹脂之基板1210的UV厚度以活化聚合物中之部分。
在此實例中，根據存在非活性部分之奈米孔部分的深度，將活化部分1221逐步接枝至奈米孔1240之部分。如圖12中所示，孔1240之深孔部分1251內的活化部分1221用引子（例如，P5）接枝1260至基板1210（1235）。為接枝孔1252之淺部中的分子，孔1240之此部分中的非活性部分首先藉由將基板1210暴露於來自位於基板1210之前側1289之光源的光1232來活化（1245）。此前側暴露在孔1240之淺部1252內產生活性部分1221。在此實例中，孔1240之深部1251中的使用引子接枝之材料不受前側暴露影響。孔1240之淺孔部分1252內的活化部分1221用引子（例如，P7）接枝1261至基板1210（1255）。因此，在此非限制性實例中，利用一或多個不同引子及光源之至少兩個位置，將聚合物之活化部分1221接枝至基板中之孔1240。
圖13A至圖13B如前述亦示出一種方法1300，其涉及具有一或多個多深度孔之基板1310。如圖12之工作流程1200中，此工作流程1300包括將基板及非活性部分暴露於來自背側1388以及來自基板1310之前側1389之光以將活性部分接枝至一或多個孔1340。此實例中之基板1310包括針對其與丙烯醯胺聚合物及其衍生物之黏著特性所選擇的材料及對UV輻射為不透光但對於可見光可為或可不為透明的材料，包括但不限於金屬氧化物（例如，TiO2、ZnO、BN等）。基板之此部分包括孔1340。此孔1340包括淺孔部分1352及深孔部分1351。
如圖13A至圖13B中所示，基板1310之包括孔1340的部分使用化學方法，包括但不限於溶膠-凝膠法進行壓印（1301）。此方法之產物為未經退火之孔部分1377。對基板1310之孔部分1377施用熱處理以將材料進行退火，使得材料經退火1378（1305）。在一些實例中，構成孔部分1377之材料為金屬氧化物（例如，TiO2）且使用熱處理將金屬氧化物進行退火。孔1340之頂表面1320a至1320g塗佈有聚合物1309（例如，PAZAM）（1315）。
如同本文中之其他實例，聚合物1309中之非活性部分之不同部分使用背側光暴露及隨後前側光暴露來活化。在此實例中，與表面1320c（深孔部分1351之底表面）接觸的聚合物1322c之部分中的非活性部分利用來自基板1310之背側1388的光1330活化（1325）。接著將此等活性部分1321接枝1360至深孔部分1351之底表面1320c（1335）。包括非活性部分1322a至1322b、1322d至1322g且未接枝至基板1310的聚合物1309之部分接著用來自基板1310之前側1389的光1332照射（1345）。由於暴露於光1332（例如，UV輻射），聚合物1309之此等部分1322a至1322b、1322d至1322g中的部分經活化1321。此等新活性部分1321接著接枝1361至其連接之表面1320a至1320b、1320d至1320g（1355）。在一些實例中，接枝至奈米孔壁上之水平表面1320a、1320g的材料經拋光且移除（1365）。
儘管上文描述各種說明性實例，但熟習此項技術者應顯而易知，可在不背離本發明主題之情況下於其中作出各種改變及修改。所附申請專利範圍意欲覆蓋屬於本發明主題之真實精神及範疇內的全部此類變化及修改。
應理解，如本文中所描述之本發明之態樣中的每一者之任何各別特徵/實例可以任何適當組合形式一起實施，且此等態樣中之任一者或多者的任何特徵/實例可與如本文中所描述之其他態樣的特徵中之任一者一起以任何適當組合形式實施，以達成如本文中所描述之益處。
應瞭解，前述概念及下文所更詳細地論述之額外概念的所有組合（限制條件為此等概念並不彼此不相容）預期為本文中所揭示之發明標的之部分。特定而言，在本發明結尾處出現之所主張主題的全部組合考慮為本文中所揭示之發明主題的一部分，且可用以達成本文中所描述之益處及優勢。
圖 1101:第一區域 102:第二區域 111:種子 121:第一區域 122:第二區域 圖 2A 至 2D200:基板 201:第一區域 202:第二區域 203:界面 210:基板 220:流體 231:捕獲引子 232:正交捕獲引子 233:切除部分 241:捕獲引子 242:正交捕獲引子 243:切除部分 251:目標聚核苷酸 251':形成擴增子 254:第一轉接子 255:第二轉接子 2000:組合物 圖 3A 至 3M301:聚合物區域 302:聚合物區域 310:基板 311:包括主鏈之聚合物 312:非活性部分 313:第一活性部分 314:第二活性部分 315:部分 320:流體 320':流體 321:第一區域 322:第二區域 323:反應性基團 324:反應性基團 330:流體 330':流體 331:寡核苷酸 332:寡核苷酸 333:切除部分 341:寡核苷酸 342:寡核苷酸 343:切除部分 360:遮罩 3000:組合物 3001:組合物 圖 4A 至 4E401:第一子區域 402:第二子區域 403:側壁 411:主鏈 412:非活性部分 421:區域 450:基板 451:孔 460:遮罩 圖 5500:方法 510:操作 520:操作 530:操作 540:操作 圖 6600:工作流程 610:步驟 620:步驟 630:步驟 圖 7700:工作流程 705:步驟 709:聚合物 710:基板 715:步驟 725:步驟 720a:表面 720b:表面 720c:表面 720d:表面 720e:表面 721:活性部分 722a:區域 722b:區域 722c:區域 722d:區域 722e:區域 730:光 740:孔 760:接枝 788:背側 789:前側 圖 8800:工作流程 805:步驟 809:聚合物 810:基板 814:奈米孔 815:步驟 820a:表面 820b:表面 820c:表面 820d:表面 820e:表面 821:活性部分 822a:區域 822b:區域 822c:區域 822d:區域 822e:區域 825:步驟 860:接枝 870:波導 889:前側 圖 9900:工作流程 905:步驟 909:聚合物 910:基板 912:UV輻射 913:UV輻射 914:奈米孔 915:步驟 920a:表面 920b:表面 920c:表面 920d:表面 920e:表面 921:活性部分 922a:區域 922b:區域 922c:區域 922d:區域 922e:區域 925:步驟 930:光 960:接枝 970:波導 988:背側 圖 101000:工作流程 1005:步驟 1009:聚合物 1010:基板 1014:奈米孔之底部 1015:步驟 1016:第一區域 1017:第二區域 1020a:表面 1020b:表面 1020c:表面 1020d:表面 1020e:表面 1021:活性部分 1022a:部分 1022b:部分 1022c:部分 1022d:部分 1022e:部分 1025:步驟 1032:光 1035:步驟 1045:步驟 1060:接枝 1061:第二接枝表面 1070:波導 1088:背側 1089:前側 圖 111100:工作流程 1101:步驟 1105:步驟 1109:聚合物 1110:基板 1114:奈米孔之底部 1115:步驟 1116:第一區域 1117:第二區域 1120a:表面 1120b:表面 1120c:表面 1120d:表面 1120e:表面 1120f:表面 1120g:表面 1120h:表面 1120i:表面 1121:活性部分 1125:步驟 1130:光 1132:光 1135:步驟 1140:孔 1145:步驟 1147:不透光層 1151:深孔部分 1152:淺孔部分 1155:步驟 1160:接枝 1161:接枝 1188:背側 1189:前側 圖 121200:工作流程 1205:步驟 1210:基板 1215:步驟 1221:活性部分 1225:步驟 1230:光 1232:光 1235:步驟 1240:孔 1245:步驟 1251:深部 1252:淺孔部分 1255:步驟 1260:接枝 1261:接枝 1263:分子 1286:分子 1288:背側 1289:前側 圖 13A 至 13B1300:工作流程 1301:步驟 1305:步驟 1309:聚合物 1310:基板 1315:步驟 1320a:表面 1320b:表面 1320c:表面 1320d:表面 1302e:表面 1320f:表面 1320g:表面 1321:活性部分 1322a:部分 1322b:部分 1322c:部分 1322d:部分 1322e:部分 1322f:部分 1322g:部分 1325:步驟 1330:光 1332:光 1335:步驟 1340:孔 1345:步驟 1351:深孔部分 1352:淺孔部分 1355:步驟 1360:接枝 1361:接枝 1365:步驟 1377:孔部分 1378:黏合 1388:背側 1389:前側
當參考附圖閱讀以下實施方式時，本發明之此等及其他特徵、態樣及優勢將變得更好理解，其中：
[圖1]示意性地示出在基板上擴增聚核苷酸之實例，該聚核苷酸包括基板之第一區域及第二區域中的不同寡核苷酸。
[圖2A]至[圖2D]示意性地示出用於在基板之第一區域及第二區域中使用不同寡核苷酸擴增聚核苷酸的製程流程中之實例組合物及操作。
[圖3A]至[圖3M]示意性地示出用於使不同寡核苷酸與安置於基板上之聚合物之第一區域及第二區域耦合的製程流程中之實例組合物及操作。
[圖4A]至[圖4E]示意性地示出用於使不同寡核苷酸與安置於基板上之聚合物之第一區域及第二區域陣列耦合的製程流程中之實例組合物及操作。
[圖5]示出用於使不同寡核苷酸與聚合物之第一區域及第二區域耦合的方法中的實例操作流程。
[圖6]為一般示出照射聚合物之某些區域的工作流程，其中該聚合物與基板之前側上的至少一個表面接觸。
[圖7]示出一實例，其包括示出選擇性光活化包括UV輻射吸收奈米孔圖案之基板上之聚合物區域的工作流程。
[圖8]描繪使用波導選擇性光活化基板上之聚合物區域的實例。
[圖9]描繪使用波導選擇性光活化基板上之聚合物區域的實例。
[圖10]示出在具有均勻深度之奈米孔之基板上執行的工作流程，其中與基板接觸之聚合物之不同區域中的分子經單獨地活化。
[圖11A]至[圖11B]示出在具有均勻深度之奈米孔之基板上執行的工作流程，其中與基板接觸之聚合物之不同區域中的分子經單獨地活化。
[圖12]示出在具有多深度孔之基板上執行且包括基板之背側及前側兩者暴露於光的工作流程。
[圖13A]至[圖13B]示出在具有多深度孔之基板上執行且包括基板之背側及前側兩者暴露於光的工作流程。
500:方法
510:操作
520:操作
530:操作
540:操作

Claims (49)

  1. 一種使寡核苷酸與聚合物耦合之方法，其包含 用光選擇性地照射聚合物之一或多個第一區域中的第一非活性部分，而不照射該聚合物之一或多個第二區域中的第二非活性部分，以在該聚合物之該一或多個第一區域中產生第一活性部分； 使該等第一活性部分與第一寡核苷酸耦合； 用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分以在該聚合物之該一或多個第二區域中產生第二活性部分；及 使該等第二活性部分與第二寡核苷酸耦合。
  2. 如請求項1之方法，其中該等第一非活性部分及該等第二非活性部分中之一者或兩者包含保護基，其中該保護基係選自具有選自以下之結構的鄰硝基苯甲基：
    Figure 03_image001
    及
    Figure 03_image003
    ，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3，及 具有以下結構之苯并哌喃酮
    Figure 03_image005
    ，其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 X係選自-S及-N(H)-且R 1為與該聚合物之主鏈的鍵聯。
  3. 如請求項2之方法，其中該等第一活性部分及該等第二活性部分中之一者或兩者包含三唑：
    Figure 03_image007
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 Y包含選自胺及硫醇之主鏈反應性基團。
  4. 如請求項3之方法，其中該主鏈反應性基團包含胺。
  5. 如請求項4之方法，其中該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團係選自與該胺反應以形成具有以下結構之耦合的N-羥基丁二醯亞胺酯、羧酸及鄰醯基異脲：
    Figure 03_image009
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 R 6包含該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸。
  6. 如請求項3之方法，其中該主鏈反應性基團包含硫醇。
  7. 如請求項6之方法，其中該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團為與該硫醇反應以形成具有以下結構之耦合的乙烯基碸：
    Figure 03_image011
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 R 6包含該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸。
  8. 如請求項6之方法，其中該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團為與該硫醇反應以形成具有以下結構之耦合的順丁烯二醯亞胺：
    Figure 03_image013
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 R 6包含該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸。
  9. 如請求項6之方法，其中該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸與寡核苷酸反應性基團耦合，且該等寡核苷酸反應性基團為與該硫醇反應以形成具有以下結構之耦合的丙烯醯胺：
    Figure 03_image015
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 R 6包含該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸。
  10. 一種使寡核苷酸與聚合物耦合之方法，其包含 在存在光引發劑之情況下用光選擇性地照射聚合物之一或多個第一區域中的第一部分，而不照射該聚合物之一或多個第二區域中的第二部分，以使第一活性部分與第一寡核苷酸耦合；及 用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二部分以使第二活性部分與第二寡核苷酸耦合，其中該等第一寡核苷酸及該等第二寡核苷酸中之一者或兩者包含硫醇基。
  11. 如請求項10之方法，其中第一非活性部分及第二非活性部分中之一者或兩者包含具有以下結構之烯烴：
    Figure 03_image017
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數。
  12. 如請求項11之方法，其中該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸與聚合物反應性基團耦合，且該等聚合物反應性基團為與該硫醇基反應以形成具有以下結構之耦合的烯烴：
    Figure 03_image019
    ，其中 Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 R 6包含該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸。
  13. 如請求項10至12中任一項之方法，其中該光引發劑係選自以下中之一或多者：苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
  14. 一種製備聚合物之方法，其包含在存在光引發劑之情況下用光選擇性地照射第一共聚單體，其中該等第一共聚單體中之一或多者包含第一寡核苷酸，而不照射第二共聚單體，其中該等第二共聚單體中之一或多者包含第二寡核苷酸，以使該等第一共聚單體聚合形成該聚合物之一或多個第一區域；且在存在該光引發劑之情況下照射該等第二共聚單體以使該等第二共聚單體聚合形成該聚合物之一或多個第二區域。
  15. 如請求項14之方法，其中使該等第一共聚單體及該等第二共聚單體中之一者或兩者聚合包含形成聚合物網路的光誘發性反應：
    Figure 03_image021
    Figure 03_image023
    ，其中 R包含該等第一寡核苷酸或該等第二寡核苷酸，且 Z包含烷烴，該烷烴包括-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數。
  16. 如請求項14或15中任一項之方法，其中該光引發劑係選自以下中之一或多者：苯基雙(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、2-羥基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮、2-羥基-4'-(2-羥基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,2'-偶氮雙[2-甲基-n-(2-羥乙基)丙醯胺]、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)氧化膦、苯基(2,4,6-三甲基苯甲醯基)亞膦酸鋰及(2,4,6-三甲基苯甲醯基)苯基膦酸乙酯。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該等第一寡核苷酸包含缺乏切除部分之第一引子及含有切除部分之第二引子的混合物。
  18. 如請求項17之方法，其中該等第二寡核苷酸包含含有切除部分之第三引子及缺乏切除部分之第四引子的混合物。
  19. 如請求項18之方法，其中該等第一引子及該等第三引子具有除該切除部分以外彼此相同的序列，且其中該等第二引子及該等第四引子具有除該切除部分以外彼此相同的序列。
  20. 如請求項18或請求項19之方法，其中該等第一引子及該等第二引子之該等序列彼此正交，且其中該等第三引子及該等第四引子之該等序列彼此正交。
  21. 如請求項14至20中任一項之方法，其中該聚合物之該一或多個第一區域包含複數個第一子區域，且其中該聚合物之該一或多個第二區域包含複數個第二子區域。
  22. 如請求項21之方法，其中複數個該等第一子區域各自包含相鄰的第一子區域且複數個該等第二子區域各自包含第二相鄰的子區域，其中各相鄰的第一子區域與該等相鄰的第二子區域中的對應者相鄰。
  23. 如請求項22之方法，其進一步包含基板，其中該基板包含複數個奈米孔，且該複數個奈米孔中之一或多者含有相鄰的子區域及相對應的相鄰第二子區域。
  24. 一種聚合物，其包含具有選自以下之結構的聚(鄰硝基苯甲基遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
    Figure 03_image025
    及
    Figure 03_image027
    ，其中R 2及R 3各自獨立地選自-H及-O-CH 3， X係選自-S及-N(H)-， Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image029
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  25. 一種聚合物，其包含具有以下結構之聚(苯并哌喃酮遮罩之丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
    Figure 03_image031
    ，其中R 4係選自-H、-O-CH 3及-N-(CH 3) 2，且R 5係選自-H及-Br， X係選自-S及-N(H)-， Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  26. 一種聚合物，其包含具有以下結構之聚(胺基三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
    Figure 03_image035
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  27. 一種聚合物，其包含具有以下結構之聚(硫代三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
    Figure 03_image037
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  28. 一種製備聚合物之方法，其包含光誘發性反應：
    Figure 03_image039
    Figure 03_image041
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  29. 一種製備聚合物之方法，其包含光誘發性反應：
    Figure 03_image043
    Figure 03_image045
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  30. 一種製備聚合物之方法，其包含光誘發性反應：
    Figure 03_image048
    Figure 03_image050
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  31. 一種製備聚合物之方法，其包含光誘發性反應：
    Figure 03_image053
    Figure 03_image055
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  32. 一種製備聚合物之方法，其包含光誘發性反應：
    Figure 03_image057
    Figure 03_image059
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  33. 一種製備聚合物之方法，其包含光誘發性反應：
    Figure 03_image060
    Figure 03_image062
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image033
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  34. 一種聚合物，其包含具有以下結構之聚(烯基三唑-丙烯醯胺-共-丙烯醯胺)共聚物：
    Figure 03_image064
    ，其中 Y係選自-C(H 2)-、-(C(H 2)-C(H 2)-O) s，其中s為1至10之整數，及
    Figure 03_image066
    ， Z包含烷烴，該烷烴包含-CH 2-、(-CH 2) m及(-CH 2-O-) n中之一或多者，其中m及n獨立地為0至50之整數，且 p為50至100,000之整數，q為5至10,000之整數，且r為5至10,000之整數。
  35. 如請求項1至23或28至33中任一項之方法，其中： 該聚合物接觸基板之頂側上之複數個表面，及 用光照射該聚合物之該一或多個第一區域中的該等第一非活性部分以在該聚合物之該一或多個第一區域中產生該等第一活性部分及用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該一或多個第二非活性部分以在該聚合物之該一或多個第二區域中產生該等第二活性部分中的一者或兩者包含照射該複數個表面中的至少一個表面。
  36. 如請求項35之方法，其中該複數個表面包含奈米孔之表面且用光照射該聚合物之該一或多個第一區域中的該等第一非活性部分及用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分中的一者或兩者包含用紫外輻射照射該基板之底側。
  37. 如請求項35之方法，其中該複數個表面包含奈米孔之表面且該等奈米孔之該等表面之一部分包含波導。
  38. 如請求項37之方法，其中該聚合物之該一或多個第一區域中的該等第一非活性部分及該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分中的一者或兩者係藉由該波導照射。
  39. 如請求項37之方法，其中該基板進一步包含對紫外輻射具有低透明度之材料。
  40. 如請求項35之方法，其中該複數個表面包含多深度奈米孔之表面且該等多深度奈米孔包含深部及淺部，其中該聚合物之該一或多個第一區域接觸該深部且該聚合物之該一或多個第二區域接觸該淺部，且照射該等第一非活性部分包含： 照射該基板之底側，且照射該等第二非活性部分包含： 照射該基板之該頂側。
  41. 如請求項35之方法，其中該複數個表面包含多深度奈米孔之表面且該等多深度奈米孔包含深孔及及淺孔，其中該聚合物之該一或多個第一區域接觸該深孔之底表面且該聚合物之該一或多個第二區域接觸該淺部之底部，且 照射該等第一非活性部分包含照射該基板之底側且 照射該等第二非活性部分包含照射該基板之該頂側。
  42. 如請求項41之方法，其進一步包括包含： 拋光該基板以移除過量的活化部分。
  43. 如請求項36之方法，其中該基板之一部分包含金屬氧化物，其中該金屬氧化物部分限定該深孔之高度及寬度及該淺孔之高度及寬度。
  44. 如請求項35之方法，其進一步包含： 在該照射之前，使該複數個表面之一部分上的金屬氧化物圖案化，其中基於該圖案化，該複數個表面包含基板表面及金屬氧化物表面；及 使該等基板表面與該聚合物之該一或多個第一區域接觸且使該等金屬氧化物表面與該聚合物之該一或多個第二區域接觸。
  45. 如請求項44之方法，其中： 用光照射該聚合物之該一或多個第一區域中的該等第一非活性部分包含照射該基板之底側；及 用光照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分包含照射該基板之該頂側。
  46. 如請求項45之方法，其進一步包含： 拋光該基板以移除過量的活性部分。
  47. 如請求項37之方法，其進一步包含： 在該照射之前將該波導圖案化至該基板上。
  48. 如請求項37之方法，其中： 照射該聚合物之該一或多個第一區域中的該等第一非活性部分包含用該波導照射，且 照射該聚合物之該一或多個第二區域中的該等第二非活性部分包含照射該基板之該頂側。
  49. 如請求項48之方法，其進一步包含： 拋光該基板以移除過量的非活性部分。
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