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TW202320842A - 用於治療黑色素瘤之組合物及方法 - Google Patents

用於治療黑色素瘤之組合物及方法 Download PDF

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TW202320842A TW111128459A TW111128459A TW202320842A TW 202320842 A TW202320842 A TW 202320842A TW 111128459 A TW111128459 A TW 111128459A TW 111128459 A TW111128459 A TW 111128459A TW 202320842 A TW202320842 A TW 202320842A
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烏葛 莎新
羅伯特 Ａ 賈布洛夫斯基
科卡拉基斯 杜琳 施瓦克
奧資連 圖雷奇
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德商拜恩技術股份公司
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Abstract

本揭示案提供用於治療黑色素瘤之組合物及方法。

Description

用於治療黑色素瘤之組合物及方法
癌症為全球第二大死亡原因。習知療法，諸如化學療法、放射療法、手術及靶向療法(例如，包括免疫療法之最新進展)已改良患有晚期實體腫瘤之患者的後果。在過去幾年中，美國食品及藥物管理局(FDA)及歐洲藥品管理局(EMA)已批准檢查點抑制劑(靶向CTLA-4路徑，伊匹單抗(ipilimumab)；及靶向程序性死亡受體/配位體[PD/PD-L1]，包括阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、得瓦魯單抗(durvalumab)、納武單抗(nivolumab)、西米普利單抗(cemiplimab)及派姆單抗(pembrolizumab))，來治療患有多種癌症類型(主要為實體腫瘤，包括黑色素瘤)之患者。然而，此等療法尚未在治療難治性腫瘤之晚期患者中顯示出成功。同樣，使用刺激針對腫瘤之靶向免疫反應之疫苗來治療癌症之臨床努力在此類晚期患者中亦未成功。
某些癌症(例如黑色素瘤)之不良預後突出了對額外治療方法之需要。本揭示案尤其提供如下見解，即遞送編碼黑色素瘤腫瘤相關抗原(TAA) (例如，黑色素瘤TAA)之RNA分子之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，諸如在一些實施例中，疫苗)代表對罹患黑色素瘤之患者尤其有效的治療選項。此類RNA分子可例如靶向淋巴組織中之樹突狀細胞。尤其，本揭示案亦提供如下見解，即本文所述之醫藥組合物在投與至患有晚期黑色素瘤(例如，III期或IV期黑色素瘤)之患者時尤其有用及/或有效。晚期癌症(例如晚期黑色素瘤)亦稱作「末期」癌症。此外，本揭示案提供一種特別見解，即在首次投與本文所述之醫藥組合物時不具有疾病跡象之患者(例如在一些實施例中，黑色素瘤已完全經切除之患者)仍可受益於由此類醫藥組合物誘導之抗腫瘤免疫性。
不希望受任何特定理論束縛，由於TAA通常為非突變之自身抗原，中樞T細胞耐受性可能導致在癌症疫苗之某些臨床試驗中觀察到的很大程度上較弱、臨床上無效之T細胞反應。尤其，本揭示案提供如下見解，即包括紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原、黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原、酪胺酸酶抗原及具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(transmembrane phosphatase with tensin homology，TPTE)抗原在內的腫瘤相關抗原之組合代表用於靶向免疫療法之一組尤其有用的腫瘤相關抗原。不希望受任何特定理論束縛，本揭示案指出腫瘤相關抗原之此類組合的正常組織表現受限及其在黑色素瘤中之高盛行率(例如，超過90%之黑色素瘤患者表現腫瘤相關抗原NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者)可能有助於其在黑色素瘤治療中之有用性。
本揭示案進一步提供如下見解，即本文所揭示之組合物可誘導從頭抗原特異性抗腫瘤免疫反應且增強針對疫苗抗原之預存在之免疫反應。
更進一步地，本揭示案提供一種特定見解，即經由靶向樹突狀細胞(例如，未成熟樹突狀細胞)之脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)藉由RNA遞送腫瘤相關抗原(NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原)可能為癌症疫苗之尤其有益的策略，其中該RNA經轉譯用於HLA I類及II類分子上之抗原呈現(例如，增強之呈現)。不希望受特定理論束縛，在一些實施例中，本文所述之RNA組合物可藉由類鐸受體(TLR)介導之I型干擾素驅動之抗病毒免疫機制使疫苗抗原遞送與共刺激在時間空間上對齊，且導致抗原特異性T細胞之深度擴增。尤其，本揭示案亦提供如下見解，即本文所述之RNA組合物不僅作為單一療法有效用於治療黑色素瘤，而且可與免疫檢查點抑制劑(例如，抗PD1療法)協同作用於黑色素瘤患者中，在一些實施例中，該等黑色素瘤患者可能先前已經免疫檢查點抑制劑治療過。迄今為止，尚未批准包含含有編碼腫瘤相關抗原之核糖核酸及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)之癌症疫苗之療法用於治療癌症(例如，黑色素瘤)。熟習此項技術者應瞭解核酸治療劑以及RNA (例如，mRNA)治療劑(參見例如mRNA編碼之蛋白質及/或細胞介素)之新興領域。本文所提供之技術的各種實施例可利用所開發之RNA (例如，mRNA)治療技術及/或遞送系統之特定特徵。例如，在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含非核苷修飾之核苷酸。在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含一或多個經修飾之核苷酸(例如但不限於假尿苷)、核苷及/或鍵聯。或者或另外，在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含增強穩定性及/或轉譯效率之經修飾之polyA序列(例如，受到破壞之polyA序列)。或者或另外，在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含至少兩個3'UTR序列之特定組合(例如，分裂RNA之胺基端增強子的序列元件及源自粒線體編碼之12S RNA的序列之組合)。或者或另外，在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含源自人類α-球蛋白mRNA之'5 UTR序列。或者或另外，在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含5'帽類似物，例如用於共轉錄加帽。或者或另外，在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含具有降低之免疫原性的分泌信號編碼區(例如，人類分泌信號編碼序列)。在一些實施例中，投與之RNA (例如，mRNA)可包含MHC運輸域。在一些實施例中，投與之RNA可在一或多種遞送媒劑(例如脂質粒子，例如脂質複合物或脂質奈米粒子)中或與其一起調配。
在一個態樣中，本揭示案尤其提供一種方法，該方法包括：向罹患癌症之患者投與至少一個劑量之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該等RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子。
在一些實施例中，適用於本文所述之技術(包括例如方法及/或醫藥組合物等)之患者係歸類為在投與時具有疾病跡象。
在一些實施例中，適用於本文所述之技術(包括例如方法及/或醫藥組合物等)之患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。
因此，本揭示案之某些態樣提供一種方法，該方法包括：向患者投與至少一個劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該等RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子；其中該患者在投與時間之前經診斷患有癌症，但該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。
在一些實施例中，藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了有疾病跡象或無疾病跡象。
在一些實施例中，本文所述之技術涉及包含一或多種RNA分子之醫藥組合物，該一或多種RNA分子包含：(i)編碼NY-ESO-1抗原之第一RNA分子，(ii)編碼MAGE-A3抗原之第二RNA分子，(iii)編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子，及(iv)編碼TPTE抗原之第四RNA分子。在一些實施例中，該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少兩者。
在一些實施例中，本文所述之技術涉及包含編碼多抗原決定基多肽之單一RNA分子之醫藥組合物，其中該多抗原決定基多肽包含NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少兩者。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中存在的一或多種RNA分子可進一步包含至少一個編碼CD4+抗原決定基之序列。例如，在一些實施例中，CD4+抗原決定基由編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者的相同RNA分子遞送。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中存在的一或多種RNA分子可進一步包含至少一個編碼破傷風類毒素P2之序列、編碼破傷風類毒素P16之序列或兩者。在一些實施例中，如與不含P2或P16之可比較RNA分子相比，在RNA分子中包括P2及/或P16可改良免疫刺激。不希望受限於任何特定理論，P2及/或P16可在初免期間提供CD4 +介導之T細胞幫助。Demotz等人，1989；Dredge等人，2002；Livingston等人，2013，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中存在的一或多種RNA分子可包含以下至少一者：編碼MHC I類運輸域之序列；5'帽或5'帽類似物；編碼信號肽之序列；至少一種非編碼調控元件；至少一個聚腺嘌呤尾；至少一個5'非轉譯區(UTR)及/或至少一個3' UTR；及其組合。在一些實施例中，欲包括於一或多種RNA分子中之聚腺嘌呤尾為或包含經修飾之腺嘌呤序列。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中存在的一或多種RNA分子可依5'至3'次序包含：(i) 5'帽或5'帽類似物；(ii)至少一個5' UTR；(iii)信號肽；(iv)編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者的編碼區；(v)至少一個編碼破傷風類毒素P2、破傷風類毒素P16或兩者之序列；(vi)編碼MHC I類運輸域之序列；(vii)至少一個3’UTR；及(viii)聚腺嘌呤尾。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中存在的一或多種RNA分子包含天然核糖核苷酸。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中存在的一或多種RNA分子包含經修飾或合成核糖核苷酸。
在一些實施例中，由一或多種RNA分子編碼之至少一種腫瘤相關抗原(例如本文所述者)為全長抗原。在一些實施例中，由一或多種RNA分子編碼之至少一種腫瘤相關抗原(例如本文所述者)為經截短之抗原。在一些實施例中，由一或多種RNA分子編碼之至少一種腫瘤相關抗原(例如本文所述者)為非突變抗原。例如，在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者為全長非突變抗原。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原為全長抗原(例如，在一些實施例中，全長非突變抗原)。在一些實施例中，MAGE-A3抗原為全長抗原(例如，在一些實施例中，全長非突變抗原)。在一些實施例中，酪胺酸酶抗原為經截短之抗原(例如，在一些實施例中，經截短之非突變抗原)。在一些實施例中，TPTE抗原為經截短之抗原(例如，在一些實施例中，經截短之非突變抗原)。
在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者由患者淋巴組織中之樹突狀細胞表現。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者存在於癌症中。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含脂質體。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含陽離子脂質體。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含脂質奈米粒子。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE)或兩者。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質及輔助脂質。在一些實施例中，例示性輔助脂質為或包含磷脂。在一些實施例中，例示性輔助脂質為或包含固醇。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之脂質粒子包含至少一種聚合物結合脂質(例如，在一些實施例中，PEG結合脂質)。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於人類患者。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療癌症及/或延長復發時間。在一些實施例中，癌症為上皮癌。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，癌症為晚期。在一些實施例中，癌症為II期、III期或IV期。在一些實施例中，癌症為IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。在一些實施例中，癌症經完全切除，不具有疾病跡象，或兩者兼有。
在一些實施例中，本文所述之方法包括向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與第二劑量的所提供之醫藥組合物(例如，本文所述者)。在一些實施例中，本文所述之方法包括向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與至少兩個劑量之醫藥組合物。在一些實施例中，本文所述之方法包括向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與至少三個劑量之醫藥組合物。
在一些實施例中，本揭示案提供對本文所述之目的尤其有用的給藥排程(dosing schedule)。例如，在一些實施例中，該至少三個劑量中之至少一個劑量在患者已接受該至少三個劑量中之另一劑量的8天內投與至患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)。在一些實施例中，該至少三個劑量中之至少一個劑量在患者已接受該至少三個劑量中之另一劑量的15天內投與至患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)。在一些實施例中，根據本揭示案之給藥排程包括在10週內向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與至少8個劑量的本文所述之醫藥組合物。在一些實施例中，根據本揭示案之給藥排程包括每週向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與一個劑量的本文所述之醫藥組合物持續6週時期，及接著每兩週投與一個劑量的本文所述之醫藥組合物持續4週時期。在一些實施例中，根據本揭示案之給藥排程包括在初始給藥方案(例如，包含至少8個劑量之初始給藥方案)之後每個月向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與一個劑量的本文所述之醫藥組合物。在一些實施例中，給藥排程包括每週向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與一個劑量的本文所述之醫藥組合物持續7週時期。在一些實施例中，給藥排程包括每三週向患者(例如，在一些實施例中，罹患黑色素瘤之患者或不具有疾病跡象之患者)投與一個劑量的本文所述之醫藥組合物。
在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為5 µg至500 µg總RNA。在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為7.2 µg至400 µg總RNA。在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為10 µg至20 µg總RNA。在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為約14.4 µg總RNA。在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為約25 µg總RNA。在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為約50 µg總RNA。在一些實施例中，投與劑量(例如，第一劑量及/或第二劑量)為約100 µg總RNA。在一些實施例中，可全身性地執行投與。在一些實施例中，可經靜脈內執行投與。在一些實施例中，可經肌肉內執行投與。在一些實施例中，可經皮下執行投與。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可作為單一療法經投與。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可作為組合療法之一部分經投與。在一些實施例中，組合療法可包含所提供之醫藥組合物及免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，本文所述之技術可用於先前已接受免疫檢查點抑制劑之患者。在一些實施例中，本文所述之技術可進一步包括向患者投與免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點抑制劑之實例包括但不限於PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑、CTLA4抑制劑、Lag-3抑制劑或其組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為或包含抗體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為或包含本文中 表 4或實例8中列出之抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗、納武單抗、派姆單抗、阿維魯單抗、西米普利單抗、阿特珠單抗、德瓦魯單抗或其組合。在一些實施例中，根據本揭示案可尤其有用之免疫檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗。在一些實施例中，根據本揭示案可尤其有用之免疫檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗及納武單抗。在一些實施例中，根據本揭示案可尤其有用之免疫檢查點抑制劑為或包含西米普利單抗。
在一些實施例中，本文所述之技術可用於在接受本文所述之醫藥組合物的患者中誘導免疫反應。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可在該患者中誘導免疫反應。
在一些實施例中，本文所述之方法可進一步包括確定患者之免疫反應水準。在一些實施例中，本文所述之此類方法可進一步包括將患者之免疫反應水準與已投與醫藥組合物的第二患者之免疫反應水準進行比較，其中該第二患者在投與時間之前經診斷患有癌症且係歸類為在投與時具有疾病跡象。在一些此類實施例中，投與之醫藥組合物在患者中誘導一定水準之免疫反應，該免疫反應水準與已投與該醫藥組合物、先前已經診斷患有癌症且歸類為在投與時具有疾病跡象之第二患者之免疫反應水準可比較。在一些實施例中，免疫反應水準係由本文所述之醫藥組合物誘導之從頭免疫反應。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與本文所述之醫藥組合物之前及之後確定患者之免疫反應水準。在一些此類實施例中，方法進一步包括將投與醫藥組合物之後患者之免疫反應水準與投與醫藥組合物之前患者之免疫反應水準進行比較。在一些實施例中，投與醫藥組合物之後患者之免疫反應水準與投與醫藥組合物之前患者之免疫反應水準相比有所增加。在一些實施例中，投與醫藥組合物之後患者之免疫反應水準與投與醫藥組合物之前患者之免疫反應水準相比得以維持。
在一些實施例中，本文所述之技術可在接受本文所述之醫藥組合物的患者中誘導適應性反應。在一些實施例中，本文所述之技術可在接受本文所述之醫藥組合物的患者中誘導T細胞反應。在一些實施例中，T細胞反應為或包含CD4+反應。在一些實施例中，T細胞反應為或包含CD8+反應。確定免疫反應水準之方法係此項技術中已知的。在一些實施例中，可使用干擾素-γ酶聯免疫吸收劑斑點(ELISpot)分析來確定患者之免疫反應水準。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括量測患者之淋巴組織中之NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之一或多者的水準。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括量測癌症中NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之一或多者的水準。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括量測患者之脾臟中的代謝活性水準。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與本文所述之醫藥組合物之前及之後量測患者之脾臟中的代謝活性水準。患者之脾臟中的代謝活性水準可藉由使用此項技術中已知之合適方法來量測，例如，在一些實施例中，使用正電子發射斷層掃描(PET)、電腦斷層掃描(CT)掃描、磁共振成像(MRI)或其組合。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括量測患者之血漿中的一或多種細胞介素之量。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與本文所述之醫藥組合物之前及之後量測患者之血漿中的一或多種細胞介素之量。待量測之一或多種細胞介素之非限制性實例包括干擾素(IFN)-α、IFN-γ、介白素(IL)-6、IFN誘導蛋白(IP)-10、IL-12 p70次單元或其組合。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括量測患者之癌症病灶的數目。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與本文所述之醫藥組合物之前及之後量測患者之癌症病灶的數目。在一些此類實施例中，與投與醫藥組合物之前相比，在投與醫藥組合物之後在患者中偵測到較少癌症病灶。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括量測患者中由本文所述之醫藥組合物誘導之T細胞的數目。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與醫藥組合物之後的複數個時間點量測患者中由本文所述之醫藥組合物誘導之T細胞的數目。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與第一劑量之醫藥組合物之後及在投與第二劑量之醫藥組合物之後量測患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的數目。在一些此類實施例中，與在投與第一劑量之醫藥組合物之後相比，在投與第二劑量之醫藥組合物之後，患者中由投與之醫藥組合物誘導之T細胞的數目較大。
在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與醫藥組合物之後確定患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的表型。在一些實施例中，患者中由投與之醫藥組合物誘導之T細胞的至少一個子集具有T輔助細胞-1表型。在一些實施例中，患者中由投與之醫藥組合物誘導之T細胞包含具有PD1+效應子記憶表型之T細胞。
在一些實施例中，本文所述之技術可用於投與至歸類為具有疾病跡象之患者。在一些此類實施例中，本文所述之用於歸類為具有疾病跡象之患者的方法進一步包括量測一或多個癌症病灶之大小。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括在投與本文所述之醫藥組合物之前及之後量測患者之一或多個癌症病灶的大小。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括比較在投與醫藥組合物之前及之後患者之一或多個癌症病灶的大小。在一些此類實施例中，在投與醫藥組合物之後患者之至少一個癌症病灶的大小等於或小於在投與醫藥組合物之前該至少一個癌症病灶的大小。
在一些實施例中，本文所述之用於歸類為具有疾病跡象之患者的方法進一步包括監測無進展存活之持續時間。在一些此類實施例中，本文所述之方法包括將患者的無進展存活之持續時間與無進展存活之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，無進展存活之例示性參考持續時間係尚未接受本文所述之醫藥組合物的複數個可比較患者之無進展存活之平均持續時間。在一些實施例中，投與本文所述之醫藥組合物的患者之無進展存活之持續時間在時間上比無進展存活之參考持續時間長。
在一些實施例中，本文所述之用於歸類為具有疾病跡象之患者的方法進一步包括量測疾病穩定化之持續時間。在一些實施例中，可藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病穩定化。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括將患者的疾病穩定化之持續時間與疾病穩定化之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，疾病穩定化之此類參考持續時間係尚未接受本文所述之醫藥組合物的複數個可比較患者之疾病穩定化之平均持續時間。在一些實施例中，與疾病穩定化之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的疾病穩定化之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之用於歸類為具有疾病跡象之患者的方法進一步包括量測腫瘤反應性之持續時間。在一些實施例中，藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定腫瘤反應性。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括將投與本文所述之醫藥組合物的患者之腫瘤反應性之持續時間與腫瘤反應性之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，腫瘤反應性之此類參考持續時間係尚未接受本文所述之醫藥組合物的複數個可比較患者之腫瘤反應性之平均持續時間。在一些實施例中，與腫瘤反應性之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的腫瘤反應性之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之技術可用於投與至歸類為不具有疾病跡象之患者。在一些此類實施例中，本文所述之方法進一步包括監測無疾病存活之持續時間。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括將患者的無疾病存活之持續時間與無疾病存活之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，無疾病存活之此類參考持續時間係尚未接受本文所述之醫藥組合物的複數個可比較患者之無疾病存活之平均持續時間。在一些實施例中，與無疾病存活之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的無疾病存活之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之用於歸類為不具有疾病跡象之患者的方法可進一步包括量測直至疾病復發之持續時間。在一些實施例中，藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病復發。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括將投與本文所述之醫藥組合物的患者之直至疾病復發之持續時間與直至疾病復發之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，直至疾病復發之此類參考持續時間係尚未接受本文所述之醫藥組合物的複數個可比較患者之直至疾病復發之平均持續時間。在一些實施例中，與直至疾病復發之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的直至疾病復發之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之技術可用於延長患者之總體存活。在一些實施例中，患者係歸類為具有疾病跡象。在一些實施例中，患者係歸類為不具有疾病跡象。
在一些態樣中，本文亦提供用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物。在一些實施例中，此類患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。在一些實施例中，醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子。
在一些態樣中，本文亦提供用於治療癌症之醫藥組合物。在一些實施例中，此類患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。在一些實施例中，醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物尤其可用於投與至患有黑色素瘤之患者。
本文所述之醫藥組合物的用途亦在本揭示案之範圍內。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應，例如，在一些實施例中，歸類為不具有疾病跡象但先前已經診斷患有癌症之患者。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可用於治療患者之癌症，例如，在一些實施例中，歸類為不具有疾病跡象但先前已經診斷患有癌症之患者。在一些實施例中，癌症為黑色素瘤。在一些實施例中，醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2021年7月29日提出申請之美國申請案第63/227,323號及2021年10月15日提出申請之美國申請案第63/256,377號的優先權，該等申請案中之每一者的完整內容由此以引用之方式併入。 某些定義
約或大約： 如本文所用，如應用於所關注之一或多個值的術語「大約」或「約」係指與規定之參考值相似的值。一般而言，熟悉上下文之熟習此項技術者將瞭解該上下文中由「約」或「大約」涵蓋之相關變化程度。舉例而言，在一些實施例中，術語「大約」或「約」可涵蓋在參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值內之一系列值。
投與： 如本文所用，術語「投與(administering/administration)」通常係指向個體投與組合物以實現將劑遞送至標靶位點或待治療位點，該劑為組合物或包括於組合物中。一般技術者將瞭解在適當情況下可用於投與至個體(例如人類)之多種路徑。例如，在一些實施例中，投與可為眼部、經口、非經腸、表面等。在一些特定實施例中，投與可為支氣管(例如，藉由支氣管滴注)、頰、真皮(其可為或包含例如表面至真皮、皮內、皮間、經皮等中之一或多者)、腸、動脈內、皮內、胃內、髓內、肌肉內、鼻內、腹膜內、鞘內、靜脈內、室內、特定器官內(例如肝內)、黏膜、鼻、經口、直腸、皮下、舌下、表面、氣管(例如，藉由氣管內滴注)、陰道、玻璃體等。在一些實施例中，投與可為非經腸。在一些實施例中，投與可為經口。在一些特定實施例中，投與可為靜脈內。在一些特定實施例中，投與可為皮下。在一些實施例中，投與可僅涉及單一劑量。在一些實施例中，投與可涉及應用固定數目的劑量。在一些實施例中，投與可涉及作為間歇性(例如，在時間上分開之複數個劑量)及/或週期性(例如，藉由共同時間段分開之個別劑量)給藥之給藥。在一些實施例中，投與可涉及連續給藥(例如，灌注)，至少持續所選時間段。在一些實施例中，投與可包含初免-加強方案。初免-加強方案可包括投與第一劑量之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)，隨後在一段時間間隔之後投與第二劑量之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)。在免疫原性組合物之情況下，初免-加強方案可導致患者之免疫反應增加。
抗體： 如本文所用，術語「抗體劑」係指特異性結合至特定抗原之劑。在一些實施例中，該術語涵蓋包括足以賦予特異性結合之免疫球蛋白結構元件之任何多肽或多肽複合物。在一些實施例中，抗體劑為或包含多肽，其胺基酸序列包括熟習此項技術者識別為免疫球蛋白可變域之結構元件。在一些實施例中，抗體劑係具有與免疫球蛋白結合域同源或很大程度上同源之結合域的多肽蛋白。
例示性抗體劑包括但不限於單株抗體或多株抗體。在一些實施例中，抗體劑可包括小鼠、兔、靈長類動物或人類抗體所特有之一或多個恆定區序列。在一些實施例中，抗體劑可包括一或多種序列元件，如此項技術中已知，該等序列元件為人類化、靈長類化、嵌合等。在多個實施例中，術語「抗體劑」用於指一或多種此項技術中已知或開發之構築體或形式，用於在替代呈現中利用抗體結構及功能特徵。例如，在一些實施例中，根據本揭示案使用之抗體劑係呈選自但不限於以下之形式：完整IgA、IgG、IgE或IgM抗體；雙特異性或多特異性抗體(例如Zybodies®等)；抗體片段，諸如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段及分離之互補決定區(CDR)或其集合；單鏈Fv；多肽-Fc融合物；單域抗體(例如鯊魚單域抗體，諸如IgNAR或其片段)；駱駝狀抗體；掩蔽抗體(例如Probodies®)；小型模塊化免疫藥物(「SMIPsTM」)；單鏈或串聯雙功能抗體(TandAb®)；VHH；Anticalins®；Nanobodies®微型抗體；BiTE®；錨蛋白重複蛋白或DARPINs®；Avimers®；DART；TCR樣抗體；Adnectins®；Affilins®；Trans-bodies®；Affibodies®；TrimerX®；MicroProteins；Fynomers®、Centyrins®；及KALBITOR®。在一些實施例中，抗體可缺乏其在天然產生時將具有之共價修飾(例如聚醣之連接)。在一些實施例中，抗體可含有共價修飾(例如，聚醣、有效載荷[例如可偵測部分、治療部分、催化部分等]或其他側基[例如聚-乙二醇等]之連接)。
與 …… 相關： 當該術語用於本文中時，若一個事件或實體之存在、水準及/或形式與另一事件或實體之存在、水準及/或形式相關聯，則兩個事件或實體彼此「相關」。舉例而言，若特定生物現象之存在與疾病、病症或疾患(例如癌症)之發生率及/或易感率(例如在相關群體中)或對治療之反應性的可能性相關聯，則認為該特定生物現象與該特定疾病、病症或疾患相關。
血源性樣品： 如本文所用，術語「血源性樣品」係指源自有需要之個體的血液樣品(亦即，全血樣品)之樣品。血源性樣品之實例包括但不限於血漿(包括例如新鮮冷凍血漿)、血清、血液部分、血漿部分、血清部分、包含紅血球(RBC)、血小板、白血球等之血液部分，以及包括其部分之細胞溶解產物(例如，可收穫且溶解細胞，諸如紅血球、白血球等，以獲得細胞溶解產物)。在一些實施例中，用於本文所述之表徵的血源性樣品為血漿樣品。
癌症 ：術語「癌症」在本文中一般用於指疾病或疾患，其中所關注組織之細胞展現相對異常、不受控及/或自主生長，使得其展現特徵在於細胞增生顯著失控之異常生長表型。在一些實施例中，癌症可包含癌前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移及/或非轉移細胞。在一些實施例中，癌症之特徵可在於實體腫瘤。在一些實施例中，癌症之特徵可在於血液腫瘤。一般而言，此項技術中已知之不同類型癌症之實例包括例如造血系統癌症，包括白血病、淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma))、骨髓瘤及骨髓增生性病症；肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、實體組織癌、口腔、咽喉、喉及肺鱗狀細胞癌、肝癌、泌尿生殖系統癌症(諸如前列腺、子宮頸、膀胱、子宮及子宮內膜癌)及腎細胞癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、皮膚或眼內黑色素瘤、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、乳癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、胃腸癌及神經系統癌症、良性病灶(諸如乳頭狀瘤)及其類似癌症。在特定實施例中，癌症可為黑色素瘤。
帽： 如本文所用，術語「帽」係指包含核苷-5'-三磷酸酯或基本上由核苷-5'-三磷酸酯組成之結構，其通常接合至未加帽RNA (例如，具有5'-二磷酸酯之未加帽RNA)之5'-末端。在一些實施例中，帽為或包含鳥嘌呤核苷酸。在一些實施例中，帽為或包含天然存在之RNA 5'帽，包括例如但不限於7-甲基鳥苷帽，其具有稱為「m7G」之結構。在一些實施例中，帽為或包含合成帽類似物，其類似於RNA帽結構且若連接至RNA，則具有使RNA穩定之能力，包括例如但不限於此項技術中已知之抗反向帽類似物(ARCA)。熟習此項技術者應理解，用於使帽接合至RNA 5'末端之方法為此項技術中已知的。例如，在一些實施例中，可藉由用加帽酶系統(包括例如但不限於牛痘加帽酶系統或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)加帽酶系統)對具有5'三磷酸酯基之RNA或具有5'二磷酸酯基之RNA進行活體外加帽來獲得加帽RNA。或者，可使用此項技術中已知之方法藉由單鏈DNA模板之活體外轉錄(IVT)來獲得加帽RNA，其中除了GTP以外，IVT系統亦含有二核苷酸帽類似物(包括例如m7GpppG帽類似物或N7-甲基, 2’-O-甲基-GpppG ARCA帽類似物或N7-甲基, 3'-O-甲基-GpppG ARCA帽類似物)。
共投與： 如本文所用，術語「共投與」係指使用本文所述之醫藥組合物及額外治療劑(例如，本文所述之化學治療劑)。本文所述之醫藥組合物及額外治療劑(例如本文所述之化學治療劑)之組合使用可同時或分開(例如以任何次序依次)執行。在本文所述之醫藥組合物的一些實施例中，本文所述之醫藥組合物及額外治療劑(例如本文所述之化學治療劑)組合於一種醫藥學上可接受之載劑中，或者其可置於單獨載劑中且在不同時間遞送至標靶細胞或投與至個體。此等情形中之每一種均預期屬於「共投與」或「組合」之含義內，其限制條件在於本文所述之醫藥組合物及額外治療劑(例如，本文所述之化學治療劑)在時間上充分接近地經遞送或投與，使得每一者對標靶細胞或所治療之個體產生的生物效應存在至少一些時間重疊。
組合療法： 如本文所用，術語「組合療法」係指其中個體同時暴露於兩種或更多種治療方案(例如兩種或更多種治療劑)之彼等情形。在一些實施例中，可同時投與兩種或更多種方案；在一些實施例中，此類方案可依序經投與(例如，第一方案之所有「劑量」均在第二方案之任何劑量的投與之前投與)；在一些實施例中，此類劑以重疊給藥方案經投與。在一些實施例中，組合療法之「投與」可涉及將一或多種劑或模態投與至接受該組合中之其他劑或模態之個體。為清楚起見，組合療法不要求個別劑在單一組合物中一起投與(或甚至在必要時同時)，不過在一些實施例中，兩種或更多種劑或其活性部分可在組合性組合物中一起投與。
可比較 ：如本文所用，術語「可比較」係指兩個或更多個劑、實體、情形、條件集合 等，其可能彼此不同，但足夠相似以允許在其間進行比較，使得熟習此項技術者應理解，可基於所觀察到的差異或相似性合理地得出結論。在一些實施例中，可比較之條件集合、情況、個體或群體之特徵在於複數個實質上相同的特徵及一個或少量不同特徵。一般技術者應理解，在上下文中，在任何既定情況下，對於被認為可比較之兩個或更多個此類劑、實體、情形、條件集合 等，需要什麼程度之一致性。例如，一般技術者應理解，當特徵在於足夠數目及類型之實質上相同之特徵時，情況集合、個體或群體係彼此可比較的，以保證如下合理結論，即在不同情況集合、個體或群體下或使用不同情況集合、個體或群體所獲得之結果或所觀察到的現象之差異係由彼等變化之特徵的變化引起或指示彼等變化之特徵的變化。
互補： 如本文所用，術語「互補」係參考與鹼基配對規則相關之寡核苷酸雜交使用。例如，序列「C-A-G-T」與序列「G-T-C-A」互補。互補性可為部分或全部的。因此，任何程度之部分互補性均意欲包括於術語「互補」之範圍內，其限制條件在於該部分互補性允許寡核苷酸雜交。部分互補性係根據鹼基配對規則，一或多個核酸鹼基不匹配。核酸之間的全部或完全互補性係在鹼基配對規則下，每個核酸鹼基均與另一鹼基匹配。
接觸： 如本文可互換使用，術語「遞送(delivery/delivering)」或「接觸」係指將ssRNA或包含ssRNA之組合物引入標靶細胞(例如，標靶細胞之細胞溶質)中。標靶細胞可活體外或離體培養或存在於個體中(活體內)。將ssRNA或包含ssRNA之組合物引入標靶細胞中之方法可隨活體外、離體或活體內應用而變化。在一些實施例中，可藉由活體外轉染將ssRNA或包含ssRNA之組合物引入細胞培養物中之標靶細胞中。在一些實施例中，可經由遞送媒劑(例如，本文所述之脂質奈米粒子)將ssRNA或包含ssRNA之組合物引入標靶細胞中。在一些實施例中，可藉由向個體投與本文所述之醫藥組合物將ssRNA或包含ssRNA之組合物引入個體之標靶細胞中。
偵測： 術語「偵測」在本文中廣泛使用以包括確定樣品中所關注實體之存在或不存在的適當手段或所關注實體之任何量測形式。因此，「偵測」可包括確定、量測、評估或分析所關注實體之存在或不存在、水準、量及/或位置。包括定量及定性確定、量測或評估，包括半定量。此類確定、量測或評估可為相對的，例如當相對於對照參考偵測所關注實體時，或者為絕對的。因此，當在對所關注實體定量之上下文中使用時，術語「定量」可指絕對或相對定量。絕對定量可藉由將所關注實體之偵測水準與已知對照標準相關聯(例如，經由標準曲線之生成)來完成。或者，可藉由比較兩個或更多個不同的所關注實體之間之偵測水準或量來實現相對定量，以提供該兩個或更多個不同的所關注實體中之每一者之相對定量，亦即，相對於彼此。
疾病： 如本文所用，術語「疾病」係指通常損害個體(例如，人類個體)之組織或系統的正常功能且通常藉由特徵性徵象及/或症狀表現之病症或疾患。在一些實施例中，例示性疾病為癌症。
編碼： 如本文所用，術語「編碼(encode/encoding)」係指第一分子之序列資訊指導產生具有確定之核苷酸序列(例如，mRNA)或確定之胺基酸序列的第二分子。例如，DNA分子可編碼RNA分子(例如，藉由包括DNA依賴性RNA聚合酶之轉錄過程)。RNA分子可編碼多肽(例如，藉由轉譯過程)。因此，若對應於基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生多肽，則該基因、cDNA或ssRNA (例如，mRNA)編碼該多肽。在一些實施例中，編碼腫瘤相關抗原(TAA)之ssRNA之編碼區係指編碼鏈，其核苷酸序列與此類腫瘤相關抗原之mRNA序列一致。在一些實施例中，編碼TAA之ssRNA之編碼區係指此類TAA之非編碼鏈，其可用作基因或cDNA轉錄之模板。
抗原決定基： 如本文所用，術語「抗原決定基」包括由患者之免疫系統特異性識別的任何部分。例如，抗原決定基可為由T細胞、B細胞、免疫球蛋白(例如，抗體或受體)、免疫球蛋白(例如，抗體或受體)、結合成分或適體特異性識別之任何部分。在一些實施例中，抗原決定基包含抗原上之複數個化學原子或基團。在一些實施例中，當抗原採用相關三維構形時，此類化學原子或基團為表面暴露的。在一些實施例中，當抗原採用此類構形時，此類化學原子或基團在空間上彼此物理接近。在一些實施例中，當抗原採用替代構形(例如，線性化)時，至少一些此類化學原子或基團彼此物理分離。
表現 ：如本文所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)由DNA序列產生RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2) RNA轉錄物之加工(例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'末端形成)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及/或(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
5' 非轉譯區： 如本文所用，術語「5'非轉譯區」或「5' UTR」係指在RNA之編碼區之轉錄起始位點與起始密碼子之間的mRNA分子之序列。在一些實施例中，「5’ UTR」係指mRNA分子之序列，該序列在RNA (例如，在其自然環境中)之編碼區之轉錄起始位點處開始且在起始密碼子(通常為AUG)之前一個核苷酸(nt)處結束。
同源性： 如本文所用，術語「同源性」或「同源物」係指聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)及/或多肽分子之序列為至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致，則其被視為彼此「同源」。在一些實施例中，若聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)及/或多肽分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相似(例如，在對應位置處含有具有相關化學特性之殘基)，則其被視為彼此「同源」。例如，如一般技術者所熟知，某些胺基酸通常係歸類為彼此相似之「疏水」或「親水」胺基酸，及/或具有「極性」或「非極性」側鏈。用一個胺基酸取代相同類型之另一胺基酸通常可被視為「同源」取代。
一致性： 如本文所用，術語「一致性」係指聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的總體相關性。在一些實施例中，若聚核苷酸分子(例如，DNA分子及/或RNA分子)及/或多肽分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致，則其被視為彼此「實質上一致」。舉例而言，可藉由以下方式來執行兩個核酸或多肽序列之一致性百分比的計算：比對兩個序列以實現最佳比較目的(例如，可在第一及第二序列中之一者或兩者中引入間隙以實現最佳比對且出於比較目的，可忽略非一致序列)。在某些實施例中，出於比較目的而比對之序列的長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或實質上100%。接著比較在對應位置處之核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之對應位置相同的殘基(例如，核苷酸或胺基酸)佔據時，則該等分子在彼位置處一致。兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列所共享之一致位置的數目而變，其中考慮到間隙之數目及每個間隙之長度，需要引入該長度間隙以實現兩個序列之最佳比對。可使用數學演算法來完成序列之比較及兩個序列之間之一致性百分比的確定。例如，可使用Meyers及Miller, 1989之演算法來確定兩個核苷酸序列之間之一致性百分比，該演算法已併入ALIGN程式(2.0版)中。在一些例示性實施例中，用ALIGN程式進行之核酸序列比較使用PAM120權重殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4。或者，可使用GCG套裝軟體中之GAP程式使用NWSgapdna.CMP矩陣來確定兩個核苷酸序列之間之一致性百分比。
RECIST 標準：如本文所用，術語「RECIST」或「RECIST標準」係指實體腫瘤反應評估準則。例如，RECSIT標準係如Eisenhauer等人(European J. Cancer 45: 228-247 (2009)，其以引用之方式整體併入本文中)所述。在一些實施例中，RECIST標準為RECIST 1.1。在一些實施例中，RECIST標準為iRECIST。舉例而言，iRECIST標準係如Seymour, L.等人(Lancet Oncol. 18:3 e143-e152 (2017)，其以引用之方式整體併入本文中)所述。在一些實施例中，RECIST標準為「irRECIST標準」，其為實體腫瘤免疫相關反應評估準則。舉例而言，irRECIST標準係如Nishino等人(Clin Cancer Res 19:3936-43 (2013)，其以引用之方式整體併入本文中)所述。在一些實施例中，irRECIST標準為irRECIST 1.1。在一些實施例中，RECIST標準為「imRECIST標準」，其為實體腫瘤免疫修飾反應評估準則。舉例而言，irRECIST標準係如Hodi等人(J Clin Oncol 36:850-8 (2018)，其以引用之方式整體併入本文中)所述。
局部晚期腫瘤： 如本文所用，術語「局部晚期腫瘤」或「局部晚期癌症」係指其技術公認含義，該含義可能隨不同類型之癌症而變化。例如，在一些實施例中，局部晚期腫瘤係指較大但尚未擴散至另一身體部位之腫瘤。在一些實施例中，局部晚期腫瘤用於描述已在其開始之組織或器官外部生長但尚未擴散至個體之身體內的遠端位點之癌症。僅舉例而言，在一些實施例中，局部晚期胰臟癌通常係指其中腫瘤延伸至鄰近器官(例如，淋巴結、肝臟、十二指腸、腸繫膜上動脈及/或腹腔幹)但不具有轉移性疾病之徵象的III期疾病；然而，陰性病理邊緣之完全手術切除係不可能的。
核酸 / 聚核苷酸 ：如本文所用，術語「核酸」係指至少10個或更多核苷酸之聚合物。在一些實施例中，核酸為或包含DNA。在一些實施例中，核酸為或包含RNA。在一些實施例中，核酸為或包含肽核酸(PNA)。在一些實施例中，核酸為或包含單鏈核酸。在一些實施例中，核酸為或包含雙鏈核酸。在一些實施例中，核酸包含單鏈部分及雙鏈部分。在一些實施例中，核酸包括包含一或多個磷酸二酯鍵聯之骨架。在一些實施例中，核酸包括包含磷酸二酯及非磷酸二酯鍵聯之骨架。例如，在一些實施例中，核酸可包括包含一或多個硫代磷酸酯或5'-N-亞磷醯胺鍵聯及/或一或多個肽鍵之骨架，例如，如在「肽核酸」中。在一些實施例中，核酸包含一或多個或所有天然殘基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、去氧腺苷、去氧胞苷、去氧鳥苷、去氧胸苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些實施例中，核酸包含一或多個或所有非天然殘基。在一些實施例中，非天然殘基包含核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、6-O-甲基鳥嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化鹼基、嵌入鹼基及其組合)。在一些實施例中，如與天然殘基中之彼等相比，非天然殘基包含一或多種經修飾之糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己糖)。在一些實施例中，核酸具有編碼功能性基因產物(諸如RNA或多肽)之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸具有包含一或多個內含子之核苷酸序列。在一些實施例中，可藉由自天然來源分離、酶合成(例如，藉由基於互補模板之聚合，例如活體內或活體外，在重組細胞或系統中繁殖，或化學合成來製備核酸。在一些實施例中，核酸為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500或20,000個或更多殘基或核苷酸長。
核酸粒子： 「核酸粒子」可用於將核酸遞送至所關注之標靶位點(例如，細胞、組織、器官及其類似位點)。核酸粒子可由至少一種陽離子或陽離子可電離之脂質或類脂質材料、至少一種陽離子聚合物(諸如魚精蛋白)或其混合物及核酸形成。核酸粒子包括基於脂質奈米粒子(LNP)及基於脂質複合物(LPX)之調配物。
核苷酸： 如本文所用，術語「核苷酸」係指其技術公認含義。當核苷酸之數目用作(例如，聚核苷酸)大小之指示時，特定數目之核苷酸係指單鏈(例如，聚核苷酸)上之核苷酸數目。
患者 ：如本文所用，術語「患者」係指患有疾病或病症或疾患或處於疾病或病症或疾患風險中之任何生物體。典型患者包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物及/或人類)。在一些實施例中，患者為人類。在一些實施例中，患者患有或易患一或多種疾病或病症或疾患。在一些實施例中，患者呈現疾病或病症或疾患之一或多種症狀。在一些實施例中，患者已經診斷患有一或多種疾病或病症或疾患。在一些實施例中，可經受所提供之技術的疾病或病症或疾患為或包括癌症，或存在一或多種腫瘤。在一些實施例中，患者正在接受或已接受某一療法以診斷及/或治療疾病、病症或疾患。在一些實施例中，患者為癌症患者。
多肽 ：如本文所用，術語「多肽」通常具有其技術公認含義，即至少三個或更多個胺基酸之聚合物。一般技術者應理解，術語「多肽」意欲足夠籠統以不僅涵蓋具有本文所述之完整序列的多肽，而且涵蓋代表此類完整多肽之功能性、生物活性或特徵性片段、部分或域(例如，保留至少一種活性之片段、部分或域)的多肽。在一些實施例中，多肽可含有L-胺基酸、D-胺基酸或兩者及/或可含有此項技術中已知之多種胺基酸修飾或類似物中之任一者。可用修飾包括例如末端乙醯化、醯胺化、甲基化等。在一些實施例中，多肽可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸及其組合(例如 ，可為或包含肽模擬物)。
參考 / 參考標準： 如本文所用，「參考」描述標準或對照，相對於該標準或對照執行比較。例如，在一些實施例中，將所關注之劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值與參考或對照劑、動物、個體、群體、樣品、序列或值進行比較。在一些實施例中，與所關注之測試或確定實質上同時，對參考或對照進行測試及/或確定。在一些實施例中，參考或對照為歷史參考或對照，視情況體現於有形媒體中。在一些實施例中，參考或對照為或包含一組規範(例如，接受準則)。通常，如熟習此項技術者應理解，參考或對照係在與經評估之彼等條件或情況可比較的條件或情況下經確定或表徵。熟習此項技術者應瞭解何時存在足夠相似性以證明對特定之可能參考或對照的依賴性及/或與之比較係正確的。
核糖核苷酸： 如本文所用，術語「核糖核苷酸」涵蓋未經修飾之核糖核苷酸及經修飾之核糖核苷酸。例如，未經修飾之核糖核苷酸包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核糖核苷酸可包括一或多種修飾，包括但不限於例如(a)末端修飾，例如5'末端修飾(例如磷酸化、去磷酸化、結合、反向鍵聯 等)、3'末端修飾(例如，結合、反向鍵聯 等)，(b)鹼基修飾，例如用經修飾之鹼基、穩定化鹼基、去穩定化鹼基、或與擴展之搭配物譜系進行鹼基配對之鹼基、或結合鹼基置換，(c)糖修飾(例如，在2'位置或4'位置處)或糖置換，及(d)核苷間鍵聯修飾，包括磷酸二酯鍵聯之修飾或置換。術語「核糖核苷酸」亦涵蓋三磷酸核糖核苷酸，包括經修飾及未經修飾之三磷酸核糖核苷酸。
核糖核酸 (RNA) ： 如本文所用，術語「RNA」係指核糖核苷酸之聚合物。在一些實施例中，RNA為單鏈。在一些實施例中，RNA為雙鏈。在一些實施例中，RNA包含單鏈部分及雙鏈部分。在一些實施例中，RNA可包含如上文「 核酸 / 聚核苷酸」定義中所述之骨架結構。RNA可為調節RNA (例如siRNA、微小RNA等)或信使RNA (mRNA)。在一些實施例中，RNA為mRNA。在其中RNA為mRNA之一些實施例中，RNA通常在其3'末端包含poly(A)區。在其中RNA為mRNA之一些實施例中，RNA通常在其5'末端包含技術公認之帽結構，例如用於識別mRNA且將其連接至核糖體以起始轉譯。在一些實施例中，RNA為合成RNA。合成RNA包括活體外(例如，藉由酶合成方法及/或藉由化學合成方法)合成之RNA。
選擇性或特異性： 術語「選擇性」或「特異性」當在本文中參考具有活性之劑使用時，熟習此項技術者應理解為意謂該劑區分潛在標靶實體、狀態或細胞。例如，在一些實施例中，若劑在一或多個競爭性替代標靶存在下優先與其標靶結合，則據說該劑「特異性」結合至彼標靶。在多個實施例中，特異性相互作用取決於標靶實體之特定結構特徵(例如，抗原決定基、裂縫、結合位點)之存在。應理解，特異性無需為絕對的。在一些實施例中，可相對於標靶結合部分對一或多個其他潛在標靶實體(例如，競爭者)之特異性來評估特異性。在一些實施例中，相對於參考特異性結合部分之特異性來評估特異性。在一些實施例中，相對於參考非特異性結合部分之特異性來評估特異性。
特異性結合： 如本文所用，術語「特異性結合」係指在其中發生結合之環境中區分可能的結合搭配物之能力。當存在其他潛在標靶時與一個特定標靶相互作用之抗體劑據說「特異性結合」至與其相互作用之標靶。在一些實施例中，藉由偵測或確定抗體劑之CDR與其搭配物之間的締合程度來評估特異性結合；在一些實施例中，藉由偵測或確定抗體劑-搭配物複合物之解離程度來評估特異性結合；在一些實施例中，藉由偵測或確定抗體劑競爭其搭配物與另一實體之間的替代相互作用之能力來評估特異性結合。在一些實施例中，藉由在一系列濃度下執行此類偵測或確定來評估特異性結合。
個體 ：如本文所用，術語「個體」係指欲投與本文所述之組合物的生物體，例如用於實驗、診斷、預防及/或治療目的。典型個體包括動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物、家養寵物等)及人類。在一些實施例中，個體為人類個體。在一些實施例中，個體患有疾病、病症或疾患(例如癌症)。在一些實施例中，個體易患疾病、病症或疾患(例如癌症)。在一些實施例中，個體呈現疾病、病症或疾患(例如癌症)之一或多種症狀或特徵。在一些實施例中，個體呈現疾病、病症或疾患(例如癌症)之一或多种非特異性症狀。在一些實施例中，個體未呈現疾病、病症或疾患(例如癌症)之任何症狀或特徵。在一些實施例中，個體係具有對疾病、病症或疾患(例如癌症)之易感性或風險所特有之一或多種特徵的人。在一些實施例中，個體為患者。在一些實施例中，個體係投與及/或已投與診斷及/或療法之個體。
患有 ：「患有」疾病、病症及/或疾患之個體已經診斷患有疾病、病症及/或疾患及/或呈現疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀。
合成： 如本文所用，術語「合成」係指人工實體，或藉由人為干預製成之實體，或合成產生而非天然存在之實體。舉例而言，在一些實施例中，合成核酸或聚核苷酸係指以化學方式合成(例如，在一些實施例中藉由固相合成)之核酸分子。在一些實施例中，術語「合成」係指在生物細胞外部製成之實體。例如，在一些實施例中，合成核酸或聚核苷酸係指使用模板藉由活體外轉錄產生之核酸分子(例如RNA)。
治療劑： 如本文可互換使用，片語「治療劑」或「療法」係指當投與至個體或患者時具有治療效應及/或引發所需生物學及/或藥理學效應之劑或干預。在一些實施例中，治療劑或療法係可用於減輕、改善、緩解、抑制、預防疾病、病症及/或疾患、延遲其發作、降低其嚴重性及/或降低其一或多種症狀或特徵之發生率的任何物質。在一些實施例中，治療劑或療法為醫學干預(例如，手術、放射、光療法)，其可經執行以減輕、緩解、抑制、預防疾病、病症及/或疾患、延遲其發作、降低其嚴重性及/或降低其一或多種症狀或特徵之發生率。
3' 非轉譯區 ：如本文所用，術語「3'非轉譯區」或「3' UTR」係指在開放閱讀框序列之編碼區之終止密碼子之後開始的mRNA分子之序列。在一些實施例中，3' UTR在開放閱讀框序列(例如，在其自然環境中)之編碼區之終止密碼子之後立即開始。在其他實施例中，3' UTR未在開放閱讀框序列(例如，在其自然環境中)之編碼區之終止密碼子之後立即開始。
閾值水準 ( 例如 ，接受準則 ) ：如本文所用，術語「閾值水準」係指用作參考以獲得有關量測結果(例如，在分析中獲得的量測結果)之資訊及/或歸類量測結果之水準。例如，在一些實施例中，閾值水準意謂在定義群體之兩個子集(例如，滿足品質控制準則之批次對不滿足品質控制準則之批次)之間的分界線之分析中量測之值。因此，等於或高於閾值水準之值定義群體之一子集，且低於閾值水準之值定義群體之另一子集。閾值水準可基於一或多個對照樣品或在一組對照樣品中確定。可在進行所關注之量測之前、同時或之後確定閾值水準。在一些實施例中，閾值水準可為值之範圍。
治療 ：如本文所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指用於部分地或完全地減輕、改善、緩解、抑制、預防疾病、病症及/或疾患、延遲其發作、降低其嚴重性及/或降低其一或多種症狀或特徵之發生率的任何方法。可將治療投與至未展現疾病、病症及/或疾患之徵象之個體。在一些實施例中，可將治療投與至僅展現疾病、病症及/或疾患之早期徵象之個體，例如以達成降低發展與疾病、病症及/或疾患相關之病變之風險的目的。在一些實施例中，可將治療投與至處於疾病、病症及/或疾患後期之個體。
不可切除之腫瘤 ：如本文所用，術語「不可切除之腫瘤」通常係指不能藉由手術移除之腫瘤。在一些實施例中，不可切除之腫瘤係指涉及基本器官或組織(包括可能無法重建之血管)及/或生長至其中及/或另外位於在不對一或多個其他關鍵或基本器官及/或組織(包括血管)造成不合理的損傷風險的情況下無法輕易接近之位置的腫瘤。在一些實施例中，不可切除之腫瘤係指不能在不對患者造成損傷風險的情況下藉由手術切除之腫瘤，該損傷在合理醫學判斷中經確定為超過彼患者預期藉由切除獲得之益處。在一些實施例中，腫瘤之「不可切除性」係指實現邊緣陰性(R0)切除之可能性。在胰臟癌之背景下，由腫瘤包裹主要血管(諸如腸繫膜上動脈(SMA)或腹腔幹)、門靜脈阻塞以及存在腹腔或主動脈旁淋巴結病一般被視為排除R0手術之發現。熟習此項技術者應理解確定腫瘤是否不可切除之參數。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養及轉化(例如，電穿孔、脂質轉染)。可根據製造商之說明書或如此項技術中通常所實現或如本文所述來執行酶反應及純化技術。前述技術及程序一般可根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所述來執行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))，其出於任何目的以引用之方式併入本文中。 某些實施例之詳細描述
對於患有復發或難治性晚期實體腫瘤之患者，照護標準(SOC)之後果仍然很差。治療選項包括進一步姑息性化學療法，其在先前重複暴露於細胞毒性化合物之後可能不太耐受，或最佳支持照護，以及未證實益處之研究性治療。此群體之療法不能治愈，預期總體存活為數月。疫苗已成為一些具有高度未滿足的醫療需求之癌症之有效治療選項。然而，治療患有難治性腫瘤之患者的疫苗試驗基本上不成功。因此，開發治療各種癌症類型(包括難治性癌症)之疫苗之醫療需求仍然很高。
本揭示案尤其提供用包含編碼腫瘤相關抗原(TAA)之RNA之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)治療癌症(例如黑色素瘤(例如，晚期黑色素瘤))之見解及技術。本揭示案尤其提供如下見解，即本文所述之醫藥組合物在投與至首次投與時不具有疾病跡象之患者時可尤其有用及/或有效，由此顯示該醫藥組合物誘導T細胞免疫性，即使不存在可偵測腫瘤。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供向患者投與至少一個劑量之本文所述之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)的方法，該醫藥組合物包括RNA分子及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。在一些實施例中，一或多種RNA分子編碼一或多種腫瘤相關抗原(TAA)，當投與至患者時，該等RNA分子組合以誘導針對由該一或多種RNA分子編碼之一或多種TAA的強適應性免疫反應(例如，CD4 +及/或CD8 +T細胞免疫反應)。不希望受任何特定理論束縛，本揭示案提出此類醫藥組合物可在癌症患者(例如，患有不可切除之癌症(例如黑色素瘤)之患者、已經接受或正在接受檢查點抑制劑之患者或具有兩者之患者)中實現抗原特異性T細胞免疫性及持久客觀反應。詳言之，本揭示案亦教示藉由將如本文所述之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)投與至患者，該患者在投與時間之前經診斷患有癌症，但其中該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。
不具有疾病跡象可為根據RECIST標準之分類。在一些實施例中，不具有疾病跡象並不意謂患者未患任何疾病，而是無跡象表明疾病存在，尤其如根據RECIST標準所確定。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供如下見解，即mRNA編碼包含腫瘤相關抗原(TAA)、其免疫原性變異體、或TAA之免疫原性片段或其免疫原性變異體之胺基酸序列。因此，mRNA編碼至少包含TAA或其免疫原性變異體之抗原決定基之肽或蛋白質，用於誘導針對TAA之免疫反應。在一些實施例中，本揭示案尤其提供向患者遞送一或多種RNA分子之RNA技術，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合。在一些實施例中，單一RNA分子編碼以下所有：(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，及(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原。在一些實施例中，編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，及(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原之序列不存在於單一RNA分子上。例如，第一RNA分子可能編碼以下兩者：(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，及(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，且第二RNA分子可能編碼剩餘兩者。作為另一實例，編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，及(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原之序列可能各自存在於不同RNA分子上，以致每一RNA分子僅編碼一種抗原。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供如下見解，即醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)與脂質粒子(例如脂質複合物或脂質奈米粒子)一起經調配以投與至患者(例如靜脈內(IV)、肌肉內或皮下投與)。詳言之，包含一或多種編碼至少一種TAA (例如NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及/或TPTE抗原)或其免疫原性片段之RNA (例如mRNA)分子之醫藥組合物與脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)一起經調配以投與至患者(例如IV、肌肉內或皮下投與)。不希望受任何特定理論束縛，如本文所述之醫藥組合物(例如免疫原性組合物，例如疫苗)可由未成熟樹突狀細胞攝取且RNA分子經轉譯用於HLA I類及II類分子上增強之抗原呈現。在一些實施例中，TAA (例如NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及/或TPTE抗原)由RNA (例如mRNA)表現，例如，該RNA經工程改造以用於最小免疫原性，及/或在脂質奈米粒子(例如，LNP)中進行調配。在一些實施例中，編碼至少一種TAA (例如，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及/或TPTE抗原)之RNA (例如，mRNA)可包含經修飾之核苷酸(例如但不限於假尿苷)。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供向患者投與至少一個劑量之醫藥組合物的方法，該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)；其中該患者在投與時間之前經診斷患有癌症，但該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象(例如，藉由應用實體腫瘤反應評估準則(RECIST)標準，例如RECIST1.1標準或irRECIST標準確定不具有疾病跡象)。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供向罹患癌症之患者投與至少一個劑量之醫藥組合物的方法，其中該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)；且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症(例如，黑色素瘤)。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)；且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症(例如，黑色素瘤)。根據RECIST標準，例如RECIST1.1標準或irRECIST標準，可確定不具有疾病跡象。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含：(a)一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及(b)脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。 I. 先前方法
本揭示案提供用於治療癌症之技術。可藉由本文所述之技術治療之例示性癌症為黑色素瘤。與黑色素瘤相關之健康風險可能很大，且晚期或轉移性黑色素瘤(例如，不可切除之III期、IV期)仍為致命疾病。例如，對於不可切除之III/IV期及復發性黑色素瘤之全身性治療，目前有兩種方法已在隨機化試驗中證明無進展存活(PFS)及總體存活(OS)之改良。彼兩種方法為(1)檢查點抑制(PD-1/PD-L1抑制、CTLA-4抑制)，及(2)靶向促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)路徑。雖然此等方法已取得了一定程度之成功，但均經歷了挑戰且可能受益於與本文所述之技術組合或由本文所述之技術替代。下文描述目前方法之概述。 A. 全身性療法 1. 檢查點抑制劑
靶向細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4；例如，伊匹單抗)及程序性死亡1 (PD-1；例如，納武單抗及派姆單抗)之免疫檢查點抑制劑(CPI)已獲批單獨或組合用於治療晚期或轉移性黑色素瘤(YERVOY ®USPI；OPDIVO ®USPI；KEYTRUDA ®USPI，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中)。在一線療法中，分別與單劑伊匹單抗或納武單抗相比，納武單抗及伊匹單抗組合療法已導致經改良之總體反應率(ORR；57%對19%對44%)及中值PFS (11.5個月對2.9個月對6.9個月)。然而，該組合與實質毒性相關且尚未完全確定組合療法對總體存活之影響(Wolchok等人，2017，其以引用之方式整體併入本文中)。對於並非組合療法之候選者的患者，使用抗PD-1療法(例如，派姆單抗或納武單抗)或CTLA-4抑制劑(例如，伊匹單抗)之單一療法治療亦為一種選項。 2. 信號轉導抑制劑
大約一半患有轉移性皮膚黑色素瘤之患者具有原癌基因B-Raf (BRAF)之活化突變，BRAF為MAPK路徑中之細胞內信號傳導激酶。BRAF抑制劑(例如，維莫非尼(vemurafenib)及達拉非尼(dabrafenib))已在具有BRAF V600突變之黑色素瘤中顯示臨床活性。BRAF抑制劑在患有BRAF突變型黑色素瘤之患者中具有單一療法功效，但由於抗藥性之發展，一半患者在大約6個月內復發。對患有先前未治療之不可切除或轉移性疾病的患者而言，與BRAF抑制劑單一療法相比，使用BRAF及MEK抑制劑之組合療法避免了抗性且具有較佳功效(例如，經改良之ORR、反應持續時間、PFS及OS)。儘管如此，50%對組合療法有反應之患者在前12個月內仍有進展(Mackiewicz等人，2018；Gellrich等人，2020，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中)。派姆單抗及納武單抗亦獲批用於具有BRAF突變之患者之一線治療。對於患有進展不快之BRAF V600突變型腫瘤的患者，目前推薦之治療次序為免疫療法(例如抗PD-1療法)，隨後為使用BRAF/MEK抑制劑之靶向療法(Michielin等人，2019，其以引用之方式整體併入本文中)。 3. 病灶內療法
拉他莫基(Talimogene laherparepvec，T-vec，商標名Imlygic ®)為經遺傳修飾之溶瘤病毒療法，適用於對患有在初次手術之後復發的黑色素瘤之患者的不可切除之皮膚、皮下及淋巴結病灶進行局部治療。T-vec為經修飾之單純皰疹病毒1型(HSV-1)，其已經歷遺傳修飾(插入人類細胞介素粒細胞巨噬細胞-群落刺激因子[GM-CSF]基因之2個複本)以促進腫瘤細胞中之選擇性病毒複製，同時降低病毒致病性且促進免疫原性。在一項隨機化III期試驗中，腫瘤內T-vec與皮下GM-CSF相比，顯示26%對5.7%之客觀反應率。然而，總體存活之可見差異並未達到統計學顯著性且內臟病灶之反應率很差(Rehman等人，2016，其以引用之方式整體併入本文中)。因此，此治療選項可能適合所選患者。 4. 其他療法
患有在靶向療法或免疫療法中出現進展之晚期或轉移性黑色素瘤之患者的治療選項可包括高劑量介白素(IL)-2或其他細胞毒性療法(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、卡鉑/太平洋紫杉醇、白蛋白結合之太平洋紫杉醇)。此等劑在一線及二線設定中具有小於20%之適度反應率，但在PD-1後設定中不存在資料。此外，關於最佳標準化學療法幾乎沒有共識(Swetter等人，2021，其以引用之方式整體併入本文中)。關於c-kit抑制劑，報導了初步有希望的結果，反應率為23.3% (Guo等人，2011，其以引用之方式整體併入本文中)，而靶向MAPK級聯以及VEGF及PDGF級聯之多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)在與卡鉑及太平洋紫杉醇組合之III期、隨機化、雙盲、安慰劑對照試驗中與安慰劑相比，未改良中值PFS (Hauschild等人，2009，其以引用之方式整體併入本文中)。 5. 輔助療法
對於患有處於III期以及完全切除之IV期(不具有疾病跡象)的完全切除之皮膚黑色素瘤的患者之治療，已推薦輔助治療(Swetter等人，2021，其以引用之方式整體併入本文中)。
對於此等患者組，輔助治療已基於使用免疫檢查點抑制劑及BRAF靶向療法之多項前瞻性臨床試驗。輔助設定中之臨床試驗已顯示，當與習知療法相比時，免疫檢查點抑制劑及BRAF靶向療法改良無復發存活(RFS)或無疾病存活率，以及在3年或5年時提供更高總體存活(OS)率。然而，對於輔助治療之毒性存在擔憂，例如在輔助免疫檢查點抑制之後，25%至41%之患者出現3至4級不良事件(AE)且較低比例之患者具有終生AE (主要與免疫相關) (Gershenwald等人，2017，其以引用之方式整體併入本文中)。 6. 所描述技術之例示性特徵的概述
基於上述治療選項之前景，在使用獲批療法治療III期及IV期黑色素瘤方面已取得重大進展。然而，據報導大約40%至45%之患者對初始療法無反應，顯示原發性抗性，且據報導另外30%至40%經歷初始反應，但最終存在進展，具有繼發性抗性(Mooradian及Sullivan，2019，其以引用之方式整體併入本文中)。患有原發性難治性疾病或繼發性復發之患者的此等子集代表醫療需求未得到滿足之群體，證明有理由開發新療法以用於患有不可切除之III期及IV期黑色素瘤之患者，以便誘導更高的初始反應率，從而降低原發性抗性，以及用於患有復發性黑色素瘤之患者(Testori等人，2020，其以引用之方式整體併入本文中)。此外，與單獨抗PDI療法相比，在抗PD-1治療中添加新穎療法可增加反應。
可用治療選項之耐受性目前排除了對患有IIB期或IIC期高危疾病之患者使用輔助療法且亦部分地排除了對患有III期疾病之患者使用輔助療法。具有較佳耐受性型態之新全身性療法可允許治療患者之此子集且改良患有完全切除之疾病之患者的可用輔助治療選項。
本文所述之例示性組合物包含TAA：NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3及TPTE。除其他原因外，此等癌症疫苗標靶係基於以下準則加以選擇： • 毒性相關器官中之低表現或缺乏表現。 • 大部分黑色素瘤細胞中之表現。 • 誘導抗原特異性免疫反應之能力。 • 根據文獻，腫瘤生物學作用。
此外，此等TAA之選擇至少部分地歸因於I期Lipo-MERIT試驗中之組織表現分析。在此試驗中，大約8%之經篩選患者在腫瘤或轉移中未表現可偵測水準之此四種抗原中之任一者。考慮到癌症之純系異質性及臨床可用樣品之限制(僅一個位置)，本揭示案提供如下認識，即有可能超過92%觀察率之患者實際上表現所選TAA中之至少一者。此外，在很大一部分患者中，發現此等TAA中之一些經共表現。因此，本揭示案提供如下見解，即預期大量黑色素瘤患者將發展多抗原決定基、疫苗誘導之免疫反應且受益於用本文所述之組合物進行的治療。如本文所用，術語「BNT111」係指包含NY-ESO-1抗原、酪胺酸酶抗原、MAGE-A3抗原及TPTE抗原之醫藥組合物，優先如 表 3所示經調配。
在一些實施例中，本文所述之組合物(例如BNT111)可啟動、活化及/或擴展CD4 +及CD8 +T細胞特異性，且因此產生針對非突變型TAA之T細胞特異性之互補池，該等非突變型TAA經常在人類黑色素瘤中表現，而與腫瘤之突變負荷無關。
本文所述之組合物(例如BNT111)之脂質體調配物係經設計以將抗原遞送至次級淋巴組織中，且利用抗病毒先天性及適應性免疫機制來誘導高度有效之抗原特異性T細胞反應。經靜脈內投與之本文所述之組合物(例如BNT111)可遞送至次級淋巴組織(例如，脾臟、淋巴結及骨髓)且由抗原呈現細胞(APC)迅速攝取。自本文所述之組合物(例如BNT111)之RNA組分轉譯的蛋白質可在患者之HLA I類及HLA II類分子之個別集合上加工且呈現(Kranz等人，2016，其以引用之方式整體併入本文中)。APC與淋巴組織中之T細胞之緊密接近代表用於有效啟動及擴增CD8 +及CD4 +T細胞反應之理想的微環境(Zinkernagel等人，1997，其以引用之方式整體併入本文中)。本文所述之組合物之組分經由類鐸受體信號傳導活化APC，這導致諸如IFN-α、IL-6、IFN-γ及IP-10之促發炎細胞介素的脈衝釋放。此外，伴隨有效抗原呈現之I型干擾素之分泌刺激免疫細胞且直接抑制調節性T細胞(Srivastava等人，2014，其以引用之方式整體併入本文中)，其與同源CD4 +T輔助細胞組合，對於克服對自身抗原之耐受性係必要的。基於此類雙重作用機制，重複投與本文所述之組合物(例如BNT111)允許有效啟動及快速擴增抗原特異性CD8 +T細胞反應。
連同TAA表現資料及所觀察到的雙重作用機制，本揭示案提供如下預期，即大多數黑色素瘤患者將發展從頭或增強之多抗原決定基、疫苗誘導之抗原特異性免疫反應且受益於用本文所述之組合物進行的治療。
原生T細胞之活化、擴增及分化在生理學上與免疫調節檢查點分子PD-1之誘導相關(Sharpe及Pauken 2018，其以引用之方式整體併入本文中)。因此，如本文進一步論述，抗PD-1/抗PD-L1阻斷將增強由本文組合物(例如BNT111)誘導之T細胞反應之活性，如小鼠腫瘤模型中之非臨床資料所支持。經PD-1/PD-L1阻斷治療之患者治療失敗的一個原因係缺乏識別相關腫瘤抗原之預形成之抗原特異性T淋巴細胞。在一些實施例中，此類T淋巴細胞由本文所述之組合物(例如BNT111)引發，該等組合物誘導有效的抗原特異性CD4 +及CD8 +T細胞反應。此等T細胞不僅在識別腫瘤細胞上之其標靶抗原後藉由其細胞毒性執行直接抗腫瘤活性，而且在腫瘤微環境中誘導發炎(例如，IFN-γ分泌)，由此使腫瘤細胞對檢查點抑制劑之治療效應敏感。
在一些實施例中，對於抗PD-1/抗PD-L1療法難治或其後復發之患者(意謂僅活化預存在之記憶T細胞不足以介導臨床活性)，添加PD- 1抑制劑(其將拯救新啟動之T細胞特異性免於耗盡)將擴增本文所述之組合物(例如BNT111)的效應。
在一些實施例中，若治療用於預治療較少之患者群體，則本文所述之組合物(例如BNT111)及PD-1抑制劑之組合的25%客觀反應率及22%疾病控制率(在中值為5次先前治療之患者中)可更高。 I. 腫瘤相關抗原
在一些實施例中，本揭示案尤其提供一或多種編碼抗原之RNA分子。在一些實施例中，抗原為腫瘤相關抗原(TAA)。本揭示案提供如下見解，即很大一部分黑色素瘤患者累積性表現四種TAA中之至少一者，而與腫瘤之突變負荷無關。在一些實施例中，一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合。此等抗原已以高盛行率在黑色素瘤患者中觀察到。又據報導，此等抗原在癌細胞中具有選擇性表現。本揭示案提供如下見解，即NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及/或TPTE抗原之選擇性表現可提供低風險之中靶/非腫瘤毒性(on-target/off-tumor toxicity)。在一些實施例中，預期一或多種編碼抗原(例如TAA，例如NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及/或TPTE抗原)之RNA分子可誘導多抗原決定基CD8 +及CD4 +T細胞反應，導致殺死表現至少一種靶向抗原之腫瘤細胞。
在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者為全長、非突變型抗原。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原全部均為全長、非突變型抗原。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原及TPTE抗原為全長、非突變型抗原。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原及MAGE-A3抗原為全長、非突變型抗原。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者並非全長抗原。例如，在一些實施例中，酪胺酸酶抗原並非全長的，而是僅包含一部分酪胺酸酶。在一些實施例中，酪胺酸酶抗原包含信號肽、EGF樣域、CμA域、CμB域或其組合。在一些實施例中，TPTE抗原並非全長的，而是僅包含一部分TPTE抗原。
在一些實施例中，在投與一或多種RNA分子(例如，一或多種共同編碼(i) NY-ESO-1抗原、(ii) MAGE-A3抗原、(iii)酪胺酸酶抗原、(iv) TPTE抗原或(v)其組合之RNA分子)之後，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者自患者之淋巴組織中的樹突狀細胞表現。
在一些實施例中，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者存在於癌症(例如，黑色素瘤)中。在一些實施例中，本文所述之方法包括確定患者之癌症中NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者的存在及/或豐度(例如，水準或量)。例如，在一些實施例中，自患者分離樣品(例如，血液或血液組分(例如，血清或血漿)樣品或腫瘤生檢)且評估NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原之一的存在及/或豐度(例如，水準或量)。
紐約食管鱗狀細胞癌 (NY-ESO-1) 抗原 ：NY-ESO-1抗原為癌症睪丸抗原(CTA)基因家族之成員。所有CTA基因中之大約50%在X染色體上形成多基因家族且稱為CT-X基因。此等CTA位於染色體上之特定簇中，在Xq24-q28區域中密度最高(參見Thomas等人， Front. Immunol.9:947 (2018)，其以引用之方式整體併入本文中)。不希望受理論束縛，通常咸信NY-ESO-1表現主要局限於睪丸生殖細胞及胎盤滋養細胞，在正常健康成年體細胞中在轉錄物或蛋白質層面上無表現或低表現。NY-ESO-1在各種人類癌症中表現，包括黑色素瘤(Giavina-Bianchi等人， J. Immunol. Res.2015，其以引用之方式整體併入本文中)。根據至少一份報告，在約20%之侵襲性黑色素瘤中偵測到NY-ESO-1蛋白(Giavina-Bianchi)。
在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原或其免疫原性片段。在一些實施例中，編碼NY-ESO-1抗原之單一RNA分子為全長、非突變型抗原。在一些實施例中，本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼不包含與黑色素瘤癌症進展相關的胺基酸取代之NY-ESO-1抗原(例如，NY-ESO-1抗原之野生型胺基酸序列)。
在一些實施例中，NY-ESO-1抗原包含與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，NY-ESO-1抗原包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，NY-ESO-1抗原由與SEQ ID NO: 2之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核酸序列編碼。
黑色素瘤相關抗原 A3 (MAGE-A3) 抗原： MAGE-A3抗原為MAGEA基因家族之成員。MAGEA基因在染色體位置Xq28處叢集。其與一些遺傳性病症，諸如先天性角化不良症有關。已提出MAGE-A3增強RING型含鋅指E3泛素蛋白連接酶之泛素連接酶活性且可增強TRIM28之泛素連接酶活性，且藉由TRIM28刺激p53/TP53泛素化。亦提出，MAGE-A3經由在E3:受質複合物處募集Ubl結合酶(E2)及/或使其穩定化而發揮作用。認識到MAGE-A3在胚胎發育中發揮作用，且在腫瘤轉化或腫瘤進展態樣中再表現。在一些實施例中，活體外表現促進黑色素瘤細胞株中之細胞活力。已知MAGE-A3抗原在黑色素瘤上表現時由T細胞識別。
在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原或其免疫原性片段。在一些實施例中，單一RNA分子編碼全長、非突變型MAGE-A3抗原。在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼不包含與黑色素瘤癌症進展相關的胺基酸取代之MAGE-A3抗原(例如，MAGE-A3抗原之野生型胺基酸序列)。
在一些實施例中，MAGE-A3抗原包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，MAGE-A3抗原包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，MAGE-A3抗原由與SEQ ID NO: 4之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核酸序列編碼。
酪胺酸酶抗原： 酪胺酸酶抗原由TYR基因編碼且為廣泛分佈於動物中之酪胺酸酶家族或蛋白質之成員。此基因編碼屬於酪胺酸酶家族之黑色素體酶且在黑色素生物合成路徑中起重要作用。已知酪胺酸酶在包括黑色素瘤在內之多種癌症中表現(參見Osella-Abate等人， Br. J. Cancer89(8): 1457-62 (2003)，其以引用之方式整體併入本文中)。
在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼酪胺酸酶抗原或其免疫原性片段。在一些實施例中，RNA分子編碼全長、非突變型酪胺酸酶抗原。在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼不包含與黑色素瘤癌症進展相關的胺基酸取代之酪胺酸酶抗原(例如，酪胺酸酶抗原之野生型胺基酸序列)。在一些實施例中，酪胺酸酶抗原並非全長的，而是僅包含一部分酪胺酸酶。在一些實施例中，酪胺酸酶抗原包含信號肽、EGF樣域、CμA域、CμB域或其組合。
在一些實施例中，酪胺酸酶抗原包含與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，酪胺酸酶抗原包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，酪胺酸酶抗原由與SEQ ID NO: 6之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核酸序列編碼。
具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶 (TPTE) 抗原 ：TPTE抗原為癌症睪丸抗原(CTA)家族之成員。CTA抗原表現受到高度組織限制。TPTE為具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶，其可在睪丸之內分泌或生精功能的信號轉導路徑中發揮作用。健康成體組織中之TPTE mRNA表現僅限於睪丸，且在所有其他正常組織標本中，轉錄水準低於高度敏感性RT-PCR之偵測極限。(Simon P等人，Functional TCR retrieval from single antigen specific human T cells reveals multiple novel epitopes. Cancer Immunol Res. 2(12): 1230-44 (2014)，其以引用之方式整體併入本文中。)
在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼TPTE抗原或其免疫原性片段。在一些實施例中，RNA分子編碼全長、非突變型TPTE抗原。在一些實施例中，RNA分子編碼經截短之TPTE抗原。在一些實施例中，RNA分子編碼經截短之非突變型TPTE抗原。在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼不包含與黑色素瘤癌症進展相關的胺基酸取代之TPTE抗原(例如，TPTE抗原之野生型胺基酸序列)。
在一些實施例中，如本文所述之一或多種RNA分子之RNA分子編碼如WO2005/026205中所述之TPTE抗原或其免疫原性片段，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。
在一些實施例中，TPTE抗原包含與SEQ ID NO: 7之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，TPTE抗原包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，TPTE抗原由與SEQ ID NO: 8之核酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之核酸序列編碼。
在一些實施例中，編碼如本文所述之TAA之例示性核酸序列及如本文所述之TAA之胺基酸序列提供於下 表 1中。 表 1 ： TAA 之序列
SEQ ID NO: 標識符 序列
1 NY-ESO-1全長核酸 ATGCAGGCCGAGGGCAGAGGAACAGGCGGCAGCACAGGCGACGCAGATGGACCAGGCGGCCCTGGAATCCCTGATGGCCCAGGCGGCAATGCTGGGGGACCAGGAGAAGCTGGCGCCACAGGCGGGAGAGGACCTAGAGGAGCTGGAGCCGCTAGAGCTTCTGGACCTGGGGGAGGCGCCCCTAGAGGACCACATGGAGGCGCTGCCAGCGGCCTGAATGGCTGCTGCAGATGCGGCGCCAGAGGCCCTGAGAGCCGGCTGCTGGAATTCTACCTGGCCATGCCCTTCGCCACCCCCATGGAAGCCGAGCTGGCCAGAAGATCCCTGGCTCAGGACGCTCCTCCTCTGCCTGTGCCCGGCGTGCTGCTGAAAGAATTCACCGTGTCCGGCAACATCCTGACCATCAGACTGACAGCCGCCGATCACAGACAGCTCCAGCTGAGCATCAGCTCTTGCCTGCAGCAGCTGAGCCTGCTGATGTGGATCACCCAGTGCTTTCTGCCCGTGTTCCTGGCCCAGCCACCCAGCGGACAGAGAAGG
2 NY-ESO-1全長胺基酸 MQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR
3 MAGEA3全長核酸 ATGCCCCTTGAACAGCGCTCACAGCACTGCAAACCTGAGGAGGGCCTTGAAGCAAGGGGCGAAGCTCTGGGGTTGGTCGGTGCACAAGCACCCGCCACTGAGGAACAGGAAGCCGCGTCTAGCTCATCAACCCTGGTTGAAGTGACACTGGGCGAAGTGCCTGCTGCGGAGAGTCCAGACCCTCCCCAGTCCCCTCAAGGCGCTTCTAGCCTGCCTACCACGATGAACTACCCACTGTGGTCACAGAGCTATGAGGACAGTTCCAATCAAGAAGAAGAAGGCCCGTCTACCTTCCCCGATCTTGAGTCCGAGTTTCAGGCCGCTCTGTCCCGGAAGGTGGCAGAGCTCGTGCACTTTCTCCTGTTGAAGTATCGAGCCCGGGAGCCTGTCACTAAGGCCGAAATGCTGGGCTCTGTAGTGGGGAATTGGCAGTATTTCTTCCCCGTGATCTTCAGCAAAGCCTCCAGCAGCCTGCAATTGGTGTTCGGTATTGAACTGATGGAAGTAGATCCGATTGGGCATCTGTACATCTTTGCGACATGTCTGGGACTGTCCTATGACGGACTGCTCGGGGATAACCAGATTATGCCGAAAGCCGGTCTGCTGATCATAGTTCTCGCCATCATTGCCAGAGAGGGAGATTGTGCTCCAGAGGAGAAGATCTGGGAGGAATTGTCTGTGCTGGAGGTCTTTGAGGGTAGGGAGGACAGCATTCTCGGCGATCCCAAGAAACTCCTGACCCAGCACTTTGTCCAGGAGAACTACCTCGAATACAGACAGGTTCCAGGCAGTGACCCTGCTTGCTACGAGTTCCTTTGGGGACCCCGTGCATTGGTAGAGACAAGCTATGTCAAAGTGCTGCACCATATGGTGAAGATATCTGGAGGACCACACATCAGTTACCCACCCCTTCATGAGTGGGTTCTGCGCGAAGGGGAGGAG
4 MAGEA3全長胺基酸 MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHISYPPLHEWVLREGEE
5 酪胺酸酶(AA1-477)核酸 ATGCTGCTGGCCGTGCTGTACTGCCTGCTGTGGAGCTTTCAGACCAGCGCCGGACACTTCCCTAGAGCCTGCGTGAGCAGCAAGAACCTGATGGAAAAAGAGTGCTGCCCCCCTTGGAGCGGCGATAGAAGCCCCTGTGGCCAGCTGAGCGGCAGAGGCTCCTGCCAGAACATCCTGCTGAGCAACGCCCCTCTGGGCCCCCAGTTCCCCTTTACCGGCGTGGACGACAGAGAAAGCTGGCCCAGCGTGTTCTACAACCGGACCTGCCAGTGCAGCGGCAACTTCATGGGCTTCAACTGCGGCAACTGCAAGTTCGGCTTCTGGGGACCCAACTGCACCGAGAGAAGGCTGCTGGTGCGGAGAAACATCTTCGACCTGAGCGCCCCTGAGAAGGACAAGTTCTTCGCCTACCTGACCCTGGCCAAGCACACCATCAGCAGCGACTACGTGATCCCCATCGGCACCTACGGCCAGATGAAGAACGGCAGCACCCCCATGTTCAACGACATCAACATCTACGATCTGTTCGTGTGGATGCACTACTACGTGTCCATGGACGCCCTGCTGGGCGGCAGCGAGATCTGGAGAGACATCGACTTTGCCCACGAGGCCCCTGCCTTTCTGCCCTGGCACCGGCTGTTTCTGCTGAGATGGGAGCAGGAAATCCAGAAGCTGACCGGCGACGAGAACTTCACCATCCCCTACTGGGACTGGCGGGACGCCGAGAAGTGCGACATCTGCACCGACGAGTACATGGGCGGCCAGCACCCCACCAACCCCAATCTGCTGAGCCCCGCCAGCTTCTTCAGCAGCTGGCAGATCGTGTGCTCCCGGCTGGAGGAGTACAACAGCCACCAGAGCCTGTGCAATGGCACCCCCGAGGGCCCTCTGAGAAGAAACCCCGGCAACCACGACAAGAGCCGGACCCCCAGACTGCCTAGCAGCGCCGACGTGGAGTTCTGCCTGAGCCTGACCCAGTACGAGAGCGGCAGCATGGACAAGGCCGCCAACTTCAGCTTCCGGAACACCCTGGAAGGCTTCGCCAGCCCTCTGACCGGCATTGCCGACGCCAGCCAGAGCAGCATGCACAACGCCCTGCACATCTACATGAATGGAACCATGAGCCAGGTGCAGGGCAGCGCCAACGACCCCATCTTCCTGCTGCACCACGCCTTCGTGGACAGCATCTTCGAGCAGTGGCTGCGGAGACACAGACCCCTGCAGGAAGTGTACCCCGAGGCCAACGCCCCTATCGGCCACAACCGGGAGAGCTACATGGTGCCCTTCATCCCCCTGTACCGGAACGGCGACTTCTTCATCAGCTCCAAGGACCTGGGCTACGACTACAGCTACCTGCAGGACAGCGACCCCGACAGCTTCCAGGACTACATCAAGAGCTACCTGGAACAGGCCAGCAGAATCTGGTCCTGG
6 酪胺酸酶(AA1-477)胺基酸 MLLAVLYCLLWSFQTSAGHFPRACVSSKNLMEKECCPPWSGDRSPCGQLSGRGSCQNILLSNAPLGPQFPFTGVDDRESWPSVFYNRTCQCSGNFMGFNCGNCKFGFWGPNCTERRLLVRRNIFDLSAPEKDKFFAYLTLAKHTISSDYVIPIGTYGQMKNGSTPMFNDINIYDLFVWMHYYVSMDALLGGSEIWRDIDFAHEAPAFLPWHRLFLLRWEQEIQKLTGDENFTIPYWDWRDAEKCDICTDEYMGGQHPTNPNLLSPASFFSSWQIVCSRLEEYNSHQSLCNGTPEGPLRRNPGNHDKSRTPRLPSSADVEFCLSLTQYESGSMDKAANFSFRNTLEGFASPLTGIADASQSSMHNALHIYMNGTMSQVQGSANDPIFLLHHAFVDSIFEQWLRRHRPLQEVYPEANAPIGHNRESYMVPFIPLYRNGDFFISSKDLGYDYSYLQDSDPDSFQDYIKSYLEQASRIWSW
7 TPTE片段核酸 ATGAACGAGAGCCCCGACCCTACAGATCTGGCCGGCGTGATCATCGAGCTGGGACCCAACGATAGCCCTCAGACCAGCGAGTTCAAGGGGGCCACAGAGGAAGCCCCTGCCAAAGAGAGCCCCCACACCTCCGAGTTTAAGGGCGCTGCTCGGGTGTCCCCTATCAGCGAGAGCGTGCTGGCCCGGCTGAGCAAGTTCGAGGTGGAGGACGCCGAGAACGTGGCCAGCTACGACAGCAAGATCAAGAAAATCGTGCACAGCATCGTGTCCAGCTTCGCCTTCGGCCTGTTCGGCGTGTTCCTGGTGCTGCTGGACGTGACACTGATCCTGGCCGACCTGATCTTCACCGACAGCAAGCTGTACATCCCCCTGGAATACCGGTCCATCAGCCTGGCCATTGCCCTGTTCTTTCTGATGGACGTGCTGCTGCGGGTGTTCGTGGAGCGGCGGCAGCAGTACTTCAGCGACCTGTTCAACATCCTGGACACCGCCATCATCGTGATTCTGCTGCTGGTGGATGTGGTGTACATCTTCTTCGACATCAAGCTGCTGAGAAACATCCCCCGGTGGACCCATCTGCTGCGGCTGCTGAGACTGATCATCCTGCTGCGGATCTTCCACCTGTTCCACCAGAAGCGGCAGCTGGAAAAGCTGATCAGACGGCGGGTGTCCGAGAACAAGCGGCGGTACACCAGGGACGGCTTCGACCTGGACCTGACCTACGTGACCGAGCGGATCATTGCCATGAGCTTCCCCAGCAGCGGCAGACAGAGCTTCTACCGGAACCCCATCAAAGAAGTGGTGCGGTTCCTGGACAAGAAGCACCGGAACCACTACCGGGTGTACAACCTGTGCAGCGAGCGGGCCTACGACCCCAAGCACTTCCACAACCGGGTGGTGCGGATCATGATCGACGACCACAACGTGCCCACCCTGCACCAGATGGTGGTGTTCACCAAAGAAGTGAACGAGTGGATGGCCCAGGACCTGGAAAACATCGTGGCCATCCACTGCAAGGGCGGCACCGACAGAACCGGCACCATGGTGTGCGCCTTTCTGATCGCCAGCGAGATCTGTAGCACCGCCAAAGAGTCCCTGTACTACTTCGGCGAGCGGAGAACCGACAAGACCCACAGCGAGAAGTTCCAGGGCGTGGAGACACCCAGCCAGAAAAGATATGTGGCTTACTTCGCCCAGGTGAAGCACCTGTACAACTGGAACCTGCCCCCCAGACGGATTCTGTTCATCAAGCACTTCATCATCTACAGCATCCCCAGATACGTGCGGGACCTGAAGATCCAGATCGAGATGGAAAAGAAAGTGGTGTTCAGCACCATCTCCCTGGGCAAGTGCAGCGTGCTGGACAACATCACCACCGACAAGATCCTGATCGACGTGTTCGACGGCCTGCCCCTGTACGACGACGTGAAGGTGCAGTTCTTCTACAGCAACCTGCCCACCTACTACGACAATTGCAGCTTCTACTTCTGGCTGCACACCAGCTTCATCGAGAACAACAGGCTGTACCTGCCCAAGAACGAGCTGGACAACCTGCACAAGCAGAAGGCCAGAAGAATCTACCCCAGCGACTTCGCCGTGGAGATCCTGTTTGGCGAGAAGATGACCAGCAGCGACGTGGTGGCCGGCAGCGAC
8 TPTE片段胺基酸 MNESPDPTDLAGVIIELGPNDSPQTSEFKGATEEAPAKESPHTSEFKGAARVSPISESVLARLSKFEVEDAENVASYDSKIKKIVHSIVSSFAFGLFGVFLVLLDVTLILADLIFTDSKLYIPLEYRSISLAIALFFLMDVLLRVFVERRQQYFSDLFNILDTAIIVILLLVDVVYIFFDIKLLRNIPRWTHLLRLLRLIILLRIFHLFHQKRQLEKLIRRRVSENKRRYTRDGFDLDLTYVTERIIAMSFPSSGRQSFYRNPIKEVVRFLDKKHRNHYRVYNLCSERAYDPKHFHNRVVRIMIDDHNVPTLHQMVVFTKEVNEWMAQDLENIVAIHCKGGTDRTGTMVCAFLIASEICSTAKESLYYFGERRTDKTHSEKFQGVETPSQKRYVAYFAQVKHLYNWNLPPRRILFIKHFIIYSIPRYVRDLKIQIEMEKKVVFSTISLGKCSVLDNITTDKILIDVFDGLPLYDDVKVQFFYSNLPTYYDNCSFYFWLHTSFIENNRLYLPKNELDNLHKQKARRIYPSDFAVEILFGEKMTSSDVVAGSD
T 細胞抗原決定基：在一些實施例中，本揭示案尤其提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包括一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i) NY-ESO-1抗原，(ii) MAGE-A3抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv) TPTE抗原，或(v)其組合；及T細胞抗原決定基。
如本文所用，術語「T細胞抗原決定基」係指當在MHC分子之背景中呈現時由T細胞識別之蛋白質之一部分或片段。術語「主要組織相容性複合物」及縮寫「MHC」包括MHC I類及MHC II類分子且係關於存在於所有脊椎動物中之基因複合物。MHC蛋白或分子對於免疫反應中淋巴細胞與抗原呈現細胞或患病細胞之間的信號傳導很重要，其中MHC蛋白或分子結合肽抗原決定基且將其呈現以供T細胞上之T細胞受體識別。由MHC編碼之蛋白質在細胞表面上表現，且向T細胞展示自身抗原(來自細胞本身之肽片段)及非自身抗原(例如，侵襲微生物之片段)。在I類MHC/肽複合物之情況下，結合肽通常為約8個至約10個胺基酸長，不過更長或更短之肽可為有效的。在II類MHC/肽複合物之情況下，結合肽通常為約10個至約25個胺基酸長且詳言之約13個至約18個胺基酸長，而更長及更短之肽可為有效的。
在一些實施例中，該一或多種RNA分子之RNA分子編碼CD4抗原決定基或其免疫原性片段。在一些實施例中，CD4抗原決定基包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「P2P16」域的CD4抗原決定基之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
在一些實施例中，CD4抗原決定基包含破傷風類毒素P2、破傷風類毒素P16或兩者。在一些實施例中，破傷風類毒素P2包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「P2」域的CD4抗原決定基之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，破傷風類毒素P16包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「P16」域的CD4抗原決定基之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，或由其組成。 II. 編碼所提供之腫瘤相關抗原之RNA的例示性實施例
在一些實施例中，本揭示案尤其提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包括一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i) NY-ESO-1抗原，(ii) MAGE-A3抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv) TPTE抗原，或(v)其組合。在一些實施例中，單一RNA分子可編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少兩者。在一些實施例中，單一RNA分子可編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少三者。在一些實施例中，單一RNA分子可編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之每一者。
在一些實施例中，單一RNA分子可編碼多抗原決定基多肽。例如，在一些實施例中，單一RNA分子編碼包括NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少兩者之多抗原決定基多肽。在另一實例中，在一些實施例中，單一RNA分子編碼包括NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少三者之多抗原決定基多肽。在另一實例中，在一些實施例中，單一RNA分子編碼包括NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之每一者之多抗原決定基多肽。
CD4+ 抗原決定基： 在一些實施例中，本揭示案尤其提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包括一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i) NY-ESO-1抗原，(ii) MAGE-A3抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv) TPTE抗原，或(v)其組合；及CD4 +抗原決定基。在一些實施例中，CD4+抗原決定基由共同編碼本文所述之腫瘤相關抗原之相同RNA分子遞送。在一些實施例中，CD4+抗原決定基由單獨RNA分子遞送。在一些實施例中，CD4+抗原決定基為或包含非特異性抗原(例如，與黑色素瘤不相關之抗原)。在一些實施例中，CD4+抗原決定基為或包含提供佐劑效應之非特異性抗原。例如，在一些實施例中，CD4+抗原決定基可包括但不限於破傷風類毒素抗原性多肽，例如在一些實施例中，破傷風類毒素P2多肽及/或破傷風類毒素P16多肽。
MHC 運輸域： 在一些實施例中，本文所述之RNA分子包含編碼MHC運輸域之序列。在一些實施例中，MHC運輸域為或包含MHC分子(例如MHC I類分子)鏈之跨膜區及細胞質區，例如，在一些實施例中如國際專利公開案第WO 2005/038030號所述，該案之內容以引用之方式整體併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，MHC運輸域為或包含MHC I類運輸域。在一些實施例中，MHC I類運輸域包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「MITD」域的MHC I類運輸域之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，MHC I類運輸域包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「MITD」域的MHC I類運輸域之胺基酸序列一致之胺基酸序列。
信號肽編碼區 ：在一些實施例中，本文所述之RNA分子包含編碼信號肽之序列。在一些實施例中，此類信號肽之包括可用於增加抗原之加工及呈現。在一些實施例中，信號肽為或包含分泌信號肽。在一些實施例中，分泌信號肽可對應於編碼人類MHC I類複合物α鏈或其片段之序列。在一些實施例中，分泌信號肽可對應於編碼分泌信號肽之70-80 bp片段，在一些實施例中，分泌信號肽可指導新生多肽鏈易位進入內質網中。在一些實施例中，信號肽包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「Sec」的信號肽編碼區之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽包含與SEQ ID NO: 11、12、15、16、19、20、23或24中描繪為「Sec」的信號肽之胺基酸序列一致之胺基酸序列。在一些實施例中，信號肽與RNA分子中所包括之抗原之N端連接。
在一些實施例中，本文所述之RNA分子包含至少一種非編碼序列元件。在一些實施例中，此類非編碼序列元件包括於RNA分子中以增強RNA穩定性及/或轉譯效率。非編碼序列元件之實例包括但不限於3’非轉譯區(UTR)、5’ UTR、帽結構、聚腺嘌呤(polyA)尾及其任何組合。
UTR (5’ UTR 及 / 或 3’UTR) ：在一些實施例中，所提供之RNA分子包含編碼所關注之5’UTR及/或所關注之3’ UTR的核苷酸序列。熟習此項技術者應理解，mRNA序列之非轉譯區(例如3’ UTR及/或5’ UTR)可有助於mRNA穩定性、mRNA定位及/或轉譯效率。
在一些實施例中，所提供之RNA分子可包含5’ UTR核苷酸序列及/或3’ UTR核苷酸序列。在一些實施例中，此類5’ UTR序列可與編碼序列(例如，涵蓋一或多個編碼區)之3’可操作性連接。或者或另外，在一些實施例中，3’ UTR序列可與編碼序列(例如，涵蓋一或多個編碼區)之5’可操作性連接。
在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之5'及3' UTR序列可由用於所關注基因之開放閱讀框的天然存在或內源5'及3' UTR序列組成，或包含該等序列。或者，在一些實施例中，RNA分子中所包括之5'及/或3' UTR序列對於編碼序列(例如，涵蓋一或多個編碼區)而言並非內源的；在一些此類實施例中，此類5'及/或3' UTR序列可用於修飾經轉錄之RNA序列之穩定性及/或轉譯效率。例如，熟練技術人員應理解3' UTR序列中富含AU之元件可降低mRNA之穩定性。因此，如熟練技術人員應理解，可選擇或設計3'及/或5’ UTR以基於此項技術中熟知之UTR特性來增加經轉錄之RNA之穩定性。
例如，熟習此項技術者應理解，在一些實施例中，可選擇由所關注之基因或核苷酸序列的開放閱讀框序列之Kozak序列組成或包含該Kozak序列之核苷酸序列且用作編碼5’ UTR之核苷酸序列。如熟練技術人員應理解，已知Kozak序列增加一些RNA轉錄物之轉譯效率，但未必所有RNA均需要該等序列才能實現有效轉譯。在一些實施例中，所提供之RNA分子可包含編碼5' UTR之核苷酸序列，該5' UTR源自RNA基因體在細胞中穩定之RNA病毒。在一些實施例中，各種經修飾之核糖核苷酸(例如，如本文所述)可用於3'及/或5' UTR，例如，以阻止經轉錄之RNA序列的核酸外切酶降解。
在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之5' UTR可源自與Kozak區組合之人類α-球蛋白mRNA。
在一些實施例中，RNA分子可包含一或多個3'UTR。例如，在一些實施例中，RNA分子可包含源自球蛋白mRNA，諸如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白(例如人類β-球蛋白) mRNA之3'-UTR之兩個複本。在一些實施例中，可使用源自人類β-球蛋白mRNA之3'UTR之兩個複本，例如在一些實施例中，其可置於RNA分子之編碼序列與poly(A)尾之間，以改良蛋白質表現水準及/或mRNA之延長持續。在一些實施例中，如WO 2007/036366中所述之源自人類β-球蛋白之3'UTR可包括於本文所述之RNA分子中，該文獻之內容以引用之方式整體併入本文中以達成本文所述之目的。
在一些實施例中，RNA分子中所包括之3’ UTR可為或包含WO 2017/060314中所揭示之一或多個(例如，1、2、3個或更多個) 3'UTR序列，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，3'-UTR可為源自「胺基端分裂增強子」(AES) mRNA (稱為F)及粒線體編碼之12S核糖體RNA (稱為I)之至少兩個序列元件的組合(FI元件)。其藉由賦予RNA穩定性且增強總蛋白質表現之序列之離體選擇過程來鑑定(參見WO 2017/060314，以引用之方式併入本文中)。
PolyA 尾 ：在一些實施例中，所提供之ssRNA可包含編碼polyA尾之核苷酸序列。polyA尾為包含一系列腺苷核苷酸之核苷酸序列，其長度可變化(例如，至少5個腺嘌呤核苷酸)且可多達數百個腺苷核苷酸。在一些實施例中，polyA尾為包含至少30個或更多腺苷核苷酸，包括例如至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個或更多腺苷核苷酸之核苷酸序列。在一些實施例中，polyA尾為包含至少120個腺苷核苷酸之核苷酸序列。在一些實施例中，如WO 2007/036366中所述之polyA尾可包括於本文所述之RNA分子中，該文獻之內容以引用之方式整體併入本文中以達成本文所述之目的。
在一些實施例中，polyA尾為或包含polyA均聚物尾。在一些實施例中，polyA尾可包含一或多個經修飾之腺苷核苷，包括但不限於科多西平(cordiocipin)及8-氮雜腺苷。
在一些實施例中，polyA尾可包含一或多個非腺苷核苷酸。在一些實施例中，polyA尾可為或包含如WO 2016/005324中所述之經破壞或經修飾之polyA尾，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。例如，在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之polyA尾可為或包含經修飾之polyA序列，其包含：連接體序列；至少20個A連續核苷酸之第一序列，其為該連接體序列的5'；及至少20個A連續核苷酸之第二序列，其為該連接體序列的3'。在一些實施例中，經修飾之polyA序列可包含：包含至少十個非A核苷酸(例如，T、G及/或C核苷酸)之連接體序列；至少30個A連續核苷酸之第一序列，其為該連接體序列的5'；及至少70個A連續核苷酸之第二序列，其為該連接體序列的3'。
5' 帽： 在一些實施例中，本文所述之RNA分子可包含5'帽，其可在轉錄期間併入此類RNA分子中，或在轉錄後接合至此類RNA分子。在一些實施例中，RNA分子可包含抗反向帽類似物(ARCA)。在一些實施例中，RNA分子可包含如下所示之帽類似物β-S-ARCA(D1) (m 2 7,2’-OGpp spG)：
Figure 02_image001
在一些實施例中，RNA分子可包含如WO2011/015347或WO2008/157688中所揭示之S-ARCA帽結構，該等文獻中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。
在一些實施例中，RNA分子可包含用於mRNA之共轉錄加帽之5'帽結構。用於共轉錄加帽之帽結構的實例係此項技術中已知的，例如包括如WO 2017/053297中所述，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之5'帽為或包含m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG。在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之5'帽為或包含Cap1結構[例如但不限於m 2 7,3’-OGppp(m 1 2’-O)ApG]。
在一些實施例中，共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子包含天然核糖核苷酸。在一些實施例中，共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子包含至少一種經修飾或合成核糖核苷酸。在一些實施例中，經修飾或合成核糖核苷酸包括於RNA分子中以增加其穩定性及/或降低其細胞毒性。例如，在一些實施例中，本文所述之RNA分子之A、U、C及G核糖核苷酸中的至少一者可由經修飾之核糖核苷酸置換。例如，在一些實施例中，RNA分子中存在之一些或全部胞苷殘基可由經修飾之胞苷置換，在一些實施例中，該經修飾之胞苷可為例如5-甲基胞苷。或者或另外，在一些實施例中，RNA分子中存在之一些或全部尿苷殘基可由經修飾之尿苷置換，在一些實施例中，該經修飾之尿苷可為例如假尿苷，諸如1-甲基假尿苷。在一些實施例中，RNA分子中存在之所有尿苷殘基均由假尿苷，例如1-甲基假尿苷置換。
在一些實施例中，本揭示案尤其提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包括一或多種RNA分子，其中RNA分子自5'至3'包含：(i) 5'帽或5'帽類似物；(ii)至少一個5’ UTR；(iii)信號肽；(iv)編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者之編碼區；(v)至少一個編碼CD4 +抗原決定基之序列；(vi)編碼MHC運輸域之序列；(vii)至少一個3’UTR；及(viii)聚腺嘌呤尾。例如，在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之帽結構可為可增加RNA分子對細胞外及細胞內RNA酶降解之抗性且導致更高蛋白質表現之帽結構。在一些實施例中，例示性帽結構為或包含β-S-ARCA(D1) (m 2 7,2’-OGpp spG)。在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之例示性5' UTR序列元件為或包含來自人類α-球蛋白之特徵序列及Kozak共有序列。在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之例示性3’ UTR序列元件可為或包含源自人類β-球蛋白之3’UTR的兩個複本，或源自「胺基端分裂增強子」(AES) mRNA (稱為F)及粒線體編碼之12S核糖體RNA (稱為I)的兩種序列元件之組合(FI元件)。參見例如WO2007/036366及WO 2017/060314，該等文獻中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，本文所述之RNA分子中所包括之poly(A)尾可經設計以增強RNA穩定性及/或轉譯效率。在一些實施例中，例示性poly(A)尾為或包含至少120個腺苷核苷酸長之連續poly(A)序列。在一些實施例中，例示性poly(A)尾為或包含110個核苷酸長之經修飾poly(A)序列，包括30個腺苷殘基之延伸段，隨後為10個核苷酸之連接體序列及70個腺苷殘基之另一延伸段(A30L70)。
連接體： 在一些實施例中，至少一個編碼連接體之序列可存在於RNA分子中以分開RNA分子中存在之個別組分。例如，在一些實施例中，至少一個編碼連接體之序列可存在於編碼如本文所述之一或多種腫瘤相關抗原的編碼區與編碼CD4+抗原決定基之序列之間。在一些實施例中，至少一個編碼連接體之序列可存在於編碼CD4+抗原決定基之序列與編碼MHC運輸域之序列之間。在一些實施例中，編碼連接體之序列可編碼肽連接體。在一些實施例中，肽連接體可富含甘胺酸及/或絲胺酸。在一些實施例中，富含甘胺酸及/或絲胺酸之肽連接體可包含至少一個非甘胺酸或絲胺酸之胺基酸。在一些實施例中，肽連接體可具有3至20個胺基酸或3至15個胺基酸或3至10個胺基酸之長度。在一些實施例中，肽連接體可具有10個胺基酸之長度。
在一些實施例中，本文所述之一或多種RNA分子為或包含一或多種mRNA。
在一些實施例中，醫藥組合物包含(i)編碼如下 表 2中所揭示之NY-ESO-1抗原的RNA分子；編碼如下 表 2中所揭示之MAGE-A3抗原的RNA分子；編碼如下 表 2中所揭示之酪胺酸酶抗原的RNA分子；及編碼如下 表 2中所揭示之TPTE抗原的RNA分子。在一些此類實施例中，可藉由使各自編碼如本文所述之腫瘤相關抗原之RNA分子以約1:1:1:1之莫耳比混合來製備醫藥組合物。換言之，在一些實施例中，若總RNA劑量為100 µg，則可製備包括25 µg NY-ESO-1抗原編碼RNA、25 µg MAGE-A3抗原編碼RNA、25 µg酪胺酸酶抗原編碼RNA、 25 µg TPTE抗原編碼RNA之醫藥組合物。在一些實施例中，這可藉由形成例如NY-ESO-1抗原脂質粒子(例如，NY-ESO-1抗原脂質複合物或脂質奈米粒子)、MAGE-A3抗原脂質粒子(例如，MAGE-A3抗原脂質複合物或脂質奈米粒子)、酪胺酸酶抗原脂質粒子(例如，酪胺酸酶抗原脂質複合物或脂質奈米粒子)及TPTE抗原脂質粒子(例如，TPTE抗原脂質複合物或脂質奈米粒子)來實現。在此方法中，接著可使RNA-脂質粒子混合。換言之，可在RNA及脂質粒子形成RNA-脂質粒子(例如，RNA-脂質複合物或RNA-脂質奈米粒子)之後進行混合。 表 2 ：各自編碼本文所述之腫瘤相關抗原之 RNA 分子 之例示性構築體
編碼蛋白 紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原
例示性RNA構築體1 (例如，RBL001.1) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS-NY-ESO-1-GS-P2P16-GS-MITD-2hBg-A120
例示性RNA構築體2 (例如，RBL001.3) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS-NY-ESO-1-GS-P2P16-GS-MITD-FI-A30L70
     
編碼蛋白 黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)
例示性RNA構築體1 (例如，RBL003.1) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS-MAGEA3-GS-P2P16-GS-MITD-2hBg-A120
例示性RNA構築體2 (例如，RBL003.3) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS-MAGEA3-GS-P2P16-GS-MITD-FI- A30L70
  
編碼蛋白 酪胺酸酶抗原
例示性RNA構築體1 (例如，RBL002.2) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-酪胺酸酶(1-477)-GS-P2P16-GS-MITD-2hBg-A120
例示性RNA構築體2 (例如，RBL002.4) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-酪胺酸酶(1-477)-GS-P2P16-GS-MITD-FI- A30L70
  
編碼蛋白 具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原
例示性RNA構築體1 (例如，RBL004.1) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS-TPTE-GS-P2P16-GS-MITD-2hBg-A120
例示性RNA構築體2 (例如，RBL004.3) β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS-TPTE-GS-P2P16-GS-MITD-FI- A30L70
GS =甘胺酸/絲胺酸連接體；MITD = MHC I類運輸域；sec =分泌信號肽；UTR =非轉譯區；hAg =人類α-球蛋白；P2P16 =破傷風類毒素衍生之P2及P16輔助抗原決定基；2hBg =人類β-球蛋白之2個複本；A120 = 120個A長之polyA尾；A30L70 =由連接體分開之兩個連續腺嘌呤核苷酸區段(一個區段具有30個A長之長度，而另一區段具有70個A長之長度)；FI =源自「胺基端分裂增強子」(AES) mRNA (稱為F)及粒線體編碼之12S核糖體RNA (稱為I)的至少兩個序列元件之組合
在一些實施例中，編碼NY-ESO-1抗原之RNA分子為或包含RBL001.1或RBL001.3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼NY-ESO-1抗原之RNA分子包含編碼具有RBL001.1或RBL001.3之胺基酸序列的多肽之序列。在下文中，針對全長RNA之核苷酸序列以及經轉譯之蛋白質(其中胺基酸位於各別密碼子三聯體之第三個核苷酸下方)給出了RBL001.1及RBL003.1之序列比對。如 圖 1a所示之序列元件呈現於核苷酸序列上方。核苷酸及胺基酸序列之差異由「*」指示。SEQ ID NO: 9，針對RBL001.1 RNA；SEQ ID NO: 10，針對RBL001.3 RNA；SEQ ID NO: 11，針對RBL001.1蛋白；SEQ ID NO: 12，針對RBL001.3蛋白。
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在一些實施例中，編碼酪胺酸酶抗原之RNA分子為或包含RBL002.2或RBL002.4之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼酪胺酸酶抗原之RNA分子包含編碼具有RBL002.2或RBL002.4之胺基酸序列的多肽之序列。在下文中，針對全長RNA之核苷酸序列以及經轉譯之蛋白質(其中胺基酸位於各別密碼子三聯體之第三個核苷酸下方)給出了RBL002.2及RBL002.4之序列比對。如 圖 1a所示之序列元件呈現於核苷酸序列上方。核苷酸及胺基酸序列之差異由「*」指示。SEQ ID NO: 13，針對RBL002.2 RNA；SEQ ID NO: 14，針對RBL002.4 RNA；SEQ ID NO: 15，針對RBL002.2蛋白；SEQ ID NO: 16，針對RBL002.4蛋白。
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在一些實施例中，編碼MAGE-A3抗原之RNA分子為或包含RBL003.1或RBL003.3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼MAGE-A3抗原之RNA分子包含編碼具有RBL003.1或RBL003.3之胺基酸序列的多肽之序列。在下文中，針對全長RNA之核苷酸序列以及經轉譯之蛋白質(其中胺基酸位於各別密碼子三聯體之第三個核苷酸下方)給出了RBL003.1及RBL003.3之序列比對。如 圖 1a所示之序列元件呈現於核苷酸序列上方。核苷酸及胺基酸序列之差異由「*」指示。SEQ ID NO: 17，針對RBL003.1 RNA；SEQ ID NO: 18，針對RBL003.3 RNA；SEQ ID NO: 19，針對RBL003.1蛋白；SEQ ID NO: 20，針對RBL003.3蛋白。
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Figure 02_image026
在一些實施例中，編碼TPTE抗原之RNA分子為或包含RBL004.1或RBL004.3之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼TPTE抗原之RNA分子包含編碼具有RBL004.1或RBL004.3之胺基酸序列的多肽之序列。在下文中，針對全長RNA之核苷酸序列以及經轉譯之蛋白質(其中胺基酸位於各別密碼子三聯體之第三個核苷酸下方)給出了RBL004.1及RBL004.3之序列比對。如 圖 1a所示之序列元件呈現於核苷酸序列上方。核苷酸及胺基酸序列之差異由「*」指示。SEQ ID NO: 21，針對RBL004.1 RNA；SEQ ID NO: 22，針對RBL004.3 RNA；SEQ ID NO: 23，針對RBL004.1蛋白；SEQ ID NO: 24，針對RBL004.3蛋白。
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B. 例示性製造方法
個別RNA分子可藉由此項技術中已知之方法產生。例如，在一些實施例中，可藉由活體外轉錄，例如使用DNA模板產生單鏈RNA。用作活體外轉錄模板以產生本文所述之RNA分子的質體DNA亦在本揭示案之範圍內。
DNA模板用於在適當RNA聚合酶(例如重組RNA-聚合酶，諸如T7 RNA-聚合酶)與三磷酸核糖核苷酸(例如ATP、CTP、GTP、UTP)存在下進行活體外RNA合成。在一些實施例中，可在經修飾之三磷酸核糖核苷酸存在下合成RNA分子(例如，本文所述者)。僅舉例而言，在一些實施例中，N1-甲基假尿苷三磷酸酯( m1ΨTP)可用於置換尿苷三磷酸酯(UTP)。如熟習此項技術者應清楚，在活體外轉錄期間，RNA聚合酶(例如，如本文所述及/或利用)通常沿3'→ 5'方向穿過單鏈DNA模板之至少一部分以沿5'→ 3'方向產生單鏈互補RNA。
在其中RNA分子包含polyA尾之一些實施例中，熟習此項技術者應理解此類polyA尾可在DNA模板中，例如藉由使用適當加尾之PCR引子經編碼，或者其可在活體外轉錄之後添加至RNA分子中，例如藉由酶處理(例如，使用poly(A)聚合酶，諸如大腸桿菌poly(A)聚合酶)。
在一些實施例中，熟習此項技術者應理解向RNA (例如，mRNA)中添加5'帽可促進RNA識別及連接至核糖體以啟動轉譯且增強轉譯效率。熟習此項技術者亦應理解，5'帽亦可保護RNA產物免受5'核酸外切酶介導之降解且因此增加半衰期。加帽之方法為此項技術中已知的；一般技術者應理解，在一些實施例中，可在活體外轉錄之後在加帽系統(例如基於酶之加帽系統，諸如牛痘病毒之加帽酶)存在下執行加帽。在一些實施例中，可在活體外轉錄期間引入帽以及複數個三磷酸核糖核苷酸，使得帽在轉錄期間併入RNA分子ssRNA中(亦稱作共轉錄加帽)。
在RNA轉錄之後，使DNA模板消化。在一些實施例中，可在適當條件下使用DNase I實現消化。
在一些實施例中，可在活體外轉錄反應之後純化RNA分子，例如以移除在生產過程中使用或形成之組分，例如蛋白質、DNA片段及/或核苷酸。可根據本揭示案使用此項技術中已知之各種核酸純化。在一些實施例中，可使用基於磁珠之純化來純化RNA分子，在一些實施例中，基於磁珠之純化可為或包含基於磁珠之層析。在一些實施例中，可使用疏水性相互作用層析(HIC)、隨後透濾來純化RNA分子。
在一些實施例中，dsRNA可作為活體外轉錄期間之副產物獲得。在一些此類實施例中，可執行第二純化步驟以移除dsRNA污染。例如，在一些實施例中，纖維素材料(例如，微晶纖維素)可用於移除dsRNA污染，例如在一些實施例中呈層析形式。在一些實施例中，可對纖維素材料(例如，微晶纖維素)進行預處理以使潛在RNA酶污染不活化，例如在一些實施例中，藉由高壓滅菌、隨後與鹼性水溶液(例如NaOH)一起培育來進行。在一些實施例中，纖維素材料可用於根據WO 2017/182524中所述之方法來純化RNA分子，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，可藉由一或多個過濾及/或濃縮步驟進一步加工一批ssRNA。例如，在一些實施例中，例如在移除dsRNA污染之後，RNA分子可進一步進行透濾，例如以將ssRNA之濃度調節至所需RNA濃度及/或將緩衝液交換為原料藥緩衝液。
在一些實施例中，可經由0.2 μm過濾來加工RNA分子，接著將其填充至適當容器中。
在一些實施例中，可在RNA分子及/或包含RNA分子之組合物之生產過程期間的任何時間執行及/或監測RNA品質控制。例如，在一些實施例中，可在RNA分子製造過程之每一個或某些步驟之後，例如在活體外轉錄及/或每一個純化步驟之後，評估及/或監測RNA品質控制參數。
在一些實施例中，可在RNA分子之製造或其他製備或使用期間使用一或多種評估(例如，作為釋放測試)。
在一些實施例中，可評估一或多種品質控制參數以確定本文所述之RNA分子是否滿足或超過預定接受準則(例如，用於後續調配及/或釋放以供分佈)。在一些實施例中，此類品質控制參數可包括但不限於RNA完整性、RNA濃度、殘餘DNA模板及/或殘餘dsRNA。用於評估RNA品質之方法為此項技術中已知的。
在一些實施例中，可針對一或多種特徵來評估一批RNA分子以確定接下來的動作步驟。例如，若RNA品質評估指示一批單鏈RNA滿足或超過接受準則，則可指定此類單鏈RNA批次用於製造及/或調配及/或分佈之一或多個進一步步驟。否則，若此類單鏈RNA批次未滿足或超過接受準則，則可採取替代動作(例如，丟棄該批次)。
在一些實施例中，具有例示性評估結果之一批RNA分子可用於製造及/或調配及/或分佈之一或多個進一步步驟。 III. RNA 遞送技術
所提供之醫藥組合物(例如，一或多種編碼一或多種TAA之RNA分子)可使用此項技術中已知之任何適當方法經遞送用於本文所述之治療應用，包括例如作為裸RNA遞送，或由病毒及/或非病毒載體、基於聚合物之載體、基於脂質之載體、奈米粒子(例如，脂質奈米粒子、聚合物奈米粒子、脂質-聚合物混合奈米粒子 等)及/或基於肽之載體介導之遞送。參見例如Wadhwa等人，「Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-Based Vaccines」 Pharmaceutics(2020) 102 (27頁)，其內容以引用之方式併入本文中，以獲取關於可用於遞送本文所述之RNA分子之各種方法的資訊。
在一些實施例中，一或多種RNA分子可與脂質粒子一起經調配以用於遞送(例如，在一些實施例中藉由靜脈內注射)。
在一些實施例中，脂質粒子可經設計以保護RNA分子(例如，mRNA)免受細胞外RNA酶影響及/或經工程改造以用於將RNA全身性遞送至標靶細胞(例如，樹突狀細胞)。在一些實施例中，當RNA分子經靜脈內投與至有需要之個體時，此類脂質粒子對於遞送RNA分子(例如，mRNA)可尤其有用。
在一些實施例中，脂質粒子包含脂質體。在一些實施例中，脂質粒子包含陽離子脂質體。
在一些實施例中，脂質粒子包含脂質奈米粒子。
在一些實施例中，脂質粒子包含脂質複合物。
在一些實施例中，脂質粒子包含N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE)或兩者。在一些實施例中，脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質。在一些實施例中，脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質及輔助脂質。在一些實施例中，輔助脂質為或包含磷脂。在一些實施例中，輔助脂質為或包含固醇。在一些實施例中，脂質粒子包含至少一種聚合物結合之脂質。
RNA 脂質複合物粒子 ：在一些實施例中，可藉由脂質體調配物遞送本文所述之RNA分子。在一些實施例中，使本文所述之帶負電荷之RNA分子與陽離子脂質體複合以形成RNA脂質複合物粒子。在一些實施例中，使本文所述之RNA分子包埋於RNA脂質複合物粒子內之(磷)脂質雙層結構中。在一些實施例中，陽離子脂質體可包含陽離子脂質或可離子化胺基脂質(例如，如本文所述者)及視情況選用之額外或輔助脂質(例如，至少一種如本文所述之中性脂質)以形成可注射粒子調配物。
在一些實施例中，可藉由使脂質體與本文所述之RNA分子混合來製備RNA脂質複合物粒子。在一些實施例中，可藉由將脂質於乙醇中之溶液注射至水或合適水相中來獲得脂質體。在一些實施例中，使陽離子脂質體在水性調配物中穩定化，例如，如WO 2016/046060中所述，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，可藉由例如如WO 2019/077053中所述之方法來產生陽離子脂質體，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。
在一些實施例中，可用於遞送本文所述之RNA分子之脾臟靶向性RNA脂質複合物粒子描述於WO 2013/143683中，該文獻之完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，使RNA分子及帶正電荷之脂質體混合，使得陽離子脂質及RNA以1.3:2之電荷比存在。此類電荷比經確定為有效地使RNA靶向脾臟。
在一些實施例中，RNA脂質複合物粒子包含陽離子脂質或可離子化胺基脂質(例如，本文所述者)及本文所述之RNA分子。在一些實施例中，此類RNA脂質複合物粒子可進一步包含額外或輔助脂質(例如，本文所述者)。不希望受理論束縛，帶正電荷之脂質體與帶負電荷之RNA之間之靜電相互作用導致RNA脂質複合物粒子之複合及自發形成。
在其中使用陽離子脂質或可離子化胺基脂質(例如，本文所述者)及輔助脂質之一些實施例中，此類陽離子脂質或可離子化胺基脂質及此類輔助脂質可以2:1之莫耳比存在。在一些實施例中，陽離子脂質或可離子化胺基脂質可為或包含DOTMA。在一些實施例中，輔助脂質可為或包含中性脂質。在一些實施例中，中性脂質可為或包含DOPE。
在一些實施例中，RNA脂質複合物粒子為奈米粒子。在一些實施例中，RNA脂質複合物奈米粒子可具有約100 nm至1000 nm、或約200 nm至900 nm、或約200 nm至800 nm、或約250 nm至約700 nm之粒徑(例如，Z-平均)。
RNA 脂質奈米粒子 ：在一些實施例中，可藉由脂質奈米粒子調配物遞送本文所述之RNA分子。在一些實施例中，可藉由使脂質與本文所述之RNA分子混合來製備RNA脂質奈米粒子。在一些實施例中，至少一部分RNA分子由脂質奈米粒子囊封。在一些實施例中，至少90%或更高(包括例如至少95%、96%、97%、98%、99%或更高)之RNA分子由脂質奈米粒子囊封。
在各種實施例中，脂質奈米粒子可具有約100 nm至1000 nm、或約200 nm至900 nm、或約200 nm至800 nm、或約250 nm至約700 nm之平均大小(例如，Z-平均)。在一些實施例中，脂質奈米粒子可具有約30 nm至約200 nm、或約30 nm至約150 nm、約40 nm至約150 nm、約50 nm至約150 nm、約60 nm至約130 nm、約70 nm至約110 nm、約70 nm至約100 nm、約80 nm至約100 nm、約90 nm至約100 nm、約70 nm至約90 nm、約80 nm至約90 nm、或約70 nm至約80 nm之粒徑(例如，Z-平均)。在一些實施例中，藉由量測粒子直徑來確定脂質奈米粒子之平均大小。
在某些實施例中，當存在於所提供之脂質奈米粒子中時，RNA分子(例如，mRNA)在水溶液中抵抗核酸酶之降解。
在一些實施例中，脂質奈米粒子為陽離子脂質奈米粒子，其包含一或多種陽離子脂質(例如，本文所述者)。在一些實施例中，陽離子脂質奈米粒子可包含至少一種陽離子脂質、至少一種聚合物結合之脂質及至少一種輔助脂質(例如，至少一種中性脂質)。 1. 輔助脂質
在一些實施例中，用於遞送本文所述之RNA分子之脂質粒子包含至少一種輔助脂質，其可為中性脂質、帶正電荷之脂質或帶負電荷之脂質。在一些實施例中，輔助脂質係可用於增加將基於脂質之粒子(諸如基於陽離子脂質之粒子)遞送至標靶細胞之有效性的脂質。在一些實施例中，輔助脂質可為或包含結構脂質，其濃度經選擇以最佳化粒徑、穩定性及/或囊封。
在一些實施例中，用於遞送本文所述之RNA分子之脂質粒子包含中性輔助脂質。此類中性輔助脂質之實例包括但不限於磷脂醯膽鹼，例如1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)、 1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DMPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DOPC)；磷脂醯基乙醇胺(諸如1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE))、鞘磷脂(SM)、神經醯胺、膽固醇、類固醇(諸如固醇)及其衍生物。中性脂質可為合成或天然來源的。此項技術中已知之其他中性輔助脂質亦可用於本文所述之脂質粒子，例如，如WO 2017/075531及WO 2018/081480中所述，該等文獻中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。在一些實施例中，用於遞送本文所述之RNA分子之脂質粒子包含DSPC及/或膽固醇。
在一些實施例中，用於遞送本文所述之RNA分子之脂質粒子包含至少一種輔助脂質(例如，本文所述者)。在一些此類實施例中，脂質粒子可包含DOPE。 2. 陽離子脂質
在一些實施例中，用於遞送本文所述之RNA分子之脂質粒子包含陽離子脂質。陽離子脂質通常為具有淨正電荷之脂質，例如在一些實施例中在特定pH下。在一些實施例中，陽離子脂質可包含一或多個攜帶正電荷之胺基。在一些實施例中，陽離子脂質可包含陽離子(意謂帶正電荷)頭基。在一些實施例中，陽離子脂質可具有疏水域(例如，中性脂質或陰離子脂質之一或多個域)，其限制條件在於陽離子脂質具有淨正電荷。在一些實施例中，陽離子脂質包含極性頭基，在一些實施例中，該極性頭基可包含一或多種胺衍生物，諸如一級胺、二級胺及/或三級胺、四級銨、胺之各種組合、脒鎓鹽或胍及/或咪唑基以及吡啶鎓、哌嗪及胺基酸頭基(諸如離胺酸、精胺酸、鳥胺酸及/或色胺酸)。在一些實施例中，陽離子脂質之極性頭基包含一或多種胺衍生物。在一些實施例中，陽離子脂質之極性頭基包含四級銨。在一些實施例中，陽離子脂質之頭基可包含多個陽離子電荷。在一些實施例中，陽離子脂質之頭基包含一個陽離子電荷。單陽離子脂質之實例包括但不限於1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲銨丙烷(DOTMA)及/或1,2-二油醯基-3-三甲銨丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲銨丙烷(DMTAP)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基溴化銨氮(DMRIE)、雙十二烷基(二甲基)溴化銨氮(DDAB)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(DORIE)、3P-[N-(N\N'-二甲基胺基-乙烷)胺甲醯基]膽固醇(DC-Choi)及/或二油烯基醚磷脂醯膽鹼(DOEPC)。
在一些實施例中，本文所述之帶正電荷之脂質結構亦可包括一或多種通常可用於形成囊泡(例如，用於穩定化)之其他組分。此類其他組分之實例包括但不限於脂肪醇、脂肪酸及/或膽固醇酯或任何其他醫藥學上可接受之賦形劑，該等賦形劑可影響表面電荷、膜流動性且有助於將脂質併入脂質總成中。固醇之實例包括膽固醇、半琥珀酸膽固醇酯、硫酸膽固醇酯或任何其他膽固醇衍生物。在一些實施例中，一種陽離子脂質包含DMEPC及/或DOTMA。在一些實施例中，陽離子脂質包含DOTMA。
在一些實施例中，陽離子脂質為可離子化的，使得其可以帶正電荷之形式或中性形式存在，視pH而定。例如，在一些實施例中，陽離子脂質為可離子化之胺基脂質。陽離子脂質之此類離子化可影響脂質粒子在不同pH條件下之表面電荷，在一些實施例中，表面電荷可影響血漿蛋白吸收、血液清除及/或組織分佈以及形成內體溶解性非雙層結構之能力。因此，在一些實施例中，陽離子脂質可為或包含pH反應性脂質。在一些實施例中，pH反應性脂質為脂肪酸衍生物或其他兩親化合物，其能夠形成溶致脂質相，且其pKa值在pH 5與pH 7.5之間。這意謂脂質在高於pKa值之pH下不帶電且在低於pKa值之pH下帶正電荷。在一些實施例中，除了陽離子脂質以外或替代陽離子脂質，可例如藉由在低pH下使一或多種RNA分子與脂質或脂質混合物結合來使用pH反應性脂質。pH反應性脂質包括但不限於1,2-二油烯基氧基-3-二甲基胺基-丙烷(DODMA)。
在一些實施例中，脂質粒子可包含一或多種陽離子脂質，如WO 2017/075531 (例如，如其中表1及表3所示)及WO 2018/081480 (例如，如其中表1-4所示)中所述，該等文獻中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。
在一些實施例中，根據本揭示案可有用之陽離子脂質為胺基脂質，其包含經由酯鍵與至少兩個飽和烷基鏈連接之可滴定三級胺基頭基，該等酯鍵可容易地水解以促進快速降解及/或經由腎臟路徑排泄。在一些實施例中，此類胺基脂質具有約6.0-6.5之表觀pK a(例如，在一個實施例中具有大約6.25之表觀pK a)，導致在酸性pH (例如，pH 5)下基本上完全帶正電荷之分子。在一些實施例中，當併入脂質粒子中時，此類胺基脂質可賦予不同的物理化學特性，該等物理化學特性調節RNA分子之粒子形成、細胞攝取、融合性及/或內體釋放。在一些實施例中，在pH 4.0下將RNA水溶液引入至包含此類胺基脂質之脂質混合物中可導致帶負電荷之RNA骨架與帶正電荷之陽離子脂質之間之靜電相互作用。不希望受任何特定理論束縛，此類靜電相互作用導致與RNA原料藥之有效囊封一致之粒子形成。在RNA囊封之後，將圍繞所得脂質奈米粒子之介質之pH調節至更具中性pH (例如，pH 7.4)，導致中和脂質奈米粒子之表面電荷。當所有其他變數保持不變時，與由網狀內皮系統快速清除之帶電粒子相比，此類電荷中性粒子呈現更長活體內循環壽命及更佳肝細胞遞送。在內體攝取之後，內體之低pH使包含此類胺基脂質之脂質奈米粒子融合且允許將RNA釋放至標靶細胞之細胞溶質中。
陽離子脂質可單獨，或與中性脂質(例如膽固醇及/或中性磷脂)組合，或與其他已知脂質總成組分組合使用。 3. 聚合物結合之脂質
在一些實施例中，用於遞送本文所述之RNA分子之脂質奈米粒子可包含至少一種聚合物結合之脂質。聚合物結合之脂質通常為包含脂質部分及與其結合之聚合物部分的分子。
在一些實施例中，聚合物結合之脂質為PEG結合之脂質。在一些實施例中，PEG結合之脂質係經設計以藉由形成遮蔽疏水性脂質層之保護性親水層來使脂質粒子空間穩定。在一些實施例中，當活體內投與此類脂質粒子時，PEG結合之脂質可減少其與血清蛋白之締合及/或由網狀內皮系統產生之攝取。
各種PEG結合之脂質為此項技術中已知的且包括但不限於聚乙二醇化二醯基甘油(PEG-DAG)，諸如1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二醯基甘油(PEG-S-DAG) (諸如4-O-(2' ,3'-二(十四烷醯基氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、聚乙二醇化神經醯胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基胺基甲酸酯(諸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺基甲酸酯)及其類似物。
某些PEG結合之脂質(亦稱作PEG化脂質)已獲得臨床批准，其安全性在臨床試驗中得到證明。已知PEG結合之脂質影響細胞攝取，這係內體定位及有效載荷遞送之先決條件。可藉由調節PEG-脂質錨之烷基鏈長度以可預測之方式控制經囊封核酸之藥理學。在一些實施例中，可基於合理之溶解度特徵及/或其分子量來設計及/或選擇PEG結合之脂質以有效地執行空間障壁之功能。例如，在一些實施例中，PEG化脂質未對生物膜顯示明顯的界面活性劑或滲透性增強或干擾效應。在一些實施例中，此類PEG結合之脂質中的PEG可用生物可降解之醯胺鍵連接至二醯基脂質錨，由此促進快速降解及/或排泄。在一些實施例中，包含PEG結合之脂質的LNP保留PEG化脂質之完整補體。在血液隔室中，隨著時間之推移，此類PEG化脂質自粒子解離，從而顯露更容易由細胞攝取之更融合粒子，最終導致RNA有效載荷之釋放。
在一些實施例中，脂質粒子(例如脂質奈米粒子)可包含一或多種PEG結合之脂質或聚乙二醇化脂質，如WO 2017/075531及WO 2018/081480中所述，該等文獻中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。例如，在一些實施例中，根據本揭示案可有用的PEG結合之脂質可具有如WO 2017/075531中所述之結構
Figure 02_image040
，或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構體或立體異構體，其中：R 8及R 9各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視情況由一或多個酯鍵中斷；且w具有介於30至60範圍內之平均值。在一些實施例中，R8及R9各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈飽和烷基鏈。在一些實施例中，w具有介於43至53範圍內之平均值。在其他實施例中，平均w為約45。
在一些實施例中，形成本文所述之脂質奈米粒子的脂質包含：聚合物結合之脂質；陽離子脂質；及輔助中性脂質。在一些此類實施例中，總的聚合物結合之脂質可以總脂質之約0.5-5 mol%、約0.7-3.5 mol%、約1-2.5 mol%、約1.5-2 mol%或約1.5-1.8 mol%存在。在一些實施例中，總的聚合物結合之脂質可以總脂質之約1-2.5 mol%存在。在一些實施例中，總的陽離子脂質與總的聚合物結合之脂質(例如，PEG結合之脂質)之莫耳比可為約100:1至約20:1，或約50:1至約20:1，或約40:1至約20:1，或約35:1至約25:1。
在涉及本文所述之脂質奈米粒子中的聚合物結合之脂質、陽離子脂質及輔助中性脂質之一些實施例中，總的陽離子脂質以總脂質之約35-65 mol%、約40-60 mol%、約41-49 mol%、約41-48 mol%、約42-48 mol%、約43-48 mol%、約44-48 mol%、約45-48 mol%、約46-48 mol%或約47.2-47.8 mol%存在。
在涉及本文所述之脂質奈米粒子中的聚合物結合之脂質、陽離子脂質及輔助中性脂質之一些實施例中，總的中性脂質以總脂質之約35-65 mol%、約40-60 mol%、約45-55 mol%或約47-52 mol%存在。在一些實施例中，總的中性脂質以總脂質之35-65 mol%存在。在一些實施例中，總的非類固醇中性脂質(例如DPSC)以總脂質之約5-15 mol%、約7-13 mol%或9-11 mol%存在。在一些實施例中，總的非類固醇中性脂質以總脂質之約9.5 mol%、10 mol%或10.5 mol%存在。在一些實施例中，總的陽離子脂質與非類固醇中性脂質之莫耳比介於約4.1: 1.0至約4.9: 1.0、約4.5: 1.0至約4.8: 1.0或約4.7: 1.0至4.8: 1.0範圍內。在一些實施例中，總的類固醇中性脂質(例如，膽固醇)以總脂質之約35-50 mol%、約39-49 mol%、約40-46 mol%、約40-44 mol%或約40-42 mol%存在。在某些實施例中，總的類固醇中性脂質(例如膽固醇)以總脂質之約39 mol%、40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、45 mol%或46 mol%存在。在某些實施例中，總的陽離子脂質與總的類固醇中性脂質之莫耳比為約1.5:1至1:1.2，或約1.2:1至1:1.2。
在一些實施例中，包含陽離子脂質、聚合物結合之脂質及中性脂質之脂質組合物可具有以總脂質之某些莫耳百分比，或以如WO 2018/081480中所述之某些莫耳比(相對於彼此)存在的個別脂質，該等文獻中之每一者的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。 IV. 所提供之醫藥組合物
本揭示案尤其提供用於將抗原(例如，TAA)遞送至患者之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之RNA分子；及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原之RNA分子；及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。在一些實施例中，醫藥組合物包含RNA-脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)之至少四個群體，其中每一種RNA-脂質粒子包含RNA分子及脂質粒子，且其中該四種RNA脂質粒子中之每一者的RNA分子為不同的，例如每一種RNA編碼如本文所述之不同TAA。
在一些實施例中，一或多種RNA分子可與脂質奈米粒子(例如，本文所述者)一起經調配以投與至患者。因此，在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之RNA分子；及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)，其中該一或多種RNA分子用脂質粒子囊封(例如，形成RNA-脂質粒子)。在一些實施例中，RNA-脂質粒子為RNA-脂質複合物粒子。在一些實施例中，RNA-脂質粒子為RNA-脂質奈米粒子。
在一些實施例中，醫藥組合物作為單一療法經投與。在一些實施例中，醫藥組合物作為組合療法之一部分經投與。
在一些實施例中，醫藥組合物包含編碼NY-ESO-1抗原之第一RNA分子、編碼MAGE-A3之第二RNA分子、編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子及編碼TPTE抗原之第四RNA分子，第一RNA分子、第二RNA分子、第三RNA分子及第四RNA分子可以約等莫耳量(例如，約1:1:1:1之莫耳比)存在於醫藥組合物中。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物中的總RNA之濃度(例如，所有一或多種RNA分子之總濃度)為約0.01 mg/mL至約0.5 mg/mL，或約0.05 mg/mL至約0.1 mg/mL。
醫藥調配物可另外包含醫藥學上可接受之賦形劑，如本文所用，該賦形劑包括任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體黏合劑、潤滑劑及其類似物，適合於所需之特定劑型。Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；以引用之方式整體併入本文中)揭示了用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及已知之其製備技術。除非任何習知賦形劑介質與物質或其衍生物不相容，諸如藉由產生任何不希望之生物效應或以其他方式與醫藥組合物之任何其他組分以有害方式相互作用，否則其用途預期在本揭示案之範圍內。
在一些實施例中，賦形劑獲批用於人類及獸醫用途。在一些實施例中，賦形劑由美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些實施例中，賦形劑為醫藥級。在一些實施例中，賦形劑滿足美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。
用於製造醫藥組合物之醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於惰性稀釋劑、分散劑及/或造粒劑、表面活性劑及/或乳化劑、崩解劑、黏合劑、防腐劑、緩衝劑、潤滑劑及/或油。此類賦形劑可視情況包括於醫藥調配物中。根據調配者之判斷，諸如可可脂及栓劑蠟、著色劑、包衣劑、甜味劑、調味劑及/或芳香劑之賦形劑可存在於組合物中。
醫藥劑之調配及/或製造中的一般考慮可見於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以引用之方式整體併入本文中)中。
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物可根據習知技術，諸如Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第21版, Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (以引用之方式整體併入本文中)中所揭示之彼等技術與一或多種醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑以及任何其他已知之佐劑及賦形劑一起經調配。
本文所述之醫藥組合物可藉由此項技術中已知之適當方法進行投與。如熟練技術人員應理解，投與路徑及/或模式可取決於多種因素，包括例如但不限於本文所述之醫藥組合物的穩定性及/或藥物動力學及/或藥效學。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物係經調配用於非經腸投與，非經腸投與包括除腸及表面投與以外之投與模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物係經調配用於靜脈內投與。在一些實施例中，可用於靜脈內投與之醫藥學上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液以及用於製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。
在一些特定實施例中，本文所述之醫藥組合物係經調配用於皮下投與。在一些特定實施例中，本文所述之醫藥組合物係經調配用於肌肉內投與。
治療組合物通常必須在製造及儲存條件下為無菌且穩定的。該組合物可經調配成溶液、分散液、粉末(例如，凍乾粉末)、微乳液、脂質奈米粒子或其他適合高藥物濃度之有序結構。該載劑可為溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及其類似物)及其合適混合物。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣，藉由在分散液之情況下維持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。在多種情況下，將較佳在組合物中包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。在一些實施例中，可藉由在組合物中包括延遲吸收之劑，例如單硬脂酸鹽及明膠，來引起可注射組合物之延長吸收。
可藉由將所需量之活性化合物併入視需要具有上文所列舉之一成分或成分組合之適當溶劑中，隨後進行滅菌微過濾來製備無菌可注射溶液。
在一些實施例中，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散液，該無菌媒劑含有基本分散介質及來自以上所列舉之彼等的所需其他成分。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，自其先前經無菌過濾之溶液中產生活性成分加上任何額外所需成分之粉末。
可用於本文所述之醫藥組合物的合適水性及非水性載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇及其類似物)及其合適混合物、植物油(諸如橄欖油)及可注射之有機酯(諸如油酸乙酯)。舉例而言，可藉由使用諸如卵磷脂之包衣材料，藉由在分散液之情況下維持所需粒徑，及藉由使用界面活性劑來維持適當流動性。
此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可藉由滅菌程序，及藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸及其類似物)來確保防止微生物之存在。亦可需要將諸如糖、氯化鈉及其類似物之等張劑包括於本文所述之醫藥組合物中。此外，可藉由包括延遲吸收之劑，諸如單硬脂酸鋁及明膠，來引起可注射醫藥形式之延長吸收。
可藉由藥理學領域中已知或以後開發之任何方法來製備本文所述之醫藥組合物的調配物。一般而言，此類製備方法包括使活性成分與稀釋劑或另一賦形劑及/或一或多種其他輔助成分結合之步驟，且接著必要時及/或需要時，使產物成型及/或將產物封裝成所需之單劑量或多劑量單位。
根據本揭示案之醫藥組合物可作為單一單位劑量及/或作為複數個單一單位劑量批量製備、封裝及/或出售。如本文所用，「單位劑量」為離散量之醫藥組合物，其包含使用本文所述之系統及/或方法產生的預定量之至少一種RNA產物。
醫藥組合物中囊封於LNP中之一或多種RNA分子、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何其他成分之相對量可根據待治療之個體、標靶細胞、疾病或病症而變化，且亦可進一步取決於欲投與該組合物之途徑。
在一些實施例中，藉由熟習此項技術者已知之習知方法將本文所述之醫藥組合物調配成醫藥學上可接受之劑型。本文所述之醫藥組合物中的活性成分(例如，一或多種囊封於脂質奈米粒子中之RNA分子)之實際劑量水準可變化，以便獲得對於特定患者、組合物及投與方式有效實現所需之治療反應而不會對患者產生毒性之量的活性成分。所選劑量水準將取決於多種藥物動力學因素，包括所用之本揭示案之特定組合物的活性、投與途徑、投與時間、所用之特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所用之特定組合物組合使用的其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況及既往病史以及醫學領域中熟知之類似因素。
一般熟習此項技術之醫師或獸醫可容易地確定所需醫藥組合物之有效量且開具處方。例如，醫師或獸醫可能以低於為了實現所需治療效應而需要之水準的水準開始醫藥組合物中所用之活性成分(例如，一或多種囊封於脂質奈米粒子中之RNA分子)的劑量且逐漸增加劑量，直至實現所需效應。例如，如實例7所述之例示性劑量可用於製備醫藥學上可接受之劑型。
在一些實施例中，醫藥組合物係經調配(例如，用於靜脈內投與)以遞送約7.2 µg至約400 µg (或其中所包括之任何子範圍)之劑量的總RNA，例如，如實例7中所述。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可進一步包含一或多種添加劑，例如，在一些實施例中，該等添加劑可增強此類組合物在某些條件下之穩定性。添加劑之實例可包括但不限於鹽、緩衝物質、防腐劑及載劑。例如，在一些實施例中，醫藥組合物可進一步包含冷凍保護劑(例如，蔗糖)及/或緩衝水溶液，在一些實施例中，該緩衝水溶液可包括一或多種鹽，包括例如鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，諸如鈉鹽、鉀鹽及/或鈣鹽。
例示性調配物包括但不限於 表 3中所列出之彼等。 表 3 ：例示性醫藥組合物調配物
成分 例示性配方 1 濃度 (mg/mL) 例示性配方 2 濃度 (mg/mL)
RNA [1] 0.10 0.05
DOTMA 0.132 0.066
DOPE 0.074 0.037
HEPES 0.48 1.80
EDTA 0.007 0.90
NaCl 6.50 1.20
蔗糖 - 220.0
注射用水 適量 適量
[1]：RNA包含編碼NY-ESO-1抗原之第一RNA分子、編碼MAGE-A3抗原之第二RNA分子、編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子及編碼TPTE抗原之第四RNA分子。
在一些實施例中，除了RNA (例如一或多種RNA分子，例如一或多種mRNA分子)以外，本文所述之醫藥組合物可進一步包含一或多種活性劑。例如，在一些實施例中，醫藥組合物包含免疫檢查點抑制劑(亦稱作「檢查點抑制劑」)。在一些實施例中，例示性免疫檢查點抑制劑可為或包含適用於治療癌症(例如，黑色素瘤)之免疫檢查點抑制劑，包括例如但不限於PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑、 CTLA4抑制劑、LAG-3或其組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗體。檢查點抑制劑可包括例如但不限於 表 4中所列出之彼等。 表 4 ：例示性免疫檢查點分子及 彼等檢查點分子之抑制劑
檢查點分子 抑制劑
CTLA-4 伊匹單抗
PD-1 西米普利單抗
納武單抗
派姆單抗
PD-L1 阿特珠單抗
阿維魯單抗
杜瓦魯單抗
LAG-3 (CD223) LAG525 (IMP701)、REGN3767 (R3767)、BI 754,091、特泊利單抗(tebotelimab)(MGD013)、艾提拉莫德α (eftilagimod alpha)(IMP321)、FS118
TIM-3 MBG453、Sym023、TSR-022
B7-H3、B7-H4 MGC018、FPA150
A2aR EOS100850、AB928
CD73 CPI-006
NKG2A 莫那利珠單抗(Monalizumab)
PVRIG/PVRL2 COM701
CEACAM1 CM24
CEACAM 5/6 NEO-201
FAK 地法替尼(Defactinib)
CCL2/CCR2 PF-04136309
LIF MSC-1
CD47/SIRPα Hu5F9-G4 (5F9)、ALX148、TTI-662、RRx-001
CSF-1 (M-CSF)/CSF-1R 拉妥珠單抗(Lacnotuzumab)(MCS110)、LY3022855、SNDX-6352、依米妥珠單抗(emactuzumab)(RG7155)、培西達替尼(pexidartinib)(PLX3397)
IL-1及IL-1R3 (IL-1RAP) CAN04、卡那單抗(Canakinumab)(ACZ885)
IL-8 BMS-986253
SEMA4D 派比奈單抗(Pepinemab)(VX15/2503)
Ang-2 曲巴尼布(Trebananib)
CLEVER-1 FP-1305
Axl 緯恩泊妥單抗(Enapotamab vedotin)(EnaV)
磷脂醯絲胺酸 巴維妥昔單抗(Bavituximab)
在一些實施例中，可包括於本文所述之醫藥組合物中的活性劑為或包含在本文所述之組合療法中投與之治療劑。本文所述之醫藥組合物可在組合療法中投與，亦即與其他劑組合。在一些實施例中，此類治療劑可包括導致調節性T細胞之耗竭或功能不活化之劑。例如，在一些實施例中，組合療法可包括所提供之醫藥組合物與至少一種免疫檢查點抑制劑。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可與放射療法及/或自體外周幹細胞或骨髓移植聯合投與。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可與檢查點抑制劑(例如，PD-1、PD-L1、CTLA4及/或其相關路徑之抑制劑)組合。在一些實施例中，檢查點抑制劑可包括伊匹單抗、納武單抗、派姆單抗或其組合。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可與信號轉導抑制劑組合。在一些實施例中，信號轉導抑制劑可包括BRAF抑制劑(例如，維莫非尼或達拉非尼)。在一些實施例中，信號轉導抑制劑可包括MEK抑制劑。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可與病灶內療法(例如，拉他莫基)組合。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可與細胞毒性療法(例如，IL-2、達卡巴嗪、卡鉑/太平洋紫杉醇、白蛋白結合之太平洋紫杉醇)組合。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可經冷凍以允許長期儲存。
儘管本文所提供之醫藥組合物的描述主要針對適合投與至人類之醫藥組合物，熟練技術人員應理解此類組合物一般適合投與至各種動物。對適合投與至人類之醫藥組合物進行修飾以便使該等組合物適合投與至各種動物係熟知的，且一般技術之獸醫藥理學家可僅需常規(若存在)實驗來設計及/或進行此類修飾。
為了確保本文所述之醫藥組合物中的可用組分(例如一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合)之適當品質，可執行及/或監測一或多種品質評估及/或準則(例如，RNA品質評估)。
尤其，本揭示案提供表徵一或多種RNA分子或其組合物之一或多種特徵之方法，該一或多種RNA分子編碼抗體劑之部分或全部。
在一些實施例中，可藉由調適毛細管凝膠電泳分析來執行一或多種RNA分子之RNA完整性評估(例如，在一些實施例中，包含一或多種RNA分子之醫藥組合物，該一或多種RNA分子共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合)。
或者或另外，在一些實施例中，可藉由微滴數位PCR來量測包含一或多種一或多種RNA分子之醫藥組合物的RNA比率，該一或多種RNA分子各自編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合。
或者或另外，在一些實施例中，殘餘DNA模板及殘餘dsRNA作為過程中對照進行量測，具有原料藥中間物水準之接受準則，以在混合至原料藥中之前，例如在混合兩種或更多種一或多種RNA分子之前確保個別RNA品質，該一或多種RNA分子各自編碼不同TAA或TAA之組合(例如，NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合)。
或者或另外，在一些實施例中，可在包含RNA分子之組合物中量測殘餘宿主細胞DNA及/或宿主細胞蛋白質。 V. 患者群體
本文所提供之技術可用於治療與癌症相關之疾病或疾患。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療與上皮癌相關之疾病及疾患。
本文所述之技術可用於治療的一種類型之癌症為黑色素瘤。黑色素瘤為黑色素細胞之惡性腫瘤。黑色素瘤可出現於皮膚中，但其亦可出現於黏膜表面或神經嵴細胞遷移到達之其他位點，包括葡萄膜。(Kuk等人，2016，該文獻以引用之方式整體併入本文中)。黏膜及葡萄膜黑色素瘤在發病率、預後因素、分子特徵及治療方面與皮膚黑色素瘤顯著不同(van der Kooij等人，2019，該文獻以引用之方式整體併入本文中)。
在美國，估計2021年將有大約106,110名患者經診斷患有皮膚黑色素瘤，且將有大約7,180例死亡(Siegel等人，2021，該文獻以引用之方式整體併入本文中)。儘管黑色素瘤之年齡標準化發病率與非黑色素瘤皮膚癌相比較低(在2020年，分別為每100,000人3.4例對11.0例)，但死亡率很高(Globocan，2020；Coricovac等人，2018，該等文獻中之每一者以引用之方式整體併入本文中)。侵襲性黑色素瘤佔皮膚癌之約1%，但導致由皮膚癌引起之大多數死亡(ACS，2021，該文獻以引用之方式整體併入本文中)。
黑色素瘤之後果取決於呈現之階段。患有早期疾病(例如，局部)之患者的5年存活率為大約99%之患者，而患有區域期(例如，擴散至淋巴結)之患者的5年存活率為66%之患者。然而，患有遠處疾病之患者的5年存活率僅為大約27% (SEER CRS，2021；Swetter等人，2021，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中)。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療黑色素瘤。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療皮膚黑色素瘤。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療晚期癌症(例如，黑色素瘤)。晚期癌症之實例包括但不限於II期、III期或IV期。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療與IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤相關之疾病或疾患。在一些實施例中，癌症經完全切除。在一些實施例中，不具有疾病(例如，癌症)跡象。在一些實施例中，癌症經完全切除且不具有疾病跡象。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療患有轉移性黑色素瘤之患者(例如，成年患者)。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療患有不可切除之黑色素瘤的患者(例如，成年患者)，例如，在其中手術切除可能導致嚴重發病率之一些實施例中。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療患有局部晚期黑色素瘤之患者(例如，成年患者)。或者或另外，在一些實施例中，此類患者之癌症可在治療後存在進展，或者此類癌症患者可能沒有令人滿意之替代療法。在一些實施例中，正在接受本文所述之治療之患者可能已接受其他癌症療法，例如但不限於化學療法。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療晚期黑色素瘤。在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療經歷過檢查點抑制劑(CPI)的患有不可切除之黑色素瘤之患者。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療在醫藥組合物之投與時間之前經診斷患有癌症之患者，但其中該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象(NED)。在一些實施例中，歸類為在投與時NED之患者係黑色素瘤已經完全切除(例如，藉由手術)之患者。在一些實施例中，歸類為在投與時NED之患者係先前已經診斷患有臨床3期或4期黑色素瘤(或病理3期或4期黑色素瘤)且黑色素瘤已經完全切除(例如，藉由手術)之患者。在一些實施例中，歸類為在投與時NED之患者係黑色素瘤已經完全切除且將繼續接受輔助治療之患者。在一些實施例中，歸類為在投與時NED之患者係先前經診斷患有臨床3期或4期黑色素瘤(或病理3期或4期黑色素瘤)且黑色素瘤已經完全切除且將繼續接受輔助治療之患者。不希望受特定理論束縛，在一些實施例中，「不具有疾病跡象」藉由應用RECIST標準，例如RECIST1.1標準或實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準來確定。
為清楚起見，歸類為在投與時NED之患者與歸類為患有「不可量測之疾病」的患者不同。患有「不可量測之疾病」的患者意謂存在疾病跡象，但其不能根據RECIST標準可靠地加以量測，例如，如Eisenhauer等人，「New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (1.1版)」 European Journal of Cancer(2009) 45:228-247中所述之RECIST1.1標準，該文獻的完整內容以引用之方式併入本文中以達成本文所述之目的。被視為不可量測之病灶的病灶之實例包括但不限於骨骼病灶、胸膜積水腹水、組織或器官中之「複雜不規則」病灶。換言之，患有「不可量測之疾病」的患者意謂患者具有根據RECIST標準(例如，如上文所論述之RECIST1.1標準)未被視為「可量測」病灶之腫瘤病灶。因此，不可量測之疾病與NED之間的差異在於，前者意謂存在疾病但無法量測，而後者(NED)意謂不存在疾病，由此不可評估且顯然不可量測。
因此，向NED患者投與如本文所述之醫藥組合物可能看起來違反直覺。然而，本揭示案認識到，可確定患者未患癌症或處於緩解狀態，但彼癌症可再出現。因此，本揭示案提供如下見解，即此類患者可受益於接受如本文所述之醫藥組合物，因為該醫藥組合物可例如增強患者對癌症之免疫反應。增強患者對癌症之免疫反應可使患者之身體攻擊癌細胞，例如，未偵測到或正在發育之癌細胞。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療患有可量測之疾病的黑色素瘤患者。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療患有不可量測之疾病的黑色素瘤患者。
在一些實施例中，本文所提供之技術可用於治療處於緩解狀態之患者。
在一些實施例中，投與本文所述之醫藥組合物之個體可能已接受先前抗癌療法。先前抗癌療法之實例包括但不限於化學療法、干擾素及介白素、單株抗體、蛋白激酶抑制劑、放射療法、免疫檢查點抑制劑或其組合。例如，在一些實施例中，投與本文所述之醫藥組合物之個體可能已接受免疫檢查點抑制劑，但未經歷腫瘤消退。在另一實例中，在一些實施例中，投與本文所述之醫藥組合物之個體可能已接受免疫檢查點抑制劑且經歷腫瘤消退。此類免疫檢查點抑制劑之實例包括但不限於PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑、CTLA-4抑制劑或其組合。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為抗體(例如但不限於伊匹單抗及納武單抗)。檢查點抑制劑之額外實例包括於上文 表 4或實例8中。
在一些實施例中，滿足如實例12中所述之一或多種疾病特異性納入準則的患者適用於本文所述之治療(例如，接受所提供之醫藥組合物作為單一療法或作為組合療法之一部分)。在一些實施例中，投與本文所述之治療的此類患者可進一步滿足如實例12中所述之一或多種其他納入準則。
在一些實施例中，未向患有黑色素瘤但滿足如實例13中所述之一或多種排除準則之癌症患者投與本文所述之治療。 VI. 已投與醫藥組合物之患者之讀數 (Readout)
在一些實施例中，投與包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子之醫藥組合物誘導免疫反應。在一些實施例中，本文所述之方法進一步包括確定投與醫藥組合物之患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)之免疫反應水準。例如，在一些實施例中，確定患者之免疫反應水準發生在醫藥組合物之投與之前及之後。
用於確定患者之免疫反應水準的方法之非限制性實例係如實例1-3中所述。例如，在一些實施例中，可藉由對脾臟進行[18F]-氟-2-去氧-2-d-葡萄糖(FDG)-正電子發射斷層掃描(PET)/電腦化斷層掃描(CT)掃描來利用醫藥組合物投與之後增強之葡萄糖消耗，該等掃描可在投與醫藥組合物之後進行。不希望受理論束縛，(FDG)-(PET)/(CT)掃描用於指示淋巴組織駐留免疫細胞之靶向及至少短暫活化。在一些實施例中，如實例1所述，使用干擾素-γ酶聯免疫吸收劑斑點(ELISpot)分析來確定患者之免疫反應水準。在一些實施例中，使用正電子發射斷層掃描(PET)、電腦化斷層掃描(CT)掃描、磁共振成像(MRI)或其組合來量測患者之脾臟中的代謝活性水準。在一些實施例中，使用正電子發射斷層掃描(PET)及電腦化斷層掃描(CT)掃描來量測患者之脾臟中的代謝活性水準。在一些實施例中，使用正電子發射斷層掃描(PET)及磁共振成像(MRI)來量測患者之脾臟中的代謝活性水準。
在一些實施例中，在接受醫藥組合物之後確定患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)之免疫反應水準包括將患者之免疫反應水準與已投與該醫藥組合物之第二患者的免疫反應水準進行比較。在一些實施例中，該第二患者在投與時間之前經診斷患有癌症且係歸類為在投與時具有疾病跡象。
在一些實施例中，醫藥組合物在患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)中誘導一定水準之免疫反應，該免疫反應水準與已投與該醫藥組合物之第二患者的免疫反應水準可比較。在一些實施例中，第二患者先前已經診斷患有癌症，且係歸類為在投與時具有疾病跡象。在一些實施例中，若患者之免疫反應水準與第二患者之免疫反應水準相差小於20%、小於15%、小於10%或小於5%，則該免疫反應水準為可比較的。
在一些實施例中，將投與醫藥組合物之後患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)之免疫反應水準與投與醫藥組合物之前患者之免疫反應水準進行比較。例如，在一些實施例中，投與醫藥組合物之後患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)之免疫反應水準與投與醫藥組合物之前患者之免疫反應水準相比有所增加。在一些實施例中，投與醫藥組合物之後患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)之免疫反應水準與投與醫藥組合物之前患者之免疫反應水準相比得以維持。
在一些實施例中，免疫反應水準係由醫藥組合物誘導之從頭免疫反應。在一些實施例中，從頭免疫反應係因應於醫藥組合物而產生之免疫反應。在一些實施例中，從頭免疫反應不包括免疫反應之背景或預存在之水準。
在一些實施例中，向患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)投與包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子之醫藥組合物誘導適應性免疫反應。例如，在一些實施例中，患者之免疫反應為T細胞反應，其中T細胞反應包括CD4 +及/或CD8 +T細胞反應。在一些實施例中，向患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)投與包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子之醫藥組合物誘導CD4 +及/或CD8 +T細胞免疫性。
在一些實施例中，本文所述之方法包括藉由量測患者之血漿中的一或多種細胞介素之量來確定患者之免疫反應水準。例如，如實例2中所述，一或多種與免疫反應相關之細胞介素(例如，IFN-α、IFN-γ、介白素(IL)-6、IFN誘導蛋白(IP)-10、IL-12 p70次單元或其組合)之存在及/或量可用於確定患者之免疫反應水準。在一些實施例中，量測患者之血漿中的一或多種細胞介素之量發生在投與醫藥組合物之前及之後。
在一些實施例中，本文所述之方法包括量測患者之癌症病灶的數目。例如，在一些實施例中，本文所述之方法包括在投與醫藥組合物之前及之後量測患者之癌症病灶的數目。在一些實施例中，如與投與醫藥組合物之前患者之癌症病灶的數目相比，向患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)投與包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子之醫藥組合物減少了癌症病灶的數目。
在一些實施例中，本文所述之方法包括量測患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的數目。例如，在一些實施例中，本文所述之方法包括在投與醫藥組合物之後的複數個時間點量測患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的數目。在另一實例中，本文所述之方法包括在投與第一劑量之醫藥組合物之後及在投與第二劑量之醫藥組合物之後量測患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的數目。在一些實施例中，與在投與第一劑量之醫藥組合物之後相比，在投與第二劑量之醫藥組合物之後，患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的數目較大。
在一些實施例中，本文所述之方法包括在投與醫藥組合物之後確定患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的表型。例如，在一些實施例中，在投與醫藥組合物之後，患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的至少一個子集具有T輔助細胞-1表型。在一些實施例中，患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的表型具有PD1 +效應子記憶表型。在一些實施例中，患者中由醫藥組合物誘導之T細胞的表型具有T輔助細胞-1及PD1 +效應子記憶表型。
在一些實施例中，對於歸類為具有疾病跡象之患者，本文所述之方法包括量測患者之一或多個癌症病灶的大小。例如，在一些實施例中，本文所述之方法包括在投與醫藥組合物之前及之後量測患者之一或多個癌症病灶的大小。在一些實施例中，如與投與醫藥組合物之前患者之一或多個癌症病灶的大小相比，向患者(例如，患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象)投與包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子之醫藥組合物維持或減少了一或多個癌症病灶的大小。換言之，在投與本文所述之醫藥組合物之後，一或多個癌症病灶的大小未增加。
在一些實施例中，本文所述之方法包括針對歸類為具有疾病跡象之患者，監測無進展存活之持續時間。在一些實施例中，本文所述之方法包括將患者的無進展存活之持續時間與無進展存活之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，無進展存活之參考持續時間係尚未接受本文所述之醫藥組合物的複數個可比較患者之無進展存活之平均持續時間。在一些實施例中，患者的無進展存活之持續時間在時間上長於無進展存活之參考持續時間。
在一些實施例中，本文所述之方法包括針對歸類為具有疾病跡象之患者，量測疾病穩定化之持續時間。在一些實施例中，藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病穩定化。在一些實施例中，本文所述之方法包括將患者的疾病穩定化之持續時間與疾病穩定化之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，疾病穩定化之參考持續時間係尚未接受醫藥組合物的複數個可比較患者之疾病穩定化之平均持續時間。在一些實施例中，與疾病穩定化之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的疾病穩定化之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之方法包括針對歸類為具有疾病跡象之患者，量測腫瘤反應性之持續時間。在一些實施例中，藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定腫瘤反應性。在一些實施例中，本文所述之方法包括將患者的腫瘤反應性之持續時間與腫瘤反應性之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，腫瘤反應性之參考持續時間係尚未接受醫藥組合物的複數個可比較患者之腫瘤反應性之平均持續時間。在一些實施例中，與腫瘤反應性之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的腫瘤反應性之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之方法包括對於歸類為不具有疾病跡象之患者，監測無疾病存活之持續時間。在一些實施例中，本文所述之方法包括將患者的無疾病存活之持續時間與無疾病存活之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，投與本文所述之醫藥組合物的患者之無疾病存活之持續時間展現在時間上長於無疾病存活之參考持續時間。在一些實施例中，無疾病存活之參考持續時間係尚未接受醫藥組合物的複數個可比較患者之無疾病存活之平均持續時間。在一些實施例中，與無疾病存活之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的無疾病存活之持續時間。
在一些實施例中，本文所述之方法包括針對歸類為不具有疾病跡象之患者，量測直至疾病復發之持續時間。在一些實施例中，藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病復發。在一些實施例中，本文所述之方法包括將患者的直至疾病復發之持續時間與直至疾病復發之參考持續時間進行比較。在一些實施例中，直至疾病復發之參考持續時間係尚未接受醫藥組合物的複數個可比較患者之直至疾病復發之平均持續時間。在一些實施例中，與直至疾病復發之參考持續時間相比，投與本文所述之醫藥組合物的患者展現增加的直至疾病復發之持續時間。 VII. 治療
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可由標靶細胞(例如，樹突狀細胞)攝取以轉譯抗原編碼RNA，由此誘導針對抗原之CD4 +及CD8 +T細胞免疫性。
因此，本揭示案之另一態樣係關於使用本文所述之醫藥組合物的方法。舉例而言，本文所提供之一態樣為一種方法，該方法包括將所提供之醫藥組合物投與至罹患癌症之個體。在一些實施例中，所提供之醫藥組合物藉由靜脈內注射或輸注經投與。癌症之實例包括但不限於上皮癌，包括但不限於黑色素瘤(例如，皮膚黑色素瘤、IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤)。
給藥排程 ：熟習此項技術者應知曉，通常使用可在給藥週期中投與的不同範圍之醫藥組合物來投與癌症治療劑。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物在首次投與之後的64天內以8個劑量進行投與，例如，使用初免及加強方案。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物在首次投與之後的43天內以6個劑量進行投與，例如，使用初免及加強方案。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物在初始給藥週期完成之後每月經投與，例如，初免及加強方案。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物在一或多個給藥週期中經投與。
在一些實施例中，一個給藥週期為至少7天或更多天(包括例如至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少21天、至少22天、至少23天、至少24天、至少25天、至少26天、至少27天、至少28天、至少29天、至少30天、至少40天、至少50天或至少60天)。在一些實施例中，一個給藥週期為至少28天。在一些實施例中，一個給藥週期為至少35天。在一些實施例中，一個給藥週期為至少42天。在一些實施例中，一個給藥週期為至少49天。在一些實施例中，一個給藥週期為至少56天。在一些實施例中，一個給藥週期為至少63天。
在一些實施例中，一個給藥週期可涉及多個劑量，例如根據如下模式，諸如劑量可在週期內定期投與，或者劑量可在週期內每6天、每7天、每8天、每9天、每10天、每12天或每14天經投與。在一些實施例中，一個給藥週期可涉及至少2個劑量，包括例如至少3個劑量、至少4個劑量、至少5個劑量、至少6個劑量、至少7個劑量、至少8個劑量或更多個劑量。在一些實施例中，一個給藥週期可涉及多達8個劑量，該等劑量可每週一次、每兩週一次或以其組合經投與。
在一些實施例中，可投與多個週期。例如，在一些實施例中，可投與至少2個週期(包括例如至少3個週期、至少4個週期、至少5個週期、至少6個週期、至少7個週期、至少8個週期、至少9個週期、至少10個週期或更多週期)。在一些實施例中，待投與之給藥週期的數目可隨治療類型(例如，單一療法對組合療法)而變化。在一些實施例中，可投與至少2個給藥週期。在一些實施例中，第一給藥週期可不同於第二給藥週期。在一些實施例中，第一給藥週期可包含6-8個每週一次及/或每兩週一次劑量，且在第一給藥週期之後的第二給藥週期可包含至少一個每月一次劑量。
在一些實施例中，週期之間可存在「中止期」；在一些實施例中，週期之間可無中止期。在一些實施例中，週期之間有時可存在中止期且有時可無中止期。
在一些實施例中，中止期可具有在數天至數月範圍內之長度。例如，在一些實施例中，中止期可具有至少3天或更長之長度，包括例如至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天或更長。在一些實施例中，中止期可具有至少1週或更長之長度，包括例如至少2週、至少3週、至少4週或更長。
劑量： 本文所述之醫藥組合物的劑量可隨多種因素而變化，包括例如但不限於待治療之個體的體重、癌症類型及/或癌症階段，及/或單一療法或組合療法。在一些實施例中，給藥週期涉及投與設定數目及/或模式之劑量。例如，在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物以每個給藥週期至少一個劑量經投與，包括例如每個給藥週期至少兩個劑量、每個給藥週期至少三個劑量、每個給藥週期至少四個劑量或更多。
在一些實施例中，給藥週期涉及例如在特定時期內，且視情況經由多個劑量來投與設定累積劑量，該多個劑量可例如以設定時間間隔及/或根據設定模式經投與。在一些實施例中，設定累積劑量可以設定時間間隔經由多個劑量經投與，使得在由此類多個劑量對標靶細胞或對正在治療之個體產生的生物學及/或藥物動力學效應中存在至少一些時間重疊。在一些實施例中，設定累積劑量可以設定時間間隔經由多個劑量經投與，使得由此類多個劑量對標靶細胞或對正在治療之個體產生的生物學及/或藥物動力學效應可為相加的。僅舉例而言，在一些實施例中，可經由兩個劑量投與X mg之設定累積劑量，每一個劑量為X/2 mg，其中該兩個劑量之投與時間足夠接近，使得由每一個X/2-mg劑量對標靶細胞或正在治療之個體產生的生物學及/或藥物動力學效應可為相加的。
在一些實施例中，以某一水準投與每一個劑量或累積劑量(例如，用於靜脈內投與)，使得預期共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子達到足以在抗原呈現細胞(例如，樹突狀細胞或未成熟樹突狀細胞)中進行轉譯及抗原呈現的高水準(例如，血漿水準及/或組織水準)，從而在整個給藥週期中誘導針對該一或多種抗原之CD4 +及CD8 +T細胞免疫性。
在一些實施例中，每一個劑量介於約7.2 μg至約400 μg之總RNA範圍內(例如，本文中之任何子範圍)。
在一些實施例中，本文所提供之方法包括劑量遞增。包括劑量遞增之例示性方法描述於例如WO2018/0077942中。
在一些實施例中，本文所提供之方法包括7個劑量遞增群組(3+3設計)及3個擴展群組。例如， 表 5提供例示性給藥排程。 表 5 ：例示性給藥排程
Figure 02_image042
在一些實施例中，可基於接受療法之個體之反應調節給藥。例如，在一些實施例中，若用於安全性藥理學評估之一或多個參數指示先前劑量可能不滿足根據醫師之醫療安全性要求，則給藥可涉及投與較高劑量、隨後投與較低劑量。在一些實施例中，可在實例7之 表 5中所示的一或多個水準下執行劑量遞增；在一些實施例中，劑量遞增可涉及投與來自 表 5之至少一個較低劑量，隨後投與來自 表 5之至少一個較高劑量。不希望受任何特定理論束縛，本揭示案尤其提供如下見解，即可應用醫藥學指導劑量遞增(PGDE)方法來確定本文所述之醫藥組合物的適當劑量。例示性劑量遞增研究提供於實例7中。
本文亦提供一種確定醫藥組合物之給藥方案的方法，該醫藥組合物包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子。例如，在一些實施例中，此類方法包括以下步驟：(A)向罹患黑色素瘤之個體或根據預定給藥方案已歸類為不具有疾病跡象之個體投與醫藥組合物(例如，本文所述者)；(B)在一段時期內定期監測或量測個體之疾病跡象(例如，腫瘤病灶大小及/或轉移)；(C)基於監測或量測結果及/或後果來評估該給藥方案。例如，若在投與醫藥組合物(例如，本文所述者)之後腫瘤大小之減少與治療無關，則可增加劑量及/或劑量頻率；或者，若在投與醫藥組合物(例如，本文所述者)之後腫瘤大小之減少與治療相關，但在個體中顯示出不良效應(例如毒性效應)，則可降低劑量及/或劑量頻率。若在投與醫藥組合物(例如，本文所述者)之後腫瘤大小之減少與治療相關，且在個體中未顯示出不良效應(例如毒性效應)，則不對劑量方案進行改變。
在一些實施例中，此類確定醫藥組合物之給藥方案的方法可在一組動物個體(例如，哺乳動物非人類個體)中執行，該醫藥組合物包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子，各動物個體攜帶人類黑色素瘤異種移植腫瘤。在一些此類實施例中，若少於30%之動物個體在投與醫藥組合物(例如，本文所述者)之後展現腫瘤大小之減少及/或由該等動物個體展現的腫瘤大小之減少程度與治療無關，則可增加劑量及/或劑量頻率；或者，若在投與醫藥組合物(例如，本文所述者)之後腫瘤大小之減少與治療相關，但在至少30%之動物個體中顯示出顯著不良效應(例如毒性效應)，則可降低劑量及/或劑量頻率。若在投與醫藥組合物(例如，本文所述者)之後腫瘤大小之減少與治療相關，且在動物個體中未顯示出顯著不良效應(例如毒性效應)，則不對劑量方案進行改變。
儘管本文所提供之給藥方案(例如，給藥排程及/或劑量)主要適合投與至人類，熟練技術人員應理解，可確定用於投與至各種動物之劑量當量。一般技術之獸醫藥理學家可僅需常規(若存在)實驗來設計及/或進行此類確定。
單一療法： 在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可作為單一療法投與至患者。
組合療法： 本揭示案尤其提供如下見解，即如本文所述包含共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合之一或多種RNA分子之醫藥組合物誘導針對由該一或多種RNA分子編碼之抗原的CD4 +及CD8 +T細胞免疫性之能力可增強化學療法及/或其他抗癌療法(例如，免疫檢查點抑制劑)之細胞毒性效應。在一些實施例中，此類組合療法可延長無進展及/或總體存活，例如，相對於單獨投與之個別療法及/或相對於另一適當參考。因此，在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物可在患有癌症(例如，黑色素瘤)之患者中與其他抗癌劑組合投與。
不希望受特定理論束縛，本揭示案觀察到某些免疫檢查點抑制劑(例如PD-1抑制、PDL-1抑制及CTLA4抑制)當作為組合療法投與至具有經歷過CPI之腫瘤的患者時，與本文所述之醫藥組合物協同作用。
本揭示案尤其提供如下見解，即本文所述之醫藥組合物在投與至首次投與時不具有疾病跡象之患者時可尤其有用及/或有效，由此顯示該醫藥組合物誘導T細胞免疫性，即使不存在可偵測腫瘤。
在一些實施例中，所提供之醫藥組合物可作為包含此類醫藥組合物及免疫檢查點抑制劑之組合療法之一部分經投與。因此，在一些實施例中，可將所提供之醫藥組合物投與至罹患癌症(例如，黑色素瘤)且已接受免疫檢查點抑制劑或化學治療劑之個體，或已接受免疫檢查點抑制劑或化學治療劑且歸類為不具有疾病跡象之個體。在一些實施例中，所提供之醫藥組合物可與免疫檢查點抑制劑共投與至罹患癌症(例如，黑色素瘤)之個體或已歸類為不具有疾病跡象之個體。在一些實施例中，所提供之醫藥組合物及免疫檢查點抑制劑可同時或依序投與。例如，在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑之第一劑量可在投與所提供之醫藥組合物之後(例如，之後至少30分鐘)經投與。在一些實施例中，同時投與免疫檢查點抑制劑及所提供之醫藥組合物。
例如，在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑包含選自上 表 4(參見例如Marin-Acevdeo等人， J. Hematology & Oncology, 14: 45 (2021)，該文獻以引用之方式整體併入本文中)或如實例8中所述之一或多種抑制劑。
使用包含伊匹單抗之抗癌療法之組合治療： 在一些實施例中，包含所提供之醫藥組合物的投與療法可與包含伊匹單抗之免疫檢查點抑制劑共投與或重疊。伊匹單抗阻斷細胞毒性T淋巴細胞抗原-4 (CTLA-4)，其為抗腫瘤T細胞反應之關鍵負調節劑。阻斷CTLA-4會抑制T細胞活化，由此允許預存在之抗原特異性T細胞的擴增。
使用包含納武單抗之抗癌療法之組合治療 ：在一些實施例中，包含所提供之醫藥組合物的投與療法可與包含納武單抗之免疫檢查點抑制劑共投與或重疊。納武單抗為單株抗體，其與PD-1受體結合且阻斷與PD-L1及PD-L2之相互作用。阻斷此相互作用會釋放PD-1介導之對免疫反應(包括抗腫瘤T細胞反應)之路徑抑制，從而允許擴增預存在之抗原特異性T細胞。
使用包含派姆單抗之抗癌療法之組合治療 ：在一些實施例中，包含所提供之醫藥組合物的投與療法可與包含派姆單抗之免疫檢查點抑制劑共投與或重疊。派姆單抗為單株抗體，其與PD-1受體結合且阻斷與PD-L1及PD-L2之相互作用。阻斷此相互作用會釋放PD-1介導之對免疫反應(包括抗腫瘤T細胞反應)之路徑抑制，從而允許擴增預存在之抗原特異性T細胞。
使用包含西米普利單抗之抗癌療法之組合治療： 在一些實施例中，包含所提供之醫藥組合物的投與療法可與包含西米普利單抗之免疫檢查點抑制劑共投與或重疊。西米普利單抗為單株抗體，其與PD-1受體結合且阻斷與PD-L1及PD-L2之相互作用。阻斷此相互作用會釋放PD-1介導之對免疫反應(包括抗腫瘤T細胞反應)之路徑抑制，從而允許擴增預存在之抗原特異性T細胞。
功效監測 ：在一些實施例中，可在給藥方案中定期監測接受所提供之治療的患者以評估所投與之治療的功效。例如，在一些實施例中，可藉由定期(例如每4週、每5週、每6週、每7週、每8週或更長)進行治療期成像來評估所投與之治療的功效。 例示性實施例
以下所提供之例示性實施例亦在本揭示案之範圍內： 實施例 1.一種方法，該方法包括： 向患者投與至少一個劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 其中該患者在投與時間之前經診斷患有癌症，但該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。 實施例 2.如實施例1之方法，其中藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了無疾病跡象。 實施例 3.一種方法，該方法包括： 向罹患癌症之患者投與至少一個劑量之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。 實施例 4.如實施例3之方法，其中該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。 實施例 5.如實施例3之方法，其中該患者係歸類為在投與時具有疾病跡象。 實施例 6.如實施例4或5之方法，其中藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了有疾病跡象或無疾病跡象。 實施例 7.如實施例1-6中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含： (i) 編碼NY-ESO-1抗原之第一RNA分子， (ii) 編碼MAGE-A3抗原之第二RNA分子， (iii) 編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子，及 (iv) 編碼TPTE抗原之第四RNA分子。 實施例 8.如實施例1-7中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少兩者。 實施例 9.如實施例1-8中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼多抗原決定基多肽，其中該多抗原決定基多肽包含NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少兩者。 實施例 10.如實施例1-9中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子進一步包含至少一個編碼CD4+抗原決定基之序列。 實施例 11.如實施例1-9中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子進一步包含至少一個編碼破傷風類毒素P2之序列、編碼破傷風類毒素P16之序列或兩者。 實施例 12.如實施例1-11中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含編碼MHC I類運輸域之序列。 實施例 13.如實施例1-12中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含5'帽或5'帽類似物。 實施例 14.如實施例1-13中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含編碼信號肽之序列。 實施例 15.如實施例1-14中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含至少一種非編碼調節元件。 實施例 16.如實施例1-15中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含聚腺嘌呤尾。 實施例 17.如實施例16之方法，其中該聚腺嘌呤尾為或包含經修飾之腺嘌呤序列。 實施例 18.如實施例1-17中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含至少一個5'非轉譯區(UTR)及/或至少一個3’ UTR。 實施例 19.如實施例18之方法，其中該一或多種RNA分子依5'至3'次序包含： (i) 5'帽或5'帽類似物； (ii) 至少一個5’ UTR； (iii) 信號肽； (iv) 編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原中之至少一者的編碼區； (v) 至少一個編碼破傷風類毒素P2、破傷風類毒素P16或兩者之序列； (vi) 編碼MHC I類運輸域之序列； (vii) 至少一個3’UTR；及 (viii) 聚腺嘌呤尾。 實施例 20.如實施例1-19中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含天然核糖核苷酸。 實施例 21.如實施例1-20中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含經修飾或合成核糖核苷酸。 實施例 22.如實施例1-21中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者為全長、非突變型抗原。 實施例 23.如實施例1-22中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原全部均為全長、非突變型抗原。 實施例 24.如實施例1-23中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者由患者之淋巴組織中的樹突狀細胞表現。 實施例 25.如實施例1-24中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者存在於癌症中。 實施例 26.如實施例1-25中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含脂質體。 實施例 27.如實施例1-26中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含陽離子脂質體。 實施例 28.如實施例1-25中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含脂質奈米粒子。 實施例 29.如實施例1-28中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE)或兩者。 實施例 30.如實施例1-29中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質。 實施例 31.如實施例1-30中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質及輔助脂質。 實施例 32.如實施例31中任一項之方法，其中該輔助脂質為或包含磷脂。 實施例 33.如實施例31或32中任一項之方法，其中該輔助脂質為或包含固醇。 實施例 34.如實施例1-33中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含至少一種聚合物結合之脂質。 實施例 35.如實施例1-34中任一項之方法，其中該患者為人類。 實施例 36.如實施例1-35中任一項之方法，其中該癌症為上皮癌。 實施例 37.如實施例1-36中任一項之方法，其中該癌症為黑色素瘤。 實施例 38.如實施例37之方法，其中該黑色素瘤為皮膚黑色素瘤。 實施例 39.如實施例1-38中任一項之方法，其中該癌症為晚期。 實施例 40.如實施例1-39中任一項之方法，其中該癌症為II期、III期或IV期。 實施例 41.如實施例1-40中任一項之方法，其中該癌症為IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。 實施例 42.如實施例1-41中任一項之方法，其中該癌症經完全切除，不具有疾病跡象，或兩者兼有。 實施例 43.如實施例1-42中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與第二劑量之該醫藥組合物。 實施例 44.如實施例1-43中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與至少兩個劑量之該醫藥組合物。 實施例 45.如實施例1-44中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與至少三個劑量之該醫藥組合物。 實施例 46.如實施例45之方法，其中該至少三個劑量中之至少一個劑量在該患者已接受該至少三個劑量中之另一劑量的8天內經投與至該患者。 實施例 47.如實施例45或46之方法，其中該至少三個劑量中之至少一個劑量在該患者已接受該至少三個劑量中之另一劑量的15天內經投與至該患者。 實施例 48.如實施例1-47中任一項之方法，該方法包括在10週內向該患者投與至少8個劑量之該醫藥組合物。 實施例 49.如實施例48之方法，該方法包括每週向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物持續6週時期，且接著每兩週投與一個劑量之該醫藥組合物持續4週時期。 實施例 50.如實施例48或49之方法，該方法進一步包括在該至少8個劑量之後每月向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物。 實施例 51.如實施例1-47中任一項之方法，該方法包括每週向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物持續7週時期。 實施例 52.如實施例51之方法，該方法進一步包括每三週向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物。 實施例 53.如實施例1-52中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為5 µg至500 µg總RNA。 實施例 54. 如實施例1-53中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為7.2 µg至400 µg總RNA。 實施例 55.如實施例1-54中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為10 µg至20 µg總RNA。 實施例 56.如實施例1-55中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約14.4 µg總RNA。 實施例 57.如實施例1-56中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約25 µg總RNA。 實施例 58.如實施例1-54中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約50 µg總RNA。 實施例 59.如實施例1-54中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約100 µg總RNA。 實施例 60.如實施例1-59中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量全身性經投與。 實施例 61.如實施例1-60中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量經靜脈內投與。 實施例 62.如實施例1-60中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量經肌肉內投與。 實施例 63.如實施例1-60中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量經皮下投與。 實施例 64.如實施例1-63中任一項之方法，其中該醫藥組合物作為單一療法經投與。 實施例 65.如實施例1-63中任一項之方法，其中該醫藥組合物作為組合療法之一部分經投與。 實施例 66.如實施例65之方法，其中該組合療法包含該醫藥組合物及免疫檢查點抑制劑。 實施例 67.如實施例1-66中任一項之方法，其中該患者先前已接受免疫檢查點抑制劑。 實施例 68.如實施例1-63及65-67中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與免疫檢查點抑制劑。 實施例 69.如實施例66-68中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑、CTLA4抑制劑、Lag-3抑制劑或其組合。 實施例 70.如實施例66-69中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含抗體。 實施例 71.如實施例66-70中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含本文中之 表 4中列出的抑制劑。 實施例 72.如實施例66-71中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗、納武單抗、派姆單抗、阿維魯單抗、西米普利單抗、阿特珠單抗、德瓦魯單抗或其組合。 實施例 73.如實施例66-72中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗。 實施例 74.如實施例66-72中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗及納武單抗。 實施例 75.如實施例1-74中任一項之方法，其中該醫藥組合物在該患者中誘導免疫反應。 實施例 76.如實施例1-76中任一項之方法，該方法進一步包括確定該患者之免疫反應水準。 實施例 77.如實施例76之方法，將該患者之免疫反應水準與已投與該醫藥組合物的第二患者之免疫反應水準進行比較，其中該第二患者在投與時間之前經診斷患有癌症且係歸類為在投與時具有疾病跡象。 實施例 78.如實施例77之方法，其中該醫藥組合物在該患者中誘導一定水準之免疫反應，該免疫反應水準與已投與該醫藥組合物、先前已經診斷患有癌症且歸類為在投與時具有疾病跡象之第二患者之免疫反應水準可比較。 實施例 79.如實施例75-78中任一項之方法，其中該免疫反應水準係由該醫藥組合物誘導之從頭免疫反應。 實施例 80.如實施例1-79中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後確定該患者之免疫反應水準。 實施例 81.如實施例80之方法，將投與該醫藥組合物之後該患者之免疫反應水準與投與該醫藥組合物之前該患者之免疫反應水準進行比較。 實施例 82.如實施例81之方法，其中投與該醫藥組合物之後該患者之免疫反應水準與投與該醫藥組合物之前該患者之免疫反應水準相比有所增加。 實施例 83.如實施例81之方法，其中投與該醫藥組合物之後該患者之免疫反應水準與投與該醫藥組合物之前該患者之免疫反應水準相比得以維持。 實施例 84.如實施例75-83中任一項之方法，其中該患者之免疫反應為適應性免疫反應。 實施例 85.如實施例75-84中任一項之方法，其中該患者之免疫反應為T細胞反應。 實施例 86.如實施例85之方法，其中該T細胞反應為或包含CD4+反應。 實施例 87.如實施例85或86之方法，其中該T細胞反應為或包含CD8+反應。 實施例 88.如實施例75-87中任一項之方法，其中使用干擾素-γ酶聯免疫吸收劑斑點(ELISpot)分析來確定該患者之免疫反應水準。 實施例 89.如實施例1-88中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之淋巴組織中之該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之一或多者的水準。 實施例 90.如實施例1-89中任一項之方法，該方法進一步包括量測該癌症中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之一或多者的水準。 實施例 91.如實施例1-90中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之脾臟中的代謝活性水準。 實施例 92.如實施例1-91中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之脾臟中的代謝活性水準。 實施例 93.如實施例91或92之方法，其中使用正電子發射斷層掃描(PET)、電腦化斷層掃描(CT)掃描、磁共振成像(MRI)或其組合來量測該患者之脾臟中的代謝活性水準。 實施例 94.如實施例1-93中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之血漿中的一或多種細胞介素之量。 實施例 95.如實施例1-94中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之血漿中的一或多種細胞介素之量。 實施例 96.如實施例94或95之方法，其中該一或多種細胞介素包含干擾素(IFN)-α、IFN-γ、介白素(IL)-6、IFN誘導蛋白(IP)-10、IL-12 p70次單元或其組合。 實施例 97.如實施例1-96中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之癌症病灶的數目。 實施例 98.如實施例1-97中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之癌症病灶的數目。 實施例 99.如實施例98之方法，其中與投與該醫藥組合物之前相比，在投與該醫藥組合物之後該患者之癌症病灶較少。 實施例 100.如實施例1-99中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目。 實施例 101.如實施例1-100中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之後的複數個時間點量測該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目。 實施例 102.如實施例1-101中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該第一劑量之該醫藥組合物之後及在投與該第二劑量之該醫藥組合物之後量測該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目。 實施例 103.如實施例102之方法，其中與在投與該第一劑量之該醫藥組合物之後相比，在投與該第二劑量之該醫藥組合物之後，該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目較大。 實施例 104.如實施例1-103中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之後確定該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的表型。 實施例 105.如實施例104之方法，其中該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的至少一個子集具有T輔助細胞-1表型。 實施例 106.如實施例104或105之方法，其中該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞包含具有PD1+效應子記憶表型之T細胞。 實施例 107.如實施例3-106中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測一或多個癌症病灶之大小。 實施例 108.如實施例3-107中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之一或多個癌症病灶的大小。 實施例 109.如實施例108之方法，該方法進一步包括比較在投與該醫藥組合物之前及之後該患者之一或多個癌症病灶的大小。 實施例 110.如實施例109之方法，其中在投與該醫藥組合物之後該患者之至少一個癌症病灶的大小等於或小於在投與該醫藥組合物之前該至少一個癌症病灶的大小。 實施例 111.如實施例3-110中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括監測無進展存活之持續時間。 實施例 112.如實施例111之方法，將該患者的無進展存活之持續時間與無進展存活之參考持續時間進行比較。 實施例 113.如實施例112之方法，其中無進展存活之參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之無進展存活之平均持續時間。 實施例 114.如實施例112或113之方法，其中該患者的無進展存活之持續時間在時間上長於無進展存活之參考持續時間。 實施例 115.如實施例3-114中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測疾病穩定化之持續時間。 實施例 116.如實施例115之方法，其中藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病穩定化。 實施例 117.如實施例115或116之方法，該方法進一步包括將該患者的疾病穩定化之持續時間與疾病穩定化之參考持續時間進行比較。 實施例 118.如實施例117之方法，其中疾病穩定化之參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之疾病穩定化之平均持續時間。 實施例 119.如實施例118之方法，其中與疾病穩定化之參考持續時間相比，該患者展現增加的疾病穩定化之持續時間。 實施例 120.如實施例3-119中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測腫瘤反應性之持續時間。 實施例 121.如實施例120之方法，其中藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定腫瘤反應性。 實施例 122.如實施例120或121之方法，該方法進一步包括將該患者的腫瘤反應性之持續時間與腫瘤反應性之參考持續時間進行比較。 實施例 123.如實施例122之方法，其中腫瘤反應性之參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之腫瘤反應性之平均持續時間。 實施例 124.如實施例123之方法，其中與腫瘤反應性之參考持續時間相比，該患者展現增加的腫瘤反應性之持續時間。 實施例 125.如實施例1-106中任一項之方法，對於歸類為不具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括監測無疾病存活之持續時間。 實施例 126.如實施例125之方法，該方法進一步包括將該患者的無疾病存活之持續時間與無疾病存活之參考持續時間進行比較。 實施例 127.如實施例126之方法，其中無疾病存活之參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之無疾病存活之平均持續時間。 實施例 128.如實施例127之方法，其中與無疾病存活之參考持續時間相比，該患者展現增加的無疾病存活之持續時間。 實施例 129.如實施例1-106及125-128中任一項之方法，對於歸類為不具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測直至疾病復發之持續時間。 實施例 130.如實施例129之方法，其中藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病復發。 實施例 131.如實施例129或130之方法，該方法進一步包括將該患者的直至疾病復發之持續時間與直至疾病復發之參考持續時間進行比較。 實施例 132.如實施例131之方法，其中直至疾病復發之參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之直至疾病復發之平均持續時間。 實施例 133.如實施例132之方法，其中與直至疾病復發之參考持續時間相比，該患者展現增加的直至疾病復發之持續時間。 實施例 134.一種用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。 實施例 135.一種用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。 實施例 136.一種用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。 實施例 137.一種用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。 實施例 138.如實施例136或137之醫藥組合物，其中該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。 實施例 139.如實施例136或137之醫藥組合物，其中該患者係歸類為在投與時具有疾病跡象。 實施例 140.如實施例134-139中任一項之醫藥組合物，其中藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了有疾病跡象或無疾病跡象。 實施例 141.如實施例134-140中任一項之醫藥組合物，其中該癌症為黑色素瘤。 實施例 142.如實施例134-141中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含： (i) 編碼NY-ESO-1抗原之第一RNA分子， (ii) 編碼MAGE-3抗原之第二RNA分子， (iii) 編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子，及 (iv) 編碼TPTE抗原之第四RNA分子。 實施例 143.如實施例134-142中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少兩者。 實施例 144.如實施例134-143中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼多抗原決定基多肽，其中該多抗原決定基多肽包含該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少兩者。 實施例 145.如實施例134-144中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子進一步包含至少一個編碼CD4+抗原決定基之序列。 實施例 146.如實施例134-145中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含至少一個編碼破傷風類毒素P2之序列、編碼破傷風類毒素P16之序列或兩者。 實施例 147.如實施例134-146中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含編碼MHC I類運輸域之序列。 實施例 148.如實施例134-147中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含5'帽或5'帽類似物。 實施例 149.如實施例134-148中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含編碼信號肽之序列。 實施例 150.如實施例134-149中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含至少一種非編碼調節元件。 實施例 151.如實施例134-150中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含聚腺嘌呤尾。 實施例 152.如實施例151之醫藥組合物，其中該聚腺嘌呤尾為或包含經修飾之腺嘌呤序列。 實施例 153.如實施例134-152中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含至少一個5'非轉譯區(UTR)及/或至少一個3’ UTR。 實施例 154.如實施例153之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子依5'至3'次序包含： (i) 5'帽或5'帽類似物； (ii) 至少一個5’ UTR； (iii) 信號肽； (iv) 編碼該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者的編碼區； (v) 至少一個編碼破傷風類毒素P2、破傷風類毒素P16或兩者之序列； (vi) 編碼MHC I類運輸域之序列； (vii) 至少一個3’UTR；及 (viii) 聚腺嘌呤尾。 實施例 155.如實施例134-154中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含天然核糖核苷酸。 實施例 156.如實施例134-155中任一項之醫藥組合物，其中該一或多種RNA分子包含經修飾或合成核糖核苷酸。 實施例 157.如實施例134-156中任一項之醫藥組合物，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者為全長、非突變型抗原。 實施例 158.如實施例134-157中任一項之醫藥組合物，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原全部均為全長、非突變型抗原。 實施例 159.如實施例134-158中任一項之醫藥組合物，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者由該患者之淋巴組織中的樹突狀細胞表現。 實施例 160.如實施例134-159中任一項之醫藥組合物，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者存在於癌症中。 實施例 161.如實施例134-160中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含脂質體。 實施例 162.如實施例134-160中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含陽離子脂質體。 實施例 163.如實施例134-162中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含脂質奈米粒子。 實施例 164.如實施例134-163中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE)或兩者。 實施例 165.如實施例134-164中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質。 實施例 166.如實施例134-165中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質及輔助脂質。 實施例 167.如實施例166中任一項之藥物組合物，其中該輔助脂質為或包含磷脂。 實施例 168.如實施例166或167中任一項之醫藥組合物，其中該輔助脂質為或包含固醇。 實施例 169.如實施例134-168中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質粒子包含至少一種聚合物結合之脂質。 實施例 170.如實施例134-169中任一項之醫藥組合物，其中該患者為人類。 實施例 171.如實施例134-170中任一項之醫藥組合物，其中該癌症為上皮癌。 實施例 172.如實施例134-171中任一項之醫藥組合物，其中該癌症為黑色素瘤。 實施例 173.如實施例172之醫藥組合物，其中該黑色素瘤為皮膚黑色素瘤。 實施例 174.如實施例134-173中任一項之醫藥組合物，其中該癌症為晚期。 實施例 175.如實施例134-174中任一項之醫藥組合物，其中該癌症為II期、III期或IV期。 實施例 176.如實施例134-175中任一項之醫藥組合物，其中該癌症為IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。 實施例 177.如實施例134-176中任一項之醫藥組合物，其中該癌症經完全切除，不具有疾病跡象，或兩者兼有。 實施例 178.一種醫藥組合物用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應的用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。 實施例 179.一種醫藥組合物用於治療癌症之用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。 實施例 180.如實施例178或179之用途，其中該癌症為黑色素瘤。 實施例 181.一種醫藥組合物用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應的用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。 實施例 182.一種醫藥組合物用於治療癌症之用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。 實施例 183.如實施例181或182之用途，其中該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。 實施例 184.如實施例181或182之用途，其中該患者係歸類為在投與時具有疾病跡象。 實施例 185.如實施例178-184中任一項之用途，其中藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了有疾病跡象或無疾病跡象。 實施例 186.如實施例178-185中任一項之用途，其中該癌症為黑色素瘤。 實施例 187.如實施例178-186中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含： (i) 編碼NY-ESO-1抗原之第一RNA分子， (ii) 編碼MAGE-3抗原之第二RNA分子， (iii) 編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子，及 (iv) 編碼TPTE抗原之第四RNA分子。 實施例 188.如實施例178-187中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少兩者。 實施例 189.如實施例178-188中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼多抗原決定基多肽，其中該多抗原決定基多肽包含該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少兩者。 實施例 190.如實施例178-189中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子進一步包含至少一個編碼CD4+抗原決定基之序列。 實施例 191.如實施例190之用途，其中該一或多種RNA分子包含至少一個編碼破傷風類毒素P2之序列、編碼破傷風類毒素P16之序列或兩者。 實施例 192.如實施例178-191中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含編碼MHC I類運輸域之序列。 實施例 193.如實施例178-192中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含5'帽或5'帽類似物。 實施例 194.如實施例178-193中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含編碼信號肽之序列。 實施例 195.如實施例178-194中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含至少一種非編碼調節元件。 實施例 196.如實施例178-195中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含聚腺嘌呤尾。 實施例 197.如實施例196之用途，其中該聚腺嘌呤尾為或包含經修飾之腺嘌呤序列。 實施例 198.如實施例178-197中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含至少一個5'非轉譯區(UTR)及/或至少一個3’ UTR。 實施例 199.如實施例198之用途，其中該一或多種RNA分子依5'至3'次序包含： (i) 5'帽或5'帽類似物； (ii) 至少一個5’ UTR； (iii) 信號肽； (iv) 編碼該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者的編碼區； (v) 至少一個編碼破傷風類毒素P2、破傷風類毒素P16或兩者之序列； (vi) 編碼MHC I類運輸域之序列； (vii) 至少一個3’UTR；及 (viii) 聚腺嘌呤尾。 實施例 200.如實施例178-199中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含天然核糖核苷酸。 實施例 201.如實施例178-200中任一項之用途，其中該一或多種RNA分子包含經修飾或合成核糖核苷酸。 實施例 202.如實施例178-201中任一項之用途，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者為全長、非突變型抗原。 實施例 203.如實施例178-202中任一項之用途，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原全部均為全長、非突變型抗原。 實施例 204.如實施例178-203中任一項之用途，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者由該患者之淋巴組織中的樹突狀細胞表現。 實施例 205.如實施例178-204中任一項之用途，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者存在於癌症中。 實施例 206.如實施例178-205中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含脂質體。 實施例 207.如實施例178-205中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含陽離子脂質體。 實施例 208.如實施例178-207中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含脂質奈米粒子。 實施例 209.如實施例178-208中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE)或兩者。 實施例 210.如實施例178-209中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質。 實施例 211.如實施例178-210中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質及輔助脂質。 實施例 212.如實施例211中任一項之用途，其中該輔助脂質為或包含磷脂。 實施例 213.如實施例211或212中任一項之用途，其中該輔助脂質為或包含固醇。 實施例 214.如實施例178-213中任一項之用途，其中該等脂質粒子包含至少一種聚合物結合之脂質。 實施例 215.如實施例178-214中任一項之用途，其中該患者為人類。 實施例 216.如實施例178-215中任一項之用途，其中該癌症為上皮癌。 實施例 217.如實施例178-216中任一項之用途，其中該癌症為黑色素瘤。 實施例 218.如實施例217之用途，其中該黑色素瘤為皮膚黑色素瘤。 實施例 219.如實施例178-218中任一項之用途，其中該癌症為晚期。 實施例 220.如實施例178-219中任一項之用途，其中該癌症為II期、III期或IV期。 實施例 221.如實施例178-220中任一項之用途，其中該癌症為IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。 實施例 222.如實施例178-221中任一項之用途，其中該癌症經完全切除，不具有疾病跡象，或兩者兼有。 範例 實例 1 ：試驗設計及材料及方法
Lipo-MERIT 臨床試驗之設計。 此試驗(NCT02410733)之主要目的係評估黑色素瘤FixVac之安全性及耐受性、其初步功效及無進展存活；研究疫苗誘導之抗原特異性免疫反應；且確定II期劑量。如本文所用，術語「FixVac」係指包含一或多種 如圖 1所示之RNA分子及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)之醫藥組合物。BNT111為FixVac之一實施例。由於此為首次人體I期試驗，且符合目的，故未使用統計方法來預定樣品大小。在實驗及結果評估期間，研究人員未進行盲法分組。
該試驗正在德國根據赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)及良好臨床實踐指南(Good Clinical Practice Guideline)進行，且由獨立倫理委員會(Ethik-Kommission of the Landesärztekammer Rheinland Pfalz, Mainz, Germany)及主管監管機構(Paul-Ehrlich Institute, Langen, Germany)批准。所有患者均提供書面知情同意書。
合格患者患有經切除及未經切除之惡性黑色素瘤III B-C期或IV期(American Joint Committee on Cancer (AJCC) 2009年黑色素瘤歸類)，且因此在基線處具有可量測及不可量測之疾病，其中表現四種疫苗TAA中之至少一者。患者亦為至少18歲，且具有適當血液學及終末器官功能。納入準則要求個體在所有可用之治療選項均已經透明揭示之後，不符合或拒絕任何其他可用之獲批療法。關鍵排除準則係存在臨床上相關之自體免疫疾病、人類免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)或活動性腦轉移。患者在64天內接受8次RNA-LPX注射(初免/重複加強方案)，群組1之患者除外，該等患者僅在43天內接受6次注射。對於未展現疾病進展或藥物相關毒性之患有可量測之疾病的患者，提供每月一次疫苗劑量之可選繼續治療。患者在七個劑量遞增群組中接受治療，標靶劑量介於14.4 μg至400 μg總RNA範圍內，且在三個擴展群組中進一步探索14.4 μg、50 μg及100 μg之劑量水準。藉由使用靜脈導管進行連續四次靜脈內緩慢推注來執行RNA-LPX投與。
有關參與該研究之患者的額外資訊包括於 圖 35及 圖 36中。
關鍵研究評估。 基於體格檢查或生命徵象之變化、臨床實驗室分析及任何不良事件之報告(包括臨床上顯著的實驗室異常)，評估安全性及耐受性。根據美國國家癌症研究所通用術語準則(NCI CTC 4.03版)，對不良事件進行分級。根據此等準則自1級至5級對安全性進行表徵。
在基線處藉由CT掃描及磁共振成像(MRI)對胸部、腹部及腦執行成像，且然後根據當地成像指南及irRECIST 1.1版(參考文獻25)每90天執行成像。
在投與FixVac之前及之後4小時且根據臨床指示來量測生命徵象(體溫、心率及血壓)。
為了評估疫苗誘導之免疫反應，在基線處、在第四次、第六次及第八次疫苗投與之前以及在第八次投與之後7-14天及19-33天對血液取樣。在群組1中，在基線處、在第三次、第四次、第五次及第六次疫苗投與之前以及在第六次投與之後7-14天對血液取樣。在繼續治療期間，每一次投與之前均採集血液樣品。藉由Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences)密度梯度離心自外周血或白細胞分離術樣品中分離PBMC。
對於細胞介素分析，在處理之前及在處理之後2 h、6 h、24 h或48 h對血清取樣，且在-80℃下裝運。使用人類泛IFN-α ELISA (PBL Assay Science)及multisport分析系統(Meso Scale Discovery)一式兩份(MLM Medical Labs)分析樣品。每次分析之樣品大小為：IFN-α對IP-10，n = 166；IFN-α對IFN-γ，n = 167；IFN-α對IL-6，n = 167；IFN-α對IL-12 p70，n = 167；來自72名患者且每位患者具有多達6個資料點。
在一小部分患者中詳細評估遲發性超敏(DTH)反應。在皮內注射濃(×2.67)林格氏溶液(由BAG Health Care根據良好製造規範(GMP)指南加以製造)中稀釋之RNA之後，在含高劑量IL-2 (50,000 U ml−1)之培養基(RPMI 1640、7%人類AB血清、1×抗黴菌劑)中培養兩週至三週之後，自穿刺生檢中回收皮膚浸潤性淋巴細胞(SIL)。
資料報告。 此為正在進行之探索性、開放標記、非隨機化首次人體I期臨床試驗。所提供之資料係基於探索性期間分析，其中資料提取日期為2019年7月29日。進行此探索性分析以向經歷過CPI之患者告知且啟動針對FixVac/抗PD1組合療法之隨機化2期試驗之設計。該分析係由以下資料之可用性觸發：針對各劑量群組中約一半的研究群體(n = 51)之基線至三個月比較性免疫原性資料，以及經FixVac單一療法及FixVac/抗PD1組合治療之患者的兩個子集之至少三個月隨訪資料。該探索性期間分析尤其集中於疫苗誘導之免疫反應(次要終點)。此外，已報告有關研究藥物之耐受性(主要終點)及根據irRECIST 1.1患有可量測之疾病之患者的反應(次要終點)之初步高級資料。所顯示之臨床資料為初步的且未完全驗證來源資料。在此論文被接受公開時，115名患者中之109名(95%)已登記。
例示性材料及方法。 以下實例中使用以下材料及方法。
FDG-PET/CT 成像。 在4-6 h禁食期(導致血糖水準低於130 mg dl−1)之後且在應用大約2 MBq kg−1 FDG後歷經60-70 min分佈時間之後，藉由進行PET/CT成像來評估脾臟中之[18F]FDG攝取。藉由EARL認證之Philips Gemini飛行時間(TOF) PET/CT掃描儀進行採集，根據臨床慣例，每個床位2-2.5 min。在以脾臟為中心之2 cm球形中量測平均標準化攝取值(SUV)。
TAA 表現譜。 自福馬林固定之石蠟包埋(FFPE)患者樣品中提取總RNA (RNeasy FFPE套組, Qiagen)。合成互補DNA (Peqstar, VWR International)且根據良好臨床實驗室規範(GCLP)指南，針對NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3及TPTE RNA以及編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT1)之參考基因的表現，藉由定量聚合酶鏈反應(PCR；Applied Biosystems 7300即時PCR系統, Thermo Fisher Scientific)進行分析。使每一個TAA之中值定量循環(Cq)值針對參考基因之中值Cq正規化以獲得相對表現ΔCq值，該值基於TAA特異性截止點係歸類為陽性或陰性。
RNA-LPX 製造。 在GMP條件下製造RNA、脂質體及RNA-LPX。藉由編碼NY-ESO-1、MAGE-A3、TPTE之全長序列或酪胺酸酶之胺基酸1-477的DNA質體模板之活體外轉錄執行RNA製造。如先前所述(參考文獻26)執行四種TAA編碼RNA藥物產品之製造、分析及釋放。
具有淨陽離子電荷之脂質體用於複合RNA以形成RNA-LPX。該等陽離子脂質體使用所採用之專有方案(參考文獻27)，基於乙醇注射技術(參考文獻28)，由陽離子合成脂質(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(R-DOTMA) (Merck and Cie)及磷脂1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE) (Corden Pharma)製得。脂質體之釋放分析包括確定外觀、脂質濃度、RNA酶存在、粒徑、重量滲透濃度、pH、亞可見粒子、熱原質測試及無菌性。
可注射之RNA-LPX藥物產品係在專用藥房中，根據專有(參考文獻27)方案，藉由使個別濃縮之RNA藥物產品與等張NaCl溶液(0.9%) (Fresenius Kabi)及陽離子脂質體一起培育來製備。RNA-LPX製備方案源自所述之核苷酸脂質複合物形成方案(參考文獻8、29)。在注射之前，用等張NaCl溶液(0.9%) (Fresenius Kabi)將RNA-LPX進一步稀釋至預期濃度。RNA-LPX藥物產品之定期品質控制包括確定RNA含量、RNA完整性、粒徑及多分散性指數。
PBMC 之活體外刺激。 使用微珠(Miltenyi Biotec)自冷凍保存之PBMC中分離CD4+及CD8+ T細胞。對於IVS，使用編碼TAA之RNA或肽。對於使用RNA之IVS，在隔夜靜置之後用編碼疫苗抗原、增強型綠色螢光蛋白(eGFP)、流感基質蛋白1 (M1)或破傷風p2/p16序列(流感M1及破傷風p2/p16分別為CD4+及CD8+ T細胞之陽性對照)之RNA對CD4或CD8耗盡之PBMC進行電穿孔。接著使該等細胞在37℃下靜置3 h，且以15 Gy進行照射。使隔夜靜置之CD4+/CD8+ T細胞以及經電穿孔及照射之抗原呈現細胞以2:1之效應子:標靶(E:T)比率組合。對於肽IVS，使CD4+ T細胞在用編碼MAGE-A3、酪胺酸酶、TPTE或NY-ESO-1之PepMix脈衝輸送之快速樹突狀細胞(E:T = 10:1)存在下擴增。為了擴增CD8+ T細胞，在IL-4及粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF) (各自1,000 U ml−1)及各別肽存在下，共培養CD4耗盡之PBMC與經純化之CD8+ T細胞(E:T = 1:10)。在開始IVS之後一天，添加含有10 U ml−1 IL-2 (Proleukin S, Novartis)及5 ng ml−1 IL-15 (Peprotech)之新鮮培養基。用肽刺激之CD8 IVS培養物另外接受IL-4及GM-CSF (各自1,000 U ml−1)。對於腫瘤細胞溶解實驗，肽脈衝輸送之批量PBMC用於IVS，且在培養6-8天之后收穫。對於較長培養，在建立IVS培養物之後7天對IL-2進行補充。在刺激11天之后，經由流式細胞術分析細胞且用於ELISpot分析。
IFN-γ ELISpot 。 對51名患者(50名離體患者，20名IVS後患者)執行ELISpot分析。除了 圖 5所示之49名患者以外，亦接受BRAF/MEK抑制劑之2名患者在IFN-γ ELISPOT中亦進行測試。用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌經IFN-γ特異性抗體(Mabtech)預包被之多篩濾板(Merck Millipore)，且用含有2%人類血清白蛋白(CSL-Behring)之X-VIVO 15 (Lonza)封閉持續1-5小時。接著，用肽(離體設定)，用經RNA電穿孔或裝載有肽(IVS後)之自體樹突狀細胞，或用肽負載之HLA I類或II類經轉染K562細胞(用於TCR驗證)刺激每孔0.5 × 10 5至3 × 10 5個效應細胞持續16-20小時。為了分析離體T細胞反應，使冷凍保存之PBMC在37℃下在2-5小時之中止期之後經受ELISpot。或者，將CD4或CD8耗盡之PBMC用作CD8或CD4效應子。所有測試均一式兩份或一式三份執行且包括陽性對照(葡萄球菌腸毒素B (Sigma Aldrich)、抗CD3 (Mabtech))以及來自具有已知反應性之參考供體之細胞。用生物素結合之抗IFNγ抗體(Mabtech)使斑點顯現，隨後用ExtrAvidin-鹼性磷酸酶(Sigma-Aldrich)及5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)/硝基藍四唑(NBT) (Sigma-Aldrich)培育。或者，使用與鹼性磷酸酶直接結合之第二抗體(ELISpot- Pro套組, Mabtech)。使用ImmunoSpot系列S5 Versa ELISpot分析儀(CTL, S5Versa-02-9038)或經典機器人ELISPOT讀取器(AID)對板進行掃描，且藉由ImmunoCapture 6.3版或AID ELISPOT 7.0軟體進行分析。斑點計數係概述為每一個一式三份或一式兩份之中值。將藉由編碼疫苗抗原之RNA或肽刺激的T細胞反應與藉由經對照RNA (螢光素酶)電穿孔之標靶細胞或藉由無負載細胞引發之反應進行比較。反應係定義為陽性，其中在離體設定中每1 × 10 5個細胞最少五個斑點，或者在IVS後設定中每5 × 10 4個細胞最少25個斑點，以及高達各別對照的兩倍以上之斑點計數。
流式細胞術。 使用螢光團結合之HLA多聚體(Immudex)來鑑定抗原特異性CD8 +T細胞。首先針對多聚體對細胞染色且接著針對如下細胞表面標記物染色(括號中為抗體純系)：CD28 (CD28.8)、CD197 (150503)、CD45RA (HI100)、CD3 (UCHT1或SK7)、CD16 (3G8)、CD14 (MφP9)、CD19 (SJ25C1)、CD27 (L128)、CD279 (EH12)、CD134 (ACT35)及CD8 (RPA-T8或SK1)，均購自BD Biosciences；CD19 (HIB19)及CD4 (OKT4)，購自Biolegend。亦使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；BD)或可固定之活力染料eFluor 780或eFluor 506 (eBioscience)進行活死細胞染色。在CD3 +(或CD8 +)、CD4 −CD14 −CD16 −CD19 −或CD3 +(或CD8 +) CD4−事件內鑑定單一、活細胞、多聚體陽性事件。為了在IVS後偵測抗原特異性T細胞，對單一、活細胞、CD3 +、CD8 +多聚體+淋巴細胞進行閘控。
對於細胞內細胞介素之染色，以10:1之E:T比率添加經編碼單一新抗原決定基之RNA電穿孔之自體樹突狀細胞，且在37℃下在布雷非德菌素A (brefeldin A)及莫能菌素(monensin)存在下培養大約16 h。針對活力(使用可固定之活力染料eFluor 506或eFluor 780，eBioscience)及表面標記物CD8 (RPA-T8或SK1)、CD16 (3G8)、CD14 (MφP9) (均來自BD Biosciences)、CD19 (HIB19)或CD4 (OKT4) (來自Biolegend)對細胞染色。在滲透化之後，使用針對IFN-γ (B27, BD Biosciences)及TNF (Mab11, BD或Biolegend)之抗體執行細胞內細胞介素染色。在單一、活細胞及CD14 −CD16 −CD19 −(未用於所有實驗中)群體中預閘控之CD8 +及CD4 +細胞內鑑定出IFN-γ+及TNF+事件。
使用針對TCR-β鏈之適當可變區家族或恆定區之抗TCR抗體(Beckman Coulter)及CD8或CD4特異性抗體(SK-1, BD；REA623, Miltenyi Biotec)來分析經轉染TCR基因之細胞表面表現。藉由用HLA II類特異性抗體(9-49, Beckman Coulter)及HLA I類特異性抗體(DX17, BD Biosciences)染色來偵測用於評估經TCR轉染之T細胞的功能之抗原呈現細胞之HLA抗原。在LSR Fortessa SORP、FACSCelesta或FACSCanto II細胞分析儀(BD Biosciences)上執行採集，且經由FlowJo軟體(Tree Star)進行分析。
HLA 抗原之選殖。 由Eurofins Genomics Germany GmbH根據各別高解析度HLA分型結果合成HLA抗原。使用DQA1_s (Pho GCC ACC ATG ATC CTA AAC AAA GCT CTG MTG C)及DQA1_as (TAT GCG ATC GCT CAC AAK GGC CCY TGG TGT CTG)引子，用2.5 U Pfu聚合酶自供體特異性cDNA擴增HLA DQA序列。將HLA抗原選殖至適當消化之IVT載體中(參考文獻10)。
RNA 轉移至細胞中。 將RNA添加至預冷卻之4-mm間隙無菌電穿孔比色皿(Bio-Rad)中的X-VIVO 15培養基(Lonza)中懸浮之細胞中。用BTX ECM 830方波電穿孔系統執行電穿孔，其中先前已針對每一種細胞類型建立條件(T細胞，500 V，每個脈衝3 ms，一個脈衝；未成熟樹突狀細胞，300 V，每個脈衝12 ms，一個脈衝；SK-MEL-29，250 V，每個脈衝3 ms，三個脈衝；Jurkat細胞，275 V，每個脈衝10 ms，一個脈衝；K562細胞，每三個脈衝200 V/8 ms)。
肽。 重疊肽池(PepMix)用於編碼全長NY-ESO-1、酪胺酸酶、MAGE-A3及TPTE，或源自此等抗原之短(8-11聚體)抗原決定基，以及編碼HIV gag之PepMix作為對照。所有合成肽均購自JPT Peptide Technologies GmbH，且溶解於含有10%二甲亞碸(DMSO)之水中，最終濃度為3 mM (短肽)，或溶解於100% DMSO (PepMix)中。
細胞株。 K562及SK-MEL-28細胞株獲自ATCC。SK-MEL-29細胞株獲自Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York。SK-MEL-37細胞株描述於參考文獻30中。表現由活化T細胞核因子(NFAT)反應元件驅動之螢光素酶報告基因的Jurkat T細胞株係由Promega製造。藉由美國典型培養物保藏中心(ATCC)及Eurofins之短串聯重複序列(STR)譜對細胞株執行再認證。所用之所有細胞株均經測試針對黴漿菌污染呈陰性。未使用通常錯誤鑑定之細胞株。
單細胞分選。 基於刺激誘導之IFN-γ分泌或多聚體結合，使用離體PBMC或IVS培養物對單一抗原特異性T細胞進行分選。關於刺激，用編碼相關抗原或對照抗原之重疊肽對PBMC進行脈衝輸送，而IVS後擴增之T細胞與自體肽脈衝輸送之樹突狀細胞一起培養。4 h後，收穫細胞且使用IFN-γ分泌分析套組(Miltenyi Biotec)，用活力染料eFluor780 (eBioscience)及針對CD3、CD8及CD4 (均來自BD Biosciences)以及IFN-γ之螢光染料結合抗體染色。或者，用各別多聚體對PBMC染色。分別使用BD FACSDiva或BD FACSChorus軟體，在FACSAria或FACSMelody流式細胞儀(均來自BD Biosciences)上進行單一新抗原特異性T細胞之分選。相對於用對照抗原刺激或無多聚體染色之對照樣品鑑定抗原特異性T細胞。將每孔一個T細胞(在單一、活細胞CD3+及CD8+IFN-γ+、CD4+IFN-γ+或CD8+多聚體+淋巴細胞上閘控)收穫至每孔含有6 μl輕度低張細胞溶解緩衝液(由無RNA酶水中之0.2% Triton X-100、0.2 μl RiboLock RNA酶抑制劑(Thermo Scientific)、5 ng poly(A)載體RNA (Qiagen)及1 μl dNTP mix (10 mM, Biozym)組成)之96孔V型底板(Greiner Bio-One)中。將板密封，離心且在分選之後直接儲存於-65℃至-85℃下。
抗原特異性 TCR 之選殖。 如10所述且進行以下修改，自單一T細胞選殖TCR基因。將具有經分選細胞之板解凍，且使用對TCR-α及-β恆定基因具特異性之引子(TRAC，5′-catcacaggaactttctgggctg-3′；TRBC1，5′-gctggtaggacaccgaggtaaagc-3′；TRBC2 5′-gctggtaagactcggaggtga agc-3′)用RevertAid H逆轉錄酶(Thermo Fisher)執行模板轉換cDNA合成，隨後使用PfuUltra Hotstart DNA聚合酶(Agilent)進行預擴增。在cDNA合成及PCR之後，藉由用5 U核酸外切酶I (NEB)處理來移除殘餘引子。cDNA之等分試樣用於Vα/Vβ基因特異性多重PCR。在毛細管電泳系統(Qiagen)上對產物進行分析。在瓊脂糖凝膠上對具有430 bp至470 bp條帶之樣品進行大小分級，且使用Gel Extraction套組(Qiagen)切除且純化該等條帶。對經純化之片段進行測序，且使用IMGT/V-Quest工具(參考文獻31)分析各別V(D)J接合。使用NotI來消化新穎且高效重排之相應TCR鏈的DNA，且將其選殖至含有適當恆定區之pST1載體中，用於活體外轉錄完整TCR-α/β鏈10。
單細胞 TCR 測序。 對於所選患者，藉由基於下一代測序(NGS)之單細胞TCR測序(scTCR-seq)工作流程獲得來自經分選單細胞之TCR。此處，使用對TCR-α及TCR-β恆定基因具特異性之引子(TRAC，5′-catcacaggaactttctgggctg-3′；TRBC，5′-cacgtggtcggggwagaagc-3′)執行模板轉換cDNA合成，隨後用5 U核酸外切酶I處理。使用2.5 U PfuUltra Hotstart DNA聚合酶(Agilent)、1× PCR緩衝液、0.2 mM dNTP、0.2 μM八種經標記之正向引子之一(Tag130-RBCx-TS 5′-cgatccagactagacgctcaggaagxxxxxaagcagtggtatcaacgcagagt-3′)及0.1 μM各經標記之巢式TCR-α及TCR-β恆定基因特異性引子(Tag146-TRAC，5′-caatatgtgaccgccgagtcccaggttagagtctc tcagctggtacacggcag-3′；Tag146-TRBC，5′-caatatgtgaccgccgagtccc aggggctcaaacacagcgacctcgggtg-3′)對各cDNA進行PCR擴增且按列標記條碼(95℃持續2 min；94℃持續30 s、61℃持續30 s、72℃持續1 min之5個週期；94℃持續30 s、64℃持續30 s、72℃持續1 min之5個週期；94℃持續30 s、72℃持續2 min之8個週期；72℃持續6 min) (RBC，列條碼；TS，模板轉換引子)。匯集各行之樣品且使用AMPure XP珠粒(Agencourt)純化兩次，且在其間進行核酸外切酶I處理。對於每個池，使用1 μl PfuUltra II Fusion Hotstart DNA聚合酶(Agilent)、1×反應緩衝液、0.2 mM dNTP、正向引子(Tag- 130 5′-(n)nnnncgatccagactagacgctcaggaag-3′)及針對各行含有不同條碼之12種Tag- 146反向寡核苷酸之一(5′-xxxxxcaatatgtgaccgccgagtcccagg-3′)藉由PCR進一步擴增三分之一的經純化TCR cDNA (95℃持續1分鐘；94℃持續20秒、64℃持續20秒、72℃持續30秒之24個週期；72℃持續3分鐘)。匯集PCR產物且用AMPure XP珠粒及核酸外切酶I純化，隨後使用TruSeq DNA Nano套組(Illumina)產生TCR測序文庫。在測序深度為每孔10,000個讀數之Illumina MiSeq上，使用配對末端300-bp測序對scTCR文庫進行測序。相繼使用bcl2fastq軟體(Illumina)、內部Python腳本，將測序資料解編至單細胞水準。接著使用MiXCR-2.1.5 (參考文獻32)獲得TCR序列。合成所選經配對α及β V(D)J片段(Eurofins Genomics)且如上文進行選殖以用於後續活體外轉錄。
批量 TCR 測序。 使用RNeasy Mini套組(Qiagen)，自疫苗接種期間之多個時間點收集的1 × 10 6個速凍PBMC中分離總RNA。用SMARTer人類TCR-α/β譜套組(Clontech)產生文庫，且使用Illumina MiSeq系統進行測序。每個樣品之總TCR讀數之數目介於1 × 10 6至4 × 10 6範圍內。使用VDJtools (參考文獻33)及MiXCR分析資料。
功能性 TCR 表徵。 將來自健康供體之經TCR轉染之CD4+或CD8+ T細胞與肽脈衝輸送之HLA I類或II類經轉染K562細胞共培養，且藉由IFN-γ ELISpot分析進行測試。或者，用編碼CD8-α及TCR-α/β之RNA轉染T細胞活化生物分析(NFAT, Promega)之Jurkat細胞，且針對標靶細胞進行測試( 圖 4c)。在添加Bio-Glo試劑(Promega)之後，經由發光量測(Infinite F200 PRO, Tecan)分析T細胞活化。
細胞毒性分析。 根據供應商之說明書，用xCELLigence MP系統(OMNI Life Science)藉由細胞指數阻抗量測來評估T細胞介導之細胞毒性。作為效應細胞，使用來自健康供體之經OKT3活化的經TCR轉染之CD8+ T細胞，或來自IVS培養物之患者源性CD8+ T細胞。作為標靶細胞，使用經各別HLA等位基因轉染之黑色素瘤細胞株，且以每孔2 × 10 4個細胞之濃度接種於96孔PET E板(ACEA Biosciences)中。24 h之後，以不同E:T比率添加效應T細胞，且使用xCELLigence系統每30 min監測一次細胞指數值持續長達48 h之時期。基於陰性對照(對於TCR，經模擬轉染之T細胞；對於IVS細胞，預處理IVS培養物)，在所指示之共培養時間( 圖 2i、 圖 3e，12小時； 圖 3d，63小時； 圖 4f，8小時)之後計算特定溶解。
突變發現及基因表現。 如所述(參考文獻26)偵測突變。本質上，使用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)軟體(參考文獻34)將各患者之基因體序列讀數與人類參考基因體hg19進行比對。比較來自腫瘤及匹配之正常樣品的外顯子體以檢索單核苷酸變異體(SNV)。為了保留高置信度SNV，過濾具有推定純合基因型之基因座，以及來自推定雜合突變事件之可疑位點，以移除假陽性。對於高置信度突變之最終清單，併入基因體坐標及加州大學聖克魯斯分校(UCSC)基因體瀏覽器已知基因以使變異體與基因相關聯。選擇非同義突變進行進一步加工。
使用腫瘤RNA測序資料，使用Sailfish (參考文獻35)及UCSC已知基因轉錄物作為參考來計算基因表現值。將轉錄物計數正規化為每百萬讀數中之轉錄物(TPM)。
為了比較突變負荷與基因表現，在基因由UCSC資料庫中之數個轉錄物同功型指示之彼等情況下，使用轉錄表現值之平均值。使用來自三個黑色素瘤群組之患者資料使突變負荷及表現水準相關聯：來自NCT02035956試驗之13名患者(參考文獻26)，來自已公開之黑色素瘤群組的25名患者(參考文獻22)，以及來自MET500群組之患者的12名患者之轉移資料(參考文獻36)。
統計學及再現性。 樣品大小(n)代表所分析之患者數目，但 圖 6c除外，其中源自72名患者之多個量測(每位患者最多6個)之總和係指定為n。若未另外說明，則中心值代表平均值，其中重複以符號描繪。對於其中無法顯示個別重複值之細胞毒性實驗，用於溶解計算之所有技術一式三份之分散均指示為標準偏差。藉由Spearman相關性( 圖 6c，rs：Spearman等級相關係數)、Pearson相關性、Kruskal-Wallis測試、隨後Dunn事後測試( 圖 6b)或Brown-Forsythe及Welch方差分析(ANOVA)、隨後Dunnett T3多重比較測試( 圖 9d)確定統計學顯著性(P)。所有分析均為雙尾且使用GraphPad Prism 8.4進行。所有實驗均執行一次。該等實驗並非隨機化的。
以下實例概述對89名患者( 圖 5)進行之探索性期間分析(截至2019年7月29日)的結果，該探索性期間分析集中於藉由黑色素瘤FixVac誘導之免疫反應。亦評估患有可量測之疾病之患者對單獨或與抗PD1抗體組合之FixVac的最佳客觀反應( 圖 29)。 實例 2 ：由本文所述之例示性 RNA 組合物介導之免疫活化的活體內表 徵
本實例證明在投與例示性醫藥組合物之後免疫活化之活體內表徵，該醫藥組合物包含一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合；及脂質粒子(例如，脂質複合物或脂質奈米粒子)。 圖 1a顯示共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原及TPTE抗原之一或多種RNA分子之例示性示意圖。
脾臟中之 FixVac 靶向 。此實例藉由利用TLR配位體刺激後細胞之葡萄糖消耗增強顯示FixVac靶向脾臟(參考文獻12)。在此實例中，在注射FixVac之後不久進行[18F]-氟-2-去氧-2-d-葡萄糖(FDG)-正電子發射斷層掃描(PET)/電腦化斷層掃描(CT)掃描。在注射之後不久，尤其脾臟中之代謝活性顯著增加，指示淋巴組織駐留免疫細胞之快速靶向及瞬時活化( 圖 1c)。
佐劑性。 為了確定投與至患者之後FixVac之佐劑性，量測血漿細胞介素之量(參考文獻8)。干擾素(IFN)-α、IFN-γ、介白素(IL)-6、IFN誘導蛋白(IP)-10及IL-12 p70次單元之水準與FixVac劑量一致增加，伴有體溫之短暫升高( 圖 1d； 圖 6a)。細胞介素分泌為脈衝、短暫及自限性的，在治療之後2-6 h達到峰值，且在24 h內正常化( 圖 1d)。使FixVac與抗PD1抗體組合不會影響細胞介素( 圖 6b)。IFN-α之血漿濃度與所有其他量測之細胞介素充分相關(參見與IFNα之Spearman相關性(r s)，如 圖 6c所示)。
不良事件概況。 與細胞介素模式一致，臨床不良事件概括以輕度至中度流感樣症狀為主，諸如發熱及寒顫。不良事件主要為早發性、短暫性及可用退熱劑控制的，且在24小時內解決。活體內觀察結果概括了小鼠中之發現，其中FixVac之作用模式係由駐留於淋巴隔室中之樹突狀細胞中的抗原編碼RNA之轉譯以及由TLR對抗原呈現細胞誘導之伴隨發炎反應驅動的(參考文獻8、13及20)。然而，觸發人類之細胞介素釋放之FixVac濃度比小鼠中低1,000倍以上(Kranz等人，2014，其以引用之方式整體併入本文中)。
在投與期間偵測到的不良事件之其他詳情包括於 圖 40及 圖 41中。如所示，最常見的相關TEAE為發熱，其次為寒顫、頭痛、疲勞、噁心、關節痛、嘔吐及心動過速。此等相關TEAE之頻率在ED與NED子組之間相似。此等症狀主要為CTCAE 1級或2級，且由於RNA-LPX之固有佐劑性而具有預期反應原性。ED子組與NED子組相比經歷≥3級相關TEAE之患者的比例更高(分別為10名患者[26.3%]對3名患者[9.1%])。在ED及NED子組中，分別有4/38患者(10.5%)及1/33患者(3.0%)經歷TESAE，其被認為與試驗治療相關(資料未顯示)。 實例 3 ：醫藥組合物之免疫原性
此實例顯示在投與FixVac之後自黑色素瘤患者(例如，患者患有經切除及未經切除之惡性黑色素瘤III B-C期或IV期(American Joint Committee on Cancer (AJCC) 2009年黑色素瘤歸類)，且因此在基線處具有可量測及不可量測之疾病，其中表現FixVac中所包括的四種TAA中之至少一者)收集之樣品的活體外刺激(IVS)後免疫原性。在此實例中，藉由IVS後之IFN-γ ELISpot量測FixVac之免疫原性。
對於50名患者，在疫苗接種之前及之後(在8次FixVac注射之後)對批量或CD4或CD8耗盡之外周血單核細胞(PBMC)執行離體IFN-γ ELISpot ( 圖 2a及 圖 2b)，該等PBMC與代表本文所述之TAA的全長序列之重疊肽(所謂的PepMix)一起培育。亦使用IVS後IFN-γ ELISpot ( 圖 2c)分析來自20名患者之樣品，其中負載有TAA PepMix之自體樹突狀細胞用作標靶。來自所有20名此等患者之樣品顯示出針對至少一種TAA之T細胞反應( 圖 2c)，主要為單獨CD4 +反應或CD8 +及CD4 +反應( 圖 7a)。與疫苗前反應增強相比，疫苗誘導之從頭反應(在疫苗接種之前無法偵測到的彼等反應)更頻繁( 圖 7a)。在來自使用離體IFN-γ ELISpot分析之50名患者的樣品中，超過75%顯示出針對至少一種TAA之免疫反應( 圖 2a)。大多數此等高量級T細胞反應為CD8 +( 圖 2a)。
藉由HLA多聚體分析及細胞內細胞介素染色(ICS)量測離體從頭CD8 +T細胞。在4-8週內斜線上升至循環CD8 +T細胞之個位數或低兩位數百分率( 圖 2e-g； 圖 3a、 圖 7b、 圖 11)的抗原特異性T細胞屬於PD1 +CCR7 −CD27 +/−CD45RA −效應子記憶表型( 圖 2f、 圖 7c及 圖 12)，且在抗原特異性再刺激後分泌IFN-γ及腫瘤壞死因子(TNF) ( 圖 2h、 圖 7d及 圖 13)。大多數患者具有多抗原決定基CD8 +免疫反應( 圖 2b、 圖 2g)。在前8次疫苗接種之後每月經受維持疫苗接種之患者中，TAA特異性T細胞之頻率繼續增加或保持穩定超過一年( 圖 2g)。在無連續疫苗接種之患者中，記憶T細胞在數月內仍然存在，且呈緩慢下降趨勢( 圖 2e及 圖 7b)。 實例 4 ：自患者分離之疫苗擴增 T 細胞的 TAA 特異性 T 細胞受體 (TCR) 之表徵
此實例表徵來自投與FixVac後擴增之T細胞的T細胞受體。
來自經轉染至健康供體T細胞中之疫苗擴增T細胞( 圖 33)的TAA特異性T細胞受體(TCR)有效殺死TAA陽性黑色素瘤細胞( 圖 2i)。T細胞反應不受放射學可量測之疾病在基線處之存在或不存在、FixVac治療劑量或FixVac係單獨投與抑或與抗PD1抗體組合投與影響( 圖 7e及 圖 7f)。 實例 5 ： 42 名患有可量測轉移性疾病之患者的最佳客觀反應
此實例顯示患有可量測轉移性疾病之黑色素瘤患者的反應，該等患者在基線處可獲得一次掃描且在治療之後可獲得至少一次掃描。41名患者處於IV期，已經受前線全身性治療，且經歷過檢查點抑制劑(CPI)；其中35名已暴露於針對PD1及細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA4)之抗體( 圖 30)。
在FixVac單一療法組(n = 25)中，3名患者經歷部分反應且7名患者具有穩定疾病( 圖 2j、 圖 5)。另一名患者在[18F]-FDG-PET/CT成像中顯示出轉移性病灶之完全代謝緩解。在FixVac/抗PD1組合組中，17名患者中之6名發展部分反應。儘管經100 μg黑色素瘤FixVac加上抗PD1治療之患者的部分反應率最高(十名患者中有五名；客觀反應率為50%)，但所有劑量中均出現標靶病灶之消退( 圖 2j)。大多數具有部分反應或穩定疾病之患者顯示持久疾病控制(在長達兩年之觀察期內) ( 圖 2k； 圖 8a及 圖 8b)。客觀反應與基線處之腫瘤負荷相關( 圖 8c)。 實例 6 ：接受 FixVac 單一療法及接受 FixVac/ 抗 PD1 組合之黑色素瘤患者的免疫反應之表徵
此實例顯示特定患者在經FixVac及PD-1抑制之組合療法治療之後的反應。
數名具有部分反應之患者(接受FixVac單一療法之患者53-02及A2-10，以及接受FixVac/抗PD1組合之患者C2-28、C2-31及C1-40； 圖 8d)具有足以用於詳細表徵免疫反應之血液樣品。
患者53-02在派姆單抗治療下出現進展之後進入試驗。在FixVac單一療法中，此患者經歷持續8個月之部分反應，其中多個轉移消退( 圖 3b及 圖 9a)。應患者要求停止疫苗接種之後數週，診斷出轉移性病灶之再生長。該患者經派姆單抗療法再攻擊，且在隨後七個月內保持穩定( 圖 8d)。
對於此患者，藉由離體ELISpot偵測到針對NY-ESO-1及MAGE-A3之強烈從頭免疫反應。藉由HLA多聚體染色鑑定出的疫苗誘導之HLA-Cw*0304限制性CD8 +T細胞針對NY-ESO-196-104抗原決定基15之反應急劇增加至外周血CD8+ T細胞之超過10%且在持續疫苗接種下保持較高( 圖 3a及 圖 9b)。ICS證實，NY-ESO-1反應性IFN-γ+ T細胞擴增至全外周血CD8+ T細胞群體之高達15% ( 圖 3c及 圖 14)。疫苗接種後PBMC之短期IVS培養物針對NY-ESO-196-104抗原決定基擴增，有效殺死內源性NY-ESO-1+黑色素瘤細胞( 圖 3d及 圖 15)。
分別使用HLA多聚體結合及抗原特異性細胞介素分泌，藉由自T細胞進行單細胞選殖來鑑定HLA-Cw*0304限制性( 圖 9c-9f)及HLA-B*4001限制性( 圖 9g-9j) NY-ESO-1特異性TCR ( 圖 16)。所有TCR均介導NY-ESO-1 +黑色素瘤細胞之殺死( 圖 3e、 圖 9e及 圖 9j)。TCR-β純系型分析證實此等T細胞從頭發生( 圖 3f及 圖 9f)。此患者亦長期發展出MAGE-A3 167-176特異性T細胞，佔總CD8 +T細胞之約2% ( 圖 3g)。
患者A2-10在伊匹單抗及納武單抗治療下顯示多轉移性疾病之快速進展( 圖 8d)。在FixVac單一療法中，此患者經歷持續6個月之部分反應，其中多處淋巴結及肺轉移消退( 圖 10a)。由於腹股溝淋巴結之進行性疾病，FixVac在八個月後停用。該患者經派姆單抗單一療法再攻擊，且經歷部分反應。
在此患者之治療後PBMC中偵測到針對MAGE-A3及NY-ESO-1之IFN-γ +CD4 +T細胞反應( 圖 10b)。在八次疫苗接種之後獲得的遲發性超敏(DTH)反應之皮膚浸潤性淋巴細胞中，偵測到NY-ESO-1特異性CD4+ T細胞( 圖 10c及 圖 17)。選殖來自治療後PBMC之CD4+ T細胞的數種NY-ESO-1、酪胺酸酶及MAGE-A3導向之TCR純系型( 圖 10d、 圖 10e及 圖 33)。此等純系型包括識別MAGE-A3281-295抗原決定基之TCR，該等TCR經報告為免疫顯性且混雜地呈現於各種HLA-DRB1等位基因16上( 圖 10e)。TCR頻率通常無法藉由TCR純系型譜偵測到，且在疫苗接種後增加至容易偵測之頻率( 圖 10f)。
患者C2-28具有數個肝臟及皮下轉移，該等轉移最初在用伊匹單抗/納武單抗組合治療下存在進展，且接著在持續納武單抗單一療法下穩定化。該患者轉換為FixVac/納武單抗組合治療且經歷部分反應( 圖 4a及 圖 8d)，其中肝臟及皮下標靶病灶減少(腫瘤負荷自91 mm減少至15 mm)。在治療11個月之後，該患者發展單骨轉移，其經照射且保持繼續疫苗接種。
對於此患者，藉由IVS後ELISpot偵測到NY-ESO-1及MAGE-A3 T細胞(資料未顯示)。針對MAGE-A3168-176抗原決定基17之從頭HLA-A*0101限制性T細胞反應增加至外周血CD8+ T細胞之高達2% ( 圖 4b及 圖 18)。自MAGE-A3168-176多聚體結合T細胞選殖之兩個TCR特異性地識別內源性MAGE-A3+黑色素瘤細胞( 圖 4c及 圖 33)。
患者C2-31患有局部復發性黑色素瘤，近期有全身轉移性傳播。該患者在派姆單抗治療下在7個月內存在進展，其中肺、肝臟及淋巴結中出現多處轉移。將FixVac添加至正在進行之派姆單抗療法中，且該患者迅速經歷部分反應( 圖 4d及 圖 8d)。偵測到針對MAGE-A3、TPTE及NY-ESO-1之CD4+ T細胞反應及針對NY-ESO-1及MAGE-A3之CD8+ T細胞反應，其中大部分為從頭反應( 圖 10g)。
患者C1-40具有派姆單抗反應性轉移性黑色素瘤之病史，且在停用派姆單抗之後7個月經歷進行性疾病，其中存在多處快速進展性肺病灶。起始納武單抗治療，8週後添加黑色素瘤FixVac。該患者經歷部分反應，其中肺轉移縮小( 圖 8d及 圖 10h)。HLA多聚體染色揭露針對MAGE-A3 168-176及NY-ESO-1 92-100抗原決定基之強烈的疫苗誘導之T細胞反應( 圖 4e及 圖 10i)。疫苗接種後淋巴細胞之短期培養物有效地殺死MAGE-A3+黑色素瘤細胞，指示疫苗誘導之T細胞的功能性( 圖 4f及 圖 19)。
發現之概述。 實例1-6中提供之資料一起提供某些關鍵發現。首先，短暫細胞介素反應以及FixVac誘導之T細胞之高量級及T輔助細胞-1表型顯示，RNA-LPX疫苗類在人類中具有相同的有效作用模式，該作用模式經表徵為對小鼠模型中之抗腫瘤效應很關鍵(參考文獻8、18)。一起遞送數種全長TAA，且患者產生多株CD4 +及CD8 +T細胞反應。如HLA多聚體陽性T細胞之動力學所指示，隨著時間的推移，初免/重複加強方案將循環抗原特異性T細胞(詳言之，靶向NY-ESO-1及MAGE-A3之彼等細胞)之池擴展了數個數量級。
經歷部分反應之患者係具有最突出及多樣化之T細胞反應的彼等患者。然而，不能排除由於此等反應者在試驗中停留更長時期這一事實而導致偏差之可能性，從而使吾人收集充足血液用於抗原決定基鑑定及多聚體分析—用於分析T細胞頻率之最有用分析。
由FixVac誘導之T細胞的功能齊全，識別黑色素瘤細胞上之其標靶抗原決定基且展現強烈細胞毒性活性。針對一些患者獲得之長期免疫監測資料顯示，疫苗誘導之T細胞藉由繼續疫苗接種持續一年以上得以維持。
其次，實例1-6中描述之觀察結果指示，儘管黑色素瘤FixVac作為單一劑具有活性，但其亦與抗PD1療法協同作用於患有經歷過CPI之腫瘤之患者。患者53-02及A2-10在抗PD1失敗之後開始黑色素瘤FixVac治療，在黑色素瘤FixVac單一療法下經歷腫瘤消退，最終再次進展且接著對抗PD1療法之再攻擊作出反應。由黑色素瘤FixVac誘導之T細胞屬於PD1+效應子記憶表型，且因此受到抗PD1抗體刺激。與此觀點一致，PD1阻斷增強了RNA-LPX疫苗在對抗PD1單一療法不敏感之晚期腫瘤小鼠模型中的抗腫瘤效應(參考文獻18)。應注意，用黑色素瘤FixVac/抗PD1組合在經歷過CPI之預治療患者中觀察到的腫瘤消退率(超過35%)處於單獨PD1阻斷在患有CPI初治轉移性黑色素瘤之患者中的客觀反應率之範圍內(參考文獻19)。
第三，實例1-6中提供之發現支持非突變型共享TAA作為癌症疫苗標靶之有用性。在過去二十年中，基於TAA之癌症疫苗試驗的臨床效應在很大程度上令人失望，且通常與患有晚期癌症之患者的疫苗誘導之免疫性相對較弱有關(參考文獻20)。將針對癌症突變之T細胞鑑定為CPI阻斷介導之臨床功效的驅動因素，以及使得能夠實現個體化癌症疫苗接種之技術的進步促進如下觀點，即不受中樞耐受機制影響之癌症突變為更具吸引力之疫苗標靶。然而，實例1-6中顯示之資料顯示，T細胞對非突變型TAA之耐受性可由有效疫苗類別克服。PD1阻斷經由擴增預存在之抗原特異性T細胞起作用，其中許多T細胞係針對突變衍生之新抗原(參考文獻21)。超過一半的患有轉移性黑色素瘤之患者具有中等至低突變負荷，這與預形成之新抗原特異性T細胞的概率較低相關，且抗PD1治療失敗且因此存在疾病進展之風險較高(參考文獻22)。已知此處靶向之四種TAA在人類黑色素瘤中非常普遍(參考文獻10、23、24)，且其表現與腫瘤突變負荷無關( 圖 4g)，黑色素瘤FixVac啟動、活化且擴展CD4 +及CD8 +T細胞之互補池。因此，基於非突變型TAA之疫苗與抗PD1療法組合，對於具有較低突變負荷之患者(包括已經歷過CPI療法之彼等患者)之腫瘤控制可能具有特殊臨床效用。 實例 7 ：例示性給藥 ( 例如 ，劑量遞增 )
在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物可作為單一療法及/或與諸如免疫檢查點抑制劑之其他抗癌療法組合投與至患有黑色素瘤之患者。在一些實施例中，待治療之黑色素瘤患者係患有抗PD1難治性/復發性、不可切除之III期或IV期黑色素瘤的患者。
在一些實施例中，投與涉及在10週內之至少8個劑量。在一些實施例中，投與可進一步涉及在10週給藥排程之後的每月一次劑量。
在一些實施例中，投與涉及6個每週一次劑量的本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)，隨後為2個每兩週一次劑量的本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)。在一些實施例中，投與可進一步涉及在投與2個每兩週一次劑量之後的每月一次劑量。
在一些實施例中，投與涉及5個每週一次劑量的本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)，隨後為2個每兩週一次劑量的本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)。在一些實施例中，投與可進一步涉及在投與2個每兩週一次劑量之後的每月一次劑量。
在其中投與組合療法之一些實施例中，本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)可與免疫檢查點抑制劑療法在同一天投與。在一些此類實施例中，本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)及免疫檢查點抑制劑療法可分開投與。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物(例如FixVac)與免疫檢查點抑制劑療法在同一天投與。
在一些實施例中，可執行劑量遞增。在一些此類實施例中，可在 表 6中所示之一或多個水準下執行給藥；在一些實施例中，劑量遞增可涉及投與來自 表 6之至少一個較低劑量，隨後投與來自 表 6之至少一個較高劑量。 表 6 ：例示性給藥
劑量水準 劑量 (µg 總 RNA)
1 7.2
2 14.4
3 29
4 50
5 75
6 100
7 200
8 400
在一些實施例中，可評估額外或替代劑量水準，舉例而言，包括例如7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400 µg總RNA之劑量水準。可藉由免疫監測及/或臨床抗腫瘤活性來評估治療之功效。 實例 8 ：可與本文所述之醫藥組合物組合使用的例示性免疫檢查點抑制劑
獲批之免疫檢查點抑制劑可用於治療某些癌症，包括黑色素瘤。FDA批准之免疫檢查點抑制劑的非限制性實例包括伊匹單抗、西米普利單抗、納武單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗及德瓦魯單抗。目前正在研究之免疫檢查點抑制劑的額外實例可包括多塔利單抗(Dostarlimab)、INCMGA00012、特瑞普利單抗(Toripalimab)、SHR-1210、INCB086550 (經口PD-1抑制劑)、PDR001、HX008及CX-072。
在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑可根據經指示為用於治療某些癌症之單一療法的方案經投與，例如，在一些實施例中，每3週經投與。 實例 9 ：例示性不良事件
在一些實施例中，可在治療方案之一段時期內針對潛在不良事件之一或多種指標監測經投與如本文所述之單一療法的個體。臨床不良事件概括以輕度至中度流感樣症狀為主，諸如發熱及寒顫。不良事件主要為早發性、短暫性及可用退熱劑控制的，且在24小時內解決( 圖 32)。在一些實施例中，尤其針對接受如本文所述之單一療法的個體，可監測個體之一或多種發熱、寒顫、頭痛、疲勞、噁心、心動過速、感覺寒冷、關節痛、四肢疼痛、嘔吐、淋巴細胞計數減少、干擾素γ水準增加、高血壓、頭暈、腹瀉、α腫瘤壞死因子增加、流感樣疾病及白細胞計數減少。 實例 10 ：例示性停用準則
在一些實施例中，若例如(i)患者經歷滿足藥物限制毒性(DLT)準則之不良事件(AE)；(ii)患者經歷在給藥週期之後滿足DLT準則之AE，該AE在預定時期內無法解決至≤ 1級；(iii)由於可與投與療法相關之毒性，劑量延遲超過一個給藥週期；(iv)存在不滿足DLT準則之藥物相關或危及生命的4級AE (不包括在14天內解決至≤ 2級之無症狀4級非血液學實驗室值升高[具有或不具有醫學介入])，除非醫療監護儀另外批准；(v)儘管在第二次投與之前進行術前用藥，但第二次發生≥3級之輸注相關反應(IRR)；及/或(vi)首次出現過敏反應或4級IRR，則可停用如本文所述之療法。 實例 11 ：本文所述之 RNA 分子的例示性評估及 / 或準則
在一些實施例中，可在RNA分子之製造或其他製備或使用期間使用如本文所述之一或多種評估(例如，作為釋放測試)。
在一些實施例中，可評估一或多種品質控制參數以確定本文所述之RNA分子是否滿足或超過接受準則(例如，用於後續調配及/或釋放以供分佈)。在一些實施例中，此類品質控制參數可包括但不限於RNA完整性、RNA濃度、殘餘DNA模板及/或殘餘dsRNA。用於評估RNA品質之方法為此項技術中已知的；舉例而言，熟習此項技術者應認識到，在一些實施例中，一或多種分析測試可用於RNA品質評估，諸如針對RNA完整性之毛細管凝膠電泳、針對RNA含量及/或濃度之UV吸收分光光度法、針對殘餘DNA模板之定量PCR、針對殘餘dsRNA之基於免疫之分析、經轉譯抗原之偵測。
在一些實施例中，可評估一批RNA，例如針對RNA完整性、RNA含量及/或濃度、殘餘DNA模板、殘餘dsRNA、抗原表現或其組合，以確定接下來的動作步驟。例如，若RNA品質評估指示一批RNA分子滿足或超過預定接受準則，則可指定此類RNA分子批次用於製造及/或調配及/或分佈之一或多個進一步步驟。否則，若此類RNA分子批次未滿足或超過接受準則，則可採取替代動作(例如，丟棄該批次)。 實例 12 ：例示性納入準則
在一些實施例中，選擇滿足一或多種以下疾病特異性納入準則之癌症患者用本文所述之組合物及/或方法進行治療： • 群組I：IV期惡性黑色素瘤(AJCC 2009黑色素瘤歸類) • 群組II-VII結束擴展群組：IIIB-C期或IV期惡性黑色素瘤(AJCC 2009黑色素瘤歸類)擴展群組C，僅含患有IV期黑色素瘤之患者(AJCC 2009黑色素瘤歸類)，具有可量測之疾病(至少一處標靶病灶，根據irRECIST 1.1) [在批准方案10.0版之後適用於所有患者] • 療法僅針對在所有可用之治療選項均已經透明揭示(以加以記錄)之後，不符合或拒絕任何其他可用之獲批療法的個體。 • 藉由RT-qPCR分析證實來自FFPE之四種TAA中之任一者的表現 • ≥ 18歲 • 書面知情同意書 • ECOG效能狀態(PS) 0-1 • 預期壽命＞/= 6個月 • WBC ≥ 3×10E9/L • 血紅蛋白≥ 9 g/dL • 血小板計數≥ 100,000/mm³ • ALT/AST ＜ 3 × ULN (具有肝轉移之患者除外) • 針對育齡女性之妊娠試驗呈陰性(藉由β-HCG量測) 實例 13 ：例示性排除準則
在一些實施例中，癌症患者患有不適用於本文所述及/或使用之組合物及/或方法的黑色素瘤。
在一些實施例中，(i)最近接受過癌症治療；(ii)同時接受全身性類固醇療法；(iii)最近接受過大手術；(iv)患有活動性感染且正在經抗感染療法治療；及/或(v)經診斷患有生長性腦或軟腦膜轉移之癌症患者不適用於本文所述及/或使用之組合物及/或方法。
在一些實施例中，可能不推薦以下癌症患者用本文所述之醫藥組合物進行治療。排除準則包括： • 懷孕或哺乳 • 原發性眼部黑色素瘤 • 併發除鱗狀細胞癌或基底細胞癌、非活動性前列腺癌或子宮頸原位癌或非活動性治療之尿路上皮癌以外的第二惡性腫瘤 • 腦轉移 ○ 具有經治療或非活動性腦轉移之病史之患者有資格在擴展群組C中接受治療，其限制條件在於該等患者滿足所有以下準則： ○ 腦外部之可量測之疾病(除了非活動性腦轉移以外)； ○ 未持續需要皮質類固醇作為腦轉移之療法， ○ 在第2次就診(第1天)之前≥1週停用皮質類固醇，且不存在可歸因於腦轉移之持續症狀； ○ 腦放射成像篩選：自放射療法完成之後≥ 4週 • 脾切除術後患者 • 已知對活性物質或任何賦形劑過敏 • 嚴重局部感染(例如蜂窩組織炎、膿腫)或全身性感染(例如肺炎、敗血症)，需要在研究藥物之第一個劑量之前2週內進行全身性抗生素治療 • 針對急性或慢性活動性B型或C型肝炎感染之測試呈陽性 • 臨床相關之活動性自體免疫疾病 • 全身性免疫抑制： ○ HIV疾病 ○ 使用長期經口或全身性類固醇藥物(允許表面或吸入性類固醇) ○ 其他臨床相關之全身性免疫抑制 • 有症狀之充血性心臟衰竭(NYHA 3或4) • 不穩定型心絞痛 • 在首次研究治療投與之前14天內接受放射療法及小手術 • 在首次研究治療投與之前14天內及血液值重建之後接受骨髓抑制性化學療法 • 在首次研究治療投與之前28天內接受伊匹單抗 • 在首次投與研究治療之前14天內用BRAF抑制劑、MEK抑制劑或兩者之組合以及抗PD-1抗體進行治療(調查員判斷不適用於在擴展群組A、B或C中進行平行治療之患者) • 在28天或5個半衰期內(取決於在首次治療之前提供較長范圍者)接受干擾素、大手術、疫苗接種及其他研究劑 • 獲批之BRAF抑制劑維莫非尼或達拉非尼、獲批之抗PD-1抑制劑納武單抗或派姆單抗以及獲批之MEK抑制劑曲美替尼或者獲批之BRAF-MEK抑制劑組合用於劑量遞增群組中之患者。在對劑量遞增群組收集之安全性資料進行分析且DSMB批准之後，允許擴展群組中包括的患者用獲批之BRAF抑制劑、獲批之抗PD-1抗體或MEK抑制劑以及獲批之BRAF-MEK抑制劑組合進行伴隨治療。亦將允許局部放射作為擴展群組中之患者的並行治療。 - 在方案10.0版獲得批准之後，僅允許抗PD-1抗體用於治療擴展群組C中之患者。 • 不願意在研究治療期間及在最後一個劑量之研究治療之後至少28天(男性患者)及90天(有生育能力之女性患者)內使用高度有效之生育控制方法(每年小於1%，例如含殺精劑之避孕套、含殺精劑之子宮帽、避孕藥丸、注射液、貼片或子宮內器件)的可生育男性及女性 • 存在嚴重併發疾病或其他狀況(例如心理、家庭、社會學或地理環境)，無法允許適當隨訪及遵守該方案 實例 14 ：例示性功效評估及 / 或監測
在一些實施例中，可定期監測投與本文所述之醫藥組合物作為單一療法或與額外抗癌療法組合之癌症患者的治療功效及/或對治療劑量/排程之調節。
在一些實施例中，可藉由電腦斷層掃描及/或磁共振成像掃描來評估治療功效。在一些實施例中，可使用3 Tesla全身儀器來執行MRI掃描。在一些實施例中，當評估病灶以進行功效評估時，可使用一或多種以下準則： ○ 完全反應：所有標靶病灶均消失。任何病理性淋巴結(標靶抑或非標靶)之短軸均必須已降低至＜ 10 mm。 ○ 部分反應：以基線總直徑為參考，標靶病灶之直徑總和至少減少30%。 ○ 疾病進展：以研究中最小之總和作為參考，標靶病灶之直徑總和至少增加20% (若基線總和為研究中最小的，則其包括彼總和)。除了20%之相對增加以外，該總和亦必須證明至少5 mm之絕對增加。一或多處新病灶之出現亦被視為進展。 ○ 穩定疾病：以研究中最小之總直徑作為參考，既無足夠收縮來符合PR，亦無足夠增加來符合進行性疾病。 實例 15 ：具有疾病跡象之患者相對不具有疾病跡象之患者的免疫反應
本實例顯示在向具有疾病跡象(ED)之患者及不具有疾病跡象(NED)之患者投與例示性醫藥組合物之後的免疫反應之離體表徵，該醫藥組合物包含一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼NY-ESO-1抗原、MAGE-A3抗原、酪胺酸酶抗原、TPTE抗原或其組合；及脂質粒子。
背景：Lipo-MERIT為正在進行之首次人體、開放標籤、劑量遞增I期試驗，該試驗研究BNT111在具有晚期黑色素瘤之患者中的安全性、耐受性及免疫原性。BNT111為核糖核酸脂質複合物(RNA-LPX)疫苗，該疫苗靶向黑色素瘤腫瘤相關抗原(TAA)紐約食管鱗狀細胞癌1 (NY-ESO-1)、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原3 (MAGE-A3)及具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)。如實例1-6所證明，單獨或與免疫檢查點抑制劑(CPI)組合時，BNT111具有有利的不良事件(AE)概況，引起抗原特異性T細胞反應且在經歷過CPI之具有不可切除之黑色素瘤的患者中誘導持久客觀反應。此實例顯示在試驗納入BNT111單一療法子組時不具有疾病跡象(NED)之患者的免疫原性、功效及安全性資料。
方法：根據初免-加強方案向具有IIIB、IIIC及IV期皮膚黑色素瘤之患者經靜脈內投與BNT111。患者在七個劑量遞增群組(劑量範圍：7.2 µg至400 µg總RNA)及三個擴展群組中經治療，以進一步探索14.4 µg、50 µg及100 µg之劑量水準。在此分析中，接受BNT111單一療法之患者係分組為具有疾病跡象(ED)或NED，且評估了免疫原性、功效(藉由實體腫瘤免疫相關反應評估準則)及安全性。直接離體使用干擾素-γ酶聯免疫吸收劑斑點(ELISpot)分析來分析疫苗誘導之免疫反應。
結果：截至2021年5月24日，115名患者已在Lipo-MERIT試驗內接受BNT111。在經BNT111單一療法治療之71名患者中，在先前療法之後，38名患者具有ED且33名患者具有NED。兩組之基線特徵相似。ELISpot資料揭露，BNT111誘導之T細胞針對ED對NED患者中之至少一種TAA的反應可比較(分別有14/22 [64%]及19/28 [68%]患者具有可用之ELISpot可評估樣品)，指示BNT111具有誘導T細胞免疫性之能力，即使不存在可偵測腫瘤。在NED患者中，臨床功效係有希望的，其中中值無疾病存活為34.8個月(95%置信區間：7.0-未達到)。ED對NED患者之安全性概況相似，分別有38/38患者(100%)及32/33患者(97%)經歷相關的治療期間出現之AE (TEAE)，其中大多數為輕度至中度流感樣症狀。
詳言之，使用離體ELISpot ( 圖 20a-c)來分析來自具有ED及NED之患者的樣品，其中負載有TAA PepMix之自體樹突狀細胞用作標靶。 圖 20a-c顯示具有疫苗誘導之(經擴增或從頭)反應之患者的頻率：CD4 +或CD8 +( 圖 20a)；CD4 +( 圖 20b)；或CD8 +( 圖 20c)反應。條形段中之數字代表每個段之經評估患者數目。僅包括以單一療法治療之患者。令人驚訝的是，NED患者之樣品顯示出比ED患者更大的疫苗誘導之反應(例如，CD4 +或CD8 +( 圖 20a)；CD4 +( 圖 20b)；或CD8 +( 圖 20c))。
亦藉由細胞類型比較離體ELISPOT之結果。如 圖 21-22所示，如與ED患者相比，TAA在NED患者中誘導更顯著及多樣化之免疫反應。在離體ELISPOT分析(評估對任何細胞類型之CD4 +或CD8 +反應)中比較從頭反應對經擴增反應，揭露每一個(4/4抗原) NED患者群體中之100%從頭反應，相比之下，ED (2/4抗原)患者群體中為一半。
使用IVS後ELISpot ( 圖 23a-c)來分析來自具有ED及NED之患者的樣品，其中負載有TAA PepMix之自體樹突狀細胞用作標靶。 圖 23a-c顯示具有疫苗誘導之(經擴增或從頭)反應之患者的頻率：CD4 +或CD8 +( 圖 23a)；CD4+ ( 圖 23b)；或CD8+ ( 圖 23c)反應。條形段中之數字代表每個段之經評估患者數目。僅包括以單一療法治療之患者。令人驚訝的是，NED患者之樣品顯示出比ED患者更大的疫苗誘導之反應(例如，CD4 +或CD8 +( 圖 23a)；CD4 +( 圖 23b)；或CD8 +( 圖 23c))。
如 圖 24及 圖 25所示，上部圖顯示無法評估之疾病患者且下部圖：顯示可評估之疾病患者。條形段中之數字代表每個段之具有經評估離體ELISPOT量測之患者的數目。僅包括以單一療法治療之患者。
圖 26a顯示NED患者基於事件數目(例如，死亡、復發及新治療開始)及檢查員數目之無疾病存活資料。 圖 26b顯示NED患者之無疾病存活資料之Kaplan-Meier概述。
圖 27a-27c顯示ED患者( 圖 27a)、NED患者( 圖 27b)以及組合之ED及NED患者( 圖 27c)基於事件數目(例如，死亡、復發及新治療開始)及檢查員數目之總體存活資料。 圖 27d-27f顯示ED患者( 圖 27d)、NED患者( 圖 27e)以及組合之ED及NED患者( 圖 27f)之總體存活資料的Kaplan-Meier概述。
圖 28a-28c顯示ED患者( 圖 28a)、NED患者( 圖 28b)以及組合之ED及NED患者( 圖 28c)之不良事件的概述。
結論： BNT111作為單一療法之免疫原性及安全性在ED及NED患者中可比較，且在NED患者中觀察到有希望之臨床活性徵象。 實例 16 ： BNT111 投與之後的藥理學及免疫反應
本實例顯示在向患者投與BNT111之後偵測到的免疫反應。
在介於基線(亦即，疫苗接種前)直至疫苗接種後36 d範圍內之不同時間點分析細胞介素，例如IFN-γ、IFN-α、TNF-α、IP-10、IL-2、IL-6、IL-10及IL-12 (p70)，其中在疫苗接種後之前48 h內頻繁取樣。患者展示一系列獨特細胞介素之血漿水準之劑量依賴性瞬時增加以及體溫升高。細胞介素釋放為脈衝的，其中在給藥之後大約2至6 h達到峰值且值在24 h或更早時恢復至基線。觀察到以IFN-α為主之細胞介素模式的活化，包括IFN-γ及連續IP-10以及IL-12、IL-6及TNF-α。
在活體外擴增之後用IFN-γ酶聯免疫吸收劑斑點(ELISpot)分析20名患者之血液樣品，觀察到每一位患者中之至少一種TAA的T細胞反應。此等反應包括在基線處無法偵測到且由疫苗從頭誘導之T細胞特異性，以及在基線處以低水準存在且由疫苗抗原擴展及擴增之T細胞特異性。
在80名患者中，在無先前活體外刺激之情況下離體進行IFN-γ-ELISpot。在72.5%之此等患者中，針對至少一種TAA之強烈免疫反應經誘導至離體可偵測之水準。
所有四種TAA均具有免疫原性。大多數患者展現單獨CD4 +反應或針對個別TAA之並行CD4 +及CD8 +T細胞反應。
發現在4至8 wk內快速誘導T細胞反應，包括從頭引發之反應，達到高量級且持續數月。在一些患者中，觀察到抗原特異性CD8 +T細胞反應佔所有外周血CD8 +T細胞之超過10%。
在所選情形中，觀察到T細胞特異性之擴展與腫瘤負荷平行減少。 實例 17 ： BNT111 投與之後的功效資料
此實例提供在投與BNT111之後觀察到的初步功效資料之概述。
提供BNT111單一療法、BNT111及納武單抗或派姆單抗以及BNT111與BRAF/MEK抑制劑之組合的初步功效。 圖 42提供根據最高投與劑量對此等治療組中之每一者的最佳總體反應之詳情。
在115名患者中，75名(68%)具有不可切除之III期或IV期黑色素瘤之患者在基線處出現可評估之疾病，其中包括4名僅具有非標靶病灶之患者。子組功效分析集包括在基線處患有可評估之疾病的患者，該等患者接受至少一個劑量之BNT111，且有基線及至少一次治療中/治療後腫瘤反應評估(N = 75)。
提供36名接受BNT111單一療法之患者、36名接受BNT111及納武單抗或派姆單抗之患者以及3名接受BNT111及BRAF/MEK抑制劑之患者的功效。所有36名BNT111單一療法患者均接受過檢查點抑制劑之先前治療，且在經BNT111與PD-1抑制劑之組合治療的彼等患者中，35/36名患者接受過檢查點抑制劑之先前治療。大多數患者在治療開始時具有進行性疾病。
在經BNT111單一療法治療之36名在基線處具有可評估之疾病的患者中，最佳總體反應(自試驗治療開始直至疾病進展/復發所記錄之最佳反應)包括1名患者(3%)具有CR、3名患者(8%)具有PR及9名患者(25%)具有SD。總體反應率為11%且疾病控制率為36%。中值反應持續時間為8.4個月(95%置信區間[CI]：6.2至33.3個月)。
在經BNT111癌症疫苗與納武單抗或派姆單抗之組合治療的36名可評估功效分析之患者中，最佳總體反應包括9名(25%)患者達到PR，及8名(22%)具有SD，導致總體反應率為25%且疾病控制率為47%。中值反應持續時間為22.9個月(95% CI：3.0至22.9個月)。
在可評估功效且經BNT111癌症疫苗與BRAF/MEK抑制劑之組合治療的三名患者中，一名(33.3%)患者實現SD。
圖 43描繪根據irRECIST在經單一療法或與納武單抗或派姆單抗或BRAF/MEK抑制組合治療的具有可量測之疾病之患者中，標靶病灶相對基線之最佳變化。 實例 18 ：安全性分析
此實例提供對本文所述之例示性組合物之安全性的評估。
將BNT111投與至115名具有黑色素瘤之患者。BNT111作為單一療法展現有利的安全性及耐受性概括(n = 38)。38名患者接受BNT111與派姆單抗或納武單抗之組合，兩者根據各別產品標籤經投與。亦展現該組合之有利的安全性及耐受性。
子組中之幾乎所有患者均具有與研究藥物相關之TEAE。治療子組(例如，BNT111單一療法對BNT111與PD-1抑制劑或BRAF/MEK之組合)之間的總體安全性概括可比較，僅注意到一些差異。然而，與BRAF/MEK抑制劑組合經治療之患者的數目過少，無法得出任何結論。
關於流感樣症狀(反應原性)，諸如發熱、寒顫、心動過速及頭痛，與PD-1抑制劑組合之療法對BNT111單一療法之總體安全性可比較。與BNT111單一療法相比，PD-1組合療法子組中最常見之最重要TEAE為暈厥(13%對0%)及黑色素細胞痣(13%對3%)。
注意到PD-1抑制劑組合子組對BNT111單一療法子組在胃腸道AE方面存在差異，諸如噁心(55%對17%)、嘔吐(29%對17%)、腹瀉(11%對3%)及食慾下降(13%對3%)。
此外，亦注意到PD-1抑制劑組合子組對BNT111單一療法子組在低血壓方面存在差異(24%對9%)。關於BNT111單一療法子組，報告了較高數目之關節痛(31%對11%)。在Lipo-MERIT I期試驗中，在劑量遞增(自7.2 µg直至400 µg總RNA之最高投與劑量)期間未報告劑量限制性毒性(DLT)。
未報告藥物相關死亡。11/115 (8%)患者在該試驗之主要過程中死亡，亦即在最後一次試驗治療之後的90天內死亡。任何死亡均未被視為與BNT111相關。大多數患者死於疾病進展及一般身體健康惡化。
被視為與研究藥物相關之TEAE為短暫的，主要為流感樣症狀且屬於不良事件通用術語準則(CTCAE) 1級及2級。
13/115 (11%)患者經歷治療相關之TESAE；30/115 (26%)患者經歷CTCAE ≥ 3級之治療相關TEAE；19/115 (17%)患者因治療相關TEAE導致永久性試驗治療停止且19/115 (17%)患者因治療相關TEAE導致劑量減少。 表 7按類別提供TEAE之概述。 表 7 ： Lipo-MERIT - 子組中具有至少一次 TEAE 之患者的數目及百分率之概述 1-4
類別 患者子組之頻率
可評估之疾病 無法評估之疾病
BNT111 單一療法 N = 38 BNT111 + PD-1 抑制劑 N = 38 BNT111 + BRAF/MEK N = 6 全部 N = 81 BNT111 單一療法 N = 33 BNT111 + BRAF/MEK N = 1 全部 N = 34
按照PT，TEAE 38 (100.0) 38 (100.0) 6 (100.0) 81 (100.0) 33 (100.0) 1 (100.0) 34 (100.0)
與BNT111相關之TEAE 38 (100.0) 36 (94.7) 6 (100.0) 79 (97.5) 32 (97.0) 1 (100.0) 33 (97.1)
CTCAE 3至5級TEAE 23 (60.5) 30 (78.9) 6 (100.0) 59 (72.8) 7 (21.2) 0 (0.0) 7 (20.6)
與BNT111相關之3至5級TEAE 3 10 (26.3) 16 (42.1) 1 (16.7) 27 (33.3) 3 (9.1) 0 (0.0) 3 (8.8)
SAE 17 (44.7) 26 (68.4) 5 (83.3) 48 (59.3) 5 (15.2) 0 (0.0) 5 (14.7)
與BNT111相關之SAE 4 (10.5) 8 (21.1) 0 (0.0) 12 (14.8) 1 (3.0) 0 (0.0) 1 (2.9)
導致死亡之SAE 7 (18.4) 2 (5.3) 2 (33.3) 11 (13.6) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
DLT 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)  0 (0.0)
導致劑量減少之TEAE 5 5 (13.2) 8 (21.1) 1 (16.7) 14 (17.3) 5 (15.2) 0 (0.0) 5 (14.7)
導致劑量中斷之TEAE 8 (21.1) 16 (42.1) 1 (16.7) 25 (30.9) 2 (6.1) 0 (0.0) 2 (5.9)
導致永久停止治療之TEAE 6 4 (10.5) 10 (26.3) 3 (50.0) 17 (21.0) 2 (6.1) 0 (0.0) 2 (5.9)
1 截至2021年5月24日之資料提取日期/eCRF資料提取。 2 缺少用BNT111採取之行動的AE未被保守地視為劑量減少。對於eCRF中缺少此條目之一事件：在擴展群組C (BNT111 + PD-1抑制劑治療組)中之一名患者中，一個CRP事件增加(尚未MedDRA編碼，未報告CTCAE等級，被視為不相關)。 3 缺少因果關係之AE未被保守地視為與BNT111相關。這適用於以下事件：一個右側疼痛事件(eCRF中尚未MedDRA編碼)；擴展群組C (BNT111 + PD-1抑制劑治療組)中之一名患者的eCRF中未提供CTCAE等級。 4 此表中指出一名患者在首次登記時接受BNT111作為單一療法且在第二次登記時接受BNT111 + BRAF/MEK。因此，所呈現之個別療法的總數與總和之間存在差異。 AE =不良事件；CRP = C反應蛋白；CTCAE =不良事件通用術語準則；DLT =劑量限制性毒性；eCRF =電子病例報告表；MedDRA =監管活動醫學詞典；MEK =促分裂原活化蛋白激酶；PD-1 =程序性死亡1；PT =較佳術語；SAE =嚴重不良事件；TE =治療期間出現；TEAE =治療期間出現之不良事件；TESAE =治療期間出現之嚴重不良事件。
表 8按最差CTCAE等級提供相關的治療期間出現之嚴重不良事件(TESAE)之頻率的概述，且 表 9按治療子群體提供相同資料之概述。 表 8 ： Lipo-MERIT - 按照 PT 具有最差 CTCAE 等級之相關 TESAE 1 的患者之數目 (N = 115) 2
相關的治療期間出現之嚴重不良事件 (TESAE) 最差 AE 等級
2 級 N (%) 3 級 N (%) 4 級 N (%) 總計 N (%)
具有任何相關TESAE之患者 4 (3.5) 8 (7.0) 1 (0.9) 13 (11.3)
發熱 2 (1.7) - - 2 (1.7)
頭暈 1 (0.9) 1 (0.9) - 2 (1.7)
暈厥 - 2 (1.7) - 2 (1.7)
低血壓 - 2 (1.7) - 2 (1.7)
淋巴結病 1 (0.9)       1 (0.9)
漿液性視網膜病變 - 1 (0.9) - 1 (0.9)
自體免疫性胰臟炎    1 (0.9) - 1 (0.9)
噁心 1 (0.9) - - 1 (0.9)
虛弱 1 (0.9) - - 1 (0.9)
一般身體健康惡化 1 (0.9) - - 1 (0.9)
過敏反應    1 (0.9) - 1 (0.9)
細胞介素釋放症候群 - - 1 (0.9) 1 (0.9)
自體免疫性腦炎 - 1 (0.9) - 1 (0.9)
癲癇 - 1 (0.9) - 1 (0.9)
後部可逆性腦病症候群 - 1 (0.9) - 1 (0.9)
1 TESAE係定義為在研究藥物投與開始之後直至最後一次研究藥物攝取之後90 d發生。該表包括來自兩個治療群組之四名雙重納入患者的TESAE。 2 截至2021年5月24日之資料提取日期/eCRF資料提取。 AE =不良事件；PT =較佳術語；TESAE =治療期間出現之嚴重不良事件。 表 9 ： Lipo-MERIT - 具有由 BNT111 單一療法或 PD-1 抑制劑組合療法引起之相關 TESAE 之患者的數目 (N = 115) 1-4
TESAE BNT111 單一療法 N = 71 BNT111 + PD-1 抑制劑 N = 38 BNT111 + BRAF/MEK (N = 7) 總計 (N = 115)
具有任何相關TESAE之患者 5 (7.0) 8 (21.1) 0 (0.0) 13 (11.3)
發熱 2 (2.8) 0 (0.0) 0 (0.0) 2 (1.7)
頭暈 1 (1.4) 1 (2.6) 0 (0.0) 2 (1.7)
暈厥 0 (0.0) 2 (5.3) 0 (0.0) 2 (1.7)
低血壓 1 (1.4) 1 (2.6) 0 (0.0) 2 (1.7)
淋巴結病 1 (1.4) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.9)
漿液性視網膜病變 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
自體免疫性胰臟炎 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
噁心 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
虛弱 1 (1.4) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.9)
一般身體健康惡化 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
過敏反應 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
細胞介素釋放症候群 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
自體免疫性腦炎 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
癲癇 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
後部可逆性腦病症候群 0 (0.0) 1 (2.6) 0 (0.0) 1 (0.9)
1 截至2021年5月24日之資料提取日期/eCRF資料提取。 2 TESAE係定義為在研究藥物投與開始之後直至最後一次研究藥物攝取之後90 d發生。 3 一名患者可罹患用超過一個較佳術語編碼之TESAE。 4 此表中指出一名患者在首次登記時接受BNT111作為單一療法且在第二次登記時接受BNT111 + BRAF/MEK。因此，所呈現之個別療法的總數與總和之間存在差異。 PD-1 =程序性死亡1；TESAE =治療期間出現之嚴重不良事件。
應注意，在Lipo-MERIT試驗中，8名患者仍在用BNT111單一療法(n = 2)或BNT111與PD-1抑制劑之組合(n = 6)進行試驗治療。此八名患者均接受過多種前線療法，處於所謂的『持續治療』中，其中治療持續時間在15直至52個月之間。最初，僅在所有IMP組分(基於四種前驅體RNA RBL001.1、RBL002.2、RBL003.1及RBL004.1)均有庫存時才提供『持續治療』。然而，由於此8名經過大量預治療之患者至少實現其疾病或反應之穩定化(根據irRECIST，部分緩解或完全緩解)且因此繼續自試驗療法中獲得臨床益處，該試驗並未停止，而是自當前BNT111材料開始進一步提供試驗治療(所謂的『延長治療』)。為了此等患者之益處，使該試驗繼續進行。 實例 19 ：在小鼠中獲得之藥理學資料
小鼠可為相關物種，用於評估RNA-LPX複合物之主要及次要藥理學以及潛在毒理學效應且因此捕捉RNA-LPX之潛在物質特異性(亦即，RNA分子特異性)毒性。小鼠展現所有主要及次要藥理學效應，自誘導CD4+及/或CD8+ T細胞反應至增強免疫反應且導致後續TLR觸發、細胞活化及細胞介素分泌之免疫調節效應。然而，已知BNT111 TAA之物種特異性且每一名患者中的獨特MHC分子集合可提供大量抗原肽，對於由BNT111編碼之人類黑色素瘤TAA，不存在相關且決定性小鼠腫瘤模型，且BNT111作為單劑或與檢查點阻斷組合對小鼠進行之藥效學研究係不可行的。因此，大多數主要藥效學、作用機制及抗腫瘤活性研究均係用編碼小鼠模型抗原之RNA-LPX疫苗進行的。
所進行之非臨床研究表明，用RNA LPX進行之疫苗接種會誘導脾臟中的主要淋巴細胞子集之DC成熟及活化，且在小鼠體內之前3至6小時內，因應於單鏈RNA對TLR7之觸發，誘導全身性細胞介素釋放，包括IFNα、TNFα、IP-10及IL 6 (Kranz等人，2016，其以引用之方式整體併入本文中)。短暫性白血球減少症與IFNα峰值水準一致，且可歸因於IFNα下游效應。
在小鼠中用RNA LPX進行之疫苗接種有效地從頭引發且擴增靶向BNT111編碼抗原NY ESO 1、酪胺酸酶、MAGE A3、TPTE及其他黑色素瘤相關或模型抗原之細胞毒性CD4+及CD8+ T細胞。在活體外共培育之後，負載BNT111 RNA之人類DC能夠以劑量依賴性方式刺激表現相應TCR RNA之抗原特異性CD8+ T細胞產生IFN-γ。
已證明，經誘導之抗原特異性CD8+ T細胞能夠浸潤小鼠腫瘤，且RNA LPX疫苗接種導致腫瘤微環境朝向促發炎、細胞毒性及較少免疫抑制性結構極化。RNA LPX疫苗接種看來觸發腫瘤中之抗原釋放，這使得疫苗誘導之腫瘤特異性T細胞能夠進一步擴增，即使在治療停止後。
腫瘤浸潤性CD8+ T細胞因應於RNA LPX疫苗接種上調PD 1之表現，且腫瘤顯著表現PD L1。具有高PD 1表現之T細胞被視為具有高抗原親和力。如所假設，RNA LPX疫苗接種與PD 1/PD L1檢查點阻斷之組合藉由使PD 1/PD L1阻斷抗性小鼠腫瘤對此治療組合敏感，而在抑制腫瘤生長及改良存活方面協同作用。PD 1/PD L1阻斷會增強疫苗誘導之針對B16黑色素瘤表現之自身抗原的耐受性之破壞，進一步證明RNA LPX疫苗接種與PD 1/PD L1阻斷之組合的強烈抗腫瘤活性。
表 10概述用BNT111執行之非臨床主要藥效學研究。 表 10 ： BNT111 非臨床主要藥效學研究之概述
評估參數 測試系統 測試項目* 劑量(μg/ 劑量) 關鍵發現
活體內免疫刺激；單一療法 小鼠， C57BL/6、C57BL/6 IFNAR1 -/- BNT111： NY-ESO-1 (RBL001.1)、酪胺酸酶(RBL002.2)、MAGE-A3 (RBL003.1)、TPTE (RBL004.1) RNA-LPX (ATM) IV、SD BNT111：15 µg (每個標靶3.75 µg) RNA-LPX • RNA-LPX在注射後24 h誘導脾臟中之DC及淋巴細胞活化。 • RNA-LPX誘導IFNα及TNFα之全身性釋放(最大值：6 h，恢復至基線：24 h)。 • RNA-LPX誘導短暫性白血球減少症(最大值：8 h，恢復至基線：48 h)。 • RNA組分驅動免疫刺激，而非脂質組分。 • 臨床相關性：RNA分子基於其藉由與細胞內及內體模式識別受體結合來誘導細胞活化過程及後續細胞介素產生之能力具有免疫調節效應。促發炎細胞介素釋放、白血球活化及白血球減少症為全身性發炎細胞介素分泌之標誌。
活體內免疫刺激；單一療法 小鼠， C57BL/6 BNT111： NY-ESO-1 (RBL001.1)、酪胺酸酶(RBL002.2)、MAGE-A3 (RBL003.1)、TPTE (RBL004.1) RNA-LPX (ATM) IV、SD BNT111：每個標靶及小鼠40 µg RNA-LPX • RNA-LPX在注射後24 h誘導脾臟DC子集、巨噬細胞、NK、T及B細胞之活化。 • 臨床相關性：此等資料證實RNA-LPX之免疫刺激效應，且表明此等效應在很大程度上與RNA序列及長度無關。
活體外T細胞免疫性；單一療法 表現標靶之hiDC與TCR電穿孔之T細胞的共培育 BNT111： NY-ESO-1 (RBL001.1)、酪胺酸酶(RBL002.2)、MAGE-A3 (RBL003.1)、TPTE (RBL004.1) RNA-LPX (ATM) 0.25、1、4、16 µg • 在活體外共培育之後，負載BNT111 RNA之人類DC能夠以劑量依賴性方式刺激表現相應TCR RNA之抗原特異性CD8 +T細胞產生IFN-γ。 • 臨床相關性：此等資料證實RNA-LPX之抗原特異性、免疫刺激及劑量依賴性效應。
活體內T細胞免疫性；單一療法 小鼠， HLA-A2.1 +/+HLA-DR1 +/+雙重tg BNT111： NY-ESO-1 (RBL001.1)、酪胺酸酶(RBL002.2)、MAGE-A3 (RBL003.1)、TPTE (RBL004.1) RNA-LPX (ATM) IV、RD (第1、4、8、11天[亦在第18天，僅MAGE-3]) BNT111：每個標靶及小鼠30 µg • RNA-LPX在人類MHC-tg A2/DR1小鼠中誘導抗原特異性CD8 +T細胞。 • 經誘導之T細胞在離體標靶識別後分泌IFN-γ且活體內殺死標靶細胞。 • 臨床相關性：經誘導之T細胞在離體標靶識別後分泌IFN-γ且活體內殺死標靶細胞。
活體內T細胞免疫性；單一療法 小鼠， HLA-A2.1 +/+HLA-DR1 +/+雙重tg BNT111： NY-ESO-1 (RBL001.1)、酪胺酸酶(RBL002.2)、MAGE-A3 (RBL003.1)、TPTE (RBL004.1) RNA-LPX (CTM) IV、RD (第1、8、15、22天) BNT111：每個標靶及小鼠30 µg • RNA-LPX在人類MHC-tg A2/DR1小鼠中誘導抗原特異性CD8 +T細胞。 • 經誘導之T細胞在離體標靶識別後分泌IFN-γ。 • 臨床相關性：經誘導之T細胞在離體標靶識別後分泌IFN-γ。
DC =樹突狀細胞；dsRNA =雙鏈RNA；HA =流感血球凝集素；hiDC =人類未成熟DC；HPV =人類乳頭狀瘤病毒；IFN =干擾素；IFNAR1 =干擾素α及β受體次單元1；IL =介白素；IP10 =干擾素-γ誘導蛋白10；IV =靜脈內；MHC =主要組織相容性複合物；NK =天然殺手；OVA =卵白蛋白；PBMC =外周血單核細胞；pDC =漿細胞樣DC；PD-1 =程序性死亡配位體1；PD-L1 =程序性死亡蛋白1；SD =單一劑量；RD =重複劑量；TAM =腫瘤相關巨噬細胞；TCR = T細胞受體；tg =轉殖基因；TIL =腫瘤浸潤性白血球；TLR =類鐸受體；TME =腫瘤微環境；TNF =腫瘤壞死因子；Treg = CD4 +CD25 +FoxP3 +T調節細胞；TRP =酪胺酸酶相關蛋白；WB =全血。 *初始開發(在Lipo-MERIT試驗中應用)係基於四種前驅體藥物產品RBL001.1、RBL002.2、RBL003.1及RBL004.1，其編碼相同標靶，但略有改良，例如用於RNA可轉譯性及穩定性。
為了進一步闡明BNT111之主要藥效學、作用機制及抗腫瘤活性，且產生BNT111與PD-1/PD-L1檢查點阻斷之組合的基本原理，應用編碼模型抗原(例如，人類乳頭狀瘤病毒16致癌蛋白E7)或其他黑色素瘤相關抗原(酪胺酸酶相關蛋白1及2)之RNA-LPX疫苗。 表 11 ： BNT111 支持性非臨床主要藥效學研究之概述
評估參數 測試系統 測試項目 劑量 (μg/ 劑量) 關鍵發現
活體內免疫刺激 小鼠， C57BL/6、C57BL/6 IFNAR1 -/-、C57BL/6 TLR7 -/- HA RNA-LPX HA：20或40 µg RNA-LPX • 免疫細胞活化、細胞介素釋放及白血球減少症依賴於TLR7及IFNAR1信號傳導。
活體內免疫刺激 小鼠， C57BL/6 HA RNA-LPX HA RNA-LPX，經假尿苷修飾及dsRNA純化 IV、SD HA：10 µg RNA-LPX • 經假尿苷修飾且dsRNA耗盡之RNA-LPX為免疫沉默的，不誘導脾臟免疫細胞子集之活化或全身性IFNα釋放。 • RNA組分驅動免疫刺激，而非脂質組分。
活體內T細胞免疫性 小鼠， C57BL/6，攜帶B16-F10腫瘤 TRP1 RNA-LPX IV、RD (第8、15、22天) 20 µg TRP1 RNA-LPX • RNA-LPX誘導抗原特異性CD8 +T細胞。 • 藉由針對自身抗原之疫苗接種誘導抗原特異性T細胞證明免疫耐受性受到破壞。 • T reg不會因疫苗接種而擴增，從而產生有益的抗原特異性CD8 +T細胞:T reg比率。
活體內T細胞免疫性 小鼠， C57BL/6，攜帶TC-1腫瘤 HPV16 E7 (研究級RBL016.1) RNA-LPX 對照RNA-LPX 抗PD-L1阻斷抗體 IV、SD (第13天) HPV16 E7：40 µg RNA-LPX 對照：40 µg RNA-LPX IP、RD (第18、25、32、39、46、53、60天) 抗PD-L1：200 µg一次，接著100 µg • RNA-LPX在單次疫苗接種之後誘導抗原特異性CD8 +T細胞，PD-L1存在及不存在下之情況下相似。 • 經誘導之T細胞為PD-1陽性。 • 經誘導之T細胞具有在腫瘤釋放之抗原存在下獨立於疫苗接種進行擴增的能力，PD-L1阻斷進一步促進該能力。
活體內T細胞免疫性 小鼠，BALB/c gp70 RNA-LPX IV、RD (第0、3、8、15天或第0、3、7、14天) 40 µg gp70 RNA-LPX • RNA-LPX誘導抗原特異性CD8 +T細胞。 • 經誘導之T細胞在離體標靶識別後分泌IFNγ且活體內殺死標靶細胞。
活體內抗腫瘤活性 TC-1腫瘤模型(SC) 小鼠，C57BL/6 BNT113： HPV16 E6 (RBL015.1)、 HPV16 E7 (RBL016.1) RNA-LPX (研究級) OVA RNA-LPX IV、RD (第17、19、25天或第13、20、27天)。 HPV16 E6及E7：每個標靶及小鼠40 µg RNA-LPX OVA：40 µg RNA-LPX • E7 RNA-LPX抑制腫瘤生長且將存活增加至90% (治療開始第10天)及30% (治療開始第13天)。 • 大腫瘤最初會消退，但在治療停止之後會復發。 • 總體治療成功與治療開始時之腫瘤大小相關。 • E6 RNA-LPX不具有任何效應。
活體內抗腫瘤活性 B16-OVA腫瘤模型(SC)、 CT26腫瘤模型(SC) 小鼠，C57BL/6、BALB/c OVA RNA-LPX、gp70 RNA-LPX IV、RD (第10、13、17、24、31、38、45、53、63天)；OVA：40 µg RNA-LPX IV、RD (第6、9、13、21、28、35天)；gp70：40 µg RNA-LPX • RNA-LPX延遲腫瘤生長且延長存活。 • 經RNA-LPX誘導之抗原特異性CD8 +T細胞與延遲之腫瘤生長及存活相關。
活體內TIL分析 TC-1腫瘤模型(SC) 小鼠，C57BL/6 HPV16 (研究級RBL016.1) E7 RNA-LPX IV、SD (第11天) HPV16 E7：40 µg RNA-LPX • HPV16 E6/E7 +腫瘤高度浸潤有CD4 +及CD8 +T細胞、NK細胞、DC及TAM，且尤其為因應於RNA-LPX之抗原特異性CD8 +T細胞。 • 由RNA-LPX誘導之抗原特異性CD8 +T細胞在離體標靶識別後表現效應子細胞介素IFNγ及gzmB-。 • RNA-LPX使TME朝向促發炎、細胞毒性及較少免疫抑制性結構極化。 • 由RNA-LPX誘導之抗原特異性CD8 +T細胞為PD-1陽性，而腫瘤細胞上調PD-L1。
活體內TIL分析 TC-1腫瘤模型(SC) 小鼠，C57BL/6 HPV16 E7 (研究級RBL016.1) RNA-LPX IV、SD (第11天) HPV16 E7：40 µg RNA-LPX • HPV16 E6/E7 +腫瘤在RNA-LPX (第7天)之後早期呈現CD8 +T細胞功能(CD8、IFNγ、PD-1)及T細胞浸潤促進因子(CCL19、CCL21、CXCL9)之跡象。 • 消退之腫瘤證明廣泛免疫活化概括(第13天)，由T細胞共刺激標記物(ICOS、CD28、CD69、CD27)、促進浸潤之趨化因子及其受體(CCL5、CCL19、CXCL9、CXCL12；CCR5、CXCR3)、促發炎細胞介素(IL-1β、IL-6、IFNγ)、Th1分化(TBX21)、DC成熟(CD40、CD86)及單核細胞/巨噬細胞募集(F4/80、CCL2、GM-CSF)組成。 • 此等腫瘤表現PD-L1及CTLA-4以抵消且抑制免疫攻擊。
CCL = CC趨化因子配位體，CCR = CC趨化因子受體，CTLA =細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白，CXCL = CXC趨化因子配位體，HA =流感血球凝集素，HPV =人類乳頭狀瘤病毒，ICOS =誘導性T細胞共刺激，IFN =干擾素，IL =介白素，gzm =顆粒酶，PD-1 =程序性死亡-1，PD-L1 =程序性死亡配位體1，SC =皮下，TAM =腫瘤相關巨噬細胞，TBX = T-box轉錄因子，TCR = T細胞受體，tg =轉殖基因，TIL =腫瘤浸潤性白血球，TLR =類鐸受體，TME =腫瘤微環境，TNF =腫瘤壞死因子，Treg = CD4 +CD25 +FoxP3 +T調節細胞，TRP =酪胺酸酶相關蛋白，WB =全血。 參考文獻
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熟習此項技術者應認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之發明的特定實施例之許多等效物。應理解，本發明涵蓋所有變化、組合及排列，其中除非另外指示或除非一般技術者將顯而易知將出現抵觸或矛盾，否則所列出之技術方案中之一或多者的一或多種限制、要素、條款、說明項等係引入至附屬於同一基礎技術方案之另一技術方案(或相關的任何其他技術方案)中。此外，亦應理解，本發明之任何實施例或態樣均可自申請專利範圍中明確排除，無論本說明書中是否敘述特定排除情況。本發明之範圍不意欲局限於上述說明，而是如以下申請專利範圍中所闡述。
圖 1a-1d描繪例示性TAA構築體、試驗設計及疫苗介導之免疫活化。 圖 1a，TAA RNA之結構。5'-帽類似物、5'-及3'-非轉譯區(UTR)及poly(A)尾針對穩定性及轉譯效率經最佳化。此外，用信號肽(SP)、破傷風類毒素CD4+抗原決定基P2及P16以及MHC I類運輸域(MITD)標記TAA編碼序列，以增強HLA呈現及免疫原性。 圖 1b，臨床試驗設計。 圖 1c，脾臟中之代謝活性，在基線處(前)及第六次疫苗注射之後4 h (後)藉由經軸[18F] FDG-PET/CT量測。 圖 1d，每週注射六個遞增劑量之患者(來自群組V)的血漿細胞介素水準(每次疫苗注射之前及之後2 h、6 h及24 h (以及在一些情況下，48 h))及體溫。水平虛線指示正常值上限。 圖 2a-2k描繪FixVac之T細胞免疫及臨床活性。 圖 2a、 圖 2c，具有疫苗誘導之T細胞反應(從頭或經擴增)的患者之比例，如在疫苗接種前及疫苗接種後藉由IFN-γ ELISpot進行分析，離體量測(a；n = 50)或在IVS之後量測(c；n = 20)。PBL，外周血淋巴細胞。 圖 2b，患者A2-09之離體CD8+ T細胞反應，使用TAA PepMix脈衝輸送之CD4耗盡之PBMC加以量測。對照，具有培養基之PBMC。 圖 2d，患者42-06之IVS後CD4+ T細胞反應，使用裝載有TAA PepMix之自體樹突狀細胞作為標靶加以量測。對照，螢光素酶轉染之樹突狀細胞。 圖 2e，來自患者12-01 (群組1，六個疫苗劑量)之HLA多聚體染色之NY-ESO-1特異性T細胞的離體頻率。虛線指示疫苗接種。 圖 2f-2i，來自患者A2-09 (群組A，繼續接種疫苗)之從頭誘導之HLA-B*3503限制性NY-ESO-1特異性T細胞。虛線指示疫苗接種。 圖 2f，NY-ESO-1/ HLA-B*3501多聚體染色之PBMC的表型。多聚體陽性CD8+ T細胞以紅色顯示。BV421及BV650為免疫螢光標記。 圖 2g，左圖，多聚體分析，及右圖，用單肽或PepMix刺激之T細胞的ICS。 圖 2h，離體NY-ESO-1肽刺激之CD8+T細胞的ICS。 圖 2i，經自患者A2-09選殖之HLA-B*3503限制性NY-ESO-1特異性TCR轉染的健康供體CD8+ T細胞對黑色素瘤細胞株之特異性溶解(效應子:標靶(E:T)比率= 20:1)。SK-MEL-37及SK-MEL-28為黑色素瘤細胞株。PD-Cy7為免疫螢光標記。 圖 2j、 圖 2k，臨床活性，經評估為不具有/具有抗PD1抗體之FixVac對標靶病灶之影響(n = 38；4名患者在基線處不具有標靶病灶)。 圖 2j，星號指示與抗PD1抗體之組合。PD，進行性疾病；PR，部分反應。 圖 3a-3g描繪經FixVac單一療法治療之患者53-02的T細胞免疫性。 圖 3a，頂部，藉由HLA多聚體染色分析之NY-ESO-196-104特異性Cw*0304限制性CD8+ T細胞。對照，巨細胞病毒(CMV)-pp65多聚體。底部，例示性流式細胞術。 圖 3b，如藉由CT掃描評估之黑色素瘤病灶。小於可定量大小之病灶係繪製為具有0.1 mm直徑。NT，非標靶病灶；T，標靶病灶；根據實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST) 1.1版。 圖 3c，頂部，藉由ICS分析之NY-ESO-196-104特異性、細胞介素分泌性CD8+ T細胞之離體頻率。底部，例示性流式細胞術。 圖 3d，頂部，由來自IVS培養物之CD8+ T細胞殺死黑色素瘤細胞株(E:T = 20:1)。底部，來自不同治療時間點(-1，基線；第22天，3次疫苗接種之後；第64天，7次疫苗接種之後)之PBMC之IVS之後NY-ESO-196-104多聚體特異性CD8+ T細胞之頻率。 圖 3e，兩種HLA-B*4001限制性NY-ESO-1特異性TCR之細胞毒性，該等TCR自疫苗接種後樣品中選殖且經轉染至健康供體CD8+ T細胞中對抗黑色素瘤細胞株(E:T = 20:1)。 圖 3f，外周血中來自e之TCR之頻率，藉由離體TCR譜系分析加以量測。TRB，T細胞受體-β。 圖 3g，頂部，MAGE-A3167-176特異性、細胞介素分泌性CD8+ T細胞之離體頻率動力學。底部，例示性流式細胞術。 圖 4a-4g描繪用FixVac/抗PD1組合治療之部分反應患者的T細胞免疫性。 圖 4a-4c，患者C2-28。a，標靶病灶之大小； 圖 4b，藉由HLA多聚體染色分析之從頭MAGE-A3特異性CD8+ T細胞(頂部)，具有例示性流式細胞術(底部)。 圖 4c，MAGE-A3168-176特異性TCR對黑色素瘤細胞之識別。 圖 4d，患者C2-31之肺部病灶的CT掃描。 圖 4e-4f，患者C1-40。 圖 4e，藉由HLA多聚體染色分析之MAGE-A3168-176特異性HLA-A*0101限制性T細胞。 圖 4f，頂部，來自治療前及治療期間收集之PBMC之IVS培養物的CD8+ T細胞對黑色素瘤細胞株之溶解(E:T = 8.5:1)。底部，IVS之後的MAGE-A3168-176特異性CD8+ T細胞。 圖 4g，來自三個獨立群組(n = 50)之黑色素瘤中的FixVac TAA轉錄物表現與非同義單核苷酸變異體(snSNV)數目的相關性。RPKM，每百萬個映射讀數中每千鹼基之讀數。 圖 5描繪患者子集。患者患有晚期黑色素瘤，在基線處具有放射學可量測之疾病或不可量測之疾病。對所有子組中之49名患者執行免疫監測。在共計56名在基線處具有可量測之疾病之患者中，評估42名(1名未切除之III C期，41名IV期)之臨床抗腫瘤活性，彼等患者在資料截止處可獲得隨訪成像資料(25名經FixVac單一療法治療，17名經FixVac與抗PD1療法之組合治療)。剩餘14名患者(5名接受FixVac單一療法且9名接受與抗PD1療法組合)由於上一句所述之原因未包括於功效分析中。PD，進行性疾病；PR，部分反應；SD，穩定疾病(根據irRECIST1.1之最佳客觀總體反應)。CR*係指具有SD之患者的代謝完全反應，根據irRECIST1.1為最佳反應。33名在基線處具有放射學不可量測之疾病的患者未接受客觀最佳總體反應之探索性分析，且正在對無復發存活進行隨訪。 圖 6a-6c描繪細胞介素分泌之表徵。 圖 6a、 圖 6b，峰值血漿細胞介素水準(疫苗注射之後6 h)及體溫(疫苗注射之後4 h)： 圖 6a，所有可用患者；及 圖 6b，經單獨(『Mono』)或與抗PD1療法組合(『aPD1』)之50 μg或100 μg標靶劑量的RNA-脂質複合物(LPX)治療之患者。框顯示第25個至第75個分位數，其中線條代表中值；須線顯示最小值至最大值；灰點顯示每個劑量水準之個別值；虛線指示正常值上限。樣品數量(n)在該圖中指出。 圖 6c，RNA-LPX投與之後6 h的血漿細胞介素水準(y軸)與血漿IFN-α濃度之相關性(對於IFN-γ、IL-12 p70及IL-6，n = 147；對於IP-10，n = 147)。 圖 7a-7f描繪由FixVac誘導之T細胞免疫性。 圖 7a，藉由IFN-γ ELISpot在IVS後(左側及中間)或離體(右側)量測之TAA特異性T細胞之表型(左側)及品質(中間及右側)。僅顯示陽性反應。 圖 7b，來自患者12-01的用NY-ESO-192-100/Cw*0304多聚體染色之PBMC之例示性流式細胞術。 圖 7c，用於多聚體+ T細胞之表型表徵的流式細胞術閘控策略。上列，自左至右：自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，吾人鑑定了單一事件(單細胞)。鑑定Dump陰性事件(活的、CD4-、CD14-、CD16-、CD19-)及淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對CD8+ HLA多聚體陽性T細胞進行閘控以用於進一步分析。下列，左圖：基於CD45RA及CCR7表現，將CD8+ T細胞(以黑色指示)及NY-ESO-1多聚體陽性CD8+ T細胞(紅色)之不同子集閘控為四個子集，在右側圖中分析CD27及CD28表現—中央記憶(CCR7+ CD45RA−)、原生(CCR7+ CD45RA+)、效應子記憶(CCR7− CD45RA−)及效應子記憶再表現RA (CCR7− CD45RA+)。針對多聚體陽性(紅色)及多聚體陰性(黑色) CD8+ T細胞分析PD1及OX40之表現。 圖 7d，在用MAGE-A3212-220肽刺激之後患者A2-09中分泌IFN-γ及TNF之CD8+ T細胞的偵測。 圖 7e，在患有可量測(n = 27)或不可量測(n = 30)疾病之患者(左側)、經不同疫苗劑量治療之患者(14.4 μg (n = 17)、50 μg (n = 10)、100 μg (n = 24)；中間)與經單獨FixVac (Mono (n = 44))或與抗PD1療法組合(aPD1 (n = 12)；右側)治療之患者之間比較疫苗接種之後離體斑點計數之倍數誘導。僅顯示在疫苗接種後就診時之陽性反應。與基線相比，超過2倍之變化被視為對疫苗之反應。若治療後CD4及CD8結果均為陽性，則僅顯示較高斑點計數之比率。 圖 7f，具有疫苗誘導之T細胞反應(從頭或經擴增)的患者之比例，在疫苗接種前及疫苗接種後藉由IFN-γ ELISpot確定，自經單獨FixVac (n = 14)或與抗PD1療法組合(n = 12)治療之患者離體量測。僅顯示來自患有可量測之疾病之患者之資料。 圖 8a-8d描繪針對臨床活性經評估之患者的疾病反應及治療排程。 圖 8a、 圖 8b，自治療開始至疾病進展或繼續治療，可針對功效評估加以評估之患者的游泳圖。 圖 8a，經黑色素瘤FixVac單一療法治療之患者。y軸上之數字代表個別患者。CR =完全反應；PR =部分反應；SD =穩定疾病；及PD =進行性疾病。灰線指示初始治療階段結束及繼續治療開始時之時間。圖8a包括自接受BNT111作為單一療法之具有疾病跡象之患者(ED患者)獲得的資料。 圖 8b，經FixVac及抗PD1療法治療之患者。深綠色三角形指示治療開始及完成。深綠色箭頭顯示仍在接受治療之患者。紅十字標記疾病進展；患者根據最佳總體反應及無進展存活時間(CR、PD、PR、SD)分類。淺綠色星號指示首次記錄之客觀反應且淺綠色箭頭指示正在進行之疾病控制。黑色垂直線標記計劃進行第八次疫苗接種之日期(研究第64天)。單一星號指示臨床過程及治療排程在d中顯示之患者。CR**，具有穩定疾病之患者的代謝完全反應，根據irRECIST1.1為最佳反應。在基線處具有放射學不可量測之疾病的患者正在針對無復發存活接受隨訪，且未進行臨床功效評估。 圖 8c，在基線處之腫瘤負荷，與FixVac治療後之臨床反應相關。PD，進行性疾病；PR，部分反應；SD，穩定疾病。 圖 8d，患者Pt 53-02、A2-09、C2-28、A2-10、C2-31及C1-40之臨床過程及治療排程。FD，任何階段的黑色素瘤之首次診斷。FD IV期，IV期黑色素瘤之首次診斷。*經診斷且經放射療法治療之新的骨病灶。 圖 9a-9j描繪在FixVac單一療法下具有部分反應之患者53-02的T細胞免疫性。 圖 9a，在黑色素瘤FixVac治療開始之前(前)及之後(後)右肺下葉及中葉之CT掃描。 圖 9b，NY-ESO-196-104特異性、HLA-Cw*0304限制性CD8+ T細胞反應之動力學(亦參見 圖 3a)。 圖 9c-f，NY-ESO-196-104特異性HLA-Cw*0304限制性TCR之發現及表徵。 圖 9c，用於TCR選殖之多聚體陽性CD8+ T細胞之分選閘(在單一的活CD3+淋巴細胞群體內閘控)。對照，螢光減一(fluorescence minus one，FMO)樣品。 圖 9d，在IFN-γ ELISpot中，NY-ESO-1-TCR轉染之CD8+ T細胞對肽脈衝輸送之HLA-Cw*0304轉染之K562細胞的識別。對照，HIV-gag PepMix；NY-ESO-1，NY-ESO-1 PepMix。 圖 9e，NY-ESO-1-TCR轉染之健康供體CD8+ T細胞在與HLA轉染之黑色素瘤細胞株(SK-MEL-37及SK-MEL-28；E:T = 50:1)共培養24 h之後的細胞毒性。 圖 9f，自疫苗接種前及疫苗接種後PBMC獲得之TCR譜系資料中的NY-ESO-1特異性TCR純系型頻率之動力學。 圖 9g-9j，兩種NY-ESO-1124-133特異性HLA-B*4001限制性TCR之發現及表徵。 圖 9g，用NY-ESO-1 PepMix刺激PBMC，且經由流式細胞術分選單一IFN-γ陽性CD8+ T細胞以用於TCR選殖(對照，HIV-gag PepMix)。 圖 9h、 圖 9i，在TCR轉染之CD8+ T細胞與肽脈衝輸送之HLA轉染之K562細胞的共培養之後，使用IFN-γ ELISpot分析之NY-ESO-1-TCR之HLA限制及抗原決定基特異性。NY-ESO-1，NY-ESO-1 PepMix。 圖 9j，在患者之疫苗接種後樣品中鑑定的NY-ESO-1特異性TCR之細胞毒性。在20:1之效應子:標靶比率下用HLA轉染之黑色素瘤細胞株(SK-MEL-37、SK-MEL-28)刺激TCR轉染之健康供體CD8+ T細胞持續12 h。 圖 10a-10i描繪患者A2-10、C2-31及C1-40之T細胞免疫性。 圖 10a-10f，患有CPI難治性黑色素瘤之患者A2-10，在FixVac單一療法下發展部分反應。 圖 10a，在疫苗接種開始之前及之後獲得的腹股溝淋巴結轉移之CT掃描。 圖 10b，在疫苗接種前及八次疫苗接種之後的IVS後CD4+ T細胞反應，在IFN-γ ELISpot分析中用經RNA (編碼TAA之一或作為對照之螢光素酶)轉染的自體樹突狀細胞或脈衝輸送TAA編碼性PepMix之樹突狀細胞對未脈衝輸送之樹突狀細胞(無肽)進行再刺激。 圖 10c，用NY-ESO-1 RNA進行皮內攻擊之後的細胞介素分泌性CD8+及CD4+ T細胞。在每週一次總計8次疫苗接種之後15天，自穿刺生檢中回收皮膚浸潤性淋巴細胞，且用編碼NY-ESO-1或酪胺酸酶之PepMix刺激。 圖 10d-10f，HLA II限制性TAA特異性TCR之發現及表徵。d，用PepMix脈衝輸送之樹突狀細胞再刺激來自IVS培養物之CD4+ T細胞，且經由流式細胞術進行分選以用於TCR選殖(對照，HIV-gag PepMix)。APC及PE為螢光染料標籤。 圖 10e，使用經TCR轉染之健康供體CD4+ T細胞及RNA轉染或肽脈衝輸送之HLA轉染之K562細胞，藉由IFN-γ ELISpot確定HLA限制及抗原決定基特異性。DRA、DRB、DQA及DQB數字係指特定HLA等位基因。對照，不含肽之K562細胞(-)。 圖 10f，外周血中TCR純系型頻率之動力學，藉由離體TCR譜系分析加以量測。 圖 10g，在用TAA PepMix進行IVS之後，藉由對肽負載之自體樹突狀細胞進行IFN-γ ELISpot獲得的患者C2-31之TAA特異性CD8+及CD4+ T細胞反應。對照，裝載有無關肽之樹突狀細胞。 圖 10h、 圖 10i，患有CPI難治性黑色素瘤之患者C1-40的臨床及免疫反應，該患者在與納武單抗組合之黑色素瘤FixVac下發展部分反應。 圖 10h，在黑色素瘤FixVac治療開始之前及之後右中及左下肺葉之CT掃描。 圖 10i，藉由HLA多聚體染色分析之MAGE-A3168-176特異性A*0101限制性(左圖)及NY-ESO-192-100特異性HLA_Cw*0304限制性(右圖) CD8+ T細胞的離體頻率。 圖 11描繪 圖 2e中所示之資料的流式細胞術分析之閘控策略(Pt 12-01，直至第50天)。用於鑑定疫苗誘導之T細胞之流式細胞術閘控策略。(上列，自左至右)自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，鑑定了單一事件。鑑定活細胞及淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對Dump陰性事件(CD4-、CD14-、CD16-、CD19陰性)進行閘控以排除該等事件，從而用於進一步分析。在Dump陰性事件內，對CD8+ HLA多聚體陽性T細胞進行閘控以用於進一步分析(下列)。 圖 12描繪 圖 2f、 圖 2g(Pt A2-09)、 圖 2e(Pt 12-01，在第50天之後)、 圖 3a(Pt 53-02)及 圖 7c(Pt A2-09)、 圖 9b(Pt 53-02)中所示之資料的流式細胞術分析之閘控策略。用於疫苗誘導之T細胞的表型表徵之流式細胞術閘控策略。(上列，自左至右)自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，鑑定了單一事件。鑑定Dump陰性事件(活的、CD4陰性、CD14陰性、CD16陰性、CD19陰性)及淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對CD8+ HLA多聚體陽性T細胞進行閘控以用於進一步分析。(中間列左圖)。針對多聚體陽性(紅色)及多聚體陰性(黑色) CD8+ T細胞分析PD1及OX40之表現(中間列中間圖及右圖)。基於CD45RA及CCR7將CD8+ T細胞(以黑色指示)及多聚體陽性CD8+ T細胞(以紅色突出顯示)之不同子集閘控為四個子集：中央記憶(CD45RA- CCR7+)、原生(CD45RA+ CCR7+)、效應子記憶(CD45RA- CCR7-)及效應子記憶再表現RA (CD45RA+ CCR7-)。在每個子集中分析CD27及CD28之表現。 圖 13描繪 圖 2h、 圖 2g(Pt A2-09)及 圖 7d(Pt A2-09)中所示之資料的流式細胞術分析之閘控策略。用於鑑定疫苗誘導之T細胞的細胞介素反應之流式細胞術閘控策略。(上列，自左至右)自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，鑑定了單一事件。鑑定Dump陰性事件(活的、CD14-、CD16-、CD19陰性)及淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對CD8+及CD4+ T細胞進行閘控以用於進一步分析(下列左圖)。對CD8+ (下列中間圖)及CD4+ T細胞(下列右圖)中之效應子細胞介素TNF及IFNγ的產生進行閘控及分析。 圖 14描繪 圖 3c及 圖 4g(Pt 53-02)中所示之資料的流式細胞術分析之閘控策略。用於鑑定疫苗誘導之T細胞的細胞介素反應之流式細胞術閘控策略。(上列，自左至右)自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，鑑定了單一事件。在下一步中鑑定淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對CD8+及CD4+ T細胞進行閘控以用於進一步分析(下列左圖)。對CD8+ (下列中間圖)及CD4+ T細胞(下列右圖)中之效應子細胞介素TNF及IFNγ的產生進行閘控及分析。 圖 15描繪基於流式細胞術偵測 圖 3d中所示之IVS後患者53-02之多聚體陽性T細胞的閘控策略。為了偵測NY-ESO-196-104多聚體特異性T細胞，首先鑑定單一事件及淋巴細胞。在單一淋巴細胞內，對CD3+活細胞進行閘控。在活的CD3+細胞內，鑑定CD8+/多聚體+。樣品在第64天之閘控策略顯示為 圖 3d中描繪之多聚體分析的實例。 圖 16描繪用於 圖 9c、 圖 9g及 圖 10d中所示之TCR選殖的TAA特異性T細胞之單細胞分選之流式細胞術閘控策略。為了基於(a)多聚體染色或(b, c) IFNγ分泌偵測TAA特異性T細胞，首先鑑定出單一事件及淋巴細胞。在單一淋巴細胞內，對CD3+活細胞進行閘控。在活的CD3+細胞內，對(a) CD8+/多聚體+、(b) CD8+/IFNγ+或(c) CD4+/IFNγ+ T細胞進行閘控。分選閘以紅色突出顯示。在(a)多聚體染色或(b) IFNγ分泌分析之後患者53-02之NY-ESO-1特異性T細胞的閘控策略顯示為對應於 圖 9c、 圖 9g中描繪之資料， 圖 10d中所示之患者A2-10的MAGE-A3特異性T細胞同樣如此。 圖 17描繪 圖 10c(Pt A2-10)中所示之資料的流式細胞術分析之閘控策略。用於鑑定疫苗誘導之T細胞的細胞介素反應之流式細胞術閘控策略。(上列，自左至右)自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，鑑定了單一事件。鑑定Dump陰性事件(活細胞)及淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對CD8+及CD4+ T細胞進行閘控以用於進一步分析(下列左圖)。對CD8+ (下列中間圖)及CD4+ T細胞(下列右圖)中之效應子細胞介素TNF及IFNγ的產生進行閘控及分析。 圖 18描繪 圖 4b(Pt C2-028)、 圖 4e(Pt C1-040)及 圖 10i(Pt C1-40)中所示之資料的流式細胞術分析之閘控策略。用於鑑定疫苗誘導之T細胞之流式細胞術閘控策略。(上列，自左至右)自用恆定流動流及螢光強度採集之事件開始，鑑定了單一事件。鑑定Dump陰性事件(活的、CD4-、CD14-、CD16-、CD19陰性)及淋巴細胞且進行閘控。在淋巴細胞內，對CD8+ HLA多聚體陽性T細胞進行閘控以用於進一步分析(下列)。 圖 19描繪用於偵測 圖 4f中所示之IVS後患者C1-40之多聚體陽性T細胞的流式細胞術閘控策略。為了偵測MAGE-A3168-176多聚體特異性T細胞，首先鑑定單一事件及淋巴細胞。在單一淋巴細胞內，對CD3+活細胞進行閘控。在活的CD3+細胞內，鑑定CD8+/多聚體+。樣品在第129天之閘控策略顯示為 圖 4f中描繪之多聚體分析的實例。 圖 20a-20c描繪離體ELISPOT CD4+或CD8+ ( 圖 20a)、CD8+ ( 圖 20b)或CD4+ ( 圖 20c)反應。具有疫苗誘導之(經擴增或從頭)反應之患者的頻率。條形段中之數字代表每個段之經評估患者數目。僅包括以單一療法治療之患者。 圖 21根據細胞類型描繪離體ELISPOT反應。可評估之ELISPOT反應之數目及百分率。僅包括具有以單一療法治療之患者的CD4及CD8可評估結果之非批量量測。 圖 22描繪疫苗誘導之對任何細胞類型之離體ELISPOT CD4+或CD8+反應。從頭及經擴增反應之分數。僅包括以單一療法治療之患者。 圖 23a-23c描繪離體ELISPOT CD4+或CD8+ ( 圖 23a)、CD8+ ( 圖 23b)或CD4+ ( 圖 23c)反應。具有疫苗誘導之(經擴增或從頭)反應之患者的頻率。條形段中之數字代表每個段之經評估患者數目。僅包括以單一療法治療之患者。 圖 24根據無法評估之疾病患者的臨床最佳反應描繪離體ELISPOT CD4+或CD8+反應。條形段中之數字代表每個段之具有經評估離體ELISPOT量測之患者的數目。僅包括以單一療法治療之患者。排除不具有可評估之ELISPOT結果或經記錄臨床最佳結果之患者。 圖 25根據可評估之疾病患者的臨床最佳反應描繪離體ELISPOT CD4+或CD8+反應。條形段中之數字代表每個段之具有經評估離體ELISPOT量測之患者的數目。僅包括以單一療法治療之患者。排除不具有可評估之ELISPOT結果或經記錄臨床最佳結果之患者。 圖 26a-26b描繪NED患者之無疾病存活資料的概述，以及NED患者之無疾病存活資料的Kaplan-Meier概述。 圖 27a-27f描繪ED患者( 圖 27a)、NED患者( 圖 27b)以及組合之NED及ED患者( 圖 27c)之總體存活資料的概述；及ED患者( 圖 27d)、NED患者( 圖 27e)以及組合之ED及NED患者( 圖 27f)之總體存活資料的Kaplan-Meier概述。 圖 28a-28c描繪ED患者( 圖 28a)、NED患者( 圖 28b)以及組合之ED及NED患者( 圖 28c)之不良事件的概述。 圖 29描繪患者處置資料。在總數89名患者中，3名登記兩次之患者僅在其首次登記時計數一次(2名患者在群組CI中經治療且稍後在群組CIII中登記，且1名來自群組CII之患者稍後在擴展群組Exp. A中登記)。起始劑量呈藍色且標靶劑量呈橙色。在群組CII至CVII及Exp. A、B及C中，患者接受8個劑量之黑色素瘤FixVac (在第1、8、15、22、29、36、50及64天)。群組CI中之患者僅接受6個劑量(在第1、8、15、22、29及43天)。在基線處具有可量測之疾病之患者允許可選繼續治療(Q4W)，直至疾病進展或藥物相關毒性。當FixVac欲與抗PD1療法組合時，此情形自第一個劑量開始發生，除了一名患者(星號)在治療期間添加抗PD1療法之情形。 圖 30描繪臨床分析集中患者之特徵及先前治療。 圖 31描繪脾臟FDG攝取之資料，如藉由PET/CT成像所量測。藉由PET/CT成像評估脾臟中之FDG攝取，且在基線處及在第四個(71-27)、第五個(C1-45)或第六個(C1-44)疫苗接種週期後之不同時間點對所選患者定量。呈現脾臟中之總及相對FDG攝取。SUV，標準化攝取值。 圖 32描繪超過5%之患者在治療之後出現的相關不良事件之資料。 圖 33描繪自黑色素瘤患者之單一T細胞中分離的抗原特異性α/β TCR之資料。 圖 34包括顯示如本文所述之例示性mRNA分子以及在脂質複合物中複合之mRNA的作用模式之示意圖。 圖 35包括表格，該表格提供與參與本文所述之例示性組合物(BNT111)的安全性及功效研究之患者相關之各種特徵。 圖 36包括表格，該表格提供與參與本文所述之例示性組合物(BNT111)的安全性及功效研究之患者相關之各種特徵。 圖 37包括根據最佳臨床反應及無疾病存活之持續時間分選的游泳圖。條形長度指示疾病控制之持續時間。虛線指示根據臨床試驗方案在初始試驗治療期間最後一次BNT111投與之大致日期。DFS =無疾病存活；LTFU =長期隨訪；PD係指進行性疾病。此圖中之資料獲自經BNT111單一療法治療之患者。 圖 38包括條形圖，該等條形圖顯示藉由ELISpot確定之患者之離體反應。分別在14/22 (64%)及19/28 (68%) ED及NED患者中偵測到離體反應。 圖 39包括條形圖，該等條形圖顯示藉由ELISpot確定之患者之活體外刺激後反應。活體外刺激(IVS)後ELISpot在9名ED患者及6名NED患者中進行(由於樣品可用性有限，樣品量較小)。在所有15名患者中，觀察到針對至少一種TAA之T細胞反應。 圖 40包括條形圖，該條形圖顯示在用本文所述之例示性組合物(BNT111)治療之後在任何患者子組中具有≥10%發生率的治療期間出現之嚴重不良事件。 圖 41包括條形圖，該條形圖顯示在用本文所述之例示性組合物(BNT111)治療之後具有大於或等於3之不良事件通用術語準則等級的相關治療期間出現之嚴重不良事件。 圖 42包括表格，該表格提供根據irRECIST對患有可評估疾病之患者的初步功效之概述。 圖 43包括在基線處具有可量測之疾病且經例示性單一療法(BNT111)或與PD-1抑制劑或BRAF/MEK抑制組合治療之患者中，根據irRECIST在標靶病灶中觀察到的相對於基線之最佳變化之瀑布圖。
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Claims (145)

  1. 一種方法，該方法包括： 向患者投與至少一個劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(transmembrane phosphatase with tensin homology，TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 其中該患者在投與時間之前經診斷患有癌症，但該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。
  2. 如請求項1之方法，其中藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了無疾病跡象。
  3. 一種方法，該方法包括： 向罹患癌症之患者投與至少一個劑量之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。
  4. 如請求項3之方法，其中該患者係歸類為在投與時不具有疾病跡象。
  5. 如請求項3之方法，其中該患者係歸類為在投與時具有疾病跡象。
  6. 如請求項4或5之方法，其中藉由應用實體腫瘤免疫相關反應評估準則(irRECIST)標準或RECIST 1.1標準來確定或確定了有疾病跡象或無疾病跡象。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含： (i) 編碼該NY-ESO-1抗原之第一RNA分子， (ii) 編碼MAGE-A3抗原之第二RNA分子， (iii) 編碼酪胺酸酶抗原之第三RNA分子，及 (iv) 編碼TPTE抗原之第四RNA分子。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少兩者。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子中之單一RNA分子編碼多抗原決定基多肽，其中該多抗原決定基多肽包含該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少兩者。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子進一步包含至少一個編碼CD4+抗原決定基之序列。
  11. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子進一步包含至少一個編碼破傷風類毒素P2之序列、編碼破傷風類毒素P16之序列或兩者。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含編碼MHC I類運輸域之序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含5’帽或5’帽類似物。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含編碼信號肽之序列。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含至少一種非編碼調節元件。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含聚腺嘌呤尾。
  17. 如請求項16之方法，其中該聚腺嘌呤尾為或包含經修飾之腺嘌呤序列。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含至少一個5’非轉譯區(UTR)及/或至少一個3’ UTR。
  19. 如請求項18之方法，其中該一或多種RNA分子依5’至3’次序包含： (i) 5’帽或5’帽類似物； (ii) 至少一個5’ UTR； (iii) 信號肽； (iv) 編碼該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者的編碼區； (v) 至少一個編碼破傷風類毒素P2、破傷風類毒素P16或兩者之序列； (vi) 編碼MHC I類運輸域之序列； (vii) 至少一個3’UTR；及 (viii) 聚腺嘌呤尾。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含天然核糖核苷酸。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該一或多種RNA分子包含經修飾或合成核糖核苷酸。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者為全長、非突變型抗原。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原全部均為全長、非突變型抗原。
  24. 如請求項1至23中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者由該患者之淋巴組織中的樹突狀細胞表現。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之至少一者存在於該癌症中。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含脂質體。
  27. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含陽離子脂質體。
  28. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含脂質奈米粒子。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含N,N,N-三甲基-2,3-二油烯基氧基-1-氯化丙銨(DOTMA)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺磷脂(DOPE)或兩者。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含至少一種可離子化胺基脂質及輔助脂質。
  32. 如請求項31之方法，其中該輔助脂質為或包含磷脂。
  33. 如請求項31或32中任一項之方法，其中該輔助脂質為或包含固醇。
  34. 如請求項1至33中任一項之方法，其中該等脂質粒子包含至少一種聚合物結合之脂質。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該患者為人類。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該癌症為上皮癌。
  37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該癌症為黑色素瘤。
  38. 如請求項37之方法，其中該黑色素瘤為皮膚黑色素瘤。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該癌症為晚期。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該癌症為II期、III期或IV期。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法，其中該癌症為IIIB期、IIIC期或IV期黑色素瘤。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該癌症經完全切除，不具有疾病跡象，或兩者兼有。
  43. 如請求項1至42中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與第二劑量之該醫藥組合物。
  44. 如請求項1至43中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與至少兩個劑量之該醫藥組合物。
  45. 如請求項1至44中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與至少三個劑量之該醫藥組合物。
  46. 如請求項45之方法，其中該至少三個劑量中之至少一個劑量在該患者已接受該至少三個劑量中之另一劑量的8天內經投與至該患者。
  47. 如請求項45或46之方法，其中該至少三個劑量中之至少一個劑量在該患者已接受該至少三個劑量中之另一劑量的15天內經投與至該患者。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，該方法包括在10週內向該患者投與至少8個劑量之該醫藥組合物。
  49. 如請求項48之方法，該方法包括每週向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物持續6週時期，且接著每兩週投與一個劑量之該醫藥組合物持續4週時期。
  50. 如請求項48或49之方法，該方法進一步包括在該至少8個劑量之後每月向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物。
  51. 如請求項1至47中任一項之方法，該方法包括每週向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物持續7週時期。
  52. 如請求項51之方法，該方法進一步包括每三週向該患者投與一個劑量之該醫藥組合物。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為5 µg至500 µg總RNA。
  54. 如請求項1至53中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為7.2 µg至400 µg總RNA。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為10 µg至20 µg總RNA。
  56. 如請求項1至55中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約14.4 µg總RNA。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約25 µg總RNA。
  58. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約50 µg總RNA。
  59. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量為約100 µg總RNA。
  60. 如請求項1至59中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量全身性經投與。
  61. 如請求項1至60中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量經靜脈內投與。
  62. 如請求項1至60中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量經肌肉內投與。
  63. 如請求項1至60中任一項之方法，其中該第一劑量及/或該第二劑量經皮下投與。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該醫藥組合物作為單一療法經投與。
  65. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該醫藥組合物作為組合療法之一部分經投與。
  66. 如請求項65之方法，其中該組合療法包含該醫藥組合物及免疫檢查點抑制劑。
  67. 如請求項1至66中任一項之方法，其中該患者先前已接受免疫檢查點抑制劑。
  68. 如請求項1至63及65至67中任一項之方法，該方法進一步包括向該患者投與免疫檢查點抑制劑。
  69. 如請求項66至68中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含PD-1抑制劑、PDL-1抑制劑、CTLA4抑制劑、Lag-3抑制劑或其組合。
  70. 如請求項66至69中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含抗體。
  71. 如請求項66至70中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含本文中之 表 4中列出的抑制劑。
  72. 如請求項66至71中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗(ipilimumab)、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(duralumab)或其組合。
  73. 如請求項66至72中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗。
  74. 如請求項66至72中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑為或包含伊匹單抗及納武單抗。
  75. 如請求項1至74中任一項之方法，其中該醫藥組合物在該患者中誘導免疫反應。
  76. 如請求項1至76中任一項之方法，該方法進一步包括確定該患者之該免疫反應的水準。
  77. 如請求項76之方法，將該患者之該免疫反應的該水準與已投與該醫藥組合物之第二患者之該免疫反應的水準進行比較，其中該第二患者在投與時間之前經診斷患有癌症且係歸類為在投與時具有疾病跡象。
  78. 如請求項77之方法，其中該醫藥組合物在該患者中誘導一定水準之該免疫反應，該免疫反應的該水準與已投與該醫藥組合物、先前已經診斷患有癌症且歸類為在投與時具有疾病跡象之第二患者之該免疫反應的水準可比較。
  79. 如請求項75至78中任一項之方法，其中該免疫反應的該水準係由該醫藥組合物誘導之從頭免疫反應。
  80. 如請求項1至79中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後確定該患者之該免疫反應的水準。
  81. 如請求項80之方法，將投與該醫藥組合物之後該患者之該免疫反應的該水準與投與該醫藥組合物之前該患者之該免疫反應的該水準進行比較。
  82. 如請求項81之方法，其中投與該醫藥組合物之後該患者之該免疫反應的該水準與投與該醫藥組合物之前該患者之該免疫反應的該水準相比有所增加。
  83. 如請求項81之方法，其中投與該醫藥組合物之後該患者之該免疫反應的該水準與投與該醫藥組合物之前該患者之該免疫反應的該水準相比得以維持。
  84. 如請求項75至83中任一項之方法，其中該患者之該免疫反應為適應性免疫反應。
  85. 如請求項75至84中任一項之方法，其中該患者之該免疫反應為T細胞反應。
  86. 如請求項85之方法，其中該T細胞反應為或包含CD4+反應。
  87. 如請求項85或86之方法，其中該T細胞反應為或包含CD8+反應。
  88. 如請求項75至87中任一項之方法，其中使用干擾素-γ酶聯免疫吸收劑斑點(ELISpot)分析來確定該患者之該免疫反應的該水準。
  89. 如請求項1至88中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之淋巴組織中之該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之一或多者的水準。
  90. 如請求項1至89中任一項之方法，該方法進一步包括量測該癌症中該NY-ESO-1抗原、該MAGE-A3抗原、該酪胺酸酶抗原及該TPTE抗原中之一或多者的水準。
  91. 如請求項1至90中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之脾臟中的代謝活性水準。
  92. 如請求項1至91中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之脾臟中的代謝活性水準。
  93. 如請求項91或92之方法，其中使用正電子發射斷層掃描(PET)、電腦化斷層掃描(CT)掃描、磁共振成像(MRI)或其組合來量測該患者之脾臟中的該代謝活性水準。
  94. 如請求項1至93中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之血漿中的一或多種細胞介素之量。
  95. 如請求項1至94中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之血漿中的一或多種細胞介素之量。
  96. 如請求項94或95之方法，其中該一或多種細胞介素包含干擾素(IFN)-α、IFN-γ、介白素(IL)-6、IFN誘導蛋白(IP)-10、IL-12 p70次單元或其組合。
  97. 如請求項1至96中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者之癌症病灶的數目。
  98. 如請求項1至97中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之癌症病灶的數目。
  99. 如請求項98之方法，其中與投與該醫藥組合物之前相比，在投與該醫藥組合物之後該患者之癌症病灶較少。
  100. 如請求項1至99中任一項之方法，該方法進一步包括量測該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目。
  101. 如請求項1至100中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之後的複數個時間點量測該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目。
  102. 如請求項1至101中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該第一劑量之該醫藥組合物之後及在投與該第二劑量之該醫藥組合物之後量測該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的數目。
  103. 如請求項102之方法，其中與在投與該第一劑量之該醫藥組合物之後相比，在投與該第二劑量之該醫藥組合物之後，該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的該數目較大。
  104. 如請求項1至103中任一項之方法，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之後確定該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的表型。
  105. 如請求項104之方法，其中該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞的至少一個子集具有T輔助細胞-1表型。
  106. 如請求項104或105之方法，其中該患者中由該醫藥組合物誘導之T細胞包含具有PD1+效應子記憶表型之T細胞。
  107. 如請求項3至106中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測一或多個癌症病灶之大小。
  108. 如請求項3至107中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括在投與該醫藥組合物之前及之後量測該患者之一或多個癌症病灶的大小。
  109. 如請求項108之方法，該方法進一步包括比較在投與該醫藥組合物之前及之後該患者之一或多個癌症病灶的該大小。
  110. 如請求項109之方法，其中在投與該醫藥組合物之後該患者之至少一個癌症病灶的該大小等於或小於在投與該醫藥組合物之前該至少一個癌症病灶的該大小。
  111. 如請求項3至110中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括監測無進展存活之持續時間。
  112. 如請求項111之方法，將該患者的無進展存活之該持續時間與無進展存活之參考持續時間進行比較。
  113. 如請求項112之方法，其中無進展存活之該參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之無進展存活之平均持續時間。
  114. 如請求項112或113之方法，其中該患者的無進展存活之該持續時間在時間上長於無進展存活之參考持續時間。
  115. 如請求項3至114中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測疾病穩定化之持續時間。
  116. 如請求項115之方法，其中藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病穩定化。
  117. 如請求項115或116之方法，該方法進一步包括將該患者的疾病穩定化之該持續時間與疾病穩定化之參考持續時間進行比較。
  118. 如請求項117之方法，其中疾病穩定化之該參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之疾病穩定化之平均持續時間。
  119. 如請求項118之方法，其中與疾病穩定化之該參考持續時間相比，該患者展現增加的疾病穩定化之持續時間。
  120. 如請求項3至119中任一項之方法，對於歸類為具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測腫瘤反應性之持續時間。
  121. 如請求項120之方法，其中藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定腫瘤反應性。
  122. 如請求項120或121之方法，該方法進一步包括將該患者的腫瘤反應性之該持續時間與腫瘤反應性之參考持續時間進行比較。
  123. 如請求項122之方法，其中腫瘤反應性之該參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之腫瘤反應性之平均持續時間。
  124. 如請求項123之方法，其中與腫瘤反應性之該參考持續時間相比，該患者展現增加的腫瘤反應性之持續時間。
  125. 如請求項1至106中任一項之方法，對於歸類為不具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括監測無疾病存活之持續時間。
  126. 如請求項125之方法，該方法進一步包括將該患者的無疾病存活之該持續時間與無疾病存活之參考持續時間進行比較。
  127. 如請求項126之方法，其中無疾病存活之該參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之無疾病存活之平均持續時間。
  128. 如請求項127之方法，其中與無疾病存活之該參考持續時間相比，該患者展現增加的無疾病存活之持續時間。
  129. 如請求項1至106及125至128中任一項之方法，對於歸類為不具有疾病跡象之患者，該方法進一步包括量測直至疾病復發之持續時間。
  130. 如請求項129之方法，其中藉由應用irRECIST或RECIST 1.1標準來確定疾病復發。
  131. 如請求項129或130之方法，該方法進一步包括將該患者的該直至疾病復發之持續時間與直至疾病復發之參考持續時間進行比較。
  132. 如請求項131之方法，其中該直至疾病復發之參考持續時間係尚未接受該醫藥組合物的複數個可比較患者之直至疾病復發之平均持續時間。
  133. 如請求項132之方法，其中與該直至疾病復發之參考持續時間相比，該患者展現增加的直至疾病復發之持續時間。
  134. 一種用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。
  135. 一種用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。
  136. 如請求項134或135之醫藥組合物，其中該癌症為黑色素瘤。
  137. 一種醫藥組合物用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應的用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中該患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。
  138. 一種醫藥組合物用於治療癌症之用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子； 且其中患者係歸類為不具有疾病跡象，但先前已經診斷患有癌症。
  139. 如請求項137或138之用途，其中該癌症為黑色素瘤。
  140. 一種用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。
  141. 一種用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。
  142. 如請求項140或141之醫藥組合物，其中該癌症為黑色素瘤。
  143. 一種醫藥組合物用於在患者中誘導針對癌症之免疫反應的用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。
  144. 一種醫藥組合物用於治療癌症之用途，其中該醫藥組合物包含： (a) 一或多種RNA分子，該一或多種RNA分子共同編碼(i)紐約食管鱗狀細胞癌(NY-ESO-1)抗原，(ii)黑色素瘤相關抗原A3 (MAGE-A3)抗原，(iii)酪胺酸酶抗原，(iv)具有張力蛋白同源性之跨膜磷酸酶(TPTE)抗原，或(v)其組合；及 (b) 脂質粒子。
  145. 如請求項143或144之用途，其中該癌症為黑色素瘤。
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