TW202245815A

TW202245815A - 源自馬奶酒之胞外體及其用途

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Publication number: TW202245815A
Application number: TW111111345A
Authority: TW
Inventors: 落谷孝広; 額爾登布魯德
Original assignee: 額爾登布魯德
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-12-01
Also published as: JP2022168346A; EP4302769A1; EP4302769A4; WO2022224644A1; CN117897164A; JP7162693B1; US20240207320A1

Abstract

本發明提供可抑制與各種炎症性疾病相關連之TARC，可用於治療例如異位性皮膚炎等之新穎材料。一種含有源自馬奶酒之胞外體之組成物，其係由馬奶酒而得，含有使源自前述馬奶酒之胞外體豐富化之胞外體豐富化餾分。又係一種含有源自馬奶酒之胞外體之組成物的製造方法，其特徵係具有下述步驟：將馬奶酒分餾為複數餾分之步驟，自前述複數餾分回收胞外體經豐富化之餾分之步驟。該源自馬奶酒之胞外體具有抑制TARC產生之作用效果，可使用作為調配於皮膚處置用組成物或抗炎症用組成物中之材料。且亦可使用作為對於異位性皮膚炎等之TARC介導性疾病之處置劑。

Description

源自馬奶酒之胞外體及其用途

本發明有關源自馬奶酒之胞外體及其用途。

胞外體係自細胞分泌之直徑為30~200nm(奈米)的細胞外囊泡，組入有細胞所具備之訊息分子的膜蛋白質、細胞內蛋白質、核酸(微RNA、信使RNA、DNA等)等，認為係負責與其他細胞之間的訊息傳遞(非專利文獻1)。近年來，該胞外體作為醫藥品、化妝品、機能性食品等應用的嘗試亦十分活躍。

胞外體於醫藥品、化妝品等之應用，例如於專利文獻1中揭示之發明係包含源自間葉系幹細胞之胞外體的醫藥組成物，以及於治療免疫介導性炎症性疾病之方法中之該等用途。又，專利文獻2中揭示之發明係含有源自牛奶之胞外體作為有效成分之抗炎症劑。又，專利文獻3中揭示之發明係自日本清酒之酒母或醪或自味噌萃取之胞外體，並記載源自酵母(酒母、醪、味噌)之胞外體增加自NK細胞分泌之殺細胞因子的顆粒酶(granzyme)的表現量，且藉由添加酒母胞外體，使老化之纖維母細胞中之膠原蛋白與彈性蛋白之基因表現量提高(專利文獻3之段落0055)。

另一方面，作為顯示對白血球之趨化性(chemotaxis)等之趨化因子(chemokine)之一，已知有TARC (Thymus and activation-regulated chemokine：胸腺及激活調節趨化因子)。例如，認為於異位性皮膚炎中，因病變部之表皮角化細胞而產生之TRAC使淋巴細胞(表現CCR4之Th2細胞)在局部遊走，藉由Th2主導的免疫反應，引起IgE產生及嗜酸性白血球之浸潤‧活化而出現過敏症狀(非專利文獻2)。

又，例如於專利文獻4中揭示與人CCL17抗體有關之發明，CCL17(「CCL17」係「TARC」之別名)與潰瘍性大腸炎、異位性皮膚炎、特發性肺纖維症及哮喘等之對各種臟器造成影響之人類疾病有關，因此人CCL17抗體經記載為可用於治療此等之CCL17介導性之炎症性疾病(專利文獻4之段落0004、0144)。 [先前技術文獻] [非專利文獻]

非專利文獻1：Kosaka N, Yoshioka Y, Fujita Y, Ochiya T.「Versatile roles of extracellular vesicles in cancer.」J Clin Invest. 2016 Apr 1; 126(4), pp1163-72.。非專利文獻2：常深祐一郎「異位性皮膚炎診療中之血清TARC值的活用」日本皮膚過敏‧接觸性皮炎學會雜誌11(3); 2017, pp220-226 [專利文獻]

[專利文獻1] 日本特表2018-531979號公報 [專利文獻2] 國際公開WO2016/039356號 [專利文獻3] 國際公開WO2020/158930號 [專利文獻4] 日本特表2016-537024號公報

[發明欲解決之課題]

若可抑制與各種炎症性疾病的發病相關之TARC，則被認為有望作為該等疾病之治療藥等。然而，例如以專利文獻4記載之抗體技術，難以說是在對患者之投予形態或效果表現性等實用面上具有廣泛性。

因此，本發明之目的在於提供可抑制與各種炎症性疾病相關連之TARC，可用於治療例如異位性皮膚炎等之新穎材料。 [用以解決課題之手段]

為了達成上述目的，本發明人等進行了各種研究之結果，發現源自馬奶酒之胞外體具有抑制引起炎症反應之來自正常人表皮角化細胞之TARC產生的作用效果，因而完成本發明。

亦即本發明第1係提供一種皮膚處置用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。

又，本發明第2係提供一種抗炎症用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。

又，本發明第3係提供一種TARC產生抑制用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。

又，本發明第4係提供一種異位性皮膚炎處置用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。

又，本發明第5係提供一種TARC產生抑制劑，其以源自馬奶酒之胞外體作為有效成分。

又，本發明第6係提供一種疾病處置用組成物，其含有上述TARC產生抑制劑。

上述疾病處置用組成物中，前述疾病較佳係TARC介導性疾病。且前述疾病較佳係異位性皮膚炎。

又，本發明第7係提供一種含有源自馬奶酒之胞外體之組成物的製造方法，其特徵係具有下述步驟：將馬奶酒分餾為複數餾分之步驟，自前述複數餾分回收胞外體經豐富化之餾分之步驟。

又，本發明第8係提供一種含有源自馬奶酒之胞外體之組成物，其係由馬奶酒而得，含有使源自前述馬奶酒之胞外體豐富化之胞外體豐富化餾分。 [發明效果]

根據本發明提供之源自馬奶酒之胞外體，可抑制與各種炎症性疾病之發病相關的TARC，例如可用於治療異位性皮膚炎等。且，可較佳地利用作為對人類或動物投予之處置用組成物之調配成分。

本說明書之「馬奶酒」係與本領域技術人員通常理解之意義同義，具體而言，係使馬奶自然發酵所得之酒精分1~3%，且含有源自馬乃之礦物質‧維生素等之營養素的飲料。可藉由將調製完的剩餘馬奶酒添加於剛擠出的馬奶中進行攪拌等而獲得。馬奶酒較佳使用以蒙古國為原產國的酒。

本說明書之「胞外體」係與本領域技術人員通常理解之意義同義，具體而言，係自細胞分泌之直徑30~200nm(奈米)之細胞外囊泡，包含細胞所具備之訊息分子的膜蛋白質、細胞內蛋白質、核酸(微RNA、信使RNA、DNA等)等。

自馬奶酒之胞外體調製中，例如為了去除馬奶酒中豐富含有之蛋白質成分，以乙酸處理馬奶酒使蛋白質沉澱，藉由超離心分離其上清液，可獲得高度純化之胞外體。

以下針對用以實施本發明之形態更詳細說明。

1.源自馬奶酒之胞外體源自馬奶酒之胞外體例如可藉由經過以下步驟而獲得。 (a) 將作為原料馬奶酒供於離心或過濾器過濾處理，去除雜質。 (b) 將經過上述步驟(a)去除了雜質之試料供於超離心處理。 (c) 回收上述步驟(b)之處理產生的沉澱物。

作為上述步驟(a)中之離心力條件，只要不使胞外體沉澱，而可將胞外體以外之雜質作為沉澱物去除即可，例如可為10,000~20,000×g，可為10,000~17,000×g，可為12,000~17,000×g，或可為12,000~ 15,000×g。且，作為上述步驟(a)中之離心時間，例如可為5~60分鐘，可為10~45分鐘，或可為15~30分鐘。且，作為上述步驟(a)中之離心溫度可於4℃~室溫下進行。藉由上述步驟(a)獲得之上清液，根據需要可藉由過濾器過濾(例如以0.65μm之過濾器過濾)，可進一步去除雜質。離心或過濾器過濾之處理可根據需要分兩階段進行。又，亦可改變離心處理與過濾器過濾之處理的順序，亦可交替進行該等處理。

作為上述步驟(b)中之離心力條件，只要可於沉澱物中回收胞外體即可，例如可為50,000~210,000×g，可為70,000~200,000×g，可為70,000~200,000×g，或可為100,000~180,000×g。且，作為上述步驟(b)中之離心時間，例如可為50分鐘~4小時，可為60分鐘~4小時，或可為70分鐘~4小時。又，作為上述步驟(b)中之離心溫度可於4℃至室溫下進行。

上述步驟(c)中，去除上述步驟(b)之超離心處理所得的上清液，於藉由上述步驟(b)之超離心處理所得之沉澱物中添加磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)等之適當溶劑使懸浮，回收該沉澱物。回收之胞外體根據需要，可藉PBS等洗淨。洗淨係藉由將沉澱物懸浮於PBS後，重複上述步驟(b)之條件的超離心處理而進行。

上述步驟(a)中，將成為原料的馬奶酒施加至不去除胞外體之程度的離心或過濾器過濾之處理，藉由去除雜質，而防止於後段步驟經豐富化之胞外體餾分中混入該雜質。

上述步驟(b)中，藉由超離心處理使魚馬奶酒中浮游之胞外體沉澱，可與在馬奶酒中浮游、分散或溶解等之胞外體以外的成分分離。

上述步驟(c)中，可將沉澱之胞外體懸浮於PBS等之適當溶劑中並回收。

因此，藉由經過步驟(a)、步驟(b)及步驟(c)，可選擇性回收馬奶酒中所含之胞外體並豐富化。

此處所謂「豐富化」係指調製之含有源自馬奶酒之胞外體之組成物中的濃度(例如可為個數基準，亦可為特定蛋白質、核酸、脂質等之胞外體成分的含量基準)，相對於原料的馬奶酒中所含之胞外體濃度，較佳高2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、500倍以上、600倍以上、700倍以上、800倍以上、900倍以上或1000倍以上。

所得胞外體豐富化餾分中是否含有所欲之胞外體，可藉由例如進行測定胞外體中落於特有粒徑範圍之粒子，或藉由進行使用特異辨識胞外體之抗體的ELISA測定等而確認。確認手段不限於該等，但可使用例如基於各個粒子之布朗運動速度差異解析粒徑之奈米粒子追蹤解析系統測定於胞外體中落於特有粒徑範圍之粒子。具體而言，可利用市售之解析系統(商品名「Nanosignt」，Malvern Panalytical公司製)等。且，可使用對馬、牛等之動物種具有交叉性之抗胞外體抗體進行ELISA測定。具體而言，例如可利用市售之測定套組「牛奶胞外體ELISA套組」(COSMO BIO公司製)等。

作為本發明提供之源自馬奶酒之胞外體的平均粒徑，例如可為80~200nm，可為100~180nm，或可為110~160nm。且，作為峰值徑較佳可為70~140nm，可為80~130nm，或可為90~120nm。

又本發明不限定於上述實施形態，在本發明主旨之範圍內，可進行各種變化實施形態，此等實施形態亦包含於本發明範圍內。且，如上述，自馬奶酒調製胞外體豐富化餾分，並利用其等，作為某觀點，本發明提供一種使源自馬奶酒之胞外體豐富化之含胞外體豐富化餾分之韓源自馬奶酒之胞外體的組成物。此外，作為另一觀點，係提供含有源自馬奶酒之胞外體之組成物的製造方法，其具有下述步驟：將馬奶酒分餾為複數餾分之步驟，自該複數餾分回收胞外體經豐富化之餾分之步驟。

2.含有源自馬奶酒之胞外體的組成物(劑) 如後述之試驗例所示，依據源自馬奶酒之胞外體，具有抑制引起炎症反應之正常人表皮角化細胞所產生之TARC產生的作用效果。

因此，某態樣中，本發明係提供一種組成物，其用於將源自馬奶酒之胞外體調配於各種組成物，而應用於人類或動物。例如舉例為以下組成物。 (a) 含有源自馬奶酒之胞外體的皮膚處置用組成物 (b) 含有源自馬奶酒之胞外體的抗炎症用組成物 (c) 含有源自馬奶酒之胞外體的TARC生產抑制用組成物 (d) 含有源自馬奶酒之胞外體的異位性皮膚炎處置用組成物 (e) 以源自馬奶酒之胞外體作為有效成分之TARC產生抑制劑 (f) 含有以源自馬奶酒之胞外體作為有效成分之TARC產生抑制劑的疾病處置用組成物

作為皮膚處置用組成物，除了源自馬奶酒之胞外體以外，根據需要可添加藥學上容許之基材或載體，通過通常之製劑方法，可作成例如霜劑、軟膏劑、洗劑、凝膠劑、噴霧劑、敷劑、貼附劑、棒劑、擦劑等之形態，可作成以將其應用於皮膚病處置之目的而使用之組成物形態。

作為抗炎症用組成物，可為預防、改善、治療炎症之症狀等目的而使用之組成物。投予形態及投予劑型未特別限制，可為與上述皮膚處置用組成物同樣，或可為經口、靜脈、腹腔、經皮、經肺、經鼻、口腔、經腸等之任一投予形態。該情況下，為了適於各種投予形態，可以適宜適當之製劑基材等，藉由通常之製劑手段，作成以含有源自馬奶酒之胞外體之方式調製之形態。例如可為錠劑、散劑、液劑、粉末、顆粒、軟膠囊、硬膠囊、果凍狀劑、口含劑、口腔內崩解劑、注射劑、吸引劑、栓劑、塗佈劑等之形態。

作為TARC產生抑制用組成物，可為基於抑制所需細胞中之TARC產生等目的而使用之組成物。投予形態及投予劑型未特別限制，可與上述皮膚處置用組成物及抗炎症用組成物相同。

作為異位性皮膚炎處置用組成物，可為基於預防、改善、治療異位性皮膚完之症狀等目的而使用之組成物。投予形態及投予劑型未特別限制，可與上述皮膚處置用組成物及抗炎症用組成物相同。特佳為基於應用於異位性皮膚炎之患部的皮膚而處置之目的使用之形態。

另一方面，本發明提供之源自馬奶酒之胞外體可為作為基於抑制期望細胞中之TARC產生為目的而使用之原藥的TARC產生抑制劑。亦即，可為以源自馬奶酒之胞外體為有效成分之TARC生產抑制劑。

因此，例如以源自馬奶酒之胞外體為有效成分之TARC生產抑制劑，可為以預防、改善、治療TARC介導性疾病之症狀等目的所用之組成物。投予形態及投予劑型未特別限制，可與上述皮膚處置用組成物及抗炎症用組成物相同。

此處，「TARC介導性疾病」係TARC參與疾病之該疾病，例如以異位性皮膚炎為代表，但除此之外，舉例有接觸性皮膚炎、硬幣狀濕疹、鬱滯性皮膚炎、汗皰、過敏性接觸性皮膚炎、毛囊炎、乾癬、皮膚乾燥之搔癢、蕁麻疹、皮脂缺乏性濕疹、脂漏性濕疹、異汗性濕疹、硬幣狀濕疹、圓形脫髮症、花粉熱、哮喘、動物過敏等。進而，關於狗或貓等之動物，舉例為蝨子‧跳蚤介導性皮膚疾病等。

作成上述各種組成物利用時，作為該組成物中含有之胞外體的含量，若以調製之胞外體豐富化餾分之質量換算，例如可為1~100質量%、2~100質量%、3~100質量%、4~100質量%、5~100質量%、10~100質量%、20~100質量%、30~100質量%、40~100質量%或50~100質量%。又，以胞外體之個數換算，例如為4×10 ⁸~1×10 ¹⁴個/mL、5×10 ⁸~1×10 ¹⁴個/mL、1×10 ⁹~1×10 ¹⁴個/mL、1×10 ¹⁰~1×10 ¹⁴個/mL、1×10 ¹¹~1×10 ¹⁴個/mL或1×10 ¹²~1×10 ¹⁴個/mL。又胞外體之個數換算為4×10 ⁸個之情況，通常以其質量換算相當於約20μg。

將本發明提供之源自馬奶酒之胞外體投予至人類或動物時，作為該胞外體之投予量，可根據用以利用其之上述組成物的形態及目的適當設定。例如，作為經口攝取用攝取時，若以調製之胞外體豐富化餾分之質量換算，成人每天數次，每次可攝取例如0.001mg~10g。又，若以胞外體之個數換算，則例如可攝取2×10 ⁷~2×10 ¹²個。且，作為皮膚處置用而塗佈於皮膚時，若以調製之胞外體豐富化餾分之質量換算，例如可塗佈0.0001mg~0.1g/ cm ²。若以胞外體之個數換算，例如可塗佈2×10 ⁶~2×10 ¹⁰個/cm ²。

本發明提供之含有源自馬奶酒之胞外體的組成物，可基於預防、改善、治療特定症狀等之目的而使用，或亦可應用於健康人類或動物。例如，可用於維持健康人類或動物之健康。

本發明提供之含有源自馬奶酒之胞外體的組成物，典型上可以例如醫藥品、準藥物、機能性食品、營養補充食品、補充劑、保健食品、動物用醫藥品、動物用準醫藥、動物用機能性食品、動物用營養補充食品、動物用補充劑、動物用保健食品、飼料、飼料添加劑等之各種製品形態。或者可與該等製品組合使用。且亦可與各種飲食品組合使用。

又某態樣中，本發明提供對人類或動物投予源自馬奶酒之胞外體而處置之方法。例如舉例為以下方法。 (a1) 對於人類或動物投予源自馬奶酒之胞外體而對皮膚之處置方法 (b1) 對人類或動物投予源自馬奶酒之胞外體而對炎症之處置方法 (c1) 對人類或動物投予源自馬奶酒之胞外體而用以抑制TARC產生、抑制TSLP產生或抑制MDC產生之處置方法 (d1) 對人類或動物投予源自馬奶酒之胞外體而對異位性皮膚炎之處置方法 (e1) 對人或動物投予源自馬奶酒之胞外體而對TARC介導性疾病之處置方法

又，某態樣中，本發明係提供用於對人類或動物投予源自馬奶酒之胞外體而處置之其用途。例如舉例為以下用途。 (a2) 源自馬奶酒之胞外體用於對皮膚處置之用途 (b2) 源自馬奶酒之胞外體用於對炎症處置之用途 (c2) 源自馬奶酒之胞外體用於抑制TARC產生、抑制TSLP產生或抑制MDC產生之用途 (d2) 源自馬奶酒之胞外體用於對異位性皮膚炎處置之用途 (e2) 源自馬奶酒之胞外體對TARC介導性疾病處置之用途 [實施例]

以下舉例實施例更具體說明本發明。該等實施例並非限定本發明之範圍。

[調製例1]＜源自馬奶酒之胞外體之調製＞準備馬奶酒(原產國：蒙古國)，將其50mL實施低速離心(2000×g，5分鐘)去除細胞破碎物等雜質。其次，保溫於37℃同時添加500μL乙酸溶液倒轉混合後，施加至離心機(12,000×g，10分鐘，4℃)，將上清液回收到新管中。將其施加至超離心裝置(BECKMAN公司製，100,000×g，70分鐘，4℃)，回收其沉澱餾分。沉澱渣分散於PBS(-)中，重複同樣超離心，進行洗淨，去除夾雜蛋白質。最後，將其懸浮於PBS(-)中，用於以下試驗。

為了確認最終產物之胞外體粒子，藉由奈米粒子追蹤解析系統(商品名「Nanosignt」，Malvern Panalytical公司製)進行評價。其結果，如圖1所示，馬奶酒胞外體之平均粒徑平均約為107nm。且，換算為原料的馬奶酒中所含之濃度時之濃度約為4.0×10 ⁸個/mL。亦即了解馬奶酒每1cc含有4億個胞外體。

(試驗例1)＜炎症模型系之效果＞將正常人表皮角化細胞(商品名「正常人表皮角化細胞(成人，單一供體)：Normal Human Epidermal Keratinocytes (NHEK), adult donor, single donor」，PromoCell公司製)，按照常用方法，使用角蛋白細胞專用培養基(商品名「角化細胞增殖培養基2套組：Keratinocyte Growth Medium 2 Kit」，PromoCell製)，於5%CO ₂、37℃下以75cm ²之平底板培養容器培養直到亞融合(subconfluent)。為了繼代，於新的培養容器中播種為40%融合之細胞濃度後，進而培養48小時候，於6孔板中以80%融合之細胞濃度播種。培養24小時後，以使IL-10為最終濃度10ng/mL，TNF-α為最終濃度10ng/mL，IFN-γ為最終濃度10ng/mL之方式分別添加，進而培養24小時。接著，於該培養24小時後之培養液中，以最終濃度為2μg/mL或10μg/mL之方式添加源自馬奶酒之胞外體。

培養48小時後，藉由刮板採取細胞，使用總RNA回收套組(商品名「NucleoSpin RNA」，TAKARA BIO公司製)回收RNA，調製mRNA定量用之DNA試料。對於該試料，根據常用方法，進行特異引子之定量PCR，測定TARC(Thymus and activation-regulated chemokine：胸腺及活化調節趨化因子)、TSLP(Thymic Stromal lymphopoietin：胸腺基質淋巴生成素)及MDC(Macropage Derived Chemokine：巨噬細胞衍生之趨化因子)之mRNA量。又，TARC已知為對於白血球系細胞顯示趨化性等之趨化因子之一，已知與異位性皮膚炎的發病密切相關，同樣TSLP亦已知為參與Th2細胞(2型輔助T細胞)之選擇分化誘導及其機能維持之過敏性炎症均成立之母分子。且，MDC(別名：CCL22)亦與TARC同樣，係對於白血球系細胞顯示趨化性等之趨化因子之一，已知係出現於異位性皮膚炎患者之血清中充分反映其重症度之分子。

其結果，如圖2、3及4所示，藉由以IL-10/ TNF-α/IFN-γ處理正常人類表皮角化細胞，而誘導於異位性皮膚炎患者中觀察到之TARC、TSLP及MDC之表現。相對於此，該等TARC、TSLP、MDC之表現誘導藉由添加源自馬奶酒之胞外體而有意義受抑制。

[圖1]係顯示針對調製例1中調製之源自馬奶酒之胞外體，以奈米粒子追蹤解析系統測定之結果的圖表，圖1(a)顯示粒徑分佈之圖形，圖1(b)顯示觀察視野圖像之一例。 [圖2]係顯示試驗例1中，對正常人表皮角化細胞作用IL-10/TNF-α/IFN-γ引起炎症性，針對源自馬奶酒之胞外體對此時產生之TARC的表現量(相對值)造成之影響進行調查之結果的圖表。 [圖3]係顯示試驗例1中，對正常人表皮角化細胞作用IL-10/TNF-α/IFN-γ引起炎症性，針對源自馬奶酒之胞外體對此時產生之TSLP的表現量(相對值)造成之影響進行調查之結果的圖表。 [圖4]係顯示試驗例1中，對正常人表皮角化細胞作用IL-10/TNF-α/IFN-γ引起炎症性，針對源自馬奶酒之胞外體對此時產生之MDC的表現量(相對值)造成之影響進行調查之結果的圖表。

Claims

一種皮膚處置用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。
一種抗炎症用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。
一種TARC產生抑制用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。
一種異位性皮膚炎處置用組成物，其含有源自馬奶酒之胞外體。
一種TARC產生抑制劑，其以源自馬奶酒之胞外體作為有效成分。
一種疾病處置用組成物，其含有如請求項5之TARC產生抑制劑。
如請求項6之組成物，其中前述疾病係TARC介導性疾病。
如請求項6之組成物，其中前述疾病係異位性皮膚炎。
一種含有源自馬奶酒之胞外體之組成物的製造方法，其特徵係具有下述步驟：將馬奶酒分餾為複數餾分之步驟，自前述複數餾分回收胞外體經豐富化之餾分之步驟。
一種含有源自馬奶酒之胞外體之組成物，其係由馬奶酒而得，含有使源自前述馬奶酒之胞外體豐富化之胞外體豐富化餾分。