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TW202237842A - 靶向ａｔｘｎ３之反義寡核苷酸 - Google Patents

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TW202237842A
TW202237842A TW110145023A TW110145023A TW202237842A TW 202237842 A TW202237842 A TW 202237842A TW 110145023 A TW110145023 A TW 110145023A TW 110145023 A TW110145023 A TW 110145023A TW 202237842 A TW202237842 A TW 202237842A
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pharmaceutically acceptable
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TW110145023A
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艾瑞克 方德
海蒂 萊 胡朵布希
盧卡斯 基爾品斯基
萊可 佩得森
克里斯多福 桑德嘉得
亞歷山大 赫伯特 史蒂芬
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瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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Abstract

本發明涉及與 ATXN3 前驅 mRNA 序列互補之反義 LNA 寡核苷酸 (寡聚物)，其能夠抑制 ATXN3 蛋白之表現。ATXN3 表現之抑制有益於治療脊髓小腦性失調症。

Description

靶向　ATXN3　之反義寡核苷酸
本發明涉及與 ATXN3前驅 mRNA 序列互補之反義 LNA 寡核苷酸 (寡聚物)，其能夠抑制 ATXN3 之表現。 ATXN3表現之抑制有益於治療脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症 (馬查多-約瑟夫病 (MJD))。
脊髓小腦性失調症 3 型 (SCA3) 亦稱為馬查多-約瑟夫病 (MJD)，為九種聚麩醯胺擴張疾病之一，並且是世界上最常見的顯性遺傳性失調症。雖然 SCA3 的某些症狀可能對對症治療有反應，但對於這種不斷加重且致命的神經退化性疾病，仍然缺乏有效的治療方法。該疾病是由 ATXN3基因中的 CAG 重複擴增引起的，該基因編碼疾病蛋白 ATXN3 (Ataxin 3) 中異常長的聚麩醯胺鏈。毒性 Ataxin-3 蛋白與在 SCA3 患者之腦組織中經常觀察到的聚集體相關。
Moore 等人報導，靶向 ATXN3的反義寡核苷酸 (ASO) 能夠降低人類疾病纖維母細胞及小鼠模型中表現全長人類變異體 ATXN3基因的致病性 ATXN3 蛋白的含量 (Moore 等人, Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:200-210)。因此，提出將 ASO 所介導之對 ATXN3之靶向作為 SCA3 的治療方法。
Swayze 等人(Nucleic Acids Res. 2007;35(2):687-700.Epub 2006 Dec 19) 報導，含鎖核酸的反義寡核苷酸具有提高效力的潛力，但在動物體內導致顯著毒性 (肝毒性)。
Toonen 等人使用反義寡核苷酸遮蔽預測的 ATXN3外顯子剪接訊號，導致外顯子 10 從 ATXN3 前驅 mRNA 中跳躍。外顯子 10 之跳躍導致截短之 Ataxin-3 蛋白的形成，該蛋白無聚麩醯胺擴張，但保留其泛素結合及截切功能 (Toonen 等人, Molecular Therapy - Nucleic Acids, 2017, Volume 8: 232-242)。
WO2013/138353、WO2015/017675、WO2018/089805、WO2019/217708 及 WO2020/172559 揭示了用於治療 SCA3 的靶向人類 ATXN3 mRNA 的反義寡核苷酸。
本發明的目的
本發明鑑別出用於 活體外或 活體內反義抑制的 ATXN3 轉錄本 ( ATXN3) 的區域，並提供了靶向 ATXN3前驅 mRNA 或成熟 mRNA 的這些區域的反義寡核苷酸 (包括 LNA 缺口體寡核苷酸)。特定而言，本發明鑑別出以下反義寡核苷酸，該等反義寡核苷酸靶向人類 ATXN3前驅 mRNA 或成熟 mRNA 比其靶向人類鉀電壓閘控通道子類 B 成員 2 ( KCNB2) 前驅 mRNA 或成熟 mRNA 更有效。本發明鑑別出抑制人類 ATXN3 的寡核苷酸，該等寡核苷酸可用於治療脊髓小腦性失調症。
本發明提供一種長度為 10 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸靶向哺乳動物 ATXN3 (Ataxin 3) 標靶核酸，其中該反義寡核苷酸能夠抑制表現哺乳動物 ATXN3 的細胞中哺乳動物 ATXN3 之表現。哺乳動物 ATXN3 標靶核酸可為例如人類、猴或小鼠 ATXN3 標靶核酸。
本發明亦提供一種長度為 10 至 30 個核苷酸的 LNA 缺口體反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含長度為 10 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO:1 至少 90% 互補，諸如完全互補，其中該反義寡核苷酸能夠抑制表現人類 ATXN3 的細胞中人類 ATXN3 之表現。
在一個態樣中，本發明提供一種包含連續核苷酸序列的反義寡核苷酸，該連續核苷酸序列包含存在於 SEQ ID NO:1122 中除一個或多個修飾核苷及/或一個或多個修飾核苷間鍵結之外的連續核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠抑制表現人類 ATXN3 的細胞中人類 ATXN3 之表現；或其醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，反義寡核苷酸更能夠抑制表現人類 ATXN3 及人類 KCNB2 的細胞中人類 ATXN3 之表現而非人類 KCNB2 之表現。在一些實施例中，對於 SEQ ID NO:1122 中之各殘基，一個或多個修飾核苷及/或一個或多個修飾核苷間鍵結獨立地選自如表 15 所示之殘基的選項。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含存在於 SEQ ID NO:1122 中的至少 10 個、諸如至少 12 個、諸如至少 14 個、諸如至少 16 個連續核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 SEQ ID NO:1122 之連續核苷酸序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含選自由表 11 所示之化合物識別編號 1122_82 至 1122_336 所組成之群組的反義寡核苷酸的鹼基序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸的核苷鹼基序列及視情況存在之醣部分修飾：表 14 所示之化合物識別編號 1122_91、1122_107、1122_154、1122_155、1122_156、1122_157、1122_158、1122_167、1122_172、1122_175、1122_294 及 1122_296。
在一些實施例中，反義寡核苷酸為 LNA 缺口體反義寡核苷酸；或其醫藥上可接受之鹽。通常，各 LNA 胞嘧啶為 LNA 5-甲基胞嘧啶。
在一些實施例中，核苷之間所有或實質上所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。在一些特定實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵結中之一者或多者為立體定義之核苷間鍵結。
在一些實施例中，一個或多個核苷亦經修飾或可替代地經修飾為 2’-醣修飾核苷。
在一些實施例中，一個或多個胞嘧啶核苷亦經修飾或可替代地經修飾為 5-甲基胞嘧啶核苷。
在一些實施例中，一個或多個胸腺嘧啶核苷經修飾為尿嘧啶核苷。
在一個態樣中，本發明提供一種包含連續核苷酸序列的反義寡核苷酸，該連續核苷酸序列包含存在於 SEQ ID NO:1816 中除一個或多個修飾核苷及/或一個或多個修飾核苷間鍵結之外的連續核苷酸，其中該反義寡核苷酸能夠抑制表現人類 ATXN3 的細胞中人類 ATXN3 之表現；或其醫藥上可接受之鹽。在一些實施例中，反義寡核苷酸更能夠抑制表現人類 ATXN3 及人類 KCNB2 的細胞中人類 ATXN3 之表現而非人類 KCNB2 之表現。在一些實施例中，對於 SEQ ID NO:1816 中之各殘基，一個或多個修飾核苷及/或一個或多個修飾核苷間鍵結獨立地選自如表 16 所示之殘基的選項。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含存在於 SEQ ID NO:1816 中的至少 10 個、諸如至少 12 個、諸如至少 14 個、諸如至少 16 個連續核苷酸。在一些實施例中，反義寡核苷酸包含 SEQ ID NO:1816 之連續核苷酸序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含選自由表 11 所示之化合物識別編號 1816_2 至 1816_74 所組成之群組的反義寡核苷酸的鹼基序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸的核苷鹼基序列及視情況存在之醣部分修飾：表 14 所示之化合物識別編號 1816_13、1816_15、1816_28、1816_41、1816_42、1816_43、1816_60、1816_61、1816_64、1816_65 及 1816_68。
在一些實施例中，反義寡核苷酸為 LNA 缺口體反義寡核苷酸；或其醫藥上可接受之鹽。通常，各 LNA 胞嘧啶為 LNA 5-甲基胞嘧啶。
在一些實施例中，核苷之間所有或實質上所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。在一些特定實施例中，硫代磷酸酯核苷間鍵結中之一者或多者為立體定義之核苷間鍵結。
在一些實施例中，一個或多個核苷亦經修飾或可替代地經修飾為 2’-醣修飾核苷。
在一些實施例中，一個或多個胞嘧啶核苷亦經修飾或可替代地經修飾為 5-甲基胞嘧啶核苷。
在一些實施例中，一個或多個胸腺嘧啶核苷經修飾為尿嘧啶核苷。
這些或其他核苷修飾及/或核苷間鍵結修飾的更多詳細資訊提供於本揭露中。
在一個態樣中，本發明提供本文所揭示之反義寡核苷酸，例如選自由實例 13 中的表中所示之化合物所組成之群組的反義寡核苷酸；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個態樣中，本發明提供本文所揭示之反義寡核苷酸，例如選自由表 11 所示之化合物所組成之群組的反義寡核苷酸；或其醫藥上可接受之鹽。
在一些實施例中，反義寡核苷酸選自由實例 16 中的表中所示之化合物所組成之群組。
在一些實施例中，反義寡核苷酸選自由表 14 所示之化合物所組成之群組。
在一個態樣中，本發明特定而言提供一種反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸選自由以下所組成之群組：化合物識別編號 1122_91、1122_107、1122_154、1122_155、1122_156、1122_157、1122_158、1122_167、1122_172、1122_175、1122_294、1122_296、1816_13、1816_15、1816_28、1816_41、1816_42、1816_43、1816_60、1816_61、1816_64、1816_65 及 1816_68；或其醫藥上可接受之鹽。
在單獨及具體態樣中，本發明提供如圖 12A、12B、12C、12D、12E、12F、12G、12H、12I、12J、12K、12L、12M、12N、12O、12P、12Q、12R、12S、12T、12U、12V 或 12W 所示之反義寡核苷酸；或其醫藥上可接受之鹽。
本發明所稱的或本文要求保護的寡核苷酸可為醫藥上可接受之鹽諸如鈉鹽或鉀鹽的形式。
在一個態樣中，本發明提供一種結合物，該結合物包含如本發明之反義寡核苷酸及共價連接至該寡核苷酸之至少一個結合物部分。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本發明之寡核苷酸或結合物以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
在一個態樣中，本發明提供一種在表現 ATXN3之標靶細胞中調節 ATXN3表現之 活體內或 活體外方法，該方法包含向該細胞投予有效量之本發明之寡核苷酸或結合物或醫藥組成物。
在一個態樣中，本發明提供一種治療或預防疾病之方法，該方法包含向患有或易罹患該疾病的受試者投予治療或預防有效量之本發明之寡核苷酸、結合物或醫藥組成物。
在一些實施例中，疾病為脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症，諸如馬查多-約瑟夫病 (MJD)。
在一個態樣中，本發明提供本發明之寡核苷酸、結合物或醫藥組成物，其用於醫藥中。
在一個態樣中，本發明提供本發明之寡核苷酸、結合物或醫藥組成物，其用於治療或預防脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症，諸如馬查多-約瑟夫病 (MJD)。
在一個態樣中，本發明提供本發明之寡核苷酸、結合物或醫藥組成物用於製備藥物之用途，該藥物用於治療或預防脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症，諸如馬查多-約瑟夫病 (MJD)。
界定
寡核苷酸
本文所用的「寡核苷酸」一詞的定義如同具有通常技術者所知，是指包含兩個或多個共價連結核苷的分子。該等共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在實驗室中藉由固相化學合成接以純化來製作。提及寡核苷酸的序列時，是指共價連結核苷酸或核苷的核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸為人造的，且為化學合成的，通常經過純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多個修飾核苷或核苷酸。
反義寡核苷酸
本文所用的術語「反義寡核苷酸」的定義是能夠藉由與標靶核酸雜交而調節標靶基因之表現的寡核苷酸，其所雜交的對象具體而言是標靶核酸上的連續序列。反義寡核苷酸實質上並非雙股，因此不是 siRNA 或 shRNA。本發明之反義寡核苷酸較佳的是單股。應理解的是，只要在寡核苷酸全長內或全長間，自我互補性低於 50%，本發明之單股寡核苷酸便可形成髮夾或分子間雙股螺旋結構 (同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙股螺旋)。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」意指寡核苷酸的與標靶核酸互補的區域。在本文中，該術語可與「連續核鹼基序列」交替使用，且術語「寡核苷酸模體序列」亦稱為「模體序列」。「模體序列」亦可稱為「寡核苷酸鹼基序列」。在某些實施例中，所述寡核苷酸的全部核苷酸構成所述連續核苷酸序列。在某些實施例中，所述寡核苷酸包含連續核苷酸序列，例如 F-G-F’ 缺口體區域，且可視情況包含其他核苷酸，例如可用於將官能基團附加至所述連續核苷酸序列的核苷酸連接子區域。所述核苷酸連接子區域可與標靶核酸互補或不互補。有利地，連續核苷酸序列與標靶核酸 100% 互補。
經修飾之寡核苷酸
術語「經修飾之寡核苷酸」描述包含一個或多個修飾核苷及/或修飾核苷間鍵結的寡核苷酸。有些文獻中使用「嵌合寡核苷酸」來描述具有修飾核苷的寡核苷酸。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸及聚核苷酸的建構組元，在本發明中包括自然產生及非自然產生核苷酸。在本質上，例如 DNA 及 RNA 核苷酸等核苷酸包含核糖部分、核鹼基部分以及一個或多個磷酸根 (核苷中則無磷酸根)。核苷及核苷酸亦可互換稱為「單元」或「單體」。
核鹼基
核鹼基一詞包括存在於核苷及核苷酸中的嘌呤 (例如腺嘌呤及鳥嘌呤) 和嘧啶 (例如脲嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶) 部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明範圍內，術語核鹼基亦包含與自然產生核鹼基不同但在核酸雜交過程中具有功能性的修飾核鹼基。於本說明書中，「核鹼基」意指例如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、脲嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤等自然產生核鹼基以及非自然產生變異體。此類變異體例如是 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1 中所描述的變異體。
在某些實施例中，該核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變為修飾嘌呤或嘧啶而被修飾，諸如取代嘌呤或取代嘧啶，諸如選自異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑并-脲嘧啶、2-硫基-脲嘧啶、2’硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及 2-氯-6-胺基嘌呤的核鹼基。
所述核鹼基部分可用每一對應核鹼基的字母代碼表示，例如 A、T、G、C 或 U，其中各字母可視情況包括對等功能的修飾核鹼基。例如，在例示的寡核苷酸中，所述核鹼基部分選自 A、T、G、C 及 5-甲基胞嘧啶。視情況，5-甲基胞嘧啶 LNA 核苷可用於 LNA 缺口體。
修飾核苷
本文中所用的「修飾核苷」或「核苷修飾」一詞意指藉由導入糖部分或 (核) 鹼基部分的一個或多個修飾，對照相等 DNA 或 RNA 核苷進行修飾的核苷。於一較佳實施例中，所述修飾核苷包含修飾糖部分。修飾核苷一詞在本文中亦可與「核苷類似物」或修飾「單元」或修飾「單體」等詞互換使用。本文中將具有未修飾 DNA 或 RNA 糖部分的核苷稱為 DNA 或 RNA 核苷。在 DNA 或 RNA 核苷的鹼基區域中包含修飾的核苷，若允許瓦特生克立克 (Watson Crick) 鹼基配對，則大體上仍稱為 DNA 或 RNA。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含一個或多個具有修飾糖部分的核苷，亦即與 DNA 及 RNA 中的核糖部分相較為經過修飾的糖部分。
目前已製成了眾多包含經修飾核糖部分的核苷，主要目的為改善寡核苷酸的特定特性，例如親和力及/或核酸酶抗性。
這些修飾包括對核糖環結構的修飾，例如取代為己糖環 (HNA)，或通常在核糖環上的 C2 與 C4 碳原子之間具有雙自由基橋的雙環 (LNA)，或通常在 C2 與 C3 碳原子之間無鍵的未連結核糖環 (例如 UNA)。其他糖修飾核苷包括，例如，雙環己糖核酸 (WO2011/017521) 或三環核酸 (WO2013/154798)。修飾核苷也包括將糖部分取代為非糖部分的核苷，例如胜肽核酸 (PNA) 或嗎啉基核酸的情形。
糖修飾也包括經由將核糖環上的取代基團改變為除在 DNA 及 RNA 核苷中自然存有的氫或 2’-OH 基團以外的基團來進行修飾。取代基可例如在 2’、3’、4’ 或 5’位置導入。
2’ 糖修飾核苷
2’ 糖修飾核苷是在 2’ 位置 (2’ 取代核苷) 具有非 H 或 –OH 的取代基的核苷或包含能夠在核糖環中的 2’ 碳與第二碳之間形成架橋的 2’ 連結雙自由基的核苷，例如 LNA (2’ – 4’ 雙自由基架橋) 核苷。
更確切地，2’ 取代核苷的開發頗受關注，目前已發現許多 2’ 取代核苷在併入寡核苷酸中時具有助益特性。例如，2’ 修飾糖可加強所述寡核苷酸的結合親和力及/或增加所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2’ 取代修飾核苷的實例包括 2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2’-胺基-DNA、2’-氟基-RNA 及 2’-F-ANA 核苷。更多實例請參看例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 以及 Deleavey 與 Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為 2’ 取代修飾核苷的圖解。
Figure 02_image001
在本發明中，2’ 取代並不包括 2’ 橋接分子，如 LNA。
鎖核酸 (LNA)
「LNA 核苷」是一種 2’-修飾核苷，其包含連結該核苷的核醣環之 C2’ 與 C4’ 的雙自由基 (亦稱為「2’ - 4’ 架橋」)，其可限制或鎖定核醣環的構造。該等核苷於文獻中也稱為橋接核酸或雙環核酸 (BNA)。鎖定核糖的構造，可在將 LNA 併入寡核苷酸中而產生互補 RNA 或 DNA 分子時提升雜交親和力 (雙鏈體穩定化)。藉由測量寡核苷酸/補體雙鏈體的融化溫度，可對此進行常規的判定。
非限制性地，例示性 LNA 核苷揭示於以下文獻中：WO 99/014226；WO 00/66604；WO 98/039352；WO 2004/046160；WO 00/047599；WO 2007/134181；WO 2010/077578；WO 2010/036698；WO 2007/090071；WO 2009/006478；WO 2011/156202；WO 2008/154401；WO 2009/067647；WO 2008/150729；Morita 等人, Bioorganic & Med.Chem.Lett.12, 73-76；Seth 等人, J. Org.Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81；Mitsuoka 等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238；以及 Wan 及 Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667。
方案 1 中揭露了其他非限制性例示 LNA 核苷。
方案 1 ：
Figure 02_image003
特定 LNA 核苷為 β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基 LNA，如 (S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET) 及 ENA。
具有特定優勢的 LNA 為 β-D-氧基-LNA。
經修飾之核苷間鍵結
「修飾核苷間鍵結」一詞，如具有通常技術者所知之定義，是指除磷酸二酯 (PO) 鍵結以外，可將兩個核苷共價耦接在一起的鍵結。因此本發明之寡核苷酸可包含修飾核苷間鍵結。在某些實施例中，所述修飾核苷間鍵結可使寡核苷酸的核酸酶抗性相較於磷酸二酯鍵結增加。就自然產生寡核苷酸而言，核苷間鍵結包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵結的磷酸根。經修飾之核苷間鍵結特別能夠穩定寡核苷酸，利於活體內使用，且可防止本發明之寡核苷酸中 DNA 或 RNA 核苷的區域發生核酸酶切斷的情形，例如在缺口體寡核苷酸的缺口區內，以及在修飾核苷的區域諸如區域 F 及 F’ 中。
在一個實施例中，寡核苷酸包含經天然磷酸二酯修飾的一個或多個核苷間鍵結，例如對核酸酶攻擊更具抗性的一個或多個經修飾的核苷間鍵結。核酸酶抗性可以藉由在血清中培養寡核苷酸，或藉由使用核酸酶抗性測定法（例如蛇毒磷酸二酯酶 (SVPD)）來確定，這都是本領域眾所周知的。能夠增強寡核苷酸之核酸酶抗性的核苷間鍵結稱為核酸酶抗性核苷間鍵結。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的核苷間鍵結經修飾，諸如寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 60%、諸如至少 70%、諸如至少 80% 或諸如至少 90% 的核苷間鍵結為抗核酸酶核苷間鍵結。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列的全部所述核苷間鍵結皆為抗核酸酶核苷間鍵結。應知在某些實施例中，將本發明之寡核苷酸連結至例如結合物等非核苷酸功能基團的核苷可為磷酸二酯。
硫代磷酸酯核苷間鍵結
一種較佳的經修飾之核苷間鍵結為硫代磷酸酯. 硫代磷酸酯核苷間鍵結由於具有核酸酶抗性、優良藥物動力學且易於製造，因此特別適用。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 50% 的核苷間鍵結為硫代磷酸酯，諸如寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的至少 60%、諸如至少 70%、諸如至少 80% 或諸如至少 90% 的核苷間鍵結為硫代磷酸酯。在某些實施例中，所述寡核苷酸或其連續核苷酸序列中的全部所述核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯。
核酸酶抗性鍵結 （例如硫代磷酸酯鍵結）在寡核苷酸區域中特別有用，其在與標靶核酸形成雙股螺旋時能夠招募核酸酶，例如缺口體的區域 G 中。然而，硫代磷酸酯鍵結也可用於非核酸酶招募區及/或親和力增強區，如缺口體的區域 F 和 F′。在一些實施例中，缺口體寡核苷酸可在區域 F 或 F′ 或區域 F 和 F′ 兩者中包含一個或多個磷酸二酯鍵結，其中在區域 G 中的核苷間鍵結可完全為硫代磷酸酯。
有利地，寡核苷酸之連續核苷酸序列中的所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯鍵結。
應知，如 EP2 742 135 中所揭示，反義寡核苷酸可包含其他核苷間鍵結 (磷酸二酯及硫代磷酸酯除外)，例如磷酸烷酯/磷酸甲酯核苷間鍵結，其依據 EP2 742 135 可例如耐受於缺口區中不同狀態之 DNA 硫代磷酸酯。
隨機立構硫代磷酸酯鍵結
硫代磷酸酯鍵結為核苷間磷酸酯鍵結，其中非橋接氧中之一者已被硫取代。非橋接氧中之一者被硫取代後引入手性中心，並因此在單硫代磷酸酯寡核苷酸內引入該等手性中心，每個硫代磷酸酯核苷間鍵結將在 S (Sp) 或 R (Rp) 立體同功型中。該等核苷間鍵結被稱為「手性核苷間鍵結」。相比之下，磷酸二酯核苷間鍵結為非手性的，因為它們有兩個非末端氧原子。
立體中心手性的名稱藉由標準 Cahn-Ingold-Prelog 規則 (CIP 優先規則) 決定，該規格率先公開於以下文獻中：Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V. (1966).「Specification of Molecular Chirality」.Angewandte Chemie International Edition.5 (4): 385–415. doi:10.1002/anie.196603851。
在標準寡核苷酸合成過程中，偶合及後續硫化的立體選擇性不受控制。為此，在採用標準寡核苷酸合成方法製備寡核苷酸時，所引入的任何特定硫代磷酸酯核苷間鍵結的立體組態可能變成 Sp 或 Rp。因此，該等寡核苷酸的所得製備物可能含有多達 2 X種不同的單個硫代磷酸酯非鏡像異構物，其中 X 為硫代磷酸酯核苷間鍵結的數量。該等寡核苷酸在本文中稱為隨機立構硫代磷酸酯寡核苷酸，且不含任何立體定義之核苷間鍵結。因此，隨機立構硫代磷酸酯寡核苷酸為來源於非立體定義之合成的單個非鏡像異構物的混合物。在這種情況下，混合物被定義為多達 2 X種不同的硫代磷酸酯非鏡像異構物。隨機立構硫代磷酸酯核苷間鍵結在本文中亦可稱為立體未定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結，或使用 HELM 註釋稱為 [sP] 或 (縮寫)「X」(見實例 13 及 16)。
立體定義之核苷間鍵結
立體定義之核苷間鍵結為將特定手性中心引入寡核苷酸中的核苷間鍵結，該寡核苷酸在單個寡核苷酸分子族群中主要以一種立體異構形式存在，亦即 R 或 S。
應知，本領域中使用的立體選擇性寡核苷酸合成方法通常在每個核苷間鍵結立體中心提供至少約 90% 或至少約 95% 的立體選擇性，並因此高達約 10% 諸如約 5% 的寡核苷酸分子可具有替代的立體異構形式。
在一些實施例中，每個立體定義之硫代磷酸酯立體中心的立體選擇性為至少約 90%。在一些實施例中，每個立體定義之硫代磷酸酯立體中心的立體選擇性為至少約 95%。
立體定義之硫代磷酸酯鍵結
立體定義之硫代磷酸酯鍵結為化學合成的硫代磷酸酯鍵結，其在單個寡核苷酸分子族群內呈 Rp 或 Sp 組態，在每個手性中心 (Rp 或 Sp) 具有諸如至少約 90% 或至少約 95% 的立體選擇性，並因此高達約 10% 諸如約 5% 的寡核苷酸分子可具有替代的立體異構形式。
硫代磷酸酯核苷間鍵結的立體組態如下所示
Figure 02_image005
其中 3' R 基團代表相鄰核苷 (5' 核苷) 的 3' 位置，且 5' R 基團代表相鄰核苷 (3' 核苷) 的 5' 位置。 Rp 核苷間鍵結亦可表示為 srP，且 Sp 核苷間鍵結在本文中表示為 ssP。使用 HELM 註釋，立體定義之 Sp 硫代磷酸酯核苷間鍵結在本文中亦可被稱為 [ssP] 或縮寫為「S」(見實例 13 及 16)。
在一些實施例中，每個立體定義之硫代磷酸酯立體中心的立體選擇性為至少約 97%。在一些實施例中，每個立體定義之硫代磷酸酯立體中心的立體選擇性為至少約 98%。在一些實施例中，每個立體定義之硫代磷酸酯立體中心的立體選擇性為至少約 99%。
在一些實施例中，立體選擇性核苷間鍵結在相同的立體異構形式中，至少 97%、諸如至少 98%、諸如至少 99% 或 (基本上) 所有寡核苷酸分子存在於寡核苷酸分子族群中。
立體選擇性可在僅有非手性主鏈 (亦即磷酸二酯) 的模型系統中測量，其能夠藉由例如將立體定義之單體偶合至以下模型系統「5' t-po-t-po-t-po 3'」來測量各單體的立體選擇性。然後，其結果將得到：5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3' 或 5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'，其可使用 HPLC 分離。立體選擇性藉由對來自兩種可能的化合物的 UV 訊號進行積分並給出它們的比率 (例如 98:2、99:1 或 ＞99:1) 來確定。
應理解，特定單一非鏡像異構物 (單一立體定義之寡核苷酸分子) 的立體 % 純度將是每個核苷間位置處已定義之立體中心的偶合選擇性及待引入之立體定義之核苷間鍵結數量的函數。例如，如果各位置處之偶合選擇性為 97%，包含 15 個立體定義之核苷間鍵結的立體定義之寡核苷酸的所得純度將為 0.97 15， 亦即63% 的所需非鏡像異構物與 37% 的其他非鏡像異構物。已定義之非鏡像異構物的純度可在合成後藉由純化來提高，例如藉由 HPLC 諸如離子交換層析或逆相層析進行純化。
在一些實施例中，立體定義之寡核苷酸是指其中族群中之至少約 40%、諸如至少約 50% 為所需非鏡像異構物的寡核苷酸族群。
換言之，在一些實施例中，立體定義之寡核苷酸是指其中族群中之至少約 40%、諸如至少約 50% 由所需 (特定) 立體定義之核苷間鍵結模體 (亦稱為立體定義之模體) 組成的寡核苷酸族群。
對於包含隨機立構及立體定義之核苷間立體中心兩者的立體定義之寡核苷酸，立體定義之寡核苷酸的純度參照保留已定義之立體定義之核苷間鍵結模體的寡核苷酸族群的 % 確定，在計算中不考量隨機立構鍵結。
立體定義之寡核苷酸
立體定義之寡核苷酸為其中核苷間鍵結中之至少一者為立體定義之核苷間鍵結的寡核苷酸。
立體定義之硫代磷酸酯寡核苷酸為其中核苷間鍵結中之至少一者為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結的寡核苷酸。
互補性
「互補性」一詞是用來形容核苷/核苷酸的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對能力。瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基對是鳥嘌呤 (G) - 胞嘧啶 (C) 及腺嘌呤 (A) - 胸腺嘧啶 (T)/脲嘧啶 (U)。應知寡核苷酸可包含具有修飾核鹼基的核苷，例如 5-甲基胞嘧啶經常用來取代胞嘧啶，因此互補性一詞包括非修飾核鹼基與修飾核鹼基之間的瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對 (見例如 Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 以及 Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl 37 1.4.1)。
如本文所用，術語「% 互補」是指核苷酸數量，其為核酸分子 (例如寡核苷酸) 中的連續核苷酸序列在給定位置與單獨的核酸分子 (例如標靶核酸或標靶序列) 之給定位置的連續核苷酸序列互補 (亦即形成華生-克立克 (Watson-Crick) 鹼基對) 的百分比(%)。該百分比(%)的計算方法為，計算兩個序列之間形成對的對齊鹼基 (當對齊於標靶序列 5’-3’ 及寡核苷酸序列 3’-5’) 的數目，將該數字除以寡核苷酸中的核苷酸總數，再乘以 100。在該等比對中，未對齊 (形成鹼基對) 的核鹼基/核苷酸稱為錯配。較佳的是，計算連續核苷酸序列的 % 互補性時不可進行插入和刪除。
「完全互補」意指具有 100% 互補性。
相同度
本文所用的「相同度 (identity)」一詞意指核酸分子（例如寡核苷酸）中的連續核苷酸序列與參考序列（例如序列模體）完全相同的核苷酸所佔的比例（以百分比表現），該核酸分子橫跨該連續核苷酸序列。相同度百分比(%)的計算方式是，算出兩個序列 (例如，在本發明之化合物的連續核苷酸序列中及在參考序列中) 之間相同 (為一個匹配) 的對齊鹼基的數目，將該數字除以對齊區域中的核苷酸總數，再乘以 100。因此，相同度百分比 = (匹配數 x 100)/對齊區域 (例如連續核苷酸序列) 長度。計算連續核苷酸序列的相同度百分比時不可對序列進行插入和刪除。應知在判定相同度時，只要核鹼基形成瓦特生克立克 (Watson-Crick) 鹼基配對的功能留存，即可不考量核鹼基的化學修飾 (例如在計算 % 相同度時，5’-甲基胞嘧啶與胞嘧啶視為相同)。
雜交
本文所用的術語「雜交」是指兩股核酸 (例如一股寡核苷酸及一股標靶核酸) 在相對股上的鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙股螺旋。兩股核酸之間的結合親和力是指雜交的強度。其通常用融化溫度 (T m) 來描述，所述融化溫度的定義是一半寡核苷酸與標靶核酸形成雙鏈體時的溫度。在生理條件下，T m並非確實與親和力成比例 (Mergny 及 Lacroix, 2003, Oligonucleotides13:515-537)。標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 更能準確代表結合親和力，並且與反應的離解常數 (K d) 之間具有 ΔG°=-RTln(K d) 的關係，其中 R 是氣體常數，而 T 是絕對溫度。因此，寡核苷酸與標靶核酸之間反應的非常低的 ΔG° 體現所述寡核苷酸與標靶核酸之間的強勢雜交。ΔG° 是與含水濃度為 1M、pH 為 7、溫度為 37℃ 的反應關聯的能量。寡核苷酸與標靶核酸的雜交是自發性反應，而自發性反應的 ΔG° 小於零。ΔG° 可經由實驗來測量，例如，利用等溫滴定熱量測定術 (ITC)　方法，如以下文獻所述：Hansen 等人, 1965, Chem.Comm.36–38；及 Holdgate 等人, 2005, Drug Discov Today。具有通常技術者應知，市面上可購得用於測量 ΔG° 的商用設備。ΔG° 亦可透過數值方式進行估計，例如藉由利用 SantaLucia 於 1998 年在 Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460–1465 中所描述的最近鄰模型或利用 Sugimoto 等人於 1995 年在 Biochemistry34:11211-11216 中及 McTigue 等人於 2004 年在 Biochemistry43:5388–5405 中所描述的適當取得的熱動力學參數。為了能夠經由雜交調節本發明之寡核苷酸的預期核酸標靶，將長度為 10-30 個核苷酸的寡核苷酸以低於 -10 千卡的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸。在某些實施例中，雜交的程度或強度是以標準狀態吉布斯自由能 ΔG° 來測量。長度為 8 至 30 個核苷酸的寡核苷酸可以低於 -10 千卡範圍的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸，例如低於 -15 千卡，例如低於 -20 千卡，及例如低於 -25 千卡。在某些實施例中，所述寡核苷酸以 -10 至 -60 千卡，例如 -12 至 -40 千卡，例如自 -15 至 -30 千卡或 -16 至 -27 千卡，例如 -18 至 -25 千卡的估計 ΔG° 值雜交至標靶核酸。
標靶核酸
根據本發明，標靶核酸為編碼哺乳動物 ATXN3 蛋白之核酸，且可例如為 ATXN3RNA、mRNA、前驅 mRNA、成熟 mRNA 或 cDNA 序列。因此所述標靶可稱為 ATXN3 標靶核酸。
在一些實施例中，標靶核酸編碼人類 ATXN3 蛋白，諸如編碼本文提供為 SEQ ID NO:1 的前驅 mRNA 序列的人類 ATXN3 基因。因此，標靶核酸可為 SEQ ID NO:1。
在一些實施例中，標靶核酸編碼小鼠 ATXN3 蛋白。適當地，編碼小鼠 ATXN3 蛋白的標靶核酸包含如 SEQ ID NO:3 所示之序列。
在一些實施例中，標靶核酸編碼食蟹獼猴 ATXN3 蛋白。適當地，編碼食蟹獼猴 ATXN3 蛋白的標靶核酸包含如 SEQ ID NO:2 所示之序列。
若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則該標靶核酸可為 cDNA 或衍生自 DNA 或 RNA 的合成核酸。
在 活體內或 活體外應用中，本發明之寡核苷酸通常能夠在表現 ATXN3標靶核酸的細胞中，抑制 ATXN3標靶核酸的表現。本發明之寡核苷酸的核鹼基之連續序列，在整個寡核苷酸長度上測量的結果通常是 ATXN3標靶核酸為互補，視情況有一個或兩個錯配的例外，且視情況不包含能夠將寡核苷酸連結至例如結合物等視情況存在之官能基團，或其他非互補的末端核苷酸 (例如區域 D’ 或 D’’) 之核苷酸基連接子區域。標靶核酸為訊息 RNA，諸如編碼哺乳動物 ATXN3 蛋白諸如人類 ATXN3 的成熟 mRNA 或前驅 mRNA，例如人類 ATXN3前驅 mRNA 序列，諸如 SEQ ID NO:1 所揭示之序列或 ATXN3成熟 mRNA。此外，標靶核酸可為食蟹獼猴 ATXN3 前驅 mRNA 序列，諸如 SEQ ID NO:1 所揭示之序列或食蟹獼猴 ATXN3 成熟 mRNA。此外，標靶核酸可為小鼠 ATXN3 前驅 mRNA 序列，諸如 SEQ ID NO:3 所揭示之序列或小鼠 ATXN3 成熟 mRNA。SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:3 為 DNA 序列 – 應理解，標靶 RNA 序列具有尿嘧啶 (U) 鹼基替代胸苷鹼基 (T)。
表 1: 標靶核酸
標靶核酸 序列 ID
ATXN3 智人前驅 mRNA SEQ ID NO: 1
ATXN3 食蟹獼猴前驅 mRNA SEQ ID NO: 2
ATXN3 小鼠mRNA SEQ ID NO: 3
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸靶向 SEQ ID NO:1。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸靶向 SEQ ID NO:2。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸靶向 SEQ ID NO:3。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸靶向 SEQ ID NO:1 及 SEQ ID NO:2。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸靶向 SEQ ID NO:1 及 SEQ ID NO:3。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸靶向 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 及 SEQ ID NO:3。
標靶序列
本文所用的術語「標靶序列」意指出現在標靶核酸中的核苷酸的一個序列，其包含與本發明之寡核苷酸為互補的核鹼基序列。在一些實施例中，標靶序列包含標靶核酸上的一個區域，該區域與本發明之寡核苷酸的連續核苷酸序列互補。
本文提供許多標靶序列區，如人類 ATXN3 前驅 mRNA (使用 SEQ ID NO:1 作為參比) 所定義，其可被本發明之寡核苷酸靶向。
在某些實施例中，所述標靶序列比單一寡核苷酸的互補序列更長，且可能例如代表所述標靶核酸的較容易受本發明之數種寡核苷酸所標定的區域。
本發明之寡核苷酸包含與標靶核酸 (諸如該標靶核酸的子序列，諸如本文所述之標靶序列) 互補或雜交的連續核苷酸序列。
寡核苷酸包含與標靶核酸分子中存在的標靶序列互補的連續核苷酸序列。連續核苷酸序列 (並由此標靶序列) 包含至少 10 個連續核苷酸，諸如 9 個、10 個、11 個、12 個、13 個、14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、20 個、21 個、22 個、23 個、24 個、25 個、26 個、27 個、28 個、29 個或 30 個連續核苷酸，諸如 12 至 25 個、諸如 14 至 18 個連續核苷酸.
標靶序列區
在一個態樣中，本發明提供一種長度為 10 至 30 個核苷酸的反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸包含長度為 10 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO:1 之區域至少 90% 互補。本發明之反義寡核苷酸與之互補的 SEQ ID NO:1 之區域被稱為標靶序列區。
在一些實施例中，標靶序列區為 AAGAGTAAAATATGGGT (SEQ ID NO:1093)。
在一些實施例中，標靶序列區為 GAATGTAAAAGTGTACAG (SEQ ID NO:1094)。
在一些實施例中，標靶序列區為 GGAATGTAAAAGTGTACA (SEQ ID NO:1095)。
在一些實施例中，標靶序列區為 GGGAATGTAAAAGTGTAC (SEQ ID NO:1096)。
在一些實施例中，標靶序列區為 TTGATGGTATAATGAAGAA (SEQ ID NO:1097)。
在一些實施例中，標靶序列區為 GGAAGATGTAAATAAGATT (SEQ ID NO:1098)。
在一些實施例中，標靶序列區為 AAGATGTAAATAAGATTC (SEQ ID NO:1992)。
應理解，標靶 RNA序列具有尿嘧啶 (U) 鹼基替代任何胸苷 (T) 鹼基。
脫靶序列
如本文所用，術語「脫靶序列」是指包含可以與本發明之寡核苷酸部分互補的核鹼基序列的核苷酸序列，該序列存在於不同於標靶 (ATXN3) 核酸的另一種核酸中。
標靶細胞
本文所用的術語「標靶細胞」是指正在表現標靶核酸的細胞。在某些實施例中，所述標靶細胞可以是體內或體外的。在一些實施例中，標靶細胞為哺乳動物細胞，諸如囓齒動物細胞諸如小鼠細胞或大鼠細胞，或靈長類動物細胞 (諸如猴細胞 (諸如食蟹獼猴細胞) 或人類細胞)。
在較佳之實施例中，標靶細胞表現人類 ATXN3mRNA，諸如 ATXN3前驅 mRNA (例如 SEQ ID NO:1) 或 ATXN3成熟 mRNA。在一些實施例中，標靶細胞表現猴 ATXN3 mRNA，諸如 ATXN3 前驅 mRNA (例如 SEQ ID NO:2) 或 ATXN3 成熟 mRNA。在一些實施例中，標靶細胞表現小鼠 ATXN3 mRNA，諸如 ATXN3 前驅 mRNA (例如 SEQ ID NO:3) 或 ATXN3 成熟 mRNA。在反義寡核苷酸靶向時，通常忽略 ATXN3mRNA 之多 A 尾。
自然產生變異體
術語「自然產生變異體」是指與標靶核酸源自相同基因座但可有差異的 ATXN3基因或轉錄的變異體，該差異可例如是出於基因碼簡併造成多重密碼子編碼同一個胺基酸，或因前 mRNA 的選擇性剪接，或多態性的存在，例如單核苷酸多態性 (SNP) 及等位基因變異體。在與所述寡核苷酸有充分互補序列的條件下，本發明之寡核苷酸可因此標定標靶核酸及其自然產生變異體。
智人ATXN3 基因位於 14 號染色體，92058552..92106621，補體 (NC_000014.9，基因 ID 4287)。
在一些實施例中，自然產生變異體與哺乳動物 ATXN3標靶核酸 (諸如選自由 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 及 SEQ ID NO:3 所組成之群組的標靶核酸) 具有至少 95% 諸如至少 98% 或至少 99% 的同源性。在一些實施例中，自然產生變異體與 SEQ ID NO:1 之人類 ATXN3標靶核酸具有至少 99% 的同源性。
表現的調節
如本文所用，術語「表現之調節」應被理解為一個總體術語，其用於描述寡核苷酸相比於投予寡核苷酸之前 ATXN3 或 ATXN3mRNA 的量改變 ATXN3 蛋白或 ATXN3mRNA 的量的能力。或者，表現之調節可參照對照組實驗進行判定。如普遍所知，對照組是以鹽水組成物處置的個體或標靶細胞，或是以非標定寡核苷酸 (仿製品) 處置的個體或標靶細胞。
一類調節是寡核苷酸抑制、調降、減少、壓制、去除、停止、阻止、預防、減輕、降低、避免或終止 ATXN3 表現的能力，例如藉由降解 ATXN3mRNA 來實現。
高親和力修飾核苷
高親和力修飾核苷是一種修飾核苷酸，當併入所述寡核苷酸中時，可提升所述寡核苷酸對其互補標靶的親和力，例如以融化溫度 (T m) 所測定者。本發明之高親和力修飾核苷較佳的是造成每一修飾核苷的融化溫度增加 +0.5 至 +12℃，更佳的是 +1.5 至 +10℃，最佳的是 +3 至 +8℃。此技術領域中已有眾多為人所知的高親和力修飾核苷，包括例如許多 2’ 取代核苷以及鎖核酸 (LNA) (見例如 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 及 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。
RNase H 活性與招募
反義寡核苷酸的 RNase H 活性是指當其與互補 RNA 分子在雙鏈體中時，招募 RNase H 的能力。WO01/23613 提供判定 RNaseH 活性的體外方法，可用於判定招募 RNaseH 的能力。以具有與受測修飾寡核苷酸相同的鹼基序列但在寡核苷酸中的全部單體之間僅包含具有硫代磷酸酯鍵結的 DNA 單體的寡核苷酸為基準，使用 WO01/23613 (經參照併入於此) 提供的實例 91 - 95 所描述的方法，以皮莫耳/公升/分鐘 (pmol/l/min) 為單位判定初始速率，如果一寡核苷酸與互補標靶核酸序列反應的初始速率為上述基準初始速率的至少 5%，例如至少 10% 或超過 20%，則通常認為所述寡核苷酸能夠招募 RNase H。在判定 RHase H 活性時可使用瑞士琉森 Lubio Science GmbH 的重組型人類 RNase H1。
缺口體
本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可為缺口體。反義缺口體常用於透過 核糖核酸酶 H 中介降解來抑制標靶核酸。缺口體寡核苷酸包含至少三個不同的結構區，在 ‘5 -＞ 3' 方向上為 5'-側翼、缺口及 3'-側翼 (F-G-F')。所述「缺口」區域 (G) 包含一段讓寡核苷酸能夠招募 核糖核酸酶 H 的連續 DNA 核苷酸。所述缺口區域側接包含一或多個糖修飾核苷的 5’ 側翼區域 (F)，有利的是高親和力糖修飾核苷，且側接包含一或多個糖修飾核苷的 3’ 側翼區域 (F’)，有利的是高親和力糖修飾核苷。區域 F 及 F’ 中的一個或多個糖修飾核苷可提升寡核苷酸對於標靶核酸的親和力 (亦即其為親和力提升型糖修飾核苷)。在某些實施例中，區域 F 及 F’ 中的一或多個糖修飾核苷是 2’ 糖修飾核苷，例如高親和力 2’ 糖修飾，例如獨立選自 LNA 及 2’-MOE。
在缺口體設計中，缺口區域的 5’ 及 3’ 多數核苷為 DNA 核苷，且位置分別鄰近 5’ (F) 或 3’ (F’) 區域的糖修飾核苷。所述側翼可進一步定義為在距離所述缺口區域最遠之端具有至少一個糖修飾核苷，也就是在 5’ 側翼的 5’ 端及在 3’ 側翼的 3’ 端。
區域 F-G-F’ 形成一個連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸，或其連續核苷酸序列，可包含式 F-G-F’ 的缺口體區域。
所述缺口體設計 F-G-F’ 的整體長度可為，例如 12 至 32 個核苷，例如 13 至 24 個，例如 14 至 22 個核苷，例如 14 至 17 個，例如 16 至 18 個核苷。
舉例而言，本發明之缺口體寡核苷酸可由下式代表： F 1-8-G 5-16-F’ 1-8，例如 F 1-8-G 7-16-F’ 2-8附帶條件是所述缺口體區域 F-G-F’ 的整體長度為至少 12 個，例如至少 14 個核苷酸。
以下進一步定義了區域 F、G 和 F'，並且可以將其合併到 F-G-F’ 公式中。
缺口體 - 區域 G
缺口體之區域 G (缺口區) 為使寡核苷酸能夠招募 RNaseH 諸如人類 RNase H1 (通常為 DNA 核苷) 的核苷區域。RNaseH 是一種細胞酶，其可識別 DNA 與 RNA 之間的雙股螺旋，並酶切 RNA 分子。適當地，缺口體可具有長度為至少 5 個或 6 個連續 DNA 核苷、諸如 5 至 16 個連續 DNA 核苷、諸如 6 至 15 個連續 DNA 核苷、諸如 7 至 14 個連續 DNA 核苷、諸如 8 至 12 個連續 DNA 核苷酸、諸如 8 至 12 個連續 DNA 核苷酸的缺口區 (G). 在一些實施例中，缺口區 G 可由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個連續 DNA 核苷組成。在一些情況下，缺口區中的一個或多個胞嘧啶 (C) DNA 可能被甲基化 (例如當 DNA c 後接 DNA g 時)，該等殘基被標記為 5-甲基-胞嘧啶( meC)。在一些實施例中，缺口區域 G 可以由 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個連續的硫代磷酸酯連接的 DNA 核苷所組成。在一些實施例中，缺口中的所有核苷間鍵結是硫代磷酸酯鍵結。
雖然傳統的缺口體具有 DNA 缺口區，但有許多修飾核苷的實例，當它們在缺口區內使用時，允許招募 RNaseH。據報導，當包含在缺口區內時能夠招募 RNaseH 的修飾核苷包括例如 α-L-LNA、C4' 烷基化 DNA (如 PCT/EP2009/050349 及 Vester 等人, Bioorg. Med. Chem. Lett.18 (2008) 2296–2300 中所述，兩者藉由引用併入本文)、阿拉伯醣衍生的核苷如 ANA 及 2'F-ANA (Mangos 等人2003 J. AM. CHEM.SOC.125, 654-661)、UNA (非鎖核酸) (如 Fluiter 等人, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 中所述，其藉由引用併入本文)。UNA 為非鎖核酸，通常其中核醣 C2 與 C3 之間的鍵被去除，形成未鎖之「醣」殘基。該等缺口體中使用的修飾核苷可為引入缺口區時呈 2' 內 (DNA 樣) 結構的核苷， 亦即允許招募 RNaseH 的修飾。在一些實施例中，本文所述之 DNA 缺口區 (G) 可視情況含有 1 至 3 個醣修飾核苷，其引入缺口區時呈 2' 內 (DNA 樣) 結構。
區域 G - 「 缺口 破壞者」
可替代地，有許多關於插入修飾核苷的報告，該修飾核苷賦予缺口體之缺口區以 3' 內構形，同時保留一些 RNaseH 活性。該等具有包含一個或多個 3' 內修飾核苷的缺口區的缺口體被稱為「缺口破壞者」或「缺口破壞」缺口體，參見例如 WO2013/022984。缺口破壞者寡核苷酸在缺口區內保留足夠的 DNA 核苷區域，以允許招募 RNaseH。缺口破壞者寡核苷酸設計招募 RNaseH 的能力通常具有序列或甚至化合物特異性的，參見 Rukov 等人2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487，其中揭示了招募 RNaseH 的「缺口破壞者」寡核苷酸，該等寡核苷酸在一些情況下提供對標靶 RNA 的更具特異性的截切。在缺口破壞者寡核苷酸的缺口區內使用的修飾核苷可為例如賦予 3' 內構形的修飾核苷，諸如 2'-O-甲基(OMe) 或 2'-O-MOE (MOE) 核苷或 β-D LNA 核苷 (核苷之核醣環的 C2' 與 C4' 之間的橋處於 β 構形)，諸如 β-D-氧 LNA 或 ScET 核苷。
與上述包含區域 G 的缺口體一樣，缺口破壞者或缺口破壞缺口體之缺口區具有在缺口之 5' 端的 DNA 核苷 (與區域 F 之 3' 核苷相鄰) 及在缺口之 3' 端的 DNA 核苷 (與區域 F' 之 5' 核苷相鄰)。包含經破壞之缺口的缺口體通常在缺口區之 5' 端或 3' 端保留由至少 3 或 4 個連續 DNA 核苷所組成的區域。
缺口破壞者寡核苷酸的例示性設計包括 F 1-8-[D 3-4-E 1-D 3-4] -F’ 1-8F 1-8-[D 1-4-E 1-D 3-4]-F’ 1-8F 1-8- [D 3-4-E 1- D 1-4]-F’ 1-8其中區域 G 在支架 [D n-E r-D m] 內，D 為 DNA 核苷的連續序列，E 為修飾核苷 (缺口破壞者或缺口破壞核苷)，且 F 及 F' 為本文所定義之側翼區，附帶條件是缺口體區域 F-G-F’ 的整體長度為至少 12 個諸如至少 14 個核苷酸。
在一些實施例中，缺口破壞缺口體之區域 G 包含至少 6 個 DNA 核苷，諸如 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 或 16 個 DNA 核苷。如上所述，DNA 核苷可為連續的，或者可視情況散佈一個或多個修飾核苷，附帶條件是缺口區 G 能夠介導 RNaseH 招募。
缺口體 - 側翼區域 F 及 F'
區域 F 定位於緊鄰區域 G 之 5' DNA 核苷。區域 F 之 3' 最末端核苷為醣修飾核苷，諸如高親和力醣修飾核苷，例如 2' 取代之核苷，諸如 MOE 核苷或 LNA 核苷。
區域 F' 定位於緊鄰區域 G 之 3' DNA 核苷。區域 F' 之 5' 最末端核苷為醣修飾核苷，諸如高親和力醣修飾核苷，例如 2' 取代之核苷，諸如 MOE 核苷或 LNA 核苷。
區域 F 的長度為 1 至 8 個連續核苷酸，諸如長度為 2 至 6 個諸如 3 至 4 個連續核苷酸。有利地，區域 F 的 5' 最末端核苷為醣修飾核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個 5' 最末端核苷為醣修飾核苷。在一些實施例中，區域 F 的 5' 最末端核苷為 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個 5' 最末端核苷為 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F 的兩個 5' 最末端核苷為 2' 取代之核苷，諸如兩個 3' MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F 的 5' 最末端核苷為 2' 取代之核苷，諸如 MOE 核苷。
區域 F' 的長度為 2 至 8 個連續核苷酸，諸如長度為 3 至 6 個諸如 4 至 5 個連續核苷酸。有利地，在實施例中，區域 F' 的 3' 最末端核苷為醣修飾核苷。在一些實施例中，區域 F' 的兩個 3' 最末端核苷為醣修飾核苷。在一些實施例中，區域 F' 的兩個 3' 最末端核苷為 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F' 的 3' 最末端核苷為 LNA 核苷。在一些實施例中，區域 F' 的兩個 3' 最末端核苷為 2' 取代之核苷，諸如兩個 3' MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F' 的 3' 最末端核苷為 2' 取代之核苷，諸如 MOE 核苷。
應注意的是，當區域 F 或 F' 的長度為 1 時，其有利地為 LNA 核苷。
在一些實施例中，區域 F 和 F′ 獨立地包括或由糖修飾的核苷的連續序列所組成。在一些實施例中，區域 F 之糖修飾的核苷可獨立地選自 2'-O-烷基-RNA 單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA 單元、2'-氟-DNA 單元、2'-烷氧基-RNA、MOE 單元、LNA 單元、阿拉伯糖核酸 (ANA) 單元和 2'-氟-ANA 單元。
在一些實施例中，區域 F 及 F' 獨立地包含 LNA 及 2' 取代之修飾核苷 (混合型翼設計)。
在一些實施例中，區域 F 及 F' 僅由一種類型的醣修飾核苷組成，諸如僅由 MOE 或僅由 β-D-氧 LNA 或僅由 ScET 組成。該等設計亦被稱為均勻側翼或均勻缺口體設計。
在一些實施例中，區域 F 或 F′或 F 和 F′ 的所有核苷均為 LNA 核苷，例如獨立地選自 β-D-氧基 LNA、ENA 或 ScET 核苷。
在一些實施例中，區域 F 或 F’或 F 和 F’ 的所有核苷都是 2’ 取代的核苷，例如 OMe 或 MOE 核苷。在一些實施例中，區域 F 由 1、2、3、4、5、6、7 或 8 個連續的 OMe 或 MOE 核苷所組成。在一些實施例中，僅一個側翼區域可以由 2′ 取代的核苷所組成，例如 OMe 或 MOE 核苷。在一些實施例中，是 5' (F) 側翼區域由 2' 取代的核苷所組成，例如 OMe 或 MOE 核苷，而 3' (F') 側翼區域包含至少一個 LNA 核苷，例如 β-D-氧基 LNA 核苷或 cET 核苷。在一些實施例中，是 3' (F') 側翼區域由 2' 取代的核苷所組成，例如 OMe 或 MOE 核苷，而 5' (F) 側翼區域包括至少一個 LNA 核苷，例如 β-D-氧基 LNA 核苷或 cET 核苷。
在一些實施例中，區域 F 及 F' 之所有修飾核苷皆為 LNA 核苷，諸如獨立地選自 β-D-氧 LNA、ENA 或 ScET 核苷，其中區域 F 或 F' 或 F 及 F' 可視情況包含 DNA 核苷 (交替側翼，更多詳細資訊參見其定義)。在一些實施例中，區域 F 及 F' 之所有修飾核苷皆為 β-D-氧 LNA 核苷，其中區域 F 或 F' 或 F 及 F' 可視情況包含 DNA 核苷 (交替側翼，更多詳細資訊參見其定義)。
在一些實施例中，區域 F 及 F' 之 5' 最末端及 3' 最末端核苷為 LNA 核苷，諸如 β-D-氧 LNA 核苷或 ScET 核苷。
在一些實施例中，區域 F 與區域 G 之間的核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。在一些實施例中，區域 F' 與區域 G 之間的核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。在一些實施例中，區域 F 或 F'、F 及 F' 之核苷之間的核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
LNA 缺口體
LNA 缺口體是指其中區域 F 及 F’ 中任一者或兩者都包含或具有 LNA 核苷的缺口體。β-D-氧基缺口體是指其中區域 F 及 F’ 中任一者或兩者都包含或具有 β-D-氧基 LNA 核苷的缺口體。
在某些實施例中，所述 LNA 缺口體係如下式：[LNA] 1–5-[區域 G] -[LNA] 1-5，其中區域 G 具有如所述缺口體區域 G 定義中的定義。
MOE 缺口體
MOE 缺口體是其中區域 F 及 F’ 由 MOE 核苷所構成的缺口體。在某些實施例中，所述 MOE 缺口體的設計為 [MOE] 1-8-[區域 G]-[MOE] 1-8，例如 [MOE] 2-7-[區域 G] 5-16-[MOE] 2-7，例如 [MOE] 3-6-[區域 G]-[MOE] 3-6，其中區域 G 具有如所述缺口體定義中的定義。具有 5-10-5 設計 (MOE-DNA-MOE) 的 MOE 缺口體已廣泛用於本技術領域中。
混合型翼缺口體
混合型翼缺口體是一種 LNA 缺口體，其中區域 F 及 F’ 中的一者或兩者都包含 2’ 取代核苷，例如獨立選自以 2’-O-烷基-RNA 單元、2’-O-甲基-RNA、2’-胺基-DNA 單元、2’-氟基-DNA 單元、2’-烷氧基-RNA、MOE 單元、阿糖基核酸 (ANA) 單元及 2’-氟基-ANA 單元所構成之群組的 2’ 取代核苷，例如 MOE 核苷。在某些實施例中，其中區域 F 及 F’ 中之至少一者或區域 F 及 F’ 兩者均包含至少一個 LNA 核苷，區域 F 及 F’ 的其餘核苷係獨立選自以 MOE 及 LNA 所構成之群組。在某些實施例中，其中區域 F 或 F’ 中的至少一者或區域 F 及 F’ 兩者均包含至少兩個 LNA 核苷，區域 F 及 F’ 的其餘核苷係獨立選自以 MOE 及 LNA 所構成之群組。在某些混合型翼的實施例中，區域 F 及 F’ 中的一或兩者可進一步包含一或多個 DNA 核苷。
混合型翼缺口體設計已於 WO2008/049085 及 WO2012/109395 中揭露，這兩個文獻均藉由引用併入本文。
交替側翼缺口體
包含交替側翼的寡核苷酸為 LNA 缺口體寡核苷酸，其中至少一個側翼 (F 或 F’) 在一個或多個 LNA 核苷之外還包含 DNA。在某些實施例中，區域 F 或 F’ 中的至少一者或兩者都包含 LNA 核苷及 DNA 核苷這兩者。在該等實施例中，側翼區域 F 或 F’，或 F 和 F’ 兩者，包含至少三個核苷，其中 F 及/或 F’ 區域的 5’ 及 3’ 多數核苷為 LNA 核苷。
在某些實施例中，區域 F 或 F’ 中的至少一者或兩者都包含 LNA 核苷及 DNA 核苷這兩者。在該等實施例中，F 或 F' 或 F 及 F' 兩者的側翼區域包含至少三個核苷，其中 F 或 F' 區域的 5' 及 3' 最末端核苷為 LNA 核苷，且存在至少一個 DNA 核苷定位於區域 F 或 F' (或區域 F 及 F' 兩者) 的 5' 及 3' 最末端 LNA 核苷之間。
寡核苷酸中的區域 D’ 或 D’’
本發明之寡核苷酸可在某些實施例中包含或具有所述寡核苷酸的所述連續核苷酸序列，其與所述標靶核酸互補，所述連續核苷酸序列如是缺口體 F-G-F’ 以及進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷。所述進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷可與或不與所述標靶核酸為完全互補。該等進一步的 5’ 及/或 3’ 核苷本文中可稱為區域 D’ 及 D’’。
區域 D’ 或 D’’ 的加入可用於將所述連續核苷酸序列，例如缺口體，連接至結合物部分或另一官能基團。當用於接合所述連續核苷酸序列與結合物部分時，其可做為生物可切斷型連接子。或者其可用於提供外核酸酶保護或促進合成或製造。
區域 D’ 及 D’’ 可分別連附至區域 F 的 5’ 端或區域 F’ 的 3’ 端，以產生下式設計：D’-F-G-F’、F-G-F’-D’’ 或
D’-F-G-F’-D’’。在此實例中，F-G-F’ 是所述寡核苷酸的缺口體部位，且區域 D’ 或 D’’ 構成所述寡核苷酸的一個分離部分。
區域 D’ 或 D’’ 可獨立包含或具有 1、2、3、4 或 5 個外加核苷酸，其可與所述標靶核酸為互補或不為互補。鄰接 F 或 F’ 區域的核苷酸並非糖修飾核苷酸，例如 DNA 或 RNA 或其鹼基修飾版本。D’ 或 D’’ 區域可做為對核酸酶易感的生物可切斷型連接子 (見連接子定義)。在某些實施例中，所述外加 5’ 及/或 3’ 端核苷酸是與磷酸二酯鍵結連結，且為 DNA 或 RNA。適用為區域 D’ 或 D’’ 的核苷酸基生物可切斷型連接子可參照 WO2014/076195 的揭露，舉例而言可包括磷酸二酯連結 DNA 二核苷酸。生物可切斷型連接子在聚寡核苷酸構造中的使用可參照 WO2015/113922 的揭露，在該案中其係用於連結單一寡核苷酸中的多重反義構造 (例如缺口體區域)。
在一實施例中，本發明之寡核苷酸除包含構成所述缺口體的連續核苷酸序列之外，還包含區域 D’ 及/或 D’’。
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式代表： F-G-F’；特別是 F 1-8-G 5-16-F’ 2-8D’-F-G-F’；特別是 D’ 1-3-F 1-8-G 5-16-F’ 2-8F-G-F’-D’’；特別是 F 1-8-G 5-16-F’ 2-8-D’’ 1-3D’-F-G-F’-D’’；特別是 D’ 1-3- F 1-8-G 5-16-F’ 2-8-D’’ 1-3
在某些實施例中，所述位在區域 D’ 與區域 F 之間的核苷間鍵結是磷酸二酯鍵結。在某些實施例中，所述位在區域 F’ 與區域 D’’ 之間的核苷間鍵結是磷酸二酯鍵結。
結合體
本文所用的結合物一詞是指共價連結至非核苷酸部分 (結合物部分或區域 C 或第三區域) 的寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸對一個或多個非核苷酸部分的接合可例如藉由影響寡核苷酸的活性、細胞分佈、細胞攝入或穩定性，來改善寡核苷酸的藥理學。在一些實施例中，結合物部分藉由改善寡核苷酸之細胞分佈、生物利用度、新陳代謝、排泄、滲透性及/或細胞攝入來調整或提升寡核苷酸之藥物動力學特性。特定而言，結合物可將寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型，從而增強該寡核苷酸在該器官、組織或細胞類型中的效應。同時，結合物可降低寡核苷酸在非標靶細胞類型、組織或器官中之活性，例如脫靶活性或在非標靶細胞類型、組織或器官中之活性。
在一個實施例中，非核苷酸部分 (結合物部分) 選自由以下所組成之群組：細胞表面受體配體、原料藥、荷爾蒙、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素 (例如細菌毒素)、維生素、病毒蛋白 (例如殼體) 或它們的組合。
連接子
鍵結或連接子是兩個原子之間的連接，用以將一個關注中的化學基團或區段經由一或多個共價鍵連結至另一個關注中的化學基團或區段。結合物部分可直接或經由連結部分 (例如連接子或繫鏈) 連附至所述寡核苷酸。連接子可將第三區域，例如結合物部分 (區域 C)，共價連接至第一區域，例如寡核苷酸或連續核苷酸序列或缺口體區域 F-G-F' (區域 A)。
在本發明的某些實施例中，本發明之結合物或寡核苷酸結合物可視情況包含一連接子區域 (第二區域或區域 B 及/或區域 Y)，其位在互補於所述標靶核酸的所述寡核苷酸或所述連續核苷酸序列 (區域 A 或第一區域) 與結合物部分 (區域 C 或第三區域) 之間。
區域 B 意指包含或具有一個生理不安定鍵的生物可切斷型連接子，所述生理不安定鍵在哺乳動物體內常態存在或與之類似的條件下會成為可切斷的鍵。生理不安定連接子經歷化學轉換 (例如，切斷) 的條件包括化學條件，例如 pH、溫度、氧化或還原條件或作用劑，以及哺乳動物細胞內所常態存在或與之類似的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中的酵素活性，例如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一實施例中，所述生物可切斷型連接子易感於 S1 核酸酶切斷。包含生物可切斷型連接子的 DNA 磷酸二酯更詳細地描述於 WO 2014/076195 (藉由引用併入本文) 中，亦參見本文之區域 D' 或 D''。
區域 Y 意指未必為生物可切斷型但主要功能是將結合物部分（區域 C 或第三區域）共價連接至寡核苷酸（區域 A 或第一區域）的連接子。區域 Y 連接子可包含鏈結構或重複單元的低聚物，如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基團。本發明之寡核苷酸結合物可由以下區域元素建構：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C 或 A-Y-C。在一些實施例中，連接子 (區域 Y) 為胺基烷基，諸如 C2 至 C36 胺基烷基基團，包括例如 C6 至 C12 胺基烷基基團。於一較佳實施例中，所述連接子 (區域 Y) 是一個 C6 胺基烷基團。
治療
本文所用的「治療」一詞意指治療既有疾病 (例如本文所提及之疾病或疾患)，或防範疾病，也就是預防。因此應知，本文中所稱的治療，於某些實施例中，是屬於預防疾病性質。
發明實施方式
本發明涉及靶向 ATXN3表現的寡核苷酸諸如反義寡核苷酸。
本發明之靶向 ATXN3的寡核苷酸能夠雜交至表現 ATXN3標靶核酸的細胞中之 ATXN3標靶核酸並抑制該標靶核酸的表現。
ATXN3 標靶核酸可為哺乳動物 ATXN3mRNA 或前驅 mRNA，諸如人類、小鼠或猴 ATXN3mRNA 或前驅 mRNA。在一些實施例中，ATXN3 標靶核酸為 ATXN3mRNA 或前驅 mRNA，例如來源於 智人Ataxin 3 (ATXN3) 的前驅 mRNA 或 mRNA，14 號染色體上的 RefSeqGene，其如 NCBI 參比序列 NM_004993.5 (SEQ ID NO:1) 所例示。
人類 ATXN3前驅 mRNA 在 智人14 號染色體 NC_000014.9 (92058552..92106621，補體) 上編碼。基因 ID = 4287 ( ATXN3)。
本發明之寡核苷酸能夠抑制表現標靶核酸諸如 ATXN3mRNA 的細胞 (例如，人類、猴或小鼠細胞) 中之 ATXN3標靶核酸諸如 ATXN3mRNA 的表現。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸能夠抑制表現標靶核酸的細胞中之 ATXN3的表現，使得 ATXN3標靶核酸 (例如 mRNA) 之表現含量相比於細胞中之 ATXN3標靶核酸 (例如 mRNA) 之原表現含量受到至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80% 或至少 90% 的抑制。適當地，該細胞選自由人類細胞、猴細胞及小鼠細胞所組成之群組。在一些實施例中，細胞為 SK-N-AS、A431、NCI-H23 或 ARPE19 細胞 (有關這些細胞的更多資訊，參見實例)。實例 1 提供了用於評估本發明之寡核苷酸抑制標靶核酸之表現的能力的合適的測定。適當地，評估化合物抑制標靶核酸之表現的能力的評估在 活體外進行，諸如裸 (gymnotic) 活體外測定，例如實例 1 所述。
在一些實施例中，與抑制表現 KCNB2 核酸的細胞中之 KCNB2 核酸的表現相比，本發明之寡核苷酸更能夠抑制表現標靶核酸的細胞中之 ATXN3 標靶核酸的表現，在靶向 ATXN3 標靶核酸上提供更高的選擇性。KCNB2 (鉀電壓閘控通道子類 B 成員 2) 核酸被鑑定為含有潛在的脫靶序列，該序列可能黏著為某些靶向 SEQ ID NO:1098 及/或 SEQ ID NO:1992 的寡核苷酸。有關 KCNB2基因及轉錄本的資訊 (包括序列資訊) 可見於公共資料庫 Ensembl (release 101)，其基因 id 為 ENSG00000182674。
適當地，在表現兩種核酸的細胞中測試寡核苷酸抑制 ATXN3 及 KCNB2 核酸表現的能力。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸能夠抑制 ATXN3標靶核酸之表現，使得 ATXN3標靶核酸 (例如 mRNA) 相比於細胞中之 ATXN3標靶核酸 (例如 mRNA) 之原表現含量受到至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80% 或至少 90% 的抑制，但使 KCNB2 脫靶核酸 (例如 mRNA) 之含量相比於細胞中之 KCNB2標靶核酸 (例如 mRNA) 之原表現含量受到較低程度之抑制。該細胞可例如選自由人類細胞、猴細胞及小鼠細胞所組成之群組。在一些實施例中，細胞為神經元細胞，諸如 iCell® Glutaneuron 細胞 (有關這些細胞的更多資訊，參見表 2)。實例 5 及 14 提供了用於評估本發明之寡核苷酸抑制標靶核酸相比於脫靶核酸之表現的能力的合適的測定。適當地，評估寡核苷酸抑制標靶核酸及脫靶核酸之表現的能力的評估在 活體外進行，諸如裸 活體外測定，例如實例 14 所述。
有利地，如本發明之寡核苷酸抑制表現標靶核酸的細胞中之 ATXN3標靶核酸之表現時具有較低之 EC50，在靶向 ATXN3 標靶核酸方面提供高功效及/或效力。在一些實施例中，抑制 ATXN3 標靶核酸之表現的 EC50 不超過約 1 µM，諸如不超過約 500 nM，諸如不超過約 300 nM，諸如不超過約 200 nM，諸如不超過約 180 nM，諸如不超過約 170 nM，諸如不超過約 160 nM，諸如不超過約 150 nM，諸如不超過約 140 nM，諸如不超過約 130 nM，諸如不超過約 120 nM，諸如不超過約 110 nM，諸如不超過約 100 nM，諸如不超過約 90 nM，諸如不超過約 80 nM，諸如不超過約 70 nM，諸如不超過約 60 nM，諸如不超過約 50 nM。該細胞可例如選自由人類細胞、猴細胞及小鼠細胞所組成之群組。在一些實施例中，細胞為神經元細胞，諸如人類神經元細胞，諸如 iCell® GlutaNeuron 細胞 (有關這些細胞的更多資訊，參見表 2)。一種特別合適的測定描述於實例 16 中。
較佳的是，另外或可替代地，如本發明之寡核苷酸抑制細胞中之 ATXN3 標靶核酸 (例如，mRNA) 之表現的 EC50 低於抑制細胞中之 KCNB2 脫靶核酸 (例如，mRNA) 之表現的 EC50，表明在較低寡核苷酸濃度下實現對核酸 (ATXN3 標靶核酸) 之表現的 50% 的抑制，從而提供更高的選擇性。在一些實施例中，抑制 KCNB2 脫靶核酸 (例如，mRNA) 之表現的 EC50 與抑制 ATXN3 標靶核酸之表現的 EC50 的比率為至少約 2，諸如至少約 2.1，諸如至少約 2.2，諸如至少約 2.5，諸如至少約 3，諸如至少約 4，諸如至少約 5，諸如至少約 6，諸如至少約 7，諸如至少約 8，諸如至少約 9，諸如至少約 10，諸如至少約 12，諸如至少約 15，諸如至少約 20，諸如至少約 50，諸如至少約 100，諸如至少約 200，諸如至少約 400，諸如至少約 600，諸如至少約 1000。該細胞可例如選自由人類細胞、猴細胞及小鼠細胞所組成之群組。在一些實施例中，細胞為神經元細胞，諸如人類神經元細胞，諸如 iCell® GlutaNeuron 細胞 (有關這些細胞的更多資訊，參見表 2)。特別合適的測定描述於實例 14 及 16 中。
通常，如本發明之寡核苷酸另外或可替代地具有低毒性。適當地，這可以在 活體外測定中測試，諸如在實例 7 中所述的測定中的任何一者或多者。
本發明的一種態樣涉及反義寡核苷酸諸如 LNA 反義寡核苷酸缺口體，其包含長度為 10 至 30 個核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:3 至少 90% 互補，諸如完全互補。
在一些實施例中，寡核苷酸包含 10 至 30 個核苷酸的連續序列，其與標靶核酸的區域或標靶序列至少 90% 互補，諸如至少 91%、諸如至少 92%、諸如至少 93%、諸如至少 94%、諸如至少 95%、諸如至少 96%、諸如至少 97%、諸如至少 98% 或 100% 互補。合適的標靶核酸的序列如上文所述。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含長度為 12 至 24 個諸如 13 個、14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、20 個、21 個、22 個或 23 個連續核苷酸的連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與具有上文章節「標靶序列區」所提供之序列的標靶核酸完全互補。
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸包含長度為 12 至 15 個諸如 13 個、14 個或 15 個連續核苷酸的連續核苷酸序列，其中該連續核苷酸序列與具有上文章節「標靶序列區」所提供之序列的標靶核酸完全互補。
通常，本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列為缺口體，諸如 LNA 缺口體、混合型翼缺口體或交替側翼缺口體。
在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸包含至少 10 連續核苷酸、諸如至少 12 連續核苷酸、諸如至少 13 連續核苷酸、諸如至少 14 連續核苷酸、諸如至少 15 連續核苷酸的連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列與選自 SEQ ID NO:1098、SEQ ID NO:1992 或兩者的序列中包含的標靶序列完全互補。
在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的標靶序列區包含 SEQ ID NO:1098 或由其組成。
在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的標靶序列區包含 SEQ ID NO:1992 或由其組成。
在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的長度少於 20 個核苷酸。在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的長度為 12 至 24 個核苷酸。在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的長度為 12 至 22 個核苷酸。在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的長度為 12 至 20 個核苷酸。在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的長度為 12 至 18 個核苷酸。在一些實施例中，如本發明之反義寡核苷酸的連續核苷酸序列的長度為 12 至 16 個核苷酸。
有利地，在一些實施例中，連續核苷酸序列之核苷之間的所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，連續核苷酸序列與標靶核酸完全互補。
該等寡核苷酸化合物代表模體序列的具體設計。通常，大寫字母或 HELM 名稱 [LR] 代表 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母或 [dR] 代表 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，且 5-甲基 DNA 胞嘧啶由「e」或 mc 或 [5meC] 表示，且除非另有說明，否則所有核苷間鍵結皆為立體未定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [sP]。
設計意指缺口體設計，F-G-F’，其中各數字代表連續修飾核苷的數目，例如 2’ 修飾核苷 (第一個數字 = 5’ 側翼)，接著是 DNA 核苷的數目 (第二個數字 = 缺口區域)，隨後是修飾核苷的數目，例如 2’ 修飾核苷 (第三個數字 = 3’ 側翼)，視情況前方或後方連接有 DNA 及 LNA 的進一步的重複區域，但與所述標靶核酸互補的連續核苷酸序列並不必須具有此等重複區域。
模體序列代表寡核苷酸中存在的核鹼基的連續序列，亦稱為寡核苷酸鹼基序列。
通常，反義寡核苷酸的長度為 12 至 24 個諸如 12 至 18 個核苷，其中反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含存在於選自 SEQ ID NO:1122 及 SEQ ID NO:1816 的序列中的至少 12 個、諸如至少 14 個、諸如至少 15 個連續核苷酸，其具有本文所述之進一步修飾中的一者或多者。
在一些實施例中，反義寡核苷酸為缺口體寡核苷酸，其包含式 5'-F-G-F'-3' 的連續核苷酸序列，其中區域 F 及 F' 獨立地包含 1 至 8 個醣修飾核苷，且 G 為包含介於 5 個和 16 個之間的能夠招募 RNaseH 的核苷的區域。
在一些實施例中，區域 F 及 F' 的醣修飾核苷獨立地選自由以下所組成之群組：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2'-O-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-胺基-DNA、2’-氟基-DNA、阿拉伯醣核酸 (ANA)、2’-氟基-ANA 及 LNA 核苷。
在一些實施例中，區域 G 包含 5 至 16 個連續 DNA 核苷。
在一些實施例中，反義寡核苷酸為包含 LNA 核苷的 LNA 缺口體寡核苷酸。
在一些實施例中，LNA 核苷為 β-D-氧 LNA 核苷。
在一些實施例中，連續核苷之間的所有或實質上所有核苷間鍵結為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，連續核苷之間的所有或實質上所有硫代磷酸酯核苷間鍵結為立體未定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結。
在一些實施例中，連續核苷之間的一個或多個核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結。
本發明之特定的序列模體及反義寡核苷酸顯示於實例 13 的表 11 中，其中各化合物代表如本發明之單獨的具體實施例。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含選自由表 11 所示之化合物識別編號 1122_82 至 1122_336 所組成之群組的反義寡核苷酸的鹼基序列。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含選自由表 11 所示之化合物識別編號 1122_82 至 1122_336 所組成之群組的反義寡核苷酸或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含選自由以下所組成之群組的反義寡核苷酸的核苷鹼基序列及視情況存在之醣部分修飾：表 14 所示之化合物識別編號 1122_91、1122_107、1122_154、1122_155、1122_156、1122_157、1122_158、1122_167、1122_172、1122_175、1122_294 及 1122_296。
在一個態樣中，反義寡核苷酸為 LNA 缺口體反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含存在於 SEQ ID NO:1122 中之連續核苷酸，但表 15 中針對 SEQ ID NO:1122 中之各殘基所示之修飾核苷及修飾核苷間鍵結除外。在一個具體實施例中，反義寡核苷酸更能夠抑制表現人類 ATXN3 及人類 KCNB2 的細胞中人類 ATXN3 之表現而非人類 KCNB2 之表現。
在一個實施例中，LNA 缺口體反義寡核苷酸包含存在於 SEQ ID NO:1122 中的連續核苷酸，其中所有核苷間鍵結皆為立體未定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結，其中區域 F 及區域 F' 中的每個中的 2 個、3 個或 4 個核苷為 β-D-氧 LNA 核苷 [LR]，通常其中各 β-D-氧 LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶[LR](5meC)，但以下情況除外： (a)       殘基 10 為 2’-O-甲基尿嘧啶核苷 [mR](U) (例如，化合物識別編號 1122_91)； (b)      殘基 3 為 2’-O-甲基尿嘧啶核苷 [mR](U) (例如，化合物識別編號 1122_107)； (c)       殘基 11 與 12 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1122_154)； (d)      殘基 12 與 13 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1122_155)； (e)       殘基 13 與 14 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1122_156)； (f)        殘基 14 與 15 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1122_157)； (g)      殘基 15 與 16 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1122_158)； (h)      殘基 7 為 2’-O-甲氧基乙基腺嘌呤核苷 [MOE](A) (例如，化合物識別編號 1122_167)； (i)        殘基 15 為 2’-O-甲基胞嘧啶核苷 [mR](C) (例如，化合物識別編號 1122_172)； (j)        殘基 11 為 2’-O-甲基腺嘌呤核苷 [mR](A) (例如，化合物識別編號 1122_175)； (k)      殘基 18 為 2’-氟 胞嘧啶核苷 [fR](C) (例如，化合物識別編號 1122_294)； (l)        殘基 4 為 2’-O-甲基胞嘧啶核苷 [mR](C) (例如，化合物識別編號 1122_296)；或 (m)    (a) 至 (l) 中之任意兩種或更多種之組合。
在一些實施例中，對於 SEQ ID NO:1122 中之各殘基，一個或多個修飾核苷及/或一個或多個修飾核苷間鍵結獨立地選自如表 15 所示之殘基的選項。
在一個態樣中，反義寡核苷酸為 LNA 缺口體反義寡核苷酸，其包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列包含存在於 SEQ ID NO:1816 中之連續核苷酸，但表 16 中針對 SEQ ID NO:1816 中之各殘基所示之修飾核苷及修飾核苷間鍵結除外。在一個具體實施例中，反義寡核苷酸更能夠抑制表現人類 ATXN3 及人類 KCNB2 的細胞中人類 ATXN3 之表現而非人類 KCNB2 之表現。
在一個實施例中，LNA 缺口體反義寡核苷酸包含存在於 SEQ ID NO:1816 中的連續核苷酸，其中所有核苷間鍵結皆為立體未定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結，其中 F 區域中的 4 個、5 個或 6 個核苷及 F' 區域中的 2 個或 3 個核苷為 β-D-氧 LNA 核苷 [LR]，通常其中各 β-D-氧 LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶[LR](5meC)，但以下情況除外： (a)       殘基 12 與 13 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1816_13)； (b)      殘基 14 與 15 之間的核苷間鍵結為立體定義之硫代磷酸酯核苷間鍵結 [ssP] (例如，化合物識別編號 1816_15)； (c)       殘基 8 為 2’-氟腺嘌呤核苷 [fR](A) (例如，化合物識別編號 1816_28)； (d)      殘基 1、2、3、5、7、8、16、17 及 18 為 LNA β-D-氧 LNA 核苷 [LR]，其中各 β-D-氧 LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶[LR](5meC) (例如，化合物識別編號 1816_41)； (e)       殘基 17 為 2’-O-甲氧基乙基胸腺嘧啶核苷 [MOE](T) (例如，化合物識別編號 1816_42)； (f)        殘基 16 為 2’-O-甲氧基乙基胞嘧啶核苷 [MOE](5meC) (例如，化合物識別編號 1816_43)； (g)      殘基 8 為 2’-O-甲基腺嘌呤核苷 [mR](A) (例如，化合物識別編號 1816_60)； (h)      殘基 3 為 2’-O-甲基腺嘌呤核苷 [mR](A) (例如，化合物識別編號 1816_61)； (i)        殘基 16 為 2’-O-氟胞嘧啶核苷 [fR](C) (例如，化合物識別編號 1816_64)； (j)        殘基 16 為 2’-O-甲基胞嘧啶核苷 [mR](C) (例如，化合物識別編號 1816_65)； (k)      殘基 17 為 2’-氟尿嘧啶核苷 [fR](U) (例如，化合物識別編號 1816_68)；或 (l)        (a) 至 (k) 中之任意兩種或更多種之組合。
在一些實施例中，對於 SEQ ID NO:1816 中之各殘基，一個或多個修飾核苷及/或一個或多個修飾核苷間鍵結獨立地選自如表 16 所示之殘基的選項。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_91 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_107 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_154 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_155 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_156 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_157 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_158 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_167 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_172 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_175 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_294 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1122_296 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_13 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_15 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_28 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_41 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_42 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_43 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_60 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_61 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_64 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_65 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸包含如表 11 所示之化合物識別編號 1816_68 或由其組成。
在一些實施例中，反義寡核苷酸為如以下化學註釋之反義寡核苷酸： (a) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [mR]U [sP]. [dR](A) [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C) [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122，其中殘基 10 為 U) (化合物識別編號 1122_91)； (b) [LR]A [sP]. [LR]A [sP]. [mR]U [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [LR]T [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR] [5me] C (SEQ ID NO:1122，其中殘基 3 為 U) (化合物識別編號 1122_107)； (c) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_154)； (d) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [ssP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_155)； (e) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5meC] [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_156)； (f) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5meC] [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [ssP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_157)； (g) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [ssP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_158)； (h) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [MOE]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_167)； (i) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5meC] [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [mR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_172)； (j) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [mR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR ][5me] C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_175)； (k) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [fR]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_294)； (l) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [mR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_296)； (m) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_13)； (n) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_15)； (o) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [fR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_28)； (p) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_41)； (q) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [MOE]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_42)； (r) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [MOE][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_43)； (s) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [mR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_60)； (t) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [mR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_61)； (u) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [fR]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_64)； (v) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [mR]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_65)；或 (w) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [fR]U [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816，其中殘基 17 為 U) (化合物識別編號 1816_68)， 或為其醫藥上可接受之鹽，其中 [LR] 為 β-D-氧-LNA 核苷， [LR][5me]C 為 β-D-氧-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR] 為 DNA 核苷， [sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵結 (立體未定義) [ssP] 為立體定義之 Sp 硫代磷酸酯核苷間鍵結 [mR] 為 2'-O-甲基核苷， [MOE] 為 2'-O-甲氧基乙基核苷，及 [fR] 為 2'-氟核苷。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12A 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_91)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12B 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_107)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12C 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_154)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12D 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_155)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12E 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_156)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12F 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_157)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12G 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_158)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12H 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_167)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12I 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_172)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12J 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_175)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12K 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_294)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12L 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_296)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12M 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_13)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12N 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_15)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12O 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_28)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12P 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_41)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12Q 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_42)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12R 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_43)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12S 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_60)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12T 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_61)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12U 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_64)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12V 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_65)；或其醫藥上可接受之鹽。
在一個實施例中，反義寡核苷酸為圖 12W 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_68)；或其醫藥上可接受之鹽。
製造方法
在又一態樣中，本發明提供用以製造本發明之寡核苷酸的方法，所述方法包含使核苷酸單元進行反應，藉此在所述寡核苷酸中形成共價連結連續核苷酸單元。較佳的是，所述方法是利用亞磷醯胺化學 (見例如 Caruthers 等人，1987 年，Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313)。在又一實施例中，所述方法進一步包含使所述連續核苷酸序列與一接合部分 (配體) 反應，以使結合物部分共價連附至所述寡核苷酸。在又一態樣中，提供一種用以製造本發明組成物的方法，所述方法包含將本發明之寡核苷酸或結合寡核苷酸與一種醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載體、鹽及/或佐藥混合。
醫藥組成物
在又一態樣中，本發明提供的醫藥組成物包含任一上述寡核苷酸及/或寡核苷酸結合物或其鹽以及一種醫藥上可接受之稀釋劑、載體、鹽及/或佐藥。
在又一態樣中，本發明提供醫藥組成物，該等醫藥組成物包含任一上述寡核苷酸及/或寡核苷酸結合物或其鹽以及醫藥上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。
醫藥上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽緩衝生理鹽水 (PBS)，而醫藥上可接受之鹽類包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在某些實施例中，所述醫藥上可接受之稀釋劑為無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水。在某些實施例中，所述寡核苷酸用於所述醫藥上可接受之稀釋劑的濃度為 50 至 300 微莫耳溶液。
如本發明之化合物可以以其醫藥上可接受之鹽的形式存在。如本文所用，術語「醫藥上可接受之鹽」是指習用的酸加成鹽或鹼加成鹽，其保留本發明之化合物的生物有效性及特性，並由合適的無毒有機或無機酸或有機或無機鹼形成。酸加成鹽包括例如源自無機酸諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磺胺酸、磷酸及硝酸的那些，以及源自有機酸諸如對甲苯磺酸、水楊酸、甲磺酸、草酸、丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸等的那些。鹼加成鹽包括源自銨、鉀、鈉及季銨氫氧化物的那些，諸如四甲基氫氧化銨。將醫藥化合物進行化學修飾成鹽是醫藥化學家眾所周知的技術，以獲得改善之化合物的物理和化學穩定性、吸濕性、流動性和溶解性。例如，在 Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435，或在 Ansel 的以下文獻中對此進行了描述：Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第六版，(1995)，第 196 頁和第 1456-1457 頁。例如，本文提供之化合物的醫藥上可接受之鹽可以是鈉鹽。
適合用於本發明的製劑可參閱 Remington 的 Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985。有關藥物遞送方法的簡要說明，請參閱例如 Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。WO 2007/031091 進一步針對醫藥上可接受之稀釋劑、載體及佐藥提供適當且可取的實例 (經參照併入於此)。WO2007/031091 對於適當劑量、製劑、給藥途徑、組成物、劑型、與其他治療劑的組合、前驅藥物製劑等方面亦有討論。
本發明之寡核苷酸或寡核苷酸結合物可與醫藥上可接受之有效或惰性物質混合，用以製備醫藥組成物或製劑。組成物及用以形成醫藥組成物製劑的方法取決於若干標準，包括但不限於，投予途徑、疾病程度或要施予的劑量。
這些組成物可經由習知消毒技術消毒或經過濾滅菌。如此製成的水溶液可經包裝後直接使用，或經凍乾，使用前先將凍乾製劑與無菌水性載體結合再行投予。製劑的 pH 通常為介於 3 和 11 之間，更佳的是介於 5 和 9 之間或是介於 6 和 8 之間，最佳的是介於 7 和 8 之間，例如 7 至 7.5。製成的固態組成物可分為單劑包裝，每劑中包含固定數量的上述作用劑，例如為藥錠或膠囊的密封包裝。也可將固態組成物裝入容器中，以利靈活調整用量，例如裝入便於局部施用乳霜或軟膏的擠壓管。
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸結合物為前驅藥。特定而言，在寡核苷酸結合物方面，待前驅藥遞送至如標靶細胞等作用位置之後，便將結合物部分自寡核苷酸上裂解。
應用
本發明之寡核苷酸可於例如診斷學、治療法及預防法等領域用為研究試劑。
在研究中，可利用此種寡核苷酸特別調節 ATXN3 蛋白在細胞 (例如體外細胞培養) 及實驗動物中的合成，藉此促進標靶的功能分析，或評估以其做為治療介入標靶的實用性。一般而言，標靶調節的做法是藉由調降或抑制可產生此蛋白質的 mRNA，從而預防蛋白質形成，或藉由對致使基因或 mRNA 產生此蛋白質的調控物進行調降或抑制。
若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則該標靶核酸可為 cDNA 或衍生自 DNA 或 RNA 的合成核酸。
本發明提供一種在 活體內或 活體外用以調節正在表現 ATXN3的標靶細胞中之 ATXN3表現的方法，該方法包含向細胞投予有效量的本發明之寡核苷酸。
在某些實施例中，所述標靶細胞是哺乳動物細胞，特別是人類細胞。所述標靶細胞可為體外細胞培養或為哺乳動物組織中的體內細胞形成部分。
在診斷學上，可藉由北方墨點法、 原位雜交或類似技術，利用寡核苷酸偵測並定量細胞及組織內的 ATXN3表現。
在治療方面，疑似罹患可經由調節 ATXN3之表現而治療之疾病或病症的動物或人。
本發明提供用以治療或預防疾病的方法，所述方法包含對罹有或易於罹患該疾病的受試者施用治療或預防上有效量之本發明寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物。
本發明亦涉及如本文中定義而可用為藥劑的寡核苷酸、組成物或結合物。
依據本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物通常是以有效量施用。
本發明亦提供如所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸結合物在製造用以治療本文中所述疾患的藥劑上的用途，或提供治療本文中所提及之疾患的方法。
本文中所提及之疾病或病症與 ATXN3之表現有關。在一些實施例中，疾病或病症可與 ATXN3基因中之突變有關。因此，在一些實施例中，標靶核酸為 ATXN3序列的突變形式。
本發明之方法較佳的是用於治療或預防因 ATXN3異常含量及/或活性所導致的疾病。
本發明進一步涉及如本文中所定義之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物在製造用以治療 ATXN3異常含量及/或活性的藥物的用途。
在一個實施例中，本發明涉及寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物，其用於治療脊髓小腦性失調症。
投予
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或醫藥組成物可經口投予。在另外的實施例中，本發明之寡核苷酸或醫藥組成物可經由局部或腸道或胃腸外途徑 (諸如靜脈內、皮下、肌內、腦內、腦室內或鞘內) 投予。
在一較佳的實施例中，本發明之寡核苷酸或醫藥組成物經胃腸外途徑投予，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌內注射或輸注、鞘內或顱內 (例如腦內) 或心室內、玻璃體內投予。在一個實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸結合物經靜脈內投予。在另一個實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸結合物經皮下投予。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物以 0.1 至 15 mg/kg、諸如 0.2 至 10 mg/kg、諸如 0.25 至 5 mg/kg的劑量投予。可以每週一次、每兩週一次、每三週一次或甚至每月一次的時間投予。
組合療法
在某些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸結合物或醫藥組成物是用以與另一治療劑進行結合治療。所述治療劑可例如為用以照護上述疾病或疾患的標準品。
實例
材料與方法
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成已為此技術領域中所公知。以下就可採用的合成方式加以說明。本發明之寡核苷酸的製造方法可能在所用裝置、撐體及濃度方面略有差異。
在 MermMade 192 寡核苷酸合成器上，以 1 μmol 規模，透過亞磷醯胺法，於脲苷通用撐體上合成寡核苷酸。在合成結束時，以氨水於 60℃ 處理 5 至 16 小時，將寡核苷酸自固相支持物上裂解。使用逆相 HPLC (RP-HPLC) 或固相萃取純化該等寡核苷酸，之後以 UPLC 進行特性分析，再用 ESI-MS 進一步確定分子質量。
寡核苷酸的延長：
經 5'DMTr 保護之核苷 β-氰乙基亞磷醯胺 (包括 DNA-A(Bz)、DNA-G(iBu)、DNA- C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T、MOE-A(Bz)、MOE-G(iBu)、MOE-(T)、MOE-(U)、MOE-5-methyl-C(Bz)、2'F-A(Bz)、2'F(T)、2'F(U)、2'F-C(Ac)、2'F-G(iBu)、2'OMe-A(Bz)、2'OMe(U)、2'OMe(T)、2'OMe-C(Ac)、2'OMe-G(iBu)、2'OMe-G(dmf)) 之偶合藉由使用 0.1 M 的 5'-O-DMT 保護的亞醯胺的乙腈溶液及 DCI (4,5-二氰基咪唑) 的乙腈 (0.25 M) 溶液作為活化劑進行。
以 RP-HPLC 純化：
使用製備性 RP-HPLC 在 Phenomenex Jupiter C18 10µ 150x10 毫米管柱上對粗產化合物進行純化。使用 0.1 莫耳 pH 為 8 的乙酸銨及乙腈為緩衝液，流速為 5 mL/min。將蒐集而得的碎片凍乾以產生純化的化合物，其通常為白色固體狀。
縮寫： DCI：          4,5-二氰基咪唑 DCM：        二氯甲烷 DMF：        二甲基甲脒 DMT：        4,4’-二甲氧三苯甲基 THF：         四氫呋喃 Bz：            苯甲醯基 Ibu：           異丁醯基 RP-HPLC： 逆相高效液相層析
T m 檢驗：
將寡核苷酸及 RNA 標靶 (磷酸鹽連結，PO) 雙鏈體在 500 毫升無 RNase 水中稀釋至 3 毫莫耳，而後與 500 毫升 2x T m緩衝液 (200 毫莫耳氯化鈉、0.2 毫莫耳 EDTA、20 毫莫耳磷酸鈉，pH 7.0) 混合。將所述溶液加熱至 95ºC 並維持 3 分鐘，而後放置在室溫中退火 30 分鐘。在配備有 Peltier 溫度編程器 PTP6 的 Lambda 40 UV/VIS 分光光度計上利用 PE Templab 軟體 (Perkin Elmer) 測量雙股螺旋熔解溫度 (T m)。溫度自 20℃ 漸升至 95℃，然後降至 25℃，於 260 奈米處記錄吸收度。利用第一衍生物及融化和退火的局部最大值來評估雙股螺旋 T m。
細胞株
表 2: 關於用於測定化合物的細胞株的細節：
細胞株 細胞 / 孔 (96 孔盤 ) 處置前細胞培養時數 處理天數
名稱 廠商 型錄號碼 細胞培養基
A431 ECACC 85090402 EMEM (型錄號碼M2279)、10% FBS (型錄號碼F7524)，2 毫莫耳麩醯胺酸 (型錄號碼G8541)，0.1 毫莫耳 NEAA (型錄號碼M7145)、25 微克/毫升慶大黴素 (型錄號碼G1397) 8000 24 3
NCI-H23 ATCC CRL-5800 RPMI 1640 (型錄號碼R2405)、10% FBS (型錄號碼F7524)、10mM Hepes (型錄號碼H0887)、1 mM 丙酮酸鈉 (型錄號碼S8636)、25µg/ml 慶大黴素 (型錄號碼G1397) 10000 24 3
ARPE19 ATCC CRL-2302 DMEM/F-12 HAM (型錄號碼D8437)、10% FBS (型錄號碼F7524)、25 微克/毫升慶大黴素 (型錄號碼G1397) 2000 0 4
U251 ECACC 9063001 EMEM (型錄號碼M2279)、10% FBS (型錄號碼F7524)，2 毫莫耳麩醯胺酸 (型錄號碼G8541)，0.1 毫莫耳 NEAA (型錄號碼M7145)、1 毫莫耳丙酮酸鈉 (型錄號碼S8636)、25µg/ml 慶大黴素 (型錄號碼G1397) 2000 0 4
U2-OS ATCC HTB-96 MCCoy 5A 培養基 (型錄號碼M8403)、10% FBS (型錄號碼F7524)，1.5 毫莫耳麩醯胺酸 (型錄號碼G8541)、25 微克/毫升慶大黴素 (型錄號碼G1397) 7000 24 3
SK-N-AS ATCC CRL-2137 Dulbecco 改良之 Eagle 培養基，補充有 0.1 mM 非必需胺基酸 (NEAA) 及最終濃度為 10% 的胎牛血清 9300 24 4
iCell® GlutaNeurons Stemcell Technologies R1034 BrainPhys 神經元培養基 (型錄號碼5790)，補充有 iCell® GlutaNeurons 套組 (Stemcell Technologies. no. R1034)，如供應商所述)、N-2 (Thermo Fisher)、1 µg/ml Laminin 512 (BioLamina, no. LN521) 50.000-80.000 168 4
* 除非另有說明，否則所有培養基及添加劑皆購自 Sigma Aldrich。
實例 1 ：測試 LNA 寡核苷酸在 SK-N-AS 、 A431 、 NCI-H23 及 ARPE19 細胞株中於 25 µM 及 5 µM 下的 活體外功效
在人類細胞株中，使用表 3 中之 LNA 寡核苷酸 (CMP 識別編號：4_1 至 1089_1，見「寡核苷酸化合物」列) 篩選靶向 SEQ ID NO:1 的寡核苷酸。人類細胞株 SK-N-AS、A341、NCI-H23 及 ARPE19 購自表 2 中所列廠商，並按照供應商建議的條件，存放於 37℃ 且具有 5% CO 2的加濕培養箱中。進行篩選測定時，將細胞種於裝有供應商建議之培養基的 96 孔盤 (見材料與方法部分的表 2)。針對各細胞株優化其細胞數/孔數 (見材料與方法部分的表 2)。
細胞經培養 0 到 24 小時之後，加入寡核苷酸，濃度為 5 µM 或 25 µM (溶解於 PBS)。加入寡核苷酸後 3 至 4 天收穫細胞 (各細胞株培養時間如材料與方法部分的表 2 所示)。
使用 Qiagen RNeasy 96 套組 (74182)，根據製造商的說明提取 RNA。使用 qScript XLT 單一步驟 RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences) 進行 cDNA 合成及 qPCR。使用 Thermo Fisher Scientific 所提供的 FAM 標定 TaqMan 測定，以 VIC 標定 GUSB 對照組在多重反應中對標靶轉錄本含量進行定量。以 TaqMan 引子測定關注的 ATXN3 (見下文) 標靶轉錄本，及管家基因 GUSB (4326320E VIC-MGB 探針)。
ATXN3 引子測定 (測定 ID：N/A 物品名稱 Hs.PT.58.39355049): 正向引體：GTTTCTAAAGACATGGTCACAGC (SEQ ID NO:1128) 反向：CTATCAGGACAGAGTTCACATCC (SEQ ID NO:1129) 探針：56-FAM/AAAGGCCAG/ZEN/CCACCAGTTCAGG/3IABkFQ/ (SEQ ID NO:1130)
相對 ATXN3 mRNA 表現含量以相較於對照組 (PBS 處理後細胞) 的百分比(%)測定，數值越低表示抑制率越高。
表 3: 本發明之例示性化合物的序列模體及化合物
SEQ ID NO 模體序列 開始 結束 設計 CMP 識別號 寡核苷酸化合物
4 aagaaaccaaaccc 743 756 2-10-2 4_1 AAgaaaccaaacCC
5 aaagaaaccaaacc 744 757 2-10-2 5_1 AAagaaaccaaaCC
6 aaaagaaaccaaac 745 758 2-10-2 6_1 AAaagaaaccaaAC
7 caaaagaaaccaaa 746 759 2-10-2 7_1 CAaaagaaaccaAA
8 ccaaaagaaaccaa 747 760 2-10-2 8_1 CCaaaagaaaccAA
9 tccactcctaatac 803 816 2-10-2 9_1 TCcactcctaatAC
10 gtccactcctaata 804 817 2-10-2 10_1 GTccactcctaaTA
11 agtccactcctaat 805 818 2-10-2 11_1 AGtccactcctaAT
12 cagtccactcctaa 806 819 2-10-2 12_1 CAgtccactcctAA
13 ccagtccactccta 807 820 2-10-2 13_1 CCagtccactccTA
14 actctttccaaaca 1012 1025 2-10-2 14_1 ACtctttccaaaCA
15 aactctttccaaac 1013 1026 2-10-2 15_1 AActctttccaaAC
16 caactctttccaaa 1014 1027 2-10-2 16_1 CAactctttccaAA
17 gcaactctttccaa 1015 1028 2-10-2 17_1 GCaactctttccAA
18 agcaactctttcca 1016 1029 2-10-2 18_1 AGcaactctttcCA
19 cagcaactctttcc 1017 1030 2-10-2 19_1 CAgcaactctttCC
20 ccagcaactctttc 1018 1031 2-10-2 20_1 CCagcaactcttTC
21 accagcaactcttt 1019 1032 2-10-2 21_1 ACcagcaactctTT
22 ctcctattaaataa 1040 1053 2-10-2 22_1 CTcctattaaatAA
23 cctcctattaaata 1041 1054 2-10-2 23_1 CCtcctattaaaTA
24 tcctcctattaaat 1042 1055 2-10-2 24_1 TCctcctattaaAT
25 ctcctcctattaaa 1043 1056 2-10-2 25_1 CTcctcctattaAA
26 gctcctcctattaa 1044 1057 2-10-2 26_1 GCtcctcctattAA
27 tgctcctcctatta 1045 1058 2-10-2 27_1 TGctcctcctatTA
28 ttgctcctcctatt 1046 1059 2-10-2 28_1 TTgctcctcctaTT
29 tttgctcctcctat 1047 1060 2-10-2 29_1 TTtgctcctcctAT
30 ctttgctcctccta 1048 1061 2-10-2 30_1 CTttgctcctccTA
31 cctttgctcctcct 1049 1062 2-10-2 31_1 CCtttgctcctcCT
32 ccctttgctcctcc 1050 1063 2-10-2 32_1 CCctttgctcctCC
33 accctttgctcctc 1051 1064 2-10-2 33_1 ACcctttgctccTC
34 aaccctttgctcct 1052 1065 2-10-2 34_1 AAccctttgctcCT
35 aaaccctttgctcc 1053 1066 2-10-2 35_1 AAaccctttgctCC
36 aaaaccctttgctc 1054 1067 2-10-2 36_1 AAaaccctttgcTC
37 aaaaaccctttgct 1055 1068 2-10-2 37_1 AAaaaccctttgCT
38 caaaaaccctttgc 1056 1069 2-10-2 38_1 CAaaaaccctttGC
39 acaaaaaccctttg 1057 1070 2-10-2 39_1 ACaaaaacccttTG
40 aacaaaaacccttt 1058 1071 2-10-2 40_1 AAcaaaaaccctTT
41 aaacaaaaaccctt 1059 1072 2-10-2 41_1 AAacaaaaacccTT
42 aaaacaaaaaccct 1060 1073 2-10-2 42_1 AAaacaaaaaccCT
43 taaaacaaaaaccc 1061 1074 2-10-2 43_1 TAaaacaaaaacCC
44 ataaaacaaaaacc 1062 1075 2-10-2 44_1 ATaaaacaaaaaCC
45 aataaaacaaaaac 1063 1076 2-10-2 45_1 AAtaaaacaaaaAC
46 taataaaacaaaaa 1064 1077 2-10-2 46_1 TAataaaacaaaAA
47 ttaataaaacaaaa 1065 1078 2-10-2 47_1 TTaataaaacaaAA
48 tttaataaaacaaa 1066 1079 2-10-2 48_1 TTtaataaaacaAA
49 atttaataaaacaa 1067 1080 2-10-2 49_1 ATttaataaaacAA
50 ttaaaataaaaatt 1194 1207 2-10-2 50_1 TTaaaataaaaaTT
51 tttaaaataaaaat 1195 1208 2-10-2 51_1 TTtaaaataaaaAT
52 ctttaaaataaaaa 1196 1209 2-10-2 52_1 CTttaaaataaaAA
53 tctttaaaataaaa 1197 1210 2-10-2 53_1 TCtttaaaataaAA
54 atctttaaaataaa 1198 1211 2-10-2 54_1 ATctttaaaataAA
55 catctttaaaataa 1199 1212 2-10-2 55_1 CAtctttaaaatAA
56 ccatctttaaaata 1200 1213 2-10-2 56_1 CCatctttaaaaTA
57 tctaacttaataaa 2886 2899 2-10-2 57_1 TCtaacttaataAA
58 ttctaacttaataa 2887 2900 2-10-2 58_1 TTctaacttaatAA
59 attctaacttaata 2888 2901 2-10-2 59_1 ATtctaacttaaTA
60 cattctaacttaat 2889 2902 2-10-2 60_1 CAttctaacttaAT
61 acattctaacttaa 2890 2903 2-10-2 61_1 ACattctaacttAA
62 tacattctaactta 2891 2904 2-10-2 62_1 TAcattctaactTA
63 ttacattctaactt 2892 2905 2-10-2 63_1 TTacattctaacTT
64 tttacattctaact 2893 2906 2-10-2 64_1 TTtacattctaaCT
65 ttttacattctaac 2894 2907 2-10-2 65_1 TTttacattctaAC
66 tttttacattctaa 2895 2908 2-10-2 66_1 TTtttacattctAA
67 gtttttacattcta 2896 2909 2-10-2 67_1 GTttttacattcTA
68 tgtttttacattct 2897 2910 2-10-2 68_1 TGtttttacattCT
69 ctgtttttacattc 2898 2911 2-10-2 69_1 CTgtttttacatTC
70 ttcaaatatttatt 2969 2982 2-10-2 70_1 TTcaaatatttaTT
71 attcaaatatttat 2970 2983 2-10-2 71_1 ATtcaaatatttAT
72 cattcaaatattta 2971 2984 2-10-2 72_1 CAttcaaatattTA
73 ccattcaaatattt 2972 2985 2-10-2 73_1 CCattcaaatatTT
74 cccattcaaatatt 2973 2986 2-10-2 74_1 CCcattcaaataTT
75 ccccattcaaatat 2974 2987 2-10-2 75_1 CCccattcaaatAT
76 gccccattcaaata 2975 2988 2-10-2 76_1 GCcccattcaaaTA
77 tatacatttttttc 3173 3186 2-10-2 77_1 TAtacattttttTC
78 atatacattttttt 3174 3187 2-10-2 78_1 ATatacatttttTT
79 tatatacatttttt 3175 3188 2-10-2 79_1 TAtatacattttTT
80 atatatacattttt 3176 3189 2-10-2 80_1 ATatatacatttTT
81 aatatatacatttt 3177 3190 2-10-2 81_1 AAtatatacattTT
82 aaatatatacattt 3178 3191 2-10-2 82_1 AAatatatacatTT
83 caaatatatacatt 3179 3192 2-10-2 83_1 CAaatatatacaTT
84 tcaaatatatacat 3180 3193 2-10-2 84_1 TCaaatatatacAT
85 ttcaaatatataca 3181 3194 2-10-2 85_1 TTcaaatatataCA
86 attcaaatatatac 3182 3195 2-10-2 86_1 ATtcaaatatatAC
87 cattcaaatatata 3183 3196 2-10-2 87_1 CAttcaaatataTA
88 ccattcaaatatat 3184 3197 2-10-2 88_1 CCattcaaatatAT
89 tccattcaaatata 3185 3198 2-10-2 89_1 TCcattcaaataTA
90 atccattcaaatat 3186 3199 2-10-2 90_1 ATccattcaaatAT
91 tatccattcaaata 3187 3200 2-10-2 91_1 TAtccattcaaaTA
92 ttatccattcaaat 3188 3201 2-10-2 92_1 TTatccattcaaAT
93 tttatccattcaaa 3189 3202 2-10-2 93_1 TTtatccattcaAA
94 ctttatccattcaa 3190 3203 2-10-2 94_1 CTttatccattcAA
95 tctttatccattca 3191 3204 2-10-2 95_1 TCtttatccattCA
96 ctctttatccattc 3192 3205 2-10-2 96_1 CTctttatccatTC
97 tctctttatccatt 3193 3206 2-10-2 97_1 TCtctttatccaTT
98 ccatatatatctca 3221 3234 2-10-2 98_1 CCatatatatctCA
99 accatatatatctc 3222 3235 2-10-2 99_1 ACcatatatatcTC
100 caccatatatatct 3223 3236 2-10-2 100_1 CAccatatatatCT
101 gcaccatatatatc 3224 3237 2-10-2 101_1 GCaccatatataTC
102 agcaccatatatat 3225 3238 2-10-2 102_1 AGcaccatatatAT
103 cagcaccatatata 3226 3239 2-10-2 103_1 CAgcaccatataTA
104 acagcaccatatat 3227 3240 2-10-2 104_1 ACagcaccatatAT
105 aacagcaccatata 3228 3241 2-10-2 105_1 AAcagcaccataTA
106 aaaacaaacaacaa 3462 3475 2-10-2 106_1 AAaacaaacaacAA
107 taaaacaaacaaca 3463 3476 2-10-2 107_1 TAaaacaaacaaCA
108 ctaaaacaaacaac 3464 3477 2-10-2 108_1 CTaaaacaaacaAC
109 actaaaacaaacaa 3465 3478 2-10-2 109_1 ACtaaaacaaacAA
110 aactaaaacaaaca 3466 3479 2-10-2 110_1 AActaaaacaaaCA
111 gaactaaaacaaac 3467 3480 2-10-2 111_1 GAactaaaacaaAC
112 agaactaaaacaaa 3468 3481 2-10-2 112_1 AGaactaaaacaAA
113 cagaactaaaacaa 3469 3482 2-10-2 113_1 CAgaactaaaacAA
114 ccagaactaaaaca 3470 3483 2-10-2 114_1 CCagaactaaaaCA
115 accagaactaaaac 3471 3484 2-10-2 115_1 ACcagaactaaaAC
116 atgttattatcccc 3882 3895 2-10-2 116_1 ATgttattatccCC
117 tatgttattatccc 3883 3896 2-10-2 117_1 TAtgttattatcCC
118 ctatgttattatcc 3884 3897 2-10-2 118_1 CTatgttattatCC
119 tctatgttattatc 3885 3898 2-10-2 119_1 TCtatgttattaTC
120 tacactctaactct 3908 3921 2-10-2 120_1 TAcactctaactCT
121 ctacactctaactc 3909 3922 2-10-2 121_1 CTacactctaacTC
122 tctacactctaact 3910 3923 2-10-2 122_1 TCtacactctaaCT
123 ctctacactctaac 3911 3924 2-10-2 123_1 CTctacactctaAC
124 tctctacactctaa 3912 3925 2-10-2 124_1 TCtctacactctAA
125 ttctctacactcta 3913 3926 2-10-2 125_1 TTctctacactcTA
126 cttctctacactct 3914 3927 2-10-2 126_1 CTtctctacactCT
127 ccttctctacactc 3915 3928 2-10-2 127_1 CCttctctacacTC
128 tacaacacaaatca 4102 4115 2-10-2 128_1 TAcaacacaaatCA
129 ctacaacacaaatc 4103 4116 2-10-2 129_1 CTacaacacaaaTC
130 actacaacacaaat 4104 4117 2-10-2 130_1 ACtacaacacaaAT
131 aactacaacacaaa 4105 4118 2-10-2 131_1 AActacaacacaAA
132 taactacaacacaa 4106 4119 2-10-2 132_1 TAactacaacacAA
133 ctaactacaacaca 4107 4120 2-10-2 133_1 CTaactacaacaCA
134 actaactacaacac 4108 4121 2-10-2 134_1 ACtaactacaacAC
135 tactaactacaaca 4109 4122 2-10-2 135_1 TActaactacaaCA
136 ctactaactacaac 4110 4123 2-10-2 136_1 CTactaactacaAC
137 actactaactacaa 4111 4124 2-10-2 137_1 ACtactaactacAA
138 cactactaactaca 4112 4125 2-10-2 138_1 CActactaactaCA
139 acactactaactac 4113 4126 2-10-2 139_1 ACactactaactAC
140 gacactactaacta 4114 4127 2-10-2 140_1 GAcactactaacTA
141 agacactactaact 4115 4128 2-10-2 141_1 AGacactactaaCT
142 tttacccccaacct 4173 4186 2-10-2 142_1 TTtacccccaacCT
143 atttacccccaacc 4174 4187 2-10-2 143_1 ATttacccccaaCC
144 catttacccccaac 4175 4188 2-10-2 144_1 CAtttacccccaAC
145 tcatttacccccaa 4176 4189 2-10-2 145_1 TCatttacccccAA
146 atcatttaccccca 4177 4190 2-10-2 146_1 ATcatttaccccCA
147 aatcatttaccccc 4178 4191 2-10-2 147_1 AAtcatttacccCC
148 aaatcatttacccc 4179 4192 2-10-2 148_1 AAatcatttaccCC
149 caaatcatttaccc 4180 4193 2-10-2 149_1 CAaatcatttacCC
150 ccaaatcatttacc 4181 4194 2-10-2 150_1 CCaaatcatttaCC
151 accaaatcatttac 4182 4195 2-10-2 151_1 ACcaaatcatttAC
152 taccaaatcattta 4183 4196 2-10-2 152_1 TAccaaatcattTA
153 ctaccaaatcattt 4184 4197 2-10-2 153_1 CTaccaaatcatTT
154 gctaccaaatcatt 4185 4198 2-10-2 154_1 GCtaccaaatcaTT
155 tgctaccaaatcat 4186 4199 2-10-2 155_1 TGctaccaaatcAT
156 ctgctaccaaatca 4187 4200 2-10-2 156_1 CTgctaccaaatCA
157 actgctaccaaatc 4188 4201 2-10-2 157_1 ACtgctaccaaaTC
158 aactgctaccaaat 4189 4202 2-10-2 158_1 AActgctaccaaAT
159 aagctttaatcaaa 5102 5115 2-10-2 159_1 AAgctttaatcaAA
160 caagctttaatcaa 5103 5116 2-10-2 160_1 CAagctttaatcAA
161 tcaagctttaatca 5104 5117 2-10-2 161_1 TCaagctttaatCA
162 atcaagctttaatc 5105 5118 2-10-2 162_1 ATcaagctttaaTC
163 catcaagctttaat 5106 5119 2-10-2 163_1 CAtcaagctttaAT
164 tcaaactatcccca 5131 5144 2-10-2 164_1 TCaaactatcccCA
165 ctcaaactatcccc 5132 5145 2-10-2 165_1 CTcaaactatccCC
166 tctcaaactatccc 5133 5146 2-10-2 166_1 TCtcaaactatcCC
167 atctcaaactatcc 5134 5147 2-10-2 167_1 ATctcaaactatCC
168 tatctcaaactatc 5135 5148 2-10-2 168_1 TAtctcaaactaTC
169 ttatctcaaactat 5136 5149 2-10-2 169_1 TTatctcaaactAT
170 cttatctcaaacta 5137 5150 2-10-2 170_1 CTtatctcaaacTA
171 ccttatctcaaact 5138 5151 2-10-2 171_1 CCttatctcaaaCT
172 cccttatctcaaac 5139 5152 2-10-2 172_1 CCcttatctcaaAC
173 gcccttatctcaaa 5140 5153 2-10-2 173_1 GCccttatctcaAA
174 tgcccttatctcaa 5141 5154 2-10-2 174_1 TGcccttatctcAA
175 caaacttcatcaaa 5540 5553 2-10-2 175_1 CAaacttcatcaAA
176 tcaaacttcatcaa 5541 5554 2-10-2 176_1 TCaaacttcatcAA
177 atcaaacttcatca 5542 5555 2-10-2 177_1 ATcaaacttcatCA
178 aatcaaacttcatc 5543 5556 2-10-2 178_1 AAtcaaacttcaTC
179 aaatcaaacttcat 5544 5557 2-10-2 179_1 AAatcaaacttcAT
180 gaaatcaaacttca 5545 5558 2-10-2 180_1 GAaatcaaacttCA
181 tgaaatcaaacttc 5546 5559 2-10-2 181_1 TGaaatcaaactTC
182 ttgaaatcaaactt 5547 5560 2-10-2 182_1 TTgaaatcaaacTT
183 aacacaaatttcct 5693 5706 2-10-2 183_1 AAcacaaatttcCT
184 taacacaaatttcc 5694 5707 2-10-2 184_1 TAacacaaatttCC
185 ctaacacaaatttc 5695 5708 2-10-2 185_1 CTaacacaaattTC
186 gctaacacaaattt 5696 5709 2-10-2 186_1 GCtaacacaaatTT
187 tgctaacacaaatt 5697 5710 2-10-2 187_1 TGctaacacaaaTT
188 ttgctaacacaaat 5698 5711 2-10-2 188_1 TTgctaacacaaAT
189 tttgctaacacaaa 5699 5712 2-10-2 189_1 TTtgctaacacaAA
190 ctttgctaacacaa 5700 5713 2-10-2 190_1 CTttgctaacacAA
191 cctttgctaacaca 5701 5714 2-10-2 191_1 CCtttgctaacaCA
192 taactaataattat 6417 6430 2-10-2 192_1 TAactaataattAT
193 ataactaataatta 6418 6431 2-10-2 193_1 ATaactaataatTA
194 aataactaataatt 6419 6432 2-10-2 194_1 AAtaactaataaTT
195 taataactaataat 6420 6433 2-10-2 195_1 TAataactaataAT
196 ataataactaataa 6421 6434 2-10-2 196_1 ATaataactaatAA
197 aataataactaata 6422 6435 2-10-2 197_1 AAtaataactaaTA
198 caataataactaat 6423 6436 2-10-2 198_1 CAataataactaAT
199 ccaataataactaa 6424 6437 2-10-2 199_1 CCaataataactAA
200 accaataataacta 6425 6438 2-10-2 200_1 ACcaataataacTA
201 aaccaataataact 6426 6439 2-10-2 201_1 AAccaataataaCT
202 taaccaataataac 6427 6440 2-10-2 202_1 TAaccaataataAC
203 ataaccaataataa 6428 6441 2-10-2 203_1 ATaaccaataatAA
204 tataaccaataata 6429 6442 2-10-2 204_1 TAtaaccaataaTA
205 gtataaccaataat 6430 6443 2-10-2 205_1 GTataaccaataAT
206 acatcacacaattt 7415 7428 2-10-2 206_1 ACatcacacaatTT
207 gacatcacacaatt 7416 7429 2-10-2 207_1 GAcatcacacaaTT
208 tgacatcacacaat 7417 7430 2-10-2 208_1 TGacatcacacaAT
209 ctgacatcacacaa 7418 7431 2-10-2 209_1 CTgacatcacacAA
210 tctgacatcacaca 7419 7432 2-10-2 210_1 TCtgacatcacaCA
211 atctgacatcacac 7420 7433 2-10-2 211_1 ATctgacatcacAC
212 ttccttaacccaac 7436 7449 2-10-2 212_1 TTccttaacccaAC
213 attccttaacccaa 7437 7450 2-10-2 213_1 ATtccttaacccAA
214 tattccttaaccca 7438 7451 2-10-2 214_1 TAttccttaaccCA
215 ctattccttaaccc 7439 7452 2-10-2 215_1 CTattccttaacCC
216 tctattccttaacc 7440 7453 2-10-2 216_1 TCtattccttaaCC
217 gtctattccttaac 7441 7454 2-10-2 217_1 GTctattccttaAC
218 catcaaatctcata 8609 8622 2-10-2 218_1 CAtcaaatctcaTA
219 gcatcaaatctcat 8610 8623 2-10-2 219_1 GCatcaaatctcAT
220 tgcatcaaatctca 8611 8624 2-10-2 220_1 TGcatcaaatctCA
221 atgcatcaaatctc 8612 8625 2-10-2 221_1 ATgcatcaaatcTC
222 aatgcatcaaatct 8613 8626 2-10-2 222_1 AAtgcatcaaatCT
223 attttaaacaaaca 8637 8650 2-10-2 223_1 ATtttaaacaaaCA
224 tattttaaacaaac 8638 8651 2-10-2 224_1 TAttttaaacaaAC
225 ttattttaaacaaa 8639 8652 2-10-2 225_1 TTattttaaacaAA
226 attattttaaacaa 8640 8653 2-10-2 226_1 ATtattttaaacAA
227 aattattttaaaca 8641 8654 2-10-2 227_1 AAttattttaaaCA
228 gaattattttaaac 8642 8655 2-10-2 228_1 GAattattttaaAC
229 ttttacaaatctac 8693 8706 2-10-2 229_1 TTttacaaatctAC
230 attttacaaatcta 8694 8707 2-10-2 230_1 ATtttacaaatcTA
231 tattttacaaatct 8695 8708 2-10-2 231_1 TAttttacaaatCT
232 ttattttacaaatc 8696 8709 2-10-2 232_1 TTattttacaaaTC
233 tttattttacaaat 8697 8710 2-10-2 233_1 TTtattttacaaAT
234 atttattttacaaa 8698 8711 2-10-2 234_1 ATttattttacaAA
235 catttattttacaa 8699 8712 2-10-2 235_1 CAtttattttacAA
236 acatttattttaca 8700 8713 2-10-2 236_1 ACatttattttaCA
237 aacatttattttac 8701 8714 2-10-2 237_1 AAcatttattttAC
238 taacatttatttta 8702 8715 2-10-2 238_1 TAacatttatttTA
239 aatttaatcattaa 9391 9404 2-10-2 239_1 AAtttaatcattAA
240 taatttaatcatta 9392 9405 2-10-2 240_1 TAatttaatcatTA
241 ataatttaatcatt 9393 9406 2-10-2 241_1 ATaatttaatcaTT
242 aataatttaatcat 9394 9407 2-10-2 242_1 AAtaatttaatcAT
243 aaataatttaatca 9395 9408 2-10-2 243_1 AAataatttaatCA
244 taaataatttaatc 9396 9409 2-10-2 244_1 TAaataatttaaTC
245 ctaaataatttaat 9397 9410 2-10-2 245_1 CTaaataatttaAT
246 cctaaataatttaa 9398 9411 2-10-2 246_1 CCtaaataatttAA
247 ccctaaataattta 9399 9412 2-10-2 247_1 CCctaaataattTA
248 cccctaaataattt 9400 9413 2-10-2 248_1 CCcctaaataatTT
249 tcccctaaataatt 9401 9414 2-10-2 249_1 TCccctaaataaTT
250 tatataaaaatcta 10958 10971 2-10-2 250_1 TAtataaaaatcTA
251 ctatataaaaatct 10959 10972 2-10-2 251_1 CTatataaaaatCT
252 tctatataaaaatc 10960 10973 2-10-2 252_1 TCtatataaaaaTC
253 atctatataaaaat 10961 10974 2-10-2 253_1 ATctatataaaaAT
254 tatctatataaaaa 10962 10975 2-10-2 254_1 TAtctatataaaAA
255 ttatctatataaaa 10963 10976 2-10-2 255_1 TTatctatataaAA
256 tttatctatataaa 10964 10977 2-10-2 256_1 TTtatctatataAA
257 ccccactctaatat 11001 11014 2-10-2 257_1 CCccactctaatAT
258 gccccactctaata 11002 11015 2-10-2 258_1 GCcccactctaaTA
259 tgccccactctaat 11003 11016 2-10-2 259_1 TGccccactctaAT
260 atgccccactctaa 11004 11017 2-10-2 260_1 ATgccccactctAA
261 aatgccccactcta 11005 11018 2-10-2 261_1 AAtgccccactcTA
262 aaatgccccactct 11006 11019 2-10-2 262_1 AAatgccccactCT
263 taaatgccccactc 11007 11020 2-10-2 263_1 TAaatgccccacTC
264 ttaaatgccccact 11008 11021 2-10-2 264_1 TTaaatgccccaCT
265 atataaccaccaaa 11546 11559 2-10-2 265_1 ATataaccaccaAA
266 tatataaccaccaa 11547 11560 2-10-2 266_1 TAtataaccaccAA
267 atatataaccacca 11548 11561 2-10-2 267_1 ATatataaccacCA
268 tatatataaccacc 11549 11562 2-10-2 268_1 TAtatataaccaCC
269 atatatataaccac 11550 11563 2-10-2 269_1 ATatatataaccAC
270 aaaattcactatct 11942 11955 2-10-2 270_1 AAaattcactatCT
271 gaaaattcactatc 11943 11956 2-10-2 271_1 GAaaattcactaTC
272 tgaaaattcactat 11944 11957 2-10-2 272_1 TGaaaattcactAT
273 ctgaaaattcacta 11945 11958 2-10-2 273_1 CTgaaaattcacTA
274 tctgaaaattcact 11946 11959 2-10-2 274_1 TCtgaaaattcaCT
275 tactatatacatct 12176 12189 2-10-2 275_1 TActatatacatCT
276 ctactatatacatc 12177 12190 2-10-2 276_1 CTactatatacaTC
277 tctactatatacat 12178 12191 2-10-2 277_1 TCtactatatacAT
278 gtctactatataca 12179 12192 2-10-2 278_1 GTctactatataCA
279 agtctactatatac 12180 12193 2-10-2 279_1 AGtctactatatAC
280 tagtctactatata 12181 12194 2-10-2 280_1 TAgtctactataTA
281 ctagtctactatat 12182 12195 2-10-2 281_1 CTagtctactatAT
282 actagtctactata 12183 12196 2-10-2 282_1 ACtagtctactaTA
283 aactagtctactat 12184 12197 2-10-2 283_1 AActagtctactAT
284 tattctacccataa 12211 12224 2-10-2 284_1 TAttctacccatAA
285 atattctacccata 12212 12225 2-10-2 285_1 ATattctacccaTA
286 tatattctacccat 12213 12226 2-10-2 286_1 TAtattctacccAT
287 gtatattctaccca 12214 12227 2-10-2 287_1 GTatattctaccCA
288 tgtatattctaccc 12215 12228 2-10-2 288_1 TGtatattctacCC
289 atgtatattctacc 12216 12229 2-10-2 289_1 ATgtatattctaCC
290 ccacacaattccta 12254 12267 2-10-2 290_1 CCacacaattccTA
291 accacacaattcct 12255 12268 2-10-2 291_1 ACcacacaattcCT
292 aaccacacaattcc 12256 12269 2-10-2 292_1 AAccacacaattCC
293 aaaccacacaattc 12257 12270 2-10-2 293_1 AAaccacacaatTC
294 aaaaccacacaatt 12258 12271 2-10-2 294_1 AAaaccacacaaTT
295 gaaaaccacacaat 12259 12272 2-10-2 295_1 GAaaaccacacaAT
296 agaaaaccacacaa 12260 12273 2-10-2 296_1 AGaaaaccacacAA
297 cagaaaaccacaca 12261 12274 2-10-2 297_1 CAgaaaaccacaCA
298 ccagaaaaccacac 12262 12275 2-10-2 298_1 CCagaaaaccacAC
299 tccagaaaaccaca 12263 12276 2-10-2 299_1 TCcagaaaaccaCA
300 aaatccataaaaaa 12327 12340 2-10-2 300_1 AAatccataaaaAA
301 taaatccataaaaa 12328 12341 2-10-2 301_1 TAaatccataaaAA
302 ctaaatccataaaa 12329 12342 2-10-2 302_1 CTaaatccataaAA
303 actaaatccataaa 12330 12343 2-10-2 303_1 ACtaaatccataAA
304 cactaaatccataa 12331 12344 2-10-2 304_1 CActaaatccatAA
305 tcactaaatccata 12332 12345 2-10-2 305_1 TCactaaatccaTA
306 atcactaaatccat 12333 12346 2-10-2 306_1 ATcactaaatccAT
307 tatcactaaatcca 12334 12347 2-10-2 307_1 TAtcactaaatcCA
308 atatcactaaatcc 12335 12348 2-10-2 308_1 ATatcactaaatCC
309 tatatcactaaatc 12336 12349 2-10-2 309_1 TAtatcactaaaTC
310 atatatcactaaat 12337 12350 2-10-2 310_1 ATatatcactaaAT
311 gatatatcactaaa 12338 12351 2-10-2 311_1 GAtatatcactaAA
312 agatatatcactaa 12339 12352 2-10-2 312_1 AGatatatcactAA
313 tagatatatcacta 12340 12353 2-10-2 313_1 TAgatatatcacTA
314 tataaatttctcta 12690 12703 2-10-2 314_1 TAtaaatttctcTA
315 atataaatttctct 12691 12704 2-10-2 315_1 ATataaatttctCT
316 tatataaatttctc 12692 12705 2-10-2 316_1 TAtataaatttcTC
317 atatataaatttct 12693 12706 2-10-2 317_1 ATatataaatttCT
318 catatataaatttc 12694 12707 2-10-2 318_1 CAtatataaattTC
319 tcatatataaattt 12695 12708 2-10-2 319_1 TCatatataaatTT
320 ctccattccaaatt 12739 12752 2-10-2 320_1 CTccattccaaaTT
321 actccattccaaat 12740 12753 2-10-2 321_1 ACtccattccaaAT
322 cactccattccaaa 12741 12754 2-10-2 322_1 CActccattccaAA
323 ccactccattccaa 12742 12755 2-10-2 323_1 CCactccattccAA
324 accactccattcca 12743 12756 2-10-2 324_1 ACcactccattcCA
325 aaccactccattcc 12744 12757 2-10-2 325_1 AAccactccattCC
326 aaaccactccattc 12745 12758 2-10-2 326_1 AAaccactccatTC
327 tcacacaaccatat 13155 13168 2-10-2 327_1 TCacacaaccatAT
328 atcacacaaccata 13156 13169 2-10-2 328_1 ATcacacaaccaTA
329 gatcacacaaccat 13157 13170 2-10-2 329_1 GAtcacacaaccAT
330 agatcacacaacca 13158 13171 2-10-2 330_1 AGatcacacaacCA
331 aagatcacacaacc 13159 13172 2-10-2 331_1 AAgatcacacaaCC
332 aaagatcacacaac 13160 13173 2-10-2 332_1 AAagatcacacaAC
333 aaaagatcacacaa 13161 13174 2-10-2 333_1 AAaagatcacacAA
334 taaaagatcacaca 13162 13175 2-10-2 334_1 TAaaagatcacaCA
335 ttcatttctaaaaa 13297 13310 2-10-2 335_1 TTcatttctaaaAA
336 tttcatttctaaaa 13298 13311 2-10-2 336_1 TTtcatttctaaAA
337 ctttcatttctaaa 13299 13312 2-10-2 337_1 CTttcatttctaAA
338 tctttcatttctaa 13300 13313 2-10-2 338_1 TCtttcatttctAA
339 atctttcatttcta 13301 13314 2-10-2 339_1 ATctttcatttcTA
340 gatctttcatttct 13302 13315 2-10-2 340_1 GAtctttcatttCT
341 tgatctttcatttc 13303 13316 2-10-2 341_1 TGatctttcattTC
342 atgatctttcattt 13304 13317 2-10-2 342_1 ATgatctttcatTT
343 ataaaaacccactt 13990 14003 2-10-2 343_1 ATaaaaacccacTT
344 cataaaaacccact 13991 14004 2-10-2 344_1 CAtaaaaacccaCT
345 acataaaaacccac 13992 14005 2-10-2 345_1 ACataaaaacccAC
346 cacataaaaaccca 13993 14006 2-10-2 346_1 CAcataaaaaccCA
347 tcacataaaaaccc 13994 14007 2-10-2 347_1 TCacataaaaacCC
348 atcacataaaaacc 13995 14008 2-10-2 348_1 ATcacataaaaaCC
349 catcacataaaaac 13996 14009 2-10-2 349_1 CAtcacataaaaAC
350 tcatcacataaaaa 13997 14010 2-10-2 350_1 TCatcacataaaAA
351 gtcatcacataaaa 13998 14011 2-10-2 351_1 GTcatcacataaAA
352 agtcatcacataaa 13999 14012 2-10-2 352_1 AGtcatcacataAA
353 tagtcatcacataa 14000 14013 2-10-2 353_1 TAgtcatcacatAA
354 atagtcatcacata 14001 14014 2-10-2 354_1 ATagtcatcacaTA
355 catagtcatcacat 14002 14015 2-10-2 355_1 CAtagtcatcacAT
356 taaatacaaatcta 14041 14054 2-10-2 356_1 TAaatacaaatcTA
357 ctaaatacaaatct 14042 14055 2-10-2 357_1 CTaaatacaaatCT
358 gctaaatacaaatc 14043 14056 2-10-2 358_1 GCtaaatacaaaTC
359 tgctaaatacaaat 14044 14057 2-10-2 359_1 TGctaaatacaaAT
360 atgctaaatacaaa 14045 14058 2-10-2 360_1 ATgctaaatacaAA
361 tatgctaaatacaa 14046 14059 2-10-2 361_1 TAtgctaaatacAA
362 aatcttacactaaa 14119 14132 2-10-2 362_1 AAtcttacactaAA
363 taatcttacactaa 14120 14133 2-10-2 363_1 TAatcttacactAA
364 ataatcttacacta 14121 14134 2-10-2 364_1 ATaatcttacacTA
365 aataatcttacact 14122 14135 2-10-2 365_1 AAtaatcttacaCT
366 gaataatcttacac 14123 14136 2-10-2 366_1 GAataatcttacAC
367 tgaataatcttaca 14124 14137 2-10-2 367_1 TGaataatcttaCA
368 atgaataatcttac 14125 14138 2-10-2 368_1 ATgaataatcttAC
369 caaaattctaataa 14257 14270 2-10-2 369_1 CAaaattctaatAA
370 tcaaaattctaata 14258 14271 2-10-2 370_1 TCaaaattctaaTA
371 ttcaaaattctaat 14259 14272 2-10-2 371_1 TTcaaaattctaAT
372 attcaaaattctaa 14260 14273 2-10-2 372_1 ATtcaaaattctAA
373 gattcaaaattcta 14261 14274 2-10-2 373_1 GAttcaaaattcTA
374 agattcaaaattct 14262 14275 2-10-2 374_1 AGattcaaaattCT
375 attactacaaccaa 14570 14583 2-10-2 375_1 ATtactacaaccAA
376 cattactacaacca 14571 14584 2-10-2 376_1 CAttactacaacCA
377 ccattactacaacc 14572 14585 2-10-2 377_1 CCattactacaaCC
378 accattactacaac 14573 14586 2-10-2 378_1 ACcattactacaAC
379 aaccattactacaa 14574 14587 2-10-2 379_1 AAccattactacAA
380 aaaccattactaca 14575 14588 2-10-2 380_1 AAaccattactaCA
381 gaaaccattactac 14576 14589 2-10-2 381_1 GAaaccattactAC
382 tgaaaccattacta 14577 14590 2-10-2 382_1 TGaaaccattacTA
383 atgaaaccattact 14578 14591 2-10-2 383_1 ATgaaaccattaCT
384 atttttaaaaacac 15778 15791 2-10-2 384_1 ATttttaaaaacAC
385 aatttttaaaaaca 15779 15792 2-10-2 385_1 AAtttttaaaaaCA
386 taatttttaaaaac 15780 15793 2-10-2 386_1 TAatttttaaaaAC
387 ataatttttaaaaa 15781 15794 2-10-2 387_1 ATaatttttaaaAA
388 cataatttttaaaa 15782 15795 2-10-2 388_1 CAtaatttttaaAA
389 tcataatttttaaa 15783 15796 2-10-2 389_1 TCataatttttaAA
390 atcataatttttaa 15784 15797 2-10-2 390_1 ATcataatttttAA
391 ctttatacaaaaaa 15814 15827 2-10-2 391_1 CTttatacaaaaAA
392 actttatacaaaaa 15815 15828 2-10-2 392_1 ACtttatacaaaAA
393 tactttatacaaaa 15816 15829 2-10-2 393_1 TActttatacaaAA
394 ttactttatacaaa 15817 15830 2-10-2 394_1 TTactttatacaAA
395 cttactttatacaa 15818 15831 2-10-2 395_1 CTtactttatacAA
396 gcttactttataca 15819 15832 2-10-2 396_1 GCttactttataCA
397 tgcttactttatac 15820 15833 2-10-2 397_1 TGcttactttatAC
398 tctcaaaataataa 15877 15890 2-10-2 398_1 TCtcaaaataatAA
399 ctctcaaaataata 15878 15891 2-10-2 399_1 CTctcaaaataaTA
400 tctctcaaaataat 15879 15892 2-10-2 400_1 TCtctcaaaataAT
401 atctctcaaaataa 15880 15893 2-10-2 401_1 ATctctcaaaatAA
402 aatctctcaaaata 15881 15894 2-10-2 402_1 AAtctctcaaaaTA
403 aaatctctcaaaat 15882 15895 2-10-2 403_1 AAatctctcaaaAT
404 taaatctctcaaaa 15883 15896 2-10-2 404_1 TAaatctctcaaAA
405 ttaaatctctcaaa 15884 15897 2-10-2 405_1 TTaaatctctcaAA
406 tttaaatctctcaa 15885 15898 2-10-2 406_1 TTtaaatctctcAA
407 ttttaaatctctca 15886 15899 2-10-2 407_1 TTttaaatctctCA
408 taatactttttcca 16080 16093 2-10-2 408_1 TAatactttttcCA
409 ttaatactttttcc 16081 16094 2-10-2 409_1 TTaatactttttCC
410 gttaatactttttc 16082 16095 2-10-2 410_1 GTtaatacttttTC
411 tgttaatacttttt 16083 16096 2-10-2 411_1 TGttaatactttTT
412 atgttaatactttt 16084 16097 2-10-2 412_1 ATgttaatacttTT
413 ttatcactaccaca 16187 16200 2-10-2 413_1 TTatcactaccaCA
414 tttatcactaccac 16188 16201 2-10-2 414_1 TTtatcactaccAC
415 atttatcactacca 16189 16202 2-10-2 415_1 ATttatcactacCA
416 catttatcactacc 16190 16203 2-10-2 416_1 CAtttatcactaCC
417 tcatttatcactac 16191 16204 2-10-2 417_1 TCatttatcactAC
418 atcatttatcacta 16192 16205 2-10-2 418_1 ATcatttatcacTA
419 catcatttatcact 16193 16206 2-10-2 419_1 CAtcatttatcaCT
420 acatcatttatcac 16194 16207 2-10-2 420_1 ACatcatttatcAC
421 aacatcatttatca 16195 16208 2-10-2 421_1 AAcatcatttatCA
422 taacatcatttatc 16196 16209 2-10-2 422_1 TAacatcatttaTC
423 ttaacatcatttat 16197 16210 2-10-2 423_1 TTaacatcatttAT
424 attaacatcattta 16198 16211 2-10-2 424_1 ATtaacatcattTA
425 aattaacatcattt 16199 16212 2-10-2 425_1 AAttaacatcatTT
426 taattaacatcatt 16200 16213 2-10-2 426_1 TAattaacatcaTT
427 ctaattaacatcat 16201 16214 2-10-2 427_1 CTaattaacatcAT
428 cctaattaacatca 16202 16215 2-10-2 428_1 CCtaattaacatCA
429 ccctaattaacatc 16203 16216 2-10-2 429_1 CCctaattaacaTC
430 gccctaattaacat 16204 16217 2-10-2 430_1 GCcctaattaacAT
431 ggccctaattaaca 16205 16218 2-10-2 431_1 GGccctaattaaCA
432 cggccctaattaac 16206 16219 2-10-2 432_1 CGgccctaattaAC
433 aaacacattttttt 16494 16507 2-10-2 433_1 AAacacatttttTT
434 taaacacatttttt 16495 16508 2-10-2 434_1 TAaacacattttTT
435 ataaacacattttt 16496 16509 2-10-2 435_1 ATaaacacatttTT
436 tataaacacatttt 16497 16510 2-10-2 436_1 TAtaaacacattTT
437 atataaacacattt 16498 16511 2-10-2 437_1 ATataaacacatTT
438 catataaacacatt 16499 16512 2-10-2 438_1 CAtataaacacaTT
439 acatataaacacat 16500 16513 2-10-2 439_1 ACatataaacacAT
440 aacatataaacaca 16501 16514 2-10-2 440_1 AAcatataaacaCA
441 taacatataaacac 16502 16515 2-10-2 441_1 TAacatataaacAC
442 ataacatataaaca 16503 16516 2-10-2 442_1 ATaacatataaaCA
443 tataacatataaac 16504 16517 2-10-2 443_1 TAtaacatataaAC
444 atataacatataaa 16505 16518 2-10-2 444_1 ATataacatataAA
445 catataacatataa 16506 16519 2-10-2 445_1 CAtataacatatAA
446 acatataacatata 16507 16520 2-10-2 446_1 ACatataacataTA
447 cacatataacatat 16508 16521 2-10-2 447_1 CAcatataacatAT
448 tcacatataacata 16509 16522 2-10-2 448_1 TCacatataacaTA
449 atcacatataacat 16510 16523 2-10-2 449_1 ATcacatataacAT
450 tatcacatataaca 16511 16524 2-10-2 450_1 TAtcacatataaCA
451 ctatcacatataac 16512 16525 2-10-2 451_1 CTatcacatataAC
452 actatcacatataa 16513 16526 2-10-2 452_1 ACtatcacatatAA
453 cactatcacatata 16514 16527 2-10-2 453_1 CActatcacataTA
454 gtccaacataactc 16834 16847 2-10-2 454_1 GTccaacataacTC
455 agtccaacataact 16835 16848 2-10-2 455_1 AGtccaacataaCT
456 cagtccaacataac 16836 16849 2-10-2 456_1 CAgtccaacataAC
457 tcagtccaacataa 16837 16850 2-10-2 457_1 TCagtccaacatAA
458 atcagtccaacata 16838 16851 2-10-2 458_1 ATcagtccaacaTA
459 tatcagtccaacat 16839 16852 2-10-2 459_1 TAtcagtccaacAT
460 aaaccctcccaaaa 16921 16934 2-10-2 460_1 AAaccctcccaaAA
461 taaaccctcccaaa 16922 16935 2-10-2 461_1 TAaaccctcccaAA
462 ttaaaccctcccaa 16923 16936 2-10-2 462_1 TTaaaccctcccAA
463 attaaaccctccca 16924 16937 2-10-2 463_1 ATtaaaccctccCA
464 cattaaaccctccc 16925 16938 2-10-2 464_1 CAttaaaccctcCC
465 acattaaaccctcc 16926 16939 2-10-2 465_1 ACattaaaccctCC
466 aacattaaaccctc 16927 16940 2-10-2 466_1 AAcattaaacccTC
467 aaacattaaaccct 16928 16941 2-10-2 467_1 AAacattaaaccCT
468 taaacattaaaccc 16929 16942 2-10-2 468_1 TAaacattaaacCC
469 ataaacattaaacc 16930 16943 2-10-2 469_1 ATaaacattaaaCC
470 tataaacattaaac 16931 16944 2-10-2 470_1 TAtaaacattaaAC
471 ctataaacattaaa 16932 16945 2-10-2 471_1 CTataaacattaAA
472 actataaacattaa 16933 16946 2-10-2 472_1 ACtataaacattAA
473 aactataaacatta 16934 16947 2-10-2 473_1 AActataaacatTA
474 aaactataaacatt 16935 16948 2-10-2 474_1 AAactataaacaTT
475 taaactataaacat 16936 16949 2-10-2 475_1 TAaactataaacAT
476 ttaaactataaaca 16937 16950 2-10-2 476_1 TTaaactataaaCA
477 tttaaactataaac 16938 16951 2-10-2 477_1 TTtaaactataaAC
478 ctttaaactataaa 16939 16952 2-10-2 478_1 CTttaaactataAA
479 gctttaaactataa 16940 16953 2-10-2 479_1 GCtttaaactatAA
480 tgctttaaactata 16941 16954 2-10-2 480_1 TGctttaaactaTA
481 cagcctatcaccac 18018 18031 2-10-2 481_1 CAgcctatcaccAC
482 acagcctatcacca 18019 18032 2-10-2 482_1 ACagcctatcacCA
483 cacagcctatcacc 18020 18033 2-10-2 483_1 CAcagcctatcaCC
484 tcacagcctatcac 18021 18034 2-10-2 484_1 TCacagcctatcAC
485 atcacagcctatca 18022 18035 2-10-2 485_1 ATcacagcctatCA
486 aatcacagcctatc 18023 18036 2-10-2 486_1 AAtcacagcctaTC
487 aaatcacagcctat 18024 18037 2-10-2 487_1 AAatcacagcctAT
488 caaatcacagccta 18025 18038 2-10-2 488_1 CAaatcacagccTA
489 ccaaatcacagcct 18026 18039 2-10-2 489_1 CCaaatcacagcCT
490 cccaaatcacagcc 18027 18040 2-10-2 490_1 CCcaaatcacagCC
491 acccaaatcacagc 18028 18041 2-10-2 491_1 ACccaaatcacaGC
492 cacccaaatcacag 18029 18042 2-10-2 492_1 CAcccaaatcacAG
493 tcacccaaatcaca 18030 18043 2-10-2 493_1 TCacccaaatcaCA
494 gtcacccaaatcac 18031 18044 2-10-2 494_1 GTcacccaaatcAC
495 cgtcacccaaatca 18032 18045 2-10-2 495_1 CGtcacccaaatCA
496 gcgtcacccaaatc 18033 18046 2-10-2 496_1 GCgtcacccaaaTC
497 agcgtcacccaaat 18034 18047 2-10-2 497_1 AGcgtcacccaaAT
498 atcctaaaatcact 18630 18643 2-10-2 498_1 ATcctaaaatcaCT
499 gatcctaaaatcac 18631 18644 2-10-2 499_1 GAtcctaaaatcAC
500 agatcctaaaatca 18632 18645 2-10-2 500_1 AGatcctaaaatCA
501 cagatcctaaaatc 18633 18646 2-10-2 501_1 CAgatcctaaaaTC
502 tcagatcctaaaat 18634 18647 2-10-2 502_1 TCagatcctaaaAT
503 aaaccaatcatcat 19107 19120 2-10-2 503_1 AAaccaatcatcAT
504 aaaaccaatcatca 19108 19121 2-10-2 504_1 AAaaccaatcatCA
505 taaaaccaatcatc 19109 19122 2-10-2 505_1 TAaaaccaatcaTC
506 gtaaaaccaatcat 19110 19123 2-10-2 506_1 GTaaaaccaatcAT
507 agtaaaaccaatca 19111 19124 2-10-2 507_1 AGtaaaaccaatCA
508 aagtaaaaccaatc 19112 19125 2-10-2 508_1 AAgtaaaaccaaTC
509 aaagtaaaaccaat 19113 19126 2-10-2 509_1 AAagtaaaaccaAT
510 catctctactaaaa 20214 20227 2-10-2 510_1 CAtctctactaaAA
511 ccatctctactaaa 20215 20228 2-10-2 511_1 CCatctctactaAA
512 tccatctctactaa 20216 20229 2-10-2 512_1 TCcatctctactAA
513 ttccatctctacta 20217 20230 2-10-2 513_1 TTccatctctacTA
514 cttccatctctact 20218 20231 2-10-2 514_1 CTtccatctctaCT
515 ccttccatctctac 20219 20232 2-10-2 515_1 CCttccatctctAC
516 cccttccatctcta 20220 20233 2-10-2 516_1 CCcttccatctcTA
517 acataacaaaccca 20555 20568 2-10-2 517_1 ACataacaaaccCA
518 tacataacaaaccc 20556 20569 2-10-2 518_1 TAcataacaaacCC
519 ctacataacaaacc 20557 20570 2-10-2 519_1 CTacataacaaaCC
520 actacataacaaac 20558 20571 2-10-2 520_1 ACtacataacaaAC
521 aactacataacaaa 20559 20572 2-10-2 521_1 AActacataacaAA
522 taactacataacaa 20560 20573 2-10-2 522_1 TAactacataacAA
523 ataactacataaca 20561 20574 2-10-2 523_1 ATaactacataaCA
524 aataactacataac 20562 20575 2-10-2 524_1 AAtaactacataAC
525 caataactacataa 20563 20576 2-10-2 525_1 CAataactacatAA
526 acaataactacata 20564 20577 2-10-2 526_1 ACaataactacaTA
527 cacaataactacat 20565 20578 2-10-2 527_1 CAcaataactacAT
528 tcacaataactaca 20566 20579 2-10-2 528_1 TCacaataactaCA
529 ttcacaataactac 20567 20580 2-10-2 529_1 TTcacaataactAC
530 attcacaataacta 20568 20581 2-10-2 530_1 ATtcacaataacTA
531 aattcacaataact 20569 20582 2-10-2 531_1 AAttcacaataaCT
532 gaattcacaataac 20570 20583 2-10-2 532_1 GAattcacaataAC
533 tgaattcacaataa 20571 20584 2-10-2 533_1 TGaattcacaatAA
534 ctaaaacaatctaa 22073 22086 2-10-2 534_1 CTaaaacaatctAA
535 cctaaaacaatcta 22074 22087 2-10-2 535_1 CCtaaaacaatcTA
536 acctaaaacaatct 22075 22088 2-10-2 536_1 ACctaaaacaatCT
537 tacctaaaacaatc 22076 22089 2-10-2 537_1 TAcctaaaacaaTC
538 atacctaaaacaat 22077 22090 2-10-2 538_1 ATacctaaaacaAT
539 tatacctaaaacaa 22078 22091 2-10-2 539_1 TAtacctaaaacAA
540 ctatacctaaaaca 22079 22092 2-10-2 540_1 CTatacctaaaaCA
541 gctatacctaaaac 22080 22093 2-10-2 541_1 GCtatacctaaaAC
542 ttgtaactaaaaat 22254 22267 2-10-2 542_1 TTgtaactaaaaAT
543 cttgtaactaaaaa 22255 22268 2-10-2 543_1 CTtgtaactaaaAA
544 ccttgtaactaaaa 22256 22269 2-10-2 544_1 CCttgtaactaaAA
545 cccttgtaactaaa 22257 22270 2-10-2 545_1 CCcttgtaactaAA
546 ccccttgtaactaa 22258 22271 2-10-2 546_1 CCccttgtaactAA
547 accccttgtaacta 22259 22272 2-10-2 547_1 ACcccttgtaacTA
548 caccccttgtaact 22260 22273 2-10-2 548_1 CAccccttgtaaCT
549 acaccccttgtaac 22261 22274 2-10-2 549_1 ACaccccttgtaAC
550 ttcatatatacatc 22424 22437 2-10-2 550_1 TTcatatatacaTC
551 cttcatatatacat 22425 22438 2-10-2 551_1 CTtcatatatacAT
552 ccttcatatataca 22426 22439 2-10-2 552_1 CCttcatatataCA
553 cccttcatatatac 22427 22440 2-10-2 553_1 CCcttcatatatAC
554 acccttcatatata 22428 22441 2-10-2 554_1 ACccttcatataTA
555 tacccttcatatat 22429 22442 2-10-2 555_1 TAcccttcatatAT
556 ttacccttcatata 22430 22443 2-10-2 556_1 TTacccttcataTA
557 attacccttcatat 22431 22444 2-10-2 557_1 ATtacccttcatAT
558 cattacccttcata 22432 22445 2-10-2 558_1 CAttacccttcaTA
559 acattacccttcat 22433 22446 2-10-2 559_1 ACattacccttcAT
560 tacattacccttca 22434 22447 2-10-2 560_1 TAcattacccttCA
561 tcttatacttacta 23204 23217 2-10-2 561_1 TCttatacttacTA
562 ttcttatacttact 23205 23218 2-10-2 562_1 TTcttatacttaCT
563 attcttatacttac 23206 23219 2-10-2 563_1 ATtcttatacttAC
564 gattcttatactta 23207 23220 2-10-2 564_1 GAttcttatactTA
565 tgattcttatactt 23208 23221 2-10-2 565_1 TGattcttatacTT
566 atgattcttatact 23209 23222 2-10-2 566_1 ATgattcttataCT
567 aacttcactaaaat 23616 23629 2-10-2 567_1 AActtcactaaaAT
568 aaacttcactaaaa 23617 23630 2-10-2 568_1 AAacttcactaaAA
569 taaacttcactaaa 23618 23631 2-10-2 569_1 TAaacttcactaAA
570 ataaacttcactaa 23619 23632 2-10-2 570_1 ATaaacttcactAA
571 aataaacttcacta 23620 23633 2-10-2 571_1 AAtaaacttcacTA
572 taataaacttcact 23621 23634 2-10-2 572_1 TAataaacttcaCT
573 ctaataaacttcac 23622 23635 2-10-2 573_1 CTaataaacttcAC
574 actaataaacttca 23623 23636 2-10-2 574_1 ACtaataaacttCA
575 aactaataaacttc 23624 23637 2-10-2 575_1 AActaataaactTC
576 aatcttctatttta 24108 24121 2-10-2 576_1 AAtcttctatttTA
577 caatcttctatttt 24109 24122 2-10-2 577_1 CAatcttctattTT
578 ccaatcttctattt 24110 24123 2-10-2 578_1 CCaatcttctatTT
579 accaatcttctatt 24111 24124 2-10-2 579_1 ACcaatcttctaTT
580 aaccaatcttctat 24112 24125 2-10-2 580_1 AAccaatcttctAT
581 caaccaatcttcta 24113 24126 2-10-2 581_1 CAaccaatcttcTA
582 gcaaccaatcttct 24114 24127 2-10-2 582_1 GCaaccaatcttCT
583 tgcaaccaatcttc 24115 24128 2-10-2 583_1 TGcaaccaatctTC
584 ctgcaaccaatctt 24116 24129 2-10-2 584_1 CTgcaaccaatcTT
585 actgcaaccaatct 24117 24130 2-10-2 585_1 ACtgcaaccaatCT
586 aactgcaaccaatc 24118 24131 2-10-2 586_1 AActgcaaccaaTC
587 taactgcaaccaat 24119 24132 2-10-2 587_1 TAactgcaaccaAT
588 tacaacacacatca 24335 24348 2-10-2 588_1 TAcaacacacatCA
589 atacaacacacatc 24336 24349 2-10-2 589_1 ATacaacacacaTC
590 aatacaacacacat 24337 24350 2-10-2 590_1 AAtacaacacacAT
591 gaatacaacacaca 24338 24351 2-10-2 591_1 GAatacaacacaCA
592 tgaatacaacacac 24339 24352 2-10-2 592_1 TGaatacaacacAC
593 atgaatacaacaca 24340 24353 2-10-2 593_1 ATgaatacaacaCA
594 cctaataaaatata 24499 24512 2-10-2 594_1 CCtaataaaataTA
595 tcctaataaaatat 24500 24513 2-10-2 595_1 TCctaataaaatAT
596 ctcctaataaaata 24501 24514 2-10-2 596_1 CTcctaataaaaTA
597 actcctaataaaat 24502 24515 2-10-2 597_1 ACtcctaataaaAT
598 tactcctaataaaa 24503 24516 2-10-2 598_1 TActcctaataaAA
599 ctactcctaataaa 24504 24517 2-10-2 599_1 CTactcctaataAA
600 actactcctaataa 24505 24518 2-10-2 600_1 ACtactcctaatAA
601 aactactcctaata 24506 24519 2-10-2 601_1 AActactcctaaTA
602 taactactcctaat 24507 24520 2-10-2 602_1 TAactactcctaAT
603 ataactactcctaa 24508 24521 2-10-2 603_1 ATaactactcctAA
604 tataactactccta 24509 24522 2-10-2 604_1 TAtaactactccTA
605 atataactactcct 24510 24523 2-10-2 605_1 ATataactactcCT
606 aatataactactcc 24511 24524 2-10-2 606_1 AAtataactactCC
607 aaatataactactc 24512 24525 2-10-2 607_1 AAatataactacTC
608 aaaatataactact 24513 24526 2-10-2 608_1 AAaatataactaCT
609 aaaaatataactac 24514 24527 2-10-2 609_1 AAaaatataactAC
610 taaaaatataacta 24515 24528 2-10-2 610_1 TAaaaatataacTA
611 gtaaaaatataact 24516 24529 2-10-2 611_1 GTaaaaatataaCT
612 agtaaaaatataac 24517 24530 2-10-2 612_1 AGtaaaaatataAC
613 actgatacccacaa 24593 24606 2-10-2 613_1 ACtgatacccacAA
614 aactgatacccaca 24594 24607 2-10-2 614_1 AActgatacccaCA
615 caactgatacccac 24595 24608 2-10-2 615_1 CAactgatacccAC
616 tcaactgataccca 24596 24609 2-10-2 616_1 TCaactgataccCA
617 atcactaaaaaact 24752 24765 2-10-2 617_1 ATcactaaaaaaCT
618 tatcactaaaaaac 24753 24766 2-10-2 618_1 TAtcactaaaaaAC
619 atatcactaaaaaa 24754 24767 2-10-2 619_1 ATatcactaaaaAA
620 tatatcactaaaaa 24755 24768 2-10-2 620_1 TAtatcactaaaAA
621 ttatatcactaaaa 24756 24769 2-10-2 621_1 TTatatcactaaAA
622 tttatatcactaaa 24757 24770 2-10-2 622_1 TTtatatcactaAA
623 gtttatatcactaa 24758 24771 2-10-2 623_1 GTttatatcactAA
624 aaacttttaattaa 24850 24863 2-10-2 624_1 AAacttttaattAA
625 caaacttttaatta 24851 24864 2-10-2 625_1 CAaacttttaatTA
626 tcaaacttttaatt 24852 24865 2-10-2 626_1 TCaaacttttaaTT
627 ttcaaacttttaat 24853 24866 2-10-2 627_1 TTcaaacttttaAT
628 cttcaaacttttaa 24854 24867 2-10-2 628_1 CTtcaaacttttAA
629 acttcaaactttta 24855 24868 2-10-2 629_1 ACttcaaactttTA
630 cacttcaaactttt 24856 24869 2-10-2 630_1 CActtcaaacttTT
631 ccacttcaaacttt 24857 24870 2-10-2 631_1 CCacttcaaactTT
632 cccacttcaaactt 24858 24871 2-10-2 632_1 CCcacttcaaacTT
633 acccacttcaaact 24859 24872 2-10-2 633_1 ACccacttcaaaCT
634 aacccacttcaaac 24860 24873 2-10-2 634_1 AAcccacttcaaAC
635 aaacccacttcaaa 24861 24874 2-10-2 635_1 AAacccacttcaAA
636 aaaacccacttcaa 24862 24875 2-10-2 636_1 AAaacccacttcAA
637 aaaaacccacttca 24863 24876 2-10-2 637_1 AAaaacccacttCA
638 aaaaaacccacttc 24864 24877 2-10-2 638_1 AAaaaacccactTC
639 caaaaaacccactt 24865 24878 2-10-2 639_1 CAaaaaacccacTT
640 acaaaaaacccact 24866 24879 2-10-2 640_1 ACaaaaaacccaCT
641 aacaaaaaacccac 24867 24880 2-10-2 641_1 AAcaaaaaacccAC
642 aaacaaaaaaccca 24868 24881 2-10-2 642_1 AAacaaaaaaccCA
643 aaaacaaaaaaccc 24869 24882 2-10-2 643_1 AAaacaaaaaacCC
644 atcttcccattaat 24976 24989 2-10-2 644_1 ATcttcccattaAT
645 aatcttcccattaa 24977 24990 2-10-2 645_1 AAtcttcccattAA
646 taatcttcccatta 24978 24991 2-10-2 646_1 TAatcttcccatTA
647 ataatcttcccatt 24979 24992 2-10-2 647_1 ATaatcttcccaTT
648 aataatcttcccat 24980 24993 2-10-2 648_1 AAtaatcttcccAT
649 aaataatcttccca 24981 24994 2-10-2 649_1 AAataatcttccCA
650 aaaataatcttccc 24982 24995 2-10-2 650_1 AAaataatcttcCC
651 tattaatcaaaaat 25057 25070 2-10-2 651_1 TAttaatcaaaaAT
652 ctattaatcaaaaa 25058 25071 2-10-2 652_1 CTattaatcaaaAA
653 tctattaatcaaaa 25059 25072 2-10-2 653_1 TCtattaatcaaAA
654 ctctattaatcaaa 25060 25073 2-10-2 654_1 CTctattaatcaAA
655 actctattaatcaa 25061 25074 2-10-2 655_1 ACtctattaatcAA
656 gactctattaatca 25062 25075 2-10-2 656_1 GActctattaatCA
657 tattctactcttct 25433 25446 2-10-2 657_1 TAttctactcttCT
658 atattctactcttc 25434 25447 2-10-2 658_1 ATattctactctTC
659 aatattctactctt 25435 25448 2-10-2 659_1 AAtattctactcTT
660 gaatattctactct 25436 25449 2-10-2 660_1 GAatattctactCT
661 agaatattctactc 25437 25450 2-10-2 661_1 AGaatattctacTC
662 atttaccaattcaa 25508 25521 2-10-2 662_1 ATttaccaattcAA
663 tatttaccaattca 25509 25522 2-10-2 663_1 TAtttaccaattCA
664 gtatttaccaattc 25510 25523 2-10-2 664_1 GTatttaccaatTC
665 tgtatttaccaatt 25511 25524 2-10-2 665_1 TGtatttaccaaTT
666 ctgtatttaccaat 25512 25525 2-10-2 666_1 CTgtatttaccaAT
667 actgtatttaccaa 25513 25526 2-10-2 667_1 ACtgtatttaccAA
668 ttataccatcaaat 27100 27113 2-10-2 668_1 TTataccatcaaAT
669 attataccatcaaa 27101 27114 2-10-2 669_1 ATtataccatcaAA
670 cattataccatcaa 27102 27115 2-10-2 670_1 CAttataccatcAA
671 tcattataccatca 27103 27116 2-10-2 671_1 TCattataccatCA
672 ttcattataccatc 27104 27117 2-10-2 672_1 TTcattataccaTC
673 cttcattataccat 27105 27118 2-10-2 673_1 CTtcattataccAT
674 tcttcattatacca 27106 27119 2-10-2 674_1 TCttcattatacCA
675 ttcttcattatacc 27107 27120 2-10-2 675_1 TTcttcattataCC
676 tttcttcattatac 27108 27121 2-10-2 676_1 TTtcttcattatAC
677 ttttcttcattata 27109 27122 2-10-2 677_1 TTttcttcattaTA
678 attttcttcattat 27110 27123 2-10-2 678_1 ATtttcttcattAT
679 tattttcttcatta 27111 27124 2-10-2 679_1 TAttttcttcatTA
680 atattttcttcatt 27112 27125 2-10-2 680_1 ATattttcttcaTT
681 aatattttcttcat 27113 27126 2-10-2 681_1 AAtattttcttcAT
682 aaatattttcttca 27114 27127 2-10-2 682_1 AAatattttcttCA
683 taaatattttcttc 27115 27128 2-10-2 683_1 TAaatattttctTC
684 aataatccaaactt 27772 27785 2-10-2 684_1 AAtaatccaaacTT
685 aaataatccaaact 27773 27786 2-10-2 685_1 AAataatccaaaCT
686 aaaataatccaaac 27774 27787 2-10-2 686_1 AAaataatccaaAC
687 caaaataatccaaa 27775 27788 2-10-2 687_1 CAaaataatccaAA
688 acaaaataatccaa 27776 27789 2-10-2 688_1 ACaaaataatccAA
689 tacaaaataatcca 27777 27790 2-10-2 689_1 TAcaaaataatcCA
690 ttacaaaataatcc 27778 27791 2-10-2 690_1 TTacaaaataatCC
691 gttacaaaataatc 27779 27792 2-10-2 691_1 GTtacaaaataaTC
692 tgttacaaaataat 27780 27793 2-10-2 692_1 TGttacaaaataAT
693 ttttacattaacta 27935 27948 2-10-2 693_1 TTttacattaacTA
694 tttttacattaact 27936 27949 2-10-2 694_1 TTtttacattaaCT
695 ttttttacattaac 27937 27950 2-10-2 695_1 TTttttacattaAC
696 attttttacattaa 27938 27951 2-10-2 696_1 ATtttttacattAA
697 tattttttacatta 27939 27952 2-10-2 697_1 TAttttttacatTA
698 ttattttttacatt 27940 27953 2-10-2 698_1 TTattttttacaTT
699 aaatactaacatca 29299 29312 2-10-2 699_1 AAatactaacatCA
700 aaaatactaacatc 29300 29313 2-10-2 700_1 AAaatactaacaTC
701 caaaatactaacat 29301 29314 2-10-2 701_1 CAaaatactaacAT
702 ccaaaatactaaca 29302 29315 2-10-2 702_1 CCaaaatactaaCA
703 gccaaaatactaac 29303 29316 2-10-2 703_1 GCcaaaatactaAC
704 tgccaaaatactaa 29304 29317 2-10-2 704_1 TGccaaaatactAA
705 tccattcattttat 29415 29428 2-10-2 705_1 TCcattcattttAT
706 atccattcatttta 29416 29429 2-10-2 706_1 ATccattcatttTA
707 catccattcatttt 29417 29430 2-10-2 707_1 CAtccattcattTT
708 acatccattcattt 29418 29431 2-10-2 708_1 ACatccattcatTT
709 cacatccattcatt 29419 29432 2-10-2 709_1 CAcatccattcaTT
710 ccacatccattcat 29420 29433 2-10-2 710_1 CCacatccattcAT
711 gccacatccattca 29421 29434 2-10-2 711_1 GCcacatccattCA
712 tgccacatccattc 29422 29435 2-10-2 712_1 TGccacatccatTC
713 atgccacatccatt 29423 29436 2-10-2 713_1 ATgccacatccaTT
714 tatgccacatccat 29424 29437 2-10-2 714_1 TAtgccacatccAT
715 ttatgccacatcca 29425 29438 2-10-2 715_1 TTatgccacatcCA
716 attatgccacatcc 29426 29439 2-10-2 716_1 ATtatgccacatCC
717 tcttaactcttctc 30753 30766 2-10-2 717_1 TCttaactcttcTC
718 ttcttaactcttct 30754 30767 2-10-2 718_1 TTcttaactcttCT
719 gttcttaactcttc 30755 30768 2-10-2 719_1 GTtcttaactctTC
720 agttcttaactctt 30756 30769 2-10-2 720_1 AGttcttaactcTT
721 tagttcttaactct 30757 30770 2-10-2 721_1 TAgttcttaactCT
722 caaatactcaaaaa 31029 31042 2-10-2 722_1 CAaatactcaaaAA
723 tcaaatactcaaaa 31030 31043 2-10-2 723_1 TCaaatactcaaAA
724 ttcaaatactcaaa 31031 31044 2-10-2 724_1 TTcaaatactcaAA
725 cttcaaatactcaa 31032 31045 2-10-2 725_1 CTtcaaatactcAA
726 gcttcaaatactca 31033 31046 2-10-2 726_1 GCttcaaatactCA
727 agcttcaaatactc 31034 31047 2-10-2 727_1 AGcttcaaatacTC
728 aagcttcaaatact 31035 31048 2-10-2 728_1 AAgcttcaaataCT
729 cctcattacccatt 32059 32072 2-10-2 729_1 CCtcattacccaTT
730 tcctcattacccat 32060 32073 2-10-2 730_1 TCctcattacccAT
731 atcctcattaccca 32061 32074 2-10-2 731_1 ATcctcattaccCA
732 tatcctcattaccc 32062 32075 2-10-2 732_1 TAtcctcattacCC
733 atatcctcattacc 32063 32076 2-10-2 733_1 ATatcctcattaCC
734 aatatcctcattac 32064 32077 2-10-2 734_1 AAtatcctcattAC
735 taatatcctcatta 32065 32078 2-10-2 735_1 TAatatcctcatTA
736 ttaatatcctcatt 32066 32079 2-10-2 736_1 TTaatatcctcaTT
737 tttaatatcctcat 32067 32080 2-10-2 737_1 TTtaatatcctcAT
738 atttaatatcctca 32068 32081 2-10-2 738_1 ATttaatatcctCA
739 aatttaatatcctc 32069 32082 2-10-2 739_1 AAtttaatatccTC
740 aaatttaatatcct 32070 32083 2-10-2 740_1 AAatttaatatcCT
741 taaatttaatatcc 32071 32084 2-10-2 741_1 TAaatttaatatCC
742 ttaaatttaatatc 32072 32085 2-10-2 742_1 TTaaatttaataTC
743 cttaaatttaatat 32073 32086 2-10-2 743_1 CTtaaatttaatAT
744 tcttaaatttaata 32074 32087 2-10-2 744_1 TCttaaatttaaTA
745 ttcttaaatttaat 32075 32088 2-10-2 745_1 TTcttaaatttaAT
746 gttcttaaatttaa 32076 32089 2-10-2 746_1 GTtcttaaatttAA
747 ttattctactttta 33431 33444 2-10-2 747_1 TTattctactttTA
748 tttattctactttt 33432 33445 2-10-2 748_1 TTtattctacttTT
749 ctttattctacttt 33433 33446 2-10-2 749_1 CTttattctactTT
750 cctttattctactt 33434 33447 2-10-2 750_1 CCtttattctacTT
751 gcctttattctact 33435 33448 2-10-2 751_1 GCctttattctaCT
752 aacaattattaata 33797 33810 2-10-2 752_1 AAcaattattaaTA
753 caacaattattaat 33798 33811 2-10-2 753_1 CAacaattattaAT
754 gcaacaattattaa 33799 33812 2-10-2 754_1 GCaacaattattAA
755 agcaacaattatta 33800 33813 2-10-2 755_1 AGcaacaattatTA
756 cagcaacaattatt 33801 33814 2-10-2 756_1 CAgcaacaattaTT
757 ccagcaacaattat 33802 33815 2-10-2 757_1 CCagcaacaattAT
758 accagcaacaatta 33803 33816 2-10-2 758_1 ACcagcaacaatTA
759 aaaccaaaacttac 33963 33976 2-10-2 759_1 AAaccaaaacttAC
760 aaaaccaaaactta 33964 33977 2-10-2 760_1 AAaaccaaaactTA
761 aaaaaccaaaactt 33965 33978 2-10-2 761_1 AAaaaccaaaacTT
762 caaaaaccaaaact 33966 33979 2-10-2 762_1 CAaaaaccaaaaCT
763 ccaaaaaccaaaac 33967 33980 2-10-2 763_1 CCaaaaaccaaaAC
764 accaaaaaccaaaa 33968 33981 2-10-2 764_1 ACcaaaaaccaaAA
765 aaccaaaaaccaaa 33969 33982 2-10-2 765_1 AAccaaaaaccaAA
766 aaaccaaaaaccaa 33970 33983 2-10-2 766_1 AAaccaaaaaccAA
767 atctaaaacacttc 34050 34063 2-10-2 767_1 ATctaaaacactTC
768 aatctaaaacactt 34051 34064 2-10-2 768_1 AAtctaaaacacTT
769 aaatctaaaacact 34052 34065 2-10-2 769_1 AAatctaaaacaCT
770 caaatctaaaacac 34053 34066 2-10-2 770_1 CAaatctaaaacAC
771 ccaaatctaaaaca 34054 34067 2-10-2 771_1 CCaaatctaaaaCA
772 cccaaatctaaaac 34055 34068 2-10-2 772_1 CCcaaatctaaaAC
773 ccccaaatctaaaa 34056 34069 2-10-2 773_1 CCccaaatctaaAA
774 accccaaatctaaa 34057 34070 2-10-2 774_1 ACcccaaatctaAA
775 aaccccaaatctaa 34058 34071 2-10-2 775_1 AAccccaaatctAA
776 aaaccccaaatcta 34059 34072 2-10-2 776_1 AAaccccaaatcTA
777 attcacaaatccta 34075 34088 2-10-2 777_1 ATtcacaaatccTA
778 tattcacaaatcct 34076 34089 2-10-2 778_1 TAttcacaaatcCT
779 atattcacaaatcc 34077 34090 2-10-2 779_1 ATattcacaaatCC
780 aatattcacaaatc 34078 34091 2-10-2 780_1 AAtattcacaaaTC
781 aaatattcacaaat 34079 34092 2-10-2 781_1 AAatattcacaaAT
782 caaatattcacaaa 34080 34093 2-10-2 782_1 CAaatattcacaAA
783 gcaaatattcacaa 34081 34094 2-10-2 783_1 GCaaatattcacAA
784 aacacacattatca 34537 34550 2-10-2 784_1 AAcacacattatCA
785 taacacacattatc 34538 34551 2-10-2 785_1 TAacacacattaTC
786 ttaacacacattat 34539 34552 2-10-2 786_1 TTaacacacattAT
787 tttaacacacatta 34540 34553 2-10-2 787_1 TTtaacacacatTA
788 atttaacacacatt 34541 34554 2-10-2 788_1 ATttaacacacaTT
789 tatttaacacacat 34542 34555 2-10-2 789_1 TAtttaacacacAT
790 ctatttaacacaca 34543 34556 2-10-2 790_1 CTatttaacacaCA
791 actatttaacacac 34544 34557 2-10-2 791_1 ACtatttaacacAC
792 tactatttaacaca 34545 34558 2-10-2 792_1 TActatttaacaCA
793 ctactatttaacac 34546 34559 2-10-2 793_1 CTactatttaacAC
794 actactatttaaca 34547 34560 2-10-2 794_1 ACtactatttaaCA
795 aactactatttaac 34548 34561 2-10-2 795_1 AActactatttaAC
796 aaactactatttaa 34549 34562 2-10-2 796_1 AAactactatttAA
797 aaaactactattta 34550 34563 2-10-2 797_1 AAaactactattTA
798 gaaaactactattt 34551 34564 2-10-2 798_1 GAaaactactatTT
799 tgaaaactactatt 34552 34565 2-10-2 799_1 TGaaaactactaTT
800 aaataacctatcat 35309 35322 2-10-2 800_1 AAataacctatcAT
801 aaaataacctatca 35310 35323 2-10-2 801_1 AAaataacctatCA
802 caaaataacctatc 35311 35324 2-10-2 802_1 CAaaataacctaTC
803 acaaaataacctat 35312 35325 2-10-2 803_1 ACaaaataacctAT
804 cacaaaataaccta 35313 35326 2-10-2 804_1 CAcaaaataaccTA
805 tcacaaaataacct 35314 35327 2-10-2 805_1 TCacaaaataacCT
806 atcacaaaataacc 35315 35328 2-10-2 806_1 ATcacaaaataaCC
807 catcacaaaataac 35316 35329 2-10-2 807_1 CAtcacaaaataAC
808 tcatcacaaaataa 35317 35330 2-10-2 808_1 TCatcacaaaatAA
809 ttcatcacaaaata 35318 35331 2-10-2 809_1 TTcatcacaaaaTA
810 tttcatcacaaaat 35319 35332 2-10-2 810_1 TTtcatcacaaaAT
811 ttttcatcacaaaa 35320 35333 2-10-2 811_1 TTttcatcacaaAA
812 attttcatcacaaa 35321 35334 2-10-2 812_1 ATtttcatcacaAA
813 tattttcatcacaa 35322 35335 2-10-2 813_1 TAttttcatcacAA
814 gtattttcatcaca 35323 35336 2-10-2 814_1 GTattttcatcaCA
815 atttaaatttatca 35354 35367 2-10-2 815_1 ATttaaatttatCA
816 aatttaaatttatc 35355 35368 2-10-2 816_1 AAtttaaatttaTC
817 aaatttaaatttat 35356 35369 2-10-2 817_1 AAatttaaatttAT
818 aaaatttaaattta 35357 35370 2-10-2 818_1 AAaatttaaattTA
819 taaaatttaaattt 35358 35371 2-10-2 819_1 TAaaatttaaatTT
820 ataaaatttaaatt 35359 35372 2-10-2 820_1 ATaaaatttaaaTT
821 cataaaatttaaat 35360 35373 2-10-2 821_1 CAtaaaatttaaAT
822 acataaaatttaaa 35361 35374 2-10-2 822_1 ACataaaatttaAA
823 ctactaatattcat 36332 36345 2-10-2 823_1 CTactaatattcAT
824 cctactaatattca 36333 36346 2-10-2 824_1 CCtactaatattCA
825 acctactaatattc 36334 36347 2-10-2 825_1 ACctactaatatTC
826 cacctactaatatt 36335 36348 2-10-2 826_1 CAcctactaataTT
827 tcacctactaatat 36336 36349 2-10-2 827_1 TCacctactaatAT
828 ttcacctactaata 36337 36350 2-10-2 828_1 TTcacctactaaTA
829 tttcacctactaat 36338 36351 2-10-2 829_1 TTtcacctactaAT
830 ttttcacctactaa 36339 36352 2-10-2 830_1 TTttcacctactAA
831 tttttcacctacta 36340 36353 2-10-2 831_1 TTtttcacctacTA
832 atttttcacctact 36341 36354 2-10-2 832_1 ATttttcacctaCT
833 tatttttcacctac 36342 36355 2-10-2 833_1 TAtttttcacctAC
834 ttatttttcaccta 36343 36356 2-10-2 834_1 TTatttttcaccTA
835 tttatttttcacct 36344 36357 2-10-2 835_1 TTtatttttcacCT
836 ttctactactaatt 36468 36481 2-10-2 836_1 TTctactactaaTT
837 cttctactactaat 36469 36482 2-10-2 837_1 CTtctactactaAT
838 acttctactactaa 36470 36483 2-10-2 838_1 ACttctactactAA
839 aacttctactacta 36471 36484 2-10-2 839_1 AActtctactacTA
840 caacttctactact 36472 36485 2-10-2 840_1 CAacttctactaCT
841 tcaacttctactac 36473 36486 2-10-2 841_1 TCaacttctactAC
842 ctcaacttctacta 36474 36487 2-10-2 842_1 CTcaacttctacTA
843 tctcaacttctact 36475 36488 2-10-2 843_1 TCtcaacttctaCT
844 ctctcaacttctac 36476 36489 2-10-2 844_1 CTctcaacttctAC
845 tctctcaacttcta 36477 36490 2-10-2 845_1 TCtctcaacttcTA
846 ttctctcaacttct 36478 36491 2-10-2 846_1 TTctctcaacttCT
847 tttctctcaacttc 36479 36492 2-10-2 847_1 TTtctctcaactTC
848 ttttctctcaactt 36480 36493 2-10-2 848_1 TTttctctcaacTT
849 tttttctctcaact 36481 36494 2-10-2 849_1 TTtttctctcaaCT
850 ctttttctctcaac 36482 36495 2-10-2 850_1 CTttttctctcaAC
851 actttttctctcaa 36483 36496 2-10-2 851_1 ACtttttctctcAA
852 tactttttctctca 36484 36497 2-10-2 852_1 TActttttctctCA
853 ttactttttctctc 36485 36498 2-10-2 853_1 TTactttttctcTC
854 gttactttttctct 36486 36499 2-10-2 854_1 GTtactttttctCT
855 agttactttttctc 36487 36500 2-10-2 855_1 AGttactttttcTC
856 cattcccattaaca 36788 36801 2-10-2 856_1 CAttcccattaaCA
857 acattcccattaac 36789 36802 2-10-2 857_1 ACattcccattaAC
858 tacattcccattaa 36790 36803 2-10-2 858_1 TAcattcccattAA
859 ttacattcccatta 36791 36804 2-10-2 859_1 TTacattcccatTA
860 tttacattcccatt 36792 36805 2-10-2 860_1 TTtacattcccaTT
861 ttttacattcccat 36793 36806 2-10-2 861_1 TTttacattcccAT
862 cttttacattccca 36794 36807 2-10-2 862_1 CTtttacattccCA
863 acttttacattccc 36795 36808 2-10-2 863_1 ACttttacattcCC
864 cacttttacattcc 36796 36809 2-10-2 864_1 CActtttacattCC
865 acacttttacattc 36797 36810 2-10-2 865_1 ACacttttacatTC
866 tacacttttacatt 36798 36811 2-10-2 866_1 TAcacttttacaTT
867 gtacacttttacat 36799 36812 2-10-2 867_1 GTacacttttacAT
868 tgtacacttttaca 36800 36813 2-10-2 868_1 TGtacacttttaCA
869 tttatcaaaaaaat 36834 36847 2-10-2 869_1 TTtatcaaaaaaAT
870 atttatcaaaaaaa 36835 36848 2-10-2 870_1 ATttatcaaaaaAA
871 catttatcaaaaaa 36836 36849 2-10-2 871_1 CAtttatcaaaaAA
872 acatttatcaaaaa 36837 36850 2-10-2 872_1 ACatttatcaaaAA
873 tacatttatcaaaa 36838 36851 2-10-2 873_1 TAcatttatcaaAA
874 atacatttatcaaa 36839 36852 2-10-2 874_1 ATacatttatcaAA
875 tatacatttatcaa 36840 36853 2-10-2 875_1 TAtacatttatcAA
876 acatcttccaattt 38848 38861 2-10-2 876_1 ACatcttccaatTT
877 tacatcttccaatt 38849 38862 2-10-2 877_1 TAcatcttccaaTT
878 ttacatcttccaat 38850 38863 2-10-2 878_1 TTacatcttccaAT
879 tttacatcttccaa 38851 38864 2-10-2 879_1 TTtacatcttccAA
880 atttacatcttcca 38852 38865 2-10-2 880_1 ATttacatcttcCA
881 tatttacatcttcc 38853 38866 2-10-2 881_1 TAtttacatcttCC
882 ttatttacatcttc 38854 38867 2-10-2 882_1 TTatttacatctTC
883 cttatttacatctt 38855 38868 2-10-2 883_1 CTtatttacatcTT
884 tcttatttacatct 38856 38869 2-10-2 884_1 TCttatttacatCT
885 atcttatttacatc 38857 38870 2-10-2 885_1 ATcttatttacaTC
886 aatcttatttacat 38858 38871 2-10-2 886_1 AAtcttatttacAT
887 gaatcttatttaca 38859 38872 2-10-2 887_1 GAatcttatttaCA
888 tgaatcttatttac 38860 38873 2-10-2 888_1 TGaatcttatttAC
889 ttcccttcactcct 40071 40084 2-10-2 889_1 TTcccttcactcCT
890 tttcccttcactcc 40072 40085 2-10-2 890_1 TTtcccttcactCC
891 ttttcccttcactc 40073 40086 2-10-2 891_1 TTttcccttcacTC
892 attttcccttcact 40074 40087 2-10-2 892_1 ATtttcccttcaCT
893 aattttcccttcac 40075 40088 2-10-2 893_1 AAttttcccttcAC
894 taattttcccttca 40076 40089 2-10-2 894_1 TAattttcccttCA
895 ttaattttcccttc 40077 40090 2-10-2 895_1 TTaattttccctTC
896 gttaattttccctt 40078 40091 2-10-2 896_1 GTtaattttcccTT
897 tttatcatttcttt 40150 40163 2-10-2 897_1 TTtatcatttctTT
898 ttttatcatttctt 40151 40164 2-10-2 898_1 TTttatcatttcTT
899 cttttatcatttct 40152 40165 2-10-2 899_1 CTtttatcatttCT
900 tcttttatcatttc 40153 40166 2-10-2 900_1 TCttttatcattTC
901 ttcttttatcattt 40154 40167 2-10-2 901_1 TTcttttatcatTT
902 cttcttttatcatt 40155 40168 2-10-2 902_1 CTtcttttatcaTT
903 acttcttttatcat 40156 40169 2-10-2 903_1 ACttcttttatcAT
904 tacttcttttatca 40157 40170 2-10-2 904_1 TActtcttttatCA
905 ttacttcttttatc 40158 40171 2-10-2 905_1 TTacttcttttaTC
906 attacttcttttat 40159 40172 2-10-2 906_1 ATtacttcttttAT
907 aattacttctttta 40160 40173 2-10-2 907_1 AAttacttctttTA
908 aaattacttctttt 40161 40174 2-10-2 908_1 AAattacttcttTT
909 aaaattacttcttt 40162 40175 2-10-2 909_1 AAaattacttctTT
910 caaaattacttctt 40163 40176 2-10-2 910_1 CAaaattacttcTT
911 ccaaaattacttct 40164 40177 2-10-2 911_1 CCaaaattacttCT
912 tccaaaattacttc 40165 40178 2-10-2 912_1 TCcaaaattactTC
913 ttccaaaattactt 40166 40179 2-10-2 913_1 TTccaaaattacTT
914 gttccaaaattact 40167 40180 2-10-2 914_1 GTtccaaaattaCT
915 tgttccaaaattac 40168 40181 2-10-2 915_1 TGttccaaaattAC
916 atgttccaaaatta 40169 40182 2-10-2 916_1 ATgttccaaaatTA
917 ttactctttttatt 40201 40214 2-10-2 917_1 TTactctttttaTT
918 tttactctttttat 40202 40215 2-10-2 918_1 TTtactctttttAT
919 ttttactcttttta 40203 40216 2-10-2 919_1 TTttactcttttTA
920 attttactcttttt 40204 40217 2-10-2 920_1 ATtttactctttTT
921 tattttactctttt 40205 40218 2-10-2 921_1 TAttttactcttTT
922 atattttactcttt 40206 40219 2-10-2 922_1 ATattttactctTT
923 catattttactctt 40207 40220 2-10-2 923_1 CAtattttactcTT
924 ccatattttactct 40208 40221 2-10-2 924_1 CCatattttactCT
925 cccatattttactc 40209 40222 2-10-2 925_1 CCcatattttacTC
926 acccatattttact 40210 40223 2-10-2 926_1 ACccatattttaCT
927 tacccatattttac 40211 40224 2-10-2 927_1 TAcccatattttAC
928 ttacccatatttta 40212 40225 2-10-2 928_1 TTacccatatttTA
929 tttacccatatttt 40213 40226 2-10-2 929_1 TTtacccatattTT
930 gtttacccatattt 40214 40227 2-10-2 930_1 GTttacccatatTT
931 tgtttacccatatt 40215 40228 2-10-2 931_1 TGtttacccataTT
932 gttacctcccttta 40368 40381 2-10-2 932_1 GTtacctcccttTA
933 ggttacctcccttt 40369 40382 2-10-2 933_1 GGttacctccctTT
934 aggttacctccctt 40370 40383 2-10-2 934_1 AGgttacctcccTT
935 caaactaaaaccta 41659 41672 2-10-2 935_1 CAaactaaaaccTA
936 tcaaactaaaacct 41660 41673 2-10-2 936_1 TCaaactaaaacCT
937 atcaaactaaaacc 41661 41674 2-10-2 937_1 ATcaaactaaaaCC
938 gatcaaactaaaac 41662 41675 2-10-2 938_1 GAtcaaactaaaAC
939 agatcaaactaaaa 41663 41676 2-10-2 939_1 AGatcaaactaaAA
940 aagatcaaactaaa 41664 41677 2-10-2 940_1 AAgatcaaactaAA
941 ccaatttcacccaa 41699 41712 2-10-2 941_1 CCaatttcacccAA
942 cccaatttcaccca 41700 41713 2-10-2 942_1 CCcaatttcaccCA
943 gcccaatttcaccc 41701 41714 2-10-2 943_1 GCccaatttcacCC
944 tgcccaatttcacc 41702 41715 2-10-2 944_1 TGcccaatttcaCC
945 ttgcccaatttcac 41703 41716 2-10-2 945_1 TTgcccaatttcAC
946 caactttctatttt 41777 41790 2-10-2 946_1 CAactttctattTT
947 ccaactttctattt 41778 41791 2-10-2 947_1 CCaactttctatTT
948 cccaactttctatt 41779 41792 2-10-2 948_1 CCcaactttctaTT
949 acccaactttctat 41780 41793 2-10-2 949_1 ACccaactttctAT
950 aacccaactttcta 41781 41794 2-10-2 950_1 AAcccaactttcTA
951 aaacccaactttct 41782 41795 2-10-2 951_1 AAacccaactttCT
952 aaaacccaactttc 41783 41796 2-10-2 952_1 AAaacccaacttTC
953 aaaaacccaacttt 41784 41797 2-10-2 953_1 AAaaacccaactTT
954 caaaaacccaactt 41785 41798 2-10-2 954_1 CAaaaacccaacTT
955 acaaaaacccaact 41786 41799 2-10-2 955_1 ACaaaaacccaaCT
956 ctttaaaatttcca 42170 42183 2-10-2 956_1 CTttaaaatttcCA
957 tctttaaaatttcc 42171 42184 2-10-2 957_1 TCtttaaaatttCC
958 ttctttaaaatttc 42172 42185 2-10-2 958_1 TTctttaaaattTC
959 tttctttaaaattt 42173 42186 2-10-2 959_1 TTtctttaaaatTT
960 atttctttaaaatt 42174 42187 2-10-2 960_1 ATttctttaaaaTT
961 catttctttaaaat 42175 42188 2-10-2 961_1 CAtttctttaaaAT
962 acatttctttaaaa 42176 42189 2-10-2 962_1 ACatttctttaaAA
963 cacatttctttaaa 42177 42190 2-10-2 963_1 CAcatttctttaAA
964 ccacatttctttaa 42178 42191 2-10-2 964_1 CCacatttctttAA
965 accacatttcttta 42179 42192 2-10-2 965_1 ACcacatttcttTA
966 aaccacatttcttt 42180 42193 2-10-2 966_1 AAccacatttctTT
967 aaaccacatttctt 42181 42194 2-10-2 967_1 AAaccacatttcTT
968 aaaaccacatttct 42182 42195 2-10-2 968_1 AAaaccacatttCT
969 caaaaccacatttc 42183 42196 2-10-2 969_1 CAaaaccacattTC
970 ttcttctcttttca 43831 43844 2-10-2 970_1 TTcttctcttttCA
971 tttcttctcttttc 43832 43845 2-10-2 971_1 TTtcttctctttTC
972 ttttcttctctttt 43833 43846 2-10-2 972_1 TTttcttctcttTT
973 tttttcttctcttt 43834 43847 2-10-2 973_1 TTtttcttctctTT
974 ttttttcttctctt 43835 43848 2-10-2 974_1 TTttttcttctcTT
975 attttttcttctct 43836 43849 2-10-2 975_1 ATtttttcttctCT
976 tattttttcttctc 43837 43850 2-10-2 976_1 TAttttttcttcTC
977 aacttaatattaaa 45488 45501 2-10-2 977_1 AActtaatattaAA
978 caacttaatattaa 45489 45502 2-10-2 978_1 CAacttaatattAA
979 tcaacttaatatta 45490 45503 2-10-2 979_1 TCaacttaatatTA
980 ttcaacttaatatt 45491 45504 2-10-2 980_1 TTcaacttaataTT
981 attcaacttaatat 45492 45505 2-10-2 981_1 ATtcaacttaatAT
982 tattcaacttaata 45493 45506 2-10-2 982_1 TAttcaacttaaTA
983 ttattcaacttaat 45494 45507 2-10-2 983_1 TTattcaacttaAT
984 tttattcaacttaa 45495 45508 2-10-2 984_1 TTtattcaacttAA
985 caaattaaaaaaca 47397 47410 2-10-2 985_1 CAaattaaaaaaCA
986 tcaaattaaaaaac 47398 47411 2-10-2 986_1 TCaaattaaaaaAC
987 ttcaaattaaaaaa 47399 47412 2-10-2 987_1 TTcaaattaaaaAA
988 cttcaaattaaaaa 47400 47413 2-10-2 988_1 CTtcaaattaaaAA
989 tcttcaaattaaaa 47401 47414 2-10-2 989_1 TCttcaaattaaAA
990 ttcttcaaattaaa 47402 47415 2-10-2 990_1 TTcttcaaattaAA
991 tttcttcaaattaa 47403 47416 2-10-2 991_1 TTtcttcaaattAA
992 aacacaaattcaaa 48077 48090 2-10-2 992_1 AAcacaaattcaAA
993 aaacacaaattcaa 48078 48091 2-10-2 993_1 AAacacaaattcAA
994 taaacacaaattca 48079 48092 2-10-2 994_1 TAaacacaaattCA
995 ataaacacaaattc 48080 48093 2-10-2 995_1 ATaaacacaaatTC
996 aataaacacaaatt 48081 48094 2-10-2 996_1 AAtaaacacaaaTT
997 caataaacacaaat 48082 48095 2-10-2 997_1 CAataaacacaaAT
998 acaataaacacaaa 48083 48096 2-10-2 998_1 ACaataaacacaAA
999 aacaataaacacaa 48084 48097 2-10-2 999_1 AAcaataaacacAA
1000 taacaataaacaca 48085 48098 2-10-2 1000_1 TAacaataaacaCA
1001 ttaacaataaacac 48086 48099 2-10-2 1001_1 TTaacaataaacAC
1002 attaacaataaaca 48087 48100 2-10-2 1002_1 ATtaacaataaaCA
1003 aattaacaataaac 48088 48101 2-10-2 1003_1 AAttaacaataaAC
1004 gaattaacaataaa 48089 48102 2-10-2 1004_1 GAattaacaataAA
1005 tgaattaacaataa 48090 48103 2-10-2 1005_1 TGaattaacaatAA
1006 atattcctcaatca 48905 48918 2-10-2 1006_1 ATattcctcaatCA
1007 tatattcctcaatc 48906 48919 2-10-2 1007_1 TAtattcctcaaTC
1008 atatattcctcaat 48907 48920 2-10-2 1008_1 ATatattcctcaAT
1009 aatatattcctcaa 48908 48921 2-10-2 1009_1 AAtatattcctcAA
1010 caatatattcctca 48909 48922 2-10-2 1010_1 CAatatattcctCA
1011 acaatatattcctc 48910 48923 2-10-2 1011_1 ACaatatattccTC
1012 gacaatatattcct 48911 48924 2-10-2 1012_1 GAcaatatattcCT
1013 caatcctaattaaa 48960 48973 2-10-2 1013_1 CAatcctaattaAA
1014 ccaatcctaattaa 48961 48974 2-10-2 1014_1 CCaatcctaattAA
1015 cccaatcctaatta 48962 48975 2-10-2 1015_1 CCcaatcctaatTA
1016 gcccaatcctaatt 48963 48976 2-10-2 1016_1 GCccaatcctaaTT
1017 tgcccaatcctaat 48964 48977 2-10-2 1017_1 TGcccaatcctaAT
1018 accctacaaatact 50093 50106 2-10-2 1018_1 ACcctacaaataCT
1019 aaccctacaaatac 50094 50107 2-10-2 1019_1 AAccctacaaatAC
1020 aaaccctacaaata 50095 50108 2-10-2 1020_1 AAaccctacaaaTA
1021 aaaaccctacaaat 50096 50109 2-10-2 1021_1 AAaaccctacaaAT
1022 aaaaaccctacaaa 50097 50110 2-10-2 1022_1 AAaaaccctacaAA
1023 aaaaaaccctacaa 50098 50111 2-10-2 1023_1 AAaaaaccctacAA
1024 aaaaaaaccctaca 50099 50112 2-10-2 1024_1 AAaaaaaccctaCA
1025 tatacactattaat 51008 51021 2-10-2 1025_1 TAtacactattaAT
1026 ttatacactattaa 51009 51022 2-10-2 1026_1 TTatacactattAA
1027 attatacactatta 51010 51023 2-10-2 1027_1 ATtatacactatTA
1028 aattatacactatt 51011 51024 2-10-2 1028_1 AAttatacactaTT
1029 gaattatacactat 51012 51025 2-10-2 1029_1 GAattatacactAT
1030 gtaacaattataca 51866 51879 2-10-2 1030_1 GTaacaattataCA
1031 tgtaacaattatac 51867 51880 2-10-2 1031_1 TGtaacaattatAC
1032 ctgtaacaattata 51868 51881 2-10-2 1032_1 CTgtaacaattaTA
1033 cctgtaacaattat 51869 51882 2-10-2 1033_1 CCtgtaacaattAT
1034 tcctgtaacaatta 51870 51883 2-10-2 1034_1 TCctgtaacaatTA
1035 ataaaaaccacctt 53263 53276 2-10-2 1035_1 ATaaaaaccaccTT
1036 aataaaaaccacct 53264 53277 2-10-2 1036_1 AAtaaaaaccacCT
1037 gaataaaaaccacc 53265 53278 2-10-2 1037_1 GAataaaaaccaCC
1038 agaataaaaaccac 53266 53279 2-10-2 1038_1 AGaataaaaaccAC
1039 cagaataaaaacca 53267 53280 2-10-2 1039_1 CAgaataaaaacCA
1040 ccagaataaaaacc 53268 53281 2-10-2 1040_1 CCagaataaaaaCC
1041 cccagaataaaaac 53269 53282 2-10-2 1041_1 CCcagaataaaaAC
1042 acccagaataaaaa 53270 53283 2-10-2 1042_1 ACccagaataaaAA
1043 tttcttactcccct 53699 53712 2-10-2 1043_1 TTtcttactcccCT
1044 ctttcttactcccc 53700 53713 2-10-2 1044_1 CTttcttactccCC
1045 actttcttactccc 53701 53714 2-10-2 1045_1 ACtttcttactcCC
1046 cactttcttactcc 53702 53715 2-10-2 1046_1 CActttcttactCC
1047 ccactttcttactc 53703 53716 2-10-2 1047_1 CCactttcttacTC
1048 cctttaccactttt 53948 53961 2-10-2 1048_1 CCtttaccacttTT
1049 ccctttaccacttt 53949 53962 2-10-2 1049_1 CCctttaccactTT
1050 tccctttaccactt 53950 53963 2-10-2 1050_1 TCcctttaccacTT
1051 atccctttaccact 53951 53964 2-10-2 1051_1 ATccctttaccaCT
1052 catccctttaccac 53952 53965 2-10-2 1052_1 CAtccctttaccAC
1053 ctacatctaacccc 54550 54563 2-10-2 1053_1 CTacatctaaccCC
1054 tctacatctaaccc 54551 54564 2-10-2 1054_1 TCtacatctaacCC
1055 gtctacatctaacc 54552 54565 2-10-2 1055_1 GTctacatctaaCC
1056 agtctacatctaac 54553 54566 2-10-2 1056_1 AGtctacatctaAC
1057 cagtctacatctaa 54554 54567 2-10-2 1057_1 CAgtctacatctAA
1058 tcagtctacatcta 54555 54568 2-10-2 1058_1 TCagtctacatcTA
1059 ttcagtctacatct 54556 54569 2-10-2 1059_1 TTcagtctacatCT
1060 taaccacacctcct 54573 54586 2-10-2 1060_1 TAaccacacctcCT
1061 ttaaccacacctcc 54574 54587 2-10-2 1061_1 TTaaccacacctCC
1062 tttaaccacacctc 54575 54588 2-10-2 1062_1 TTtaaccacaccTC
1063 ttttaaccacacct 54576 54589 2-10-2 1063_1 TTttaaccacacCT
1064 gttttaaccacacc 54577 54590 2-10-2 1064_1 GTtttaaccacaCC
1065 agttttaaccacac 54578 54591 2-10-2 1065_1 AGttttaaccacAC
1066 caacaaaacatcaa 55228 55241 2-10-2 1066_1 CAacaaaacatcAA
1067 tcaacaaaacatca 55229 55242 2-10-2 1067_1 TCaacaaaacatCA
1068 ttcaacaaaacatc 55230 55243 2-10-2 1068_1 TTcaacaaaacaTC
1069 tttcaacaaaacat 55231 55244 2-10-2 1069_1 TTtcaacaaaacAT
1070 ttttcaacaaaaca 55232 55245 2-10-2 1070_1 TTttcaacaaaaCA
1071 gttttcaacaaaac 55233 55246 2-10-2 1071_1 GTtttcaacaaaAC
1072 tgttttcaacaaaa 55234 55247 2-10-2 1072_1 TGttttcaacaaAA
1073 ttctaaaacttacc 55269 55282 2-10-2 1073_1 TTctaaaacttaCC
1074 tttctaaaacttac 55270 55283 2-10-2 1074_1 TTtctaaaacttAC
1075 ctttctaaaactta 55271 55284 2-10-2 1075_1 CTttctaaaactTA
1076 tctttctaaaactt 55272 55285 2-10-2 1076_1 TCtttctaaaacTT
1077 atctttctaaaact 55273 55286 2-10-2 1077_1 ATctttctaaaaCT
1078 aatctttctaaaac 55274 55287 2-10-2 1078_1 AAtctttctaaaAC
1079 gaatctttctaaaa 55275 55288 2-10-2 1079_1 GAatctttctaaAA
1080 agaatctttctaaa 55276 55289 2-10-2 1080_1 AGaatctttctaAA
1081 cagaatctttctaa 55277 55290 2-10-2 1081_1 CAgaatctttctAA
1082 cctttatttccctt 55494 55507 2-10-2 1082_1 CCtttatttcccTT
1083 ccctttatttccct 55495 55508 2-10-2 1083_1 CCctttatttccCT
1084 tccctttatttccc 55496 55509 2-10-2 1084_1 TCcctttatttcCC
1085 ttccctttatttcc 55497 55510 2-10-2 1085_1 TTccctttatttCC
1086 tttccctttatttc 55498 55511 2-10-2 1086_1 TTtccctttattTC
1087 atttccctttattt 55499 55512 2-10-2 1087_1 ATttccctttatTT
1088 tatttccctttatt 55500 55513 2-10-2 1088_1 TAtttccctttaTT
1089 gtatttccctttat 55501 55514 2-10-2 1089_1 GTatttccctttAT
實例 2 ：在 SK-N-AS 人類細胞株中使用另外的靶向 ATNX3 的 LNA 缺口體寡核苷酸在 活體外降低 ATXN3 。
測試靶向人類 ATXN3 的經 LNA 修飾的寡核苷酸降低從 ECACC 獲得的人類 SK-N-AS 神經母細胞瘤細胞 (型錄號碼：94092302) 中 ATXN3 mRNA 表現的能力。根據供應商指南，在 Dulbecco 改良之 Eagle 培養基中培養細胞，該培養基中補充有 0.1 mM 非必需胺基酸 (NEAA) 及最終濃度為 10% 的胎牛血清。在活性蒸發培養箱 (Thermo C10) 中，於 37℃、5% CO2 及 95% 的濕度下培養細胞。將細胞以每孔 9000 個細胞 (96 孔盤) 的密度接種到 190 μl SK-N-AS 細胞培養基中。然後，向細胞中加入來自預製備的 96 孔稀釋盤的 10 µl 寡核苷酸懸浮液或 PBS (對照)，使其最終濃度為 5 µM。將細胞培養盤在培養箱中培養 72 小時。
培育後，按照製造商的方案，藉由去除培養基並使用 QIAGEN RNeasy 96 套組 (型錄號碼：74181) 進行細胞裂解及 RNA 純化來收穫細胞。在單一步驟 qPCR 反應之前，將 RNA 用水稀釋 2 倍。對於單一步驟 qPCR 反應，使用來自 Integrated DNA Technologies 針對 ATXN3 (Hs.PT.58.39355049) 及 TBP (Hs.PT.58v.39858774) 的測定，將 qPCR 混合物 (qScriptTM XLT One-Step RT-qPCR ToughMix® Low ROX，購自 QuantaBio，型錄號碼 95134-500) 及 QPCR 作為 duplex QPCR 運行
Hs.PT.58.39355049 – 引子序列 探針：5'-/56-FAM/AAAGGCCAG/ZEN/CCACCAGTTCAGG/3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1130) 引子 1：5'-CTATCAGGACAGAGTTCACATCC-3' (SEQ ID NO:1129) 引子 2：5'-GTTTCTAAAGACATGGTCACAGC-3' (SEQ ID NO:1128)
Hs.PT.58v.39858774 – 引子序列 探針：5’- /5HEX/TGA TCT TTG /ZEN/CAG TGA CCC AGC ATC A/3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO:1131) 引子 1：5’- GCT GTT TAA CTT CGC TTC CG-3’ (SEQ ID NO:1132) 引子 2：5’- CAG CAA CTT CCT CAA TTC CTT G-3’ (SEQ ID NO:1133)
然後將反應混合物在 qPCR 盤 (MICROAMP®optical 384 孔，4309849) 中混合。密封後，將盤於室溫下以 1000 g 快速離心 1 分鐘，然後轉移至 ViiaTM 7 系統 (Applied Biosystems, Thermo)，使用以下 PCR 條件：在 50℃ 下保持 15 分鐘；在 95℃ 下保持 3 分鐘；40 次循環：在 95℃ 下保持 5 秒，然後以 1.6℃/秒的速率降溫，並於 60℃ 下保持 45 秒。使用 QuantStudioTM Real_time PCR 軟體對資料進行分析，並藉由 ΔΔ Ct 法計算數量 (數量 = 2^(-Ct)×1000000000)。將數量標準化至同一孔內運行的管家基因測定 (TBP) 所計算出的數量。藉由用同一盤上的所有經 PBS 處理的孔的中值相除，計算相對標靶數量 = 標靶數量/管家基因數量 (RNA 減弱)。標準化標靶數量 = (相對標靶數量/[平均]相對標靶數量]_pbs_孔)×100。
在上述測定中評估靶向 SEQ ID NO:1 之選定標靶序列區的化合物。
標靶減弱資料見以下化合物及資料表：
在化合物中，模體序列代表寡核苷酸中存在的核鹼基的連續序列。
寡核苷酸化合物代表模體序列的具體設計。大寫字母代表 β-D-氧 LNA 核苷，小寫字母代表 DNA 核苷，所有 LNA C 皆為 5-甲基胞嘧啶，所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯核苷間鍵結。
表 4: 化合物及資料表
SEQID CMPID 寡核苷酸鹼基序列 寡核苷酸化合物 剩餘 ATXN3 mRNA 百分比(%)
1099 1099_1 CCAAAAGAAACCAAACCC CCAAaagaaaccaaacCC 90.6
1100 1100_1 CCCCATTCAAATATTTATT CCccattcaaatatttATT 90.5
1101 1101_1 AATCATTTACCCCCAAC AAtcatttaccccCAAC 92
1102 1102_1 TATCTCAAACTATCCCCA TAtctcaaactatcccCA 93
1103 1103_1 TCTATTCCTTAACCCAAC TCTattccttaacccAAC 76.6
1104 1104_1 TCCCCTAAATAATTTAATCA TCccctaaataatttaATCA 79.3
1105 1105_1 AAACCACTCCATTCCAA AaaccactccattCCAA 57.7
1106 1106_1 TCTAAACCCCAAACTTTCA TCtaaaccccaaactttCA 74.3
1107 1107_1 TTCTAAACCCCAAACTTTC TTCtaaaccccaaacttTC 61.8
1108 1108_1 AGTTCTAAACCCCAAACT AGttctaaaccccaaACT 73.7
1109 1109_1 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaccattactacAACC 24.9
1110 1110_1 ACATCATTTATCACTACCAC ACAtcatttatcactaccAC 71.9
1111 1111_1 AACATTAAACCCTCCCA AacattaaaccctcCCA 80.2
1112 1112_1 TCAGATCCTAAAATCACT TCAgatcctaaaatcACT 79.5
1113 1113_1 CTATACCTAAAACAATCTA CTAtacctaaaacaatCTA 99.1
1114 1114_1 TGATTCTTATACTTACTA TGAttcttatacttaCTA 72.1
1115 1115_1 TAAAAATATAACTACTCCTA TAaaaatataactactCCTA 93.7
1116 1116_1 TCTTCATTATACCATCAAAT TCTtcattataccatcaAAT 51.5
1117 1117_1 GTTTCATATTTTTAATCC GTTtcatatttttaaTCC 37.7
1118 1118_1 TAATATCCTCATTACCCATT TAatatcctcattacccaTT 84
1119 1119_1 CAAATATTCACAAATCCTA CAaatattcacaaatCCTA 73.3
1120 1120_1 CATCACAAAATAACCTATCA CATcacaaaataacctaTCA 79.9
1121 1121_1 CTCTCAACTTCTACTACTAA CTCtcaacttctactactAA 59.6
1122 1122_1 AATCTTATTTACATCTTCC AATcttatttacatctTCC 20.7
1123 1123_1 CCAAAATTACTTCTTTTATC CCAaaattacttcttttATC 56.5
1124 1124_1 AACCCAACTTTCTATTTT AACCcaactttctattTT 52.7
1125 1125_1 ACAATATATTCCTCAATCA ACAatatattcctcaaTCA 86.8
1126 1126_1 CCTGTAACAATTATACA CCTgtaacaattatACA 92.3
1127 1127_1 CATCCCTTTACCACTTT CAtccctttaccactTT 94.5
在寡核苷酸化合物列中，大寫字母代表 β-D-氧 LNA 核苷，LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶，小寫字母代表 DNA 核苷，且所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯。
從中可以看出，靶向所列出之標靶序列區的上述化合物中的大部分能夠抑制人類 Ataxin 3 轉錄本之表現，且靶向與 SEQ ID NO:1122 及 SEQ ID NO:1109 互補之標靶序列區的化合物在抑制人類 Ataxin 3 轉錄本方面特別有效。ATXN3 的其他有效標靶位點可由上表確定。
實例 3
實例 2 中所述的篩選測定使用一系列另外的靶向人類 ATXN3 前驅 mRNA 的寡核苷酸，藉由 qPCR：(ATXN3_外顯子_8-9(1) PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) 來進行。
qPCR 探針及引子組 2： 探針：5'-/56-FAM/CTCCGCAGG/ZEN/GCT ATTCAGCT AAGT /31ABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1134) 引子 1：5'-AGT AAGATTTGT ACCTGATGTCTGT-3' (SEQ ID NO:1135) 引子 2：5'-CATGGAAGATGAGGAAGCAGAT-3' (SEQ ID NO:1136)
結果顯示於下表中
表 5
SEQID CMPID 寡核苷酸鹼基序列 寡核苷酸化合物 剩餘 ATXN3 mRNA 百分比(%)
1137 1137_1 CCTACTTCACTTCCTAA CctacttcacttcCTAA 68.9
1138 1138_1 TTTCCTACTTCACTTCCTA TttcctacttcacttccTA 95.1
1139 1139_1 TTCCTACTTCACTTCCTA TtcctacttcacttcCTA 85
1140 1140_1 TTTCCTACTTCACTTCCT TTtcctacttcacttcCT 88.1
1141 1141_1 TTTCCTACTTCACTTCC TttcctacttcactTCC 83.1
1142 1142_1 GTTTCCTACTTCACTTC GTTtcctacttcactTC 60.2
1143 1143_1 ACCAAACCCAAACATCCC AccaaacccaaacatcCC 88
1144 1144_1 AGAAACCAAACCCAAACATC AgaaaccaaacccaaaCATC 91.3
1145 1145_1 AGAAACCAAACCCAAACAT AGaaaccaaacccaaACAT 93.5
1146 1146_1 CTCCTAATACCTAAAAACAAA CTCCtaatacctaaaaacaAA 100
1147 1147_1 CTCCTAATACCTAAAAACA CTCCtaatacctaaaaaCA 94.2
1148 1148_1 ACTCCTAATACCTAAAAACA ACTCctaatacctaaaaaCA 81
1149 1149_1 CACTCCTAATACCTAAAAACA CACtcctaatacctaaaaACA 90.4
1150 1150_1 CCACTCCTAATACCTAAAAA CCACtcctaatacctaaaAA 63
1151 1151_1 TCCACTCCTAATACCTAAAAA TCCactcctaatacctaaaAA 54
1152 1152_1 CCACTCCTAATACCTAAAA CCACtcctaatacctaaAA 73.7
1153 1153_1 TCCACTCCTAATACCTAAAA TCCactcctaatacctaAAA 59
1154 1154_1 CCACTCCTAATACCTAAA CCACtcctaatacctaAA 65.2
1155 1155_1 GTCCACTCCTAATACCTAAA GtccactcctaataccTAAA 86.8
1156 1156_1 CCACTCCTAATACCTAA CCactcctaatacCTAA 52.3
1157 1157_1 TCCACTCCTAATACCTAA TCcactcctaatacCTAA 64.3
1157 1157_2 TCCACTCCTAATACCTAA TCCActcctaatacctAA 66
1158 1158_1 GTCCACTCCTAATACCTAA GtccactcctaataccTAA 85.5
1159 1159_1 AGTCCACTCCTAATACCTA AgtccactcctaataccTA 87.4
1160 1160_1 TCCACTCCTAATACCTA TCcactcctaatacCTA 70.1
1161 1161_1 AGTCCACTCCTAATACCT AgtccactcctaatacCT 84.2
1162 1162_1 GTCCACTCCTAATACC GTCcactcctaataCC 57.8
1163 1163_1 AGTCCACTCCTAATACC AGtccactcctaataCC 77.1
1164 1164_1 CAGTCCACTCCTAATACC CagtccactcctaatACC 86.7
1162 1162_2 GTCCACTCCTAATACC GTCcactcctaatACC 67.8
1165 1165_1 CCAGTCCACTCCTAATAC CcagtccactcctaaTAC 85.4
1166 1166_1 CAGTCCACTCCTAATAC CAgtccactcctaaTAC 60.7
1167 1167_1 AGTCCACTCCTAATAC AGTCcactcctaatAC 78.9
1168 1168_1 CAGTCCACTCCTAATA CAGtccactcctaaTA 44.5
1169 1169_1 CCAGTCCACTCCTAATA CCagtccactcctaaTA 33.8
1170 1170_1 GCAACTCTTTCCAAACA GCAActctttccaaaCA 36
1171 1171_1 AGCAACTCTTTCCAAACA AGCaactctttccaaaCA 35.3
1172 1172_1 CAGCAACTCTTTCCAAACA CAgcaactctttccaaACA 58.3
1173 1173_1 CCAGCAACTCTTTCCAAA CcagcaactctttcCAAA 69.7
1174 1174_1 CCAGCAACTCTTTCCAA CCagcaactctttcCAA 42.1
1175 1175_1 ACCAGCAACTCTTTCCAA ACcagcaactctttcCAA 65
1176 1176_1 TTACCAGCAACTCTTTC TTACcagcaactcttTC 53
1177 1177_1 TGCTCCTCCTATTAAATAA TGCtcctcctattaaatAA 76.3
1178 1178_1 GCTCCTCCTATTAAATAA GCtcctcctattaaATAA 61.8
1179 1179_1 GCTCCTCCTATTAAATA GCtcctcctattaaATA 60.2
1180 1180_1 TGCTCCTCCTATTAAATA TGctcctcctattaaATA 70.2
1181 1181_1 TGCTCCTCCTATTAAAT TGCtcctcctattaaAT 80.2
1182 1182_1 TTGCTCCTCCTATTAAAT TTGCtcctcctattaaAT 79
1183 1183_1 ATTTAATAAAACAAAAACCCT ATttaataaaacaaaaaCCCT 97.2
1184 1184_1 GCCCAAAAAACTAAATT GCCCaaaaaactaaaTT 95.5
1185 1185_1 GTTTTTACATTCTAACTT GTTtttacattctaaCTT 54.1
1186 1186_1 TGTTTTTACATTCTAACT TGTTtttacattctaaCT 63.8
1187 1187_1 CTGTTTTTACATTCTAAC CTGTttttacattctaAC 62.5
1188 1188_1 CCCCATTCAAATATTTAT CCCcattcaaatattTAT 64.9
1189 1189_1 GCCCCATTCAAATATTTAT GCcccattcaaatattTAT 86.2
1188 1188_2 CCCCATTCAAATATTTAT CCCCattcaaatatttAT 96.2
1190 1190_1 GCCCCATTCAAATATTTA GCcccattcaaatatTTA 82.2
1191 1191_1 CCATTCAAATATATACATTTT CCATtcaaatatatacattTT 72
1191 1191_2 CCATTCAAATATATACATTTT CCATtcaaataTatacattTT 37.7
1192 1192_1 TCCATTCAAATATATACATTT TCCAttcaaatatatacatTT 56.8
1193 1193_1 ATCCATTCAAATATATACATT ATCCattcaaaTatatacaTT 48
1194 1194_1 TCCATTCAAATATATACATT TCCAttcaaatatatacaTT 53.7
1193 1193_2 ATCCATTCAAATATATACATT ATCCattcaaatatatacaTT 54.7
1195 1195_1 TATCCATTCAAATATATACAT TATccattcaaatatataCAT 80.1
1196 1196_1 TCCATTCAAATATATACAT TCCattcaaatatataCAT 43.1
1197 1197_1 ATCCATTCAAATATATACA ATCCattcaaatatataCA 53.9
1198 1198_1 TTATCCATTCAAATATATACA TTatccattcaaatataTACA 69.4
1199 1199_1 TCCATTCAAATATATACA TCCAttcaaatatataCA 54.7
1200 1200_1 TATCCATTCAAATATATACA TATCcattcaaatatataCA 53.3
1201 1201_1 CTTTATCCATTCAAATATATA CTttatccattcaaataTATA 85.5
1202 1202_1 TCTTTATCCATTCAAATATAT TCTttatccattcaaataTAT 62.6
1203 1203_1 CTCTTTATCCATTCAAATATA CTCtttatccattcaaatATA 38.4
1204 1204_1 TCTTTATCCATTCAAATATA TCtttatccattcaaaTATA 70.9
1203 1203_2 CTCTTTATCCATTCAAATATA CTCTttatccattcaaataTA 33.6
1205 1205_1 CTTTATCCATTCAAATATA CTttatccattcaaaTATA 78.4
1206 1206_1 TCTCTTTATCCATTCAAATAT TCtctttatccattcaaaTAT 82
1207 1207_1 CTCTTTATCCATTCAAATAT CTCtttatccattcaaaTAT 39.8
1208 1208_1 TCTTTATCCATTCAAATAT TCTttatccattcaaaTAT 63.1
1209 1209_1 TCTCTTTATCCATTCAAATA TCtctttatccattcaAATA 65.2
1210 1210_1 CTCTTTATCCATTCAAATA CTCTttatccattcaaaTA 32.2
1211 1211_1 TCTCTTTATCCATTCAAAT TCTCtttatccattcaaAT 42
1212 1212_1 TCTCTTTATCCATTCAAA TCTCtttatccattcaAA 42.5
1213 1213_1 AGCACCATATATATCTCA AgcaccatatatatCTCA 16
1214 1214_1 GCACCATATATATCTCA GCaccatatatatcTCA 16
1215 1215_1 CAGCACCATATATATCTCA CagcaccatatatatCTCA 19.2
1215 1215_2 CAGCACCATATATATCTCA CAgcaccatatatatcTCA 24.1
1216 1216_1 AGCACCATATATATCTC AGCaccatatatatcTC 19.9
1217 1217_1 GCACCATATATATCTC GCACcatatatatcTC 82.7
1218 1218_1 CAGCACCATATATATCTC CAgcaccatatatatCTC 21.1
1219 1219_1 CAGCACCATATATATCT CAGcaccatatataTCT 28.9
1220 1220_1 ACAGCACCATATATATCT ACAGcaccatatatatCT 21.9
1221 1221_1 ACAGCACCATATATATC ACAGcaccatatataTC 25.4
1222 1222_1 CTATGTTATTATCCCCA CTAtgttattatcccCA 56.1
1223 1223_1 TCTATGTTATTATCCCC TctatgttattatcCCC 47.7
1224 1224_1 CTCTACACTCTAACTCT CtctacactctaaCTCT 79.3
1225 1225_1 TCTCTACACTCTAACTCT TctctacactctaaCTCT 79.6
1226 1226_1 TTCTCTACACTCTAACTCT TTCtctacactctaactCT 86.9
1227 1227_1 CTTCTCTACACTCTAACTCT CTtctctacactctaactCT 97
1227 1227_2 CTTCTCTACACTCTAACTCT CttctctacactctaacTCT 84.5
1228 1228_1 TTCTCTACACTCTAACTC TTCtctacactctaacTC 81.4
1229 1229_1 CTTCTCTACACTCTAACTC CttctctacactctaaCTC 89.1
1230 1230_1 TCTCTACACTCTAACTC TCtctacactctaaCTC 87.3
1231 1231_1 CCTTCTCTACACTCTAACTC CcttctctacactctaacTC 98.3
1232 1232_1 TTCTCTACACTCTAACT TTCTctacactctaaCT 80.1
1233 1233_1 CTTCTCTACACTCTAACT CTTctctacactctaaCT 73.6
1234 1234_1 CCTTCTCTACACTCTAACT CcttctctacactctAACT 77.7
1235 1235_1 CCTTCTCTACACTCTAAC CCTtctctacactctaAC 82.4
1236 1236_1 CTTCTCTACACTCTAAC CTtctctacactcTAAC 90.6
1237 1237_1 AGCCTTCTCTACACTCTAA AgccttctctacactcTAA 80
1238 1238_1 CCTTCTCTACACTCTAA CCttctctacactcTAA 72.2
1239 1239_1 GCCTTCTCTACACTCTAA GCcttctctacactctAA 62.9
1240 1240_1 AGCCTTCTCTACACTCTA AgccttctctacactcTA 85.2
1241 1241_1 TACTAACTACAACACAAATCA TACtaactacaacacaaaTCA 91.3
1241 1241_2 TACTAACTACAACACAAATCA TACtaactacAacacaaaTCA 81.1
1242 1242_1 CTACTAACTACAACACAAATC CTACtaactacaacacaaaTC 108
1243 1243_1 CACTACTAACTACAACACAAA CACTactaactacaacacaAA 74
1244 1244_1 CACTACTAACTACAACACAA CACtactaactacaacaCAA 87.4
1245 1245_1 ACACTACTAACTACAACACAA ACActactaactacaacaCAA 84.1
1246 1246_1 CACTACTAACTACAACACA CACTactaactacaacaCA 83.5
1247 1247_1 ACACTACTAACTACAACACA ACACtactaactacaacaCA 81.3
1248 1248_1 GACACTACTAACTACAACAC GACactactaactacaaCAC 51.6
1249 1249_1 GACACTACTAACTACAACA GACActactaactacaaCA 51
1250 1250_1 AGACACTACTAACTACAA AGAcactactaactaCAA 57.2
1251 1251_1 AGACACTACTAACTACA AGACactactaactaCA 34.7
1252 1252_1 ATCATTTACCCCCAACCT AtcatttacccccaacCT 96
1253 1253_1 ATCATTTACCCCCAACC AtcatttacccccAACC 89.1
1254 1254_1 CAAATCATTTACCCCCAA CaaatcatttacccCCAA 92
1255 1255_1 CCAAATCATTTACCCCCAA CcaaatcatttaccccCAA 91
1256 1256_1 ACCAAATCATTTACCCCCA AccaaatcatttaccccCA 89.9
1257 1257_1 TACCAAATCATTTACCCCC TaccaaatcatttacccCC 84
1258 1258_1 ACCAAATCATTTACCCC ACcaaatcatttacCCC 69.9
1259 1259_1 TACCAAATCATTTACCCC TACcaaatcatttaccCC 56.3
1260 1260_1 CTACCAAATCATTTACCCC CtaccaaatcatttaccCC 94
1261 1261_1 TACCAAATCATTTACCC TAccaaatcatttACCC 68.9
1262 1262_1 CTACCAAATCATTTACC CTACcaaatcatttaCC 70.3
1263 1263_1 TGCTACCAAATCATTTACC TgctaccaaatcattTACC 79
1264 1264_1 GCTACCAAATCATTTACC GCtaccaaatcatttACC 83.6
1265 1265_1 TGCTACCAAATCATTTAC TGCTaccaaatcatttAC 88.3
1266 1266_1 GCTACCAAATCATTTAC GCTaccaaatcattTAC 71.4
1267 1267_1 TGCTACCAAATCATTTA TGCtaccaaatcatTTA 79.8
1268 1268_1 CTGCTACCAAATCATTTA CTGctaccaaatcatTTA 75.3
1269 1269_1 ACTGCTACCAAATCATTT ACTGctaccaaatcatTT 83.4
1270 1270_1 CTGCTACCAAATCATTT CTGCtaccaaatcatTT 83
1271 1271_1 ACTGCTACCAAATCATT ACTGctaccaaatcaTT 71.1
1272 1272_1 CACTTTGCCATAATCAA CActttgccataaTCAA 26
1273 1273_1 TTATCTCAAACTATCCCCA TTAtctcaaactatcccCA 92.9
1274 1274_1 ATCTCAAACTATCCCCA ATctcaaactatccCCA 72.3
1275 1275_1 CTTATCTCAAACTATCCCCA CttatctcaaactatcccCA 85.5
1276 1276_1 TATCTCAAACTATCCCC TatctcaaactatcCCC 79.8
1277 1277_1 CTTATCTCAAACTATCCCC CTtatctcaaactatccCC 84
1278 1278_1 TTATCTCAAACTATCCCC TTAtctcaaactatccCC 89.7
1279 1279_1 CTTATCTCAAACTATCCC CttatctcaaactaTCCC 83.5
1280 1280_1 CCTTATCTCAAACTATCCC CcttatctcaaactatcCC 87.6
1279 1279_2 CTTATCTCAAACTATCCC CTtatctcaaactatCCC 76.9
1281 1281_1 TTATCTCAAACTATCCC TtatctcaaactaTCCC 84.7
1282 1282_1 CTTATCTCAAACTATCC CTTatctcaaactaTCC 78.3
1283 1283_1 CCCTTATCTCAAACTATCC CccttatctcaaactaTCC 76.4
1284 1284_1 CCTTATCTCAAACTATCC CCTtatctcaaactatCC 69.3
1285 1285_1 CCTTATCTCAAACTATC CCttatctcaaacTATC 75.9
1286 1286_1 GCCCTTATCTCAAACTATC GCccttatctcaaactaTC 76.6
1287 1287_1 CCCTTATCTCAAACTATC CCcttatctcaaacTATC 67.2
1288 1288_1 TGCCCTTATCTCAAACTAT TgcccttatctcaaacTAT 90.5
1289 1289_1 GCCCTTATCTCAAACTAT GCccttatctcaaacTAT 71.9
1290 1290_1 CCCTTATCTCAAACTAT CCCTtatctcaaactAT 77.7
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1372 1372_1 TAAAAGATCACACAACCA TAaaagatcacacaACCA 47.5
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1402 1402_1 TCCTAATTTAACCCACA TCCtaatttaacccACA 38.3
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1420 1420_2 CATCATTTATCACTACCAC CatcatttatcactaCCAC 34.3
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1423 1423_1 CATCATTTATCACTACCA CATCatttatcactacCA 11.3
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1425 1425_1 ACATCATTTATCACTACCA ACATcatttatcactacCA 19
1422 1422_2 AACATCATTTATCACTACCA AACatcatttatcactaCCA 25
1424 1424_2 TAACATCATTTATCACTACCA TaacatcatttatcactACCA 61.3
1425 1425_2 ACATCATTTATCACTACCA ACatcatttatcactACCA 23.5
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1432 1432_2 ATTAACATCATTTATCACTAC ATtaacatcAtttatcaCTAC 62.8
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1443 1443_1 CCCTAATTAACATCATTTA CCCtaattaacatcattTA 88.7
1444 1444_1 GCCCTAATTAACATCATTT GCCctaattaacatcatTT 87.9
1445 1445_1 CCCTAATTAACATCATTT CCCTaattaacatcatTT 75.6
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1447 1447_1 CTCGGCCCTAATTAA CTCggccctaatTAA 57.4
1448 1448_1 CACATATAACATATAAACACA CACAtataacatataaacaCA 61.7
1449 1449_1 TCACATATAACATATAAACAC TCAcatataacatataaaCAC 43.6
1450 1450_1 ACTATCACATATAACATATA ACTAtcacatataacataTA 58.5
1451 1451_1 CACTATCACATATAACATATA CACTatcacatataacataTA 28.1
1452 1452_1 CACTATCACATATAACATAT CACtatcacatataacaTAT 52
1453 1453_1 CACTATCACATATAACATA CACTatcacatataacaTA 24.3
1454 1454_1 CACTATCACATATAACAT CACtatcacatataaCAT 40.1
1455 1455_1 CACTATCACATATAACA CACTatcacatataaCA 27
1456 1456_1 CAAAGTTTTCCCATTAC CAaagttttcccaTTAC 21
1457 1457_1 ACAAAGTTTTCCCATTA ACAaagttttcccaTTA 20.5
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1472 1472_1 TAAACATTAAACCCTCC TAaacattaaaccCTCC 82.2
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1482 1482_1 GCTTTAAACTATAAACATT GCtttaaactataaaCATT 58.2
1483 1483_1 TGCTTTAAACTATAAACA TGCTttaaactataaaCA 57.2
1484 1484_1 CAGATTTATCACTATTA CAGAtttatcactatTA 15.4
1485 1485_1 TCACAGCCTATCACCAC TCacagcctatcacCAC 47.3
1485 1485_2 TCACAGCCTATCACCAC TCAcagcctatcaccAC 46.3
1486 1486_1 ATCACAGCCTATCACCA AtcacagcctatcACCA 56.9
1486 1486_2 ATCACAGCCTATCACCA ATCacagcctatcacCA 23.7
1487 1487_1 AATCACAGCCTATCACC AATCacagcctatcaCC 32.9
1487 1487_2 AATCACAGCCTATCACC AatcacagcctatCACC 52.2
1488 1488_1 ATCACAGCCTATCACC AtcacagcctatCACC 60.1
1489 1489_1 GCGTCACCCAAATCAC GCgtcacccaaatCAC 11
1490 1490_1 AGCGTCACCCAAATCA AG mcgtcacccaaaTCA 17.4
1491 1491_1 AGCGTCACCCAAATC AG mcgtcacccaAATC 18.8
1492 1492_1 CAGATCCTAAAATCACT CAGAtcctaaaatcaCT 71.8
1493 1493_1 TCAGATCCTAAAATCAC TCAgatcctaaaatCAC 66.2
1494 1494_1 AGTAAAACCAATCATCAT AGTaaaaccaatcatCAT 30.8
1495 1495_1 AGTAAAACCAATCATCA AGTaaaaccaatcaTCA 24.2
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1497 1497_1 ATAACTACATAACAAACCCA ATaactacataacaaaCCCA 69.1
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1500 1500_1 TAACTACATAACAAACCCA TAactacataacaaaCCCA 65
1501 1501_1 ACTACATAACAAACCCA ACtacataacaaaCCCA 60.4
1502 1502_1 CAATAACTACATAACAAACCC CAAtaactacataacaaaCCC 72.6
1503 1503_1 ATAACTACATAACAAACCC ATAactacataacaaaCCC 60.2
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1510 1510_1 CCCCTTGTAACTAAAAA CCCCttgtaactaaaAA 86.1
1511 1511_1 CCCCTTGTAACTAAAA CCCCttgtaactaaAA 101
1512 1512_1 ACCCCTTGTAACTAAA ACCCcttgtaactaAA 88.8
1513 1513_1 CACCCCTTGTAACTAA CAccccttgtaaCTAA 80.4
1514 1514_1 ACACCCCTTGTAACTA ACACcccttgtaacTA 72.4
1515 1515_1 GCTAAAACTAATCATCT GCTaaaactaatcaTCT 72.2
1516 1516_1 GGCTAAAACTAATCAT GGCtaaaactaatCAT 70.8
1517 1517_1 TTACCCTTCATATATACATCT TtacccttcatatatacaTCT 89.4
1518 1518_1 ATTACCCTTCATATATACATC AttacccttcatatataCATC 82.4
1519 1519_1 TTACCCTTCATATATACATC TTAcccttcatatatacATC 56.3
1520 1520_1 CATTACCCTTCATATATACAT CAttacccttcatatataCAT 84.2
1521 1521_1 TTACCCTTCATATATACAT TTAcccttcatatataCAT 55.3
1522 1522_1 ATTACCCTTCATATATACAT ATTacccttcatatataCAT 49.3
1523 1523_1 ACATTACCCTTCATATATACA ACAttacccttcatatataCA 55.2
1523 1523_2 ACATTACCCTTCATATATACA AcattacccttcatataTACA 63.4
1524 1524_1 TTACCCTTCATATATACA TTACccttcatatataCA 46.9
1525 1525_1 CATTACCCTTCATATATACA CattacccttcatataTACA 66
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1529 1529_1 CATTACCCTTCATATATAC CATtacccttcatataTAC 63.4
1530 1530_1 ACATTACCCTTCATATATAC ACAttacccttcatataTAC 34.5
1531 1531_1 TACATTACCCTTCATATATAC TAcattacccttcatataTAC 76.9
1532 1532_1 CATTACCCTTCATATATA CAttacccttcataTATA 76.5
1533 1533_1 TACATTACCCTTCATATATA TACattacccttcatatATA 36.5
1534 1534_1 ATTACCCTTCATATATA ATtacccttcataTATA 78
1535 1535_1 ACATTACCCTTCATATATA ACattacccttcataTATA 59.5
1536 1536_1 CATTACCCTTCATATAT CATtacccttcataTAT 73.7
1537 1537_1 ACATTACCCTTCATATAT ACAttacccttcataTAT 46.1
1538 1538_1 TACATTACCCTTCATATAT TACattacccttcataTAT 36.9
1539 1539_1 ACATTACCCTTCATATA ACattacccttcaTATA 54.2
1540 1540_1 TACATTACCCTTCATATA TAcattacccttcaTATA 71.5
1541 1541_1 TACATTACCCTTCATAT TACattacccttcaTAT 34.5
1542 1542_1 GATTCTTATACTTACTA GATtcttatacttaCTA 46.2
1543 1543_1 TGATTCTTATACTTACT TGattcttatactTACT 45.7
1544 1544_1 ATGATTCTTATACTTACT ATGAttcttatacttaCT 54
1545 1545_1 GCCTCATTTTTACCTTT GCctcatttttaccTTT 82.6
1546 1546_1 ACCAATCTTCTATTTTA ACCAatcttctatttTA 94.8
1547 1547_1 CAACCAATCTTCTATTTTA CAACcaatcttctatttTA 90.3
1548 1548_1 GCAACCAATCTTCTATTTT GCAAccaatcttctattTT 88.3
1549 1549_1 GCAACCAATCTTCTATTT GCAaccaatcttctaTTT 85
1550 1550_1 GCAACCAATCTTCTATT GCaaccaatcttcTATT 87.3
1551 1551_1 TGCAACCAATCTTCTATT TGCaaccaatcttctaTT 90.2
1552 1552_1 TAACTGCAACCAATCTT TAactgcaaccaaTCTT 88.2
1553 1553_1 TGAATACAACACACATCA TGAatacaacacacaTCA 97.4
1554 1554_1 ATGAATACAACACACATCA ATGAatacaacacacatCA 84.4
1555 1555_1 TAAAAATATAACTACTCCT TAaaaatataactacTCCT 99.8
1556 1556_1 GTAAAAATATAACTACTCC GTaaaaatataactaCTCC 93.7
1557 1557_1 TCAACTGATACCCACAA TCAactgatacccaCAA 57.7
1558 1558_1 TGTCTTAACATTTTTCTT TGTCttaacatttttcTT 63.1
1559 1559_1 CCACTTCAAACTTTTAATTAA CCActtcaaacttttaatTAA 85
1560 1560_1 CCACTTCAAACTTTTAATTA CCACttcaaacttttaatTA 84.9
1561 1561_1 CCCACTTCAAACTTTTAATTA CCcacttcaaacttttaaTTA 88.7
1562 1562_1 CCACTTCAAACTTTTAATT CCACttcaaacttttaaTT 79.1
1563 1563_1 CCCACTTCAAACTTTTAATT CCCacttcaaacttttaaTT 86.2
1564 1564_1 ACCCACTTCAAACTTTTAATT ACCcacttcaaacttttaaTT 100
1565 1565_1 CCACTTCAAACTTTTAAT CCACttcaaacttttaAT 85.3
1566 1566_1 ACCCACTTCAAACTTTTAAT ACCcacttcaaacttttAAT 88.8
1567 1567_1 AACCCACTTCAAACTTTTAAT AACCcacttcaaacttttaAT 92.3
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1569 1569_1 ACCCACTTCAAACTTTTAA ACCcacttcaaactttTAA 82.5
1570 1570_1 CCCACTTCAAACTTTTA CCCacttcaaactttTA 79.6
1571 1571_1 ACCCACTTCAAACTTTTA ACCcacttcaaacttTTA 77.2
1572 1572_1 AACCCACTTCAAACTTTTA AACCcacttcaaactttTA 86.2
1573 1573_1 ACCCACTTCAAACTTTT ACCCacttcaaacttTT 93.3
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1578 1578_1 CTGTATTTACCAATTCAA CTGtatttaccaattCAA 90.8
1579 1579_1 CTGTATTTACCAATTCA CTGTatttaccaattCA 88.7
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1581 1581_1 ACTGTATTTACCAATTC ACTGtatttaccaatTC 104
1582 1582_1 CACTGTATTTACCAATT CACTgtatttaccaaTT 91.1
1583 1583_1 TCACTGTATTTACCAAT TCACtgtatttaccaAT 98.6
1584 1584_1 CCAACTACTTTACTTTTCAAA CCaactactttacttttCAAA 84.3
1585 1585_1 CCAACTACTTTACTTTTCAA CCaactactttactttTCAA 80
1586 1586_1 ACCAACTACTTTACTTTTCAA ACcaactactttactttTCAA 85.1
1585 1585_2 CCAACTACTTTACTTTTCAA CCAactactttacttttCAA 75.2
1587 1587_1 CCAACTACTTTACTTTTCA CCAactactttacttttCA 71.9
1588 1588_1 TACCAACTACTTTACTTTTCA TaccaactactttacttTTCA 82.8
1587 1587_2 CCAACTACTTTACTTTTCA CCAactactttactttTCA 67.7
1589 1589_1 ACCAACTACTTTACTTTTCA ACcaactactttactttTCA 84
1590 1590_1 TACCAACTACTTTACTTTTC TACcaactactttacttTTC 75.3
1591 1591_1 GTACCAACTACTTTACTTT GTACcaactactttactTT 75.8
1592 1592_1 GTACCAACTACTTTACTT GTAccaactactttaCTT 65.7
1593 1593_1 GTACCAACTACTTTACT GTACcaactactttaCT 74.5
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1598 1598_1 TTGTACCAACTACTTTA TTGTaccaactacttTA 49.3
1599 1599_1 ATTTCATTTTTCTTTTAATA ATTtcatttttcttttaATA 98.6
1599 1599_2 ATTTCATTTTTCTTTTAATA ATTTcatttttcttttaaTA 90.7
1600 1600_1 CCTAATTTCATTTTTCTTTT CCtaatttcatttttcTTTT 69.2
1601 1601_1 TCCTAATTTCATTTTTCTTT TCctaatttcatttttCTTT 47
1602 1602_1 TTCTTCATTATACCATCAAAT TTCTtcattataccatcaaAT 29.4
1603 1603_1 TTTCTTCATTATACCATCAAA TTTCttcattataccatcaAA 24.1
1604 1604_1 TTTTCTTCATTATACCATCAA TTttcttcattataccaTCAA 14.3
1605 1605_1 TCTTCATTATACCATCAA TCttcattataccaTCAA 5.02
1606 1606_1 TTTCTTCATTATACCATCAA TTtcttcattataccaTCAA 21.2
1607 1607_1 TTCTTCATTATACCATCAA TTCttcattataccatCAA 5.83
1608 1608_1 ATATTTTCTTCATTATACCAT AtattttcttcattataCCAT 76.1
1609 1609_1 ATATTTTCTTCATTATACCA ATattttcttcattataCCA 40.2
1610 1610_1 AATATTTTCTTCATTATACCA AATattttcttcattataCCA 37
1611 1611_1 AAATATTTTCTTCATTATACC AAatattttcttcattaTACC 23.4
1612 1612_1 ATATTTTCTTCATTATACC ATattttcttcattaTACC 14.2
1613 1613_1 AATATTTTCTTCATTATACC AATAttttcttcattataCC 68
1614 1614_1 TAAATATTTTCTTCATTATA TAaatattttcttcatTATA 96.8
1615 1615_1 TTTTCCTTCATCTACTTCT TTTtccttcatctacttCT 42.8
1616 1616_1 ATTTTCCTTCATCTACTTCT ATtttccttcatctacttCT 76
1617 1617_1 AATTTTCCTTCATCTACTTC AATTttccttcatctactTC 54.9
1618 1618_1 AGAATTTTCCTTCATCTA AgaattttccttcaTCTA 58
1619 1619_1 CAGAATTTTCCTTCATCT CAgaattttccttcATCT 23.5
1620 1620_1 TCAGAATTTTCCTTCATC TCAgaattttccttcaTC 29.7
1621 1621_1 CTAGAAATATCTCACATT CTAGaaatatctcacaTT 64.6
1622 1622_1 CTAGAAATATCTCACAT CTAgaaatatctcaCAT 75.5
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1624 1624_1 ATTAGCCATTAATCTAT ATtagccattaatCTAT 71.9
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1625 1625_2 TTGTTACAAAATAATCCA TTGttacaaaataatCCA 23.8
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1627 1627_1 TGCCAAAATACTAACATCA TGCcaaaatactaacaTCA 32
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1630 1630_1 GAGTACAACACTTACA GAGTacaacacttaCA 31.8
1631 1631_1 CACATCCATTCATTTTAT CACatccattcatttTAT 30.6
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1647 1647_2 TATCCTCATTACCCATT TATCctcattacccaTT 22.3
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1649 1649_1 AATATCCTCATTACCCAT AAtatcctcattacCCAT 46.1
1650 1650_1 TAATATCCTCATTACCCAT TAAtatcctcattaccCAT 58.3
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1652 1652_1 ATATCCTCATTACCCAT ATAtcctcattaccCAT 56.2
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1656 1656_2 TTAATATCCTCATTACCCA TTAAtatcctcattaccCA 57.9
1654 1654_2 TAATATCCTCATTACCCA TAAtatcctcattacCCA 40
1653 1653_2 AATATCCTCATTACCCA AATatcctcattacCCA 44.8
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1666 1666_1 ATTTAATATCCTCATTACC ATttaatatcctcatTACC 55.5
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1668 1668_1 TTAAATTTAATATCCTCATTA TTAaatttaatatcctcaTTA 95.2
1669 1669_1 CTTAAATTTAATATCCTCATT CTtaaatttaatatcctCATT 73.2
1670 1670_1 TCTTAAATTTAATATCCTCAT TCttaaatttaatatccTCAT 46.8
1671 1671_1 TCTTAAATTTAATATCCTCA TCttaaatttaatatcCTCA 29.8
1672 1672_1 TTCTTAAATTTAATATCCTCA TTCttaaatttaatatccTCA 35
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1674 1674_1 TCTTAAATTTAATATCCTC TCttaaatttaatatCCTC 25.1
1675 1675_1 TTCTTAAATTTAATATCCT TTCttaaatttaatatCCT 46.9
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1680 1680_1 ACCAGCAACAATTATTAA ACCagcaacaattatTAA 20.5
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1681 1681_1 ACCAGCAACAATTATTA ACCAgcaacaattatTA 39.4
1682 1682_1 TACCAGCAACAATTATT TACCagcaacaattaTT 26.4
1683 1683_1 CCCCAAATCTAAAACACTTC CCccaaatctaaaacacTTC 79.4
1684 1684_1 AACCCCAAATCTAAAACACTT AACCccaaatctaaaacacTT 82
1685 1685_1 CCCCAAATCTAAAACACTT CCCcaaatctaaaacacTT 86.4
1686 1686_1 AACCCCAAATCTAAAACACT AACCccaaatctaaaacaCT 75.2
1687 1687_1 ACCCCAAATCTAAAACACT ACcccaaatctaaaaCACT 72.5
1688 1688_1 ACCCCAAATCTAAAACAC ACCccaaatctaaaaCAC 80.9
1689 1689_1 GCAAATATTCACAAATCCT GCAaatattcacaaatCCT 20.7
1689 1689_2 GCAAATATTCACAAATCCT GCaaatattcacaaaTCCT 29.3
1690 1690_1 ACTATTTAACACACATTATCA ACTatttaacacacattaTCA 36.6
1691 1691_1 CTATTTAACACACATTATCA CTAtttaacacacattaTCA 49.6
1692 1692_1 TACTATTTAACACACATTATC TACTatttaacacacattaTC 52.4
1693 1693_1 ACTATTTAACACACATTATC ACTAtttaacacacattaTC 51.8
1694 1694_1 TACTATTTAACACACATTAT TACtatttaacacacatTAT 91.1
1695 1695_1 CTACTATTTAACACACATTAT CTActatttaacacacatTAT 72.7
1696 1696_1 CTACTATTTAACACACATTA CTACtatttaacacacatTA 47.4
1697 1697_1 ACTACTATTTAACACACATTA ACTActatttaacacacatTA 38.3
1698 1698_1 CTACTATTTAACACACATT CTACtatttaacacacaTT 41.6
1699 1699_1 ACTACTATTTAACACACATT ACtactatttaacacaCATT 40.3
1700 1700_1 ACTACTATTTAACACACAT ACTactatttaacacaCAT 36.8
1701 1701_1 CTACTATTTAACACACA CTACtatttaacacaCA 45.9
1702 1702_1 ACTACTATTTAACACACA ACTActatttaacacaCA 32.6
1703 1703_1 TATAGACCCTTAATATT TATAgacccttaataTT 41.4
1704 1704_1 TTATAGACCCTTAATAT TTAtagacccttaaTAT 68.5
1705 1705_1 CATCACAAAATAACCTATCAT CAtcacaaaataacctaTCAT 86.8
1706 1706_1 TCATCACAAAATAACCTATCA TCAtcacaaaataacctaTCA 67.4
1707 1707_1 TTCATCACAAAATAACCTATC TTCAtcacaaaataacctaTC 49
1708 1708_1 TTCATCACAAAATAACCTA TTcatcacaaaataaCCTA 76.4
1709 1709_1 TTTCATCACAAAATAACCTA TTtcatcacaaaataaCCTA 88.6
1710 1710_1 TCATCACAAAATAACCTA TCatcacaaaataaCCTA 59.2
1711 1711_1 TTTTCATCACAAAATAACCTA TTttcatcacaaaataaCCTA 86.1
1712 1712_1 ATTTTCATCACAAAATAACCT ATTttcatcacaaaataaCCT 64.8
1713 1713_1 TATTTTCATCACAAAATAACC TATTttcatcacaaaataaCC 76.9
1713 1713_2 TATTTTCATCACAAAATAACC TATTttcatcaCaaaataaCC 56
1714 1714_1 GTATTTTCATCACAAAATA GTATtttcatcacaaaaTA 47
1715 1715_1 TTACCTAGATCACTCC TtacctagatcaCTCC 73.1
1716 1716_1 CTTACCTAGATCACTC CTTacctagatcaCTC 81.5
1717 1717_1 CCTTACCTAGATCACT CCTtacctagatcaCT 95.9
1718 1718_1 TAACTGCTCCTTAATCC TAActgctccttaatCC 34.8
1719 1719_1 TCTAGCAATCCTCTCCT TCtagcaatcctctcCT 64.2
1720 1720_1 TTCTAGCAATCCTCTCC TtctagcaatcctcTCC 70.4
1721 1721_1 TTTTCACCTACTAATATTCAT TTttcacctactaatatTCAT 55.3
1722 1722_1 TTTCACCTACTAATATTCAT TTtcacctactaatatTCAT 66.2
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1732 1732_1 TATTTTTCACCTACTAATATT TAtttttcacctactaaTATT 90.2
1733 1733_1 TATTTTTCACCTACTAATAT TATttttcacctactaaTAT 89.1
1734 1734_1 TTATTTTTCACCTACTAATAT TTAtttttcacctactaaTAT 86.1
1735 1735_1 TTATTTTTCACCTACTAATA TTATttttcacctactaaTA 52.9
1736 1736_1 TATTTTTCACCTACTAATA TATTtttcacctactaaTA 54.9
1737 1737_1 TTTATTTTTCACCTACTAATA TTTAtttttcacctactaaTA 52
1738 1738_1 TTTATTTTTCACCTACTAA TTtatttttcacctaCTAA 51.2
1739 1739_1 TTTATTTTTCACCTACTA TTTatttttcacctaCTA 19
1740 1740_1 CTCAACTTCTACTACTAATT CTCAacttctactactaaTT 19.7
1741 1741_1 TCTCAACTTCTACTACTAATT TCTCaacttctactactaaTT 25.8
1742 1742_1 CTCTCAACTTCTACTACTAAT CTCtcaacttctactactAAT 43
1743 1743_1 CTCAACTTCTACTACTAAT CTCAacttctactactaAT 20.1
1744 1744_1 TCTCAACTTCTACTACTAAT TCTCaacttctactactaAT 22.8
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1768 1768_1 TTTCTCTCAACTTCTACT TTTCtctcaacttctaCT 28.6
1769 1769_1 TTTTCTCTCAACTTCTACT TTTtctctcaacttctaCT 44.1
1770 1770_1 CTTTTTCTCTCAACTTCTACT CtttttctctcaacttctaCT 99.8
1771 1771_1 TTTTTCTCTCAACTTCTACT TTTttctctcaacttctaCT 43.7
1772 1772_1 CTTTTTCTCTCAACTTCTAC CTTtttctctcaacttctAC 36.2
1773 1773_1 ACTTTTTCTCTCAACTTCTAC ACTttttctctcaacttctAC 35.6
1774 1774_1 TTTTCTCTCAACTTCTAC TtttctctcaacttCTAC 38.6
1775 1775_1 TTTTTCTCTCAACTTCTAC TttttctctcaacttCTAC 42.1
1776 1776_1 CTTTTTCTCTCAACTTCTA CTttttctctcaacttCTA 41.2
1777 1777_1 TACTTTTTCTCTCAACTTCTA TactttttctctcaacttCTA 69.4
1778 1778_1 ACTTTTTCTCTCAACTTCTA ActttttctctcaacttCTA 66.2
1779 1779_1 TTTTTCTCTCAACTTCTA TttttctctcaactTCTA 35.5
1780 1780_1 TACTTTTTCTCTCAACTTCT TActttttctctcaacttCT 65
1781 1781_1 TTACTTTTTCTCTCAACTTCT TtactttttctctcaactTCT 62.1
1782 1782_1 TTACTTTTTCTCTCAACTTC TTActttttctctcaactTC 38.9
1783 1783_1 TACTTTTTCTCTCAACTTC TACtttttctctcaactTC 34
1784 1784_1 ACTTTTTCTCTCAACTTC ActttttctctcaaCTTC 19.7
1785 1785_1 TTACTTTTTCTCTCAACTT TTActttttctctcaaCTT 22
1786 1786_1 TACTTTTTCTCTCAACTT TACtttttctctcaaCTT 22.3
1787 1787_1 TTACTTTTTCTCTCAACT TTACtttttctctcaaCT 11.6
1788 1788_1 GTTACTTTTTCTCTCAACT GTtactttttctctcAACT 43.2
1789 1789_1 GTTACTTTTTCTCTCAAC GTtactttttctctCAAC 29
1790 1790_1 GTTACTTTTTCTCTCAA GTtactttttctcTCAA 5.53
1791 1791_1 AGTTACTTTTTCTCTCAA AGTtactttttctctCAA 6.5
1792 1792_1 CTTTTACATTCCCATTAACA CTTTtacattcccattaaCA 24.5
1793 1793_1 CACTTTTACATTCCCATTAAC CACttttacattcccattaAC 25.3
1794 1794_1 CTTTTACATTCCCATTAAC CTtttacattcccatTAAC 21.5
1795 1795_1 ACTTTTACATTCCCATTAAC ACttttacattcccatTAAC 23
1796 1796_1 ACTTTTACATTCCCATTAA ACttttacattcccaTTAA 30
1797 1797_1 CTTTTACATTCCCATTAA CTtttacattcccaTTAA 27.4
1798 1798_1 CACTTTTACATTCCCATTAA CActtttacattcccaTTAA 28
1798 1798_2 CACTTTTACATTCCCATTAA CACttttacattcccatTAA 15.9
1799 1799_1 TACACTTTTACATTCCCATTA TAcacttttacattcccatTA 52.2
1800 1800_1 ACTTTTACATTCCCATTA ACTtttacattcccaTTA 13.1
1801 1801_1 CACTTTTACATTCCCATTA CActtttacattcccATTA 15.7
1802 1802_1 ACACTTTTACATTCCCATTA ACacttttacattcccaTTA 19.1
1802 1802_2 ACACTTTTACATTCCCATTA ACActtttacattcccatTA 9.66
1803 1803_1 CACTTTTACATTCCCATT CActtttacattccCATT 10.2
1804 1804_1 TACACTTTTACATTCCCATT TACacttttacattcccaTT 10.3
1805 1805_1 ACACTTTTACATTCCCATT ACACttttacattcccaTT 4.51
1805 1805_2 ACACTTTTACATTCCCATT ACacttttacattccCATT 6.8
1806 1806_1 TACACTTTTACATTCCCAT TACacttttacattccCAT 3.53
1806 1806_2 TACACTTTTACATTCCCAT TACActtttacattcccAT 4.79
1807 1807_1 TACACTTTTACATTCCCA TACacttttacattccCA 6.35
1808 1808_1 GTACACTTTTACATTCCCA GtacacttttacattcCCA 3
1808 1808_2 GTACACTTTTACATTCCCA GTacacttttacattccCA 16.3
1809 1809_1 GTACACTTTTACATTCCC GTAcacttttacattcCC 4.33
1810 1810_1 TACACTTTTACATTCCC TACacttttacattcCC 3.26
1811 1811_1 TGTACACTTTTACATTCCC TGtacacttttacattcCC 12.3
1809 1809_2 GTACACTTTTACATTCCC GtacacttttacattCCC 2.49
1812 1812_1 TGTACACTTTTACATTCC TGtacacttttacatTCC 2.47
1813 1813_1 CTGTACACTTTTACATTC CTGtacacttttacaTTC 1.89
1814 1814_1 ATCTTATTTACATCTTCC ATcttatttacatcTTCC 5.41
1815 1815_1 GAATCTTATTTACATCTTC GAatcttatttacatCTTC 25.8
1816 1816_1 GAATCTTATTTACATCTT GAatcttatttacaTCTT 19.1
1817 1817_1 TGAATCTTATTTACATCT TGAatcttatttacaTCT 41.3
1818 1818_1 ATTCAGCTTTTTCAATC ATTCagctttttcaaTC 16.8
1819 1819_1 TTAATTTTCCCTTCACTCCT TtaattttcccttcactcCT 85.8
1820 1820_1 TTAATTTTCCCTTCACTCC TtaattttcccttcactCC 85.8
1821 1821_1 TTAATTTTCCCTTCACTC TtaattttcccttcACTC 51
1822 1822_1 GTTAATTTTCCCTTCACTC GttaattttcccttcACTC 27.2
1823 1823_1 CAAAATTACTTCTTTTATCAT CAaaattacttcttttaTCAT 86.7
1823 1823_2 CAAAATTACTTCTTTTATCAT CAaaattacTtcttttaTCAT 51.5
1824 1824_1 CCAAAATTACTTCTTTTATCA CCAaaattacttcttttaTCA 31.3
1824 1824_2 CCAAAATTACTTCTTTTATCA CCaaaattacttcttttATCA 36
1825 1825_1 TCCAAAATTACTTCTTTTATC TCcaaaattacttctttTATC 40.9
1826 1826_1 TCCAAAATTACTTCTTTTAT TCCaaaattacttctttTAT 50.2
1827 1827_1 CCAAAATTACTTCTTTTAT CCAaaattacttctttTAT 70
1828 1828_1 TTCCAAAATTACTTCTTTTAT TTCcaaaattacttctttTAT 64.9
1829 1829_1 TCCAAAATTACTTCTTTTA TCCAaaattacttctttTA 36.9
1830 1830_1 TTCCAAAATTACTTCTTTTA TTCCaaaattacttctttTA 52.2
1831 1831_1 GTTCCAAAATTACTTCTTT GTTCcaaaattacttctTT 54.8
1832 1832_1 GTTCCAAAATTACTTCTT GTtccaaaattactTCTT 12.5
1833 1833_1 TGTTCCAAAATTACTTCT TGTtccaaaattactTCT 20.1
1834 1834_1 ATGTTCCAAAATTACTTC ATGTtccaaaattactTC 23.8
1835 1835_1 CATATTTTACTCTTTTTATT CATAttttactctttttaTT 90.6
1836 1836_1 CCATATTTTACTCTTTTTAT CCATattttactctttttAT 35.4
1836 1836_2 CCATATTTTACTCTTTTTAT CCAtattttactcttttTAT 60.8
1837 1837_1 CCCATATTTTACTCTTTTTAT CccatattttactctttTTAT 75.8
1838 1838_1 CATATTTTACTCTTTTTAT CATattttactcttttTAT 83.2
1839 1839_1 CCCATATTTTACTCTTTTTA CCcatattttactcttttTA 81.1
1840 1840_1 CCATATTTTACTCTTTTTA CCatattttactcttTTTA 24.7
1841 1841_1 ACCCATATTTTACTCTTTTTA AcccatattttactcttTTTA 59
1842 1842_1 CCATATTTTACTCTTTTT CCATattttactctttTT 21.6
1843 1843_1 CCCATATTTTACTCTTTTT CCcatattttactcttTTT 77.2
1844 1844_1 ACCCATATTTTACTCTTTTT ACccatattttactctTTTT 97.4
1845 1845_1 TACCCATATTTTACTCTTTTT TAcccatattttactcttTTT 58.6
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1847 1847_1 CCCATATTTTACTCTTTT CCCatattttactcttTT 93.2
1848 1848_1 ACCCATATTTTACTCTTTT ACCcatattttactcttTT 21.8
1846 1846_2 TACCCATATTTTACTCTTTT TAcccatattttactcTTTT 22.5
1849 1849_1 TTACCCATATTTTACTCTTTT TTAcccatattttactcttTT 41.4
1850 1850_1 TACCCATATTTTACTCTTT TAcccatattttactCTTT 18.9
1851 1851_1 ACCCATATTTTACTCTTT ACCcatattttactcTTT 13.4
1852 1852_1 TTACCCATATTTTACTCTTT TTacccatattttactCTTT 14.5
1853 1853_1 TTTACCCATATTTTACTCTTT TTTacccatattttactcTTT 22.2
1852 1852_2 TTACCCATATTTTACTCTTT TTACccatattttactctTT 16.7
1853 1853_2 TTTACCCATATTTTACTCTTT TTTAcccatattttactctTT 16
1854 1854_1 TTACCCATATTTTACTCTT TTAcccatattttactCTT 14
1855 1855_1 TTTACCCATATTTTACTCTT TTtacccatattttacTCTT 14.9
1856 1856_1 ACCCATATTTTACTCTT ACCcatattttactCTT 8.02
1857 1857_1 TACCCATATTTTACTCTT TACccatattttactCTT 16.7
1858 1858_1 TACCCATATTTTACTCT TACccatattttacTCT 22.3
1859 1859_1 TTACCCATATTTTACTCT TTACccatattttactCT 15.2
1860 1860_1 TTTACCCATATTTTACTCT TTTAcccatattttactCT 11.8
1861 1861_1 TTACCCATATTTTACTC TTAcccatattttaCTC 24.4
1862 1862_1 TTTACCCATATTTTACTC TTTacccatattttaCTC 14
1863 1863_1 GTTTACCCATATTTTACTC GTttacccatattttaCTC 12.2
1864 1864_1 GTTTACCCATATTTTACT GTttacccatatttTACT 24.9
1865 1865_1 TGTTTACCCATATTTTAC TGTttacccatatttTAC 13.1
1866 1866_1 GTTTACCCATATTTTAC GTttacccatattTTAC 13.2
1867 1867_1 TGTTTACCCATATTTTA TGTttacccatattTTA 6.69
1868 1868_1 TTCTTGCTTCAACCATC TtcttgcttcaacCATC 13.6
1869 1869_1 GTTACCTCCCTTTATAT GTtacctccctttatAT 60.9
1870 1870_1 GGTTACCTCCCTTTAT GgttacctccctTTAT 39
1871 1871_1 AGGTTACCTCCCTTTA AggttacctcccTTTA 35.4
1872 1872_1 ATGTTCTCTATCTCTATA ATGttctctatctctATA 53.3
1873 1873_1 TATGTTCTCTATCTCTA TAtgttctctatctCTA 73.4
1874 1874_1 AGATCAAACTAAAACCT AGAtcaaactaaaaCCT 88.7
1875 1875_1 TGCCCAATTTCACCCAA TGcccaatttcacccAA 30.3
1876 1876_1 TTTGCCCAATTTCACCC TttgcccaatttcacCC 53.3
1877 1877_1 TTTTGCCCAATTTCACC TTttgcccaatttcaCC 57.8
1878 1878_1 TGTATATCAACAATTCAT TGTatatcaacaattCAT 20.8
1879 1879_1 ACATTTCTTTAAAATTTCCA ACatttctttaaaattTCCA 96.4
1879 1879_2 ACATTTCTTTAAAATTTCCA ACAtttctttaaaatttCCA 96.6
1880 1880_1 CACATTTCTTTAAAATTTCCA CACAtttctttaaaatttcCA 95.5
1879 1879_3 ACATTTCTTTAAAATTTCCA AcatttctttaaaattTCCA 98.1
1879 1879_4 ACATTTCTTTAAAATTTCCA ACATttctttaaaatttcCA 98
1881 1881_1 CCACATTTCTTTAAAATTTCC CcacatttctttaaaatTTCC 90
1882 1882_1 CACATTTCTTTAAAATTTCC CAcatttctttaaaattTCC 94.8
1882 1882_2 CACATTTCTTTAAAATTTCC CAcatttctttaaaatTTCC 89.1
1882 1882_3 CACATTTCTTTAAAATTTCC CACAtttctttaaaatttCC 94.4
1883 1883_1 ACATTTCTTTAAAATTTCC ACAtttctttaaaattTCC 91.9
1882 1882_4 CACATTTCTTTAAAATTTCC CACatttctttaaaattTCC 92.4
1884 1884_1 CCACATTTCTTTAAAATTTC CCACatttctttaaaattTC 98.3
1885 1885_1 ACCACATTTCTTTAAAATTTC ACCAcatttctttaaaattTC 97.5
1884 1884_2 CCACATTTCTTTAAAATTTC CCAcatttctttaaaattTC 102
1884 1884_3 CCACATTTCTTTAAAATTTC CCacatttctttaaaaTTTC 94.9
1884 1884_4 CCACATTTCTTTAAAATTTC CCAcatttctttaaaatTTC 87.2
1886 1886_1 ACCACATTTCTTTAAAATTT ACCAcatttctttaaaatTT 94.8
1887 1887_1 ACAAAACCACATTTCTTTAA ACAaaaccacatttcttTAA 97.4
1888 1888_1 CTGTTTTCAAATCATTTC CTGTtttcaaatcattTC 15.8
1889 1889_1 GAACCATTACTATTATCAA GAaccattactattaTCAA 27.3
1890 1890_1 AGAACCATTACTATTATCA AGAaccattactattaTCA 19.8
1891 1891_1 AGAACCATTACTATTATC AGaaccattactatTATC 17.9
1892 1892_1 CTAGAACCATTACTATTA CTAGaaccattactatTA 35.3
1893 1893_1 TAGAACCATTACTATTA TAGAaccattactatTA 13.2
1894 1894_1 CTAGAACCATTACTATT CTAGaaccattactaTT 32.1
1895 1895_1 AGATTACCATCTTTCAAAA AGATtaccatctttcaaAA 59.5
1895 1895_2 AGATTACCATCTTTCAAAA AGAttaccatctttcaAAA 54.1
1896 1896_1 AGATTACCATCTTTCAAA AGATtaccatctttcaAA 50.6
1896 1896_2 AGATTACCATCTTTCAAA AGattaccatctttCAAA 42.3
1897 1897_1 AGATTACCATCTTTCAA AGAttaccatctttCAA 32.4
1898 1898_1 AAGATTACCATCTTTCA AAGAttaccatctttCA 47.9
1899 1899_1 CATGCTCACACATTTTAA CATgctcacacatttTAA 60.5
1899 1899_2 CATGCTCACACATTTTAA CAtgctcacacattTTAA 70.3
1899 1899_3 CATGCTCACACATTTTAA CAtgctcacacatttTAA 69.8
1899 1899_4 CATGCTCACACATTTTAA CATGctcacacattttAA 55.9
1900 1900_1 CTTAAGCTATCTAAACA CTTAagctatctaaaCA 82.6
1901 1901_1 TGAACAATTCAACATTCA TGAacaattcaacatTCA 67.7
1902 1902_1 GATCAAAAAACTTTCCCT GAtcaaaaaactttCCCT 76.1
1903 1903_1 AGATCAAAAAACTTTCCCT AGatcaaaaaactttCCCT 70.4
1904 1904_1 AGATCAAAAAACTTTCCC AGAtcaaaaaactttCCC 73.6
1905 1905_1 TCCTAGATCAAAAAACT TCCTagatcaaaaaaCT 69.9
1906 1906_1 ATTTTTTCTTCTCTTTTCA ATTTtttcttctcttttCA 8.98
1907 1907_1 TATTTTTTCTTCTCTTTTCA TATtttttcttctcttttCA 63.8
1908 1908_1 ATATTTTTTCTTCTCTTTTC ATattttttcttctctTTTC 16.1
1909 1909_1 TCTGCTTTAAAAACTCTC TCtgctttaaaaacTCTC 34.3
1910 1910_1 CTCTGCTTTAAAAACTC CTCtgctttaaaaaCTC 51.6
1911 1911_1 ACTACACAAACACATTCAA ACtacacaaacacatTCAA 37.6
1912 1912_1 CAAACTACACAAACACATTCA CAaactacacaaacacaTTCA 41.2
1913 1913_1 ACAAACTACACAAACACATTC ACAaactacacaaacacaTTC 63.1
1914 1914_1 CAACAAACTACACAAACACAT CAAcaaactacacaaacaCAT 86.1
1915 1915_1 CACAACAAACTACACAAACAC CACaacaaactacacaaaCAC 62.1
1916 1916_1 TCACAACAAACTACACAAACA TCACaacaaactacacaaaCA 48.6
1917 1917_1 TTCACAACAAACTACACAAAC TTCAcaacaaactacacaaAC 58.8
1918 1918_1 ATTTCACAACAAACTACACAA ATTtcacaacaaactacaCAA 76.8
1919 1919_1 CAATTTCACAACAAACTACAC CAAtttcacaacaaactaCAC 70.7
1920 1920_1 TGTAACAATTTCACAACAA TGTaacaatttcacaaCAA 59.5
1921 1921_1 TGTAACAATTTCACAACA TGTAacaatttcacaaCA 28.7
1922 1922_1 TTAAGCCAACCCCACCA TtaagccaaccccacCA 83.1
1923 1923_1 TTTAAGCCAACCCCACC TttaagccaaccccACC 69.2
1924 1924_1 ATTTAAGCCAACCCCAC AtttaagccaaccCCAC 60.6
1925 1925_1 CCAGTAATACAAATTATA CCAGtaatacaaattaTA 69.5
1926 1926_1 CCCAGTAATACAAATTA CCCAgtaatacaaatTA 55.9
1927 1927_1 TCCCAGTAATACAAATT TCCCagtaatacaaaTT 64.9
1928 1928_1 ATCCCAGTAATACAAAT ATCCcagtaatacaaAT 65.9
1929 1929_1 CTACTAGCATCACCACT CtactagcatcacCACT 19.8
1930 1930_1 TTCTACTAGCATCACC TtctactagcatCACC 21.8
1931 1931_1 CTTCTACTAGCATCAC CTtctactagcaTCAC 33.2
1932 1932_1 TAAATTACTCATTAAATCCAT TAaattactcattaaatCCAT 77.8
1933 1933_1 ATAAATTACTCATTAAATCCA ATaaattactcattaaaTCCA 52.4
1934 1934_1 TAAATTACTCATTAAATCCA TAaattactcattaaaTCCA 51.6
1935 1935_1 CATAAATTACTCATTAAATCC CATaaattactcattaaaTCC 58.5
1935 1935_2 CATAAATTACTCATTAAATCC CATaaattacTcattaaaTCC 22.3
1936 1936_1 GATTTATTTTTCTACTTA GAtttatttttctaCTTA 66
1937 1937_1 ATACAACAAACAATTCACTTT ATacaacaaacaattcaCTTT 53.2
1937 1937_2 ATACAACAAACAATTCACTTT ATACaacaaacaattcactTT 48.1
1938 1938_1 CGATACAACAAACAATTCA CGATacaacaaacaattCA 23
1939 1939_1 GAACATCCACACTAACAACA GAACatccacactaacaaCA 43.6
1940 1940_1 ACATCCACACTAACAACA ACAtccacactaacaACA 65
1939 1939_2 GAACATCCACACTAACAACA GAAcatccacactaacaACA 52
1939 1939_3 GAACATCCACACTAACAACA GAacatccacactaacAACA 58.1
1941 1941_1 GAACATCCACACTAACAAC GAACatccacactaacaAC 51.3
1941 1941_2 GAACATCCACACTAACAAC GAacatccacactaaCAAC 63.3
1942 1942_1 TGAACATCCACACTAACAA TGAacatccacactaaCAA 57.8
1943 1943_1 TTGAACATCCACACTAACA TTGAacatccacactaaCA 60.3
1944 1944_1 TGAACATCCACACTAACA TGAAcatccacactaaCA 42.6
1945 1945_1 CATTGAACATCCACACTA CATtgaacatccacaCTA 59.4
1946 1946_1 ATTGAACATCCACACTA ATTgaacatccacaCTA 50
1947 1947_1 CATTGAACATCCACACT CAttgaacatccaCACT 43
1948 1948_1 ACTCATTGAACATCCAC ACtcattgaacatCCAC 46.8
1949 1949_1 TATCTTTATTTAATAATCTT TATCtttatttaataatcTT 93.4
1949 1949_2 TATCTTTATTTAATAATCTT TAtctttatttaataaTCTT 96.9
1950 1950_1 TCTCAAGCTTCACTCTA TCtcaagcttcactcTA 78.6
1951 1951_1 GACAATATATTCCTCAATC GACAatatattcctcaaTC 73
1952 1952_1 GACAATATATTCCTCAAT GACAatatattcctcaAT 82
1952 1952_2 GACAATATATTCCTCAAT GAcaatatattcctCAAT 76.8
1953 1953_1 TCCTGTAACAATTATAC TCCtgtaacaattaTAC 95.4
1954 1954_1 ACCCAGAATAAAAACCAC ACccagaataaaaaCCAC 95.5
1955 1955_1 TTCCACTTTCTTACTCCC TtccactttcttactcCC 96.6
1956 1956_1 TTCCACTTTCTTACTCC TtccactttcttacTCC 86.3
1957 1957_1 TTTCCACTTTCTTACTCC TttccactttcttacTCC 89.2
1958 1958_1 TTTCCACTTTCTTACTC TTTCcactttcttacTC 89.2
1959 1959_1 ATCCCTTTACCACTTTT ATCcctttaccactTTT 101
1960 1960_1 CATCCCTTTACCACTTTT CAtccctttaccactTTT 98
1961 1961_1 TCATCCCTTTACCACTTT TCatccctttaccactTT 101
1962 1962_1 TCATCCCTTTACCACTT TCAtccctttaccacTT 96.9
1963 1963_1 CTCATCCCTTTACCACTT CtcatccctttaccacTT 97.7
1964 1964_1 GTCTACATCTAACCCC GtctacatctaacCCC 97
1965 1965_1 AGTCTACATCTAACCCC AGtctacatctaaccCC 99.6
1966 1966_1 CAGTCTACATCTAACCCC CagtctacatctaaccCC 97.4
1967 1967_1 CAGTCTACATCTAACCC CagtctacatctaaCCC 99.5
1968 1968_1 TCAGTCTACATCTAACCC TCagtctacatctaacCC 98.9
1969 1969_1 AGTCTACATCTAACCC AGTctacatctaacCC 98.2
1970 1970_1 TCAGTCTACATCTAACC TCagtctacatctAACC 98.3
1971 1971_1 TTCAGTCTACATCTAACC TTCagtctacatctaaCC 98
1972 1972_1 TTCAGTCTACATCTAAC TTCAgtctacatctaAC 98.7
1973 1973_1 TTTCAGTCTACATCTAA TTtcagtctacatCTAA 90.1
1974 1974_1 AGTTTTAACCACACCTCCT AgttttaaccacacctcCT 102
1975 1975_1 GTTTTAACCACACCTCC GTTttaaccacacctCC 93.7
1976 1976_1 AGTTTTAACCACACCTCC AgttttaaccacaccTCC 95
1977 1977_1 AGTTTTAACCACACCTC AGttttaaccacacCTC 88.7
1978 1978_1 GAGTTTTAACCACACC GAGttttaaccacACC 94.7
1979 1979_1 CAGATCTTCTCTTTATTT CAGatcttctctttaTTT 96.3
1980 1980_1 TGTTTTCAACAAAACATCA TGTtttcaacaaaacaTCA 89.9
1981 1981_1 TGTTTTCAACAAAACATC TGttttcaacaaaaCATC 97.5
1982 1982_1 CTGTTTTCAACAAAACAT CTGttttcaacaaaaCAT 102
1983 1983_1 TCTGTTTTCAACAAAACA TCTGttttcaacaaaaCA 98
1984 1984_1 ATCTTTCTAAAACTTACC ATCTttctaaaacttaCC 96.3
1985 1985_1 CAGAATCTTTCTAAAACT CAGAatctttctaaaaCT 91.7
1986 1986_1 CTACAGAATCTTTCTAA CTacagaatctttCTAA 97.6
1986 1986_2 CTACAGAATCTTTCTAA CTAcagaatctttcTAA 95.6
1987 1987_1 ATTTCCCTTTATTTCCCTT AtttccctttatttccCTT 92
1988 1988_1 GTATTTCCCTTTATTTCC GtatttccctttattTCC 99.5
在寡核苷酸化合物列中，大寫字母代表 β-D-氧 LNA 核苷，LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶，小寫字母代表 DNA 核苷，且所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯。 mc 代表 5-甲基胞嘧啶 DNA 核苷 (用於化合物 1490_1 及 1491_1 中)。
實例 4
實例 2 中所述的篩選測定使用一系列另外的靶向人類 ATXN3 前驅 mRNA 的寡核苷酸，藉由 qPCR：(ATXN3_外顯子_8-9(1) PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) 來進行。
qPCR 探針及引子組 2： 探針：5'-/56-FAM/CTCCGCAGG/ZEN/GCT ATTCAGCT AAGT /31ABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1134) 引子 1：5'-AGT AAGATTTGT ACCTGATGTCTGT-3' (SEQ ID NO:1135) 引子 2：5'-CATGGAAGATGAGGAAGCAGAT-3' (SEQ ID NO:1136)
表 6
SEQID CMPID 寡核苷酸鹼基序列 寡核苷酸化合物 剩餘 ATXN3 mRNA 百分比(%)
1110 1110_2 ACATCATTTATCACTACCAC ACatcatttatcactacCAC 44
1102 1102_2 TATCTCAAACTATCCCCA TatctcaaactatccCCA 74
1104 1104_2 TCCCCTAAATAATTTAATCA TCCcctaaataatttaaTCA 78
1116 1116_2 TCTTCATTATACCATCAAAT TCTTcattataccatcaaAT 12
1121 1121_2 CTCTCAACTTCTACTACTAA CtctcaacttctactaCTAA 68
1114 1114_2 TGATTCTTATACTTACTA TGATtcttatacttacTA 64
1120 1120_2 CATCACAAAATAACCTATCA CATCacaaaataacctatCA 38
1100 1100_2 CCCCATTCAAATATTTATT CCCcattcaaatatttATT 79
1112 1112_2 TCAGATCCTAAAATCACT TCAGatcctaaaatcaCT 65
1123 1123_2 CCAAAATTACTTCTTTTATC CCaaaattacttctttTATC 37
1117 1117_2 GTTTCATATTTTTAATCC GTttcatatttttaATCC 10
1099 1099_2 CCAAAAGAAACCAAACCC CCaaaagaaaccaaACCC 88
1109 1109_2 TGAAACCATTACTACAACC TGAaaccattactacaACC 22
1113 1113_2 CTATACCTAAAACAATCTA CTatacctaaaacaaTCTA 86
1119 1119_2 CAAATATTCACAAATCCTA CaaatattcacaaatCCTA 78
1125 1125_2 ACAATATATTCCTCAATCA ACaatatattcctcaATCA 74
1127 1127_2 CATCCCTTTACCACTTT CatccctttaccaCTTT 97
1118 1118_2 TAATATCCTCATTACCCATT TaatatcctcattaccCATT 97
1103 1103_2 TCTATTCCTTAACCCAAC TCtattccttaaccCAAC 81
1122 1122_2 AATCTTATTTACATCTTCC AATCttatttacatcttCC 11
1126 1126_2 CCTGTAACAATTATACA CCTGtaacaattataCA 93
1122 1122_3 AATCTTATTTACATCTTCC AatcttatttacaTCtTCC 54
1122 1122_4 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTtatttacAtCttCC 17
1122 1122_5 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcttatttacAtCttCC 21
1122 1122_6 AATCTTATTTACATCTTCC AatctTatttacaTCttCC 12
1122 1122_7 AATCTTATTTACATCTTCC AatcttatttacAtCttCC 28
1122 1122_8 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcttatttacAtcTTCC 28
1122 1122_9 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTtatttacAtctTCC 11
1122 1122_10 AATCTTATTTACATCTTCC AatctTatttacAtctTCC 9
1122 1122_11 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTtatttacatcTTCC 10
1122 1122_12 AATCTTATTTACATCTTCC AATcTtatttacAtcTtCC 10
1122 1122_13 AATCTTATTTACATCTTCC AatCTtatttacAtcttCC 10
1122 1122_14 AATCTTATTTACATCTTCC AatCttatttacatctTCC 7
1122 1122_15 AATCTTATTTACATCTTCC AatcttatttacaTCttCC 32
1122 1122_16 AATCTTATTTACATCTTCC AatCttatttacatcTTCC 4
1122 1122_17 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCttatttacatcTtCC 5
1122 1122_18 AATCTTATTTACATCTTCC AaTcTtatttacaTcTtCC 9
1122 1122_19 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTTatttacatcTtCC 5
1122 1122_20 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTtatttacatCttCC 13
1122 1122_21 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcttatttacatCttCC 23
1122 1122_22 AATCTTATTTACATCTTCC AatctTatttacatCttCC 8
1122 1122_23 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTTatttacatCttCC 4
1122 1122_24 AATCTTATTTACATCTTCC AatctTatttacatcTTCC 8
1122 1122_25 AATCTTATTTACATCTTCC AATcTTatttacatcTtCC 5
1122 1122_26 AATCTTATTTACATCTTCC AAtctTatttacatcTtCC 12
1122 1122_27 AATCTTATTTACATCTTCC AaTCTtatttacatcTtCC 3
1122 1122_28 AATCTTATTTACATCTTCC AaTcTTatttacatcTtCC 3
1122 1122_29 AATCTTATTTACATCTTCC AatCTTatttacatcTtCC 3
1122 1122_30 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTTatttacatctTCC 5
1122 1122_31 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTtatttacatctTCC 12
1122 1122_32 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcttatttacatctTCC 33
1122 1122_33 AATCTTATTTACATCTTCC AatCtTatttacatctTCC 3
1122 1122_34 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTTatttacatctTCC 6
1122 1122_35 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTtatttacatctTCC 16
1122 1122_36 AATCTTATTTACATCTTCC AATCtTatttacatcttCC 8
1122 1122_37 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCTTatttacatcttCC 5
1122 1122_38 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCttatttacatcttCC 16
1122 1122_39 AATCTTATTTACATCTTCC AaTCTtatttacatcttCC 7
1122 1122_40 AATCTTATTTACATCTTCC AaTCtTatttacatcttCC 5
1122 1122_41 AATCTTATTTACATCTTCC AatCTTatttacatcttCC 5
1122 1122_42 AATCTTATTTACATCTTCC AatCTtatttacatcttCC 13
1122 1122_43 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTTatttacatcttCC 17
1109 1109_3 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaccattacTAcaaCC 58
1109 1109_4 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaccattacTAcAaCC 20
1109 1109_5 TGAAACCATTACTACAACC TgaAAccattacTacAaCC 23
1109 1109_6 TGAAACCATTACTACAACC TgAaAccattactAcaaCC 50
1109 1109_7 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaCcattactAcaaCC 46
1109 1109_8 TGAAACCATTACTACAACC TgaAAccattacTacaaCC 48
1109 1109_9 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaccattactaCAaCC 25
1109 1109_10 TGAAACCATTACTACAACC TgaaAccattacTaCaACC 24
1109 1109_11 TGAAACCATTACTACAACC TGaaAccattactaCaaCC 36
1109 1109_12 TGAAACCATTACTACAACC TgAAAccattactaCaaCC 20
1109 1109_13 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaCcattactaCaaCC 26
1109 1109_14 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaccattactaCaaCC 27
1109 1109_15 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaccattacTacAaCC 14
1109 1109_16 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaCcattactacAACC 12
1109 1109_17 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaCcattacTacAaCC 36
1109 1109_18 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaCcattacTacaaCC 62
1109 1109_19 TGAAACCATTACTACAACC TGaaAccattactacaaCC 47
1109 1109_20 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaccattactaCAaCC 19
1109 1109_21 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaccattactACaACC 16
1109 1109_22 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaccattactACaACC 9
1109 1109_23 TGAAACCATTACTACAACC TgAaAccattactAcaACC 29
1109 1109_24 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaCcattactAcaACC 41
1109 1109_25 TGAAACCATTACTACAACC TgaAACcattactAcaaCC 34
1109 1109_26 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaCcattactaCaaCC 28
1109 1109_27 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaCcattactacAACC 10
1109 1109_28 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaCcattactAcAACC 52
1109 1109_29 TGAAACCATTACTACAACC TGaAAccattactacaACC 16
1109 1109_30 TGAAACCATTACTACAACC TGAaaccattactacaaCC 36
1109 1109_31 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaCcattactaCaACC 21
1109 1109_32 TGAAACCATTACTACAACC TgAAAccattactacAACC 9
1109 1109_33 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaCcattactacAaCC 14
1109 1109_34 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaccattactacaACC 43
1109 1109_35 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaCcattactacaACC 15
1109 1109_36 TGAAACCATTACTACAACC TgaAACcattactacaaCC 15
1109 1109_37 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaCcattactacaaCC 16
1109 1109_38 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaCcattactacaaCC 38
1109 1109_39 TGAAACCATTACTACAACC TgAAACcattactacaaCC 14
1109 1109_40 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaCcattactacaaCC 16
1109 1109_41 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaCcattactacaaCC 28
1109 1109_42 TGAAACCATTACTACAACC TgaaACcattactacaaCC 28
1122 1122_44 AATCTTATTTACATCTTCC AatcttatttacaTCTtCC 65
1122 1122_45 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTtatttacAtCttCC 38
1122 1122_46 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTtatttacaTcTTCC 34
1122 1122_47 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCttatttacAtcTtCC 10
1122 1122_48 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTtatttacATcTtCC 35
1122 1122_49 AATCTTATTTACATCTTCC AatCttatttacAtcTtCC 10
1122 1122_50 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCttatttacAtcttCC 11
1122 1122_51 AATCTTATTTACATCTTCC AAtctTatttacatCTtCC 9
1122 1122_52 AATCTTATTTACATCTTCC AatcTTatttacAtcTtCC 12
1122 1122_53 AATCTTATTTACATCTTCC AatctTatttacatCTtCC 8
1122 1122_54 AATCTTATTTACATCTTCC AaTcTtatttacatcTTCC 4
1122 1122_55 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcttatttacAtcTtCC 27
1122 1122_56 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCtTatttacAtcttCC 5
1122 1122_57 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTTatttacatcttCC 14
1122 1122_58 AATCTTATTTACATCTTCC AaTCttatttacatcttCC 13
1122 1122_59 AATCTTATTTACATCTTCC AATcttatttacatCttCC 6
1122 1122_60 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTtatttacatCttCC 10
1122 1122_61 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTTatttacatcTtCC 6
1122 1122_62 AATCTTATTTACATCTTCC AatCtTatttacatcTtCC 3
1122 1122_63 AATCTTATTTACATCTTCC AATCttatttacaTcttCC 5
1122 1122_64 AATCTTATTTACATCTTCC AatCttatttacatcTtCC 7
1122 1122_65 AATCTTATTTACATCTTCC AatCttatttacatcttCC 32
1122 1122_66 AATCTTATTTACATCTTCC AatcttatttacatcTTCC 19
1122 1122_67 AATCTTATTTACATCTTCC AATCttatttacatcTtCC 3
1122 1122_68 AATCTTATTTACATCTTCC AATcTtatttacatcTtCC 4
1122 1122_69 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCTtatttacatcTtCC 3
1122 1122_70 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCtTatttacatcTtCC 3
1122 1122_71 AATCTTATTTACATCTTCC AAtcTtatttacatcTtCC 13
1122 1122_72 AATCTTATTTACATCTTCC AaTCttatttacatcTtCC 5
1122 1122_73 AATCTTATTTACATCTTCC AatCTtatttacatcTtCC 5
1122 1122_74 AATCTTATTTACATCTTCC AatctTatttacatcTtCC 10
1122 1122_75 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCTtatttacatctTCC 3
1122 1122_76 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCttatttacatctTCC 5
1122 1122_77 AATCTTATTTACATCTTCC AaTCttatttacatctTCC 5
1122 1122_78 AATCTTATTTACATCTTCC AatCTtatttacatctTCC 4
1122 1122_79 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCTtatttacatcttCC 7
1122 1122_80 AATCTTATTTACATCTTCC AAtCtTatttacatcttCC 5
1122 1122_81 AATCTTATTTACATCTTCC AatCtTatttacatcttCC 8
1109 1109_43 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaccattacTAcAaCC 18
1109 1109_44 TGAAACCATTACTACAACC TgAaAccattacTacAaCC 27
1109 1109_45 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaCcattacTacAaCC 65
1109 1109_46 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaccattacTacaACC 25
1109 1109_47 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaccattacTacaACC 35
1109 1109_48 TGAAACCATTACTACAACC TgaaAccattacTacaACC 48
1109 1109_49 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaCcattacTacaaCC 44
1109 1109_50 TGAAACCATTACTACAACC TgaAaccattacTaCaaCC 34
1109 1109_51 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaccattacTacaACC 29
1109 1109_52 TGAAACCATTACTACAACC TgAAaccattacTacaACC 23
1109 1109_53 TGAAACCATTACTACAACC TgaaaCcattacTaCaaCC 39
1109 1109_54 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaccattactaCaaCC 33
1109 1109_55 TGAAACCATTACTACAACC TgAaAccattactaCaaCC 29
1109 1109_56 TGAAACCATTACTACAACC TGaaAccattactacAACC 16
1109 1109_57 TGAAACCATTACTACAACC TGaaAccattactacAaCC 18
1109 1109_58 TGAAACCATTACTACAACC TgAaACcattactacaaCC 12
1109 1109_59 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaccattactaCAaCC 13
1109 1109_60 TGAAACCATTACTACAACC TgaaAccattactACaaCC 36
1109 1109_61 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaccattactAcaACC 34
1109 1109_62 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaCcattactACaaCC 43
1109 1109_63 TGAAACCATTACTACAACC TGaAAccattactaCaaCC 19
1109 1109_64 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaCcattactACaaCC 29
1109 1109_65 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaccattactAcaaCC 40
1109 1109_66 TGAAACCATTACTACAACC TgaAAccattactAcAACC 14
1109 1109_67 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaccattactAcAaCC 14
1109 1109_68 TGAAACCATTACTACAACC TGaaaCcattactAcAaCC 27
1109 1109_69 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaCcattactAcAACC 31
1109 1109_70 TGAAACCATTACTACAACC TgAaAccattactAcAaCC 24
1109 1109_71 TGAAACCATTACTACAACC TgaaACcattactacAACC 10
1109 1109_72 TGAAACCATTACTACAACC TGAaaccattactacAaCC 11
1109 1109_73 TGAAACCATTACTACAACC TgaAACcattactAcAaCC 34
1109 1109_74 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaCcattactacaACC 15
1109 1109_75 TGAAACCATTACTACAACC TGaaACcattactacaaCC 14
1109 1109_76 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaccattactaCaaCC 22
1109 1109_77 TGAAACCATTACTACAACC TgaAAccattactaCaaCC 30
1109 1109_78 TGAAACCATTACTACAACC TgaaAccattactaCaaCC 50
1109 1109_79 TGAAACCATTACTACAACC TgaAACcattactacAaCC 9
1109 1109_80 TGAAACCATTACTACAACC TGaAaccattactacaaCC 31
1109 1109_81 TGAAACCATTACTACAACC TgAaaCcattactacaaCC 31
在寡核苷酸化合物列中，大寫字母代表 β-D-氧 LNA 核苷，LNA 胞嘧啶為 5-甲基胞嘧啶，小寫字母代表 DNA 核苷，且所有核苷間鍵結皆為硫代磷酸酯。
實例 5 ：在 iCell® GlutaNeuron 中測試 25 µM LNA 寡核苷酸的 活體外功效
使用前面實例中的選定 LNA 寡核苷酸，在人類細胞株中進行寡核苷酸篩選。
源自人類誘導多能幹細胞的 iCell® GlutaNeuron 購自表 2 中所列供應商，並按照供應商建議的條件，存放於 37℃ 且具有 5% CO 2的加濕培養箱中。進行篩選檢驗時，將細胞種於裝有供應商建議之培養基的 96 孔盤 (見材料與方法段落中表 2)。對細胞/孔數進行優化 (表 2)。
細胞生長 7 天，然後加入濃度為 25 µM 的寡核苷酸 (溶解於培養基中)。加入寡核苷酸後 4 天，收穫細胞。
如「實例 1」所述進行 RNA 提取和 qPCR
ATXN3 及管家基因之引子測定為：
ATXN3 引子測定 (測定 ID：N/A，物品名稱：Hs.PT.58.39355049： 正向引體：GTTTCTAAAGACATGGTCACAGC (SEQ ID NO:1128) 反向：CTATCAGGACAGAGTTCACATCC (SEQ ID NO:1129) 探針：56-FAM/AAAGGCCAG/ZEN/CCACCAGTTCAGG/3IABkFQ/ (SEQ ID NO:1030)
TBP 引子測定 (測定 ID：N/A，物品名稱：Hs.PT.58v.39858774 探針：5’- /5HEX/TGA TCT TTG /ZEN/CAG TGA CCC AGC ATC A/3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO:1131) 引子 1：5’- GCT GTT TAA CTT CGC TTC CG-3’ (SEQ ID NO:1132) 引子 2：5’- CAG CAA CTT CCT CAA TTC CTT G-3’ (SEQ ID NO:1133)
相對 ATXN3 mRNA 表現含量以相較於對照組 (經培養基處理後的細胞) 的百分比(%)確定，數值越低表示抑制率越高。
所測試的化合物及標靶減弱資料見表 7。
實例 6 ：測定靶向 ATXN3 的 LNA 缺口體的 EC50 值
測定細胞株 SK-N-AS、A431 及 iPSCs (iCell® GlutaNeurons) 的 EC50 值 (觀察到對標靶減弱一半的濃度)。使用以下寡核苷酸濃度： -          SK-N-AS：50 µM – 半對數稀釋 (3.16 倍) – 8 步 (包括空白對照) -          A431: 50 µM – 半對數稀釋 (3.16 倍) – 8 步 (包括空白對照) -          iPCS：10 µM – 10 倍稀釋 – 8 步 (包括空白對照)
如前面的實例所示，將細胞用寡核苷酸處理、裂解並分析。
所測試的化合物及其 EC50 值顯示於表 7 中。
實例 7 ： 活體外毒性評估
在各種安全性測定中評估的寡核苷酸的選擇標準基於所獲得的訊號的大小及頻率。所用的安全性測定為：凋亡蛋白酶活化、肝毒性、腎毒性及免疫毒性測定。在單個 活體外安全性測定獲得的訊號得出評分 (0- 安全，0.5- 臨界毒性，1- 輕度毒性，2- 中度毒性，3- 重度毒性)，並總結為各序列的累積分數 (見表 7)，提供化合物的客觀排名。正如所提供的參考資料中所報告的，訊號強度為基於使用 活體內相關參考分子對測定進行驗證的 活體內毒性風險的量度
活體外毒性測定按以下參考文獻所述進行： 凋亡蛋白酶活化測定：Dieckmann 等人, Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 10 March 2018, pp45 - 54。 肝毒性測定：Sewing 等人, Methods in Molecular Biology Oligonucleotide-Based Therapies MIMB, volume 2036, pp 249-259 2019；Sewing 等人, PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0159431 July 21, 2016。 腎毒性測定：Moisan 等人, Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Mar 17;6:89-105. doi: 10.1016/j.omtn.2016.11.006.Epub 2016 Dec 10。 免疫毒性：Sewing 等人, PLoS One.2017 Nov 6;12(11):e0187574. doi: 10.1371/journal.pone.0187574. eCollection 2017。
作為篩選級聯的一部分，在評估化合物功效的細胞株 SK-N-AS 及 A431 中評估了 1170 種化合物 (表 4 至 6)。其中，對 50 種最有效的化合物進行了凋亡蛋白酶活化評估，其中 18 種在其他三種 活體外毒性測定中進行了進一步評估 (累計評分見表 7)。
最後，8 種化合物在 活體外被鑑定為高度有效且強效，且在 4 種 活體外測定中毒性低或無毒性，因此選擇這些化合物在表現人類 ATNX3 前驅 mRNA 的基因轉殖小鼠中進行評估：化合物編號 1856_1、1813_1、1812_1、1809_2、1607_1、1122_62、1122_67 及 1122_33。
表 7 – 由實例 5 、 6 及 7 獲得的資料
CMPID 總體毒性評分 SK-N-AS EC50 (µM) A-431 EC50 (µM) HiPSC EC50 (µM) HiPCS，25 µM 下的最大功效 (剩餘 ATXN3 轉錄本百分比(%))
1856_1 1.5 0.53 0.22 0.23 2.87
1806_2 2 0.35 0.19 0.03 0.91
1888_1 - 0.72 0.54 -  
1813_1 2 0.24 0.08 0.04 1.85
1640_1 - 1.50 0.19 -  
1812_1 1.5 0.20 0.09 0.09 0.59
1117_2 - 0.73 0.57 -  
1810_1 - 0.36 0.14 -  
1809_2 1.25 0.22 0.09 0.05 1.44
1489_1 - 1.16 0.30 -  
1867_1 - 0.54 0.50 -  
1893_1 - 0.95 0.34 0.41 4
1906_1 - 0.36 0.57 0.04 2.55
1214_1 - 1.05 0.38 -  
1213_1 - 1.01 0.38 -  
1423_1 - 0.75 0.23 0.03 3.58
1790_1 - 0.42 0.47 -  
1605_1 - 0.47 0.17 -  
1607_1 2.5 0.32 0.25 0.08 4.46
1805_1 - 0.75 0.23 -  
1806_1 - 0.45 0.20 0.04 1.3
1809_1 3 0.24 0.20 0.02 1.81
1808_1 2 0.26 0.22 0.06 1.4
1625_1 0.5 0.94 0.25 0.66 7.16
1122_54 - 0.62 0.15 -  
1122_16 - 0.30 0.15 -  
1122_17 - 0.33 0.17 0.11 1.07
1122_62 0.5 0.21 0.10 0.03 3.53
1122_19 - 0.28 0.24 -  
1122_23 - 0.54 0.18 0.05 0.59
1122_67 0 0.29 0.10 0.01 0.52
1122_68 - 0.28 0.13 0.01  
1122_69 - 0.27 0.12 -  
1122_70 - 0.20 0.10 -  
1122_27 1 0.23 0.12 0.03 0.55
1122_72 0.5 0.25 0.15 0.06 2.28
1122_28 1 0.20 0.12 0.01 0.37
1122_29 - 0.19 0.09 0.02 1.6
1122_73 - 0.29 0.18 0.04 1.59
1122_75 1 0.44 0.12 0.03 2
1122_76 - 0.33 0.19 -  
1122_77 1 0.30 0.20 0.04 1.97
1122_78 - 0.29 0.18 0.02 1.91
1122_33 1.25 0.18 0.10 0.02 1.84
1122_37 - 0.25 0.13 0.03 0.89
1122_80 - 0.33 0.17 -  
1122_41 - 0.24 0.16 0.01 0.47
1109_22 - 0.90 0.23 0.11 8.41
1109_32 0 0.75 0.17 0.09 3.49
1109_79 - 1.48 0.20 -  
實例 8 ： 活體內基因轉殖小鼠研究
動物照護
在 10 至 13 週齡的 B6;CBA-Tg(ATXN3*)84.2Cce/IbezJ 的雄性及雌性小鼠 (JAX® Mice,The Jackson Laboratory) 中測試化合物的活體內活性及耐受性，這些小鼠每籠飼養 3 至 5 只。小鼠為表現人類 ATXN3 前驅 mRNA 序列 (包含 84 個 CAG 重複模體，是與人類 MJD 相關的等位基因) 的基因轉殖小鼠。將動物飼養在維持固定溫度 (22℃ ± 2℃) 及濕度 (40 + 80%) 的聚落室中，並且每天照光 12 小時 (早晨 6:00 開始光照)。所有動物在研究期間均可任意取用食物及飲水。所有程序均根據相應的瑞士法規進行，並獲得州動物研究倫理委員會的批准。
投予途徑 - 腦池內注射。
藉由腦池內 (ICM) 注射，向小鼠投予化合物。在 ICM 注射之前，動物接受皮下投予 0.05 mg/kg 丁丙諾啡作為止痛劑。在 ICM 注射時，將動物被置於異氟醚中。使用裝有 36 號針頭的 FEP 導管的 Hamilton 微型注射器進行腦室內注射。將皮膚切開，縮回肌肉並暴露寰枕膜。使用裝有 36 號針頭的導管的 Hamilton 微型注射器進行腦室內注射。在 30 秒內推注 4 微升測試化合物或載體。重新定位肌肉並用 2 至 3 根縫線縫合皮膚。動物被放置在一個溫暖環境中，直到從麻醉中恢復為止。
以多組不同化合物進行的 2 項獨立實驗如表 8A 所示。
表 8A
化合物識別號 劑量，微克 時間點 群組大小
僅鹽水 0 4wk 6
1856_1 250 4wk 8
1813_1 250 4wk 8
1812_1 250 4wk 8
1809_2 250 4wk 8
1607_1 250 4wk 8
1122_62 250 4wk 8
1122_67 250 4wk 8
1122_33 250 4wk 8
耐受性結果：
發現所有化合物均可耐受長達 4 週的時間點。藉由 WO2016/126995 中所述的監控動物行為方法測量急性毒性 (見實例 9)。藉由監測每一隻動物在實驗時程中的體重來測量亞急性毒性，體重減輕 ＞5% 代表產生亞急性毒性。在一些組中，1 隻或 2 隻動物在 ICM 投予後表現出一些痛苦並被處以安樂死，但這可能是由於程序而不是任何化合物的不良毒性。因此，認為所有八種化合物在 活體內皆有良好的耐受性。
投予 4 週後犧牲動物，採集皮質、中腦、小腦、海馬迴、腦橋/延髓及紋狀體組織稱重，並在取樣後直接置於液氮中速凍。將樣本儲存在乾冰上，直到儲存於 -80℃ 下。
活體內 樣本分析。用於含量測量及 qPCR 的組織製備說明。
使用 Qiagen TissueLyzer II 以 MagNA Pure LC RNA 分離組織裂解緩衝液 (Roche, Indianapolis, IN) 對小鼠組織樣本進行均質化。均質物在室溫下培養 30 分鐘，使其完全裂解。將裂解後的均質物以 13000 rpm 速度離心處理 3 分鐘，取上清液進行分析。留下一半用於生物分析，另一半直接進行 RNA 萃取。
寡核苷酸含量分析
在生物分析時，將樣本稀釋 10-50 倍，以雜交 ELISA 法測量寡核苷酸含量。生物素化 LNA 捕捉探針及洋地黃毒結合 LNA 偵測探針 (皆為 35 奈莫耳於 5xSSCT，各與待偵測 LNA 寡核苷酸的一端互補) 與稀釋的均質物或關聯標準物混合，在室溫下培養 30 分鐘，然後加進塗有鏈親和素的 ELISA 微盤 (Nunc 型錄號碼 436014)。
將培養皿在室溫下培養 1 小時，於 2xSSCT (300 毫莫耳氯化鈉、30 毫莫耳檸檬酸鈉及 0.05% v/v Tween-20，pH 7.0) 中清洗。使用與鹼性磷酸酶結合的抗 DIG 抗體 (Roche Applied Science 型錄號碼 11093274910) 及鹼性磷酸酶基質系統 (Blue Phos 基質，KPL 產品代碼 50-88-00) 偵測捕捉到的 LNA 雙鏈體。在 615 奈米以 Biotek 讀取器測量吸光度，判定寡核苷酸複合物的量。
將資料標準化至組織重量，並以寡核苷酸奈莫耳數表示。
mRNA 分析
使用 MagNA Pure 96 儀器搭配套件 Cellular RNA Large Volume Kit (Roche，美國印地安納州印第安納波利斯)，自 350 微升的上清液中將 RNA 純化出來。RNA 樣本以無核酸酶水標準化至 2ng/µL，並存放於 -20℃ 備用。
對於單一步驟 qPCR (cDNA 合成及 qPCR)，每個樣本以二重複方式運行，四組探針 (IDT, Leuven, Belgium) 在雙股螺旋中運行。
在各反應物中加入 4 微升先前稀釋的 RNA、0.5 微升水及 5.5 微升 TaqMan MasterMix。培養皿經離心處理後，在 90℃ 熱緊迫 40 秒，接著在冰上短暫培養，再使用 qPCR 來分析樣本 (在 50℃ 培養 15 分鐘，90℃ 培養 3 分鐘，隨後是 40 週期的 95℃ 持續 5 秒及 60℃ 持續 45 秒)。測定探針如下所述。
使用相對標準曲線方法分析資料，其中各資料首先標準化至管家基因 (RPL4)，然後以相較於未經處理的對照組動物的百分比(%)表示。
用於 活體內研究的 qPCR 測定：
人類 ATXN3，qPR 測定：(ATXN3_外顯子_8-9(1) PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) 來進行。
qPCR 探針及引子： 探針：5'-/56-FAM/CTCCGCAGG/ZEN/GCT ATTCAGCT AAGT /31ABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1134) 引子 1：5'-AGT AAGATTTGT ACCTGATGTCTGT-3' (SEQ ID NO:1135) 引子 2：5'-CATGGAAGATGAGGAAGCAGAT-3' (SEQ ID NO:1136)
所用的管家基因：
小鼠 RPL4，qPCR 測定 (Mm.PT.58.17609218) PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT)。
qPCR 探針及引子： 探針：5'- /5HEX/CTG AAC AGC /ZEN/CTC CTT GGT CTT CTT GTA /3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1090) 引子 1：5'- CTT GCC AGC TCT CAT TCT CTG-3' (SEQ ID NO:1091) 引子 2：5'- TGG TGG TTG AAG ATA AGG TTG A-3' (SEQ ID NO:1092)
結果顯示於表 8B 中。
所有測試的化合物在測試的組織中皆提供了有效的標靶抑制，並在測試的劑量下耐受性良好。在測試的化合物中，1122_33 在所有組織中具有最高或第二高的比活性 (EC50 較低)，其次是 1122_62 及 1122_67。
化合物 1122_67、1607_1、1813_1 和 1122_33 在所有測試的組織中提供了高的 活體內功效，表明在測試的腦組織中顯著且一致地抑制了 ATXN3 之表現。基於累積排名評分，在測試的組織中 ATXN3 減弱的功效方面，化合物 1122_67 始終是排名最高或排名第二的化合物。
實例 9 ：在時程、劑量範圍實驗中測試 LNA 寡核苷酸及參考化合物在人類 iPSC 源性神經元中的 活體外功效
所用化合物：1122_67 及 1813_1 以及 WO2019/217708 中揭示的以下參考化合物 (如 WO2019/217708 中所用的化合物識別編號所示：1100673、1101657、1102130、1103014 及 1102987)。化合物 1100673、1101657、1102130 在 WO2019/217708 中突出顯示為提供有效的 活體內抑制，化合物 1103014 及 1102987 未在 WO2019/217708 中進行 活體內評估，但作為參考化合物包括在內，因為其序列與化合物 1122_67 (1103014) 及 1813_1 (1102987) 相似。
iCell® GlutaNeurons 細胞的製備和維持如實例 5 及表 2 中所述。細胞生長 7 天，然後加入濃度為 0 至 10 µM 的寡核苷酸 (溶解於培養基中)。
在寡核苷酸處理後 4 天、6 天、9 天、12 天和 20 天收穫細胞，並使用實例 5 中所述的 ATXN3 引子分析，如「實例 1」所述進行 RNA 提取及 qPCR。相對 ATXN3 mRNA 表現含量以相較於對照組 (經培養基處理後的細胞) 的百分比(%)確定，數值越低表示抑制率越高。結果顯示於表 9 中。
表 9
化合物 hiPSC 源性神經元中的 EC50，nM
第 4 天 第 6 天 第 9 天 第 12 天 第 20 天
1122_67 7.2 1.3 1.4 1.1 1.1
1813_1 23 6.3 10 8.9 7.7
1100673 110 27 30 34 44
1101657 515 204 69 90 73
1102130 315 164 390 101 133
1103014 662 64 435 98 369
1102987 944 305 135 391 200
化合物 1122_67 及 1813_1 明顯比 5 種參考化合物更有效，其中化合物 1122_67 在所有時間點皆為最有效的化合物，1122_67 及 1813_1 皆對 ATXN3 mRNA 產生了顯著有效且持久的抑制。
實例 10 ：比較 活體內基因轉殖小鼠研究
在 Charles River Laboratories Den Bosch B.V. (Groningen, NL) 使用化合物 1122_67 及 1813_1 以及參考化合物 1100673 (WO2019/217708) 進行進一步的 活體內研究。該研究使用雄性及雌性 B6;CBA-Tg(ATXN3*)84.2Cce/IbezJ 小鼠以及經由腦池內 (ICM) 投予的化合物。在化合物投予後的兩個時間點，即 1 週或 4 週，將動物處以安樂死並收集終末血漿樣本及組織。
動物照護
在 7 至 10 週齡的 62 B6;CBA-Tg(ATXN3*)84.2Cce/IbezJ 雄性及雌性小鼠 (JAX® 小鼠，The Jackson Laboratory) 中測試化合物的 活體內活性及耐受性。到達後，將動物分成多達 5 組，飼養在單獨通風的籠子 (IVC, 40 x 20 x 16 cm) 中，處於溫度 (22 ± 2℃) 及濕度 (55 ± 15%) 受控的環境中，採用 12 小時光照週期 (07.00 至 19.00 h)。將雄性及雌性動物飼養在單獨的籠中。標準飼料 (SDS Diets, RM1 PL) 及家用優質自來水可隨意使用。如果需要，除標準飼料之外，動物還接受浸泡過的食物及/或 Royal Canin 作為悉心照顧的一部分。實驗嚴格按照實驗動物護理及使用指南 (國家研究委員會 2011) 進行，並符合歐盟指令 2010/63 及荷蘭法律。所述 活體內實驗在 Charles River Laboratories Den Bosch B.V. 的 Groningen 基地 (Groningen, the Netherlands) 進行。
投予途徑 - 腦池內注射。
藉由腦池內 (ICM) 注射，向小鼠投予化合物。使用異氟醚 (2.5% 至 3% 及 500 mL/min O2) 將小鼠麻醉。手術前，投予 Finadyne (1 mg/kg, s.c.) 用於手術期間和手術後恢復期的止痛。將布比卡因 (bupivacaine) 與腎上腺素的混合物應用於切口部位及顱骨骨膜以進行局部止痛。
將動物置於立體定位框架 (Kopf instruments, USA) 中，並在頭部後部朝向頸部切口。然後，在頭顱的枕骨上鑽孔以在其中放置套管之前，將皮膚鋪開並標記坐標。然後，將化合物注射到腦池 (ICM) 中。在 30 秒內注射體積為 4 µL 的指定供試品。注射後，將針頭和套管固定 30 秒以確保不發生回流。然後收回套管，用皮膚覆蓋孔並縫合切口。
動物被放置在一個溫暖環境中，直到從麻醉中恢復為止。
化合物 1122_67 以 90 µg 、150 µg 或 250 µg 的單劑量投予，化合物 1813_1 以 150 µg 或 250 µg 的單劑量投予。參考化合物 1100673 僅以 250 µg 的單劑量投予。
從 ICM 注射前 3 天到投予後最多 1 週，每天記錄動物體重。在剩餘的實驗中，每周監測並記錄動物體重至少兩次。
實驗結束時，在第 8 天或第 29 天 (1 週或 4 週)，藉由過量使用 Euthasol®，將動物處以安樂死。將終末血漿收集到 Li-Hep 管中。收穫動物的終末組織，並在低溫表面上進行解剖。將一半組織樣本儲存於 2.0 mL 安全鎖管中，進行 PCR 清潔、預稱重並預冷卻。收集後立即對樣本稱重，並在液氮中快速冷凍，然後儲存於 -80℃ 下。將另一半在 4% PFA 中固定 72 小時，隨後轉移至 70% 乙醇中等待運輸。進行組織解剖及收集，從一系列組織中收集組織：中腦、皮質、紋狀體、海馬迴、小腦、腦幹及脊髓 (頸部、胸部及腰部)。
耐受性結果：
藉由 WO2016/126995 中所述的監控動物行為方法測量急性毒性 (見實例 9)。藉由監控每一隻動物在實驗時間過程中的體重測量慢性毒性，體重減輕 ＞5% 代表產生慢性毒性。在一些組中，1 隻或 2 隻動物在 ICM 投予後表現出一些痛苦並被處以安樂死，但這可能是由於外科程序的性質而不是任何化合物的不良毒性。
3 隻小鼠在接受劑量為 250 μg 的 1813_1 後出現急性毒性跡象，導致該組動物提早被處以安樂死。除此以外，發現所有化合物均可耐受長達 4 週的時間點。
4 週後將動物處以安樂死並收集大腦及 CNS 組織：在液氮中收集脊髓、皮質、紋狀體、海馬迴、中腦、腦幹及小腦以及肝臟及腎臟用於藥物濃度分析，在給藥後 1 週或 4 週進行 ATAXN3 mRNA 分析。
活體內樣本分析：用於含量測量及 qPCR 的組織製備說明按照實例 8 所述進行。計算 EC50，並記錄所實現的最大 KD，該資料提供於表 10 中。
化合物 1122_67 在所有測試的腦組織中是最有效的化合物，並在所有測試的腦組織中提供了優異的有效減弱，表明在所有關鍵組織中的生物分佈良好 (1813_1 在脊髓、腦幹及中腦中與 1122_67 一樣有效)。值得注意的是，化合物 1122_67 在小腦中產生了高效的減弱作用，而參考化合物 1100673 在小腦中的作用明顯較低。經 4 週處理後的另一個主要觀察結果是，與 1 週時間點相比，1122_67 在所有腦組織中的功效甚至進一步改善。值得注意的是，參考化合物 1100673 的功效在 4 週階段與 1 週時間點相比明顯較低，特別是在關鍵的小腦及皮質組織中。1122_67 的較長的作用持續時間及高效力表明該化合物在治療環境中需要較低的投予頻率。
實例 11 ：化合物對 SVPD 的穩定性
方法：3´-核酸外切酶蛇毒磷酸二酯酶 I (SVP) (製品編號 LS003926，批號58H18367) 由 Worthington Biochemical Corp. (Lakewood, New York, USA) 購得。用於 3´-核酸外切酶蛇毒磷酸二酯酶 I (SVP) 分析的反應混合物由 50 mM TRIS/HCl pH 8 緩衝劑、10 mM MgCl 2、30 U CIP (NEB, Ipswich, Massachusetts, USA)、0.02 U SVP 及寡核苷酸化合物組成。ASO 對 SVPD 的穩定性藉由在一天的時程中進行核酸酶分析來測定。在各反應混合物中，在 150 µl 的總體積中使用約 0.2 mg/mL 的 ASO。
在自動進樣器上於 37℃ 下 24 小時的培育，藉由配備二極管陣列偵測器並與電噴霧電離-飛行時間質譜 (ESI-ToF-MS) 聯用的 UHPLC 系統按時間間隔監測 SVPD 及反應以及 ASO 穩定性。為得到 t=0 h 時間點，在首次注射之前將酶加入反應混合物中。在 24 小時內定期進行另外的注射。
測試的化合物 1122_67、1813_1，以及參考化合物 1100673、1101657、1102130、1103014 及 1102987。
資料如圖 9 所示。雖然 WO2019/217708 中重點介紹的三種參考化合物以及 1122_67 及 1813_1 化合物在 SVPD 測定中具有良好的穩定性，但 WO2019/217708 中與 1122_67 及 1813_1 的序列最接近的 2 種參考化合物 (亦即化合物 1103014 及 1102987) 相比於 1122_67 及 1813_1 明顯更容易受到 SVPD 降解的影響。
實例 12 ：經選定寡核苷酸 (ASO) 處理的人類 SCA3 患者源性纖維母細胞中的 WT 及 polyQ Ataxin 3 蛋白含量
執行該實驗以研究 1122_67 及 1122_33 相比於現有技術化合物 1100673 及 1102130 在 SCA3 患者源性纖維母細胞中減弱 LNA 寡核苷酸的功效，以評估對引起疾病的 Ataxin3 等位基因及 Ataxin3 WT 等位基因的功效。
用於 ASO 處理的細胞株，人類 SCA3 患者源性纖維母細胞 (GM06153 – Coriell Institute)。在 24 孔盤中，每孔接種 10 萬個細胞，總體積為 1 ml。然後立即加入 ASO，使其最終濃度為 10 µM (裸吸收)。培育 4 天後，將細胞用 PBS 洗滌兩次，並收穫於 200 μl RIPA 緩衝劑 (Thermo Scientific, Pierce) 中。
使用 WES 12-230 kDa Wes 分離模塊在基於毛細管的免疫測定平台 (WES, ProteinSimple) 上進行西方墨點測定。將細胞裂解物用上樣緩衝劑 (ProteinSimple) 稀釋 10 倍，然後上樣至管匣上。針對 Ataxin 3 (兔單株抗體，產品編號：702788，購自 Invitrogen) 及 HPRT (兔單株抗體，型錄號碼：Ab109021，購自 Abcam) 的初級抗體。兩種抗體皆以 1/100 稀釋度使用。將山羊抗兔 HRP 結合物 (部件號：DM-001，ProteinSimple) 用為二級抗體。
利用 Compass 軟體 (ProteinSimple) 對蛋白條帶進行定量。
結果
為顯示野生型及 polyQ 擴展的 Ataxin 3 蛋白的有效 KD，在 WES 上進行蛋白質分析之前，將 GM06153 細胞用 10 uM ASO 處理四天。Ataxin 3 抗體識別兩種同種型，並將強度 (峰下面積) 基於來自 HPRT 的訊號標準化至蛋白輸入。如圖 10A 及圖 10B 所示，觀察到經 1122_67 及 1122_33 處理後，與野生型 Ataxin 3 相比，polyQ 擴展的 Ataxin 3 的減少幅度增加。與野生型 Ataxin 3 相比，在其他 ASO (加擾對照，1100673 或 1102130) 中未觀察到這種趨勢，在這些 ASO 中，觀察到更高含量的 polyQ 擴展的 Ataxin 3。與 WT Ataxin 3 相比，對引起疾病的 polyQ 擴展的 Ataxin 3 具有更高活性為較佳的，因為它允許選擇性減少引起疾病的等位基因。
實例 13 ：重新設計庫
將化合物識別編號 1122_67 及 1122_33 用為重新設計庫中的母體。重新設計庫中的化合物在所用的核苷間鍵結及/或核苷方面不同於母化合物且彼此不同。一般而言，LNA、DNA 與核苷類似物在特定位置的核苷不同，在核醣的 2' 位置包含不同的修飾。除此之外，核苷間鍵結為硫代磷酸酯鍵結。在一些化合物中，藉由使用硫代磷酸酯鍵結提供立體定義之主鏈，對手性進行控制。採用的修飾如下所示。
Figure 02_image007
重新設計庫中的化合物列於表 11 中，其中各化合物的結構由大分子分層編輯語言 (HELM) 描述 (詳見 Zhang 等人, Chem. Inf.Model.2012, 52, 10, 2796–2806)，使用以下 HELM 註釋符號： [LR](G) 為 β-D-氧基-LNA 鳥嘌呤核苷， [LR](T) 為 β-D-氧基-LNA 胸腺嘧啶核苷， [LR](A) 為 β-D-氧基-LNA 腺嘌呤核苷， [LR]([5meC] 為 β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR](G) 為 DNA 鳥嘌呤核苷， [dR](T) 為 DNA 胸腺嘧啶核苷， [dR](A) 為 DNA 腺嘌呤核苷， [dR]([C] 為 DNA 胞嘧啶核苷， [sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵結 (立體未定義) [ssP] 為立體定義之 Sp 硫代磷酸酯核苷間鍵結 [mR](G) 為 2’-O-甲基鳥嘌呤核苷， [mR](U) 為 2’-O-甲基尿嘧啶核苷， [mR](A) 為 2’-O-甲基腺嘌呤核苷， [mR](C) 為 2’-O-甲基胞嘧啶核苷， [MOE](G) 為 2’-O-甲氧基乙基鳥嘌呤核苷， [MOE](T) 為 2’-O-甲氧基乙基胸腺嘧啶核苷， [MOE](A) 為 2’-O-甲氧基乙基腺嘌呤核苷， [MOE]([5meC]) 為 2’-O-甲氧基乙基 5-甲基胞嘧啶核苷， [fR](G) 為 2’-氟鳥嘌呤核苷， [fR](U) 為 2’-氟尿嘧啶核苷， [fR](A) 為 2’-氟腺嘌呤核苷， [fR](C) 為 2’-氟胞嘧啶核苷。
在表 11 中，具有化合物識別編號 1122_ 或 1816_ 的化合物分別為 SEQ ID NO:1122 或 SEQ ID NO:1816 的修飾版本。
表 11: 化合物及 HELM 表
CMP 識別編號 HELM
1122_82 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_83 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_84 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_85 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_86 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_87 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[mR](U)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_88 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_89 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_90 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_91 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_92 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_93 [MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])
1122_94 [MOE](A)[sP].[MOE](A)P.[MOE](T)P.[MOE]([5meC])P.[MOE](T)P.[MOE](T)P.[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])P.[MOE](T)P.[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])
1122_95 [LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_96 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_97 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_98 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_99 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_100 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_101 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_102 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_103 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_104 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_105 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_106 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_107 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_108 [LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_109 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_110 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_111 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_112 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_113 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_114 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_115 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_116 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_117 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_118 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_119 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_120 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_121 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[mR](U)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_122 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_123 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_124 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
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1122_184 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_185 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_186 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
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1122_189 [MOE](A)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE]([5meC])
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1122_304 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_305 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_306 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_307 [LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_308 [LR](A)[sP].[fR](A)[sP].[fR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
1122_309 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[fR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
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1122_327 [LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](C)[sP].[LR](T)[sP].[fR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR]([5meC])
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1816_3 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
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1816_5 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[mR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
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1816_9 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[mR](U)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
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1816_15 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[ssP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
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1816_17 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[ssP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_18 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[ssP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_19 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[ssP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
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1816_21 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[ssP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_22 [MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)
1816_23 [MOE](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[MOE](T)
1816_24 [MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)
1816_25 [MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[MOE](T)P.[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)
1816_26 [MOE](G)[sP].[MOE](A)P.[MOE](A)P.[MOE](T)P.[MOE]([5meC])P.[MOE](T)P.[MOE](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE](T)P.[MOE]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](T)
1816_27 [LR](G)[sP].[fR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_28 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[fR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_29 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[fR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_30 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[fR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_31 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[fR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_32 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[fR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_33 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_34 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_35 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_36 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_37 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_38 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[LR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_39 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_40 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_41 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_42 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[LR](T)
1816_43 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_44 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[MOE](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_45 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_46 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_47 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_48 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_49 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[MOE](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_50 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_51 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[MOE](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_52 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[MOE](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_53 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_54 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[MOE](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_55 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_56 [LR](G)[sP].[MOE](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_57 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_58 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_59 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_60 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_61 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[mR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_62 [LR](G)[sP].[mR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_63 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[fR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_64 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[fR](C)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_65 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_66 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[mR](C)[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_67 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[fR](U)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_68 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[fR](U)[sP].[LR](T)
1816_69 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[fR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_70 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[fR](U)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_71 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[fR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_72 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[fR](U)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_73 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[fR](U)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
1816_74 [LR](G)[sP].[LR](A)[sP].[dR](A)[sP].[fR](U)[sP].[LR]([5meC])[sP].[dR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR](A)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[dR](T)[sP].[LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)
實例 14 ： 在 iCell® GlutaNeuron 中測試 1.25 µM 及 62.5 nM LNA 寡核苷酸的活體外功效
評估實例 13 的表 11 中所述的重新設計庫的化合物在兩種濃度 (1.25 µM 及 62.5 nM) 下在人類 iPSC 細胞中的效力，比較兩種濃度下對 ATXN3 轉錄本及 KCNB2 轉錄本的影響。
iCell GlutaNeuron 細胞的製備和維持基本上如實例 5 及表 2 中所述。將 96 孔細胞培養盤用聚-L-鳥胺酸 (0.01%) (Sigma-P4957) 100 µl/孔塗覆 4 小時。用 PBS 沖洗 3 次並用層粘連蛋白 (Roche Diagnostic, 11243217001) (0.5 mg/ml，在 PBS 中以 1:500 稀釋) 在 4 攝氏度下塗覆過夜。按照供應商的建議，使用所提供的以下方案處理並維持細胞：iCell® GlutaNeurons，用戶指南，文件 ID：X1005，1.2 版，Cellular Dynamics，Fujifilm；可從以下網址獲得：cdn.stemcell.com/media/files/manual/MADX1005-icell_glutaneurons_users_guide.pdf (於例如 2020 年 11 月 10 日訪問)。將來自預稀釋盤的化合物 (用 PBS 稀釋的化合物) 加入細胞中，達到所需的最終濃度。RNA 純化及 qPCR 如實例 2 所述進行；但是，使用如下所述的 qPCR 測定進行分析。
人類 KCNB2 前驅 mRNA，使用 qPCR 測定：「Hs.PT.58.39309562」，PrimeTime® XL qPCR 測定 (Integrated DNA Technologies (IDT), Leuven, Belgium) 探針：5’-/56-FAM/AGA AAC CTA /ZEN/ACT CAT CAG TGG CTG CAA /3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO:1989) 引子 1：5’-GAA CAG GAT AGA CAC GAT GGC-3’ (SEQ ID NO:1990) 引子 2：5’- AGA GAC TAT GCG AGA GCG A-3’ (SEQ ID NO:1991)
人類 ATXN3 前驅 mRNA，使用 qPCR 測定：定制設計「(ATXN3_外顯子_8-9(1)」，PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT)。 探針：5'-/56-FAM/CTCCGCAGG/ZEN/GCT ATTCAGCT AAGT /31ABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1134) 引子 1：5'-AGT AAGATTTGT ACCTGATGTCTGT-3' (SEQ ID NO:1135) 引子 2：5'-CATGGAAGATGAGGAAGCAGAT-3' (SEQ ID NO:1136)
人類 TBP 前驅 mRNA，使用 qPCR 測定：「Hs.PT.58v.39858774」，PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) 探針：5’- /5HEX/TGA TCT TTG /ZEN/CAG TGA CCC AGC ATC A/3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO:1131) 引子 1：5’- GCT GTT TAA CTT CGC TTC CG-3’ (SEQ ID NO:1132) 引子 2：5’- CAG CAA CTT CCT CAA TTC CTT G-3’ (SEQ ID NO:1133)
該篩選的結果以相對於未處理細胞的百分比(%) 給出的值作為剩餘轉錄本的含量呈現於表 12，亦即低含量意味著高效減弱。對兩種標靶基因 (ATXN3 及 KCNB2) 中的每一種的應用濃度都進行了此操作。大多數測試的化合物在所用的兩種濃度下均表現出對 ATXN3 轉錄本的有效減弱。對 KCNB2 轉錄本的影響是可變的。
表 12
CMP 識別號 1.25 uM (剩餘 ATXN3 mRNA 百分比(%)) 62.5nM (剩餘 ATXN3 mRNA 百分比(%)) 1.25uM (剩餘 KCNB2 mRNA 百分比(%)) 62.5nM (剩餘 KCNB2 mRNA 百分比(%))
1122_33 14.84 41.69 66.57 88.67
1122_67 15.03 39.41 9.93 59.09
1122_82 18.29 50.93 17.61 73.26
1122_83 18.12 54.07 84.73 96.23
1122_84 12.59 40.95 27.66 74.71
1122_85 15.13 40.70 23.47 82.11
1122_86 16.64 53.29 75.13 113.41
1122_87 13.46 35.67 19.90 69.29
1122_88 12.85 34.25 24.41 68.38
1122_89 16.45 46.10 38.00 75.09
1122_90 18.52 50.88 60.64 93.90
1122_91 17.83 45.26 35.19 86.04
1122_92 15.49 41.46 21.27 68.79
1122_93 65.98 89.20 90.58 103.35
1122_94 63.83 92.70 82.15 98.30
1122_95 15.40 35.25 6.65 49.08
1122_96 16.51 44.63 2.69 48.45
1122_97 37.79 65.35 42.78 75.62
1122_98 14.34 38.27 0.91 42.75
1122_99 33.48 58.08 25.62 69.29
1122_100 12.21 31.92 0.85 44.41
1122_101 15.41 46.59 60.45 90.56
1122_102 15.62 41.71 16.98 62.88
1122_103 14.11 37.53 2.61 46.87
1122_104 18.01 47.10 36.56 81.02
1122_105 18.20 43.65 19.99 74.46
1122_106 16.64 36.77 7.75 55.14
1122_107 14.84 41.59 32.47 69.47
1122_108 12.89 32.26 8.10 72.49
1122_109 15.35 35.47 2.01 57.70
1122_110 19.02 45.56 0.72 45.61
1122_111 55.00 73.98 36.41 88.13
1122_112 16.38 40.70 0.77 50.17
1122_113 29.42 56.92 17.68 60.51
1122_114 13.63 33.67 0.43 42.62
1122_115 18.86 46.13 57.49 98.41
1122_116 31.73 59.42 28.44 86.09
1122_117 26.55 55.77 10.27 67.46
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1816_17 22.53 55.69 91.49 101.21
1816_18 21.46 53.93 85.50 99.48
1816_19 21.31 54.40 87.10 95.06
1816_20 23.72 53.87 92.47 105.09
1816_21 19.76 50.72 89.60 105.93
1816_22 95.15 104.15 102.13 103.05
1816_24 91.75 95.00 98.28 102.02
1816_25 56.04 88.36 86.52 109.26
1816_26 102.21 101.78 105.12 108.00
1816_27 24.15 67.01 92.61 99.83
1816_28 21.76 57.39 101.49 98.46
1816_29 30.53 72.76 99.75 98.54
1816_30 24.86 57.27 74.75 84.15
1816_31 41.00 72.35 106.54 101.47
1816_32 21.68 53.64 83.45 100.28
1816_33 36.10 74.71 78.48 109.62
1816_34 43.48 68.78 90.47 99.53
1816_35 78.05 89.09 93.93 96.53
1816_36 81.65 87.07 91.10 97.06
1816_37 62.87 82.62 96.63 102.82
1816_38 34.50 62.63 88.71 98.47
1816_39 17.06 43.55 68.41 91.25
1816_40 22.42 59.75 58.94 93.82
1816_41 24.34 60.50 78.94 94.74
1816_42 17.21 51.49 88.87 106.71
1816_43 15.45 48.67 93.79 96.40
1816_44 27.69 62.14 89.86 98.76
1816_45 28.43 62.53 93.60 104.83
1816_46 38.65 95.31 99.48 95.34
1816_47 39.25 73.69 85.32 99.46
1816_48 72.88 95.79 95.86 105.23
1816_49 42.05 72.73 95.26 95.07
1816_50 24.87 61.64 93.95 95.41
1816_51 24.13 58.48 94.87 86.45
1816_52 19.07 46.64 61.73 103.50
1816_53 24.65 59.39 95.95 103.39
1816_54 18.52 50.37 75.25 100.65
1816_55 21.38 55.81 80.93 97.54
1816_56 23.72 74.56 81.95 94.12
1816_57 31.08 63.23 97.13 97.12
1816_58 26.25 60.06 82.44 91.63
1816_59 38.54 74.45 96.86 99.10
1816_60 21.27 53.40 102.79 95.99
1816_61 22.84 55.21 84.32 108.50
1816_62 28.18 66.34 89.02 100.92
1816_63 22.52 58.32 99.09 104.39
1816_64 17.21 48.69 101.88 109.05
1816_65 18.02 48.71 97.59 108.12
1816_66 24.48 59.70 98.74 91.48
1816_67 25.08 60.20 102.17 102.41
1816_68 18.20 52.03 93.53 107.27
1816_69 28.58 64.76 100.03 95.56
1816_70 32.32 65.70 93.94 104.28
1816_71 47.83 78.25 89.25 109.07
1816_72 35.33 62.27 91.64 107.72
1816_73 20.55 98.77 85.68 103.65
1816_74 26.71 60.10 87.66 99.83
實例 15 ： 活體外毒性評估 – 凋亡蛋白酶測定
基於表 12 中的結果，選擇在靶向 ATXN3 方面最有效且對 KCNB2 影響最小的化合物在兩種凋亡蛋白酶活化測定中進行毒性評估 (參見 Dieckmann 等人, Molecular Therapy: Nucleic Acids Vol. 10 March 2018, pp45–54)；其分別在 HepG2 細胞 (「HEPG2」) 及 3T3 細胞 (「3T3」) 中實施。
結果顯示於表 13 中。使用與實例 7 中相同的評分標準，在毒性評估中發現絕大多數化合物是安全的。在「HEPG2」測定中，化合物 1816_52 的評分為 0.5，化合物 1816_30 及 1816_40 的評分為 1，化合物 1816_39 的評分為 3。在「3T3」測定中，評分為 0.5 的化合物為：1816_11、1816_74 及 1816_30；評分為 1 的化合物為：1816_54 及 1816_10；評分為 2 的化合物為：1816_52；評分為 3 的化合物為：1816_40 及 1816_39。
表 13
CMP 識別編號 HepG2 測定評分 3T3 測定評分 EC50 ATXN3 (nM) EC50 KCNB2 (nM) EC50 比率 (KCNB2/ATXN3)
1122_33 0 0 103.7 2330 22.5
1122_67 0 0 71.09 155.40 2.20
1122_91 0 0 87.73 673.50 7.68
1122_107 0 0 89.93 789.00 8.77
1122_125 0 0 81.85 98.95 1.2
1122_144 0 0 103.10 515.60 5.00
1122_146 0 0 93.11 490.10 5.26
1122_149 0 0 62.77 766.80 12.22
1122_150 0 0 89.36 808.50 9.05
1122_151 0 0 75.71 654.80 8.65
1122_152 0 0 66.09 662.20 10.02
1122_153 0 0 84.38 1208.00 14.32
1122_154 0 0 64.22 820.00 12.77
1122_155 0 0 75.16 1303.00 17.34
1122_156 0 0 55.26 736.10 13.32
1122_157 0 0 71.27 1658.00 23.26
1122_158 0 0 53.18 1217.00 22.88
1122_159 0 0 92.93 1472.00 15.84
1122_160 0 0 57.47 791.50 13.77
1122_163 0 0 98.81 564.40 5.71
1122_167 0 0 87.59 763.60 8.72
1122_172 0 0 67.13 465.70 6.94
1122_175 0 0 127.90 1277.00 9.98
1122_218 0 0 87.76 311.80 3.55
1122_294 0 0 93.12 2338.00 25.11
1122_296 0 0 114.80 8032.00 69.97
1122_302 0 0 104.10 682.80 6.56
1122_313 0 0 90.50 418.70 4.63
1122_319 0 0 70.04 408.20 5.83
1122_320 0 0 87.66 364.50 4.16
1122_323 0 0 99.59 720.60 7.24
1122_325 0 0 90.83 585.40 6.45
1816_4 0 0 200.90 248307.00 1235.97
1816_6 0 0 261.00 26826.00 102.78
1816_9 0 0 224.00 3280.00 14.64
1816_10 0 1 - - -
1816_11 0 0.5 - - -
1816_12 0 0 110 27238 247.6
1816_13 0 0 129.30 36344.00 281.08
1816_14 0 0 181.10 2262.00 12.49
1816_15 0 0 159.80 18449.00 115.45
1816_17 0 0 208.90 33758.00 161.60
1816_18 0 0 138.40 322538.00 2330.48
1816_19 0 0 180.40 107214.00 594.31
1816_20 0 0 299.50 279468.00 933.12
1816_21 0 0 203.00 16057.00 79.10
1816_28 0 0 141.10 10000.00 70.87
1816_30 1 0.5 - - -
1816_32 0 0 170.80 13406.00 78.49
1816_39 3 3 - - -
1816_40 1 3 - - -
1816_41 0 0 154.50 12106.00 78.36
1816_42 0 0 134.60 63672.00 473.05
1816_43 0 0 89.79 569489.00 6342.45
1816_51 0 0 239.70 9150.00 38.17
1816_52 0.5 2 - - -
1816_53 0 0 392.80 35864.00 91.30
1816_54 0 1 - - -
1816_55 0 0 209.00 7219.00 34.54
1816_58 0 0 259.00 23941.00 92.44
1816_60 0 0 167.10 67695.00 405.12
1816_61 0 0 165.20 22618.00 136.91
1816_63 0 0 263.00 19355.00 73.59
1816_64 0 0 127.00 5929.00 46.69
1816_65 0 0 99.75 36592.00 366.84
1816_66 0 0 351.30 3822.00 10.88
1816_67 0 0 - - -
1816_68 0 0 177.80 112276.00 631.47
1816_74 0 0.5 - - -
實例 16 ：測定 ATXN3 及 KCNB2 在 iCell® Glutaneurons 中的 EC50 值
在 iCell Glutaneurons 中的 EC50 測定中評估化合物，包括化合物 1122_67 及 1122_33。實驗設置與實例 14 中所述相同，不同之處在於使用以下化合物濃度 (nM)：31.6；10；3.2；1；0.32；0.1；0.03；0.01 (8 步半對數)。
ATXN3 及 KCNB2 的所得 EC50 值以及所得 EC50 值之間的比率 (KCNB2/ATXN3) 如表 13 所示。根據所得到的資料，觀察到與化合物 1122_67 相比，該化合物表現出的對 KCNB2 及 ATXN3 的測定 EC50 值之間的比率增加。對於大多數化合物，化合物對 ATXN3 減弱的效力相對保持不變，而當重點關注對 KCNB2 減弱的效力時，所有化合物的效力皆降低 (EC50 值更高)。
基於表 12 (雙點測定) 及表 13 (凋亡蛋白酶 活體外毒性；ATXN3 減弱的 EC50 及 KCNB2 與 ATXN3 EC50 值之間的比率) 中的資料，23 種化合物 (見表 14 及圖 12) 基於其安全性 (凋亡蛋白酶評分高於 0 已停止)、ATXN3 抑制的高效力及功效、選擇性 (亦即 KCNB2/ATXN3 EC50 值之間的高比率) 以及它們的化學多樣性進行選擇。
選定化合物的鹼基序列、醣序列及主鏈序列特徵見表 14，使用如下所示的 HELM 字典 (更詳細的 HELM 註釋見實例 13)。
鹼基序列 A: (A) C：(C) E：(5meC) G：(G) T：(T) U：(U) 醣序列 D: [dR] F：[fR] L：[LR] M：[MOE] O：[mR] 主鏈序列 S：[ssP] X：[sP]
表 14: 選定化合物
CMP 識別編號 鹼基序列 醣序列 主鏈序列 圖
1122_91 AATETTATTUACATCTTEE LDDLDLDDDODDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12A
1122_107 AAUETTATTTACATCTTEE LLOLDDDDDDDDDDDLDLL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12B
1122_154 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXSXXXXXXX 12C
1122_155 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXSXXXXXX 12D
1122_156 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXSXXXXX 12E
1122_157 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXSXXXX 12F
1122_158 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXSXXX 12G
1122_167 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLMDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12H
1122_172 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDDDDDODLLL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12I
1122_175 AATETTATTTACATCTTEE LDDLDLDDDDODDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12J
1122_294 AATETTATTTACATCTTCE LDDLDLDDDDDDDDDDLFL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12K
1122_296 AATCTTATTTACATCTTEE LDDODLDDDDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXXX 12L
1816_13 GAATETTATTTACATETT LLDDLDLLDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXSXXXXX 12M
1816_15 GAATETTATTTACATETT LLDDLDLLDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXSXXX 12N
1816_28 GAATETTATTTACATETT LLDDLDLFDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12O
1816_41 GAATETTATTTACATETT LLLDLDLLDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12P
1816_42 GAATETTATTTACATETT LLDDLDLLDDDDDDDLML XXXXXXXXXXXXXXXXX 12Q
1816_43 GAATETTATTTACATETT LLDDLDLLDDDDDDDMLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12R
1816_60 GAATETTATTTACATETT LLDDLDLODDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12S
1816_61 GAATETTATTTACATETT LLODLDLLDDDDDDDLLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12T
1816_64 GAATETTATTTACATCTT LLDDLDLLDDDDDDDFLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12U
1816_65 GAATETTATTTACATCTT LLDDLDLLDDDDDDDOLL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12V
1816_68 GAATETTATTTACATEUT LLDDLDLLDDDDDDDLFL XXXXXXXXXXXXXXXXX 12W
表 8B
  皮質 中腦 小腦 海馬迴 腦橋/延髓 紋狀體
化合物 EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘)
1856_1 251 33 77 20 434 49 202 41 - 24 103 27
1813_1 260 22 93 20 347 47 279 30 - 22 89 18
1812_1 307 52 156 28 603 50 233 35 - 26 184 32
1809_2 134 57 153 34 511 50 111 46 - 21 93 29
1607_1 193 40 89 17 120 42 81 21 - 15 63 26
1122_62 125 56 74 26 226 16 86 46 - 19 54 36
1122_67 125 23 79 14 261 27 146 22 - 13 88 19
1122_33 102 47 38 16 166 35 79 24 - 17 63 29
表 10
組織 皮質 (A1) 小腦 腦幹 中腦 紋狀體
EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值
處理 1 週 1122_67 242 88% 833 74% 196 87% 165 89% 148 77%
1813_1 278 61% 966 57% 377 85% 183 90% 118 51%
1100673 391 67% 2012 48% 769 79% 279 81% 331 69%
處理 4 週 1122_67 100 92% 365 81% 81 93% 94 95% 46 89%
1813_1 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND
1100673 199 49% 1229 33% 419 72% 129 74% 130 35%
組織 海馬迴 脊髓，頸部 脊髓，胸部 脊髓，腰部  
EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值 EC50 (nM) 最大 KD 觀測值  
處理 1 週 1122_67 243 75% 41 89% 39 90% 54 89%  
1813_1 341 63% 45 90% 36 92% 48 91%  
1100673 516 66% 83 83% 51 83% 68 82%  
處理 4 週 1122_67 89 92% 16 93% 不精確 93% 18 93%  
1813_1 ND ND ND ND ND ND ND ND  
1100673 329 52% 48 83% 不精確 84% 56 84%  
表 15: SEQ ID NO:1122 的特定反義寡核苷酸變異體
用於如本發明之特定反義寡核苷酸的核鹼基、醣修飾及核苷間鍵結的選項。SEQ ID NO:1122 中每個特定殘基編號處的核苷皆可從中選擇的選項顯示在由該殘基編號指示的每行中，從 5' 端開始。特定核鹼基 (「殘基編號的核鹼基選項」) 及醣修飾 (「殘基編號的醣修飾選項」) 定義了該殘基編號處的核苷。從 5' 端開始的特定殘基編號與下一個殘基之間的核苷間鍵結選項見名稱為「核苷間鍵結編號的主鏈修飾選項」一列。
SEQ ID NO:1122 中的殘基編號(從 5' 端開始) 殘基編號的核鹼基選項A: (A)；C：(C)；E：(5meC)；G：(G)；T：(T)；U：(U) 殘基編號的醣修飾選項D: [dR]；F：[fR]；L：[LR]；M：[MOE]；O：[mR] 核苷間鍵結編號的主鏈修飾選項(從 5' 端開始) S：[ssP]；X：[sP]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 A A T E T T A T T U A C A T C T TEE A A U E T T A T T T A C AT C T TEE AATETT ATTTAC A T C T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TEE AATETT ATTTACATC T TCE AATCTT ATTTACATC T TEE LDDLDL DDDODDDDD D L L L LLOLDD D D D D D D D D D L D L L LDDLDL D D D D D D D D D D LLL LDDLDL D D D D D D D D D D LLL LDDLDL D D D D D D D D D D LLL LDDLDL D D D D D D D D D D LLL LDDLDL DDDDDDDDD D LLL LDDLDL MDDDDDDDD D LLL LDDLDL DDDDDDDDO D LLL LDDLDL DDDDODDDD D LLL LDDLDL DDDDDDDDD D LFL LDDODL DDDDDDDD D D L L L XXXXXX XXXXXXXXX X XX XXXXXX XXXXXXXXX X XX XXXXXX XXXXSXXXX X XX XXXXXX XXXXXSXXX X XX XXXXXX XXXXXXSXX X XX XXXXXX XXXXXXXSX X XX XXXXXX XXXXXXXXS X XX XXXXXX XXXXXXXXX X XX XXXXXX XXX X X X X X X X X X XXXXXX XXXXXXXXX X XX XXXXXX XXX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
表 16: SEQ ID NO:1816 的特定反義寡核苷酸變異體
用於如本發明之特定反義寡核苷酸的核鹼基、醣修飾及核苷間鍵結的選項。SEQ ID NO:1122 中每個特定殘基編號處的核苷皆可從中選擇的選項顯示在由該殘基編號指示的每行中，從 5' 端開始。特定核鹼基 (「殘基編號的核鹼基選項」) 及醣修飾 (「殘基編號的醣修飾選項」) 定義了該殘基編號處的核苷。從 5' 端開始的特定殘基編號與下一個殘基之間的核苷間鍵結選項見名稱為「核苷間鍵結編號的主鏈修飾選項」一列。
SEQ ID NO:1816 中的殘基編號(從 5' 端開始) 殘基編號的核鹼基選項A: (A)；C：(C)；E：(5meC)；G：(G)；T：(T)；U：(U) 殘基編號的醣修飾選項D: [dR]；F：[fR]；L：[LR]；M：[MOE]；O：[mR] 殘基編號的主鏈修飾選項(從 5' 端開始) S：[ssP]；X：[sP]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATETT GAATETTATTTACATCTT GAATETTATTTACATCTT GAATETTATTTACATEUT LLDDLDLLDDDDDDDLLL LLDDLDLLDDDDDDDLLL LLDDLDLFDDDDDDDLLL LLLDLDLLDDDDDDDLLL LLDDLDLLDDDDDDDLML LLDDLDLLDDDDDDDMLL LLDDLDLODDDDDDDLLL LLODLDLLDDDDDDDLLL LLDDLDLLDDDDDDDFLL LLDDLDLLDDDDDDDOLL LLDDLDLLDDDDDDDLFL XXXXXXXXXXXSXXXXX XXXXXXXXXXXXXSXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXX
實例 17 ：評估經重新設計的化合物的 PK/PD 的基因轉殖小鼠研究
該研究主要如實例 8 中所述進行。簡言之，該研究包括 10 至 12 週齡的基因轉殖動物 (B6;CBA-Tg(ATXN3*)84.2Cce/IbezJ 雄性及雌性小鼠 – 每組 8 只 (JAX® 小鼠，The Jackson Laboratory))。將 150 μg 化合物 (4 μl) 注射到動物腦池 (ICM) 中。4 週後犧牲動物，獲得選定組織以評估寡核苷酸含量以及對標靶轉錄本的減弱。分析方法如實例 8 中所述。
結果見下表 17。
表 17: 療效結果。
  皮質 中腦 小腦 腦橋/延髓
化合物識別編號 EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘) EC50 (nM) 最大效率 (% 剩餘)
1122_91 894 77 69 52 616 63 134 41
1122_107 1385 35 73 20 388 22 95 21
1816_28 1791 71 442 62 1682 79 664 70
1816_42 8587 86 14763 73 1990 76 598 69
1122_156 812 69 75 43 330 56 105 40
1816_65 1633 73 453 55 1147 73 1053 59
*ND：基於可用資料無法確定值
表 17 顯示了由實例 17 所述的研究所得到的讀出。計算每個獲得的大腦區域中各化合物的 EC50 值。此外，在每組/組織內突出顯示了最大程度地獲得的標靶減弱，顯示了標靶 mRNA 相對於鹽水對照組的剩餘百分比(%)。
評估結果得到了在功效及效力方面具有吸引力的化合物，亦即 EC50 值較低且「最大功效 (剩餘百分比(%))」一列的值較低。基於這些標準的最有吸引力的化合物是 1122_107，其在所有組織中具有最佳功效，且 EC50 值為所有實測值的最低值的一半。基於功效及效力的另一種有吸引力的化合物是 1122_156。
實例 18 ：比較基因轉殖小鼠研究 – 耐受性評估
實施另外的 活體內研究以評估測試化合物的耐受性。該研究主要如實例 10 中所述進行。簡言之，將約 7 週的野生型動物 (C57BL/6J) 納入研究。使用購自 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) 的動物，且皆為雌性動物。經由腦池內 (ICM) 投予，為小鼠注射化合物。4 週後，將動物處以安樂死並採集選定組織。向 WT 動物注射劑量為 300 μg 的化合物。
在第 1 天投予後 1 小時、4 小時及 24 小時 ± 2 小時，獲得動物的功能觀察組 (FOB) 評分，然後在計劃終止前再次獲得動物的 FOB 評分。
FOB ( 功能觀察組 ) 評分
FOB 評分是一種描述各種神經行為及活動相關參數的非侵襲性工具。
程序：
技術人員對群組歸屬不知情。動物在其飼養籠中觀察至少 1 分鐘，以記錄以下參數的評分。使用直腸溫度計記錄體溫。
除體溫之外，評估均在動物保留在其飼養籠期間進行；不使用開放空間試驗箱。
活動： -           醒覺/警覺 -           重復運動 -           姿勢/體態 興奮性： -           抽搐 自主： -           瞼閉合/上瞼下垂 -           皮毛豎立
神經肌肉： -           步態/活動能力 -           震顫 生理： -           呼吸 -           體溫  
基於對動物的評估，將其評為受到化合物投予的輕度 (與鹽水對照組在同一範圍內)、中度或重度影響。
化合物投予
給藥途徑：立體定向腦室內 (ICV) 注射。劑量體積為 10 μl。使用連接有 22 號針頭的 10 µL Hamilton 注射器在一次注射中以 1 µL/秒的標靶速率投予。
表 18 提供了化合物列表，列出化合物識別編號、測試化合物的注射量及生活觀察結果的評級 (輕度、中度或重度)，其中輕度的定義是無或只有很少的不良事件跡象，重度的定義是組內動物有提前終止可能的組的重度觀察結果。
表 18: 耐受性結果。
化合物識別號 劑量 活體階段耐受性觀察結果 動物數量* 提前終止
鹽水 – 輕度 6 0
1122_91 300 µg 中度 7 0
1122_107 300 µg 中度 7 0
1122_172 300 µg 中度 7 0
1816_28 300 µg 重度 3 1
1816_42 300 µg 重度 3 0
1816_43 300 µg 重度 3 1
1122_154 300 µg 中度 6 0
1122_156 300 µg 輕度 6 0
1813_15 300 µg 重度 3 1
1605_4 300 µg 輕度 6 0
1816_65 300 µg 重度 3 1
1605_2 300 µg 輕度 6 0
1816_64 300 µg 重度 3 3
*出於人道原因，對 3 只動物投予，並根據耐受性在第二天對另外 3 至 4 只動物投予。
化合物識別編號：1813_15 具有以下結構 (HELM 符號)：
1813_15 [LR]([5meC])[sP].[LR](T)[sP].[LR](G)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[mR](C)[sP].[mR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](T)[sP].[dR](A)[sP].[dR](C)[sP].[dR](A)[sP].[LR](T)[sP].[LR](T)[sP].[LR]([5meC])
根據表 18，觀察到不同化合物的與急性耐受性相關的不同結果，一些化合物表現出「輕度」跡象 (如鹽水組動物)，包括化合物識別編號 1122_156、1605_4 及 1605_2；一些化合物表現出「中度」跡象，如化合物識別編號 1122_107 及 1816_64；而其他化合物則表現出「重度」跡象，如化合物識別編號 1816_43 及 1816_64。
處理小鼠後，對動物進行組織病理學評估 (大體及微觀)。評估的目的是確定與化合物相關的毒理學事件，包括亞急性及遲發性事件。評估包括病理學家基於蘇木精及曙紅染色對可能的化合物相關的神經元變化的評估，以及藉由 Fluoro-Jade 染色來評估神經元變性的跡象。
實例 19 ：在人類 iPSC 源性神經元中的時程、劑量範圍實驗中對 LNA 寡核苷酸進行活體外作用持續時間評估
利用表 19 及表 20 中列出的化合物，在時程實驗設置中對效力及功效進行 活體外評估。該研究主要如實例 9 中所述進行，採用不同的時間點及化合物。
iCell® GlutaNeuron細胞的製備和維持基本上如實例 5 及表 2 中所述。將 96 孔細胞培養盤塗以聚 L-鳥胺酸 (0.01%) (Sigma-P4957)，100 μl/孔，4 小時，用 PBS 沖洗 3 次，並於 4 攝氏度下過夜以 Laminin (Roche Diagnostic, 11243217001) 0.5 mg/ml 塗覆(用 PBS 按 1:500 稀釋)。細胞按照供應商的建議進行處理和維持，使用所提供的方案：iCell® GlutaNeurons，用戶指南，文件 ID：X1005，1.2 版，Cellular Dynamics，Fujifilm；可從以下網址獲得：cdn.stemcell.com/media/files/manual/MADX1005-icell_glutaneurons_users_guide.pdf (於例如 2020 年 11 月 10 日訪問)。細胞生長 7 天，然後加入寡核苷酸。將來自預稀釋盤的化合物 (用 PBS 稀釋的化合物) 加入細胞中，達到所需的最終濃度。所用濃度為包含以下濃度 (nM) 的 8 步半對數：31.6；10；3.2；1；0.32；0.1；0.03；0.01。
所用化合物列於表 19 及表 20 中。
利用以下引子評估 hATXN3 的標靶 mRNA 的減弱水平。
人類 ATXN3 前驅 mRNA，使用 qPCR 測定：定制設計「(ATXN3_外顯子_8-9(1)」，PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT)。 探針：5'-/56-FAM/CTCCGCAGG/ZEN/GCT ATTCAGCT AAGT /31ABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1134) 引子 1：5'-AGT AAGATTTGT ACCTGATGTCTGT-3' (SEQ ID NO:1135) 引子 2：5'-CATGGAAGATGAGGAAGCAGAT-3' (SEQ ID NO:1136)
人類 TBP 前驅 mRNA，使用 qPCR 測定：「Hs.PT.58v.39858774」，PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) 探針：5’- /5HEX/TGA TCT TTG /ZEN/CAG TGA CCC AGC ATC A/3IABkFQ/ -3’ (SEQ ID NO:1131) 引子 1：5’- GCT GTT TAA CTT CGC TTC CG-3’ (SEQ ID NO:1132) 引子 2：5’- CAG CAA CTT CCT CAA TTC CTT G-3’ (SEQ ID NO:1133)
在寡核苷酸處理後 4 天、20 天、29 天及 40 天收穫細胞，並使用實例 5 中所述的 ATXN3 引子測定，如實例 1 所述進行 RNA 提取及 qPCR。相對 ATXN3 mRNA 表現含量以相較於對照組 (經培養基處理後的細胞) 的百分比(%)確定，數值越低表示抑制率越高。結果列於表 19 及表20 中。表 19 顯示了在給藥後指定時間點內測試化合物的效力 (EC 50 值 (nM))。表 20 顯示了在給藥後指定時間點用 3.2 μM 化合物給藥後相對於 PBS 處理的細胞的剩餘 ATXN3 mRNA 百分比(%)的資料。
表 19: hiPSC 源性神經元中的 EC50
CMP 識別編號 hiPSC 源性神經元中的 EC50，nM
第 4 天 第 20 天 第 29 天 第 40 天
1122_154 56.5 42.4 89.3 314.4
1122_156 53.2 33.4 50.1 88.7
1816_28 128.4 653.3 926.1 1465.0
1605_4 76.7 33.6 47.3 71.8
1816_65 70.9 51.0 184.2 692.3
1122_91 115.5 76.9 171.6 748.0
1122_107 74.6 20.7 19.0 35.1
1122_172 66.1 50.1 90.4 306.1
1816_42 196.0 262.0 546.3 830.7
1816_43 97.2 68.5 136.1 709.8
陰性對照 ND ND ND ND
*ND：基於可用資料無法確定值
在各個時間點計算出的各種化合物的 EC50 值列於表 19 中。根據這些資料可以看出，在不同時間點獲得的不同化合物的 EC50 值範圍很寬。一般而言，一些化合物表現出高 EC50 值，表明其效力低，且隨著時間的推移而下降 (值更高)。這些化合物的示例為化合物識別編號 1816_28 及 1122_172。另一方面，亦有化合物在 40 天內保持高效力 (EC50 值低)，表現出低於 100 nM 的 EC50 值。這些化合物的示例為化合物識別編號 1122_156、1605_4 及 1122_107。低 EC50 值是化合物的一種有益的特性，因為它表明需要較少量的化合物來引發效應。
表 20: 添加 3.2 µM 化合物後對 hiPSC 源性神經元的功效。
CMP 識別編號 經 3.2 µM 化合物處理後，hiPSC 源性神經元中剩餘轉錄本的百分比(%)
第 4 天 第 20 天 第 29 天 第 40 天
1122_154 6.3 4.4 11.5 19.0
1122_156 6.8 5.0 7.8 16.0
1816_28 13.2 29.6 32.3 50.5
1605_4 8.7 3.3 2.9 4.5
1816_65 7.5 8.2 13.1 22.7
1122_91 10.5 8.0 15.5 32.5
1122_107 8.3 4.5 4.3 6.0
1122_172 7.1 4.8 8.2 22.0
1816_42 9.8 15.2 23.6 46.3
1816_43 7.1 7.8 9.8 20.9
陰性對照 93.5 95.1 94.1 115.8
表 20 顯示了用如上所述的 3.2 μM 化合物處理細胞後所觀察到的剩餘 mRNA 含量(相比於 PBS 對照的剩餘轉錄本的百分比(%))。在添加化合物後的多個時間點進行評估。從表中可以清楚地看出，在單次暴露於化合物後 40 天內，許多化合物能夠保持對 mRNA 含量的抑制。許多化合物能夠在 40 天的持續時間內保持超過 90% 的抑制，諸如化合物識別編號 1605_4 及 1122_107。此外，化合物識別編號 1122_156 在 40 天內表現出高水平的減弱。長時間內的高水平的減弱表明作用持續時間長，並且有可能更不頻繁地投予。
實例 20 ：基因轉殖動物 活體內功效及作用持續時間的評估
使用化合物識別編號 1605_4、1122_107 及 1122_156 實施另一項 活體內研究。該研究使用雄性及雌性 B6;CBA-Tg(ATXN3*)84.2Cce/IbezJ 小鼠以及經由腦池內 (ICM) 投予的化合物。在化合物投予後的三個時間點，即 4 週、8 週及 11 週，將動物處以安樂死並收集終末血漿樣本及組織。
動物照護
在 10 週齡的 62 B6; CBATg(ATXN3*)84.2Cce/IbezJ 雄性及雌性小鼠 (JAX® 小鼠，The Jackson Laboratory) 中測試化合物的 活體內活性及耐受性。到達後，將動物分成多達 5 組，飼養在單獨通風的籠子 (IVC, 38 x 22 x 15 cm) 中，處於溫度 (22 ± 2℃) 及濕度 (55 ± 15%) 受控的環境中，採用 12 小時光照週期 (07.00 至 19.00 h)。將雄性及雌性動物飼養在單獨的籠中。標準飼料 (SDS Diets, RM1 PL) 及家用優質自來水可隨意使用。如果需要，除標準飼料之外，動物還接受浸泡過的食物及/或 Royal Canin 作為悉心照顧的一部分。實驗嚴格按照實驗動物護理及使用指南 (國家研究委員會 2011) 進行，並符合歐盟指令 2010/63 及荷蘭法律。
投予途徑 - 腦池內注射。
藉由腦池內 (ICM) 注射，向小鼠投予化合物。使用異氟醚 (2.5% 至 3% 及 500 mL/min O2) 將小鼠麻醉。手術前，投予 Finadyne (1 mg/kg, s.c.) 用於手術期間和手術後恢復期的止痛。將布比卡因 (bupivacaine) 與腎上腺素的混合物應用於切口部位及顱骨骨膜以進行局部止痛。將動物置於立體定位框架 (Kopf instruments, USA) 中，並在頭部後部朝向頸部切口。然後，在頭顱的枕骨上鑽孔以在其中放置套管之前，將皮膚鋪開並標記坐標。然後，將化合物注射到腦池 (ICM) 中。在 30 秒內注射體積為 10 μL 的指定供試品。注射後，將針頭和套管固定 30 秒以確保不發生回流。然後收回套管，用皮膚覆蓋孔並縫合切口。動物被放置在一個溫暖環境中，直到從麻醉中恢復為止。化合物作為單劑量投予，如表 21 中所列。每組包含 4 至 6 隻動物。
表 21: 治療方案。
化合物識別編號 體積為 10 µl 的化合物劑量 治療週
0.9% 鹽水 - 4
1605_4 20 µg/µl 相當於 200 µg 化合物 4，8，11
1122_107 20 µg/µl 相當於 200 µg 化合物 4，8，11
1122_156 20 µg/µl 相當於 200 µg 化合物 4，8，11
實驗結束時 (第 4、8 及 11 週後)，藉由過量使用 Euthasol®，將動物處以安樂死。將終末血漿收集到 Li-Hep 管中。收穫動物的終末組織，並在低溫表面上進行解剖。將一半組織樣本儲存於 2.0 mL 安全鎖管中，進行 PCR 清潔、預稱重並預冷卻。收集後立即對樣本稱重，並在液氮中快速冷凍，然後儲存於 -80℃ 下。將另一半在 4% PFA 中固定 72 小時，隨後轉移至 70% 乙醇中等待運輸。進行組織解剖及收集，從一系列組織中收集組織：皮質、小腦、腦幹、中腦及紋狀體。所投予的任何化合物均未表現出急性毒性跡象，因此未因化合物相關的毒性而提前終止動物。
活體內樣本分析：用於含量測量及 qPCR 的組織製備說明按照實例 8 所述進行。將所實現的標靶 mRNA 減弱的中位數記錄為相對於鹽水對照組的剩餘靶標轉錄本百分比(%)，該資料見表 22。
表 22: 各種化合物在各時間點的減弱資料。
組織 皮質 小腦 腦幹 中腦 紋狀體
KD 中位數 (% 剩餘轉錄本) KD 中位數 (% 剩餘轉錄本) KD 中位數 (% 剩餘轉錄本) KD 中位數 (% 剩餘轉錄本) KD 中位數 (% 剩餘轉錄本)
處理 4 週 1605_4 – 200 µg 19 34 8 5 34
1122_107 – 200 µg 35 31 14 8 41
1122_156 – 200 µg 53 44 16 12 53
處理 8 週 1605_4 – 200 µg 56 41 22 12 67
1122_107 – 200 µg 43 30 25 17 33
1122_156 – 200 µg 76 46 46 38 72
處理 11 週 1605_4 – 200 µg 65 50 38 21 73
1122_107 – 200 µg 82 41 46 39 75
1122_156 – 200 µg 99 70 70 75 100
總體而言，可以看出，當重點關注減弱功效時，腦幹及中腦為所有化合物中最有效靶向的腦區域。
實例 21 ：經選定寡核苷酸 (ASO) 處理的人類 SCA3 患者源性纖維母細胞中的 WT 及 polyQ Ataxin 3 蛋白含量
本實例中提及的參考化合物 1287095 及 1102579 分別對應於 WO2020/172559 A1 中以化合物編號 1287095 揭示的寡核苷酸及 WO2019/217708 中以化合物編號 1102579 揭示的寡核苷酸。
本實驗的目的是研究所測試的反義寡核苷酸的減弱功效。該研究主要如實例 12 中所述進行。
在 SCA3 患者原形纖維母細胞中進行評估，從而評估對引起疾病的 Ataxin3 等位基因及 Ataxin3 WT 等位基因的功效。
用於 ASO 處理的細胞株為人類 SCA3 患者源性纖維母細胞 (GM06153 – Coriell Institute)。在 24 孔盤中，每孔接種 2 萬個細胞，總體積為 1 ml。然後立即加入 ASO，使其最終濃度為 5 μM (裸吸收)。培育 4 天後，將細胞用 PBS 洗滌兩次，並收穫於 50 µl LDS 樣本緩衝劑 (NuPAGE, Thermo Scientific) 中，該緩衝劑中添加有 50 mM 新鮮 DTT。
使用 WES 12-230 kDa Wes 分離模塊在基於毛細管的免疫測定平台 (WES, ProteinSimple) 上進行西方墨點測定。將細胞裂解物用上樣緩衝劑 (ProteinSimple) 稀釋 10 倍，然後上樣至管匣上。針對 Ataxin 3 (兔單株抗體，產品編號：702788，購自 Invitrogen) 及 HPRT (兔單株抗體，型錄號碼：Ab109021，購自 Abcam) 的初級抗體。兩種抗體皆以 1/100 稀釋度使用。將山羊抗兔 HRP 結合物 (部件號：DM-001，ProteinSimple) 用為二級抗體。
利用 Compass 軟體 (ProteinSimple) 對蛋白條帶進行定量。
結果
Ataxin 3 抗體識別兩種同種型，並將強度 (峰下面積) 基於來自 HPRT 的訊號標準化至蛋白輸入。原始資料顯示於圖 13 及 14 中，並按圖 15 所示進行定量。
對於各種化合物，使用普通 t 檢驗 (未配對、雙尾、同方差，使用 Microsoft Excel 2016 版本 16.0.5227.1000 計算) 評估等位基因選擇性之間的差異，比較所偵測到的各種等位基因含量的每種化合物。觀察到化合物識別編號 1287095 與 1122_156 之間存在差異 (α = 0.05)。
評估各種等位基因 (例如，分別為野生型及 polyQ 擴展的等位基因) 對蛋白減弱的影響，並使用普通單向 ANOVA 檢驗與用於多重檢驗的 Dunnett 校正 (使用 GraphPad Prism 計算，版本 8.4.2 (679))，與陰性對照進行比較。除化合物識別編號 1287095 之外，所有化合物均觀察到來自 WT 及 polyQ 等位基因的蛋白質有一定程度的減少，其中使用有效濃度為 5 μM 的化合物未觀察到任一等位基因減少。
總之，從圖 13 至 15 中可以觀察到，化合物識別編號 1605_2、1605_4、1122_107 及 1122_156 有效誘導標靶蛋白 (野生型及 polyQ 擴展版本) 減弱，並且化合物識別編號 1122_156 還對 polyQ 擴展的等位基因具有統計學上顯著的影響。與 WT Ataxin 3 相比，對引起疾病的 polyQ 擴展的 Ataxin 3 具有更高活性為較佳的，因為它允許選擇性減少引起疾病的等位基因。在測試條件下，參考化合物 1287095 及 1102579 未誘導任一版本的標靶蛋白顯著減少。
該實驗裝置還測量了用圖 15 中所示的化合物處理後對 mRNA 含量的影響。資料未顯示，但分析完全按照實例 22 中所述進行。化合物對 ATXN3 mRNA 含量的影響遵循與蛋白含量相同的模式。這意味著當觀察到高水平的蛋白質減弱時，也觀察到高水平的 mRNA 減弱，反之亦然，如實例 22 所示。
實例 22 ：在用選定寡核苷酸 (ASO) 處理的人類 SK-N-AS 細胞株中減弱 WT Ataxin3 蛋白含量
本實驗的目的是研究所測試的反義寡核苷酸的減弱功效。評估在 SK-N-AS 細胞 (表 2 中列出的細胞株) 中進行，從而評估對 Ataxin3 等位基因及相關蛋白質產生的功效。在 24 孔盤中，每孔接種 2.5 萬個細胞，總體積為 500 µl。在三個重複孔中，然後立即加入 ASO，使其最終濃度為 5 μM (裸吸收)。參考化合物 1287095 及 1102579 以 15 µM 的濃度進行了額外測試。培育 4 天後，將細胞用 PBS 洗滌兩次，並收穫於 100 µl LDS 樣本緩衝劑 (NuPAGE, Thermo Scientific) 中，該緩衝劑中添加有 50 mM 新鮮 DTT。使用 WES 12-230 kDa Wes 分離模塊在基於毛細管的免疫測定平台 (WES, ProteinSimple) 上進行西方墨點測定。將細胞裂解物用上樣緩衝劑 (ProteinSimple) 稀釋 10 倍，然後上樣至管匣上。針對 Ataxin 3 (兔單株抗體，產品編號：702788，購自 Invitrogen) 及 HPRT (兔單株抗體，型錄號碼：Ab109021，購自 Abcam) 的初級抗體。兩種抗體皆以 1/100 稀釋度使用。將山羊抗兔 HRP 結合物 (部件號：DM-001，ProteinSimple) 用為二級抗體。
利用 Compass 軟體 (ProteinSimple) 對蛋白條帶進行定量。
在類似的設置中，亦藉由數位液滴 PCR (ddPCR) 分析上述化合物對轉錄本含量的影響進行評估。相對於化合物濃度及時間點，細胞的處理與用於蛋白質測定的細胞類似。SK-N-AS 細胞株用於 ASO 處理，在 96 孔盤中每孔接種 10,000 個細胞，總體積為 0.1 ml。然後立即添加 ASO，使其最終濃度為 5 µM；對於化合物 1287095 及 1102579，其濃度亦為 15 µM (裸吸收)。培育 4 天後，將細胞用 PBS 洗滌兩次，並收穫於 200 μl RIPA 緩衝劑 (Thermo Scientific, Pierce) 中。純化的 RNA 在 cDNA 合成前變性。根據製造商的說明，使用用於 RT-qPCR 的 iScript Advanced cDNA (Biorad) 合成套組創建 cDNA。使用 QX200 液滴系統 (Bio-Rad) 以及 QX200 軟體標準版，藉由液滴數位 PCR 測量標靶基因的表現含量。
使用以下測定進行分析：
qPCR 探針及引子組：
PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) - ATXN3_外顯子_8-9(1) 探針：5'-/56-FAM/CTCCGCAGG/ZEN/GCT ATTCAGCT AAGT /31ABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1134) 引子 1：5'-AGT AAGATTTGT ACCTGATGTCTGT-3' (SEQ ID NO:1135) 引子 2：5'-CATGGAAGATGAGGAAGCAGAT-3' (SEQ ID NO:1136)
參考基因為 hHPRT
PrimeTime® XL qPCR 測定 (IDT) - Hs.PT.58v.45621572 探針：5'- /5HEX/AGCCTAAGA/ZEN/TGAGAGTTCAAGTTGAGTTTGG/ 3IABkFQ/-3' (SEQ ID NO:1993) 引子 1：5'- GCGATGTCAATAGGACTCCAG-3' (SEQ ID NO:1994) 引子 2：5'- TTGTTGTAGGATATGCCCTTGA-3' (SEQ ID NO:1995)
經化合物處理後剩餘 mRNA 含量的評估結果如圖 19 所示。
結果
Ataxin 3 抗體識別由細胞表現的野生型 Ataxin 3 蛋白，並將強度 (峰下面積) 基於來自 HPRT 的訊號標準化至蛋白輸入。原始資料顯示於圖 16 及圖 17 (參考化合物，包括陰性及陽性對照) 中，且定量結果以圖形格式顯示於圖 18 中。
使用普通單向 ANOVA 檢驗與用於多重檢驗的 Dunnett 校正 (使用 GraphPad Prism 計算，版本 8.4.2 (679))，與隱性 PBS 對照進行比較，以評估所測試的化合物中之每一者對蛋白質減弱的影響。與 PCR 對照樣本相比，對於 p 值 ＜0.001 的所有化合物，均觀察到蛋白質含量降低。從原始 WES 資料 (圖 16 及圖 17) 及定量 (圖 18) 可以清楚地看出，化合物之間的蛋白質減弱水平存在顯著差異。化合物 1605_2、1605_4、1122_107 及 1122_156 在使用 5 μM 的有效濃度時非常有效地減弱 Ataxin 3 蛋白。參考化合物 1287095 及 1102579 皆不太有效。參考化合物 1287095 及 1102579 即使在不利的高濃度 (15 µM，比其他相應的劑量 5 µM 高 3 倍) 下也無法誘導與表現最佳的化合物相同水平的影響 (蛋白減弱水平)。
圖 19 顯示了具有所列應用的濃度的化合物在編碼 ATXN3 的轉錄本的減弱方面的功效。mRNA 減弱遵循與圖 18 中所示的蛋白質定量所觀察到的相同模式。同樣觀察到，與化合物 1287095 及 1102579 相比，化合物識別編號 1605_2、1605_4、1122_107 及 1122_156 在降低 ATXN3 mRNA 含量方面更有效。同樣，應用濃度高三倍的化合物 1287095 及 1102579 仍未獲得與表現最佳的化合物一樣高的功效水平。
圖 1：化合物 1122_67 (SEQ ID NO:1122) 的圖示。 圖 2：化合物 1813_1 (SEQ ID NO:1813) 的圖示。 圖 3：化合物 1856_1 (SEQ ID NO:1856) 的圖示。 圖 4：化合物 1812_1 (SEQ ID NO:1812) 的圖示。 圖 5：化合物 1809_2 (SEQ ID NO:1809) 的圖示。 圖 6：化合物 1607_1 (SEQ ID NO:1607) 的圖示。 圖 7：化合物 1122_62 (SEQ ID NO:1122) 的圖示。 圖 8：化合物 1122_33 (SEQ ID NO:1122) 的圖示。 圖 9：化合物 1122_67 及 1813_1 以及 5 種參考化合物在 24 小時 SVPD 測定中的穩定性。 圖 10.A) 經不同 ASO 處理之 GM06153 細胞的 WES 分析結果，獲得的野生型 Ataxin 3 (55 kDa) 及 polyQ (polyglutamine，聚麩醯胺) 延伸之 Ataxin 3 (77 kDa) 減少。B) 經標準化至 HPRT 的條帶強度的分析結果。野生型 Ataxin 3 由 55 kDa 處之條帶表示，polyQ 延伸之 Ataxin 3 由 77 kDa 處之條帶表示。在蛋白分析之前，細胞經 10 uM ASO 處理 4 天。資料表示經 ASO 以三重複方式處理之細胞的平均值 +-SD。SC，加擾對照寡核苷酸（scrambled control oligo）。 圖 11.化合物 1816_12 的圖示。 圖 12.表 14 中化合物 (實例 16) 的圖示： (A) 化合物 1122_91； (B) 化合物 1122_107； (C) 化合物 1122_154； (D) 化合物 1122_155； (E) 化合物 1122_156； (F) 化合物 1122_157； (G) 化合物 1122_158； (H) 化合物 1122_167； (I) 化合物 1122_172； (J) 化合物 1122_175； (K) 化合物 1122_294； (L) 化合物 1122_296； (M) 化合物 1816_13； (N) 化合物 1816_15； (O) 化合物 1816_28； (P) 化合物 1816_41； (Q) 化合物 1816_42； (R) 化合物 1816_43； (S) 化合物 1816_60； (T) 化合物 1816_61； (U) 化合物 1816_64； (V) 化合物 1816_65； (W) 化合物 1816_68； 化學圖示顯示了反義寡核苷酸的質子化形式，應理解，硫代磷酸酯核苷間鍵結中硫原子上的各個氫可獨立存在或不存在。在鹽形式中，氫原子中之一者或多者可例如經陽離子諸如金屬陽離子 (諸如鈉離子或鉀離子) 取代。 圖 13.影像示出蛋白含量之 WES 分析的原始結果。包括化合物 1605_4、1122_107、1122_156 及加擾對照寡核苷酸。 圖 14.影像示出蛋白含量之 WES 分析的原始結果。包括化合物 1287095、1102579、1605_2 及加擾對照寡核苷酸。 圖 15.經標準化至 HPRT 的條帶強度的分析結果。在蛋白分析之前，細胞經 5 μM ASO 處理 4 天。資料表示經 ASO 以三重複方式處理之細胞的平均值 +-SD。* p 值 ＜0.05；** p 值 ＜0.01。 圖 16.經不同 ASO 處理之 SK-N-AS 細胞的 WES 分析結果，獲得的野生型 Ataxin 3 (55 kDa) 減少。用於標準化的加載對照為 HPRT。. 圖 17.經不同參考化合物 ASO 處理之 SK-N-AS 細胞的 WES 分析結果，獲得的野生型 Ataxin 3 (55 kDa) 減少。用於標準化的加載對照為 HPRT。. 圖 18.經標準化至 HPRT 的條帶強度的分析結果。在蛋白分析之前，細胞經 5 uM 或 15 uM ASO 處理 4 天。資料表示經 ASO 以三重複方式處理之細胞的平均值 +-SD。 圖 19.ddPCR 分析結果示出經所列化合物處理後之 ATXN3 mRNA 的剩餘含量。 
<![CDATA[<110>  瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)]]>
          <![CDATA[<120>  靶向 ATXN3 之反義寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<130>  P36525-WO]]>
          <![CDATA[<150>  EP20211618.2]]>
          <![CDATA[<151>  2020-12-03 ]]>
          <![CDATA[<160>  1995  ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 第 3.5 版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  62130]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          ggaggagagg ggcagggggc ggagctggag ggggtggttc ggcgtggggg ccgttggctc       60
          cagacaaata aacatggagt ccatcttcca cgagaaagtg agtgtccgcg ttcggtgggg      120
          agctgtctgc cgcgcggtgg cgggcgtgga gcgcggcatc accgcctctc ggagggctgg      180
          gtggggcccg agtcgccccc atgccgatct cgcccggcga ggggcgacgc cgcagcctcc      240
          cgcctcctcg gctcgaggag gggagcatca cctacgcccc tacttccccc gcggcccccg      300
          ccctgggagc cgggagggag tatgggcggg gccgggggcg tctcgggaca cgggagtggg      360
          gtggcgccca gtgggtttgc ttctgccttt ctccgtcact ttccatcgct tttcggagga      420
          ttccttcacc cctccccaat ccttccctct ccctagggtc tagctagagt catctctggg      480
          acacctccct caacccctcc taccctaatc ctggcagaat taacttttcc tcctccggac      540
          tgctcaattc tatattggag tcttccctac acgtagatct ttggggtctt gttcgtgtct      600
          ttcccctgca ctaggtccgc gagcctcccg agggaggaga ccttggctcg cccactgtag      660
          ggcctgacat ttaggaagtg aagtaggaaa cccggcgtgc ccctaaacag ggaagtcgtc      720
          acaagagttt ttattacggg atgtttgggt ttggtttctt ttggtactcc catctttccg      780
          gagcaggcgg ccagctttgt ttttaggtat taggagtgga ctgggatgat tttgttgtag      840
          tctgcctagc ctgctgtccc tttaactctt ccgtgaccat gcacttgaag atactgtttg      900
          tgatatgtaa agaaactcct cgtttctctc atactattat ccagccattt gtgtgtgagt      960
          gaagccttcc ccaggacagc tttggcacat ggtatcatgt ttcataatag tttcgtgttt     1020
          ggaaagagtt gctggtaagg ctgttattta ataggaggag caaagggttt ttgttttatt     1080
          aaatacttat aaatgatcat ttatcccaga catttaaaat tcacacacac acaacaaata     1140
          aagcaaagac aaaagaatac atttaccaaa tgtaaatctg tagcataaat tttttttaat     1200
          ttttatttta aagatggggt ctcattctgt cacccaggca ggtgtgcaat ggagagatca     1260
          tggctcactg cagccttgat ctcctaggca caagcgatcc tcccgcctct gcctccagag     1320
          tagctgggac tacaggtgca tatcgccagg gccaggtaat gtttttggga gagacggggt     1380
          ctcgctgtgt tgcccaggct ggtctcgaac tcctggactc aggtgattct cccacctcgg     1440
          cctctcgaag tgctgtgatt acaggcgtga gccactgtgc ctggaacaaa ttgttaagta     1500
          caatgctttt cattgtagaa aacatctcgg aaacttttga aataggctga tgttcagtgg     1560
          gggaggaagg actcagtcgt atagttgtca ctaatttttt gacttgattg acatgactcg     1620
          taaatcatag acaatagaga tttggttgct tggctgagta gagtgcgtga aaaatacaca     1680
          cgtacttttt tttttttttt tttgagatgg agtttggctc ttgtcaccca ggctggagtg     1740
          caatggcgcc atcatggctc actgcaacct ccgcctcccc gttcaagcga ttctcctgcc     1800
          tcagtctccc cagtagctga gattacaggc gcccgccacc acgcccagct aatttttgta     1860
          tttttagtag agacagggtt tcaccatgtt ggccaggctg gtctccaact cctgacaggt     1920
          ggtccgcccg cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gcgtgagcca ccgcacccgg     1980
          ccatattttt gttattaatt ttcaaaggct ttggtgtggg accacatttc aacatggaag     2040
          gccttaaaca tgttccacac tacttcctga gaattagaca agatttttaa caatattgtt     2100
          acctagttgg gacacatttg tactgaccca tgggatgaaa aaaagctgag tgctagccta     2160
          gtgaaaatct acttacccga aagaaatccc tcttagtctg ggtgcagtgg ctcacaccag     2220
          tgctttggga ggcccagacg ggcggatcat gaggtcagta gtttgagacc agcctggcca     2280
          acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat acaaaaaatt agccaggtgt ggtggcaggc     2340
          gcctgtaatc ccaggtactc tggaggctga ggcaggagaa ttgcttgaac ccgagaggca     2400
          gaggttgcag tgagccgaga ccgtgccact gcacttcagc ctgggcaaca gagcgagact     2460
          ccgtctcaaa aaaaagaaaa ggaaaaaaga gtccctctta attatcagca tgtgtatagg     2520
          cctacagata cttcaggaat acctttacca ttatcatcaa cttgtatcta catagcatgt     2580
          gaagattcaa caatttagtt ttttgggcgt cctcaagagt acgcacctat aaccatatgg     2640
          cccaattgtt aatctcctat acagtccatt ctgggaatgt ttgggcttac tgtgccattt     2700
          ttccgttcac tgccttcccc tctgcaatat acctttaacc cttgctaggt cctgggtttg     2760
          gagagccaga gaaccaactt tggccctaaa gaagctgtgt aggtagcaat atctgcctac     2820
          gaagggcctt gcaaccattt cctcttggaa ccttggtttc ctctttctga gtagtcactt     2880
          tgagtaccct ttattaagtt agaatgtaaa aacagtttct cactgatata tctgcagtgc     2940
          ctgagagagg gcctggcaca gagtaagtac tcaataaata tttgaatggg gccgggcgtg     3000
          gtgagacctg tctctacaag aatgaacaaa attagctggg cgtgttagca catgcctgta     3060
          gacttgggag gctgaggtgg gaggattgca tgagtctggg aggtcgaggc tgtagtgagc     3120
          catgatcgca ccactgcact ccagcctagg ggacagagca agatcctgtc tcaaaagaaa     3180
          aaaatgtata tatttgaatg gataaagaga tggctttgag tttctgagat atatatggtg     3240
          ctgtttatct aaagtaaaca agttttctgt aaatatttta aggctttgca ggccagctgt     3300
          agtctctgtc acacattctt atttgtgcat gtttttccca accatgtaaa aatgtaaagt     3360
          gcattcttag ctactggggc aggttgaatt tggcccatgg gctagagttt gccaacccct     3420
          aacttaaacc tttgtactaa ctttatgacc actactggat ttttgttgtt gtttgtttta     3480
          gttctggtgc ctgctttgtt tttttttttt tttttaatcc tcttgctgat gtttcttggt     3540
          gcagttactg tgccatttgt attggtgctt ttaatgtaat gcaaactggt aataatatct     3600
          aaacttgctg gggttgtaca taaaattatt gaaaagattg aaaagatgct gagcattgac     3660
          tctgtggcat tcattatgcc cttttgtgat tgctggattt tagccatctt taggacattt     3720
          gagctttagg agaagccaaa ttctgtataa atgacttgaa gtgctaatag cacaggtttt     3780
          gaaacctctg cctgggtttg agtctcagct ctgcctttta ctacctgtgt gatcctgagc     3840
          aagttactta gtatccctgt cctctagttt cctcctctgt agtgtgggga taataacata     3900
          gacataacct gagagttaga gtgtagagaa ggctccctgg cagatagtgc tgtagaagta     3960
          ctggccattg ccattactca ggtgcttgtg tttgctgaac ctcatagtaa gggctcggag     4020
          agcactaaga ggaggtgaga aatgctgcta gattgacagc ttgtccccag atagcccatt     4080
          cccgagagca ccttaggttt atacctgatt tgtgttgtag ttagtagtgt ctctggtaat     4140
          ttgaactagt ttcaggttgg tcttgaaaac ctggggaggt tgggggtaaa tgatttggta     4200
          gcagttctct tttgtgattt tatacattat ctttgtagaa ctgcagtttg ctaattctct     4260
          gagcccaaca caatgaagtc tgggcctaaa atcatagaat ttcttttatt tttttttttg     4320
          tttttaattt atttattccc tccctccctc ctttcttcct ttcttccttt tctttctttc     4380
          tttccttcct tccttccttc tttcttttct ttctttcttt tctttctttg gagtctcact     4440
          ctgtcaccag gctggagtgc agtggcacga actttcttca gagtctcact ttgtcaccag     4500
          gctggagtgc agtggcgcga actcagctca ctgcaacctc cgtctcctga gttcaagaga     4560
          ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gactataggc atgtgccacc atgcccagct     4620
          aattttctta tttttagtag agacgaggtt tcaccatgtt ggccaggatg gtcttgatct     4680
          cttgacctcg tgatccacct gcctcagcct cccaaagtgc ggggattaca ggcgtgagct     4740
          accacgccca gcctattttt tattttttga ggcagagtct cactctgtca cccaggctgg     4800
          agtgcagtgg tgcaatctca gctcactgca acctccgcct cctgggttca ggtgattctc     4860
          ctgccttagc ctcctgagca cctgggacta caggcgcctg ccaccacacc tggctaattc     4920
          ttatattttt agtagaggcg gggtttcacc atgttggcca ggctggtctc gaactcctga     4980
          tctcaagtga tcaacctgcc ttggcctccc aaagtgctgg aattacagcc atgagccacc     5040
          atgcccagcc aaatcatgag atttcaatac cgctgaactt tgattatggc aaagtgaact     5100
          tctgctttga ttaaagcttg atgagagagg tggctgggga tagtttgaga taagggcaag     5160
          gcaggaaaat gcataatctt acgtgggctc attgtcattg tacaattctt ttggtccatg     5220
          tggaatttga tccgtcctat gacttaagtt atgtttattt ttgtttttat ttttatttat     5280
          tttgtgtctt tttgagagac atgatgttgc tctgtcacct gggccagaat acagtggcac     5340
          aatcttagct ccgtgtagcc ttgaactcct gggctcaagt gatcctccca cctcagcccc     5400
          tcaaacagtt gagattatag tatgaaccac tgtgcctagc cttaagtgat ttttaaattt     5460
          gtactgaaca gtttgtcctt tccttccatt aaatcatatt agaagtacag aacttgatat     5520
          ttcctgtagc aatacagttt ttctttgatg aagtttgatt tcaagtactt atttttcata     5580
          atttaaagct attttttata gagagaattt taatcaaata tttggatgtc actattgcta     5640
          tatatggtat taagtatggt gaccatagtt tgtaaactcc aaactgacag caagacagga     5700
          aatttgtgtt agcaaaggct tttttcttac tgtttgaatt ttttaaaaat tagatacaat     5760
          acagagagga gcacacaaat cattaagagt acagctcagc gaattttcac acagtgaaca     5820
          tgtgtaaaca gcaagtaaca aaagatttac ctgcatccta taacctccca ttattccctt     5880
          ttctaggtac tgtctctcca ctgcattccc accaaatata accactatgc tgaattctga     5940
          catcataaat gagttttgcc tgattttgag cttttgtgac tggaagtgta cagtgtatat     6000
          accctttcga ttctgtcctc tttagtttac cattgtttga gaaatttatc catactgttc     6060
          cagaattaac tactgttaat tattgttaat taactactgt tgtagttaat tcatcctcat     6120
          tgttatctag tattcttttg tgagtaaaca caatttccat tctactgtga tcccagctat     6180
          ccatttgggt cgtttccagt ttggggtcca ttacaaatag taatgctatc tgtaatgcta     6240
          ttttgtatta ctacaaatag taatgctatt tgtggcacaa aaatactgct tttgtgaaca     6300
          ttcttataca tgtcttttga tgaatgtatg tttgcattgc tgttgtttac attatgtacc     6360
          tagtaatgga attgctagat cataggagat gtatatatta agctttagtg gatgcattac     6420
          ataattatta gttattattg gttataccaa tttatcctct catcagtagt atacaacagt     6480
          ttctgtatct ctaatctcca acattttagc cattttagag tttgtgtact aacacattgt     6540
          ggttttaatt tacatttccc tgatgactaa taaagttgag tacctctttt gtgttcttta     6600
          tagccatttg actgtcttgt gaagtgcttg tttgtcttgc ctatttttct tttctttctt     6660
          tctttttctt ccttccttcc tttctttctt tcttctttct ttccttcctt cttttctttc     6720
          tttctgtctt tctttcttgt ctttcttgtc tttctgtctt tcttggtctt gccctgtcac     6780
          ccatgctgga gtgcagtggt gcagtctcag cttactgtag cctcgacctt tttggggctc     6840
          aagttatcct cctttctcag cctcccaaga agctggacta caagcacgca ccaccatgct     6900
          cagttaattt tttatttttt gtagaaatgg ggtttcacca tgttgtccag gctggtctca     6960
          aacttctggg ctcaagtaat cctcctgcct tggcctccca aaatgctggg attacaggca     7020
          tgagccaccg cagccagcct tggctatttt tcaaaaggat ataagtagaa catctgtata     7080
          tcccttcaat ttgcatatta ttcagtaaga gttgcactct ggtagtagaa atatataagg     7140
          aggagaaaga agtggaaaca aaaagtctat tctcatgaga agacttgggg gatagtgttc     7200
          tctctagctc caagctactt attccttacg aaaagttgaa gataaactta tctcagactg     7260
          aggctgtctc aatgttgtct tcctattcca ttatacacat ataacccata tttttttcac     7320
          cagctgaatt ttgctcctag aaaattgatt catcaggaaa aatatccgtc ttgcaaggtg     7380
          gttctcttta gagtctgctg tgtgacatag ctcaggacaa attgtgtgat gtcagatagg     7440
          ttgggttaag gaatagacct tattggggaa agagagaact tggagggcca aggttagcag     7500
          gagaaggaaa tgttctctca tctgccgtca attcagggag gggcaaacct ggtgtctgtg     7560
          ttcacaggga gggatccatc catctgtgat tctcccttct tatcaggtag catgggaaag     7620
          ctacactgtt gcggggagga gggtcacacg caggctactt agtaccaggc accctggact     7680
          tggattcagg ttgccagttg tgtgagaaac tgcccagcac ctgaaggccc tgaacccatg     7740
          agaagttgta cctacctccc atgaggagga atcctgtcat cccatgggag ctgagcttgg     7800
          gtgcagtccc tcttgctggc ttgtccagga gtgagctcca gggttgtttg ggacagttct     7860
          gctcattgct ttacactgtg tatacattat ctgtagagtt ccatgaagag aacttcagca     7920
          ctgtaactgc aagttttaac atggaacaga atttttctca cctgtattaa ttcttaagat     7980
          ttgaagttct atcaacaagc atttagattg tgtggagatt tttttatttt tatttttgga     8040
          gacagagtct tgctctgtta cccagactgg agtggcagtg gcatggtctt ggctcactgc     8100
          aggctctact tcctgggttc aagcgattct catgcctcag tgtcctgatt agctaggact     8160
          acaggtacac accaccatgc tggctaattt ttgtattttt agtagagacg aggtttcacc     8220
          gtattggtca ggctggtctc gaactcccag cctcaagcag tccacccacc tcggcctccc     8280
          aaactgctgg gattacaggt gtgagccacc atgcttgact gacatcatca tgttaaaaga     8340
          ataaatgttc tagggagctg ggcacagtgt catgtttctg tagttctagc tgctcgggag     8400
          gctgaggcag gaagatccct tgagccctgg agttcaagtc cagcctgggc aacatagtga     8460
          gatctctttt tttaaataaa taaataactg ttctagggac taaaatttcc tttcaccatt     8520
          agtaatttac tgtagaatct ccaagaatga acttatttta ggtactgaaa atgagggaga     8580
          ctaaatgttt tatacagtag tttttagtaa aatatgagat ttgatgcatt tgatagatga     8640
          tgtttgttta aaataattct taaatttttg atcatgtaat tatagtttca ttaatggtag     8700
          atttgtaaaa taaatgttac caaatgaaaa tgcatgtacc tatgttaatt atccttatct     8760
          aaagctgaaa gttcagttca actatgttaa aacatagtag gggcctggca gggtggctct     8820
          tgcctgtaat cccagaactt agggaggcca aggtgggcag atcacgaggt caggagatcg     8880
          agaccatcct ggctaacatt gtgaaaccgt atcgctacta aaaatacaaa aaattagccg     8940
          ggcatggcgg tgggcacctg tagtcgcagc tacttggtag gctgaggcag gagaatggcg     9000
          tgaactcagg aggcagagct tacagtgagc cgagatcatg ccactgcact ccaggctggg     9060
          tgacagagca agactccatc tcaaaaaaaa aaaaaaagtt ggccaggtgt ggcggctcac     9120
          acctgtaatc ccagcacttt tggaggccga ggcaggcgga tcacaagatc aggagtttga     9180
          gaccagcctg gctaacagag tgaaaccctg tatatactaa aaatacaaaa attagccagg     9240
          catggtggtg catgcctgta gtcccagcta cttgagaggc tgaggcagga gaatcacttg     9300
          aacccgggag gcggaggttg tggtaagctg agattgctcc actgcactcc agcctggaca     9360
          acagagcaag actctgtctc aaaaaaaaaa aaaattaatg attaaattat ttaggggagc     9420
          cgggcgcagt ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggccaaggc gggcggatca     9480
          cgaggtcagg agatcaagac catcctggct aacacaggat gaaaccccgt ctctactaaa     9540
          aatacaaaaa tttagccggg cgtggtggcg ggtgcctgta gtaccagcta ctcgggaggc     9600
          tgaggcagga gaatggcatg aacccgggtg gcggagcttg cagtgagcca agatagcgcc     9660
          actgcactcc ggcctgggtg aaagagtgag actccgtctc aaaaaaaaaa aaaaattatt     9720
          taggggaaga tactatacaa ttctgtttaa caagtcacat tttaattttt tcttttggaa     9780
          atattagcaa gaaggctcac tttgtgctca acattgcctg aataacttat tgcaaggaga     9840
          atattttagc cctgtggaat tatcctcaat tgcacatcag ctggatgagg aggagaggat     9900
          gagaatggca gaaggaggag ttactagtga agattatcgc acgtttttac aggtactgat     9960
          tttaaactca ctaagtcaca tttctttttt tttttttttt ttgagacgga gtctcgccct    10020
          gttgcccatg ctggagtgca atggcgcgat ctcggctcac tgcaacctct gcctcccggg    10080
          ttcaagcgat tctcctgcct cagcctccca agtagctggg attacaggca cacggcacta    10140
          tgcccggcta attttttgta tctttgttag agatggggtt tcaccatgtt ggtcaggttg    10200
          gtctcaaact cctgacctta tgatccacct gtcttggcct cccaaagtgc tgggattata    10260
          ggtgtgagcc accacacccg gcttacattt cttttaaaaa tgtggatacc atttagaaaa    10320
          ggatgggcca ttcttcctat agggatctga ctggtgaatt ataactgtgc tgttaacttt    10380
          ggaaatggga atgcacaaga tattgtttta aatatgcacg ctaatgacag tttgtatcct    10440
          tctttcccca cccccaccct tgcttcaact acctgtcaaa attaacagca gccttctgga    10500
          aatatggatg acagtggttt tttctctatt caggtaagta gtcacaagca tgtactatgt    10560
          gttgcttaca tcccaggcac cgtttcacag cctttcaata gtcactgtaa caaggcgacc    10620
          ttcggaagtt cttctgtcta cagagtatag attatactct agagtactag attttttttt    10680
          tcttgagaca gagtctcgtt ctgtcaccta ggctggagtg cagtggcgtg atcttggctc    10740
          actgtagcct ctgcctcccg ggttcaagcg atcctcctgc ctcagcctcc caagtagctg    10800
          ggattacagg cacccgccac cacaccagtt aatatttgta tttttagtag agatagtggg    10860
          gtttcaccgt gttggccagt ctggtctcca actcctgacc tcagcctccc aaagtgctgg    10920
          gattacaggt gtgagccact gcacctggcc aactagagta ctagattttt atatagataa    10980
          acatgaaagg attgtagaat cttcatatta gagtggggca tttaaaaatt ccttcttgag    11040
          aaagattaat ttgcatctgg atgctaataa taaccttaat tctggccggg cgcggtggct    11100
          cacacctgta atcccagcac tttggggagg ccgaggtggg cggatcacga ggtcaggaga    11160
          ttgagaccat cctggctaac atggtgaaac cccgtctcta ctaaaaatac aaaaattagc    11220
          tggacgtggt gacacgtgcc tgtaatccca gctactcggg aggctgaggc aggagaatcg    11280
          cttgaaccag ggagtcgtag gttgcagtga gccaagatcg cgccactgca ctctagcctg    11340
          gtgacagagc gagactccat ctcaaagaaa aaaagaaatc cttaattcta ataagtcaca    11400
          atgtctcaaa cttaccatct gttgggtaaa tttgagaaaa tgcaatacct tgctaccatc    11460
          cttttaaatc agcctaccag actggatttc cttattatgg tttgtggctt ttgatttttt    11520
          ttttttaatg tatagctctc tttgaattct ttggtggtta tatatatatg tactcgcaag    11580
          attcttttat ctgtgggtct ttcattcttt ttctaacact gtgagttgta tccagagtac    11640
          tttcggaacc tctcctgagc gacctatctc tgcagatatc tttgtttatg tttcccttgt    11700
          actgccctcc tggactcttc ctcatccacc agcatttcca tctagtgctt taccgtgcca    11760
          ctgctaacag gtaatggcta ctgcagggct gaaatcagag gccagagtag gcccagcact    11820
          tggcgtttcc tatttgtgcc ttgctgctct tggtgcctgt tcatgtgtgc ccactacctt    11880
          gcactcaatt tctgtctttg ctggtacctg gctcacttgc ttctttgttg gctaccttgg    11940
          agggcagata gtgaattttc agaaatttcc ctttttttgt cagacagatt gaaataaaca    12000
          ggtttgcatt ttgttttttc tacaagcggc aagcccatga ccctagaagt ctgacatcta    12060
          tggaaccttc agtttaaatg cccagggaga acttattttg gtagatatga tttctgacat    12120
          tgcaggtagc aagttgaata taatttttct aaagtagcac ccacagcagc caaattatca    12180
          gatgtatata gtagactagt tttaagaaaa gcacttatgg gtagaatata catctggatt    12240
          tttgaggcag ttttatttag gaattgtgtg gttttctgga acatctcaga gacctggtat    12300
          gaaaagcact cttctaatat atatgtgttt ttttttatgg atttagtgat atatctatac    12360
          acacacactt tttaaaacct atagccggct gggcgtggtg gctcatgcct gtaatcccag    12420
          tactttggga ggcccaggcg ggtggatcac aaggtcagga gattgagacc agcctggcca    12480
          acaaggtgaa accctgtctc tactaaaaat acaaaaatag ctgggtgtgg tggcgtgtgc    12540
          ttgtaatccc agctactcgg gagcctcagg aggagaatcg cttgaacctg ggaggcggag    12600
          gttgcagcga gccgagatcg tgccactata ctccagcctg ggcgacagag caagactctg    12660
          tcacaaaaaa aaaaaaaaaa acctatagcc ttctagagaa atttatatat gaagtacaca    12720
          actaacatag ctacacttcc taaatttgga atggagtggt ttagcttatg aaaagttgct    12780
          atttttctta acaggttata agcaatgcct tgaaagtttg gggtttagaa ctaatcctgt    12840
          tcaacagtcc agagtatcag aggctcagga tcgatcctat gtaagattct gttttgcatt    12900
          tcatacattt cttttcccaa atttgatttt taaagttgta atttcttaaa gaagagaaat    12960
          acattttgaa tacttttgtt ttgatgttcc ctgtttcatt cactcagact ttcctatttc    13020
          acctttgtga tgtccatgag catctgccct gtagccttcc tggcacccca gtgtctgtgg    13080
          cagcacagag ctgaccccat aagtggtgca tgaggccatc ttgtggcaca gcatcactaa    13140
          gctgctgcag agacgttcat atggttgtgt gatcttttaa aaacatcagt gacacttaac    13200
          tataaatata atcttaaatt atcacaaatt ttatataata tttgccagta gacaacataa    13260
          atatgaattc aatatttcaa gttaatattg tctgttttct tttttagaaa tgaaagatca    13320
          tttatatgca attataagga acactggttt acagttagaa aattaggaaa acaggtaaca    13380
          tttcttaccc ttccttgtct ttttttctta tattgtaccc catttaaaac taaaatgtgg    13440
          gccaggtgtg gtggctcatg ccaacagttt gggaggctga ggtgggggga tcacttgaag    13500
          ccaggagttt gagaccagcc tgggcaacaa agggaggtcc tgtctcttaa aaaaaaaata    13560
          aaaataaaaa taaaaataaa taaaaaaaaa aacaaagagc caggcatggt ggctcacatc    13620
          tgtaattcca gcttacttgg aaggctgagt cagaaggatc acttgagctc aggagtttga    13680
          ggctgcagtg aactatgatt ttgtcactgt accccagcct gggtgacaga gtaagactgt    13740
          tctataaaac ataaaaataa aaaaaatata tttaaaaatt aaaaaaaaaa aaggattgct    13800
          gactttaaaa ttaggaaact gaccagtaat gtgtgtgtgt gtagcatggt ttatccttct    13860
          tgatagatag aaattgtcat tttaaaagat aatatcagtt ttccttataa atttatttgt    13920
          gacaagtata tgcaatttaa ctatatcata agaaaaattc tatattaaag ataatacaaa    13980
          tgtggttact tttaagtggg tttttatgtg atgactatgt tctgtcagtt aattattaca    14040
          tttatagatt tgtatttagc atagtgctgt cacaaagcct gaaatagtgt caagcatgaa    14100
          taaagcattc aattatgttt gctttagtgt aagattattc attatgattc caaaagccat    14160
          gtaatacgta cgtctacaga aaatcacttc tattttttaa ataaaacatg aaatatgtct    14220
          tgagcaagct attttaagaa acaatcattt aacgtccttg ttattagaat tttgaatctt    14280
          tgaaagaggg ttattgaaaa ccagctagga cagtaaaaaa gaataaacta gtgatacatg    14340
          cagcaatatg gatgaatctc aaaataatta tgctgaaaga ataacccaca aacaaaatac    14400
          tacctgctgt atggtatcat ttattaaaag tctagaaaag tgcagattca tctgtagtga    14460
          tggaaagcag attgaccagc ggttgcctgg ggacgagaag gctatggagg agtgagaggg    14520
          gagggttaca gagaggcacg ggaaacatgg caatgaggaa tgtgttcact atcttggttg    14580
          tagtaatggt ttcatgggag tacagtatac aaatgtgaaa acatttcaga ggccagatgc    14640
          agtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt tggaggccaa ggcaggagga ttgcttgagc    14700
          tcaaggagtt caggaccagc ctgggcaatg gcacaagacc ccatctctaa aaaaaaaatg    14760
          aaagaaaaaa aaattggcta ggcgtggtga tgcatggccg tagtcccagg tgctagggag    14820
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          agcttgggtg acagaaggag atcctgtctc aaaaaaaaag tttcaaatta tacactttaa    14940
          atatgtgcag tttattatat gtcacttata ccccaataaa tctgtttttt ttaaaatgta    15000
          aatacaagcc aaaaaaggta taagtcaaga aaatatattg aattaaatct gtaagagata    15060
          attcaaaaac aaaaacccta ttgttatctt ttaagtcacc caaatcaaat ttgggaaaag    15120
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          gtgctggggt tacaggcgtg agccaccatg ccgagcccta agttggttct ttcttaaagt    15480
          tcttcctgag gagccaagag caagttaagg agatgtaacc tagaagctta cagtggaggc    15540
          tagctgggtg cagtggttca cgcctgtaat cccagcactt taggaggctg aggcagggag    15600
          atcactgagg ccaggagctt gagagcagct tggcccaaca cagtgacacc ttgtctctac    15660
          aaaaaaaaaa aaaaaaaaag gcagcttaca gcagtagagg ctgatgcgag tgggaatcac    15720
          ctctaggtaa aaaccagtgt agcgtactgc tgagattatt taacctctgg gttttattta    15780
          tgtgttttta aaaattatga tccagtattt tttacttttt tttgtataaa gtaagcactg    15840
          aatttttaag gttgtattaa tttgcaaata aatgtctatc ttattatttt gagagattta    15900
          aaaaatttta gttcttcaaa attgcatttt cacattttga attacgttat ctttgacaaa    15960
          tacagaagat gtcaaatttt ggtttatttt ctttggttct aatttatatt tttgtttaaa    16020
          actatatttt tcactataga ctctttctgt ctctcgaggt ccctgtataa tgaaaaagaa    16080
          ggctggaaaa agtattaaca ttgtcaaaat ccaggaaaag tagttggtca tgatattgat    16140
          cgttaacttt agaaactttt tgtatcttgt gggttaaatt aggattacta tgtggtagtg    16200
          ataaatgatg ttaattaggg ccgagtgcag tggctaacac ctgtaattcc agcatgtagg    16260
          gaggctgagg tgggaggatg tcttgaatcc aggagtttga gaccagcctg tacaacatag    16320
          tgtaagaccc cttctccaca caaaaaaatt agaaaatttg tcaagcatct tggtgcacac    16380
          ctgtagtccc agctgcttgg gaggatgaag cgagagaatc acttaagccc aggtgttcga    16440
          ggctgcagtg agctatgatt gcaccactgc actccagact agatgaccat ctcttttaaa    16500
          aaaatgtgtt tatatgttat atgtgatagt gctttttaaa aacattttta aattatagag    16560
          acagggtctc actatgttac agcccaggct ggtctcaaat tcctgggctc aagcaatcct    16620
          cccaccttag ctaacctccc aaagtgctcg gattataggc atgagctgca tgcccagcta    16680
          atttagtgat ttttaaaaac tgagctggta attataaatt ctcttcctgg aacttctgac    16740
          tttctcacaa ttggaatctt ttgacaaaaa ttatcagtaa tgggaaaact ttgtgtagtt    16800
          gtcatttttc ctcccatcag tgtgatagat atgattggag ttatgttgga ctgatatttt    16860
          gaaaaaagat ttaattatag ctattaataa agacatttaa actactgact atgcattttt    16920
          attcttttgg gagggtttaa tgtttatagt ttaaagcaaa ctgttgtttt taaaaaagta    16980
          tctaacaggg ccgggcgcgg tggctcacac ctgtaatccc agcactttgg gaggcctagg    17040
          cgggcggatc acaaggtcaa gagatcaaga ccatcctggc taacatggtg aaaccctgtc    17100
          tctactaaaa atacaaaaaa atagctgggt gtggcggcgt gcgcctgtag tcccagctac    17160
          tcgggaggct gaggcaggag gatggcatga acccgggagg cggagcttgc agtgagccga    17220
          gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagcaata ctctgtctaa aaaaaaaaaa    17280
          aaaaaaaaaa aaagagtatt tagcagaggc caggtgcagt ggctcatgtt tgtaatccca    17340
          gaactttggg aggctgaggc gggcggatca tttgaggtca ggagtttgag accagcctgg    17400
          ccaatgtggc aaatgtgctg tctctaacta aaaatacaaa aattagctgg gtgtggtggt    17460
          gcagacctgt agtcccagct acttgggagg ctgaggcagg agaatcactt gaacctggga    17520
          ggcagaggtt gcagtgatcc gagatcatgc cactgcactc cagcctgggt tacagagtga    17580
          gactcttctc aaaaaaaaaa aaaagtattt aatagtgata aatctgcagt attctcttgt    17640
          agtttttaag atcatattat tcagtcaaag aaaagagctc aacttgaaat atttccagag    17700
          tttaaacaat cttactaagc tttgatgggt tgtatctatt cttaacatgt gaaacttcct    17760
          tattacctat aatatacact aacttaaata ttgacaattt ttttccagtg gtttaacttg    17820
          aattctctct tgacgggtcc agaattaata tcagatacat atcttgcact tttcttggct    17880
          caattacaac aggaaggtaa gtaacggctg aacattttgt aatgttacct ttcgaagtag    17940
          ttaaataacc aggcacatta gatgacagtg tgataaaact gtttttctgg cagtggcagt    18000
          gaaacaatct ttagttttga cgtggtgata ggctgtgatt tgggtgacgc tgttcagtta    18060
          gagttctcac tgacacctgg cccttcctct tctgaggatg ctgctttctt tgcagccctt    18120
          ctaagtaatg gctttttctt ttatacatca catatcacac ggctgagagg agggatagat    18180
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          ggctgaggca ggcggatcac gatgtcagga gatcgagacc atcctggcta acacggtgaa    18360
          atcctgtctc tactaaaaat aacaaaaaat tagccggggt gtggtggcgg acgcctgtag    18420
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          agtgagctga gatcgcgcca ctgccctcca gcctgggcga cagagcgaga ctccgtctca    18540
          aaaaaaaaaa gaaaagaaaa aaaaaagaaa tacatgcccc tagattaaac tatcccttgt    18600
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          tttttctcta cttcaactac ttttatcatt cttaattatt tctgtatcgt caatcaatcc    18720
          agtacctgcc tcttagtttc aaaatcactt actcttgctt agctattacc agtaatcata    18780
          accactgtca aatctcaatt gcaagcatat tactctttaa ctaccacctc ctatctttaa    18840
          accatgtttt gtctgttttt ttattccagc cattctttaa accctactgt ggggcccaag    18900
          catttccttt atacgcattc ttcctttctt ctactgctta ttttctgtaa tccgtcatca    18960
          taatcactcc attgcattct tcaacgtgtt tcccctctct ccctccatca tacttgaatg    19020
          acaaaaatct caaccctggt taaaccacat cttggccttg tccattcctg taccagagta    19080
          gctggacgtg gctaaaaaat aacataaaac atgatgattg gttttacttt tttcttaaat    19140
          gatctatcca tccattcacc catccatcta tcaaagtgac taggcctatt tctgaagccc    19200
          aggctggagt gcagcagcat aatcacagct cattgcagct ccaaactcct gggctcaagt    19260
          gattctcttg ccttagcctg ttgagtagct gggactacag gcttgtgcta ccacacctag    19320
          ctaaggtttt actttaaatt tattataatc acaaaattca gatgagcctt tagtgctgtc    19380
          tgatatttct actatgtttt cttagtgatg taccaccctc caaggtgttt ataaaaaatt    19440
          atgtaccact ctccaagaag tttataaaaa ataatgtgcc accctccaag gtgactaatt    19500
          tcacagctta tgtctttaaa cctttaagca ctttcctctc ccttacacac cttccttgtg    19560
          gctttccgtt acattctgct gagaacatag aagcaattaa aattatgttc tttctaccag    19620
          caaatttatc aatttgctta tatcttcacc tgtgctttga gcctatttaa atagatgaat    19680
          ggtcccctac ctctaaccaa aaccagtccc tcacttgtgg gctggatccc agctcttctc    19740
          acctactcaa gatgttcctg ctttcatctc tccactctct tatataatca gttccccccc    19800
          cctttttttg taatattcct ataagcagta aaataagctt tttatttcca ttgattaaaa    19860
          ataaaaatcc tctcttaatt ccatgaaact ccagctgcct ccccattttt attttttcct    19920
          taggattgtc tctagtgtgc cttctccttt tcttgaactc tgcctcctgg gttcaagcga    19980
          ttctcctgcc tcaacctccc gagtagctgg gattacaggc gtgcaccacc atgaccggct    20040
          aatttttttt tttttttttt gagatggagt ttccctcttg ttgctccggc tggagtgcaa    20100
          tggcgtgatc tcggctcacc gtaacttctg cctcctgggt tcaagcgatt ttcttgcctc    20160
          agcctcccga gtagctggat ttacaggcat gtgccaccat gcctggctaa ttttgtattt    20220
          tagtagagat ggaaggggtt tctccatgtt tgttaggctg gtctccaact cctgacctca    20280
          ggtgagccgc ccacctcggc cccctaaagt gctgggatta caggcatgag ccactgcgcc    20340
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          ggagatcaca atttgagtgc tggcatgctt attgctgctg ggtttgttat gtagttattg    20580
          tgaattcaca tttaggaata tagggttttt aattctttga ttttagatac ttgtatcttt    20640
          tttcttttat atttaaaacc ttggttcctg atgatatccc ttcttagaaa ccctgtctac    20700
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          tcctttcatg gatcttaaat atcatctgta aataagatct atgtgtcaat aattaccaaa    20820
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          tactctggtt cctatatatt ataccgacag agcagcccag agtgcttctt aaccagtgta    21060
          aggcctgtta tgtcccaccc tcactctttg tccttcagtg gcttcccagc acacttagaa    21120
          taaaatctga agtcttaggc cgggcttggt ggctcatgcc tgcaatccca gcactttggg    21180
          aggatgaggg ggcagatcac ttgaggtcag gagttgatga gaccagcctg gccaacatgg    21240
          tgaaaccctg tctctaccaa aaaatacaaa aattaactgg gtgtggtgtt gtgcacctgt    21300
          agtcccagct actcgggagg ctgagatagg agaatcactt gaacccggga ggcagaggtt    21360
          acagcgagcc aagatcatac cactgcactc cagcctgggt gacagaacga gactctcaaa    21420
          aaaaaattaa aaaaaaaaaa tatgtgaagt cttgaataaa acccaagatc tttaccatgg    21480
          cccctgaaca gggcagagta tccattcttc agacactctt catagaatac catggtgagc    21540
          tggcatattt attatacaat acagaaacaa ttttactggc agaaaacaca ttaaaccgtc    21600
          taaactctga atacagttgt cctcataaaa aatgttcaac atactatttt gaggttttcc    21660
          attaatagtt cttataatct ttgtcccatt atgtgttaat ccaacaaagg atatccaata    21720
          acaaacacca aagtttaaga aaaatgtgct aggcgcggtg gctcacacct gtaatcccag    21780
          cactttggga ggccgaggtg ggcagatcac ctgaggtcag gagttcgaga ccagcccagc    21840
          caacatggtg aaaccctgcc tctcctaaaa atacaaacat taactgggtg tggtggtggg    21900
          tgcctgtaat cccagctact caggaggctg aggcaggaga atcgcttgaa cctcctggga    21960
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          gactccatct caaattaaaa aaaaaaaaaa attaatgata gagaaactta aatcagttag    22080
          attgttttag gtatagccca tccttggttt ttgtgtgtag catctagctt ggggaaaccc    22140
          tggatttctg gaatcatatt tagacacagt cacactagac taatgtaatt cttttgggat    22200
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          ttagttttag ccatgttact agttattgca cacattatct gtgtcctcac agcagccctg    22380
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          agggtaatgt attaaggagt atcgactcgt atgatcacaa ggtgaagtcc cacaataggc    22500
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          tgtaagttca agagtccaaa agatgaagaa cttggagtct gatgtttgag ggcaggaagc    22680
          atccagcatg ggagaaagat gaaggctcag caagtctagt acttccacac tcttatttct    22740
          gcctgcttta ttctagctga gctggcagct gattagatgg tgaccaccca gtttgagggt    22800
          gggtctacct ctcccagttc actggcttaa atgttaatct cctttggcaa caccctcgca    22860
          gacacaccca gaaacaataa tttgtagcct tcaatccaat caagttgata atattaacca    22920
          tcacaggaag gtactagtat catatgttta acagtagaaa ccaagacaaa tgcagctagg    22980
          aagtgggaga actgggatca gatgcaggca gtctgattct aaatcagttg ctgttaccca    23040
          ctctgacaac agtaagtgag tagcctgctc agtcaagtac tatattagta gggcccttta    23100
          cagacatatt tatttctcac agtcactcaa tgagacggct cttccagtct tacaatggag    23160
          aaagtgaggc tcagagactt taagtaactt accttagacg actttactag taagtataag    23220
          aatcattatt tggactaaag tctttctgaa tcctcagctt gtattttttt ccagtgttct    23280
          gtgctgcctt tttatctact agtgttttac atcaattttg aatctcttta ctaactggtt    23340
          aggttgattt ttgccttttt tttttaggtt attctatatt tgtcgttaag ggtgatctgc    23400
          cagattgcga agctgaccaa ctcctgcaga tgattagggt ccaacagatg catcgaccaa    23460
          aacttattgg agaagaatta gcacaactaa aagagcaaag gtaaaaatga ggcctgcagt    23520
          atggaatata tggtagtatt tcattatgag aattaaattt tcatgcttag attgaatatg    23580
          tggtccttgt gttgttggcg actctatttt ggaccttata ttttagtgaa gtttattagt    23640
          ttaaacttga atcaactctt tgaaatactt aaatatatta acttagttag ctggtatggt    23700
          atattcctag cacttcggga ggctgaggca ggctgattgc ttcaacccag gagttcgaga    23760
          ccagcctggg caacatggca aaacctcatc tctacaaata gtacaaaaat tagccagatg    23820
          tggtggtgta tgcctatagt cccagctact tgggaggcag aggaagaagg atcacctgaa    23880
          actggggagg tagagactac agtgagccat aatcacacta ccgcactcca gcctggtcga    23940
          gagagtcaga ccctgtctca aaaaaaaaaa aaaaaagaaa cggaaaaaaa aaacttagtt    24000
          ggattcaaat tgcaacacaa tcattatatt actagagctt atttgccaga aaacatttta    24060
          agttttgact tacttaaagc ctttacatta caaatgcctt tatgttatgt ctaaaataga    24120
          agattggttg cagttattac cagtgctttt gttctttaga gtccataaaa cagacctgga    24180
          acgagtgtta gaagcaaatg atggctcagg aatgttagac gaagatgagg aggatttgca    24240
          gagggctctg gcactaagtc gccaagaaat tgacatggaa gatgaggaag cagatctccg    24300
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          tgaagaattg attccaatta ttcttagatt tcatggaagt taatgtactc ttagaggtgt    24420
          tttgacaatt actgcagaag caatagctat atagtgggct ttccctttag atttcttata    24480
          atggaaatca ctttttacaa cctatatttt attaggagta gttatatttt tactcctggt    24540
          tattttattt ggtttcaaca ctgtactaac acaatagtaa attgtggttt taatctttgt    24600
          gggtatcagt tgacccttat ccaaatcagc tgttacataa atatgtgcca ttagacacta    24660
          tggaagggcc tggacaggga atataaactg attttacaaa aacccaacat ttattggcta    24720
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          atagagaaaa gcgaaaacat atcccctaga caatctaggc aaagaaaaat gttaagacat    24840
          agctcaaagt agcttaatta aaagtttgaa gtgggttttt tgttttattt ttttctaact    24900
          catatgtatt tgcttctact ttctaatgaa attatttatc agttgatttc cttagatatc    24960
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          aaatttttta aactgagtga aggaaacctt ataaaatttc atttattaaa agaaaaatga    26220
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          gtaagcctgt tagcatcagg ggaatggatg caaaccataa atctggatca actcctaaaa    26460
          ccttaccttg tgcccagcct tgtaagtgct tgctaaatag gaattccacc atatgaaaat    26520
          acattctttt caagtaacta tcattcagac ttttgtcccc cacttttttt ttttaaagaa    26580
          aaataaaagg ctgggcacgg tggcttacgt ctgtaatccc accattttag gaggccaagg    26640
          caggtggatc acctgaggtc aggaattcaa gaccagcctg accaacatgg tgaaacctca    26700
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          agataacgcc attgcactcc agcctggggg acaagagcga gacttcgtct caaaaaaaaa    26880
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          gatgcacata gtttcacatt tcaatgtctc tgaaattgag aagcatctta cagtcataat    27060
          tgacagtata ttagcagcac ctataaatat tggctcattt tacatttgat ggtataatga    27120
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          gaaaattctg atcagctgac atcctcttaa tgtgagatat ttctagtctt tattcagtat    27240
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          taagtttcaa aattaacttt tttattataa taaactccaa atttatacaa aagtagaaaa    27360
          actagcatac tcctgtttat gacccagatt caacaaatac tagcacacgg ccaatcttgc    27420
          tttttttttt tttttttttt gagatggagt cttgctctgt tgcccaggct ggagtgcaat    27480
          ggcacaattt ctgctcactg caacctctgc ctcctgagtt caagcgattc tcccacttca    27540
          gcctcccaag tagctgggat tacaggtaca caccaccatg cctggctaat tcttgtattt    27600
          ttagtagaca cgggatttca ccatgtcgtc caggctggcc ttaaactcct gacctcaagt    27660
          gatccacctg cctcggcctc ccagagtgct gggattacag gcatgagcca ctgagcccgg    27720
          cccaatctcg ttttataata ctcccatctc ccattctttc cactgtccca cctgcaagtt    27780
          tggattattt tgtaacaaat ctcaatcatc atattattct ataaccattt taatatgtgt    27840
          ctctaaaata tattagcttt atttttaaca tagttaaatg ctattgtcat aaaataataa    27900
          tcataataat taattgtaat tctatatcat caattatcta gttaatgtaa aaaataaatc    27960
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          aaaatacaaa aaaattagtt gggcatggtg gtgcacacct gtaatcacag ctactttgga    28860
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          tccatgcctg gctaattttt gtgtcttttg tagacatggg gtttcaccat gttgcccagg    29880
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          taaagacata catcatagag aaactataat acaaaattta caggtatatc taagaaaaga    30060
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          gaatatcgat atacctcctt cctacttggt ggaggattga ttgaggagga aagtgtgcag    30660
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          tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac tccctattac agattcataa tttatgagtc    31500
          attaaataat attttcaagc catgacattt tttccagcag tagtctctaa atctgtttta    31560
          ccatcataaa accccaagca aaactctact acatcagctg tgtcactgta aaacctgcct    31620
          taactcacag aagcatgaaa ttaagcaatg tgtgtgaaac tattttataa actgtaaagt    31680
          attccataca tacatgttgg cagttattaa tgtcttctct aggtgtggct ttgaaatgga    31740
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          ttttaaagag gaaaatactt aatatagaaa ttaggggttt acataatctt aagaaaggat    31980
          gaaggtgcag ctcttagcca ggcctccaca gtaccacaaa ccaacttgca ggaagagctg    32040
          taaccactgc cccagttggg acaatgggta atgaggatat taaatttaag aacatactgc    32100
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          gtaaccagaa tcctacttgt aaaataatct aagacatgta gcttttagct ttgtaacctc    33300
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          agtgtcttca cagctggaag gtgtctacat tgtttcaagg tggacaattg atttacttct    33420
          catttttcat aaactaaaag tagaataaag gctattcctc taaaattgct atctcacctg    33480
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          ccataaagag ggaaataaag agaacaccag atgatgataa gtttatgctg agaattaaaa    34740
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          caaaaattag ccaggcgtga tggcaggcac ctgtagtcca gctattcagg aggctgaggc    37140
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          ctccagcctg ggtgacagag caaaactctg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagggctg    37260
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          tgaggtcagg agttcaagac cagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctactaaaaa    37380
          tacaaaaatt tgctgggcat ggtggtgggc acctgtaatc ccaggaggct gaggcaggag    37440
          aatcacttga acccgggagg cggagattgc agtgagccaa gattgtgcca ttgaactcca    37500
          gcctgggtga caagaccaaa actccttctc aaaaaaaaaa aagattatag catctttatt    37560
          catcattgcc caaaattaca aactgcctaa atgtagacct tcatttagtt aatgaatgca    37620
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          gggtgcggtg gctcacacgt gtaatcccag cactttggga ggctgaggcg ggtggatcac    37800
          ctaaggttgg gagttcaaga ccggtctgac caacatggag aaaccctgtc tcaactaaaa    37860
          atacaagatt agtcgggcat ggtggcgcat gcctgtaatc ccagcttctt gggaggctga    37920
          ggcaggagaa ttgcttgatc ccgggaagcg aaggttgcag taagctgaga ttgcaccatt    37980
          gcactccagc ctgggcaaca agagcaaaac tctgtctcaa aaagaaaaaa aaaaccattc    38040
          agctgaatct caaaggcaga gagaagacag actggctagg gaccttggaa ccagaggagc    38100
          agtgtggtgg ggagtggact ggattttctt tttgcctcat ttatcctgga cttggtgctg    38160
          gagaagctat gggttcagac caagagaaaa ccccatgaaa agcctgctct ctctagccaa    38220
          aagaggcaac ctagcaagat aaaaaccttt agataataag cacttgactc cagtcaaaca    38280
          aaacagaata aactggcccc attcacccct gtcagcaaag gccaagtggg agccaagata    38340
          tgtaccccaa cctggaagtc ataaggtaca cttctcccct ttcccagcca aggtggtgtt    38400
          agagaaggct gactggggag ctgggattct cattccctcc aggaggtgat aacactcctt    38460
          tcacatggtg tcagtggtca cagggaggct gaacttccac ccagtaatac ataggcatct    38520
          ctctggctcc tatatgggtg atgttggaga agaggccgag tagagaatcc agactgttgc    38580
          tgacacccag cagtaacaag gacacctcca caatgtccgt ggaggccatg tggagatcag    38640
          taacaaggca ctgctctccc tcccagtcag agagatgtca gtggaggact agggggctag    38700
          aactcccatg tgcgttcagc agtaatcccc atgaccgcca ctccttgaca tcacaggcct    38760
          tgaagaaacc tggactttca ctcccctctg gttgtagcga ggtggcactc ccttttccct    38820
          gttgccagtg ctgtgtcagt ggaggcttgc taaattggaa gatgtaaata agattcacat    38880
          tctcataaca taatacccca aattttcagg atttaattga aaatcactaa gctgggcatg    38940
          gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gtgggccaaa cacttaaggt    39000
          caggaattca agaccagcct ggccagcatg gtgaaaccct gtctctacta aaaatacaaa    39060
          aattagctgg gcgtggtggc acatgcctgt aatcccagct actgggaagg ctaaggcagg    39120
          aaaatcactg gaacctggga gacggaggtt gcagtgatcc aagatcgcac tagtgtactg    39180
          cagcctgggc aacagagcaa gactccatct aaatttgtgt caggattccc agaaggagat    39240
          gagaaagggt ggggctgaaa aaaattgagg aagaagtcat ggctgaaaat ttcccaaatt    39300
          tggcaaaagt cagaaaccta cagattgaaa aagctgaatg aagctcaaat atgataaact    39360
          caaagaagtt cacacagaga cacatcacag tcagatttct gaacactgca gacaaaaaat    39420
          gaagatctcg aaattagcaa gaaatgacct tacctaagca atttgaatga cagcagattt    39480
          cccatcagag atcataaagg ccagaaggaa ggggtacata caacattttt tctagtgctg    39540
          aaagacaaaa actctaggct gggcacggtg gcacacacct gtaatcccag cacttttgga    39600
          ggctgaggca ggcagatcac ctgaagtcag gagttcgaga ccagcctggc caacatgggg    39660
          aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat tagccaggtg tggtggcacg cacctataat    39720
          cctagctact tgggaggctg aggcagggga atcgcttgaa cctgggaggc gacggttgca    39780
          gtgagccaag gtcgcgccac tgcactccag cctgggcagt tgagcgagac tccatctcaa    39840
          aaaaaaaaaa attatccagg cttggtggtg ggcgcctata gtcccagcta cttgggaggc    39900
          tgaggcaaga gaattggttg aacccaggag gtggaggttg cagtgagcca agctcatgcc    39960
          actgtactcc agcctgggtg acagagcgag accttgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    40020
          aaaacaagaa aaaaactcta aacccagagt tacatatcca gtgaaatatc cttcaggagt    40080
          gaagggaaaa ttaacgattt gtcttcagga gacctaccct aaaagaatgg ctaaaggaat    40140
          ttctctaaac agaaaagaaa tgataaaaga agtaattttg gaacatcagg aaggaagaaa    40200
          gaacaataaa aagagtaaaa tatgggtaaa cacaatagac tttcccctcc ttttgaattt    40260
          tctaaattgt atgatggttg aagcaagaat tatagcactg atttggtttt cagtatatat    40320
          attggaaata tttaaggcat tatgttacag atgaaggagg gtcaaaggat ataaagggag    40380
          gtaacctttc tatatttctt ttgtactgat gcaggcactt tggaaaataa tttcactatt    40440
          tgtttaaaaa ctgaacatac cctgaccata tgacatagca tctatactcc tgggcattta    40500
          tcccagagaa acagaaattt atttattttt tttttagtat tacactccgt aagtgctgta    40560
          atactagcac ttagggaggc tgaggcaagc agattgcttg agcccaggag ttcaagacca    40620
          gcctgggcaa tgctgcacag tcaaaaaaga aaaacaaaca tttagaaaac tattttaaaa    40680
          gtctttaatt gctgaatgcc tctttggcta atatttggaa gatcattatt attatttttc    40740
          ttttttaggc agagtcttgc tctgtcactg aggctggagt gcagtggcgc catctcggct    40800
          tactgcaacc tctgcctccc gggttcacgc cattctcctg cctcagcctc ccgagtagct    40860
          gggactacag gcgtgtgcca ccatgcccgg ctaatttttt gtgtttttag tagagatggg    40920
          gtttcactat gttagtcagg atggtctcca tctcctaacc tcgtgatccg cccacctcgg    40980
          cttcccaaaa tgctgggatt acaggcgtga gccactgtgc ccagcctgga agatcattat    41040
          ttagtcctac aactgacaca ttgttccact gacgcaattg cccaggctgg tcttgaactc    41100
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          cactgtgccc agccaaaaat agaaatttat attctcacaa aaacatgtac atgaatgttt    41220
          atagcagctt tacttgtcat aatcaaaaac tggaaacaac caaaatgtcc tacagtgaaa    41280
          caaactgtag tacatccata gcatgtaata ctctactgtc aggattaaaa agaaacccac    41340
          tgttggcaca ggcagcaccg tggctggatc tcaggggcat tatgctgagt gcaaaaaagc    41400
          ctcaaagggt cttacactgt atgattccac ttgttcaact aaaaatgaca gctgtataga    41460
          gatagagaac atattagtgg tttccactag ttagagaaag tgggtaaaag ataggtgggt    41520
          gggaatataa atcgatagca gggagatctt tgtggtatta taacacttct atgtcttgat    41580
          tgtagtggtg gtggttacat gaatacacgt gtgataaaat gccatgtaga actacatata    41640
          acgttgtgcc aatgtcaata tctaggtttt agtttgatct ttagttacat aagatgtaac    41700
          tattgggtga aattgggcaa aagagtacac gaaacctctc ttaaatatct ttacaacttc    41760
          ctttgaattg acagtttttc aaaatagaaa gttgggtttt tgtaaataca tgaattgttg    41820
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          acatacctac tgatgccttt tatatgacgt gcaggaaaag ataaaactgt aggacagaga    41940
          atatactggt ggctatctgg gattaggaaa tggggatcga ccacaaaggg gcagcatggg    42000
          ggaattttct ggggcaatgg aatggttgtg tatcttgatg gtgtatttgt caaaatatat    42060
          agaactataa aagtaaattt tgctttatat gtattaaatc aaaaaaagaa actcgtgctc    42120
          aaatagaaat acattttctg agaacttgcc ttttgatgac tttgagaatt ttctggaaat    42180
          tttaaagaaa tgtggttttg tttcccaaca ggtgatgcta tgagtgaaga agacatgctt    42240
          caggcagctg tgaccatgtc tttagaaact gtcagaaatg atttgaaaac agaaggaaaa    42300
          aaataatacc tttaaaaaat aatttagata ttcatacttt ccaacattat cctgtgtgat    42360
          tacagcatag ggtccacttt ggtaatgtgt caaagagatg aggaaataag acttttagcg    42420
          gtttgcaaac aaaatgatgg gaaagtggaa caatgcgtcg gttgtaggac taaataatga    42480
          tcttccaaat attagccaaa gaggcattca gcaattaaag acatttaaaa tagttttcta    42540
          aatgtttctt tttctttttt gagtgtgcaa tatgtaacat gtctaaagtt agggcatttt    42600
          tcttggatct ttttgcagac tagctaatta gctctcgcct caggcttttt ccatatagtt    42660
          tgttttcttt ttctgtcttg taggtaagtt ggctcacatc atgtaatagt ggctttcatt    42720
          tcttattaac caaattaacc tttcaggaaa gtatctctac tttcctgatg ttgataatag    42780
          taatggttct agaaggatga acagttctcc cttcaactgt ataccgtgtg ctccagtgtt    42840
          ttcttgtgtt gttttctctg atcacaactt ttctgctacc tggttttcat tattttccca    42900
          caattctttt gaaagatggt aatcttttct gaggtttagc gttttaagcc ctacgatggg    42960
          atcattattt catgactggt gcgttcctaa actctgaaat cagccttgca caagtacttg    43020
          agaataaatg agcatttttt aaaatgtgtg agcatgtgct ttcccagatg ctttatgaat    43080
          gtcttttcac ttatatcaaa accttacagc tttgttgcaa ccccttcttc ctgcgcctta    43140
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          cttcaatttt aatagcagtt ttattttatt ttttctccta tgactggagc tttgtgttct    43320
          ctttacagtt gagtcatgga atgtaggtgt ctgcttcaca tcttttagta ggtatagctt    43380
          gtcaaagatg gtgatctgga acatgaaaat aatttactaa tgaaaatatg tttaaattta    43440
          tactgtgatt tgacacttgc atcatgttta gatagcttaa gaacaatgga agtcacagta    43500
          cttagtggat ctataaataa gaaagtccat agttttgata aatattctct ttaattgaga    43560
          tgtacagaga gtttcttgct gggtcaatag gatagtatca ttttggtgaa aaccatgtct    43620
          ctgaaattga tgttttagtt tcagtgttcc ctatccctca ttctccatct ccttttgaag    43680
          ctcttttgaa tgttgaattg ttcataagct aaaatccaag aaatttcagc tgacaacttc    43740
          gaaaattata atatggtata ttgccctcct ggtgtgtggc tgcacacatt ttatcaggga    43800
          aagttttttg atctaggatt tattgctaac taactgaaaa gagaagaaaa aatatctttt    43860
          atttatgatt ataaaatagc tttttcttcg atataacaga ttttttaagt cattattttg    43920
          tgccaatcag ttttctgaag tttcccttac acaaaaggat agctttattt taaaatctaa    43980
          agtttctttt aatagttaaa aatgtttcag aagaattata aaactttaaa actgcaaggg    44040
          atgttggagt ttagtactac tccctcaaga tttaaaaagc taaatatttt aagactgaac    44100
          atttatgtta attattacca gtgtgtttgt catattttcc atggatattt gttcattacc    44160
          tttttccatt gaaaagttac attaaacttt tcatacactt gaattgatga gctacctaat    44220
          ataaaaatga gaaaaccaat atgcatttta aagttttaac tttagagttt ataaagttca    44280
          tatataccct agttaaagca cttaagaaaa tatggcatgt ttgactttta gttcctagag    44340
          agtttttgtt tttgtttttg tttttttttg agacggagtc ttgctatgtc tcccaggctg    44400
          gagggcagtg gcatgatctc ggctcactac aacttccacc tcccgggttc aagcaattct    44460
          cctgcctcag cctccagagt agctgggatt acaggcgccc accaccacac ccggcagatt    44520
          tttgtatttt tggtagagac gcggtttcat catgtttggc caggctggtc tcgaactcct    44580
          gacctcaggt gatccgcctg ccttggcctc ccaaagtgtt gggattacag gcatgagcca    44640
          ctgcgcctgg ccagctagag agtttttaaa gcagagctga gcacacactg gatgcgtttg    44700
          aatgtgtttg tgtagtttgt tgtgaaattg ttacatttag caggcagatc cagaagcact    44760
          agtgaactgt catcttggtg gggttggctt aaatttaatt gactgtttag attccatttc    44820
          ttaattgatt ggccagtatg aaaagatgcc agtgcaagta accatagtat caaaaaagtt    44880
          aaaaattatt caaagctata gtttatacat caggtactgc catttactgt aaaccacctg    44940
          caagaaagtc aggaacaact aaattcacaa gaactgtcct gctaagaagt gtattaaaga    45000
          tttccatttt gttttactaa ttgggaacat cttaatgttt aatatttaaa ctattggtat    45060
          catttttcta atgtataatt tgtattactg ggatcaagta tgtacagtgg tgatgctagt    45120
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          ttttacggta atcatgtaaa tatttcagta atataaactg tttgaaaagg ctgctgcagg    45300
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          tgtgattaga gctgggcttg gtggcttgca tctacagttc cagctaccca ggaggcagaa    48180
          gcaggaggat tgcttgagcc taggagttcg aggctgcagt gagctatgat cctgccactg    48240
          aattctagcc tgggcgacaa aacaggaaaa aagtatggat ggaggaccag cagcatctgt    48300
          atcacctgtg agtctttcag aaatgcagag tttcaggcta cactcggacc tactgaatca    48360
          gaacttgcac tttttacaag atccccagga cactaaagta tagagtgaag cttgagaagc    48420
          gctgttgtgt ggattgttct taaccagctg cagtgatgaa tatgaataac gcaggccagc    48480
          acagtccatt gatattctat tccagcttac tgcctgccaa aaggtccatt attactggat    48540
          cctcagtctt ttccaagaga agctaagaat tccaaatttt tatttgaaat atatttttta    48600
          aatgtttgtt caactggccc agtgccagtg gctcatgcct ttaatcctag cactttgaga    48660
          ggccgaggtg gaaggatcac ttgaccccag gagtttgaga ccagcctggg caacataaag    48720
          agaccccatc tctattaaaa aaaaatagag acaatgctgc cttaaaaaag tcaaataaat    48780
          gtttgctcaa ctgattttta atactgaggg ccaaacaaag cacatcaaat ttttaagtgc    48840
          tgcttttcct cattttatcc aactctggac accagaatcc aaatgtagtg attggaatcc    48900
          acctagactg attgaggaat atattgtcct caaattttat gagggttgac tattcatttt    48960
          aactttaatt aggattgggc acaaattttg aaacataata acattacagg accggggccc    49020
          gatccagacc ccaagagagg gttcttggat cttgtgcaag aatgaattca gggcaagtcc    49080
          ataaattgaa agctagttca ttaagaaagt agaggaataa aagaatggct accccatagg    49140
          tagagcagcc ctgagggctg ctggttgcca tgtccacccc cgcgccccct ccccccgctt    49200
          tgttgttgtt gtttaagaca gagcttcgct gtgtcatcag gctggagtgc agtggcatga    49260
          tagctcactg caacctctgc ctcccgcgtt caagcaattc tcctgcctca gcctcctgag    49320
          tagctgggac tacaggcgtg caccaccacg cccagctaat ttttgtattt ttagtagaga    49380
          tgcggtttca ccatgttggc caggaaggtc tcaatctctt gacttcgtga tccacccgcc    49440
          ttggcctccc aaagtgctgg gatgagccac ctcgcctggc tggttatttc ttgatgatat    49500
          gctaaacaag gggtggatta ttcatgcctg ccctttttag accatttagg gtaacttccc    49560
          ggcattgcca tggcatttgt caactgtcat ggtgccaatg ggagtgtagc agtgaggagg    49620
          accagaggtc actttcatca ccattttggc tttttcagcc ggcttcttta ctgcaacctg    49680
          ttttatcagc aaggttttta tgatctgtat cttgtgcaga ccttctatct catcctgtga    49740
          cttagaatgc cttaaccatc tgggaatgca gcctagtagg tcttggcctc attttaccaa    49800
          ccccctattc aagatggagt tgctctggtt caaatgcctc tgatatttcc ctactccctt    49860
          ttataagaaa acccttaatc ctaagggttg cagagggatg aagatccatc ttctgtattc    49920
          ttcaggctga ataggggtga tgatattcct gcctatgaga gtctcttgta ttagggtaga    49980
          gaggagctca gtcagtcagt atggctccct atccttcctc ccttccccag cccctgacaa    50040
          ctaccattct actttgtctc tatgattcta agtatctcct ataagtggaa tcattcagta    50100
          tttgtagggt ttttttgtga ctagtgtatt tcacttagca tgtcaaggtt catccatgtt    50160
          gtagcatacg tccaaatttt cttcttttta aaaactgaat aatattccat tgtatgatat    50220
          atgcacattt tgcttattca tttatccatc aaagaaaacc agtagctttt ttacataccg    50280
          gcagtaacct ggttaaaaaa ataagatgga aaataccaag cccgaaaatg tcaaattctt    50340
          gaataccaga caggtactat aatccaagct gagcagagag gaatggccct tgtctcagcc    50400
          ctgagccaca tgtcactaca tgggccccaa ggagctcttg tgcccagagt cctgctaagg    50460
          ctcgttcttc acccctctaa agtggctcaa actagcgtag gaggccagga gggagcagat    50520
          tctatgccac ctccattgct tccgtgcctt ctccagatcc attttttcca aaagctgtgt    50580
          ttgaattctg cacaggggca tctctgtctc caacactgaa accccttttg ccagacccag    50640
          agaagattta actgcctttt tttttgagac agggcctcgt tctgtcacct aagctggagt    50700
          gcagtggcac gatcttggct cacggcaacc tctgcctcct gggctcaagc aattctcctg    50760
          cctcagccac ccgaatagct gggattatag gcgcaggcca ccacatccag ctaagttttg    50820
          tatttttagt agagacgcag ttttgccatg ttgcccaggc tggtctagaa cttctgagct    50880
          caggtgatcc acccgcctcg gcctcccaaa gttctgggat gacaggcatg agccacctaa    50940
          cctggccaga tttaactgct ttgagccacc gtctcacaca tcttccagga gcttctagtc    51000
          aaatgcagag gattaatagt gtataattcc atttacataa gatctttgga atagtcaaac    51060
          tcatagagac agaaagtaga atggtggttg ccgggggatg gttgagggga aaattaggag    51120
          ttgtttaacg agtatggagt ttcagtttgg gaagatgaaa aaagttctgg agatggacag    51180
          ttgtaatggc tgcacaacaa cgtgaatgta cttaatgccg gtgaaccgta taaccattta    51240
          acaactgaaa atggttacaa aattttgtgt tatatatatc ttatcacaat aaaaaatata    51300
          gaggattgat cactatattt gctcccttcc aaaatctcac ctaggttaaa gtaaagaaaa    51360
          atatataaac ccacaagaac acagggacca ggagaggaga tgcattcatt ggattacgtt    51420
          tggttgtaaa aaaaacaaaa aatcctcccc ggcacggtgg ctcacacctt gtaatcccag    51480
          cactttggga ggctgaggca ggcggatcac gaggtcacga gtttgagacc agcctgacca    51540
          acatggtgaa acctcatctc tactaaaaat acaaaaatta gccgggtgtg gtggcgtacg    51600
          cctgtaatcc cagctactga agtggctgag acaggagaat tgcttgaacc cgggaggcgg    51660
          aggttgcagt gagccgagat cacgccactg cactccagat taggtgacag aacaagactc    51720
          catctcaaac aaaaacaaaa acaaaaacaa actaatataa cagtgacttt acatgctatg    51780
          ggtttttttt ctcctctcat cttcaagaaa tgtggagact gccagtccgg ggatgataca    51840
          gcatcacagt gtcaggaatc tgctctttct gtataattgt tacaggaaag gggtccggat    51900
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          gtttactaag aaagtaaagg aataaaaaaa tcgctactcc atagacagag cagccctgag    52020
          ggctgctggt tgcccatttt tatggttatt tcttgatgat atgctaaaca aggggtggat    52080
          tattcatgcc tccccttttt agaccatata gggtaacttc ctgatgttgc catggcattt    52140
          gcaaactgtc atggtgctgg tgggggcgta gcaccaagga ggaccagagg tcactcttgt    52200
          ggcctttgtg gttttggtgg gttttggcca gctcctttac tgcaacctgt tttatcggca    52260
          aggactttat gacctgtatt ttgtgttgac cttgtatctc atcctgtgac ttagaatgcc    52320
          ttaaccatct gggaatgcag cccagtaggt ttcagcctca ttttacccag ctcctattca    52380
          agatggagtt gcagccgggc acggtggttc atgcctgtaa tcccagcact ttgggaggtt    52440
          gaggcgggtg gatcacaagg tcaagagttc aagaccagcc tggccaacat ggcaaaaccc    52500
          catctctact aaaaatacaa aaattagcca ggcgtggttg gtgtgcgcct attatgccag    52560
          ctacttggga ggctgatgca ggagaatcac ttggatctgg gaggcggagg ttgcagtaag    52620
          cagatatcgc gccatgcact ccagcctgga tgacagagca agactccgtc tcgggggaaa    52680
          aaaaaaccaa aatggagttg ctctggttta caggcctctg acataatggc tttatgtaca    52740
          tggcttccat ggctagggtc agctcataga tctaatatgg ctgtgttggt gctcatgttg    52800
          cagcccagca atcagaaaga gaaaggaggc tgggtttggt ggcttacacc tgtcatccca    52860
          gcatttcggg aggccaaggc gggaggatca catgagccca tgagtttgag accagcttga    52920
          gcaacacagg gagacctcat ctctacaaga aataaaaata aattagttgg gtatggtggc    52980
          atgcacctgt ggtcccagct attcgggagg ctgaggtgag aggatacctt gagcctggag    53040
          gtttgaggct gcagtgagct atgatcgcac cactgcactc cagcctgggc aacagagtga    53100
          gaccccatct caaataatta aaaaaaaaaa aaagaaagaa agaaaaaaaa aaggagagca    53160
          gaaaaaggct atgtaccttt tctttcgggt taccttctca aagttgtgca tactacttcc    53220
          gtttacatta cattggccag aacttaacat gacaactact agctacaagg tggtttttat    53280
          tctgggttgc catgcatctt agcttaagta ccctacaggt cctgagataa tgattcctat    53340
          gaaaatgatt atttacttat ttaattaatt tattttgaga tggagtctca ctctgtcacc    53400
          caggctggag atcagtggcg tgatctcggc tcactgcaac ctctgcctcc caggttcaag    53460
          caattctcct gcttcagtct cccgagtagc tgggactaca ggcatgcgcc accatgccca    53520
          gcttttttgt atttttagta gagacggggt ttcactatgt tggccaggct gatctcgaac    53580
          tcctgacctc aggtgatctg cctgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga    53640
          gccactgtgc ctggctgaaa atgatttttt aaaagtgttc caggaggaaa tggaaagggc    53700
          ataggggagt aagaaagtgg aaataggaaa agaaggaagc caagcaagag gagcctatca    53760
          agcaaagcct cagtcctgca gacagtctgg aggcaggata ttcacatctt agagttgtcc    53820
          aaaacagaac aggcaagctg cataattttc aactctggct gaataaggtt gcatttcagc    53880
          tctctgggca cctggaaagt atgggctcca gtaacctgga ggcagtctgc tgactgctgg    53940
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          ctgtcatgca tccaggtaaa aagtggaggc tcaattacta tatatgaagg ggagaacaga    54060
          ctttggggaa caattagcag tcatttccag gtgagacaac aacagaagag aaatgctaat    54120
          tttttttttt ttctttgaga tggagtttcg ctcttgttgc ccaggctgga gtgcaatggc    54180
          gctatatcca gctcaccgca acctccgcct cctgggttca agtgattctc ctgcctcagc    54240
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          acggggtttc tccatgttgg tcagggtggt ctcaaactcc caacctcagg tgatccgccc    54360
          gcctcagcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgaacc accgcacccg gcgagagatg    54420
          cgaacatttt ttttgttttt tggaggatga caagttgatg caggaatgag cagaaccagg    54480
          aggctgaata ctgagtgtta aagagttcct agcaatatgc aggaaaggaa agcaacaagt    54540
          atcctgagag gtgggggtta gatgtagact gaaatcagga ggtgtggtta aaactctttg    54600
          aaagaggctg ggtgcggtgg ctcacataat cccagcactt tgggaggcca aggcgggtgc    54660
          atcatgaggt caggagttcg agaccagcct gaccaacatg tgaaaccccg tctctactaa    54720
          aaatacaaaa attagccggg catggtggcg catgcctgta atcccagcta ctaaggaggc    54780
          taaggcagga gaaccgcttg aacctgggag gcgaaggttg cagtgagccg agatcatgcc    54840
          attggactcc agcccaggcg acagagagag atcccatctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    54900
          aaaaaaagaa aggaaaagaa gaaaagaaaa aagaaacagc agattcccta gagaggagac    54960
          attcatcact aaaaaaaaaa aaaaaaatta aaataaatcg cagaagtaaa agcccttttt    55020
          gaaagggctc agggtaccca gcttaatgta tgaaacaaaa gcaaacccac atcaaagcac    55080
          accattatta atttcagagc atcagaaata aagagaagat ctgacaagct tcttggaaga    55140
          aaacaaggca tagagaataa tcagagtaga gtagagcagg aaaacagagt cctgggtaga    55200
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          aaaaatggaa tctgttaact tcaggaagaa caaaaggtag aaaaatcaag gcaatataat    55380
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          ccaaaaaatt agccgggtgt ggtggtgcac gtttgtaata ccagctactc aggaggctga    55860
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          actgttttcc tttgaggaat attgatgatc ccactgcttg agtaatggaa accagcttgc    56040
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          actcccgaca ttagaaaaag ctccaaaaat tagattccgg ccctcaaacc ccacaacagg    58260
          acttaattaa catcaccttc aaggtgtaca ataatagagt agaggcagcc aagtagtaac    58320
          gtatttctga gttgcaattc cttgcctcca ctgtgagaca aaccccagcc acatctccag    58380
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          ccaggattcc tcctaagcca tgtcccatct gtgcaggacc ccactggaaa tcggactgtc    58560
          caacccggca gccactccca gggcccctag aactctggcc aaaggctctc tgactgactc    58620
          cttcccagat cttctcagct tagcagctga agactgatgc tgcctgatcg ccttggaagc    58680
          cccctggacc attacggatg ctgagctttg gataactctt acagtagagg gtaggtccat    58740
          cccctgttta atcgatatgg gagctaccca ctccacatta ccttcttttc aagggcctgt    58800
          ttcctttgcc cctataactg ttgtgggtat tgatggccag gattctaaac cccttaaaac    58860
          tcccccactc tggcaccaac ttggacaaca ttcttttatg tactcttttt tagttatccc    58920
          cacctgccca gttcccttat taggccaaga cattttaacc aaattatctg cttccctgat    58980
          tattcctgga ctacagccac atctcattgc cacccttctt cccaacccaa agcctccttc    59040
          gcctcttcct ctcgtatccc ccaaccttaa cccacaagta tgggacacct ccactccctc    59100
          cctggcaacc gatcaaacac ccattactat cccattaaaa cctaatcacc cttacctggc    59160
          tcaatgccac tattccatcc cacaactggc tttaagagga ctgaagcctg ttatcactcg    59220
          cctgctacag catgggcttc taaaacctat aaactcttct tacaattctc ccattttacc    59280
          tgttcaaaaa ccggacaagt cttacaggtt acctcaggat ctggatctta tcaaccaaat    59340
          tgttttgcct atccaccctg tggtgcccaa cccatacact tgtttgtcct caataccttc    59400
          ctccacaact cactattccg ttcttgatct cacagatgct tttttcacta ttccctacac    59460
          cactcatccc agcctctttt gcttttacct ggactgaccc tgacacccat cagtcccagc    59520
          agcttacctg ggctgtactg ccgcaaggct tcagggacag ccctcattac ttcagccaag    59580
          ctctttctca tgatatactt tctttccatc ccttcgcttc tcaccttatt caatatattg    59640
          atgaccttct actttgtagc ccctcctttg aatcttctca acaagatact tttcaacatt    59700
          tattctccaa gggatatcgg atgtccccct ccaaagctca aatttcttct ccatccgtta    59760
          cctacctcag tataattctt cataaaaaca catgtgctct ccctgctgat catgtctgac    59820
          tgatctctca aaccccaaca ccttctacaa aacaacaact cctttccttc ctgggcatgg    59880
          ttggatacct ttgcctttgg atacctggtt ttgccatcct aacaaaacca ttatataaac    59940
          tcacaaaagc aaacctagct gacctcataa atcctaaatc ctttccccac tcccctttcc    60000
          attccttaaa aaacagccct aaaagctgct cccacactag ctctccctaa ctcatcccaa    60060
          cccttttttc attacacaca gctgaaatgc agggctgtgc agttggaatt cttacacaag    60120
          agccaggacc atgccctgta gcctttctgt ccaaacaact tgaccttact gttttaggct    60180
          agcccccaca ttattcctga taccacacct gacccccatg actgtatctc tctaatccac    60240
          ctggcattca ctccatttcc ccatacttcc ttctttccta ttcctcaccc tgatcacact    60300
          tggtttattg atggcagttc cacctggcct aatcgccatt caccagcaaa ggtgggctat    60360
          gctatagtag tatcttccac atctatcctt gaagctaccg ctctgccccc ctccactacc    60420
          tctcagcaag ctgaactcat tgccttaact cgagccctcg ctcttgcaaa aggactacat    60480
          gtcaatattt atactgactc taaatatgcc ttccatatcc tgcaccacaa tgctgttata    60540
          tgggcagaaa gaggtttcct cagtacgcaa aggtcctcca tcattattgc ctccttaata    60600
          aaaactcttc tcaaggccgc tttacttcca aaggaagctg gagtcattca ctgcaagggc    60660
          catcaaaagg catcagatcc catcgctcag ggcaatgctt atgctgataa ggtagctaaa    60720
          gaagctgcta gctttctaac ttctgtccct cacggccagt ttttcttctt ctcatcagtc    60780
          actcccacct attcaccgac tgaaacttcc acctatcaat ctcttctcac acaaggcaaa    60840
          tggttcttag accaaggaaa atatctcctt ccagcctcac aggcccattc tattctgttg    60900
          tcatttcata acctcttcca tgtaggttac aagccactag cccacctctt agaacctctc    60960
          atttcctttc catcatggaa atctatcctc aaggaaatca cttctcagtg ttccatctgc    61020
          tattctacta cccctcaggg attattcagg ccccctccct accctataca tcaagttcag    61080
          ggatttgccc ccacccagga ctagcaaatt gactctattc acatgccctg agttaggaaa    61140
          ctaaaatacc tcttggtctg ggaagacact ttcactggat gggtagaggc ctttcccaca    61200
          gggtctgaga aggccaccac agtcatttct tcccttctgt cagaaataat ttctcggttt    61260
          ggccttccca cctttataca gtccgataac ggactggcct ttactagtca aatcacccaa    61320
          gcagtttctc aggctcttgg tattcagtgg aaccttcata ccccttaccg tcctcaatct    61380
          tcaggaaagg tagaacggac taatggtctt ttaaagacat ctcaccaagc tcagcctcca    61440
          acttaaaaag gactggacag tatttttacc tcttgccctt cacagaatta gagcccgtcc    61500
          tcgagaagct acagggtaca gtccatttga acttttatat ggacgcactt tcttgctcag    61560
          ccccaacctc gttccagaca ccagccctct aggcgactat cttccagtcc tctggcaggc    61620
          tagacaggaa atccaccagg ctgctaatct tctcttgtct actccagatt cccaactata    61680
          tgaagacacc ctagctggac gatcagttct tattaagaac ctgacccctc aaactctaca    61740
          acctcgatgg actggaccct acttagtcat ctatagtacc ccaactgccg tccgcctgca    61800
          ggatcctccc cactgggttc accgttccag aataaagctg tgcccatcgg acaaccagcc    61860
          taatctctct tcttcctcct ggaagtcaca agtactcccc actacttccc ttaaagtcac    61920
          tctcatttct gaagaacagt aataaccctt atgagcctaa tacatccctt cattctatta    61980
          gctctattca tccttaccct actttttgca acagggcttt acacagtcac cccccctact    62040
          tggactgaac cccaaaaact tgtcatccct actatcttct gtttactcat actcccattc    62100
          actattctca actactcata aatgccctaa                                     62130
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          <![CDATA[<213>  食蟹獼猴]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          agaatgtaat gatggctttt tcttactaaa ttttcagtgg aggaggagga gaaagaaagt       60
          aaatagttat atgaacacag tagaaagtac aaagtggaaa acaaaaagag tatcgaaccc      120
          aggtgagtgg tccaaacctc cccccagaaa cctaagaacc catagaaatg ggtgggaagc      180
          ggagaagatc ctccagacag caggtggcga tgtagcatcc cccagaaggc cctctaacag      240
          aaactaggag gacgcgctac caaggtcacg tgtccccggc gttcactcgc tcttcgcttc      300
          acgtgactcg catcctcgcg ggtgattggc ctgcgtgcgg cacgtgggcg gggggaccag      360
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          gtgggggccg ttggctccag acaaataaac atggagtcca tcttccacga gaaagtgagt      480
          gtccgcgtgc ggtggggagc tgtctgccgc gcggtggcgg gcgtggagcg cggcatcaca      540
          gcctcccgga gggctgggtg gggtccgagt cgcccccatg ccgatctcgc cgggctaggg      600
          gcgacgccgc aaccccccgc ctcttcggct cggggagggg agcatcacct acgctcctac      660
          ttcccccgcg gcccccgccc tgggagccgg gagggagtat gggcggggcc gggggcgtct      720
          cgggacacgg gagcgcggtg gcgcccagtg gatttgcttc ttcctttcta agtcactttc      780
          catagctttt cggaggattc cttcacccct ccccaatctt tccctctccc tagggtctag      840
          ctacagtcac ctctgggaca cctccctcga cccctcctac cctactcctg gcagaattaa      900
          cttttctttc tccagactgc tcaattctat attggagtct tccctacatt tagatctttg      960
          aggtcttgtt catgtttttt cccctgcacc aggtccgcga gcctcccgag ggaggagacc     1020
          ttggctcgcc cactgtaggg cctgacactt aggaagtgaa gtaggaaacc cgttgtgccc     1080
          ctaaacaggg aagtcgtcac gagtttttat tacgggatgt ttgggtttgg tttcttttgg     1140
          tactctcatc tttccggagc aggcagccag ctttgttttt aggtattagg agtggactgg     1200
          aatgattttg ttgtggtctg cctagcctgc tgtcacttta actcttcagt gaccatgcac     1260
          ttgaagatac tgtttgtgac atgtggagaa actcctcgtt tctcacatgc tattatccat     1320
          ccatttgtat gtgagtgaag ccttccccag gacaactttg gcacatgata tcttgtttca     1380
          taatagtatc atgtttggaa agagttgctg gtaaggctat tatttaatag gaggagcaaa     1440
          gggtttttgt tttattaaat gcttataaat gatcgtttat cccagacatt taaaattcac     1500
          acacacagcc gggcgcggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga ggccgaggcg     1560
          ggcggatcac aaggtcagga gatcgagacc atggtgaaac cccgtctcta ctaaaaaaaa     1620
          tacaaaaaat gagccgggcg cggtggcggg cgcctgtagt tccagctact cgggaggctg     1680
          aggcaggaga atggcgtgaa cccgggaggc ggagcttgca gtgagccagg atagcgccac     1740
          tgcactccag cttgggcgac agagcgagac tccgtctcaa aaaaaataaa ataaaataaa     1800
          ataaaataaa attcacacac acacaacaaa taaagcaaag acaaaagaat acatttacca     1860
          gatgtaaatc tgtagtataa atcttttttt taatttttat tttaaagatg gcatctcatt     1920
          ctgtcaccca ggcaggtgtg cagtggagag atcatggctc actgcagcct tgactcccta     1980
          ggcacaagcg atcctccctc ctccgcctcc agagtagctg ggactacagg tgtatatcgc     2040
          cagggccagc taatgttttt ggagagacag gggtctcgct gtgttgccca ggctggtcta     2100
          gaactcctgg actcaggtga ttctcccacc tcagcctctc gaagtgctgt gattacaggc     2160
          gtgagccact gtgcctggaa caaattgtta agtacaatgc ttttcattgt agaaaacatc     2220
          tcggaaactt ttgaaatagg cagatttaca gtgggggagg aaggcctcag tcgtatagtt     2280
          gtcactgatt ttttgacttg attgacatga tttataaatc atagacaata gagatttagt     2340
          tgcttggctg agtaaagtgt gtgaaaaata cacatgtact ttcttaaaaa catttttttt     2400
          ttgagatcga gttttgctct tgtcacccag gctagagtgc aatggcgcga tcctggctca     2460
          ctgcaacctc tgcctccctg ttcaagctat tctcctgcct cagtctccct agtagctgag     2520
          attacaggtg cccaccacca cgcccagcta atttttgtat ttttagtaga gacagggttt     2580
          caccctgttg gccaggctgg tctccaactc ctgacctcag gcgatccact cgcctcggcc     2640
          tcccaaagtg ccgggattac aggcgtgagc cactgcaccc ggccatattt ttgttattaa     2700
          ttttcaaagg ctttggtgtg ggaccagatt tcaacatgga aggccttaaa catgttccac     2760
          actacttcct gagaatcaga caagattttt aacaatattg attgttacct agttgggacg     2820
          catttctact gaaccatggg atcaataaaa gctgggtgct agccttgcga aaatctactt     2880
          acccgaaaga agtccctctt agtccgggtg cggtggctca caccagcgct ttgggaggcc     2940
          caggtgggtg gatcacaagg tcaggagttt gagaccagcc tggccaacat ggtgaaacca     3000
          cgtctctact aaaaatacaa aaaattagcc aggtgtggtg gcaggtgcct gtaatcccag     3060
          gtactcagga ggctgaggca ggagaatagc ttgaacccaa gaggcagagg ttgcagtgag     3120
          ctgagactgc accacttcac tccagcctgg gcaacaaagc gagactctgt ctaaaaaaag     3180
          aaaagaaaag aaaaaaaaaa gagtccctct gaattatcag catgtgtata ggcctacaga     3240
          tacttcagga atgtatttac cattatcatt aacttgtatg tacatagcaa gtgaagattc     3300
          aacaatttag ttttttgggc atactcaaga gtatgcacct ataaccatat ggcccattgt     3360
          taatctccta tacagtccat tctaggaatg tttgggctta ctgtgccatt tttcagttca     3420
          ccgccttccc ctctgcaata tacctttaac ccttgctagg tgctgggttt ggagagccag     3480
          agaaccaact ttggccctag agaagctggg taggtgggaa tatctgccta caaagggcct     3540
          tgcaaccact tcctcttgga accttggttt cctctttctg agttgtcact ttgagtaccc     3600
          tttattaagt tagaatgtaa aaacagtttc gcactgatac atctacagtg cctgagatag     3660
          ggcctggcac agagtaagta ctcaataaat atttgaatgg ggctgagcgt agtgagacct     3720
          gtctctacaa agaatgaaca aaattagccc gggtgtgtta gcacacgcct gtagtcatag     3780
          ctacttggga ggctgaggtg ggaggattgc atgagtctgg gaggtcgagg ctgtagtgag     3840
          ccaaggtcac accactgcac tccagcctgg gggacagagc aagatcctgt cccaaaagaa     3900
          aaaaatgtat atatttgaat ggataaagag aggtctttga gtttctgaga tatatatggt     3960
          gctgtttatc taaagtaaac aacttttctg taaacatttt aaggctttgc aggccagctg     4020
          tagtctctgt cacacattct tatgtgtgca tgtttttccc aaccatctaa aattgtaaag     4080
          tgcattctta gctaccaggg caggttaaat ttggcccatg ggctagagtt tgccaacccc     4140
          taacttaaac ttttgtacta actttatgac cactaactac tggatttttg ttgtttgttt     4200
          tagttctggt gcctgctttc tgtctttttt ttttttaaat cacttctctt tctgatgttt     4260
          cttggtgcag tcactgtgcc atttgtattg gtgattttaa tgtaatgcaa actgggaata     4320
          ataactaaac ttgctgggat tgtacataaa gttattgaaa agatgctgag tattgactct     4380
          gtggcattca ttatgccctt ttgtggttgc tggattttag ctgtctttag gatatttgag     4440
          ctttaggaga agccaaattc tgtataaatg acttgaagtg ctaatggcac agattttgaa     4500
          acctctgcct gggtttgagt ctcagctctg ccttttacta cttgtgtgat cctgagcaag     4560
          ttacttagga tccctgtcct ctggtttcct cctgtgtagt ggtggggata ataacataga     4620
          cataacctca gagttagagt gtagagaagg ctccctggca gatagtgctg tagaagtact     4680
          ggccattgcc attactcaga tgcttgtgtt tgctgatcct catagtaagg cctcggagag     4740
          cactaagagg aggtgagaat gctgctagat tgacagcttg tccccagata gcccattcct     4800
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          gttcccttgt gattttataa attatctttg tagaactgca gtgtgctaat tctctgagcc     4980
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          ttcatttcat gtcttttctt ttcttctttt tttttttttt tttttgaggc ggagtcttgc     5100
          tctgtcacca ggctggagtg cagtggcgtg aagtcagctc actgcaacct ccgtctcctg     5160
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          tacccagctg atttttgtat ttttagtaga gacaaggttt ctccatgttg gccaggattg     5280
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          gcgtgagcta ccatgcccgg cctatttttt atttttttga ggcggagtgt cgctctgtca     5400
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          ggtgattctc ctaccttagc ctcccgagta cctgggacta caggcgcctg ccatcacaca     5520
          tggctaattt ttgtattttt agaagagaca gggtttcacc atgttggcca ggcgggtcta     5580
          gaactcctga tctcaagtga cctacctgcc tcggcctccc gaagtgctgg gattacgggc     5640
          atgagccacc attcccagcc aaatcatgag atttcaatac tgctgaactt tgattatggc     5700
          aaagtgaact actgctttga ttaaagcttg atgagagagg tggctgggga tagtttgaga     5760
          taagggcaag gcaggaaaat gcataatctt aggtgggctc attgtcattg tacaattctt     5820
          ttggtctgtg tggcatttga tctgtcctat gacttaagtt acgtttattt ttatttttat     5880
          ttttatttat tttatttctt tttgagagac atggtgttgc tctgtcaccc aggccagaat     5940
          acagtggcac aatcatagct ccatgtagcc ttgaactcct gggctcaagt gatcctccca     6000
          ctcagcctct caaacagttg agattacggt atgaaccact gtgcctagcc ttaagtcatt     6060
          tttaaatttg tactgaacag tttgtccttt ccttccatta aatcatatta gaagtacaga     6120
          acttgatatt tcctgtagca atacagtgta tctttgatga agtttgattt caaatactta     6180
          tttttcataa tttaaagcta ttttttatag agataatttt aatcaaatat ttggatgtcg     6240
          ctattgctat atgtgatatt aagtatggtg accatagttt gtaaactcca aactgacagc     6300
          aggacaggaa atttgtgtta gcaaaggctt ttttcttact gtttgaattt tttaaaaatt     6360
          aggtaccata cagagaggag cacacaaatc gttaagagta cggctcagtg aattctcaca     6420
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          gaattctgat atcataaatg agttttgcct agttttgagc ttttgtgact ggaatcgtac     6600
          agtgtgtata cccttttgac tctgtcctct ttagtttacc attgtttgag agatttatcc     6660
          atactgttcc aggtcgttgt agttaattca ttcacattgt tatgtagtat tcctttgtga     6720
          gtaaacacaa tttccattct gctgtgatcc cagctatcca tttgggtcgt ttccagttta     6780
          gggaccatta caaatagtaa tgctatctgt aatgctattt tgtgttacta caaatagtaa     6840
          tgctatttgt agcacaaaaa tagtgctttt gtgaacattc tttttttttt tttttttgag     6900
          acggagtctc gctctgtcac ccaggctgga gtgcagtggc cggatttcag ctcactgcaa     6960
          gctccgcctc ccgggttcac cccattctcc tgcctcagcc tccggagtag ctgggactac     7020
          aggcgcccgc cacctcgccc ggctagtttt ttgtattttt tagtagagac ggggtttcac     7080
          cgtgttagcc aggatggtct cgatctcctg acctcgtgat ctgcccatct cggcctccca     7140
          aaatgctggg attacaggct tgagccaccg cgcccggccc tacattctta tacatatctt     7200
          ttgatgaata tatgtttgca tttctgttgt ttacattatg tacctactaa tggaattgct     7260
          agatcatagg agatgtacat gttaagcttt agtagatgca ttacataatt attagttatt     7320
          attggttata ccaatttact ctctcaccag tagtatacaa cagtttctat atctctgatc     7380
          tccaatattt tagccatttt agagtttgtg taataacaca ttgtggtttt aatttacatt     7440
          tccctgatga ctaatgaagt tgagtacctt ttttgtgttc tttatagcta tttgactgtc     7500
          ttgtgaagtg cttgtttgtc ttgccttttc ttttctttct cccctcccct cccctcccct     7560
          ctttttgaga caggttcttg ccctgtcatc caggctggag tgcagtggtg caatatcagc     7620
          ttactatagc ctcaaccttt ttggggctca ggttatcctc ctatctcagc ctcccaagaa     7680
          gctggactac aagcacacac caccatgctc agttaatttt ttaatttttg tagaaatggg     7740
          gtttcaccat gttgcccagg ctggtctcaa acttctggac tcaagtaatc ctcctgcctt     7800
          ggcctcccaa aatgctggga ttacaggcat gagccaccgc agccagcctt ggctgttttt     7860
          caataggtta taagtagaac atctgtatat cccttcaatt tgcatatcat tcagtaagag     7920
          ttgcactctg gtagtagaaa tatagaagaa agagaaagaa gtggaaacaa aaagtctatt     7980
          ttcatgagaa gacttggggg ctagtgttct ctctggctcc aagctactta ttccttacca     8040
          aaagatgagg ataaacttat ctcagactca ggctgtctca atgctgtctt cctattccat     8100
          tatacacata taacccatat ttttttcacc agctgaattt tgttcctaga aaattgattt     8160
          atcaggaaaa aattccgtct tgcaaggtgg ttctctttag agtctactgt gtaacatagc     8220
          tcaggacaaa ttgtgtgatg tcagataagt tgggttaagg aatagacctt attggggaaa     8280
          gagagaactt ggagggccaa ggttagcagg agaaggaaat gttctctcat ctgctatcat     8340
          ttcaggaagg ggcaaacctg gtgtctgtgt tcacagggag ggatccatct atacgtgatt     8400
          ctcccttctt accaggtagc atgggaaagc tactgctgtg gggaggagga ttacacacag     8460
          gttactcggt accaggcacc ctggacttgg attcaggctg ccagttgtgt gagaaactgc     8520
          ccagcacttg aaggttctga acccgtggga ggttgtacct acctcccata aggaggaagc     8580
          ctgtcgtccc gtgggagctg agcttgggtg cagtccctct tgctggcttg tccaggagtg     8640
          agctccaggg ttgtttggga cagttctgct cattgcatta cgctgcgtgt acattatctg     8700
          tagagttcca tgaagagaac ttcagctctg taactgcaag ttttaacatg gaacagaatt     8760
          tttctcacct gtattgattc ttaagatttg aaattctgtc aacaagcatt taaattgtgt     8820
          ggagtgtttt tttttttttt tttttttttt ttttttttga gacagaaggc tggagtggca     8880
          gtggcatagt cttggctcac tgcagtctgt acttcccagg ttcaagcgat gctcatgcct     8940
          tggagtcccg attagctagg tgtacgggtg cacaccatca cactggctaa tttttgtatt     9000
          tttagtagag acggggtttc gccatattgg tcaggctcat ctcgaactcc tggcctcaag     9060
          caatccaccc gccttgacct cccaaactgc tgggattaca ggtgtgagcc accatgcttg     9120
          accggcatta tgttaaaaga ataaatgttc taggcagcta ggcacagtgg catgtttctg     9180
          tagtcctagc tgctcgggag gctgaggtaa gaagatccct tgggccctgg agttcaagtc     9240
          cagcctgggc aacatagtca gatctcattt tttaaataaa taaataactg ttctagagac     9300
          taaaatttcc tttcaccatt agtaatttac tgtggaatct ccaagaatga acttatttta     9360
          ggtagtgaaa atgagggaga ctaaatgttt tatacagtgg tttttagtaa agtatgagat     9420
          ttgatgcatt tgatagatga taatgttttt ttgttttttg ttttttgttt tttttttgag     9480
          acagagtctt gctctgttgc ccaggctgga gtgcagtggt gtgatcttgg ctcactgcag     9540
          gctccgcctc ctgggttcat gctattctcc tgcctcagcc tcccgagtag ctgggactac     9600
          aggtgcccgc caccacgccc ggctaatttt ttgtattttt tagtagagat ggggtttcac     9660
          cgtgttagcc acgatggtct tgatctcctg acctcgtgat ctgcctacct cggcctccca     9720
          gagtgctggg attacaggtg tgggccactg cacccgaccg ataatgtttg tttaaaataa     9780
          ttcttaaatt tttgatcatg taatgtagtt tcattaatag tagatttgta aaataaatgt     9840
          taacaaatga aaatgcatgt acctatgtta attatactta tctaaagctg aaagttcagt     9900
          tcaactatgt taaaaaatag ttggagccgg gcacggtgac tcacacctgt aatccgagca     9960
          cttggagagg cctaggcggg tggatcacaa ggtcaggaga tcgagagcat cctggctaac    10020
          acggtgaaac cccatcacta ctaaaaatac aaaaaattag ccgtacgtgg tggcggcgcc    10080
          tgtagtccca gctactcggg acgctgaggc agtagaatgg cgtgaacccg ggaggcagag    10140
          cttgcagtaa gctgagattg tgccactgca ctccagcctg ggtgacagag caagactccg    10200
          tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagagtt gcccaggcgc ggtggctcac acctgtaatc    10260
          ccagcacttt gggagactga ggcaggcgga tcacaagatc aggagttcga gaccatcctg    10320
          gctaacatag tgaaaccctg tatctactaa aaatacaaaa attagccggg catggtggtg    10380
          catgcctgta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga gaattgcttg aacccaggag    10440
          gcagaggttg tggtgagccg agagtgctcc actgtactcc agcctggaca acagagcaag    10500
          actgtgtctc aaaaaagaaa gaaaagttaa tgattaaatt atttagggga aaatactgtg    10560
          caattctgtt taataagtca cattttaatt ttttcttttg gaaatattag caagaaggct    10620
          cactttgtgc tcaacattgc ctgaataatt tattgcaagg agaatatttt agccctgtgg    10680
          aattatcctc aattgcacat cagctggatg aggaggagag gatgagaatg gcagaaggag    10740
          gagttactag tgaagattat cgcacgtttt tacaggtact gatgttaaac tcactaagtc    10800
          acattttctt tttttttttt tttgagacgg agtcttgccc tgttgtccag gctggagtgc    10860
          aatggcgcaa tctcagctca ctgcaacctc tgcctcctgg gttcaagcaa ttctcctgcc    10920
          tcagcctccc aagtagctgg gattacaggc acacgccact atgcctggct aattttttgt    10980
          atctttgtta gagacggggt ttcaccatgt tggtcaggtt ggtctggaac tcctgatctc    11040
          atgatccacc tgcctcagcc tcccaaagtg ctgggattat aggtgtgagc caccacaccc    11100
          ggcttacatt tcttttaaaa acgtagatac tatttagaaa aggatgtgcc attcttccta    11160
          tagggatctg actggtgaat tataactgca ctgttaactt tggaaatgga aatgcaaaga    11220
          tgttatttta aatatgcacg ctaatgacag tttgtatcct tctttcccca cccccacgcg    11280
          tgcttcaact acctgtcaaa attaacagca gccttctgga aatatggatg acagtggttt    11340
          tttctctatt caggtaagta gtcacaagca tctactatgt gttgcttaca tcccaggccc    11400
          cgtttcacag cctttcaata gtcactataa caaggcgacc ttcagaagtt cttctaatag    11460
          atcatgtcta cagagtataa gattatactc tagatcacta gattgtgatc cacctgcctc    11520
          agccttccaa agtgctagga ttacaggcat gagccaccat gcccggccaa ctagagtact    11580
          agatttttat atagataaac atgaaaggat tgtagaatct tcatattaga gtggggcatt    11640
          taaaaattcc tttttgagaa agattattta atttgcatct ggatgctaat aataacctta    11700
          attctggcca ggcgtggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgggag ggcgaggtgg    11760
          gcggacctca gggtcaggag atcaagacca tcctggccaa catggtgaaa ccctgtctct    11820
          actaaaaata caaaaattag ctgggcgtgg tgatgcaagc ctgtaatccc agctactctg    11880
          gagactgagg caggagaatc gcttgaacca gggagtcaga ggttgcagtg agccaagatc    11940
          gcaccactgc actccagcct ggtgacagag caagactctg tctcaaagaa aaccaaatac    12000
          ccttaattat aataagtccc aatgtctcaa acttaccatt tgttgggtaa acttaagaaa    12060
          atgcagtacc ttgctaccat ccttttaaat cagcctacca gactggattt ccttattatg    12120
          gtctgtggct tttgattttt ctctttgagt tctttggtgg ttatatatat gtacttgaaa    12180
          gattctttta tctgcgtgtc tttcattctt ttctgacact gtgagttgta tccagaggtc    12240
          tttcagaacc tctcctgagc gacctatctc tgcagatacc tttgtttgta tttctcttgt    12300
          actgccctcc tggactcctc ctcatccacc agcatttcca tctagtgctt taccgtgcca    12360
          ctgttaacag gtaattgcta ctgcagggct ggaatcagag gtcagagtag gcccagcact    12420
          tggcgtttcc tatttgtgcc ttgctgctct tggtacccac tgccttgcac tcactttctg    12480
          tctttgccgg tacctggttg acttgcttct ttgttggcta ccttggaggg tagatagtga    12540
          attttcagaa atttcccatt ttttgtcaga cagattgaaa taatcaggtt tgcattttgt    12600
          ttttttctac aagtggcaag cccatgaccc tggaagtctg atacctatgg aaacttcagt    12660
          ttaagtgccc agggagaact tattttggta gacacgattt ctgacattgc aagtagtaag    12720
          ttgaatatac attttctaaa gtagcaccca cggcagccaa attaccagat gtatatagta    12780
          gactagtttt aagaatagca cttatgggta gaatatacat acatctggat ttttgagaca    12840
          gttttatgta ggaattgtgt ggttttctgg aacatctcag agacctggta tgaaaagcac    12900
          tcttctaata tatatgtgta tgttttttat ggatttagtg atatatctat acacacacac    12960
          acttttgaaa acctatagcc ggctgggcgt ggtgactcat gcctgtaatc ccagtacttt    13020
          gggaggccga ggcgggcaca tcacaaggtc aggagtttga gaccagcctg gccaacaagg    13080
          tgaaaccctg tctctactaa aaatacaaaa attagctggg tgtggtggcg catgcttgta    13140
          atcccagcta ctcgggagcc tgaggtagga gaatcacttg aactcaggag gcagaggttg    13200
          cagtgagccg agatcatgcc actgtacttc agcctaggca acagagcaag actctttgtc    13260
          ttaaaaaaaa aaaaaaaaca aaaaaaaacc tgtagccttc tagagaaatt tatatatgag    13320
          gtacacaact aacatagcta tacttcttaa agtgtttaca caactgacat agctatactt    13380
          cttcaatttg gaatggagtg gtttggctta tgaaaagtta ctatttttct taacaggtta    13440
          taagcaatgc cttgaaagtt tggggtttag aactaatcct gttcaacagt ccagagtatc    13500
          agaggctcag gatcgatcct atgtaagatt ttgttttgca tttcatacat ttcttttccc    13560
          aaatttgatt tttaaagata tttcttaaag aagagaaata taattggaat acttgtgttt    13620
          tgatgttccc tgtttcattc cctcagactt tcctatttca cctttgtgat gtccatgagc    13680
          atctgccctg tagccttcct ggcaccccag tgtctgtggc agcacagagc tgccccgtaa    13740
          gtggtgcgtg aggccatctt ttggcccggc atcactaagc tgctgcagag acgttcatat    13800
          ggttgtgtga tcttttaaaa acatcagtga cacttaactg taaatctaat cttaaattat    13860
          cacaaatttt atataatgtt tgccagtaga caacataagt atgaattcaa tatttcaagt    13920
          taatattgtg tgttttcttt tttagaaatg aaagatcatt tatatgcaat tataaggaac    13980
          actggtttac agttagaaaa ttaggaaaac aggtaacatt tcttaccctt ccttgtcttt    14040
          ttttcttata ttgtgcccca tttaaaacta aaatgtgggc cagatgtggt ggctcatgcc    14100
          tgtaatccca acagtttgag aggcttaggt tgggggatca cttgaagcca gaactttgaa    14160
          actagcctgg gcaacaaagg gaggtcctgt ctcttattaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    14220
          aaaaaagcca ggtatggtgg ctcacatctg taattccagc tttcttggaa ggctgaggca    14280
          ggaggatcac ttgagctcag gagtgtgagg ctgcagtgaa ctatgattgt gccactgtac    14340
          cccagcctgg gtgacagagt aagactctgt tttataaaac ataaaaagaa aaagaaattt    14400
          taaaattaaa aagaaaaaac aaaaggattg ctgactttaa aattaggaaa ctgactagta    14460
          atgtgtgtgt ttgtggcatg gttatctatc ttgatagata gaaatttgtc attttaaaac    14520
          atatcagttt tccttgtaaa tttatttgtg acaagtatat gcaatttaac tatatcataa    14580
          gaaaaattct atattaaata taatacaaat gtggttactt tgaagtgggt ttttatgtga    14640
          tgactatgtt ctgtcagtta attactacat ttgtagattt gtatttagca tagtgctgtc    14700
          acaaagcctg aaatagtgtc aagcatgaat aaagcattca attatgcttg ctttagtgta    14760
          agattattca tatgattcca aaagccatgt aatacatacg tctacataaa atcacttcta    14820
          tttgttaaat aaaacatgaa atatgtcttg agcaagctat tttaagaaac agaatcattt    14880
          aacatccttt ttattagaat tttgaatctt tgaaagaggg ttcttgaaaa ccagctagca    14940
          cagtaaaaaa gaataaacta gtgatacatg cagcaacatg gatgaatctc aaaataatta    15000
          tgctgaaaga ataaccccga aacagaatac tacatgctgt atggtatcat ttattaaaag    15060
          tctagaaaag tgcagattca tctgtagtga tgaaaagcag atccaccagt ggttgcctgg    15120
          ggatgaaaag gctaaggaag agtgagaggg gggagggtca gagagaggca tgggaaacgt    15180
          ggcagtgatt aatgtgtcac agtgttggtt gtagtaatgg tttcatggga gtacagtata    15240
          caaatgtcaa aacatttcaa aggccaggtg cagtggctca tgtctgtaat cccggcactt    15300
          ttggatgcca cggcaggagg atcacttgag ctcaaggagt tcaggaccag cctgggcaat    15360
          gtcacaagac cccatctcta caaaaaaatg aaaaaaaaaa aaaagaaaaa ttggctaggt    15420
          gtggtgatac atgcatgtag tcctaggtgc tagggaggat gaggagggag cccagaggtc    15480
          aagcctgcag tgagtcatga tcgcactact acactccagc ttgggtgaca gaaggagatc    15540
          ctctctcaaa aaaaaaaaaa gtttcaaatt gtacacttta aatatgtgaa gtttattata    15600
          tatcacttat accccaataa agctgtttgt ttttttaaaa aagtaaataa aagccaaaaa    15660
          agatatgtca agaaagtata ttgaattaaa tctataagag ataattcaaa aacaaaaacc    15720
          ctattgttat cttttaagtc acccaaatca aatttgggaa aagtcaccta cttagcttca    15780
          tcctaagttg gttcgttctt tctttctttc tctctttctc tctttctgat ggattcttgc    15840
          tctgtcaccc aggctggagt gcagtggtgg gatctcggct cattgcaacc tccgccaccc    15900
          aggttcaagc aattttcctg tctcagcctc ccgagtagct gggactacag gtgtgcacca    15960
          ccacacccag ctaatttttg tatttttagc agagacgggg tttctccatg ttggtcaggc    16020
          tggtcttgaa ctcctgacct caggtgatcc tgtccatctc tgcctctcaa atacagggaa    16080
          tacaggcgtg agccaccatg cccagcccta agttggttct ttcttaaagt tcttcctgag    16140
          gagccaagag caagttaagg aggtgtaatc tagaagctta cagtggaggc tagctgggtg    16200
          cagtggttca cgcttgtaat cccagcactt tgggaggctg aagcagggag atcactgagg    16260
          ccaggagctt gagaccggct tggaccaaca cagtgaaacc ttgtctctac cgaaaaaaaa    16320
          tttaaaaagt gcaacttaga gcagtagagg ctgacacgag tgggaatcac ctctaggtaa    16380
          aaaccagggt agggtactgc tgagattatt taacctctgg gttttattta cgtgttttta    16440
          aaaattatga tccagtattc tttacttttt ttgtataaag taagcactga atttttaagg    16500
          tctgtagact tagatttcag aagtaccctc gtattaattt gcaaataaat gtctatctta    16560
          ttattttgag agatttaaaa atttttagtt cttcaaaatt gaattttcac attttgaatt    16620
          acattatctt tgacaaatac agatgatgtt ggccgggcgc tgtggctcat gcctataatc    16680
          ccagcacttt gggaggctga ggtgggtgga tcacctgagg tcaggagttc aagatcagct    16740
          ttgccaacgt ggtgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aattagctgg gtgtgttcgc    16800
          gcatgcctgt aatcacagct acttggaagg ctgaggcagg agaattgctt gaacctggga    16860
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          aaactctatc tttaaaaaaa aaaaaaacaa aaaaaaaaca aatacagaag atgtcaaatt    16980
          ttggtttatt ttattttctt tggttctaat ttatattttt gtttaaaact atatttttca    17040
          ctatagactc tgtctgaggt ccctgtataa taaaaaagaa ggctggaaaa agtattaaca    17100
          ttgtcaaaat ccaggaaaat agttggtcat gatactgaca gtaactttaa acactttttg    17160
          tatcttgtgg gttaaattag gattactttg tggtagtgat aaatgatgtt aattagggcc    17220
          gagtgcagtg gttaacacct gtaattccag catgtaggga gactgaggtg ggaggatgtc    17280
          ttgaggccag gagtttgaga ccagcctgta caacacagag acccccattt ctacaaaaaa    17340
          aattagaaaa ttcgtcaagc atcttggtgc acacctgtag tcccagctat ttgggaggat    17400
          gaagcgagag aatcacttaa gccaggggtt caaggctgca gtgagttatg attgcaccac    17460
          tgcactccag cctagatgac catctcttta aaaaaaaatg tgtttatatg ttatatgtga    17520
          tagtgttttt taaaaacatt tttaaattat agagggtctc actatgttgc ccaggctggt    17580
          ctcaaattcc tgggctcaag caatcctccc acgttagctt cccaaagtgc ttggattata    17640
          ggcatgagct gccatgccca cctaatttag tgatttttaa aaactgagtt ggtaattata    17700
          aattatcttc ctggaacttc tgactttctc acaattggaa tcttttgaca aaaattatcg    17760
          gtaatgggaa aactttgtat agttgtcatt tttcctccca tcagtatgat agatgcgatt    17820
          agagttatgt tggactgata ctttgaaaaa agatttaact atagctatta ataaagacat    17880
          ttcaactacg gactatccat ttttattctt ttgggagggt ttaatgttta tagtttaaag    17940
          caaagtgttg tttttaaaaa actatttaac agggccgggc gccatggctc acgcctgtaa    18000
          tcccagcact ctgggaggcc aaggcgggtg gatcacaagg tcaggagatc aagaccatcc    18060
          tggctaacac tgtgaaaccc catctctact aaaaatacaa aaaattagcc gggtgtggcg    18120
          gtgtgcgcat atcgtcctag ctactcggga ggctgaggca ggaggatggc atgagcctgg    18180
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          tctgcagtat tctcttttaa gatattattc agtcagagga aagagctcaa cttgaaatat    18660
          ttccagagtt taaacaatct tactaaactt tgatgggtta tatctgttct taacatgtga    18720
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          tttaacttga attctctctt gacgggtcca gagttaatat cagatacata tcttgcactt    18840
          ttcttggctc aattacaaca ggaaggtaag taaaggctga aaattttgta acgttatctt    18900
          tcgaagtagt taaataaact ggagcattag atgacagtgt gacaatactg tttttctggc    18960
          agtggcagtg aaacaatctt taggtttgac gtggtgatag gctgtgattt gggtgacgct    19020
          gttccattag agttctcact ggcacctggc cctccctctt ctgaggatgc tgctttcttt    19080
          gcagcccttc taagtaatgg ttttttcttt tatacatcac ataccacaca gctgagagga    19140
          gggatagata tttttctttt ttgcctcttc taggccactg ttcttcccta taaactccag    19200
          tttctttgaa atacatgccc ctaagggcca gttgtggtgg ctttcgcctg taatcccagc    19260
          actttgggag gccgaggcgg gcagatcacg aggtcaggag atcaagacca tcctggctaa    19320
          cggggaaacc ccgtgtctac taaaaataac aaaaaattag ccagttgtgg tggtggacac    19380
          ctgtagtctc agctatttgg gagactgagg caggagaata gtgtgaaccc gggaggtgga    19440
          tcttgcagtg agctgagatt gcgccactgc cctccagcct gggcgacaga gactccatct    19500
          caaagacgaa agaaatacgc gcccctagat taaactatcc cttgcccttt tgcactcatc    19560
          caaaagtctc ttttcatcag tgattttagg atctgactca ttgtgttttt ctctacttca    19620
          actcctttta tcattcttaa tgatttctgt attgctaatc aatccagtaa tccagtacct    19680
          acttcttagt ttcaaaatca ctcactcttg cttagctatt accaataatc ataaccactg    19740
          tcaaatctca attgcaagcg tattactctt taactaccac ctcctatcct taaaccatgt    19800
          tttatctgtt ttttttattc cagccattct ttaaacccta ccgtggggcc caagcatttc    19860
          ctttatatgc attcttcctt tcttctgctg cttattttct gtaattcatt gttataatca    19920
          ctccattgca ttcttcagct tgtttccccc ttctctccct ccatcatact tgaatgacaa    19980
          aaatctcaac cctggttaaa accaaatctt ggccttgtcc attcctgtac cagagtagca    20040
          ggatatggct aaaaaataac ataaaacatg atgattggtt ttactttttt cttaaacgat    20100
          ctatccatcc attcacccat ccatctgtct atcaaagtga ctaggcctct ctgaagccca    20160
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          aaaaaatcat gtgccacttt ccaaggtgac taatttcaca gcttctgtct tcaaaccttt    20520
          aaccactttc ctctcccttc cttacacacc ttgcgtatgg ccttccatta cattctgctg    20580
          agaacataga agcaattaaa attatgttct tacctttcta ccagcaagtg tactaatttg    20640
          cttatatctt cacctgtgct ttgcgactac taaaatagat gaatggtccc ctacctctag    20700
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          tctctagtgt gccttctcct tttcttgaac tccgcctcct gggttcaagc gattcttctg    21000
          cctcagcctc ccgagtagct gggattacag gtgcgtgcca ccacgactgg ataatttttt    21060
          cttttttttt gagatggagt ttcccttttg ttgcccaggc tggagtgcaa tggcgtgatc    21120
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          tggaaggggt ttctccgtgt tggttaggct ggtctcgaac tcctaactgc aggtgatctg    21300
          ccacctcagc ctcccaaagt gctgggatta caggcatgag ccactgcgcc tggcccctgg    21360
          ctaagtgttt ttttattttt atatttttag tagagacagg gtttcaccat attggccagg    21420
          ttggtctcga attccggcct caggtgatct acctgcctcg gcctcctaaa gtgctgggat    21480
          tacaggcatg agccactgtg cctaaccatc ttttagtaat ggtatttaga gatcacaatt    21540
          tgagtgctgg catgcttatt gctactgggt ttgttatgta gttattgtga attcacattt    21600
          aggaatatag agtttttaat tctttgattt tagatacttg tatctttttt cttttatagt    21660
          taaaaccttg gttcctaatg atatcccttc ttaaaaaccc tgtctgccct tgacctccag    21720
          cccaccatgc tgtggttttc ctaacttgtt gcctgcatct ttcagatccc tttcatggat    21780
          cttaggtata tctctaaata agatctgtgt gtcagtaatt accaaacttt tatctttagt    21840
          cttgacatct accctgaaca cctagctttg actaactcct agctttggca tctccacttt    21900
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          ccatgctatc tatcaggttt tccatttcca taagggtgac acttcttgta ctctggttcc    22020
          tatatattat actgatagag ccgctcagag tgcttcttaa ccagtgtaat gcctgttatg    22080
          tcccaccctc actccttgtc tttcagtggc ttcccagcac acttagaata aaatctgaag    22140
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          agatcacttg aggtcaggag tttgagacca gcctagccaa catggtgaaa ccctgtctct    22260
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          gaaaagtaaa ataaaatctg aagtcttgaa taaaacccaa gatcttgacc atgacccctg    22500
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          atttattgta cgatatagaa acagttttac tggcagaaaa cacattaaac catttgaact    22620
          ctgaatacag ttgtcctcat aaaaaatgtt cattgtacta ttttgaggtt ttccattagt    22680
          agttcttaca atctttgtcc cattatgtgt taattctaac aaaggatatc caataacaaa    22740
          caccagagtt taagaaaaat gtgccaggtg cggtggctca cacctgtaat cccagcactt    22800
          tgggaggctg aggtgggcag atcacctgag gtcaggagtt tgagaccagc ctggccaaca    22860
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          gtaatcccag ctactcagga ggctgaggca ggagaatcgc ttgaacctcc tgggaggcag    22980
          aggttgcaat gagctgagat tgcaccactg cacttcagcc tgggtgacag agtgagactc    23040
          catctcaaat aaaaaataat aataataatt aataatagaa aaacttagat tgttttaggt    23100
          atagcccact cttagttttt gtgtgtagca tctagcttgg ggaaaccctg gatttctgga    23160
          atcatattta tacacagtca cactagacta atgtaattct tttgggatgc aaaccacacg    23220
          tttgacacct taaatagctt ttaggtattt ggcttctcag ctcctatttt tagttacaag    23280
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          ctagttattg cacacattat ctgactgtgt cctcaaaaca gccctgtgag tgtattagtc    23400
          agggttctct agagggacag aactaataag atagatgtat atatgaaggg taatgtacta    23460
          aggaatattg actcatatga tcacaaggtg aagtcccaca ataggctgtc tgcaagctga    23520
          ggaaccagga agcctgtcca agtcccaaaa cctcaaaagt agggaagctg acagtgcagc    23580
          cttcagtcta tggccaaagg cccaagagcc cctggcaaac cactggtgta aattcaagag    23640
          tccaaaagat gaagaacttg gagtctgata tttgagggca ggaagcatcc agcatgggag    23700
          aaaggtgaag gctcagcaag tctggtcctt ccacactctt atttctgcct gatttattct    23760
          agccgagctg gcagctgatt agatggtgac cacccagatt gagggtgggt ctgcctctcc    23820
          cagttcactg gcttaaatgt taatctcctt tggaaacacc ctcacagaca cacccagaaa    23880
          caataatttg tagccttcaa tccaatcaag ttgataatat taaccatcac aggaaggtac    23940
          cagtatcatt atgtttaaca gtagaaacca agacaaatgc agctaggaag tgggagaact    24000
          gggatcagat gcaggcagtc tgattctcaa tcagttgctc ttaccgactc ctttactctc    24060
          tctcatacca gtaagtgagt agcctgctca gtcaagtgct atattagtag ggccctttac    24120
          agacatttac ttcgcacagt cactcagtga gacggctatt ccagtcttac aatggagaaa    24180
          gtgaggctca gagattttaa gtaacttatc ctagatgact ttactagtaa gtataagaat    24240
          cattatttga actaaaatct ttctgaatcc tcagcttgta tttttttcca gtgtactgtg    24300
          ctgcctcttt actagcattt tacatcaatt ttgaatctct ttactagctg tttaggttga    24360
          tttttgcctt tttgttttag gttattctat atttgttgtt aagggtgacc tgccagattg    24420
          cgaagctgac caactcctgc agatgatcag ggtccaacag atgcaccgac caaaacttat    24480
          tggagaagaa ttagcacaac tgaaagagca aaggtaaaaa tgaggcctgc agtatggaac    24540
          atatgacgat atttcattat gagaataaaa ttttcatgct tacattgaat atgtggtcct    24600
          tgtgttgtcg gcacctctat tttggacctt acattttagt gaagtttatt agttcgaacg    24660
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          gggcaacatg gcaaaacctc acctctacaa atagtacaaa aattagccag acgtggtggt    24840
          gcgtgtctgt agtcctagct acttgggagg cagaggagga aggatcaccc aaaactgggg    24900
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          actttctaat gaaattattt atcaattgat ttccttagat atccagataa aattgagatt    25980
          ccattaatgg gaagattatt ttcatcctga acttttcttg cctctaggca cacctctgag    26040
          tactccatat ggtgtgcaat cccatttttg attaatagag tcctgctgga ttagcaggga    26100
          cagaaatcag ctttagattt cttttgtttt ttgaattaag agtctcactg tcgcccagcc    26160
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          gcctcagcct cttgagtaac tgggactaca ggcacctacc accatgcctg gctaattttt    26280
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          ctcaggtgat ccacctgcct tggcctccca cagtgctggg attacatgtg tgagccacca    26400
          cgcccagcca gaagagtaga atattcttca agaaaaaaca ttttaaaagc ttactcaaat    26460
          gaggataaac aaatgtattg ttgcttgaat tggtaaatac agtgattggt ttttgttctg    26520
          ttgtgttttg ttttcaggta gttccagaaa tatatctcaa gatattccac agacatcagg    26580
          tacaaatctt acttcagaag agcttcggaa gagacgagaa gcctactttg aaaagtaaag    26640
          tagttggtac aaattaaagt agcacgttta atatttgctt tggctatttt gtctgtttgt    26700
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          actaaaaaat acaaaaaaat tagccgggcg tggcagtgtg cgctgtagtc ccagctgctt    26940
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          tcgcaccact gcactccaga ctggttgata cagtgagact gtctccaaaa atatatgtgt    27060
          gtatatataa ataaaaataa aaatttacag caaataacat gaagcaaaat gtagttttaa    27120
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          aatttcattt attaaaagaa aaatgaaatt aggacaaggc aagaagaata cctattgatc    27240
          ctttggatgt gcttcttgct tacctgatta accctgcaaa atttctctac caatcagtaa    27300
          gaaaaacagc ttttgaggta tgggagcaca ttcccaaata gacatgggta gttcatttag    27360
          ctgctcatgg ctgctgcagg gggtcctgta ggcctgttag catcaggaga atggatgcaa    27420
          accataaatc tggatcaact cctaaaactt taccttgtgc ccagccttgt aagtgcttgc    27480
          taaataggaa ttccactgta tgaaaataca ttcttttcaa gtaactatca ttcagacttt    27540
          tgtcccccac ttttttaaaa aaagaaaaag aaaaggctgg gtgcagtggc ttacgcctgt    27600
          aatcccacca ttgtatgaaa taggaattcc actgtatgaa aatacattct tttcaagtaa    27660
          ctatcattca gacttttgtc ccccactttt ttaaaaaaag aaaaataaaa ggctgggcac    27720
          agtggcttat gcctgtaatc ccaccatttt gggaggccaa ggcgggtctt tgggagtgag    27780
          tttttgggag gcaggagaat cgcttgaacc cgggaggcgg aggttgtggt gagctgagat    27840
          cgcgccattg ctctccagcc tgggcaacaa gagtgaaact ccgtcttaaa aaaaacaaaa    27900
          caaaacaaaa attagctggg cgtggtggtg ggtgtctata atcccagcta ctcgggaggc    27960
          tgaggcagga gaatcgcttg aatccgggac gcagaagttg cagtgagctg agattgtgcc    28020
          actgcactcc agcctgggga caagagcgag acctcgtctc aaaaaaaaaa aaagaaaaac    28080
          tccatgttaa aaattacaag ataaataatc agacccgctg atcctaggtc agaaaacaaa    28140
          agactcatag ctgaatctga cctgccattg ctgtatttca tccattctaa gatgcacata    28200
          gtttcacatt tcaatgtctc tgaaattgag aagtatctta caatcataat tgacagtata    28260
          ttagcagcac ctaaaaatat tggctcattt tacatttgat ggtataatga agaaaatatt    28320
          tacctttttt tctgttttgt ttttaagtca caactcagaa gtagatgaag gaaaattctg    28380
          atcagctgac atcctcttaa tgtgagatat ttctagtctt tattcagcat agattaatgg    28440
          ctaattatat gttacatttc aaagtagtgc ttattagtgc tttttacttt taagtttcaa    28500
          aattaacttt tttattaaac tccaaattta tacaaaagta gaaaaactag cataatgaac    28560
          tcttgtttat cacccagatt caacaaatac tagcacacgg ccaatcctgc tttttttttt    28620
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          cacagggttt caccatgttg cccaggctgg tcttaaactc ctgacctcaa gtgatccacc    28860
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          cgttttataa tactcccatc tcccattctt tccactgtcc cacctacaag tttggattat    28980
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          aaaatatatg aacttttttt aacatagtta aatgctattg tcataaaata atcatgataa    29100
          ttaattgtaa ttctatatca ccaattatct agttaatgta aaaaataact taaatctaag    29160
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          cacctgaggt caggagttca agaccagcct gaccaacatg gagaaacccc atctctacta    29280
          aaaacacaaa aaaatagctg ggcgtggtgg cgcatgcctg taattccagc tagttgggag    29340
          gctgaggcag gagaatcagg gagacagagg ttgtggtgag ctgagatctt gccactgcac    29400
          tctagccttg gcaaaaagag tgaaactctg tctcaaataa ataaataaat aataaaaaaa    29460
          taacttaaat ctacttaatt agaaaaacta atattctgga aattttattt taagaaatat    29520
          ctaaattggc cgggcacgat ggctcacacc tctaatccca gcactttggg aggctgaggc    29580
          gagcagatca cctgaggtca gaagggtcag gagttcaaga ccagcctggc caatgtggcg    29640
          aaacaccgtc gccactaaaa atacaaaaat tagctgggca tgatggcgag cccctgtaat    29700
          cccagctact caggaggctg aaacaggaga atctcttgaa cccaggaggt ggaggttgca    29760
          gtgagctgag atcaccccac tgcactccag cctggatgac agagtgaaac tctatctcaa    29820
          aaaaacaaac aaaaaaaaga aatagcaaaa ttaaaagaaa gcatacatgg ccaggtgtag    29880
          tggctcatgt ctgtaatccc agcacttttg gaggctgagg caagcagatc atttgaggcc    29940
          acgagttcaa taccagcctg gccaacatgg cgaaagcccg tctctcctaa aaatacaaaa    30000
          aaattagtcg ggcatggcgg cgcacacctg taattgcagc tactttggag gctgaggcag    30060
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          tatcctgggt gacagagcga gactctgtct caaaaagtaa aaaaggggcc gggtgcggta    30180
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          gatggagacc atcctggcta acacagtgaa accccgtctc tctactaaaa aatacaaaaa    30300
          aaattagctg ggtgtgatgg caggcgcctg tagtcccagc tacttgggag gctgaggcag    30360
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          ccagcctggg cgacagagcg aggctctgtc tcaaaaaaaa aaaaaaaacc gtcacctcct    30480
          ttagtaactg atgttagtat tttggcacat tctctttctg tgacttatac acacttacct    30540
          tgtaagtgtt gtactcattt cctatgacag taaatagtct ttgtaacagg ctgcatgata    30600
          tttcataaaa tgaatggatg tggcataatt tatatatgtg ccttttgaat tatgctatta    30660
          taattaatac tgcaatgaac aattcttata ttgcctctat gcctcaaatg tctcatcatt    30720
          tcttcttttt tctgaggatg tcagattact gggttaaagg gtatgaatat ttttaagacc    30780
          ttggtacaga tttctaaatt gctttccaga ataattccca tgtgatactt tcatcatgtt    30840
          tatttcagac tttctttttc cttttttgag acgaaatctc actctgtcac ccaggctggc    30900
          gtgtagtggc acaatctcag ctcactgcaa cctccgccct ctgagtttaa gcgattcttc    30960
          tccttcagcc tcccaagtag ctgggatcac agacaagtgc caccatgccc ggctaatttt    31020
          cgtgtttttt gtagagatgg ggtttcacca tgttacccag gctggtttcg aactcctgag    31080
          ctcaggcaat ctgcccacct cggcctccca aagttctggg attacaggcg tgtgccacca    31140
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          catcatatag aaactataat acaaaattta taggtatatc taagaaaatg aaagtatatt    31260
          taaagcataa aaataaaccc ctcttttact taaaattttt aaaaaattgg attaaaaata    31320
          tgaaacttcc aacaaattga actttttttt ttttcttttt tgagacaggg tcttgctttt    31380
          gtcacccaga ctggagtgca gtggcgtgat cttggctcac tgcaacctcc acctccctgg    31440
          ttcaagcaat tcccctgcct cagcctccca agtagctggg attacaggcg catgtcacca    31500
          cgcccagcta attttttttg tatttttagt agagacaggg tttcaccatg ttggccagac    31560
          tgggctcgaa ctcctgacct caggcaattt gcctgcctgg gcctcccagc gcgctgggat    31620
          tacaggcatg agccactgca cccagcctga acgttttata gtagtaaaga taattcagta    31680
          atgcccaata atgactaagt aagttataac aagaacaatg tcagcaataa ctagtgcttt    31740
          ttagtaaaca gggtcaggca accttgtacc ctttaaaaat gttcaaatct tgatataact    31800
          ccttcctaat tggagcagga ttgattgagg aggaaagtgt gcagtgatgg ttaccagctt    31860
          cagcctcttg gcttgacttt gcaaatactg tggagaattt ggaaagagct tgagaatatc    31920
          ttacatagtc acatgttgct gagaagagtt aagaactaac ttcttgatgt tcatttttaa    31980
          tagtggtttg cattcaaaac cttatagagc tcattagtag gagagctgag aagctaatat    32040
          ttgcttttca ctaaaattcc tgattactta gcctaggtag ttccttgtct ctctaggttc    32100
          tgtctttggg agcttggctc taaggttatc aagctaactc tttcttacct cttacccttc    32160
          ccaaattgac cctggttctg atttgttatt cgtatgattt tctagttttt cttttccctt    32220
          tttgagtatt tgaagcttca tactgaatat agtaatcata gtattcatgc ataaagaaaa    32280
          tcataaagta attgcataaa tccataaagt aatcatagtt ttcatgcatt aaaaaaacta    32340
          gtttaggccg ggcgctgtgg ctcacacttg taatcccagc acttttggag gccgagacag    32400
          gcgaataatc tgaggtcagg agttcgagac cagcctggcc aatatggcaa aacctcttct    32460
          ctactaaaaa tacaaaaaat tagccgtgtg gtggtgggca ctgtaatccc agctattcag    32520
          caggctgagg caggagaatc acttgaacct gggaggcaga ggttgcagtg agctgaggta    32580
          atgccgttgc actacagcct aggcgacaag agtgagactc ttatctcaaa acaacaacaa    32640
          caacaaaaac tagtttctct ctagtgtaaa aaatactgtt aagccgggag tggtggctca    32700
          cgcctgtaat cccagcactt tgggaaggcg aggcgggcag atcacaaggt caggagatcg    32760
          agaccattct ggctaacaca gtgaaacccc gtctctatta aaaatacaaa aaattagcca    32820
          ggcgtggtga caggcgcctg tagtcccagc tactcaggag actgaagtag gagaatggcg    32880
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          ctacagagcg agactccatc tcaaaatata tatatatata gactgttaaa aagtctccct    33000
          attacagatt cataatttat gagtcattaa ataatatttt taagccatga cattttttcc    33060
          agcaggagtc tctaaatctg ttttaccact gtaaaacccc aagcaaaact ctactacatc    33120
          agctgtgtca ctgtaaaacc tgccttaact cacatcagta tgaaattaag caatgtgtgt    33180
          gaaactattt tataaactgt aaaggattcc atacatgcat gttggcaatt attaatgtct    33240
          tctctaggtg tggctttgaa acagatgcag attctttctg ctacaaaaaa catagttaca    33300
          aatgttttgt aacaaggaga gacacaaata tcttcatgga catggattgc tatgagtttt    33360
          tgattgacta atacttgagc caccacttca gtgatggtat aatttatcaa acagtattga    33420
          gaaacagaaa ctactgggga tgttttaagg agaaaaagta cttaatagag aaattagggt    33480
          tttacataat cttaagaaaa gatgaaggtg cagatcttag ccaggcctcc agagtaccac    33540
          aaaccaactt gcaggaagag ctgtaaccac tgccccaatt ggcacaatgg gtaatgagga    33600
          tattaaattt aagaacacac tgctatagca atgatcctgg gcttagaaag ctgccaccac    33660
          aattgcctag acatgggaag tctggccccc actgcaaaag cagtgaagca gaattttggg    33720
          actggcatct ccatgacttt gcttgccacc agagaacaac caaagtaggg agatggctgg    33780
          ccttatttct gcctatttat tttattttat tttttgagac agactcttgt ctgtcaccca    33840
          ggctggagtg cagttgtgtg atcttggctc actgcaacct ccacctccca gcttcaaaca    33900
          attctcctgc ctcagccttc tgagtagctg agattatagg cacccgccac tgtacccagc    33960
          taattttctt atttttagta gaggtgggtt tttgccatgt tgaccaggct ggtctcgaac    34020
          tcctgacttc aggtgatgca cctgcctcag cttcccaaag tgttgggatt ataggcgtga    34080
          gccaccatgc ctggcccatt tgtgcctttt tttttttttt tttttttttt tgagatggag    34140
          tcttactctg ttgcccagac cagagtgcaa tggtggcatc ttggctcatt gcaacctctg    34200
          acttccagtt tcaagcaatt ctcctgcttc agcctcccga gtagctggga ctacagctgt    34260
          gcagcaccat gcctgcctaa cttttgtttc tgttttgttt ttttgagata gagtcttgct    34320
          ctgtcaccca ggctggagtg tagtggtatg atctgggctt actacaacct ccgcctcccg    34380
          ggttcaagca attctcctgc ctcagcctcc taagtagctg ggactacagg cacgcaccaa    34440
          cacacccagc taattttttt gtatttttaa cagagatggg gtttcaccat gttggccagg    34500
          ctggtctcga actcctgacc tcgtgatctg cccgcctcag ccttccaaag tgctgggatt    34560
          acaggcatga gccaccatgc ccagacaatt tttgtatttt tagtagagac agttttgcca    34620
          tgttggccag gctggtcttg aactcctgac ctcgggtgat ccacctgcct tggcctccgg    34680
          aagtgctagg attacaggcg caagccaccg tgctcaaccc attttggcct tttaaagctc    34740
          atgtgagcac ttaatttgta accagaatcc tacttgtaaa ataatctaag acatgtagct    34800
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          taaacatgtt ccatctcagt gtcttcacag ctggaaggtg tcaacattgt ttcaaggtgg    34920
          gcaattgatt tacttctcac ttttcataaa ctaaaagtag aataaaggct attcctctaa    34980
          aattgctatc ttacctgtca ctcccttgca ttctcaccta ccttcttgag tggaggggaa    35040
          gagggcatgg agtgatagct gatgtgccag gaattctcca tactcagtcc gtctttcttg    35100
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          gccatgcaca ctaaagtctt acacctacac acaggtcagt attcgggctt agagaccaac    35220
          agggaaaaat tgcagttctc attggttgaa ctttattgtt cacagtttta aaacacaaaa    35280
          ttgagaggaa ctctagaaaa aatgtgtcat tctattaata attgttgctg gtagtttaaa    35340
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          gtgcctgcca cttcaactgg ctaatttttt gtatttttag tagagacagg gtttcactgt    37740
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          tagaagttga gagaaaaagt aactgtatct gacaaagaaa ttataagcag aatatataaa    38040
          gaactcttaa aactgaacaa taagagagca actcaataaa aaggtgaaga atttgaaaag    38100
          gtacttcacc aaataagaca tagggatgac aagcccatga aaagactctc agcatcacta    38160
          gtcacaggga gatgcacaat aaaaccacaa tgagatacca cggcacccct gtaggtgtgg    38220
          cttaatgagg aaataaaact gacaatacca agtgttgaca aggatccagg cagctgagac    38280
          tcatacactg ttaatgggaa tgtaaaagtg tacagctttg ggaaacagtt tggcattttt    38340
          ttgataaatg tatacttagc catatgatcc agccatccta atcatgtata tataaccaag    38400
          agaaaagaaa acttaggttc acataaaaac ttgtatcaaa tgcttatagc tggccaggca    38460
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          aaaaattagc caggcatgat ggcgggcacc tgtagtccca gctcttcagg aggctgaggc    38640
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          tctaaattta tgtcatggag tcccagaagg agaggagaaa gagggtgggg ctgaaaaaat    40740
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          accatgactg gctaattttt tgtattttca gtagagatgg ggtttcacca tgttggtcag    42480
          gcaggtctcg aactcctgac ctcgtgatcc acccgcctca gtttcccaaa gtcctgggat    42540
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          attgttccac tgacacaatt gcccaggctg gtcttgaact cctgggctca agcagtctgc    42660
          ctgccttggc ctccctaagt gctagtatta caggcttgag ccactgtgcc cagccaaaaa    42720
          tagaaattta tattctcaca aaaacatgta catgaatgtt tatagcagct ttacttgtaa    42780
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          agcatgtaat actctactgt caggattaaa aagaaaccaa ctgttggcac aggcagcacc    42900
          gtggctggat ctcaggggca ttatgctgag tgcaaaaaag cctcaaaggg tcttatactg    42960
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          gatattgttg atatacacaa caaattggtg atatacacaa caaatcccaa atgcattaca    43500
          ctaagtgaaa gaagccatat tcaaaaggct acatatctac tgatgccttt tatatgacat    43560
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          agctcttgcc tcaggctttt tccagttttc tttttctctc ttgtagataa tttggctcac    44340
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          tagtctgtgt tgataatagt aatggttcta gaaggataaa cagtcctccc ttcaactgta    44460
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          ggttttcatt attttcccac aattcttttg aaagatggta atcttttctg aggtctagca    44580
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          gagaagcata gtatgcaggc aagtctcctt ctgttagaag actaaacata cgtacccacc    44880
          atgaatgtat aatacatgaa atttggcctt caattttaat agcagtttta ttttattttt    44940
          ttctcctatg actggagctt tctgttctct ttacagttga gtcatggaat ataggtgtct    45000
          acttcacatc ttttagtagg tatagcttgt caaagatggt gatctggaac atgaaaataa    45060
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          ggccaccatg cctggccttg ggctactgtt ttcaaagtga attgtttgtt gtatcgagtc    48480
          cttaacaagt atagacatat gatatatgtg atcctaatta agaaatacca gattggatca    48540
          actaatcatg tcagcaatgt aaataacttt ttatttttca tattcaaaat aaaaactttc    48600
          ttttattcct ggtcccttta taaccagcat tttttgcttt gaaaaatgag ctggctttgt    48660
          agttttttaa agttttaaac ataagaaaaa tgtcttttgt tctatttgct ttcatgaatg    48720
          aagatcattg acatggttgg taaattctag aattttgatt ttgtttttta atttgaagaa    48780
          aacctttgct atttttattt tttccaaatg gtctgacatt ttaagaatga atgctaataa    48840
          cttaacttct aaatttatcg tcattggcat gtttaatagc atatcaaaaa acattttaag    48900
          ctggtggatg catagacaaa gcaatgggaa actagtgaaa tacacacgga tgttcctgag    48960
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          taatgctttt ttttttttga aagacaaaaa catacatttt aaatgtgatt atctaatttt    49080
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          ttcttaacca gctgtggtgg tgaatatgag taacgcaggc cagcacagtc cattgatatt    49860
          ctattccagc ttactgcctg ccaaaaggtc cattattact ggatcccgag tcttttccaa    49920
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          ttgaaagcca gttcattaag aaagtagagg aataaaagaa tggctacccc ataggcagag    50520
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          cctcctgggt tcaagcaatt ctcctgcctc agcctcctga gtagctggga ctacaggtgt    50700
          gtgccaccat gcccagctaa tttttgtatt tttagtagag acagggtttc accatgttgg    50760
          ccaggaaggt ctccatctct ttaccttgtg atgcacctgc cttggcctca aaaagtgctg    50820
          ggatgagcaa cctcgcctgg ctggttattt cttgaggata tgctaaacaa ggggtggatt    50880
          attcatgcct ccccttttta gaccatttag ggtaacttcc cagcattgct atggcatttg    50940
          tcaactatca tggtgcttac gggagtgcag cagtgaggag gaccagaggt catttcatcg    51000
          ccatcttggc tttttcagct ggcttcttta ctgcaacctg ttttactagc aagttttttt    51060
          atgacctgta tcttgtgcag accttctatt tcatcctgtg acttagaatg ccttaaccat    51120
          ctgggaatgc agcccagtag gtctcaggct cattttaccc agcccttatt caagatggag    51180
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          cctaagggtt gcagagggat gaagatccat cttctgtaac ttcttcaggc tgaataaggg    51300
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          tggctctcta tccttcctcc cttccccagc ccctgacaac taccattcta ctttgtctct    51420
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          ctagtgtatt tcactttgca tgtcaaggtt catccatgtt gtagcatatg tccgaatttt    51540
          cttcttttta aaagctgaat aatattccat tgaatgatat atgcacattt tgcttattca    51600
          tttatccatc aaagaaaacc aatagctttt ttacatacca gtaacctggt taaaaaaaat    51660
          aagatggaaa aataccaagc ccaaaaatgt caaattgttg aacaccagag aggtactata    51720
          attcaagctg agcagaaagg aatggccctt gtctcagccc tgagccacat gtcactacat    51780
          gggccccaag cagctcttct tgtgctcaga gtcctgctaa gtcttgttct gcactcctct    51840
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          tttttttttt tttttttttt ttttagacgg ggcctcgttc tgtcgcctaa gctggagtgc    52080
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          atccacccgc cttggcctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac ctaacccggc    52320
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          agagtattaa tagtgtataa ttccatttat gtaagatcct tggaatagcc aaactcacag    52440
          agacaaaaag tagaatggtg gttgccgggg gatggtagag gggaaaattg ggagtcattt    52500
          aacgagtatg gagtttcagt ttaggaagat gaaaaaagtt ctggagatgg atagttgtga    52560
          tggctgcaca acaatatgaa tgtacttaat gtcggtgaac cgtataacca tttaacaatt    52620
          gaaaatggtt ataaaggtca attttgtgtt atgcatatct tatcacataa aaaatacaga    52680
          ggactgatca ttatatttgc tcccttccaa aatcccacct aggttaaaga aaaatatata    52740
          aacccacaag aacacaggga ccaggagagg agatgcattc attggattag gtttggttgt    52800
          aaaacaaaaa caaaaacaac aaaaacaaaa aaaaacacct gggcgcgatg gctcacacct    52860
          tgtaatccca gcactttggg aggctgaggc aggcagatca caaggtcagg agttcgagac    52920
          cagcctgacc aacatagtaa aacctcatct ctactaagaa tataaaaacc agccaggtgt    52980
          ggtggcatat gcctgtaatc ccagctactg aagttggctg agacaggaga atcacttgaa    53040
          ccagggaggc agaggttgca gtgagctgag atcgtgtcac tgcactccag actagatgac    53100
          agagcaagac tccgtctcaa atggaaacaa aaactaatat aacagtgact ttacatgcta    53160
          tgggtttttt ttctcctctc atcttcaaga aatgcggaga cggccagtcc agggatgata    53220
          cagcatcaca gtgtcaggaa tctgctcttt ctgtataatt gttacaggaa aggggtcccg    53280
          atccagaccc caagagaggg ttcttgaatt caggccaagt ccacagtgca aagtaaaagc    53340
          aagtttatta agaaaggaat aaaaattccc tactccatag acagagctgc ccggagggct    53400
          gctggttgcc catttttatg gttatttctt gatgatatgc taaacaaggg gtggattatt    53460
          tatgcctccc ctttttagac catatagggt aacttcctga tattgccgtg gcattcgcaa    53520
          actgtcatgg tgctggtggg agcgtagcac tgaggaggac cagaagtcac tcttgtgtgg    53580
          cctttttggt ttggtgggtt ttggccagct cctttactgt aacctgtttt aacagcaagg    53640
          actttatgac ctgtatttta tgttgacctt gtatctcatc ctgtgactta gaatgcctta    53700
          accatctggg aatacagccc agtaggtttc aacctcattt tacccagctc ctattcaaga    53760
          tggagttgcg gcccggcgcg gtggttcatg cctgtaatcc cagaactttg ggaggttgag    53820
          gtgggtggat cacgaggtca agagttcaag accagcctgg tcaacatggc aaaaccccgt    53880
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          cttgggaggc tgatgcagga gaatcacttg aacccaggag gcagtggagg ttgcagtgag    54000
          cagagatcgc gccatgcact ccagcctgga cgacagagca agactgcgtc ttggggagga    54060
          aaaagaagaa aagatggagt tgctctggtt tacattcctc tgacataatg gctttatgta    54120
          catggcttcc atggttaagg tcagctcgtg gatctgatat ggctgtgttg gtgatcatgc    54180
          ccagcaatca gaaagagaag ggaggccggg tttggtggct catatctgtc atcccagcac    54240
          ttcgggaggc caaggcagga ggatcacatg agcccatgag tttgagacca gcttgagcaa    54300
          catagggaga cctcatctct acaagatata aaaaaaactg tcggacatgg tggcgtgtac    54360
          ctgtggtccc agatattcag gaggttgagg tgagaggata cctggaacct ggaggtttga    54420
          ggctgcagtg agctataatc gcgccactgc actccagcct gagcaacaga gtgagacccc    54480
          atctcaaaca attaaaaaaa aaaaaaggag ggcagaaaaa gtctatgtac cttttctttc    54540
          aggttacctt ctcaaagttg tgcatacccc ttccatttac attatattgg ccagagctta    54600
          acatgacaac tactagctac aaggtggttt ttattctggg ttgccatgca tcttagcttg    54660
          agtaccctac aggcagatcc tgagacgagg attcctgtga aaatgattat ttacttattt    54720
          aattaattta ttttgagatg gagtctcact ctgtcaccca ggctggagat cagtggcatg    54780
          atctcggctc actgcaacct ctgcctccca ggttcaagca attctcctgc ctcagtctcc    54840
          caaatagctg ggactacagg catgtgccac catgcccggc tatttttttt tttttttttt    54900
          tgtattttta gtagagacag ggtttcacta tgttggccag gctgatctca aactcctgac    54960
          ctcaggtgat ctgcccgcct cggcctccca aagtgctggg attacaggcg tgaaacactg    55020
          cgcctggccg aaaatgattt tttaaaagtg ttccaggaag aaacggaaag ggcatagggg    55080
          agtaagaaag tggaaaatgg aaaggaagga agccaagcaa ggggatccta tcaagcaaag    55140
          cctcagtcct gcagacagtt tggaggcagg atattcacat cttagagttg tccaaaacag    55200
          gacaggcaag ctgcagaatt ttcaactctg gctgaataag gttgcgtttc agctctccgg    55260
          gcacctggaa agtatgggct ccagtagcct ggaggcagtc tgctgacaga cacaggtgct    55320
          ggctggtgtg cacaaaagtg gtaaagggat gagcgggtgc aatagggaca ctggcatctt    55380
          ggctgtcatg catccaggta aaaagtgggg gctcaattac tatatatgaa agggagaaca    55440
          gactttaagg aataattatc agtcatttcc aggtgagaca gcaacagaag agaaatgcta    55500
          aattttccct tttttggggg ggtgcggtgg ggggacagag tttcgctctt gttgcccagg    55560
          ctggagtgca atggtgcact ctccggctca ctgcgacctc cacctcctgg gttcaagcga    55620
          ttctcctgcc tcagcctcct gagcagctgg gattacaggc atgcaccacc atacccagct    55680
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          ccaacctcag gtgatccgcc cgccttggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc    55800
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          aggaaaggaa agcaacaagt atcccgggag gtggggttag atgtagactg aaatcaggag    55980
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          gggaggccaa ggcaggtgat gacgaggtca ggagttcgag accagcctga ccaacatgtg    56100
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          ttacctcctt cactatgggc aaccttccgc ccgccattcc cccttcttct cccttagcct    58800
          gtgttctcaa gaacttaaaa cctcttcaac tcacacctga cctaaaactt aaaagtctta    58860
          ttttcttctg caatactgct tgaccctaat acaaactcga cagtagttcc aagtggccag    58920
          agaatggcac gttcaatttg tctgtcctac aggatctaga taatttttgt tgaaaaatgg    58980
          gcaaatggtc taaggtgcct gacgtccaca cattctttta cacattggtc cctccctagt    59040
          ctctgctccc aatgtgactc gttccgaatc tttcttcttt ctctcctgtc tcttccttca    59100
          gtctccaccc caagctctga gtcctttgcg tcctcctttt ctacagattc atctgacctc    59160
          tcccctcttc cccaggctgc tcctcgctag gctgacccag gtcccaattc ttcctcagtc    59220
          tccactcccc caccctataa tccttttatc accccctcct aacatcccat ctggcttaca    59280
          gtttctttcc ttgactagcc ctcccccact tgcccaacaa tttcctctta aagaggtggc    59340
          tggagctgaa ggcatagcca aggttaatgc tcctttttct ttatccgacc tctcccaaat    59400
          cagttagcgt ttagactctt tttcatcaaa tataaaaact caaccctgtt catggcctgt    59460
          ttggcaacaa cccttagatg ctttaccacc ctagacccag aagggccaga aggccgtctt    59520
          attctcaaca tgcattttat tacccaaccc actcccgaca ttagaaaaag ctccaaaaaa    59580
          ttagattctg gccctcaatc cccacaacat gacttaatta accttgcctt caaggtgtac    59640
          aataacagag tagaggcagc caagtagcaa catatttctg agttgcaatt ccttgcctcc    59700
          actgtgagac aaaccccagc cacatctcca gcacacaaga ccttccaaat gcctgaaccg    59760
          cagtggtcag gcattcctcc aggaccgcct accccaggat cttgcttcaa gtgccagaaa    59820
          tctggccact gggccaagga atgcccgcag cccaggattc ctcctaagcc atgtcccatc    59880
          tgtgcaggac tccagtggaa atcggactgt ccaacctggc agatactccc agagcccctg    59940
          gaactttggc ccaaggctct ctgactgact ctttcccaga tcttctcggc ttagcagctg    60000
          aagaccgaca ctgctcgatt gcctcagaag ccccctggac catcacagat gctgagcttt    60060
          gggtaactct tacagtggag ggtaagtcca tcccctgttt aactgatatg ggggctaccc    60120
          actccacatt accttctctt taagggcctg tttcccttgc ctccataact gttgtgggta    60180
          ttgacagcca agcttcaaaa ccctttaaaa ctcccccact ctggtgccaa cttggacaac    60240
          attcttttat gcactctttt ttagttatcc ccacatgccc agttccctta ttaggctgag    60300
          acattttaac ctagttatct gcttccctga ttattcctgg actacagcca catctcattg    60360
          ccaaccttct tcccaaccca aagcctcctt tgcgtcttcc tctcttatcc caccttaacc    60420
          cacaatggga cacctccact ccctccctgg caactgatca aacacccatt actatcccat    60480
          taaaacctaa tcacccttac ccggctcaac gccagtatcc catcccacaa caggctttaa    60540
          ggggattgaa gtctgttatc actcgcctgc tacagcacgg gcttctaaaa cctataaact    60600
          cttcttaaaa ttctcccatt ttacctgttc aaaaaccaga caagtcttac aggttaattc    60660
          aggatctggg ccttatcaac caaattgttt tgcctatcca ccctgtggtg cccaaccccg    60720
          tacactcttt tgtcctcagt accttcctcc acaactcact attccattct tgatcttaaa    60780
          gatgcttttt tcactattcc cctacacccc ttgtcccagc ctctctttgc ttttacctga    60840
          actgaccctg acacccatca gtctcagcag cttacctggg ctgtactgcc acaaggcttc    60900
          agggacagcc ctcattactt cagccaagct ctttctcatg atttactttc cactccttcg    60960
          cttctcacct tattcaatat agtgatgacg ttcaactttg tagcccctcc tttgaatctt    61020
          ctcaacaaaa caccctcctg ctccttcaac atttattctc caagggatat aaggtatctc    61080
          cctccaaagc tcaaatttct tctccatccg ttacctacct cggcataatt cttcataaaa    61140
          acatacatgc tgtccctgcc tatcatgtcc aactgatctc tcaaacccca accccttcta    61200
          caaaacaaca actcctttcc ttcctgggca tggttggata tttttgcctt tggaaacctg    61260
          gttgtgccat cctaacaaaa ccattatata aactcacaga agcaaaccta gctgacccca    61320
          taaatcctat gtcctttccc cacttccctt tccattcctt aaaaaacagc cctaaaagct    61380
          gctcccacac tagttctccc taactcatcc caactctttt ttcattacac acagccgaag    61440
          tgcagggctg tgtggtcgga attcttacac aagagccagg actgtgcctt gtagtctttc    61500
          tgtccaaaca acttgacctt actgttttag gctagccccc acattattcc tgataccaca    61560
          cctgatcccc atgactgtat ctctctaatc cacctggcat tcactccatt tccccgtatt    61620
          tccttctttc ctgttcctca ccctgatcac acttggttta ctgatggcag gcctaattgc    61680
          cattcaccag caaaggcagg ctatgctata gtagtatctt ccacatctat ccttgaggct    61740
          accgctctgc ccccctccac tgcctctcag caagccgaac tcattgcctt aactcaagcc    61800
          ctcactcgtg caaaaggact acctgtcaat ataaactgac tctaaatatg ccttccatat    61860
          cctgcaccac aatgctgtta tatgggcaga aagaggtttc ctcactacgc aagggtcctc    61920
          catcattaat gcctctttaa taaaaactct tctcaaggct gctttacttc caaaggaagc    61980
          tggagtcgtt cactacaggg gccatcaaaa ggcatcagat cctattgctc tgggcaacgc    62040
          ttatgctgat aaggcagcta aagcagcagc tagcgttcca acttctgtcc ctcatggcca    62100
          gtttttctcc ttctcatcag tcactcccac ctactcacag actgaaactt ccacctatca    62160
          atctcttccc acataacgca aatggttctt agaccaagga aaatatctcc ttccaacctc    62220
          actggcccat tctattctat tgtcgtttca taacctcttc catgtacgtt aaaagctgct    62280
          agcccgtctc ttagaacctc tcatttcctt tccaacgtgg aaatctatcc tcaaggaaat    62340
          cacttctcag tgttccatct gctgttctac tactcctcag ggattattca ggccccctgc    62400
          cttccctaca catcaagctc ggggatttgc ccctgcccag gactggcaaa ttgactttac    62460
          tcacatgtcc cgagtcagga aactaaaata cctcttggtc tgggtagaca ctttcacttg    62520
          atgagtagag gcctttccca cagggtctga gaaggccacg tggtcatttc ttcccttctg    62580
          tcagacataa ttcctcagtt tggccttccc acctctatac agtccaataa tggaccagcc    62640
          tttactagtc aaatcgccca agcagtttct caggctcttg gtattcagtg gaaacttcat    62700
          accccttact gtcctcaatc atcaggaaac gtagaacgga ctaatggtct tttaaagaca    62760
          cacctcacca agctcagcct ccaactttaa aaggactgga cagtattttt acctcttgcc    62820
          cttctcagaa ttagagcctg tcctcaagat gttacagggt acagtcgatt tgaactttta    62880
          aatggatgca gtttcttgct cggccccaac cttgtcccag acaccagccc tctaggtgac    62940
          aatcttctag tcctcc                                                    62956
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  小鼠]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          ggcggaccgg ggctgagggg tggggccggg ggcggagctg ctggaggggg ctgctccgcg       60
          ccggggccgt tggctccaga caaataaaca tggagtccat cttccacgag aaagtgagtg      120
          tgggcgttcg gtggggagcc gtcctcggct cggcggcggg cgtggggagc agcgacgccg      180
          cttcaggaac tcaggcgggg cccgagcgcc cccatcccga cctggctggg tgaggggtgc      240
          ttcctgcctt ctccccatgg ctccgctcgt gaagcctccc gcatgcgttc ccggcaccct      300
          cgccctagaa gaccgggcgg gtagcctggg catttcgggg ggcttcaccc ggaggattag      360
          cgcgggcgtt ccttgtccac ttgccacacc ttttcgggtt tcttctctct tctctcttag      420
          ggtctagtct agcgagtcgc cttttcagca cctggcggac ccttcccaac tccacccacg      480
          ccccctaacc tgtcctctgg cagatccaac tttctctctc aactcagttc tataatggaa      540
          tgctccatgc atttagatct tgattatcca tcccacgtct ttctgcagtt gtgaccgtgg      600
          ctttcccatt aaagggcctg acacttcgga agtaaagtag gaaaccccgg agggaagtcg      660
          tcataagagt ttttattacg gggatgtttg ggttgttctc ccatttttcc ggaccaggag      720
          gccagctttg tttttaggta ttatggatag attagaatcg ttctactgtg tgatttggct      780
          tagtctcttc ctcaccttaa ttcctaagtg actacgctta aaagtattgc tgtgacatct      840
          tgagaaactg gtctatgttc gcatacaatt atcaagtcat ttgggtgttt ctcggacaac      900
          catgtttcat aatcatttta ggtttggaga gggttgctag ttgagactat tatttcgttg      960
          ggagcaaagg cctttgtttt tatcacttgt aaaggagcat tgactcatag tgtttaaaat     1020
          ccacgcacaa caaaaagaca aaaatgatgt gaatctaagg acgttgttaa atgaagtgct     1080
          cttaagaaga cattttgagt gttttggaac tggaacaagt tagtttgtga caggatttct     1140
          tgtagcccaa gttggctcca gactcccatc gtcctgtctc tgcctcctga gagctggctg     1200
          ggatgatggc cacgtgctat gactgagtga gctccccctc ccggccccct ccccacattc     1260
          atttgtaatt aattttccaa aggttttgga ataagaccca ttttaaacat gttatatttt     1320
          gaacactgta tacactgctt catgagactc ttgccattca ttctatttaa aaaaaaaagt     1380
          tactgtttgt gtgtatgtgc tggtgtggag gtcagggagg actttataaa gttctctctt     1440
          cccaacttgg tgtgagttcc gggtgtctca ggctcttagc aagcccgttt actcactgag     1500
          tcatctctag ggtgaatgaa aaaagaaatg ggaaggacat gacttttcct agggatggcg     1560
          gaggagaagg tttattaaag agatttggga gagcagagcc aggggcagac atatttggga     1620
          gaacccagag tggtcttgac cctgagggga agggagaaaa gggaaggaaa tacagcagcc     1680
          aggagccaaa gttgcaaacc atacaaaaag agggtgggta accaaaatgt atggattaca     1740
          taggcaagag ccactagggg aagggcagca tagtccatgc tctggagagt tcagggtaga     1800
          gggccgggta taccagccat accctgtaac aggagggact aagggatgct gggacaacct     1860
          ggaggccagg tccacttcca tatgttaaat aggtacctca gccactaagc ctgggattaa     1920
          aacttaacat agggcactta aacaatgcat taaaaaatta tttttggcca gcaatggtgg     1980
          tatacctgtt tttgatattt tatttattta cattttattt atttattttg gtttttcgag     2040
          acagggtttc tctgtatacc cttggctgtc ctggaactca ctttgtagat caggctggct     2100
          tcggactcag aaatccgcct gcctctgcct cctgagttct gggatcaaag gtgcacgcta     2160
          ccacgcccag ctatttacat tttaaatgtt atcccatttt ctggttcctc tctacaaact     2220
          cccaatccca tcccccccca ccctctgctt ctatgagagt acttcccccc accactcccg     2280
          cctacccgct ctggcattcc cctacactgg ggcatcaggc cttcacagga ccaagggcct     2340
          ctcctcccat tgatgcccta caaggccatc ctctgctaca gctggagcca tgggtcgctc     2400
          catgtgtact ctttggttga tggtttagtc cttgggagct ctgggtgtgg gtgtggggtc     2460
          tggttggttc atattgttgt tcttcctatg gggctgcaga ccccttcagc ttcttcagtc     2520
          ctttctctag ctcctccact ggggactctg tgctcagtcc aatggttggc tgtgagcatc     2580
          tgcttctgta tttgtcaggc acagagagag ttttaagata gccagggcta tccagagaaa     2640
          ctctgccatt aaaatccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ggtgtttgcc agggtactgt     2700
          gtgctcctag tgcccactaa agccagaaga tctggaactg gaggaactgg agttaaagag     2760
          gccacgtgag cagccacgtg ggtgtgagga attgaaccca ggtcctctgg aaaagcagcc     2820
          aatactcttt gttttgtttt gttttttgag acagggtttc tctgtatagc cctgcctgtc     2880
          ctggaactca ctctgtagac caggctggcc tcaaactcag aaatctgcct gcctctgcct     2940
          cccaagtgct gggattaaag gtgtgcgcca ccaccgccgg gctagcagcg aggactctta     3000
          actgctgagc catctctcca tctcccccaa taccttcttg acagtactgt ttctcattgg     3060
          agcagatttc agtggaggtg actactgaat tggtatatgc aaaatgctag gcttacaaag     3120
          tgcttgtgag taagcatgga agcccgagtt cagatcccag tgtgtgttgt attcaccaat     3180
          actcgaggca gggaatggac agacaagtgg gtttctgggt gctgccccgt cagtcagtcc     3240
          agctgaatgg tgagcactag actccactag aaaggtggag agcagctgag gaggacatct     3300
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          ctgcccattt ttacctctcc agcgctatag ttacagatgg gtaccgccat gcatggcttt     3660
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          tcagatcctg aggccagtat ggcaagcacc ttactgattg actaagctca gatcctgagg     3840
          ccagtatggc aagcacctta ttgattgact aagctcagat cctaaggcca gtatggcaag     3900
          caccttattg attgactaag ctcagatcct aaggccagta tggcaagcac cttattgatt     3960
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          tattgattga ttaagctcag ctcctaaggc cagtatggca agcaccttat tgattgacta     4200
          agctcagatc ctaaggccag tatggcaagc accttattga ttgactaagc tcagatccta     4260
          aggccagtat ggcaagcacc ttattgattg actaagctca gctcctaagg ccagtatggc     4320
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          attgactaag ctcagatcct aaggccagta tggcaagcac cttattgaca gaggcatctc     4440
          cccaatcctg gagacttcat ttgcctttgt cattaattta actgtatgaa gcaagtgaac     4500
          acttaatgaa gtcatagcat atttcttttt tctttttttt agatttcttt ttttaagcat     4560
          ttattactat atataagtac actgtagctg tcttcagaca caccagagga gcatcagatg     4620
          tcattacgga tggttgtgag ccaccatgtg ggtgctggga tttgaaccca ggatctccag     4680
          aagagcagtt ggagctctta actgctgagc catctctcca gcccgccata gcatatttca     4740
          agagaatgta cctgtgactg tagaagagac cagactggga atatttaaca taattgctat     4800
          tttccagaga attcttttcc cttccataac ttgcctttaa ccagtaaatt aactagagaa     4860
          gatatcaacc actttctcat ggagttaatt ttacacttaa cccctttgaa tgcttccttt     4920
          taaattagac ataaaagcag ttgtcagcca ggcatgatag catatgcctt taatcctagt     4980
          acttgggagg cagaggcaag caggctcctt ttgtgatttt tttttagatt atttggaaga     5040
          gtggaagtgt agtgtgttca tcttctgagc ctagcacagt aaaatgtgga ttccccaact     5100
          catagaattt taatagcaaa gagagtttct cttgtgtgaa atagaaaagt gttttattat     5160
          attgtatcgc atatgtatgt aggggttctc catgcatgcc actgtgtaca tacggaggtc     5220
          aaaggacggg ttgcaggggt tggtcctctc ctcccactgt gcgggtcctt aggtctgcat     5280
          ggtcacagcc ttttggttcg tgtagaattt ttttttcccc cgagacaggg tttctctgtg     5340
          tagccctggc tgccctggaa ctcactctgt agaccaggct ggccttgaac tcagaaatcc     5400
          gcctgcctct gcctcccgag tgctgggatt aaaggcgtgc gccatcacac ccggcttcga     5460
          gtagaatttg acagcctgtg gctctatgat ttttaaattg acttgaacaa tttgttgttt     5520
          ccgtccatta atcatatcag aagcagtacc attttacttg gtcagggctt cattttaagt     5580
          gcttattttt cataataaaa aagctacttg ttttagagac tgaatgtagc acatttggta     5640
          gagtgcttgc cttgcgtgaa taaagcttaa attctatcca ttcccaatac acatgaattg     5700
          ggcataatga gataggtact tttgattttt ttaaagattt aattattttt atgtgtatga     5760
          gtatcttcat gaatcaagtg caccatgcgc agacagtgac tgaggaagcc aggagagggt     5820
          gccagatcct ttaggactgc agttactaac tagtcatgag cccctctgta gattctgggg     5880
          acagaaccca ggtcctttgc aaggatatca agtgttctta actccatctc tccagcctcc     5940
          aaattccaat tattaataac aagaatgttt tatcaaaaca ctggatgcca ttatttctgt     6000
          atgttaaagc tggtgaccag gagctcagtg gttataagca ctggctgctg tggacccagg     6060
          gtccccagca cccatctgat gacttaaaac tgtctgcaac tccagtctta gaaggtccag     6120
          catcgtcttt tggccttcgt agacactagg catgtacatg gtgcagacac acatacaagc     6180
          aaaacaccta tacacataaa aaccatagtt tatgaccccc acactgaagc atattgccta     6240
          gcaataggac tgaggagtca tcatagctgg tccccaagtt gagtgcctgg ttaccatgtt     6300
          agatagttgt tgatttcctt ctttctttct ttctttcttt ctttcttttt tttttttttt     6360
          tgtctttttt tcaagacagc gtttctctgt atagccctgg ctgtcgtgga actcactctg     6420
          tagaccaggc tgtcctcgaa ctcagaaatc cacctgcctc tgcctcccaa gtgctgggat     6480
          taaaggcgtg cgccaccacc gcccggttgt tgatttgaga caaggtctca ctatgtaggt     6540
          aacaggccag gaactcacag gagtattctt gcctctgctt cctgagtact gggattaaag     6600
          ttgttactgc catgcccggc cctcttcttt gaatgtttta aatcaagcat ttcacataca     6660
          agaacacaca aattatgaga atgtgcagtt gagggagcac acatggaaac agcccttggg     6720
          tgaagtcaca gactgtttcc ctgaatcctc gacaccccct gtcctttctt ccagctcttc     6780
          ctcagtgctt acttctacaa gaaaaatctg acttcctaga ctgagattaa tttcccctat     6840
          ttaaagcttt tgtaaaaaaa ccatgtaagt ctttaactcc ggcatttggg aggcagagcc     6900
          aggtggatct ctgagttcga ggccagctta gtctacagag tgagttccag gttagctagg     6960
          ctccacagag ggaggttggg ggaaaagaaa aaagaaaaga aaaggaaaaa aacatggcat     7020
          gcacttaaat tttttactac tgtgtatctc tgcttgatat gttgtatgag tggacacata     7080
          caccaaagtt ctgtatagag atcaaagggg agctttgtgg aattcccttc cactttggag     7140
          tcagttccag gcataggact caggtcttcc ctagggtcct ctcatccacc ccatcctgca     7200
          ctttaactgt ctttgattgg tgatagtttt ggggattgaa cccaggtcct tgtacagact     7260
          agctccatcc ttagctctgg tgtctactct tttgagtgtt gtgtgttttt tactttttaa     7320
          cagtgtttga gagattcatc catattgtta tagttgtgtt taatttactt ttattcttat     7380
          agtgttcttt tgttattgta attctgtgtt caaactgtct ttgggtgctt tccagtttgg     7440
          aaagcctgta agtagtgctg tagtgagtgc atcggcagtg tgtctaatca cagcacacag     7500
          cgttaagctt tggtaacgac tgaggattgt tgtagagttg gttcactact ttatactcgc     7560
          tcctgtaacg atggctttct gtcattctaa gcctcccact gtaatagctg ttttggagac     7620
          tgtagcagta acaccatgtg agtgtttctt ttgtaaaagt actttttttt cttagctagg     7680
          tgtggtggtt gtattattag tcagggttct ctagagtcac aaaacttacg gaatatcctt     7740
          ttatgttgag ggattttatt gtaatgactt acagtctgta gtccaactaa cccaacagtg     7800
          gtcagctgtg aatggaagtc caagaatcta gtagttgctc agtcccacga tgctagttgt     7860
          ttcagctggt cttctgtaga agtagattcc aacagatgtg ctgactagta agtgcaagca     7920
          ggcatagaag aatgaaactt ccttttaatg tccttaggta ggccttctgc agaaggtgtg     7980
          gcccagatta aaggtgtgta acacctgcct agatctggga cttactttgt ctcaggctga     8040
          ccttgaactc agagatcttc cctcagtctc ctggggttaa aggcaagtat taccgtgcct     8100
          gaccactatg cctcaagatc tccatgtcaa gatccaggtc agaaacttgt gtcttttggc     8160
          ctcaagatct ggatcacagg ttagccctcc aattctgaat tgtaactcat ttcagatata     8220
          gtcaagttga caaccaggaa taaccattac ggtggtgtgc acctttaatc ggagcactca     8280
          gagtcagaag caaacagatt tatctgaatt tgaggccatc gtggtttaca tagtgagttc     8340
          caggctagct agagctactt attgagacct tgtctcaaaa ccaagtgagt gcaggcctac     8400
          acgtggctag gtgtgcatgt ggggacaggt actcaggagc cagctctgtc tttctacagt     8460
          agtattgggg attgacagca ggccctgtta cctgctgagc catcttctgt tgtagtttgg     8520
          tatacatttc cctgatgact aatgaagttg agcatctttt tgtatctctt agccactaga     8580
          ctatcttgtg aaatgattac atttccacta gaatataagt agaacatctg tctgtcctta     8640
          cctcatagta attggtattc agtggaagtt gcttctagta aatcaacatt aaaggaggca     8700
          aagaattctg aggataagtt gttctagctc tctgtcagac tcaagctctc tgaactctcc     8760
          cttcctggtc catagcagac aggtatgcta tatctacttc agcaattaca ttttgtttct     8820
          gtaggagtga tacattggtg tgtgtgtgtg tgtttggggg gatgcatctt gcaggtgctc     8880
          tctggagtca tcatctgcca tgtaacatag ctcaggccag ggggcatgtt gtcaggcagg     8940
          ttgagttcag taggcctcac tggcccttta gagggccaga gttaacagaa ggaagtgttt     9000
          tcccatctgc ctttgccttc cgaaaggcag agttagggtc tgtgtccaca ggactcatct     9060
          actcatgtgt ctcgttcttt ggaaagcaat actgttggtc caggagaatg acaagcaagc     9120
          tgcccactat caggcagtct ggatatagag ctggactggg tgccagttgt gtatgaaagg     9180
          cagctagcca gtgcaagaag cccctggacc tatgggacat tgtgtccacc cgtcatgggg     9240
          aggatgttaa tgacccctta gggagctgaa gttggctgca gttcctctta ctgctgtcta     9300
          ctcgtggaca tggacttggg gctgttgaga gcctctgctc tagaactgtg ggccttaact     9360
          taaagtgaga caggattgtt ctcgcttacc cagttcttga atttgaaagg acaggctttt     9420
          aaggtcaaac agcaaccatc ttgtcacaag aatgaatgtt ctagaggttt atgctccctt     9480
          tttgcagtag taatttgctg tggaatttct aaaggtaaat tctaataggt actgaaaaat     9540
          tcaaagggta aatgttttta taggttaatt tttaggttta tgtgattgga tagatgaatt     9600
          atactgtaaa ccgttcttca tttttgttcc taaagtagct gtagaatata catgggcaag     9660
          gaaaatgtat gtgcttgtga aatctggttt gcatggggct tacaaagttt gttttgactg     9720
          ccttaaaaag ttagtaatta cattttttag gagatattgt acagatcggc ttgatgacat     9780
          ttgaatgttt tcttttggaa acactagcaa gaaggctcac tttgtgctca gcattgcctg     9840
          aataacctat tgcaaggaga gtattttagc cctgtggagc tatcctcaat tgcacaccag     9900
          ctggatgaag aggagaggct gagaatggca gaagggggag tcactagtga agactaccgc     9960
          acatttttac aggtactgat tttcgactca ctgagcccca ttttattgtg gaaatgcggg    10020
          tgctctttag aggaggatga gccgttctcc cccaggagtc tgactcggta attatcactc    10080
          tgctcctcct cacttgggaa atggggttgt acagcgtgtt cttttaaacg tgcacactaa    10140
          ttttaaccct tttcccatcc ccctctgccc acaactactg cccatgaaaa ttgaacagca    10200
          gccttctgga aatatggatg acagcggctt tttctctatt caagtaagta gtccagagtg    10260
          cagcgctgcc tcatttccag ccccgctttg tcctgaggct cagttgtggt tgatgtgcca    10320
          cagtgtgcca cagctcttta tgtaacgatg gaggcttctg cagctccttc tgtaaactgt    10380
          ctgcagaaga taagacactg cagagtgcta cacgtacaga gatgaccaca ggacagtaga    10440
          ctcttcactt tagaacggct ttgactgctc acatgcttag gacaggcagg cccttgctgc    10500
          ctatacagtc ctcgctggtc tgagacttgt gatcgtcttc ccctctgtgt ctccagactg    10560
          aaattatagg tgtgtgctac cacagtcagt ttagagtggg gcttttaaaa attactttct    10620
          aagagagatt gcttaatttg catgtaggtg ctaataactc taataaattt cagtgcttca    10680
          aactccccat ctctggcatg tctgagaaat tgcagtgtct tgcagtcttc tatttaaatc    10740
          atcctccagg attggattcc tgttgggtag gttgtagccc tctgaaggct ggtatggaga    10800
          ttgccctcaa ggccttgcat gtgccgagct caaactgacc ccgagccaca tcccagtact    10860
          ttacgttcta tttatctgtg ttggtttatt ctttttagtg ctggggatga tatctaagac    10920
          aatattctgc tctagagaaa atctccagcc ctgtggttat acatacatac atacatacat    10980
          acatacatac atgcatgcat atacgtgtgt gtgtctgtgt ctgtccttct gtagcctagc    11040
          atggcatggc cttgaacaaa gccctgctgc ggcatcccag ttgttggggt tgaagtctgg    11100
          gcacggatgc ctgacttcgt ttgtgtactt gtgaagtcca ttctgacaat gtgagcgttg    11160
          tccaaattct ttctgaatct gtcttttgag agatctactt atgcaagtgt ctttctttat    11220
          actttccttc tatgccaccc ttctagagtc ctcattctct agcatttcca cccagtactt    11280
          cacttgtgac attgtgaggc ccagtgggct tgtgctgaga gtacaggtga gagccagcag    11340
          tctcctgtgg tgtcctgtgt ggcactgctt ccatctctgc tctctcgcac ttgcagttgg    11400
          tctgagttgt acatgtttct ttgttgactt cctgggataa caggtggaat gttgtcttaa    11460
          tttctctctt tttttttttc agcttgctat catcaggttt gattttctgt tcatggaagt    11520
          ttaaaataca tcaaaccttc tttttaaaga tttatgtgcc catgtgtgga tatgtgcaca    11580
          tgagtgctgg tgtctgtgga ggacagaaga gggcactgga accctgcagt tgacattaca    11640
          ggctgttggg agccctgacg tgggtgctgg gaactgagct tgggttctgt aagagcagtg    11700
          tatactgttg accacagtca tctccccagt gcccagacct ttcttttcaa cccccaggga    11760
          gaatttattt actatacacc tttggtgact gccattgcag gtagtaagtg taggaaggga    11820
          tagttttaca aacagcaccc acagtgtggc gtgcttctgg atgtgtgaga cagtgttatc    11880
          tacaaattct ctgcttttct gacattcctc agaatggaaa agctctcttt caaaatggat    11940
          gtgaggggct ggagagatgg cttccgttta agaatgctta atggtatttc agaagaagac    12000
          cggctcagtt cccagcatgt acgatagact gcttacaact gcctgtagct cctacatgga    12060
          cacctgatgc cgtctggcct ccacaggcac tcagacacac ttagataaaa aataataaaa    12120
          caatacatct ttaaaacttg caatgaaata aaattaagtt cacatgtata tattatttat    12180
          ggatttagtg gggtgtcaag ggaacataat ttgtaaaagc tatatcctca aactatatat    12240
          gaagaatagt tgcttatagt agctgtgcta cttaaacttg gacttgaagg tttagctcat    12300
          gaaaagttgt tatttttctt ttgacaggtt ataagcaatg ctttgaaagt ttggggttta    12360
          gaactaatcc tgttcaacag tccagagtac cagaggctca gaattgatcc tatgtaagat    12420
          tttttcctat atttctttat ttagatttga tttttaaagc tgtaatttct gaatgaggac    12480
          aaaatcatca tgaatgtctt tgctttattc tgtatttgat gcccttagac ttcaccccgt    12540
          cacctttttg gtgcctttct tcagtgtcag tggtggccct gccctgagtc ctgtgggggc    12600
          tttgtgctta gcatcactaa gctcctatgg gagacgcata gtgatgcgac ttttattttt    12660
          tcaaataagt aattaagtat taataagtaa ttaagtatgt cattaagtaa atgataggag    12720
          atacttgcta gtacatctct actatcccaa cttaacagta tatgttttgt tttcttctag    12780
          aaacgaaaga tcctttatat gcaattataa agaacactgg tttacagtta gaaaattagg    12840
          caagcaggta atatatcttc tattttcttg tccttttatc ataatctgta ctctgtttga    12900
          aactaaaatt tgatattggt ctctttggaa tgtatcctag gattctgtgc actctaccca    12960
          agtctggact caatttaaca gataaaaatt tcctagctta agagaagata atcatcttct    13020
          cttcagattt ttaaaaataa acctatatat gttatgtcat aatgaaaatt ttgtagtaaa    13080
          aacagtgcat atgtggttac cgttacatat gtttttgtgt gacgatttgt gtttagcata    13140
          gtactacaac aaagcctgag atcatggtgg gaatgcgcat tacgggatgg gcttctttag    13200
          gcgattctag tgtctggcag tacttacatc tgtgcacagt taccactgaa cgtggcttta    13260
          aactagtcac gtaaggcctt actagaatgt tagagcttgc taaaggttat tgaaaaccag    13320
          cttatatagt caaagggaat gaactgctaa tatactcgca gcgtggatga atctcagaaa    13380
          tgggagctaa gacctaatga cagaaagtag accgactagt gcttgtgtag ggctgaagtt    13440
          ggagagaagg cacagaggga cctggagacg ggactctgat gagggtgctc cagtctcggt    13500
          catgttgatg tgggtgatag agattctttg aaacgacaaa ctgtagaagt ggaaatataa    13560
          ttatgtgcag ttttatccca gtgctgtggc ccacaccttt gacctaggaa gaccttgaga    13620
          ccagcctgga ccacataatg aaaccctcaa gagagatggg ggagcgggaa ggcactttat    13680
          gtgccctagt aaaactgtta tttaaaataa aaagaaaggg gctggagaaa tggctcattg    13740
          gttaagagca ctgactgctc tccagaggtc ctgagttcaa ttcccagcaa ccacatggtg    13800
          gctcacaacc atctgtaatg ggatccaatg ccctcttctg gtgtgtctga ggacagctac    13860
          agtaaactca tataaattaa gtaaatgact taaaaaaaaa agaaatataa aagattatta    13920
          aaaaatataa aaaaaaaatg tcgagtgtgg tggtgcacat ctttaatccc agcagagatc    13980
          tctgtgagct caaccaaagc ttcagagtga gaccctgtgt ttaaaaatcc aacaataaat    14040
          aagaaacaga acattgaacc tggagatgtg gctcagcgag tatgacttta ctgctctctc    14100
          agaggacctg agtttggttc ccagcaccca cgtggtggct tataactgtc tataactcca    14160
          gctctgtgga ggaggtgcct ttgggcacca agcacacaca tgatgcacat acatacatac    14220
          atacatacac acacacacac acacacacac acacacacac aaaattaata tattaaaaag    14280
          aaagaataca gtgagttaaa tcaatatata ttaattatat attatgtata tatatgtata    14340
          ttgatttaat tcactgtgtt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt    14400
          ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctgttagc ttttaattca gtcacctgga    14460
          aggagccagt cttcagtgat tgtttgctga tatagatcat tggcagtgat atacttataa    14520
          taagcacaag accctaagat tccacctctt gctccagaac aataaggaaa gagcaatctt    14580
          taggttcttt gtaagctgca tagggagcca gttaagagcg gtgtgtatag taaggtagct    14640
          tagctggaac aggaatcaat tatgaaaggt ccagggtcaa cttcatttaa cttctctgcc    14700
          cttctccctt gtagccactg agggtttatt tgtgccttta gaaaattatg acccagggct    14760
          ggagaggtgg ctcagtggtt aagagcgtgg actgcttttc cagaggttct aagttcaatt    14820
          tccagcaacc atatggtggc ttacaacatc tgtaataggg tctgatgccc tcttctggtg    14880
          tgaagacagc tacagtgtac tcatataact taaataaatc tttttaaaaa gaaaaaagaa    14940
          aattatcacc cagcattatt ttcctgtatc aagtaatcac tggagtttta aggtctggaa    15000
          atttaaaacc cataaaaact tagtagaaat aggaaaacat tgttttgaac ttttacaatt    15060
          tttagctcat ttttggattt tttacatttt gaactagttt tagtttgtct ttgacaggta    15120
          caaagatagc aagaatatgt atattgatcc ttgattctga ttcctattct tgtttaagaa    15180
          cagagtttta gctggatgtg atggcacgtc tttaatccca gcactcagga gggcttggct    15240
          gatctgtgag ttctgagccc agcccctggt cctgtgtaaa gaaaggaatg attggaaagg    15300
          ttctttggct ggggtcagaa tccaggaaga gcccttagtt gtgcatggag ttgagcatga    15360
          ctttttgcat ttttctgttt taagttaggg cacctctgag gttgtgactt acctaatgct    15420
          gttaatcaca tgtagcaata gcttagaggt cttgttagaa tgaagtgctc gtcataaatt    15480
          ctctccgtag agtgtctttt agaaattgga gtcttttggc caaaggaaaa agtgtgttgc    15540
          tgtcattttt ttgtctgtca atatggcagg agtctgtgtg ttggcctgac agtgtaaaac    15600
          ctcttagtta cagctatcaa aaagggcatc ttaagatact gccagttgct ctccttttag    15660
          aagttcaggt tcttgttttt agaaaagcat ttaatagtga caaatgttca gctttttttt    15720
          tttttttttt ggtttttcaa gacagggttt ctctgtatag ctctggctgt cctggaactc    15780
          actctgtaga ccaggctgtc ctcgaactca gaaatccttc tgcctctgcc tcccgagtgc    15840
          tgggattaaa ggcatgcgcc accgcgcccg gcttcagcct tttttttaaa gtcatagtat    15900
          tcagtacttt aaaaattctc agtttgatat atttctatta tttctatagt cttattaaat    15960
          tttggtgggt tatatgcata acatgggaaa ttctttttac atataatatt cattaactta    16020
          aatactgatt tttttttcct agtggtttaa cttgaattct ctgttgacgg gtccagaatt    16080
          aatatcagat acatacctcg cactattctt ggctcaatta cagcaagaag gtaaataaga    16140
          tcaaaagttt gcttttaaac tttaaaagta gcttaaatat agctgagtca tgaattgtga    16200
          ctacagaagc actggtctcc gatttgtgag tgtgacggta ctgatttctg gctgtggttt    16260
          gagtgacgca gttctatgtg agtgctccct acactgggac atcccctgag cctggggctt    16320
          cctttccatt cctaagtgct cttttgcttt tccgtcctcc ccctcacagg gctcacagga    16380
          ggaggggcat gctcctctca ttcctgttgg ctcattttca gtcactgttc acttggtaga    16440
          ttggtgcctt tgagtaacca cctggattcg ccatgccttg tctgtgtagg catctgtgag    16500
          ctgccatttt tattggagag tttggatgtc tagttatctg tctcttttcc ttaaattctt    16560
          agtcatttcc acaccagtaa ctattcctct ttcaaagatt gttttgttca ctcttgtctt    16620
          ggcattgcca atgagtgtaa ctcccttcag attctagtca taagcatcgc agtctttgac    16680
          catcaccttc taccttcatg acagtttgct gttccgacca ggctctgaag ttaccatgag    16740
          atccagaact cctcttaaat gattcttcaa ggtgttttgt tttgttttgt taccatgaga    16800
          tccagaactc ctcttatatg attcttcaag gtgttttgtt ttgtttttgt ttttttgaga    16860
          caaggtttct ctatgtaaaa gagccctggc tatcctggaa ctcactttgt agaccaagct    16920
          gccttgaact cggagacctg cctgcctctg cctcctgagt gctgggttta aaggcacgca    16980
          ccaccatgcc tggtgattgt tttctttttt taaagatttt aaaaaattta ttttatgtga    17040
          taagatgttt gcctgcatga ttctgtgtac actacaagca tgcagttctc aaaaaggcca    17100
          gaagagggtt ttgggagtct tggaaatgga ttcacagaca gttgtgagtc accacggtgg    17160
          gtgcttggac tagaacctgg gacctctgca agagcagcca gtgctcttag ctctgagcca    17220
          tctctccagt ccctgagcct gtgttcagtt gcattcgctg gcttctttcc tcatctttcc    17280
          taaataacaa gaatcttgac cacaggtaaa gtagctcgtg accctagacg tttcctgtat    17340
          catagcagct gaacatggct tcaaacttag gtgaaatatg ttggttataa ttttgtgctt    17400
          acagctttca aatgacccct tgatagttat ttcacaactt agctctccat ttgttacaca    17460
          ttgctattct ttctggcttt ctcttgtatt cttctgagaa catagacatg attccctttc    17520
          tggtagcaga tctctctctt tgtttctgta gcttgtggtt tgagcctatt aaaataggtg    17580
          ggcgtggccc tccgtgtaag gtcagccctt caacatgtac tgtatccctg tggctcctgt    17640
          tcagtcaaca ttcagttttt gtctaatgct ctcctgggtt gaacattctc ccactccctt    17700
          aaaaaaagtc tatgcatggg taaaaatccc tttccctccc cctccattga ttaaaaataa    17760
          agtgcttttg gtaactatga aactttagct gcttgcccat ttaaattttt tccagtagaa    17820
          ttatctatag tgcattgtct attgaactca ttccacttgg gttgtgctgt aaaccactca    17880
          tcttcaaaag tctctcttct cactatccgg gtgacttcta cattgccagt gccaggattc    17940
          aattcttaga tctcctagtc taaacagaac acaataaact tgttattaaa aaacaaacag    18000
          ggctggtgag atggctcagt gggtaagagc acctgactgc tcttccgaag gtcctgagtt    18060
          caaatcccag caaccacatg gtggctcaca accatccgta acgagatctg gcgccctctt    18120
          ctggagtgtc tgaagacagc tacagtgtac ttacatacaa taaataaata aatctttaaa    18180
          aaaaaaaaac aaaaaaaaaa acaaacaaac gaacaaacat cccaaactaa aaacagatat    18240
          aaaaggcgag gaagtgatgt gccttcctgt gcccttcccc tcatggcctg ttcctttata    18300
          ccttgtccac ttaaggctct aaaagtaaat tctgtttgtt tgtttattta ttaaaaacta    18360
          cacactggca ctatgattat acctaaaagt gttgcacttt ctggtgatgg ggattggaaa    18420
          tcccagttgt gcgtatgtga tgcagagctc cactctgctt tgtatcccca gctggctagc    18480
          cacagagctg tgatgtcaca gatacacagc tttaagttcc gtatccctca cctctgatga    18540
          tttctttcac acgttaatct gagttgaaat caggttcaat aattgtattg ggttagttgt    18600
          ttgttttttt tcctaaatct tcttataagt ttccttgtct ctgttttttg cctttgatgt    18660
          atttgccagt gttttgtcag ggggatattg ggttgtttgc ctgtttactg catcttggtt    18720
          tttttcttgt gtattttctg actgctggat gctctatagt gcctggacct gagatgtagg    18780
          tacttaacca tgctcaagct ggtttgggaa ttgtcttagt cagggtttct atttctgcac    18840
          aaacatcatg accaagcagc aagttgggga ggaaagggtt tattcagctt acccttccat    18900
          caccaaagga agtcaggact ggaactcaag caggtcagga agcaggagct gatgcagagg    18960
          ccatggaggg atgttcttta ctggcttgct tcccctggct tgctcagctt gctctcttat    19020
          agaacccagg actacaagcc agggatggta ccacccacaa tgggcccgcc cgccttgatc    19080
          accaaccaag ataacacagt ggccttactt gtgggcatct gcctgtctca ccagttgctg    19140
          cttttgagga tcatccttct cttcccagtg tgtaacgttg gggtgacctg ggctcagttc    19200
          agcttcttcc ttaggtgcca tttcattgct tcaatcacag cctatgatct gtgctcccat    19260
          aattctcaga atttgttctt tagcctagac atttcctttg gaacaccttt gtgtggcagc    19320
          tcaggaagat ttcaaatcaa acaggtccac aaaagacatt taaaatgttt attttaatat    19380
          ttaacgcgta tgagtgtttt atttatgtgt gtgcctggtc cccatggaag ccagaaaagg    19440
          gcatcatcgg atcccttgga actggagttg cagatggttg tgggctgcca tgcaagtgct    19500
          aggaatcaca tgtgaatcct ctgcaagagc agcgagcgct gttaacctct gcaccatccc    19560
          tcagagtggc ttacccactg agccatctca ccagccccac agagtacttt tataaaaaca    19620
          aaatgtatat tatgccatac ccttacatta cctgttagtg gtttcctcga acactcaaaa    19680
          taaattccaa agttgtaaat aaaatccaga attactatgc tgtttgtata aggcaggata    19740
          tcttctcagg acgtgttcac taggtaccat agtgagctgg catgctgatt ctaggattta    19800
          gaaacagttt tgttagcaga aaacagatta agacatctga actctgatta agcttgttct    19860
          taaaaaatgt taaacatagc cgggcgtggt agcgcacgcc tttaatccca gcactgggga    19920
          ggcagaggca ggcggatttc tgagttcaag gccagcctgg tctacagagt gagttccagg    19980
          acagccaggg ctacacagag aaaccctgtc tcaaaaaacc taaaaaaaaa aaaatgttaa    20040
          acatattctt tttagtgagc agccttctca ttctttgttt cattgaagta caagaaaaat    20100
          caatagtaga aaatgttttt aaaaaattaa acttaattgt ggttgagaaa gcttagctta    20160
          ttaggtatgt atttattaaa agttgctttg tactagtgta tttttttttt ctttctaaac    20220
          cacaaggcac acaaactaga ttagggtact ggcttcccag ctcctgtttt tggttagaag    20280
          gcatctatgt atggggcagt gagcagggtg ccatttccag catgttttcc agtgatttgt    20340
          ccattttagc agtcactgga catactaacc aagtgtgtct tcacaccagc catgtgaggg    20400
          aggttccttt atcctccttc aacaaagggt gccagcagag atgggtgaga tagttgacaa    20460
          aaccctgtgg caccggcagg tggcagagct aggctaaaac gcaggcagtc aattccggat    20520
          cctcctcttt agactgtgtt caggctctgc cctcctaggg accttgtaga ctgcctttgt    20580
          ttcttgtagc ccctgaggct tcgagatgag aagagtgatc ctgtgtgact taccgtagat    20640
          taccttccta atccaagcga gagtcggcac taaatcaggt cttctgtttt tcctactgtg    20700
          ctctttctgt cagctatcat ttcaaacaag tttgaattct ttactagttg ttttagtttg    20760
          tttttgcctc tttttaggtt attctatatt tgttgttaag ggtgatctgc cagattgtga    20820
          agctgaccaa cttttgcaga tgatcaaggt ccaacagatg catcgaccaa aacttattgg    20880
          agaggaactt gcacatctga aagagcagag gtaaaactac gcgtgagtgt ggcgtgtatg    20940
          gtggagcacc ccttagaaga gttaaaggtc catgcgtcca ttccttgtgt ctgtgagtgc    21000
          atgcacatga ttgtgagctg tgtgatgtgg gggctgggaa ccgaacttgg ccctttggag    21060
          agcaggacgt atttgaaccc tgagccatct ccctgccatt taatgtgtga tcactttacc    21120
          gttggtgatt tgggtaattt gtattttgtg catttctttt gtagtgctgg agatcagcct    21180
          cttgttcata ctaataaatg ttctattcag tttatgttca atctcctggg tttgttttgt    21240
          attgttttgt cgagacaggg tttctctgta tagtcctggc tgtcctggaa ctcactctgt    21300
          agaccaggct ggcctcgaac tcagagatcc gcctgcctct gcctcccaag tgttgggatt    21360
          aaaggcatgt gccaccatgc ccagccttca atctcctatt tttatttatt tgtttattaa    21420
          ttttttttga tcattttatt tatatgaaca cacttggatg gagggctggg agtttgcgcg    21480
          tatttaattt taagtattta tttgacaatt ttatacatgt gtataaatgt tttcattatg    21540
          tcgtccctca ctaccctctt ttatcccctg tctgttccct ctgaatccct cccagcaggt    21600
          ccgcttccta tgctcattgc tatttcttct cttccttctc ctcctcctcc tcttccttcc    21660
          cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctctt ccttcccctc ctccttctcc tcctcctcct    21720
          ccttcccctc ctccttctct ttctcctcct ccttctcctc cccctcctct tcctcctcct    21780
          cttttttcat cccttctttc tcctcccctt ctttctcctc ctccttctct tcttcctctt    21840
          cctcctcctt ttctccttcc tgactcactg aggtttgctt acacagccag cctaccagtg    21900
          gttgtcccat tgaagaaaag ttactccccc tcccttagca gccatagctc ttcagctagg    21960
          catagggacc tctgagtact ccctatccat gctggaatgt tgatgaattg ttcttgtgca    22020
          ggttttgtgc tggtaactat agctgctgtg agtttatgag agcaacagac atattatagt    22080
          gagaaaataa cacggcagca tttcttccta atctcctgct cttacatcct ttctccctgc    22140
          tcttccgtga agttccttga gccttagagg gatgatagag atgtcccatc taagtctggg    22200
          catttagcgg tcacttattc taaaacactt tgaatagttc tgctatttgc taggggagag    22260
          ggcagctttt cagcccaaac actaacctgt aggtctaact ctatttagaa gggtgattga    22320
          catgtctgtt tattgaaact gcagtagttg tttcccctac cgaggacctg tgaccaacat    22380
          agccatggac ttttgaccaa gtttatggta ccaggtcata cctacagaac tacctaatgt    22440
          ggagtggccc tcaaatccag taaaacgatg gttgggccag gcctggtggc acacctttaa    22500
          tcccagtact tgggagacaa aagcaggtag atctctctga gtttgaagcc aaccagctct    22560
          actgagttct aggacagcca gagctagata atagagagac actgtctcaa ataaataaaa    22620
          aagaaagaga agaaaaagtg gttgtttgcc ccataatagt cacgtcactc ttgtgtagca    22680
          gaagaatatt acagcatcac atgggctggt ttagactatt agtgattttc ccctccagca    22740
          gcctttgtag aatctttcag cactgtgaaa gcttgtcagc aaggtggaat cttctagcgc    22800
          agttccagct tggtttctgt tatgtaacca aagtgttaca taaccaacat ctctgccaat    22860
          taggtcttac tatttagttc tggtgggaaa ctaagaacga tgtctgcaaa gaagcagctt    22920
          ttctctgagt ggcactagtc tataggtctg atgtgcttag aatgcagttt gacatggtca    22980
          catactattt gaggagcctc tgtatttgtt tgcttcttga tataagatct caagtagctc    23040
          caactggctg ggagtacata tgtttgtgcc tccatgtttt atttatggtg atggaaactg    23100
          aactcagggg attgtgaatg ctatgcacat attcttccca ctgcatttca tctccagcgc    23160
          ttacctcccc caaccaaaat gatttagtgt caagtgatta tttgtagtgt tttggctcta    23220
          atcctgcatt ttatgcatat actcttatca ttgaacagtt ccttagtccc ttccctgttc    23280
          ccttctgttg aaagacaggt ctcattaagt tgtccagtta tcaaacttga catccttctg    23340
          tctttggctc aaaagtagct gatactcaac aagcatatgc cactctgccc agggaggctg    23400
          tgttttagtg aagtttatag aatcaacact ttgaattcct agaatacatt aggtttttat    23460
          cagcactcag ttgttgttag tagaccttat ctaatagagc atgttttcca tttaaaatct    23520
          ttcatttgca agtgccttca tgtttatcag acttgatcta aagttgaaga atactggact    23580
          agagagatgg cttggtggtt aagaggactg gctactttct agaggacctg ggtttggttc    23640
          tcggcaccca cctgctcgct cacgaccttc tgtctccagt gtcatcggat ccagcaccct    23700
          cttctggcct cctcaggcac tacacacaca ttgtgcaaga catacatgca aacaaaatat    23760
          ccgtgcatat tggttagatt tttgagacag gatttctagg ctgtaattac tatgaattca    23820
          tttgttgttt agtgccctca aagcagacct ggagcgcgtc ttagaagcag ctgatgggtc    23880
          gggcatattt gatgaagatg aggatgattt acagagggct ctagccataa gtcgccagga    23940
          aatcgacatg gaggatgaag aagctgatct ccgcagggcc attcagctca gtatgcaagg    24000
          tttggacatg ttgatgtgta ctttagtcat ttttggagaa gtggatcacg tccttaacgt    24060
          ttctgaaagt tagtgcactt ttggaagttc tttgatagtt actgcaaaag caatagctcc    24120
          aaactttgag catttcttta agattttctt gatcttaaat cattttttta taacttgcat    24180
          tatactagga ctgtattgtg tttaacacat ttaccatttt ggttgtggtt atgctgttga    24240
          gtatgatact gagccaatac aacactaatt taattacttt tctagtgacc agatgcccct    24300
          tacccaagcc agctgtttta ataaattcac acagcactta ctggctataa agacttatat    24360
          agactataca gattaagact ccagccatgt cacaggatgc atctttttca ttgatgtaag    24420
          cgctcatcat cagtggagga aagggaaggc aaagcccctt agggtaggca gagaaaagtg    24480
          ctgagacact caaagccgtt cctgagagca caaagcactt tatttttgtg attttgtttt    24540
          aatctaattc gtatgaagct gtttctactt ctaatgaggt tgctcatcat ctaaattcct    24600
          caaaggtctt agtgtactga ggttttgtta tgatggccat tatcgttatc ctagactcct    24660
          cacctccagg ctcacctctg catactcttg tggtgtgaag tcccatgtta tattaggagg    24720
          ggcttgttgg gttattgaag taataaacag aaaaccatct taccattttc acaatttaca    24780
          tagaatctgt gcttggtaca attactgttg agagcttaga aacattcaag ttgttaaaaa    24840
          cagatgttat ggtcatcctt caaaggttgt gaggaatgcc ttgcctttga aggtggagat    24900
          gcaagttaaa gagcacagaa gtgtggtctt gatacttctt atacgaggtg aacagagagc    24960
          ttgtatcctc acatctgatg catcacagat cgcatcagcc ttgcttgcag taacacattg    25020
          aattgtaagt ccttaattag atttctaaga cttccatagg ctttttaaag ttacagaaca    25080
          gtagtggaat gttttaaaac tttctagaag cttgctccta taagaacaaa catactactg    25140
          cttgtacagg tatataaaat aattttttgt gtttgttttt aggtagttcc agaagtatgt    25200
          gtgaaaatag tccacagaca tcaagtccag atctctcttc agaagagctg cggaggagac    25260
          gagaagccta ctttgaaaag taaagtagtt ggtacagatt aaagttgcat atttaatacc    25320
          tgctgatttt gtctgtttat aaattactgc ttaccgcctg aacctatgaa cgtaagaata    25380
          tattttctaa aattttttca gagaataagg tgtgaaatac ttaatcgttt ggagaaaaac    25440
          gattgccaga tcttggataa atttatatag actaggataa aggaaacctt gtgaaatttt    25500
          gcttatcaaa aggaaaatag acttaggaca agcagaacta tgtcagtgcc tattgatcct    25560
          ttgtatgtag cgttggtcac ctatgagtcc tgcttacctt ctcatcagta gacagggaaa    25620
          acagcatctg agggaggtgg agcctcttcc cagtgcagtg gcacatgctc cctagtcttt    25680
          ctcttgtcgc tttaggaggt ccaagtccac cagcatcagc ggcatagaag cataaatctg    25740
          agccataagc ttccgaagct atacgttgta ctctgtctat acgtcctcgg aagagaaaca    25800
          cttccacttt tatagtgtct tcctttacag taatcatcat tcacaagtct ttcttttatt    25860
          ttttggtttg ggcagggctt tgttatgtac tcctggtggc ctcactgatg gctatcttcc    25920
          tgtagtccta gctggtctca ctactggtgg ctgttctcct gcctcagttt cccttgtact    25980
          aggacaggta tatgttgtcg tacctagatt tttattttaa accatactcc accttaaaag    26040
          ttaaataatc catagtagat aattgaaccc tctgacctca ggtcagaaag gtaaggccag    26100
          ggatggactc tgcctggtta tataccacat ctctcaattc agccatgcat ttattttcac    26160
          atttcaaaat ctctgaaaag atgggctttt taagcagctc aaagggcagt gctcagccag    26220
          tatgaatgag cccccagccc ccgagtgcag cacagcagcc cctgagcttg agctgattag    26280
          taaggcttgg actgttctgc atcggctagt gtctgaaggt aatgtttacc ttgttctgtt    26340
          tgctggtttt ttaagtcaca actcataagt atatgaagga aagttctgat cagctgacat    26400
          cctcttaatg tgagatattt ctagacttta ttcagtcact gattaataga tttaattata    26460
          tttacatttt agaacagtct tttagtgttt tttatgtcct ttgagttttt gaaattatta    26520
          ctctttaaat tatgataaac cttagattta tgtataatgc actcatactt gttactcgtt    26580
          gttggttgag accagcacac agcccagttt ttatgcctct gactcccgtt ctttccgttc    26640
          tcccacggca tcgggcttgc tccaagtcac agtcagcgtg tcattacttt ttgtgtgtgt    26700
          ctccaaaata ttgtgggacg tgtgcttgct tgtgatctgt agggttgctt ctggctttgt    26760
          ttttgtgttt ttttgagcaa tctagctcac tgctgtgcaa gtcctcaact cctgattatc    26820
          ctgactctca ctccgagtgc tggagtgcgg gtgtgcacac cacatctgac ttgactgttt    26880
          ctctctttat ttctcctaat tagtgctgtt gtcacaatat agtaataaca acaacaacaa    26940
          caacaacata aatatctagt tttaaaaaga acttaaaatt acttaagtag gcaaaatgag    27000
          tattctagaa agtttaagtt tcttaaaaag tttgttcctg ccaggcagtg gtggcacacg    27060
          cctttaatct cagcacttgg gaggcagagg caggcggatt tctgagtttg cggccagcct    27120
          ggtctacaga gtgagttcca ggacagccag ggctacacag agagaccctg tcttgaaaaa    27180
          caacaacaac aaaaaaacaa aaacaaagtt tgttcctact atcccttcct tcagtaagtg    27240
          ttgttagtga ctgtatattc ccttctgtca tacacatatt catagtctct ctctcagtgt    27300
          gtgtgtgttc atgtgcgtgt gcatgaacat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt    27360
          gtgtgtgtgt gtgtgcaata cgctatctat ggttcatagg aggtccaaag acaaggctcg    27420
          caggttttgg tccctcttct ccctccatgt gggtcctgtc agtggcccag ggcatcaggc    27480
          ttggctgcca gcagggtctt cacttgctga gctttgtcac cacctccttt tttgtatata    27540
          aacattttgt tacctttttt gaaatgagaa tttgaagctt ccactgactt acacttttag    27600
          cagcagtaaa ggtaactcag tcccattcca tgacgggtca gtgatctata gcaaccacag    27660
          tgtaaagccg taacttgcgc ttttgagctg acagatttgg gcccatcttg taccctttgg    27720
          gaaaaaaaat aaaaacactt tgggtatgag catgcctctt ttctagtggt agattgtgta    27780
          ttaaagattg cttctagctt tagtctttta tcttctgctg agagcttaga cagctagaat    27840
          attctaccta gtcacagata gccaagatga attaagggtt aactttgtag tatttatttt    27900
          taacattaac tagtatttaa aagtgctagt gtgggctgga gagatggctc actggttaag    27960
          agcacttact gctcttccag aggtcccgag tccaattccc agcaaccata ttgtggctca    28020
          caaccatctg taatgggatc tgatgccctc ttctggtgtc tgaagacggc tacactgtac    28080
          tctcagacat aaaacaaatc ttaaagaaat aatgtactag tgtactacag attttaagaa    28140
          gaaggtgtgc gtgtgggggt ggggtggggg aggggtgctg gagggtggct cattggttaa    28200
          agtacttcct gcgcttgcct tttcctcaaa ccctccattt cttagctgga atagctccct    28260
          gtttctctag gctctgtctt ggctctaaga ctctgacttc cttctttccc tccaagctgg    28320
          ccctgctgtc agcctattac tcacaggtca gcagtcttcc ctcgtctccc cactgcctct    28380
          gaaggcctca tacttaatgg aaatatgaaa tatgacacat tataggattt cttttcttag    28440
          gtaaaaatgt tactaaaaat tagcctacta taaattcata gcttatgagt aagggttact    28500
          aagtaatgtt tccttgacat gacatttttt ttagcagtga tgtgtaaata aagtccactc    28560
          cggcattgtt aacacctgct attgggagca taggagtcag tgatgggact gaagactgtc    28620
          ggctgctgca tgctctacag atgtgtgtca gcatcactta cgtcctctct aggatggctt    28680
          tgaatgccgt ggtctatctg ctacaagaag cggtgtttcc cagcagaaca ataacacaca    28740
          ttcgtagcca aggagtcctg tgatgctttg actgcttatt cttgcactgt agctttcatg    28800
          gtgtgaccta gtttatcaga cagttcagtt taagagacac aaataggtag gggcgtttaa    28860
          gcgaaacact aactaatagt taagttaggg gcttaacaat cttaggcatt gttctgagcc    28920
          aggcttttga aatatagacc aatttgtgag aagggctgcc accattgcct gattagggtg    28980
          gtggggtcag tggagagcgc ccatgttcag ttcccagaac gacccctatg gctcataatc    29040
          acccaagact cagaggattc tgcactccat tatcacccct gagggtatgt gcgagtgcac    29100
          acccctgcac gtatgcatgc acgtgagcac acacacacac agagtctaaa acattagatc    29160
          ttttatataa catatttaat tagtaaaaca ttttcttcaa ttttttatat gtatgggtgt    29220
          ttttcttgca tgtatgtatc agtctcacgt gcatgtagtg cctgaggagc cagagaggat    29280
          attagatccc cctgggacca ggattgtaga tggttttgtg ctgccctata ggtgctggaa    29340
          attgagccca ggtcctttga agaacagcct gtgccctcaa ctgctgaacc agctttccag    29400
          tccctaacta aatcttatca acaaacaaac gagcaaaacc ccagaaatta tgtatagcta    29460
          tgatatagtt gtcaagactt tctggttcca ctgaaatagc tgtgaggcag gattcaaggc    29520
          tgaatctcca tgactttgct tactaggaaa acagtgtgtc tcactgactc atttatgctt    29580
          tttgtagctc atgtgggttc ttagtctgca gccagagacc aggttttagc tctgtactgc    29640
          tgtaagcctg aaggaagaca tggtgggagg ttctgaggga ctcattccct agcagcatct    29700
          tcagggcttc acagtggttg ggtcagggtt ggcagctgat ttctgttctc attttgcata    29760
          atgtaaggtt ataataaccc catgaatatg tacaatatta agtgaaaaat taaaggtaaa    29820
          ttaaagggta actctctgaa gttgcattca cacatagaat ccgcagagct caggcctccc    29880
          ttcacatcac ccttgtatag aggtttgtag catcaggaag tcagtatttt gcctcaaagg    29940
          ccaacaggag gaaagtggag tgcctacaat ctgggttaac tttattgctc gctcacttta    30000
          aaaactcaag cctggggagg acaggcaggg tgcccttggg aggggaggcc ggcagctcct    30060
          ggagttcaag gccatcctgg ctaccaacct ggactagaga ccgtttgaaa attgagaaga    30120
          acaataggaa aaaagtatgc taactataac ttagttttaa agttttggtc cttttaaaat    30180
          cacacaactt ttaaatctga cttctatgtc atttatgggt tttcttggtt tttagctctc    30240
          ttgtgtgttt aaagcagaac tagtgtgcag agctgcttgc ccctcgcaat acactttacc    30300
          cagaggcgtc tggaagtgtt cttattatag cttggtattc agcatacatt ttctgaacac    30360
          aaggatacat tcctgcaatg tgttgttttg ttttgtttgt tgttgctttt gagataggga    30420
          ctgatatgtt accaaggctg gtattccatt cctgggctca gatttccttt tcctttggcc    30480
          agttgggtga ctgcaggcat gtgtcacaat gagcttcgct acttttgctt tgagacagtg    30540
          tcttagccag tgctcttgct gtaatgaggc ataatgatct cggcaactca aaaaggggag    30600
          tatttaattg gggctggatt acagttcaga gatttagtcc actgtcacag cagggagcat    30660
          ggcgggatgc aggtagacat gggctggaga agtagctcag agtcctacat cggcatccat    30720
          agacagagag actgggcctg gcataggcat ttgaaacttt agagtccacc cccagtgaca    30780
          cacttcctcc agtaagatca cacctatatg accctgtggg gccattcata ttcagactat    30840
          tacattctag tccctggtcc ccacaagctt gtagccatgt catagtgcaa aatagtccaa    30900
          cttcaaaggt caccatagtc tcttggtctt aagactgctt caaaatctaa agtgtcttct    30960
          gagattcatg gcaatctctt cactgtaatc ccctgtaaca tcaaatcaca ggtcacaaca    31020
          tacagtggtt ctgaatatag tcatttctat gtctttaatt cttcaagtct gtgatgaagc    31080
          tgctgtgtga caaggcacag tttcaggtac tgggacacag gtaagcagca tcaggttgag    31140
          ctctcattgc ttacagacca gacagagtat caagacagta tgtttgtgcc gagaatgaaa    31200
          atgaaatagt gagaaagcca ggaggttgct tgaaacggga tagtcggaga gggactccag    31260
          ggagaaactt agtaaatcca ggcttgagtg gcagcgaggg agccagcccg ggaaagcaca    31320
          ttaaagtgag atagtttgtc ttatcaaagg tgttttccag tggcttctaa cagtgataaa    31380
          gatatataaa ccaacactca tttgtgtaag aatcactact agtgaacctt gaacagaaag    31440
          tgcaaatacc tacctcttct ctgataattc aaatgtgtag gttttttgaa tcagaacttt    31500
          gacattttta tacttgtaat tattaaacta atttctcacc ttctgaggta ttcaggcagt    31560
          gaccattttg attcatggaa cagcttattt cctacgtgat tgcctgctct cctggcagat    31620
          ctcctatgcg ttgttttaac agatattcac gtttgaatgt ttcaggcaac agcagcagca    31680
          gcaggaggta gaccgacctg gacccctttc atatccacgt gaaagaccga ccacaagttc    31740
          aggaggacgt aggagcgacc aaggtttgct ttctgtccat tcacagtgat gctttactcg    31800
          atacccaaga tcctcgtcaa ttgtacttta tatttctcct cctcctcctc tccttcctcc    31860
          tctttctctt ccccctcctt ctttatattg ggttttttat ttgtttgttt ctatcttttt    31920
          cttttttttt cttttctttc tttctttttt ttttttgaga cagggtttct ctgtatagcc    31980
          ttggctgtcc tacaactcac tctgtaaacc atacatagag tcataagaga tctgcctgcc    32040
          tctgcctccc agcacagtga ttaaagatgt gcaccaccac ctggcttttc cttttttaaa    32100
          aatttatgaa ttttatgtat tagtgctctg tctgtatgta tgcctgcatg ccagctgaga    32160
          gcatcagatc ccattataaa tgttgctggg aattgaactc agaacctctg gaagagcaac    32220
          ccatgcttct aaccactgag ccatctctcc agcccccttt tcttctttaa ttgtattata    32280
          aaactctttt tgttttttgg ttttttgaga cagggtttct ctgtgtagcc ctcagctatc    32340
          ctggaactca ctctgtagac caggcgggcc tcgaatacag aaatccatct gcctctgctt    32400
          cccaagtgct gggattaaag gcgtgcacca ccacgcccag cttataaaac tcttaaaaat    32460
          gaatttgtaa tataccaatt tcctctgaac tataagggag atagacactt ggtagttgtt    32520
          tggattttat ttatttaatg tagttttggt tttgagacag tttcattatg tagctagggc    32580
          tagcttggaa ctcactgtgt agcccagact agcttcaaat tcatgagtct tcggtttggg    32640
          cttttttaga agtaacagga acaggcatgc accaccatgc cctggttggt tctaaaatcg    32700
          cacacatagt actttaactt cacagttgac acattcctga gaaatccttc agagatgatt    32760
          agaggtaata aataatagta agtggaaagg aaacacattt caccacttag taaaggaaac    32820
          catctcgtta gcatagtcta gataacagct ggaggccagg tgactactca cccatcctcc    32880
          agacagcagc tgttaagctc gagtcaagta ttggtagaag ctgaatggag aagaagccct    32940
          gtctgtcaga ggacttcata gaatctatgc agagctctca gagtgacaca aaaacagtaa    33000
          aaaaaaactg atgaaggggt gctggagaga tggctcagca gttaagagtg ctgactgctc    33060
          ttccagaggc ccagagttca aatcccagca accacatggt ggctcacaat catctataat    33120
          gggatccaat gccctcttct gatatgttca aagacatcat tgatgtactc acatacataa    33180
          aataaataaa tagataaatc ttaaaaaaac aaaaaaaaga ctggtgaagg attgtggatg    33240
          tgagatgtgt cttgcactag agagcacatt acacagaatc ctataatgca gctgcaggtg    33300
          gctttgacac ctctgtccta cttgggcacc tgcggtcaat gtgcatatat cctacacaga    33360
          tgcctgtatc agaggaggct caccgaaagg aagatttcat taaaactcac aaggtgacaa    33420
          aacccaagta cccagggttc acttggaaac aaaccactgt tattccagga accatgaaag    33480
          aaggaaccac gtggacaatt ttaattgagc attgcttttt ggttttttgt tttgttttgt    33540
          tctgtttcga ggcagtctca ctctgtagcc cagcctggct gtgaattcac tattgtccca    33600
          cgtctgcctc tggagtgctg agactctggt cacccgcagc cacctgcatc tcacacattt    33660
          tagagcagaa gagtaactga aatgtaaaag ctcagtgaat ggacttagca tagaaagctg    33720
          gtagactaga tgacaggcat gtagaaatcc ttcccatcaa cacggcaaac tgactgtagc    33780
          caatgagcag agcgctggag gcatctgaca ttattagctc agcctaactc acaggagcct    33840
          cctaactgga agcagaaggg gtggtgaaaa catctgatga tcttttcatc gtctcagctg    33900
          aacagaaact agaagcctgc aagtggaaga aattgagtga acttcaaatt tatgtaaacg    33960
          aaaagaaata cttactagga cttctgaaaa ctgaaggcat aatcaaaaga aagaactaat    34020
          caaagaaaga actgttcttc aaagaacagc aatttgaagt gggaggtgtc tatgagtgac    34080
          agtggataat gtggttccca tgctgaaaga aacctttaat ccaggactac atatgctgga    34140
          cttacatact tactaggatt gggaaagagt ttcaaaaatg tctccagcag ttaaagaaag    34200
          ggatggctgt tcagggctgg caatcagatc agcatctcga ttagccacca tcagagatgc    34260
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          tgcaatcatg tttaaatcgc ttaagaatta cagaagtcac aaagcttaaa gggtctgttt    36180
          gtaaatagga aagtccttag ttttgataaa cattaagcag gatgcagagc tagtcttgct    36240
          gggtcaatac gtggtatgat ttgggtggaa attaactctg tgtctttgtc atggtgtcat    36300
          agataccctg atacctgctt tcccctccct cccctttgaa gcccctttga atggtgactt    36360
          gtacataggt aaagtccaag aagagattgt agccagctta ggaaggggca gcatgctata    36420
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          tccttgtttg ctttttgttg tttttcttag ccattttgtg ccaactacag ttgtttttta    36720
          aaaatttgct tcatgaaaaa ttaggcagtc ctattttaaa atctatgaag ttttctttca    36780
          gtaattgcaa aggttcagaa gagttgggca gctgtagggt gttagagtta ggactttgct    36840
          tacagttgat tgctatactg aagtatgtaa ctactcccgt atgctgctca catgtctaga    36900
          cattcattgg cccttttcct ttaccctttg aaaaatcaca ttaaactttc catacattta    36960
          gattggtgtg ctgcctgatg aaaaatgaga aagccaatat acacttcagc tttaacttta    37020
          gagtttataa aatgttcata taacacaccc tacttaaatc atgtatgaaa tacagcatgt    37080
          tagtctttta ttagaaatgt tttaaagaga aactgagcac acactgaatc tatttgagtg    37140
          aagcttttta gtttgttata tttatggcat tgtccaggca gatccaaaat caccattgaa    37200
          ttgccatcct ctttgggttg acctaggctt actaaacatt tagatttcat tattaatgag    37260
          tagccagtat gaaaagatgc caatgcttat tctagccaca gtatccaaag tgtaggagtt    37320
          ctatgacatt ctaattcata accaggagtt gctgtttata gtactgcagg acagacaggg    37380
          gcaagggact ccactgccac ggctggtcac agactcgact aacttttcca tttgtttttt    37440
          taccaattgg aatacttaaa tgtattgtat gtaatgaata ctaaactact gataatcatt    37500
          ttttttaaat ctgtaacttg ttctgccaga taaaatgcgt acagccgtga tgctagtgtt    37560
          ataaccaagt gtaaggaccc tttggaaggc cagacatggt gctgtgttcc tttgatgctg    37620
          gtacttagga gaaatctgca gaggtaggca gatttcttct tgagttcaag gccagcctgg    37680
          tctacatagt aagttccaga ctttctggag ctgcacagta agaccctgtc ttaaacaaaa    37740
          aacaaacaaa ccaacctttg gaaagatcac tttcatattt tgggatgtca tgagcttatc    37800
          tatgtttcaa aattcagaat agctgtcctt tggcctaaac cataaatcta cacccccaac    37860
          gacagtacta tgcagacatt tcactgattt aagttgtttg atacagtcag tgcaggtgaa    37920
          ctccatgcta aagttttaag ccttggccaa ataacttaca cctcacagac tgtctgaggc    37980
          ggtgcttctt tttttcctga aaacttgatt tttcttgatg aagccaaagt taatgagcat    38040
          gaattctcaa aggagtagtc tgctttgttt tacttaatat caggttgagt gaagtaagtt    38100
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          agacagggca gtgcggaacc caaatgtgct atctgagagt cttaagctag gaaatctggg    38280
          tgttttaaat tagtgagagg tttcagttag tgttgaaacc tccagatccg acttgatgtt    38340
          aggcagtgtg gatgtgctca gtggtagagc agttacctag tggcccaggc cttgggttca    38400
          gtctctaaca ctgcaaaagg agagcagtgg ctcacagtgt aacctacgtt tagagagaca    38460
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          tatgatatgt gaccttaatt aagaaaaacc agattggatc agtagtattt ttgttgtttt    38580
          tcatatttaa cataaaaatt cccttcatcc ctaatttgtt tataattaaa gagacaaatt    38640
          gattttgtat tttttcaaag ttttatacat attaaaaggg ttttgttgta gtctatcatg    38700
          aatgaaaagg atattttttt ttttaatttg aggaatactt ttgtgtgtgt gtgcctaaaa    38760
          tggtctgtca ttttaagaat tagcacaaaa aaaaaattag ctagttccta aatgtatgga    38820
          ggtttaatag taccagtaca cagttgtggg tgaggcacta gtgagaagtg tgtgggaaat    38880
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          tttttttaat gatttttttt ttcaaggaag acagacattc gaaatgtgct tatcaaattt    39000
          ctacaacact ggactaatag gaataacttt ttttttaaaa aaaaaagact gttctgtata    39060
          aataaaatat atgaaactca agtgcaaaag ccgtgaaaat aaaaggcatt gtcttctgtc    39120
          aatgtgatgc actgtggccg agcagttccc tcaggactca actctgcagc ccttcctcct    39180
          gtgcctcaag tgtcggctgc cactccacag gtcttccgtc tgtcggctcc tttgaaagcc    39240
          gggcttccaa agccctgttg aacactgagg gttctggtga tgtgtgttaa tgagttgtat    39300
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          aagaaaccaa accc                                                         14
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          aaagaaacca aacc                                                         14
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          aaaagaaacc aaac                                                         14
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          caaaagaaac caaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          ccaaaagaaa ccaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          tccactccta atac                                                         14
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          gtccactcct aata                                                         14
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          agtccactcc taat                                                         14
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          cagtccactc ctaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          ccagtccact ccta                                                         14
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          actctttcca aaca                                                         14
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          aactctttcc aaac                                                         14
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          caactctttc caaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          gcaactcttt ccaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          agcaactctt tcca                                                         14
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          cagcaactct ttcc                                                         14
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          ccagcaactc tttc                                                         14
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          accagcaact cttt                                                         14
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          ctcctattaa ataa                                                         14
          <![CDATA[<210>  23]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          cctcctatta aata                                                         14
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
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          tcctcctatt aaat                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          ctcctcctat taaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  26]]>
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          gctcctccta ttaa                                                         14
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          tgctcctcct atta                                                         14
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          ttgctcctcc tatt                                                         14
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          tttgctcctc ctat                                                         14
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          ctttgctcct ccta                                                         14
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          cctttgctcc tcct                                                         14
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          ccctttgctc ctcc                                                         14
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          accctttgct cctc                                                         14
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          aaccctttgc tcct                                                         14
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          aaaccctttg ctcc                                                         14
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          aaaacccttt gctc                                                         14
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          aaaaaccctt tgct                                                         14
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          caaaaaccct ttgc                                                         14
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          acaaaaaccc tttg                                                         14
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          aacaaaaacc cttt                                                         14
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          aaacaaaaac cctt                                                         14
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          aaaacaaaaa ccct                                                         14
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          taaaacaaaa accc                                                         14
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          ataaaacaaa aacc                                                         14
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          aataaaacaa aaac                                                         14
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          taataaaaca aaaa                                                         14
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          ttaataaaac aaaa                                                         14
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          tttaataaaa caaa                                                         14
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          atttaataaa acaa                                                         14
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          ttaaaataaa aatt                                                         14
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          tttaaaataa aaat                                                         14
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          ctttaaaata aaaa                                                         14
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          <![CDATA[<400>  53]]>
          tctttaaaat aaaa                                                         14
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          atctttaaaa taaa                                                         14
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          catctttaaa ataa                                                         14
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          ccatctttaa aata                                                         14
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          tctaacttaa taaa                                                         14
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          ttctaactta ataa                                                         14
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          attctaactt aata                                                         14
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          cattctaact taat                                                         14
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          acattctaac ttaa                                                         14
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          tacattctaa ctta                                                         14
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          ttacattcta actt                                                         14
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          tttacattct aact                                                         14
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          ttttacattc taac                                                         14
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          gtttttacat tcta                                                         14
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          ttcaaatatt tatt                                                         14
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          attcaaatat ttat                                                         14
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          cattcaaata ttta                                                         14
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          ccattcaaat attt                                                         14
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          cccattcaaa tatt                                                         14
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          ccccattcaa atat                                                         14
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          gccccattca aata                                                         14
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          tatacatttt tttc                                                         14
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          atatacattt tttt                                                         14
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          atatatacat tttt                                                         14
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          aatatataca tttt                                                         14
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          aaatatatac attt                                                         14
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          caaatatata catt                                                         14
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          cattcaaata tata                                                         14
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          tttatccatt caaa                                                         14
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          ctttatccat tcaa                                                         14
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          tctttatcca ttca                                                         14
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          ctctttatcc attc                                                         14
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          tctctttatc catt                                                         14
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          ccatatatat ctca                                                         14
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          accatatata tctc                                                         14
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          caccatatat atct                                                         14
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          gcaccatata tatc                                                         14
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          agcaccatat atat                                                         14
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          cagcaccata tata                                                         14
          <![CDATA[<210>  104]]>
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          acagcaccat atat                                                         14
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          <![CDATA[<400>  105]]>
          aacagcacca tata                                                         14
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          aaaacaaaca acaa                                                         14
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          taaaacaaac aaca                                                         14
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  108]]>
          ctaaaacaaa caac                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  109]]>
          actaaaacaa acaa                                                         14
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          aactaaaaca aaca                                                         14
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          gaactaaaac aaac                                                         14
          <![CDATA[<210>  112]]>
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          agaactaaaa caaa                                                         14
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          cagaactaaa acaa                                                         14
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          accagaacta aaac                                                         14
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          atgttattat cccc                                                         14
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          tatgttatta tccc                                                         14
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          <![CDATA[<400>  118]]>
          ctatgttatt atcc                                                         14
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          tctatgttat tatc                                                         14
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          tacactctaa ctct                                                         14
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          ctacactcta actc                                                         14
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          tctacactct aact                                                         14
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          ctctacactc taac                                                         14
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          tctctacact ctaa                                                         14
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          ttctctacac tcta                                                         14
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          cttctctaca ctct                                                         14
          <![CDATA[<210>  127]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          ccttctctac actc                                                         14
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          tacaacacaa atca                                                         14
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          ctacaacaca aatc                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          actacaacac aaat                                                         14
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          aactacaaca caaa                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<400>  132]]>
          taactacaac acaa                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  133]]>
          ctaactacaa caca                                                         14
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  134]]>
          actaactaca acac                                                         14
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          tactaactac aaca                                                         14
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          cactactaac taca                                                         14
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          acactactaa ctac                                                         14
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          gacactacta acta                                                         14
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          agacactact aact                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          tttaccccca acct                                                         14
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          atttaccccc aacc                                                         14
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          catttacccc caac                                                         14
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          tcatttaccc ccaa                                                         14
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          atcatttacc ccca                                                         14
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          aatcatttac cccc                                                         14
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          aaatcattta cccc                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          caaatcattt accc                                                         14
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          ccaaatcatt tacc                                                         14
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          taccaaatca ttta                                                         14
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          gctaccaaat catt                                                         14
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          tgctaccaaa tcat                                                         14
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          ctgctaccaa atca                                                         14
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          actgctacca aatc                                                         14
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          aactgctacc aaat                                                         14
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          aagctttaat caaa                                                         14
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          caagctttaa tcaa                                                         14
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          atcaagcttt aatc                                                         14
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          catcaagctt taat                                                         14
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          tcaaactatc ccca                                                         14
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          ctcaaactat cccc                                                         14
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          atctcaaact atcc                                                         14
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          tatctcaaac tatc                                                         14
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          ttatctcaaa ctat                                                         14
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          cttatctcaa acta                                                         14
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          ccttatctca aact                                                         14
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          caaacttcat caaa                                                         14
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          tcaaacttca tcaa                                                         14
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          atcaaacttc atca                                                         14
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          aatcaaactt catc                                                         14
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          aaatcaaact tcat                                                         14
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          gaaatcaaac ttca                                                         14
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          tgaaatcaaa cttc                                                         14
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          ttgaaatcaa actt                                                         14
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          aacacaaatt tcct                                                         14
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          taacacaaat ttcc                                                         14
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          ctaacacaaa tttc                                                         14
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          gctaacacaa attt                                                         14
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          attttaaaca aaca                                                         14
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          tattttaaac aaac                                                         14
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          ttattttaaa caaa                                                         14
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          attattttaa acaa                                                         14
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          aattatttta aaca                                                         14
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          gaattatttt aaac                                                         14
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          ttttacaaat ctac                                                         14
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          attttacaaa tcta                                                         14
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          tattttacaa atct                                                         14
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          ttattttaca aatc                                                         14
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          tttattttac aaat                                                         14
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          atttatttta caaa                                                         14
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          catttatttt acaa                                                         14
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          acatttattt taca                                                         14
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          aacatttatt ttac                                                         14
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          taacatttat ttta                                                         14
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          aatttaatca ttaa                                                         14
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          taatttaatc atta                                                         14
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          ataatttaat catt                                                         14
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          aataatttaa tcat                                                         14
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          aaataattta atca                                                         14
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          taaataattt aatc                                                         14
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          ctaaataatt taat                                                         14
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          cctaaataat ttaa                                                         14
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          ccctaaataa ttta                                                         14
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          cccctaaata attt                                                         14
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          tcccctaaat aatt                                                         14
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          tatataaaaa tcta                                                         14
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          atctatataa aaat                                                         14
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          tatctatata aaaa                                                         14
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          tctactatat acat                                                         14
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          atgtatattc tacc                                                         14
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          taatttttaa aaac                                                         14
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          ataattttta aaaa                                                         14
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          cataattttt aaaa                                                         14
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          tcataatttt taaa                                                         14
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          atcataattt ttaa                                                         14
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          ctttatacaa aaaa                                                         14
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          actttataca aaaa                                                         14
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          tactttatac aaaa                                                         14
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          ttactttata caaa                                                         14
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          cttactttat acaa                                                         14
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          gcttacttta taca                                                         14
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          cacagcctat cacc                                                         14
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          tcacagccta tcac                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          aatcacagcc tatc                                                         14
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          ccaaatcaca gcct                                                         14
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          acccaaatca cagc                                                         14
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          tcacccaaat caca                                                         14
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          gtcacccaaa tcac                                                         14
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          agcgtcaccc aaat                                                         14
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          atcctaaaat cact                                                         14
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          gatcctaaaa tcac                                                         14
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          agatcctaaa atca                                                         14
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          taaaaccaat catc                                                         14
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          ttccatctct acta                                                         14
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          ccttccatct ctac                                                         14
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          taactacata acaa                                                         14
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          caataactac ataa                                                         14
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          acaataacta cata                                                         14
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          attcacaata acta                                                         14
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          aattcacaat aact                                                         14
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          gaattcacaa taac                                                         14
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          ctaaaacaat ctaa                                                         14
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          tacctaaaac aatc                                                         14
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          atacctaaaa caat                                                         14
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          acattaccct tcat                                                         14
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          aaccaatctt ctat                                                         14
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          caaccaatct tcta                                                         14
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gcaaccaatc ttct                                                         14
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          tgcaaccaat cttc                                                         14
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          ctgcaaccaa tctt                                                         14
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          actgcaacca atct                                                         14
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          aactgcaacc aatc                                                         14
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          taactgcaac caat                                                         14
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          tacaacacac atca                                                         14
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          atacaacaca catc                                                         14
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          aatacaacac acat                                                         14
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          gaatacaaca caca                                                         14
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          atgaatacaa caca                                                         14
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          cctaataaaa tata                                                         14
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          tcctaataaa atat                                                         14
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          ctcctaataa aata                                                         14
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          actcctaata aaat                                                         14
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          tactcctaat aaaa                                                         14
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          ctactcctaa taaa                                                         14
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          actactccta ataa                                                         14
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          aactactcct aata                                                         14
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          taactactcc taat                                                         14
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          atataactac tcct                                                         14
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          aatataacta ctcc                                                         14
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          aaatataact actc                                                         14
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          aaaatataac tact                                                         14
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          taaaaatata acta                                                         14
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          gtaaaaatat aact                                                         14
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          agtaaaaata taac                                                         14
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          atcttcccat taat                                                         14
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          taatcttccc atta                                                         14
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          ataatcttcc catt                                                         14
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          tctattaatc aaaa                                                         14
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          ctctattaat caaa                                                         14
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          tattttcttc atta                                                         14
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          aatattttct tcat                                                         14
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          aaatattttc ttca                                                         14
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          aaataatcca aact                                                         14
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          aaaataatcc aaac                                                         14
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          caaaataatc caaa                                                         14
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          tattttttac atta                                                         14
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          taaaatttaa attt                                                         14
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          acataaaatt taaa                                                         14
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          aacttctact acta                                                         14
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          agatcaaact aaaa                                                         14
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          gcccaatttc accc                                                         14
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          ttgcccaatt tcac                                                         14
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          caactttcta tttt                                                         14
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          ccaactttct attt                                                         14
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          cccaactttc tatt                                                         14
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          acccaacttt ctat                                                         14
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          aaacccaact ttct                                                         14
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          caaaaaccca actt                                                         14
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          ctttaaaatt tcca                                                         14
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          tctttaaaat ttcc                                                         14
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          ttctttaaaa tttc                                                         14
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          tttctttaaa attt                                                         14
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          atttctttaa aatt                                                         14
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          acatttcttt aaaa                                                         14
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          caaaaccaca tttc                                                         14
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          aattaacaat aaac                                                         14
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          gaattaacaa taaa                                                         14
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          tgaattaaca ataa                                                         14
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          atattcctca atca                                                         14
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          tatattcctc aatc                                                         14
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          atatattcct caat                                                         14
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          aatatattcc tcaa                                                         14
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          gacaatatat tcct                                                         14
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          ccaatcctaa ttaa                                                         14
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          attatacact atta                                                         14
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          gtaacaatta taca                                                         14
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          ataaaaacca cctt                                                         14
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          aataaaaacc acct                                                         14
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          gaataaaaac cacc                                                         14
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          agaataaaaa ccac                                                         14
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          cagaataaaa acca                                                         14
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          ccagaataaa aacc                                                         14
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          cccagaataa aaac                                                         14
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          acccagaata aaaa                                                         14
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          tttcttactc ccct                                                         14
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          agtctacatc taac                                                         14
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          ttttaaccac acct                                                         14
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          agttttaacc acac                                                         14
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          caacaaaaca tcaa                                                         14
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          tcaacaaaac atca                                                         14
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          <![CDATA[<400>  1068]]>
          ttcaacaaaa catc                                                         14
          <![CDATA[<210>  1069]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1069]]>
          tttcaacaaa acat                                                         14
          <![CDATA[<210>  1070]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1070]]>
          ttttcaacaa aaca                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1071]]>
          gttttcaaca aaac                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1072]]>
          tgttttcaac aaaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  1073]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
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          <![CDATA[<400>  1073]]>
          ttctaaaact tacc                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          tttctaaaac ttac                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
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          ctttctaaaa ctta                                                         14
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          tctttctaaa actt                                                         14
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          atctttctaa aact                                                         14
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          aatctttcta aaac                                                         14
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          gaatctttct aaaa                                                         14
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          agaatctttc taaa                                                         14
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          cagaatcttt ctaa                                                         14
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          cctttatttc cctt                                                         14
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          ccctttattt ccct                                                         14
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          tccctttatt tccc                                                         14
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          ttccctttat ttcc                                                         14
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          tttcccttta tttc                                                         14
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          atttcccttt attt                                                         14
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          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<400>  1088]]>
          tatttccctt tatt                                                         14
          <![CDATA[<210>  1089]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1089]]>
          gtatttccct ttat                                                         14
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針]]>
          <![CDATA[<400>  1090]]>
          ctgaacagcc tccttggtct tcttgta                                           27
          <![CDATA[<210>  1091]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1091]]>
          cttgccagct ctcattctct g                                                 21
          <![CDATA[<210>  1092]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1092]]>
          tggtggttga agataaggtt g                                                 21
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          <![CDATA[<400>  1093]]>
          aagagtaaaa tatgggt                                                      17
          <![CDATA[<210>  1094]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  1094]]>
          gaatgtaaaa gtgtacag                                                     18
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          <![CDATA[<211>  18]]>
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          ggaatgtaaa agtgtaca                                                     18
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          <![CDATA[<211>  18]]>
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          gggaatgtaa aagtgtac                                                     18
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          ccaaaagaaa ccaaaccc                                                     18
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          ccccattcaa atatttatt                                                    19
          <![CDATA[<210>  1101]]>
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          <![CDATA[<400>  1102]]>
          tatctcaaac tatcccca                                                     18
          <![CDATA[<210>  1103]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  1103]]>
          tctattcctt aacccaac                                                     18
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          tcccctaaat aatttaatca                                                   20
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          aaaccactcc attccaa                                                      17
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          <![CDATA[<220>]]>
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          agttctaaac cccaaact                                                     18
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          <![CDATA[<400>  1109]]>
          tgaaaccatt actacaacc                                                    19
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          acatcattta tcactaccac                                                   20
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          ctatacctaa aacaatcta                                                    19
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          aatcttattt acatcttcc                                                    19
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          ccaaaattac ttcttttatc                                                   20
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          <![CDATA[<211>  17]]>
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          catcccttta ccacttt                                                      17
          <![CDATA[<210>  1128]]>
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1128]]>
          gtttctaaag acatggtcac agc                                               23
          <![CDATA[<210>  1129]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1129]]>
          ctatcaggac agagttcaca tcc                                               23
          <![CDATA[<210>  1130]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  FAM 標記探針]]>
          <![CDATA[<400>  1130]]>
          aaaggccagc caccagttca gg                                                22
          <![CDATA[<210>  1131]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  FAM 標記探針]]>
          <![CDATA[<400>  1131]]>
          tgatctttgc agtgacccag catca                                             25
          <![CDATA[<210>  1132]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1132]]>
          gctgtttaac ttcgcttccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  1133]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
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          cagcaacttc ctcaattcct t                                                 21
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          ttatccattc aaatatatac a                                                 21
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          tccattcaaa tatataca                                                     18
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          tatccattca aatatataca                                                   20
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          tgctaccaaa tcatttacc                                                    19
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          actgctacca aatcatt                                                      17
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          cactttgcca taatcaa                                                      17
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          ttatctcaaa ctatcccca                                                    19
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          acaaagtttt cccatta                                                      17
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          tgattcttat acttact                                                      17
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          cagatcttct ctttattt                                                     18
          <![CDATA[<210>  1980]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1980]]>
          tgttttcaac aaaacatca                                                    19
          <![CDATA[<210>  1981]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1981]]>
          tgttttcaac aaaacatc                                                     18
          <![CDATA[<210>  1982]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1982]]>
          ctgttttcaa caaaacat                                                     18
          <![CDATA[<210>  1983]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1983]]>
          tctgttttca acaaaaca                                                     18
          <![CDATA[<210>  1984]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1984]]>
          atctttctaa aacttacc                                                     18
          <![CDATA[<210>  1985]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1985]]>
          cagaatcttt ctaaaact                                                     18
          <![CDATA[<210>  1986]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1986]]>
          ctacagaatc tttctaa                                                      17
          <![CDATA[<210>  1987]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1987]]>
          atttcccttt atttccctt                                                    19
          <![CDATA[<210>  1988]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成寡核苷酸]]>
          <![CDATA[<400>  1988]]>
          gtatttccct ttatttcc                                                     18
          <![CDATA[<210>  1989]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  FAM 標記探針]]>
          <![CDATA[<400>  1989]]>
          agaaacctaa ctcatcagtg gctgcaa                                           27
          <![CDATA[<210>  1990]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1990]]>
          gaacaggata gacacgatgg c                                                 21
          <![CDATA[<210>  1991]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1991]]>
          agagactatg cgagagcga                                                    19
          <![CDATA[<210>  1992]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  1992]]>
          aagatgtaaa taagattc                                                     18
          <![CDATA[<210>  1993]]>
          <![CDATA[<211>  31]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針]]>
          <![CDATA[<400>  1993]]>
          agcctaagat gagagttcaa gttgagtttg g                                      31
          <![CDATA[<210>  1994]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1994]]>
          gcgatgtcaa taggactcca g                                                 21
          <![CDATA[<210>  1995]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  1995]]>
          ttgttgtagg atatgccctt ga                                                22
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Claims (33)

  1. 一種反義寡核苷酸，其選自由以下所組成之群組：化合物識別編號 1122_107、1122_156、1122_91、1122_154、1122_155、1122_157、1122_158、1122_167、1122_172、1122_175、1122_294、1122_296、1816_13、1816_15、1816_28、1816_41、1816_42、1816_43、1816_60、1816_61、1816_64、1816_65 及 1816_68，或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 一種如以下化學註釋之反義寡核苷酸： (a) [LR]A [sP]. [LR]A [sP]. [mR]U [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [LR]T [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122，其中殘基 3 為 U) (化合物識別編號 1122_107)； (b) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5meC] [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_156)； (c) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [mR]U [sP]. [dR](A) [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C) [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122，其中殘基 10 為 U) (化合物識別編號 1122_91)； (d) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_154)； (e) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [ssP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_155)； (f) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5meC] [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [ssP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_157)； (g) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [ssP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_158)； (h) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [MOE]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_167)； (i) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [mR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_172)； (j) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [mR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_175)； (k) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [fR]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_294)； (l) [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [mR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR][5me]C (SEQ ID NO:1122) (化合物識別編號 1122_296)； (m) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_13)； (n) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [ssP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_15)； (o) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [fR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_28)； (p) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_41)； (q) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [MOE]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_42)； (r) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [MOE][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_43)； (s) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [mR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_60)； (t) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [mR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_61)； (u) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [fR]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_64)； (v) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [mR]C [sP]. [LR]T [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816) (化合物識別編號 1816_65)；或 (w) [LR]G [sP]. [LR]A [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [dR]T [sP]. [LR]T [sP]. [LR]A [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]T [sP]. [dR]A [sP]. [dR]C [sP]. [dR]A [sP]. [dR]T [sP]. [LR][5me]C [sP]. [fR]U [sP]. [LR]T (SEQ ID NO:1816，其中殘基 17 為 U) (化合物識別編號 1816_68)； 或其醫藥上可接受之鹽，其中 [LR] 為 β-D-氧-LNA 核苷， [LR][5me]C 為 β-D-氧-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷， [dR] 為 DNA 核苷， [sP] 為硫代磷酸酯核苷間鍵結 (未界定立體性) [ssP] 為已界定立體性之 Sp 硫代磷酸酯核苷間鍵結 [mR] 為 2'-O-甲基核苷， [MOE] 為 2'-O-甲氧基乙基核苷，及 [fR] 為 2'-氟核苷。
  3. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12A 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_91)；或其醫藥上可接受之鹽。
  4. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12B 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_107)；或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12C 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_154)；或其醫藥上可接受之鹽。
  6. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12D 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_155)；或其醫藥上可接受之鹽。
  7. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12E 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_156)；或其醫藥上可接受之鹽。
  8. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12F 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_157)；或其醫藥上可接受之鹽。
  9. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12G 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_158)；或其醫藥上可接受之鹽。
  10. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12H 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_167)；或其醫藥上可接受之鹽。
  11. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12I 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_172)；或其醫藥上可接受之鹽。
  12. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12J 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_175)；或其醫藥上可接受之鹽。
  13. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12K 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_294)；或其醫藥上可接受之鹽。
  14. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12L 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1122_296)；或其醫藥上可接受之鹽。
  15. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12M 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_13)；或其醫藥上可接受之鹽。
  16. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12N 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_15)；或其醫藥上可接受之鹽。
  17. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12O 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_28)；或其醫藥上可接受之鹽。
  18. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12P 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_41)；或其醫藥上可接受之鹽。
  19. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12Q 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_42)；或其醫藥上可接受之鹽。
  20. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12R 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_43)；或其醫藥上可接受之鹽。
  21. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12S 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_60)；或其醫藥上可接受之鹽。
  22. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12T 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_61)；或其醫藥上可接受之鹽。
  23. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12U 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_64)；或其醫藥上可接受之鹽。
  24. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12V 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_65)；或其醫藥上可接受之鹽。
  25. 如請求項 1 或請求項 2 之反義寡核苷酸，其為圖 12W 所示之反義寡核苷酸 (化合物識別編號 1816_68)；或其醫藥上可接受之鹽。
  26. 一種結合物，其包含如請求項 1 至 25 中任一項之寡核苷酸，及共價連接至該寡核苷酸之至少一個結合物部分；或其醫藥上可接受之鹽。
  27. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 25 之寡核苷酸或如請求項 26 之結合物以及醫藥上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
  28. 一種在表現 ATXN3之標靶細胞中調節 ATXN3表現之活體內或活體外方法，該方法包含向該細胞投予有效量之如請求項 1 至 25 中任一項之寡核苷酸或鹽、如請求項 26 之結合物、或如請求項 27 之醫藥組成物。
  29. 一種治療或預防疾病之方法，其包含向患有或易罹患該疾病的受試者投予治療或預防有效量之如請求項 1 至 25 中任一項之寡核苷酸或鹽或如請求項 26 之結合物或如請求項 27 之醫藥組成物。
  30. 如請求項 29 之方法，其中該疾病為脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症，諸如馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)。
  31. 如請求項 1 至 25 中任一項之寡核苷酸或鹽或如請求項 26 之結合物或如請求項 27 之醫藥組成物，其用於醫藥中。
  32. 如請求項 1 至 25 中任一項之寡核苷酸或鹽或如請求項 26 之結合物或如請求項 27 之醫藥組成物，其用於治療或預防脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症，諸如馬查多-約瑟夫病 (MJD)。
  33. 一種如請求項 1 至 25 中任一項之寡核苷酸或鹽或如請求項 26 之結合物或如請求項 27 之醫藥組成物用於製備藥物之用途，該藥物用於治療或預防脊髓小腦性失調症，諸如第 3 型脊髓小腦性失調症，諸如馬查多–約瑟夫病。
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