TW202229562A

TW202229562A - 用於試管內測定過敏反應之ｂａｔ分析

Info

Publication number: TW202229562A
Application number: TW110133604A
Authority: TW
Inventors: 艾迪吉爾鮑吉芬
Original assignee: 美商Ｄｏｔｓ科技公司
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2022-08-01
Also published as: WO2022056065A1; US20230324384A1

Abstract

本揭露關於用於診斷及/或預測個體對過敏原之過敏反應之適體媒介之BAT。

Description

用於試管內測定過敏反應之ＢＡＴ分析

本揭露關於用於診斷及/或預測個體對過敏原(諸如食物過敏原)之過敏反應的試管內嗜鹼性球活化測試(basophil activation test, BAT)。本BAT使用核酸配體(亦即適體配體)來測量在過敏原刺激後之嗜鹼性球活化。 [相關申請案之交叉參照]

本申請案主張於2020年9月9日提交之美國臨時專利申請案第63/076,026號及於2021年7月7日提交之美國臨時專利申請案第63/219,007號之優先權；其各自內容係以引用方式全文併入本文中。 參考序列表

本申請案係與電子格式之序列表一起提交。序列表係以名稱2066.1016TW-SEQLST.txt的文件提供，該文件於2021年8月20日創建並最後修改，檔案大小為約4,168位元組。電子格式序列表之資訊據此以引用方式全文併入本文中。

過敏，特別是食物過敏，係一個公眾主要關心的問題，估計影響約5%的人口。食物過敏可為嚴重或危及生命，且係食物相關之全身性過敏反應(anaphylaxis)的常見原因。

今日，過敏個體基於用皮膚穿刺測試(skin prick test, SPT)及/或偵測血清特異性IgE (serum specific IgE, sIgE)的IgE媒介之對過敏原之過敏反應史來診斷。儘管SPT及sIgE具有高敏感性，但彼等對診斷食物過敏之特異性低。有時，即使當使用特異於過敏原組分的IgE時，結果仍可能模棱兩可。當SPT及/或sIgE的結果不確定時，通常施用口服激發試驗(Oral Food Challenges, OFC)。然而，在沒有明確過敏反應史之情況下，解讀來自SPT及sIgE方法的結果會有爭議。此外，在沒有口服激發試驗之情況下，過敏者難以判定她/他係如何對過敏原過敏及她/他對危及生命的反應係有多敏感。如果個體沒有接受過OFC測試，則很難判定個體的過敏嚴重度。然而，OFC承擔使患者暴露於嚴重或危及生命的反應的風險中，對患者心理健康留下長期影響。

由於無法治癒食物過敏，因此對於被診斷出具有過敏反應的人，目前管理方案為完全規避並使用腎上腺素自動注射器作為救援治療。然而，完全規避係困難的，且意外的過敏反應係很常見的。即使小量的過敏原，這些反應中之一些仍可能危及生命。危及生命的壓力可能負面地影響生活品質。食物過敏對患者及彼等的家庭帶來重大負擔。如果過敏測試可測定過敏個體的個體過敏閥值，則其可有助於確定過敏原規避的嚴格度(stringency of allergen avoidance)並改善他/她的生活品質。因此，做出正確的診斷至關重要。

近來出現的診斷性過敏測試，諸如組織胺體外誘發試驗(histamine-release assays)、特異性表位結合(specific epitope binding)、及肥大細胞活化測試( Bahri 等人 ,Mast cell activation test in the diagnosis of allergic disease and anaphylaxis.J Allergy Clin Immunol. 2018; 142:485-496； Larsen 等人 ,A comparative study on basophil activation test, histamine release assay, and passive sensitization histamine release assay in the diagnosis of peanut allergy.Allergy. 2017; 73:137-144；及 Beyer 等人 ,Measurement of peptide-specific IgE as an additional tool in identifying patients with clinical reactivity to peanuts.J Allergy Clin Immunol. 2003; 112:202-207)，嗜鹼性球活化測試(BAT)在診斷及預測個體對過敏原之過敏反應方面顯示巨大的臨床應用潛力。BAT已顯示比IgE致敏測試(IgE sensitization test)更精確，且縱然在各種研究中已致敏，卻能夠將臨床過敏個體與耐受個體區分開來( Santos 等人 ,Basophil activation test discriminates between allergy and tolerance in peanut-sensitized children. J Allergy Clin Immunol.2014;134(3):645-652)。

嗜鹼性球及肥大細胞係全身性過敏反應的效應細胞。近期的研究報告已表明活化之嗜鹼性球與過敏反應的嚴重度呈線性相關。例如，據近期研究報告，BAT非常接近地再現花生致敏之患者在過敏與耐受方面的表型( Santos 等人 ,Basophil activation test discriminates between allergy and tolerance in peanut-sensitized children. J Allergy Clin Immunol.,2014; 134:645-652)。過敏與耐受之間的成功辨別為個體中對花生之反應嚴重度提供有用的資訊。在BAT中，活化之嗜鹼性球百分比與過敏反應(例如食物過敏反應)的嚴重度相關。對過敏原具有嚴重反應的人可顯示出更高的嗜鹼性球反應性，並會對較低劑量的過敏原做出反應( Santos 等人 ,Distinct parameters of the basophil activation test reflect the severity and threshold of allergic reactions to peanut , J Allergy Clin.Immunol.,2015; 135(1):179-186)。在由Santos等人所報告的大型花生過敏研究( J Allergy Clin Immunol.2014;134(3):645-652)中，BAT在新的獨立群體中得到外部驗證並顯示出100%的特異性。BAT對花生呈陽性之高特異性，其確認花生過敏而無需口服激發試驗(OFC)。這些觀察結果與較高活化之嗜鹼性球百分比造成嗜鹼性球去顆粒增加及血管活性介質的釋放增加的假設一致，導致更嚴重的症狀。

將BAT實施到現行治療過敏症專家(allergist)實務中將對過敏管理，特別是對食物過敏管理具有顯著效果。理解過敏反應的嚴重度，個體不僅改善他/她的生活品質，亦可使意外之暴露最小化。嗜鹼性球回應於特定過敏原之敏感性可用作對該特定過敏原之過敏反應的嚴重度及閥值的生物標誌物。

現行BAT係基於流式細胞之分析來偵測活化之嗜鹼性球表面上之生物標誌物(諸如CD63及CD203c)的表現。在大多數分析中，BAT使用抗體來標記嗜鹼性球活化生物標誌物。儘管此種測試在食物過敏管理上有顯著效果，但在過敏診所環境中實施該測試極其困難且成本昂貴。

本揭露實施基於核酸之平台，其中使用特異性結合至嗜鹼性球生物標誌物的適體配體來測量在過敏原刺激後之嗜鹼性球活化。

在本揭露之一態樣中，提供嗜鹼性球活化測試(BAT)，其中使用特異性結合至嗜鹼性球生物標誌物的核酸配體來識別嗜鹼性球並測量在過敏原刺激後在血液樣本中之嗜鹼性球的活化。

用於測量回應於過敏原刺激之嗜鹼性球活化之BAT包含使用特異性結合至嗜鹼性球之生物標誌物的核酸配體來識別血液樣本中之嗜鹼性球；及用特異於在活化之嗜鹼性球細胞表面上表現的生物標誌物的核酸配體來偵測活化之嗜鹼性球。總嗜鹼性球與活化之嗜鹼性球之間的比值隨過敏原濃度而變動。

在一具體實施例中，用於測量回應於過敏原刺激之嗜鹼性球活化之BAT包含使用特異性結合至CD203c (嗜鹼性球之生物標誌物)的核酸配體來識別血液樣本中之嗜鹼性球；及用特異於在活化之嗜鹼性球細胞表面上表現的生物標誌物的核酸配體來偵測活化之嗜鹼性球。活化生物標誌物係CD63，而核酸配體係特異性結合至CD63的適體。

由過敏原所誘導的嗜鹼性球活化係藉由計算CD63/CD203c訊號比值來測量。

在其他具體實施例中，用於測量回應於過敏原刺激之嗜鹼性球活化之BAT包含使用特異性結合至CD123(嗜鹼性球之生物標誌物)的核酸配體來識別血液樣本中之嗜鹼性球；及用特異於活化生物標誌物CD63的核酸配體來偵測活化之嗜鹼性球。由過敏原所誘導的嗜鹼性球活化係藉由計算CD63/CD123訊號比值來測量。

在本揭露之另一態樣中，提供用於診斷及/或預測個體對所感興趣之過敏原之過敏反應之方法；方法包含在用所感興趣之過敏原刺激來自個體的血液樣本之後，測量嗜鹼性球之活化。該方法被稱為嗜鹼性球活化測試(BAT)。嗜鹼性球活化係藉由在活化之嗜鹼性球表面上表現的生物標誌物來測量。

在一些具體實施例中，本BAT包含以下步驟：a)自對象收集血液樣本並將血液樣本與測試物質(例如，所感興趣之過敏原)培育以活化血液樣本中之嗜鹼性球；b)向血液樣本中引入核酸配體之混合物，該核酸配體之混合物包含針對在嗜鹼性球活化時暴露在細胞表面上之活化生物標誌物的適體，及針對在嗜鹼性球上表現的識別生物標誌物的適體，其中各適體係用不同的螢光團標記；c)捕捉未與嗜鹼性球標誌物結合的核酸配體；d)讀取螢光訊號並測量嗜鹼性球活化；及e)藉由關連螢光訊號變化及測定過敏反應來計算嗜鹼性球活化指數。

在一例示性具體實施例中，嗜鹼性球識別生物標誌物係CD203c，而特異於活化之嗜鹼性球細胞之生物標誌物係CD63。將特異性結合CD203c的適體配體用於選取血液樣本中之嗜鹼性球群體，而將特異性結合至CD63的適體配體用於標記由過敏原暴露所誘導的活化之嗜鹼性球。因此，過敏反應係藉由CD63/CD203c訊號比值來測定。

在另一例示性具體實施例中，嗜鹼性球識別生物標誌物係CD123，而特異於活化之嗜鹼性球細胞之生物標誌物係CD63。將特異性結合至CD123的適體配體用於選取血液樣本中之嗜鹼性球群體，而將特異性結合至CD63的適體配體用於標記由過敏原暴露所誘導的活化之嗜鹼性球。因此，過敏反應係藉由CD63/CD123訊號比值來測定。

在一些具體實施例中，在用測試物質刺激樣本之前，將血液樣本處理以富集嗜鹼性球群體。

在一些具體實施例中，血液樣本中之經標記之嗜鹼性球係藉由使樣本流過塗佈有與適體配體互補的錨序列的晶片之上來捕捉。

本試管內BAT係用於測定個體對所感興趣之過敏原之過敏反應的嚴重度、閥值、及程度之功能測試。

在一些具體實施例中，本試管內BAT可用於診斷及/或診斷對食物過敏原之過敏反應，諸如花生、大豆、雞蛋、小麥、牛奶、堅果、魚、貝類。在其他具體實施例中，本試管內BAT可用於診斷及/或診斷對空浮過敏原、環境過敏原、或病原體過敏原、或藥物之過敏反應。

前述已相當廣泛地概述本揭露之特徵及技術優點，以便可更好地理解下列本揭露之詳細描述。在下文中將描述本揭露之額外特徵及優勢，其形成本揭露之申請專利範圍之主題。所屬技術領域中具有通常知識者應理解，所揭示的概念及特定具體實施例可容易地採用作為用於修改或設計實現本揭露之相同目的的其他結構之基礎。所屬技術領域中具有通常知識者應理解，此類等效結構不會偏離在隨附申請專利範圍中闡述的本揭露之精神及範疇。當結合附圖來考慮時，自下列描述將更好地理解咸信為本揭露之特性的新穎特徵(就其組織及操作方法兩者而言)以及另外的目標及優勢。然而，應明確理解，該等圖中之各者僅出於說明及描述之目的而提供且不意欲界定本揭露之限制。除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與此揭露所屬之技術領域中具有通常知識者所共同理解的相同含義。在有衝突之情況下，以本說明書為準。

食物過敏很常見且盛行率不斷增加，代表為世界上許多國家的主要健康問題。因並非總是可完全預防過敏，所以精確診斷對過敏原之過敏反應係促進針對性及安全性的管理計畫以預防過敏的關鍵。現行監督口服激發試驗(OFC)之黃金標準診斷對所有進展而言實際上不可用或經濟上不可行。開發精確的診斷手段以自假陽性中釐清真實的診斷並對特定過敏原之過敏反應的嚴重度及水平進行分類的需求仍急待解決。仍需要特異性、敏感性、安全、及快速的診斷方法來測定對象在暴露於特定過敏原之後的過敏反應。

嗜鹼性球活化正成為體內過敏反應的可靠且強大的試管內指標。測量嗜鹼性球活化之嗜鹼性球活化測試(BAT)係新的診斷測試，其具有高特異性及敏感性，且可與特異性IgE (sIgE)相輔相成。作為愈來愈具有吸引力的試管內診斷工具，BAT已在過敏診斷方面受到愈來愈多的關注。然而，現行BAT係基於流式細胞之分析，其為複雜的技術且需要適當的設備。此外，現行BAT使用特異於與嗜鹼性球相關的標誌物的抗體來測量嗜鹼性球活化。一種改善且簡單的測試將使現行對過敏診斷之BAT更加進步。

根據本揭露，所提供者係用於診斷及預測個體對所感興趣之過敏原之過敏反應的基於適體之BAT。因此，本試管內BAT使用核酸配體(例如，適體配體)以識別並標記回應於過敏原(諸如食物過敏原)之活化之嗜鹼性球。核酸配體係藉由SELEX方法所選擇的適體，其特異性結合至與嗜鹼性球相關的生物標誌物。適體配體可進一步經修飾以產生用於標記嗜鹼性球之傳訊多核苷酸(signaling polynucleotides, SPN)。

此外，不是使用流式細胞技術來捕捉嗜鹼性球，而是實施核酸適體配體與其互補錨探針之雜交來捕捉嗜鹼性球的平台。

現行基於適體之BAT可與任何合適的偵測裝置及系統結合實施。作為非限制性實施例，偵測系統可包括由申請人在PCT專利申請公開案第WO2016149253號、第WO2017/160616號、第WO2018/156535號、及第WO2019/165014號；及PCT專利申請案第PCT/US2019/ 054599號中所揭示者；其各自內容係以引用方式全文併入本文中。

在一些具體實施例中，偵測系統包括取樣器以收集樣本、含有運行偵測分析所需的所有化學品的一次性莢艙、及運行及解析該分析的儀器。

本試管內BAT對現行可用的測試具有優越的特異性及敏感性。其可預估對過敏原之嚴重度、及閥值、以及過敏持續性的可能性。此外，本BAT可幫助鑑定最適用於免疫療法之患者。定義

過敏：如本文中所使用，術語「過敏(allergy)」、「過敏反應(allergic reaction/allergic response)」可互換使用以描述對遇到藉由吸入、攝取、或皮膚接觸所引入的過敏原之異常免疫反應。術語亦指對環境過敏原及藥物之臨床上不良反應，該等反應反映了涉及過敏原特異性抗體及/或T細胞的後天免疫反應性之表現。這些術語亦包括與產生過敏原特異性IgE相關的不良免疫反應。

過敏原：如本文中所使用，術語「過敏原(allergen)」係指在易感的對象中誘發過敏的任何物質。過敏原包括引發特異性IgE相關之免疫反應的任何抗原。常見的過敏原包括但不限於花粉、禾草類、灰塵、以及食物，包括但不限於、核果、牛奶、雞蛋、貝類、及毒液、及各種藥物。過敏原包括但不限於奈米粒子、金屬或金屬合金、藥物或藥劑相關之抗原；可能與動物諸如昆蟲類或蛛形類有關的各種生物物質(例如，蛋白質)。因此，過敏原一般被稱為抗原。

生物標誌物：如本文中所使用，術語「生物標誌物(biomarker)」係指包括但不限於蛋白質、核酸、及代謝物、以及彼等的多態形(polymorphism)、同功型體、突變體、衍生物、變體、修飾體、及前驅物的分子，包括核酸及前蛋白(pro-protein)、裂解產物、受體(包括可溶性受體(soluble receptor)及穿膜受體)、次單元、片段、配體、蛋白質-配體複合物、多聚體複合物(mulitmeric complex)、及降解產物、元素、相關之代謝物、及其他分析物或樣本衍生之量度(sample-derived measure)。生物標誌物易可包括突變之蛋白質或突變之核酸。生物標誌物亦包括數學上產生的任何計算指數或任何一或多種前述量度值之組合。在本揭露之上下文中，生物標誌物係特異於嗜鹼性球的分子，其允許正確識別嗜鹼性球。

互補：如本文中所使用，術語「互補(complementary)」或「補體(complement)」係指多核苷酸藉由鹼基配對(諸如A-T(U)及C-G配對)之自然結合。兩個單股分子可為部分互補，使得僅有一些的核酸結合，或其可為「完全」互補，使得在單股分子之間存在整體互補性(total complementarity)。核酸股之間的互補性程度對於核酸股之間的雜交效率及強度具有顯著的影響。

流式細胞術：如本文中所使用，術語「流式細胞術(flow cytometry)」係指測量呈大略相同尺寸或處於大略相同階段之單一細胞或廣義來說其他生物或非生物粒子之物理或化學特性的過程。在流式細胞術中，測量係在細胞或粒子在流體流中通過測量設備(流式細胞儀)時進行。細胞分選儀、或流動分類儀係一種流式細胞儀，其使用電氣及/或機械手段來轉移及收集具有落入使用者選擇之範圍值內的測量特性的細胞(或其他小粒子)。

雜交：如本文中所使用，術語「雜交(hybridization)」係指多核苷酸股與互補股在所定義的雜交條件下通過鹼基配對而黏合的過程。特異性雜交係指示兩條核酸序列共享高度的同一性，諸如本揭露之適體配體及該適體的短互補序列。特異性雜交複合物在容許的黏合條件下形成，並在(多個)「清洗」步驟之後仍保持雜交。(多個)清洗步驟在判定雜交過程之嚴格度方面特別重要，其中愈嚴格的條件使非特異性結合(亦即在不完美匹配的核酸股對之間的結合)愈低。

配體：如本文中所使用，術語「配體(ligand)」係指可結合至目標(諸如受體及細胞表面上之生物標誌物等)的任何分子。配體包括但不限於蛋白質、抗體、多肽、核酸(DNA、RNA、及其經修飾之形式)、寡核苷酸(例如，適體)、肽、類肽(peptoid)、多胺、碳水化合物、脂質、及小分子。在本揭露之上下文中，配體係核酸分子，特別是特異性結合至生物標誌物(例如嗜鹼性球之生物標誌物)的適體。

核酸：如本文中所使用，用語「核酸(nucleic acid)」、「多核苷酸(polynucleotide)」、「寡核苷酸(oligonucleotide)」可互換使用。核酸分子係由至少兩個核苷酸共價連接在一起所組成的核苷酸之聚合物。核酸分子係DNA(去氧核醣核苷酸)、RNA(核醣核苷酸)以及重組RNA及DNA分子、或使用核苷酸類似物生成的DNA或RNA之類似物。核酸可為單股或雙股、線性或環狀。術語「核酸(nucleic acid)」在其廣義上包括包含核苷酸之聚合物的任何化合物及/或物質。這些聚合物通常被稱為多核苷酸。本發明之例示性核酸分子或多核苷酸包括但不限於D-或L-核酸、核糖核酸(RNA)、去氧核醣核酸 (DNA)、蘇糖核酸(threose nucleic acid, TNA)、乙二醇核酸(glycol nucleic acid, GNA)、肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)、鎖核酸(LNA，包括具有β- D-核糖組態的LNA、具有α-L-核糖組態(LNA的非鏡像異構物)的α-LNA、具有2’-胺基官能化的2’-胺基-LNA、及具有2’-胺基官能化的2’-胺基- α-LNA)、或其雜交體。術語亦包含核酸的片段，諸如可使用所揭示的萃取方法回收的自然存在的RNA或DNA，或試管內人工合成的人工DNA或RNA分子(亦即，合成的多核苷酸)。核酸之分子量亦不受限制，可視需要的在幾個鹼基對(bp)至幾百個鹼基對之範圍內，例如約2個核苷酸至約1,0000個核苷酸、或約10個核苷酸至約5,000個核苷酸、或約10個核苷酸至約1,000個核苷酸。

術語「核苷酸(nucleotide)」係指核酸之單體，包含雜環鹼基、糖、及一或多個磷酸基團的化學化合物。鹼基係嘌呤及嘧啶之衍生物，且糖係戊糖，不是去氧核糖就是核糖。

樣本：如本文中所使用，術語「樣本(sample)」係指可能含有待分析之所感興趣之目標的任何組成物，該所感興趣之目標包括但不限於獲自對象的生物樣本(諸如血液樣本)、獲自環境的樣本(例如土壤樣本、水樣本、農業樣本(包括植物及作物樣本))、或食物樣本。食物樣本可獲自新鮮食物、處理/烹煮之食物或冷凍食物。

敏感性：如本文中所使用，術語「敏感性(sensitivity)」意指偵測分子對結合至目標分子之能力。術語「敏感性(sensitivity)」及「反應性(reactivity)」可互換使用。

特異性結合：如本文中所使用，術語「特異性結合(specifically bind)」意指適體以比其與另外目標分子更持久及更大的親和力之方式與特定目標分子更頻繁地、更快速地反應或締合。例如，特異性結合至目標過敏原的適體以比其結合至不相關之過敏原蛋白質及/或其部分或片段更大的親合力、結合力(avidity)、更快速地及/或更持久之方式結合該過敏原或其結構部分或片段。藉由閱讀此定義應理解，例如，特異性結合至第一目標的適體可特異性結合或可不特異性結合至第二目標。因此，「特異性結合」不一定需要另一分子之排他性結合或無法測得的結合，此由術語「選擇性結合(selective binding)」所涵蓋。結合的特異性係根據適體對目標相較於環境中適體與其他材料或總體上非相關之分子的解離常數的對比解離常數(comparative dissociation constant) (Kd)來定義。一般而言，適體相對於目標的Kd比相對於目標與環境中之不相關之分子或伴隨分子的Kd小2倍、5倍、或10倍。甚至更佳地，Kd將低50倍、100倍、或200倍。

對象：如本文中所使用，術語「對象(subject)」、「個體(individual)」、及「患者(patient)」可互換使用，且係指脊椎動物、較佳地為哺乳動物、更佳地為人類。哺乳動物包括但不限於鼠類、類人猿、人類、農畜、運動動物、及寵物。

目標：如本文中所使用，術語「目標(target)」及「目標分子(target molecule)」係指可在測試之樣本中發現，且能夠結合至偵測分子(諸如適體或抗體)的分子。 嗜鹼性球活化測試 (BAT)

嗜鹼性球係在血液流中循環的一類白血球且屬於顆粒性白血球。儘管在人類血液中嗜鹼性球的含量低(小於白血球部分之2%)，但嗜鹼性球如同肥大細胞一樣，藉由釋放包括組織胺及白三烯的有效發炎介質而被認為是過敏超敏性反應(allergic hypersensitivity reaction)之重要效應細胞。

免疫球蛋白E (IgE)代表一類的免疫球蛋白。已知其參與過敏反應。循環IgE分子經由嗜鹼性球上之高親和力IgE受體(FcεRI)結合至嗜鹼性球膜。在此上下文中，一種使用流式細胞術技術被稱為嗜鹼性球活化測試(BAT)的新的嗜鹼性球分析在診斷對各種過敏原之過敏反應方面已受到愈來愈多的關注。BAT係測量IgE功能的功能性分析，亦即在過敏原存在下誘發嗜鹼性球之活化的能力。試管內BAT密切複製了第I型超敏性反應(當過敏個體暴露於過敏原中時該超敏性反應在體內發展)且因此可在過敏疾病之診斷及預測及研究應用方面具有臨床應用。

BAT係在過敏原刺激之後藉由測量在活化之嗜鹼性球表面上生物標誌物之表現來測量活化之嗜鹼性球百分比，該等生物標誌物係在由過敏原或抗IgE刺激產生的IgE抗體與高親和力IgE受體(FcεRI)結合之交聯後上調。幾個報告已證實，活化之嗜鹼性球百分比與過敏反應(例如食物過敏反應)之嚴重度緊密關聯。對過敏原具有嚴重反應的個體可顯示出更高的嗜鹼性球反應性，並會對較低劑量的過敏原做出反應( Alexandra 等人 ,Distinct parameters of the basophil activation test reflect the severity and threshold of allergic reactions to peanut , J Allergy Clin Immunol.,2015; 135(1):179-186)。

嗜鹼性球反應性與過敏原誘導之IgE媒介之過敏反應及全身性過敏反應密切相關；過敏反應愈嚴重，嗜鹼性球反應性愈大(亦即，活化之嗜鹼性球百分比愈高)。活化之嗜鹼性球百分比愈高會造成嗜鹼性球脫粒(degranulating)百分比愈高且血管活性介質(vasoactive mediator)釋放之量愈高，導致更嚴重的症狀。據 Santos等人報告，可將過敏原特異性嗜鹼性球反應性(如藉由CD63花生/抗IgE所測量)及嗜鹼性球敏感性(如藉由CD-sens所測量)用作在OFC期間對花生之過敏反應之嚴重度及閥值之生物標誌物。因此，BAT可用於測定對特定過敏原(諸如食物過敏原)之過敏反應之嚴重度、閥值、及程度。

嗜鹼性球群體之精確識別係有效解讀測試結果之先決條件。許多不同的標誌物可用於識別嗜鹼性球並藉由流式細胞術定量彼等的活化。細胞表面標誌物或彼等的組合可允許正確識別嗜鹼性球。

如本文中所使用，術語「識別生物標記(identification biomarker)」係指在特定類型的細胞上組成性及特異性表現的分子。例如，CD203c在嗜鹼性球上組成性及特異性表現且通常用作嗜鹼性球之識別生物標誌物。在一些具體實施例中，可將特異於嗜鹼性球的識別生物標誌物用於BAT中以自樣本進行嗜鹼性球之陽性選擇。例如，可識別嗜鹼性球的標誌物包括但不限於CCR3、CD203c、CD123、CD3、IgE、及CRTH2。

如本文中所使用，術語「活化生物標誌物(activation biomarker)」係指在過敏原刺激後被誘導暴露於細胞表面中的分子，從而指示嗜鹼性球活化。在測試物質(例如，過敏原)之刺激後與嗜鹼性球活化緊密相關的分子可用於測量嗜鹼性球活化。已發現CD63(又名溶酶體相關之膜蛋白質(LAMP-3))為嗜鹼性球活化標誌物( Knol 等人 ,Monitoring human basophil activation via CD63 monoclonal antibody 435. J Allergy Clin Immunol.1991; 88:328-338)。CD63主要與細胞內囊泡之膜相關且可經誘導而在活化之嗜鹼性球細胞之細胞表面上表現，因此在BAT中作為流式細胞術定量活化之嗜鹼性球之生物標誌物。嗜鹼性球活化標誌物包括但不限於在嗜鹼性球上之CD203c、CD63、CD13、CD69、CD107a、CD107b、CD164、CD80、CD86、CD40L、HLA-DR、CD123、CD193、CRTH2、CCR3、及其他細胞外標誌物、或細胞內標誌物諸如Ph-CREB、Ph-STATS、Ph-S6rp、Ph-eIF4E、CREB、或mTOR途徑蛋白質(mTOR pathway protein)、或其他磷酸化相關之標誌物、或與嗜鹼性球之活化相關的其他蛋白質或小分子。細胞內分子(諸如p38、MAPK、及STAT5)之一些嗜鹼性磷酸化可替代地用於測量嗜鹼性球活化( Ebo 等人 ,Combined analysis of intracellular signaling and immunophenotype of human peripheral blood basophils by flow cytometry: a proof of concept. Clin Exp Allergy.2007; 37(11): 1668-1675)。生理狀況可為暴露於物質、過敏原、藥物、蛋白質、化學品、或其他刺激物之結果，或可能為移除物質、過敏原、藥物、蛋白質、化學品、或其他刺激物之結果。

如本文中所使用，術語「細胞表面標誌物(cell surface marker)」係指在特定類型的細胞表面上發現的抗原決定位或表位。細胞表面標誌物可促進細胞類型之表徵、其識別、及最終地其單離。細胞分選技術係基於細胞生物標誌物，其中一或多種細胞表面標誌物用於自細胞群體中進行陽性選擇或陰性選擇(亦即包括或排除)。

CD203c及CD63分別係最常使用的嗜鹼性球識別及活化標誌物。CD203c係僅在嗜鹼性球上組成性及特異性表現的譜系特異性嗜鹼性球標誌物(lineage-specific basophil marker)且通常用作單一識別標誌物或與其他標誌物組合使用。CD63係在用過敏原刺激且嗜鹼性球活化/脫粒後，在嗜鹼性球表面上上調。CD193及CD123亦可用作嗜鹼性球標誌物。

BAT在食物過敏中之應用已報告各種食物過敏原，諸如花生( Sabato 等人 ,Basophil activation reveals divergent patient-specific responses to thermally processed peanuts. J Investig Allergol Clin Immunol.2011; 21(7): 527-531)及牛奶( Rubio 等人 ,Benefit of the basophil activation test in deciding when to reintroduce cow’s milk in allergic children. Allergy.2011; 66(1): 92-100))。BAT在許多過敏反應調查中均顯示高特異性及敏感性。例如，在大型花生過敏研究中，BAT在新的獨立群體中得到外部驗證並顯示出100%特異性。高特異性意指的是BAT對花生呈陽性，其確認花生過敏而無需口服激發試驗(OFC)( Santos 等人 ,Basophil activation test discriminates between allergy and tolerance in peanut-sensitized children. J Allergy Clin Immunol.2014; 134(3): 645-652)。在魯比歐(Rubio)的牛奶測試中，如與皮膚測試、及抗牛奶IgE抗體測量相比，BAT產生最高的特異性(90%)及敏感性(91%)、具有81%的最高的陽性預估值、及具有96%的最高的陰性預估值( Allergy.2011; 66(1): 92-100)。用其他食物(諸如雞蛋及堅果過敏原)獲得了類似結果。

在BAT中，通常使用針對嗜鹼性球識別及活化生物標誌物的抗體來標記嗜鹼性球，以進行標記之嗜鹼性球之流式細胞術分選。改良之BAT用更簡單的技術來測量嗜鹼性球活化。本申請案揭示用於食物過敏診斷及或/預測之基於核酸配體之BAT平台。在一個例示性具體實施例中，核酸配體係適體配體，其中適體取代用於現行BAT分析中之針對嗜鹼性球細胞標誌物的抗體，且其中適體以高親和力及特異性結合至嗜鹼性球細胞標誌物。適體

根據本揭露，使用特異性結合至生物標誌物的基於核酸之配體。核酸配體係適體或其衍生物。

適體(有時亦稱為化學抗體(chemical antibody))係單股寡核苷酸(RNA或單股DNA)，其形成能夠以高親力及特異性結合至各種分子目標的穩定但獨特的三維確認。適體以與抗體大致一樣的方式結合至蛋白質目標並調節蛋白質功能。適體比抗體更具有優勢在於彼等免疫性較差、穩定、且通常比抗體更緊密地接合至目標分子。通常，適體可藉由試管內轉錄、PCR、或化學合成而容易且大量的合成( Annu.Rev. Med. 2005, 56, 555-583; Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 123-132)，且目標特異性適體可自隨機序列、單股核酸庫藉由稱為SELEX(指數富集配體之系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment))的試管內選擇及放大程序來選擇。經選擇之適體係摺疊成明確三維結構的小單股核酸。適體對彼等的目標分子顯示高親和力及特異性。此外，適體具有簡化其工業化的重要特性。例如，適體係熱穩定的，所以彼等可容易儲存及運輸。鑒於成熟的化學合成及修飾技術，適體可大規模生產或修飾，且批次間的差異最小。

就生化分析而言，適體係可用且具成本效益的工具。此外，適體可針對似乎無限範圍的目標快速開發。時至今日，已成功發展出針對多樣目標的特異性適體，包括小無機鐵、有機肽、藥物、蛋白質(例如生物標誌物)、脂質、及甚至複雜的細胞及微生物。近來幾個評論概述了適體在各種領域中作為靶向包括所感興趣之生物標誌物之配體的應用( Guan 等人 ,Aptamers as versatile ligands for biomedical and pharmaceutical applications, Int. J Nanomedicine., 2020; 15:1059-1071；及 Ozalp 等人 ,Aptamers: molecular tools for medical diagnosis. Curr. Top Med Chem., 2015; 15(12):1125-1137；其各自內容係以引用方式全文併入本文中)。

如本文中所使用，「適體(aptamer)」係結合至特定目標分子並調節目標的活性、結構、或功能的生物分子。本發明之適體可為基於核酸或基於胺基酸。核酸適體通過交互作用而非典型的瓦生克立克(Watson-Crick)鹼基配對而對分子具有特異性結合親和力。核酸適體，如同由噬菌體展示所生成的肽或單株抗體(mAbs)一樣，能夠特異性結合至所選擇的目標，且通過結合，阻斷彼等的目標發揮功能之能力。在一些情況下，適體亦可為肽適體。如本文中所使用，「適體(aptamer)」特別係指核酸適體或肽適體。

典型的核酸適體大小為大約10至15 kDa(25至45個核苷酸)，以次奈米莫耳親和力(sub-nanomolar affinity)結合其目標，並辨別密切相關之目標。核酸適體可為RNA(核糖核酸)、DNA(去氧核醣核酸)、或混合之DNA及RNA。適體可為單股RNA、DNA、或混合之RNA及DNA。

適體可為單價或多價的。適體可為單體、二聚體、三聚體、四聚體、或其他更高級的多聚體。可將個別的適體單體連接以形成多聚體適體融合分子。作為非限制性實施例，可將連接用寡核苷酸(linking oligonucleotide)(亦即，連接子)設計成含有與隨機適體之5’-臂及3’-臂區域皆互補的序列以形成二聚體適體。對於三聚體或四聚體適體，將小的三聚體或四聚體(亦即，類哈勒戴氏連結(Holliday junction-like))DNA奈米結構工程改造成包括與隨機適體的3’-臂區域互補的序列，由此通過雜交來產生多聚體適體融合。此外，可將富含3至5或5至10 dT的核苷酸工程改造成連接子多核苷酸以作為適體結合基序之間的單股區域，其提供多個適體之可撓性及自由度以協調或協同與細胞配體或受體的多價交互作用。替代地，多聚體適體亦可藉由將生物素化適體與鏈黴親和素混合來形成。

如本文中所使用，術語「多聚體適體(multimeric aptamer)」或「多價適體(multivalent aptamer)」係指包含多個單體單元的適體，其中各單體單元其自身可為適體。多價適體具有多價結合特性。多聚體適體可為同型多聚體(homomultimer)或異型多聚體(heteromultimer)。術語「同型多聚體(homomultimer)」係指包含多個相同種類之結合單元的多聚體適體，亦即各單元結合至相同目標分子的相同結合部位。術語「異型多聚體(heteromultimer)」係指包含多個不同種類之結合單元的多聚體適體，亦即各結合單元結合至相同目標分子之不同結合位點，或各結合單元結合至不同目標分子上之結合位點。因此，異型多聚體可係指結合至一個目標分子之不同位點處的多聚體適體或結合至不同目標分子的多聚體適體。結合至不同目標分子的異型多聚體亦可稱為多特異性多聚體。 1. 選擇特異於目標的適體

適體可藉由稱為指數富集配體之系統進化技術(SELEX)的方法人工生成( Tuerk and Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, 1990; 249:505-510；及 Ellington and Szostak, In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature, 1990; 346:818-822；其各自內容係以引用方式全文併入本文中)。此方法允許與目標分子具有高度特異性結合的核酸分子之試管內進化。SELEX方法及改良進一步描述於例如美國專利第10,546,650號、第9,454,642號、第8,680,017號、第7,964,356號、第7,087,735號、第6,716,583號、第5,817,785號、第5,475,096號、及第5,270,163中；其各自內容係以引用方式全文併入本文中。

SELEX™過程係基於以下獨特見解：核酸具有足夠形成各種二維及三維結構的能力且在彼等的單體內可得到足夠的化學通用性(chemical versatility)，以充當幾乎任何化學化合物(無論單體還是聚合的)的配體(亦即，形成特異性結合對)。

SELEX™過程以包含隨機化序列的大型單股寡核苷酸庫或池為依據作為起點。寡核苷酸可為經修飾或未經修飾之DNA、RNA、或DNA/RNA雜交物。在一些實施例中，池包含100%隨機或部分隨機寡核苷酸。在其他實施例中，池包含隨機或部分隨機的寡核苷酸，該等隨機或部分隨機的寡核苷酸含有至少一個固定序列及/或保守序列併入隨機化序列內。在其他實施例中，池包含隨機或部分隨機的寡核苷酸，該等隨機或部分隨機的寡核苷酸在其5’端及/或3’端含有至少一個固定序列及/或保守序列，該至少一個固定序列及/或保守序列可包含由寡核苷酸池之所有分子所共享的序列。固定序列係池中之寡核苷酸共有的序列，其為預定的目的而併入，諸如CpG基序、PCR引子之雜交位點、RNA聚合酶之啟動子序列(例如，T3、T4、T7、及SP6)、限制位點、或均聚序列(諸如聚A(poly A)或聚T(poly T)束)、催化核心、與親和力管柱選擇性結合之位點、及促進所感興趣之寡核苷酸之選殖及/或定序的其他序列。保守序列係不同於先前描述的固定序列的序列，由結合至相同目標的許多適體所共享。

隨機化核苷酸可以許多方式生產，包括化學合成及自隨機切割之細胞核酸的尺寸選擇，例如，使用所屬技術領域中眾所周知的固相寡核苷酸合成技術及液相方法(諸如三酯合成方法)的磷酸二酯連接之核苷酸。在自動化DNA合成設備上進行的一般合成產出10 ¹⁴至10 ¹⁶個個別分子，對大多數SELEX™實驗而言係足夠的數量。隨機序列可為任何長度且可包含核醣核苷酸及/或去氧核醣核苷酸，且可包括經修飾或非天然存在之核苷酸或核苷酸類似物(參見例如US 5,958,691及US 5,660,985)。測試核酸中之序列差異亦可在選擇/擴增疊代之前或期間藉由突變誘發來引入或增加。

用於適體選擇之寡核苷酸庫可為RNA、DNA、或RNA/DNA雜交物。DNA寡核苷酸庫可藉由在DNA合成儀上之自動化化學合成來生成，而寡核苷酸之RNA庫一般使用T7 RNA聚合酶或經修飾之T7 RNA聚合酶藉由試管內轉錄DNA庫來生成。然後，在有利於結合的條件下將RNA或DNA庫與目標(例如，生物標誌物)混合並使用相同的通用選擇方案進行結合、分離、及擴增之逐步疊代，以達到如本申請案中所定義的結合親和力及選擇性之所欲標準。

結合親和力描述了分子彼此之間結合或親和力之強度的量度。本文中之適體相對於目標及其他分子之結合親和力係根據K _d定義。解離常數可藉由所屬技術領域中已知的方法來測定。然而，已觀察到對於一些小寡核苷酸，直接測定K _d係困難的，且可導致誤導地高結果。在這些情形下，可相對於已知結合目標或候選物的物質進行目標分子或其他候選物物質的競爭性結合分析。發生50%抑制時之濃度(K,)在理想條件下等於K _d。 2.適體修飾

根據本揭露，寡核苷酸及適體可進一步經修飾以改善彼等的穩定性。本揭露亦包括如本文中所述之類似物及/或設計用以改善適體之一或多種特性(諸如防止核酸酶消化)的額外修飾。在本揭露中設想的寡核苷酸修飾包括但不限於對核酸配體鹼基或對整體核酸配體提供併入額外電荷、極性、疏水性、氫鍵結、靜電交互作用、及流變性的其他化學基團者。

生成對核酸酶具有抗性的寡核苷酸之修飾亦可包括一或多個取代的核苷酸間鍵聯、改變糖、改變鹼基、或其組合。此類修飾包括2’-位置的糖修飾、5-位置的嘧啶修飾、8-位置的嘌呤修飾、在環外胺(exocyclic amine)處之修飾、4-硫代尿苷之取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶之取代、主鏈修飾、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修飾、甲基化、及罕見的鹼基配對組合，諸如，異鹼基異胞苷(isobase isocytidine)及異鳥苷(isoguanosine)；3’及5’修飾諸如帽蓋；與高分子量、非免疫性化合物共軛；與親脂性化合物共軛；及磷酸主鏈修飾。

在一些具體實施例中，適體包含至少一種化學修飾。在一些具體實施例中，化學修飾係選自核酸在糖位置處之化學取代、在磷酸位置處之化學取代、及在鹼基位置處之化學取代。在其他具體實施例中，化學修飾係選自併入經修飾之核苷酸；3’帽蓋；與高分子量、非免疫性化合物共軛；與親脂性化合物共軛；及將硫代磷酸酯併入磷酸主鏈中。在較佳具體實施例中，高分子量、非免疫性化合物係聚伸烷基二醇、且更佳地係聚乙二醇(PEG)。將PEG與另一分子(通常為藥物或治療性蛋白質)共價共軛之過程稱為聚乙二醇化(PEGylation)。聚乙二醇化通常藉由PEG之反應衍生物與目標分子之培育來達成。將PEG與藥物或治療性蛋白質之共價附接可遮蔽藥物免於宿主的免疫系統侵害，從而提供降低之免疫原性及抗原性，並增加藥劑之流體動力學尺寸(溶液中之尺寸)，藉由降低腎清除率來延長藥劑循環時間。聚乙二醇化亦可為疏水性藥物及蛋白質提供水溶性。

在另一較佳具體實施例中，3’帽係反向去氧胸苷帽。

在一些具體實施例中，提供核酸適體，其中P(O)O基團被P(O)S(「硫代酸酯(thioate)」)、P(S)S(「二硫代酸酯(dithioate)」)、P(O)NR2(「胺基酸酯(amidate)」)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(「甲縮醛(formacetal)」)、或3’-胺(—NH—CH2—CH2—)置換，其中各R或R’係獨立地H或經取代或未經取代之烷基。鍵聯基團可通過—O—、—N—、或—S—鍵聯附接至相鄰核苷酸。並非在核酸適體中之所有鍵聯都需要相同。

作為非限制性實例，核酸適體分子可包括D-核糖或L-核糖核酸殘基，且亦可包括至少一個經修飾之核糖核苷，包括但不限於2’-O-甲基修飾之核苷、包含5’硫代磷酸酯基團的核苷、連接至膽固醇基衍生物或十二酸雙癸醯胺基團的末端核苷、鎖核苷(locked nucleoside)、無鹼基核苷(abasic nucleoside)、反向去氧核苷或反向核糖核苷、2’-去氧-2’-氟修飾之核苷、2’-胺基修飾之核苷、2’-烷基修飾之核苷、N-嗎啉基核苷、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、或包含核苷之非天然鹼基、或其任何組合。替代地核酸適體可包含至少兩個經修飾之核糖核苷、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、或更多個經修飾之核糖核苷，至多分子之整個長度。對於核酸分子中此種複數個經修飾之去氧-或核糖核苷之各者而言，修飾不需是相同的。

適體可包含經修飾之核鹼基(所屬技術領域中通常簡稱為「鹼基」)以增加對彼等的目標蛋白質之親和力及特異性。如本文中所使用，「未經修飾(unmodified)」或「天然(natural)」核酸鹼基包括嘌呤鹼基：腺嘌呤(A)及鳥糞嘌呤(G)，及嘧啶鹼基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。例如，經修飾之鹼基可為在其5-位置處由疏水性基團(諸如苄基、萘基、或吡咯苄基)所修飾的嘧啶。經修飾之核苷可例示為5-(N-苄基羧醯胺)-2’-去氧尿苷(稱為BzdU)、5-(N-萘基羧醯胺)-2’-去氧尿苷(稱為NapdU)、5-(N-4-吡咯苄基羧醯胺)-2’-去氧尿苷(稱為4-PBdU)、5-(N-苄基羧醯胺)-2’-去氧胞苷(稱為BzdC)、5-(N-萘基羧醯胺)-2’-去氧胞苷(稱為NapdC)、5-(N-4-吡咯苄基羧醯胺)-2’-去氧胞苷(稱為4-PBdC)、5-(N-苄基羧醯胺)-2’-尿苷(稱為BzU)、5-(N-萘基羧醯胺)-2’-尿苷(稱為NapU)、5-(N-4-吡咯苄基羧醯胺)-2’-尿苷(稱為4-PBU)、5-(N-苄基羧醯胺)-2’-胞苷(稱為BzC)、5-(N-萘基羧醯胺)-2’-胞苷(稱為NapC)、5-(N-4-吡咯苄基羧醯胺)-2’-胞苷(稱為4-PBC)、及類似者，但不限於此。進一步核酸鹼基包括揭示於美國專利案第3,687,808號中者、揭示於Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008中者；揭示於The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990中者、由Englisch等人, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613所揭示者、及由Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993所揭示者。

適體可進一步經修飾以提供對核酸酶及其他酶活性的保護。適體序列可藉由所屬技術領域中已知的任何適當方法來修飾。例如，可將硫代磷酸酯併入主鏈中，且可在ssDNA之5’端中包括5’-修飾之嘧啶以用於DNA適體。就RNA適體而言，可使用T7 RNA聚合酶突變體將經修飾之核苷酸(諸如例如用2’-去氧-NTP或2’-氟-NTP取代核糖主鏈之2’-OH基團)併入RNA分子中。這些經修飾之適體對核酸酶之抗性可藉由將彼等與純化之核酸酶或來自小鼠血清的核酸酶培育來測試，而適體的完整性可藉由凝膠電泳來分析。

在一些具體實施例中，此類經修飾之核酸適體可完全由經修飾之核苷酸、或用經修飾之核苷酸之子集來整體合成。修飾可為相同或不同的。所有核苷酸皆可經修飾，且都可含有相同的修飾。所有核苷酸皆可經修飾，但含有不同的修飾，例如，含有相同鹼基的所有核苷酸可具有一種類型的修飾，而含有其他鹼基的核苷酸可具有不同類型的修飾。例如，所有嘌呤核苷酸可具有一種類型的修飾(或未經修飾)，而所有嘧啶核苷酸具有另一種不同類型的修飾(或未經修飾)。以此方式，使用本文中所揭示之修飾之任何組合來生成寡核苷酸、或寡核苷酸庫。 3.針對嗜鹼性球特異性生物標誌物的適體配體

根據本揭露，提供特異性結合至嗜鹼性球特異性生物標誌物的適體及其衍生物。

在一些具體實施例中，適體合適的核苷酸長度在約15至約100核苷酸(nt)之範圍內，且在不同的其他較佳具體實施例中，長度為15至30nt、20至25nt、30至100nt、30至60nt、25至70nt、25至60nt、40至60nt、25至40nt、30至40nt、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 、或40nt、或40至70 nt中任一者。在一些具體實施例中，適體長度可為41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、或70nt。在其他具體實施例中，適體長度可為71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100nt。然而，可將序列設計成具有足夠的可撓性，使得其可順應適體在本文中所述之距離處與兩個目標之交互作用。

在一些具體實施例中，核酸適體包含一或多個雙股特徵區域。此類雙股區域可源自內部自身互補或與第二個或其他適體或寡核苷酸分子的互補。在一些具體實施例中，雙股區域長度可為4至12、4至10、4至8個鹼基對。在一些具體實施例中，雙股區域可為5、6、7、8、9、10、11、或12個鹼基對。在一些具體實施例中，雙股區域可形成主幹區域(stem region)。此類具有雙股特徵的延伸主幹區域可用以穩定核酸適體。如本文中所使用，術語「雙股特徵(double stranded character)」意指在兩個核酸分子之任何長度上，彼等的序列超過50百分比的長度形成鹼基配對(標準或非標準的)。

根據本揭露之某些具體實施例，提供適體之變體及衍生物。術語「衍生物(derivative)」係與術語「變體(variant)」同義地使用，且係指相對於參考或起始適體已以任何方式修飾或改變的分子。相較於參考或起始序列，適體變體之核酸序列可在核酸序列內的某些位置處具有取代、刪除、及/或插入。通常，變體與參考序列具有至少約50%同一性(同源)，且較佳地，彼等與參考序列為至少約80%、更佳地至少約90%同一的(同源的)。

在一些具體實施例中，提供適體之變體擬似物。如本文中所使用，術語「變體模擬物(variant mimic)」係含有一或多個模擬活化之序列的核酸者。變體模擬物之核酸序列可包含自然存在的核酸、或替代地，非自然存在的核酸。

將基於適體之配體用標誌物標記以用於訊號偵測。在一些具體實施例中，將配體用螢光染料標記，該螢光染料選自但不限於Alex Fluor ®螢光團(諸如Alex 514、Alex 532、Alex 546、Alex 555、Alex 568、Alex 594、Alex 610、Alex 633、Alex 635、Alex 647、Alex 660、Alex 680、Alexa 700、Alex 750、Alex 800、Alex 610-R-藻紅素(R-PE)、Alex 647-R-藻紅素(R-PE)、Alex 680-R-藻紅素(R-PE)、及Alex 680-異藻藍素(APC))、異藻藍素(APC)及其衍生物、Cy螢光團(例如，Cy3.5、Cy3-FITC、CY5、CY 5.5、CY7、CY7-APC、CY5.5-APC)、Qdots、TRITC、R-PE、Tamara、羅丹明紅-X (Rhodamine Red-X)、Rox、TruRed、SYPRO紅(SYPRO red)、BODIPY TR、碘化丙啶(Propidium iodide)及德克薩斯紅(Texas red)。在一些實施例中，螢光染料係Alex 647、Cy5、CY3-FITC、或德克薩斯紅。

作為非限制性實施例，適體配體可結合至嗜鹼性球之識別生物標記，包括但不限於CCR3、CD203c、CD123、CD3、及CRTH2。在一個較佳具體實施例中，適體配體係特異於CD203c。

本揭露之適體配體可結合至嗜鹼性球活化生物標誌物，包括但不限於CD203c、CD63、CD13、CD69、CD107a、CD107b、CD164、CD80、CD86、CD40L、HLA-DR、CD123、CRTH2、CCR3。在一個較佳具體實施例中，適體配體係特異於CD63。特異於CD63的一些例示性適體可包括於美國專利申請公開案第US20170044546號中之SEQ ID No：122至183的適體；及LL4A ( Li 等人 , Molecular Ther. Nucleic Acids, 2019; 18:727-738)；其各自內容係以引用方式全文併入本文中。

在一些具體實施例中，適體配體結合至最常用的嗜鹼性球活化標誌物CD63及CD203c。適體 -BAT 平台

本試管內BAT使用核酸配體(例如，適體配體)測量由所感興趣之過敏原所誘導的嗜鹼性球活化以用於診斷及/或預測個體對所感興趣之過敏原之過敏反應。此即時基於適體之BAT平台(point-of-care aptamer-based BAT platform)可在五分鐘內診斷過敏反應。在一些具體實施例中，BAT可在三分鐘內診斷過敏反應。

用於測量由過敏原刺激所誘導的鹼性球活化之BAT包含使用特異性結合至嗜鹼性球識別生物標誌物的核酸配體來識別血液樣本中之嗜鹼性球；及用特異於在活化之嗜鹼性球細胞表面上表現的生物標誌物的核酸配體來偵測活化之嗜鹼性球。由所感興趣之過敏原所誘導的嗜鹼性球活化係藉由計算識別標誌物與活化標誌物的訊號比值來測定。

作為非限制性實施例，嗜鹼性球識別生物標誌物係CD203c，而核酸配體係特異性結合至CD203c的適體。活化生物標誌物係CD63，而核酸配體係特異性結合至CD63的適體。由所感興趣之過敏原所誘導的嗜鹼性球活化係藉由計算CD63/CD203c訊號比值來測定。

根據本揭露，提供用於診斷及/或預測個體對測試物質(例如，食物過敏原)之過敏反應之方法。方法包含測定由測試物質所誘導的嗜鹼性球活化，其中嗜鹼性球活化係藉由指示在嗜鹼性球細胞表面上之二或多種生物標誌物之表現的螢光訊號變化來測量；方法包含以下步驟：a)從個體收集血液樣本並將血液樣本與測試物質培育以活化血液樣本中之嗜鹼性球；b)向血液樣本中引入核酸配體之混合物，該核酸配體之混合物包含針對在嗜鹼性球活化時暴露在細胞表面上之活化生物標誌物的適體，及針對在嗜鹼性球上表現的識別生物標誌物的適體，其中各適體係用不同的螢光團標記；c)捕捉未與嗜鹼性球標記結合的核酸配體；d)讀取螢光訊號並測量嗜鹼性球活化；及e)藉由關連螢光訊號變化及測定過敏反應來計算嗜鹼性球活化指數。

血液樣本可為來自對象的全血或單離之周邊血液單核細胞(PBMC)，其包括嗜鹼性球。PBMC可使用所屬技術領域中已知的標準方法諸如密度梯度分離(density gradient separation)來單離，並使用磁性粒子之額外負向選擇以允許嗜鹼性球的富集( Gibbs, 等人 ,A rapid two-step procedure for the purification of human peripheral blood basophils to near homogeneity. Clin Exp Allergy.2008; 38(3): 480-485；其各自內容係以引用方式全文併入本文中)。

在一個例示性具體實施例中，血液樣本係全血。全血樣本係緊接在進行BAT前收集(在BAT之前4小時內)。亦可在BAT之前處理收集之血液樣本並儲存在4°C下至少24小時。收集用於BAT之全血通常在肝素、及/或其他抗凝劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))或檸檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose, ACD)中進行以抑制嗜鹼性球脫粒。例如，血液樣本可為抗凝血液樣本。

樣本可係人類或動物全血樣本。

測試物質可為過敏原，諸如食物過敏原、藥物過敏原、病原體過敏原、或空浮過敏原。在一些具體實施例中，在BAT期間誘導嗜鹼性球活化之過敏原範圍自粗萃取物至重組或純化之單一過敏原來源。

核酸配體(亦即適體及其衍生物)可用螢光團標記，該螢光團選自(但不限於)Alex Fluor ®螢光團(諸如Alex 514、Alex 532、Alex 546、Alex 555、Alex 568、Alex 594、Alex 610、Alex 633、Alex 635、Alex 647、Alex 660、Alex 680、Alexa 700、Alex 750、Alex 800、Alex 610-R-藻紅素(R-PE)、Alex 647-R-藻紅素(R-PE)、Alex 680-R-藻紅素(R-PE)、及Alex 680-異藻藍素(APC))、異藻藍素(APC)及其衍生物、Cy螢光團(例如，Cy3.5、Cy3-FITC、CY5、CY5.5、CY7、CY7-APC、CY5.5-APC)、Qdots、TRITC、R-PE、Tamara、羅丹明紅-X、Rox、TruRed、SYPRO紅(SYPRO red)、BODIPY TR、碘化丙啶及德克薩斯紅。

在一些具體實施例中，將特異於嗜鹼性球之生物標誌物的適體配體共軛至磁珠或固體支撐物(例如，玻璃載片或塑膠晶片)之表面。可將刺激之血液樣本流過固體支撐物上方。由適體配體所標記之嗜鹼性球被捕捉到晶片，然後進行測量。

核酸分子可藉由基於形成共價鍵之方法來共價地附接至磁性粒子/珠。羧基及胺基係最常見用於將配體附接至表面的反應基團。在一些態樣中，一級胺基 (-NH2)修飾物(modifier)可置於核酸分子(例如，SPN)的5’端、或3’端，或在內部使用胺基-C或胺基-T修飾之鹼基。胺基修飾之核酸分子可使用醯化劑(例如碳二亞胺(Carbodiimide, EDC))附接至磁性粒子。

在一個例示性具體實施例中，將適體配體或複數個適體配體分子固定至固體支撐物，例如，將適體配體附接至陣列基材。適體配體可以多份的各適體設置在基材之斑點上。

在一些具體實施例中，將與適體配體之部分序列互補的短序列共軛至晶片表面用於捕捉適體配體。短互補序列被稱為「錨(anchor)」。錨可共價地固定在晶片表面上(例如，圖3B)。

在一些態樣中，互補序列(亦即，錨)可含有約5至20個核苷酸殘基、或約5至10個核苷酸殘基、或約10至15個核苷酸殘基、或約10至20個核苷酸殘基。特定而言，錨可含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個核苷酸殘基。在一個具體實施例中，互補序列含有5個核苷酸殘基。在另一具體實施例中，互補序列含有10個核苷酸殘基。在一些態樣中，互補序列可與適體序列至少100%、至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、或至少80%互補。在另一具體實施例中，互補序列可具有額外聚(A)核苷酸。短互補序列可容易地從相應的適體配體卸離。

如本文中所使用，術語「晶片(chip)」可理解為任何三維形狀。基材可為適用於如上述之核酸固定的任何類型的材料。用作晶片的基材可具有所需特性，包括光學特性，例如平坦度、透明度、明確的光學吸收光譜、最小的自發性螢光(auto-fluorescence)、高反射率；及化學特性，例如允取共價鍵聯的表面反應性。

適體配體或錨可附接至任何固體基材表面，諸如微量滴定盤、矽晶片、印刷之玻璃表面(例如，環氧鹽水衍生之玻璃表面)。印刷之晶片可稱為微陣列晶片。合適的固體基材(亦稱為固體支撐物)之其他實施例可包括但不限於由二氧化矽或基於二氧化矽之材料、官能化玻璃、經修飾之矽、無機玻璃、塑膠、樹脂、多糖、碳、金屬、尼龍、天然纖維(諸如絲、羊毛、及綿)、及聚合物製得者。固體基材可具有任何有用形式，包括薄膜或膜、珠、微孔盤、碟、載片、纖維、編織纖維、成形之聚合物、粒子、晶片、晶圓、及微粒。固體基材可為多孔或非多孔的。

在一些具體實施例中，固體基材可為玻璃載片或矽載片。玻璃為容易取得且便宜的支撐介質，其具有低的內生性螢光(intrinsic fluorescence)。僅管大部分附接方案涉及化學修飾玻璃表面以促進寡核苷酸之附接，但玻璃或矽載片之表面可為經修飾或未經修飾的。玻璃具有相對均質的化學表面，其特性已被完整研究，且可使用非常通用且已發展完整的矽烷化化學(silianization chemistry)進行化學修飾。在某些具體實施例中，玻璃或矽載片表面係未經修飾的。例如，矽烷化寡核苷酸可被共價連接至未經修飾之玻璃表面( Kumar 等人 , Nucleic Acids Res.2000; 28(14): e71)。

在其他具體實施例中，固體基材包括無機材料(例如，陶瓷(諸如低溫共燒陶瓷(low temperature cofired ceramic, LTCC)))、聚合物基材、複合材料、及紙。聚合物可包括彈性體(例如，聚二甲基矽氧烷(PDMS；二甲聚矽氧(dimethicone))、聚酯(例如，熱固性聚酯(thermoset polyester, TPE)))；熱塑性聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚-甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、及聚乙二醇二丙烯酸酯(poly-ethylene glycol diacrylate, PEGDA))、全氟化化合物/聚合物(諸如全氟烷氧基烷烴(Teflon PFA)、氟化乙烯丙烯(Teflon FEP)、及聚氟聚酯二醇甲基丙烯酸酯(polyfluoropolyether diol methacrylate, PFPE-DMA))、及聚胺甲酸酯(PU))；及熱固性塑膠、及聚醯亞胺、及壓克力紙(acrylic. paper)、可撓性基於纖維素之材料、複合材料(例如，非晶形材料)、環烯烴聚合物(cyclic olefin polymers, COP)、基於環烯烴單體之聚合物、及乙烯(諸如環烯烴共聚物(cyclic olefin copolymer, COC))。

在一些具體實施例中，將預先合成之適體配體及錨經由生成共價鍵共軛至固體基材。因此，核酸分子被牢固地固定在表面上，提供陣列高穩定性及所獲得之數據之再現性。在一些情況下，核酸及固體表面皆用反應性官能基修飾以允許在核酸及表面之間形成共價鍵之化學反應。常用的官能基包括但不限於羧基、磷酸基、醛基、及胺基。例如，可將胺基用於核酸及表面，因為其製備容易、官能性穩定、且應用性廣。固體表面可用胺基修飾以生成NH ₂-官能化表面，隨後藉由使用同型雙功(homo-bifunctional)連接子(諸如二琥珀醯亞胺基戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate, DSG)、苯二異硫氰酸(phenylene diisothiocyanate, PDC))來進行化學活化。在其他實施例中，將在末端具有羧基或磷酸基的探針DNA寡核苷酸固定在NH ₂-官能化表面上，脫水試劑為諸如碳二環己亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)等。

例如，玻璃或矽之表面可用胺基矽烷處理以具有一級胺或環氧化物之均勻層。用NH2基團修飾之核酸可固定在環氧矽烷衍生之玻璃載片或異硫氰酸酯塗佈之玻璃載片上。在另一實施例中，琥珀酸化核酸可藉由肽鍵耦合至胺基苯基或胺基丙基衍生之玻璃載片。在又另一實施例中，經二硫化物修飾之核酸可藉由硫醇/二硫化物交換反應或通過化學交聯劑固定在巰基矽烷化(mercaptosilanized)玻璃支撐物上。作為非限制性實施例，可在適體配體或互補序列之末端添加短聚(A)序列(例如，5 nt)。然後將聚(A)尾用硫醇基團修飾以促進共軛。

在一個具體實施例中，所示之核酸可在約300nm至500nm之暴露波長下、較佳地在350 nm之暴露波長下經由UV光交聯來固定在固體基材上。基材可包含超疏水性聚合物表面。

在一些具體實施例中，適體配體及/或錨可進一步最佳化以增加與固體表面之共軛。在一些實施例中，可將短連接子及間隔序列添加至適體配體及/或錨之序列之(多個)末端。作為非限制性實施例，可將聚(T)連接子序列添加至適體及/或錨(TTTTTTTTTT, SEQ ID NO.1)之序列之末端。間隔序列可包括但不限於SEQ ID NO：2至16之序列。

在其他實施例中，本揭露之適體配體及錨可藉由原位( in situ)寡核苷酸合成(亦即藉由在固體表面上直接合成)共軛至固體支撐物。標準3’至5’亞磷醯胺化學反應可用於寡核苷酸合成。自動合成儀可用於合成短互補錨序列。

在一些具體實施例中，與共軛至晶片的CD203c適體配體互補的錨通過雜交捕捉未與嗜鹼性球結合的CD203c適體配體(例如，游離CD203c適體)(圖2；A及B之上圖)。來自游離CD203c適體配體的螢光訊號定義血液樣本中嗜鹼性球之基線強度。與共軛至晶片的CD63適體配體互補的錨通過雜交捕捉未與活化之嗜鹼性球結合的CD63適體配體(例如，游離CD63適體)(圖2；A及B之下圖)。來自游離CD63適體配體的螢光訊號關聯在過敏原存在下血液樣本中活化之嗜鹼性球之百分比。如圖2中所示，當沒有過敏原存在時，嗜鹼性球未被活化且會為CD63-，抗CD63適體配體通過與特異於抗CD63適體配體之錨雜交而被捕獲至晶片(圖2，A.0g花生)。測量來自抗CD63適體配體的螢光訊號。然而，如果過敏原存在，則嗜鹼性球被活化並在細胞表面上表現CD63 (CD63+)，抗CD63適體配體結合至細胞表面上之CD63。只有少數游離抗CD63適體配體通過與特異於抗CD63適體配體的錨雜交而被捕獲至晶片(圖2，B. 1g花生)。測量來自抗CD63適體配體的螢光訊號。來自無過敏原刺激的血液樣本的訊號具有較高的CD63/CD203c比值，而來自暴露於過敏原中之血液樣本的訊號具有較低CD63/CD203c比值。信號比值關聯過敏原之濃度。

作為非限制性實施例，將特異性結合至CD63的適體配體用於測量嗜鹼性球回應於過敏原暴露之反應性。一些例示性抗CD63適體可為由Song等人( Song 等人 ,Development of a CD63 aptamer for efficient cancer immunochemistry and immunoaffinity-based exosome isolation. Molecules 2020,25, 5585；其內容係以引用方式全文併入本文中)所開發者。其他CD63特異性適體可包括由Gao等人( Gao 等人 ,a dual signal amplification method for exosome detection based on DNA dendrimer self-assembly; Analyst, 2019, 144, 1995-2002)、Yu等人( YU 等人 ,An aptamer-based new method for competitive fluorescence detection of exosomes; Nanoscale,2019, 11: 15589-15595)所選擇者；其各自內容係以引用方式全文併入本文中。

作為非限制性實施例，將特異性結合至CD203c的適體配體用於測量嗜鹼性球回應於過敏原暴露之反應性。

作為非限制性實施例，將特異性結合至CD123的適體配體用於測量嗜鹼性球回應於過敏原暴露之反應性。一些例示性抗CD123適體可包括由Wu等人( Wu 等人 ,Novel CD123-aptamer-originated targeted drug trains for selectively delivering cytotoxic agent to tumor cells in acute myeloid leukemia theranostics. Drug Deliv., 2017, 24, 1216-1229)；及Wang等人( Wang 等人 ,SS30, a novel trioaptamer targeting CD123, inhibits the growth of acute myeloid leukemia cells; Life Science, 2019, 232: 116663)所開發者；其各自內容係以引用方式全文併入本文中。

作為非限制性實施例，將特異性結合至CD193的適體配體用於測量嗜鹼性球回應於過敏原暴露之反應性。

在一些具體實施例中，本BAT測試對特定過敏原之劑量反應(dose-response)。劑量依賴性測試可包含三至五個不同過敏原濃度，例如以10倍增量。因此，BAT形成劑量反應曲線(dose response curve)可測量為嗜鹼性球反應性、嗜鹼性球敏感性、或兩者兼具之結果。例如，嗜鹼性球對特定過敏原之反應性可用在給定過敏原之濃度下呈CD63陽性之嗜鹼性球之百分比、或用CD _max(亦即，在發生最大嗜鹼性球活化時之濃度)測量。嗜鹼性球敏感性可測量為EC50(亦即，發生最大嗜鹼性球反應之50%時的濃度)或CD-sens(亦即，EC50之倒數乘以100，其係由劑量反應曲線之斜率計算出)。劑量反應曲線下之面積可用於同時評估嗜鹼性球反應性及敏感性。

其他特異於嗜鹼性球細胞之生物標誌物可包括但不限於CCR3、CD203c、CD123、CD3、及CRTH2，其等可識別血液樣本中之嗜鹼性球。嗜鹼性球活化標誌物可包括但不限於CD203c、CD63；CD13、CD69、CD107a、CD107b、CD164、CD80、CD86、CD40L、HLA-DR、CD123、CRTH2、CCR3、及其他細胞外標誌物。

視需要地，在BAT中，本BAT係伴隨有IgE-依賴性(例如，抗IgE或抗FceRI)及IgE非依賴性(例如，fMLP或離子黴素(ionomycin))陽性對照。此外，亦應包括僅由刺激緩衝液所組成之陰性對照以評估嗜鹼性球之背景及自發性活化水平。

在另一態樣中，本BAT可用於藉由測量指示在嗜鹼性球細胞表面上至少一種生物標誌物之表現的螢光訊號之變化來測量對過敏原之過敏反應之嚴重度及閥值，其中生物標誌物之表現係用特異性結合至該生物標誌物的核酸配體測量。具有嚴重反應的個體顯示更大的活化之嗜鹼性球比例，而對痕量過敏原具有反應的個體顯示更大的嗜鹼性球敏感性，亦即彼等的嗜鹼性球在較低的過敏原濃度下開始反應。

本BAT比皮膚穿刺測試及血漿IgE測試更精確。此外，本BAT可將臨床過敏個體與耐受的個體區別開來。

本BAT可具有高特異性及敏感性。測試特異性可在60與100%、或65與100%、或70與100%、或75與100%、或80與100%、或90與100%之間的範圍。測試敏感性可在75與100%、或80與100%、或90與100%之間的範圍。

作為非限制性實施例，本揭露之分析可包括以下步驟

(1)樣本製備：可將收集之全血樣本肝素化(heparinized)並用緩衝液稀釋。將稀釋之血液樣本引入分析卡匣中，該分析卡匣包含包括衍生自適體的信號多核苷酸(SPN)的偵測適體，其靶向特異於嗜鹼性球及活化之嗜鹼性球的生物標誌物。

(2)標記及捕捉嗜鹼性球：使SPN結合嗜鹼性球樣本與陣列晶片接觸，該陣列晶片印有多個與SPN分子之序列互補的短DNA序列的錨。錨包括與靶向嗜鹼性球之生物標誌物並與結合至目標分析物(過敏原)競爭的SPN之活性結構域互補的測試錨序列、及無論分析物是否結合至SPN分子，與靶向嗜鹼性球之生物標誌物的SPN之非活性結構域互補的對照錨序列。

(3)訊號偵測及處理：計算來自各生物標誌物之測試錨及對照錨的訊號。使用演算法以分析來自各生物標誌物之測試及對照錨的訊號強度。所有訊號皆基於對照錨進行校正。訊號參數包括樣本中嗜鹼性球及活化之嗜鹼性球之存在。

在一些具體實施例中，將靶向CD123及CD63的SPN分子在診斷分析中組合使用。樣本中存在的嗜鹼性球可藉由靶向CD123的SPN分子之測試及對照錨之間的比值來判定。樣本中存在的活化之嗜鹼性球可藉由靶向CD63的SPN分子之測試及對照錨之間的比值來判定。計算樣本中存在的嗜鹼性球與活化之嗜鹼性球之間的比值並用於指示過敏反應。

在一些具體實施例中，將靶向CD203c及CD193的SPN分子用於診斷分析中。

在本文中所揭示，用於偵測嗜鹼性球回應於過敏原之本分析係一種比較系統，其基於患者細胞之校正比較實現明確的輸出。應用 - 過敏反應 BAT 之診斷食物過敏

本BAT可用於診斷、預測、及監測食物過敏，本BAT用於測量對食物過敏之過敏反應之嚴重度。

食物之實施例係蛋類、乳品、肉類、魚類、甲殼類及軟體動物類、穀物類、豆類及堅果類、水果類、蔬菜類、啤酒酵母、及明膠；更具體的是，蛋類之蛋白及蛋黃、乳品之牛奶及乳酪、豬肉、牛肉、肉類之雞肉及羊肉、鯖魚、鰺魚、沙丁魚、鮪魚、鮭魚、鱈魚、魚類之比目魚及鮭魚魚子醬、螃蟹、蝦子、藍貽貝、魷魚、章魚、甲殼類及軟體動物類之龍蝦及鮑魚及、小麥、米、蕎麥、黑麥、大麥、燕麥、玉米、小米、穀物類之梁栗及稗草、黃豆、花生、可可豆、豌豆、敏豆、榛子豆、巴西栗子、杏仁、豆類及堅果類之椰子及核桃、蘋果、香蕉、橘子、桃子、奇異果、草莓、香瓜、酪梨、葡萄柚、芒果、梨、水果類之芝麻及芥末、蕃茄、胡蘿蔔、馬鈴薯、菠菜、洋蔥、大蒜、竹筍、南瓜、番薯、芹菜、洋芫荽、蔬菜類之山藥及松茸、含有彼等、及其成分的食物。

在一些具體實施例中，本試管內BAT係用於診斷、預測、及監測個體對常見食物過敏原之過敏反應，包括但不限於花生、堅果、雞蛋、小麥、牛奶、大豆、魚、及貝類。

與食物相關的過敏性蛋白質之實施例包括但不限於豐年蝦(Art fr 5)、螃蟹(Cha f 1)、北海蝦(Cra c 1, Cra c 2, Cra c 4, Cra c 5, Cra c 6, Cra c 8)、美國龍蝦(Hom a 1, Hom a 3, Hom a 6)、白蝦(Lit v 1, Lit v 2, Lit v 3, Lit v4)、淡水長臂大蝦(Mac r 1)、蝦子(Met e 1, Pen a 1, Pen i 1)、北方蝦(Pan b 1)、棘龍蝦(Pan s 1)、黑虎蝦(Pen m 1, Pen m 2, Pen m 3, Pen m 4, Pen m 6)、窄爪螫蝦(Pon i 4, Pon i 7)、藍花蟹(Por p 1)、家牛(Bos d 4, Bos d 5, Bos d 6, Bos d 7, Bos d 8, Bos d 9, Bos d 10, Bos d 11, Bos d 12)、大西洋鯡(Clu h 1)、鯉魚(Cyp c 1)、波羅的海鱈魚(Gad c 1)、大西洋鱈魚(Gad m 1, Gad m 2, Gad m 3)、鱈魚(Gad c 1)、雞(Gal d 1, Gal d 2, Gal d 3, Gal d 4, Gal d 5)、紅目鱸(Lat c 1)、大菱鮃魚(Lep w 1)、白鮭(Onc k 5)、大西洋鮭魚(Sal s 1, Sal s 2, Sal s 3)虹鱒(Onc m 1)、莫三比克吳郭魚(Ore m 4)、食用蛙(Ran e 1, Ran e 2)、太平洋沙瑙魚(Sar sa 1)、大洋鱸(Seb m 1)、黃鰭鮪(Thu a 1, Thu a 2, Thu a 3)、劍魚(Xip g 1)、鮑魚(Hal m 1)、庭園大蝸牛(Hel as 1)、魷魚(Tod p 1)、鳳梨(Ana c 1、Ana c 2)、蘆筍(Aspa o 1)、大麥(Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 20, Hor v 21)、香蕉(Mus a 1, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, Mus a 5)、香蕉(Musxp1)、米(Ory s 12)、黑麥(Sec c 20)、小麥(Tri a 12, Tri a 14, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 36, Tri a 37)、玉蜀黍(玉米)(Zea m 14, Zea m 25)、奇異果(Act c1, Act c 2, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 9, Act d 10, Act d 11)、腰果(Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3)、芹菜(Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 4, Api g 5, Api g 6)、花生(Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Ara h 12, Ara h 13)、巴西栗子(Ber e 1, Ber e 2)、東方芥菜(Bra j 1)、油菜子(Bra n 1)、甘藍(Bra o 3)、蕪菁(Bra r 1, Bra r 2)、甜椒(Cap a 1w, Cap a 2)、胡桃(Car i 1, Car i 4)、板栗(Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9)、檸檬(Cit I 3)、柑橘(Cit r 3)、甜橘(Cit s 1、Cit s 2、Cit s 3)、榛子(Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14)、香瓜(Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3)、胡蘿蔔(Dau c 1, Dau c 4, Dau c 5)、普通蕎麥(Fag e 2, Fag e 3)、苦蕎麥(Fag t 2)、草莓(Fra a 1, Fra a 3, Fra a 4)、大豆(Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly m 4, Gly m 5, Gly m 6, Gly m 7, Gly m 8)、向日葵(Hel a1, Hel a 2, Hel a 3)、黑胡桃(Jug n 1, Jug n 2)、胡桃(Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4)、栽培的萵苣(Lac s 1)、扁豆(Len c 1, Len c 2, Len c 3)、荔枝(Lit c 1)、窄葉藍羽扇豆(Lup an 1)、蘋果(Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4)、木薯(Man e 5)、桑椹(Mor n 3)、酪梨(Pers a 1)、四季豆(Pha v 3)、開心果(Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5)、豌豆(Pis s 1, Pis s 2)、山杏(Pru ar 1, Pru ar 3)、歐洲甜櫻桃(Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4)、西洋李(Pru d 3)、杏仁(Pru du 3, Pru du 4, Pru du 5, Pru du 6)、桃(Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pru p 4, Pru p 7)、石榴(Pun g 1)、梨(Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 4, Pyr c 5)、蓖麻子(Ric c 1)、歐洲紅莓(Rub i 1, Rub i 3)、芝蔴(Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Ses i 7)、黃芥菜(Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sin a 4)、蕃茄(Sola I 1, Sola I 2, Sola I 3, Sola I 4)、馬鈴薯(Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4)、綠豆(Vig r 1, Vig r 2, Vig r 3, Vig r 4, Vig r 5, Vig r 6)、葡萄(Vit v 1)、大棗(Ziz m 1)、介壽果(Ana o 1.0101, Ana o 1.0102)、根芹菜 (Api g 1.0101, Api g 1.0201)、胡蘿蔔(Dau c1.0101, Dau c1.0102, Dau c1.0103, Dau c1.0104, Dau c1.0105, Dau c1.0201)、甜橙(Cit s3.0101, Cit s3.0102)、大豆(Gly m1.0101, Gly m1.0102, Gly m3.0101, Gly m3.0102)、濱豆(Len c1.0101, Len c1.0102, Len c1.0103)、豌豆(Pis s1.0101, Pis s1.0102)、西紅柿(Lycopersicon sativum) (Lyc e2.0101, Lyc e2.0102)、草莓(Fra a3.0101, Fra a3.0102, Fra a3.0201, Fra a3.0202, Fra a3.0203, Fra a3.0204, Fra a3.0301)、蘋果(Mal d1.0101, Mal d1.0102, Mal d1.0103, Mal d1.0104, Mal d1.0105, Mal d1.0106, Mal d1.0107, Mal d1.0108, Mal d1.0109, Mal d1.0201, Mal d1.0202, Mal d1.0203, Mal d1.0204, Mal d1.0205, Mal d1.0206, Mal d1.0207, Mal d1.0208, Mal d1.0301, Mal d1.0302, Mal d1.0303, Mal d1.0304, Mal d1.0401, Mal d1.0402, Mal d1.0403, Mal d3.0101w, Mal d3.0102w, Mal d3.0201w, Mal d3.0202w, Mal d3.0203w, Mal d4.0101, Mal d4.0102, Mal d4.0201, Mal d4.0202, Mal d4.0301, Mal d4.0302)、甜櫻桃(Pru av1.0101, Pru av1.0201, Pru av1.0202, Pru av1.0203)、及碧桃(Pru p4.0101, Pru p4.0201)；及其任何變體。與食物相關的過敏原之名稱係根據IUIS過敏原命名小組委員會(IUIS Allergen Nomenclature Sub-Committee)系統化命名及表列出(參見，國際免疫學會過敏原聯盟命名小組委員會異過敏原及變異體列表。) BAT 之診斷藥物過敏

藥物過敏係對藥物之過敏反應，為一類型的藥物超敏反應(drug hypersensitivity reaction, IDHR)，其中存在由免疫球蛋白(IgE)及/或T細胞所媒介之對藥物之特異性免疫反應。將本試管內BAT應用於IDHR之診斷。對藥物之不良過敏反應係多樣的且使診斷更加困難。此挑戰提出了改善測試方法之需求。例如，對藥物之皮膚測試，特別是皮內測試，會引起全身性反應(包括全身性過敏反應)之重大風險。此外，sIgE測試無法對天然藥物及其所有代謝物兩者進行。對某些藥物之藥物誘發性測試(drug provocation tests, DPT)係不切實際或不道德的，特別是在全身麻醉下之全身性過敏反應之背景下。然而，本試管內BAT為其他測試提供便宜且更安全的替代診斷工具。

本試管內BAT可用於診斷對一系列藥物之過敏反應，包括但不限於β-內醯胺類、喹啉酮類(塞普沙辛、莫西沙星、及左氧氟沙星)、NMBA (neuromuscular blocking agent)(神經肌肉阻斷劑)、及抗生素類(例如，β-內醯胺類及氟喹啉酮)。

在一些具體實施例中，本試管內BAT可作為藥物脫敏作用後全身性過敏反應之生物標誌物。藥物脫敏作用對需要全治療劑量的救命藥物之過敏患者係絕對必要的。在上下文中，BAT可識別在藥物脫敏作用期間對具有高風險不良反應的藥劑過敏的患者。 BAT 之診斷其他過敏

本試管內BAT可用於診斷空浮過敏原，包括但不限於樺樹花粉及禾草花粉。BAT亦可用於診斷對由IgE媒介之免疫反應所引起之其他吸入式過敏原之過敏反應。

例示性空浮顆粒/過敏原及其他環境過敏原包括但不限於可獲自下列之過敏原：植物類(例如，野草、禾草、樹木、花粉)、動物類(例如，在哺乳動物(諸如貓、狗、乳牛、豬、綿羊、馬、兔子、大鼠、天竺鼠、小鼠、及沙鼠)之皮屑、尿液、唾液、血液、或其他體液中發現的過敏原)、真菌/黴菌、昆蟲類(例如，會螫刺的昆蟲類諸如蜜蜂、黃蜂、及胡蜂及搖蚊科(非咬人糠蚊)、以及其他昆蟲類(諸如家蠅、果蠅、綿羊綠頭蒼蠅、螺旋蠅、穀物象鼻蟲、蠶、蜜蜂、非叮咬糠蚊幼蟲、蜂蛾幼蟲、粉蜱、蟑螂及黃粉蟲甲蟲之幼蟲；蜘蛛類及蟎類(諸如居家塵蟎)、橡膠類(例如乳膠)、金屬類、化學品類(例如藥物類、白質清潔劑添加物類)、及自體過敏原及人類自體過敏原(例如Hom s 1, Hom s 2, Hom s 3, Hom s 4, Hom s 5)(參見，過敏原命名：國際免疫學會過敏原聯盟命名小組委員會過敏原列表及過敏原命名：國際免疫學會過敏原聯盟命名小組委員會異過敏原及變體列表)。

本試管內BAT可用於診斷對病源體諸如細菌、真菌、及黴菌之過敏。

本試管內BAT亦可用於診斷毒液過敏，包括但不限於膜翅目毒液過敏( Korosec 等人 ,Clinical routine utility of basophil activation testing for diagnosis of Hymenoptera-allergic patients with emphasis on individuals with negative venom-specific IgE antibodies. Int Arch Allergy Immunol. 2013;161(4): 363-368；其內容係以引用方式全文併入本文中)、蜜蜂及黃蜂毒液。BAT在毒液過敏中之另一應用係監測免疫療法治療。BAT可使用天然萃取物進行，亦可用重組毒液蛋白質進行。

本試管內BAT可用於診斷呼吸道過敏。對吸入式過敏原之過敏反應係異質且可為複雜的，乃因個體係天然暴露於多樣過敏原中。一些患有局部過敏鼻炎的患者可能具有無法偵測到的sIgE水平且皮膚測試呈陰性，使sIgE定量及SPT測試無法區分過敏鼻炎及非過敏鼻炎。BAT分析可用於測試具有嗜鹼性球敏感性及特異性的過敏鼻炎及過敏哮喘之獨特態樣。其他應用

在一些具體實施例中，本試管內BAT可用作理解一些過敏疾病(例如，慢性蕁麻疹、異位性皮膚炎)之機制的工具。本BAT可用於表徵由嗜鹼性球所表現的表面蛋白質及這些如何調節對過敏原刺激或攻毒之回應。作為非限制性實施例，本BAT分析可用於定量FcεRI表現，以及其他Fcγ受體(CD16, CD32, CD64)在穩態下及在回應於活化或攻毒下之表現。

在一些具體實施例中，本試管內BAT可用於在實驗條件下之比較治療學，諸如測試IgE抑制劑之有效性。作為非限制性實施例，本BAT可用於測量在效應細胞表面上之受體結合抗體。活化之嗜鹼性球之變化(例如，嗜鹼性球數目降低)可指示抗過敏治療之療效。

在一些具體實施例中，本試管內BAT可測試嗜鹼性球對過敏原刺激之回應，例如，過敏原特異性IgE諸如對過敏原之濃度、特異性、選殖性及親和性之表徵。作為非限制性實施例，本BAT分析可測試並比較嗜鹼性球對不同過敏原性蛋白質及表位之回應。增進對於引發過敏反應的過敏肽或表位之理解係改善診斷測試及潛在新穎治療兩者之關鍵。

在一些具體實施例中，本試管內BAT可測試與IgE誘導無關之嗜鹼性球活化。

在一些具體實施例中，可判定嗜鹼性球對過敏原之回應的本試管內BAT可用於監測接受過敏原特異性免疫療法(allergen specific immunotherapy, AIT)及其他免疫療法治療諸如抗IgE治療的患者。例如，已有報導在用奧馬珠單抗治療橫跨一系列過敏(包括對花生、貓、及麴菌屬之過敏)後，嗜鹼性球敏感性降低(Gernez等人, Basophil CD203c levels are increased at baseline and can be used to monitor omalizumab treatment in subjects with nut allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2011; 154(4): 318-327； Johansson 等人 ,The size of the disease relevant IgE antibody fraction in relation to ‘total-IgE’ predicts the efficacy of anti-IgE (Xolair) treatment. Allergy. 2009; 64(10): 1472-147；及 Voskamp 等人 ,Clinical efficacy and immunologic effects of omalizumab in allergic bronchopulmonary aspergillosis. J Allergy Clin Immunol Pract.2015; 3(2): 192-199；其各自內容係以引用方式全文併入本文中)。套組

根據本揭露，將適體配體、與適體配體互補的錨、與錨或適體配體共軛的珠及固體基材包裝以形成用於測量過敏反應之套組。組成物可與其他成分或試劑組合、或製備為套組組分或其他零售產品以供商業銷售或分銷。

套組將含有本揭露之劑以及關於該套組之施用及/或使用說明書。在一些具體實施例中，套組進一步包含用於收集血液樣本之樣本收集器。實施例 實施例 1 ：樣本製備及嗜鹼性球標記

將來自患者之全血樣本肝素化並用緩衝液稀釋。將樣本稀釋劑引入四個不同分析容器(例如，圖3A及圖3B中之一次性莢艙 300)中，其中一個容器作為對照。然後將在其他三個容器中之血液樣本稀釋劑進一步暴露於不同濃度之花生過敏原(亦即，花生過敏原之水平增加)中。過敏原之量取決於患者的病史。然後將混合物培育大約30分鐘。

在每個分析容器中，將偵測劑(亦即，特異於活化之嗜鹼性球標誌物CD123及CD63的傳訊多核苷酸(SPN))預裝在容器中。將被花生過敏原預刺激之血液樣本混合並暴露於靶向CD123及CD63的SPN中，該SPN特異性結合至嗜鹼性球。將混合物引入捕捉晶片(亦即，在圖3A及圖3B之一次性莢艙300之反應室中之錨晶片)，該捕捉晶片包括具有多個印好包含與CD63及CD123之SPN分子之活性結構域互補的短序列的錨、及包含與CD63及CD123之SPN分子之非活性結構域互補的短序列的對照錨的陣列。

在將分析容器插入儀器(例如，圖3A中之偵測裝置 100)中之後，在樣本被引入反應室時開始收集多個陣列晶片之捕捉影像以記錄反應速率。分析及處理影像以進行訊號偵測。使用演算法以分析來自CD123及CD63兩者之測試及對照錨的螢光訊號強度。計算幾個參數，包括樣本中存在的嗜鹼性球(藉由靶向CD123的SPN的測試與對照錨之間的比值)及樣本中存在的活化之嗜鹼性球(藉由靶向CD63的SPN的測試與對照錨之間的比值。所有訊號皆基於對照錨進行進一步校正。 實施例 2 ：基於適體之 BAT 分析之訊號分析

將結合CD123及CD63的適體用於測試BAT訊號分析，其使用圖3A及圖3B之偵測系統。

特異於CD63(SEQ ID No：17及18)的適體係討論於Zhong等人之( Zhong 等人 ,Development of a CD63 aptamer for efficient cancer immunochemistry and immunoaffinity-based exosome isolation; Molecules, 2020, 25: 5585-5601)中。特異於CD123(SEQ ID NO：19及20)的適體係討論於Wu等人之( Wu 等人 ,Novel CD123-aptamer-originated targeted drug trains for selectively delivering cytotoxic agent to tumor cells in acute myeloid leukemia theranostics; Drug Delivery,2017, 24(1): 1216-1229)中。

對三個不同濃度之花生樣本(1mg、10mg、及100mg)進行測試及比較。將不含花生之樣本(0mg花生)用作對照。

在此例示性分析中，使用四個一次性莢艙來計算BAT分析。在各測試莢艙中，使用特異於CD123的SPN及特異於CD63的SPN以捕捉並標記回應於不同濃度之過敏原的呈CD123陽性之嗜鹼性球及活化之呈CD63陽性之嗜鹼性球。各莢艙含有分別塗佈有特異於CD123 SPN及CD63 SPN的錨的晶片。偵測晶片亦分別塗佈有CD123及CD63之對照錨序列(如圖3B及圖4)。

莢艙#0：沒有過敏原添加至此莢艙。未活化之嗜鹼性球結合CD123+SPN。CD123+對照錨上之強度將為亮的而CD123+測試錨上之強度將為暗的。因為沒有活化之嗜鹼性球，所以CD63測試及對照錨之強度為亮的。CD63及CD123+錨之強度將用於校正有添加過敏原的莢艙中之CD63傳訊(圖4)。

莢艙#1：將1mg花生過敏原添加至該莢艙。未活化之嗜鹼性球結合CD123+SPN。CD123+對照錨上之強度將為亮的而CD123+測試錨上之強度將為暗的。一些嗜鹼性球回應於過敏原而活化，因此CD63測試錨之強度降低，而CD63對照錨之強度將為亮的。在添加過敏原之情況下，CD63及CD123+錨之強度將被校正到莢艙#0中傳訊之CD63及CD123+。

莢艙#2：將10mg花生過敏原添加至該莢艙。非活化之嗜鹼性球結合CD123+SPN；因此CD123+對照錨上之強度將為亮的而CD123+測試錨上之強度將為暗的。較多嗜鹼性球回應於增加之過敏原量而活化，因此CD63測試錨之強度將降低，而對照錨之強度將為亮的。在添加過敏原之情況下，CD63及CD123+錨之強度將被校正到莢艙#0中傳訊之CD63及CD123+。

莢艙#3：將100mg花生過敏原添加至該莢艙。非活化之嗜鹼性球結合CD123+ SPN；因此CD123+對照錨上之強度為亮的而CD123+測試錨上之強度為暗的。增加數量的嗜鹼性球回應於增加之過敏原量而活化，因此CD63測試錨之強度將降低，而對照錨之強度將為亮的。在添加過敏原之情況下，CD63及CD123+錨之強度將被校正到莢艙#0中傳訊之CD63及CD123+。訊號校正

使用總嗜鹼性球與活化之嗜鹼性球之間所計算的比值為過敏原濃度之函數。所有訊號皆基於對照錨校正。等同物及範疇

所屬技術領域中具有通常知識者將認可或能夠僅使用常規實驗來確定根據本文中所述之揭露的特定實施例的許多等同物。本揭露之範疇不欲局限於以上說明，而是如在隨附申請專利範圍中所闡述。

在本說明過程期間引入許多可能的替代特徵。應當理解，根據，所屬技術領域中具有通常知識者之知識及判斷，此類替代特徵可以各種組合來替代以得到本揭露之不同具體實施例。

被宣稱以引用之方式併入本文中之任何專利、出版物、互連網站、或其他揭露材料之全部或部分僅以所併入的材料不與現有定義、語句、或在本揭露中所闡述的其他揭露材料相衝突的程度被併入到本文中。因此，並且在必要的程度上，在本文中明確地闡述的揭露取代以引用之方式併入本文中之任何衝突材料。被宣稱以引用之方式併入本文的但與現有定義、語句、或在本文中所闡述的其他揭露材料相衝突的任何材料或其部分將僅以在所併入的材料與現有揭示材料之間不出現衝突的程度被併入。

在申請專利範圍中，文章諸如「一(a/an)」及「該(the)」可意指一個或多於一個，除非有相反的指示或自上下文以其他方式明顯看出。若群組成員之一個、多於一個、或所有成員存在於、使用於、或以其他方式與給定的產物或處理相關，則視為滿足群組的一或多個成員之間包括「或」之申請專利範圍或說明，除非有相反的指示或自上下文以其他方式明顯看出。本揭露包括其中群組之一個成員準確地存在於、使用於、或以其他方式與給定的產物或處理相關的具體實施例。本揭露包括其中群組之多於一個、或整個成員準確地存在於、使用於、或以其他方式與給定的產物或處理相關的具體實施例。

亦應注意，術語「包含(comprising)」意欲為開放式且容許但不要求包括額外元件或步驟。當在本文中使用術語「包含(comprising)」，術語「由...所組成(consisting of)」因此亦被涵蓋及揭示。

當給定範圍時，端點被包括在內。此外，應理解的是，除非另外指出或自上下文及所屬技術領域中具有通常知識者之理解中顯而易見，否則在本揭露之不同具體實施例中，以範圍表示的值可假設為在所陳述範圍內的任何特定值或子範圍，除非上下文另有明確規定，否則為範圍的下限單位的十分之一。

此外，應理解，落入先前技術的範籌內之本揭露之任何特定具體實施例可自申請專利範圍之任一或多者明確排除。因為此種具體實施例被認為對所屬技術領域中具有通常知識者為已知的，其可被排除，即使在本文中沒有明確地闡述排除。本揭露(例如，任何抗生素、治療或活性成分；任何生產方法；任何使用方法等)之組成物之任何特定具體實施例可自一或多個申請專利範圍排除，不論是否涉及現有的先前技術領域。

應理解，所使用的字為說明性而非限制性文字，且可在所附申請專利範圍的範圍內改變而不會偏離本揭露在其更廣泛態樣中之真正範圍及精神。雖然本揭露已以一些長度及一些特定關於幾個所述實施例來描述，但並不意味其應限制任何此種細節或具體實施例或任何特定具體實施例，而是參考所附申請專利範圍來建構，以便根據先前技術提供此類申請專利範圍之廣泛解釋可能性，而因此有效涵蓋本揭露之預期的範疇。

100:偵測裝置 300:一次性莢艙

[圖1]展示本BAT分析之步驟。 A說明樣本處理之步驟，其中將肝素化(heparinized)全血用緩衝液稀釋。 B說明將處理之血液樣本與適體配體培育之步驟；將稀釋之血液樣本分入3個莢艙並暴露於無花生蛋白質(陰性對照)及2個測試莢艙(分別為0.1g及1.0g花生蛋白質)中。 C說明例示性標記過程，其中將針對CD63及CD203c的兩種螢光標記之適體配體用於識別血液樣本中之嗜鹼性球。 D說明清洗及訊號讀取之步驟；在培育之後，將各樣本引入專有反應室，該反應室包括兩種錨，每種適體配體對一種錨。

[圖2]顯示在各花生濃度(0.1g及1.0g花生蛋白質)下計算CD63/CD203c比值，並比較在沒有花生的樣本與含有不同濃度之花生的樣本之間的比值。較高的花生濃度會具有更接近1之訊號。而沒有花生的樣本具有較高的比值。上圖(0g花生(A)及1g花生(B))顯示未活化之嗜鹼性球結合至CD203c。基線強度在所有樣本中均類似，因未結合至嗜鹼性球的CD203c適體將結合至晶片上之錨。下圖(A，0g花生)顯示未活化之嗜鹼性球未結合至CD63。在不存在過敏原之情況下基線強度係亮的。未結合至嗜鹼性球的CD63適體將結合至錨。下圖(B，1g花生)顯示活化之嗜鹼性球結合至CD63。在存在過敏原之情況下，基線強度降低。未結合至嗜鹼性球的CD63適體將結合至錨。

[圖3A]顯示用於操作BAT分析的偵測系統之代表性具體實施例。

[圖3B]顯示一次性莢艙，其展示莢艙內部的反應室及晶片，該晶片塗佈有錨以捕捉衍生自適體的傳訊多核苷酸。

[圖4]說明如實施例2中所述之分析。


          <![CDATA[<110>  DOTS科技公司 (DOTS Technology Corp.)]]>
          <![CDATA[<120>  用於試管內測定過敏反應之BAT分析]]>
          <![CDATA[<130>  2066.1016TW]]>
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          taaccacccc acctcgctcc cgtgacacta atgctaattc caa                         43
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Claims

一種用於診斷或預測個體對測試物質之過敏反應之方法，其包含由該測試物質所誘導之嗜鹼性球活化的測定；該方法包含以下步驟： a) 從該個體收集血液樣本並將該血液樣本與該測試物質培育以活化該血液樣本中之該嗜鹼性球； b) 向該血液樣本中引入核酸配體的混合物，其包含針對在嗜鹼性球活化時暴露在該細胞表面上之活化生物標誌物的適體，及針對在嗜鹼性球上表現的識別生物標誌物的適體，其中各適體係用不同的螢光團標記； c) 捕捉未與該嗜鹼性球生物標誌物結合的該核酸配體； d) 讀取該螢光訊號並測量該嗜鹼性球活化；及 e) 藉由關連該螢光訊號變化來計算該嗜鹼性球活化指數並測定該過敏反應。
如請求項1之方法，其中該方法進一步包含將來自該個體的該血液樣本與陽性對照及陰性對照培育，其中該陰性對照係藉由在不存在測試物質之情況下測定該嗜鹼性球活化來達成。
如請求項2之方法，其中未與該嗜鹼性球標記結合的該適體配體經捕捉至晶片，該晶片塗佈有與該適體配體的該序列的一部分互補的短序列。
如請求項3之方法，其中讀取來自針對在該晶片上所捕捉的該嗜鹼性球活化生物標誌物的該適體配體的該螢光訊號及來自針對在該晶片上所捕捉的該嗜鹼性球識別生物標誌物的該適體配體的該螢光訊號並定量。
如請求項4之方法，其中該活化生物標誌物係CD63且該識別生物標誌物係CD203c。
如請求項4之方法，其中該活化生物標誌物係CD63且該識別生物標誌物係CD123。
如請求項4之方法，其中該嗜鹼性球活化生物標誌物係選自CD63、CD13、CD107a、CD107b、CD164、及CD69、且其中該識別生物標誌物係選自CD203c、CCR3、IgE、CD123、CD193、及CRTH2。
如請求項1之方法，其中該測試物質係過敏原。
如請求項8之方法，其中該過敏原係食物過敏原、空浮過敏原、藥物過敏原、環境過敏原、或病原體過敏原。
如請求項9之方法，其中該食物過敏原係花生、堅果、牛奶、雞蛋、大豆、小麥、魚、或貝類。
一種用於藉由在暴露於所感興趣之過敏原後測量指示該活化之嗜鹼性球百分比的該螢光訊號來測定個體對該所感興趣之過敏原之過敏反應的嚴重度及閥值之方法，該方法包含以下步驟： a) 將血液樣本與該所感興趣之過敏原培育以活化該血液樣本中之該嗜鹼性球； b) 向該血液樣本中引入核酸配體的混合物，其包含針對在嗜鹼性球活化時暴露在該細胞表面上之活化生物標誌物的適體，及針對在嗜鹼性球上表現的識別生物標誌物的適體，其中各適體係用不同的螢光團標記； c) 捕捉未與該嗜鹼性球標記結合的該核酸配體； d) 讀取該螢光訊號並測量該嗜鹼性球活化；及 e) 藉由關連該螢光訊號變化來計算該嗜鹼性球活化指數。
如請求項11之方法，其中未與該嗜鹼性球標記結合的該適體配體經捕捉至晶片，該晶片塗佈有與該適體配體的該序列的一部分互補的短序列。
如請求項12之方法，其中讀取來自針對在該晶片上所捕捉的該嗜鹼性球活化生物標誌物的該適體配體的該螢光訊號及來自針對在該晶片上所捕捉的該嗜鹼性球識別生物標誌物的該適體配體的該螢光訊號並定量。
如請求項13之方法，其中該血液樣本係與至少三種不同濃度的該所感興趣之過敏原培育；且其中針對各濃度測定該嗜鹼性球活化指數，從而測定對該所感興趣之過敏原之該過敏反應的嚴重度及閥值。
如請求項14之方法，其中該活化生物標誌物係CD63且該識別生物標誌物係CD203c。
一種用於測定由測試物質所誘導之嗜鹼性球活化之方法，其包含在暴露至該測試物質後測量指示該活化嗜鹼性球百分比的該螢光訊號；該方法包含以下步驟： a) 將血液樣本與該測試物質培育以活化該血液樣本中之該嗜鹼性球； b) 向該血液樣本中引入核酸配體的混合物，其包含針對在嗜鹼性球活化時暴露在該細胞表面上之活化生物標誌物的適體，及針對在嗜鹼性球上表現的識別生物標誌物的適體，其中各適體係用不同的螢光團標記； c) 捕捉未與該嗜鹼性球標記結合的該核酸配體； d) 讀取該螢光訊號並測量該嗜鹼性球活化；及 e) 藉由關連該螢光訊號變化來計算該嗜鹼性球活化指數。
如請求項16之方法，其中未與該嗜鹼性球標記結合的該適體配體經捕捉至晶片，該晶片塗佈有與該適體配體的該序列的一部分互補的短序列。
如請求項17之方法，其中讀取來自針對在該晶片上所捕捉的該嗜鹼性球活化生物標誌物的該適體配體的該螢光訊號及來自針對在該晶片上所捕捉的該嗜鹼性球識別生物標誌物的該適體配體的該螢光訊號並定量。
如請求項18之方法，其中該活化生物標誌物係CD63且該識別生物標誌物係CD203c。
如請求項19之方法，其中該測試物質係過敏原。
如請求項20之方法，其中該過敏原係食物過敏原、藥物、空浮過敏原、環境過敏原、或病原體過敏原。
如請求項21之方法，其中該食物過敏原係花生、堅果、牛奶、雞蛋、大豆、小麥、魚、或貝類。
一種用於診斷或預測對象對測試物質之過敏反應之方法，其包含(i)測量在嗜鹼性球表面上之至少一種識別生物標誌物及至少一種活化生物標誌物，其中該嗜鹼性球係使用與該嗜鹼性球表面上之該識別生物標誌物結合的適體配體來識別，且其中活化之嗜鹼性球係使用與該活化之嗜鹼性球表面上之該活化生物標誌物結合的適體配體來捕捉；及(ii)使用與該適體配體互補的錨來測定嗜鹼性球。
如請求項23之方法，其進一步包含在用該測試物質刺激之前評定該嗜鹼性球活化狀態。
如請求項23之方法，其中未與該嗜鹼性球活化生物標誌物或識別生物標誌物結合的該適體配體經捕捉至晶片，該晶片塗佈有辨識該適體配體的該錨序列。
如請求項25之方法，其中該晶片進一步包含該活化生物標誌物的該適體配體的對照錨序列及該識別生物標誌物的該適體配體的對照錨序列。
如請求項24之方法，其中在該嗜鹼性球表面上之該識別生物標誌物係選自CCR3、CD203c、CD193、CD123、IgE、及CRTH2；且其中在該活化之嗜鹼性球表面上之該活化生物標誌物係選自CD63、CD13、CD107a、CD107b、CD164、及CD69。
如請求項27之方法，其中該識別生物標誌物係CD123且該活化生物標誌物係CD63。