TW202216187A - 術後手術疼痛之治療 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種於治療患者術後手術疼痛使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前多於5日，對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係經由i)皮內；或ii)鞘內被投予。 亦提供對應的治療方法及梭狀芽孢桿菌神經毒素的投予劑量。

Description

術後手術疼痛之治療

本發明係關於由於手術所造成的手術疼痛(例如，術後手術疼痛)及/或手術誘導的焦慮(例如，術後焦慮)之治療。更詳細言之，本發明提供一種治療方法，包含梭狀芽孢桿菌神經毒素(clostridial neurotoxin)之投予，更特別地，提供一種使用肉毒桿菌神經毒素(botulinum neurotoxin)治療術後手術疼痛及焦慮之方法。

術後手術疼痛為由手術程序造成的不愉快的感覺。術後手術疼痛可能由於手術介入、手術程序本身、傷口閉合以及手術程序期間施加的任何力對組織造成的損傷而引起。手術後之手術疼痛(例如，術後手術疼痛)亦可能源於伴隨手術的因素。例如，患者可能因患者在手術台上的姿勢而罹患背痛，或可能是由於胸部區域的手術介入的胸痛。全身麻醉後亦可能發生喉嚨痛，因為插入呼吸管可引起刺激。然而，最常見者為因手術介入切入皮膚及肌肉而引起的術後手術疼痛。

例如，手術介入(或更具體而言，手術切口)可能代表導致疼痛的「有害刺激」。有害刺激，即可激發組織損傷的刺激，可激活來自感覺接受性傳入末梢的神經傳遞物的釋放及來自感覺末梢的神經肽如物質P及抑鈣素基因系胜肽(Calcitonin gene related peptide(CGRP))的釋放。然後有害資訊從周圍神經系統傳導至中樞神經系統，於中樞神經系統處個體會感知疼痛。

術後手術疼痛可由於在手術介入位的發炎及神經組織損傷的組合所引起。任何發炎及/或神經組織損傷皆為術後手術疼痛的補強。例如，對於組織傷害的反應而激活的肥胖細胞之脫顆粒作用可造成各種物質(包括蛋白酶、細胞介素及血清素)的釋放。此等物質可使初級傳入神經元敏感(以較低的閾值激活)以產生疼痛超敏反應。由於組織的廣泛神經支配，身體的任何部位都容易受到手術造成的神經損傷。

術後焦慮可能導致患者出現身體症狀及行為改變，包括但不限於疲勞、專注及睡眠困難、以及肌肉緊張。此外，患者可能會出現焦慮的情緒症狀，包括煩躁、易怒、難以控制恐懼或擔憂、畏懼和恐慌。術後焦慮可能是由麻醉、手術本身、術後手術疼痛及/或醫院環境壓力的影響所引起。例如，手術患者在手術前(例如因預期手術引起的壓力)及手術後通常處於相當程度的精神、身體及情緒壓力之下，這種壓力表現在焦慮的症狀。

用於治療手術(例如術後)疼痛的現有方法通常針對神經傳遞物及肽，且包括非類固醇性抗炎藥((NSAIDS)、類鴉片類藥物、局部麻醉藥阻斷或它們的組合使用。然而，此等治療方法會產生各式各樣的副作用，尤其是通常會誘導依賴性(例如成癮)。此外，此等治療方法僅提供術後急性疼痛緩解，例如僅在投予後短時間提供手術疼痛緩解，因此需要連續/重複投予(加劇患者對鎮痛藥依賴/成癮的問題)。未有效控制急性術後疼痛時，此會增加患者發生慢性術後手術疼痛的機會。此種疼痛管理方法(需要連續投予藥劑)亦經常導致耐藥性。與先前處理術後手術疼痛的方法相關的另外問題包括需要高劑量的鎮痛藥物投予以提供鎮痛效果，而不良副作用通常隨著劑量的增加而增加。

如此，目前治療手術疼痛的方法不適合於(例如，不足以)管理/減輕術後手術疼痛，尤其是中度至重度術後手術疼痛，且它們亦未提供對患者經歷的術後焦慮的適當管理(後者通常需要替代/額外的藥物)。因此，越來越需要用於治療術後手術疼痛及/或術後焦慮的替代/改進方法。

本發明藉由提供一種長期術後手術疼痛/焦慮之治療(包括降低慢性術後手術疼痛的傾向)的方法而解決此等問題中的一個或多個，例如即使在單次(例如急性)投予後。本發明的較佳態樣基於令人驚訝的觀察結果，即在對患者進行手術之前開始治療(投予)而允許在患者從手術中出現時有效的術後手術疼痛或術後焦慮管理(有利地減輕術後疼痛或術後焦慮，否則會被視為全身/局部麻醉劑消退的效果)，且提供特別適用於基於梭狀芽孢桿菌神經毒素的治療的特定術前投予時間點。

發明摘述

更詳言之，本發明係基於以下驚人的發現，即於手術之前多於5日，在手術前藉由皮內或鞘內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(如肉毒桿菌神經毒素)，而治療術後手術疼痛及減少或抑制術後焦慮。此為完全未預期的，因為當梭狀芽孢桿菌神經毒素在接近手術時間及藉由選擇性投予途徑投予時，先前技術之方法報告最佳鎮痛活性。

有利地，本發明人等已證實：藉由在手術之前多於5日，藉由皮內或鞘內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，最早於手術後一小時的某個時間點，梭狀芽孢桿菌神經毒素有效治療術後手術疼痛，且於手術後數天(甚至數週)內持續控制/治療術後手術疼痛，而無需連續投予，且無與傳統鎮痛劑/麻醉藥物相關的副作用。如此，隨著任何「全身」或「局部」麻醉劑(手術期間使用)的作用逐漸減弱，梭狀芽孢桿菌神經毒素可提供術後手術疼痛緩解。換言之，手術前(手術前＞5日)投予，有利地允許梭狀芽孢桿菌神經毒素的鎮痛作用在患者由於手術期間使用的主要麻醉劑/鎮痛劑的效果逐漸減弱而開始感知術後手術疼痛或手術後焦慮的時間點出現(例如達到最大功效/作用)。因此，可於術後手術疼痛出現之前對其進行治療，從而防止患者出現任何相關的(潛在顯著的)不適及窘迫。如下文更詳細描述，術後手術疼痛(例如急性中度至重度術後手術疼痛)的這種早期處理可有利地減輕慢性手術後手術疼痛的發作。

此與當接近手術的時間(或手術全期(peri-operative))投予梭狀芽孢桿菌神經毒素時觀察到的治療形成對比，其中手術全期的投予在手術後觀察到明顯的遲滯期(lag phase)或「活化期(activation period)」，直到提供梭狀芽孢桿菌神經毒素之任何手術疼痛治療效果。

本發明人等的另一令人驚訝的觀察為：於梭狀芽孢桿菌神經毒素為皮內投予時，梭狀芽孢桿菌神經毒素為一特別有效的(例如，快速)術後手術疼痛/術後焦慮治療。確實，當與替代投予途徑如皮下投予及肌肉內投予進行比較時，本發明人等觀察到皮內投予可提供增加的術後手術疼痛及/或術後焦慮的緩解。此係完全未被預期的，因為梭狀芽孢桿菌神經毒素在其它適應症中藉由此類選擇的投予途徑(例如皮下/肌肉內投予)例行地投予時，在功效方面沒有任何明顯缺點。

本發明人等的另一有利發現為：梭狀芽孢桿菌神經毒素能夠在投予部位的遠端的部位發揮作用。例如，在手術介入部位處或附近投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，發明人等觀察到脊髓處的SNARE蛋白質切割(例如，SNAP-25蛋白質切割)(且在在手術介入部位處或附近為最少的或者無SNARE蛋白質切割)，暗示梭狀芽孢桿菌神經毒素從其投予部位逆向運輸行進到脊髓。這使得梭狀芽孢桿菌神經毒素在遠離可能引起患者不適的(任何)損傷部位(例如手術介入部位)的部位投予，該損傷部位可能會給患者帶來不適，如此可將患者感受到的任何進一步的疼痛減少到最小。

現僅藉由例示的方式，參考下列圖式及實施例描述本發明之具體實施例。

詳細說明

於一態樣，本發明提供一種使用於治療患者術後手術疼痛的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前多於5日對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係以下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。

換言之，本發明之一態樣提供一種用以治療患者術後手術疼痛之方法，該方法包含於手術之前多於5日對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係以下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。

於一態樣，本發明提供一種於治療術後疼痛中使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前多於5日對患者投予(例如，皮內)梭狀芽孢桿菌神經毒素。換言之，本發明之一態樣提供一種治療術後疼痛之方法，該方法包含在手術之前多於5日對患者投予(例如，皮內)梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一相關的觀察，已發現梭狀芽孢桿菌神經毒素之預先投予(手術前)減少或抑制/預防(例如，完全預防)患者手術後焦慮發作(術後焦慮)。因此，本發明所提供的又另一令人驚訝的技術效果為由於術前投予梭狀芽孢桿菌神經毒素而可實現的抗焦慮作用。

因此，本發明之另一態樣提供一種用於減少或抑制術後焦慮之梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係以下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。

換言之，本發明之一態樣提供一種減少或抑制術後焦慮之方法，該方法包含於手術之前對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係以下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。

較佳地，一種減少或抑制術後焦慮之方法，包含在手術之前5日以上投予梭狀芽孢桿菌神經毒素；例如，可在手術之前多於5日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

本發明之另一態樣提供一種用於減少或抑制術後焦慮之梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前(如於手術之前5日以上)對患者投予(例如，皮內)梭狀芽孢桿菌神經毒素。換言之，本發明之一態樣提供一種減少或抑制術後焦慮之方法，該方法包含於手術之前對患者投予(例如，皮內)梭狀芽孢桿菌神經毒素。

較佳地，一種減少或抑制術後焦慮之方法，包含於手術之前5日以上投予梭狀芽孢桿菌神經毒素；例如，可在手術之前多於5日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

較佳地，可皮內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

另外或替代地，可鞘內投予(例如，藉由鞘內投予/注射)梭狀芽孢桿菌神經毒素。

現將描述本發明的各種附加(可選擇的)具體實施例。應當注意，下列具體實施例中的每一者皆可適用於本文所述的任何方法或所使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予不包括肌肉內投予。

於一具體實施例，可於手術之前5-50日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如於手術之前6-50日，可選擇地於手術之前5-40日。例如，可於手術之前5-30日、較佳地於手術之前5-20日、更佳地於手術之前5-15日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一具體實施例，可於手術之前＞5日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(較佳於本文所述治療術後手術疼痛之方法)，可選擇地以單一投予步驟。例如，可於手術之前10-20日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素；於手術之前14-16日(較佳於本文所述治療術後手術疼痛之方法)，可選擇地以單一投予步驟。

可於手術之前15日以上、較佳地於手術之前約15日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一較佳具體實施例，可於手術之前＞5日至≤ 15日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(較佳於本文所述治療術後手術疼痛之方法)，可選擇地以單一投予步驟。

於一具體實施例，於手術之前5日以上投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(較佳於本文所述治療術後手術疼痛之方法)。

於一具體實施例，於手術之前12日以上投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(較佳於本文所述治療術後手術疼痛之方法)。

於一具體實施例，於手術之前15日以上皮內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。於一較佳具體實施例，於手術之前約15日皮內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一具體實施例，於手術之前15日以上鞘內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。於一較佳具體實施例，於手術之前約15日鞘內投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

梭狀芽孢桿菌神經毒素通過提供鎮痛作用而治療術後手術疼痛。因此，本文使用的術語「治療」或「處理」意圖涵括鎮痛治療。術語「治療」或「處理」涵括治療術後手術疼痛，使得患者不再感知到手術疼痛(或與未以梭狀芽孢桿菌神經毒素治療的對照患者相比，感知到較少的手術疼痛)。

相似地，梭狀芽孢桿菌神經毒素通過提供抗焦慮作用而抑制術後焦慮。因此，術語「抑制」或「壓制」涵括於患者中藉由梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予所提供的抗焦慮作用而抑制術後焦慮(例如，其症狀)。抑制可與術後手術疼痛治療同時提供，例如作為術後手術疼痛治療的結果。因此，未受限於任何理論，藉由梭狀芽孢桿菌神經毒素的鎮痛效果，梭狀芽孢桿菌神經毒素可提供抗焦慮作用。梭狀芽孢桿菌神經毒素可抑制與手術麻醉、手術本身、術後手術疼痛及/或壓力(例如來自醫院環境)的影響相關(或由其引起)的術後焦慮症狀。

因此，可以治療上有效量或預防上有效量(較佳為預防上有效量)投予梭狀芽孢桿菌神經毒素至受試者。「治療上有效量」為梭狀芽孢桿菌神經毒素之任何量，當單獨或組合投予於受試者以治療術後手術疼痛及/或術後焦慮時，足以實現此類術後手術疼痛及/或術後焦慮之治療。「預防上有效量」為梭狀芽孢桿菌神經毒素之任何量，當單獨或組合投予於受試者以抑制或延緩術後手術疼痛及/或術後焦慮之發作。於一些具體實施例，預防上有效量完全防止術後焦慮的發作。「抑制」發作意指減少術後手術疼痛及/或術後焦慮的可能性，或完全防止發作。

較佳地，治療及/或預防有效量為不導致肌肉麻痺的量。術語「肌肉麻痺」較佳係指長期肌肉麻痺，因為短暫的肌肉麻痺可能於投予後的短時間內發生。

於本文中術語「受試者」、「個體」及「患者」可互換使用以指哺乳類動物受試者。於一具體實施例，「受試者」為人類、伴生動物(例如，如狗、貓及/或兔的寵物)、家畜(例如，豬、綿羊、牛及/或山羊)、及/或馬。於一較佳具體實施例，受試者(患者)為人類。

本發明具體係關於術後手術疼痛，其不同於其它類型的疼痛，如炎症性疼痛及神經性疼痛。在這方面，炎症性疼痛通常由感染、刺激物或過度激活的免疫反應引起，而神經性疼痛通常由神經系統疾病/症候群引起。相反地，本發明與由此等刺激引起的疼痛無關。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予治療術後手術疼痛優先於炎症性疼痛。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予治療最小至無炎症性疼痛。於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予治療術後手術疼痛及最小至無炎症性疼痛。

提及「手術介入」意指涉及治療受試者的損傷或疾病的醫療程序，包含身體的一部分經歷切口(可選擇移除或修復身體受損傷的部分)。儘管侵入的水平(例如所需手術切口的水平)可能因手術類型而異，但意圖涵括具有在手術完成後在受試者中引起術後手術疼痛及/或術後焦慮的侵入水平的手術。術後手術疼痛通常由切割患者皮膚及/或筋膜及/或肌肉及/或骨骼及/或器官的手術切口所引起。因此，通常在手術介入部位處/或附近經歷手術疼痛。

手術介入可包含對皮膚及/或筋膜及/或肌肉的切開。較佳地，手術介入包含對皮膚的切開。

手術介入不限於可以由醫生進行的手術，亦包括例如牙科手術介入。手術介入之非限制性例包括闌尾切除術、乳房生檢、隆胸或縮小、整容、膽囊切除術、冠狀動脈繞道手術、清創術(例如傷口、燒傷或感染)、皮膚移植、器官移植及扁桃體切除術。

較佳地，「術後」可指在手術之後至多一天開始的時間段(例如手術後)。換言之，術語「術後」可指從手術後不超過一天開始的時間段。例如，術語「術後」可指手術後1-20小時開始的時間點；可選擇地為手術後2-15小時；可選擇地為手術後5-10小時。此種時間可代表在時序界面處開始的時間段，在該時間段來自投予至患者的手術麻醉劑的鎮痛作用減弱(例如逐漸縮減)且如此患者開始感知到手術疼痛。

此外，術語「術後」可與術語「手術後」互換使用，因為本文中以「外科手術」的意義使用「手術」。

相似地，術語「術後手術疼痛」可指在手術之後至多一天開始的時間段內感知到(或更具體地，開始感知到)手術疼痛(例如手術後)。換言之，術語「術後手術疼痛」可指患者在手術後不超過一天開始的時間段內感知到的手術疼痛。例如，術語「術後手術疼痛」可指在手術後1-20小時開始的時間段內感知到的手術疼痛；可選擇地為手術後2-15小時；可選擇地為手術後5-10小時。

該時間段可為手術後的1-50週；例如5-45週、10-40週或10-35週。

此與術語「手術全期(peri-operative)」形成對比，手術全期可指例如患者接受手術時或前後的時間段(例如，患者在手術室中的時間)，適當地為手術前至少1小時開始及/或手術後不到1小時結束的期間。

本發明之手術後治療可與手術全期及/或術後治療策略組合以增進效力，較佳地增加持續時間或術後手術疼痛抑制(例如，在發生手術疼痛的高風險患者中)。

於一具體實施例，本發明之方法可包含於手術全期及/或術後(較佳為術後)對患者投予另外的鎮痛劑。換言之，於手術期間(例如，於手術前至少1小時開始及/或手術後不到1小時結束的期間)可投予另外的鎮痛劑。於一具體實施例，可於手術之後(例如，於手術後10、20、40或50週)投予另外的鎮痛劑。

術後手術疼痛可為由感覺接受性傳入末梢之神經傳遞物的釋放及/或如來自感覺末梢的物質P及抑鈣素基因系胜肽(CGRP)的神經肽的釋放引起的疼痛，例如由手術之有害刺激(較佳為手術切口)誘導的疼痛。例如，然後有害訊息(由有害刺激產生)可由周圍神經系統轉導到中樞神經系統，於那裡患者會感知到手術疼痛。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素通過抑制疼痛神經調節劑(如物質P及CGRP)的胞吐作用(exocytosis)而治療手術疼痛。

術後手術疼痛可由手術介入部位的發炎或神經組織損傷或其組合所引起。任何發炎及/或神經組織損傷皆為術後手術疼痛的補強。例如，經活化的肥胖細胞對組織損傷反應的脫顆粒可能造成各種物質的釋放，包括蛋白酶、細胞介素及血清素。此等物質可使初級傳入神經元敏感(以較低的閾值激活)以產生疼痛超敏反應。由於組織受到廣泛的神經支配，身體的任何區域皆可能容易受到手術引起的神經損傷。

換言之，疼痛可為感覺接受性疼痛，例如，術後手術疼痛由組織損傷引起，並藉由痛覺受器(nociceptor)(疼痛受體)對有害刺激的反應而被感知。

於一具體實施例，術後手術疼痛可為神經病性疼痛(例如，由影響體感覺神經系統的損傷或疾病引起的疼痛)。例如，術後手術疼痛可為周圍神經病變(亦稱為周圍疼痛)，例如來自腦及脊髓外的神經(周圍神經)的損傷造成的疼痛。

術後手術疼痛可顯現為其它類型的疼痛，如觸感痛(allodynia)。觸感痛意指「其它疼痛」。觸感痛為由通常不為疼痛的刺激引起的疼痛。罹患「觸覺」觸感痛(又稱為靜態觸覺觸感痛或機械性觸感痛)的患者可能經歷觸痛，如將手術切口的(身體)部位放在床上，或穿著與該部位接觸的衣服。因此，觸感痛被認為係「由通常不會引起疼痛的刺激所引起的疼痛」，而不是痛覺過敏(由通常會引起疼痛的刺激所引起的疼痛增加)。

術後手術疼痛可較佳地為急性術後手術疼痛；例如，可持續少於3個月(手術後)的手術疼痛類型。

於一具體實施例，術後手術疼痛為慢性術後手術疼痛；例如，可持續大於3個月(手術後)的手術疼痛類型且在組織損傷(例如由於手術切口)癒合後可繼續被感知到。

更詳言之，如本文所使用的術語「慢性術後手術疼痛」較佳地係指內在傷害(例如，由手術切口對肌肉造成的損傷)解決後持續超過3個月的疼痛，例如手術後疼痛持續超過3個月。例如，「慢性術後手術疼痛」可能係由於對急性術後手術疼痛(例如，通常持續不到3個月的一種手術疼痛類型)的治療不足(或缺乏)所致。術後「急性手術疼痛」之管理不善可能會增加這種急性手術疼痛變成慢性術後手術疼痛的機會。因此，有利地，藉由在早期階段控制急性術後手術疼痛(有利地係由於手術前投予在手術後不久提供鎮痛功效)，本發明減輕慢性術後手術疼痛的發生。

在瘢痕(在手術切口部位形成的瘢痕)處或周圍可能會感知到慢性術後手術疼痛。於一較佳具體實施例，慢性術後手術疼痛為慢性瘢痕疼痛。術語「慢性瘢痕疼痛」係指由於組織瘢痕形成而產生的疼痛。「慢性瘢痕疼痛」可能由於皮膚及/或肌肉組織及/或神經組織的損傷以及神經的再生而發展。

於一較佳具體實施例，術後手術疼痛為在手術介入部位感知到的手術疼痛及/或在接近手術介入部位的部位感知到的手術疼痛，較佳地其中感知到在組織(例如皮膚、肌肉)內的手術疼痛，該組織係通過手術介入而受損。術後手術疼痛亦可為在已經進行生檢的身體內部的組織/器官部位感知到的手術疼痛。

較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素的投予降低患者手術後的手術疼痛感知水平。例如，與在手術前(例如，於手術之前5日以上)未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素的患者(對照)的手術疼痛感知水平相比，手術後患者的手術疼痛感知水平可降低。

於一具體實施例，於手術後24小時中患者的術後手術疼痛感知降低。換言之，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予於手術後24小時中可降低患者的術後手術疼痛感知。例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予於手術後6小時中、較佳地於手術後1小時中可降低患者的術後疼痛感知。

患者的術後手術疼痛感知於手術後至少3日、手術後至少6日或手術後至少9日可能會減少；例如，手術後至少15日；於另外例中，手術後至少30日。於一較佳具體實施例，手術後多至3個月(包括3個月)患者的術後手術疼痛可能會減少。

減少的患者的術後手術疼痛感知可被維持手術後至少5日，手術後至少7日或手術後至少9日，較佳地為手術後至少9日。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予實質上減少患者的術後手術疼痛感知，且其中減少的術後手術疼痛感知在緊接手術後被維持24小時。於另一具體實施例，患者的術後手術疼痛感知在緊接手術後實質上被減小並維持2日。於一具體實施例，實質上所有減少的術後手術疼痛感知在緊接手術後被維持3日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的手術後疼痛感覺被維持4日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的手術後疼痛感覺被維持5日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的手術後疼痛感覺被維持6日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的手術後疼痛感覺被維持7日。較佳地，緊接手術後，實質上所有減少的手術後疼痛感覺被維持8日。

於一具體實施例，緊接手術後於界定的時間點(如前一段所述)觀察到的疼痛感知之降低水平為在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後任何時間觀察到的疼痛感知降低的最大水平的至少50%。例如，緊接手術後，於界定的時間點(如前一段所述)觀察到的疼痛感知之減少水平為在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後任何時間觀察到的減少的疼痛感知之最大水平的至少55%、至少60%、至少65%、至少70%，較佳地至少75%。

更詳言之，提及「減少」(於術後手術疼痛方面)較佳地意指當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(或投予安慰劑)的受試者(同樣地已接受過手術)所接受的手術疼痛水平相比，投予梭狀芽孢桿菌神經毒素的受試者(例如，患者)感知到較低的手術疼痛的水平。例如，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(或投予安慰劑)的受試者(同樣地已接受過手術)比較時，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予後，手術疼痛感知的水平可減少至少15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%或95%。例如，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(或投予安慰劑)的受試者(同樣地已接受過手術)比較時，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予後，手術疼痛感知的水平可減少至少75%、較佳地至少85%、更佳地至少95%可減少。

用於評估疼痛感知的多種手段為所屬技術領域中具通常知識者已知。例如，對機械性觸感痛(靜態或動態任一者)的評估常規地用於人類疼痛研究，如Pogatzki-Zahn等人所述(Pain Rep.2017 Mar；2(2)：e588)，藉由引述而併入本文。

用於評估受試者疼痛感知之適合(即使為非限制性例示)方法包括以下：數字評定量表(Numerical Rating Scale (NRS))評分；儘管所屬技術領域中具通常知識者知道可附加地或替代地使用的其它方法，如感覺閾值、痛覺感知閾值、靜態機械性觸感痛、動態機械性觸感痛、時間加成(temporal summation)、壓力性疼痛閾值、條件性疼痛調節(conditioned pain modulation)及溫度閾值。

疼痛感知測量之其它非限制性例示包括：在每個預定時間點SF-36分數從基線的變化；研究期間服用的急救藥物的量及首次服用急救藥物的時間。此等可能被視為「探索性」終點或疼痛感知評估測量。

因此，於一較佳具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素投予後，術後手術疼痛感知可以下列一或多者評估：(a)數字評定量表(NRS)；(b)刺激誘發的NRS；(c)疼痛區域的溫度；(d)疼痛區域的大小；(e)鎮痛效果開始的時間；(f)峰值鎮痛效果；(g)達到峰值鎮痛效果的時間；(h)鎮痛效果的持續期間；及(i)SF-36生活品質。

所屬技術領域中具通常知識者知悉用於評估疼痛感知的此種方法。為了方便起見，下面提供了數字評定量表及生活品質調查表簡短版-36(Quality of Life questionnaire Short Form-36)的進一步描述。

數字評定量表(NRS)：一般而言依據本發明之手術疼痛感知使用數字評定量表(NRS)。NRS為11分制的量表，用於評估受試者的手術疼痛感知。受試者被要求給予最適合他們的手術疼痛強度之0到10之間的數字。零代表「完全沒有手術疼痛」，而上限10代表「可能的最嚴重的手術疼痛」。

NRS可用於評估手術疼痛的許多方面，包括自發的平均手術疼痛、自發的最嚴重手術疼痛及自發的當前手術疼痛。自發的平均手術疼痛係藉由要求受試者選擇最佳描述受試者在一段時間內(例如，至少6小時、12小時、24小時或至少48小時)的平均手術疼痛(例如，感知的手術疼痛)的數字而評估。自發的最嚴重手術疼痛係藉由要求受試者選擇一個最能描述受試者在指定時期內最嚴重手術疼痛的數字而評估，例如至少前6小時、12小時、24小時或前48小時。自發的當前手術疼痛係藉由要求受試者選擇一個最能描述受試者在評估時所處的手術疼痛程度為多少的數字而評估。

NRS亦可用於評估受試者對各種不同刺激的手術疼痛感知。為了評估對刺激響應的手術疼痛感知程度，受試者將接受適用於疼痛區域的各種性質的刺激。詢問受試者在投劑前和投劑後當前的NRS得分為何。

所使用的刺激之例包括：(i)輕觸(可藉由在應用本文所述的馮佛雷纖維細絲(von Frey filament)之後，通過測量放射輻(radial spoke)的疼痛區域表面上的疼痛來評估)；(ii)壓力(壓力疼痛閾值)，可藉由使用壓力感覺計，於施加壓力增加時要求受試者給予NRS分數來評估，如本文所述；及(iii)溫度(可藉由使用熱電極(thermode)貼附於疼痛區域，詢問受試者以NRS分數來評估溫暖、冷及熱刺激)，如本文所述。

較佳地，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素的對照患者的NRS評分比較時，本文所述的梭狀芽孢桿菌神經毒素的投予降低患者的手術後NRS評分(例如，從≥7的等級到≤6的等級)。

生活品質調查表簡短版-36(SF-36)：SF-36生活品質調查表可用於評估受試者的手術疼痛感知。SF-36為受試者報告的36項受試者健康調查。SF-36由八項評分(活力、身體機能、身體疼痛、一般健康感、身體角色機能、情感角色機能、社會角色機能及心理健康)所組成。假設每個問題的權重相等，則每個量表直接轉換為0-100尺度。SF-36中記錄的分數越高，失能程度越小。

在臨床試驗中通常測試的用於治療手術疼痛的相關參數為本領域已知，且可由所屬技術領域中具通常知識者容易地選擇。此種參數之例包括，但未限於NRS；刺激誘發的NRS；疼痛區域的溫度；疼痛區域的大小；鎮痛作用開始的時間；鎮痛效果高點；達到鎮痛效果高點的時間；鎮痛效果的期間；及/或如本文所述之SF-36生活品質。評估此等參數的方法於本領域中亦為已知，且可由所屬技術領域中具通常知識者使用常規方法及程序進行。

較佳地，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素的對照患者的SF-36評分比較時，本文所述的梭狀芽孢桿菌神經毒素的投予增加患者的手術後SF-36評分(例如，從≤50的評分到≥50的評分)。

現在轉向「術後焦慮」，對相同內容的引用(即，術後焦慮)可能是指患者出現身體症狀和行為變化的情況，包括但不限於疲勞、注意力集中及睡眠困難以及肌肉緊張。此外，患者可能會出現焦慮的情緒症狀，包括煩躁、易怒、難以控制恐懼或擔憂、畏懼和恐慌。術後焦慮可能是由麻醉、手術本身、術後手術疼痛及醫院環境壓力的影響所引起。

如此，於一具體實施例，術後焦慮係由術後手術疼痛所引起。

術後焦慮可定義為恐慌症、恐懼症、創傷後應激障礙、社交焦慮症(社交恐懼症)或廣泛性焦慮症(GAD)(例如導致你對範圍廣泛的情況及問題感到焦慮，而不是對一特定事件感到焦慮)。

於一具體實施例，用於減少或抑制術後焦慮的梭狀芽孢桿菌神經毒素或包含在手術前投予梭狀芽孢桿菌神經毒素至患者之方法係於手術之前5日以上投予，較佳地其中於手術之前超過5日投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予實質上減少患者的術後焦慮感知，且其中該減少的術後焦慮感知在緊接手術後被維持24小時。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持2日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持3日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持4日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持5日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持6日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持7日。於一具體實施例，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持8日。較佳地，緊接手術後，實質上所有減少的術後焦慮感知被維持9日。

較佳地，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素的對照患者作比較時，本文所述梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予減少手術後焦慮的症狀(例如，減少30%、50%、75%或95%)。術後焦慮之症狀之例包括煩躁、易怒、難以控制恐懼或擔憂、畏懼和恐慌。

更詳言之，提及「減少」(於術後焦慮方面)較佳地意指當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(或投予安慰劑)的受試者(同樣地已接受過手術)所感知的術後焦慮水平相比，投予梭狀芽孢桿菌神經毒素的受試者(例如，患者)感知到較低的術後焦慮的水平。例如，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(或投予安慰劑)的受試者(同樣地已接受過手術)比較，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予後，焦慮感知的水平可減少至少15%、25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%或95%時。例如，當與未投予梭狀芽孢桿菌神經毒素(或投予安慰劑)的受試者(同樣地已接受過手術)比較時，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予後，焦慮感知的水平可減少至少75%、較佳地至少85%、更佳地至少95%。

於一具體實施例，患者所經歷的術後焦慮在手術後24小時內被抑制。換言之，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予於手術後24小時內可降低患者的術後焦慮。例如，於手術後2小時內、手術後4小時內或手術後24小時內、較佳於手術後4小時內，可減少或抑制患者的術後焦慮。

本發明人等已證實可投予梭狀芽孢桿菌神經毒素以治療手術後疼痛以及抑制術後焦慮。如此，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素治療術後疼痛並減少或抑制術後焦慮。

綜合上述，本發明通過減少手術/外科手術後感知的手術疼痛和焦慮其它方面的水平，如此提高患者的生活品質，本發明有利地增加患者整體「術後健康」。

如此，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予促進術後健康。

下文提供本發明涵括的梭狀芽孢桿菌神經毒素的更多細節以及技術背景資訊。

梭狀芽孢桿菌屬(genus Clostridia)中的細菌產生強效且特異性的蛋白質毒素，其可毒害彼等被遞送至之神經元及其他細胞。此種梭狀芽孢桿菌神經毒素之例包括破傷風桿菌( C. tetani)(TeNT)及肉毒桿菌( C. botulinum)(BoNT)血清型A-G所產生的神經毒素，以及彼等由巴氏梭菌( C. baratii)及酪酸梭菌( C. butyricum)所產生者。

梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如，在自然界中)藉由抑制周圍神經系統中膽鹼性傳導(cholinergic transmission)而引起肌肉麻痺，特別是於神經肌肉會合處，因此可為致命的。自然界中，梭狀芽孢桿菌神經毒素係以單鏈多肽的方式被合成，其係藉由蛋白酶切割事件進行轉譯後修飾，而形成藉由雙硫鍵連結在一起的兩條多肽鏈。切割發生於特定切割位(cleavage site)，其通常稱為活化位(activation site)，其位於提供鏈間(inter-chain)雙硫鍵之半胱胺酸殘基間。其為此種雙鏈型，為此毒素之最活性的型式。此兩鏈被稱為重鏈(H-鏈)，其具有約100 kDa之分子量；及輕鏈(L-鏈)，其具有約50kDa之分子量。此H-鏈包含N-端轉位組件(N-translocation component)(HN域)及C-端標靶組件(C-targeting component)(HC域)。此切割位係位於L-鏈及HN域之間。

梭狀芽孢桿菌神經毒素的作用模式取決於五個不同的步驟：(1)HC域與其目標神經元之結合，隨後(2)此結合的毒素經由胞內體(endosome)內化至細胞中，(3)L-鏈藉由HN域轉位通過胞內體膜並進入細胞溶質，(4)藉由提供非細胞毒性蛋白酶功能的L鏈對已知為SNARE蛋白質的細胞內轉運蛋白進行蛋白水解切割，及(5)抑制由目標細胞的細胞分泌。

非細胞毒性蛋白酶係藉由將已知為SNARE蛋白質(例如，SNAP-25、VAMP、或突觸融合蛋白(Syntaxin))之細胞內運輸蛋白進行蛋白酶切割而作用–參見Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (第4版) John Wiley & Sons, Inc.。首字母縮略詞SNARE衍生自可溶性NSF附著受體( Soluble NSF Attachment Receptor)一詞，其中NSF意指N-乙基馬來醯亞胺-敏感性因子( N-ethylmaleimide- Sensitive Factor)。SNARE蛋白質對於細胞內囊泡融合為不可或缺的，因此對於自細胞經由囊泡運輸之分子分泌為不可或缺的。此蛋白酶功能為鋅依賴型內肽酶活性且展現對SNARE蛋白質之高受質特異性。因此，一旦被遞送至所欲標的細胞，此非細胞毒性蛋白酶能夠抑制自標的細胞的細胞分泌。梭狀芽孢桿菌神經毒素之L-鏈蛋白酶係切割SNARE蛋白質之非細胞毒性蛋白酶。

由於其獨特的特性，梭狀芽孢桿菌神經毒素如肉毒桿菌毒素已被成功地運用在廣泛的治療應用，特別是用於運動及自律神經失調，以恢復例如過度活躍的神經末梢的活性至正常水平。目前已描述至少七種抗原性不同的BoNT血清型，即，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G (Rossetto, O. et al., "Botulinum neurotoxins：genetic, structural and mechanistic insights." Nature Reviews Microbiology 12.8 (2014)：535-549)。

儘管有此多樣性，BoNT/A仍然是治療中的血清型選擇，有三種常用的商業製劑(Botox®、Dysport®及Xeomin®)，而市場上僅有一種BoNT/B產品(Neurobloc®/Myobloc®)。迄今為止，此等BoNT/A及BoNT/B產品，其為純化自梭狀芽孢桿菌株的毒素，為監管機構目前批准的僅兩種BoNT血清型，用於人類應用，範圍包括痙攣、膀胱功能障礙或多汗症(於BoNT/A)(參見例如： https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112、https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/870、https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162，藉由引用其完整被併入本文中)至頸部肌張力不全症(於BoNT/B)(參見例如，https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568，藉由引用其完整被併入本文中)。

與藉由殺死其天然目標細胞起作用的細胞毒性蛋白酶(例如，蓖麻毒蛋白(ricin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin))相反，梭狀芽孢桿菌神經毒素為藉由暫時喪失其天然目標細胞的細胞功能而起作用的非細胞毒性蛋白酶。重要地，非細胞毒性蛋白酶於其作用時不會殺死天然目標細胞。除了梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如，肉毒桿菌神經毒素，以已諸如Dysport ^TM、Neurobloc ^TM、及Botox ^TM的商標名販售)以外，一些非細胞毒性蛋白酶的最著名例包括IgA蛋白酶(參見，例如，WO99/032272)，及antarease蛋白酶(參見，例如，WO2011/022357)。

如本文使用之術語「梭狀芽孢桿菌神經毒素」意指進入神經元並抑制神經傳導物質釋放的任何多肽。此過程涵括神經毒素對低或高親和性受體的結合、神經毒素的內化、神經毒素的內肽酶部份進入細胞質的轉位、及神經毒素受質之酶修飾。更具體而言，術語「神經毒素」涵括進入神經元並抑制神經傳導物質釋放的由梭狀芽孢桿菌所產生的任何多肽(梭狀芽孢桿菌神經毒素)，且此種多肽產自重組技術或化學技術。較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。

BoNT血清型A至G可基於藉由特異性中和性抗血清的失活來區分，以此種藉由血清型的分類與於胺基酸水平的序列同一性百分比相關。給定血清型之BoNT蛋白被進一步分成不同亞型，基於胺基酸百分比序列同一性。

BoNT/A神經毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：1 (UniProt登錄號A5HZZ9)及SEQ ID NO：13，其由作為SEQ ID NO：12提供的核苷酸序列編碼。BoNT/B神經毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：2 (UniProt登錄號B1INP5)。BoNT/C神經毒素胺基酸序列被提供為SEQ ID NO：3 (UniProt登錄號P18640)。BoNT/D神經毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：4 (UniProt登錄號P19321)。BoNT/E神經毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：5 (登錄號WP_003372387)。BoNT/F神經毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：6 (UniProt登錄號Q57236)或為SEQ ID NO：9 (UniProt/UniParc登錄號UPI0001DE3DAC)。BoNT/G毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：7 (登錄號WP_039635782)。BoNT/D-C神經毒素胺基酸序列之例被提供為SEQ ID NO：8 (登錄號BAM65681)。BoNT/X神經毒素胺基酸序列之一例被提供為SEQ ID NO：11 (登錄號BAQ12790.1)。較佳地，BoNT為BoNT/A，更佳地為野生型BoNT/A。

於本文中使用時，術語「H _C域」係指具有約50kDa分子量之神經毒素重鏈之功能上獨特的區域，其能夠使神經毒素結合至位於目標細胞表面的受體。H _C域由兩個結構上獨特的次域「H _CN次域」(H _C域之N端部分)及「H _CC次域」(H _C域之C端部分)，其各具有約25kDa之分子量。H _CC域能夠結合梭狀芽孢桿菌神經毒素蛋白質受體。

於本文中使用時，術語「LH _N域」係指不同於H _C域的神經毒素區域，其由內肽酶域(「L」或「輕鏈」)及負責將內肽酶轉移入細胞質的域(重鏈之H _N域)所組成。內肽酶域(「L」或「輕鏈」)能夠切割SNARE蛋白質。

例示的L、H _N、H _CN及H _CC域示於表1。

表 1–例示的L、H _N、H _CN及H _CC域

BoNT	登錄號	SEQ ID NO ：	L	H N	H CN	H CC
BoNT/A1	A5HZZ9	1	1-448	449-872	873-1094	1095-1296
BoNT/B1	B1INP5	2	1-441	442-859	860-1081	1082-1291
BoNT/C1	P18640	3	1-449	450-867	868-1095	1096-1291
BoNT/D	P19321	4	1-442	443-863	864-1082	1083-1276
BoNT/E1	WP_003372387	5	1-423	424-846	847-1069	1070 -1252
BoNT/F1	Q57236	6	1-439	440-865	866-1087	1088-1278
BoNT/F7	UPI0001DE3DAC	9	1-508	509-862	863-1076	1077-1268
BoNT/G	WP_039635782	7	1-446	447-864	865-1089	1090-1297
BoNT/DC	BAM65681	8	1-442	443-863	864-1091	1092-1285
BoNT/X	BAQ12790.1	11	1-439	440-892	893-1306

上述識別的參考序列應被視為指導，因為根據亞血清型可能會發生輕微的變化。例如，US 2007/0166332(於此藉由引用完整併入)引用些微不同的梭狀芽孢桿菌序列。

術語「活化圈」係指包含蛋白酶切割位的多肽域。神經毒素之活化圈已被描述於本技術領域，如WO2016156113(於此藉由引用完整併入)。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素由下列胺基酸序列組成或包含下列胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：11中任一者具有至少70%、較佳為至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素由下列胺基酸序列組成或包含下列胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：1具有至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素由SEQ ID NO：1之胺基酸序列組成或包含其之胺基酸序列(例如，BoNT/A)。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素為嵌合神經毒素。

如本文所使用的術語「嵌合神經毒素」意指包含源自第一神經毒素之一個或多個域及源自第二神經毒素之一個或多個域的神經毒素。例如，嵌合神經毒素可包含源自第一神經毒素血清型或亞型之LH _N域及源自第二神經毒素血清型或亞型之H _C域。嵌合神經毒素之另一例為包含源自第一神經毒素血清型或亞型之LH _NH _CN域及源自第二神經毒素血清型或亞型之H _CC域的神經毒素。嵌合神經毒素之再一例為包含源自第一神經毒素血清型或亞型之LH _N域及源自第二神經毒素血清型或亞型之活化圈的神經毒素。嵌合神經毒素之例被提供於WO2017191315及WO2016156113，兩者全文藉由引用而併入本文。

例如，嵌合神經毒素可包含來自第一神經毒素的LH _N域，其共價連接至來自第二神經毒素的H _C域，較佳地其中該第一及第二神經毒素不同，其中該LH _N域的C端胺基酸殘基對應於該第一神經毒素中分開LH _N及H _C域的3 ₁₀螺旋之第一胺基酸殘基，且其中該H _C域之N端胺基酸殘基對應於該第二神經毒素中分開LH _N及H _C域的3 ₁₀螺旋之第二胺基酸殘基。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素為嵌合神經毒素，其包含源自BoNT/B的H _C域及源自BoNT/A、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、或BoNT/G的LH _N域。

例如，於一具體實施例，H _C域由下列胺基酸序列組成或包含下列胺基酸序列，該胺基酸序列對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291(例如，BoNT/B)，或與其具有至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性；且LH _N域由下列胺基酸序列組成或包含下列胺基酸序列，該胺基酸序列選自由下列組成的群組： -     SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872(例如，BoNT/A)，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列， -     SEQ ID NO：3之胺基酸殘基1至867，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列， -     SEQ ID NO：4之胺基酸殘基1至863，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列， -     SEQ ID NO：5之胺基酸殘基1至846，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列， -     SEQ ID NO：6之胺基酸殘基1至865，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列， -     SEQ ID NO：7之胺基酸殘基1至864，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列， -     SEQ ID NO：8之胺基酸殘基1至863，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列，及 -     SEQ ID NO：9之胺基酸殘基1至862，或具有與其至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的序列。

於一較佳具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素為嵌合神經毒素，其包含源自BoNT/B的H _C域及源自BoNT/A的LH _N域。

於一更佳具體實施例，H _C域由下列胺基酸序列所組成或包含該胺基酸序列，該胺基酸序列對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基860至1291，或與其具有至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列；且LH _N域包含對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基1至872的胺基酸序列，或與其具有至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

於具體實施例，其中梭狀芽孢桿菌神經毒素包含源自BoNT/B的H _C域(例如，於梭狀芽孢桿菌神經毒素為BoNT/B，或包含源自BoNT/B的H _C域之嵌合神經毒素)，梭狀芽孢桿菌神經毒素於提供「經修飾的重鏈」的重鏈之胺基酸序列(如於H _C域中)可具有一個或多個修飾，較佳地，其中該經修飾的重鏈以比天然神經毒素更高(或更低)親和性，結合至目標神經細胞。於H _C域中此種修飾可包括H _CC域之神經節甘脂結合位中的胺基酸殘基的修飾，其可改變神經節甘脂與目標神經細胞的結合，及/或H _CC域之蛋白質受體結合位中的胺基酸殘基之修飾，可改變對目標神經細胞之蛋白質受體的結合。此種修飾的神經毒素之例描述於WO2006027207及WO2006114308，其兩者藉由引用而完整併入本文。

本文中將於重鏈之胺基酸序列具有一個或多個修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素稱為「經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素」。

與該BoNT血清型之天然H _CC域比較時，於依據本發明之經修飾的梭狀芽孢桿菌神經毒素之一具體實施例，源自BoNT/B的H _CC域為經修飾的。

於一較佳具體實施例，源自BoNT/B神經毒素的H _CC域包含至少一個胺基酸殘基突變，其與天然BoNT/B H _CC域比較時，增加該H _CC域對人類Syt II的結合親和性。又，較佳地，與天然BoNT/B H _CC域比較時，該至少一個胺基酸殘基突變增加該H _CC域對人類Syt II的結合親和性至少50%。

於BoNT/B H _CC域中此種適合的胺基酸殘基突變已被描述於本項技術領之WO2013180799及WO2016154534，兩者全文藉由引用而併入本文。

尤其，與天然BoNT/B H _CC域比較時，該適合於增加BoNT/B H _CC域對人類Syt II的結合親和性至少50%的至少一個胺基酸殘基突變，為選自由下列組成的群組的胺基酸殘基取代、添加或缺失：1118M、1183M、1191M、1191I、1191Q、1191T、1199Y、1199F、1199L、1201V、1191C、1191V、1191L、1191Y、1199W、1199E、1199H、1178Y、1178Q、1178A、1178S、1183C、1183P及其任何組合。較佳地，於BoNT/B H _CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係由選自下列組成的群組之兩個胺基酸殘基取代、添加或缺失所組成：1191M及1199L、1191M及1199Y、1191M及1199F、1191Q及1199L、1191Q及1199Y、1191Q及1199F、1191M及1199W、1191M及1178Q、1191C及1199W、1191C及1199Y、1191C及1178Q、1191Q及1199W、1191V及1199W、1191V及1199Y、或1191V及1178Q。又較佳地，於BoNT/B H _CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係由三個胺基酸殘基取代、添加或缺失所組成：1191M、1199W及1178Q。更佳地，於BoNT/B H _CC域中該至少一個胺基酸殘基突變係由兩個胺基酸殘基取代、添加或缺失所組成：1191M及1199Y。

於一更佳具體實施例，與天然BoNT/B H _CC域比較時，該適合於增加BoNT/B H _CC域對人類Syt II的結合親和性至少50%的至少一個胺基酸殘基突變，為選自由下列組成的群組的胺基酸殘基取代、添加或缺失：V1118M、Y1183M、E1191M、E1191I、E1191Q、E1191T、S1199Y、S1199F、S1199L、S1201V、E1191C、E1191V、E1191L、E1191Y、S1199W、S1199E、S1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其任何組合。較佳地，於BoNT/B H _CC域中該至少一個胺基酸殘基突變由兩個胺基酸殘基取代所組成，該取代選自下列組成的群組：E1191M及S1199L、E1191M及S1199Y、E1191M及S1199F、E1191Q及S1199L、E1191Q及S1199Y、E1191Q及S1199F、E1191M及S1199W、E1191M及W1178Q、E1191C及S1199W、E1191C及S1199Y、E1191C及W1178Q、E1191Q及S1199W、E1191V及S1199W、E1191V及S1199Y、或E1191V及W1178Q。又，較佳地，於BoNT/B H _CC域中該至少一個胺基酸殘基突變由三個胺基酸殘基取代所組成：E1191M、S1199W及W1178Q。更佳地，該於BoNT/B H _CC域中至少一個胺基酸殘基突變係由兩個胺基酸殘基取代所組成：E1191M及S1199Y。

於一較佳具體實施例，待修飾的BoNT/B H _CC域對應於SEQ ID NO：2之胺基酸殘基1082至1291(天然的BoNT/B H _CC域)，或對應於與其具有至少70%、較佳至少80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

於一具體實施例，如上所述，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可為嵌合及修飾兩者。例如，於一較佳具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素包含(或由其組成)SEQ ID NO：10之胺基酸序列，或與其具有至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

於一具體實施例，如上所述，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可為嵌合及修飾兩者。例如，於一較佳具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素包含(或由其組成)SEQ ID NO：10之胺基酸序列(例如，BoNT/AB _MY)、或與其具有至少70%、較佳至少75%、80%、85%、90%、95%或99%序列同一性的胺基酸序列。

使用重組技術可生產本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素。如此，於一具體實施例，本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素為重組梭狀芽孢桿菌神經毒素。

運用此類重組神經毒素可有利地擴大用於本文所述方法的梭狀芽孢桿菌神經毒素的選擇，例如基於性質的選擇，如被認為適合於任何給定手術的效力及作用持續時間。適合的(已知)重組梭狀芽孢桿菌神經毒素包括經修飾的肉毒桿菌神經毒素A(BoNT/A)，當與未經修飾的BoNT/A(例如，Dysport®)比較時，其較佳具有較長作用期間。該作用期間可為至少大1.25x、1.5x、1.75x、2.0x、或2.25x。經修飾的BoNT/A之作用期間可為6至9個月之間。例如，作用期間可為至少：4.5個月(由開始)、5.0個月、5.5個月、6個月、6.5個月、7.0個月、7.5個月、8.0個月、8.5個月或9.0個月。

適合的經修飾的BoNT/A多肽(及編碼其之核苷酸序列，於存在時)被描述於WO 2015/004461 A1及WO 2017/191315，其兩者藉由引用完整併入本文。

更詳言之，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素為經修飾的重組BoNT/A神經毒素。於一具體實施例，經修飾的BoNT/A包含於選自下列一個或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 1081、GLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、及THR 1277，較佳地其中該修飾選自：(i)以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；(ii)以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；(iii)以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基；(iv)鹼性胺基酸殘基之插入；及(v)酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。

當與SEQ ID NO：1所示的未經修飾的BoNT/A相比，該修飾可為一修飾，其中胺基酸殘基編號係藉由與SEQ ID NO：1的比對而確定。由於SEQ ID NO：1(以及對應本文所述經修飾的BoNT/A多肽的SEQ ID NO)之位於位置1的甲硫胺酸殘基係可選擇的，當確定胺基酸殘基編號時，所屬技術領域中具通常知識者將考量甲硫胺酸殘基的存在/不存在。例如，於SEQ ID NO：1包括甲硫胺酸時，位置編號將如上定義(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：1之ASN 886)。或者，於甲硫胺酸不存在於SEQ ID NO：1，胺基酸殘基編號應-1修飾(例如，ASN 886將為SEQ ID NO：1之ASN 885)。當本文所述的其它多肽序列的位置1處存在/不存在甲硫胺酸時，適用類似的考慮，且所屬技術領域中具通常知識者將使用本領域常規技術而容易決定正確的胺基酸殘基編號。此同樣適用於本文所述的任何其它BoNT(例如，上述嵌合BoNT)。

修飾用所指的胺基酸殘基係表面暴露的胺基酸殘基。

經修飾的BoNT/A可經與選自SEQ ID NOs：14、16、18、及20之核酸序列具有至少70%序列同一性的核酸序列編碼。例如，與選自SEQ ID NOs:14、16、18及20之核酸序列具有至少至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的核酸序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可經一核酸序列編碼，該核酸序列包含(或由其組成)SEQ ID NOs：14、16、18或20。經修飾的BoNT/A可包含與選自SEQ ID NOs:15、17、19及21之多肽序列具有至少70%序列同一性之多肽序列。例如，與選自SEQ ID NOs:15、17、19及21之多肽序列具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含(更佳為由其組成)一多肽序列，該多肽序列選自SEQ ID NO：15、17、19、及21。

當使用於經修飾的BoNT/A的上下文時，術語「一個或多個胺基酸殘基」較佳意指所指胺基酸殘基之至少2、3、4、5、6或7個。如此，經修飾的BoNT/A於所指胺基酸殘基可包含至少2、3、4、5、6或7(較佳為7)個修飾。經修飾的BoNT/A可包含1-30、3-20、或5-10個胺基酸修飾。更佳地，當使用於經修飾的BoNT/A的上下文時，術語「一個或多個胺基酸殘基」意指所有之所指胺基酸殘基。

較佳地，除了所指胺基酸殘基處的一個或多個胺基酸修飾之外，當與SEQ ID NO：1相比時，經修飾的BoNT/A不含有任何進一步的胺基酸修飾。

最佳地，經修飾的BoNT/A包含(更佳為由其組成)位於選自下列的一個或多個胺基酸殘基的修飾：ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052、及GLN 1229。經修飾的BoNT/A可經與SEQ ID NO:14具有至少70%序列同一性的核酸序列編碼。例如，與SEQ ID NO：14具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性之核酸序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可經一核酸編碼，其包含(或由其組成) SEQ ID NO：14。經修飾的BoNT/A可包含與SEQ ID NO：15具有至少70%序列同一性的多肽序列。例如，與SEQ ID NO：15具有至少80%、90%、95%或99.9%序列同一性的多肽序列。較佳地，本發明中使用的經修飾的BoNT/A可包含(更佳為由其組成)SEQ ID NO：15。

此修飾可選自：(i)以鹼性胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；(ii)以未帶電胺基酸殘基取代酸性表面暴露的胺基酸殘基；(iii)以鹼性胺基酸殘基取代未帶電的表面暴露的胺基酸殘基；(iv)鹼性胺基酸殘基之插入；及(v)酸性表面暴露的胺基酸殘基之刪除。

如上所指之修飾造成經修飾的BoNT/A當與對應的未經修飾的BoNT/A比較時具有增加的正表面電荷及增加的等電點。

等電點(pI)為指定蛋白質之特性。更詳言之，等電點(pI)被定義為蛋白質顯示淨電荷為零之pH值。pI的增加意指蛋白質顯示淨電荷為零需要較高pH值。如此，pI的增加代表於所給pH下，蛋白質之淨正電荷增加。相反地，pI的減少意指蛋白質顯示淨電荷為零所需的pH值較低。如此，pI的減少代表於所給pH下，蛋白質之淨正電荷減少。

在本領域中測定蛋白質之pI的方法為已知，且為本項技術領域中具有通常知識者所熟悉。舉例而言，蛋白質之pI可由存於蛋白質中之各胺基酸之平均pKa值計算而得(「經計算的pI」)。此種計算可使用此項技術中已知的電腦程式進行，如來自ExPASy的Compute pI/MW Tool(https：//web.expasy.org/compute_pi/)，其為依據本發明計算pI的較佳方法。不同分子之間的pI值之比較應使用相同計算技術/程式進行。在適當情況下，蛋白質之計算的pI可使用等電焦集法(「觀察到的pI」)之技術確認。該技術使用電泳根據其pI而分離蛋白質。等電焦集法一般使用具有固定化pH梯度的膠體而進行。當施加電場時，蛋白質通過pH梯度移動直到其到達其具零淨電荷的pH，此點為蛋白質的pI。等電焦集法提供的結果一般於性質上為相對低的解析，如此本發明者咸信藉由計算的pI(如上述)所提供的結果係更為適用。

除非另有陳述，本說明書全文中「pI」意指「計算的pI」。藉由改變於蛋白質表面上所顯示的鹼性及/或酸性基團的數目，蛋白質之pI可被增加或減少。此可藉由修飾此蛋白質之一個或多個胺基酸而達成。例如，藉由減少酸性殘基的數目或藉由增加鹼性殘基的數目而可提供pI的增加。

本發明之經修飾的BoNT/A可具有高於未經修飾的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：1)至少0.2、0.4、0.5或1 pI單位的pI值。較佳地，經修飾的BoNT/A可具有至少6.6之pI，例如，至少6.8之pI。

下表指出20種標準胺基酸之性質：

胺基酸			側鏈	胺基酸			側鏈
天冬胺酸	Asp	D	帶電(酸性)	甲硫胺酸	Met	M	未帶電(極性)
麩胺酸	Glu	E	帶電(酸性)	色胺酸	Trp	W	未帶電(極性)
精胺酸	Arg	R	帶電(鹼性)	半胱胺酸	Cys	C	未帶電(極性)
離胺酸	Lys	K	帶電(鹼性)	丙胺酸	Ala	A	未帶電(疏水性)
組胺酸	His	H	未帶電(極性)	甘胺酸	Gly	G	未帶電(疏水性)
天冬醯胺酸	Asn	N	未帶電(極性)	纈胺酸	Val	V	未帶電(疏水性)
麩醯胺酸	Gln	Q	未帶電(極性)	白胺酸	Leu	L	未帶電(疏水性)
絲胺酸	Ser	S	未帶電(極性)	異白胺酸	Ile	I	未帶電(疏水性)
蘇胺酸	Thr	T	未帶電(極性)	脯胺酸	Pro	P	未帶電(疏水性)
酪胺酸	Tyr	Y	未帶電(極性)	苯丙胺酸	Phe	F	未帶電(疏水性)

下列胺基酸被視為帶電胺基酸：天冬胺酸(負的)、麩胺酸(負的)、精胺酸(正的)、及離胺酸(正的)。

於pH 7.4，天冬胺酸(pKa 3.1)及麩胺酸(pKa 4.1)之側鏈具有負電荷，而精胺酸(pKa 12.5)及離胺酸(pKa 10.8)之側鏈具有正電荷。天冬胺酸及麩胺酸被稱為酸性胺基酸殘基。精胺酸及離胺酸被稱為鹼性胺基酸殘基。

下列胺基酸被視為不帶電、極性(意指其可參與氫鍵結)胺基酸：天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸。下列胺基酸被視為不帶電、疏水性胺基酸：丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、及甘胺酸。

於胺基酸插入，額外的胺基酸殘基(並非通常存在者)被併入BoNT/A多肽序列，如此，增加於該序列中的胺基酸殘基的總數。於胺基酸刪除，胺基酸殘基自梭狀芽孢桿菌毒素胺基酸序列刪除，如此，減少於該序列中的胺基酸殘基的總數。

較佳地，修飾為一取代，其於經修飾的BoNT/A中有利地保持相同數目的胺基酸殘基。於胺基酸取代，形成BoNT/A多肽序列之部分的胺基酸殘基以不同胺基酸殘基置換。置換胺基酸殘基可為如上述20種標準胺基酸之一者。或者，於胺基酸取代中該置換胺基酸可為非標準胺基酸(非上述20種標準組之部分之胺基酸)。舉例而言，置換胺基酸可為鹼性非標準胺基酸，例如，L-鳥胺酸、L-2-胺基-3-胍丙酸、或離胺酸、精胺酸及鳥胺酸之D-異構物)。導入非標準胺基酸至蛋白質之方法為此項技術領域已知，並且包括使用大腸桿菌營養缺陷型的表現宿主之重組蛋白質合成。

於一具體實施例，取代係選自：以鹼性胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基、以未帶電胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基、及以鹼性胺基酸殘基取代未帶電胺基酸殘基。於一具體實施例，其中該取代為以未帶電胺基酸殘基取代酸性胺基酸殘基，酸性胺基酸殘基以其對應的未帶電醯胺胺基酸殘基替換(即，天冬胺酸以天冬醯胺酸替換，及麩胺酸以麩醯胺酸替換)。

較佳地，鹼性胺基酸殘基為離胺酸殘基或精胺酸殘基。換言之，取代為以離胺酸或精胺酸之取代。最佳地，修飾為以離胺酸之取代。

根據本發明進行修飾後，經修飾的BoNT/A能夠結合至未經修飾的BoNT/A(例如，SEQ ID NO：1)所結合的目標細胞受體。

剛才描述適合的修飾(重組)BoNT/A神經毒素，例如，具有較長的作用期間，下文描述者為適合的修飾(重組)BoNT/E神經毒素，其作用可能相對較快及/或具有較短的作用期間。此再次證明基於本發明的療法之梭狀芽孢桿菌神經毒素提供的有利的靈活性。例如，對於侵入性較小的手術(例如，預計術後疼痛不會持續很長時間)，可運用此種BoNT/E以提供較短的作用期間。

BoNT/E(例如，rBoNT/E)可包含與SEQ ID NO：5具有至少70%(較佳至少80%；更佳至少90%)序列同一性之多肽序列，其但書為該多肽序列包括一個或多個(例如，一個或多個、二或多個、三或多個、四或多個、五或多個、六或多個、七或多個、或八個；較佳所有八個)之下列胺基酸(其中胺基酸位置編號以BoNT/E蛋白質的N端甲硫胺酸胺基酸殘基開始並以C端胺基酸殘基結束)：位於位置177的甘胺酸；位於位置198的絲胺酸；位於位置340的丙胺酸；位於位置773的白胺酸；位於位置963的白胺酸；位於位置964的麩醯胺酸；位於位置967的丙胺酸；位於位置1195的天冬醯胺酸。

該胺基酸可為與野生型BoNT/E多肽序列(如UniProt Q00496之序列)有關的取代(例如，突變)。例如：位於位置177的甘胺酸可能為精胺酸至甘胺酸取代(R177G)；位於位置198的絲胺酸可能為C198S取代；位於位置340的丙胺酸可為R340A取代；位於位置773的白胺酸可為I173L取代；位於位置963的白胺酸可為F963L取代；位於位置964的麩醯胺酸可為E964Q取代；位於位置967的丙胺酸可為R967A取代；及/或位於位置1195的天冬醯胺酸可為插入(例如，於野生型BoNT/E序列如UniProt Q00496)之多肽序列之G1194與N1195之間的插入。

於一具體實施例，如上述，該一個或多個胺基酸的存在，提供與缺乏該胺基酸的BoNT/E蛋白質相比，具有改善的溶解度的BoNT/E蛋白質。該改善的溶解度增加異源表現系統(如大腸桿菌表現系統)中蛋白質的產量。

於一具體實施例，如上述，該一個或多個胺基酸的存在，提供與缺乏該胺基酸的BoNT/E蛋白質相比，具有改善的效力的BoNT/E蛋白質。該改善的效力可較佳地為改善的活體內效力(更佳地，在人類受試者中改善的活體內效力)。

於一具體實施例BoNT/E為描述於WO 2014/068317 A1中(或由描述於WO 2014/068317的核苷酸序列所編碼)者，其藉由引用而併入本文。

較佳地，梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如，如本文所述之使用)為與至少一醫藥上可接受的載劑一起之醫藥組成物的一部分。關於「醫藥上可接受的載劑」，本文中其係意指與醫藥組成物之其它成分(特別是與梭狀芽孢桿菌神經毒素)可相容的任何組分，且其對人類患者並非有害的。依據標準醫藥實務，基於所欲投予途徑，可選擇醫藥上可接受的載劑，包括但未限於賦形劑、稀釋劑、佐劑、推進劑(propellant)及鹽。

因此，本發明進一步係關於一種用於治療人類患者術後手術疼痛及/或焦慮中使用之醫藥組成物，其中該組成物包含本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素及至少一種醫藥上可接受的載劑，且被投予至患者之梭狀芽孢桿菌神經毒素的劑量係如上述。亦被涵括者為對應於治療術後手術疼痛及/或焦慮之用途及方法，其包含投予本發明之醫藥組成物至人類患者。於另一具體實施例，本發明係關於一種於促進術後健康中使用的醫藥組成物，其中該術後健康是減少術後手術疼痛及焦慮。

本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素可較佳地被調配成用於皮內投予。

投予之較佳途徑係經由皮內投予。較佳地，皮內投予意指皮內注射。

較佳地，該治療術後手術疼痛及/或術後焦慮之BoNT為經純化的BoNT。於本文中使用時，術語「經純化的BoNT」意指純化自天然產生的梭狀芽孢桿菌菌株(天然存在的梭狀芽孢桿菌菌株)或使用重組技術而被純化的肉毒桿菌神經毒素。經純化的BoNT/A可與複合蛋白結合或無複合蛋白，但較佳地無複合蛋白。如此，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素與BoNT複合蛋白締合，該BoNT複合蛋白亦稱為無毒性神經毒素相關蛋白質(non-toxic neurotoxin-associated proteins(NAP))。換言之，將梭狀芽孢桿菌神經毒素與BoNT複合蛋白締合或組合投予至人類患者。因此，於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素與一個或多個BoNT複合蛋白複合。市售的純化及複合蛋白相關BoNT/A的例子包括Botox®、Dysport®(與BoNT複合蛋白締合)及Xeomin®(純化的)。

於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素並無BoNT複合蛋白(或未與BoNT複合蛋白締合或組合)。換言之，梭狀芽孢桿菌神經毒素在未與BoNT複合蛋白締合或組合而被投予至人類患者。

梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量可以奈克(nanogram)測量。

依據本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量應了解為活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量，即，不包括與該神經毒素可能締合的複合蛋白的量。換言之，它係指活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量，無論投予至患者的該神經毒素是否與或不與複合蛋白締合。如本領域技術人員眾所周知，活性雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素能夠結合膜(例如細胞膜)受體，將輕鏈轉移到細胞質中並切割SNARE蛋白質，而複合蛋白並未顯示此種生物活性(即，並非「活性」)。

另外或替代地，梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量可以梭狀芽孢桿菌神經毒素之「單位」(U)測量。例如，當投予BoNT/A(或更特別地，例如，Dysport®)時，以單位為劑量的測量可能為特別適合的。

確實，如本領域技術人員眾所周知，梭狀芽孢桿菌神經毒素之效力係關於需要達成LD50(致死劑量50)單位的神經毒素的量(例如，奈克)；一個LD50單位被定義為(如於小鼠中測量的)腹膜內半數致死劑量。然而，目前市場上的BoNT醫藥製劑含有不同量之150 kD神經毒素，亦含有不同量之LD50單位。此外，於此等製劑中，神經毒素可能與或可能不與無毒性神經毒素相關蛋白(NAP)締合(即，與其組合)，無毒性神經毒素相關蛋白亦稱為複合蛋白。為了易於轉換(如被報告於Field et. al,“AbobotulinumtoxinA (Dysport®), OnabotulinumtoxinA (Botox®), and IncobotulinumtoxinA (Xeomin®) Neurotoxin Content and Potential Implications for Duration of Response in Patients”.Toxins 2018, 10(12), 535)： -     100單位之Botox®(亦稱為OnabotulinumtoxinA)，含有約0.9ng之150 kD BoNT/A，以及複合蛋白； -     500單位之Dysport®(亦稱為AbobotulinumtoxinA)，含有約2.69ng之150 kD BoNT/A，以及複合蛋白；1單位Dysport®含有約5.38 pg BoNT/A； -     100單位之Xeomin®(亦稱為IncobotulinumtoxinA)，含有約0.40ng之150 kD BoNT/A，不具有複合蛋白。

應當注意，轉換值可能略有變化。例如，報告於Frevert, 2012 (“Content of botulinum neurotoxin in Botox®/Vistabel®, Dysport®/Azzalure®, and Xeomin®/Bocouture®”；Drugs R D. 2010;10(2):67-73)之轉換值如下： -     100單位之Botox®(亦稱為OnabotulinumtoxinA)，含有約0.73ng之150 kD BoNT/A，以及複合蛋白； -     100單位之Dysport®(亦稱為AbobotulinumtoxinA)，含有約0.65ng之150 kD BoNT/A，以及複合蛋白； -     100單位之Xeomin®(亦稱為IncobotulinumtoxinA)，含有約0.44ng之150 kD BoNT/A，不具有複合蛋白； -     100單位之Neurobloc/Myobloc®(亦稱為RimabotulinumtoxinB)，含有約0.2ng至約1ng之150 kD BoNT/B，以及複合蛋白。

梭狀芽孢桿菌神經毒素的量可由本領域技術人員根據本技術領域習用的方法，較佳以奈克水平定量蛋白質，其中包括質譜法，如同位素稀釋質譜法(Muñoz et al., Quantification of protein calibrants by amino acid analysis using isotope dilution mass spectrometry, Anal.Biochem.2011, 408, 124–131)，或螢光分析(Poras et al., Detection and Quantification of Botulinum Neurotoxin Type A by a Novel Rapid In Vitro Fluorimetric Assay, Appl Environ Microbiol.2009 Jul； 75(13)：4382-4390)。

皮內投予可包含以如30號針頭之類的針頭進行皮內注射，較佳為其中針(如30號針)以相對於手術介入部位(其可以在腹側)處的皮膚表面約5°-15°的角度插入皮膚的真皮中。注射的深度(相對於皮膚表面的深度)可為約0.2-0.3(較佳為約0.25)英吋。

梭狀芽孢桿菌神經毒素可以在身體上要進行手術介入的部位(例如，手術切口，或手術切口部位的近端)投予。

於一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素可以在患者的手術介入部位(例如，在患者的手術介入部位的一個或個投予部位)(如經由皮內注射或鞘內注射)投予。

梭狀芽孢桿菌神經毒素可以在一個或多個部位投予，例如在靠近手術介入部位的一個或多個部位。「靠近手術介入部位」的部位可能距手術介入部位至多15 cm；例如，距手術介入部位至多10 cm；較佳距手術介入部位至多5 cm；更佳距手術介入部位至多1 cm。

於一具體實施例，投予後，梭狀芽孢桿菌神經毒素藉由逆向運輸移行至脊髓，並在該脊髓中影響SNARE蛋白切割(SNAP-25蛋白切割)。

於一具體實施例，當於皮內部位投予梭狀芽孢桿菌神經毒素時，於投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，在該皮內部位處或附近觀察到該梭狀芽孢桿菌神經毒素引起的極少或沒有SNARE蛋白切割(SNAP-25蛋白切割)。於一具體實施例，在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後5-7日進行觀察，並於投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，在該皮內部位處或附近觀察到該梭狀芽孢桿菌神經毒素引起的極少或沒有SNARE蛋白切割(SNAP-25蛋白切割)。

於一具體實施例，當於鞘內部位投予梭狀芽孢桿菌神經毒素時，於投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，在該鞘內部位處或附近觀察到該梭狀芽孢桿菌神經毒素引起的極少或沒有SNARE蛋白切割(SNAP-25蛋白切割)。於一具體實施例，在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後5-7日進行觀察，並於投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，在該鞘內部位處或附近觀察到該梭狀芽孢桿菌神經毒素引起的極少或沒有SNARE蛋白切割(SNAP-25蛋白切割)。

如此，梭狀芽孢桿菌神經毒素可於手術介入部位的遠端投予以治療術後手術疼痛及術後焦慮。

如此，於一較佳具體實施例，當由於手術介入引起術後手術疼痛時，可於手術介入部位的遠端(例如，在患者切口部位遠端的一個或多個投予部位)(如經由皮內注射或鞘內注射)投予梭狀芽孢桿菌神經毒素。

可於手術介入部位遠端的一個或多個部位投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如在距手術介入部位至少15 cm的部位；在距手術介入部位至少50 cm的部位或在距手術介入部位至少100 cm的部位。

所屬技術領域中具通常知識者應了解本發明係針對手術前投予，如此提及「在或接近手術介入部位」投予係指一旦手術開始後於將歷經(例如，隨後)手術介入的部位處或附近投予。提及「在手術介入部位遠端的部位」投予係指一旦手術開始後於將歷經(例如，隨後)手術介入的部位處的遠端投予。

梭狀芽孢桿菌神經毒素可以在至多15個(較佳至多10個)部位(例如靠近手術介入部位的部位)投予。此種部位可橫貫手術介入部位的周邊。

於一較佳具體實施例，被投予至人類患者中用以治療手術疼痛之本發明之梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量(即，治療劑量)為約0.00025ng至約3ng之範圍。

於一較佳具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之治療劑量為範圍約0.0003ng至約2ng，較佳為約0.0004ng至約1.5ng、約0.0005ng至約1ng，又較佳為約0.0006ng至約0.5ng之該梭狀芽孢桿菌神經毒素。

例如，包含BoNT/A的梭狀芽孢桿菌神經毒素之劑量(例如，總劑量)係較佳地範圍為約1ng至約2ng。

患者可被投予100-500 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素。例如，患者可被投予150-300 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素；較佳地為175-250 U；更佳地為約200 U。

患者可被投予每公斤(kg)患者體重80-250皮克(picograms (pg))之梭狀芽孢桿菌神經毒素(例如，850-250 pg/kg)。例如，患者可被投予100-200 pg/kg、115-175 pg/kg、或130-150 pg/kg。

如上述，可以在一個或多個部位投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如於多於1個投予部位。於一具體實施例，患者被投予每個投予部位2.5-30 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素；較佳地其中患者被投予每個投予部位20 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素。例如，10個投予部位可接受每個投予部位20 U之投予，提供總共200 U之投予。

可以每個投予部位10-170pg的總劑量投予患者梭狀芽孢桿菌神經毒素。於一較佳具體實施例，可於以每個投予部位1-14 pg/kg(體重)之劑量下，投予患者梭狀芽孢桿菌神經毒素。

於另一具體實施例，梭狀芽孢桿菌神經毒素之治療劑量較佳地範圍為約0.001 ng至約2ng。又，例如，梭狀芽孢桿菌神經毒素之治療劑量較佳地範圍為約0.0003 ng至約0.05 ng。

儘管如此，應理解所需劑量範圍取決於梭狀芽孢桿菌神經毒素的確切性質、特定受試者(例如人類受試者)的最大耐受劑量、皮膚狀況、投予途徑、調配物的性質、患者年齡、患者體重、患者狀況的性質、程度或嚴重度、禁忌(如有)、以及主治醫師的判斷。可使用用以最佳化之標準經驗慣例來調整於此等劑量程度的變動。

於一具體實施例，投予患者基於單一肉毒桿菌神經毒素血清型(例如，BoNT/A)的單一療法。如此，於一具體實施例，本發明運用單一肉毒桿菌神經毒素血清型(例如，BoNT/A)之用途。

與本發明的各種方法相關的具體實施例係意圖同等地應用於其它方法，梭狀芽孢桿菌神經毒素，例如，工程化梭狀芽孢桿菌神經毒素(無論是單鏈或雙鏈形式)、用途或醫藥組成物，反之亦然。

序列同源性

可使用多種序列比對方法中的任一種來確定一致性百分比，包括但不限於整體方法(global methods)、局部方法和雜合方法((hybrid methods)，諸如，例如區段逼近法(segment approach method)。確定一致性百分比的實驗規程為本領域所屬技術領域中具有通常知識者範疇內的常規程序。整體方法從分子的起始到末端比對序列，並藉由累加各個殘基對的分數並藉由施加間隙(gap)罰分(gap penalties)來確定最佳比對。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，參見例如，Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position- Specific Gap Penalties and Weight MatrixChoice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；及其疊代細化(iterative refinement)，參見例如，Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI.Biol.823-838 (1996)。局部方法藉由鑑定所有輸入序列共有的一個或多個保守基序來比對序列。非限制性方法包括，例如，Match-box，參見例如，Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box：A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509(1992)；吉布斯採樣(Gibbs sampling)，參見例如，C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214(1993)；Align-M，參見例如，Ivo Van WaIIe et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics:1428-1435(2004)。

如此，藉由習知方法確定序列同一性百分比。參見例如，Altschul et al., Bull.Math.Bio.48：603-16, 1986及Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-19, 1992。簡而言之，將兩個胺基酸序列進行比對，以優化比對得分，其使用間隙開放罰分10、間隙延伸罰分1以及Henikoff及Henikoff(同上)的「blosum 62」評分矩陣，如下所示(胺基酸藉由標準的單一字母代碼表示)。

在兩個以上核酸或胺基酸序列間的「序列同一性百分比」係在序列所共有的相同位置之數目的函數。如此，同一性%可以下述方式計算：相同核苷酸/胺基酸的數目除以核苷酸/胺基酸總數乘以100。序列同一性%的計算亦可考慮到為了最佳化兩個以上序列的比對所需要引入之間隙的數量、以及各間隙的長度。兩個以上序列之間的序列比較及一致性百分比的確定可使用例如BLAST的特定數學演算法進行，其為具有技術通常知識者熟悉。

用於確定序列同一性的比對分數

然後，同一性百分比計算為：

實質上同源的多肽特徵在於具有一或多個胺基酸取代、刪除或添加。這些改變較佳為較小性質，即保留的胺基酸取代(詳見下文)且不會顯著影響多肽的折疊或活性的其它取代；小刪除，通常刪除1至約30個胺基酸；及小的胺基或羧基末端延伸，諸如胺基末端的甲硫胺酸殘基、最多達約20-25個殘基的小型連接肽或親和性標籤。

保留的胺基酸取代

鹼性：	精胺酸；離胺酸；組胺酸
酸性：	麩胺酸；天冬胺酸
極性：	麩醯胺酸；天冬醯胺酸
疏水性：	白胺酸；異白胺酸；纈胺酸
芳香族：	苯丙胺酸；色胺酸；酪胺酸
小的：	甘胺酸；丙胺酸；絲胺酸；蘇胺酸；甲硫胺酸

除了20種標準胺基酸之外，可以用非標準胺基酸(諸如4-羥基脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺基異丁酸、異纈胺酸及α-甲基絲胺酸)取代本發明的多肽的胺基酸殘基。有限數量的非保留胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸及非天然胺基酸可取代多肽胺基酸殘基。本發明之多肽亦可包含非天然存在的胺基酸殘基。

非天然存在的胺基酸包括但不限於反式-3-甲基脯胺酸、2,4-甲橋-脯胺酸(2,4-methano-proline)、順式-4-羥基脯胺酸、反式-4-羥基-脯胺酸、N-甲基甘胺酸、別-蘇胺酸、甲基-蘇胺酸、羥基-乙基半胱胺酸、羥基乙基升半胱胺酸(hydroxyethylhomo-cysteine)、硝基-麩醯胺酸、升麩醯胺酸(homoglutamine)、2-哌啶甲酸、三級白胺酸、正纈胺酸、2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯基-丙胺酸、4-氮雜苯基-丙胺酸、及4-氟苯丙胺酸。此項技術領域已知將非天然存在的胺基酸殘基併入蛋白質中的數種方法。例如，可使用活體外系統，其中使用經化學胺基醯化的壓制型tRNA(suppressor tRNA)而抑制無意義突變(nonsense mutation)。用於合成胺基酸和胺基醯化tRNA的方法為此項技術領域所知。包含無意義突變的質體的轉錄和轉譯係於無細胞系統中進行，該無細胞系統包含大腸桿菌S30萃取物及可商業上購得的酶和其它試劑。蛋白質可藉由層析純化。參見例如，Robertson et al., J. Am. Chem.Soc.113:2722, 1991；Ellman et al., Methods Enzymol.202:301, 1991；Chung et al., Science 259:806-9, 1993；及Chung et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9, 1993)。於第二種方法中，藉由顯微注射突變的mRNA及經化學胺基醯化的壓制型tRNA，而在爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte)中進行轉譯(Turcatti et al., J. Biol.Chem.271:19991-8, 1996)。於第三種方法中，在欲替換的天然胺基酸(例如苯丙胺酸)不存在且所欲的非天然存在的胺基酸(例如2-氮雜苯丙胺酸、3-氮雜苯丙胺酸、4-氮雜苯丙胺酸或4-氟苯丙胺酸)存在下培養大腸桿菌細胞。非天然存在的胺基酸被併入多肽中代替其天然的對應物。參見，Koide et al., Biochem.33:7470-6, 1994。天然存在的胺基酸殘基可藉由活體外化學修飾而轉化為非天然存在的種類。化學修飾可與定點誘變結合以進一步擴大取代範圍(Wynn and Richards, Protein Sci.2:395-403, 1993)。

有限數量的非保留的胺基酸、非由遺傳密碼編碼的胺基酸、非天然存在的胺基酸及非天然的胺基酸可取代本發明之多肽的胺基酸殘基。

本發明之多肽中的必需胺基酸可根據所屬技術領域中已知的程序，諸如定點突變或丙胺酸-掃描誘變(scanning mutagenesis)(Cunningham and Wells, Science 244：1081-5, 1989)進行鑑定。生物相互作用的位點亦可藉由結構物理分析來確定，如藉由如核磁共振、結晶學、電子繞射或光親和性標幟(photoaffinity labeling)之技術，結合推定的接觸位點胺基酸的突變來確定。參見例如，de Vos et al., Science 255:306-12, 1992；Smith et al., J. Mol.Biol.224:899-904, 1992；Wlodaver et al., FEBS Lett.309:59-64, 1992。必需胺基酸的同一性亦可由與本發明之多肽的相關組分(例如轉位或蛋白酶組分)的同源性分析來推斷。

可使用已知的誘變與篩選方法，如由Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53-7, 1988)或Bowie and Sauer (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6, 1989)揭示者而進行並測試多個胺基酸取代。簡而言之，此等作者揭示用於在多肽中同時隨機化二或多個位置，選擇功能性多肽，然後定序誘變的多肽以確定每個位置允許取代的幅度之方法。可使用的其它方法包括噬菌體展示(phage display)(例如，Lowman et al., Biochem.30: 10832-7, 1991；Ladner et al., U.S.專利號5,223,409；Huse, WIPO公開案WO 92/06204)及區域定向誘變(region-directed mutagenesis)(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986；Ner et al., DNA 7:127, 1988)。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有如被本揭示所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York(1994)，及Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY(1991)為所屬技術領域中具通常知識者提供本揭示中使用的許多術語的一般詞典。

此揭示並不受限於本文所揭示的例示方法及材料，且與本文描述的彼等方法或材料相似或等同的任何方法和材料皆可用於本揭示之具體實施例的實施或試驗中。數字範圍包括定義範圍的數字。除非另有說明，否則分別為任何核酸序列均以5'至3'方向從左至右書寫；胺基酸序列以胺基至羧基的方向從左至右書寫。

本文所提供的標題並非此揭示之各種態樣或具體實施例的限制。

胺基酸在本文中使用胺基酸的名稱、三字母縮寫或單字母縮寫來指稱。本文所使用之術語「蛋白質」包括蛋白質、多肽及肽。本文所使用之術語「胺基酸序列」與術語「多肽」及/或術語「蛋白質」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「肽」同義。在一些情況下，術語「胺基酸序列」與術語「酶」同義。術語「蛋白質」和「多肽」在本文可互換使用。在本揭示及申請專利範圍中，可使用用於胺基酸殘基的習知一字母及三字母代碼。胺基酸的三字母代碼，係與IUPACIUB聯合生化命名委員會(Joint Commission on Biochemical Nomenclature，JCBN)一致地定義。亦應理解的是，由於遺傳密碼的簡併性，一種多肽可藉由一種以上的核苷酸序列所編碼。

術語之其它定義可能於整個說明書中出現。在更詳細地描述示例性具體實施例之前，應理解本揭示不限於所描述的特定具體實施例，並且因此可變化。亦應理解，本文所使用的術語僅用於描述特定具體實施例的目的，而無意於限制本發明，由於本揭示內容的範圍僅由所附申請專利範圍限定。

於本文提供一數值範圍時，應當理解，除非上下文另有明確指明，否則在該範圍的每個中間值到該範圍的上限和下限之間的單位的十分之一亦被具體揭示。在本揭示內容中包含「在所述範圍內的任何所述值或中間值」與「所述範圍內的任何其它所述或中間值」之間的每個較小範圍。應當進一步理解，本文中由表現「由a至b」所表示的數值範圍意指由a擴展到b的數值範圍(即，包括嚴格的端點a及b)。

此外，應當理解本文中術語「約」應理解為加或減(±)5%，較佳為與其一起使用的數值的±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%。

必須注意於本文及所附申請專利範圍中使用時，單數形式「一」、「一種」、及「該」包括複數的指涉對象，除非上下文另有明確規定。如此，例如，提及「一種肉毒桿菌神經毒素」包括多種的此種候選藥劑，且提及「該肉毒桿菌神經毒素」包括提及所屬技術領域中具有通常知識者已知的一或多種梭狀芽孢桿菌神經毒素及其等效物等。

本文中討論的出版物僅提供用於彼等在本申請案之申請日之前的揭示。本文中的任何內容均不應解釋為承認此類出版物構成所附之申請專利範圍的先前技術。

序列表於下列SEQ ID NOs之任一者中指示初始Met胺基酸殘基或對應的初始密碼子時，該殘基/密碼子為任選的。

實施例

材料及方法

動物模型在以下研究中使用體重為11-13 kg的雄性家豬。豬為研究術後手術疼痛之治療的適合模型，因豬皮膚在結構、厚度、神經支配、色素沉著、膠原蛋白及脂質成分、傷口癒合和免疫反應方面與人類皮膚有相似之處。

Dysport 之回溶Dysport被提供於含有500U的小瓶中。用於投劑，500U的小瓶以鹽水(0.9% NaCl)回溶。根據測試劑量以鹽水進行後續稀釋，如下所示： 以3 ml注射器+21 G針頭吸取2.5 ml鹽水並轉移至Dysport 500U小瓶；濃度為200 U/ml = 400 U/2 ml；輕輕旋轉小瓶直至材料溶解。每個小瓶左右傾斜2-3次(以確保溶液均勻)；使用連接到30 G針頭的2個1 ml注射器對豬投劑2 ml。此溶液用於投劑400U。

200U/2 ml 劑量的製備：Dysport如上說明回溶；使用3 ml注射器及21 G針頭吸取2 ml之回溶的Dysport 500U；使用3 ml注射器及21 G針頭吸取2 ml之鹽水；使用真空採血管小瓶以混合2種上述溶液；將混合溶液左右傾斜5-6次(以確保溶液均勻)；使用連接到30 G針頭的2個 1 ml注射器對豬投劑2 ml。

100U/2 ml 劑量的製備：如上說明將Dysport回溶；使用3 ml注射器及21 G針頭吸取2 ml之回溶的Dysport 500U；使用3 ml注射器及21 G針頭吸引2 ml之鹽水；使用真空採血管小瓶以混合2種上述溶液；將混合溶液左右傾斜5-6次(以確保溶液均勻)；使用3 ml注射器及21 G針頭從真空採血管小瓶中吸取2 ml製備的溶液；使用3 ml注射器及21 G針頭吸取2 ml之鹽水；使用新的真空採血管以混合2種上述溶液；將混合溶液左右傾斜5-6次(以確保溶液均勻)；使用連接到30 G針頭的2個 1 ml注射器對豬投劑2 ml。

術後手術疼痛的誘導通過面罩輸送異氟烷(isoflurane)/氧氣混合物而將豬麻醉。使用Septol及Polydine (Iodo-Vit)溶液清潔切口區域。6-7 cm長的皮膚切口在左側，朝向豬的尾端和脊柱線外側3 cm(第1日)或7 cm長的皮膚切口在左腿上。然後切開筋膜，縮回肌肉(Castel et al., Characterization of a porcine model of post-operative pain, Eur.J. Pain.2014, 18(4), 496-505；藉由引用併入本文)。然後以3-0 Vicryl線縫合皮下組織。使用連續縫合法以3-0絲線縫合皮膚。在切口閉合及材料注射後，豬接受抗生素(Marbocyl 10%)。切口區域以Syntomicine 3%的薄層覆蓋。在手術及投劑期間(約20分鐘)將動物保持在麻醉狀態。手術後，將動物放回圍欄進行恢復及觀察。

治療

Dysport 之手術全期皮內投予 於手術全期投予，在縫合左脅腹切口後立即注射動物。將Dysport(試驗項目)、鹽水(陰性對照)或參考化合物Exparel(陽性對照)皮內注射(或對於Exparel為皮下注射)，使用30G針頭附著於1 ml注射器，並注射至切口周圍的10個部位中。每個部位注射固定投劑體積及固定投劑水平。更詳言之，沿左側7 cm水平切口/縫合線的每一側(例如8個部位)注射4個部位(以2 cm間隔)，以及左側切口/縫合線每一端的部位(參見圖1)。以下實驗組的評估如下：

組數	治療	動物數	投劑體積	每隻動物投劑水平
1	鹽水	6	200 μL/注射部位	鹽水
2	Exparel	6	20 ml	266 mg
3	Dysport	6	200 μL/注射部位	100 U
4	Dysport	6	200 μL/注射部位	200 U
5	Dysport	6	200 μL/注射部位	400 U

Dysport 之手術全期皮下投予 於手術全期注射，由於動物在切開之前注射(在豬的左脅腹或左腿)，以2 ml之固定總體積，首先進一步紋身切口的位置。使用附著於1 ml注射器之30G針頭，將Dysport(試驗項目)或鹽水(陰性對照)皮下注射至切口周圍的10個部位。每個部位注射固定投劑體積及固定投劑水平。在手術之前15日、5日或1日進行投予。下列實驗組(當在豬的左脅切開切口時)的評估如下：

組數	治療	動物編號	投劑體積	每隻動物投劑水平	投劑日 vs. 手術日
1	Dysport	6	200 μL/注射部位	鹽水	- 15
2	鹽水	6	200 μL/注射部位	200 U/豬，以20 U注射10個部位
3	Dysport	6	200 μL/注射部位	鹽水	- 5
4	鹽水	6	200 μL/注射部位	200 U/豬，以20 U注射10個部位
5	Dysport	6	200 μL/注射部位	鹽水	- 1
6	鹽水	6	200 μL/注射部位	200 U/豬，以20 U注射10個部位

下列實驗組(當在豬的左腿切開切口時)的評估如下：

組數	治療	動物編號	投劑體積	每隻動物投劑水平	投劑日 vs. 手術日
1	鹽水	6	200 μL/注射部位	鹽水	- 15
2	Dysport	5	200 μL/注射部位	200 U/豬，以20 U注射10個部位
3	Exparel	6	20 ml	266 mg	1

經由皮內、肌肉內或皮下途徑之Dysport投予 由於動物是在進行切口之前15日注射，所以進一步將切口位置進行紋身。使用附著於1 ml注射器之30G針頭，將Dysport(試驗項目)或鹽水(陰性對照)注射至切口周圍的10個部位。每個部位注射固定投劑體積及固定投劑水平。經由皮內、皮下或肌肉內途徑進行投予。

以下實驗組的評估如下：

組數	治療	投予途徑	投劑體積及投劑水平	投劑日 vs. 手術日
1	Dysport	肌肉內	200 U/2 ml/豬，分成10個200 μL的部位	-15
2	鹽水
3	Dysport	皮內	200 U/2 ml/豬，分成10個200 μL的部位	-15
4	鹽水
5	Dysport	皮下	200 U/2 ml/豬，分成10個200 μL的部位	-15
6	鹽水

馮佛雷測定第1日手術後1、2、4及6小時及每日一次持續10日，Dysport/鹽水注射後，在健康、未手術的動物中進行馮佛雷測定。將馮佛雷纖維細絲(Ugo Basile，義大利)施加於靠近側面或腿部皮膚表面的切口線約0.5 cm處。隨著纖維細絲克數的增加，作用在側腹或腿部皮膚上的力也會增加。使用的最大力為60g。施加纖維細絲直到動物從刺激中縮回。每根纖維細絲施加3-5次。若未達成縮回，則施加較粗的纖維細絲。若達成縮回，則施加更細的纖維細絲(更粗或更細係指更高/更粗或更低/更細的公克力)。藉由改變纖維細絲厚度，確定並記錄達成縮回反應所需的力。下表列出了馮佛雷纖維細絲的尺寸及力：

納入標準：若於基線側腹縮回力≥26g(較佳為60g)，則動物被包括於研究中。手術後，若側腹縮回力≤10g，則認為存在疼痛(觸感痛)。若動物不符合此標準，則將其排除在研究之外。由於術前閾值相對較低(≤10g)，一隻動物被排除在研究之外。

若基線時腿部縮回力≥13 g，則動物被納入研究。手術後，若腿部縮回力≤2g，則認為存在疼痛(觸感痛)。若動物不符合此標準，則將其排除在研究之外。

接近時間測試 (Approaching Time test)在對豬投予之前，進行接近時間(AT)測試的研究人員第一次進入圍欄。當有人進入豬圈時，豬的正常行為是遠離入侵者然後接近該人。豬與人越熟悉，越感覺自在，它們接近人的時間就越短。接近進入牠們的家-圍欄之研究人員的潛伏期以秒為單位(截止時間為120 秒)。此測試在早晨進行，在早晨進食(上午6:30)後至少1小時在窘迫行為評分之前及在習慣期間進行。

窘迫行為評分切開後，動物的行為發生變化。當接近時，動物遠離進入圍欄的研究人員，傾向於保護切口側，有時習慣發出聲音。此為此類手術後觀察到的主要現象，在極少數情形，動物會變得焦躁不安或表現出孤立行為。窘迫行為從0(正常)到7(非常窘迫)評分。窘迫行為評分測試在接近時間測試後立即進行。動物的一般行為在早晨期間在牠們的家圍欄中被監測。窘迫行為評分亦可評估動物的整體健康狀況。動物的行為由對治療不知情的觀察者評分，其中總分為下表中所示的所有部分的總和。

評分部分	參數	分數
部分1	避免站立(躺下)	1
站立	0
部分2	避免行走	1
行走	0
部分3	於行走時會保護切口側	1
表現正常	0
部分4	當研究人員接近時會遠離	1
當研究人員接近時不會遠離	0
部分5	焦躁	1
正常	0
部分6	與其它動物隔離	1
與其它動物一起	0
部分7	尖叫(高聲)	1
正常發聲	0

行為評分的評估不是按特定順序進行的，而是根據動物的總自發行為進行。

運動活動的開放場所測試開放空間為寬2.5m、長4.7m的長方形場地。場地的牆壁光滑，高1.6m。在測試的早晨，將所有組的動物個別引導至開放空間，一次一隻，於5分鐘期間(5)。使用CCTV攝像機記錄動物的運動活動，並以AnyMaze軟體(Stoelting Co.)進行分析。在圍欄中進行的行為測試(即接近時間、窘迫行為及馮佛雷)結束時進行開放空間試驗。每次開放空間實驗後，分析以下參數：總步行距離(m)及在區域中心(E區；參見圖2)花費的時間百分比。

窘迫的動物和痛苦的動物通常會行走得更靠近圍欄的牆壁或開放空間裝置。沒有窘迫的動物會毫不猶豫地進入開放空間裝置的中心。

實施例 1 Dysport 之手術全期投予提供手術後延遲的鎮痛及抗焦慮效果 ( 豬的左脅腹切口 )

在縫合豬的左脅腹的切口後立即(即，手術全期地)對豬皮內注射鹽水、Exparel(266mg 固定劑量)或不同濃度的Dysport。豬的機械敏感性藉由馮佛雷測定測量，作為對術後手術疼痛治療的評估。當與鹽水處理組相比，Exparel顯示1日期間的鎮痛效果，但之後沒有顯示出有效的鎮痛活性。400U的Dysport投予在手術後2日誘導中度鎮痛作用。當對豬投予200U或400U的Dysport時，手術後4日誘導較大的鎮痛效果。術後6日，所有測試的Dysport濃度皆完全抑制術後手術疼痛。此暗示Dysport為治療術後手術疼痛提供了有效且持久的鎮痛效果。此數據於圖3A中的條形圖中說明。

測量豬接近牠們的管理者的潛伏期。在切開時對豬皮內注射鹽水、Exparel或不同濃度的Dysport。到手術後2小時，所有治療組皆顯示出接近其管理者的延遲。到6小時，皮內注射200U或400U之Dysport減少豬接近其管理者所需的時間，此等影響持續長達手術後5日，暗示有減少術後窘迫及焦慮樣反應的潛能。以鹽水或Exparel治療的豬在接近牠們的管理者方面未顯示任何改善，暗示此等治療不會減少術後窘迫及焦慮樣反應。此數據說明於圖3B。

測量豬的窘迫行為評分。與鹽水及Exparel治療組不同，接受100U、200U或400U的Dysport的豬在手術後2日顯示其窘迫行為評分降低。該數據說明於圖3C。

開放空間試驗顯示手術前及手術後鹽水處理後動物行走的總距離沒有差異。在投劑後3日，以Exparel或Dysport治療不影響總步行距離，暗示手術後動物的運動功能沒有變化。此數據說明於圖4A。以400U Dysport治療的動物在開放空間設備的中心待更多的時間，儘管此差異沒有統計學上的意義(參見圖4B)。

實施例 2 Dysport 的術前投予誘導更快的鎮痛效果，並在豬的左脅腹進行手術切口時抑制術後窘迫及焦慮樣反應的出現

由於手術全期投予Dysport顯示鎮痛效果的延遲，因此測量術前投予Dysport的鎮痛及抗焦慮效果。在手術之前15日(參見圖5A)、5日(參見圖5B)或1日(參見圖5C)(豬的左脅腹切口)對豬皮內注射投予鹽水或200U之Dysport。藉由使用馮佛雷測定，當於手術之前15日投予Dysport時，觀察到最快的鎮痛效果，減少術後手術疼痛至手術後1日。相較之下，當於手術之前5日投予Dysport時，在手術後5日減少術後手術疼痛。

當於手術之前15或5日皮內注射Dysport而投予時，豬顯示減少接近牠們的處理者的時間(參見圖6)。相似地，當於手術之前15或5日皮內注射Dysport而投予時，豬顯示減少窘迫行為評分(參見圖7)。在手術之前1日投予Dysport並沒有誘導出有效的抗焦慮效果。此暗示在手術之前15或5日Dysport之術前投予可完全地防止術後窘迫及焦慮樣反應的出現。

所有治療組(在手術之前15日、5日或1日皮內注射Dysport)均未顯示其術後總步行距離有差異(參見圖8)，暗示肌肉活動未受影響，且無毒素的全身性散播。

注射鹽水的動物在手術前及手術後在開放空間設備中心花費的時間百分比相似。在手術之前15日以Dysport治療的動物在開放空間設備中心花費的時間更多(參見圖9A)。當於手術之前5日或1日投予時，鹽水及Dysport治療的動物在中央區花費的時間百分比沒有差異(參見圖9B及圖9C)。

實施例 3 Dysport 的皮內投予對於減輕術後手術疼痛及抑制術後焦慮的出現提供有利的途徑

評估在手術之前15日200U Dysport之不同投予途徑(皮內、皮下及肌肉注射)，以評估其在術後誘導鎮痛及抗焦慮效果的能力。令人驚訝地，皮內投予提供相較於其它選用的途徑較佳的結果(確實，通常觀察到只有Dysport投予之皮內途徑顯示出快速的鎮痛效果(參見圖10)。Dysport投予的皮下及肌內途徑兩者均顯示對鎮痛活性幾乎沒有影響。當於手術之前15日皮內注射Dysport時，豬接近其管理者的時間縮短，窘迫行為評分降低(參見圖11及圖12)。此暗示皮內投予途徑有效緩解術後手術疼痛並防止術後窘迫及焦慮樣反應的完全出現。

所有鹽水組中手術後記錄的步行距離與手術前記錄者相同。此外，以Dysport治療及其投予途徑(皮內、皮下或肌肉內途徑)不影響手術後總步行距離(參見圖13)。

手術前及手術後注射鹽水的動物在開放空間裝置中心停留的時間百分比相似。不同投予途徑之間動物在開放空間裝置中心停留的時間百分比沒有差異(參見圖14)。

實施例 4 SNAP-25 切割發生於 Dysport 注射遠端的部位，在脊髓的同側背角

為了評估Dysport(皮內注射)的作用機制，在手術切口部位(豬的左脅腹)及脊髓的兩個組織樣本上進行免疫組織化學。在皮膚樣品之神經中未檢測到經切割的SNAP-25(參見圖15)。未預期地，在同側脊髓背角中可看到經切割的SNAP-25(參見圖16)，此提示脊髓中BoNT/A之活性，且提示於脊髓中經由中樞作用可提供述後手術後疼痛/焦慮控制。此亦凸顯Dysport可經由鞘內投予直接投予至脊髓中。

藉由免疫組織化學染色，評估脊髓中涉及疼痛調節之兩種神經肽(抑鈣素基因系胜肽(CGRP)及物質P)的表現水平。與未治療的豬相比，以Dysport治療的豬的脊髓中，神經肽任一者的表現水平均未顯示出差異(參見圖17)。

與未處理的豬相比，以Dysport治療的豬的脊髓中小神經膠質細胞活化之標誌物Iba1的表現水平降低(參見圖18A、B)。相似地，當與未治療的豬相比時，以Dysport 處理的豬的脊髓中，星狀細胞活化之標誌物GFAP的表現水平降低(圖18C、D)。

實施例 5 當於豬的左腿上進行手術切口時，術前投予 Dysport 誘導快速鎮痛效果並抑制術後窘迫及焦慮樣反應的出現

當對豬進行不同的手術切口部位(對左腿而不是左脅腹的手術切口)時，測量術前投予Dysport之鎮痛及抗焦慮效果。在手術之前15日對豬進行皮內注射鹽水或200U之Dysport或於手術當天注射Exparel(第1日)(參見圖19A)(對左腿的手術切口)。藉由使用馮佛雷測定，觀察到快速鎮痛效果，在手術後1日減少術後手術疼痛，且在第4日觀察到機械性觸感痛的持久逆轉。

當與投予鹽水及Exparel相比，在手術之前15日皮內注射Dysport時，豬(左腿有縫合切口)顯示接近牠們的處理者的時間減少(參見圖19B)。相似地，當與投予鹽水及Exparel相比，在手術之前15日皮內注射Dysport時，豬(左腿有縫合切口)表現出降低的窘迫行為評分(參見圖19C)。此暗示在手術之前15日(對左腿的切開)，Dysport的術前投予完全防止術後窘迫及焦慮樣反應的出現。

總體而言，此實驗進一步支持當在手術之前15日投予Dysport時的快速鎮痛及抗焦慮效果。

實施例 6 SNAP-25 切割發生在左腿有手術切口之豬的同側脊髓背角

為了評估在豬的不同部位皮內投予Dysport時是否發生相同的Dysport作用機制，對在手術切口部位(豬的左腿)及脊髓不同區域的組織樣本進行免疫組織化學(參見圖20)。切開並注射Dysport後5-7日收集的樣品中，在皮膚樣品的神經中未檢測到經切割的SNAP-25(參見圖21)。在脊髓的同側背角中可見經切割的SNAP-25，特別是在腰部L5-L6區域(參見圖22)，此類似於在豬的左側腹脅進行手術切口的發現。此等發現表明脊髓中的BoNT/A活性，且可經由脊髓中的中樞效應提供術後手術疼痛/焦慮的控制。與在豬的左側腹脅進行手術切口之經切割的SNAP-25染色相比，同側背角中經切割的SNAP-25染色的定位是不同的。

經切割的SNAP-25染色的強度按1-3級分級，0級=無切割的SNAP-25染色，1級=低強度切割的SNAP-25染色，2級=平均切割的SNAP-25強度染色及3級=高強度切割的SNAP-25染色(參見圖23A)。基於該分級系統，與在左側腹脅進行手術切口的豬相比，在左腿進行手術切口的豬在同側背角具有較低強度的經切割的SNAP-25染色。

對經切割的SNAP-25染色的強度進行量化(參見圖23B)。計算H分數作為經切割的SNAP-25染色強度的量度。藉由將陽性脊髓切片的百分比乘以背角中的染色強度而計算H分數。在以Dysport(並在左腿有手術切口)治療的豬中，在腰椎區域L5-L6的脊髓中觀察到經切割的SNAP-25的最高染色(指定為2級之經切割的SNAP-25強度染色)，當與腰椎區域L3-L4及L1-L2以及脊髓的胸椎和頸椎區域相比時(頸椎區域有切割的SNAP-25染色痕跡)。於鹽水或Exparel注射的豬中沒有證據表明經切割的SNAP-25染色。

上述免疫組織化學染色摘述於圖24中並證實在脊髓局部區域觀察到SNAP-25切割。局部區域L5-L6、L3-L4及L1-L2以及脊髓的胸椎及頸椎區域，對經切割的SNAP-25染色檢測呈陽性，而其餘組織(包括注射部位的皮膚)，對經切割的SNAP-25染色檢測呈陰性。

於上述說明書中提及的所有出版物均藉由引用併入本文。在不脫離本發明的範疇及精神的情況下，本發明所描述方法及系統的各種修飾及變化對於所屬技術領域中具通常知識者將是顯而易見的。儘管已結合特定較佳具體實施例對本發明進行描述，但應當理解，所請發明不應過度限於此類特定具體實施例。實際上，對於生物化學和生物技術或相關技術領域中具有通常知識者而言顯而易見的是，所述用於實施本發明之模式的各種修飾皆在以下申請專利範圍的範疇內。

無。

圖 1顯示沿手術切口的注射部位的示意圖，其中注射Dysport、鹽水或參考化合物Exparel。 圖 2顯示用於運動活動(locomotion activity)的開放空間試驗之活動場所示意圖。 圖 3顯示皮內注射生理鹽水、Exparel(對照劑)或不同濃度的Dysport(100、200及400U)之手術全期投予對減輕術後手術疼痛及焦慮的影響。進行馮佛雷(Von Frey)測定作為手術疼痛感知之測量，結果示於(A)。橫穿圖表的水平線設定為26g，表示未感知手術疼痛的基線(例如，一個閾值，高於該閾值可考慮治療受試者的術後手術疼痛)。當機械靈敏度為0-15g時，疼痛可定義為中度/重度，當在15-26g之間時為輕度/中度，且當在26g以上時感知到很少/沒有疼痛。在手術全期皮內投予Exparel或Dysport後，豬接近其管理員所需的時間(以秒為單位)示於(B)。在手術全期投予Exparel或Dysport後對窘迫行為進行評分，並示於(C)。 圖 4顯示動物在5分鐘期間內行走的平均組總步行距離(以公尺為單位)(A)及手術全期皮內注射鹽水、Exparel(對照劑)或不同濃度的Dysport(100、200及400U)後，在開放空間裝置的中央區域花費的平均時間百分比(B)。 圖 5顯示在手術之前15日(A)、5日(B)或1日(C)，皮內投予鹽水(對照)相對於BoNT/A(Dysport)的馮佛雷測定。 圖 6顯示在手術之前15日(A)、5日(B)或1日(C)，皮內投予鹽水或Dysport(200U/豬)後，豬接近其管理者的潛伏期(以秒為單位)。條形圖(A-C)中的每個時間點(日)，左側(較淺)的條形顯示Dysport治療的結果，右側(較深的)條形顯示鹽水治療的結果。 圖 7顯示在手術之前15日(A)、5日(B)或1日(C)，皮內投予鹽水或Dysport後，豬的窘迫行為評分。條形圖(A-C)中的每個時間點(日)，左側(較淺)的條形顯示Dysport治療的結果，右側(較深的)條形顯示鹽水治療的結果。 圖 8顯示在手術之前15日(A)、5日(B)或1日(C)皮內投予鹽水或Dysport後，豬的總步行距離(以公尺為單位)。 圖 9顯示在手術之前15日(A)、5日(B)或1日(C)皮內投予鹽水或Dysport後，於5分鐘之期間在開放空間裝置的中心區域花費的時間的時間進程(time course)(個別值及中位數)。 圖 10顯示當經由皮內(A)、皮下(B)或肌肉內(C)注射投予時，鹽水相對於BoNT/A(Dysport)的馮佛雷測定。對於測試的每個注射途徑，每頭豬總共投予200U的Dysport。 圖 11顯示當經由皮內(A)、皮下(B)或肌肉內(C)注射投予鹽水或Dysport時，豬接近其管理者的潛伏期(以秒為單位)。對於測試的每個注射途徑，每頭豬總共投予200U的Dysport。 圖 12顯示當經由皮內(A)、皮下(B)或肌肉內(C)注射投予鹽水或Dysport時，豬的窘迫行為評分。對於測試的每個注射途徑，每頭豬總共投予200U的Dysport。 圖 13顯示皮內、皮下或肌肉內投予鹽水或Dysport後，動物在開放空間中行走5分鐘期間的總距離(以公尺為單位)的時間進程(個別值及平均值±SEM)。 圖 14顯示皮內、皮下或肌肉內投予鹽水或Dysport後，動物在開放空間裝置的中心區域花費的時間的時間進程(個別值及平均值±SEM)。 圖 15顯示皮膚樣本中SNAP-25的免疫組織化學染色，具有小動脈周圍的小神經(A)、豎毛肌中的神經末梢(B)及真皮中的中小神經(C)。 圖 16顯示未經治療的豬脊髓中經切割的SNAP-25的免疫組織化學染色(A)及以Dysport治療的豬的同側角(B)或對側角(C)中的經切割的SNAP-25染色。 圖 17顯示當未經治療(A、C)或投予皮內注射Dysport(B、D)時，豬脊髓中抑鈣素基因系胜肽(CGRP)及物質P的表現水平。 圖 18顯示當未經治療或皮內注射Dysport之投予時，豬脊髓中Iba1(A、B)及神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein (GFAP))(C、D)的表現水平。 圖 19顯示在手術之前15日鹽水(對照)或BoNT/A(Dysport)皮內投予或手術當天(D1)的Exparel皮內投予的馮佛雷測定，且當豬的左腿經歷手術切口時，(A)*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；****p＜0.0001 vs.鹽水組，使用單因子ANOVA，然後塔基檢定(Tukey test)。#p＜0.05；##p＜0.01 ####p＜0.0001 Dysport vs. Exparel組，使用單因子ANOVA，然後塔基檢定。$$ p＜0.01：手術後時間點vs. 第-4日，使用成對T檢定(paired T-test))。(B)顯示在手術之前15日皮內投予鹽水(對照)或BoNT/A(Dysport)或手術當天(D1)皮內投予Exparel後，豬接近其管理員的潛伏期(以秒為單位)，且當豬的左腿經歷手術切口時($$ p＜0.01：手術後時間點vs.第-4日，使用成對T檢定。£££ p＜0.001：第-16日vs.第-4日，使用成對T檢定。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001治療vs.食鹽組，使用單因子ANOVA，然後塔基檢定)。(C)顯示在手術前15日皮內投予鹽水(對照)或BoNT/A(Dysport)或手術當天(D1)皮內投予Exparel後，豬的窘迫行為評分，且當豬的左腿經歷手術切口時(*p＜0.05，***p＜0.001及****p＜0.0001 vs.食鹽組，使用單因子ANOVA，然後塔基檢定。$$ p＜0.01，$p＜0.05：手術後時間點vs.第-4日，使用成對T檢定)。 圖 20顯示收集用於免疫組織化學染色的組織樣本(福馬林固定石蠟包埋的組織)的摘要，以及從脊髓收集組織樣本的特定區域。 圖 21顯示左腿手術切口豬的皮膚(A)、肌肉(B)及背根神經節(C)中，切割的SNAP-25的免疫組織化學染色。 圖 22顯示左腿手術切口(A)及放大視圖(B)的豬脊髓中，腰椎L5-L6同側背角中經切割的SNAP-25染色。 圖 23顯示用於確定經切割的SNAP-25染色強度的分級量表。切割的SNAP-25染色以1-3級分級，0級=無切割的SNAP-25染色，1級=低強度切割的SNAP-25染色，2級=平均切割的SNAP-25強度染色及3級=高強度切割的SNAP-25染色(A)。圖23亦顯示脊髓不同區域的染色強度的量化：腰椎L5-L6、L3-L4、L1-L2及胸椎和頸椎區域。染色強度藉由「H分數」的方式測量並以陽性脊髓切片的% x 背角中的染色強度(B)來計算。 圖 24提供收集的組織樣本中切割的SNAP-25染色存在、「陽性」或不存在、「陰性」的摘要。

無。

Claims (29)

1. 一種於治療患者術後手術疼痛中使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前多於5日，對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係經由下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。
2. 一種用以治療患者術後手術疼痛之方法，該方法包含於手術之前多於5日，對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係經由下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。
3. 如請求項1之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係於手術之前6至50日被投予；較佳地於手術之前10至20日。
4. 如請求項1或3之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2或3之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係於手術之前14至16日被投予；較佳地於手術之前約15日。
5. 如請求項1、3或4中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至4中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予實質上減少患者的術後手術疼痛感知，且其中該減少的術後手術疼痛感知在緊接手術後被維持24小時。
6. 如請求項1或3至5中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至5中任一項之方法，其中實質上所有減少的術後手術疼痛感知在緊接手術後被維持3日，在緊接手術後被維持5日，在緊接手術後被維持7日，較佳地在緊接手術後被維持8日。
7. 如請求項5或6之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項5或6之方法，其中在緊接手術後於界定的時間點觀察到的該疼痛感知減少的水平為在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後任何時間觀察到的減少的疼痛感知之最大水平的至少50%，較佳地為在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後任何時間觀察到的減少的疼痛感知之最大水平的至少75%。
8. 一種於減少或抑制術後焦慮中使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素，該方法包含於手術之前對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係經由下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。
9. 一種用以減少或抑制術後焦慮之方法，該方法包含於手術之前對患者投予梭狀芽孢桿菌神經毒素，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係經由下列方式投予： i)皮內；或 ii)鞘內。
10. 如請求項8之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項9之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係於手術之前5日或以上被投予；較佳地其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素係於手術之前多於5日被投予。
11. 如請求項8或10之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項9或10之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素之投予實質上減少患者的術後焦慮感知，且其中該減少的術後焦慮感知在緊接手術後被維持24小時。
12. 如請求項11之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項11之方法，其中實質上所有減少的術後焦慮感知在緊接手術後被維持2日，在緊接手術後被維持5日，在緊接手術後被維持7日，較佳地在緊接手術後被維持9日。
13. 如請求項1、3至8、或10至12中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至12中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素治療術後手術疼痛並減少或抑制術後焦慮。
14. 如請求項1、3至8、或13中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或13中任一項之方法，其中該術後手術疼痛係由手術介入所引起，且其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素被投予在遠離手術介入位置的位置。
15. 如請求項14之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項14之方法，其中該遠離手術介入位置係距該手術介入位置至少15 cm、50 cm或100 cm。
16. 如請求項1、3至8、或10至15中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至15中任一項之方法，其中，在投予後，該梭狀芽孢桿菌神經毒素藉由逆向運輸移行至脊髓並影響該脊髓中的SNARE蛋白質切割(SNAP-25蛋白質切割)。
17. 如請求項1、3至8、或10至16中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至16中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素被投予在皮內部位，且其中在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，在該皮內部位處或附近觀察到由該梭狀芽孢桿菌神經毒素引起的極少或沒有SNARE蛋白質切割(SNAP-25蛋白質切割)。
18. 如請求項1、3至8、或10至16中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至16中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素被投予在脊髓的鞘內空間中的部位，且其中在投予梭狀芽孢桿菌神經毒素後，在該部位處或附近觀察到由該梭狀芽孢桿菌神經毒素引起的極少或沒有SNARE蛋白質切割(SNAP-25蛋白質切割)。
19. 如請求項1、3至8、或10至18中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至18中任一項之方法，其中該手術介入包含對皮膚及/或筋膜及/或肌肉的切開，較佳地其中該手術介入包含對皮膚的切開。
20. 如請求項1、3至8、或10至19中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至19中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)。
21. 如請求項1、3至8、或10至20中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至20中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素為肉毒桿菌神經毒素血清型A(BoNT/A)。
22. 如請求項1、3至8、或10至21中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至21中任一項之方法，其中該術後手術疼痛為急性術後手術疼痛。
23. 如請求項1、3至8、或10至22中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至22中任一項之方法，其中該術後手術疼痛為慢性術後手術疼痛。
24. 如請求項1、3至8、或10至23中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至23中任一項之方法，其中該使用或該方法不包括梭狀芽孢桿菌神經毒素之肌肉內投予。
25. 如請求項1、3至8、或10至24中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至24中任一項之方法，其中該患者被投予100-500 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素；較佳地其中該患者被投予200 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素。
26. 如請求項1、3至8、或10至25中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至25中任一項之方法，其中該患者被投予總劑量1-3 ng之梭狀芽孢桿菌神經毒素。
27. 如請求項1、3至8、或10至26中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至26中任一項之方法，其中該患者被投予每kg(體重)80-250 pg之梭狀芽孢桿菌神經毒素。
28. 如請求項1、3至8、或10至27中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至27中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素被投予在多於1個投予部位；較佳地其中該患者被投予每個投予部位2.5-30 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素；更佳地其中該患者被投予每個投予部位20 U之梭狀芽孢桿菌神經毒素。
29. 如請求項1、3至8、或10至28中任一項之使用的梭狀芽孢桿菌神經毒素或如請求項2至7或9至28中任一項之方法，其中該梭狀芽孢桿菌神經毒素被投予在多於1個投予部位；較佳地其中該患者被投予每個投予部位10-170 pg之梭狀芽孢桿菌神經毒素；更佳地每個投予部位1-14 pg/kg體重。

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