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TW202142129A - 腸內細菌叢改善用組成物 - Google Patents

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TW202142129A
TW202142129A TW110112459A TW110112459A TW202142129A TW 202142129 A TW202142129 A TW 202142129A TW 110112459 A TW110112459 A TW 110112459A TW 110112459 A TW110112459 A TW 110112459A TW 202142129 A TW202142129 A TW 202142129A
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lactobacillus mucosae
bacteria
increase
bifidobacteria
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TW110112459A
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加田茂樹
塚原拓也
木村彰
小川七菜
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日商雪印惠乳業股份有限公司
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Abstract

本發明之課題在於提供一種包含具有腸內細菌叢改善機能的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)來作為有效成分之食品組成物。此外，本發明之另一課題在於提供一種以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑。本發明提供一種以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分的腸內細菌叢改善用組成物。此外，本發明之其他態樣提供一種以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑。

Description

腸內細菌叢改善用組成物
本發明是關於包含以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之腸內細菌改善用食品組成物以及對適用於改善腸內細菌叢之食品組成物進行評價的方法。 此外，本發明是關於以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及增加促進用飲食品。再者，本發明是關於以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之雙叉桿菌增值促進劑及增殖促進用飲食品。
人類的腸內棲息著多達1000種，40兆個細菌，形成複雜的共生關係(腸內細菌叢)。隨著體學分析(Omics analysis)的發展，加上健康狀態、年齡增加、飲食、生活習慣會影響腸內細菌叢，已明確地發現腸內細菌叢平衡(腸內細菌的多樣性)之混亂與疾病的發生或惡化息息相關。肥胖及糖尿病患者中腸內細菌的多樣性減少，或是藉由攝取食物纖維類使得腸內細菌的多樣性增加，相關的臨床症狀獲得改善等已獲得實證。
此外，許多報告指出，作為腸內細菌的主要代謝產物之短鏈脂肪酸，有著各式各樣的健康機能效果，且亦被指出與腸內細菌的多樣性有所相關。短鏈脂肪酸是指以乙酸、丙酸、丁酸為代表之碳數為6以下的脂肪酸。這些短鏈脂肪酸，不僅能藉由使腸內的pH值呈酸性來抑制病原微生物的生長，亦使腸道上皮細胞活化，與宿主的生物性防禦或免疫系統的控制有著複雜相關。此外，亦有藉由會產生促進腸道蠕動運動代謝產物之腸內細菌，或是與維持腸道黏膜恆常性有關之腸內細菌等來加以利用之報告。作為使構成腸內細菌叢的腸內細菌之多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加的方法，可舉出攝取促進腸內細菌的生長或代謝產物產生之食品用組成物(益生質，prebiotics)，或是直接攝取包含乳酸菌或雙叉桿菌之食品用組成物(益生菌，probiotics)來作為主要方法。
由多種多樣的腸內細菌所構成之人類腸內細菌叢，與以乳酸桿菌屬為腸內優勢細菌之小鼠等模型動物有著極大的差異。此外，已知即使在人類中，個體之間的腸內細菌叢亦會有著極大差異，加上相較於外國人的腸內細菌叢，日本人的腸內細菌叢具有特徵性(非專利文獻1)。將個體間、人種間的腸內細菌叢之差異加以標準化的模型評價系統並不存在，在這樣的現狀下，極難選出能使構成腸內細菌叢的腸內細菌之多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加之食品組成物。 在此，雖有多數個報告記載，藉由從腸內細菌叢抽出多數腸內細菌，以人工的方式再建構腸內細菌叢，來達成標準化之評價體外(in vitro)系統(非專利文獻2、非專利文獻3)，但並沒有報告記載有將日本人的腸內細菌叢以人工的方式再建構之物。此外，以選擇使構成腸內細菌叢的腸內細菌多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加之食品組成物為目的來建構之評價系統並不存在。
非專利文獻1中，根據日本人腸內細菌叢的總體基因體解析分析了其特徵，報告指出日本人的腸內細菌叢中50種優勢的腸內細菌，同時亦指出與11個國家的外國人試驗者之腸內細菌叢相比，日本人的腸內細菌叢中包含最豐富的是布勞特氏菌屬(Blautia)、雙叉桿菌屬、柯林斯菌屬(Collinsella)、鏈球菌屬(Streptococcus)。此外，上述的50種優勢腸內細菌，並不包含變形菌門(proteobacteria)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，可清楚得知該等腸內細菌於日本人的腸內並非優勢的腸內細菌。再者，由非專利文獻1中所收集的106人的總體基因體數據可清楚得知，日本人的腸內細菌叢分類學的比例，屬於厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)之腸內細菌，以菌種而言分別包含約57%、約24%、約19%。然而，並未實施關於這些日本人腸內細菌叢之優勢的腸內細菌之培養，對於培養可能的組合或其培養方法亦未加以討論。
關於抽出的菌種數，非專利文獻2中記載，是以被稱為ASF(Altered Schaedler Flora)之8種腸內細菌的組合來作為腸內細菌叢的最小單位模型。此外，非專利文獻3中記載，是將15種腸內細菌的組合作為具有歐洲人腸內細菌叢特徵之模型。然而，其中包含了日本人腸內細菌叢中之非優勢的腸內細菌，且亦未包含作為日本人腸內細菌叢之特徵之雙叉桿菌屬。
相較於乳酸菌或雙叉桿菌，腸內細菌具有高度的厭氧需求性，培養極為困難。因此，以配合各腸內細菌的特徵之培養基來進行培養是一般的做法。非專利文獻4中記載，可以將報告所指出的歐洲人腸內細菌叢中優勢的數種腸內細菌，以單一的培養基(GAM肉汁培養基，日本NISSUI股份有限公司)加以培養。然而如上所述，歐洲人與日本人之腸內優勢細菌有著極大的差異，無法期待將同樣的培養基作為單一培養基來使日本人的腸內優勢細菌安定地生長。此外，雖將每個菌種產生的短鏈脂肪酸加以比較，但仍僅是測定單一的腸內細菌產生之物，關於菌叢整體的短鏈脂肪酸產生量仍為不明。
專利文獻1中記載一種腸內細菌叢模擬培養方法或培養裝置，其能以幾乎維持腸內細菌叢的組成平衡的狀態來進行培養。此外，非專利文獻5是使用同樣的方法/裝置，以體外(in vitro)狀態來評價食物纖維類使腸內細菌叢中之短鏈脂肪酸增加的情況。專利文獻1、非專利文獻5的特徵在於皆使用糞便作為評價用培養物，但人類的腸內細菌叢在個體間有著極大的差異，使用由人體而來的糞便時，會受到提供糞便的個體間之腸內細菌叢差異而帶來的影響。因此，使用糞便一事，在選擇會使構成腸內細菌叢之腸內細菌多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加之食品組成物時，會因而有所限制，故有建構不使用糞便之評價系統的需求出現。此外，會需要使用那樣的評價系統所選出的使構成腸內細菌叢之腸內細菌的多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加的食品組成物。
此外，有報告指出，上述腸內細菌叢中細菌種的平衡會隨著健康狀態或年齡增加而有所變化，腸內細菌中的雙叉桿菌或乳酸菌之比例減少。作為補充減少的雙叉桿菌或乳酸菌之方法，攝取包含該等菌種之發酵乳製品是其中一種解決方式。 作為發酵乳製品所使用的乳酸菌，其代表的種類可舉出屬於乳酸桿菌屬(Lactobacillus)之乳酸菌。做為常用的菌種，可舉出：保加利亞桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、洛德乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)等。另一方面，作為不常被利用之菌種，可舉出黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)。 專利文獻2中，舉出黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有助於改善乳糖不耐症之乳酸菌之一。該專利文獻中的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，其特徵在於具有高度腸道附著性及乳糖分解能力，但文中並未揭示關於對人類大腸中之雙叉桿菌比例所賦予之作用，或是對試管內雙叉桿菌增殖所賦予之作用。 此外，由於乳糖會促進雙叉桿菌之增殖，攝取乳糖分解能力高的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，被認為可能會使人類大腸中之雙叉桿菌比例減少，或是可能會阻礙雙叉桿菌之增殖。 非專利文獻6及7中，是關於源自豬隻的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) M1，揭示了其對腸道附著性高，且抑制病原性細菌對腸道的附著。然而，不論何者，皆未揭示關於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) M1對雙叉桿菌之作用。 非專利文獻6中，是在試管內解析對腸道附著性之例子，但並未揭示於人體中之效果。非專利文獻7中，使用小鼠來解析抑制病原性細菌對腸道的附著，但並未揭示於人體中之效果。 如上所述，至今尚未揭示關於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之雙叉桿菌增殖促進作用，或是人類大腸中之雙叉桿菌比例之增加作用，且關於其方法亦為不明。 [先行技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第6482135號公報 [專利文獻2]國際公開WO2008/001676號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]DNA Res. 2016 Apr；23(2)：125-33.[非專利文獻2]Appl Environ Microbiol. 1999 Aug；65(8)：3287-92.[非專利文獻3]Sci Transl Med. 2011 Oct 26；3(106)：106ra106.[非專利文獻4]Biosci Biotechnol Biochem. 2017 Oct；81(10)：2009-2017.[非專利文獻5]Sci Rep. 2018 Jan 11；8(1)：435.[非專利文獻6]J. Appl Microbiol. 2014年117號2卷485-497頁 [非專利文獻7]Micro寄存Pathog. 2019年137號103760
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種包含黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之食品組成物及飲食品，而該黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)具有腸內細菌叢改善機能，意即短鏈脂肪酸增加機能及/或多樣性增加機能。此外，本發明之課題在於：建構具有日本人腸內細菌叢特徵之新式腸內細菌叢模型；再者，提供一種使用該模型之新式模型評價系統，其能對腸內細菌叢改善機能，意即短鏈脂肪酸增加機能及/或多樣性增加機能進行評價；以及提供一種使用該評價系統之食品組成物的篩選方法。此外，更進一步，本發明之課題在於提供一種具有腸內細菌叢改善機能，意即，具有短鏈脂肪酸增加機能及/或多樣性增加機能之飲食品，而該飲食品是使用以上述新式評價方法或篩選方法所獲得的食品組成物。
此外，本發明的其他課題在於提供一種新式益生菌。特別是提供一種以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及增加用飲食品。此外，本發明提供一種以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之雙叉桿菌增殖促進劑及增殖促進用飲食品。 [解決問題之方式]
本發明是為了解決上述課題之研究，將日本人腸內細菌叢中之多數種優勢的腸內細菌抽出，以人工的方式再建構日本人的腸內細菌叢。此時，是以維持腸內分類學的比例，以及包含與外國人相比顯示出高存在比之腸內細菌，來作為日本人腸內細菌叢之特徵進行抽出。然後，將抽出的腸內細菌混合物作為評價用培養物，將其與已有報告指出經攝取可使人類腸內的短鏈脂肪酸增加之難消化性食物纖維類共同培養時，已確認到短鏈脂肪酸的增加且再現性良好。由此可知，本發明作為將個體間腸內細菌叢的差異標準化之日本人腸內細菌叢的模型評價系統，已實證為有效，此外，本發明人發現該模型評價系統亦能利用在日本人腸內細菌叢中之短鏈脂肪酸增加之評價上。同樣地，本發明人發現本模型評價系統亦能活用在構成腸內細菌叢之腸內細菌的多樣性增加之評價上。 再者，本發明使用上述日本人腸內細菌叢中之模型評價系統，選拔出各種乳酸菌及雙叉桿菌，來作為具有短鏈脂肪酸增加機能、多樣性增加機能之食品用組成物，其結果確認黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)具有該機能。關於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之短鏈脂肪酸增加促進作用、或多樣性增加促進作用，以往並未為人所知，現已明確地能用於日本人的腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加促進用途、多樣性增加促進用途。
意即，本發明具有下述之架構。 ＜1＞ 一種腸內細菌叢改善用組成物，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。 ＜2＞ 一種腸內細菌叢改善用飲食品，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。 ＜3＞ 一種短鏈脂肪酸增加促進用組成物，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。 ＜4＞ 一種短鏈脂肪酸增加促進用飲食品，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。 ＜5＞ 一種腸內細菌多樣性增加促進用組成物，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。 ＜6＞ 一種腸內細菌多樣性增加促進用飲食品，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。 ＜7＞ 一種人類腸內細菌叢模型，其是用來評價對象食品組成物之人體腸內之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用； 該人類腸內細菌叢模型是以不包含屬於變形菌門(proteobacteria)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)之細菌，而包含屬於雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)之細菌，且包含至少9菌種以上的細菌評價用菌體培養物所構成。 ＜8＞ 如＜7＞所述之人類腸內細菌叢模型，其中，該9菌種以上的細菌是屬於厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、或擬桿菌門(Bacteroidetes)之細菌，且包含屬於布勞特氏菌屬(Blautia)、柯林斯菌屬(Collinsella)、或鏈球菌屬(Streptococcus)之細菌。 ＜9＞ 如＜8＞所述之人類腸內細菌叢模型，其中，包含屬於厚壁菌門之細菌以菌種數而言佔56～59%，屬於放線菌門之細菌以菌種數而言佔21～24%，屬於擬桿菌門之細菌以菌種數而言佔17～22%。 ＜10＞ 如＜7＞～＜9＞中任一項所述之人類腸內細菌叢模型，其中，該至少9菌種以上的細菌，是選自由Blautia wexlerae、龍根菌(Bifidobacterium longum)、偽鏈狀雙叉桿菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、青春雙叉桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、產氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)、Dorea longicatena、普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)、瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、迪氏副擬桿菌(Parabacteroides distasonis)、長鏈多爾氏菌(Dorea formicigenerans)、卵瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)、扭鏈瘤胃球菌(Ruminococcus torques)、Bacteroides dorei、Flavonifractor plautii、屎副擬桿菌(Parabacteroides merdae)、食葡糖羅斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、系結梭菌(Clostridium nexile)、涎鏈球菌(Streptococcus salivarius)、緩慢愛格士氏菌(Eggerthella lenta)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium bolteae)、Roseburia intestinalis、陪伴糞球菌(Coprococcus comes)、卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)、霍氏真桿菌(Eubacterium hallii)、人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、及多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)構成之群組。 ＜11＞ 如＜7＞～＜10＞中任一項所述之人類腸內細菌叢模型，其中，該至少9菌種以上的細菌是Blautia wexlerae、龍根菌、偽鏈狀雙叉桿菌、直腸真桿菌、青春雙叉桿菌、產氣柯林斯菌、單形擬桿菌、Dorea longicatena、普通擬桿菌、瘤胃球菌、普拉梭菌、Blautia obeum、Bacteroides dorei、Flavonifractor plautii、涎鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、及陪伴糞球菌。 ＜12＞ 一種人類腸內細菌叢模型之培養方法，其是用來評價對象食品組成物在人類腸內之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用，且該培養方法包含以下步驟： (1)將不包含屬於變形菌門、乳酸桿菌屬之細菌，包含屬於雙叉桿菌屬之細菌之至少9菌種以上之細菌添加於改質GAM肉汁培養基之步驟； (2)於厭氧的條件下進行培養之步驟。 ＜13＞ 一種用來評價對象食品組成物在人類腸內之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用之方法，且該評價方法包含以下步驟： (1)將作為評價對象的食品組成物添加於＜7＞～＜11＞中任一項所述之人類腸內細菌叢模型中並加以培養之步驟； (2)測定由(1)所獲得的培養物之短鏈脂肪酸產生量及/或計算出多樣性指數之步驟； (3)將(2)的測定值及/或計算值和無添加該食品組成物時比較，其相對值為1.0倍以上的情況下，則評價具有短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用之步驟。 ＜14＞ 一種腸內細菌叢改善用飲食品之製造方法，其是使用＜13＞所述之評價方法中，被評價具有短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用之食品組成物，來製造食品之方法。 ＜15＞ 一種屬於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌株，其是選自由SBT10028株(NITE BP-03275)、SBT10217株(NITE P-03276)、SBT10027株(NITE P-03274)、SBT10038株(NITE P-03283)、SBT2261株(NITE P-03272)、SBT2027株(NITE P-03271)、SBT2271株(NITE P-03273)、SBT2025(NITE P-03189)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT10043(NITE BP-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之菌株。
此外，本發明的其他態樣，是用來解決上述其他課題之發明，首次發現黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)具有雙叉桿菌增殖促進作用，並確認其可作為雙叉桿菌增殖促進劑及增殖促進用飲食品的用途，以及適用於人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及增加用飲食品，作為新式益生菌而完成了本發明。
意即，本發明進一步具有下述之架構。 ＜16＞ 一種人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。 ＜17＞ 一種雙叉桿菌增殖促進劑，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。 ＜18＞ 如＜16＞或＜17＞所述之製劑，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)係在與雙叉桿菌培養時，相較於無添加之情況下，具有1.1倍以上之增殖活性的菌株。 ＜19＞ 如＜16＞～＜18＞中任一項所述之製劑，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 是選自由SBT2025(NITE P-03189)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT10043(NITE P-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之1種以上的乳酸菌株。 ＜20＞ 一種人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用飲食品，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。 ＜21＞ 一種雙叉桿菌增殖促進用飲食品，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。 ＜22＞ 如＜20＞或＜21＞所述之飲食品，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)係在與雙叉桿菌培養時，相較於無添加之情況下，具有1.1倍以上之增殖活性的菌株。 ＜23＞ 如＜20＞～＜22＞中任一項所述之飲食品，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 是選自由SBT2025(NITE P-03189)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT10043(NITE P-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之1種以上的乳酸菌株。 ＜24＞ 一種發酵乳製品之製造方法，其包含在主成分為乳品的培養基中培養黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之步驟，且該製造方法的特徵在於，是使用具有下述性質之菌株作為黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)：在與雙叉桿菌培養時，相較於無添加之情況下，具有1.1倍以上的增殖活性為特徵之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)。 ＜25＞ 如＜24＞所述之製造方法，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)是選自由SBT2025(NITE P-03189)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT10043(NITE P-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之1種以上的乳酸菌株。 ＜26＞ 一種腸內細菌叢改善方法，其包含將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體或菌體培養物投予至對象之步驟。 ＜27＞ 一種短鏈脂肪酸增加促進方法，其包含將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體或菌體培養物投予至對象之步驟。 ＜28＞ 一種腸內細菌之多樣性增加方法，其包含將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體或菌體培養物投予至對象之步驟。 ＜29＞ 一種人類腸內之雙叉桿菌比例之增加方法，其包含將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體或菌體培養物投予至對象之步驟。 ＜30＞ 一種雙叉桿菌增殖促進方法，其包含將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體或菌體培養物投予至對象之步驟。 [發明之效果]
本發明之日本人腸內細菌叢的模型評價系統，作為日本人的腸內細菌叢之特徵，是藉由於日本人腸內優勢存在的腸內細菌所構成，維持構成日本人腸內細菌叢之腸內細菌分類學的比例，並且包含與外國人相比顯示出高存在比之腸內細菌，因此，藉由利用本模型評價系統，能夠評價各式各樣食品組成物之腸內環境改善機能。 此外，根據本發明，可在未使用人類或動物，且不使用活體試驗材料的人類糞便之條件下，選拔出改善腸內細菌叢之食品組成物。 進而，藉由攝取以本發明所發現之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分的腸內細菌叢改善用組成物，可期待使構成腸內細菌叢之腸內細菌多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加，並且能期待隨之而來的代謝疾病及肥胖等症狀的改善。
此外，本發明的其他態樣，是提供包含具有雙叉桿菌增殖促進活性的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分之發酵乳製品。然後，藉由攝取該黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之發酵乳製品等，能使人類腸內之雙叉桿菌比例之增加。因此，根據本發明可提供一種新式益生菌。
(黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)) 本發明之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，是指屬於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之細菌。意即，是指與黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之標準培養菌株JCM12515，在16S核醣體RNA基因之鹼基序列的相同性為97%以上，更佳為98%以上，進而更佳為99%以上之菌株。作為分離來源，任何來源皆可，較佳是源自人類。 作為本發明之腸內細菌叢改善用組成物或飲食品有效成分之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌株，只要是能使構成腸內細菌叢之腸內細菌多樣性或腸內細菌叢中之短鏈脂肪酸增加之菌株即可，例如可舉出於下述實施例中展現活性之SBT10028、SBT10043、SBT10217、SBT10027、SBT10038、SBT2261、SBT2027、SBT2271等。 此外，作為本發明之其他態樣也就是人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑或雙叉桿菌增殖促進劑中之之有效成分黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌株，只要是具有雙叉桿菌增殖促進活性的菌株即可，例如可舉出於下述實施例中展現活性之SBT2025、SBT2268、SBT2269、SBT2867、SBT10043、SBT10228等。
本說明書中，作為人類腸內細菌叢中腸內細菌叢改善用組成物、短鏈脂肪酸增加促進用組成物或多樣性增加促進用組成物，以及腸內細菌叢改善用飲食品、短鏈脂肪酸增加促進用飲食品與多樣性增加促進飲食品之有效成分的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，只要為具有人類腸內之短鏈脂肪酸增加促進活性或多樣性增加促進活性之狀態即可。 此外，本說明書中，作為雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑之有效成分的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，只要為具有使雙叉桿菌比例之增加、或是增值促進雙叉桿菌之活性的狀態即可。 該等並不限於純粹地分離成菌體之物，亦可為菌體培養物、菌體懸浮物、其他菌體含有物。菌體可為生菌體，亦可為死菌體，其中以生菌體為佳。 作為生菌體，可舉出將菌體進行培養集菌之菌體濃縮物、或是菌體的乾燥物、冷凍乾燥物，作為菌體培養物，除了菌體培養液的濃縮物、乾燥物、冷凍乾燥物之外，可舉出如黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之發酵乳製品等。作為發酵乳製品，可舉例如乳酪、發酵乳、乳製品、乳酸菌飲料等乳製品，並無特別限制。 以離心分離等集菌的方法，從所獲得的培養物分離而得的菌體，能以那樣的狀態直接作為本發明之有效成分來使用。 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，可依照一般的方法來培養。關於培養基則可使用乳培養基、包含乳成分之培養基、不包含乳成分之半合成培養基等各式各樣的培養基。作為這樣的培養基，可舉例如還原脫脂乳培養基等。
(發酵乳製品) 本說明書中，發酵乳製品，是指在乳品或包含與乳品同等以上的無脂肪乳固體成分之液體或糊狀體中，將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)進行培養之物。乳品可為生乳、牛乳、生山羊乳、生綿羊乳等，亦可將脫脂奶粉以水還原來加以使用。關於使用脫脂奶粉時之濃度，只要是無脂肪乳固體成分是與乳品同等以上的條件下且可培養黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的濃度，則該濃度並無限制，理想上可為8%(w/w)以上，較佳是9%(w/w)以上，更佳是10%(w/w)以上。
(脫脂奶粉以外的成分) 上述發酵乳製品，亦可包含脫脂奶粉以外的營養素，添加酵母萃取物的情況下，理想為0.1%(w/w)以上，較佳是0.2%(w/w)以上，更佳是0.5%(w/w)以上。作為其他的營養素，可舉例如糖類、胺基酸、礦物質、維生素等。本發明之發酵乳製品中，亦可含有黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)以外的細菌。例如可包含作為發酵乳之發酵菌種而被廣泛使用的乳酸菌，像是保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii. subsp. Bulgaricus)及嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。 此外，作為雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑之有效成分的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，亦能與雙叉桿菌混合培養，作為與增殖被促進的雙叉桿菌之混合培養物(例如，發酵乳製品)來提供。
(發酵乳製品之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)生菌數) 關於發酵乳製品之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，理想是以生菌的形式被包含。本說明書中，生菌是指於將營養素包含於洋菜等支持體的固體培養基上形成菌落(colony forming)，生菌數是以菌落形成單位cfu(colony forming unit)來標示。作為測定黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)生菌數之固體培養基，可舉出如乳酸菌用培養基之MRS洋菜培養基、乳酸桿菌用培養基之LBS洋菜培養基等。發酵乳製品中的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)生菌數，較佳是1.0E+06 cfu/mL以上，更佳是1.0E+07 cfu/mL以上，最佳是1.0E+08 cfu/mL以上。
(短鏈脂肪酸增加促進作用) 本說明書中，「短鏈脂肪酸增加促進」，是指促進人類腸內之短鏈脂肪酸的增加。短鏈脂肪酸增加促進活性，是指在具有日本人腸內細菌叢特徵之腸內細菌叢模型中，添加食品用組成物的情況下與未添加的情況下，添加的情況下，短鏈脂肪酸的增加較大時，則稱為具有該活性。例如，下述之腸內細菌叢模型中，在未添加乳酸菌或雙叉桿菌等細菌、難消化性的食物纖維類下進行培養，將所獲得的短鏈脂肪酸濃度設為1.0倍時，在添加乳酸菌或雙叉桿菌等細菌、難消化性的食物纖維類下所獲得的短鏈脂肪酸濃度大於1.0倍時，則稱為具有該活性。具有該活性之食品組成物在本發明中是稱為短鏈脂肪酸增加促進用組成物。作為本發明之短鏈脂肪酸增加促進用組成物有效成分之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，在未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)進行培養下，將所獲得的短鏈脂肪酸濃度設為1.0倍時，在添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)下，所獲得的短鏈脂肪酸濃度，較佳是顯示1.1倍以上之菌株，更佳是1.5倍以上之菌株，進而更佳是2.0倍以上之菌株。下述的實施例中，已確認不管是何種菌株之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，相較於無添加的情況下，有添加時，丁酸與總短鏈脂肪酸兩者皆變得大於1.0倍。
在此，作為短鏈脂肪酸，可舉出例如乙酸、丁酸、丙酸，或是將該等酸合計之總短鏈脂肪酸，其中，較佳是將會直接地表現出腸內環境變化之丁酸作為評價對象。已知相較於乙酸、丙酸，丁酸對腸道上皮細胞的增殖活性為高，並且有報告指出各式各樣的疾病會使丁酸於腸內細菌叢中減少，或是產生丁酸的腸內細菌減少。報告指出潰瘍性大腸炎等發炎性腸病病患，其產生丁酸之腸內細菌，像是具代表性的普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)，會隨著症狀的惡化/好轉而有所減少/增加。
(多樣性增加促進作用) 本說明書中，「多樣性增加促進」，是指促進人類腸內細菌叢的多樣性增加。作為表示構成腸內細菌叢之腸內細菌多樣性的指數，經常使用表示菌種均等度之香農指數(Shannon index)，或是考慮到系統學數據之系統演化多樣性指數(Phylogenic diversity index)等。
多樣性增加促進活性，是指在具有日本人腸內細菌叢特徵之腸內細菌叢模型中，添加食品用組成物的情況下與未添加的情況下，添加的情況下，表示腸內細菌叢之多樣性的指數較大時，則稱為具有該活性。例如，下述之腸內細菌叢模型中，在未添加乳酸菌或雙叉桿菌等細菌、難消化性的食物纖維類下進行培養，將所獲得的表示多樣性之指數設為1.0倍時，在添加乳酸菌或雙叉桿菌等細菌、難消化性的食物纖維類下，所獲得的表示多樣性之指數大於1.0倍時，則稱為具有該活性。具有該活性之食品組成物在本發明中是稱為多樣性增加促進用組成物。作為本發明之多樣性增加促進用組成物有效成分之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，在未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)進行培養下，將所獲得的表示多樣性之指數設為1.0倍時，在添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)下所獲得的表示多樣性之指數，較佳是顯示1.1倍以上之菌株，更佳是1.2倍以上之菌株，進而更佳是1.3倍以上之菌株。 本發明中，不論是具有上述之短鏈脂肪酸增加促進活性或多樣性增加促進活性之中任一方，或是兩方的活性兼具，皆可稱為具有腸內細菌叢改善活性。因此，短鏈脂肪酸增加促進用組成物、多樣性增加促進用組成物，亦為腸內細菌叢改善用組成物。此外，相同地，短鏈脂肪酸增加促進用飲食品、多樣性增加促進用飲食品，亦為腸內細菌叢改善用飲食品。
(人類腸內細菌叢改善用組成物、短鏈脂肪酸增加促進用組成物及多樣性增加促進用組成物) 作為本發明之人類腸內之腸內細菌叢改善用組成物、短鏈脂肪酸增加促進用組成物及多樣性增加促進用組成物之有效成分，如上所述，可利用黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的發酵培養物本身，或是黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體本身。作為發酵培養物，較佳可舉出上述之發酵乳製品。 該腸內細菌叢改善用組成物、短鏈脂肪酸增加促進用組成物及多樣性增加促進用組成物，亦可進一步製劑化來利用。於製劑化時可適當地混合製劑上許可之賦形劑、安定劑、矯味劑等來加以製劑化。作為劑形，可為錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑、糖漿劑等。醫藥製劑、膳食增補劑等則符合製劑化利用的條件。將該等之物藉由經口攝取，透過人類腸內細菌叢中之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用，可期待腸內細菌叢的改善。
(人類腸內腸內細菌叢改善用飲食品、短鏈脂肪酸增加促進用飲食品及多樣性增加促進用飲食品) 作為本發明之人類腸內之腸內細菌叢改善用飲食品、短鏈脂肪酸增加促進用飲食品及多樣性增加促進用飲食品之有效成分，可利用黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的發酵培養物本身，或是黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體本身。作為以食品來利用的發酵培養物，較佳可舉出上述之發酵乳製品等。 此外，該腸內細菌叢改善用飲食品、短鏈脂肪酸增加促進用飲食品及多樣性增加促進用飲食品，是可利用將上述腸內細菌叢改善用組成物、上述短鏈脂肪酸增加促進用組成物及多樣性增加促進用組成物摻合於適當的飲食品內之物。該等之物的摻合，可在飲食品的製造步驟中添加於原料內，亦可使其與材料摻合，亦可摻合於最終製品之飲食品內。 作為飲食品之例子，可舉出：乳酪、發酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、奶油、人造奶油等乳製品；乳飲料、果汁飲料、清涼飲料等飲料；果凍、糖果、布丁、美乃滋等蛋類加工品；奶油蛋糕等點心/麵包類；進而，各種奶粉，除此之外，嬰幼兒食品、營養組成物等；並無特別限定。 此外，本發明之腸內細菌叢改善用飲食品、短鏈脂肪酸增加促進用飲食品及多樣性增加促進用飲食品，亦可作為機能性表示食品、特定保健用食品、營養機能食品、美容用食品來使用。 藉由以飲食品來攝取該等之物，透過人類腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用，可期待腸內細菌叢的改善。
摻合黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體及/或培養物來製造人類腸內之腸內細菌叢改善用組成物、短鏈脂肪酸增加促進用組成物及多樣性增加促進用組成物、人類腸內之腸內細菌叢改善用飲食品、短鏈脂肪酸增加促進用飲食品及多樣性增加促進用飲食品時，摻合比例並無特別限制，配合製造的簡易性或理想的一日投予量來適當地調節即可。可考慮投予對象者的症狀、年齡等來個別地決定，但一般成人的情況下，調整摻合量等使其能攝取黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體培養物10～200g，或是菌體本身0.1～100mg即可。
(腸內細菌叢模型) 本發明之腸內細菌叢模型，是將日本人的平均腸內細菌叢加以模型化之菌體混合培養物，該菌體混合培養物之特徵在於不包含屬於變形菌門、乳酸桿菌屬之細菌，而包含屬於雙叉桿菌屬之細菌，包含至少9菌種以上的細菌。此外，作為日本人的平均腸內細菌叢所包含的細菌，是由屬於厚壁菌門、放線菌門、或擬桿菌門之細菌所構成，進而，作為特徵，理想是包含屬於布勞特氏菌屬、柯林斯菌屬、或鏈球菌屬之細菌。屬於厚壁菌門、放線菌門、或擬桿菌門之腸內細菌，其個別的菌種數構成比，理想是包含56～59%、21～24%、17～22%之組合。更理想是個別為約57%、約24%、約19%。 此外，屬於厚壁菌門、放線菌門、或擬桿菌門之腸內細菌，其個別為包含56～59%、21～24%、17～22%之組合的同時，更理想是包含布勞特氏菌屬、柯林斯菌屬、或鏈球菌屬。 本說明書中，菌種是指細菌之「種」的意思。意即，將細菌的系統分類學的分類以大至小的順序來稱呼是「門」、「屬」、「種」、「株」，是指其中的「種」之意。
作為上述至少9菌種以上的細菌，只要是選自下述之中任9菌種以上即可：Blautia wexlerae、龍根菌、偽鏈狀雙叉桿菌、直腸真桿菌、青春雙叉桿菌、產氣柯林斯菌、單形擬桿菌、Dorea longicatena、普通擬桿菌、瘤胃球菌、普拉梭菌、迪氏副擬桿菌、長鏈多爾氏菌、卵瘤胃球菌、扭鏈瘤胃球菌、Bacteroides dorei、Flavonifractor plautii、屎副擬桿菌、食葡糖羅斯拜瑞氏菌、系結梭菌、涎鏈球菌、緩慢愛格士氏菌、梭狀芽孢桿菌、Roseburia intestinalis、陪伴糞球菌、卵形擬桿菌、霍氏真桿菌、人羅斯拜瑞氏菌、及多形擬桿菌(以上29菌種)；更佳是選自下述之中任9菌種以上即可：Blautia wexlerae、龍根菌、偽鏈狀雙叉桿菌、直腸真桿菌、青春雙叉桿菌、產氣柯林斯菌、單形擬桿菌、Dorea longicatena、普通擬桿菌、瘤胃球菌、普拉梭菌、Blautia obeum、Bacteroides dorei、Flavonifractor plautii、涎鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、及陪伴糞球菌(以上17菌種)；進而更佳是包含該等17菌種之混合培養物，最佳是由該等17菌種而成之混合培養物。 關於細菌，是由日本人腸內細菌叢中優勢存在的50種腸內細菌中，從日本國內分讓機構的JCM(日本國立研究開發法人理化學研究所生物資源研究中心)取得可獲得的29菌種，進行培養，並由藉此確認已增殖的菌株，抽出多數種腸內細菌並加以組合，使其具有日本人腸內細菌叢之特徵。
(培養方法) 腸內細菌叢模型之菌體混合物的培養，只要是能使構成其之多數腸內細菌，在單一條件下生長之條件即可，作為培養基，可舉出YCFA培養基(JCM培養基編號1130)、或EG培養基(JCM培養基編號14)，亦可舉出調製上更簡便的GAM肉汁培養基、改質GAM肉汁培養基。其中又以改質GAM肉汁培養基為佳。培養溫度，可舉出如人類體溫附近之溫度36～38°C，較佳是37°C。已知大腸會因為部位(橫結腸、遠端大腸、直腸)，而有不同的pH值，會由於短鏈脂肪酸的產生，或是短鏈脂肪酸被宿主吸收，而使pH值有所變化。因此，培養前的培養基之pH值以6以上為佳，其中又以7以上為佳，7.2左右為更佳。大腸為無氧狀態，在此生長的腸內細菌為絕對厭氧性。因此，必須以氮氣來將培養基中及培養基氣層中維持成無氧狀態。此外，由於在腸內亦存在腸內細菌產生的二氧化碳或氫氣，較佳是將該等氣體包含在內。作為比例，可舉出例如氮氣80～90%、二氧化碳5～10%、氫氣5～10%。培養時間，理想是持續進行至培養基pH值變得穩定為止，較佳是16～32小時，更佳是16小時。 構成菌體混合物之各種腸內細菌，相對於100mL的培養基，是以使其成為1.0E+0.7至1.0E+0.8 cfu/mL的程度來添加。菌體混合物整體中各種腸內細菌之菌數構成比，可將添加的細菌數以全部的菌種來整合計算出。
(短鏈脂肪酸增加促進作用之評價方法) 本發明之短鏈脂肪酸增加促進作用的評價方法，是於作為腸內細菌叢模型的菌體混合物中，添加評價對象物並藉由上述培養方法進行培養，經過一定的時間後測定短鏈脂肪酸量，可藉由與無添加的情況下相比來進行評價。測定是可藉由例如將培養的上清液交給高效液相層析儀(HPLC)等來進行。
(多樣性增加促進作用之評價方法) 本發明之多樣性增加促進作用的評價方法，是於作為腸內細菌叢模型的菌體混合物中，添加評價對象物並藉由上述培養方法進行培養，經過一定的時間後測定表示多樣性的指數，可藉由與無添加的情況下相比來進行評價。測定是藉由使用次世代定序儀與分析流程，由抽取自培養物上清液的基因組DNA，算出表示多樣性之指數(多樣性數值化)的方式來進行。
(篩選方法) 本發明之篩選方法，是於作為腸內細菌叢模型之細菌混合物中，添加篩選對象物並藉由上述培養方法進行培養，經過一定時間後，可選出具有短鏈脂肪酸增加促進作用或多樣性增加促進作用之物。 作為使構成腸內細菌叢之腸內細菌多樣性或腸內細菌叢之短鏈脂肪酸增加的方法，可考慮攝取促進構成腸內細菌叢之腸內細菌運作且使短鏈脂肪酸或多樣性增加之乳酸菌或雙叉桿菌的方法。例如，攝取包含該等菌種之發酵乳製品。作為發酵乳製品所使用的乳酸菌，其代表的種類可舉出屬於乳酸桿菌屬之乳酸菌。作為常用的菌種，可舉出保加利亞桿菌、加氏乳桿菌、洛德乳桿菌、瑞士乳桿菌等。另一方面，作為不常被利用之菌種，可舉出黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)。於歐洲食品安全機關(EFSA)之安全性適格推定(qualified presumption of safety，QPS)中，被記載為無安全性疑慮之菌種，亦作為具有抑制病原性細菌定殖之效果或是降低膽固醇之效果的益生菌株而備受注目。藉由本發明之篩選方法，在篩選出乳酸桿菌屬的各菌種之乳酸菌時，首次發現黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)具有短鏈脂肪酸增加促進作用及多樣性增加促進作用。 作為本篩選對象物，並不限於乳酸菌或雙叉桿菌等細菌，周知的食品組成物亦可作為篩選對象。此外，下述實施例中，將已知能使短鏈脂肪酸增加之難消化性食物纖維類α-環狀糊精(α-CD，α-cyclodextrins)，以本評價方法評價(screening)時，已確認其能使短鏈脂肪酸及多樣性增加。
(腸內細菌叢改善用飲食品之製造方法) 本發明之腸內細菌叢改善用飲食品的製造方法，是使用在上述評價方法或篩選方法中被評價具有短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用之食品組成物來製造食品之方法。可藉由將本發明之食品組成物摻合於飲食品中來製造飲食品。該等之物的摻合，可在飲食品的製造步驟中添加於原料內，亦可使其與材料摻合，亦可摻合於最終製品之飲食品內來製造。此外，當本發明之食品組成物為乳酸菌或雙叉桿菌的情況下，可藉由發酵該等菌而獲得培養物來製造。
(雙叉桿菌) 本說明書中，「雙叉桿菌」是指屬於雙叉桿菌屬之菌。雙叉桿菌，只要是屬於雙叉桿菌屬之細菌，則無特別限定，可舉出如龍根菌、偽鏈狀雙叉桿菌、青春雙叉桿菌、比菲德氏菌(Bifidobacterium bifidum)、短雙叉桿菌(Bifidobacterium breve)、齒雙叉桿菌(Bifidobacterium dentium)等。其中，作為較佳之例可舉出龍根菌。此外，作為菌株，可提出龍根菌標準培養菌株JCM1217，或是龍根菌SBT2928株(寄存編號：FERM P-10657，寄存日：1989年4月13日，日本獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心)為例。
(雙叉桿菌之增殖促進) 本說明書中，「雙叉桿菌之增殖促進」，是指雙叉桿菌的生菌數增加。雙叉桿菌之增殖促進活性，是指在添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下與未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下，有添加的情況下，其雙叉桿菌的生菌數增加較大時，則稱為具有該活性。例如，於試管內在未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下培養雙叉桿菌，將所獲得的雙叉桿菌生菌數設為1.0倍，當在有添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下所獲得的雙叉桿菌生菌數大於1.0倍時，則稱為具有活性。具有該活性之製劑，在本發明中是稱為雙叉桿菌增殖促進劑。作為本發明雙叉桿菌增殖促進劑之有效成分的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，在未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下培養雙叉桿菌，並將所獲得的雙叉桿菌之生菌數設為1.0倍時，在有添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下，較佳是可使所獲得的雙叉桿菌生菌數呈現1.1倍以上之菌株，更佳是1.5倍以上，進而更佳是呈現2.0倍以上之菌株。
(雙叉桿菌之生菌數) 雙叉桿菌之生菌數，是指在雙叉桿菌可生長的厭氧性細菌用培養基之GAM培養基、雙叉桿菌用培養基之TOS丙酸洋菜培養基等中，所觀測到的菌落形成數。
(人體腸內之雙叉桿菌比例之增加) 本說明書中，「人體腸內之雙叉桿菌比例之增加」，是指人類腸內細菌群中之雙叉桿菌的比例之增加。例如，雙叉桿菌在腸內細菌中之比例，相較於攝取黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)前，攝取後的比例大於1.0倍時，則稱為具有活性。具有該活性之製劑在本發明中是稱為腸內之雙叉桿菌比例之增加劑。作為本發明腸內之雙叉桿菌比例之增加劑的有效成分黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，相較於攝取前，較佳是攝取後之比例呈現1.1倍以上之菌株，更佳是1.3倍以上，進而更佳是2.0倍以上，再進而更佳是呈現3.0倍以上之菌株。作為這種菌株之篩選方法，可舉出下述之篩選方法：首先，在模仿腸內環境之培養條件下，於試管內在未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下培養雙叉桿菌，將所獲得的雙叉桿菌生菌數設為1.0倍時，篩選出在有添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的情況下使所獲得的雙叉桿菌生菌數呈現1.1倍以上之菌株。
(雙叉桿菌之比例) 人類腸內之雙叉桿菌之比例，是指糞便中之DNA中的雙叉桿菌之比例。關於由糞便而得的DNA，是將16SrRNA基因藉由PCR增幅，可算出PCR產物整體所包含來自雙叉桿菌之DNA比例。關於比例之算出，可使用以次世代定序儀之16S增擴子定序分析法(16S rRNA gene amplicon sequencing analysis)，或是末端限制性片段長度多形性分析法(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)等菌叢分析手法。
(人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑) 本發明之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑，可利用黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的發酵培養物本身，或是其菌體本身。作為食品所利用的發酵培養物，可舉出上述之發酵乳製品。 此外，亦可進一步製劑化來利用。於製劑化時可適當地混合製劑上許可之賦形劑、安定劑、矯味劑等，並加以濃縮、冷凍乾燥，除此之外亦可進行加熱乾燥使其成為死菌體。亦含有該等的乾燥物、濃縮物、糊狀物。 此外，在不妨礙雙叉桿菌增殖促進活性的範圍內，亦可混合賦形劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、矯味矯臭劑、懸浮劑、被覆劑、其他的任意藥劑，來進行製劑。作為劑形，可為錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、粉劑、糖漿劑等，理想是口服投予該等之製劑。
(人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用飲食品及雙叉桿菌增殖促進用飲食品) 本發明之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用飲食品及雙叉桿菌增殖促進用飲食品，可利用黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的發酵培養物本身。作為食品所利用的發酵培養物，則可舉出上述之發酵乳製品。 此外，該等的飲食品，亦可利用將上述人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑及雙叉桿菌增殖促進劑摻合於適當的飲食品之物。該等之物的摻合，可在飲食品的製造步驟中添加於原料內，亦可使其與材料摻合，亦可摻合於最終製品之飲食品內。 作為飲食品之例子，可舉出：乳酪、發酵乳、乳製品乳酸菌飲料、乳酸菌飲料、奶油、人造奶油等乳製品；乳飲料、果汁飲料、清涼飲料等飲料；果凍、糖果、布丁、美乃滋等蛋類加工品；奶油蛋糕等點心/麵包類；進而，各種奶粉，除此之外，嬰幼兒食品、營養組成物等；並無特別限定。 此外，本發明之人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用飲食品及雙叉桿菌增殖促進用飲食品，亦可作為機能性表示食品、特定保健用食品、營養機能食品、美容用食品來使用。
摻合黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體及/或培養物來製造人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑、雙叉桿菌增殖促進劑、人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用飲食品、雙叉桿菌增殖促進用飲食品、人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用營養組成物、雙叉桿菌增殖促進劑營養組成物時，摻合比例並無特別限制，配合製造的簡易性或理想的一日投予量來適當地調節即可。可考慮投予對象者的症狀、年齡等來個別地決定，但一般成人的情況下，調整摻合量等使其能攝取黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的菌體培養物10～200g，或是菌體本身0.1～100mg即可。 以下，詳細說明本發明之實施例，但本發明並不限定於此。 [實施例]
[試驗例1]模型評價系統用培養物之調製 1. 具有日本人腸內細菌叢特徵的腸內細菌之抽出 (1) 腸內細菌之取得及選擇 由分讓機關JCM(日本國立研究開發法人理化學研究所生物資源研究中心)取得日本人腸內細菌叢中優勢存在的腸內細菌中之可獲得之菌種，再以改質GAM肉汁培養基(商品編號05433，日本NISSUI股份有限公司)加以培養。從藉由該培養而確認增殖的29種腸內細菌中，以能維持日本人腸內分類學比例之組合的方式來抽出腸內細菌。意即，將屬於厚壁菌門、放線菌門、或擬桿菌門之腸內細菌，以菌種數而言分別包含約57%、約24%、約19%的組合。之後，維持該等菌種的比例，且抽出腸內細菌使其包含與外國人相比在日本人中顯示更高存在比之菌屬即布勞特氏菌屬、雙叉桿菌屬、柯林斯菌屬、或鏈球菌屬之組合。
(2) 各種濃縮菌體之調製 調製改質GAM肉汁培養基，以121°C、15分鐘的加熱處理來將培養基滅菌。將上述29菌種之腸內細菌分別植菌於個別的滅菌培養基上，使用厭氧操作台(Concept400，日本Central Scientific Commerce股份有限公司)，以37°C來進行厭氧培養。將所獲得的各個培養物藉由離心操作進行濃縮，並添加甘油使濃度成為10%(v/v)，而取得各種的濃縮菌體。於-80°C下冷凍該等的濃縮菌體，之後實施融解後，進行循序稀釋，再塗抹於改質GAM肉汁洋菜培養基上來測定生菌數，確認到不論何種菌株皆包含1.0E+07 cfu/mL以上的生菌數。使用的改質GAM肉汁培養基之組成如下述表1所示。
[表1]
成分 1L中
蛋白腖 5.0g
大豆蛋白腖 3.0g
朓蛋白腖 5.0g
消化血清末 10.0g
酵母萃取物 2.5g
肉類萃取物 2.2g
肝臟萃取物 1.2g
葡萄糖 0.5g
可溶性澱粉 5.0g
L-色胺酸 0.2g
L-半胱胺鹽酸鹽 0.3g
硫代乙醇酸鈉 0.3g
L-精胺酸 1.0g
維生素K1 5.0mg
氯化血紅素 10.0mg
磷酸二氫鉀 2.5g
氯化鈉 3.0g
2. 試驗結果 根據上述1(1)之觀點，將屬於厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門之腸內細菌以下述的方式來抽出腸內細菌：分別包含5菌種、2菌種、2菌種，合計9菌種的組合；分別包含7菌種、3菌種、2菌種，合計12菌種的組合；分別包含8菌種、3菌種、3菌種，合計14菌種的組合；分別包含10菌種、4菌種、3菌種，合計17菌種的組合。表2顯示17菌種的組合，而該17菌種的組合是包含已取得的29菌種中所包含之屬於放線菌門的4菌種全部。
[表2]
菌種 菌種名 JCM株編號 依照門之分類
1 涎鏈球菌 5707T 厚壁菌門
2 瘤胃球菌 6515T 厚壁菌門
3 Blautia wexlerae 17041T 厚壁菌門
4 Dorea longicatena 11232T 厚壁菌門
5 梭狀芽孢桿菌 12243T 厚壁菌門
6 直腸真桿菌 17463T 厚壁菌門
7 陪伴糞球菌 31264 厚壁菌門
8 Blautia obeum 31340 厚壁菌門
9 普拉梭菌 31915 厚壁菌門
10 Flavonifractor plautii 32125T 厚壁菌門
11 偽鏈狀雙叉桿菌 1200T 放線菌門
12 龍根菌 1217T 放線菌門
13 青春雙叉桿菌 1275T 放線菌門
14 產氣柯林斯菌 10188T 放線菌門
15 普通擬桿菌 5826T 擬桿菌門
16 單形擬桿菌 5828T 擬桿菌門
17 Bacteroides dorei 13471T 擬桿菌門
3. 模型評價系統之培養方法 於可經時監控溫度及pH值之小容量培養裝置內，添加已滅菌之改質GAM肉汁培養基，於培養前將氮氣、二氧化碳、氫氣之混合氣體進行一定時間的換氣，盡可能地去除培養基中之溶解氧。具體而言，使用將矽膠材質的密封墊類更換成腈類(丁腈橡膠，NBR)材質，管類更換成PharMed管之少量多重培養裝置(Bio Jr. 8，日本Able biott股份有限公司)，而混合氣體的比例，分別是氮氣80%、二氧化碳10%、氫氣10%，並以此比例之混合氣體來進行換氣。 將表2所示的再建構之17菌種細菌的混合培養物進行植菌，將上述混合氣體進行換氣，邊攪拌培養至培養基的pH值變為穩定。模型評價系統之混合培養物，相對於100mL的培養基，各腸內細菌為1.0E+07至1.0E+08 cfu/mL的程度，攪拌為100 rpm以下，培養開始時之pH值為7.2，培養時間為16小時來進行。 以下的試驗例中，將作為候選的食品用組成物添加於模型評價系統，再將藉由上述的培養方法培養出的培養物回收，測定出短鏈脂肪酸產生量及算出表示多樣性之指數，來進行評價。
[試驗例2]短鏈脂肪酸及多樣性增加促進作用之評價方法的確立 人類體內藉由攝取難消化性食物纖維類，會使腸內細菌叢中之短鏈脂肪酸增加一事已廣為人知，另一方面，能安定地使多樣性增加之食物組成物，至今仍未被報告指出。然而，患有肥胖或糖尿病、脂質異常症之患者中，不僅是短鏈脂肪酸的低下，關於多樣性亦被報告揭示有低下的情況，推測短鏈脂肪酸與多樣性有一定程度的相關性。 由於本評價系統是利用經標準化之腸內細菌叢模型，能以高精確度來確認因個體間的腸內細菌叢之差別而難以比較的多樣性增加促進作用。
(1) 試驗方法 作為試驗對象，將已被確認能使上述短鏈脂肪酸增加之難消化性食物纖維 α-CD(α-cyclodextrin，CAVAMAX WG Food，日本Cyclochem股份有限公司)，添加於本評價系統，在確認短鏈脂肪酸增加的同時，也對多樣性實施該評價。難消化性食物纖維類是添加0.2%(相對於3000g的膳食，估計添加6g)，其為人類攝取可能之量。
(2) 短鏈脂肪酸產生增加促進作用之評價方法 使用HPLC(ICS2100，Diatech股份有限公司)，由培養物之上清液，將丁酸及總短鏈脂肪酸產生量(乙酸/丙酸/丁酸之總和)算出，並進行評價。人類大腸中藉由腸內細菌所產生的代表性短鏈脂肪酸為乙酸、丙酸、及丁酸三種。
(3) 多樣性增加促進作用之評價方法 使用次世代定序儀(IonPGM，Thermo Fisher Scientific股份有限公司)與分析流程(QIIME2)，由抽取自培養物上清液的基因組DNA，來算出表示多樣性之指數(多樣性數值化)，並進行評價。 作為表示腸內細菌叢之多樣性的指數，是選擇香農指數、系統演化多樣性指數這兩個指標。
(4) 試驗結果 將無添加α-CD之對照組設為1.0時，其短鏈脂肪酸產生量之增加率，丁酸為1.57倍，總短鏈脂肪酸產量(乙酸/丙酸/丁酸之總和)，亦增加1.13倍。 此外，將無添加設為1.0時，其多樣性指數之增加率，香農指數為1.25倍，系統演化多樣性指數亦增加1.05倍。 由上可知，本評價方法中藉由添加α-CD，再現性良好地確認了短鏈脂肪酸的增加。此外，亦再現性良好地確認了多樣性的增加。因此，本評價方法，作為模型評價系統，已被實證為精確度良好之評價方法。
[試驗例3]篩選使短鏈脂肪酸及/或腸內細菌叢之多樣性增加之乳酸菌 (1) 試驗方法 將屬於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之乳酸菌藉由經試驗例2所實證之評價方法，來確認短鏈脂肪酸增加與否，同時，亦對多樣性的增加進行評價。具體而言，是將發明人持有的以人類作為分離源且屬於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之各個乳酸菌(表2)，相對於100mL的培養基，添加1.0E+0.7cfu/mL的程度。
(2) 短鏈脂肪酸產生增加促進作用之評價方法 與試驗例2相同的方法來進行。
(3) 多樣性增加促進作用之評價方法 與試驗例2相同的方法來進行。
(4) 試驗結果 在探索於模型評價系統中藉由添加而使短鏈脂肪酸增加之各種乳酸菌及雙叉桿菌時，再現性良好地確認了藉由黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之添加而短鏈脂肪酸增加。此外，亦再現性良好地確認了多樣性的增加。 例如，添加發明人持有的以人類作為分離源之鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)時，其短鏈脂肪酸產生量之增加率則分別是，丁酸為0.66倍、0.85倍，總短鏈脂肪酸產量(乙酸/丙酸/丁酸之總和)亦分別減少為0.94倍、0.95倍。此外，多樣性指數的增加率分別是，香農指數為0.97倍、0.85倍，系統演化多樣性指數亦減少為0.95倍、0.95倍。 將未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之對照組設為1.0的情況下，短鏈脂肪酸產生量之增加率示於表3，多樣性指數之增加率示於表4。
[表3] 表3. 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)培養物之添加所造成短鏈脂肪酸產生量的增加率
菌種名 SBT株編號 分離源 丁酸 總短鏈脂肪酸
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10028 人類 2.33 1.13
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10043 人類 1.87 1.22
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10217 人類 1.74 1.15
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10027 人類 1.56 1.12
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10038 人類 1.47 1.08
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 2261 人類 1.41 1.10
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 2027 人類 1.34 1.07
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 2271 人類 1.18 1.11
[表4] 表4. 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)培養物之添加所造成多樣性指數之增加率
菌種名 SBT株編號 分離源 香農指數 系統演化多樣性指數
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10028 人類 1.26 1.20
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10043 人類 1.46 1.36
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10217 人類 1.36 1.29
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10027 人類 1.29 1.20
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 10038 人類 1.38 1.34
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 2261 人類 1.19 1.11
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 2027 人類 1.25 1.12
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 2271 人類 1.29 1.22
(5) 考察 於以日本人的腸內優勢細菌來再建構出的混合培養物之腸內細菌叢模型中，添加作為促進腸內細菌生長之食品組成物的α-CD、黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，並進行混合培養，將其與無添加時相比，可確認添加時促進了短鏈脂肪酸產生量的增加及/或多樣性的增加。
[試驗例4]雙叉桿菌之增殖促進 (1) 菌株 作為黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，是使用表5之以人類作為分離源的菌株。此外，關於雙叉桿菌，是使用與已知為廣泛分佈於日本人的嬰幼兒至高齡者之龍根菌為同菌種之標準培養菌株JCM1217。
[表5]
使用菌株    
種名 菌株編號 分離源
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2025 人類
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2268 人類
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2269 人類
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2867 人類
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT10043 人類
黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT10228 人類
(2) 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)濃縮菌體之調製 調製乳酸菌用培養基之MRS液體培養基，以121°C，15分鐘的加熱處理來進行培養基的滅菌。將表5所記載之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2025、黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2268、黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2269、黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT2867、黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT10043、及黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) SBT10228，植菌於該滅菌之培養基，使用厭氧培養系統(商品名：Anaero Pack，日本Mitsubishi gas chemical股份有限公司)，在37°C，16小時的條件下進行厭氧培養。將所獲得的培養物藉由離心操作加以濃縮，並添加甘油使其濃度成為10%(v/v)，而取得濃縮菌體。將該等濃縮菌體冷凍至-80°C，在之後實施融解後，進行循序稀釋，再塗抹於MRS洋菜培養基上來測定生菌數，確認到不論何種菌株皆包含2.0E+09 cfu/mL以上的生菌數。
(3) 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品之調製 調製包含0.5%(w/w)酵母萃取物、2.5%(w/w)葡萄糖之10%(w/w)脫脂奶粉乳，以115°C，20分鐘的加熱處理來進行殺菌。於該脫脂奶粉乳中，添加上述調製的各濃縮菌體使其濃度成為0.1%(v/w)，使用厭氧培養系統，在37°C，16小時的條件下進行厭氧培養。關於所獲得的發酵乳製品，以容量為基準進行循序稀釋，並塗抹於包含0.132%(v/v)乙酸之乳酸桿菌用LBS洋菜培養基上來測定生菌數，確認到不論何種菌株皆包含1.0E+06 cfu/mL以上的生菌數。將該等發酵乳製品使用於與龍根菌JCM1217之混合培養。
(4) 龍根菌JCM1217濃縮菌液之調製 調製厭氧性細菌用培養基之GAM液體培養基(GAM肉汁，製品編號05422，日本日水製藥股份有限公司製)，以115°C，15分鐘的加熱處理來進行培養基的殺菌。將龍根菌JCM1217植菌於該培養基，使用厭氧培養系統，在37°C，16小時的條件下進行厭氧培養。將所獲得的培養物藉由離心操作加以濃縮，並添加甘油使其濃度成為10%(v/v)，而取得濃縮菌體。將該等濃縮菌體冷凍至-80°C，在之後實施融解後，進行循序稀釋，再塗抹於雙叉桿菌用TOS丙酸洋菜培養基上來測定生菌數，確認到包含1.0E+09 cfu/mL的生菌數。將該龍根菌JCM1217濃縮菌體使用於與黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之混合培養。
(5) 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品與龍根菌JCM1217之混合培養 調製厭氧性細菌用培養基之GAM液體培養基(GAM肉汁，製品編號05422，日本日水製藥股份有限公司製)，以115°C，15分鐘的加熱處理來進行培養基的殺菌。將1%(v/v)黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品(1.0E+06 cfu/mL以上)、與10%(v/v)龍根菌JCM1217濃縮菌體(1.0E+09 cfu/mL)添加混合於該培養基中，使用厭氧培養系統，在37°C，16小時的條件下進行培養。作為對照組，設計出未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品之試驗組。此外，GAM液體培養基是作為腸內環境模型培養基所使用之培養基(PLOS ONE DOI：10.1371/JOURNAL. PONE. 0160533 August 2, 2016)
(6) 混合培養後的雙叉桿菌生菌數與增值促進 將上述混合培養物，在容量上以變為10倍的方式進行循序稀釋，並塗抹於雙叉桿菌的選擇性培養基之TOS丙酸洋菜培養基，該培養基包含0.005%(w/v)的莫螢菌素鋰，再使用厭氧培養系統，在37°C下，3天的條件下進行培養。觀測洋菜培養基上所形成的菌落數，按倍率計算出將對照組設為1.0倍時，各發酵乳製品所造成的菌落形成數(cfu)增加，意即雙叉桿菌之增值促進。
其結果，未添加黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品之對照組的雙叉桿菌生菌數為4.7E+08 cfu/mL，相對於此，添加SBT2025發酵乳製品的情況為8.7E+08 cfu/mL(增殖促進1.8倍)、添加SBT2268發酵乳製品的情況為1.0E+09 cfu/mL(增殖促進2.1倍)、添加SBT2269發酵乳製品的情況為1.0E+09 cfu/mL(增殖促進2.1倍)、添加SBT2867發酵乳製品的情況為1.3E+09 cfu/mL(增殖促進2.9倍)、添加SBT10043發酵乳製品的情況為5.1E+08 cfu/mL(增殖促進1.1倍)、添加SBT10228發酵乳製品的情況為1.3E+09 cfu/mL(增殖促進2.7倍)。意即，該等的黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品，相較於對照組，雙叉桿菌之增值促進為1.1倍以上(表6)。此外，「E+08」、「E+09」是表示「×108 」、「×109 」。
[表6] 黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品之雙叉桿菌增殖促進
發酵乳製品(菌株編號) 雙叉桿菌生菌數(cfu/mL) 增殖促進(倍) (無發酵乳製品設為1.0倍)
無 4.7E+08 1.0
有(SBT2025) 8.7E+08 1.8
有(SBT2268) 1.0E+09 2.1
有(SBT2269) 1.0E+09 2.1
有(SBT2867) 1.3E+09 2.9
有(SBT10043) 5.1E+08 1.1
有(SBT10228) 1.3E+09 2.7
[試驗例5]人類腸內之雙叉桿菌比例之增加 (1) 菌株與發酵乳製品之試作 針對試驗例4中增值促進為1.1倍之SBT10043，來試作發酵乳製品。於MRS洋菜培養基上單一菌落分離出SBT10043後，於由1%(w/w)食用酵母萃取物、2%(w/w)食用酪蛋白腖、2%(w/w)食用葡萄糖所構成之營養培養基進行釣菌，使用厭氧培養系統，在37°C下，16小時的條件下進行厭氧培養。將該培養物藉由離心以容量為基準濃縮成10倍，而取得食用濃縮菌體。接下來調製包含0.5%(w/w)食用酵母萃取物、2.5%(w/w)食用葡萄糖之10%(w/w)脫脂奶粉乳，以115°C，20分鐘來進行殺菌。於該脫脂奶粉培養基中，添加食用濃縮菌體使其濃度成為10%(v/w)，於密閉的容器內，在37°C、24小時的條件下靜置培養。
將上述發酵乳製品植菌於新調製的包含已殺菌的0.5%(w/w)食用酵母萃取物、2.5%(w/w)食用葡萄糖之10%(w/w)脫脂奶粉乳中，使其濃度成為10%(w/w)，再將其於密閉的容器內，在37°C、24小時的條件下靜置培養。將其作為食用發酵乳製品。此外，食用發酵乳製品是將同樣的食品發酵乳製品作為種菌，重複繼代培養，並依所需製造多數次。意即，將食用發酵乳製品植菌於同樣的脫脂乳培養基(包含0.5%(w/w)食用酵母萃取物、2.5%(w/w)食用葡萄糖之10%(w/w)脫脂奶粉乳)，使其濃度成為10%(w/w)，於密閉的容器內，重複在37°C下靜置培養24小時之繼代培養，作為食用發酵乳製品之種菌的同時，依所需增加培養需求，作為食用發酵乳製品來攝取使用。
(2) 食用發酵乳製品中SBT10043之生菌數 將食用發酵乳製品1.0mL，在容量上以變成10倍的方式來進行循序稀釋，並塗抹於包含0.132%(v/v)乙酸之乳酸桿菌用LBS洋菜培養基上來測定生菌數，確認包含5.0E+08 cfu/mL以上的生菌數。
(3) 食用發酵乳製品之攝取期間及攝取者 以1天200mL，意即1.0E+09 cfu/日以上的方式，來攝取包含上述SBT10043之食用發酵乳14天。回收攝取前後之糞便並抽出DNA，以菌叢解析方法之一的T-RFLP法來求得雙叉桿菌之比例。作為攝取者，是以攝取食用發酵乳製品前，雙叉桿菌未滿10%的攝取者A，以及雙叉桿菌為10%以上的攝取者B的兩名攝取者來進行實驗。
(4) 攝取者A之腸內雙叉桿菌比例的增加 在攝取包含黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品前的攝取者A，其大腸內之雙叉桿菌的比例為3.3%，但在攝取14天上述發酵乳製品後則增加為11.6%。意即，相對於攝取上述發酵乳製品前，攝取後增加了3.5倍(表7)。
[表7] 攝取者A攝取包含黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品前後腸內細菌群之比例
菌群 攝取前(%) 攝取後(%)
雙叉桿菌屬(Bifidobacterium) 3.3 11.6
乳桿菌目(Lactobacillales) 3.1 5.1
類桿菌屬(Bacteroides) 50.7 55.1
普雷沃菌屬(Prevotella) 1.1 1.3
Clostridium cluster IV 15.4 5.9
Clostridium subcluster XIVa 20.3 13.7
Clostridium cluster IX 0.0 0.0
Clostridium cluster XI 0.6 1.2
Clostridium cluster XVIII 0.0 1.2
其他 5.5 4.8
(5) 攝取者B之腸內雙叉桿菌比例的增加 攝取包含黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品前的攝取者B，其大腸內之雙叉桿菌的比例為19.9%，但在攝取上述發酵乳製品14天後則增加為25.9%。意即，相對於攝取上述發酵乳製品前，攝取後增加了1.3倍(表8)。 由上可知，人類藉由攝取包含試驗例4中模仿人類大腸內環境的培養試驗顯示具有雙叉桿菌增殖促進活性之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的發酵乳製品，可使大腸內之雙叉桿菌的比例之增加。
[表8] 攝取者B攝取包含黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)發酵乳製品前後腸內細菌群之比例
菌群 攝取前(%) 攝取後(%)
雙叉桿菌(Bifidobacterium) 19.9 25.9
乳桿菌目(Lactobacillales) 2.7 1.5
類桿菌屬(Bacteroides) 33.0 46.3
普雷沃菌屬(Prevotella) 0.0 0.0
Clostridium cluster IV 5.9 6.1
Clostridium subcluster XIVa 32.5 17.9
Clostridium cluster IX 0.0 0.0
Clostridium cluster XI 0.0 0.0
Clostridium cluster XVIII 0.0 0.0
其他 6.0 2.2
[產業上之利用可能性]
依據本發明，藉由使用將日本人的腸內細菌叢以人工的方式再建構的模型評價系統，可在不使用人類或動物，且未使用活體試驗材料之人類糞便的條件下，探索出使構成腸內細菌叢之腸內細菌的多樣性或腸內細菌叢中之短鏈脂肪酸增加的食品組成物。此外，藉由攝取包含使用上述模型評價系統篩選而得之屬於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的細菌來作為有效成分之飲食品等，可期待在構成腸內細菌叢之腸內細菌上發揮作用，而改善腸內細菌叢。 此外，依據本發明的其他態樣，藉由攝取於試管內會促進雙叉桿菌增殖之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)的發酵乳製品，可使人類大腸中之雙叉桿菌的比例之增加。由此可知，本發明可提供一種新式益生菌。
(1) SBT10028 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：獨立行政法人 製品評價技術基盤機構 專利微生物寄存中心(日本千葉縣木更津市Kazusakamatari 2-5-8(郵遞區號292-0818)) 寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日(國際寄存之移管日 2021年3月23日) 該寄存機關之寄存編號：NITE BP-03275 (2) SBT10217 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03276 (3) SBT10027 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03274 (4) SBT10038 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03283 (5) SBT2261 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03272 (6) SBT2027 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03271 (7) SBT2271 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年9月15日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03273 (8) SBT10043 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年3月27日(國際寄存的移管日 2021年3月23日) 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03187 (9) SBT2025 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年3月27日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03189 (10) SBT2268 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年3月27日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03190 (11) SBT2269 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年3月27日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03191 (12) SBT2867 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年3月27日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03192 (13) SBT10228 寄存國家：日本 寄存該生物材料之寄存機關名稱及住址：同上述(1) 寄存寄存生物材料於該寄存機關之日期：2020年3月27日 該寄存機關之寄存編號：NITE P-03188

Claims (25)

  1. 一種腸內細菌叢改善用組成物，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。
  2. 一種腸內細菌叢改善用飲食品，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。
  3. 一種短鏈脂肪酸增加促進用組成物，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。
  4. 一種短鏈脂肪酸增加促進用飲食品，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。
  5. 一種腸內細菌多樣性增加促進用組成物，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。
  6. 一種腸內細菌多樣性增加促進用飲食品，其是將黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌體或菌體培養物作為有效成分。
  7. 一種人類腸內細菌叢模型，其是用來評價對象食品組成物之人體腸內之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用； 係以不包含屬於變形菌門(proteobacteria)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)之細菌，而包含屬於雙叉桿菌屬(Bifidobacterium)之細菌之至少9菌種以上的細菌的評價用菌體培養物構成。
  8. 如請求項7之人類腸內細菌叢模型，其中，該9菌種以上的細菌是屬於厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、或擬桿菌門(Bacteroidetes)之細菌，且包含屬於布勞特氏菌屬(Blautia)、柯林斯菌屬(Collinsella)、或鏈球菌屬(Streptococcus)之細菌。
  9. 如請求項8之人類腸內細菌叢模型，其中，包含屬於厚壁菌門之細菌以菌種數而言佔56～59%，屬於放線菌門之細菌以菌種數而言佔21～24%，屬於擬桿菌門之細菌以菌種數而言佔17～22%。
  10. 如請求項7至9中任一項之人類腸內細菌叢模型，其中，該至少9菌種以上的細菌，是選自由Blautia wexlerae、龍根菌(Bifidobacterium longum)、偽鏈狀雙叉桿菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、直腸真桿菌(Eubacterium rectale)、青春雙叉桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、產氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)、Dorea longicatena、普通擬桿菌(Bacteroides vulgatus)、瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)、普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、迪氏副擬桿菌(Parabacteroides distasonis)、長鏈多爾氏菌(Dorea formicigenerans)、卵瘤胃球菌(Ruminococcus obeum)、扭鏈瘤胃球菌(Ruminococcus torques)、Bacteroides dorei、Flavonifractor plautii、屎副擬桿菌(Parabacteroides merdae)、食葡糖羅斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、系結梭菌(Clostridium nexile)、涎鏈球菌(Streptococcus salivarius)、緩慢愛格士氏菌(Eggerthella lenta)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium bolteae)、Roseburia intestinalis、陪伴糞球菌(Coprococcus comes)、卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)、霍氏真桿菌(Eubacterium hallii)、人羅斯拜瑞氏菌(Roseburia hominis)、及多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)構成之群組。
  11. 如請求項7至9中任一項之人類腸內細菌叢模型，其中，該至少9菌種以上的細菌是Blautia wexlerae、龍根菌、偽鏈狀雙叉桿菌、直腸真桿菌、青春雙叉桿菌、產氣柯林斯菌、單形擬桿菌、Dorea longicatena、普通擬桿菌、瘤胃球菌、普拉梭菌、Blautia obeum、Bacteroides dorei、Flavonifractor plautii、涎鏈球菌、梭狀芽孢桿菌、及陪伴糞球菌。
  12. 一種人類腸內細菌叢模型之培養方法，其是用來評價對象食品組成物在人類腸食品組成物在人類腸內之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用，包含以下步驟： (1)將不包含屬於變形菌門、乳酸桿菌屬之細菌，包含屬於雙叉桿菌屬之細菌之至少9菌種以上之細菌，添加於改質GAM肉汁培養基； (2)於厭氧的條件下進行培養。
  13. 一種用來評價對象食品組成物在人類腸內之短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用之方法，包含以下步驟： (1)將作為評價對象的食品組成物添加於如請求項7至11中任一項之人類腸內細菌叢模型中並加以培養； (2)測定(1)獲得的培養物之短鏈脂肪酸產生量及/或計算出多樣性指數； (3)將(2)的測定值及/或計算值和無添加該食品組成物時進行比較，當相對值為1.0倍以上的情況，則評價具有短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用。
  14. 一種腸內細菌叢改善用飲食品之製造方法，其是使用如請求項13之評價方法中，被評價具有短鏈脂肪酸增加促進作用及/或多樣性增加促進作用之食品組成物，來製造食品之方法。
  15. 一種屬於黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之菌株，其是選自由SBT10028株(NITE BP-03275)、SBT10217株(NITE P-03276)、SBT10027株(NITE P-03274)、SBT10038株(NITE P-03283)、SBT2261株(NITE P-03272)、SBT2027株(NITE P-03271)、SBT2271株(NITE P-03273)、SBT2025(NITE P-03189)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT10043(NITE BP-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組之菌株。
  16. 一種人類腸內之雙叉桿菌比例之增加劑，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。
  17. 一種雙叉桿菌增殖促進劑，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。
  18. 如請求項16或17之製劑，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)，係在與雙叉桿菌培養時，相較於無添加之情況下，具有1.1倍以上之增殖活性的菌株。
  19. 如請求項16或17之製劑，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 是選自由SBT2025(NITE P-03189)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT10043(NITE P-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之1種以上的乳酸菌株。
  20. 一種人類腸內之雙叉桿菌比例之增加用飲食品，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。
  21. 一種雙叉桿菌增殖促進用飲食品，其是以黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)作為有效成分。
  22. 如請求項20或21之飲食品，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)係在與雙叉桿菌培養時，相較於無添加之情況下，具有1.1倍以上之增殖活性的菌株。
  23. 如請求項20或21之飲食品，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae) 是選自由SBT2025(NITE P-03189)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT10043(NITE P-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之1種以上的乳酸菌株。
  24. 一種發酵乳製品之製造方法，其包含在主成分為乳品的培養基中培養黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)之步驟， 特徵在於，是使用具有下述性質之菌株作為黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)： 在與雙叉桿菌培養時，相較於無添加之情況下，具有1.1倍以上的增殖活性為特徵之黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)。
  25. 如請求項24之發酵乳製品之製造方法，其中，黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)是選自由SBT2025(NITE P-03189)、SBT2268(NITE P-03190)、SBT2269(NITE P-03191)、SBT2867(NITE P-03192)、SBT10043(NITE P-03187)、及SBT10228(NITE P-03188)構成之群組中之1種以上的乳酸菌株。
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