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TW202140798A - 具有用於模板多核苷酸接附的單一位置的奈米顆粒 - Google Patents

具有用於模板多核苷酸接附的單一位置的奈米顆粒 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種奈米顆粒，其包括支架、用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中該支架選自不對稱丙烯醯胺聚合物一或包括離胺醯基組成性重複單元的樹枝狀聚合物，用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的該單一模板位置選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置，且用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的該複數個輔助位置選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。亦提供使用該奈米顆粒之方法。

Description

具有用於模板多核苷酸接附的單一位置的奈米顆粒
本發明係關於奈米顆粒及使用該等奈米顆粒之方法。 相關申請案之交叉參考
本申請案係依照專利合作條約申請之國際申請案，其主張2019年12月23日申請的美國臨時專利申請案第62/952,799號及2019年12月23日申請的美國臨時專利申請案第62/952,866號的優先權益，該等申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有2020年12月16日創建的序列表；檔案呈ASCII格式，命名為1912732.txt且大小為3.2 KB。該檔案以全文引用之方式併入本申請案中。
許多當前定序平台使用「合成式定序（sequencing by synthesis；SBS）」技術及基於螢光之方法用於偵測。在一些實例中，自庫分離為序列之大量目標多核苷酸或模板多核苷酸在稱為接種的方法中接附至基板表面。模板多核苷酸之多個複本接著可在稱作簇聚的方法中合成接附至接近作為複本之模板多核苷酸接種之位置的表面。隨後，簇聚多核苷酸之新生複本在以下條件下合成：各核苷酸接附至新生股時該等新生複本發射鑑別各核苷酸之信號。所接種之模板多核苷酸的複數個複本接近模板多核苷酸最初接種之位置簇聚引起可視化聚合期間產生之信號的擴增，從而改良偵測。
當可用的基板表面儘可能多地由模板多核苷酸接種時，SBS之接種及簇聚很好地工作，此可使在定序運作期間可獲得的定序資訊量達到最大。相比之下，一般而言，基板用於接種及簇聚之可用表面積愈小，SBS方法之效率可能愈低，導致為獲得給定庫之給定量定序資訊，時間延長、反應物增加、費用提高且資料處理複雜。
接種及簇聚亦在以下時很好地工作：來自庫的序列彼此不同之模板多核苷酸接種於或接附至足夠遠離彼此之表面位置，使得簇聚引起各自由接種單一模板多核苷酸產生之複製的多核苷酸的空間不同簇，此狀況一般稱作單株性。亦即，模板多核苷酸之庫一般可包括核苷酸序列彼此不同之大量模板多核苷酸分子。若兩種此類模板多核苷酸在基板表面上過於緊密地接種在一起，則簇聚可產生複製的多核苷酸之空間共混群，其中一些具有附近接種之模板多核苷酸之一的序列，且其他具有亦在表面上附近接種之另一模板多核苷酸的序列。或者，由彼此過於接近地接種之兩種不同模板多核苷酸形成的兩個簇可能彼此過於鄰近或彼此鄰接，使得儘管簇之間可能不存在或存在極小基板接附序列的空間共混，但SBS方法中所使用之成像系統可為無法將該等簇區分為獨立簇。此種不利狀況一般可稱作多株性。若存在多株簇，則自多株簇獲得明確的序列資訊可能更困難、費時、昂貴且效率更低，且需要更複雜的資料分析。
因此期望在一定條件下執行SBS，在該等條件下，基板表面儘可能多的可用表面積用於接種及簇聚，同時亦促進所接種之模板多核苷酸分開，以使簇之單株性儘可能達到最大且使多株簇儘可能減至最少。本文揭示可用於在SBS中有利地提高接種密度及單株簇聚之組成物及方法。
在一個方面，提供一種奈米顆粒，其包括支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中該支架為式I化合物：
Figure 02_image001
， 各X為式II化合物：
Figure 02_image003
， 其中R2 選自式IIIa：
Figure 02_image005
，其中R5 選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
Figure 02_image015
、及
Figure 02_image017
，x為在1至2,000範圍內之整數，且y為在1至10,000範圍內之整數，且x:y之比可為大致10:90至大致1:99，且其中各Rz 獨立地為H或C1-4 烷基、及式IIIb：
Figure 02_image019
，其中R5 選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
Figure 02_image015
、及
Figure 02_image017
，y為在1至2,000範圍內之整數，且x及z為總和在1至10,000範圍內之整數，且(x:y):z之比可為大致(85):15至大致(95):5，且其中各Rz 獨立地為H或C1-4 烷基，R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包括經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的輔助位置。
在一實例中，單一模板位置包括共價模板鍵結位置。在另一實例中，共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶（sortase）-偶聯鍵結位置。
在另一實例中，單一模板位置包括非共價模板鍵結位置。在又另一實例中，非共價模板鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價模板鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈（coiled-coil）鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
在另一實例中，用於將輔助寡核苷酸鍵結至支架的複數個輔助位置包括共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在再另一實例中，共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
在另一實例中，輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在又另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
在另一實例中，奈米顆粒進一步包括鍵結至單一模板位置的單一模板多核苷酸。在又另一實例中，支架進一步包括鍵結至複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
在另一實例中，奈米顆粒直徑為至少10 nm，直徑為至少20 nm，直徑為至少30 nm，直徑為至少約40 nm，直徑為至少約50 nm，直徑為至少約60 nm，直徑為至少約70 nm，直徑為至少約80 nm，直徑為至少約90 nm，直徑為至少約100 nm，直徑為至少約125 nm，直徑為至少約150 nm，直徑為至少約175 nm，直徑為至少約200 nm，直徑為至少約225 nm，直徑為至少約250 nm，直徑為至少約275 nm，直徑為至少約300 nm，直徑為至少約325 nm，直徑為至少約350 nm，直徑為至少約375 nm，直徑為至少約400 nm，直徑為至少約425 nm，直徑為至少約450 nm，直徑為至少約475 nm，直徑為至少約500 nm，直徑為至少約550 nm，直徑為至少約600 nm，直徑為至少約650 nm，直徑為至少約700 nm，直徑為至少約750 nm，直徑為至少約800 nm，直徑為至少約850 nm，直徑為至少約900 nm，或直徑為至少約950 nm。
在另一方面，提供一種方法，其包括將單一模板多核苷酸鍵結至奈米顆粒的單一模板位置。在又另一方面，提供一種方法，其包括將複數個輔助寡核苷酸鍵結至奈米顆粒的複數個輔助位置。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中支架接附的複本自輔助寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括將支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至基板的寡核苷酸雜合。
在一實例中，基板包括複數個奈米孔，且接附至基板的寡核苷酸在複數個奈米孔內接附。在另一實例中，不多於一個支架在奈米孔中之任一者內結合。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
在另一方面，提供奈米顆粒，其包括支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至支架的複數個輔助位置，其中支架包含樹枝狀聚合物，其中樹枝狀聚合物包括2至10代組成性重複單元，組成性重複單元包括離胺酸，其中上游代之離胺酸與緊接下游代之第一離胺酸形成肽鍵，且與緊接下游代之第二離胺酸形成異肽鍵，單一模板位置自樹枝狀聚合物之第一代之離胺酸的C末端延伸，且複數個輔助位置自樹枝狀聚合物之最後一代之離胺酸的NH2 基團延伸。
在一實例中，單一模板位置包括共價模板鍵結位置。在另一實例中，共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶-­偶聯鍵結位置。
在另一實例中，單一模板位置包括非共價模板鍵結位置。在又另一實例中，非共價模板鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價模板鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
在另一實例中，用於將輔助寡核苷酸鍵結至支架的複數個輔助位置包括共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在再另一實例中，共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
在另一實例中，輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在又另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
在另一實例中，奈米顆粒進一步包括鍵結至單一模板位置的單一模板多核苷酸。在又另一實例中，支架進一步包括鍵結至複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
在另一實例中，奈米顆粒直徑為至少10 nm，直徑為至少20 nm，直徑為至少30 nm，直徑為至少約40 nm，直徑為至少約50 nm，直徑為至少約60 nm，直徑為至少約70 nm，直徑為至少約80 nm，直徑為至少約90 nm，直徑為至少約100 nm，直徑為至少約125 nm，直徑為至少約150 nm，直徑為至少約175 nm，直徑為至少約200 nm，直徑為至少約225 nm，直徑為至少約250 nm，直徑為至少約275 nm，直徑為至少約300 nm，直徑為至少約325 nm，直徑為至少約350 nm，直徑為至少約375 nm，直徑為至少約400 nm，直徑為至少約425 nm，直徑為至少約450 nm，直徑為至少約475 nm，直徑為至少約500 nm，直徑為至少約550 nm，直徑為至少約600 nm，直徑為至少約650 nm，直徑為至少約700 nm，直徑為至少約750 nm，直徑為至少約800 nm，直徑為至少約850 nm，直徑為至少約900 nm，或直徑為至少約950 nm。
在另一方面，提供一種方法，其包括將單一模板多核苷酸鍵結至奈米顆粒的單一模板位置。在又另一方面，提供一種方法，其包括將複數個輔助寡核苷酸鍵結至奈米顆粒的複數個輔助位置。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中支架接附的複本自輔助寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括將支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至基板的寡核苷酸雜合。
在一實例中，基板包括複數個奈米孔，且接附至基板的寡核苷酸在複數個奈米孔內接附。在另一實例中，不多於一個支架在奈米孔中之任一者內結合。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
在另一方面，提供一種奈米顆粒，其包括支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中該支架為式IV化合物：
Figure 02_image021
， 各X為式V化合物：
Figure 02_image022
， 其中R2 選自式VIa：
Figure 02_image024
及式VIb：
Figure 02_image026
其中p為選自1至20之整數，且R5 包括用於鍵結輔助寡核苷酸之輔助位置，R3 選自直接鍵、
Figure 02_image028
、
Figure 02_image030
、
Figure 02_image032
、
Figure 02_image034
、
Figure 02_image036
、及
Figure 02_image038
，m為1至2,000之整數且n為1至10,000之整數，R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包括經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的輔助位置。在前述實例中之任一者中，三硫代碳酸酯基
Figure 02_image040
可視情況經直接鍵、-CH2 -鍵聯、-S-鍵聯、-N-鍵聯或-O-鍵聯置換。
在一實例中，單一模板位置包括共價模板鍵結位置。在另一實例中，共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶­-偶聯鍵結位置。
在另一實例中，單一模板位置包括非共價模板鍵結位置。在又另一實例中，非共價模板鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價模板鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
在另一實例中，用於將輔助寡核苷酸鍵結至支架的複數個輔助位置包括共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在再另一實例中，共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
在另一實例中，輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在又另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
在另一實例中，奈米顆粒進一步包括鍵結至單一模板位置的單一模板多核苷酸。在又另一實例中，支架進一步包括鍵結至複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
在另一實例中，奈米顆粒直徑為至少10 nm，直徑為至少20 nm，直徑為至少30 nm，直徑為至少約40 nm，直徑為至少約50 nm，直徑為至少約60 nm，直徑為至少約70 nm，直徑為至少約80 nm，直徑為至少約90 nm，直徑為至少約100 nm，直徑為至少約125 nm，直徑為至少約150 nm，直徑為至少約175 nm，直徑為至少約200 nm，直徑為至少約225 nm，直徑為至少約250 nm，直徑為至少約275 nm，直徑為至少約300 nm，直徑為至少約325 nm，直徑為至少約350 nm，直徑為至少約375 nm，直徑為至少約400 nm，直徑為至少約425 nm，直徑為至少約450 nm，直徑為至少約475 nm，直徑為至少約500 nm，直徑為至少約550 nm，直徑為至少約600 nm，直徑為至少約650 nm，直徑為至少約700 nm，直徑為至少約750 nm，直徑為至少約800 nm，直徑為至少約850 nm，直徑為至少約900 nm，或直徑為至少約950 nm。
在另一方面，提供一種方法，其包括將單一模板多核苷酸鍵結至奈米顆粒的單一模板位置。在又另一方面，提供一種方法，其包括將複數個輔助寡核苷酸鍵結至奈米顆粒的複數個輔助位置。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中支架接附的複本自輔助寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括將支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至基板的寡核苷酸雜合。
在一實例中，基板包括複數個奈米孔，且接附至基板的寡核苷酸在複數個奈米孔內接附。在另一實例中，不多於一個支架在奈米孔中之任一者內結合。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
在另一方面，提供一種奈米顆粒，其包括支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中該支架為式VII化合物：
Figure 02_image042
， 各X為式VIII化合物：
Figure 02_image044
， 其中y為1至20之整數，R2 選自式IXa：
Figure 02_image024
及式IXb：
Figure 02_image047
其中p為選自1至20之整數，且R5 包括用於鍵結輔助寡核苷酸之輔助位置，R3 選自直接鍵、
Figure 02_image028
、
Figure 02_image030
、
Figure 02_image032
、
Figure 02_image034
、
Figure 02_image036
、及
Figure 02_image038
，m為1至2,000之整數且n為1至10,000之整數，R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包括經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的輔助位置。在前述實例中之任一者中，三硫代碳酸酯基
Figure 02_image040
可視情況經直接鍵、-CH2 -鍵聯、-S-鍵聯、-N-鍵聯或-O-鍵聯置換。
在一實例中，單一模板位置包括共價模板鍵結位置。在另一實例中，共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶-偶聯鍵結位置。
在另一實例中，單一模板位置包括非共價模板鍵結位置。在又另一實例中，非共價模板鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價模板鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
在另一實例中，用於將輔助寡核苷酸鍵結至支架的複數個輔助位置包括共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在再另一實例中，共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
在另一實例中，輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。在又另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括多核苷酸雜合位置。在再另一實例中，非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包括非共價肽結合位置，且非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
在另一實例中，奈米顆粒進一步包括鍵結至單一模板位置的單一模板多核苷酸。在又另一實例中，支架進一步包括鍵結至複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
在另一實例中，奈米顆粒直徑為至少10 nm，直徑為至少20 nm，直徑為至少30 nm，直徑為至少約40 nm，直徑為至少約50 nm，直徑為至少約60 nm，直徑為至少約70 nm，直徑為至少約80 nm，直徑為至少約90 nm，直徑為至少約100 nm，直徑為至少約125 nm，直徑為至少約150 nm，直徑為至少約175 nm，直徑為至少約200 nm，直徑為至少約225 nm，直徑為至少約250 nm，直徑為至少約275 nm，直徑為至少約300 nm，直徑為至少約325 nm，直徑為至少約350 nm，直徑為至少約375 nm，直徑為至少約400 nm，直徑為至少約425 nm，直徑為至少約450 nm，直徑為至少約475 nm，直徑為至少約500 nm，直徑為至少約550 nm，直徑為至少約600 nm，直徑為至少約650 nm，直徑為至少約700 nm，直徑為至少約750 nm，直徑為至少約800 nm，直徑為至少約850 nm，直徑為至少約900 nm，或直徑為至少約950 nm。
在另一方面，提供一種方法，其包括將單一模板多核苷酸鍵結至奈米顆粒的單一模板位置。在又另一方面，提供一種方法，其包括將複數個輔助寡核苷酸鍵結至奈米顆粒的複數個輔助位置。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中支架接附的複本自輔助寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括將支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至基板的寡核苷酸雜合。
在一實例中，基板包括複數個奈米孔，且接附至基板的寡核苷酸在複數個奈米孔內接附。在另一實例中，不多於一個支架在奈米孔中之任一者內結合。在再另一實例中，方法進一步包括合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：模板多核苷酸之複本、與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。在又另一實例中，方法進一步包括對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
在本說明書通篇中對「一個實例」、「另一實例」、「一實例」等等之參考意謂結合實例描述之特定要素（例如特徵、結構及/或特性）包括於本文所描述之至少一個實例中，且可或可不存在於其他實例中。另外，應理解，除非上下文另外明確規定，否則關於任何實例所描述之要素可在各種實例中以任何適合方式組合。
本發明係關於用於在SBS期間增加單株簇聚之組成物及方法。在一實例中，使用粒徑排阻原理來阻止個別模板多核苷酸接種且因此促進彼此過於接近地簇聚。藉由將各個別模板多核苷酸與具有給定、足夠的空間尺寸之奈米顆粒締合，可誘導模板多核苷酸足夠遠離彼此接附至基板表面，以減少多株簇之形成且增加單株簇之形成。奈米顆粒可包括用於模板多核苷酸的鍵結位置。奈米顆粒可僅具有用於接附模板多核苷酸的一個單一位置。因此一個且僅一個模板多核苷酸可能能夠接附至奈米顆粒，使得模板多核苷酸接附至支架阻止第二模板多核苷酸接附至同一奈米顆粒，所接附的模板多核苷酸佔據其單一模板多核苷酸鍵結位置。每個奈米顆粒接附僅單一模板多核苷酸，及直接或間接歸因於所接附的奈米顆粒之大小的接附至此類奈米顆粒之模板多核苷酸距離彼此的所得空間分佈減少多株簇之形成。
奈米顆粒亦可包括用於將奈米顆粒接附至除模板多核苷酸之外的組成物或表面的其他類型之一或多個鍵結位置，其在本文中稱作輔助鍵結位置。舉例而言，除單一模板多核苷酸鍵結位置之外，奈米顆粒可包括准許將奈米顆粒接附至用於SBS方法之基板表面的輔助鍵結位置。在另一實例中，奈米顆粒可具有用於將一或多種表面聚合物接附至奈米顆粒的一或多個輔助鍵結位置。在另一實例中，奈米顆粒可包括用於將輔助寡核苷酸接附至奈米顆粒的一或多個輔助鍵結位置，其中作為如下文更充分描述之簇聚方法的一部分，寡核苷酸可結合至模板多核苷酸或其複本的一端。在另一實例中，此類輔助寡核苷酸可能可與接附至用於SBS方法之基板之表面的寡核苷酸雜合，使得具有與其接附之單一模板多核苷酸的奈米顆粒可接附至此類基板表面。
支架可包括用於模板多核苷酸之單一鍵結位置及用於接附例如輔助寡核苷酸的一或多個輔助位置，而單一模板多核苷酸鍵結位置與輔助鍵結位置可具有不同化學性質或結構。在所有鍵結位置中，單一模板多核苷酸鍵結位置可為化學性質或結構經設計以便接附至具有用於與其接附之對應化學性質或結構的模板多核苷酸的唯一一者。相比之下，一或多個輔助鍵結位置可具有不同化學性質或結構，其與結合或接附至模板多核苷酸不相容。實際上，一或多個輔助鍵結位置可具有對於結合或接附至輔助鍵結位置意欲結合的其他組成物或結構，諸如輔助寡核苷酸、聚合物等而言相容，且與結合或接附至模板多核苷酸不相容的化學性質或結構。因此，模板多核苷酸將不能結合或接附至一或多個輔助鍵結位置，使得每個奈米顆粒僅在奈米顆粒之單一模板多核苷酸鍵結位置處接附一個模板多核苷酸。
模板多核苷酸可為獲自樣品之多核苷酸，諸如自樣品分離之多去氧核糖核苷酸，或由獲自樣品之mRNA分子複製的cDNA分子。可進行SBS方法，例如以測定模板多核苷酸之核苷酸序列，或以鑑別與參考序列相比，模板多核苷酸中之一或多種多型現象或更改。可由一或多種樣品製備庫，該庫包括獲自一或多種樣品的複數個模板多核苷酸。可藉由獲得作為樣品中存在或由樣品複製之序列之部分的多核苷酸序列，獲得模板多核苷酸。藉由以SBS方法對複數個模板多核苷酸進行定序，可確定關於模板多核苷酸之序列、基因型或其他序列相關資訊，且在收集並分析關於庫中複數個模板多核苷酸之序列資訊時，可確定關於樣品之資訊，該庫獲自該樣品。
作為自樣品獲得模板多核苷酸之方法的一部分，可對模板多核苷酸進行加工。加工之一部分可包括添加多核苷酸序列，諸如添加至模板之5'端、3'端或兩端，以幫助子序列SBS加工。如本文進一步揭示，可藉由添加促進或准許與奈米顆粒上之位置形成鍵之特徵來對模板多核苷酸進行進一步修飾。
模板多核苷酸可具有適合於以SBS方法獲得定序資訊的任何給定長度。舉例而言，模板多核苷酸可為約50個核苷酸長、約75個核苷酸長、約100個核苷酸長、約125個核苷酸長、約150個核苷酸長、約175個核苷酸長、約200個核苷酸核苷酸長、約225個核苷酸長、約250個核苷酸長、約275個核苷酸長、約300個核苷酸長、約325個核苷酸長、約350個核苷酸長、約375個核苷酸長、約400個核苷酸長、約425個核苷酸長、約450個核苷酸長、約475個核苷酸長、約500個核苷酸長、約525個核苷酸長、約550個核苷酸長、約575個核苷酸長、約600個核苷酸長、約625個核苷酸長、約650個核苷酸長、約675個核苷酸長、約700個核苷酸長、約725個核苷酸長、約750個核苷酸長、約775個核苷酸長、約800個核苷酸長、約825個核苷酸長、約850個核苷酸長、約875個核苷酸長、約900個核苷酸長、約925個核苷酸長、約950個核苷酸長、約975個核苷酸長、約1,000個核苷酸長、約1,025個核苷酸長、約1,050個核苷酸長、約1,075個核苷酸長、約1,100個核苷酸長、約1,125個核苷酸長、約1,150個核苷酸長、約1,175個核苷酸長、約1,200個核苷酸長、約1,225個核苷酸長、約1,250個核苷酸長、約1,275個核苷酸長、約1,300個核苷酸長、約1,325個核苷酸長、約1,350個核苷酸長、約1,375個核苷酸長、約1,400個核苷酸長、約1,425個核苷酸長、約1,450個核苷酸長、約1,475個核苷酸長、約1,500個核苷酸長或更長。
在一些實例中，奈米顆粒上可存在兩種或更多種不同輔助鍵結位置之群，其中具有一種類型的化學性質或結構的一些與結合或接附至一種組成物或結構之群相容，且具有第二類型的化學性質或結構的其他與結合或接附至另一組成物或結構之群相容。舉例而言，一種輔助位置之群可具有與結合至輔助寡核苷酸相容的化學性質或結構，該等輔助寡核苷酸可結合至參與例如如下文更充分描述的奈米顆粒上模板多核苷酸之簇聚的模板多核苷酸之複本，而其他輔助位置可具有與結合或接附至用於進行SBS之基板之表面相容的不同化學性質或結構。
奈米顆粒可包括支架。支架為奈米顆粒之結構組分，其根據模板奈米顆粒之間所需的最小距離量或接附至奈米顆粒之模板奈米顆粒的最大密度（如對於給定應用而言可能期望）佔據體積。支架可包括前述鍵結位置，如在單一模板多核苷酸結合位置及一或多個輔助鍵結位置中。支架與鍵結位置合在一起可構成奈米顆粒。支架可經合成以便包括，且一旦合成則可包括多於一種用於接附的化學性質或結構類型。亦即，其可經合成以包括或經修飾以包括接附至模板多核苷酸之單一位置，外加對應於輔助鍵結位置、化學性質或結構不同於單一模板多核苷酸鍵結位置的一或多個額外鍵結位置。
支架可包括不對稱聚合物，其中數個聚合物鏈自支架核心延伸，支架核心亦包括用於模板多核苷酸之不同結合位置。直鏈或分支鏈之聚合物鏈可自支架核心延伸，輔助鍵結位置在聚合物上，且相對於輔助鍵結位置具有正交鍵結化學之另一鍵結位置存在於支架核心上以用於鍵結至單一模板多核苷酸。在一實例中，支架可包括核心，含丙烯醯胺單體之雜聚物或均聚物自核心延伸，雜聚物或均聚物包括輔助鍵結位置，及具有不同鍵結化學用於鍵結模板多核苷酸的另一鍵結位置。在一實例中，支架核心可包括用於兩個或三個直鏈或分支鏈聚合物之接附點。
在一實例中，支架可包括分別連接至支架核心的兩個或三個直鏈或分支鏈聚合物。支架之一非限制性實例為式I化合物：
Figure 02_image001
， 各X為式II化合物：
Figure 02_image003
， 其中R2 選自式IIIa：
Figure 02_image005
，其中R5 選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
Figure 02_image015
、及
Figure 02_image017
，x為在1至2,000範圍內之整數，且y為在1至10,000範圍內之整數，且x:y之比可為大致10:90至大致1:99，且其中各Rz 獨立地為H或C1-4 烷基、及式IIIb：
Figure 02_image019
，其中R5 選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
Figure 02_image015
、及
Figure 02_image017
，y為在1至2,000範圍內之整數，且x及z為總和在1至10,000範圍內之整數，且(x:y):z之比可為大致(85):15至大致(95):5，且其中各Rz 獨立地為H或C1-4 烷基，R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包括經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的輔助位置。在前述實例中之任一者中，三硫代碳酸酯基
Figure 02_image040
可視情況經直接鍵、-CH2 -鍵聯、-S-鍵聯、-N-鍵聯或-O-鍵聯置換。
在另一實例中，在R2 為式IIIa化合物
Figure 02_image005
時，y可為0且x可為1至2,000之整數。
在一實例中，R1 包括胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫鍵鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置或轉肽酶-偶聯鍵結位置。在一特定非限制性實例中，R1 包括胺基、四
Figure 109145765-A0101-12-01
基或二苯并環辛烯基。
在一實例中，各R3 可包括胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫鍵鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置或轉肽酶-偶聯鍵結位置。在一特定非限制性實例中，各R3 包括疊氮基。
在一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image065
。
在另一實例中，X可包括
Figure 02_image067
。在另一實例中，X可包括
Figure 02_image069
。在另一實例中，X可包括
Figure 02_image071
。
在另一實例中，R1 鍵結至模板多核苷酸，且一或多個R3 鍵結至輔助物，諸如輔助寡核苷酸。在另一實例中，輔助寡核苷酸接附至作為模板多核苷酸之複本或與模板多核苷酸互補的核苷酸序列。
支架之另一非限制性實例為式IV化合物
Figure 02_image021
， 各X為式V化合物：
Figure 02_image073
， 其中R2 選自式VIa：
Figure 02_image024
及式VIb：
Figure 02_image076
其中p為選自1至20之整數，且R5 包括用於鍵結輔助寡核苷酸之輔助位置，R3 選自直接鍵、
Figure 02_image028
、
Figure 02_image030
、
Figure 02_image032
、
Figure 02_image034
、
Figure 02_image036
、及
Figure 02_image038
，m為1至2,000之整數且n為1至10,000之整數，R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包括經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的輔助位置。在前述實例中之任一者中，三硫代碳酸酯基
Figure 02_image040
可視情況經直接鍵、-CH2 -鍵聯、-S-鍵聯、-N-鍵聯或-O-鍵聯置換。
在一實例中，R1 包括胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫鍵鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置或轉肽酶-偶聯鍵結位置。在另一實例中，R1 包括纏繞線圈鍵結位置或抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。在一特定非限制性實例中，R1 包括胺基、四
Figure 109145765-A0101-12-01
基或二苯并環辛烯基。
在一實例中，各R5 可包括胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫鍵鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置或轉肽酶-偶聯鍵結位置。在另一實例中，各R5 包括纏繞線圈鍵結位置或抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。在一特定非限制性實例中，各R5 包括疊氮基。
在一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image085
。
在一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image087
其中R6 選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
Figure 02_image015
及
Figure 02_image017
。
在另一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image095
。
在另一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image097
。
在另一實例中，R1 鍵結至模板多核苷酸，且一或多個R5 鍵結至輔助物，諸如輔助寡核苷酸。在另一實例中，輔助寡核苷酸接附至作為模板多核苷酸之複本或與模板多核苷酸互補的核苷酸序列。
在另一實例中，支架核心可為或可源自前驅三
Figure 109145765-A0101-12-01
分子。支架之一非限制性實例為式IV化合物：
Figure 02_image042
， 各X為式VIII化合物：
Figure 02_image044
， 其中y為1至20之整數，R2 選自式IXa：
Figure 02_image024
及式IXb：
Figure 02_image047
其中p為選自1至20之整數，且R5 包括用於鍵結輔助寡核苷酸之輔助位置，R3 選自直接鍵、
Figure 02_image028
、
Figure 02_image030
、
Figure 02_image032
、
Figure 02_image034
、
Figure 02_image036
、及
Figure 02_image038
，m為1至2,000之整數且n為1至10,000之整數，R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至支架的單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包括經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的輔助位置。在前述實例中之任一者中，三硫代碳酸酯基
Figure 02_image040
可視情況經直接鍵、-CH2 -鍵聯、-S-鍵聯、-N-鍵聯或-O-鍵聯置換。
在一實例中，R1 包括胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫鍵鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置或轉肽酶-偶聯鍵結位置。在另一實例中，R1 包括纏繞線圈鍵結位置或抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。在一特定非限制性實例中，R1 包括胺基、四
Figure 109145765-A0101-12-01
基或二苯并環辛烯基。
在一實例中，各R5 可包括胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫鍵鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置或轉肽酶-偶聯鍵結位置。在另一實例中，各R5 包括纏繞線圈鍵結位置或抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。在一特定非限制性實例中，各R5 包括疊氮基。
在一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image102
。
在另一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image104
其中R6 選自
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
、
Figure 02_image013
Figure 02_image015
及
Figure 02_image017
。
在另一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image108
。
在另一特定非限制性實例中，支架包括以下結構（其中為描繪簡單起見，僅完整繪製一個X，但另外兩個X與完整繪製的X具有相同結構）：
Figure 02_image110
。
在另一實例中，R1 鍵結至模板多核苷酸，且一或多個R5 鍵結至輔助物，諸如輔助寡核苷酸。在另一實例中，輔助寡核苷酸接附至作為模板多核苷酸之複本或與模板多核苷酸互補的核苷酸序列。
可使用可控自由基聚合（controlled radical polymerization；CRP）方法自支架核心生長聚合物鏈。可藉由可逆加成碎斷鏈轉移（Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer；RAFT）聚合方法、原子轉移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization；ATRP）方法或氮氧調控自由基聚合（nitroxide-mediated radical polymerization；NMP）方法自支架核心生長聚合物。在另一實例中，可合成聚合物，接著將其鍵結至支架核心。CRP方法可包括嚴格控制接附至支架核心之聚合物的聚合度（degree of polymerization；DP），且因此控制聚合物分子量及奈米顆粒大小。舉例而言，可使用之DP為約100/鏈、約150/鏈、約200/鏈、約250/鏈、約300/鏈、約350/鏈、約400/鏈、約450/鏈、約500/鏈、約550/鏈、約600/鏈、約650/鏈、約700/鏈、約750/鏈，約800/鏈、約850/鏈、約900/鏈、約950/鏈、約1,000/鏈、約1,050/鏈、約1,100/鏈、約1,150/鏈、約1,200/鏈、約1,250/鏈、約1,300/鏈、約1,350/鏈、約1,400/鏈、約1,450/鏈、約1,500/鏈、約1,550/鏈、約1,600/鏈、約1,650/鏈、約1,700/鏈、約1,750/鏈、約1,800/鏈、約1,850/鏈、約1,900/鏈、約1,950或約2,000/鏈。在一些實例中，在自支架核心生長第一此類聚合物之後，可藉由RAFT方法，如「活」RAFT聚合方法自第一聚合物進一步延伸第二此類聚合物。
在另一實例中，支架可包括樹枝化基元（dendron），其中組成重複直至包括離胺酸胺基酸，且其中離胺酸為分支點，藉由在緊接上游代之離胺酸的胺基酸α胺基的羧酸之間形成肽鍵，且在緊接上游代之離胺酸之ε胺基末端之間形成異肽鍵發生聚合。離胺酸從而充當樹枝狀聚合物結構中之分支點。在一實例中，樹枝狀聚合物之核心單元可包括離胺酸。舉例而言，核心單元離胺酸之羧酸可接附至單一模板多核苷酸鍵結位置，而α胺基及ε胺基可分支且接附至下游胺基酸。舉例而言，半胱胺酸可接附至核心離胺酸，提供單一硫醇模板多核苷酸鍵結位置。在其他實例中，其他胺基酸、經修飾之胺基酸或其他結構可自核心離胺酸延伸以提供單一模板多核苷酸鍵結位置。樹枝化基元最下游支鏈之端基可包括輔助鍵結位置。舉例而言，輔助鍵結位置可包括樹枝化基元之末端代之離胺醯基α胺基及ε胺基。如本文所用，術語下游及上游係指相對於樹枝化基元之核心單元沿分支之鏈的方向，其中上游意謂沿核心單元方向且下游意謂沿分支鏈之端單元方向。樹枝化基元之代數可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多。
在一實例中，上游離胺酸經由其α胺基及ε胺基接附至兩個下游離胺酸。此類下游離胺酸各自可同樣經由利用其α胺基及ε胺基形成肽鍵及異肽鍵接附至另外兩個離胺酸，產生具有離胺酸組成性重複單元之樹枝化基元，離胺酸組成性重複單元各自經由其上游羧酸接附至上游離胺酸之胺基且經由其胺基接附至兩個下游離胺酸。
在另一實例中，支架可包括第一多肽序列，多肽中包括一或多個離胺酸殘基。一或多個此類離胺酸可經由其ε胺基形成與下一多肽之異肽鍵，且經由其α胺基形成與多肽中相鄰胺基酸之肽鍵。此類下一多肽亦可為或包括一或多個離胺酸，且下一多肽之一或多個此類離胺酸可經由其ε胺基形成與額外多肽之異肽鍵，且經由其α胺基形成與下一多肽中相鄰胺基酸之肽鍵。此類額外多肽同樣可包括一或多個離胺酸，形成與一或多個其他多肽之一或多個異肽鍵，以此類推。可進一步包括具有連續離胺酸分支點之連續多核苷酸。在此實例中，支架包括以分支鏈形式彼此接附之多肽，其連接於離胺酸殘基處。第一多肽序列可包括或接附至單一模板多核苷酸鍵結位置，且最後的多肽（例如下一、額外、其他或後續多肽，其不包括形成與連續多肽之異肽鍵的離胺酸）可包括最後多肽的輔助鍵結位置（例如在N末端胺基酸之末端胺基上、最後多肽之離胺酸的ε胺基酸上，或兩者上）。
用於接附至支架之模板多核苷酸可具有包括用於以SBS方法定序的任何適合長度。舉例而言，模板多核苷酸可為約50個核苷酸長、約75個核苷酸長、約100個核苷酸長、約125個核苷酸長、約150個核苷酸長、約175個核苷酸長、約200個核苷酸長、約225個核苷酸長、約250個核苷酸長、約275個核苷酸長、約300個核苷酸長、約325個核苷酸長、約350個核苷酸長、約375個核苷酸長、約400個核苷酸長、約425個核苷酸長、約450個核苷酸長、約475個核苷酸長、約500個核苷酸長、約525個核苷酸長、約550個核苷酸長、約575個核苷酸長、約600個核苷酸長、約625個核苷酸長、約650個核苷酸長、約675個核苷酸長、約700個核苷酸長、約725個核苷酸長、約750個核苷酸長、約775個核苷酸長、約800個核苷酸長、約825個核苷酸長、約850個核苷酸長、約875個核苷酸長、約900個核苷酸長、約925個核苷酸長、約950個核苷酸長、約975個核苷酸長、約1,000個核苷酸長、約1,100個核苷酸長、約1,200個核苷酸長、約1,300個核苷酸長、約1,40個核苷酸長、約1,500個核苷酸長、約1,600個核苷酸長、約1,700個核苷酸長、約1,800個核苷酸長、約1,900個核苷酸長、約2,000個核苷酸長或更長。
單一模板多核苷酸或輔助物（例如輔助寡核苷酸、輔助組成物或輔助結構）接附至支架可藉由在支架及模板多核苷酸或輔助物上包括彼此互補之部分或結構來實現，彼此互補意謂其經組態以彼此共價或非共價結合，在其間形成接附。其可針對共價結合互補或針對非共價結合互補。支架可包括單一模板位置，其具有與模板多核苷酸互補之部分或結構，或具有接附至模板多核苷酸之部分或結構（單一模板位置）。支架亦可包括或接附至與輔助物互補之其他部分或結構，或具有接附至輔助物之部分或結構（輔助位置）。應避免接附至模板多核苷酸之部分或結構與輔助位置之部分或結構之間的交叉反應性，以防止多於一種模板多核苷酸接附至支架。亦應避免接附至輔助物之部分或結構與單一模板位置之部分或結構之間的交叉反應性，以防止單一模板位置由輔助物佔據，該佔據阻止單一模板多核苷酸與其接附。在一些實例中，可藉由以化學方式阻斷單一模板位置或輔助位置同時分別地，輔助物結合至輔助位置或單一模板多核苷酸接附至單一模板位置，接著解阻斷未佔據位置以准許單一模板多核苷酸或輔助物與其接附，避免此類交叉反應性。
互補結合搭配物之非排他性清單呈現於表1中：
鍵結位置 （a）支架接附的鍵結位置或（b）模板多核苷酸或輔助物上的示例部分/結構    （a）模板多核苷酸或輔助物或（b）支架接附的鍵結位置上的示例部分/結構
胺-NHS 胺基，-NH2 N-羥基丁二醯亞胺基酯
Figure 02_image112
胺-亞胺基酯 胺基，-NH2 亞胺基酯
Figure 02_image114
胺-五氟苯基酯 胺基，-NH2 五氟苯基酯，
Figure 02_image116
胺-羥甲基膦 胺基，-NH2 羥甲基膦
Figure 02_image118
胺-羧酸 胺基，-NH2 羧酸基，-C(=O)OH（例如在由碳二亞胺，諸如EDC（1-乙基-3-(-3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽）或DCC（N',N'-二環己基碳二亞胺）活化羧酸，使得活化的羧酸可與胺基形成醯胺鍵之後）
硫醇-順丁烯二醯亞胺 硫醇，-SH 順丁烯二醯亞胺
Figure 02_image120
硫醇-鹵乙醯基 硫醇，-SH 鹵乙醯基（例如碘乙醯基或其他鹵乙醯基）
Figure 02_image122
硫醇-吡啶基二硫化物 硫醇，-SH 吡啶基二硫化物
Figure 02_image124
硫醇-硫代磺酸酯 硫醇，-SH 硫代磺酸酯
Figure 02_image126
硫醇-乙烯基碸 硫醇，-SH 乙烯基碸
Figure 02_image128
醛-醯肼 醛，-C(=O)H 醯肼
Figure 02_image130
醛-烷氧基胺 醛，-C(=O)H 烷氧基胺
Figure 02_image132
羥基-異氰酸酯 羥基，-OH 異氰酸酯
Figure 02_image133
疊氮-炔 疊氮，-N3 炔
Figure 02_image135
疊氮-膦 疊氮，-N3 膦，例如：
Figure 02_image137
疊氮-環辛炔 疊氮，-N3 環辛炔，例如二苯并環辛炔
Figure 02_image139
或BCN（雙環[6.1.0]壬炔）
Figure 02_image141
疊氮-降莰烯 吖
Figure 109145765-A0101-12-01
，-N3 		降莰烯
Figure 02_image143
反式環辛烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
 反式環辛烯
Figure 02_image145
 四
Figure 109145765-A0101-12-01
，例如苯甲基-甲基四
Figure 109145765-A0101-12-01
：
Figure 02_image147
降莰烯-四
Figure 109145765-A0101-12-01
 降莰烯
Figure 02_image143
 四
Figure 109145765-A0101-12-01
，例如苯甲基-四
Figure 109145765-A0101-12-01
Figure 02_image149
肟 醛或酮（例如由磷酸吡哆醛轉化為醛或酮之多肽的胺基或N末端） 烷氧基胺
SpyTag-SpyCatcher  SpyTag：胺基酸序列AHIVMVDAYKPTK（SEQ ID NO:1）  SpyCatcher胺基酸序列： MKGSSHHHHHHVDIPTTENLYFQGAMVDTLSGLSSEQGQSGDMTIEEDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATK（SEQ ID NO:2）
 SNAP-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤  SNAP-tag（O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶） O6 -苯甲基鳥嘌呤
Figure 02_image150
 CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶  CLIP-tag（經修飾之O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶） O2 -苯甲基胞嘧啶
Figure 02_image152
轉肽酶-偶聯 -Leu-Pro-X-Thr-Gly -Gly(3-5)
前述中之任一者可添加至或包括於如本文所揭示之支架中，以便接附至模板多核苷酸或輔助物，諸如輔助寡核苷酸，該模板多核苷酸或輔助物可包括或經修飾以包括前述對之互補部分或結構以便鍵結至支架。
可使用用於在此類互補部分或結構對之間添加或形成鍵的任何適合生物綴合（bioconjugation）方法。經修飾之核苷酸可為可商購的，其具有此類互補部分或結構對之實例之一者或另一者的實例，且用於將此類部分或結構之實例中之一或多者包括於，或接附或包括至聚合物、核苷酸或多核苷酸的方法亦為已知的。亦可能可商購雙官能連接分子，其在一端具有來自表1中所列出之一個鍵結搭配物互補對的部分或結構，且具有來自表1中所列出之另一鍵結搭配物互補對的部分或結構。接附至前述特徵中之任一者，以便提供用於在此類前述特徵中之任一者之間鍵結的部分或結構的支架、模板多核苷酸或輔助物之部分或結構，或寡核苷酸或多肽可結合至此種連接子之一端，使得初始部分或結構經另一者，亦即存在於連接子之另一端上的部分或結構有效置換。
經修飾之胺基酸可為可商購的，其具有此類互補部分或結構對之實例之一者或另一者的實例，且用於將此類部分或結構之實例中之一或多者包括於或接附至胺基酸或多肽的方法亦為已知的。已知用於在此類互補部分或結構對之成員之間形成鍵的方法。因此，可將此類互補部分或結構添加至或包括於支架及模板多核苷酸或支架及輔助物中，以形成鍵結位置且准許其間之接附。
如本文所用，術語「多肽」意欲意謂由肽鍵結合在一起之胺基酸鏈。術語「蛋白質」與「多肽」可互換使用。多肽可包括由肽鍵彼此結合之數個胺基酸的序列，且胺基酸之數目可為約2或更多、約5或更多、約10或更多、約15或更多、約20或更多、約25或更多、約30或更多、約35或更多、約40或更多、約45或更多、約50或更多、約55或更多、約60或更多、約65或更多、約70或更多、約75或更多、約80或更多、約85或更多、約90或更多、約95或更多、約100或更多、約110或更多、約120或更多、約130或更多、約140或更多、約150或更多、約160或更多、約170或更多、約180或更多、約190或更多、約200或更多、約225或更多、約250或更多、約275或更多、約300或更多、約325或更多、約350或更多、約375或更多、約400或更多、約425或更多、約450或更多、約475或更多、約500或更多、約550或更多、約600或更多、約650或更多、約700或更多、約750或更多、約800或更多、約850或更多、約900或更多、約950或更多、約1000，或更高數目。
在一些情況下，多肽或蛋白質可採用結構或三維構形以促進或准許鍵結至另一鍵結搭配物，諸如亦採用有利於此類鍵結之三維結構的另一多肽，或其他非蛋白質鍵結搭配物。多肽亦可採用有利於在其他受質多肽或其他分子上進行酶反應，或以便於充當另一酶或其他反應之受質的三維構形。多肽亦可採用使得一或多個位置，諸如胺基末端、羧基末端、胺基酸之側基或對胺基酸之修飾對於與另一分子鍵結而言可接近的三維構形。
各種生物綴合化學可用於將模板多核苷酸接附至支架。可將能夠與互補化學部分形成共價綴合之化學部分包括於或添加至此種位置中，該互補部分可接附至模板多核苷酸或包括於模板多核苷酸中。模板多核苷酸接著可與支架綴合，諸如經由互補化學部分之間的共價接附。
在另一實例中，支架可包括或接附至作為單一模板位置，能夠形成與另一多肽序列或其他化學部分之共價接附的多肽序列。接著可將此類其他多肽或其他化學部分包括於模板多核苷酸中或接附至模板多核苷酸，使得支架之單一模板位置與模板多核苷酸可彼此共價鍵結。可替代地，模板多核苷酸可具有第一此類多肽序列，且支架之單一模板位置可具有能夠共價鍵結至模板多核苷酸之多肽序列的此類其他多肽序列或其他化學部分。此類對之非限制性實例包括SpyTag/SpyCatcher系統、Snap-tag/O6 -苯甲基鳥嘌呤系統及CLIP-tag/O2 -苯甲基胞嘧啶系統。
可獲得SpyTag/SpyCatcher系統之互補對的胺基酸序列及編碼其的多核苷酸。序列之實例提供於表1中。SpyTag序列及SpyCatcher序列之數個胺基酸位置突變可用於包括於重組多肽中。Snap-tag為功能性O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶，且CLIP-tag為Snap-tag之經修改版本。編碼Snap-tag、CLIP-tag、SpyCatcher之核苷酸序列可能可商購以便次選殖且包括於經工程改造之多肽序列中。
可替代地，支架之單一模板位置及模板多核苷酸上用於共價接附的互補對可經由酶催化形成共價鍵彼此共價接附。舉例而言，支架之單一模板位置及模板多核苷酸可包括能夠藉由轉肽酶介導之偶聯彼此共價接附的模體，例如一者上LPXTG之胺基酸序列及另一者上之寡甘胺酸親核序列（具有例如3至5個甘胺酸之重複序列）。接著可進行轉肽酶介導之轉肽作用，以引起支架與模板多核苷酸在單一模板位置處共價接附。
在另一實例中，支架可包括用於在單一模板位置處非共價接附單一模板多核苷酸的區。舉例而言，支架可包括用於藉由華特生-克里克（Watson-Crick）鹼基配對雜合至模板多核苷酸之端的寡核苷酸。在另一實例中，支架及模板多核苷酸可包括或接附至互補肽結合位置。舉例而言，支架及模板多核苷酸可包括或接附至可作為纏繞線圈模體之互補對彼此結合的肽序列。纏繞線圈模體為一些多肽之結構特徵，其中兩個或更多個多肽股各自形成α螺旋二級結構，且α螺旋纏繞在一起以形成緊密非共價鍵。纏繞線圈序列可包括七聯體重複序列，亦即七個胺基酸HPPHCPC之重複模式（其中H指示疏水性胺基酸，C典型地表示帶電胺基酸且P表示極性親水性胺基酸）。七聯體重複序列之一實例發現於白胺酸拉鏈纏繞線圈，其中七聯體之第四胺基酸常常為白胺酸。
支架可包括或接附至形成纏繞線圈鍵結對之一部分的一個胺基酸序列，且模板多核苷酸可接附至形成纏繞線圈鍵結對之另一部分的另一胺基酸序列，其與作為或接附至支架的胺基酸序列互補，使得兩者彼此接附。舉例而言，支架可共價接附至形成纏繞線圈鍵結對之一部分的一個胺基酸序列，且模板多核苷酸可接附至形成纏繞線圈鍵結對之另一部分的另一胺基酸序列，其與作為或接附至支架之胺基酸序列互補，使得兩者彼此接附。
在另一實例中，支架及模板多核苷酸可各自包括或接附至非共價結合在一起的肽對之其他互補搭配物。一實例包括生物素-抗生物素蛋白結合對。生物素及抗生物素蛋白肽（諸如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素（streptavidin）與中性抗生物素蛋白（neutravidin），除非另外具體說明，否則在本文中其皆統稱為「抗生物素蛋白」）彼此形成強非共價鍵。此類對之一部分，無論生物素之結合部分抑或抗生物素蛋白之結合部分，可為支架或模板多核苷酸之一部分或接附至支架或模板多核苷酸，互補部分相對應地為支架或模板多核苷酸之一部分或接附至支架或模板多核苷酸，准許在其間非共價接附。
大量方法可用於將一或多種生物素部分包括於或將一或多種生物素部分添加至DNA分子、模板多核苷酸、支架、寡DNA、其他多肽或其他組成物以便如本文所揭示將分子鍵結在一起（諸如模板多核苷酸鍵結至支架，或輔助物鍵結至支架）。舉例而言，可商購用於由聚合酶併入至DNA分子中的經生物素標記之核苷酸，且可商購用於將生物素部分添加至多核苷酸或多肽中之套組。亦可將生物素殘基添加至胺基酸或經修飾之胺基酸，或核苷酸或經修飾之核苷酸中。表1中所示之連接化學亦可用於將生物素基團添加至蛋白質，諸如在羧酸基、胺基或硫醇基上。數種生物素連接酶亦可用於對諸如多肽（例如對多肽中所包括的AviTag胺基酸序列GLNDIFEAQKIEWHE（SEQ ID NO:4）的離胺酸殘基）進行酶靶向生物素標記。經基因工程改造之抗壞血酸過氧化酶（ascorbate peroxidase；APEX）亦可用於修飾生物素以准許對富電子胺基酸，諸如酪胺酸，及可能的色胺酸、半胱胺酸或組胺酸進行生物素標記。
在另一實例中，包括胺基酸序列DSLEFIASKLA（SEQ ID NO:5）之多肽可經生物素標記（在序列中存在的兩個S殘基中較靠近N末端者處），其為針對與輔酶A（coenzyme A；CoA）綴合之小分子與其進行Sfp磷醯基泛醯巰基轉移酶催化的共價接附的受質。舉例而言，包括此序列之多肽可經由CoA-生物素綴合物與其共價接附而經生物素標記。此系統亦可用於接附表1中所鑑別之許多其他類型的鍵結部分或結構，其用於為支架產生鍵結位置以鍵結至DNA分子或多肽或如本文所揭示之其他分子。舉例而言，與表1中所鑑別之反應性對部分中之任一者綴合的CoA可由Sfp磷醯基泛醯巰基轉移酶共價接附至含有以上鑑別之序列的多肽，從而准許包括互補鍵結搭配物之另一組成物與其鍵結。
其他酶可用於將鍵結部分添加至多肽中。舉例而言，類脂酸連接酶可添加類脂酸分子，或包括表1中所鑑別之鍵結部分，諸如炔或疊氮基的經修飾之類脂酸分子，可共價連接至存在於多肽中所包括的胺基酸序列DEVLVEIETDKAVLEVPGGEEE（SEQ ID NO:6）或GFEIDKVWYDLDA（SEQ ID NO:7）中之離胺酸之側基的胺。在另一實例中，支架、模板多核苷酸或其中包括或意欲與其鍵結的其他多肽或DNA分子可包括或接附至活性絲胺酸水解酶。氟膦酸酯分子共價連接至絲胺酸水解酶活性位置中之絲胺酸殘基。氟膦酸酯分子之可商購類似物包括表1中所鑑別之鍵結部分，諸如疊氮基或去硫生物素基團（可結合至抗生物素蛋白之生物素類似物）。因此，此類基團可共價接附至絲胺酸水解酶，絲胺酸水解酶包括於或接附至用於或接附至如本文所揭示之支架的多肽或DNA分子，且可藉由使用接附適用於在此類蛋白質上產生用於來自表1之互補鍵結搭配物（諸如用於疊氮-炔、疊氮-膦、疊氮-環辛炔、疊氮-降莰烯或去硫生物素-抗生物素蛋白鍵結）之鍵結位置的經修飾氟膦酸酯分子，向其中共價添加此類鍵結部分或結構。
對組成物進行生物素標記以促進鍵結至包括抗生物素蛋白序列之多肽（諸如包括於另一組成物中或接附至另一組成物之抗生物素蛋白多肽），或以其他方式將官能基添加至多肽中，作為支架之一部分，接附至支架，輔助物之一部分，或接附至輔助或模板多核苷酸，以便支架與模板多核苷酸之間的鍵結或支架與輔助之間的鍵結的前述方法中之任一者可用於准許或促進如本文所揭示之此等組分之間的鍵結。
為了接附至支架之單一模板位置，模板多核苷酸可具有向其中添加的互補接附部分或結構。在一實例中，在庫樣品製備期間，可製備複數個模板多核苷酸以供定序。通常，在此類樣品製備期間，庫樣品之模板多核苷酸經修飾以包括除作為待定序之庫的一部分已包括於其中之序列之外的特定核苷酸序列。此類添加的核苷酸序列可起各種作用中之任一者，包括用於後續鑑別模板多核苷酸或接附至SBS基板表面，作為接種方法之一部分。根據本發明，此類模板多核苷酸製備亦可包括與其接附或包括於其中的互補接附部分或結構。
舉例而言，製備模板多核苷酸可包括將核苷酸序列接附於模板多核苷酸中，諸如自模板多核苷酸之端中之一者延伸，且該序列與另一序列互補，該另一序列包括於支架之單一模板位置中或接附至支架之單一模板位置。歸因於華特生-克里克鹼基配對之雜合引起兩者之間鍵結。在另一實例中，輔助物，諸如輔助寡核苷酸可經修飾以准許與其互補的部分或結構共價接附至其。舉例而言，可包括對包括於諸如輔助寡核苷酸之輔助物中之核苷酸的修飾，諸如磷酸基、鹼基或糖上之修飾，以提供用於共價接附至支架之輔助位置的位置。支架之輔助位置可反過來包括准許接附至諸如寡DNA輔助物之輔助物的互補部分或結構。在一實例中，在樣品製備期間，經修飾以包括接附部分之核苷酸包括於添加至模板多核苷酸中的多核苷酸序列中，該接附部分與支架之輔助鍵結位置的互補部分接附。可商購帶有此類化學部分之大量經修飾之核苷酸，以便將組成物共價接附至已併入有此類經修飾之核苷酸的DNA分子。
在另一實例中，諸如在樣品製備期間，可藉由將多肽接附至模板多核苷酸來對模板多核苷酸進行修飾。此類多肽可具有胺基酸序列及/或結構以與支架之單一模板位置的胺基酸結構互補，使得模板多核苷酸可經由其接附的多肽接附至支架之單一模板位置。用於在支架之單一模板位置與模板多核苷酸之間共價或非共價鍵結的多肽對之實例在上文提供且包括作為非限制性實例，用於形成彼此纏繞線圈接附的具有七聯體重複序列之α螺旋胺基酸序列、生物素-抗生物素蛋白結合對、SpyTag/SpyCatcher系統、用於轉肽酶介導之轉肽作用鍵結的LPXTG/寡甘胺酸親核對。在另一實例中，在樣品製備期間，模板多核苷酸可經修飾以包括Snap-tag序列或O6 -苯甲基鳥嘌呤中之一者，且支架之單一模板位置可包括兩者中之另一者，以准許根據Snap-tag/O6 -苯甲基鳥嘌呤系統在兩者之間共價鍵結。在另一實例中，在樣品製備期間，模板多核苷酸可經修飾以包括CLIP-tag序列或O2 -苯甲基胞嘧啶中之一者，且支架之單一模板位置可包括兩者中之另一者，以准許根據CLIP-tag/O2 -苯甲基胞嘧啶系統，及CLIP-tag/O2 -苯甲基胞嘧啶系統在兩者之間共價鍵結。
前述實例中之任一者可同樣用於將一或多種輔助物接附至支架之一或多個輔助位置。為了接附至DNA支架或多肽支架之輔助位置，輔助物（諸如輔助寡DNA）可具有向其中添加的互補接附部分或結構。在一實例中，核苷酸序列可包括於輔助物中或接附至輔助物，且可包括與其接附或包括於其中的互補接附部分或結構。
在另一實例中，輔助物（諸如輔助寡DNA）可包括或接附至核苷酸序列，諸如在輔助寡DNA情況下自核苷酸序列之端中之一者延伸，且該序列與另一序列互補，該另一序列包括於支架之輔助位置中或接附至支架之輔助位置。互補序列之間的華特生-克里克鹼基配對引起兩者之間雜合及鍵結，及因此輔助物接附至輔助鍵結位置。在另一實例中，輔助物可包括其共價修飾以准許與其互補的部分或結構共價接附至其。舉例而言，可包括對包括於模板多核苷酸中之核苷酸的修飾，諸如磷酸基、鹼基或糖上之修飾，以提供用於共價接附至支架之輔助位置的位置。支架之輔助位置可反過來包括准許接附至諸如寡DNA輔助物之輔助物的互補部分或結構。在一實例中，在添加至或包括於諸如輔助寡DNA中之輔助物中的多核苷酸序列中，可包括經修飾以包括接附部分以及支架之輔助鍵結位置的互補部分的核苷酸，以准許在其之間鍵結。可商購帶有此類化學部分之大量經修飾之核苷酸，以便將組成物共價接附至已併入有此類經修飾之核苷酸的DNA分子。
在另一實例中，可藉由將多肽接附至輔助物來對輔助物進行修飾。此類多肽可具有胺基酸序列及結構以與支架之輔助位置的胺基酸結構互補，使得輔助物可經由其接附的多肽接附至支架之輔助位置。用於在輔助位置與輔助物之間共價或非共價鍵結的多肽對之實例在上文提供且包括作為非限制性實例，用於形成彼此纏繞線圈接附的具有七聯體重複序列之α螺旋胺基酸序列、生物素-抗生物素蛋白結合對、SpyTag/SpyCatcher系統、用於轉肽酶介導之轉肽作用鍵結的LPXTG/寡甘胺酸親核對。在另一實例中，輔助物，諸如輔助寡DNA可經修飾以包括Snap-tag序列或O6 -苯甲基鳥嘌呤中之一者，且支架之輔助位置可包括兩者中之另一者，以准許根據Snap-tag/O6 -苯甲基鳥嘌呤系統在兩者之間共價鍵結。在另一實例中，輔助物可能包括CLIP-tag序列或O2 -苯甲基胞嘧啶中之一者，且支架之輔助位置可包括兩者中之另一者，以准許根據CLIP-tag/O2 -苯甲基胞嘧啶系統在兩者之間共價鍵結。
在一實例中，單一模板多核苷酸可結合至支架之單一模板位置，且多個輔助核苷酸，諸如輔助寡DNA分子可結合至支架之輔助位置。此類寡DNA分子之實例可為用於在支架上進行簇聚的引子。作為習知簇聚方法之一部分，在基板表面上製得模板多核苷酸或其互補序列之複本。如上所解釋，在一些情況下，此類表面上簇聚可不利地導致形成一或多種多株簇。如本文所揭示，可諸如在溶液中在支架上進行簇聚，而不事先將支架接附至表面。在其他實例中，可將接附有單一模板多核苷酸之支架接附至基板表面，且接著可在基板表面上、支架上或支架上及基板表面上進行簇聚。
對於簇聚程序，諸如在樣品製備期間可對模板多核苷酸進行修飾以在其3'端及5'端中之一或兩者處包括一或多種核苷酸序列。接著可如本文所揭示，在支架上合成模板核苷酸及與模板核苷酸互補之核苷酸序列的一或多個複本，形成簇。此類支架上簇聚可引起單株簇形成。
舉例而言，模板多核苷酸可鍵結至單一模板接附位置，其中其5'端朝向支架定向且其3'端遠離鍵結至支架之位置定向。3'端可包括與第一引子中所包括之核苷酸序列互補的核苷酸序列。「引子」定義為充當DNA或RNA合成之起點的單股核酸序列（例如單股DNA或單股RNA）。引子可為任何數目的鹼基長且可包括多種非天然核苷酸。在一實例中，引子為短股，在20至40個鹼基，或10至20個鹼基範圍內。與模板多核苷酸之3'端互補的引子之複本可進一步接附至支架之輔助位置。
接著可進行聚合反應，其中模板多核苷酸之3'端經由華特生-克里克鹼基配對雜合至與其互補的支架結合之第一引子。聚合反應中之聚合酶可產生如接附至支架之模板多核苷酸的新生股互補序列，自模板多核苷酸之3'端所雜合至的支架接附之引子起始。接著可對模板多核苷酸及其互補序列進行解雜合。
模板多核苷酸之互補序列在該互補序列之3'端處可包括與第二引子序列互補的核苷酸序列。與模板多核苷酸之互補序列的3'端互補的第二引子之複本可進一步接附至支架之輔助位置。接著可進行第二聚合反應，其中模板多核苷酸之3'端經由華特生-克里克鹼基配對雜合至與其互補的支架結合之第一引子，且模板多核苷酸之互補序列的3'端經由華特生-克里克鹼基配對雜合至與其互補的支架結合之第二引子。第二聚合反應中之聚合酶可產生如接附至支架之模板多核苷酸的另一新生股互補序列，自模板多核苷酸之3'端所雜合至的支架接附之第一引子起始。且第二聚合反應中之聚合酶可進一步產生如接附至支架之模板多核苷酸的新生股複本，自先前聚合反應中聚合的模板之互補序列的3'端所雜合至的支架接附之第二引子起始。接著可對模板多核苷酸及其複本以及其互補序列進行解雜合。
接著可以迭代過程進行後續聚合反應。支架結合之模板多核苷酸及其複本的3'端雜合至與其互補的支架結合之第一引子，且支架結合的模板多核苷酸之互補序列的3'端雜合至與其互補的支架結合之第二引子。新生股由聚合酶聚合，在支架結合之第一及第二引子處起始，支架結合之模板多核苷酸及其互補序列以及其複本雜合至該等引子。在聚合後對股進行解雜合之後，進行連續聚合反應，從而使接附至支架的模板多核苷酸之複本及其互補序列的數目倍增。以此方式，模板多核苷酸之複本及互補序列經擴增，其中擴增的複本結合至支架，形成簇。如本文所揭示，與在習知SBS方法中在基板表面上進行的習知簇聚相對，此簇聚方法可諸如在溶液中在支架上進行。因為僅單一模板多核苷酸之複本及互補序列簇聚在支架上，所以單株簇存在於支架上。
在此類實例中，在處於或接附至模板多核苷酸之5'端的序列鍵結至單一模板位置，使模板多核苷酸之3'端遠離支架定向時，模板多核苷酸可藉由雜合至稱作模板位置引子的接附至單一模板位置或為單一模板位置之一部分的引子序列，鍵結至支架之單一模板位置。在一實例中，如藉由樣品製備方法製備的模板多核苷酸在其5'端可具有或接附至與模板位置引子互補的核苷酸序列。在與模板位置引子互補之此類核苷酸序列的3'，模板多核苷酸可包括對應於上述第二引子（第二引子為支架接附之引子，模板多核苷酸之互補序列的3'端可藉由互補華特生-克里克鹼基配對雜合至該引子）之核苷酸序列的核苷酸序列。在模板多核苷酸中包括此類序列意謂在聚合步驟期間合成的模板多核苷酸之互補序列將具有朝向其3'端的與此類第二引子之序列互補的多核苷酸序列。具有朝向模板多核苷酸之互補序列之3'端的此類序列使得在簇聚期間，在後續聚合反應過程中互補序列的3'端能夠雜合至此類第二引子。
在遠離結合至單一模板位置之模板多核苷酸之5'端定向的模板多核苷酸之3'端處，模板多核苷酸可包括與如上文所描述之第一引子互補的序列。如上文所描述，在第一聚合步驟期間，模板多核苷酸之3'端處的此類核苷酸序列可雜合至第一引子，接著聚合模板多核苷酸之新生互補序列。可能有利的是在雜合至模板位置引子之模板多核苷酸的一部分與包括第二引子之序列的模板多核苷酸中位於其3'的核苷酸序列之間，存在模板多核苷酸之互補序列之聚合的中斷。亦即，可能有利的是模板多核苷酸之互補序列在其3'端處具有與第二引子互補之序列。然而，若將與對應於第二引子之序列互補的核苷酸序列添加至模板多核苷酸之新生互補序列之後不存在聚合的中斷，則模板多核苷酸之互補序列的3'端將不終止於彼處。
舉例而言，若與模板位置引子互補之核苷酸序列位於與第二引子互補之序列的5'且與其相鄰，則模板多核苷酸之合成互補序列的3'端可包括模板位置引子中所包括的核苷酸序列。舉例而言，在聚合模板多核苷酸之互補序列時，DNA聚合酶可移動模板位置引子，使其不雜合至模板多核苷酸之5'端，且進行聚合，將與其對應之核苷酸序列添加至模板多核苷酸之互補序列的3'端。若此種結果使模板多核苷酸之互補序列的3'端在輔助位置處雜合至上述第二引子的能力減弱，則可能非吾人所樂見。
在一實例中，可能因此期望併入有模板多核苷酸之5'端的3'聚合中斷，其中模板多核苷酸之此類5'端藉由雜合至模板位置引子鍵結至單一模板位置。舉例而言，可包括連接子，諸如PEG連接子、烷基連接子或其他化學部分以將雜合至模板位置引子之核苷酸序列連接至模板多核苷酸之5'端。存在此種連接子，而非連續核苷酸序列連接，將阻止聚合酶將與對應於模板位置引子之核苷酸序列添加至模板多核苷酸之互補序列的3'端，其將實際上如可能所需，以與第二引子之核苷酸序列互補的核苷酸序列結束。
在其他實例中，在模板多核苷酸之3'端處，模板多核苷酸可具有或接附至與作為支架之單一模板位置的一部分或接附至支架之單一模板位置的引子（稱作模板位置引子）互補的多核苷酸序列。在將模板多核苷酸之3'端的此類序列或接附至其的序列雜合至模板位置引子之後，可進行聚合方法，其中DNA聚合酶進行聚合，形成與模板多核苷酸互補之新生多核苷酸，自模板位置引子起始。接著進行模板多核苷酸與支架接附的模板多核苷酸之互補序列的解雜合。遠離接附至支架之位置定向的支架接附的模板多核苷酸之互補序列的3'端可包括與上述第二引子序列（第二引子為支架接附之引子，模板多核苷酸之互補序列的3'端可藉由互補華特生-克里克鹼基配對雜合至該引子）互補的核苷酸序列。與模板多核苷酸之互補序列的3'端互補的第二引子之複本可進一步接附至支架之輔助位置。接著可進行第二聚合反應，其中模板多核苷酸之互補序列的3'端經由華特生-克里克鹼基配對雜合至與其互補的支架結合之第二引子。第二聚合反應中之聚合酶可產生模板多核苷酸之新生股複本（亦即，支架結合的模板多核苷酸之互補序列的互補序列），自先前聚合反應中聚合的模板之互補序列的3'端所雜合至的支架接附之第二引子起始。接著可進行解雜合步驟，以將支架結合的模板多核苷酸之互補序列與模板多核苷酸之複本彼此解雜合。
模板多核苷酸之複本在該複本之3'端處可包括與上述第一引子序列互補的核苷酸序列。上文所描述的與模板多核苷酸之複本的3'端互補的第一引子之複本可進一步接附至支架之輔助位置。接著可進行第三聚合反應，其中模板多核苷酸之複本的3'端經由華特生-克里克鹼基配對雜合至與其互補的支架結合之第一引子，且模板多核苷酸之互補序列的3'端經由華特生-克里克鹼基配對雜合至與其互補的支架結合之第二引子。第三聚合反應中之聚合酶可產生如接附至支架之模板多核苷酸的另一新生股互補序列，自模板多核苷酸之複本之3'端所雜合至的支架接附之第一引子起始。且第三聚合反應中之聚合酶可進一步產生模板多核苷酸的新生股複本，自先前聚合反應中聚合的模板之互補序列的3'端所雜合至的支架接附之第二引子起始。接著可進行解雜合步驟，其使模板多核苷酸之複本及互補序列彼此解雜合。
接著可以迭代過程進行後續聚合反應。支架結合的模板多核苷酸之複本的3'端雜合至與其互補的支架結合之第一引子，且支架結合的模板多核苷酸之互補序列的3'端雜合至與其互補的支架結合之第二引子。新生股由聚合酶聚合，在支架結合之第一及第二引子處起始，支架結合之模板多核苷酸及其互補序列以及其複本雜合至該等引子。在聚合之後進行股之解雜合，接著進行連續聚合反應，後接進一步解雜合。以此方式，模板多核苷酸之複本及互補序列經擴增，其中擴增的複本及互補序列結合至支架，形成簇。如本文所揭示，與在習知SBS方法中在基板表面上進行的習知簇聚相對，此簇聚方法可諸如在溶液中在支架上進行。因為僅單一模板多核苷酸之複本及互補序列簇聚在支架上，所以單株簇存在於支架上。
在一實例中，模板多核苷酸之端包括或接附至一核苷酸序列，其與包括於支架之單一模板位置中或接附至支架之單一模板位置的核苷酸序列（稱作第三模板位置引子）互補。在一實例中，模板多核苷酸之互補序列可在第三模板位置引子處起始在支架上合成。
在如本文所揭示之支架上簇聚的實例中，模板多核苷酸可根據本文所揭示之各種共價或非共價鍵中之任一者結合至支架的單一模板位置。舉例而言，模板多核苷酸之任一端可包括來自諸如表1中所鑑別之鍵結位置對的部分或結構，且同一對之互補部分或結構可存在於支架之單一模板位置處。接著可後繼連續輪次聚合，就像上文所描述一樣。舉例而言，結合至處於或朝向模板多核苷酸之5'端的支架之單一模板位置的模板多核苷酸之3'端可雜合至結合至支架之輔助位置的寡核苷酸引子，及由DNA聚合酶合成的其互補序列。接著可如上文所描述後繼連續輪次聚合，引起源自支架之輔助位置的模板多核苷酸之多個複本及其互補序列的聚合。因為僅單一模板多核苷酸結合至支架，支架具有僅單一模板多核苷酸位置，所以此類複本將構成支架上之單株簇。
在另一實例中，支架可接附至基板表面，諸如用於SBS程序之基板表面。舉例而言，支架之輔助位置可包括或為或接附至基板表面，或鍵結至基板表面之組成物所接附至的位置。在一實例中，基板表面可結合至引子，例如與作為非限制性實例，如上文所描述之第一引子或第二引子或兩者互補的引子之複本。此類互補引子可直接接附至基板表面，或可接附至經改質表面，諸如聚合物分子已接附至的表面（例如PAZAM或相關聚合物），其中引子接附至此類聚合物。前述第一引子及第二引子可接附至支架之輔助位置（直接，或經由聚合物，諸如如上文作為非限制性實例揭示之PAZAM或其他類PAZAM聚合物，或間隔子或其他組成物）。支架的或接附至支架的此類第一及第二引子可雜合至如接附至基板表面之與其互補的引子，從而將支架鍵結至基板表面。
如上文所論述之第一及第二引子的實例可包括現有SBS方法中所使用之引子。適合引子的具體實例包括P5及/或P7引子，其在由因美納公司（Illumina, Inc.）銷售之商業流槽表面上使用，用於在HiSeq™、HiSeqX™、MiSeq™、MiSeqDX™、MiNISeq™、NextSeq™、NextSeqDX™、NovaSeq™、Genome Analyzer™、ISEQ™及其他儀器平台上定序。且包括與如上文所揭示之第一或第二引子對應或互補之核苷酸序列的模板多核苷酸之一部分可具有例如與P5引子（包括AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC（SEQ ID NO:8）之核苷酸序列）、P7引子（包括CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT（SEQ ID NO:9）之核苷酸序列）或兩者對應或互補的序列，與如上文所提及之SBS平台中所使用之引子序列一致，或其他。
用於SBS方法之基板可包括作為非限制性實例，前述SBS平台或其他中任一者所使用之基板。作為非限制性實例，此種基板可為流槽。如本文所用，術語「流槽」意欲意謂具有可進行反應之腔室（亦即，流動通道）、用於將試劑遞送至腔室之入口及用於將試劑自腔室移出之出口的容器。在一些實例中，腔室使得能夠偵測腔室中發生的反應或信號。舉例而言，腔室可在腔室中包括使得可對陣列進行光學偵測的一或多個透明表面、光學標記分子或其類似物。如本文所用，「流動通道」或「流動通道區」可為界定於兩個接合組件之間的區域，其可選擇性接收液體樣品。在一些實例中，流動通道可界定於圖案化支撐物與蓋之間，且因此可與圖案化支撐物中所界定之一或多個凹陷成流體連通。在其他實例中，流動通道可界定於非圖案化支撐物與蓋之間。
如本文所用，術語「凹陷」係指圖案化支撐物中之離散凹入特徵，其表面開口由圖案化支撐物表面之間隙區完全包圍。凹陷在表面中其開口處可具有多種形狀中之任一者，包括例如圓形、橢圓形、正方形、多角形、星形（具有任何數目的頂點）等。與表面正交截取之凹陷的橫截面可為曲線、正方形、多角形、雙曲線、錐形、角形等。作為一實例，凹陷可為孔。此外如本文所用，「功能化凹陷」係指離散凹入特徵，其中接附有引子，在一些實例中引子由聚合物（諸如PAZAM或類似聚合物）接附至凹陷表面。
術語流槽「支撐物」或「基板」係指上面可添加表面化學之支撐物或基板。術語「圖案化基板」係指中間或上面界定凹陷之支撐物。術語「非圖案化基板」係指實質上平坦的支撐物。基板在本文中亦可被稱作「支撐物」、「圖案化支撐物」或「非圖案化支撐物」。支撐物可為晶圓、面板、矩形片、模或任何其他適合之組態。支撐物一般為剛性的且不溶於水性液體中。支撐物可對用於改質凹陷之化學物質呈惰性。舉例而言，支撐物可對用於形成聚合物塗層，用於接附引子（諸如接附至已沈積之聚合物塗層）等的化學性質呈惰性。適合支撐物之實例包括環氧矽氧烷、玻璃及改質或功能化玻璃、多面體寡聚矽倍半氧烷（polyhedral oligomeric silsequioxanes；POSS）及其衍生物、塑膠（包括丙烯酸類、聚苯乙烯及苯乙烯與其他材料之共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚胺基甲酸酯、聚四氟乙烯（諸如來自Chemours之TEFLON®）、環狀烯烴/環烯烴聚合物（cyclo-olefin polymer；COP）（諸如來自Zeon之ZEONOR®）、聚醯亞胺等）、耐綸、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化矽、熔融二氧化矽或基於二氧化矽之材料、矽酸鋁、矽及改質矽（例如硼摻雜p+矽）、氮化矽（Si3 N4 ）、氧化矽（SiO2 ）、五氧化鉭（TaO5 ）或其他氧化鉭（TaOx ）、氧化鉿（HaO2 ）、碳、金屬、無機玻璃或其類似物。支撐物亦可為玻璃或矽或基於矽之聚合物，諸如POSS材料，視情況表面處具有氧化鉭或另一陶瓷氧化物塗層。POSS材料可為Kejagoas等人, Microelectronic Engineering 86 (2009) 776-668中所揭示之POSS材料，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一實例中，凹陷可為孔，使得圖案化基板在其表面中包括孔陣列。孔可為微孔或奈米孔。各孔之大小特徵可由其容積、孔開口面積、深度及/或直徑界定。
各孔可具有能夠限制液體之任何容積。最小或最大容積可經選擇例如以適應流槽之下游用途所預期的通量（例如多重性）、解析度、分析物組成或分析物反應性。舉例而言，容積可為至少約1×10-3 μm3 、約1×10-2 μm3 、約0.1 μm3 、約1 μm3 、約10 μm3 、約100 μm3 或更大。可替代地或另外，容積可為至多約1×104 μm3 、約1×103 μm3 、約100 μm3 、約10 μm3 、約1 μm3 、約0.1 μm3 或更小。
可根據如上文關於孔容積所闡述之類似準則選擇表面上之各孔開口所佔據之面積。舉例而言，表面上各孔開口之面積可為至少約1×10-3 μm2 、約1×10-2 μm2 、約0.1 μm2 、約1 μm2 、約10 μm2 、約100 μm2 或更大。可替代地或另外，面積可為至多約1×103 μm2 、約100 μm2 、約10 μm2 、約1 μm2 、約0.1 μm2 、約1×10-2 μm2 或更小。各孔開口所佔據之面積可大於、小於以上指定之值，或介於該等值之間。
各孔之深度可為至少約0.1 μm、約1 μm、約10 μm、約100 μm或更大。可替代地或另外，深度可為至多約1×103 μm、約100 μm、約10 μm、約1 μm、約0.1 μm或更小。各孔14'之深度可大於、小於以上指定之值，或介於該等值之間。
在一些情況下，各孔之直徑可為至少約50 nm、約0.1 μm、約0.5 μm、約1 μm、約10 μm、約100 μm或更大。可替代地或另外，直徑可為至多約1×103 μm、約100 μm、約10 μm、約1 μm、約0.5 μm、約0.1 μm或更小（例如約50 nm）。直徑可為約150 nm、約200 nm、約250 nm、約300 nm、約350 nm、約400 nm、約450 nm、約500 nm、約550 nm、約600 nm、約650 nm、約700 nm、約750 nm、約800 nm、約900 nm、約950 nm、約1 μm、約1.25 μm、約1.5 μm、約1.74 μm、約2 μm、約2.25 μm、約2.5 μm、約2.75 μm、約3 μm、約3.25 μm、約3.5 μm、約3.75 μm、約4 μm、約4.25 μm、約4.5 μm、約4.75 μm、約5 μm、約5.25 μm、約5.5 μm、約5.75 μm、約6 μm、約6.25 μm、約6.5 μm、約6.75 μm、約7 μm、約7.25 μm、約7.5 μm、約7.75 μm、約8 μm、約8.25 μm、約8.5 μm、約8.75 μm、約9 μm、約9.25 μm、約9.5 μm或約9.75 μm。各孔之直徑可大於、小於以上指定之值，或介於該等值之間。如本文所用之術語奈米孔意欲意謂具有最大直徑為約1 μm或更小之圓形開口的孔。
應理解本文所提供之範圍包括陳述的範圍及陳述範圍內的任何值或子範圍。舉例而言，在約100 nm至約1 μm（1000 nm）範圍內應解釋為不僅包括約100 nm至約1 μm的明確所述限值，且亦包括個別值，諸如約708 nm、約945.5 nm等，及子範圍，諸如約425 nm至約825 nm、約550 nm至約940 nm等。另外，當「約」及/或「實質上」用以描述值時，其意謂涵蓋陳述值的較小變化（至多+/-10%）。
在一實例中，奈米顆粒之大小可使得奈米顆粒在諸如奈米孔之孔中的存在佔據孔容積之很大部分，而另一奈米顆粒無法同時佔據該孔。奈米顆粒之大小可參考基板表面中孔之已知大小設計或確定，使得其可進入不存在其他奈米顆粒之孔，但其向孔中的進入將由先前進入且仍存在於孔中之另一奈米顆粒的存在阻止。經大小設定以免能夠使超過兩個容納於孔的奈米顆粒可促進孔內簇的單株性。舉例而言，在習知SBS方法中，模板多核苷酸可在溶液中引入至以孔圖案化之流槽中，其濃度經校準以使模板多核苷酸將接種（亦即，結合，諸如結合至直接或經由表面接附的聚合物接附至孔的引子，該引子與模板核苷酸之一部分的核苷酸序列互補的）之孔的數目達到最大，但足夠低以儘可能使多株簇之形成減至最少。
在一實例中，流槽可包括奈米級區，其不為凹陷或奈米孔而是以其他方式空間分隔的區，模板多核苷酸或支架可在其內結合或接種，在本文中稱作奈米墊。在一些實例中，流槽表面包括奈米墊，其由模板多核苷酸或支架可能不結合之表面區彼此分隔。奈米墊可彼此隔開以便促進單株簇形成。舉例而言，奈米墊可彼此分隔，使得由單一模板多核苷酸接種之一個奈米墊內形成的簇將與僅由一個模板多核苷酸接種之另一此類奈米墊充分分隔開。然而，可能難以阻止奈米墊由多於一個模板多核苷酸接種，導致一或多個多株簇形成。在如本文所揭示之一實例中，藉由阻止多於一個模板多核苷酸接種或接附於給定奈米墊內，奈米顆粒可促進單株簇優先於多株簇形成。舉例而言，奈米顆粒之大小可使得奈米墊上之空間不足以供多於一個奈米顆粒結合，其中模板多核苷酸鍵結至支架之單一模板多核苷酸位置。
在一些情況下，若核苷酸序列彼此不同之兩個或更多個模板多核苷酸結合於彼此相同之孔內，或接種該孔，則可出現多株簇。分子可基於卜瓦松分佈（Poisson distribution），基於其在所施加之溶液內的濃度在孔當中分佈，根據該分佈，使未佔據孔之數目減至最小（以便提高SBS運作效率）同時使由多個不同模板多核苷酸佔據之孔的數目減至最小之間存在平衡。最小孔大小與模板多核苷酸之大小的差異（例如B-DNA分子之直徑可為約2 nm）可引起在以下之間進行選擇：一方面，未如可用或較佳儘量多利用基板表面，諸如孔內表面的濃度；及導致形成非期望或不合期望地大量多株簇。
如本文所揭示，模板多核苷酸可鍵結至奈米顆粒，其中每個奈米顆粒僅具有一個模板多核苷酸鍵結。奈米顆粒可經大小設定，以准許奈米顆粒進入流槽中尚未存在另一奈米顆粒的孔，而非進入流槽中已存在另一奈米顆粒的孔。簇聚，諸如單株簇聚，可在奈米顆粒進入孔之前在奈米顆粒上出現，使得單株簇存在於孔中。或者，模板多核苷酸可鍵結至奈米顆粒之模板位置且奈米顆粒可進入孔且在孔內結合（例如，藉由將輔助位置結合至表面或對孔表面之修飾），從而用僅單一奈米顆粒接種孔，且接著可在孔內進行簇聚，使得單株簇存在於孔中。在一些實例中，在奈米顆粒進入孔之前奈米顆粒上可出現一定程度之簇聚，且在奈米顆粒進入孔之後可出現進一步簇聚。所有此類實例包括單株簇在孔內形成之實例。此外，調節奈米顆粒之大小以便減少、最小化或在一實例中消除多於一個奈米顆粒在一時間在孔中的同時存在可減少、最小化或在一實例中消除多株簇形成。
可藉由修改支架之大小、修改鍵結至輔助位置之輔助物，諸如接附於其之聚合物的大小或兩者來調節奈米顆粒大小。奈米顆粒之大小亦可由奈米顆粒上已出現或尚未出現之簇聚的量來修改，諸如藉由修改奈米顆粒上模板多核苷酸之複本及互補序列可在簇聚過程中在聚合輪次期間結合的位置數，其中較少此類位置潛在地引起較低奈米顆粒大小上限，且較多此類位置潛在地引起較大奈米顆粒大小上限。簇聚過程中之聚合輪數亦可修改奈米顆粒大小，其中較多輪產生較多結合至奈米顆粒的模板多核苷酸之複本及互補序列且因此潛在地提高其大小上限，且較少輪產生較少結合至奈米顆粒的模板多核苷酸之複本及互補序列且因此潛在地降低其大小上限。奈米顆粒之大小可根據支架上出現簇聚之前或支架上出現簇聚之後的奈米顆粒大小來確定。
如本文所用，術語「奈米顆粒」意欲意謂最大尺寸大小為至多約1,000 nm之顆粒。視幾何形狀而定，尺寸可以指長度、寬度、高度、直徑等。儘管作為本文之一實例，一般使用「直徑」來描述尺寸，本文所描述之奈米顆粒不必為球形或圓形。如本文所揭示之奈米顆粒的直徑可為約2 nm、約5 nm、約7 nm、約10 nm、約12 nm、約15 nm、約17 nm、約20 nm、約22 nm、約25 nm、約27 nm、約30 nm、約32 nm、約35 nm、約40 nm、約42 nm、約45 nm、約47 nm、約50 nm、約52 nm、約55 nm、約57 nm、約60 nm、約62 nm、約65 nm、約67 nm、約70 nm、約72 nm、約75 nm、約77 nm、約80 nm、約82 nm、約85 nm、約87 nm、約90 nm、約92 nm、約95 nm、約97 nm、約100 nm、約125 nm、約150 nm、約175 nm、約200 nm、約225 nm、約250 nm、約275 nm、約300 nm、約325 nm、約350 nm、約375 nm、約400 nm、約425 nm、約450 nm、約475 nm、約500 nm、約525 nm、約550 nm、約575 nm、約600 nm、約625 nm、約650 nm、約675 nm、約700 nm、約725 nm、約750 nm、約775 nm、約800 nm、約825 nm、約850 nm、約875 nm、約900 nm、約925 nm、約950 nm、約975 nm或約1,000 nm。奈米顆粒之直徑藉由動態光散射（dynamic light scattering；DLS），亦稱為準彈性光散射量測，表示為流體動力半徑（hydrodynamic radius；Rh）的兩倍，其可在DLS系統或包括DLS及其他功能的其他系統（例如ZETASIZER®, Malvern Instruments有限公司）上測定。
如本文所揭示之奈米顆粒的直徑可在以下範圍內：約2 nm至約10 nm、約5 nm至約15 nm、約7 nm至約20 nm、約10 nm至約25 nm、約15 nm至約30 nm、約20 nm至約50 nm、約40 nm至約60 nm、約50 nm至約75 nm、約60 nm至約100 nm、約70 nm至約100 nm、約75 nm至約100 nm、約80 nm至約110 nm、約90 nm至約130 nm、約100 nm至約150 nm、約100 nm至約200 nm、約150 nm至約225 nm、約200 nm至約250 nm、約200 nm至約300 nm、約225 nm至約275 nm、約250 nm至約300 nm、約275 nm至約325 nm、約300 nm至約400 nm、約300 nm至約350 nm、約325 nm至約375 nm、約350 nm至約400 nm、約375 nm至約425 nm、約400 nm至約500 nm、約400 nm至約450 nm、約425 nm至約475 nm、約450 nm至約500 nm、約475 nm至約525 nm、約500 nm至約600 nm、約500 nm至約550 nm、約525 nm至約575 nm、約550 nm至約600 nm、約575 nm至約625 nm、約600 nm至約700 nm、約600 nm至約625 nm、約625 nm至約675 nm、約650 nm至約700 nm、約675 nm至約725 nm、約700 nm至約800 nm、約700 nm至約725 nm、約725 nm至約775 nm、約750 nm至約800 nm、約775 nm至約825 nm、約800 nm至約900 nm、約800 nm至約850 nm、約825 nm至約875 nm、約850 nm至約900 nm、約875 nm至約925 nm、約900 nm至約1,000 nm、約900 nm至約950 nm、約925 nm至約975 nm、約950 nm至約1,000 nm、約300 nm至約450 nm、約350 nm至約500 nm、約400 nm至約550 nm、約450 nm至約600 nm、約500 nm至約650 nm、約550 nm至約700 nm、約600 nm至約750 nm、約650 nm至約800 nm、約700 nm至約850 nm、約750 nm至約900 nm、約800 nm至約950或約850 nm至約1,000 nm。
為方便及清楚起見，本文描述說明書、實例及申請專利範圍中所採用的某些術語。
「丙烯酸基」包括丙烯酸及其衍生物（例如甲基丙烯酸）之鹽、酯及共軛鹼。丙烯酸根離子具有分子式CH2 =CHCOO- 。
「丙烯醯胺單體」為具有結構
Figure 02_image154
或其經取代之類似物（例如甲基丙烯醯胺或N-異丙基丙烯醯胺）的單體。包括丙烯醯胺基及疊氮基之單體的一實例為疊氮基乙醯胺基戊基丙烯醯胺：
Figure 02_image156
。
如本文所用，「烷基」係指完全飽和（亦即，不含雙鍵或參鍵）的直鏈或分支鏈烴鏈。烷基可具有1至20個碳原子。示例烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、三級丁基、戊基、己基及其類似基團。作為一實例，名稱「C1-4烷基」指示烷基鏈中存在一至四個碳原子，亦即，烷基鏈選自由以下組成之群：甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、二級丁基及三級丁基。
如本文所用，「烯基」係指含有一或多個雙鍵的直鏈或分支鏈烴鏈。烯基可具有2至20個碳原子。示例烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及其類似基團。
如本文所用，「炔」或「炔基」係指含有一或多個參鍵的直鏈或分支鏈烴鏈。炔基可具有2至20個碳原子。
烷氧基（Alkoxy/alkoxyl）係指經由氧接附至母結構的直鏈或分支鏈組態的1至20個碳原子，例如1至10個碳原子，諸如1至6個碳原子等的基團。實例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基及其類似基團。
氧雜烷基係指一或多個碳（及其相關聯的氫）已經氧置換的烷基殘基。實例包括甲氧基丙氧基、3,6,9-三氧雜癸基及其類似基團。術語氧雜烷基係指氧經由單鍵鍵結至其相鄰原子（形成醚鍵）之化合物；其不指如將見於羰基中的雙鍵氧。類似地，硫雜烷基及氮雜烷基係指一或多個碳已分別經硫或氮置換的烷基殘基。氮雜烷基之實例包括乙胺基乙基及胺基己基。
如本文所用，「芳基」係指在環主鏈中僅含有碳的芳環或環系統（亦即，共用兩個相鄰碳原子的兩個或更多個稠環）。當芳基為環系統時，系統中之每個環為芳族。芳基可具有6至18個碳原子。芳基之實例包括苯基、萘基、薁基及蒽基。
如本文所用，術語「接附」係指兩個事物共價抑或非共價（例如藉由氫鍵、離子鍵、凡得瓦爾（van der Waals）力、親水相互作用及疏水相互作用）彼此接合、緊固、黏著、連接或結合之狀態。舉例而言，核酸可藉由共價或非共價鍵接附至官能化聚合物。
「疊氮」或「疊氮基」官能基係指-N3 。
如本文所用，「鍵結區」係指基板上待鍵結至另一材料的區域，作為實例，另一材料可為間隔層、蓋、另一基板等或其組合（例如間隔層及蓋）。形成於鍵結區處的鍵可為化學鍵（如上文所描述），或機械接合（例如使用緊固件等）。
「三級丁氧基羰基（tert-butyloxycarbonyl group；Boc）」係指
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基團。「丁氧基羰基氧基」係指-OCO2 tBu基團。
如本文所用，「碳環基」意謂環系統主鏈中僅含有碳原子的非芳族環狀環或環系統。當碳環基為環系統時，兩個或更多個環可以稠合、橋接或螺連接方式接合在一起。碳環基可具有任何飽和度，其限制條件為環系統中之至少一個環為非芳族。因此，碳環基包括環烷基、環烯基及環炔基。碳環基可具有3至20個碳原子。碳環基環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環己烯基、2,3-二氫-茚、雙環[2.2.2]辛基、金剛烷基及螺[4.4]壬基。
如本文所用，術語「羧酸」或「羧基」係指-COOH。
如本文所用，「伸環烷基」意謂經由兩個接附點接附至分子之其餘部分的完全飽和碳環基環或環系統。
如本文所用，「環烯基」或「環烯」意謂具有至少一個雙鍵的碳環基環或環系統，其中環系統中沒有環為芳族。實例包括環己烯基或環己烯及降莰烯基或降莰烯。亦如本文所用，「雜環烯基」或「雜環烯」意謂環主鏈中具有至少一個雜原子，具有至少一個雙鍵的碳環基環或環系統，其中環系統中沒有環為芳族。
如本文所用，「羥基（hydroxy/hydroxyl）」係指-OH基團。
如本文所用，「引子」定義為充當DNA或RNA合成之起點的單股核酸序列（例如單股DNA或單股RNA）。引子之5'末端可經修飾以使得可與官能化聚合物層進行偶聯反應。引子長度可為任何數目的鹼基長且可包括多種非天然核苷酸。在一實例中，引子為短股，在20至40個鹼基範圍內。
如本文所用，術語「視情況經取代」可與「未經取代或經取代」互換使用。術語「經取代」係指指定基團中一或多個氫原子經指定基團置換。舉例而言，經取代之烷基、芳基、環烷基、雜環基等係指烷基、芳基、環烷基或雜環基，其中各殘基中之一或多個H原子經以下置換：鹵素、鹵烷基、烷基、醯基、烷氧基烷基、羥基低碳數烷基、羰基、苯基、雜芳基、苯磺醯基、羥基、低碳數烷氧基、鹵烷氧基、氧雜烷基、羧基、烷氧基羰基[-C(=O)O-烷基]、烷氧基羰基胺基[HNC(=O)O-烷基]、甲醯胺基[-C(=O)NH2 ]、烷胺基羰基[-C(=O)NH-烷基]、氰基、乙醯氧基、硝基、胺基、烷胺基、二烷胺基、(烷基)(芳基)胺基烷基、烷胺基烷基（包括環烷基胺基烷基）、二烷胺基烷基、二烷胺基烷氧基、雜環基烷氧基、巰基、烷硫基、亞碸、碸、磺醯基胺基、烷基亞磺醯基、烷磺醯基、烷磺醯胺基、芳磺醯基、芳磺醯胺基、醯基胺基烷基、醯基胺基烷氧基、醯基胺基、甲脒基、芳基、苯甲基、雜環基、雜環基烷基、苯氧基、苯甲氧基、雜芳基氧基、羥亞胺基、烷氧基亞胺基、氧雜烷基、胺基磺醯基、三苯甲基、甲脒基、胍基、脲基、苯甲基氧基苯基及苯甲氧基。「側氧基」亦包括在「視情況經取代」中提及的取代基中；所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，因為側氧基為二價基團，所以存在其將不適合作為取代基的情況（例如在苯基上）。在一個實例中，1、2或3個氫原子可經指定基團置換。在烷基及環烷基情況下，多於三個氫原子可經氟置換；實際上，所有可用氫原子可經氟置換。此類化合物（例如全氟烷基）落入「氟代烴」類別內。為清楚起見，通用術語可涵蓋多於一個取代基，亦即，例如「鹵烷基」或「鹵苯基」係指至少一個，但可能多於一個氫經鹵素置換的烷基或苯基。在一些實例中，取代基為鹵素、鹵烷基、烷基、醯基、羥烷基、羥基、烷氧基、鹵烷氧基、氧雜烷基、羧基、氰基、乙醯氧基、硝基、胺基、烷胺基、二烷胺基、烷硫基、烷基亞磺醯基、烷磺醯基、烷磺醯胺基芳磺醯基、芳磺醯胺基及苯甲氧基。
本文中描述化合物時，使用術語「經至少一個含氧取代基取代」。含氧取代基為除碳及氫之外含有氧的取代基；含氧取代基亦可包括額外雜原子，諸如氮（例如，甲醯胺或甲磺醯基）。含氧取代基之典型實例包括烷氧基、羥基、氟烷氧基、甲醯基、乙醯基及其他C1 至C6 醯基鏈。 非限制性實例
以下實例意欲說明本發明之特定具體實例，但決不意欲限制其範圍。
圖1展示如本文所揭示之奈米顆粒之非限制性實例的圖示。在此非限制性實例中，單一模板多核苷酸位置展示為如所揭示之奈米顆粒之支架部分的楔形部分。展示單一模板多核苷酸結合至單一模板位置。亦在此非限制性實例中，展示自支架之輔助位置延伸的複數個輔助物。在中間圖示中，輔助物展示為聚合物。在左圖中，展示數個與模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本及模板多核苷酸的複本，其中此類複本接附至支架且自支架延伸。在此實例中，其自聚合物延伸，聚合物又自支架延伸。
在右圖中，在基板之孔中展示具有在單一模板位置處與其結合之模板多核苷酸的奈米顆粒。展示自支架延伸的複數個輔助寡核苷酸。儘管右側圖中未展示，但在此實例中，輔助寡核苷酸自接附至支架的聚合物延伸。輔助寡核苷酸之核苷酸序列與接附至孔表面的引子互補。輔助寡核苷酸從而雜合至孔接附的引子且接附至孔表面。此處，歸因於相對於孔之大小的奈米顆粒之大小，在孔中一次僅可存在一個奈米顆粒。因此，簇聚自單一模板起始。
圖2為根據本發明之奈米顆粒支架之一非限制性實例的圖示。在左側，支架指示為不對稱支架，帶有接附至支架的三個聚合物尾及單一模板多核苷酸。在右側，描繪奈米顆粒之分子結構的一實例（包括3臂RAFT劑核心），其中展示單一模板接附點，及自支架之核心延伸的聚合物。亦展示可形成支架之一部分的丙烯醯胺單體之一非限制性實例，支架包括輔助位置，在此實例中描繪為疊氮基（例如基質單體及引子接附點）。
圖3展示如本文所揭示之支架聚合物的另一非限制性實例。在右側，展示支架核心，其具有自其延伸的三個聚合物臂，及單一模板多核苷酸接附位置。在左側，展示核心及聚合物臂中之一者的化學結構（其他聚合物臂出於圖示清晰性的目的被省略但將包括於支架中）。二苯并環辛烯基展示為單一模板多核苷酸接附位置。輔助結合位置在圖示聚合物臂上展示。
圖4展示描繪用於根據本發明之方面之支架的一實例之合成方案的另一非限制性實例。在該實例中，tris分子之胺末端經阻斷（二碳酸三級丁基酯，或Boc2O、DIPEA、或N,N-二異丙基乙胺及THF，或四氫呋喃），且2-(十二烷基硫基硫代羰基硫基)-2-甲基丙酸（2-(Dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid；DDMAT）基團添加至tris核心之羥基端中。展示用於其後聚合的兩個選項。在途徑1中，進行標準水性RAFT聚合以將單體添加至鏈中，接著對胺基進行保護基脫除且將二苯并環辛烯基（dibenzocyclooctene；DBCO）接附至其。在替代途徑2中，首先用三氟乙酸（triflouroacetic acid；TFA）移除對胺基之阻斷，且首先接附二苯并環辛烯基（DBCO-PEG1-NHS酯），隨後進行RAFT聚合以添加單體基團。
用於合成根據本發明之支架的替代方案如下。
Figure 02_image160
Figure 02_image162
（在此實例中，為圖示簡單起見，在DDMAT添加之後僅指示聚合物臂中之一者，不過所有三個臂將具有相同結構）。在此非限制性工作實例中，PEG連接子已添加在模板多核苷酸位置（R）與聚合物臂之間，聚合物臂包括輔助位置，在此實例中為疊氮基。
用於合成根據本發明之方面完成之支架的另一方案係根據以下非限制性工作實例：
Figure 02_image164
Figure 02_image166
。可自彼處進行合成方案之以下非限制性實例（出於圖示清晰性的目的同樣僅展示三個聚合物臂中之一者，不過所有聚合物臂將根據同一方案合成）：
Figure 02_image168
Figure 02_image170
在此非限制性實例中，單一模板多核苷酸位置為四
Figure 109145765-A0101-12-01
。以下帶有R1 之單體可在聚合期間添加，以用於合成如本文所揭示之支架的不同物種（作為非限制性實例，用於添加用於輔助鍵結位置的疊氮基）：
Figure 02_image172
以下帶有R2 之單體可視情況在聚合期間添加，以用於合成如本文所揭示之支架的不同物種：
Figure 02_image174
丙烯醯胺單體可視情況根據以下方案聚乙二醇化：
Figure 02_image176
用於根據本發明由三
Figure 109145765-A0101-12-01
核心合成支架的替代方案係根據以下非限制性實例：
Figure 02_image178
Figure 02_image180
Figure 02_image182
Figure 02_image184
在此非限制性實例中，單一模板多核苷酸位置為胺，其自如以上所展示之四
Figure 109145765-A0101-12-01
核心頂部延伸。以下帶有R1 之單體可在聚合期間添加，以用於合成如本文所揭示之支架的不同物種（作為非限制性實例，用於添加用於輔助鍵結位置的疊氮基）：
Figure 02_image186
以下帶有R2 之單體可視情況在聚合期間添加，以用於合成如本文所揭示之支架的不同物種：
Figure 02_image174
丙烯醯胺單體可視情況根據以下方案聚乙二醇化：
Figure 02_image188
供添加至三
Figure 109145765-A0101-12-01
支架核心中之雙官能聚乙二醇化二級胺可根據以下方案合成：
Figure 02_image190
對在向三
Figure 109145765-A0101-12-01
支架核心中初始添加雙官能聚乙二醇化二級胺期間添加的組分進行化學計算量控制及純化方法（基於例如極性差異）可用於促進相對於單取代及三取代產物，二取代三
Figure 109145765-A0101-12-01
（添加有兩個雙官能二級胺）的產生及分離。
圖5展示根據本發明之方面之樹枝狀聚合物支架的一實例。在此實例中，展示包括四個離胺酸且以C末端半胱胺酸結束的多肽。第二、第三及第四離胺酸包括叉，其包括該等離胺酸經由其ε胺基與另一離胺酸基的異肽鍵。第二離胺酸具有由異肽鍵接附的單一離胺酸。第三離胺酸接附至二離胺酸，其具有由與其C末端離胺酸之ε胺基的異肽鍵連接至其的另一離胺酸。第四離胺酸接附至三離胺酸殘基，對於三離胺酸殘基，另一離胺酸藉由異肽鍵接附至其第二離胺酸，且具有藉由異肽鍵與之連接之另一離胺酸的二離胺酸殘基接附至其C末端離胺酸。
因此，在樹枝化基元支架之此實例中，不同數目代由自半胱胺酸核心延伸之支鏈顯現。在其他實例中，可包括較多或較少代，且不同支鏈可具有彼此相同數目的代，彼此不同數目的代。在其他實例中，在離胺醯基叉之間或帶有單一模板多核苷酸位置的端處可包括額外胺酸物種，諸如經由與離胺酸殘基之肽鍵。
圖6示出用於具有帶α胺基肽鍵及ε胺基異肽鍵之分支鏈離胺酸取代基的奈米顆粒的合成方案，諸如在離胺醯基樹枝狀聚合物構造支架，或在離胺酸取代基之ε胺基處由異肽鍵連接在一起形成分支鏈多肽支架的含離胺酸多肽的支架中。固相肽合成可用於將胺基酸序列一起合成在例如根據圖6上圖之線性多肽鏈中（藉由固相肽合成（Solid Phase Peptide Synthesis；SPSS）進行之循序合成策略）。胺基經茀基甲氧羰基（fluorenylmethyloxycarbonyl；Fmoc）或三級丁氧基羰基（Boc）阻斷。在添加的組成物/偶聯試劑存在下選擇性移除保護基。藉由對自由胺基進行迭代保護（添加數目為n的單體，其中n=循環數），後接其移除且添加活化胺基酸，可合成直鏈多肽（添加數目為n的單體，其中n=循環數）。從而可產生包括一或多個離胺酸殘基的帶電胺基酸之線性股作為支架的組分。接著可將組成物自基質樹脂裂解且如所期望進一步修飾。
如圖6之下圖中進一步描繪，可使用彙集固相蛋白質合成方法，其中在合成步驟期間，包括一或多個離胺酸殘基的分別形成的多肽鏈之長度可作為聚合物組添加（下圖，藉由固相肽合成（SPPS）進行之彙集合成策略）。在圖6中未描繪的一些實例中，胺基酸或多肽可作為叉之支鏈獨立地添加，其中叉為含有兩個胺基（亦即，離胺酸或另一胺基酸之N末端，諸如α胺基）及離胺酸之ε胺基酸）的結構，而非如圖22中所描繪由單一胺基線性串連。舉例而言，具有兩個胺基之離胺酸胺基酸可充當分叉接附點，線性多肽之兩個支鏈或兩個單獨離胺酸殘基可接附至該分叉接附點，根據圖6中所描繪之固相蛋白質合成方案各胺基接附至一者。
圖7為用於將模板多核苷酸鍵結至支架之不同方法的圖示。在頂部展示支架，其具有單一模板多核苷酸位置。在左側，模板位置引子包括於單一模板多核苷酸位置中，且其端與模板多核苷酸之端互補，以准許藉由華特生-克里克鹼基對雜合將模板多核苷酸非共價鍵結至支架。在中間，模板多核苷酸及單一模板多核苷酸位置分別具有互補部分或結構，使得在模板多核苷酸與支架之間形成共價鍵。在右側，多肽包括於單一模板位置中，且與其互補之多肽接附至模板多核苷酸之端。單一模板位置之多肽與模板多核苷酸之間的非共價鍵結將模板多核苷酸鍵結至支架。
圖8展示藉由雜合至由PX表示之模板位置引子（GFP-寡核苷酸綴合物），鍵結至蛋白質支架之單一模板位置的模板多核苷酸之實例。展示庫之模板多核苷酸的兩個實例，一個為具有P5及P7序列之標準庫分子，在3'端具有與PX模板位置引子（命名為PX'）互補之區，或經修飾版本，其中PX'序列由PEG連接子與P5序列分隔。醚股鍵結至支架之單一模板位置。標準庫序列可用於第一股延伸聚合反應，其中PX引子充當用於聚合與模板多核苷酸互補之新生股的起始引子。
圖9展示非共價鍵結之一實例，具體而言纏繞線圈肽非共價鍵（在一實例中，KD在＜ 1×10-10 M之皮莫耳範圍內）。展示α螺旋多肽結構之兩個胺基酸序列，其形成纏繞線圈接附之兩個互補鍵結搭配物。藉由將一個此類序列接附至支架或接附至庫模板多核苷酸，模板多核苷酸可經由α螺旋之間的非共價鍵結結合至支架。在另一實例中，與接附至支架之序列互補的α螺旋序列之一可接附至輔助物，諸如輔助寡核苷酸，以便將輔助寡核苷酸接附至輔助位置。
圖10展示可存在於給定奈米孔表面積（surface area；SA）或直徑（diameter；D）之奈米孔中的給定大小支架數目（樹枝狀聚合物/奈米孔）之測試之一實例的圖（接種事件對奈米孔表面積）。將直徑為約100 nm的奈米顆粒（結構不同於如本文所揭示之奈米顆粒的奈米顆粒結構）接種至直徑為185、285或375 nm之奈米孔中，且量測每奈米孔之樹枝狀聚合物數目。自結果最佳擬合曲線（y = 3E-0.5x - 3.4874，R2 = 0.9991）外推指示奈米孔之單一奈米顆粒接種將引起在此實例中使用直徑為約100 nm之奈米顆粒及直徑為約100 nm之奈米孔。
圖11A至11C展示根據本發明之方面使用支架用模板多核苷酸接種基板的一實例。根據美國臨時申請案第62/952,799號構造為DNA樹枝狀聚合物支架之支架的直徑為50 nm至150 nm。支架包括用於鍵結模板多核苷酸之單一模板位置（Pa）及複數個輔助位置（cPX）。圖11A展示模板多核苷酸及其互補序列，其中引子序列添加至各端（P5/cP5及P7/cP7）。模板多核苷酸之P5-引子端由PEG連接子連接至引子（cPa）。cPa引子與支架之單一模板位置（Pa）互補。圖11B為對支架分子的描繪，該分子經由其單一模板位置（Pa）雜合至模板多核苷酸且經由cPa引子雜合至圖11A中所描繪之其互補序列。支架接附至基板。基板接附至與支架之輔助位置（cPX）互補的引子（PX）。基板亦接附至引子，准許模板端與其雜合以准許在基板上簇聚。
圖11C描繪根據前述內容之一實例，展現使用具有單一模板位置之支架，用模板多核苷酸接種基板，接著簇聚。根據本發明之方面及圖11A及11B支架接附至模板多核苷酸。支架與模板多核苷酸（庫）以展示的莫耳定量組合，基板（具有用於接種之奈米孔的流槽）經其接種，接著根據重組酶驅動簇擴增方法（ExAmp簇擴增）進行簇聚。陰性對照組包括不含模板之支架及不含支架之模板。作為陽性對照組（+對照組），在模板分子雜合至不經由支架接附至基板的引子之後在基板上使用簇聚，在無支架之情況下在基板上進行簇聚。
左圖為根據以上條件之簇聚方法之後的流槽影像（2個陰性對照組，5種各種支架:模板莫耳比之條件及1個陽性對照組）。除陰性對照組外，所有條件下之螢光指示具有單一模板結合位置之支架可用模板多核苷酸接種基板且支持簇聚方法。條形圖為對8種條件之簇聚結果的定量量測。上圖，C1強度為作為對簇大小或產量之間接量度的第1循環強度（其中強度與簇大小或產量成正比）。下圖，%PF為通過過濾器%，其為通過臨限過濾器之奈米孔的百分比，指示其中所形成之簇的純度，亦即與具有單株簇之奈米孔數目成正比。
應瞭解，前述概念及本文更詳細論述之額外概念的所有組合（限制條件為此類概念並不相互矛盾）預期為本文所揭示之本發明主題的一部分。特定而言，在本發明結尾出現的所主張之主題的所有組合預期為本文所揭示之本發明主題的一部分，且可用於達成本文所描述之益處及優勢。
無
當參考附圖閱讀以下實施方式時，將更好理解本發明之此等及其他特徵、方面及優勢，其中：
[圖1]展示根據本發明之方面之奈米顆粒的一實例。
[圖2]展示根據本發明之方面之奈米顆粒的支架之部分的一實例。
[圖3]展示根據本發明之方面之奈米顆粒的單一模板多核苷酸位置及輔助接附位置的一實例。
[圖4]展示合成根據本發明之奈米顆粒之方法的一實例。
[圖5]展示具有含包括離胺酸之組成性重複單元的樹枝狀聚合物結構之奈米顆粒的實例。
[圖6]展示用於合成根據本發明之方面的奈米顆粒之實例的合成法。
[圖7]展示將模板接附至根據本發明之方面之奈米顆粒的實例。
[圖8]展示根據本發明之方面，藉由雜合將模板多核苷酸非共價接附至奈米顆粒的一實例。
[圖9]展示根據本發明之方面，藉由纏繞線圈肽結合位置將模板多核苷酸非共價接附至奈米顆粒的一實例。
[圖10]為展示根據本發明之方面，與奈米孔表面積對應，每奈米孔之奈米顆粒數目的圖。
[圖11A至11C]展示根據本發明之方面使用支架用模板多核苷酸接種基板的一實例。

Claims (88)

  1. 一種奈米顆粒，其包含 支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中 該支架為式I化合物：
    Figure 03_image001
    ， 各X為式II化合物：
    Figure 03_image003
    ， 其中R2 選自式IIIa：
    Figure 03_image005
    ，其中R5 選自
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    Figure 03_image015
    、及
    Figure 03_image017
    ，x為在1至20,000範圍內之整數，且y為在1至100,000範圍內之整數，且x:y之比可為大致10:90至大致1:99，且其中各Rz 獨立地為H或C1-4 烷基、及式IIIb：
    Figure 03_image019
    ，其中R5 選自
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    、
    Figure 03_image013
    Figure 03_image015
    、及
    Figure 03_image017
    ，y為在1至2,000範圍內之整數，且x及z為總和在1至10,000範圍內之整數，且(x:y):z之比可為大致(85):15至大致(95):5，且其中各Rz 獨立地為H或C1-4 烷基， R1 包括用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的該單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包含經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包括用於鍵結輔助寡核苷酸的該輔助位置。
  2. 如請求項1之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含共價模板鍵結位置。
  3. 如請求項2之奈米顆粒，其中該共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、醛-NHS酯鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶（sortase）-偶聯鍵結位置。
  4. 如請求項1中任一項之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含非共價模板鍵結位置。
  5. 如請求項4之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  6. 如請求項4之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該非共價肽結合位置選自纏繞線圈（coiled-coil）鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
  7. 如請求項1至6中任一項之奈米顆粒，其中用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的該複數個輔助位置包含共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  8. 如請求項7之奈米顆粒，其中該等共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
  9. 如請求項1至6中任一項之奈米顆粒，其中該等輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  10. 如請求項9之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  11. 如請求項9之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該等非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
  12. 如請求項1至11中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該單一模板位置的單一模板多核苷酸。
  13. 如請求項1至12中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
  14. 如請求項1至13中任一項之奈米顆粒，其中該奈米顆粒之直徑係至少約10 nm。
  15. 一種方法，其包含將單一模板多核苷酸鍵結至如請求項1至14中任一項之奈米顆粒的該單一模板位置。
  16. 一種方法，其包含將複數個輔助寡核苷酸鍵結至如請求項1至15中任一項之奈米顆粒的該複數個輔助位置。
  17. 如請求項15或16之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等支架接附的複本自該等輔助寡核苷酸延伸。
  18. 如請求項15至17中任一項之方法，其進一步包含將該支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至該基板的寡核苷酸雜合。
  19. 如請求項18之方法，其中該基板包含複數個奈米孔，且接附至該基板的該等寡核苷酸在該複數個奈米孔內接附。
  20. 如請求項19之方法，其中不多於一個支架在該等奈米孔中之任一者內結合。
  21. 如請求項18至20中任一項之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。
  22. 如請求項17或21之方法，其進一步包含對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序（sequencing by synthesis）。
  23. 一種奈米顆粒，其包含 支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中 該支架包含樹枝狀聚合物（dendrimer），其中該樹枝狀聚合物包含2至10代組成性重複單元，該等組成性重複單元包含離胺酸，其中上游代之離胺酸與緊接下游代之第一離胺酸形成肽鍵，且與該緊接下游代之第二離胺酸形成異肽鍵， 該單一模板位置自該樹枝狀聚合物之第一代之離胺酸的C末端延伸，且該複數個輔助位置自該樹枝狀聚合物之最後一代之離胺酸的NH2 基團延伸。
  24. 如請求項23之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含共價模板鍵結位置。
  25. 如請求項24之奈米顆粒，其中該共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶-偶聯鍵結位置。
  26. 如請求項23中任一項之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含非共價模板鍵結位置。
  27. 如請求項26之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  28. 如請求項28之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
  29. 如請求項23至28中任一項之奈米顆粒，其中用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的該複數個輔助位置包含共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  30. 如請求項29之奈米顆粒，其中該等共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
  31. 如請求項23至28中任一項之奈米顆粒，其中該等輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  32. 如請求項31之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  33. 如請求項31之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該等非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
  34. 如請求項23至33中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該單一模板位置的單一模板多核苷酸。
  35. 如請求項23至34中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
  36. 如請求項23至35中任一項之奈米顆粒，其中該奈米顆粒之直徑係至少約10 nm。
  37. 一種方法，其包含將單一模板多核苷酸鍵結至如請求項23至36中任一項之奈米顆粒的該單一模板位置。
  38. 一種方法，其包含將複數個輔助寡核苷酸鍵結至如請求項23至37中任一項之奈米顆粒的該複數個輔助位置。
  39. 如請求項37或38之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等支架接附的複本自該等輔助寡核苷酸延伸。
  40. 如請求項37至39中任一項之方法，其進一步包含將該支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至該基板的寡核苷酸雜合。
  41. 如請求項40之方法，其中該基板包含複數個奈米孔，且接附至該基板的該等寡核苷酸在該複數個奈米孔內接附。
  42. 如請求項41之方法，其中不多於一個支架在該等奈米孔中之任一者內結合。
  43. 如請求項40至42中任一項之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。
  44. 如請求項39或43之方法，其進一步包含對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
  45. 一種奈米顆粒，其包含 支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中 該支架為式IV化合物：
    Figure 03_image021
    ， 各X為式V化合物：
    Figure 03_image022
    ， 其中R2 選自式VIa：
    Figure 03_image024
    及式VIb：
    Figure 03_image204
    其中p為選自1至20之整數，且R5 包含用於鍵結輔助寡核苷酸的該輔助位置，R3 選自直接鍵、
    Figure 03_image028
    、
    Figure 03_image030
    、
    Figure 03_image032
    、
    Figure 03_image034
    、
    Figure 03_image036
    、及
    Figure 03_image038
    ，m為1至20,000之整數且n為1至100,000之整數， R1 包含用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的該單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包含經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包含用於鍵結輔助寡核苷酸的該輔助位置。
  46. 如請求項45之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含共價模板鍵結位置。
  47. 如請求項46之奈米顆粒，其中該共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶-偶聯鍵結位置。
  48. 如請求項45中任一項之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含非共價模板鍵結位置。
  49. 如請求項48之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  50. 如請求項48之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
  51. 如請求項45至50中任一項之奈米顆粒，其中用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的該複數個輔助位置包含共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  52. 如請求項51之奈米顆粒，其中該等共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
  53. 如請求項45至50中任一項之奈米顆粒，其中該等輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  54. 如請求項53之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  55. 如請求項53之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該等非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
  56. 如請求項45至55中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該單一模板位置的單一模板多核苷酸。
  57. 如請求項45至56中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
  58. 如請求項45至57中任一項之奈米顆粒，其中該奈米顆粒之直徑係至少約10 nm。
  59. 一種方法，其包含將單一模板多核苷酸鍵結至如請求項45至58中任一項之奈米顆粒的該單一模板位置。
  60. 一種方法，其包含將複數個輔助寡核苷酸鍵結至如請求項45至59中任一項之奈米顆粒的該複數個輔助位置。
  61. 如請求項59或60之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等支架接附的複本自該等輔助寡核苷酸延伸。
  62. 如請求項59至61中任一項之方法，其進一步包含將該支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至該基板的寡核苷酸雜合。
  63. 如請求項62之方法，其中該基板包含複數個奈米孔，且接附至該基板的該等寡核苷酸在該複數個奈米孔內接附。
  64. 如請求項63之方法，其中不多於一個支架在該等奈米孔中之任一者內結合。
  65. 如請求項62至64中任一項之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。
  66. 如請求項61或65之方法，其進一步包含對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
  67. 一種奈米顆粒，其包含 支架、選自共價模板鍵結位置及非共價模板鍵結位置的用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的單一模板位置、及選自共價輔助寡核苷酸鍵結位置及非共價輔助寡核苷酸鍵結位置的用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的複數個輔助位置，其中 該支架為式VII化合物：
    Figure 03_image042
    ， 各X為式VIII化合物：
    Figure 03_image044
    ， 其中y為1至20之整數，R2 選自式IXa：
    Figure 03_image024
    及式IXb：
    Figure 03_image047
    其中p為選自1至20之整數，且R5 包含用於鍵結輔助寡核苷酸的該輔助位置，R3 選自直接鍵、
    Figure 03_image028
    、
    Figure 03_image030
    、
    Figure 03_image032
    、
    Figure 03_image034
    、
    Figure 03_image036
    、及
    Figure 03_image038
    ，m為1至2,000之整數且n為1至10,000之整數， R1 包含用於將模板多核苷酸鍵結至該支架的該單一模板位置，R4 選自視情況經取代之C1 -C20 烷基、視情況經取代之C1 -C20 烯基、視情況經取代之C1 -C20 炔基、視情況經取代之C1 -C20 氧雜烷基、視情況經取代之C1 -C20 硫雜烷基、及視情況經取代之C1 -C20 氮雜烷基，其中經取代包含經C1 -C20 烷基、雙鍵氧、及羥基中之一或多者取代，且R3 包含用於鍵結輔助寡核苷酸的該輔助位置。
  68. 如請求項67之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含共價模板鍵結位置。
  69. 如請求項68之奈米顆粒，其中該共價模板鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、及轉肽酶-偶聯鍵結位置。
  70. 如請求項67中任一項之奈米顆粒，其中該單一模板位置包含非共價模板鍵結位置。
  71. 如請求項70之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  72. 如請求項70之奈米顆粒，其中該非共價模板鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置。
  73. 如請求項67至72中任一項之奈米顆粒，其中用於將輔助寡核苷酸鍵結至該支架的該複數個輔助位置包含共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  74. 如請求項73之奈米顆粒，其中該等共價輔助寡核苷酸鍵結位置選自胺-NHS酯鍵結位置、胺-亞胺基酯鍵結位置、胺-五氟苯基酯鍵結位置、胺-羥甲基膦鍵結位置、羧基-碳二亞胺鍵結位置、硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵結位置、硫醇-鹵乙醯基鍵結位置、硫醇-吡啶基二硫化物鍵結位置、硫醇-硫代磺酸酯鍵結位置、硫醇-乙烯基碸鍵結位置、醛-醯肼鍵結位置、醛-烷氧基胺鍵結位置、羥基-異氰酸酯鍵結位置、疊氮-炔鍵結位置、疊氮-膦鍵結位置、反式環辛烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、降莰烯-四
    Figure 109145765-A0101-12-01
    鍵結位置、疊氮-環辛炔鍵結位置、疊氮-降莰烯鍵結位置、肟鍵結位置、SpyTag-SpyCatcher鍵結位置、Snap-tag-O6 -苯甲基鳥嘌呤鍵結位置、CLIP-tag-O2 -苯甲基胞嘧啶鍵結位置、轉肽酶-偶聯鍵結位置、及前述中之兩者或更多者的任何組合。
  75. 如請求項67至72中任一項之奈米顆粒，其中該等輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價輔助寡核苷酸鍵結位置。
  76. 如請求項75之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含多核苷酸雜合位置。
  77. 如請求項75之奈米顆粒，其中該等非共價輔助寡核苷酸鍵結位置包含非共價肽結合位置，且該等非共價肽結合位置選自纏繞線圈鍵結位置及抗生物素蛋白-生物素鍵結位置中之一或兩者。
  78. 如請求項67至77中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該單一模板位置的單一模板多核苷酸。
  79. 如請求項67至78中任一項之奈米顆粒，其進一步包含鍵結至該複數個輔助位置的複數個輔助寡核苷酸。
  80. 如請求項67至79中任一項之奈米顆粒，其中該奈米顆粒之直徑係至少約10 nm。
  81. 一種方法，其包含將單一模板多核苷酸鍵結至如請求項67至80中任一項之奈米顆粒的該單一模板位置。
  82. 一種方法，其包含將複數個輔助寡核苷酸鍵結至如請求項67至81中任一項之奈米顆粒的該複數個輔助位置。
  83. 如請求項81或82之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之支架接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等支架接附的複本自該等輔助寡核苷酸延伸。
  84. 如請求項81至83中任一項之方法，其進一步包含將該支架接附至基板，其中接附包含將輔助寡核苷酸與接附至該基板的寡核苷酸雜合。
  85. 如請求項84之方法，其中該基板包含複數個奈米孔，且接附至該基板的該等寡核苷酸在該複數個奈米孔內接附。
  86. 如請求項85之方法，其中不多於一個支架在該等奈米孔中之任一者內結合。
  87. 如請求項84至86中任一項之方法，其進一步包含合成一或多種選自以下者之基板接附的複本：該模板多核苷酸之複本、與該模板多核苷酸互補之多核苷酸的複本、及兩者之複本，其中該等基板接附的複本自接附至基板的寡核苷酸延伸。
  88. 如請求項83或87之方法，其進一步包含對支架接附的複本及基板接附的複本中之至少一者進行定序，其中定序包含合成式定序。
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