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TW202138384A - 顆粒蛋白前體變異體 - Google Patents

顆粒蛋白前體變異體 Download PDF

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TW202138384A
TW202138384A TW109145722A TW109145722A TW202138384A TW 202138384 A TW202138384 A TW 202138384A TW 109145722 A TW109145722 A TW 109145722A TW 109145722 A TW109145722 A TW 109145722A TW 202138384 A TW202138384 A TW 202138384A
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Taiwan
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polypeptide
seq
sequence
variant
fusion protein
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TW109145722A
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English (en)
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傑拉德 麥斯威爾 契爾夫
古納斯卡蘭 卡南
卡特琳娜 Ｗ 萊克薩
烈榮 劉
瑞秋 普洛洛可
安基塔 斯里瓦斯塔娃
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美商戴納立製藥公司
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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Abstract

本文提供顆粒蛋白前體變異體以及包含顆粒蛋白前體變異體及Fc多肽之融合蛋白。本文亦提供使用此類蛋白質治療顆粒蛋白前體相關病症(例如神經退化性疾病，諸如額顳葉型失智(FTD))之方法。

Description

顆粒蛋白前體變異體
額顳葉型失智(FTD)為進行性神經退化性病症，其佔所有失智患者之5-10%及65歲前失智發作患者之10-20% (Rademakers等人,Nat Rev Neurol . 8(8):423-34, 2012)。儘管若干基因已與FTD相關聯，但FTD中最頻繁突變之基因之一為GRN ，其定位至人類染色體17q21且編碼富半胱胺酸蛋白顆粒蛋白前體(progranulin，PGRN) (亦稱為上皮素前體(proepithelin)及頂顆粒蛋白(acrogranin))。GRN 中之高度滲透性突變於2006年首次報導為家族性FTD之體染色體顯性形式之原因(Baker等人,Nature . 442(7105):916-9, 2006；Cruts等人,Nature . 2006年8月24日;442(7105):920-4；Gass等人,Hum Mol Genet . 15(20):2988-3001, 2006)。最新估計表明GRN 突變佔具有陽性家族史之FTD患者之5-20%及散發病例之1-5% (Rademakers等人, 同上)。
將GRN 突變鑑定為FTD之原因之後，顆粒蛋白前體之水準降低及顆粒蛋白前體之功能損失已與多種神經退化性疾病及病症相關聯，包括阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease，AD)、帕金森氏病(Parkinson's Disease，PD)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)及由溶酶體貯積病引起之神經退化性病症(Petkau及Leavitt. 2014.Trends Neurosci 37(7):388-398)。因此，需要開發可處理由顆粒蛋白前體之功能損失及顆粒蛋白前體之水準降低引起之病症或得益於顆粒蛋白前體之水準增加之病症的療法。
本文提供顆粒蛋白前體變異體及包含顆粒蛋白前體或其變異體之融合蛋白以及使用此類變異體或融合蛋白用於治療得益於顆粒蛋白前體之水準增加之任何疾病的方法，該疾病包括神經退化性疾病(例如FTD)、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、年齡相關性黃斑變性(AMD)或顆粒蛋白前體相關病症。本文所提供之顆粒蛋白前體變異體具有對野生型顆粒蛋白前體之C端進行之修飾或添加。如本文所述，與含有野生型顆粒蛋白前體之融合蛋白相比，當自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中重組表現及純化蛋白質時，含有顆粒蛋白前體變異體之融合蛋白在蛋白質之顆粒蛋白前體部分中不易發生C端裂解。
在一個態樣中，本揭示案係關於一種顆粒蛋白前體變異體，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基574至576之位置處由X1 X2 X3 定義之序列，其中X1 、X2 及X3 各自獨立地為胺基酸且合在一起不為QLL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少95% (例如至少96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少98%一致性(例如至少99%)。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少95% (例如至少96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少98%一致性(例如至少99%)之序列。
在此態樣之一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體包含序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1 X2 X3 (SEQ ID NO:3)， 其中X1 X2 X3 合在一起不為QLL。
在一些實施例中，X1 為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。在一些實施例中，X2 為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。在一些實施例中，X3 為L、Y或P。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 IL、X1 FL、X1 QL、PX2 L、QX2 L或VX2 L。在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 X2 L，且在一些實施例中，X1 X2 L中之X2 為A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。
在特定實施例中，X1 X2 X3 為PIL、PFL、QQL、VVL或VTL。在特定實施例中，X1 X2 X3 為PPL、PYL、QQL、QHL或QRL。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種顆粒蛋白前體變異體，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基576之位置的相鄰及C端處由Y1 Y2 QLL定義之序列(SEQ ID NO:137)，其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。
在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體包含序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1 Y2 QLL (SEQ ID NO:55)。
在一些實施例中，Y1 為L。在一些實施例中，Y2 為R。在一些實施例中，Y1 及Y2 兩者均不存在。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種包含顆粒蛋白前體變異體之多肽，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基574至576之位置處由X1 X2 X3 定義之序列，其中X1 、X2 及X3 各自獨立地為胺基酸且合在一起不為QLL。在一些實施例中，多肽中之顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少95% (例如至少96%、97%、98%或99%)一致性。在一些實施例中，多肽中之顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少95% (例如至少96%、97%、98%或99%)一致性之序列。
在此態樣之一些實施例中，多肽中之顆粒蛋白前體變異體包含序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1 X2 X3 (SEQ ID NO:3)。 其中X1 X2 X3 不為QQL。
在此態樣之一些實施例中，X1 為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。在一些實施例中，X2 為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。在一些實施例中，X3 為L、Y或P。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 IL。在某些實施例中，X1 IL中之X1 可為R、H、K、E、P、N、F或Y (例如R、H、K、E或P)。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 FL。在某些實施例中，X1 FL中之X1 可為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y或P。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 QL。在某些實施例中，X1 QL中之X1 可為R、H、K、D、E、N、L、F、Y或Q。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為PX2 L。在某些實施例中，PX2 L中之X2 可為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R (例如H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I或F)。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為QX2 L。在某些實施例中，QX2 L中之X2 可為R、H、K、D、E、N、P、Y或Q。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為VX2 L。在某些實施例中，VX2 L中之X2 可為V或T。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 X2 L。在某些實施例中，X1 X2 L中之X2 為A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為PIL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為PFL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為QQL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為VVL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為VTL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為PPL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為PYL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為QRL。在一些實施例中，X1 X2 X3 為QHL。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種包含顆粒蛋白前體變異體之多肽，其中該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性及在對應於SEQ ID NO:2之殘基576之位置的相鄰及C端處由Y1 Y2 QLL定義之序列(SEQ ID NO:137)，其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。在一些實施例中，多肽包含具有以下序列之顆粒蛋白前體變異體： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1 Y2 QLL (SEQ ID NO:55)。
在一些實施例中，Y1 為L。在一些實施例中，Y2 為R。在一些實施例中，Y1 及Y2 兩者均不存在。
在一些實施例中，本文所述之多肽進一步包含連接至顆粒蛋白前體變異體之Fc多肽。Fc多肽之N端或C端可連接至顆粒蛋白前體變異體。在一些實施例中，Fc多肽由肽鍵或由多肽連接子連接至顆粒蛋白前體變異體。在一些實施例中，多肽連接子之長度為1至50個(例如1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至5個、5至50個、10至50個、15至50個、20至50個、25至50個、30至50個、35至50個、40至50個、45至50個、1個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個或45個)胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子為可撓性多肽連接子，例如富甘胺酸連接子。在某些實施例中，富甘胺酸連接子為G4 S (SEQ ID NO:90)或(G4 S)2 (SEQ ID NO:91)。
在某些實施例中，Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:64-67組成之群的序列。在某些實施例中，Fc多肽為特異性結合至轉鐵蛋白受體(TfR；亦即，TfR結合Fc多肽)之經修飾之Fc多肽。在一些實施例中，Fc多肽(例如TfR結合Fc多肽)包含選自由SEQ ID NO:68-87及129-132 (例如SEQ ID NO:70、75、80、85及129-132)組成之群的序列。
在特定實施例中，Fc多肽(例如TfR結合Fc多肽)包含選自SEQ ID NO:70、75、80、85及129-132之序列。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種融合蛋白，該融合蛋白包含：(a)本文所述之顆粒蛋白前體變異體；(b)連接至(a)之顆粒蛋白前體變異體之第一Fc多肽；及(c)與第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。在此態樣之一些實施例中，第二Fc多肽亦連接至野生型顆粒蛋白前體或本文所述之顆粒蛋白前體變異體(亦即，第二顆粒蛋白前體多肽)。連接至第一Fc多肽之顆粒蛋白前體變異體及連接至第二Fc多肽之顆粒蛋白前體變異體可相同或不同。
在一些實施例中，第一Fc多肽由肽鍵或由多肽連接子連接至顆粒蛋白前體變異體，及/或第二Fc多肽由肽鍵或由多肽連接子連接至顆粒蛋白前體變異體。在一些實施例中，多肽連接子之長度為1至50個(例如1至45個、1至40個、1至35個、1至30個、1至25個、1至20個、1至15個、1至10個、1至5個、5至50個、10至50個、15至50個、20至50個、25至50個、30至50個、35至50個、40至50個、45至50個、1個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個或45個)胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子為可撓性多肽連接子，例如富甘胺酸連接子。在某些實施例中，富甘胺酸連接子為G4 S (SEQ ID NO:90)或(G4 S)2 (SEQ ID NO:91)。
在此態樣之一些實施例中，第一Fc多肽之C端連接至顆粒蛋白前體之N端，及/或第二Fc多肽之C端連接至顆粒蛋白前體變異體之N端。
在一些實施例中，第一Fc多肽或第二Fc多肽特異性結合至轉鐵蛋白受體。在某些實施例中，第一Fc多肽或第二Fc多肽獨立地包含選自由SEQ ID NO:68-87及129-132組成之群的序列。在某些實施例中，第一Fc多肽或第二Fc多肽獨立地包含選自SEQ ID NO:70、75、80、85及129-132之序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽及第二Fc多肽各自包含促進異二聚化之修飾。舉例而言，根據EU編號，第一Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代且第二Fc多肽包含T366W取代。在一些實施例中，根據EU編號，第一Fc多肽包含T366W取代且第二Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽獨立地包含減弱效應子功能之修飾。在某些實施例中，根據EU編號，減弱效應子功能之修飾為L234A及L235A取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:64-67組成之群的序列。在一些實施例中，第二Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:68-87及129-132 (例如SEQ ID NO:70、75、80、85及129-132)組成之群的序列。
在此態樣之一些實施例中，根據EU編號，第一Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代以及L234A及L235A取代，且第二Fc多肽包含T366W取代以及L234A及L235A取代。在一些實施例中，根據EU編號，第一Fc多肽包含T366W取代以及L234A及L235A取代，且第二Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代以及L234A及L235A取代。
在此態樣之一些實施例中，鉸鏈區或其一部分連接至第一Fc多肽及/或第二Fc多肽。
在一些實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白(sortilin)結合之KD 小於約100 nM (例如小於約95 nM、90 nM、85 nM、80 nM、75 nM、70 nM、65 nM、60 nM、55 nM、50 nM、45 nM或40 nM)。在一些實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之KD 相對於第一多肽中包含SEQ ID NO:2之融合蛋白展現小於10倍之分揀蛋白結合降低。在一些實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之KD 相對於第一多肽中包含SEQ ID NO:2之融合蛋白展現小於5倍之分揀蛋白結合降低。
在一些實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50小於約25 nM (例如小於約20 nM、15 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1.5 nM或1 nM)。在特定實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於第一多肽中包含SEQ ID NO:2之融合蛋白展現小於10倍之分揀蛋白結合降低。在某些實施例中，如本文所述(例如實例4中所述)藉由ELISA量測EC50。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於參考融合蛋白展現小於10倍之分揀蛋白結合降低，其中該參考融合蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:2之第一多肽及(ii)與第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。
在一些實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於參考融合蛋白展現小於10倍之分揀蛋白結合降低，其中該參考融合蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:108之第一多肽及(ii)與第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。
在一些實施例中，在HEK細胞中產生參考融合蛋白。在一些實施例中，實質上如本文所述(例如實例1中所述)純化參考融合蛋白。
在一些實施例中，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生融合蛋白。在特定實施例中，大於50% (例如大於55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)之融合蛋白在融合蛋白之顆粒蛋白前體變異體部分之C端處不裂解。在一些實施例中，藉由一或多種方法自含有融合蛋白表現細胞之細胞培養基純化融合蛋白，該一或多種方法選自由以下組成之群：蛋白質A層析、離子交換層析、疏水相互作用管柱層析及透析。在一些實施例中，實質上如本文所述(例如實例1中所述)純化融合蛋白。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白，及醫藥學上可接受之載劑。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含複數種本文所述之融合蛋白，及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，大於50% (例如大於55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%)之複數種融合蛋白在融合蛋白之顆粒蛋白前體變異體中包含完整C端。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種治療患有神經退化性疾病、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD或顆粒蛋白前體相關病症之個體的方法，該方法包括向該個體投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體、本文所述之融合蛋白或本文所述之醫藥組合物。在特定實施例中，個體患有神經退化性疾病。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種增加個體中之顆粒蛋白前體或其變異體之量的方法，該方法包括向該個體投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體、本文所述之融合蛋白或本文所述之醫藥組合物。在某些實施例中，個體患有神經退化性疾病、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD或顆粒蛋白前體相關病症。在特定實施例中，個體患有神經退化性疾病。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種降低個體中之組織蛋白酶D活性的方法，該方法包括向該個體投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體、本文所述之融合蛋白或本文所述之醫藥組合物。在某些實施例中，個體患有神經退化性疾病、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD或顆粒蛋白前體相關病症。在特定實施例中，個體患有神經退化性疾病。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種在個體中增加溶酶體降解或改善溶酶體功能之方法，該方法包括向該個體投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體、本文所述之融合蛋白或本文所述之醫藥組合物。在某些實施例中，個體患有神經退化性疾病、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD或顆粒蛋白前體相關病症。在特定實施例中，個體患有神經退化性疾病。
在本文所述之方法之一些實施例中，神經退化性疾病為額顳葉型失智(FTD)、神經元類蠟脂褐質症(NCL)、A型尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease type A，NPA)、B型尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease type B，NPB)、C型尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease type C，NPC)、C9ORF72相關肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)/FTD、散發性ALS、阿茲海默氏病(AD)、高歇氏病(Gaucher's disease)或帕金森氏病。在某些實施例中，神經退化性疾病為FTD。
實施例亦涉及治療有需要之個體之FTD的方法，其中該方法包括向該個體投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白。在一些實施例中，FTD為C9ORF72相關FTD。
在前述方法中之任一者之一些實施例中，個體在編碼顆粒蛋白前體之基因中具有突變。
在另一個態樣中，本揭示案係關於一種包含編碼本文所述之顆粒蛋白前體變異體或多肽之核酸序列的多核苷酸。在另一個態樣中，本揭示案係關於一種包含本文所述之多核苷酸之載體。在另一個態樣中，本揭示案係關於一種包含本文所述之多核苷酸或載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞進一步包含如下多核苷酸，該多核苷酸包含編碼第二Fc多肽之核酸序列。在某些實施例中，第二Fc多肽具有選自SEQ ID NO: 61及64-87中之任一者之序列。在另一個態樣中，本揭示案係關於一種產生多肽之方法，該方法包括在表現由本文所述之多核苷酸編碼之多肽的條件下培養宿主細胞。
在另一個態樣中，提供一種評估化合物或監測個體對本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白或其醫藥組合物或給藥方案之反應用於治療本文所述之疾病或病症的方法，該方法包括：(a)量測來自患有顆粒蛋白前體相關病症之個體之測試樣品中之一或多種雙(單醯甘油)磷酸酯(BMP)物質及/或葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)的豐度，其中該測試樣品或個體已用化合物或其醫藥組合物治療(例如用本文所述之融合蛋白治療)；(b)比較(a)中量測之一或多種BMP物質及/或GlcSph與一或多個參考值之間的豐度差異；及(c)自比較確定化合物、其醫藥組合物或給藥方案(例如本文所述之融合蛋白)是否改善一或多種BMP物質水準及/或GlcSph水準用於治療疾病或病症。
在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包括用另一種化合物治療另一個測試樣品或個體及選擇改善一或多種BMP物質水準及/或GlcSph水準之候選化合物。
在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包括(d)維持或調整向測試樣品或個體投與化合物(例如本文所述之融合蛋白)之量或頻率；及(e)向測試樣品或向個體投與化合物。
在一些實施例中，本文所提供之方法進一步包括向個體投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體用於改善一或多種BMP物質水準及/或GlcSph水準以供治療顆粒蛋白前體相關病症。在一些實施例中，在治療後改善顆粒蛋白前體相關病症之一或多種徵象或症狀中之至少一者。
在一些實施例中，治療包括向個體投與本文所述之融合蛋白。在一些實施例中，治療包括向複數個個體或測試樣品投與化合物之文庫。
在一些實施例中，可自來自個體之相同測試樣品量測一或多種BMP物質之豐度及GlcSph之豐度。在其他實施例中，可自個體獲取兩個測試樣品(例如在相同時間或在不同時間獲取)，其中一個測試樣品可用於量測一或多種BMP物質之豐度，而另一個測試樣品可用於量測GlcSph之豐度。可自個體之相同流體、細胞或組織(例如全血、血漿、細胞、組織、血清、腦脊髓液、間隙液、唾液、尿液或淋巴)獲取兩個測試樣品。在其他實施例中，可自個體之不同流體、細胞或組織獲取兩個測試樣品，例如，一個樣品可為血漿，而另一個樣品可為腦組織。
在一些實施例中，在自參考個體或參考個體之群體(例如平均值)獲得之參考樣品中量測參考值。在一些實施例中，參考值為在參考樣品中量測之一或多種BMP物質之豐度。在一些實施例中，參考值為在參考樣品中量測之GlcSph之豐度。在一些實施例中，參考樣品為與測試樣品相同類型之細胞、組織或流體。在一些實施例中，量測來自不同類型之細胞、組織或流體之至少兩個參考值。
在一些實施例中，參考樣品為健康對照。在一些實施例中，參考個體或參考個體之群體不具有顆粒蛋白前體相關病症或水準降低之顆粒蛋白前體。在特定實施例中，參考個體或參考個體之群體不具有此種病症之任何徵象或症狀。
在一些實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在骨髓源性巨噬細胞(BMDM)中BMP物質水準提高，該等骨髓源性巨噬細胞活體外來源於患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的骨髓細胞。
在一些實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的肝、腦、腦脊髓液、血漿或尿液中BMP物質水準降低。
在一些實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的例如全血、血漿、細胞、組織、血清、腦脊髓液、間隙液、唾液、尿液、淋巴或其組合中GlcSph水準提高。在特定實施例中，可在個體之血漿中發現提高之GlcSph水準。
在一些實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的腦中，例如腦額葉及/或顳葉中GlcSph水準提高。在特定實施例中，可在額葉之一或多個區域，例如額上回、額中回、額下回及/或中央前回中發現提高之GlcSph水準。
在一些實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的細胞，諸如血細胞、腦細胞、外周血單核細胞(PBMC)、骨髓源性巨噬細胞(BMDM)、視網膜色素上皮(RPE)細胞、紅血球、白血球、神經細胞、小神經膠質細胞、大腦皮質細胞、脊髓細胞、骨髓細胞、肝細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛細胞、肌肉細胞、皮膚細胞、纖維母細胞、心臟細胞、淋巴結細胞或其組合中GlcSph水準提高。在一些實施例中，可在血細胞中發現提高之GlcSph水準。在一些實施例中，可在腦細胞中發現提高之GlcSph水準。
在一些實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的組織，諸如腦組織、大腦皮質組織、脊髓組織、肝組織、腎組織、肌肉組織、心臟組織、眼組織、視網膜組織、淋巴結、骨髓、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾組織、瓣膜組織或其組合中GlcSph水準提高。在一些實施例中，可在腦組織，諸如來自個體之腦額葉或顳葉之腦組織中發現提高之GlcSph水準。在特定實施例中，可在額葉之額上回、額中回、額下回及/或中央前回中發現提高之GlcSph水準。
在其他實施例中，相較於健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的胞內體、溶酶體、細胞外囊泡、胞外體、微泡或其組合中GlcSph水準提高。
在一些實施例中，相較於諸如健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照的對照之參考值，患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的測試樣品中之BMP物質及/或GlcSph之豐度具有至少約1.2倍、1.5倍或2倍差異。在其他實施例中，相較於諸如健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照的對照之參考值，患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體的測試樣品中之BMP物質及/或GlcSph之豐度具有約1.2倍至約5倍(例如約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍)差異。在一些實施例中，相較於參考值之差異為約2倍至約3倍(例如約2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍或3倍)。在一些實施例中，個體具有與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症及/或與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症的一或多種徵象或症狀。
在一些實施例中，參考值為治療之前的BMP物質值及/或GlcSph值。在一些實施例中，針對水準降低之顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體相關病症治療個體，且測試樣品包括在已開始治療之前自個體獲得之一或多個治療前測試樣品及在已開始治療之後自個體獲得之一或多個治療後測試樣品。在一些實施例中，方法進一步包括當治療後一或多種BMP物質中之至少一者及/或GlcSph之豐度相對於健康對照顯示優於治療前一或多種BMP物質及/或GlcSph之改善時確定個體對治療有反應。
在一些實施例中，方法包括(a)量測自個體獲得之測試樣品中之一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度；(b)用化合物、其醫藥組合物或給藥方案治療測試樣品或個體(例如用本文所述之Fc二聚體:PGRN融合蛋白治療測試樣品或個體)；(c)量測自經治療之個體獲得之測試樣品中之一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度；及(d)比較步驟(a)及(c)中量測之一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度；及(e)確定化合物或給藥方案是否改善BMP水準及/或GlcSph水準用於治療顆粒蛋白前體相關病症。
在一些實施例中，在已開始治療之後的不同時間點獲得兩個或更多個治療後測試樣品，且方法進一步包括當治療後樣品中量測之一或多種BMP物質中之至少一者之豐度a)在BMDM中低於或b)在肝、腦、腦脊髓液、血漿或尿液中高於治療前樣品中量測之相應一或多種BMP物質之豐度時確定個體對治療有反應。在一些實施例中，當治療後樣品中量測之一或多種BMP物質中之至少一者之豐度相比治療前樣品中量測之相應一或多種BMP物質之豐度a)在BMDM中至少約低1.2倍或b)在肝、腦、腦脊髓液、血漿或尿液中至少約高1.2倍時確定個體對治療有反應。
在一些實施例中，在已開始治療之後的不同時間點獲得兩個或更多個治療後測試樣品，且方法進一步包括當治療後樣品中量測之GlcSph之豐度在例如全血、血漿、細胞、組織、血清、腦脊髓液、間隙液、唾液、尿液或淋巴中低於治療前樣品中量測之GlcSph之豐度時確定個體對治療有反應。在一些實施例中，當治療後樣品中量測之GlcSph之豐度相比治療前樣品中量測之GlcSph之豐度在例如全血、血漿、細胞、組織、血清、腦脊髓液、間隙液、唾液、尿液或淋巴中至少約低1.2倍(例如至少約低1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍)時確定個體對治療有反應。
在一些實施例中，改善之BMP物質水準及/或GlcSph水準為相對於諸如健康對照或與顆粒蛋白前體相關病症無關之對照的對照之參考值優於治療之前BMP物質水準及/或GlcSph水準之改善。在一些實施例中，改善之BMP物質水準及/或GlcSph水準的值相比治療前BMP物質水準及/或GlcSph水準與對照之接近程度更接近於對照。在一些實施例中，改善之BMP物質水準及/或GlcSph水準相較於對照具有小於20%、15%、10%或5%之差異。在一些實施例中，改善之BMP物質水準及/或GlcSph水準相較於健康對照具有小於10%或5%之差異。在一些實施例中，改善之BMP物質水準及/或GlcSph水準相較於健康對照具有小於5%之差異。
在一些實施例中，方法進一步包括當一或多個治療後測試樣品中之至少一者中量測的一或多種BMP物質中之至少一者及/或GlcSph之豐度與健康對照之相應參考值大約相同時確定個體對治療有反應。
在一些實施例中，測試或參考樣品或一或多個參考值包括或涉及細胞、組織、全血、血漿、血清、腦脊髓液、間隙液、唾液、尿液、糞便、支氣管肺泡灌洗液、淋巴、精液、母乳、羊水或其組合。在一些實施例中，細胞為外周血單核細胞(PBMC)、BMDM、視網膜色素上皮(RPE)細胞、血細胞、紅血球、白血球、神經細胞、小神經膠質細胞、腦細胞、大腦皮質細胞、脊髓細胞、骨髓細胞、肝細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛細胞、肌肉細胞、皮膚細胞、纖維母細胞、心臟細胞、淋巴結細胞或其組合。在一些實施例中，細胞為經培養之細胞。在一些實施例中，經培養之細胞為BMDM或RPE細胞。
在一些實施例中，組織包括腦組織、大腦皮質組織、脊髓組織、肝組織、腎組織、肌肉組織、心臟組織、眼組織、視網膜組織、淋巴結、骨髓、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾組織、瓣膜組織或其組合。在一些實施例中，測試及/或參考樣品自細胞及/或組織純化且包含胞內體、溶酶體、細胞外囊泡、胞外體、微泡或其組合。
在一些實施例中，一或多種BMP物質包含兩種或更多種BMP物質。在一些實施例中，一或多種BMP物質包含BMP (16:0_18:1)、BMP (16:0_18:2)、BMP (18:0_18:0)、BMP (18:0_18:1)、BMP (18:1_18:1)、BMP (16:0_20:3)、BMP (18:1_20:2)、BMP (18:0_20:4)、BMP (16:0_22:5)、BMP (20:4_20:4)、BMP (22:6_22:6)、BMP (20:4_20:5)、BMP (18:2_18:2)、BMP (16:0_20:4)、BMP (18:0_18:2)、BMP (18:0e_22:6)、BMP (18:1e_20:4)、BMP (18:3_22:5)、BMP (20:4_22:6)、BMP (18:0e_20:4)、BMP (18:2_20:4)、BMP (18:1_22:6)、BMP (18:1_20:4)、BMP (18:0_22:6)或其組合。
在一些實施例中，一或多種BMP物質包含BMP (18:1_18:1)、BMP (18:0_20:4)、BMP (20:4_20:4)、BMP (22:6_22:6)、BMP (20:4_22:6)、BMP (18:1_22:6)、BMP (18:1_20:4)、BMP (18:0_22:6)、BMP (18:3_22:5)或其組合。
在一些實施例中，測試樣品包含經培養之細胞且一或多種BMP物質包含BMP (18:1_18:1)。在一些實施例中，測試樣品包含血漿、組織、尿液、腦脊髓液(CSF)及/或腦或肝組織，且一或多種BMP物質包含BMP (22:6_22:6)。在一些實施例中，測試樣品包含肝組織且一或多種BMP物質包含BMP (22:6_22:6)、BMP (18:3_22:5)或其組合。在一些實施例中，測試樣品包含CSF或尿液且一或多種BMP物質包含BMP (22:6_22:6)。在一些實施例中，測試樣品包含小神經膠質細胞且一或多種BMP物質包含BMP (18:3_22:5)。
在一些實施例中，使用液相層析-串聯質譜法(LC-MS/MS)量測一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度。在一些實施例中，內部BMP及/或GlcSph標準用於在步驟(a)中量測一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度及/或確定相應參考值。在一些實施例中，內部BMP及/或GlcSph標準包括非天然存在於個體及/或參考個體或參考個體之群體中之BMP物質及/或GlcSph。在一些實施例中，內部BMP標準包括BMP (14:0_14:0)。在一些實施例中，內部GlcSph標準包括氘標記之GlcSph。
在一些實施例中，個體患有與顆粒蛋白前體表現、處理、糖基化、細胞吸收、運輸及/或功能相關之病症，或處於發展該病症之風險下。在一些實施例中，個體及/或參考個體或參考個體之群體具有水準降低之顆粒蛋白前體及/或與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症，且測試樣品已與候選化合物(例如本文所述之Fc二聚體:PGRN融合蛋白)接觸。在一些實施例中，個體及/或參考個體或參考個體之群體具有與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症的一或多種徵象或症狀。在一些實施例中，個體及/或參考個體或參考個體之群體在顆粒蛋白(GRN )基因中具有突變。在一些實施例中，GRN 基因中之突變降低顆粒蛋白前體表現及/或活性。在一些實施例中，個體患有動脈粥樣硬化、高歇氏病(例如1型、2型或3型高歇氏病)或AMD，或處於發展該等疾病之風險下。在一些實施例中，個體患有與TDP-43相關之病症(例如AD或ALS)，或處於發展該病症之風險下。
在一些實施例中，個體及/或參考個體為人類、非人類靈長類動物、囓齒動物、犬或豬。
在另一個態樣中，本揭示案提供一種用於監測個體中之顆粒蛋白前體變異體水準之套組。在一些實施例中，套組包括BMP及/或GlcSph標準用於量測自個體獲得之測試樣品及/或自參考個體或參考個體之群體獲得之參考樣品中之一或多種BMP物質及/或GlcSph的豐度。在一些實施例中，BMP及/或GlcSph標準包括非天然存在於個體及/或參考個體中之BMP物質及/或GlcSph。在一些實施例中，BMP標準包括BMP (14:0_14:0)。在一些實施例中，GlcSph標準為氘標記之GlcSph。
在一些實施例中，套組進一步包括用於自個體及/或參考個體獲得樣品、處理樣品、量測一或多種BMP物質之豐度、量測GlcSph之豐度或其組合之試劑。在一些實施例中，套組進一步包括使用說明書。
I. 前言
提高水準之顆粒蛋白前體可適用於治療個體之許多疾病，尤其在個體具有降低之顆粒蛋白前體水準之情況下。吾等發現當在CHO細胞中表現時野生型顆粒蛋白前體之C端裂解，此導致分揀蛋白結合削弱。分揀蛋白直接結合至顆粒蛋白前體且涉及到顆粒蛋白前體至細胞溶酶體之吸收及運輸。為減少此種裂解，吾等開發在C端處具有胺基酸修飾之顆粒蛋白前體變異體，以及包括一或多個連接至Fc多肽之顆粒蛋白前體變異體之融合蛋白。特定而言，相較於野生型顆粒蛋白前體，本文所述之某些變異體在野生型顆粒蛋白前體之C端處之QLL序列中具有一或多個胺基酸取代或具有添加至C端之額外胺基酸。重要地，此等顆粒蛋白前體變異體可維持分揀蛋白結合。因此，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白適合於治療此類疾病，包括神經退化性疾病(例如FTD)、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD或顆粒蛋白前體相關病症。
除開發此等顆粒蛋白前體變異體以外，吾等亦已開發含有融合至Fc分子之顆粒蛋白前體變異體之融合蛋白。在一些情況下，融合蛋白包括二聚Fc多肽，其中Fc多肽單體中之至少一者連接至顆粒蛋白前體變異體。Fc多肽可提高顆粒蛋白前體水準，且在一些情況下可經修飾以向蛋白質賦予額外功能特性。
吾等亦已開發有助於顆粒蛋白前體或其變異體跨越血腦障壁(BBB)遞送之融合蛋白。此等蛋白質包含形成二聚體之Fc多肽及經修飾之Fc多肽，以及連接至Fc區及/或經修飾之Fc區的顆粒蛋白前體或其變異體。經修飾之Fc區可特異性結合至BBB受體，諸如TfR。當向個體投與時，融合蛋白結合至TfR受體，該TfR受體存在於形成BBB之內皮上。融合蛋白可跨越BBB進行胞吞轉運，由此增加其於腦中之濃度。
顆粒蛋白前體(PGRN) (亦稱為上皮素前體及頂顆粒蛋白)為由定位至人類染色體17q21之基因GRN 編碼之富半胱胺酸蛋白。顆粒蛋白前體為由保守顆粒蛋白肽之七個半串聯重複組成之溶酶體蛋白以及分泌蛋白，其中每一者為約60個胺基酸長且可由各種細胞外蛋白酶(例如彈性蛋白酶)及溶酶體蛋白酶(例如組織蛋白酶L)經裂解而釋放(Kao等人,Nat Rev Neurosci. 18(6):325-333, 2017)。一般而言，據信顆粒蛋白前體在先天性免疫以及溶酶體功能之控制中起到細胞自主性及非細胞自主性作用，其中顆粒蛋白前體調控各種組織蛋白酶及其他水解酶之活性及水準(Kao等人, 同上)。顆粒蛋白前體亦具有神經營養功能且促進神經突外生及神經元存活(Kao等人, 同上)。 II. 定義
除非上下文另有明確規定，否則如本文所用，單數形式「一個/種(a/an)」及「該」包括複數個(種)指示物。因此，舉例而言，提及「一個多肽」可包括兩個或更多個此類分子，及類似情況。
如本文所用，術語「約」及「近似」當用於修飾以數值或範圍指定之量時，指示該數值以及熟習此項技術者已知的與該值之合理偏差，例如± 20%、± 10%或± 5%，在所述值之預定含義內。
「顆粒蛋白前體」或「PRGN」係指由基因GRN 編碼之富半胱胺酸溶酶體蛋白。顆粒蛋白前體可包含人類顆粒蛋白前體序列，例如SEQ ID NO:1或2之序列。顆粒蛋白前體可包含SEQ ID NO:1之序列，其中最初17個胺基酸指示信號肽。顆粒蛋白前體可為成熟顆粒蛋白前體，其中17個胺基酸之信號肽經裂解。成熟顆粒蛋白前體可包含SEQ ID NO:2之序列。顆粒蛋白前體可包括呈含有信號肽之形式或成熟形式之序列，其來自非人類物種，例如小鼠(寄存編號NP_032201.2)、大鼠(NP_058809.2或NP_001139314.1)及黑猩猩(XP_016787144.1或XP_016787145.1)。
「顆粒蛋白前體變異體」或「PRGN變異體」係指野生型顆粒蛋白前體之序列變異體。顆粒蛋白前體變異體可具有與野生型顆粒蛋白前體之彼等功能類似或實質上相同之功能，例如，其中顆粒蛋白前體變異體亦結合分揀蛋白或鞘脂激活蛋白原，調控各種溶酶體蛋白(例如組織蛋白酶)之活性及水準，促進神經突外生及神經元存活，及/或本文所述之任何其他功能。
術語「顆粒蛋白前體相關病症」係指涉及顆粒蛋白前體，包括表現、處理、糖基化、細胞吸收、運輸及/或功能之任何病理性疾患。術語「與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症」係指由不足以能夠執行(亦即，過低而不能執行)細胞、組織及/或個體內之正常生理功能之顆粒蛋白前體水準直接或間接引起的任何病理性疾患，以及此類疾患之前兆。舉例而言，顆粒蛋白前體相關病症可由顆粒蛋白前體基因(GRN )中之突變引起或與該突變相關。在一些實施例中，顆粒蛋白前體相關病症為神經退化性疾病(例如FTD)或溶酶體貯積症。
術語「顆粒蛋白前體水準」係指存在於個體中或樣品(例如自個體獲得之樣品)中之顆粒蛋白前體之量、濃度及/或活性水準。顆粒蛋白前體水準可指所存在之顆粒蛋白前體之絕對量、濃度及/或活性水準，或可指相對量、濃度及/或活性水準。該術語亦指所存在之顆粒蛋白前體及/或顆粒蛋白前體mRNA (例如自GRN 基因表現)之量或濃度。
術語「骨髓源性巨噬細胞」或「BMDM」係指活體外自哺乳動物骨髓(例如自個體獲得之骨髓)產生或得到之巨噬細胞。作為非限制性實例，BMDM可藉由在諸如巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之細胞激素存在下培養未分化之骨髓細胞而產生。
如本揭示案之上下文所用，「轉鐵蛋白受體」或「TfR」係指轉鐵蛋白受體蛋白質1。人類轉鐵蛋白受體1多肽序列以SEQ ID NO:109列出。亦已知來自其他物種之轉鐵蛋白受體蛋白質1序列(例如黑猩猩，寄存編號XP_003310238.1；恆河猴，NP_001244232.1；犬，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；及雞，NP_990587.1)。術語「轉鐵蛋白受體」亦涵蓋由轉鐵蛋白受體蛋白質1染色體基因座處之基因編碼之例示性參考序列，例如人類序列的對偶基因變異體。全長轉鐵蛋白受體蛋白質包括短N端細胞內區、跨膜區及大細胞外結構域。細胞外結構域以三個結構域為特徵：蛋白酶樣結構域、螺旋結構域及頂端結構域。
如本文所用，術語「Fc多肽」係指以Ig摺疊成結構域為特徵之天然存在之免疫球蛋白重鏈多肽的C端區。Fc多肽含有至少包括CH2結構域及/或CH3結構域之恆定區序列且可含有鉸鏈區之至少一部分。一般而言，Fc多肽不含可變區。
「經修飾之Fc多肽」係指相較於野生型免疫球蛋白重鏈Fc多肽序列具有至少一個突變，例如取代、缺失或插入，但保留天然Fc多肽之總體Ig摺疊或結構的Fc多肽。
如本文所用，術語「Fc多肽二聚體」係指兩個Fc多肽之二聚體。在一些實施例中，兩個Fc多肽藉由兩個CH3結構域之間的相互作用二聚化。若鉸鏈區或鉸鏈去之部分存在於兩個Fc多肽中，則一或多個二硫鍵亦可在兩個二聚化Fc多肽之鉸鏈區之間形成。
「經修飾之Fc多肽二聚體」係指兩個Fc多肽之二聚體，其中至少一個Fc多肽為經修飾之Fc多肽，該經修飾之Fc多肽相較於野生型免疫球蛋白重鏈Fc多肽序列具有至少一個突變，例如取代、缺失或插入。舉例而言，經修飾之Fc多肽二聚體可為特異性結合TfR且具有至少一個經修飾之Fc多肽的二聚體，該至少一個經修飾之Fc多肽相較於野生型免疫球蛋白重鏈Fc多肽序列具有至少一個突變，例如取代、缺失或插入。
如本文所用，術語「CH3結構域」及「CH2結構域」係指免疫球蛋白恆定區結構域多肽。出於本申請案之目的，CH3結構域多肽係指如根據EU編號方案編號自大約位置341至大約位置447之胺基酸的區段，且CH2結構域多肽係指如根據EU編號方案編號自大約位置231至大約位置340之胺基酸的區段且不包括鉸鏈區序列。CH2及CH3結構域多肽亦可藉由IMGT (ImMunoGeneTics)編號方案編號，其中根據IMGT Scientific圖表編號(IMGT網站)，CH2結構域編號為1-110且CH3結構域編號為1-107。CH2及CH3結構域為免疫球蛋白Fc區之一部分。Fc區係指如根據EU編號方案編號自大約位置231至大約位置447之胺基酸的區段，但如本文所用，可包括抗體鉸鏈區之至少一部分。說明性鉸鏈區序列為人類IgG1鉸鏈序列EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:88)。
關於CH3或CH2結構域之術語「野生型」、「天然」及「天然存在」在本文中用於指具有自然界中存在之序列的結構域。
在本揭示案之上下文中，關於突變多肽或突變多核苷酸之術語「突變體」與「變異體」可互換使用。關於給定野生型CH3或CH2結構域參考序列之變異體可包括天然存在之對偶基因變異體。「非天然」存在之CH3或CH2結構域係指在自然界中不存在於細胞中且藉由例如使用基因工程改造技術或誘變技術對天然CH3結構域或CH2結構域多核苷酸或多肽進行基因修飾而產生之變異或突變結構域。「變異體」包括相對於野生型包含至少一個胺基酸突變之任何結構域。突變可包括取代、插入及缺失。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸以及胺基酸類似物及以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的胺基酸模擬物。
天然存在之胺基酸為由基因密碼編碼之彼等胺基酸，以及稍後經修飾之彼等胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構(亦即，α碳結合至氫、羧基、胺基及R基團)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。「胺基酸模擬物」係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構，但以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的化合物。
天然存在之α-胺基酸包括但不限於丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺酸(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸之立體異構體包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺酸(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號提及。
術語「多肽」與「肽」在本文中可互換使用以指呈單鏈之胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸聚合物可僅包含L-胺基酸，僅包含D-胺基酸，或包含L及D胺基酸之混合物。
如本文所用，術語「蛋白質」係指多肽或者單鏈多肽之二聚體(亦即，兩個)或多聚體(亦即，三個或更多個)。蛋白質之單鏈多肽可由共價鍵(例如二硫鍵)或非共價相互作用接合。
術語「保守取代」、「保守突變」或「保守修飾之變異體」係指使得胺基酸經可歸類為具有類似特徵之另一個胺基酸取代的改變。以此種方式定義之保守胺基酸組之類別的實例可包括：「帶電/極性組」，包括Glu (麩胺酸或E)、Asp (天冬胺酸或D)、Asn (天冬醯胺或N)、Gln (麩醯胺酸或Q)、Lys (離胺酸或K)、Arg (精胺酸或R)及His (組胺酸或H)；「芳族組」，包括Phe (苯丙胺酸或F)、Tyr (酪胺酸或Y)、Trp (色胺酸或W)及(組胺酸或H)；及「脂族組」，包括Gly (甘胺酸或G)、Ala (丙胺酸或A)、Val (纈胺酸或V)、Leu (白胺酸或L)、Ile (異白胺酸或I)、Met (甲硫胺酸或M)、Ser (絲胺酸或S)、Thr (蘇胺酸或T)及Cys (半胱胺酸或C)。在各組內，亦可鑑定子組。舉例而言，帶電或極性胺基酸組可細分成包括以下之子組：「帶正電子組」，包括Lys、Arg及His；「帶負電子組」，包括Glu及Asp；及「極性子組」，包括Asn及Gln。在另一個實例中，芳族或環狀組可細分成包括以下之子組：「氮環子組」，包括Pro、His及Trp；及「苯基子組」，包括Phe及Tyr。在又另一個實例中，脂族組可細分成子組，例如「脂族非極性子組」，包括Val、Leu、Gly及Ala；及「脂族弱極性子組」，包括Met、Ser、Thr及Cys。保守突變之類別的實例包括在上述子組內之胺基酸之胺基酸取代，諸如但不限於：Lys取代Arg或反之亦然，由此可維持正電荷；Glu取代Asp或反之亦然，由此可維持負電荷；Ser取代Thr或反之亦然，由此可維持游離-OH；及Gln取代Asn或反之亦然，由此可維持游離-NH2 。在一些實施例中，用疏水性胺基酸取代例如在活性位點中之天然存在之疏水性胺基酸，以保持疏水性。
在兩個或更多個多肽序列之情形中，術語「一致」或百分比「一致性」係指當在比較窗口或指定區域內比較及比對以達到最大對應性時，如使用序列比較算法或藉由手動比對及目測檢查所量測，相同的或具有在指定區域內一致之胺基酸殘基之指定百分比，例如至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%或更大一致性的兩個或更多個序列或子序列。
對於多肽之序列比較，典型地一個胺基酸序列充當參考序列，以與候選序列相比較。比對可使用熟習此項技術者可用之各種方法，例如目測比對或使用公開可用之軟體使用已知算法進行，以達成最大比對。此類程式包括BLAST程式、ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Calif.)或Megalign (DNASTAR)。用於比對以達成最大比對之參數可由熟習此項技術者確定。出於本申請案之目的，對於多肽序列之序列比較，使用以預設參數比對兩個蛋白質序列之BLASTP算法標準蛋白質BLAST。
當在鑑定多肽序列中之給定胺基酸殘基之情形中使用時，術語「對應於」、「參照……確定」或「參照……編號」係指當將給定胺基酸序列與指定參考序列最大程度地比對及比較時該參考序列之殘基位置。因此，舉例而言，經修飾之Fc多肽中之胺基酸殘基當與SEQ ID NO:61最佳比對時，在殘基與SEQ ID NO:61中之胺基酸比對之情況下，其「對應於」SEQ ID NO:61中之胺基酸。與參考序列比對之多肽無需與參考序列長度相同。
如本文所用，「結合親和力」係指兩個分子，例如多肽上之單一結合位點與標靶之間的非共價相互作用之強度，該標靶為例如多肽所結合之轉鐵蛋白受體。因此，舉例而言，除非上下文另有指示或顯而易見，否則該術語可指多肽與其標靶之間的1:1相互作用。結合親和力可藉由量測平衡解離常數(KD )來定量，該平衡解離常數係指解離速率常數(kd ，時間-1 )除以締合速率常數(ka ，時間-1 M-1 )。可藉由例如使用表面電漿子共振(SPR)方法，例如Biacore™系統；動力學排除檢定，諸如KinExA® ；及生物膜層干涉法(例如使用ForteBio® Octet® 平台)量測複合物形成及解離之動力學來確定KD 。如本文所用，「結合親和力」不僅包括形式上之結合親和力，諸如反映多肽與其標靶之間的1:1相互作用之彼等結合親和力，而且包括可反映親合性結合之計算KD 之表觀親和力。
片語「特異性結合」或「選擇性結合」至標靶，例如轉鐵蛋白受體，當涉及包含如本文所述之結合轉鐵蛋白受體之經修飾之Fc多肽的多肽時，係指多肽相比其結合至結構上不同之標靶，例如不在轉鐵蛋白受體家族中之標靶以更高親和力、更大親合力及/或更長持續時間結合至標靶的結合反應。在典型實施例中，當在相同親和力檢定條件下檢定時，多肽相較於無關標靶對轉鐵蛋白受體具有至少5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、1000倍、10,000倍或更高之親和力。如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性結合至」或「特異性針對」特定標靶(例如TfR)可例如由對所結合之標靶具有例如10-4 M或更小，例如10-5 M、10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或10-12 M之平衡解離常數KD 的分子展現。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽特異性結合至在物種當中保守(例如在物種當中結構上保守)，例如在非人類靈長類動物與人類物種之間保守(例如在非人類靈長類動物與人類物種之間結構上保守)的轉鐵蛋白受體上之抗原決定基。在一些實施例中，多肽可排他性地結合至人類轉鐵蛋白受體。
術語「治療(treatment/treat)」及類似術語在本文中一般用於意指獲得所需藥理學及/或生理學作用。「治療」可指在治療或改善疾病，包括神經退化性疾病(例如FTD、NCL、NPA、NPB、NPC、C9ORF72相關ALS/FTD、散發性ALS、AD、高歇氏病(例如1型、2型或3型高歇氏病)及帕金森氏病)、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD及顆粒蛋白前體相關病症中之成功的任何指標，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除、緩解、患者存活狀況改善、存活時間或存活率增加、減輕症狀或使患者對病症更易忍受、減緩退化或衰退之速率，或改善患者之身體或精神健康。症狀之治療或改善可基於客觀或主觀參數。治療作用可與未接受治療之一位個體或一組個體，或與治療之前或在治療期間之不同時間的同一患者相比較。
如本文中可互換使用之術語「個體」、「個人」及「患者」係指哺乳動物，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、囓齒動物(例如大鼠、小鼠及天竺鼠)、兔、牛、豬、馬及其他哺乳動物物種。在一個實施例中，患者為人類。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指在生物學上或藥理學上相容的用於人類或動物中之非活性醫藥成分，諸如但不限於緩衝劑、載劑或防腐劑。
如本文所用，藥劑之「治療量」或「治療有效量」為治療個體之疾病症狀之藥劑的量。
術語「投與」係指將藥劑、化合物或組合物遞送至生物作用之所需部位的方法。此等方法包括但不限於局部遞送、非經腸遞送、靜脈內遞送、皮內遞送、肌肉內遞送、鞘內遞送、結腸遞送、直腸遞送或腹膜內遞送。在一個實施例中，靜脈內投與本文所述之多肽。 III. 顆粒蛋白前體替代療法
在一些態樣中，本文描述顆粒蛋白前體變異體及包含其之融合蛋白。本文所述之融合蛋白包含Fc多肽二聚體及顆粒蛋白前體變異體。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白進一步包含第二顆粒蛋白前體或其變異體(例如野生型顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體)。Fc多肽二聚體中之Fc多肽可含有修飾(例如一或多個促進異二聚化之修飾)或可為野生型Fc多肽。在一些實施例中，Fc多肽二聚體中之一或兩個Fc多肽可含有得以結合至BBB受體，例如TfR之修飾。Fc多肽二聚體中之一或兩個Fc多肽可為TfR結合Fc多肽。顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體可接合至Fc多肽(例如野生型Fc多肽或TfR結合Fc多肽)之N端或C端。在一些實施例中，顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體可直接(例如經肽鍵)或經由連接子接合至Fc多肽(例如野生型Fc多肽或TfR結合Fc多肽)。在其他實施例中，鉸鏈區或其一部分可存在於Fc多肽(例如野生型Fc多肽或TfR結合Fc多肽)之N端處。若鉸鏈區或其一部分存在，則顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體可直接或經由連接子接合至鉸鏈區或其部分之N端。
在神經退化性疾病中可缺乏顆粒蛋白前體。在FTD中以及其他疾病，諸如高歇氏病及AD中可缺乏顆粒蛋白前體。併入融合蛋白中之顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體可結合至分揀蛋白或鞘脂激活蛋白原(例如結合至分揀蛋白)。
在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體相較於其在未接合至Fc多肽或TfR結合Fc多肽時的活性保留至少25%之其活性。在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體相較於其在未接合至Fc多肽或TfR結合Fc多肽時的活性保留至少10%或至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% (例如至少80%、85%、90%或95%)之其活性。
在一些實施例中，與Fc多肽或TfR結合Fc多肽之融合不降低顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體之表現及/或活性。 IV. 顆粒蛋白前體變異體
本文提供在野生型顆粒蛋白前體之C端處具有胺基酸修飾或添加之顆粒蛋白前體變異體。顆粒蛋白前體變異體為與成熟野生型顆粒蛋白前體(例如SEQ ID NO:2)具有至少90%序列一致性(例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)且在野生型顆粒蛋白前體之C端處具有胺基酸修飾或添加的野生型顆粒蛋白前體之功能變異體。
在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體在野生型顆粒蛋白前體之C端處包含修飾，以使得在顆粒蛋白前體變異體之C端處之最後三個胺基酸不為QLL。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:2至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致之序列，其中對應於SEQ ID NO:2之殘基574至576之位置具有由X1 X2 X3 定義之胺基酸序列，且限制條件為X1 X2 X3 合在一起不為QLL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1 X2 X3 (SEQ ID NO:3)， 其中X1 、X2 及X3 中之每一者獨立地為胺基酸，且X1 X2 X3 合在一起不為QLL。在某些實施例中，X1 為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。在某些實施例中，X2 為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。在某些實施例中，X3 為L、Y或P。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為PX2 L。在某些實施例中，PX2 L中之X2 可為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R (例如H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I或F)。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:4-18中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有PHL、PKL、PDL、PEL、PSL、PTL、PNL、PQL、PGL、PPL、PAL、PYL、PVL、PIL或PFL。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:13之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有PPL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:13之序列。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:15之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有PYL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:15之序列。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:17之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有PIL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:17之序列。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:18之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有PFL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:18之序列。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為QX2 L。在某些實施例中，QX2 L中之X2 可為R、H、K、D、E、N、P、Y或Q。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:19-27中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有QRL、QHL、QKL、QDL、QEL、QNL、QPL、QYL或QQL。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:19之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有QRL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:19之序列。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:20之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有QHL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:20之序列。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:27之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有QQL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:27之序列。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為VX2 L。在某些實施例中，VX2 L中之X2 可為V或T。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:28及29中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有VVL或VTL。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:28之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有VVL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:28之序列。詳言之，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:29之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有VTL。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:29之序列。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 IL。在某些實施例中，X1 IL中之X1 可為R、H、K、E、P、N、F或Y (例如R、H、K、E或P)。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:30-33及17中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有RIL、HIL、KIL、EIL或PIL。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 FL。在某些實施例中，X1 FL中之X1 可為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y或P。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:34-45及18中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有RFL、HFL、KFL、DFL、EFL、SFL、TFL、NFL、QFL、LFL、FFL、YFL或PFL。
在一些實施例中，X1 X2 X3 為X1 QL。在某些實施例中，X1 QL中之X1 可為R、H、K、D、E、N、L、F、Y或Q。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:46-54及27中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有RQL、HQL、KQL、DQL、EQL、NQL、LQL、FQL、YQL或QQL。
在其他實施例中，X1 X2 X3 為X1 X2 L，其中X2 為A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。
在其他實施例中，顆粒蛋白前體變異體相較於野生型顆粒蛋白前體在C端處包含額外胺基酸。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可包含添加至野生型顆粒蛋白前體之C端處之胺基酸QLL或LRQLL (SEQ ID NO:58)。舉例而言，顆粒蛋白前體變異體可包含與SEQ ID NO:2之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基576之位置的相鄰及C端處由Y1 Y2 QLL定義之序列(SEQ ID NO:137)，其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體包含序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1 Y2 QLL (SEQ ID NO:55)。
在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:56之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有胺基酸QLLQLL (SEQ ID NO:59)。在特定實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:56之序列。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:57之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體在C端處具有胺基酸QLLLRQLL (SEQ ID NO:60)。在特定實施例中，顆粒蛋白前體變異體具有SEQ ID NO:57之序列。
本文所述之顆粒蛋白前體變異體(例如具有SEQ ID NO:3-57、111-121、127及128中之任一者之序列的顆粒蛋白前體變異體)可接合至Fc多肽(例如野生型Fc多肽或經修飾之Fc多肽)之N端或C端。在一些實施例中，連接至Fc多肽之顆粒蛋白前體變異體可具有選自SEQ ID NO:13、15、17、18、19、20及27-29中之任一者之序列。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可直接(例如經肽鍵)或經由連接子接合至Fc多肽(例如野生型Fc多肽或經修飾之Fc多肽)。若鉸鏈區或其一部分存在於Fc多肽(例如野生型Fc多肽或經修飾之Fc多肽)之N端處，則顆粒蛋白前體變異體可直接或經由連接子接合至鉸鏈區或其部分之N端。
此外，本文所述之顆粒蛋白前體變異體可自CHO細胞產生。在特定實施例中，所產生之大於50% (例如大於55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)之顆粒蛋白前體變異體在C端處不截短(例如保持完整)。在特定實施例中，大於50% (例如大於55%、65%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)之顆粒蛋白前體變異體能夠以相對於野生型顆粒蛋白前體(例如自HEK細胞產生之野生型顆粒蛋白前體)降低小於10倍(例如小於9倍、8倍、7倍、6倍或5倍)之KD 值結合分揀蛋白。可藉由例如包括蛋白質A層析、離子交換層析、疏水相互作用管柱層析及/或透析之純化方案自含有顆粒蛋白前體變異體表現細胞之細胞培養基來純化顆粒蛋白前體變異體。 V. Fc多肽及其修飾
在一些態樣中，本文所述之融合蛋白可包含顆粒蛋白前體變異體及Fc多肽二聚體，其中二聚體中之一或兩個Fc多肽相對於野生型Fc多肽含有胺基酸修飾。在一些實施例中，Fc多肽(例如經修飾之Fc多肽)中之胺基酸修飾可使得Fc多肽二聚體結合至BBB受體(例如TfR)，促進二聚體中之兩個Fc多肽之異二聚化，調節效應子功能，延長血清半衰期，影響糖基化，及/或降低人類中之免疫原性。在一些實施例中，存在於融合蛋白中之Fc多肽獨立地與相應野生型Fc多肽(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之胺基酸序列一致性。經修飾之Fc多肽(例如TfR結合Fc多肽)之實例及描述可見於例如國際專利公開案第WO 2018/152326號中，該公開案以全文引用之方式併入本文中。 針對BBB受體結合之Fc多肽修飾
本文提供包含能夠跨越BBB轉運之顆粒蛋白前體變異體之融合蛋白。此種蛋白質包含結合至BBB受體之經修飾之Fc多肽。BBB受體在BBB內皮以及其他細胞及組織類型上表現。在一些實施例中，BBB受體為TfR。
在各種Fc修飾中指定之胺基酸殘基，包括引入結合至BBB受體(例如TfR)之經修飾之Fc多肽中之彼等殘基，在本文中使用EU索引編號進行編號。任何Fc多肽，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽，可在如本文所述之一或多個位置處具有修飾，例如胺基酸取代。在一些實施例中，針對BBB (例如TfR)受體結合活性而修飾之結構域為人類Ig CH3結構域，諸如IgG1 CH3結構域。CH3結構域可屬於任何IgG亞型，亦即，來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗體之情形中，CH3結構域係指如根據EU編號方案編號自大約位置341至大約位置447之胺基酸的區段。
在一些實施例中，特異性結合至TfR之經修飾之Fc多肽結合至TfR之頂端結構域且可結合至TfR，而不阻斷或以其他方式抑制轉鐵蛋白與TfR之結合。在一些實施例中，轉鐵蛋白與TfR之結合實質上不受抑制。在一些實施例中，對轉鐵蛋白與TfR之結合的抑制小於約50% (例如小於約45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%)。
在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在包括266、267、268、269、270、271、295、297、298及299之胺基酸位置處包含一或多個，至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，至少四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在包括274、276、283、285、286、287、288、289及290之胺基酸位置處包含至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，至少四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在包括268、269、270、271、272、292、293、294、296及300之胺基酸位置處包含至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，至少四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在包括272、274、276、322、324、326、329、330及331之胺基酸位置處包含至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，至少四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在包括345、346、347、349、437、438、439及440之胺基酸位置處包含至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，至少四個、五個、六個或七個取代。
在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在胺基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416及421處包含至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，至少四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。在一些實施例中，在位置388及/或421處之胺基酸為芳族胺基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些實施例中，在位置388處之胺基酸為Trp。在一些實施例中，在位置421處之芳族胺基酸為Trp或Phe。在額外實施例中，BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽根據EU編號方案在包括391、392、414、415、424及426之位置處進一步包含一或多個取代。在一些實施例中，位置414為Lys、Arg、Gly或Pro；位置424為Ser、Thr、Glu或Lys；及/或位置426為Ser、Trp或Gly。在額外實施例中，經修飾之Fc多肽根據EU編號方案在包括414、424及426之位置處進一步包含一個、兩個或三個取代。在一些實施例中，位置414為Lys、Arg、Gly或Pro；位置424為Ser、Thr、Glu或Lys；及/或位置426為Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽與SEQ ID NO:68之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，且在一些實施例中具有在位置150處之Glu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ala、在位置160處之Asn、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe，其中各位置係參照SEQ ID NO:68編號。在特定實施例中，BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽具有SEQ ID NO:68之序列。在本文所述之融合蛋白之一些實施例中，Fc多肽二聚體中之兩個Fc多肽之一可為具有SEQ ID NO:68之序列之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽，而Fc多肽二聚體中之另一個Fc多肽可具有野生型Fc多肽(例如SEQ ID NO:61)之序列。在本文所述之融合蛋白之其他實施例中，Fc多肽二聚體中之兩個Fc多肽均可為具有SEQ ID NO:68之序列之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽。
在一些實施例中，BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽與SEQ ID NO:78之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，且在一些實施例中具有在位置150處之Leu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ser、在位置160處之Ser、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe，其中各位置係參照SEQ ID NO:78編號。在特定實施例中，BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽具有SEQ ID NO:78之序列。在本文所述之融合蛋白之一些實施例中，Fc多肽二聚體中之兩個Fc多肽之一可為具有SEQ ID NO:78之序列之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽，而Fc多肽二聚體中之另一個Fc多肽可具有野生型Fc多肽(例如SEQ ID NO:61)之序列。在本文所述之融合蛋白之其他實施例中，Fc多肽二聚體中之兩個Fc多肽均可為具有SEQ ID NO:78之序列之BBB (例如TfR)受體結合Fc多肽。 針對異二聚化之Fc多肽修飾
在一些實施例中，存在於融合蛋白中之Fc多肽包括杵及臼突變以促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成。一般而言，修飾在第一多肽之界面處引入突起(「杵」)且在第二多肽之界面中引入相應空腔(「臼」)，使得突起可安置於空腔中以促進異二聚體形成且由此阻礙同二聚體形成。突起係藉由將來自第一多肽之界面的小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來構築。藉由將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換，在第二多肽之界面中產生與突起相同或類似大小之補償性空腔。在一些實施例中，此類額外突變係在Fc多肽中對該多肽與BBB受體，例如TfR之結合無不利影響之位置處。
在杵及臼二聚化方法之一個說明性實施例中，存在於融合蛋白中之Fc多肽之一的位置366 (根據EU編號方案編號)包含色胺酸替代天然蘇胺酸。二聚體中之另一個Fc多肽在位置407 (根據EU編號方案編號)處具有纈胺酸替代天然酪胺酸。另一個Fc多肽可進一步包含取代，其中在位置366 (根據EU編號方案編號)處之天然蘇胺酸經絲胺酸取代且在位置368 (根據EU編號方案編號)處之天然白胺酸經丙胺酸取代。因此，本文所述之融合蛋白之Fc多肽之一具有T366W杵突變且另一個Fc多肽具有Y407V突變，該突變典型地伴隨T366S及L368A臼突變。
在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之一或兩個Fc多肽亦可經工程改造以含有針對異二聚化之其他修飾，例如在CH3-CH3界面內接觸殘基之靜電工程改造，其為天然帶電或疏水性補丁(patch)修飾。
舉例而言，在一些實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有一個Fc多肽，該Fc多肽具有T366W杵突變且與SEQ ID NO:64之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性；及另一個Fc多肽，該另一個Fc多肽具有T366S、L368A及Y407V臼突變且與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性。在某些實施例中，Fc多肽二聚體中之一或兩個Fc多肽可為TfR結合Fc多肽。在特定實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:66編號之位置處包括在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:69之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:69編號之位置處包括在位置136處之Trp，且在一些實施例中具有在位置150處之Glu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ala、在位置160處之Asn、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。在特定實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:66之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:66編號之位置處包括在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:79之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:79編號之位置處包括在位置136處之Trp，且在一些實施例中具有在位置150處之Leu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ser、在位置160處之Ser、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。
在特定實施例中，本文所述之融合蛋白可含有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:64之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:64編號之位置處包括在位置136處之Trp；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:71之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:71編號之位置處包括在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val，且在一些實施例中具有在位置150處之Glu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ala、在位置160處之Asn、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。在特定實施例中，本文所述之融合蛋白可含有(i)第一Fc多肽二聚體，該第一Fc多肽二聚體與SEQ ID NO:64之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:64編號之位置處包括在位置136處之Trp；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:81之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:81編號之位置處包括在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val，且在一些實施例中具有在位置150處之Leu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ser、在位置160處之Ser、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。 用於調節效應子功能之Fc多肽修飾
在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之一或兩個Fc多肽可包含減弱效應子功能，亦即，在結合至介導效應子功能之效應細胞上表現之Fc受體後誘導某些生物功能之能力減弱的修飾。抗體效應子功能之實例包括但不限於C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。效應子功能可隨抗體類別而變化。舉例而言，天然人類IgG1及IgG3抗體在結合至存在於免疫系統細胞上之適當Fc受體後可引發ADCC及CDC活性；且天然人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4在結合至存在於免疫細胞上之適當Fc受體後可引發ADCP功能。
在一些實施例中，存在於本文所述之融合蛋白中之一或兩個Fc多肽可包含減弱或消除效應子功能之修飾。減弱效應子功能之說明性Fc多肽突變包括但不限於在CH2結構域中，例如根據EU編號方案在位置234及235處之取代。舉例而言，在一些實施例中，一或兩個Fc多肽可包含在位置234及235處之丙胺酸殘基。因此，一或兩個Fc多肽可具有L234A及L235A (LALA)取代。
調節效應子功能之額外Fc多肽突變包括但不限於以下：位置329可具有脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或足夠大以破壞Fc/Fcγ受體界面之胺基酸殘基取代的突變，該Fc/Fcγ受體界面在Fc之脯胺酸329與FcγRIII之色胺酸殘基Trp 87及Trp 110之間形成。根據EU編號方案，額外說明性取代包括S228P、E233P、L235E、N297A、N297D及P331S。亦可存在多個取代，例如，根據EU編號方案，人類IgG1 Fc區之L234A及L235A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及P329G；人類IgG4 Fc區之S228P及L235E；人類IgG1 Fc區之L234A及G237A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及G237A；人類IgG2 Fc區之V234A及G237A；人類IgG4 Fc區之L235A、G237A及E318A；及人類IgG4 Fc區之S228P及L236E。在一些實施例中，一或兩個Fc多肽可具有一或多個調節ADCC之胺基酸取代，例如，根據EU編號方案在位置298、333及/或334處之取代。
舉例而言，在一些實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:67之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:67編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala、在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:70之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:70編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala、在位置136處之Trp，且在一些實施例中具有在位置150處之Glu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ala、在位置160處之Asn、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:67之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:67編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala、在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:80之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:80編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala、在位置136處之Trp，且在一些實施例中具有在位置150處之Leu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ser、在位置160處之Ser、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:65之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:65編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala及在位置136處之Trp；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:72之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:72編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala、在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val，且在一些實施例中具有在位置150處之Glu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ala、在位置160處之Asn、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白可含有Fc多肽二聚體，該Fc多肽二聚體具有(i)第一Fc多肽，該第一Fc多肽與SEQ ID NO:65之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:65編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala及在位置136處之Trp；及(ii)第二Fc多肽，該第二Fc多肽與SEQ ID NO:82之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性，其中序列在參照SEQ ID NO:82編號之位置處包括在位置4處之Ala、在位置5處之Ala、在位置136處之Ser、在位置138處之Ala及在位置177處之Val，且在一些實施例中具有在位置150處之Leu、在位置154處之Tyr、在位置156處之Thr、在位置157處之Glu、在位置158處之Trp、在位置159處之Ser、在位置160處之Ser、在位置183處之Thr、在位置185處之Glu、在位置186處之Glu及在位置191處之Phe。 用於延長血清半衰期之Fc多肽修飾
在一些實施例中，可引入用以增加血清半衰期之修飾。舉例而言，在一些實施例中，如根據EU編號方案編號，存在於本文所述之融合蛋白中之一或兩個Fc多肽可包含在位置252處之酪胺酸、在位置254處之蘇胺酸及在位置256處之麩胺酸。因此，一或兩個Fc多肽可具有M252Y、S254T及T256E取代。或者，如根據EU編號方案編號，一或兩個Fc多肽可具有M428L及N434S取代。或者，一或兩個Fc多肽可具有N434S或N434A取代。
在一些實施例中，Fc多肽中之一或兩者可移除其所暴露之C端離胺酸(例如根據EU編號，在Fc多肽之位置447處之Lys殘基)。C端離胺酸殘基在Fc結構域中高度保守且可在蛋白質產生期間由細胞機構完全或部分移除。在一些實施例中，移除Fc多肽中之C端離胺酸可改善融合蛋白之穩定性。
在一些實施例中，鉸鏈區(例如SEQ ID NO:88)或其一部分(例如SEQ ID NO:89)可接合至本文所述之Fc多肽或經修飾之Fc多肽。鉸鏈區可來自任何免疫球蛋白子類或同型。說明性免疫球蛋白鉸鏈為IgG鉸鏈區，諸如IgG1鉸鏈區，例如人類IgG1鉸鏈胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:88)或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:89)。在一些實施例中，鉸鏈區在Fc多肽之N端區。 VI. 顆粒蛋白前體與Fc多肽之間的連接
在一些實施例中，Fc多肽係由連接子，例如多肽連接子接合至顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體。在一些實施例中，Fc多肽係由肽鍵或由多肽連接子接合至顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體，例如，為融合多肽。多肽連接子可經配置以使得其允許顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體相對於所接合之Fc多肽旋轉；及/或對蛋白酶消化具有抗性。多肽連接子可含有天然胺基酸、非天然胺基酸或其組合。在一些實施例中，多肽連接子可為可撓性連接子，例如含有胺基酸，諸如Gly、Asn、Ser、Thr、Ala及類似物。此類連接子係使用已知參數設計且可具有任何長度且含有許多具有任何長度之重複單位(例如Gly及Ser殘基之重複單位)。舉例而言，連接子可具有重複，諸如兩個、三個、四個、五個或更多個Gly4 -Ser (SEQ ID NO:90)重複或單一Gly4 -Ser (SEQ ID NO:90)。在一些實施例中，多肽連接子可包括例如由存在於中樞神經系統中之酶可裂解之蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，若鉸鏈區(例如SEQ ID NO:88)或其一部分(例如SEQ ID NO:89)接合至Fc多肽之N端，則顆粒蛋白前體或其變異體之C端可由肽鍵或由多肽連接子(例如Gly4 -Ser (SEQ ID NO:90)重複或單一Gly4 -Ser (SEQ ID NO:90))接合至鉸鏈區或其部分之N端。
在一些實施例中，顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體係例如由Gly4 -Ser連接子(SEQ ID NO:90)或(Gly4 -Ser)2 連接子(SEQ ID NO:91)接合至Fc多肽之N端。在一些實施例中，Fc多肽可包含接合至連接子或直接接合至顆粒蛋白前體的在N端處之鉸鏈序列或部分鉸鏈序列。
在一些實施例中，顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體係例如由Gly4 -Ser連接子(SEQ ID NO:90)或(Gly4 -Ser)2 連接子(SEQ ID NO:91)接合至Fc多肽之C端。在一些實施例中，Fc多肽之C端直接接合至顆粒蛋白前體。
在一些實施例中，Fc多肽與顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體之間的多肽連接子可具有3-50個、3-25個、3-10個、3-5個、3個、5個、7個、10個、25個或50個胺基酸。適合之多肽連接子在此項技術中為已知的(例如Chen等人Adv. Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369, 2013中所述)，且包括例如含有可撓性胺基酸殘基，諸如甘胺酸及絲胺酸之多肽連接子。在某些實施例中，多肽連接子可為聚甘胺酸連接子，例如(Gly)n (SEQ ID NO:138)，其中n為1與10之間的整數。在某些實施例中，多肽連接子可含有(GS)n (SEQ ID NO:139)、(GGS)n (SEQ ID NO:140)、(GGGGS)n (SEQ ID NO:133)、(GGSG)n (SEQ ID NO:134)或(SGGG)n (SEQ ID NO:135)之基元，例如多個或重複基元，其中n為1與10之間的整數。在其他實施例中，多肽連接子亦可含有除甘胺酸及絲胺酸以外之胺基酸，例如KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO:94)、EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO:95)及GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO:96)。在其他實施例中，多肽連接子亦可為剛性多肽連接子。在一些實施例中，剛性多肽連接子可採用α-螺旋構形，其可由區段內氫鍵及/或區段內鹽橋穩定。如Chen等人Adv. Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369, 2013中所述，剛性多肽連接子之實例包括但不限於A(EAAAK)n A (SEQ ID NO:136)，其中n為1與5之間的整數；及(XP)n (SEQ ID NO:141)，其中X為Ala、Lys或Glu，且n為1與10之間的整數。
在一些實施例中，顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體係由化學交聯劑接合至Fc多肽。此類結合物可使用熟知之化學交聯試劑及方案產生。舉例而言，存在大量化學交聯劑，其為熟習此項技術者所知且適用於使多肽與所關注之藥劑交聯。舉例而言，交聯劑為異雙功能交聯劑，其可用於以逐步方式連接分子。異雙功能交聯劑提供設計用於結合蛋白質之更特異性偶合方法，從而減少諸如同源蛋白聚合物之不當副反應發生的能力。多種異雙功能交聯劑在此項技術中為已知的，包括N-羥基丁二醯亞胺(NHS)或其水溶性類似物N-羥基磺基丁二醯亞胺(磺基-NHS)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)；(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺酯(SIAB)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)；4-丁二醯亞胺氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)及6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯]己酸丁二醯亞胺酯(LC-SPDP)。具有N-羥基丁二醯亞胺部分之彼等交聯劑可作為N-羥基磺基丁二醯亞胺類似物獲得，其一般具有較大水溶性。另外，可替代地作為烷基衍生物合成在連接鏈內具有二硫橋之彼等交聯劑以減少活體內連接子裂解之量。除異雙功能交聯劑以外，存在許多其他交聯劑，包括同雙功能及光反應性交聯劑。辛二酸二丁二醯亞胺酯(DSS)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)及庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽(DMP)為有用之同雙功能交聯劑之實例，且雙[B-(4-疊氮基水楊醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)及6(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸N-丁二醯亞胺酯(SANPAH)為有用之光反應性交聯劑之實例。 VII. 說明性融合蛋白
在一些態樣中，本文所述之融合蛋白包含連接至顆粒蛋白前體變異體之第一Fc多肽；及與第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白進一步包含第二顆粒蛋白前體或其變異體(例如野生型顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體)。在一些實施例中，第一Fc多肽為經修飾之Fc多肽及/或第二Fc多肽為經修飾之Fc多肽。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有一或多個促進其與另一個Fc多肽異二聚化之修飾。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有一或多個減弱效應子功能之修飾。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有一或多個延長血清半衰期之修飾。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有一或多個促使結合至BBB受體，例如TfR之修飾。
在其他態樣中，本文所述之融合蛋白包含：包含Fc多肽之第一多肽鏈，及包含特異性結合至BBB (例如TfR)受體之經修飾之Fc多肽，例如TfR結合Fc多肽之第二多肽鏈，該經修飾之Fc多肽與第一多肽鏈中之Fc多肽二聚化以形成Fc多肽二聚體。在一些實施例中，融合蛋白包含可接合至第一多肽鏈或第二多肽鏈之顆粒蛋白前體變異體。在某些實施例中，顆粒蛋白前體變異體經由多肽連接子接合至第一多肽鏈之N端或C端。在某些實施例中，顆粒蛋白前體變異體經由多肽連接子接合至第二多肽鏈之N端或C端。
在一些實施例中，融合蛋白包含兩個顆粒蛋白前體變異體。在某些實施例中，第一顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之N端且第二顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之N端。在某些實施例中，第一顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之N端且第二顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之C端。在某些實施例中，第一顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之C端且第二顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之N端。在某些實施例中，第一顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之C端且第二顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之C端。
在一些實施例中，融合蛋白包含顆粒蛋白前體變異體及野生型顆粒蛋白前體。在某些實施例中，顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之N端且野生型顆粒蛋白前體接合至第二多肽鏈之N端。在某些實施例中，顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之N端且野生型顆粒蛋白前體接合至第二多肽鏈之C端。在某些實施例中，顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之C端且野生型顆粒蛋白前體接合至第二多肽鏈之N端。在某些實施例中，顆粒蛋白前體變異體接合至第一多肽鏈之C端且野生型顆粒蛋白前體接合至第二多肽鏈之C端。在某些實施例中，野生型顆粒蛋白前體接合至第一多肽鏈之N端且顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之N端。在某些實施例中，野生型顆粒蛋白前體接合至第一多肽鏈之N端且顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之C端。在某些實施例中，野生型顆粒蛋白前體接合至第一多肽鏈之C端且顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之N端。在某些實施例中，野生型顆粒蛋白前體接合至第一多肽鏈之C端且顆粒蛋白前體變異體接合至第二多肽鏈之C端。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白對於分揀蛋白結合之KD 小於約100 nM (例如小於約95 nM、90 nM、85 nM、80 nM、75 nM、70 nM、65 nM、60 nM、55 nM、50 nM、45 nM或40 nM)。在一些實施例中，本文所述之融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50小於約25 nM (例如小於約20 nM、15 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2.5 nM、2 nM、1.5 nM或1 nM)。在特定實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於第一多肽中包含SEQ ID NO:2之融合蛋白展現小於約10倍(例如小於約9倍、8倍、7倍、6倍或5倍)之分揀蛋白結合降低。在一些實施例中，融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於第一多肽中包含SEQ ID NO:108之融合蛋白展現小於約10倍(例如小於約9倍、8倍、7倍、6倍或5倍)之分揀蛋白結合降低。在某些實施例中，藉由ELISA量測EC50。用以藉由ELISA量測對於分揀蛋白結合之EC50的例示性方法描述於本文中。
在一些實施例中，在CHO細胞中產生本文所述之融合蛋白。在特定實施例中，大於50% (例如大於55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)之融合蛋白(例如自CHO細胞產生之融合蛋白)在融合蛋白之顆粒蛋白前體變異體部分之C端處不裂解。
在特定實施例中，本文所述之融合蛋白包含：(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含接合至包含T366S、L368A及Y407V (臼)取代以及L234A及L235A (LALA)取代之經修飾之Fc多肽的顆粒蛋白前體變異體；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含結合至TfR且包含T366W (杵)取代以及L234A及L235A (LALA)取代之經修飾之Fc多肽。顆粒蛋白前體變異體可包括與SEQ ID NO:4-54、111-121及127-128中之任一者之序列具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體之位置574-576如SEQ ID NO:4-54、111-121及127-128中所定義。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可包括與SEQ ID NO:56具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體之位置574-579如SEQ ID NO:56中所定義。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可包括與SEQ ID NO:57具有至少90% (例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中顆粒蛋白前體變異體之位置574-581如SEQ ID NO:57中所定義。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可接合至經修飾之Fc多肽之N端或C端(例如C端)。在特定實施例中，鉸鏈區或其一部分在第一多肽鏈及第二多肽鏈中之經修飾之Fc多肽中之每一者之N端處接合。在特定實施例中，多肽連接子(例如GGGGS (SEQ ID NO:90)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:91))存在於第一多肽鏈中之顆粒蛋白前體變異體與經修飾之Fc多肽之間。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:98編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Pro、在位置812處之Ile及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:98之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:98之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:99編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Pro、在位置812處之Phe及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:99之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:99之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:100之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:100編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Gln、在位置812處之Gln及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:100之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:100之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:101編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Val、在位置812處之Val及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:101之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:101之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:102之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:102編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Val、在位置812處之Thr及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:102之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:102之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:123之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:123編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Pro、在位置812處之Pro及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:123之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:123之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:124之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:124編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Pro、在位置812處之Tyr及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:124之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:124之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:125之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:125編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Gln、在位置812處之Arg及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:125之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:125之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:126之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:126編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Gln、在位置812處之His及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:75之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:75編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:126之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:75之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:126之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:130之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:98之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:98編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Pro、在位置812處之Ile及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:85之序列具有至少90%一致性(例如至少95%、98%或99%一致性)之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:85編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:98之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:85之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:98之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:132之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:99之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:99編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Pro、在位置812處之Phe及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:85之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:85編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:99之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:85之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:99之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:132之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:100之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:100編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Gln、在位置812處之Gln及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:85之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:85編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:100之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:85之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:100之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:132之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:101之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:101編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Val、在位置812處之Val及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:85之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:85編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:101之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:85之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:101之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:132之序列。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:102之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:102編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置187處之Val、在位置811處之Val、在位置812處之Thr及在位置813處之Leu；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:85之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:85編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:102之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:85之序列。在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO:102之序列，且第二多肽鏈包含SEQ ID NO:132之序列。
在特定實施例中，本文所述之融合蛋白包含：(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含結合至TfR且包含T366S、L368A及Y407V (臼)取代以及L234A及L235A (LALA)取代之經修飾之Fc多肽；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含接合至包含T366W (杵)取代以及L234A及L235A (LALA)取代之經修飾之Fc多肽的顆粒蛋白前體變異體。顆粒蛋白前體變異體可具有與SEQ ID NO:3-57、111-121及127-128中之任一者之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列。在一些實施例中，顆粒蛋白前體變異體可接合至經修飾之Fc多肽之N端或C端(例如C端)。在特定實施例中，鉸鏈區或其一部分在第一多肽鏈及第二多肽鏈中之經修飾之Fc多肽中之每一者之N端處接合。在特定實施例中，多肽連接子(例如GGGGS (SEQ ID NO:90)或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:91))存在於第二多肽鏈中之顆粒蛋白前體變異體與經修飾之Fc多肽之間。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:77之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:77編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:103編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Pro、在位置812處之Ile及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:77之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:77編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:104之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:104編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Pro、在位置812處之Phe及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:77之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:77編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:105編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Gln、在位置812處之Gln及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:77之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:77編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:106之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:106編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Val、在位置812處之Val及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:77之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:77編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Glu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ala、在位置170處之Asn、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:107之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:107編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Val、在位置812處之Thr及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:87之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:87編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:103之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:103編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Pro、在位置812處之Ile及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:87之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:87編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:104之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:104編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Pro、在位置812處之Phe及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:87之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:87編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:105之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:105編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Gln、在位置812處之Gln及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:87之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:87編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:106之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:106編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Val、在位置812處之Val及在位置813處之Leu。
在一些實施例中，本文所述之融合蛋白包含(a)第一多肽鏈，該第一多肽鏈包含與SEQ ID NO:87之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:87編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Ser、在位置148處之Ala、在位置160處之Leu、在位置164處之Tyr、在位置166處之Thr、在位置167處之Glu、在位置168處之Trp、在位置169處之Ser、在位置170處之Ser、在位置187處之Val、在位置193處之Thr、在位置195處之Glu、在位置196處之Glu及在位置201處之Phe；及(b)第二多肽鏈，該第二多肽鏈包含顆粒蛋白前體變異體及經修飾之Fc多肽，其中第二多肽鏈包含與SEQ ID NO:107之序列具有至少90% (例如至少95%、98%或99%)一致性或100%一致性之序列，其中序列在參照SEQ ID NO:107編號之位置處包括在位置14處之Ala、在位置15處之Ala、在位置146處之Trp、在位置811處之Val、在位置812處之Thr及在位置813處之Leu。 VIII. 結合特性
本文所述之融合蛋白可具有大範圍之結合親和力。舉例而言，在一些實施例中，蛋白質對BBB受體，例如TfR具有在1 pM至10 µM範圍內之親和力。在一些實施例中，對TfR之親和力在1 nM至5 µM或10 nM至1 µM之範圍內。
用於分析結合親和力、結合動力學及交叉反應性以分析與BBB受體(例如TfR)之結合的方法在此項技術中為已知的。此等方法包括但不限於固相結合檢定(例如ELISA檢定)、免疫沈澱、表面電漿子共振(例如Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ))、動力學排除檢定(例如KinExA®)、流式細胞量測術、螢光活化細胞分選(FACS)、生物膜層干涉法(例如Octet® (FortéBio, Inc., Menlo Park, CA))及西方墨點分析。在一些實施例中，使用ELISA確定結合親和力及/或交叉反應性。用於進行ELISA檢定之方法在此項技術中為已知的且亦描述於以下實例章節中。在一些實施例中，使用表面電漿子共振(SPR)確定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用動力學排除檢定確定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用生物膜層干涉檢定確定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。評估融合蛋白之作用
可使用各種檢定，包括量測活體外或活體內活性之檢定來評定包含顆粒蛋白前體或其變異體之本文所述之融合蛋白的活性。如實例中所述，可使用骨髓源性巨噬細胞(BMDM)及用針對人類顆粒蛋白前體及人類Fc之抗體進行免疫染色來檢定本文所述之融合蛋白的細胞吸收。在細胞經本文所述之融合蛋白處理之後可再次評估由GRN 突變引起之細胞效應(例如溶酶體基因，諸如Ctsl 、Tmem106b 及Psap 之增加之組織蛋白酶D活性及升高之mRNA水準) (實例6及7)。在此等檢定中可使用螢光探針及qPCR技術。最後，如實例9及10中所示，可使用野生型及/或轉殖基因小鼠確定本文所述之融合蛋白之藥物動力學特性及腦吸收。
對於細胞樣品，檢定可包括破碎細胞及破開微泡。細胞破碎可藉由使用凍融及/或音波處理達成。在一些實施例中，評估組織樣品。可使用多個，例如2個、3個、4個、5個或更多個凍融循環來評估組織樣品，該等凍融循環係在音波處理步驟之前進行以確保微泡破開。
可藉由本文所述之檢定評估之樣品包含例如腦、肝、腎、肺、脾、血漿、血清、腦脊髓液(CSF)及尿液。在一些實施例中，可評估來自接受包含如本文所述之顆粒蛋白前體或其變異體之融合蛋白之患者的CSF樣品。 IX. 雙(單醯甘油)磷酸酯(BMP)
本文提供監測顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體(例如於樣品中、細胞中、組織中及/或個體中)之水準的方法，其中確定顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體之水準包括量測BMP (例如於樣品、細胞、組織及/或個體中)之豐度。
BMP為帶負電之甘油磷脂(例如在通常存在於晚期胞內體及溶酶體之pH值下)，其具有式I所描繪之結構：
Figure 02_image001
(I)。
BMP分子包含兩個脂肪酸側鏈。式I中之R及R'代表獨立選擇之飽和或不飽和脂族鏈，其中每一者典型地含有14個、16個、18個、20個或22個碳原子。當脂肪酸側鏈不飽和時，其可含有1個、2個、3個、4個、5個、6個或更多個碳碳雙鍵。此外，BMP分子可含有一或兩個烷基醚取代基，其中一或兩個脂肪酸側鏈之羰基氧經兩個氫原子置換。本文中用於描述特定BMP物質之命名係指具有兩個脂肪酸側鏈之物質，其中脂肪酸側鏈之結構在BMP格式中之括號內指示(例如BMP(18:1_18:1))。數字遵循「脂肪酸碳原子數:雙鍵數」之標準脂肪酸記數格式。「e-」字首用於指示烷基醚取代基之存在，其中脂肪酸側鏈之羰基氧經兩個氫原子置換。舉例而言，「BMP(16:0e_18:0)」中之「e」表示具有16個碳原子之側鏈為烷基醚取代基。
在本揭示案之方法之一些實施例中，量測單一BMP物質之豐度。在一些實施例中，量測兩種或更多種BMP物質之豐度。在一些實施例中，量測表1中之至少兩種、三種、四種、五種或更多種BMP物質之豐度。當量測兩種或更多種BMP物質之豐度時，可使用不同BMP物質之任何組合。
在一些實施例中，可合計多於一種BMP物質之豐度，且將總豐度與參考值相比較。舉例而言，可合計一或多種BMP物質(例如表1中所列之BMP物質)之豐度，接著將總豐度與參考值相比較。 表1. BMP物質
名稱 總碳原子 : 總不飽和度 名稱 總碳原子 : 總不飽和度 名稱 總碳原子 : 總不飽和度
BMP(14:0_14:0) BMP(28:0) BMP(16:0e_20:5) BMP(36:5) BMP(18:3_20:3) BMP(38:6)
BMP(14:0_16:0) BMP(30:0) BMP(16:0e_22:4) BMP(38:4) BMP(18:3_20:4) BMP(38:7)
BMP(14:0_16:1) BMP(30:1) BMP(16:0e_22:6) BMP(38:6) BMP(18:3_20:5) BMP(38:8)
BMP(14:0_18:0) BMP(32:0) BMP(16:1e_14:0) BMP(30:1) BMP(18:3_22:4) BMP(40:7)
BMP(14:0_18:1) BMP(32:1) BMP(16:1e_16:0) BMP(32:1) BMP(18:3_22:5) BMP(40:8)
BMP(14:0_18:2) BMP(32:2) BMP(16:1e_18:0) BMP(34:1) BMP(18:3_22:6) BMP(40:9)
BMP(14:0_18:3) BMP(32:3) BMP(16:1e_18:1) BMP(34:2) BMP(18:0e_14:0) BMP(32:0)
BMP(14:0_20:1) BMP(34:1) BMP(16:1e_18:2) BMP(34:3) BMP(18:0e_16:0) BMP(34:0)
BMP(14:0_20:2) BMP(34:2) BMP(16:1e_18:3) BMP(34:4) BMP(18:0e_18:0) BMP(36:0)
BMP(14:0_20:3) BMP(34:3) BMP(16:1e_20:3) BMP(36:4) BMP(18:0e_18:1) BMP(36:1)
BMP(14:0_20:4) BMP(34:4) BMP(16:1e_20:4) BMP(36:5) BMP(18:0e_18:2) BMP(36:2)
BMP(14:0_20:5) BMP(34:5) BMP(16:1e_20:5) BMP(36:6) BMP(18:0e_18:3) BMP(36:3)
BMP(14:0_22:4) BMP(36:4) BMP(16:1e_22:4) BMP(38:5) BMP(18:0e_20:3) BMP(38:3)
BMP(14:0_22:5) BMP(36:5) BMP(16:1e_22:6) BMP(38:7) BMP(18:0e_20:4) BMP(38:4)
BMP(14:0_22:6) BMP(36:6) BMP(18:0_18:0) BMP(36:0) BMP(18:0e_20:5) BMP(38:5)
BMP(16:0_16:0) BMP(32:0) BMP(18:0_18:1) BMP(36:1) BMP(18:0e_22:4) BMP(40:4)
BMP(16:0_16:1) BMP(32:1) BMP(18:0_18:2) BMP(36:2) BMP(18:0e_22:6) BMP(40:6)
BMP(16:0_18:0) BMP(34:0) BMP(18:0_18:3) BMP(36:3) BMP(18:1e_14:0) BMP(32:1)
BMP(16:0_18:1) BMP(34:1) BMP(18:0_20:1) BMP(38:1) BMP(18:1e_16:0) BMP(34:1)
BMP(16:0_18:2) BMP(34:2) BMP(18:0_20:2) BMP(38:2) BMP(18:1e_18:0) BMP(36:1)
BMP(16:0_18:3) BMP(34:3) BMP(18:0_20:3) BMP(38:3) BMP(18:1e_18:1) BMP(36:2)
BMP(16:0_20:1) BMP(36:1) BMP(18:0_20:4) BMP(38:4) BMP(18:1e_18:2) BMP(36:3)
BMP(16:0_20:2) BMP(36:2) BMP(18:0_20:5) BMP(38:5) BMP(18:1e_18:3) BMP(36:4)
BMP(16:0_20:3) BMP(36:3) BMP(18:0_22:4) BMP(40:4) BMP(18:1e_20:3) BMP(38:4)
BMP(16:0_20:4) BMP(36:4) BMP(18:0_22:5) BMP(40:5) BMP(18:1e_20:4) BMP(38:5)
BMP(16:0_20:5) BMP(36:5) BMP(18:0_22:6) BMP(40:6) BMP(18:1e_20:5) BMP(38:6)
BMP(16:0_22:4) BMP(38:4) BMP(18:1_18:1) BMP(36:2) BMP(18:1e_22:4) BMP(40:5)
BMP(16:0_22:5) BMP(38:5) BMP(18:1_18:2) BMP(36:3) BMP(18:1e_22:6) BMP(40:7)
BMP(16:0_22:6) BMP(38:6) BMP(18:1_18:3) BMP(36:4) BMP(20:3_20:3) BMP(40:6)
BMP(16:1_16:1) BMP(32:2) BMP(18:1_20:1) BMP(38:2) BMP(20:3_20:4) BMP(40:7)
BMP(16:1_18:0) BMP(34:1) BMP(18:1_20:2) BMP(38:3) BMP(20:3_20:5) BMP(40:8)
BMP(16:1_18:1) BMP(34:2) BMP(18:1_20:3) BMP(38:4) BMP(20:3_22:4) BMP(42:7)
BMP(16:1_18:2) BMP(34:3) BMP(18:1_20:4) BMP(38:5) BMP(20:3_22:5) BMP(42:8)
BMP(16:1_18:3) BMP(34:4) BMP(18:1_20:5) BMP(38:6) BMP(20:3_22:6) BMP(42:9)
BMP(16:1_20:1) BMP(36:2) BMP(18:1_22:4) BMP(40:5) BMP(20:4_20:4) BMP(40:8)
BMP(16:1_20:2) BMP(36:3) BMP(18:1_22:5) BMP(40:6) BMP(20:4_20:5) BMP(40:9)
BMP(16:1_20:3) BMP(36:4) BMP(18:1_22:6) BMP(40:7) BMP(20:4_22:4) BMP(42:8)
BMP(16:1_20:4) BMP(36:5) BMP(18:2_18:2) BMP(36:4) BMP(20:4_22:5) BMP(42:9)
BMP(16:1_20:5) BMP(36:6) BMP(18:2_18:3) BMP(36:5) BMP(20:4_22:6) BMP(42:10)
BMP(16:1_22:4) BMP(38:5) BMP(18:2_20:1) BMP(38:3) BMP(20:5_20:5) BMP(40:10)
BMP(16:1_22:5) BMP(38:6) BMP(18:2_20:2) BMP(38:4) BMP(20:5_22:4) BMP(42:9)
BMP(16:1_22:6) BMP(38:7) BMP(18:2_20:3) BMP(38:5) BMP(20:5_22:5) BMP(42:10)
BMP(16:0e_14:0) BMP(40:0) BMP(18:2_20:4) BMP(38:6) BMP(20:5_22:6) BMP(42:11)
BMP(16:0e_16:0) BMP(32:0) BMP(18:2_20:5) BMP(38:7) BMP(22:4_22:4) BMP(44:8)
BMP(16:0e_18:0) BMP(34:0) BMP(18:2_22:4) BMP(40:6) BMP(22:4_22:5) BMP(44:9)
BMP(16:0e_18:1) BMP(34:1) BMP(18:2_22:5) BMP(40:7) BMP(22:4_22:6) BMP(44:10)
BMP(16:0e_18:2) BMP(34:2) BMP(18:2_22:6) BMP(40:8) BMP(22:6_22:6) BMP(44:12)
BMP(16:0e_18:3) BMP(34:3) BMP(18:3_18:3) BMP(36:6)      
BMP(16:0e_20:3) BMP(36:3) BMP(18:3_20:1) BMP(38:4)      
BMP(16:0e_20:4) BMP(36:4) BMP(18:3_20:2) BMP(38:5)      
在一些情況下，一或多種BMP物質在一種類型之樣品中相較於另一種樣品可有差異地表現(例如更大或更小豐度)，諸如基於細胞之樣品(例如經培養之細胞)對比基於組織之樣品或血液樣品。因此，在一些實施例中，一或多種BMP物質之選擇(亦即，用於豐度量測)視樣品類型而定。在一些實施例中，一或多種BMP物質包含BMP(18:1_18:1)，例如當樣品(例如測試樣品及/或參考樣品)包括BMDM時。在其他實施例中，一或多種BMP物質包含BMP(20:4_20:4)，例如當樣品包含組織(例如腦組織、肝組織)或血漿、尿液或CSF時。在其他實施例中，一或多種BMP物質包含BMP(22:6_22:6)，例如當樣品包含組織(例如腦組織、肝組織)或血漿、尿液或CSF時。
在一些實施例中，內部BMP標準(例如BMP(14:0_14:0))用於量測樣品中一或多種BMP物質之豐度及/或確定參考值(例如量測參考樣品中一或多種BMP物質之豐度)。舉例而言，可將已知量之內部BMP標準添加至樣品(例如測試樣品及/或參考樣品)中以充當校準點，從而可確定存在於樣品中之一或多種BMP物質之量。在一些實施例中，自樣品中提取或分離BMP所用之試劑(例如甲醇) 「外加」有內部BMP標準。典型地，內部BMP標準將為不天然存在於個體中之標準。 X. 葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)
本文提供監測顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體(例如於樣品中、細胞中、組織中及/或個體中)之水準的方法，其中確定顆粒蛋白前體或顆粒蛋白前體變異體之水準包括量測葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph) (例如於樣品、細胞、組織及/或個體中)之豐度。
GlcSph為溶血糖神經鞘脂(lysoglycosphingolipid)，其具有式I所描繪之結構：
Figure 02_image003
(I)。
GlcSph為葡萄糖腦苷脂酶(GCase)之受質且發現在展現降低之GCase活性之人類高歇氏病患者及小鼠模型之細胞及組織中積聚。GlcSph之積聚牽涉到高歇氏病中所觀測之內臟及神經元病理學。
在一些實施例中，可將GlcSph之豐度與參考值相比較。在一些實施例中，患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體具有相較於參考值提高之GlcSph水準，例如，個體之測試樣品中之GlcSph之豐度可為參考值之至少約1.2倍(例如約1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍或更大)。在一些實施例中，參考值為在個體接受治療之前患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體之測試樣品中的GlcSph水準。
在方法之一些實施例中，在自參考個體或參考個體之群體獲得之參考樣品中量測參考值。參考個體或參考個體之群體可為健康對照個體或健康對照個體之群體。參考個體或參考個體之群體可為不具有顆粒蛋白前體相關病症或水準降低之顆粒蛋白前體之個體或個體群體。在一些實施例中，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體接受治療之後，來自個體之測試樣品中之GlcSph水準可改善優於在個體接受任何治療之前來自個體之測試樣品中之GlcSph水準。在一些實施例中，相比在個體接受治療之前患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體中之GlcSph水準，改善之GlcSph水準更接近於參考值(例如在自健康對照個體或健康對照個體之群體獲得之參考樣品中量測之參考值)，例如，改善之GlcSph水準在參考水準之約20%、15%、10%或5%以內。在一些實施例中，改善之GlcSph水準與參考水準實質上相同。
在一些情況下，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體中，可在例如個體之全血、血漿、細胞、組織、血清、腦脊髓液、間隙液、唾液、尿液、淋巴或其組合中發現相較於參考值提高之GlcSph水準。在特定實施例中，可在個體之血漿中發現提高之GlcSph水準。在本揭示案之方法之一些實施例中，自患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體獲取之測試樣品或一或多個參考值可包括血漿或與血漿有關。
此外，在患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體中，可在個體之腦中，例如腦額葉及/或顳葉中發現相較於參考值提高之GlcSph水準。在特定實施例中，可在額葉之一或多個區域，例如額上回、額中回、額下回及/或中央前回中發現提高之GlcSph。
在本文所述之方法中使用的自患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體獲取之測試樣品可包含細胞，諸如血細胞、腦細胞、外周血單核細胞(PBMC)、骨髓源性巨噬細胞(BMDM)、視網膜色素上皮(RPE)細胞、紅血球、白血球、神經細胞、小神經膠質細胞、大腦皮質細胞、脊髓細胞、骨髓細胞、肝細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞、絨毛細胞、肌肉細胞、皮膚細胞、纖維母細胞、心臟細胞、淋巴結細胞或其組合。在一些實施例中，測試樣品包含血細胞。在一些實施例中，測試樣品包含腦細胞。
在本文所述之方法中使用的自患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體獲取之測試樣品可包含組織，諸如腦組織、大腦皮質組織、脊髓組織、肝組織、腎組織、肌肉組織、心臟組織、眼組織、視網膜組織、淋巴結、骨髓、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾組織、瓣膜組織或其組合。在一些實施例中，測試樣品包含腦組織，諸如來自個體之腦額葉或顳葉之腦組織。在特定實施例中，測試樣品中所用之腦組織可來自額上回、額中回、額下回及/或中央前回。
自患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體獲取之測試樣品可包含胞內體、溶酶體、細胞外囊泡、胞外體、微泡或其組合。
在一些實施例中，內部GlcSph標準用於量測來自患有顆粒蛋白前體相關病症或處於患有顆粒蛋白前體相關病症之風險下之個體之測試樣品中之GlcSph的豐度及/或確定參考值(例如量測參考樣品中之GlcSph之豐度)。舉例而言，可將已知量之內部GlcSph標準添加至樣品(例如測試樣品及/或參考樣品)中以充當校準點，從而可確定存在於樣品中之GlcSph之量。在一些實施例中，自樣品中提取或分離GlcSph所用之試劑(例如甲醇) 「外加」有內部GlcSph標準。典型地，內部GlcSph標準為不天然存在於個體中之標準。在一些實施例中，內部GlcSph為氘標記之GlcSph，諸如實例中所用之GlcSph(d5)。 XI. 監測對治療之反應
在一個態樣中，本揭示案提供用於監測個體(例如目標個體)中之顆粒蛋白前體水準或顆粒蛋白前體變異體水準之方法。在另外之態樣中，提供用於監測個體對本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白或其醫藥組合物或給藥方案之反應用於治療疾病或病症(例如本文所述之任一者)的方法。
典型地，將測試樣品中之一或多種BMP物質中之每一者及/或GlcSph之豐度與一或多個參考值(例如相應參考值)相比較。在一些實施例中，在治療之前及在治療之後的一或多個時間點量測BMP值及/或GlcSph值。可將在稍後時間點獲取之豐度值與治療之前的值以及對照值，諸如健康或患病對照之值相比較，以確定個體對療法反應如何。一或多個參考值可來自對應於測試樣品之細胞、組織或流體的不同細胞、組織或流體。
在一些實施例中，參考值為在參考樣品中量測之一或多種BMP物質之豐度。在一些實施例中，參考值為在參考樣品中量測之GlcSph之豐度。參考值可為所量測之豐度值(例如在參考樣品中量測之豐度值)，或可自所量測之豐度值推導或外推。在一些實施例中，參考值為一定範圍之值，例如當自複數個樣品或個體之群體獲得參考值時。此外，參考值可呈現為單個值(例如所量測之豐度值、平均值或中位值)或一定範圍之值，帶有或不帶有標準差或標準誤差。
當獲得兩個或更多個測試樣品(例如自個體)時，獲得測試樣品之時間點可相隔約1、12、24小時或以上；約1、2、3、4、5、6、7天或以上；約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週或以上；或甚至更長時間。當獲得三個或更多個測試樣品時，獲得各測試樣品之間的時間間隔可全部相同，時間間隔可全部不同，或其組合。
在一些實施例中，在已治療個體之後自個體(例如目標個體)獲得第一測試樣品及第二測試樣品兩者，亦即，在治療期間在比第二測試樣品更早之時間點自個體獲得第一測試樣品。在一些實施例中，在已針對與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症治療個體之前獲得第一測試樣品(亦即，治療前測試樣品)，且在已針對與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症治療個體之後獲得第二測試樣品(亦即，治療後測試樣品)。在一些實施例中，自個體獲得多於一個(例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個)治療前及/或治療後測試樣品。此外，所獲得之治療前及治療後測試樣品之數目無需相同。
在一些實施例中，當所量測之BMP物質之豐度在個體接受任何治療之前來自個體之參考樣品中獲取之參考值之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%以內時，可確定個體對治療無反應。
在一些實施例中，當所量測之BMP物質之豐度在來自健康對照個體之參考樣品中獲取之參考值之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%以內時，可確定個體對治療有反應。
在一些實施例中，當所量測之GlcSph之豐度在個體接受任何治療之前來自個體之參考樣品中獲取之參考值之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%以內時，可確定個體對治療無反應。
在一些實施例中，當所量測之GlcSph之豐度在來自健康對照個體之參考樣品中獲取之參考值之約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%以內時，可確定個體對治療有反應。
當個體(例如目標個體)對治療(例如針對與水準降低之顆粒蛋白前體相關之病症)無反應時，在一些實施例中，改變(例如增加)一或多種治療劑(例如顆粒蛋白前體)之劑量及/或改變給藥時間間隔(例如縮短給藥之間的時間)。在一些實施例中，當個體對治療無反應時，選擇不同治療劑。在一些實施例中，當個體對治療無反應時，停用一或多種治療劑。 XII. BMP及GlcSph偵測技術
在一些實施例中，抗體可用於偵測及/或量測一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度。在一些實施例中，可諸如藉由顯微術或ELISA偵測結合至抗體之BMP物質。在一些實施例中，可諸如藉由顯微術或ELISA偵測結合至抗體之GlcSph。
在其他實施例中，質譜法(MS)用於根據本揭示案之方法偵測及/或量測一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度。質譜法為使化合物電離，且將所得離子按其質荷比(縮寫為m/Q、m/q、m/Z或m/z)分選之技術。使可呈氣體、液體或固體形式存在之樣品(例如包含BMP分子及/或GlcSph分子)電離，接著經電場及/或磁場使所得離子加速，使其按質荷比分離。離子最終撞擊離子偵測器且生成質譜圖。所偵測離子之質荷比連同其相對豐度可用於鑑定母體化合物，有時藉由使已知質量(例如整個或完整分子之質量)與所偵測離子之質量相關聯及/或藉由識別質譜圖中偵測之圖案。
在一些實施例中，可藉由使用單一質量分析器(例如四極桿)之單一MS來偵測一或多種BMP物質及/或GlcSph。在一些實施例中，可藉由串聯質譜法(MS/MS)來偵測一或多種BMP物質及/或GlcSph，該串聯質譜法使用一系列質量分析器(例如三個質量分析器)以進行多輪質譜法，典型地在各輪之間具有分子片段化步驟。
若干方法可用於片段化，包括但不限於碰撞誘導解離(CID)、電子捕獲解離(ECD)、電子轉移解離(ETD)、紅外多光子解離(IRMPD)、黑體紅外輻射解離(BIRD)、電子脫離解離(EDD)及表面誘導解離(SID)。
串聯質譜儀可用於運作不同類型之實驗，包括全掃描、產物離子掃描、前體離子掃描、中性丟失掃描及選擇性(或多重)反應監測(SRM或MRM)掃描。在全掃描實驗中，掃描兩個質量分析器(例如Q1及Q3)之整個質量範圍(或其一部分)且第二質量分析器(例如Q2)不含任何碰撞氣體。此允許偵測樣品中所含之所有離子。在產物離子掃描實驗中，選擇特定質荷比用於第一質量分析器(例如Q1)，用碰撞氣體填充第二質量分析器(例如Q2)以使具有所選質荷比之離子片段化，接著掃描第三質量分析器(例如Q3)之整個質量範圍(或其一部分)。此允許偵測所選前體離子之所有片段離子。在前體離子掃描實驗中，掃描第一質量分析器(例如Q1)之整個質量範圍(或其一部分)，用碰撞氣體填充第二質量分析器(例如Q2)以使處於掃描範圍內之離子片段化，且選擇特定質荷比用於第三質量分析器(例如Q3)。藉由使產物離子偵測之間的時間與臨偵測前所選之特定質荷比相關聯，此種類型之實驗可允許使用者確定哪個(些)前體離子可能已產生所關注之產物離子。在中性丟失掃描實驗中，掃描第一質量分析器(例如Q1)之整個質量範圍(或其一部分)，用碰撞氣體填充第二質量分析器(例如Q2)以使在掃描範圍內之所有離子片段化，且跨域指定範圍掃描第三質量分析器(例如Q3)，該指定範圍對應於在前體掃描範圍內之每個電位離子已發生之單一特定質量的片段化誘導之丟失。此種類型之實驗允許鑑定已丟失共同所關注之特定化學基團(例如甲基)之所有前體。在MRM實驗中，選擇一個特定質荷比用於第一質量分析器(例如Q1)，用碰撞氣體填充第二質量分析器(例如Q2)，且對於另一特定質荷比設定第三質量分析器(例如Q3)。此種類型之實驗允許高度特異性偵測已知片段化成經選擇用於第三質量分析器中之產物的分子。MS及MS/MS方法進一步描述於Grebe等人Clin. Biochem. Rev. (2011) 32:5-31中，其出於所有目的特此以全文引用之方式併入。
此外，MS及MS/MS技術可與液相層析(LC)或氣相層析(GC)技術相結合。此類液相層析-質譜(LC-MS)、液相層析-串聯質譜(LC-MS/MS)、氣相層析-質譜(GC-MS)及氣相層析-串聯質譜(GC-MS/MS)方法允許比典型地用單獨MS或MS/MS可能達成的增強之質量解析及質量確定。
液相層析係指隨著流體均勻滲透過細粉狀物質之管柱或滲透過毛細通路，選擇性地阻滯流體溶液之一或多種組分的過程。阻滯係由隨著流體相對於固定相移動，混合物之組分在一或多個固定相與主體流體(亦即，移動相)之間分佈而引起。高效液相層析(HPLC)，有時亦稱為「高壓液相層析」，為藉由迫使移動相在壓力下穿過固定相而增加分離程度之LC變型，典型地為密集裝填管柱。
此外，超高效液相層析(UHPLC)，亦稱為「超高壓液相層析」或「超效液相層析(UPLC)」，為使用比傳統HPLC技術高得多的壓力進行之HPLC變型。
氣相層析係指用於分離及/或分析可汽化而不分解之化合物的方法。移動相為典型地為惰性氣體(例如氦氣)或非反應性氣體(例如氮氣)之載氣，且固定相典型地為安置於充當「管柱」之玻璃或金屬管內部之惰性固體支撐體上的顯微液體或聚合物層。隨著所關注之氣態化合物與管柱內之固定相相互作用，該等化合物有差異地受阻滯且在不同時間自管柱溶離。接著可將經分離之化合物引入質譜儀中。
在一些實施例中，基於抗體之方法用於偵測及/或量測一或多種BMP物質及/或GlcSph之豐度。適合方法之非限制性實例包括ELISA、免疫螢光及放射免疫檢定(RIA)技術。用於進行ELISA、免疫螢光及RIA技術之方法在此項技術中為已知的。
許多樣品類型可在本揭示案之方法中用作測試樣品及/或參考樣品，只要樣品包含足以偵測之量的BMP及/或GlcSph以便可量測豐度即可。非限制性實例包括細胞、組織、血液(例如全血、血漿、血清)、流體(例如腦脊髓液、尿液、支氣管肺泡灌洗液、淋巴、精液、母乳、羊水)、糞便、唾液或其任何組合。適合細胞類型之非限制性實例包括BMDM、血細胞(例如PBMC、紅血球、白血球)、神經細胞(例如腦細胞、大腦皮質細胞、脊髓細胞)、骨髓細胞、肝細胞、腎細胞、脾細胞、肺細胞、眼細胞(例如視網膜細胞，諸如RPE細胞)、絨毛細胞、肌肉細胞、皮膚細胞、纖維母細胞、心臟細胞、淋巴結細胞或其組合。在一些實施例中，樣品包含細胞之一部分。在一些實施例中，自細胞或組織純化樣品。經純化樣品之非限制性實例包括胞內體、溶酶體、細胞外囊泡(例如胞外體、微泡)及其組合。
在一些實施例中，樣品(例如測試樣品及/或參考樣品)包含作為經培養之細胞的細胞。非限制性實例包括BMDM及RPE細胞。BMDM可例如藉由獲取包含PBMC之樣品且培養其中所含之單核細胞而獲得。
適合組織樣品類型之非限制性實例包括神經組織(例如腦組織、大腦皮質組織、脊髓組織)、肝組織、腎組織、肌肉組織、心臟組織、眼組織(例如視網膜組織)、淋巴結、骨髓、皮膚組織、血管組織、肺組織、脾組織、瓣膜組織及其組合。在一些實施例中，測試樣品及/或參考樣品包含腦組織或肝組織。在一些實施例中，測試及/或參考樣品包含血漿。 XIII. 核酸、載體及宿主細胞
如本文所述之融合蛋白中所含之多肽鏈典型地使用重組方法製備。因此，在一些態樣中，本揭示案提供包含編碼如本文所述之顆粒蛋白前體變異體、多肽或融合蛋白中之任一者之核酸序列的經分離核酸，及在內部引入用於複製多肽編碼核酸及/或用於表現多肽之核酸的宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞為真核的，例如人類細胞。
在另一個態樣中，提供包含編碼本文所述之顆粒蛋白前體變異體及多肽鏈之核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可為單股或雙股。在一些實施例中，多核苷酸為DNA。在特定實施例中，多核苷酸為cDNA。在一些實施例中，多核苷酸為RNA。
本揭示案提供一種經分離核酸，其包含編碼具有SEQ ID NO:98-108及123-126中之任一者之序列之多肽的核酸序列。本文亦提供一種經分離核酸，其包含編碼具有SEQ ID NO:3-57、111-121、127及128中之任一者之序列之顆粒蛋白前體變異體的核酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸包括於核酸構築體內。在一些實施例中，構築體為可複製載體。在一些實施例中，載體係選自質體、病毒載體、噬菌粒、酵母染色體載體及非附加型哺乳動物載體。
在一些實施例中，多核苷酸可操作地連接至表現構築體中之一或多個調控核苷酸序列。在一系列實施例中，核酸表現構築體適於用作表面表現文庫。在一些實施例中，文庫適於酵母中之表面表現。在一些實施例中，文庫適於噬菌體中之表面表現。在另一系列實施例中，核酸表現構築體適於在允許以毫克或公克之量分離多肽之系統中的多肽表現。在一些實施例中，系統為哺乳動物細胞表現系統。在一些實施例中，系統為酵母細胞表現系統。
用於產生重組多肽之表現運載體包括質體及其他載體。舉例而言，適合之載體包括以下類型之質體：用於在原核細胞，諸如大腸桿菌中表現之源自pBR322之質體、源自pEMBL之質體、源自pEX之質體、源自pBTac之質體及源自pUC之質體。源自pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及pHyg之載體為適合於轉染真核細胞之哺乳動物表現載體之實例。或者，諸如人乳頭狀瘤病毒(BPV-1)或愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus) (pHEBo，源自pREP，及p205)之病毒衍生物可用於真核細胞中多肽之瞬時表現。在一些實施例中，可能需要藉由使用桿狀病毒表現系統表現重組多肽。此類桿狀病毒表現系統之實例包括源自pVL之載體(諸如pVL1392、pVL1393及pVL941)、源自pAcUW之載體(諸如pAcUW1)及源自pBlueBac之載體。額外表現系統包括腺病毒、腺相關病毒及其他病毒表現系統。
載體可轉型至任何適合之宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞，例如細菌或酵母細胞，可適於用作表面表現文庫。在一些細胞中，在宿主細胞中表現載體以表現相對大量之多肽。此類宿主細胞包括哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及原核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞，諸如CHO細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、NS0細胞、Y0細胞、HEK293細胞、COS細胞、Vero細胞或HeLa細胞。在特定實施例中，細胞為CHO細胞。
可在適當條件下培養用編碼本文所述之融合蛋白之一或多個顆粒蛋白前體變異體之表現載體轉染的宿主細胞以允許一或多個多肽之表現發生。可自含有多肽之細胞與培養基之混合物分泌及分離多肽。或者，多肽可保留於細胞質中或膜部分中，且收集細胞，使其溶解且使用所需方法分離多肽。 XIV. 醫藥組合物及套組
在其他態樣中，提供包含根據本揭示案之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白之醫藥組合物及套組。 醫藥組合物
用於製備在本揭示案中使用之調配物之導則可見於熟習此項技術者已知之醫藥製劑及調配物之許多手冊中。
在一些實施例中，醫藥組合物包含如本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白且進一步包含一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑包括生理上相容且不干擾或以其他方式抑制活性劑之活性的任何溶劑、分散介質或包衣。
顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白可經調配用於藉由注射非經腸投與。典型地，用於活體內投與之醫藥組合物為無菌的，例如熱滅菌、蒸汽滅菌、無菌過濾或照射。
本文所述之醫藥組合物之劑量及所需藥物濃度可視所預期之特定用途而變化。 套組
在一些實施例中，提供一種用於治療神經退化性疾病(例如FTD、NCL、NPA、NPB、NPC、C9ORF72相關ALS/FTD、散發性ALS、AD、高歇氏病(例如2型及3型高歇氏病)及帕金森氏病)、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症及AMD及顆粒蛋白前體相關病症)之套組，該套組包括本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白。
在一些實施例中，套組進一步包括一或多種額外治療劑。舉例而言，在一些實施例中，套組包括如本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白且進一步包括一或多種用於治療本文所述之任何疾病或病症(例如神經退化性疾病(例如FTD))之額外治療劑。在一些實施例中，套組進一步包括說明材料，該說明材料含有關於實踐本文所述之方法的指導(亦即，方案) (例如關於使用套組投與包含顆粒蛋白前體變異體之融合蛋白的說明書)。儘管說明材料典型地包括書面或印刷材料，但其不限於此。本揭示案涵蓋能夠儲存此類說明書且將其傳達給終端使用者之任何媒體。此類媒體包括但不限於電子儲存媒體(例如磁盤、磁帶、盒式磁盤、晶片)、光學媒體(例如CD-ROM)及類似物。此類媒體可包括提供此類說明材料之網際網路站點的位址。 XV. 適應症
在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白用於治療一或多種神經退化性疾病。舉例而言，本文所述之融合蛋白可用於治療一或多種選自由以下組成之群的神經退化性疾病：AD、原發性年齡相關性τ蛋白病、路易體失智(lewy body dementia)、進行性核上麻痹(PSP)、FTD、與染色體17相關之FTD伴發帕金森氏症、嗜銀顆粒性失智、ALS、關島型ALS/帕金森氏症-失智複合症(ALS-PDC)、皮質基底核退化、慢性創傷性腦病、克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、拳擊員失智、彌漫性神經纖維纏結伴發鈣化、唐氏症候群(Down's syndrome)、家族性英國型失智、家族性丹麥型失智、傑茨曼-斯脫司勒-史茵克氏病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、球狀膠質τ蛋白病、瓜德羅普島型帕金森氏症伴發失智(Guadeloupean parkinsonism with dementia)、瓜德羅普島型PSP、哈勒沃登-施帕茨氏病(Hallevorden-Spatz disease)、遺傳性彌漫性腦白質病伴發軸索球樣變(HDLS)、包涵體肌炎、多系統萎縮、肌強直性營養不良、那須-哈科拉氏病(Nasu-Hakola disease)、神經纖維纏結主導型失智、NPC、蒼白球-橋腦-黑質退化、帕金森氏病、匹克氏病、腦炎後帕金森氏症、普里昂蛋白型大腦澱粉樣血管病(prion protein cerebral amyloid angiopathy)、進行性皮質下神經膠質瘤病、亞急性硬化性泛腦炎及單純纏結性失智。
許多神經退化性疾病可由溶酶體貯積症引起或與溶酶體貯積症相關聯，該等溶酶體貯積症以最終導致細胞及生物體功能障礙以及臨床異常之未消化或部分消化之巨分子的積聚為特徵。溶酶體貯積症係由積聚之受質類型定義，且可分類為膽固醇貯積症、鞘脂貯積病、寡糖貯積病、黏脂貯積病、黏多醣貯積病、脂蛋白貯積症、神經元類蠟脂褐質症及其他病症。在一些情況下，溶酶體貯積症亦包括導致巨分子積聚之蛋白質的缺乏或缺陷，諸如溶酶體酶之正常轉譯後修飾所必需之蛋白質，或對於適當溶酶體運輸重要之蛋白質。可由溶酶體貯積症引起或與溶酶體貯積症相關聯之神經退化性疾病之實例包括例如FTD、NCL、NPA、NPB、NPC、C9ORF72相關ALS/FTD、散發性ALS、AD、高歇氏病(例如2型及3型高歇氏病)及帕金森氏病。在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白用於治療由溶酶體貯積症引起或與溶酶體貯積症相關聯之神經退化性疾病，包括例如前述神經退化性疾病中之任一者。
其他病症之實例包括動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症及AMD。此類病症可得益於本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白之投藥。
在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白用於治療FTD。FTD為進行性神經退化性病症。FTD包括呈現出選擇性涉及額葉及顳葉之一系列臨床上、病理學上及基因學上異質之疾病(Gazzina等人,Eur J Pharmacol . 817:76-85, 2017)。FTD之臨床表現包括行為及個性改變、額葉執行缺陷及語言功能障礙。基於臨床表型之多樣性，已鑑定不同呈現形式，諸如行為變異型FTD (bvFTD)及原發性進行性失語症(PPA)，PPA可為遲滯/語法失能變異型PPA (avPPA)或語義變異型PPA (svPPA)。此等臨床呈現形式亦可與非典型帕金森氏症，諸如皮質基底核症候群(CBS)、進行性核上麻痹(PSP)及ALS重疊(Gazzina等人,Eur J Pharmacol . 817:76-85, 2017)。FTD與各種神經病理性標誌相關，包括神經元及星形細胞中之τ蛋白病變或神經元中包括細胞質泛素。具有43 kDa分子量之反式活化DNA結合蛋白(TDP-43)為在大多數FTD病例中以及ALS中積聚之最突出的泛素化蛋白病變(Petkau及Leavitt, 同上)。FTD為高達80%之病例在45歲與64歲之間呈現的早發型失智之顯著原因。該疾病亦呈現顯著家族性成分，其中約30-50%之病例報告疾病家族史(Petkau及Leavitt, 同上)。
在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白用於治療與GRN 中之突變相關聯或有關之病症。儘管若干基因已與FTD相關聯，但FTD中最頻繁突變之基因之一為GRN ，其定位至人類染色體17q21且編碼富半胱胺酸蛋白顆粒蛋白前體(亦稱為上皮素前體及頂顆粒蛋白)。最新估計表明GRN 突變佔具有陽性家族史之FTD患者之5-20%及散發病例之1-5% (Rademakers等人, 同上)。作為GRN 相關FTD中之神經退化及疾病過程之基礎的精確分子及細胞機制為未知的，不過GRN 剔除小鼠之表型特徵化與患者腦部之組織學分析組合表明炎症及溶酶體缺陷兩者均對疾病至關重要(Kao等人,Nat Rev Neurosci. 18(6):325-333, 2017)。的確，大塊性神經膠質瘤病存在於患者之皮質區中(Lui等人,Cell. 165(4):921-35, 2016)，且指示溶酶體病症之溶酶體色素脂褐質在包括症狀前個體及患者之突變GRN 攜帶者之眼部及皮質中已有報導(Ward等人,Sci Transl Med . 9(385), 2017)。
超過七十種GRN 疾病突變已有報導且在整個基因中定位，在此該等突變產生經確認或預測之功能損失(LOF)對偶基因(Ji等人J Med Genet. 54:145-154, 2017)。與FTD相關聯之大多數異型接合突變引起mRNA水準之約50%降低，此主要係由於無義mRNA衰減及顆粒蛋白前體之蛋白質水準的可比降低(Petkau及Leavitt, 同上；Kao等人, 同上)。在包括症狀前個體之攜帶者之血液(血清)及腦脊髓液(CSF)中亦發現顆粒蛋白前體之較低水準(Finch等人,Nat Rev Neurosci . 18(6):325-333, 2017；Goossens等人,Alzheimers Res Ther. 10(1):31, 2018；Meeter等人,Dement Geriatr Cogn Dis Extra. 6(2):330-340, 2016)。因此，據信單倍體不足為GRN 相關FTD中之主要疾病機制，表明升高攜帶者中之顆粒蛋白前體水準之治療方法可延遲發作年齡以及FTD進展(Petkau及Leavitt, 同上；Kao等人, 同上)。此概念係由指示基因TMEM106B 之變異體使顆粒蛋白前體之水準提高25%且使GRN 相關FTD之發作年齡延遲13歲的人類基因研究支持(Nicholson及Rademakers,Acta Neuropathol . 132(5):639-651, 2016)。
亦已報導同型接合GRN 突變，不過攜帶者呈現大不相同之臨床表型，稱為NCL (貝敦氏病(Batten disease)；在100,000名活產兒中發病率1-2.5；Cotman等人,Curr Neurol Neurosci Rep. 13(8):366, 2013)，其為溶酶體貯積症(Smith等人,Am J Hum Genet. 90(6):1102-7, 2012；Almeida等人,Neurobiol Aging . 41:200.e1-200.e5, 2016)。GRN 實際上為據報導與NCL相關聯之14種類蠟脂褐質症神經元(CLN )基因之一且GRN 亦稱為CLN11 (Kollmann等人,Biochim Biophys Acta. 1832(11):1866-81, 2013)。本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白可展現消炎特性及增強之溶酶體功能，其中任一者可對NCL有益。在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白可用於治療NCL。
攜帶GBA 基因之同型接合突變之高歇氏病患者在其血清中具有較低水準之顆粒蛋白前體(Jian等人,EBioMedicine 11:127-137, 2016)。具有GBA之異型接合突變之帕金森氏病患者亦可具有較低水準之顆粒蛋白前體。在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白可用於治療高歇氏病或帕金森氏病。
GRN 變異體已與AD相關聯(Rademakers等人, 同上；Brouwers等人,Neurology. 71(9):656-64, 2008；Lee等人,Neurodegener Dis. 8(4):216-20, 2011；Viswanathan等人,Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 150B(5):747-50, 2009)且TDP-43病變在AD患者之腦中為常見的(Youmans及Wolozin,Exp Neurol. 237(1):90-5, 2012)。亦已顯示顆粒蛋白前體基因遞送減少小鼠AD模型中之澱粉樣蛋白負荷(van Kampen及Kay,PLoS One. 12(8):e0182896, 2017)。因此，在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白可用於治療AD。
NPA及NPB由編碼酸性鞘磷脂酶之基因(SMPD1)的突變引起。NPC由膽固醇轉運中所涉及之基因，亦即，NPC1及NPC2的突變引起(Kolter及Sandhoff,Annu Rev Cell Dev Biol. 21:81-103, 2005；Kobayashi等人,Nat Cell Biol. 1(2):113-8, 1999)。在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白可用於治療NPA、NPB及/或NPC。
絕大多數ALS病例呈現TDP-43病變，其亦與帶有GRN 突變之患者共享(Petkau及Leavitt,Trends Neurosci . 37(7):388-98, 2014；Rademakers等人,Nat Rev Neurol . 8(8):423-34, 2012)。在所有ALS病例當中，C9ORF72基因內之GGGGCC重複擴展為ALS之最常見原因及FTD之顯著原因。在北美及歐洲人群中報導之平均突變頻率對於家族性ALS為37%，對於散發性ALS為6%，對於家族性FTD為21%，且對於散發性FTD患者為6% (Rademakers等人, 同上)。另外，在GRN 相關FTD中具保護性之TMEM106B 變異體在帶有C9ORF72基因中之重複擴展的FTD患者中亦具保護性(van Blitterswijk等人,Acta Neuropathol. 127(3):397-406, 2014)。在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白可用於例如藉由促進溶酶體功能及/或減輕炎症而減少C9ORF72相關ALS/FTD中之TDP-43病變。
AMD為退化性疾病及已開發世界中失明之主要原因。其導致對接近視網膜中心之小斑點黃斑及敏銳中心視力所需之眼部分的損傷。眼中退化性變化及視力損失可由溶酶體之受損功能及視網膜後方之有害蛋白質積聚引起(Viiri等人,PLoS One. 8(7):e69563, 2013)。隨著疾病進展，中心視力區中之視網膜感覺細胞受損傷，導致中心視力損失。在一些實施例中，本文所述之顆粒蛋白前體變異體及融合蛋白可用於治療AMD。 XVI. 治療方法
本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白可在治療上用於治療神經退化性疾病(例如FTD、NCL、NPA、NPB、NPC、C9ORF72相關ALS/FTD、散發性ALS、AD、高歇氏病(例如2型及3型高歇氏病)及帕金森氏病)、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、AMD或顆粒蛋白前體相關病症。
可向個體投與治療有效量或劑量的本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白。劑量可根據若干因素而變化，包括給藥頻率、所選投藥途徑、組合物之調配物、患者反應、疾患之嚴重性、個體之體重及處方醫師之判斷。根據個別患者之要求，劑量可隨時間增加或減少。在一些實施例中，最初向患者給與低劑量，接著將劑量增加至患者可耐受之有效劑量。
在各種實施例中，藉由任何途徑投與本文所述之顆粒蛋白前體變異體或融合蛋白。在一些實施例中，藉由非經腸遞送投與蛋白質。在一些實施例中，靜脈內投與蛋白質。在一些實施例中，藉由腹膜內遞送投與蛋白質。 XVII. 實例
本揭示案將經由特定實例更詳細地描述。以下實例僅出於說明性目的而提供，且不欲以任何方式限制本揭示案。熟習此項技術者將容易識別多種非關鍵參數，可改變或修改該等參數以得到基本上相同之結果。已努力確保關於所用數字(例如量、溫度等)之精確性，但一些實驗誤差及偏差可能存在。除非另有指示，否則本揭示案之實踐將採用在此項技術之技能範圍內之蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習用方法。此類技術在文獻中全面地解釋。另外，熟習此項技術者應顯而易見，如應用於某些文庫之工程改造方法亦可應用於本文所述之其他文庫。實例 1. 重組 Fc 二聚體 :PGRN 融合蛋白表現及純化
為表現重組Fc二聚體:PGRN融合蛋白，使用PEIMax (MW 40,000，線性，Polysciences)以DNA (µg)與PEI (µL)之1:4比率經由麩醯胺合成酶(GS)剔除中國倉鼠卵巢(CHO) K1細胞(Horizon Discovery)之瞬時轉染來表現構築體。最初在37℃下使細胞於BalanCD Transfectory CHO (Irvine Scientific)中生長及轉染。轉染後，將細胞培養溫度轉換至32℃，且在5% CO2 及80%濕度下於定軌振盪器(Infors Multitron)中維持培養持續時間。在培養第1天以初始培養體積之20%添加營養物進料BalanCD CHO Feed 4 (Irvine Scientific)。7天後，藉由離心收集蛋白質，繼而使用0.22um PES過濾器過濾。
對於HEK細胞中表現之融合蛋白，在Expi293 (Thermo-Fisher)中，根據製造商之說明書(Thermo-Fisher)將細胞以2×106 個細胞/毫升之密度用ExpifectamineTM 293/質體DNA複合物轉染。轉染之後，在37℃下在6-8% CO2 之潮濕氛圍中於定軌振盪器(Infors HT Multitron)中培育細胞。轉染後第一天，將ExpifectamineTM 轉染增強劑1及2添加至培養物中。在轉染後96小時之後藉由離心收集培養基上清液。用無EDTA蛋白酶抑制劑(Roche)補充澄清之上清液且在-80℃下儲存。
對於重組融合蛋白純化，將澄清之培養基上清液負載於HiTrap MabSelect Prisma蛋白質A親和管柱(GE Healthcare Life Sciences)上且用含0.5% (v/v) Triton X-100之PBS緩衝液(pH 7.4)與0.5 M NaCl洗滌。在50 mM檸檬酸鹽緩衝液與100 mM NaCl (pH 3.5-3.6)中溶離融合蛋白。將來自親和管柱之溶離物(1)負載於HiTrap®去鹽管柱(GE Healthcare Life Sciences)上用於串聯緩衝液交換為1x PBS之最終緩衝液，或(2)藉由添加精胺酸-丁二酸鹽緩衝液(1 M精胺酸，685 mM丁二酸，pH 5.0)中和以調整溶離物之pH值。對於某些融合蛋白，藉由負載至陽離子交換管柱(SP HP，HiTrap™)上且用200 mM NaCl (pH 5.0)洗滌管柱來進一步處理來自親和管柱之溶離物。接著藉由經20個管柱體積施加NaCl溶液之梯度(200 mM至500 mM)自管柱溶離融合蛋白。接著將含有＞95%蛋白質之部分彙集在一起。將硫酸銨添加至彙集部分中達到約1 M之最終濃度，此後將溶液負載至疏水相互作用管柱(Butyl HP，HiTrap™)中。用含1 M硫酸銨之0.1 M檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)洗滌管柱，且藉由經20個管柱體積施加硫酸銨之梯度(1 M至0)來溶離蛋白質。將含有＞95%蛋白質之彙集部分合併且於含有6%蔗糖之10 mM磷酸鈉緩衝液中透析。獲得於10 mM磷酸鈉、6%蔗糖(pH 6.5)中之經純化蛋白質。下表2及表3示出例示性融合蛋白之序列。
圖1A及圖1B包括指示融合蛋白純化至高於98%純度之代表性數據。 表2. Fc二聚體:PGRN融合蛋白之序列
Fc 二聚體 :PGRN 第一 Fc 多肽 第二 Fc 多肽 -PGRN
融合物1 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:98
融合物2 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:99
融合物3 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:100
融合物4 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:101
融合物5 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:102
融合物6 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:98
融合物7 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:99
融合物8 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:100
融合物9 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:101
融合物10 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:102
融合物11 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:108
融合物32 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:123
融合物34 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:124
融合物36 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:125
融合物37 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:126
表3  Fc二聚體:PGRN融合蛋白之額外序列
Fc 二聚體 :PGRN 第一 Fc 多肽 第二 Fc 多肽 -PGRN
部分鉸鏈 + Fc 連接子 PGRN 變異體
融合物12 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:111
融合物13 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:112
融合物14 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:113
融合物15 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:114
融合物16 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:115
融合物17 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:116
融合物18 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:117
融合物19 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:118
融合物20 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:119
融合物21 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:120
融合物22 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:121
融合物23 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:4
融合物24 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:5
融合物25 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:6
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融合物27 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:8
融合物28 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:9
融合物29 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:10
融合物30 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:11
融合物31 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:12
融合物32 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:13
融合物33 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:14
融合物34 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:15
融合物35 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:16
融合物36 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:19
融合物37 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:20
融合物38 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:21
融合物39 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:22
融合物40 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:23
融合物41 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:24
融合物42 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:25
融合物43 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:26
融合物44 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:30
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融合物46 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:32
融合物47 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:33
融合物48 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:34
融合物49 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:35
融合物50 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:36
融合物51 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:37
融合物52 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:38
融合物53 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:39
融合物54 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:40
融合物55 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:41
融合物56 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:42
融合物57 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:43
融合物58 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:44
融合物59 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:45
融合物60 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:46
融合物61 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:47
融合物62 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:48
融合物63 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:49
融合物64 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:50
融合物65 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:51
融合物66 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:52
融合物67 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:53
融合物68 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:54
融合物69 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:56
融合物70 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:57
融合物71 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:127
融合物72 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:128
實例 2. Fc 二聚體 :PGRN 融合蛋白之 C 端裂解之自頂向下質譜分析
藉由肽定位或藉由自頂向下質譜法使用耦接至Exactive plus EMR質譜儀之Thermo Ultimate 3000 UHPLC量測自CHO細胞表現及純化之完整Fc二聚體:PGRN融合蛋白。為作比較，亦評估在HEK293細胞或CHO細胞中表現之含有野生型PGRN序列之融合蛋白(融合物11)。自頂向下質譜分析
注射含約10 µg樣品之PBS緩衝液或調配緩衝液(10 mM磷酸鹽緩衝液，pH 6.5，6%蔗糖)以供分析。用Thermo MabPAC RP管柱(4 µm，2.1 × 50 mm，P/N 88648)在55℃之管柱溫度下且使用含0.1三氟乙酸(TFA)之H2 O之移動相(A)及乙腈之移動相(B)以0.3毫升/分鐘之流動速率進行液相層析(LC)。梯度始於20% (B)且勻升至70% (B)，隨後返回至20% (B)。在214 nm及280 nm下使用UV/Vis進行偵測。用兩個全離子片段化分析(AIF)掃描來操作EMR質譜儀。
第一AIF設定：掃描範圍350-5000 m/z。CE：25。源內CID 90 ev。解析度設定：17,500及AGC目標3e6，最大IT：200 ms。顯微掃描：1。
第二AIF設定：掃描範圍350-5000 m/z。CE：200。源內CID 90 ev。解析度設定：35,000及AGC目標1e6，最大IT：200 ms。顯微掃描：5。
電噴霧電離(ESI)源條件：鞘氣流動速率：25，輔助氣速率：4。噴霧電壓3kV，毛細管溫度325℃，S-透鏡RF水準125。輔助氣加熱器溫度300℃。EMR模式開啟。捕集氣壓力設定2.0。
自頂向下氣相反應誘導天冬胺酸(D)及脯胺酸(P) (對應於SEQ ID NO:2之位置569及位置570)之胺基酸之間的PGRN C端裂解，此產生7個胺基酸長度之完整肽，其序列對應於不同顆粒蛋白前體變異體之獨特C端序列。裂解之肽代表自C端之依序損失。使用20 ppm (百萬分率)提取肽XIC峰，且曲線下面積(AUC)用於計算完整蛋白質對比總蛋白質之百分比。肽定位分析
為製備樣品，在37℃下將含約40 µg樣品之50 mM碳酸氫鹽(pH 7.8)與AspN (New England Biolabs，目錄號P8014S)以1:40 (w/w)之酶:蛋白質比率培育30分鐘。添加甲酸(1%)以淬滅反應，且將樣品轉移至LCMS小瓶以供分析。藉由液相層析在耦接至UV/Vis及Q Exactive Orbitrap電噴霧電離質譜儀(Thermo Scientific, CA, USA)之UHPLC Vanquish (Thermo Scientific, CA, USA)上進行肽定位分析。對於各分析，使用0.20 mL/min之流動速率在40℃下於正電離模式下將25 µL樣品注射於CSH C18 1.7 µm 2.1×150 mm管柱(Waters)上。移動相A由含水與0.1%甲酸組成，而移動相B由乙腈與0.1%甲酸組成。梯度始於1% (B)且經50分鐘時段在三個步驟中自1%勻升至10% (B)，自10%勻升至40% (B)，且自40%勻升至70% (B)，隨後返回至1% (B)。在280及214 nm之波長下記錄UV/Vis跡線，且在正模式下使用Full MS-ddMS2擷取來收集數據。峰面積用於計算完整肽及裂解肽之百分比。
下表4示出，大於95%之融合物1具有完整C端且大於80%之融合物2具有完整C端。剪短之融合蛋白(例如在C端處失去1個至3個胺基酸之融合蛋白)的存在小於5% (融合物1)且小於20% (融合物2)。在表4中，「-L」、「-IL」、「-PIL」、「-FL」及「-PFL」係指末端胺基酸自融合蛋白裂解。額外融合蛋白之數據可見於表8A及表8B中。作為參考點，約95%含有野生型PGRN之融合蛋白(融合物11)當在HEK細胞中表現時保持完整，而7%之融合物11當在CHO細胞中表現時保持完整。 表4
   融合物 1 (PIL) 融合物 2 (PFL)
   面積計數 %相對面積    面積計數 %相對面積
完整 50114249 95.6 完整 41831754 80.3
-L 2206596 4.2 -L 9100294 17.5
-IL 12728 0.0 -FL 529791 1.0
-PIL 76847 0.1 -PFL 608392 1.2
實例 3. 熱穩定性及凍融穩定性
藉由Prometheus儀器(NanoTemper)量測融合蛋白之熱穩定性。固有螢光用於監測在溫度勻升期間之蛋白質以生成熔融型態(Tm 、T起始 )。融合物1及融合物2之結果在圖2中說明。
亦對融合蛋白進行凍融分析。簡言之，將蛋白質樣品在乾冰上培育約10分鐘，此後將樣品轉變至室溫且培育30分鐘。凍融循環重複五次，此後使樣品達到4℃且使用SEC-HPLC (Waters BEH SEC管柱，200 Å 1.7 µm，30 cm，2x PBS與10% (v/v)乙醇之移動相，0.2 mL/min流動速率)分析。融合物1及融合物2之結果在圖3中說明。
對於融合物1及融合物2所獲得之結果(圖2及圖3)指示兩種融合蛋白具有良好熱穩定性及良好凍融穩定性。實例 4. 重組 Fc 二聚體 :PGRN 融合蛋白與分揀蛋白之結合
在25℃下在具有Series S感測器晶片CM5及HBS-EP+運作緩衝液之GE Healthcare Biacore 8K儀器上進行所有表面電漿子共振(SPR)實驗。為量測Fc二聚體:PGRN融合蛋白對分揀蛋白之結合親和力，使用經GE Healthcare人類抗體捕獲套組固定之感測器晶片(對於人類分揀蛋白)或Biacore™感測器晶片蛋白質A (對於食蟹猴及小鼠分揀蛋白，Cytiva，編號29127555)捕獲融合蛋白。以0.4 nM - 100 nM範圍內之3倍濃度系列之分揀蛋白分析物使用多循環動力學，允許300秒接觸時間、600秒解離時間及30 µL/min之流動速率。1:1動力學模型用於評估分揀蛋白結合之結合動力學。Fc二聚體:PGRN融合蛋白與分揀蛋白之Biacore結合數據示於下表5-7中。分揀蛋白分析物來源如下：人類分揀蛋白(R&D Systems)；小鼠分揀蛋白(R&D Systems)；食蟹猴分揀蛋白(內部，基於UniProt A0A2K5VHG2)。
如表5中所說明，融合物1相對於融合物2展現對人類分揀蛋白更強之親和力。關於在HEK細胞中表現之含有野生型PGRN之融合蛋白(融合物11)，融合物1相比融合物2 (約14倍)說明對人類分揀蛋白之結合親和力的損失更小(約3倍)。人類分揀蛋白結合親和力之損失似乎由融合物1及融合物2兩者相對於野生型PGRN融合蛋白之更快解離速率動力學引起。關於在HEK細胞中表現之野生型PGRN融合蛋白(融合物11)，融合物1說明對小鼠分揀蛋白大約相同之結合親和力及對食蟹猴分揀蛋白約弱2至3倍之結合親和力。 表5. 人類分揀蛋白結合
融合蛋白 ka ( 1/ Ms ) kd ( 1/ s ) KD ( M) 與融合物 11 之倍數差異 (HEK)
融合物11 (HEK) 1.08E+05 1.66E-03 1.53E-08 1.0
融合物1 (CHO) 9.59E+04 4.66E-03 4.85E-08 3.2
融合物2 (CHO) 8.50E+04 1.82E-02 2.14E-07 14.0
表6. 小鼠分揀蛋白結合
融合蛋白 ka ( 1/ Ms ) kd ( 1/ s ) KD ( M)
融合物11 (HEK) 3.87 × 104 2.94 × 10-3 7.61 × 10-8
融合物1 (CHO) 2.03 × 105 1.38 × 10-2 6.38 × 10-8
表7. 食蟹猴分揀蛋白結合
融合蛋白 ka ( 1/ Ms ) kd ( 1/ s ) KD ( M)
融合物11 (HEK) 5.38 × 104 1.43 × 10-3 2.65 × 10-8
融合物1 (CHO) 4.49 × 104 2.96 × 10-3 6.58 × 10-8
藉由SPR (上文所述)或藉由量測Fc二聚體:PGRN融合蛋白與固定之分揀蛋白之結合的標準比色ELISA檢定來分析額外融合蛋白之分揀蛋白結合。對於藉由ELISA量測，將重組His標記之分揀蛋白(R&D Systems，目錄號3154-ST-050)固定於鎳塗佈之96孔盤上。將含有完整蛋白質與C端裂解蛋白質(「%完整」在表8A及表8B中)之混合物之融合蛋白於3% BSA/TBST中稀釋且以連續稀釋液添加至經塗佈之孔中。在室溫下與融合蛋白培育兩小時後，用TBST洗滌孔。藉由在室溫下與3% BSA/TBST中稀釋之抗人IgG抗體(山羊抗人IgG HRP抗體，Jackson ImmunoResearch，目錄號109-035-088)培育一小時來偵測結合之融合蛋白。與偵測抗體培育後，用TBST洗滌孔且與TMB溶液(Surmodics，目錄號TMBW-1000-01)培育五分鐘。用450 nM終止溶液(Surmodics，目錄號LSTP-1000-01)終止顯色反應，且在450 nm下使用BioTek Synergy盤讀取器(型號Neo2)量測吸光度。表8A及表8B中提供例示性融合蛋白之結果。除非有指示，否則表8A及表8B中所列之所有融合蛋白皆自CHO細胞表現。 表8A
融合蛋白 QLL 置換為 % 完整 ( 自頂向下 MS) % 完整 ( 肽定位 ) 分揀蛋白 EC50 (nM) (ELISA) EC50 之倍數差異
融合物11 (HEK) --- 95% --- 2.8 1.0
融合物11 (CHO) --- 7% --- 60±12.7 21.0
融合物6 PIL 98% --- 13.5 4.8
融合物7 PFL 87% --- 14.3 5.1
融合物8 QQL 59% --- 19.1 6.8
融合物9 VVL 39% --- 18.6 6.6
融合物10 VTL 29% --- 23.9 8.5
融合物12 NIL 3% --- 34.4 12.3
融合物13 LLL ＜ 1% --- 56.5 20.2
融合物14 PLL ＜ 1% --- 55 19.6
融合物15 PRL ＜ 1% --- 120 42.9
融合物16 YIL --- 0.6% ＞ 100 ＞ 50
融合物17 VLL --- 2.5% ＞ 100 ＞ 50
融合物18 VIV --- 35% ＞ 100 ＞ 50
融合物19 FIL --- 4.4% ＞ 100 ＞ 50
融合物20 MLL --- 0.7% ＞ 100 ＞ 50
融合物21 QLLG (SEQ ID NO:142) 0% --- ＞ 100 ＞ 50
融合物22 QLLGK (SEQ ID NO:143) 0% --- ＞ 100 ＞ 50
表8B
融合蛋白 QLL 置換為 % 完整 ( 肽定位 ) 分揀蛋白 KD (M) (SPR) KD 之倍數差異
融合物11 (HEK) --- 85.8% 9.70E-09 1.0
融合物1 PIL 91.0% 3.27E-08 3.4
融合物23 PHL --- 5.18E-08 5.3
融合物24 PKL 38.0% 1.10E-08 1.1
融合物25 PDL --- 4.88E-08 5.0
融合物26 PEL 51.4% 2.98E-08 3.1
融合物27 PSL --- 7.96E-08 8.2
融合物28 PTL --- 5.51E-08 5.7
融合物29 PNL --- 1.04E-07 10.7
融合物31 PGL --- 4.67E-08 4.8
融合物32 PPL 89.70% 9.30E-09 1.0
融合物34 PYL 77.8% 2.62E-08 2.7
融合物35 PVL --- 4.57E-08 4.7
融合物36 QRL 64.7% 1.24E-08 1.3
融合物37 QHL 62.6% 1.17E-08 1.2
融合物38 QKL 62.7% 1.57E-08 1.6
融合物39 QDL --- 4.04E-08 4.2
融合物41 QNL 36.5% 2.68E-08 2.8
融合物42 QPL --- 6.25E-08 6.4
融合物52 EFL 0.00% 6.84E-09 0.7
融合物54 TFL 0.0% 1.66E-08 1.7
融合物60 RQL 0.10% 7.75E-09 0.8
融合物62 KQL 2.4% 1.91E-08 2.0
融合物68 YQL 0.60% 8.81E-09 0.9
融合物70 QLLLRQLL (SEQ ID NO:60) 5.0% 1.19E-08 1.2
如藉由SPR量測，融合物30、33、40、43-51、53、55-59、61、62-67、69、71及72展現極少乃至無分揀蛋白結合。
亦藉由表面電漿子共振(SPR)針對與人類TfR之結合來檢定融合物1及融合物2。在25℃下在具有Series S感測器晶片CM5及HBS-EP+運作緩衝液之GE Healthcare Biacore 8K儀器上進行表面電漿子共振(SPR)實驗。為量測融合蛋白對hTfR之結合親和力，用抗生物素蛋白鏈菌素固定感測器晶片且捕獲生物素化AviTag-hTfR。以25 nM - 2 µM範圍內之3倍濃度系列之融合蛋白分析物使用單循環動力學，允許80秒接觸時間、180秒解離時間及30 µL/min之流動速率。穩態親和力模型用於展示融合蛋白能夠以約50 nM至150 nM之親和力結合hTfR。實例 5. 活體外功能檢定
使用與Trouplin等人J. Vis. Exp. 2013 (81) 50966中類似之方法活體外自GRN KO/hTfR.KI小鼠之骨髓得到BMDM (下文所述)，但將重組M-CSF直接添加至細胞生長培養基中以誘導分化。用融合物11、融合物1及融合物2之半對數滴定將BMDM處理48小時。經由添加含有內部標準混合物之甲醇提取細胞脂質，且藉由液相層析-質譜法(LC-MS/MS)在Q-trap 6500 (SCIEX)上量測BMP豐度。GRN KO/hTfR.KI BMDM相對於GRN WT/hTfR.KI BMDM具有約2.5倍之BMP 36:2增加。融合物1及融合物2兩者均以劑量依賴性方式在可比功效下挽救BMP積聚(圖5)。相對於含有野生型PGRN之融合蛋白(融合物11)，融合物1說明極其類似之活體外效力。 液相層析-質譜法
藉由液相層析(Shimadzu Nexera X2 系統, Shimadzu Scientific Instrument, Columbia, MD, USA)與電噴霧質譜法(Sciex 6500+ QTRAP, Sciex, Framingham, MA, USA)相結合進行BMP分析。對於各分析，在55℃下使用0.40 mL/min之流動速率將5 µL樣品注射於BEH醯胺1.7 µm 2.1×150 mm管柱(Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA)上。移動相A由水與10 mM甲酸銨 + 0.1%甲酸組成。移動相B由乙腈與0.1%甲酸組成。梯度如下程式化：在95% B下0.0-1.0分鐘；1.0-7.0分鐘達到50% B；7.0-7.1分鐘達到95% B；及在95% B下7.1-12.0分鐘。在負離子模式中使用以下設定進行電噴霧電離：氣簾氣，25；碰撞氣體設定為中間值；離子噴霧電壓，-4500；溫度，600；離子源氣體1，50；離子源氣體2，60；碰撞能，-50；CXP，-15；DP，-60；EP，-10；停留時間，20 ms。在多反應監測模式(MRM)中使用Analyst 1.6.3 (Sciex)進行數據擷取，其中擷取參數類似於先前所述(Ullman等人 2020.Sci Transl Med 12(545):eaay1163)。使用MRM轉變參數偵測BMP物質。使用BMP(14:0_14:0)作為內部標準定量BMP物質。BMP物質係基於其滯留時間及MRM特性來鑑定。在針對同位素重疊校正之後使用MultiQuant 3.02 (Sciex)進行定量。將BMP物質針對總蛋白量、組織重量或生物流體體積正規化。使用二喹啉甲酸(BCA)檢定(Pierce, Rockford, IL, USA)量測蛋白質濃度。
前體(Q1) [M-H]- 及產物離子(Q3)m/z 轉變用於量測BMP物質。縮寫在本文中用於指具有兩個側鏈之物質，其中脂肪酸側鏈之結構在BMP格式中之括號內指示(例如BMP(18:1_18:1))。數字遵循脂肪酸碳原子數:雙鍵數之標準脂肪酸記數格式。或者，BMP物質可一般性地根據碳原子總數:雙鍵總數提及；具有類似值之物質可由其Q1及Q3值區分。實例 6. 融合蛋白在 GRN KO/hTfR.KI 小鼠中跨越 BBB 且校正相關藥效學終點
將融合物1 (表2)經由尾靜脈注射至與hTfR KI小鼠(GRN KO/hTfR.KI小鼠)雜交之GRN KO小鼠(Jackson Laboratory，儲備號013175)中以測試其跨越BBB之能力。hTfR KI小鼠描述於國際專利公開案第WO2018152285號中。為產生GRN KO/hTfR.KI小鼠，在第一輪育種中，使GRN 異型接合(GRN HET)小鼠與TfRms/hu KI同型接合(TfRms/hu .KI HOM)小鼠雜交以產生GRN HET × TfRms/hu .KI HET子代。接著使GRN HET × TfRms/hu .KI HET小鼠與TfRms/hu .KI HOM小鼠雜交以在此第二輪中獲得GRN HET × TfRms/hu .KI HOM子代。在第三輪及最後一輪育種中，使GRN HET × TfRms/hu .KI HOM小鼠與GRN HET × TfRms/hu .KI HOM小鼠雜交以產生用於本研究之最終GRN KO × TfRms/hu .KI HOM小鼠。
向2-3月齡之GRN KO/hTfR.KI小鼠經由尾靜脈經靜脈內給與單次劑量之無菌鹽水(媒劑)或0.5、1.5、5或15 mg/kg融合物1。在給藥後3天藉由頜下放血使小鼠出血用於血漿分離。在給藥後7天，用阿佛丁(avertine)使小鼠鎮靜，且進行心臟穿刺以收集全血用於血漿分離。用冷卻之1X PBS以5毫升/分鐘之速率經心臟灌注動物5-8分鐘，或直至肝清除血液。收集肝之100 mg部分及腦之左半球。在4℃下以1000xg 使血液樣品離心，此後移出頂部血漿層，在乾冰上急速冷凍，且在-80℃下或低於-80℃下儲存直至如下文所述進行分析。將所有組織樣品立即在乾冰上急速冷凍，且在-80℃下或低於-80℃下儲存直至如下文所述進行分析。 表9. 研究設計/實驗組
分子 細胞株 基因型 劑量 (mg/kg) N/ 組
鹽水 N/A TfR.KI N/A 8
鹽水 N/A GRN KO/TfR.KI N/A 6
融合物1 CHO GRN KO/TfR.KI 0.5 6
融合物1 CHO GRN KO/TfR.KI 1.5 6
融合物1 CHO GRN KO/TfR.KI 5 6
融合物1 CHO GRN KO/TfR.KI 15 6
為量測組織樣品中之融合蛋白含量，將組織樣品稱重且在按重量計10X體積之補充有1X蛋白酶抑制劑(Roche)及1X磷酸酶抑制劑(Roche)之細胞溶解緩衝液(Cell Signaling Technologies；20 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM Na2 EDTA、1 mM EGTA、1% Triton、2.5 mM焦磷酸鈉、1 mM β-甘油磷酸鹽、1 mM Na3 VO4 及1 µg/mL亮抑酶肽)中均化。在29 Hz下使用具有3 mm金屬珠粒之TissueLyzer均化樣品，2次3分鐘。均化之後，在4℃下於桌上型離心機上使樣品以最大速度旋轉20分鐘。將上清液轉移至新管，且藉由Fc-PGRN ELISA檢定(Fc捕獲及PGRN偵測ELISA)及Fc-Fc ELISA檢定(Fc捕獲及Fc偵測ELISA)分析上清液之一部分。
如實例5中所述對樣品進行BMP分析。
可溶性TREM2 (sTREM2)水準如下量測：藉由在4℃下用1µg/mL生物素化綿羊抗小鼠抗體(R&D Systems BAF1729)塗佈隔夜來製備MSD GOLD 96w小斑點抗生物素蛋白鏈菌素盤(MSD L45SA)用於Trem2檢定。次日，用tris緩衝鹽水與triton (TBST)沖洗MSD盤，且使用含3%牛血清白蛋白之TBST封閉兩小時，同時在600rpm下振盪。用TBST再次沖洗MSD盤，且將腦溶解產物於封閉溶液中稀釋5倍且添加至MSD盤中以在600rpm下培育1小時。下次TBST沖洗之後，將磺基標記之綿羊抗小鼠抗體(R&D Systems AF1729)添加至盤中且培育1小時，在600rpm下再次培育，且進行最後沖洗，隨後添加水中稀釋之2X MSD讀取緩衝液。接著使用MSD Meso Sector S600讀取盤。將Trem2信號針對蛋白質濃度正規化且用GraphPad Prism繪圖。
圖6A-6C說明融合物1於GRN KO/hTfR.KI小鼠之血漿、腦及肝中之藥物動力學。空心圓代表媒劑處理之GRN WT群組，且正方形代表媒劑處理之GRN KO群組。融合蛋白處理之GRN KO群組由三角形(15 mg/kg)、菱形(5 mg/kg)、星形(1.5 mg/kg)及x標誌(0.5 mg/kg)代表。在所有劑量下，融合蛋白自血漿、腦及肝清除，其中在給藥後7天小於0.1 nM所偵測之蛋白質在組織中且約1 nM所偵測之蛋白質在血漿中。
圖7A及圖7B說明在給藥後7天GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦及肝組織中之TREM2水準。空心圓代表媒劑處理之GRN WT群組，且正方形代表媒劑處理之GRN KO群組。融合蛋白處理之GRN KO群組由三角形(15 mg/kg)、菱形(5 mg/kg)、星形(1.5 mg/kg)及x標誌(0.5 mg/kg)代表。5 mg/kg及15 mg/kg之劑量水準能夠挽救腦中之TREM2水準，而低至1.5 mg/kg之劑量水準能夠挽救肝中之TREM2水準。
圖8A及圖8B說明在給藥後7天GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦及肝組織中之BMP(18:1/18:1)水準。空心圓代表媒劑處理之GRN WT群組，且正方形代表媒劑處理之GRN KO群組。融合蛋白處理之GRN KO群組由三角形(15 mg/kg)、菱形(5 mg/kg)、星形(1.5 mg/kg)及x標誌(0.5 mg/kg)代表。低至1.5 mg/kg之劑量水準能夠挽救腦中之BMP水準，而在所有劑量下挽救肝中之BMP水準。對於其他BMP物質，包括BMP(20:4/20:4)及BMP(22:6/22:6)，觀測到類似結果。
圖6A-6C、圖7A及圖7B以及圖8A及8B中之數據顯示融合物1能夠跨越GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦中之BBB且校正顆粒蛋白缺乏之相關PD終點。實例 7. 挽救 GRN KO/hTfR.KI 小鼠之腦組織中之葡苷基神經鞘胺醇水準 腦收集及處理用於脂質提取及葡苷基神經鞘胺醇分析
將融合物1 (如表2中所述)或不具有任何TfR結合能力之相應融合蛋白經由尾靜脈以5mg/kg單次劑量注射至GRN KO/hTfR.KI小鼠(圖9中之「Grn KO」)中。相應融合蛋白包含具有SEQ ID NO:122之序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:108之序列的第二多肽。兩種融合蛋白如實例1中所述自CHO細胞表現及純化。在投與融合蛋白之後七天，將小鼠處死以檢查腦、肝及血漿中之葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)水準。用致死劑量之三溴乙醇麻醉後，用冰冷PBS經心臟灌注小鼠。接著在冰上收集18-20 mg額皮質，稱重，與3-mm不鏽鋼珠粒一起轉移至1.5 Safe-Lock Eppendorf管，接著速凍。為製備腦樣品用於脂質體學分析，將400 µL具有內部標準之LCMS級甲醇添加至樣品中。接著在4℃下於25 Hz下用Qiagen Tissuelyser均化組織30秒。接著在4℃下以21,000xg使樣品離心20分鐘。旋轉之後，將上清液轉移至96孔V底半深孔盤且在-20℃下儲存1小時以使蛋白質進一步沈澱。在此培育之後，在4℃下以21,000xg使樣品再旋轉10分鐘。將100 µL上清液轉移至具有玻璃插片之96孔盤(Analytical Sales & Services，參考號27350)。接著在氮氣流下乾燥樣品(約2小時)，接著再懸浮於100 µL乙腈/異丙醇/水(92.5/5/2.5，v/v/v)與5 mM甲酸銨及0.5%甲酸中。 用於葡苷基神經鞘胺醇之LCMS檢定
藉由液相層析(Shimadzu Nexera X2系統, Shimadzu Scientific Instrument, Columbia, MD, USA)與電噴霧質譜法(Sciex QTRAP 6500+ Sciex, Framingham, MA, USA)相結合進行葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)分析。對於各分析，在45℃下使用0.45 mL/min之流動速率將10 µL樣品注射於HALO HILIC 2.0 µm 3.0 × 150 mm管柱(Advanced Materials Technology, PN 91813-701)上。移動相A由92.5/5/2.5 ACN/IPA/H2O與5 mM甲酸銨及0.5%甲酸組成。移動相B由92.5/5/2.5 H2O/IPA/ACN與5 mM甲酸銨及0.5%甲酸組成。梯度如下程式化：在100% B下0.0-3.1分鐘，在95% B下3.2分鐘，在85% B下5.7分鐘，在85% B下保持至7.1分鐘，在7.25分鐘時降至0% B及保持至8.75分鐘，且在10.65分鐘時勻變返回至100%及保持至11分鐘。在正離子模式中應用以下設定進行電噴霧電離：氣簾氣，25；碰撞氣體設定為中間值；離子噴霧電壓，5500；溫度，350℃；離子源氣體1，55；離子源氣體2，60。使用Analyst 1.6 (Sciex)在多反應監測模式(MRM)中用以下參數進行數據擷取：停留時間(msec)及碰撞能(CE)；入口電位(EP)，10；及碰撞室出口電位(CXP)，12.5。數據擷取參數類似於先前所述(Ullman等人 2020.Sci Transl Med 12(545):eaay1163)。使用同位素標記之內部標準GlcSph(d5)定量GlcSph。使用MultiQuant 3.02 (Sciex)進行定量。 葡苷基神經鞘胺醇腦結果
評估GRN KO及GRN WT小鼠以及接受靜脈內(IV)投與5 mg/kg劑量之融合物1或相應融合蛋白之GRN KO小鼠之腦中的GlcSph水準(圖9)。GRN KO腦GlcSph水準平均為WT同窩仔之值的4.13倍(分別為23.91±1.963 ng/µL對比5.782±1.262 ng/µL，p=＜0.0001)。在融合物1處理之小鼠中，朝向GRN WT小鼠之挽救為88% (7.866±0.8237 ng/µL，p=0.0002)。反之，經靶向非CNS之相應融合蛋白處理之GRN KO小鼠僅展現朝向WT GlcSph水準之22%恢復(19.92±3.486 ng/µL，p=0.5619)。實例 8.GRN KO/hTfR.KI 小鼠中之 BMP 及葡苷基神經鞘胺醇校正之持久性
將融合物1 (如表2中所述，如實例1中所述自CHO細胞表現及純化)經由尾靜脈以單次劑量注射至GRN KO/hTfR.KI小鼠中，劑量如下：1 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg。對於對照，用鹽水注射GRN KO/hTfR.KI及GRN 野生型/hTfR.KI小鼠。在投與融合蛋白或鹽水之後兩週、三週及六週，將小鼠群組處死以檢查腦中之BMP及葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)水準。如實例7中所述將小鼠麻醉且製備其腦組織。分別如實例5及7中所述量測BMP及GlcSph水準。結果在圖10-12中說明。葡苷基神經鞘胺醇腦結果
評估GRN KO/hTfR.KI及GRN 野生型/hTfR.KI小鼠中之葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)水準。如圖10中所說明，GRN KO/hTfR.KI中之GlcSph水準相對於GRN 野生型/hTfR.KI小鼠升高約4倍。投與所有劑量之融合物1校正GRN KO/hTfR.KI中升高之GlcSph水準，所投與之最高劑量(5 mg/kg)顯示所有融合蛋白處理之群組的最大改善。在給藥後兩週觀測到以單次劑量之融合物1達到接近GRN 野生型水準之最大校正，不過在給藥後至六週觀測到部分校正。BMP 腦結果
如先前所報導，GRN KO/hTfR.KI中之BMP水準受顆粒蛋白前體之水準不足所影響。向GRN KO/hTfR.KI投與融合物1能夠校正此影響。代表性BMP物質之水準在圖11及圖12中說明。投與所有劑量之融合物1校正GRN KO/hTfR.KI中之BMP水準。在所投與之最高劑量下，在給藥後兩週觀測到BMP水準之最大校正，且在給藥後三週維持部分校正。實例 9. 挽救 GRN KO/hTfR.KI 小鼠中之 GCase 活性
將融合物1 (如表2中所述，如實例1中所述自CHO細胞表現及純化)經由尾靜脈以實例8中所述之劑量注射至GRN KO/hTfR.KI小鼠中。對於對照，用鹽水注射GRN KO/hTfR.KI及GRN 野生型/hTfR.KI小鼠。在投與融合蛋白或鹽水之後兩週、三週及六週，將小鼠群組處死以檢查腦中之葡萄糖腦苷脂酶(GCase)酶活性。如實例7中所述將小鼠麻醉且製備其腦組織。如下檢定GCase活性。將腦組織於含1% NP-40之PBS緩衝液中溶解。藉由BCA檢定來量測腦溶解產物樣品中之總蛋白質水準，且使樣品正規化用於量測GCase活性。將組織樣品首先於GBA活性緩衝液(磷酸鹽檸檬酸鹽緩衝液(Sigma-Aldrich，目錄號P4809)與0.5%牛膽酸鈉及0.25% Triton X-100)中稀釋且添加至96孔盤之孔中。隨後將4-MU葡萄糖受質(Sigma-Aldrich，目錄號M3633-1G)添加至各樣品孔中達到1 mM之最終濃度。將盤封蓋且在室溫下以700 RPM攪動5分鐘，隨後轉移至非CO2 培育箱且在37℃下培育三小時。在培育期結束時，將終止溶液(500 mM甘胺酸，300 mM NaOH，pH 9.8)添加至樣品中以停止酶反應，且在BioTek盤讀取器中量測酶活性。結果在圖13中說明。
如圖13中所說明，投與融合物1在給藥後兩週將GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦中的GCase活性校正至野生型水準。實例 10. 融合蛋白之長期給藥挽救 GRN KO/hTfR.KI 小鼠中之遠端生物標誌物
進行研究以確定用如本文所述之融合蛋白長期給藥是否可挽救遠端生物標誌物。藉由每週一次持續八(8) 週以5 mg/kg腹膜內遞送至7月齡GRN KO/hTfR.KI小鼠來投與融合蛋白。對於對照，用鹽水注射GRN KO/hTfR.KI及GRN 野生型/hTfR.KI小鼠(亦稱作「hTfR.KI小鼠」)。以融合蛋白之初始劑量開始且此後每兩週向各群組中之小鼠提供CD4注射。第0週、第2週、第4週、第6週及第8週(給藥後)藉由頜下放血獲得血液樣品用於血漿分離。在融合蛋白之第八個及最後劑量之後二十四(24)小時，將小鼠群組處死；獲得末端血液及CSF樣品，且收集腦及肝組織且如先前(實例6)所述而保存。使用實例6中所述之Fc:Fc:ELISA在腦及肝中量測所投與之融合蛋白的量。在腦、肝、血漿及/或CSF中分析BMP、葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)及Trem2水準。另外，在腦組織中分析神經膠質瘤病之某些標誌物(CD68、Iba1、GFAP)，且在CSF及血漿樣品中分析神經絲輕鏈(Nf-L)水準。分別如實例5、6及7中所述量測BMP、TREM2及GlcSph水準。如下文所述量測神經膠質瘤病標誌物之CSF Nf-L水準及腦水準。表10提供實驗設計之彙總，且結果在圖14-28中說明。 表10. 用於長期給藥研究之研究設計/實驗組
分子 第一Fc 多肽 第二Fc 多肽-PGRN 細胞株 基因型 劑量(mg/kg)
鹽水 -- -- N/A hTfR.KI N/A
鹽水 -- -- N/A GRN KO/hTfR.KI N/A
融合物1 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:98 CHO GRN KO/hTfR.KI 5
融合物11 SEQ ID NO:85 SEQ ID N:108 HEK GRN KO/hTfR.KI 5
Fc-PGRN (非TfR結合) SEQ ID NO:122 SEQ ID NO:108 CHO GRN KO/hTfR.KI 5
用於Nf-L之CSF及血漿分析之方法
如先前所述且根據製造商推薦(Ullman等人 2020.Sci Transl Med 12(545):eaay1163)來分析CSF及血漿Nf-L水準。簡言之，使用Quanterix Simoa Neurofilament Light Advantage (NFL)套組。簡言之，在樣品稀釋劑(Quanterix 102252)中將腦脊髓液稀釋100倍且將血漿稀釋10倍，接著添加Simoa偵測器試劑及珠粒試劑(Quanterix 103159, 102246)，且在30℃下以800rpm振盪下培育樣品30分鐘。此後，根據Quanterix兩步方案在Simoa微盤洗滌器上用Simoa洗滌緩衝液A (Quanterix 103078)洗滌樣品盤，添加SBG試劑(Quanterix 102250)，且在30℃、800rpm下再次培育樣品10分鐘。繼續兩步洗滌方案，使樣品珠粒兩次再懸浮於Simoa洗滌緩衝液B (Quanterix 103079)中，隨後進行緩衝液之最後抽吸。在室溫下乾燥10分鐘後，使用Nf-L分析方案在Quanterix SR-X儀器上量測樣品Nf-L濃度且針對與Quanterix檢定套組一起提供之校準曲線進行內插。 用於神經膠質瘤病標誌物之檢定
在PBS經心臟灌注及於4% PFA中後固定之後，將小鼠半腦冠向切片。簡言之，對大批腦(至多40個)進行修整且安放於單個明膠塊中，接著以40 µm之厚度冠向切片。接著將包埋有腦切片之明膠薄片儲存於抗原保存溶液(50% PBS:50%乙二醇 + 1% PVP)中直至染色。將切片針對神經膠質瘤病標誌物GFAP (驢抗雞，Novus NBP1-05198，1:1000)、Iba1 (驢抗山羊，Novus NB100-1028，1:1500)及CD68 (驢抗大鼠，BioRad MCA1957，1:500)進行染色。簡言之，在室溫下搖動下將切片於封閉緩衝液(PBS + 1% BSA + 0.1%魚膠 + 0.5% triton X-100)中培育4小時，接著轉移至具有上文所列濃度之初級抗體之抗體稀釋緩衝液，且在4℃下搖動下儲存隔夜。在PBS中洗滌3次之後，接著將樣品轉移至具有二級抗體之抗體稀釋緩衝液(1:500稀釋)，且在室溫下搖動下培育4小時。接著用PBS + DAPI (Invitrogen D1306 1:10,000)洗滌樣品20分鐘，接著用PBS再洗滌兩次，隨後安放於具有Prolong Glass hardset封片劑(Life Tech P36984)之2吋×3吋載片上，且在室溫下乾燥隔夜。使用Zeiss Axio Scan.Z1數位幻燈片掃描器使全腦半球20倍成像。使用Zeiss Zen Blue 3.2軟體完成影像分析。繪製Thalamus ROI且滾球閾值化方法用於確定各神經膠質瘤病標誌物相對於總丘腦面積之面積。每個腦分析1-3個切片且跨影像計算平均百分比覆蓋值。 CNS細胞類型分離
為製備用於分選CNS細胞之單細胞懸浮液，根據製造商之方案使用成年腦解離套組(Miltenyi Biotec 130-107-677)將腦組織切開且處理成單細胞懸浮液。將細胞經Fc封閉(Biolegend編號101320，1:100)，且用Fixable Viability Stain BV510 (BD Biosciences編號564406，1:100)以排除死細胞、CD11b-BV421 (BD Biosciences 562605，1:100)、ACSA2-APC (Miltenyi編號130-117-386，1:100)及Thy1-PE (R&D編號FAB7335P，1:100)進行染色用於流式細胞量測分析。用PBS/1% BSA洗滌細胞且經100µm過濾器過濾，隨後在具有100 µm噴嘴之FACS Aria III (BD Biosciences)上分選CD11b+小神經膠質細胞、ACSA2+星形細胞及Thy1+神經元。將分選之細胞直接收集至添加有內部標準之MS級甲醇中用於脂質體學及代謝體學分析。使用與實例1中所述之彼等類似之方法進行細胞溶解產物製備及LCMS檢定用於量測GAG、BMP、神經節苷脂、GlcCer及GalCer。 結果
圖14及圖15提供關於所投與之融合蛋白於經處理之GRN KO小鼠群組之腦及肝組織中之濃度的資訊。如圖14及圖15中所說明，融合物1及11中之TfR結合促使蛋白質之腦吸收相對於非TfR結合Fc:PGRN蛋白質顯著增加。另外，相對於融合物1之單次腹膜內劑量，用融合物1每週處理直至八(8)週不減少蛋白質之腦吸收。另一方面，肝中Fc:PGRN之暴露大於融合物1及融合物11之暴露，此可能歸因於TfR介導之自周邊清除的缺乏。
圖16-19提供關於例示性BMP (二-22:6)於經處理之GRN KO小鼠群組之腦、CSF、肝及血漿中之水準的資訊。如圖16及圖17中所說明，相對於媒劑處理或Fc:PGRN處理，每週投與融合物1及融合物11直至八(8)週均改善CNS區室(腦、CSF)中之BMP水準的挽救。在周邊(肝、血漿)中，投與Fc:PGRN、融合物1及融合物11在等效作用下挽救BMP水準。
圖20及圖21提供關於經處理之GRN KO小鼠群組之腦及肝組織中之GlcSph水準的資訊。如圖20中所說明，相對於媒劑處理及Fc:PGRN處理，每週投與融合物1及11直至八(8)週以統計上顯著之方式挽救腦中之GlcSph水準。在周邊中(圖21)，每週投與Fc:PGRN、融合物1及融合物11在等效作用下挽救GlcSph水準。
圖22提供關於經處理之GRN KO小鼠群組中之CSF Nf-L水準的資訊。如圖22中所說明，在GRN KO小鼠中每週投與融合物1八(8)週之後觀測到CSF Nf-L減少之趨勢。相比之下，藉由每週用Fc:PGRN或融合物11處理似乎未校正CSF Nf-L。
圖23提供關於經處理之GRN KO小鼠群組之腦中之相對TREM2水準的資訊。如圖23中所說明，相對於媒劑處理，每週投與融合物1直至八(8)週以統計上顯著之方式降低腦組織中之TREM2水準。每週投與融合物11亦降低GRN KO小鼠之腦中之TREM2水準，但作用不如每週投與融合物1所觀測之作用一般高。
圖24-26提供關於經處理之GRN KO小鼠群組之腦(丘腦)中之神經膠質瘤病標誌物的資訊。如圖24-26中所說明，相對於媒劑處理，每週投與Fc:PGRN、融合物1及融合物11直至八(8)週降低GRN KO小鼠之腦中之CD68、Iba1及GFAP水準。
圖27為自經處理之GRN KO小鼠群組之腦組織分選之神經元、星形細胞及小神經膠質細胞中之BMP及某些脂質的熱圖。如圖27中所說明，每週投與融合物1直至八(8)週挽救小神經膠質細胞、星形細胞及神經元中之BMP表型。挽救在小神經膠質細胞中最為明顯，不過在較小程度上在星形細胞及神經元中亦觀測到校正。圖28-30說明在投與融合物1之後在經處理之GRN KO之神經元、星形細胞及小神經膠質細胞之分選群組(相對於媒劑處理之GRN野生型(hTfR.KI)群組之CNS細胞)中之某些BMP物質(BMP 18:1/18:1、BMP 22:6/22:6及BMP 20:4/20:4)的校正趨勢。
應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明性目的，且熟習此項技術者將提出根據該等實例及實施例之各種修改或變化且該等修改或變化將包括於本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文所列出之序列寄存編號之序列特此以引用之方式併入。非正式序列表
SEQ ID NO: 序列 描述
1 MWTLVSWVALTAGLVAGTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL 含有信號肽(胺基酸1-17)之顆粒蛋白前體(PGRN)多肽
2 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL 成熟PRGN
3 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1 X2 X3 ，其中X1 、X2 及X3 中之每一者獨立地為胺基酸，且X1 X2 X3 合在一起不為QLL PGRN變異體-1
4 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPHL PGRN變異體-2
5 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPKL PGRN變異體-3
6 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPDL PGRN變異體-4
7 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPEL PGRN變異體-5
8 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPSL PGRN變異體-6
9 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPTL PGRN變異體-7
10 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPNL PGRN變異體-8
11 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPQL PGRN變異體-9
12 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPGL PGRN變異體-10
13 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPPL PGRN變異體-11
14 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPAL PGRN變異體-12
15 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPYL PGRN變異體-13
16 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPVL PGRN變異體-14
17 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPIL PGRN變異體-15
18 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPFL PGRN變異體-16
19 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQRL PGRN變異體-17
20 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQHL PGRN變異體-18
21 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQKL PGRN變異體-19
22 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQDL PGRN變異體-20
23 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQEL PGRN變異體-21
24 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQNL PGRN變異體-22
25 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQPL PGRN變異體-23
26 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQYL PGRN變異體-24
27 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQQL PGRN變異體-25
28 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVVL PGRN變異體-26
29 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVTL PGRN變異體-27
30 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRRIL PGRN變異體-28
31 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRHIL PGRN變異體-29
32 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRKIL PGRN變異體-30
33 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALREIL PGRN變異體-31
34 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRRFL PGRN變異體-32
35 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRHFL PGRN變異體-33
36 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRKFL PGRN變異體-34
37 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRDFL PGRN變異體-35
38 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALREFL PGRN變異體-36
39 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRSFL PGRN變異體-37
40 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRTFL PGRN變異體-38
41 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRNFL PGRN變異體-39
42 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQFL PGRN變異體-40
43 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRLFL PGRN變異體-41
44 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRFFL PGRN變異體-42
45 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRYFL PGRN變異體-43
46 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRRQL PGRN變異體-44
47 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRHQL PGRN變異體-45
48 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRKQL PGRN變異體-46
49 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRDQL PGRN變異體-47
50 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALREQL PGRN變異體-48
51 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRNQL PGRN變異體-49
52 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRLQL PGRN變異體-50
53 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRFQL PGRN變異體-51
54 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRYQL PGRN變異體-52
55 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1 Y2 QLL，其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在 PGRN變異體-53
56 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLQLL PGRN變異體-54
57 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLLRQLL PGRN變異體-55
58 LRQLL   
59 QLLQLL   
60 QLLLRQLL   
61 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 野生型人類Fc序列 位置231-447 EU索引編號
62 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK CH2結構域序列 位置231-340 EU索引編號
63 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK CH3結構域序列 位置341-447 EU索引編號
64 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵突變之Fc序列
65 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵及LALA突變之Fc序列
66 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼突變之Fc序列
67 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼及LALA突變之Fc序列
68 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 純系CH3C.35.23.2
69 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵突變之純系CH3C.35.23.2
70 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.23.2
71 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼突變之純系CH3C.35.23.2
72 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼及LALA突變之純系CH3C.35.23.2
73 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-純系CH3C.35.23.2
74 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有杵突變之純系CH3C.35.23.2
75 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.23.2
76 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有臼突變之純系CH3C.35.23.2
77 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之純系CH3C.35.23.2
78 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 純系CH3C.35.21.17
79 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵突變之純系CH3C.35.21.17
80 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.21.17
81 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼突變之純系CH3C.35.21.17
82 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有臼及LALA突變之純系CH3C.35.21.17
83 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-純系CH3C.35.21.17
84 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有杵突變之純系CH3C.35.21.17
85 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.21.17
86 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有臼突變之純系CH3C.35.21.17
87 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之純系CH3C.35.21.17
88 EPKSCDKTHTCPPCP 人類IgG1鉸鏈胺基酸序列
89 DKTHTCPPCP 人類IgG1鉸鏈序列之部分(部分鉸鏈)
90 GGGGS 多肽連接子
91 GGGGSGGGGS 多肽連接子
92 GGSG 多肽連接子
93 SGGG 多肽連接子
94 KESGSVSSEQLAQFRSLD 多肽連接子
95 EGKSSGSGSESKST 多肽連接子
96 GSAGSAAGSGEF 多肽連接子
97 AEAAAKA 多肽連接子
98 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPIL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(PIL)
99 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPFL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(PFL)
100 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQQL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(QQL)
101 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVVL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(VVL)
102 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVTL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(VTL)
103 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPIL 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(PIL)
104 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPFL 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(PFL)
105 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQQL 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(QQL)
106 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVVL 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(VVL)
107 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVTL 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(VTL)
108 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN
109 MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAARRLYWDDLKRKLSEKLDSTDFTGTIKLLNENSYVPREAGSQKDENLALYVENQFREFKLSKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTPGFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIKGFVEPDHYVVVGAQRDAWGPGAAKSGVGTALLLKLAQMFSDMVLKDGFQPSRSIIFASWSAGDFGSVGATEWLEGYLSSLHLKAFTYINLDKAVLGTSNFKVSASPLLYTLIEKTMQNVKHPVTGQFLYQDSNWASKVEKLTLDNAAFPFLAYSGIPAVSFCFCEDTDYPYLGTTMDTYKELIERIPELNKVARAAAEVAGQFVIKLTHDVELNLDYERYNSQLLSFVRDLNQYRADIKEMGLSLQWLYSARGDFFRATSRLTTDFGNAEKTDRFVMKKLNDRVMRVEYHFLSPYVSPKESPFRHVFWGSGSHTLPALLENLKLRKQNNGAFNETLFRNQLALATWTIQGAANALSGDVWDIDNEF 人類轉鐵蛋白受體蛋白質1 (TFR1)
110 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc序列
111 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRNIL PGRN變異體-56
112 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRLLL PGRN變異體-57
113 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPLL PGRN變異體-58
114 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPRL PGRN變異體-59
115 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRYIL PGRN變異體-60
116 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVLL PGRN變異體-61
117 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRVIV PGRN變異體-62
118 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRFIL PGRN變異體-63
119 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRMLL PGRN變異體-64
120 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLG PGRN變異體-65
121 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLGK PGRN變異體-66
122 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之Fc序列
123 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPPL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(PPL)
124 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRPYL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(PYL)
125 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQRL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(QRL)
126 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSTRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQHL 部分鉸鏈-具有臼及LALA突變之Fc多肽-(G4 S)2 -PGRN(QHL)
127 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLY PGRN變異體-67
128 TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLP PGRN變異體-68
129 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.23.2，截短
130 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESYGTEWANYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.23.2，截短
131 APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.21.17，截短
132 DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVLWESYGTEWSSYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVTKEEWQQGFVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 部分鉸鏈-具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.21.17，截短
圖1A及圖1B示出展示如本文所揭示之例示性融合蛋白純化至高於98%純度的層析跡線。 圖2示出展示如本文所揭示之例示性融合蛋白於不同緩衝液中之熱特性的表格。 圖3包括說明如本文所揭示之例示性融合蛋白之凍融穩定性的層析圖。 圖4為說明本文所揭示之例示性融合蛋白之分揀蛋白結合的圖形。 圖5為說明如本文所揭示之例示性融合蛋白可降低活體外自GRN KO/hTfR.KI小鼠之骨髓獲得之經培養之細胞中之BMP水準的圖形。 圖6A-6C示出本文所揭示之例示性融合蛋白於GRN KO/hTfR.KI小鼠之血漿中(為期7天)以及腦及肝中(給藥後7天)之蛋白質濃度的代表圖。 圖7A及圖7B包括在投與本文所揭示之例示性融合蛋白之後在給藥後7天GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦及肝中之TREM2水準的代表圖。 圖8A及圖8B包括在投與本文所揭示之例示性融合蛋白之後在給藥後7天GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦及肝中之BMP水準的代表圖。 圖9為說明如本文所揭示之融合物1可降低GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦中之GlcSph水準的圖形。 圖10為說明如本文所揭示之融合物1可降低GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦中之GlcSph水準的圖形。 圖11為說明如本文所揭示之融合物1可校正GRN KO/hTfR.KI小鼠中之BMP 二-18:1水準的圖形。 圖12為說明如本文所揭示之融合物1可校正GRN KO/hTfR.KI小鼠中之BMP 二-22:6水準的圖形。 圖13為說明如本文所揭示之融合物1可在給藥後兩週將GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦中之葡萄糖腦苷脂酶(GCase)活性校正至野生型水準的圖形。 圖14為說明在八個週劑量之後本文所揭示之例示性融合蛋白於GRN KO/hTfR.KI小鼠中之腦蛋白質水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗(Dunnett multiple comparison test)之單因子ANOVA；**** p ＜ 0.0001。 圖15為說明在八個週劑量之後本文所揭示之例示性融合蛋白於GRN KO/hTfR.KI小鼠中之肝蛋白質水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗之單因子ANOVA；** p ＜ 0.01及**** p ＜ 0.0001。 圖16為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後代表性BMP物質於GRN KO/hTfR.KI小鼠之腦中之水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗之單因子ANOVA；** p ＜ 0.01及**** p ＜ 0.0001。 圖17為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後代表性BMP物質於GRN KO/hTfR.KI小鼠中之CSF水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗之單因子ANOVA；* p ＜ 0.05及**** p ＜ 0.0001。 圖18為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後代表性BMP物質於GRN KO/hTfR.KI小鼠之肝中之水準的散佈圖。 圖19為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後代表性BMP物質於GRN KO/hTfR.KI小鼠中之血漿水準的散佈圖。 圖20為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之腦葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗之單因子ANOVA；**** p ＜ 0.0001。 圖21為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之肝葡苷基神經鞘胺醇(GlcSph)水準的散佈圖。 圖22為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之CSF神經絲(Nf-L)水準的散佈圖。 圖23為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之相對腦Trem2水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗之單因子ANOVA；* p ＜ 0.05及**** p ＜ 0.0001。 圖24為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之相對腦CD68水準的散佈圖。該圖顯示平均值 ± SEM及p值：使用鄧奈特多重比較檢驗之單因子ANOVA；** p ＜ 0.01及*** p ＜ 0.001。 圖25為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之相對腦Iba1水準的散佈圖。 圖26為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之相對腦GFAP水準的散佈圖。 圖27為說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠中之BMP物質及脂質之相對變化的熱圖。 圖28-30提供說明在本文所揭示之例示性融合蛋白之八個週劑量之後GRN KO/hTfR.KI小鼠之神經元、星形細胞及小神經膠質細胞中之代表性BMP物質之水準的散佈圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (123)

  1. 一種顆粒蛋白前體變異體，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基574至576之位置處由X1 X2 X3 定義之序列，其中X1 、X2 及X3 各自獨立地為胺基酸且合在一起不為QLL。
  2. 如請求項1之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少95%一致性。
  3. 如請求項1或2之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少98%一致性。
  4. 如請求項1至3中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少99%一致性。
  5. 如請求項1之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少95%一致性之序列。
  6. 如請求項1或5之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少98%一致性之序列。
  7. 5及6中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少99%一致性之序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體具有序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1 X2 X3 (SEQ ID NO:3)。
  9. 如請求項1至8中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X1 為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。
  10. 如請求項1至9中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X2 為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。
  11. 如請求項1至10中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X3 為L、Y或P。
  12. 如請求項1至11中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X1 X2 X3 為X1 IL、X1 FL、X1 QL、PX2 L、QX2 L或VX2 L。
  13. 如請求項1至11中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X1 X2 X3 為X1 X2 L。
  14. 如請求項13之顆粒蛋白前體變異體，其中X2 為A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。
  15. 如請求項1至11中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X1 X2 X3 為PIL、PFL、QQL、VVL或VTL。
  16. 如請求項1至11中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中X1 X2 X3 為PPL、PYL、QQL、QHL或QRL。
  17. 一種顆粒蛋白前體變異體，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基576之位置的相鄰及C端處由Y1 Y2 QLL定義之序列(SEQ ID NO:137)，其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。
  18. 如請求項17之顆粒蛋白前體變異體，其中該顆粒蛋白前體變異體包含序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1 Y2 QLL (SEQ ID NO:55)， 其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。
  19. 如請求項17或18之顆粒蛋白前體變異體，其中Y1 為L。
  20. 如請求項17至19中任一項之顆粒蛋白前體變異體，其中Y2 為R。
  21. 如請求項17或18之顆粒蛋白前體變異體，其中Y1 及Y2 兩者均不存在。
  22. 一種包含顆粒蛋白前體變異體之多肽，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基574至576之位置處由X1 X2 X3 定義之序列，其中X1 、X2 及X3 各自獨立地為胺基酸且合在一起不為QLL。
  23. 如請求項22之多肽，其中該顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少95%一致性。
  24. 如請求項22或23之多肽，其中該顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少98%一致性。
  25. 如請求項22至24中任一項之多肽，其中該顆粒蛋白前體變異體與SEQ ID NO:2具有至少99%一致性。
  26. 如請求項22至25中任一項之多肽，其中該顆粒蛋白前體變異體具有序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRX1 X2 X3 (SEQ ID NO:3)。
  27. 如請求項22至26中任一項之多肽，其中X1 為R、H、K、D、E、S、T、N、Q、L、F、Y、P或V。
  28. 如請求項22至27中任一項之多肽，其中X2 為H、K、D、E、S、T、N、Q、G、P、A、Y、V、I、F、L或R。
  29. 如請求項22至28中任一項之多肽，其中X3 為L、Y或P。
  30. 如請求項22至29中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為X1 IL、X1 FL或X1 QL。
  31. 如請求項22至29中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為PX2 L、QX2 L或VX2 L。
  32. 如請求項22至29中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為X1 X2 L。
  33. 如請求項32之多肽，其中X2 為A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y或V。
  34. 如請求項22至30中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為PIL。
  35. 如請求項22至30中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為PFL。
  36. 如請求項22至30中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為QQL。
  37. 如請求項22至29及31中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為VVL。
  38. 如請求項22至29及31中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為VTL。
  39. 如請求項22至29及31中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為PPL。
  40. 如請求項22至29及31中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為PYL。
  41. 如請求項22至29及31中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為QRL。
  42. 如請求項22至29及31中任一項之多肽，其中X1 X2 X3 為QHL。
  43. 一種包含顆粒蛋白前體變異體之多肽，該顆粒蛋白前體變異體包含與SEQ ID NO:2具有至少90%一致性之序列及在對應於SEQ ID NO:2之殘基576之位置的相鄰及C端處由Y1 Y2 QLL定義之序列(SEQ ID NO:137)，其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。
  44. 如請求項43之多肽，其中該顆粒蛋白前體變異體包含序列： TRCPDGQFCPVACCLDPGGASYSCCRPLLDKWPTTLSRHLGGPCQVDAHCSAGHSCIFTVSGTSSCCPFPEAVACGDGHHCCPRGFHCSADGRSCFQRSGNNSVGAIQCPDSQFECPDFSTCCVMVDGSWGCCPMPQASCCEDRVHCCPHGAFCDLVHTRCITPTGTHPLAKKLPAQRTNRAVALSSSVMCPDARSRCPDGSTCCELPSGKYGCCPMPNATCCSDHLHCCPQDTVCDLIQSKCLSKENATTDLLTKLPAHTVGDVKCDMEVSCPDGYTCCRLQSGAWGCCPFTQAVCCEDHIHCCPAGFTCDTQKGTCEQGPHQVPWMEKAPAHLSLPDPQALKRDVPCDNVSSCPSSDTCCQLTSGEWGCCPIPEAVCCSDHQHCCPQGYTCVAEGQCQRGSEIVAGLEKMPARRASLSHPRDIGCDQHTSCPVGQTCCPSLGGSWACCQLPHAVCCEDRQHCCPAGYTCNVKARSCEKEVVSAQPATFLARSPHVGVKDVECGEGHFCHDNQTCCRDNRQGWACCPYRQGVCCADRRHCCPAGFRCAARGTKCLRREAPRWDAPLRDPALRQLLY1 Y2 QLL (SEQ ID NO:55)， 其中Y1 為L或不存在，且Y2 為R或不存在。
  45. 如請求項44之多肽，其中Y1 為L。
  46. 如請求項43至45中任一項之多肽，其中Y2 為R。
  47. 如請求項43或44之多肽，其中Y1 及Y2 兩者均不存在。
  48. 如請求項22至47中任一項之多肽，該多肽進一步包含連接至該顆粒蛋白前體變異體之Fc多肽。
  49. 如請求項48之多肽，其中該Fc多肽之N端或C端連接至該顆粒蛋白前體變異體。
  50. 如請求項48或49之多肽，其中該Fc多肽係由肽鍵或由多肽連接子連接至該顆粒蛋白前體變異體。
  51. 如請求項50之多肽，其中該多肽連接子之長度為1至50個胺基酸。
  52. 如請求項50或51之多肽，其中該多肽連接子為可撓性多肽連接子。
  53. 如請求項52之多肽，其中該可撓性多肽連接子為富甘胺酸連接子。
  54. 如請求項53之多肽，其中該富甘胺酸連接子為G4 S (SEQ ID NO:90)或(G4 S)2 (SEQ ID NO:91)。
  55. 如請求項48至54中任一項之多肽，其中該Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:64-67組成之群的序列。
  56. 如請求項48至54中任一項之多肽，其中該Fc多肽為特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾之Fc多肽。
  57. 如請求項56之多肽，其中該Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:68-87及129-132組成之群的序列。
  58. 如請求項57之多肽，其中該Fc多肽包含選自SEQ ID NO:70、75、80、85及129-132之序列。
  59. 一種融合蛋白，該融合蛋白包含： (a) 如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體； (b) 連接至(a)之該顆粒蛋白前體變異體之第一Fc多肽；及 (c) 與該第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。
  60. 如請求項59之融合蛋白，其中該第二Fc多肽連接至如請求項1至21中任一項之第二顆粒蛋白前體變異體。
  61. 如請求項59或60之融合蛋白，其中該第一Fc多肽係由肽鍵或由多肽連接子連接至該顆粒蛋白前體變異體，及/或該第二Fc多肽係由肽鍵或由多肽連接子連接至該顆粒蛋白前體變異體。
  62. 如請求項61之融合蛋白，其中該多肽連接子之長度為1至50個胺基酸。
  63. 如請求項61或62之融合蛋白，其中該多肽連接子為可撓性多肽連接子。
  64. 如請求項63之融合蛋白，其中該可撓性多肽連接子為富甘胺酸連接子。
  65. 如請求項64之融合蛋白，其中該富甘胺酸連接子為G4 S (SEQ ID NO:90)或(G4 S)2 (SEQ ID NO:91)。
  66. 如請求項59至65中任一項之融合蛋白，其中該第一Fc多肽之C端連接至該顆粒蛋白前體之N端，及/或該第二Fc多肽之C端連接至該顆粒蛋白前體變異體之N端。
  67. 如請求項59至66中任一項之融合蛋白，其中該第一Fc多肽或該第二Fc多肽特異性結合至轉鐵蛋白受體。
  68. 如請求項59至67中任一項之融合蛋白，其中該第一Fc多肽及該第二Fc多肽各自包含促進異二聚化之修飾。
  69. 如請求項68之融合蛋白，其中： (i) 根據EU編號，該第一Fc多肽包含T366W取代且該第二Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代；或 (ii) 根據EU編號，該第一Fc多肽包含T366S、L368A及Y407V取代且該第二Fc多肽包含T366W取代。
  70. 如請求項59至69中任一項之融合蛋白，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽獨立地包含減弱效應子功能之修飾。
  71. 如請求項70之融合蛋白，其中根據EU編號，該等減弱效應子功能之修飾為L234A及L235A取代。
  72. 如請求項59至71中任一項之融合蛋白，其中該第一Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:64-67組成之群的序列。
  73. 如請求項59至72中任一項之融合蛋白，其中該第二Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:68-87及129-132組成之群的序列。
  74. 如請求項73之融合蛋白，其中該第二Fc多肽包含選自由SEQ ID NO:70、75、80、85及129-132組成之群的序列。
  75. 如請求項59至74中任一項之融合蛋白，其中鉸鏈區或其一部分連接至該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽。
  76. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:98之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  77. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:98之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  78. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:99之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  79. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:99之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  80. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:100之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  81. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:100之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  82. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:101之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  83. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:101之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  84. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:102之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  85. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:102之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  86. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:123之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  87. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:123之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  88. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:124之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  89. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:124之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  90. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:125之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  91. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:125之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  92. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:126之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:75之序列。
  93. 如請求項59至75中任一項之融合蛋白，其中連接至該顆粒蛋白前體變異體之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO:126之序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO:130之序列。
  94. 如請求項59至93中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白係在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生。
  95. 如請求項94之融合蛋白，其中該融合蛋白實質上如實例1中所述來純化。
  96. 如請求項59至95中任一項之融合蛋白，其中該等融合蛋白之該等第一多肽中大於50%之該等顆粒蛋白前體變異體在C端處不截短。
  97. 如請求項59至96中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白對於分揀蛋白結合之KD 值小於約100 nM。
  98. 如請求項59至97中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50小於約25 nM。
  99. 如請求項98之融合蛋白，其中該EC50係藉由ELISA量測。
  100. 如請求項99之融合蛋白，其中該ELISA檢定實質上如實例4中所述來進行。
  101. 如請求項59至100中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於參考融合蛋白展現小於10倍之分揀蛋白結合降低，其中該參考融合蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:2之第一多肽及(ii)與該第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。
  102. 如請求項59至101中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白對於分揀蛋白結合之EC50相對於參考融合蛋白展現小於10倍之分揀蛋白結合降低，其中該參考融合蛋白包含(i)包含SEQ ID NO:108之第一多肽及(ii)與該第一Fc多肽形成Fc多肽二聚體之第二Fc多肽。
  103. 如請求項101或102之融合蛋白，其中該參考融合蛋白係在HEK細胞中產生。
  104. 如請求項103之融合蛋白，其中該參考融合蛋白實質上如實例1中所述來純化。
  105. 一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體、如請求項22至58中任一項之多肽或如請求項59至104中任一項之融合蛋白，及醫藥學上可接受之載劑。
  106. 一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含複數種如請求項59至104中任一項之融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
  107. 如請求項106之醫藥組合物，其中大於50%之該複數種融合蛋白在該融合蛋白之該顆粒蛋白前體變異體中包含完整C端。
  108. 一種治療患有神經退化性疾病、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症、年齡相關性黃斑變性(AMD)或顆粒蛋白前體相關病症之個體的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體、如請求項22至58中任一項之多肽、如請求項59至104中任一項之融合蛋白或如請求項105至107中任一項之醫藥組合物。
  109. 一種增加個體中之顆粒蛋白前體或其變異體之量的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體、如請求項22至58中任一項之多肽、如請求項59至104中任一項之融合蛋白或如請求項105至107中任一項之醫藥組合物。
  110. 一種降低個體中之組織蛋白酶D活性的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體、如請求項22至58中任一項之多肽、如請求項59至104中任一項之融合蛋白或如請求項105至107中任一項之醫藥組合物。
  111. 一種增加患有顆粒蛋白前體相關病症之個體中之溶酶體降解的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體、如請求項22至58中任一項之多肽、如請求項59至104中任一項之融合蛋白或如請求項105至107中任一項之醫藥組合物。
  112. 一種改善或挽救患有顆粒蛋白前體相關病症之個體中之溶酶體功能的方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體、如請求項22至58中任一項之多肽、如請求項59至104中任一項之融合蛋白或如請求項105至107中任一項之醫藥組合物。
  113. 如請求項109至112中任一項之方法，其中該個體患有神經退化性疾病、動脈粥樣硬化、與TDP-43相關之病症或AMD。
  114. 如請求項108至113中任一項之方法，其中該個體患有神經退化性疾病。
  115. 如請求項114之方法，其中該神經退化性疾病係選自由以下組成之群：額顳葉型失智(FTD)、神經元類蠟脂褐質症(NCL)、A型尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease type A，NPA)、B型尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease type B，NPB)、C型尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick disease type C，NPC)、C9ORF72相關肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)/FTD、散發性ALS、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，AD)、高歇氏病(Gaucher's disease)及帕金森氏病(Parkinson's disease)。
  116. 如請求項115之方法，其中該神經退化性疾病為FTD。
  117. 如請求項108至116中任一項之方法，其中該個體在編碼該顆粒蛋白前體之基因中具有突變。
  118. 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼如請求項1至21中任一項之顆粒蛋白前體變異體或如請求項22至58中任一項之多肽的核酸序列。
  119. 一種載體，該載體包含如請求項118之多核苷酸。
  120. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項118之多核苷酸或如請求項119之載體。
  121. 如請求項120之宿主細胞，該宿主細胞進一步包含如下多核苷酸，該多核苷酸包含編碼第二Fc多肽之核酸序列。
  122. 如請求項121之宿主細胞，其中該第二Fc多肽具有選自SEQ ID NO: 61及64-87中之任一者之序列。
  123. 一種用於產生多肽之方法，該方法包括在表現由如請求項118之多核苷酸編碼之該多肽的條件下培養宿主細胞。
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