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TW202134427A - 含有nk細胞之細胞集團之製造方法 - Google Patents

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TW202134427A
TW202134427A TW109110301A TW109110301A TW202134427A TW 202134427 A TW202134427 A TW 202134427A TW 109110301 A TW109110301 A TW 109110301A TW 109110301 A TW109110301 A TW 109110301A TW 202134427 A TW202134427 A TW 202134427A
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米満吉和
原田結
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日商蓋亞生物製藥有限公司
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Abstract

本發明之課題在於提供一種對製造用於細胞療法之NK細胞之集團有效之方法。改善NK細胞於體外之擴增效率。使NK細胞之授權所需要之訊號靈活增加。 本發明係一種含有NK細胞之細胞集團之製造方法，該製造方法包含：準備來自複數個供體且含有NK細胞之單核細胞之集團，於對NK細胞處理增生有效之條件下對所準備之單核細胞之集團進行培育培養，使NK細胞增生。

Description

含有NK細胞之細胞集團之製造方法
本發明係關於一種包含自然殺手細胞(NK細胞)之細胞集團之製造方法及其用途。
惡性腫瘤係國民死亡之首要原因，迫切需要其對策。尤其是於包含外科手術、放射線治療及化學療法之既有之治療方法中，對於抵抗性之進展期難治性惡性腫瘤之新的治療方法之開發極其重要且有意義。近年來，作為第4治療方法，使用了免疫檢查點抑制劑或嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)基因修飾T細胞之療法(CAR-T療法)等免疫療法備受關注。然而，由於多數情況下將藉由識別抗原而得以活性化之T細胞作為效應物，故有對特異抗原具有約束性這一根源性的障礙。
作為使用作為自然免疫之主要因子發揮作用之NK細胞之免疫療法，使NK細胞於體外增生後投予至患者之NK細胞療法作為副作用相對較少之治療方法而受到關注。然而，NK細胞自末梢血液等獲得之數量相對較少，並且於體外之增生性較低。因此，一直研究用於培養NK細胞並使其增生之技術。例如專利文獻1揭示一種NK細胞之擴增方法及含有包含藉由擴增而獲得之NK細胞之細胞集團的用於細胞療法之醫藥組合物，該NK細胞之擴增方法之特徵在於包含：製備含有NK細胞之細胞集團之步驟、自上述含有NK細胞之細胞集團去除T細胞之步驟、及於僅包含IL-2作為細胞激素之培養基中於不使用飼養細胞之條件下培養所去除之剩餘之細胞之步驟。又，專利文獻2揭示一種NK細胞之製備方法及含有包含所製備之NK細胞之細胞集團的用於細胞療法之醫藥組合物，該NK細胞之製備方法包含：於包含IL-15、SCF、IL-7及Flt3L之單一之培養條件下使造血前驅細胞擴增之步驟，於包含IL-2之培養條件下使上述擴增之步驟中獲得之細胞於5、6、7、8或9天內分化誘導為NK細胞之步驟。
又，作為使腫瘤細胞毒殺活性提高之培養細胞，本發明人等報告了為CD16陽性、CD56高表現性、且CD57陰性，且為NKG2C陽性、NKG2A陰性-低表現性及CD94陽性之NK細胞以及包含該NK細胞之細胞集團(專利文獻3)，且報告了表現趨化因子受體及細胞接著分子之CD3陰性細胞(專利文獻4)。
另一方面，NK細胞之細胞表面上表現識別HLA I類之受體群。該等受體中，KIR(Killer cell Immunoglobulin-like Receptor，殺手細胞免疫球蛋白樣受體)家族與HLA同樣地具有多樣性。於造血幹細胞移植中，並未儘可能地使HLA匹配，於最近，以使受體不具備對供體NK細胞之KIR的配體之方式選擇供體等，就復發、GVHD(graft versus host disease、移植物抗宿主病)及預後之觀點而言，供體與受體之間的故意之KIR/HLA失配可帶來更理想之結果，因此目前正在有效地利用該方法。然而，關於NK細胞之抗腫瘤活性，據如下報告(非專利文獻1)暗示，於以抗腫瘤效果為指標而要求NK細胞之高活性化之情形時，來自KIR之訊號越少越好；該報告(非專利文獻1)將NK細胞和與抑制性KIR配體一致或失配(缺少存在於NK細胞供體中之1個以上配體)之任一飼養細胞共同培養，調查HLA I類與KIR之相互作用對同種異系環境中之人類NK細胞增生有何種程度之影響。近年來之關於HLA異質NK細胞(於單向適配之情形)對來自HLA單體型同型接合型(HLA同型)iPS細胞之組織之同種應答性之報告(非專利文獻2)關於NK細胞之培養，強烈暗示包含HLA/KIR失配之混合培養不成立。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2013-27385號公報(日本專利第5572863號、日本專利第5989016號) [專利文獻2]日本專利特開2014-226079號公報(日本專利第5511039號、日本專利第6164650號) [專利文獻3]日本專利特開2018-193303號公報 [專利文獻4]日本專利特願2018-059624號申請說明書(本案申請時尚未公開) [非專利文獻]
[非專利文獻1]Mingus J. J. Rose et al., Killer Ig-Like Receptor Ligand Mismatch Directs NK Cell Expansion In Vitro, The Journal of Immunology, 2009, 183: 4502-4508. [非專利文獻2]Hiroshi Ichise et al., NK Cell Alloreactivity against KIR-Ligand-Mismatched HLA-Haploidentical Tissue Derived from HLA Haplotype-Homozygous iPSCs, Stem Cell Reports, 2017, 9: 853-867,
[發明所欲解決之問題]
本發明人等正在推進包含活性高之NK細胞之細胞集團之開發。然而，作為原料之末梢血液或利用血球分離法所獲得之血液之量是有限的，因此無法將治療用之NK細胞集團成品(off-the-shelf)化而隨時用於將來之治療。
另一方面，據本發明人等之研究，根據供體，而有NK細胞於體外之擴增效率極差之情形。
進而，雖然認為只要於體內，於自骨髓中之造血幹細胞分化之過程中，經歷過與配體(HLA I類)結合之未成熟NK細胞被「授權」，於成熟後具備檢測自體HLA I類之表現降低之細胞的「喪失自我(missing-self)應答」之能力，但自iPS細胞或ES細胞分化成熟之NK細胞可能沒有充分的授權所需要之訊號以獲得抗腫瘤效果。 [解決問題之技術手段]
本發明提供以下者。 [1]一種含有NK細胞之細胞集團之製造方法，該製造方法包含： 準備來自複數個供體且含有NK細胞之單核細胞之集團， 於對NK細胞處理有效之條件下對所準備之單核細胞之集團進行培育。 [2]如1中記載之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含去除CD3陽性細胞之步驟。 [3]如1或2中記載之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含去除CD34陽性細胞之步驟。 [4]如1至3中任一項中記載之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含由自複數個供體採取之末梢血液獲得單核細胞之集團之步驟。 [5]如1至4中任一項中記載之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含由自複數個供體採取之血球分離血液獲得單核細胞之集團之步驟。 [6]如1至3中任一項中記載之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟為準備來自複數個供體的來自選自由胚胎幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞及成體幹細胞所組成之群中之任一者的單核細胞之集團。 [7]如1至6中任一項中記載之製造方法，其中複數個供體包含一供體及與其相比於HLA及KIR之至少一者中基因類型不同之其他供體。 [8]一種含有NK細胞之細胞集團，其具備以下特徵： (1)來自複數個供體。 (2)於將NK細胞設為效應細胞(E)，將K562細胞設為標的細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1共同培養之情形時，細胞毒殺活性為50%以上。 [9]一種用於細胞療法之醫藥組合物，其包含藉由如1至7中任一項中記載之製造方法而製造之細胞集團。 [10]一種用於細胞療法之醫藥組合物，其包含如8中記載之細胞集團。 [11]如9或10中記載之醫藥組合物，其用於治療傳染病及/或癌。 [發明之效果]
可將複數人份之成為原料之血液或PBMC加以混合，因此可使原材料量增加，可期待成品(off-the shelf)化。
可不受供體影響而穩定地使NK細胞增生，且可提高增生率。
可與HLA-KIR匹配之多樣化對應，可期待穩定之活性化。
可使NK細胞之授權所需要之訊號靈活地增加，可期待來自iPS細胞或ES細胞之NK細胞集團之抗腫瘤效果之改善。
本發明關於一種含有NK細胞之細胞集團。
[細胞集團之製造]  本發明之含有NK細胞之細胞集團可利用包含以下步驟之方法而製造： 準備來自複數個供體且含有NK細胞之單核細胞之集團， 於對NK細胞處理有效之條件下對所準備之單核細胞之集團進行培育。
(來自複數個供體之單核細胞之集團之準備)  本發明之細胞集團由來自複數個供體之單核細胞之集團而獲得。此處所謂單核細胞之集團包含NK細胞，亦可包含除NK細胞以外之單核細胞、例如單核球。NK細胞可為初代NK細胞(自生物體採取且未被繼代之NK細胞)。
有來自複數個供體且含有NK細胞之單核細胞之集團為自一供體獲得之單核細胞(包含NK細胞，亦可包含單核球)之集團與自其他供體獲得之單核細胞(包含NK細胞，亦可包含單核球)之集團混合而成者之情形，且有該集團為自一供體獲得之NK細胞與自其他供體獲得之單核球混合而成者之情形。
關於供體，所謂複數個係指2個以上，只要滿足上述條件則並無特別限制，例如可使用將來自3個以上、4個以上、7個以上、9個以上供體之單核細胞混合而成者。有於複數個供體中包含被投予含有NK細胞之細胞集團之患者本身、該患者之血緣相近者之情形。
複數個供體可以如下方式選擇：包含一供體及與其相比於HLA及KIR之至少一者中基因類型不同之其他供體。KIR包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL4、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KIR3DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B。
關於NK細胞，所謂授權(Licensing)係指於細胞分化成熟之過程中獲得NK細胞所特有之「喪失自我(missing-self)應答(自體HLA缺失之檢測)」之能力之過程。關於人類或小鼠，認為於自骨髓中之造血幹細胞分化NK細胞之過程中，僅經歷了KIR或NKG2A與HLA I類分子之結合的未成熟NK細胞被授權，於成熟後獲得檢測自體HLA I類之表現降低之細胞之能力。已知與授權相關之KIR之例為KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1及NKG2A/CD94。NK細胞可識別之HLA類型為典型性HLA中的HLA-C同種異型之全部、HLA-B同種異型之約1/3、HLA-A同種異型之一部分(具有Bw4模體者)、非典型性HLA之HLA-E、HLA-G。於本發明中，於以包含一供體及與其相比於HLA及KIR之至少一者中基因類型不同之其他供體之方式選擇複數個供體時，尤其可考慮如上所述之與授權相關之KIR及HLA。
於本發明之較佳之一態樣中，為了使供於NK細胞之授權之分子譜系增加，可選擇基因類型不同之供體。又，可以不刺激NK細胞之抑制性KIR、或刺激抑制性KIR之方式進行選擇。
關於供體之選擇，於期待NK細胞之抗體依存性細胞毒殺(Antibody dependent cellular cytotoxicity、ADCC)活性之情形時，以於培養混合之單核細胞之集團時，CD16high 之NK細胞增加之方式進行即可。作為NK細胞之細胞毒殺之機制之一，已知有ADCC，但NK細胞經由其細胞表面上之Fc受體CD16而結合至與標的細胞結合之抗體，進行標的細胞之毒殺。因此，藉由使CD16high 之NK細胞增加，可期待ADCC活性進一步變高。此種供體之組合條件之例為於NK細胞中以利用來自KIR3DL1及KIR3DS1之一者或兩者之訊號進行授權之方式選擇供體並加以混合。
混合於將NK細胞投予至對象之前進行。只要可獲得目標之混合效果，則可於任一階段進行混合。例如可將自複數個供體採取之血液加以混合，其次自進行了混合者獲得單核細胞之集團，又，亦可於由自各供體採取之血液分別獲得單核細胞之集團之後，將各集團進行混合。又，可於對自複數個供體採取之單核細胞之集團分別進行培養之後，將各集團加以混合。就增生變良好之觀點而言，較佳為於培養前進行混合。
來自複數個供體之單核細胞之集團之混合比率可適當設定。例如可設為以大致相等之比率包含來自複數個供體之細胞，且可設為較多或較少地包含來自特定供體之細胞。於將來自一供體之NK細胞與來自其他供體之單核球混合之情形時，混合比率亦可適當設定。例如可使NK細胞與其之1-9倍之單核球加以混合(NK細胞：單核球＝1：1-9)，又，可將NK細胞與其之2-4倍之單核球加以混合(NK細胞：單核球＝1：2-4)。關於本發明，於表示細胞之混合比率時，除特別記載之情形以外，均基於細胞之個數。
作為獲得單核細胞之集團之原料，可使用末梢血液、臍帶血、自骨髓及/或淋巴結採取之血液細胞。較佳之原料之一為末梢血液，末梢血液可藉由血球分離法而採取。即，於本發明之較佳之態樣中，準備單核細胞之集團之步驟包含由自複數個供體採取之末梢血液獲得單核細胞之集團之步驟。又，於另一較佳之態樣中，準備單核細胞之集團之步驟包含由自複數個供體採取之血球分離血液獲得單核細胞之集團之步驟。
包含NK細胞及單核球之單核細胞之集團可使用業者所知之各種順序進行製備。例如藉由於室溫條件下進行密度離心分離，可自如末梢血液及臍帶血這樣的血液去除紅血球並回收單核球細胞組分。自末梢血液分離之單核細胞PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cells)包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球及樹狀細胞等各種各樣之淋巴細胞。關於本發明，可將為CD3陰性且為CD56陽性之單核細胞稱為NK細胞。NK細胞可使用業者所知之各種順序進行製備。例如已知有自全血或PBMC去除無用之細胞以分離NK細胞之方法。單核球可使用業者所知之各種順序進行製備。例如已知有自全血或PBMC去除無用之細胞而分離單核球之方法。
(CD3陽性細胞之去除、CD34陽性細胞之去除)  單核細胞之集團有除單核球、NK細胞以外亦包含NK細胞前驅物、T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞等之情形。有於擴增後使用例如比重離心法、免疫磁珠、FACS、流式細胞儀等而選擇所需之NK細胞之情形。NK細胞有使用例如抗CD3抗體、抗CD16抗體、抗CD34抗體、抗CD56抗體、抗CD69抗體、抗CD94抗體、抗CD107a抗體、抗KIR3DL1抗體、抗KIR3DL2抗體、抗KIR2DL3抗體、抗KIR2DL1抗體、抗KIR2DS1抗體、抗KIR2DL5抗體、抗NKp46抗體、抗NKp30抗體、抗NKG2D抗體等，自細胞集團選擇性地分離之情形。抗體有單株抗體、多株抗體等情形。有選擇性地去除T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞及其他細胞而進行NK細胞之選擇之情形。
準備單核細胞之集團之步驟可包含去除T細胞之步驟，該步驟有藉由去除CD3陽性細胞而達成之情形。又，準備單核細胞之集團之步驟可包含去除造血前驅細胞之步驟，該步驟有藉由去除CD34陽性細胞而達成之情形。即，準備單核細胞之集團之步驟可包含去除CD3陽性細胞之驟，亦可包含去除CD34陽性細胞之步驟。
CD3陽性細胞之去除、CD34陽性細胞之去除例如可藉由使用由Invitrogen公司銷售之Dynal Biotech公司製造之Dynabeads或Miltenyi Biotec公司之CliniMACS等免疫磁珠，將表現細胞表面抗原CD3及/或CD34之細胞分離去除而實施。此種步驟較佳為以不使NK細胞疲弱之方式，且不使單核球發揮多餘之巨噬功能之方式進行。具體而言，可列舉如下者作為較佳之操作：使用相對小型之磁珠(可藉由離心操作而將未與細胞結合之未反應之珠粒與上清液一同去除)、將珠粒與細胞集團於低溫下之培育時間設定為相對較短、去除未反應之珠粒之後使用管柱獲得未與珠粒結合之細胞作為目標細胞集團等。細胞之去除可使用自動閉鎖系統細胞處理裝置而進行。
(iPS細胞等之利用)  單核細胞之集團可為由來自選自由胚胎幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞及成體幹細胞所組成之群中之任一者的造血幹細胞製備而成者。自該等幹細胞誘導含有NK細胞之單核細胞之細胞之方法為已知，熟知本技藝者可將其應用於本發明中(Domogala A. et al., Natural killer cell immunotherapy: from bench to bedside, Frontiers in Immunology, 2015;6, doi:10.3389/fimmu. 2015.00264及Zeng J. et al., Generation of "Off-the-Shelf" Natural Killer Cells from Peripheral Blood Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells, Stem Cell Reports, 2017;9:1796-1812)。又，幹細胞可進行修飾以獲得高活性之NK細胞，例如已知有高親和性CD16(158V：158號胺基酸為纈胺酸)，可應用此種見解。
(單核細胞之集團之培養)  所準備之單核細胞之集團於混合有來自複數個供體之細胞之狀態下，於對NK細胞處理有效之條件下進行培育。培育(Incubate)有並不伴隨細胞增生之情形及伴隨有細胞增生之情形。於本發明之較佳之態樣之一中，培育(Incubate)伴隨有增生。伴隨有增生之培育(Incubate)亦可稱為培養(Culture)或增生(Proliferate)。
所謂對NK細胞處理有效之條件係指適合來自複數個供體之經混合細胞發揮目標之混合效果之條件。只要發揮目標效果，則用以使細胞懸浮之培養基或等張液、時間、溫度、環境等並無特別限制。
對NK細胞處理有效之條件包含對NK細胞之活性化有效之條件。此種條件例如包含於適當濃度之活性化所需要之因子、例如IL-2及IL-15之存在下，於37℃、5% CO2 及飽和水蒸氣氛圍下，培育4-18小時。
對NK細胞處理有效之條件包含對NK細胞之增生有效之條件。對NK細胞增生有效之條件包括使用適合NK細胞之增生之培養基。此種培養基之例子包括：KBM 501培養基(KOHJIN BIO股份有限公司)、CellGro SCGM培養基(CellGenix、岩井化學藥品股份有限公司)、X-VIVO15培養基(Lonza、TAKARA BIO股份有限公司)、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640等，但並不限定於該等。
有以可達成本發明之目的之濃度向培養基中添加介白素2(IL-2)之情形。IL-2之濃度有超過2000 IU/mL之情形，有2500-2813 IU/mL之情形。IL-2較佳為具有人類之胺基酸序列，就安全方面而言，較佳為利用重組DNA技術而生產。IL-2之濃度有以日本國內標準單位(JRU)及國際單位(IU)表示之情形。1 IU約為0.622 JRU，故1750 JRU/mL約為2813 IU/mL。
有向培養基中添加受驗者之自體血清、可自BioWhittaker公司或其他公司獲得之人類AB型血清或可自日本紅十字組織獲得之獻血人類血清蛋白之情形。自體血清及人類AB型血清較佳為以1-10%之濃度添加，獻血人類血清蛋白較佳為以1-10%之濃度添加。受驗者有健康者及罹患疾病之患者之情形。又，有代替血清或與血清一同向培養基中添加為了使免疫細胞增生而調配之組合物之情形。此種組合物有所市售。例如亦可將UltraGro系列(AventaCell公司)、CTS Immune Cell SR(Thermo Fisher Scientific公司)用於本發明中。
只要不損及NK細胞之擴增效果，則有於培養基中包含適當之蛋白質、細胞激素、抗體、化合物及其他成分之情形。細胞激素有介白素3(IL-3)、介白素7(IL-7)、介白素12(IL-12)、介白素15(IL-15)、介白素21(IL-21)、幹細胞因子(SCF)及/或類FMS酪胺酸激酶3配體(Flt3L)之情形。IL-3、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、SCF及Flt3L較佳為具有人類之胺基酸序列，就安全方面而言，較佳為利用重組DNA技術而生產。
只要獲得所需之NK細胞之細胞數，則培養基之更換於培養開始後於任何時間進行均可，但較佳為每3-5天更換一次。
培養容器包含商業方面可獲得之碟、燒瓶、平皿、孔板，但並不限定於該等。為了獲得治療用之含有NK細胞之細胞集團，較佳為使用可培養較多細胞，且操作容易之培養容器。作為此種培養容器之例子，可列舉由具有高透氣性之原材料形成的細胞培養用袋。
於使用袋之情形時，較佳為於培養期間使上下翻轉而使用。於培養時，可看到NK細胞、單核球均與培養面接著。於接著系之細胞之情形時，每單位面積之細胞密度與每單位容積之細胞密度一同對包括細胞之生存率及增生速度之培養效率有著較大之影響。藉由於培養期間中使袋翻轉，可使一部分NK細胞及單核球移動至迄今為止為上側而細胞之接著相對較少之面，故可更有效率地進行培養。
至於培養條件，只要不損及NK細胞之擴增效果，則並無特別限制，但一般而言為37℃、5% CO2 及飽和水蒸氣氛圍下之培養條件。本發明之目的之一是大量製備NK細胞，故於培養基中培養之時間越長，則獲得之NK細胞越多，因此有利。於培養期間，只要使NK細胞擴增至所需之細胞數，則並無特別限制。例如可進行7-28天，亦可設為10-18天，亦可設為12-16天、例如14天(Saito S. et al., Ex vivo generation of highly purified and activated natural killer cells from human peripheral blood. Hum Gene Ther Methods. 2013;24(4):241-252、及上述專利文獻1)。
培養可並不於準備單核細胞之集團之後立刻實施。有將所準備之包含單核細胞之細胞集團冷凍保存，根據向患者投予之時間而解凍，然後供至NK細胞培養之情形。再者，單核細胞之集團可根據本發明之NK細胞之擴增方法，於擴增之途中或擴增結束後進行冷凍，根據向患者移植之時間而解凍，供於向患者移植。冷凍及解凍可使用業者所周知之任意方法。於細胞之冷凍中，有使用任意市售之細胞冷凍保存液之情形。
藉由培養而獲得之特定之NK細胞之集團有除目標NK細胞以外亦包含NK細胞前驅物、T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞等之情形。有培養後使用例如比重離心法、免疫磁珠、FACS、流式細胞儀等而選擇目標NK細胞或其集團之情形。例如有使用抗CD3抗體、抗CD16抗體、抗CD34抗體、抗CD56抗體、抗CD69抗體、抗CD94抗體、抗CD107a抗體、抗KIR3DL1抗體、抗KIR3DL2抗體、抗KIR2DL3抗體、抗KIR2DL1抗體、抗KIR2DS1抗體、抗KIR2DL5抗體、抗NKp46抗體、抗NKp30抗體、抗NKG2D抗體等而選擇性地分離目標NK細胞或其集團之情形。抗體有單株抗體、多株抗體等情形。有選擇性地去除T細胞、NKT細胞、造血前驅細胞及其他細胞而進行目標NK細胞或其集團之選擇之情形。
(混合培養之效果)  據本發明人等之研究，藉由對來自複數個供體且含有NK細胞之單核細胞之集團進行培養，NK細胞之增生變良好。認為其原因在於：由於HLA/KIR之組合之變化增加，故更多之授權訊號互相進入。所謂增生良好係指與對來自混合培養之複數個供體中之一個單獨供體之細胞進行培養之情形相比而言，細胞之增生率(培養後之細胞數/培養前之細胞數)提高。
又，於藉由混合培養而獲得之細胞集團中，NK細胞可為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上。
又，據本發明人等之研究，與來自單獨供體之NK細胞相比而言，藉由包含來自複數個供體之NK細胞的單核細胞之集團之混合培養而獲得之NK細胞之細胞毒殺活性可為同等以上。進而，與來自單獨供體之NK細胞相比而言，包含CD16高表現性之NK細胞之比率亦為同等以上。所謂細胞毒殺活性，除特別記載之情形外，均指對象細胞(效應細胞、E)對標的細胞(T)之溶解能力。細胞毒殺活性可以由效應細胞導致死亡之標的細胞之百分率(%)表示，例如藉由以下式子而求出。
(與效應細胞共同培養之情形時之細胞死亡－自然細胞死亡(陰性對照))/(最大細胞死亡(陽性對照)－自然細胞死亡(陰性對照))×100
於測定細胞毒殺活性時，一般情況下可根據效應細胞之細胞毒殺活性之程度等，根據使用之細胞之種類或活性之強度而適當設定效應細胞與標的細胞之混合比(E：T)、效應細胞與標的細胞之共同培養之時間。於將NK細胞作為效應細胞時，標的細胞有K562細胞、SKOV3細胞(人卵巢癌細胞株)、急性骨髓性白血病細胞、慢性骨髓性白血病細胞之情形，但並不限定於該等。效應細胞與標的細胞、活細胞與死細胞可藉由利用放射性物質、螢光色素等標記之抗體等試劑而進行區分，及定量。
又，本發明之來自複數個供體之本發明之NK細胞之集團不受MDSC(Myeloid-derived suppressor cells，源自骨髓之抑制細胞)之抑制，或該抑制顯著較低。本發明人等根據之研究可確認：利用如上所述之培養方法所獲得之來自單獨供體之NK細胞之集團不受利用MDSC之抑制。作為原因之一，可列舉對體液因子(TGF-β、IL-10)之受體沒有表現或表現顯著較低。又，據本發明人等之此番研究可知，於將來自複數個供體之細胞加以混合之情形時，亦不損及上述優點。
[含有NK細胞之細胞集團]  藉由本發明而獲得之含有NK細胞之細胞集團具備以下特徵： (1)來自複數個供體。 (2)於將NK細胞設為效應細胞(E)，將K562細胞設為標的細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1共同培養之情形時，細胞毒殺活性為50%以上。 可代替上述(2)之特徵或與(2)之特徵一同具備下述特徵： (2')於將SKOV3細胞設為標的細胞(T)，並以混合比(E：T)3：1共同培養之情形時，細胞毒殺活性為50%以上。
此種細胞集團可進而具備下述特徵。 (3)NK細胞之比率為70%以上，進一步特定為80%以上，更進一步特定為90%以上。 (4)可包含CD16高表現性之NK細胞之集團及CD16低表現性之NK細胞之集團兩者。CD16高表現性之NK細胞之比率為50%以上。
NK細胞之細胞毒殺活性可藉由業者所周知之方法進行測定而算出。細胞毒殺活性(%)通常基於效應細胞(E)作用後之標的細胞(T)之活細胞數，例如可藉由式：(1－活細胞數/陰性對照活細胞數)×100而算出。 於將NK細胞設為效應細胞(E)，將K562細胞設為標的細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1共同培養之情形時，細胞毒殺活性較佳為60%以上，更佳為70%以上，進而較佳為80%以上，進而較佳為90%以上，進而較佳為95%以上。 於將NK細胞設為效應細胞(E)，將SKOV3細胞設為標的細胞(T)，並以混合比(E：T)3：1共同培養之情形時，細胞毒殺活性較佳為60%以上，更佳為70%以上，進而較佳為80%以上，進而較佳為90%以上，進而較佳為95%以上。
關於CD16等標記，有以＋表示陽性，以-表示陰性之情況。例如有CD16陽性表示為CD16＋ ，CD16陰性表示為CD16- 之情況。陽性包含高表現性之情形及低表現性之情形。高表現性有表示為high、bright之情況。例如，CD16高表現性有表示為CD16high 、CD16bright 之情況。低表現性有表示為low、dim之情況。例如，CD16低表現性有表示為CD16low 、CD16dim 之情況。
陽性、陰性、高表現性、低表現性可基於藉由流式細胞儀法而獲得之圖進行判斷。圖中所出現之位置有根據設備之電壓設定、感度設定、使用抗體克隆、染色條件、使用色素等而變動之情況，但業者可以於獲得之圖中不分割被識別為一組之細胞集團之方式適當地畫線。
關於目標標記之表現為陽性或陰性之判斷，可使用使用了同型對照(Isotype control)抗體之情形作為陰性對照而進行判斷。同型對照抗體係不與特定抗原反應之抗體。一般而言，於使用抗體之實驗中，有由於與除標的以外之蛋白質之非特異性結合或與細胞表面上之Fc受體之結合而產生基底之可能性。藉由與使用成為陰性對照之抗體之系統比較，可明確一次抗體對目標抗原之反應為特異性的。又，將基底之影響排除，可正確地解釋訊號之強度。
目標標記之表現之程度(低表現性或高表現性)可藉由與相同條件下測定之對照細胞之結果進行比較而判斷。對照細胞之例子為本案說明書之實施例之項中所記載之初生NK細胞等自末梢血液獲得之未進行實質性培養之NK細胞。
例如，關於某NK細胞之集團中之CD16之表現之程度，可使用流式細胞儀將該細胞集團中之CD16表現量與自末梢血液獲得之未進行實質性培養之NK細胞之集團(對照)中之CD16表現量進行比較，於發現表現與對照同等之情形時，判斷為高表現性，於表現較對照細胞低之情形時，判斷為低表現性。再者，已知對照之NK細胞為CD16高表現性。
[醫藥用途]  又，本發明提供一種將上述含有NK細胞之細胞集團作為有效成分之用於細胞療法之藥品組合物。所謂細胞療法係指藉由將於體外處理之細胞投予至對象，而治療對象之疾病或狀態之方法，該方法包含免疫細胞療法。
醫藥組合物除有效成分之細胞集團以外亦包含可使NK細胞懸浮之溶液，例如：生理鹽水、磷酸緩衝生理鹽水(PBS)等。又，醫藥組合物或溶液可包含藥學上所容許之添加劑。醫藥組合物例如可投予至靜脈、動脈、皮下、腹腔內等。利用醫藥組合物之細胞療法可單獨實施，或與外科療法、化學療法、輻射療法等加以組合而實施。
可期待含有NK細胞之細胞集團於癌治療或傳染病治療中之應用(Dahlberg C. M. et al., Natural Killer Cell-Based Therapies Targeting Cancer: Possible Strategies to Gain and Sustain Anti-Tumor Activity, Front. Immunol., 2015;30:https://doi.0rg/10.3389/fimmu.2015.00605及Schmidt S. et al, Natural killer cells as a therapeutic tool for infectious diseases-current status and future perspectives, Oncotarget, 2018;9(29):20891-20907)，本發明之醫藥組合物可用於治療此種癌或傳染病。更具體而言，包括：口腔癌、膽嚢癌、膽管癌、肺癌、肝癌、大腸癌、腎癌、膀胱癌、白血病；由病毒、細菌等導致之傳染病，但並不限定於該等。於使用本發明之醫藥組合物之細胞療法中，有將NK細胞投予至例如靜脈、動脈、皮下、腹腔內等之情形。細胞療法有單獨實施或與外科療法、化學療法、輻射療法、抗體藥品等加以組合而實施之情形。
認為抗體藥品大多於靜脈內投預後表現出ADCC活性之抗腫瘤效果。另一方面，於發揮ADCC活性時，除NK細胞以外，單核球/巨噬細胞或嗜中性球亦被調動。並且除NK細胞以外之效應物不區分正常細胞與癌細胞地顯示ADCC活性，認為該情況與副作用之表現相關。於本發明中，可將NK細胞與抗體於投予前加以混合，使NK細胞預先配備抗體。認為藉此將效應物限定於NK細胞中，可減少投予之抗體之量，且對副作用之降低亦極其有效。即，本發明之醫藥組合物可於將NK細胞集團與抗體加以混合之後，經過去除未與NK細胞結合之抗體之步驟而製備。即，本發明之醫藥組合物之較佳態樣之一為雖然包含NK細胞及抗體，但抗體與NK細胞結合，且實質上不含未與NK細胞結合之抗體。(參照上述專利文獻3)。
本發明之醫藥組合物之製造較佳為於符合藥品及準藥品之製造管理及品質管理規則之條件(good manufacturing practice、GMP)及再生醫療等製品之製造管理及品質管理之標準(Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice、GCTP)下實施。
以下所說明之本發明之實施例僅用於例示，並不限定本發明之技術範圍。本發明之技術範圍僅受專利申請範圍之記載限定。可於不脫離本發明之主旨之條件下對本發明進行變更，例如添加、刪除及替換本發明之構成要素。 [實施例]  [實施例1：自新鮮末梢血液獲得之NK細胞之混合培養1]  自健康志願者實施採血，藉由使用聚蔗糖(GE HEALTHCARE、17144002)之密度梯度離心而單離末梢血液單核球。以大致相同之比率將所單離之複數人份之末梢血液單核球加以混合，添加CD3 beads※ 1 並使其懸浮，於4℃下培育15分鐘之後，添加分離緩衝液1 mL※ 2 ，並使其充分懸浮，進行300×g、10分鐘之離心分離。去除上清液，懸浮於0.5 mL之分離緩衝液中，添加至預先添加有2 mL之分離緩衝液而使其濕潤之LD管柱(Miltenyi Biotec、130-042-901)中，回收來自LD管柱之溶出液。進而將1 mL之分離緩衝液添加至LD管柱中，回收溶出液。其後，利用1 mL之分離緩衝液清洗管柱，並對回收之液體中之細胞數進行計數，算出總細胞數。進行500×g、5分鐘之離心分離，去除上清液之後，以成為5×105 細胞/mL之方式懸浮於KBM 501培養基※ 3 中。
將一部分細胞回收用於流式細胞儀測定，並對剩餘之細胞進行培養。使用6孔板(Thermo Fisher Scientific、140675)、T-75燒瓶(Thermo Fisher Scientific、156499)或500 cm2 培養袋(Nipro)，於CO2 培育箱中進行培養(37℃、5% CO2 )。於培養之第5天及第9天取出培養液之一部分，對細胞數進行計數，於第9天以如下方式添加KBM 501培養基：於6孔板之情形時，最終液量成為每孔中為6 mL，於T-75燒瓶之情形時，最終液量成為每1燒瓶中為50 mL。於第14天回收細胞，對細胞數進行計數，使用一部分細胞，藉由流式細胞儀進行細胞表面抗原之測定。
※1：CliniMACS CD3、Miltenyi Biotec、130-017-601(每1×107 細胞為5 μL) ※2：包含0.5%人類AB型血清(Cosmobio、12181301、於56℃下進行了30分鐘非活化處理者)、2 mM EDTA(Thermo Fisher Scientific、15575-020)之PBS((和光純藥工業、045-29795) ※3：添加了5%人類AB型血清(Cosmobio、12181301、於56℃下進行了30分鐘之非活化處理者)之KBM 501(Kohjin-bio、16025015)
將結果示於圖1中。於混合9人份(圖1之A)、混合8人份(圖1之B)、混合7人份(圖1之C)之任一者中，細胞之增生均良好。確認純度，結果發現於任一混合培養中，90%以上均為CD3- CD56+ 之NK細胞。混合8人份之培養係於T-75燒瓶及500 cm2 培養袋中進行培養，但兩者之細胞之增生均良好。再者，混合9人份之培養、混合7人份之培養及來自單獨供體(7人中之1人)之培養係使用6孔板進行培養。於使用500 cm2 之培養袋之培養中，如後文所述之實施例4所記載那樣，進行將袋翻轉之作業。
又，將混合7人份之培養與來自單獨供體之培養之細胞增生進行比較，發現來自單獨供體之培養自6.8×106 細胞增生至1.9×107 細胞(約2.8倍)，相對於此，混合培養自7.8×106 細胞增生至3.7×107 細胞(約4.7倍)，混合培養之細胞之增生更良好(圖1之C))。
[實施例2：自新鮮末梢血液獲得之NK細胞之混合培養2]  利用實施例1中記載之方法於T-75燒瓶中進行來自單獨供體之培養(n＝17)及4人以上之混合培養(n＝10)，並將數據累加，針對所獲得之NK細胞數之細胞增生率進行統計分析。分析軟體使用JMP Pro13，進行Wilcoxon之秩和檢定。
將結果示於圖2中。來自單獨供體之細胞培養之情形時的增生率(增生後之總細胞數/增生前之總細胞數)為3.10±0.56，相對於此，混合培養之情形時之增生率為6.56±1.24，混合培養之增生率於統計學上而言顯著提高(P＜0.01)。
[實施例3：腫瘤細胞毒殺活性試驗]  《NK細胞之製備》  將自健康志願者之利用實施例1中記載之方法獲得之4人之混合培養NK細胞及來自單獨供體(4人中之1人)之培養NK細胞回收清洗後，分別使其懸浮於含有10%之FBS(Nichirei bioscience、171012-500 ML)及100單位之青黴素、100 µg/mL之鏈黴素(Nacalai Tesque、26253-84)之RPMI 1640培養基(和光純藥工業、189-02025)(以下稱為10%之FBS/RPMI 1640)中，利用相同之培養基製備為1×106 細胞/mL之濃度。
《SKOV3之製備》  利用不含血清成分之RPMI 1640培養基(和光純藥工業、189-02025)將SKOV3細胞(人卵巢癌細胞株)製備為1×106 細胞/mL之濃度。使用PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit(PKH26紅色螢光細胞連接子套組)(Sigma、PKH26GL-1KT)對所製備之SKOV3細胞進行染色，最終利用10%之FBS/RPMI 1640以成為2×106 細胞/mL及2×105 細胞/mL之方式進行製備。
《MDSC(Myeloid-derived suppressor cells，源自骨髓之抑制細胞)之製備》  自健康志願者(與NK細胞之供體不同)，使用聚蔗糖而單離末梢血液單核球，利用含有10 ng/mL之IL-6(PEPROTECH、200-06-5UG)及10 ng/mL之GM-CSF(CellGenix、1012-050)之10%之FBS/RPMI 1640培養7-10天，藉此誘導MDSC。使MDSC懸浮於不含血清成分之RPMI 1640培養基(和光純藥工業、189-02025)中，使用PKH Green Fluorescent Cell Linker Kit(PKH藍色螢光細胞連接子套組)(Sigma、MINI67-1KT)進行染色，最終利用10%FBS/RPMI 1640以成為8×105 細胞/mL之方式進行製備。
《細胞毒殺活性試驗》  準備來自複數個供體之混合培養NK細胞與SKOV3細胞之群、來自單獨供體之培養NK細胞與SKOV3細胞之群、向該等2個群中分別添加MDSC之群之總計4個群及作為陰性對照之僅SKOV3細胞之群。
NK細胞與SKOV3細胞以細胞比成為3：1之方式播種於96孔板(IWAKI、4870-800SP)中，進行混合，於37℃、5% CO2 下使其反應4小時。關於添加有MDSC之群，以NK細胞、SKOV3與MDSC之細胞比成為5：1：4之方式首先將NK細胞與MDSC於96孔板中加以混合，於37℃、5% CO2 下使其反應12-18小時。其後，進行離心分離(500×g、5分鐘)，去除上清液之後，添加SKOV3細胞並進行混合，於37℃、5% CO2 下使其反應4小時。於反應後進行離心分離(500×g、5分鐘)，去除上清液後，添加利用PBS稀釋之Zombie溶液(Biolegend、423105)並進行混合，於室溫下、暗處培育30分鐘。進行離心、去除上清液之後，利用PBS進行懸浮，添加AccuCheck Counting Beads(Thermo Fisher Scientific、PCB100)。使用流式細胞儀(BD LSR Fortessa、BD biosciences公司)進行測定，利用FlowJo軟體(FLOWJO、LLC)進行分析，算出細胞毒殺活性率 (%Lysis)※ 4 。
※4：細胞毒殺活性率＝(1－SKOV3活細胞數/陰性對照SKOV3活細胞數)×100 活細胞數：SKOV3細胞實測數×添加珠粒液中之珠粒數/珠粒實測數 SKOV3細胞實測數：FSC/SSC 閘控(碎片排除，debris exclusion)、雙重排除(doublet exclusion)之後、PKH26+ 閘控
將結果示於圖3。來自複數個供體之混合培養NK細胞與來自單獨供體之NK細胞相比而言，表現出同等以上之細胞毒殺活性。
[實施例4：自冷凍血球分離血液製備之NK細胞之混合培養]  將2個供體之冷凍血球分離血液(HemaCare、PB001CLP)解凍後加以混合，利用HBSS(-)溶液(Nacalai Tesque、17461-05)進行稀釋，使用自動閉鎖系統細胞處理裝置Lovo Cell Processing System(FRESENIUS KABI)，利用PBS/EDTA溶液(Miltenyi Biotec、130-021-201)進行洗淨，並進行濃縮。其次，使用CliniMACS Prodigy TS 310(Miltenyi Biotec、130-097-183)、CliniMACS CD3 MicroBeads(Miltenyi Biotec、130-017-601)、CliniMACS CD34 Reagent(Miltenyi Biotec、130-017-501)對濃縮之細胞液進行去除CD3陽性細胞、CD34陽性細胞，洗淨並進行溶出。對溶出液中之細胞數進行計數，算出總細胞數。進行500×g、5分鐘之離心分離，去除上清液之後，以成為1×106 細胞/mL之方式懸浮於KBM 501培養基中。使用T-75燒瓶(Thermo Fisher Scientific、156499)或500 cm2 培養袋(Nipro)於CO2 培育箱中進行培養(37℃、5% CO2 )。關於袋之培養，進行於培養開始30分鐘後將袋翻轉，於培養第9天再次翻轉之作業(參照圖4-1)。又，於培養第9天取出培養液之一部分，對細胞數進行計數，並以如下方式添加KBM 501培養基：於T-75燒瓶之情形時最終液量成為每1燒瓶中為50 mL，於培養袋之情形時，最終液量成為每1袋中為500 mL。於第14天回收細胞，對總細胞數進行計數，使用一部分細胞，利用流式細胞儀進行細胞表面抗原之測定。
以如下方式利用抗體對所回收之細胞進行染色： 將Alexa Fluor®700標記抗人類CD56抗體(Biolegend、318316)、PerCP/Cy5.5標記抗人類CD3抗體(Biolegend、300430)、PE-Cy7標記抗人類CD16抗體(Biolegend、302016)以1 µg/mL之濃度於4℃下染色30分鐘後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)，去除上清液，懸浮於PBS(−)(和光純藥工業)中之後，使用流式細胞儀(BD LSRFortessa、BD biosciences公司)進行測定，並利用FlowJo軟體(FLOWJO、LLC)進行分析。
將結果示於圖4-2。於使用自冷凍血球分離血液獲得之NK細胞之情形時，亦藉由混合培養，使細胞充分地增生14天。詳細而言，於T-75燒瓶培養之情形時，自1.50×108 細胞增生至5.72×108 細胞(約3.81倍)，於500 cm2 培養袋培養之情形時，自1.50×108 細胞增生至5.60×108 細胞(約3.73倍)(圖4-2、左)。
關於所獲得之培養NK細胞之集團中之NK細胞之純度，於T-75燒瓶培養之情形時為90.5%，於500 cm2 培養袋培養之情形時為91.7%。又，關於CD16之表現，混合培養NK細胞之集團與來自單獨供體之培養NK細胞之集團(參照日本專利特開2018-193303)同樣地為二峰性。詳細而言，CD16低表現性及CD16高表現性之比率於T-75燒瓶培養之情形時依序為50.9%及49.1%，於500 cm2 培養袋培養之情形時依序為46.7%及53.3%(圖4-2、右)。
[實施例5：單核球/NK細胞 交換實驗]  《初生NK細胞與單核球之製備》  自健康志願者2名(設為供體1、2)實施採血，藉由使用聚蔗糖之密度梯度離心而單離末梢血液單核球。使用EasySepTM Human NK Cell Enrichment Kit(EasySepTM 人類NK細胞富集套組)(STEMCELL、19055)自所單離之末梢血液單核球分離初生NK細胞，使用EasySepTM Human Monocyte Enrichment Kit without CD16 Depletion(EasySepTM 不消耗CD16之人類單核球富集套組)(STEMCELL、19058)自所單離之末梢血液單核球分離單核球，分別對細胞數進行計數。以初生NK細胞成為1×105 細胞/mL、單核球成為3×105 細胞/mL之方式懸浮於KBM 501培養基中。
《交換培養》  將分別將供體1之初生NK細胞與供體1之單核球、供體1之初生NK細胞與供體2之單核球、供體2之初生NK細胞與供體2之單核球、供體2之初生NK細胞與供體1之單核球加以組合之總計4群，以初生NK細胞與單核球之細胞比成為1：3之方式加以混合，於6孔板(Thermo Fisher Scientific、140675)中開始培養(37℃、5% CO2 )。以與實施例1中記載之方法同樣地於培養第9天添加KBM 501培養基，於第14天回收細胞。使用所獲得之細胞測定對細胞表面抗原及K562(人類慢性骨髓性白血病細胞株)之細胞毒殺活性率。
細胞表面抗原之測定係以如下之方式利用抗體對所回收之細胞進行染色，並進行分析： 將Alexa Fluor®700標記抗人類CD56抗體(Biolegend、318316)、APC/Cy7標記抗人類CD3抗體(Biolegend、300426)、FITC標記抗人類KIR2DL1抗體(Miltenyi Biotec、130-103-966)、PerCP/Cy5.5標記抗人類KIR3DL1抗體(Biolegend、312718)以1 µg/mL之濃度於4℃下染色30分鐘後，進行離心分離(500×g、5分鐘、4℃)而去除上清液，懸浮於PBS(−)(和光純藥工業)中之後，使用流式細胞儀(BD LSRFortessa、BD biosciences公司)進行測定，利用FlowJo軟體(FLOWJO、LLC)進行分析。
於細胞毒殺活性之測定中，準備使2個供體之初生NK細胞與單核球組合而成之各培養NK細胞與K562細胞反應之4群、作為陰性對照之僅K562細胞之群、作為陽性對照之利用10%福馬林將K562細胞固定之群。
《K562之製備》  利用不含血清成分之RPMI 1640培養基(和光純藥工業、189-02025)將K562細胞(人類慢性骨髓性白血病細胞株)製備為1×106 細胞/mL之濃度。使用PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit(PKH26紅色螢光細胞連接子套組)(Sigma、PKH26GL-1KT)對所製備之K562細胞進行染色，最終利用10%之FBS/RPMI 1640以成為2×106 細胞/mL之方式進行製備。
《培養NK細胞之製備》  對利用上述方法獲得之將2個供體之初生NK細胞與單核球加以組合並培養而獲得之4群之培養NK細胞進行回收洗淨之後，使其分別懸浮於10%之FBS/RPMI 1640中，利用相同之培養基製備為1×106 細胞/mL之濃度。
《細胞毒殺活性試驗》  將NK細胞與K562細胞以細胞比成為1：1之方式添加至96孔板(IWAKI，4870-800SP)中，並進行混合，於37℃、5% CO2 下使其反應2小時。於反應後進行離心分離(500×g、5分鐘)，去除上清液之後，添加利用PBS稀釋之7-AAD溶液(Beckman Coulter、A07704)並進行懸浮，於室溫下培育20分鐘。使用流式細胞儀(BD LSR Fortessa、BD biosciences公司)進行測定，利用FlowJo軟體(FLOWJO、LLC)進行分析，算出細胞毒殺活性率(%Lysis)※ 5 。
※5：細胞毒殺活性率＝(K562細胞死細胞率-陰性對照死細胞率)/(陽性對照死細胞率-陰性對照死細胞率)×100
將供體分型資訊示於下表中，將結果示於圖5中。
[表1]
   單核球 Bw4 C1 C2 HLA-F
   供體1 - + - +
   供體2 + + - +
                 
陰性訊號 NK細胞 KIR3DL1 KIR2DL2 KIR2DL1   
   供體1 + -/+ +   
   供體2 + -/+ +   
                 
陽性訊號 NK細胞 KIR3DS1 KIR2DS2 KIR2DS1 KIR3DS1
   供體1 - - - -
   供體2 + - + +
於來自KIR3DL1、KIR3DS1之訊號之一者或兩者進入之條件之情形時，CD16high 之集團增加，故可期待更高之ADCC活性。
圖1為培養試驗：自複數人份之PBMC分別去除CD3陽性細胞，使用KBM-501培養基培養14天。 圖2為實驗結果之彙總(左)及統計分析(右)：若進行混合培養，則與來自單獨供體之培養相比，增生率顯著提高。 圖3為腫瘤細胞毒殺活性試驗：以對SKOV3(人卵巢癌細胞株)之毒殺為指標，對藉由混合培養與來自單獨供體之培養所製成之NK細胞之毒殺活性進行評價。 圖4-1為利用500 cm2 培養袋之培養。於自培養開始30分鐘後及培養第9天，進行將袋翻轉之作業。 圖4-2為培養試驗。以冷凍血球分離血液(2份供體)為材料，使用自動閉鎖系統細胞處理裝置去除CD3陽性細胞及CD34陽性細胞之後，使用T75燒瓶或500 cm2 培養袋，並使用KBM-501培養基培養14天。 圖5為單核球/NK細胞交換實驗：於來自KIR3DL1、KIR3DS1之訊號的一者或兩者進入之條件之情形時，CD16high 之集團增加。CD16high 之集團可期待更高之ADCC活性。

Claims (11)

  1. 一種含有NK細胞之細胞集團之製造方法，該製造方法包含： 準備來自複數個供體且含有NK細胞之單核細胞之集團， 於對NK細胞處理有效之條件下對所準備之單核細胞之集團進行培育。
  2. 如請求項1之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含去除CD3陽性細胞之步驟。
  3. 如請求項1或2之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含去除CD34陽性細胞之步驟。
  4. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含由自複數個供體採取之末梢血液獲得單核細胞之集團之步驟。
  5. 如請求項1至4中任一項之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟包含由自複數個供體採取之血球分離血液獲得單核細胞之集團之步驟。
  6. 如請求項1至3中任一項之製造方法，其中準備單核細胞之集團之步驟為準備來自複數個供體的來自選自由胚胎幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞及成體幹細胞所組成之群中之任一者的單核細胞之集團。
  7. 如請求項1至6中任一項之製造方法，其中複數個供體包含一供體及與其相比於HLA及KIR之至少一者中基因類型不同之其他供體。
  8. 一種含有NK細胞之細胞集團，其具備以下特徵： (1)來自複數個供體； (2)於將NK細胞設為效應細胞(E)，將K562細胞設為標的細胞(T)，並以混合比(E：T)1：1進行共同培養之情形時，細胞毒殺活性為50%以上。
  9. 一種用於細胞療法之醫藥組合物，其包含藉由如請求項1至7中任一項之製造方法而製造之細胞集團。
  10. 一種用於細胞療法之醫藥組合物，其包含如請求項8之細胞集團。
  11. 如請求項9或10之醫藥組合物，其用於治療傳染病及/或癌。
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