TW202122569A - 應用小片多孔膜的細胞培養法 - Google Patents

Abstract

[課題]本發明之目的在於提供一種使用小片聚合物多孔質膜的細胞培養法。 [解決手段]本發明提供一種細胞培養法，包含將細胞應用於表面層A或B的面積在4mm² 以下的小片聚合物多孔質膜以進行培養的步驟，且不需要攪拌。該小片聚合物多孔質膜具有特徵性的三維結構，在細胞培養液中，小片聚合物多孔質膜分散及/或小片聚合物多孔質膜彼此互相多重聚積，而利用在細胞培養容器的底部分散及/或積層的性質，更簡便地供給及回收培養基。藉此可實現長期培養及大量培養，進而能夠穩定地長期產生胞外體。

Description

應用小片多孔膜的細胞培養法

本發明係關於細胞培養及物質產生系統，更具體而言，係關於使用小片聚合物多孔質膜的細胞培養法。又，關於具備小片聚合物多孔質膜的細胞培養裝置及套組。

細胞培養

細胞一般係作為具有三維結構的集合體而存在於生物體內。另一方面，在人工環境中培養細胞的情況，一般係使用在培養容器底部將細胞鋪設為單層狀的型態以進行二維培養的古典平面培養法、以及將細胞分散於液體培養液的狀態下進行培養的漂浮培養法。就平面培養法中所使用的細胞而言，適合接著性較高的細胞，但即便使用適合的細胞，根據培養環境的不同，細胞的性質也可能大幅變化。就漂浮培養法而言，亦存在適合的細胞與不適合的細胞。

隨著對於疫苗、酵素、賀爾蒙、抗體、細胞激素（cytokine）等醫療用途中所使用的生物體內蛋白質等的需求提高，使用細胞培養來大量產生生物體內蛋白質等的重要性增加。又，隨著再生醫學中的細胞移植等往實用階段邁進的傾向，有效率且簡便地培養大量細胞的方法理論受到矚目。再者，最近亦見到細胞培養系統的例子，其用以有效率地產生發揮作為生理活性物質之功能的胞外體，以期望將其用於診斷標記、藥物遞輸載體及生物醫藥。

針對大腸桿菌等漂浮細胞，已有人研究了以大型培養槽進行大量培養的技術。使用大型培養槽來大量培養漂浮細胞，需要大量的培養液與攪拌裝置。另一方面，使用附著細胞（adherent cell）來產生物質的研究，隨著所使用之細胞的研究發展，亦受到許多的矚目。欲大量培養附著細胞的情況，古典的平面培養法中，細胞只能夠二維展開，因此需要大量的培養面積。

作為在立體環境下培養大量細胞的方法，已有人提出使用生物反應器及細胞培養載體的方法（非專利文獻1、專利文獻1）。作為使用生物反應器的方法，具有使玻璃纖維等纖維狀物質蓄積於管柱內，並在該空間中持續培養細胞以產生物質的方法（專利文獻2）。又，作為代表性的細胞培養用載體，能夠使細胞進行附著育成的小粒子，即微載體（microcarrier）成為廣泛研究的對象（專利文獻3、4）。

如專利文獻4中以產生為例所示，為了藉由使用微載體的細胞培養法來增加產物的量以提升效率，達成高密度的細胞培養成為最重要的課題。又，不管如何有效率且簡便地使細胞增殖，是否能將細胞移植、接種到作為載體的微載體上仍是重要的課題。關於此點，使用微載體的細胞培養系統中，為了避免微載體互相凝集，必須充分攪拌、擴散。因此，至少需要能夠將分散有微載體的培養液充分攪拌、擴散的容積，故可培養之細胞的密度具有上限。再者，為了將微載體與培養液分離，必須以可辨別細微粒子的過濾器進行分離等，在量及效率方面仍具有許多課題。又，雖已研發了許多三維培養技術，但大部分是水凝膠及球狀體（Spheroid）法等暫時的培養技術或適於評價的技術，尚未有人提出實際上能夠長期產生物質的培養方法。為了穩定生產生物醫藥品及生物活性（bioactivity）稀有物質或是胞外體這樣的物質，需要穩定的長期培養技術。關於此點，已有許多人提出包含間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）的初代細胞之長期培養（非專利文獻2；非專利文獻3），但並不足以作為細胞培養系統的製造方法。

胞外體所具有的生理活性，係藉由胞外體的來源細胞所控制的核酸及蛋白質的構成來支撐，據認為在細胞培養中的誘導期、對數增殖期、靜止期及死亡期的各階段所產生的胞外體之品質有所變化。因此，考量以工業規模生產胞外體的情況，胞外體的特性根據培養時間而有所變化，此點對於品質管理而言並不佳，因此要求一旦確立生產系統即可長期產生品質均勻的胞外體。以往使用培養細胞產生胞外體的技術中，並未充分應對這種細胞培養系統隨著時間經過導致胞外體的品質改變的問題，而成為了阻礙供給品質穩定之胞外體以及確立工業規模的胞外體產生系統的技術屏障。

又，從在細胞培養中供氧的觀點來看，細胞培養中無論是否使用細胞培養用載體，又無論是漂浮細胞還是附著性細胞，除了厭氧細菌以外，供氧對於培育健全的細胞而言是重要的課題。例如，使用培養皿、盤或腔室來對於附著性細胞進行平面培養的情況，相對於培養容器的面積，培養基量的適當範圍會有所限制。因此，不必要地使用大量培養基的情況，亦會發生無法對於細胞供給充分的氧而因低氧引起障礙的狀況、或是導致細胞死亡的狀況。又，細胞群形成球狀的情況，若其尺寸變得太大，則內部的細胞會陷入氧氣不足的情況，此已為人所知（非專利文獻4）。對於這樣的供氧課題，有人嘗試了使用微氣泡來提升氧濃度（專利文獻5）、或是在微載體培養中均勻供氧的方法（專利文獻6）等。另一方面，已知在間葉系幹細胞的培養中，該細胞偏好在低氧環境下棲息、增殖，因此必須根據細胞的種類在細胞培養時進行增加或減少供氧的繁瑣操作。於是，希望開發並建構一種細胞培養法，在簡便且適合自動化的製程中能夠輕易調節所提供之氧量，進而能夠培養更大量的細胞。

本案發明人，目前為止提供了使用聚合物多孔質膜的細胞培養法及細胞培養裝置，但為了防止膜狀聚合物多孔質膜的形態持續性地變形，而將聚合物多孔質膜收納於殼體（外套）以作為細胞培養模組，並將其應用於細胞培養容器、細胞培養裝置或細胞培養系統（專利文獻7：「細胞培養模組」）。藉此防止對於在聚合物多孔質膜內培育的細胞施加壓力，而抑制凋亡（apoptosis）等，進而能夠穩定且大量的培養細胞。然而，使用細胞培養模組的細胞培養法中，需要用來收納聚合物多孔質膜的殼體，且收置該殼體的細胞培養容器本身的尺寸及強度有所限制。 ＜聚醯亞胺多孔質膜＞

聚醯亞胺多孔質膜，在本申請案之前，係使用於以過濾器、低介電常數膜、燃料電池用電解質膜等、尤其是電池相關技術為中心的用途。專利文獻8～10記載了一種具有大量巨孔的聚醯亞胺多孔質膜，其氣體等物質的穿透性尤其優良、空孔率高、兩個表面的平滑性優良、強度相對高、且儘管為高空孔率其對於膜厚方向上的壓縮應力之耐力仍優良。此等皆為經由醯胺酸製作而成的聚醯亞胺多孔質膜。 ［先前技術文獻］ ［專利文獻］

［專利文獻1］日本特開昭62-065681號公報 ［專利文獻2］國際公開第2008/084857號 ［專利文獻3］日本特開平7-313151號公報 ［專利文獻4］國際公開第2003/054174號 ［專利文獻5］日本專利第5549209號公報 ［專利文獻6］日本專利第5460241號公報 ［專利文獻7］國際公開第2018/021368號 ［專利文獻8］國際公開第2010/038873號 ［專利文獻9］日本特開2011-219585號公報 ［專利文獻10］日本特開2011-219586號公報 ［非專利文獻］

［非專利文獻1］Ogata et al., Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.77, No.1, p.46-51 1994 ［非專利文獻2］Dosh, R. H., et al., Science Reports, volume 9, Article number:1812 (2019) ［非專利文獻3］M. Mirbagheri, et al., Mater. Horiz., 6, 45-71 (2019) ［非專利文獻4］黑澤尋，生物工學第91卷，第11號，646-653頁，2013年

［發明所欲解決之課題］

為了大量培養接著性的動物細胞，若維持培養皿或培養碟的各種平面形態，則勢必需要大面積，因此發展出積層形態的培養裝置。另一方面，亦開發了許多使可漂浮之載體在培養基中漂浮以進行培養的微載體等方法，並且亦開始建構並活用以漂浮細胞的各種形態培養大量接著細胞的方法。此等的方法，雖可活用於在某種程度的期間使細胞增殖、產生病毒或蛋白質等物質，但並未發現不損及細胞特性而長期穩定地培養細胞的方法理論。

又，為了培養大量的動物細胞，必須持續地使大量的氧溶存於培養基中。作為使氧溶存於培養基的方法，具有攪拌培養基的方法、以及起泡的方法。然而，動物細胞大多不耐剪切力，因此在攪拌培養方法中，具有導致細胞死亡的問題。又，一般的磁力攪拌器與攪拌子組合而成的攪拌培養方法中，在培養容器與攪拌子接觸的部分會將細胞搗碎，難以大量培養細胞。又，進行起泡的培養方法中，具有因為起泡時產生的泡沫導致細胞死亡的問題。另一方面，若為偏好在低氧環境棲息的間葉系幹細胞等細胞，則使大量的氧持續溶存於培養基並不佳。對於這種細胞的培養而言，必須加裝用以降低恆溫箱內之氧濃度的裝置。 ［解決課題之手段］

本案發明人重新審視使用聚醯亞胺多孔質膜的細胞培養技術，使以往用於細胞培養的多孔膜片的尺寸成為1mm左右的小尺寸，而創造出完全不需要特殊設備的靜置型長期大量細胞培養系統。發現藉由使多孔膜成為小片，可將大量的片大量地設置於極小的空間內，並藉由供給營養，可穩定且簡便地培養大量的細胞。又，目前為止顯示了無法有效率地從聚醯亞胺多孔質膜回收細胞的傾向，但本方法中明確顯示了亦可在某種程度上有效率地進行細胞回收。又，藉由作為小片，在分散狀態或積層狀態的培養基等的流通性良好，因此小片培養法在細胞的成長、胞外體的產量等方面呈現了高效率。因為小片的特性，系統的目視性亦優良，可形成用以產生抗體、病毒或胞外體等各種物質的優良系統。又，亦可與溢流反應器等連續培養法組合使用，而能夠靜態地長期培養大量細胞。尤其發現在產生胞外體的過程中，藉由使用了本發明之小片聚合物多孔質膜的細胞培養法，可長期產生具有穩定產量與品質的胞外體。

本發明藉由將聚合物多孔質膜作為小片，可提供一種不需要特殊細胞培養設備且無須在細胞培養容器中使用攪拌機、旋轉器即可大量培養細胞的最佳空間。進一步發現，在培養液中，小片聚合物多孔質膜分散及/或小片聚合物多孔質膜彼此多重聚積，而在分散及/或積層的狀態下沉入細胞培養容器的底部，因為可維持這樣的狀態，而可輕易調節細胞培養液的液體量（深度），甚至能夠簡便地調節培養液中的溶存氧量（氧供給狀態），進而完成本發明。亦即，本發明包含以下的態樣，但並不限於此。

［1］一種細胞培養法，包含將細胞應用於小片聚合物多孔質膜並進行培養的步驟，且無須攪拌； 其中該小片聚合物多孔質膜，係包含具有多個孔的表面層A及表面層B、以及夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之小片聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有與該表面層A及B結合的分隔壁以及被該分隔壁與該表面層A及B所圍住的多個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通， 該表面層A或表面層B的面積為4mm² 以下， 培養液中，該小片聚合物多孔質膜分散及/或小片聚合物多孔質膜彼此多重聚積而在細胞培養容器的底部分散及/或積層。 ［2］如［1］之細胞培養法，其中藉由間歇或連續地更換培養基以進行長期培養。 ［3］如［1］或［2］之細胞培養法，其中在使接著於該小片聚合物多孔質膜的細胞增殖後，藉由酵素處理將細胞剝離，再將未接著有細胞的小片聚合物多孔質膜添加至細胞培養容器中，藉此使細胞繼代以進行大量培養。 ［4］如［1］至［3］項中任一項之細胞培養法，其中該小片聚合物多孔質膜具有平均孔徑0.01～100μm的多個細孔。 ［5］如［1］至［4］項中任一項之細胞培養法，其中該表面層A的平均孔徑為0.01～50μm。 ［6］如［1］至［5］項中任一項之細胞培養法，其中該表面層B的平均孔徑為20～100μm。 ［7］如［1］至［6］項中任一項之細胞培養法，其中該小片聚合物多孔質膜的總膜厚為5～500μm。 ［8］如［1］至［7］項中任一項之細胞培養法，其中該小片聚合物多孔質膜為小片聚醯亞胺多孔質膜。 ［9］如［8］之細胞培養法，其中該小片聚醯亞胺多孔質膜，係包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺的小片聚醯亞胺多孔質膜。 ［10］如［8］或［9］之細胞培養法，其中該小片聚醯亞胺多孔質膜，係將包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯胺酸溶液與著色前驅物的聚醯胺酸溶液組成物成形後，於250℃以上進行熱處理所得到的經著色之小片聚醯亞胺多孔質膜。 ［11］如［1］至［10］項中任一項之細胞培養法，其包含藉由細胞產生胞外體的步驟。 ［12］一種細胞培養裝置，其包含小片聚合物多孔質膜，並用於如［1］至［11］項中任一項之細胞培養法。 ［13］一種套組，其包含小片聚合物多孔質膜，並用於如［1］至［11］項中任一項之細胞培養法。 ［14］一種胞外體，係藉由如［1］至［11］項中任一項之方法而取得。 ［發明之效果］

本發明中，在培養液中小片聚合物多孔質膜分散及/或小片聚合物多孔質膜彼此多重聚積，而可在小片聚合物多孔質膜於細胞培養容器的底部分散及/或積層的狀態進行細胞培養，因此能夠不需要以攪拌機等進行攪拌而進行放置，故不同於以往使用具備殼體的模組化聚合物多孔質膜，細胞培養容器的尺寸、材料、強度等皆無限制，而且不需要設置攪拌機等，因此可使用於極廣泛範圍的細胞培養容器。又，在將細胞接種於小片聚合物多孔質膜並進行培養後，不回收細胞而追加小片聚合物多孔質膜，藉此亦可使細胞量增加（內部擴大）。再者，藉由使用小片聚合物多孔質膜，可穩定且長期產生物質。相較於以往的聚醯亞胺多孔質膜，使用小片聚合物多孔質膜的培養中，細胞的增殖明顯變高，又，細胞回收效率顯著改善，如上所述，亦可進行內部擴大，因此變得易於更長期地持續培養細胞。再者，亦具有可在細胞載持於小片聚合物多孔質膜內的狀態下將小片構件凍結以進行保存這樣的優點。

以下，一邊因應需求參照圖式，一邊說明本發明的實施型態。實施型態的構成為例示，本發明的構成不限於實施型態的具體構成。

A.小片聚合物多孔質膜 1.小片聚合物多孔質膜的製作 小片聚合物多孔質膜，可藉由使後述聚合物多孔質膜成形為預期的尺寸而製作。成形可使用各種加工用單元進行。例如，雖未限定，但可藉由使用了蝕刻刀簡易式沖孔機的蝕刻刀模（pinnacle die）對於聚合物多孔質膜（例如，聚醯亞胺多孔質膜、聚醚碸（PES）多孔質膜）進行沖孔，而得到預期形狀的小片聚合物多孔質膜。

2.聚合物多孔質膜 本發明中所使用之聚合物多孔質膜中的表面層A（以下亦稱為「A面」或「網孔面」）中存在之孔的平均孔徑並未特別限定，例如可為0.01μm以上且小於200μm、0.01～150μm、0.01～100μm、0.01～ 50μm、0.01μm～40μm、0.01μm～30μm、0.01μm～25μm、0.01μm～20μm、或0.01μm～15μm，較佳為0.01μm～25μm。

本發明中所使用之聚合物多孔質膜中的表面層B（以下亦稱為「B面」或「大孔面」）中存在之孔的平均孔徑只要大於存在於表面層A的孔的平均孔徑則未特別限定，例如可超過5μm且在200μm以下、20μm～100μm、25μm～100μm、30μm～100μm、35μm～100μm、40μm～100μm、50μm～100μm、或60μm～100μm，較佳為30μm～100μm。

本說明書中，聚合物多孔質膜表面的平均孔徑為面積平均孔徑。面積平均孔徑可藉由以下的（1）及（2）求得。另外，聚合物多孔質膜表面以外的部位其平均孔徑亦可相同地求出。 （1）從多孔質膜表面的掃描式電子顯微鏡影像，針對200點以上的開孔部測量孔面積S，將該孔面積假設為正圓，從式I求出各別的孔徑d。 [數1]

（2）將以上述式I所求得之所有孔徑應用於以下的式II，求出孔的形狀為正圓時的面積平均孔徑da。 [數2]

表面層A及B的厚度並未特別限定，例如為0.01～50μm，較佳為0.01～20μm。

聚合物多孔質膜中的巨孔層中，巨孔在膜平面方向上的平均孔徑並未特別限定，例如為10～500μm，較佳為10～100μm，更佳為10～80μm。又，該巨孔層中的分隔壁的厚度並未特別限定，例如為0.01～50μm，較佳為0.01～20μm。一實施型態中，該巨孔層中的至少1個分隔壁，具有使鄰接的巨孔彼此連通且平均孔徑為0.01～100μm、較佳為0.01～50μm的1個或多個孔。另一實施型態中，該巨孔層中的分隔壁不具有孔。

本發明中所使用之聚合物多孔質膜表面的總膜厚並未特別限定，可為5μm以上、10μm以上、20μm以上或25μm以上，亦可為500μm以下，300μm以下、100μm以下、75μm以下或50μm以下。較佳為5～500μm，更佳為25～75μm。

本發明中所使用之聚合物多孔質膜的膜厚的測量，可以接觸式的厚度計進行。

本發明中所使用之聚合物多孔質膜的空孔率並未特別限定，例如在40%以上且小於95%。

本發明中所使用的聚合物多孔質膜的空孔率，可藉由測量裁切成既定尺寸的多孔質膜之膜厚及質量，再從單位面積質量以下式III求出。 [數3]

（式中，S表示多孔質膜的面積，d表示總膜厚，w表示測量質量，D表示聚合物的密度；聚合物為聚醯亞胺的情況，密度為1.34g/cm³ ）。

本發明中所使用的聚合物多孔質膜，較佳為包含具有多個孔的表面層A及表面層B、與夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚合物多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑為0.01μm～25μm，存在於該表面層B的孔的平均孔徑為30μm～100μm，該巨孔層具有與該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的多個巨孔，該巨孔層的分隔壁、以及該表面層A及B的厚度為0.01～20μm，該表面層A及B中的孔與巨孔連通，總膜厚為5～500μm，空孔率為40%以上且小於95%。一實施型態中，巨孔層中的至少1個分隔壁，具有將鄰接的巨孔彼此連通且平均孔徑為0.01～100μm、較佳為0.01～50μm的1個或多個孔。另一實施型態中，分隔壁不具有這樣的孔。

本發明中所使用的聚合物多孔質膜較佳係經過滅菌。作為滅菌處理，並未特別限定，可列舉：熱滅菌、蒸氣滅菌、以乙醇等消毒劑所進行的滅菌、紫外線或γ射線等電磁波滅菌等任意的滅菌處理等。

本發明中所使用之小片聚合物多孔質膜，只要具備上述結構的特徵則未特別限定，較佳為小片聚醯亞胺多孔質膜或小片聚醚碸（PES）多孔質膜。以下說明小片聚合物多孔質的製作中所使用之聚醯亞胺多孔質膜及聚醚碸（PES）多孔質膜。

2-1.聚醯亞胺多孔質膜 聚醯亞胺，係重複單元中包含醯亞胺鍵的聚合物之統稱，通常意指芳香族化合物直接由醯亞胺鍵連結而成的芳香族聚醯亞胺。芳香族聚醯亞胺中，芳香族與芳香族透過醯亞胺鍵而具有共軛結構，因此具有剛性（rigid）且牢固的分子結構，且醯亞胺鍵具有強大的分子間力，因此具有極高水準的熱性質、機械性質、化學性質。

本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，較佳為包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺（作為主要成分）的聚醯亞胺多孔質膜，更佳為由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺所構成之聚醯亞胺多孔質膜。「包含其作為主要成分」，係指作為聚醯亞胺多孔質膜的構成成分，本質上不包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺以外的成分，或是雖可包含，但其為不對於由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺的性質造成影響的附加成分。

一實施型態中，本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，亦包含在使包含由四羧酸成分與二胺成分所得之聚醯胺酸溶液與著色前驅物之聚醯胺酸溶液組成物成形後，以250℃以上進行熱處理所得到的經著色之聚醯亞胺多孔質膜。

聚醯胺酸係將四羧酸成分與二胺成分聚合而得。聚醯胺酸，係可藉由熱醯亞胺化或化學醯亞胺化進行閉環而得以成為聚醯亞胺的聚醯亞胺前驅物。

聚醯胺酸中，即使醯胺酸的一部分醯亞胺化，只要在不影響本發明的範圍內即可使用。亦即，聚醯胺酸亦可部分地熱醯亞胺化或化學醯亞胺化。

將聚醯胺酸熱醯亞胺化的情況，可因應需求，在聚醯胺酸溶液中添加醯亞胺化觸媒、含有機磷之化合物、無機微粒子、有機微粒子等微粒子等。又，將聚醯胺酸化學醯亞胺化的情況，亦可因應需求在聚醯胺酸溶液中添加化學醯亞胺化劑、脫水劑、無機微粒子、有機微粒子等微粒子等。在聚醯胺酸溶液中摻合前述成分，較佳係在著色前驅物不會析出的條件下進行。

本說明書中，「著色前驅物」係指藉由250℃以上的熱處理而一部分或全部碳化進而生成著色化物的前驅物。

作為上述聚醯亞胺多孔質膜的製造中可使用的著色前驅物，較佳係在聚醯胺酸溶液或聚醯亞胺溶液中均勻地溶解或分散，藉由250℃以上、較佳為260℃以上、再佳為280℃以上、更佳為300℃以上的熱處理，較佳在空氣等的氧存在下於250℃以上、較佳為260℃以上、再佳為280℃以上、更佳為300℃以上的熱處理進行熱分解、碳化而生成著色化物者，更佳為生成黑色系的著色化物者，更佳為碳系著色前驅物。

著色前驅物，若開始加熱乍看之下會成為看起來像碳化物者，但就組織而言，包含碳以外的不同元素，其包含層結構、芳香族交聯結構、含有四面體碳之無序結構者。

碳系著色前驅物未特別限制，可列舉例如：石油溚（petroleum tar）、石油瀝青、煤溚（coal tar）、煤瀝青等的溚或瀝青、煤焦、由包含丙烯腈之單體所得之聚合物、二茂鐵化合物（二茂鐵及二茂鐵衍生物）等。此等之中，較佳為由包含丙烯腈的單體所得之聚合物及/或二茂鐵化合物，作為由包含丙烯腈之單體所得之聚合物，較佳為聚丙烯腈。

又，另一實施型態中，本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，亦包含不使用上述著色前驅物，而是使由四羧酸成分與二胺成分所得之聚醯胺酸溶液成形後藉由熱處理所得到的聚醯亞胺多孔質膜。

不使用著色前驅物而製造的聚醯亞胺多孔質膜，例如，亦可藉由下述方法製造：將由極限黏度數值為1.0～3.0的聚醯胺酸3～60質量%與有機極性溶劑40～97質量%所構成之聚醯胺酸溶液澆注為膜狀，使其浸漬於或接觸以水作為必要成分的凝固溶劑，以製作聚醯胺酸的多孔質膜，之後對於該聚醯胺酸的多孔質膜進行熱處理以進行醯亞胺化。此方法中，以水為必要成分的凝固溶劑，可為水、或是5質量%以上、小於100質量%的水與超過0質量%且在95質量%以下的有機極性溶劑的混合液。又，上述醯亞胺化之後，亦可對於所得之多孔質聚醯亞胺膜的至少單面實施電漿處理。

上述聚醯亞胺多孔質膜的製造中可使用的四羧酸二酐，可使用任意的四羧酸二酐，可因應預期的特性等適當選擇。作為四羧酸二酐的具體例，可列舉：苯均四酸二酐、3,3’,4,4’-聯苯四羧酸二酐（s-BPDA）、2,3,3’,4’-聯苯四羧酸二酐（a-BPDA）等聯苯四羧酸二酐、氧基二鄰苯二甲酸二酐、二苯碸-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、雙（3,4-二羧基苯基）硫醚二酐、2,2-雙（3,4-二羧基苯基）-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷二酐、2,3,3’,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、3,3’,4,4’-二苯甲酮四羧酸二酐、雙（3,4-二羧基苯基）甲烷二酐、2,2-雙（3,4-二羧基苯基）丙烷二酐、對伸苯基雙（苯偏三酸單酯酸酐）、對聯伸苯基雙（苯偏三酸單酯酸酐）、間三聯苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、對三聯苯基-3,4,3’,4’-四羧酸二酐、1,3-雙（3,4-二羧基苯氧基）苯二酐、1,4-雙（3,4-二羧基苯氧基）苯二酐、1,4-雙（3,4-二羧基苯氧基）聯苯二酐、2,2-雙［（3,4-二羧基苯氧基）苯基］丙烷二酐、2,3,6,7-萘四羧酸二酐、1,4,5,8-萘四羧酸二酐、4,4’-（2,2-六氟異亞丙基）二鄰苯二甲酸二酐等。又，較佳係使用2,3,3’,4’-二苯碸四羧酸等芳香族四羧酸。此等可單獨亦可組合2種以上使用。

此等之中，特佳係選自由聯苯四羧酸二酐及苯均四酸二酐所構成之群組中的至少一種芳香族四羧酸二酐。作為聯苯四羧酸二酐，可理想地使用3,3’,4,4’-聯苯四羧酸二酐。

上述聚醯亞胺多孔質膜的製造中可使用的二胺，可使用任意的二胺。作為二胺的具體例，可舉出以下的化合物。 1）1,4-二胺基苯（對伸苯基二胺）、1,3-二胺基苯、2,4-二胺基甲苯、2,6-二胺基甲苯等具有1個苯核的苯二胺； 2）4,4’-二胺基二苯醚、3,4’-二胺基二苯醚等二胺基二苯醚、4,4’-二胺基二苯基甲烷、3,3’-二甲基-4,4’-二胺基聯苯、2,2’-二甲基-4,4’-二胺基聯苯、2,2’-雙（三氟甲基）-4,4’-二胺基聯苯、3,3’-二甲基-4,4’-二胺基二苯基甲烷、3,3’-二羧基-4,4’-二胺基二苯基甲烷、3,3’,5,5’-四甲基-4,4’-二胺基二苯基甲烷、雙（4-胺基苯基）硫醚、4,4’-二胺基苯并醯胺苯、3,3’-二氯聯苯胺、3,3’-二甲基聯苯胺、2,2’-二甲基聯苯胺、3,3’-二甲氧基聯苯胺、2,2’-二甲氧基聯苯胺、3,3’-二胺基二苯醚、3,4’-二胺基二苯醚、4,4’-二胺基二苯醚、3,3’-二胺基二苯硫醚、3,4’-二胺基二苯硫醚、4,4’-二胺基二苯硫醚、3,3’-二胺基二苯碸、3,4’-二胺基二苯碸、4,4’-二胺基二苯碸、3,3’-二胺基二苯甲酮、3,3’-二胺基-4,4’-二氯二苯甲酮、3,3’-二胺基-4,4’-二甲氧基二苯甲酮、3,3’-二胺基二苯基甲烷、3,4’-二胺基二苯基甲烷、4,4’-二胺基二苯基甲烷、2,2-雙（3-胺基苯基）丙烷、2,2-雙（4-胺基苯基）丙烷、2,2-雙（3-胺基苯基）-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙（4-胺基苯基）-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、3,3’-二胺基二苯亞碸、3,4’-二胺基二苯亞碸、4,4’-二胺基二苯亞碸等具有2個苯核的二胺； 3）1,3-雙（3-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯基）苯、1,4-雙（3-胺基苯基）苯、1,4-雙（4-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯氧基）苯、1,4-雙（3-胺基苯氧基）苯、1,4-雙（4-胺基苯氧基）苯、1,3-雙（3-胺基苯氧基）-4-三氟甲基苯、3,3’-二胺基-4-（4-苯基）苯氧基二苯甲酮、3,3’-二胺基-4,4’-二(4-苯基苯氧基）二苯甲酮、1,3-雙（3-胺基苯基硫）苯、1,3-雙（4-胺基苯基硫）苯、1,4-雙（4-胺基苯基硫）苯、1,3-雙（3-胺基苯碸）苯、1,3-雙（4-胺基苯碸）苯、1,4-雙（4-胺基苯碸）苯、1,3-雙［2-（4-胺基苯基）異丙基］苯、1,4-雙［2-（3-胺基苯基）異丙基］苯、1,4-雙［2-（4-胺基苯基）異丙基］苯等具有3個苯核的二胺； 4）3,3’-雙（3-胺基苯氧基）聯苯、3,3’-雙（4-胺基苯氧基）聯苯、4,4’-雙（3-胺基苯氧基）聯苯、4,4’-雙（4-胺基苯氧基）聯苯、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］醚、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］酮、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］硫、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］碸、雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］甲烷、雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］甲烷、雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］甲烷、雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］甲烷、2,2-雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］丙烷、2,2-雙［3-（3-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙［3-（4-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙［4-（3-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷、2,2-雙［4-（4-胺基苯氧基）苯基］-1,1,1,3,3,3-六氟丙烷等具有4個苯核的二胺。

此等可單獨亦可混合2種以上使用。所使用之二胺，可因應預期的特性等適當選擇。

此等之中，較佳為芳香族二胺化合物，理想係使用3,3’-二胺基二苯醚、3,4’-二胺基二苯醚、4,4’-二胺基二苯醚及對伸苯基二胺、1,3-雙（3-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯基）苯、1,4-雙（3-胺基苯基）苯、1,4-雙（4-胺基苯基）苯、1,3-雙（4-胺基苯氧基）苯、1,4-雙（3-胺基苯氧基）苯。特佳為選自由苯二胺、二胺基二苯醚及雙（胺基苯氧基）苯基所構成之群組中的至少一種二胺。

本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，從耐熱性、高溫下的尺寸穩定性的觀點來看，較佳係由將玻璃轉移溫度在240℃以上或是在300℃以上且無明確之轉移點的四羧酸二酐與二胺組合而得到的聚醯亞胺來形成。

本發明中可使用的聚醯亞胺多孔質膜，從耐熱性、高溫下的尺寸穩定性的觀點來看，較佳為以下的芳香族聚醯亞胺所構成之聚醯亞胺多孔質膜。 （i）選自由聯苯四羧酸單元及苯均四酸單元所構成之群組的至少一種四羧酸單元與芳香族二胺單元所構成之芳香族聚醯亞胺； （ii）四羧酸單元與選自由苯二胺單元、二胺基二苯醚單元及雙（胺基苯氧基）苯基單元所構成之群組中的至少一種芳香族二胺單元所構成之芳香族聚醯亞胺；及/或 （iii）選自由聯苯四羧酸單元及苯均四酸單元所構成之群組中的至少一種四羧酸單元與選自由苯二胺單元、二胺基二苯醚單元及雙（胺基苯氧基）苯基單元所構成之群組中的至少一種芳香族二胺單元所構成之芳香族聚醯亞胺。

本發明中所使用的聚醯亞胺多孔質膜，較佳為含有具有多個孔的表面層A及表面層B、夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚醯亞胺多孔質膜，其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑為0.01μm～25μm、存在於該表面層B的孔的平均孔徑為30μm～100μm，該巨孔層具有將該表面層A及B連結的分隔壁、由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的多個巨孔，該巨孔層的分隔壁、以及該表面層A及B的厚度為0.01～20μm、該表面層A及B中的孔與巨孔連通，總膜厚為5～500μm，空孔率為40%以上且小於95%。其中巨孔層中的至少1個分隔壁，具有將鄰接之巨孔彼此連通且平均孔徑為0.01～100μm、較佳為0.01～50μm的1個或多個孔。

例如，國際公開第2010/038873號、日本特開2011-219585號公報或日本特開2011-219586號公報中所記載的聚醯亞胺多孔質膜亦可用於本發明。

2-2.聚醚碸（PES）多孔質膜 本發明中可使用的PES多孔質膜包含聚醚碸，典型而言，實質上係由聚醚碸所構成。聚醚碸可為由本領域從業者以習知方法所合成者，例如，可藉由使二價酚、鹼金屬化合物及二鹵代二苯基化合物在有機極性溶劑中進行聚縮合反應的方法、預先合成二價酚之鹼金屬二鹽並在二鹵代二苯基化合物與有機極性溶劑中使其進行聚縮合反應的方法等來製造。

作為鹼金屬化合物，可列舉：鹼金屬碳酸鹽、鹼金屬氫氧化物、鹼金屬氫化物、鹼金屬烷氧化物等。特佳為碳酸鈉及碳酸鉀。

作為二價酚化合物，可列舉：對苯二酚、兒茶酚、間苯二酚、4,4’-聯苯酚、雙（羥基苯基）烷類（例如2,2-雙（羥基苯基）丙烷、及2,2-雙（羥基苯基）甲烷）、二羥基二苯碸類、二羥基二苯醚類，或此等的苯環的至少1個氫被甲基、乙基、丙基等低級烷基或是甲氧基、乙氧基等低級烷氧基所取代者。作為二價酚化合物，可將上述化合物混合二種以上以使用。

聚醚碸亦可為市售品。作為市售品的例子，可列舉：Sumika Excel 7600P、Sumika Excel 5900P（以上為住友化學股份有限公司製）等。

聚醚碸的對數黏度，從良好地形成多孔質聚醚碸膜之巨孔的觀點來看，較佳為0.5以上，更佳為0.55以上，從多孔質聚醚碸膜的製造容易性的觀點來看，較佳為1.0以下，更佳為0.9以下，再佳為0.8以下，特佳為0.75以下。

又，PES多孔質膜或作為其原料的聚醚碸，從耐熱性、高溫下的尺寸穩定性的觀點來看，玻璃轉移溫度較佳為200℃以上，或是無法觀察到明確的玻璃轉移溫度。

本發明中可使用的PES多孔質膜的製造方法並未特別限定，例如，可以包含下述步驟的方法製造： 將包含0.3質量%～60質量%的對數黏度0.5～1.0之聚醚碸與40質量%～99.7質量%之有機極性溶劑的聚醚碸溶液澆注成膜狀，浸漬於或接觸以聚醚碸之不良溶劑或非溶劑作為必要成分的凝固溶劑，以製作具有空孔之凝固膜的步驟；及 對於前述步驟中所得之具有空孔的凝固膜進行熱處理以使該空孔粗大化而得到PES多孔質膜的步驟； 其中，該熱處理包含將具有該空孔之凝固膜升溫至該聚醚碸的玻璃轉移溫度以上或240℃以上的步驟。

本發明中可使用的PES多孔質膜，較佳為包含具有表面層A、表面層B及夾在該表面層A與該表面層B之間的巨孔層的PES多孔質膜，其中， 該巨孔層，具有將該表面層A及B連結的分隔壁、與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的在膜平面方向上之平均孔徑為10μm～500μm的多個巨孔， 該巨孔層的分隔壁厚度為0.1μm～50μm， 該表面層A及B的厚度分別為0.1μm～50μm， 該表面層A及B之中，一者具有平均孔徑超過5μm且在200μm以下的多個細孔，且另一者具有平均孔徑在0.01μm以上且小於200μm的多個細孔； 表面層A及表面層B中，一者的表面開口率為15%以上，另一表面層的表面開口率為10%以上； 該表面層A及該表面層B之該細孔與該巨孔連通， 該PES多孔質膜，總膜厚為5μm～500μm，且空孔率為50%～95%。

本發明的細胞培養裝置中所使用的、作為細胞培養載體的上述聚合物多孔質膜，因為具有微親水性的多孔質特性，因此液體可穩定地保持於聚合物多孔質膜內，即使在乾燥之中亦可保持優良的潤濕環境。因此，相較於使用以往細胞培養載體的細胞培養裝置，即使以極少量的培養基，亦可達成細胞的生存及增殖。又，接種於聚合物多孔質膜的細胞，可在不會因為剪切力或泡沫導致細胞死亡的情況下進行培養，因此可有效率地對於細胞供給氧氣及營養，而能夠培養大量的細胞。

根據本發明，可對於細胞充分地供氧。

2-3.細胞培養法中所使用的小片聚合物多孔質膜的實施型態 本發明的實施態樣所使用之小片聚合物多孔質膜，未如同以往技術將聚合物多孔質膜收納於殼體（外套）內，而是可添加於任意的細胞培養溶液中以使用。一實施態樣中，本發明的細胞培養法中所使用之小片聚合物多孔質膜，其特徵為表面層A或表面層B的面積為4mm² 以下，較佳為3mm² 以下，更佳為2mm² 以下，最佳為1mm² 。表面層A或表面層B的面積的下限，例如可為0.01mm² 以上，亦可為0.04mm² 以上，亦可為0.09mm² 以上，亦可為0.16mm² 以上。作為小片聚合物多孔質膜的形狀，可列舉例如：多角形（例如，三角形、四角形（例如矩形）、五角形、六角形･･･n角形（n為任意整數））、略圓形、略橢圓形，亦可為包含曲線與直線的形狀。一實施態樣中，細胞培養裝置1a中所應用的聚合物多孔質膜200a，例如，表面層A或表面層B的最長徑/最短徑的比為0.5～1，較佳為0.75～1，更佳為0.9～1。本說明書中，「徑」係指表面層A或表面層B外周之任意二點間的長度。本說明書中，「最長徑」係指在表面層A或表面層B外周之任意二點間的長度中，成為最長的長度。本說明書中，「最短徑」係指在表面層A或表面層B外周之任意二點間的長度中，成為最短的長度。一實施態樣中，應用於本發明之細胞培養方法的小片聚合物多孔質膜為方形，例如矩形的情況，最長徑為2×2^（1/2）mm以下以及最短徑為2×2^（1/2）mm以下，較佳係最長徑為1.5×2^（1/2）mm以下及最短徑為1.5×2^（1/2）mm以下，更佳係最長徑為1×2^（1/2）mm以下及最短徑為1×2^（1/2）mm以下。另一態樣中，應用於本發明之細胞培養方法的聚合物多孔質膜為略圓形或略橢圓形的情況，最長徑為2mm以下及最短徑為2mm以下，較佳係最長徑為1.5mm以下及最短徑為1.5mm以下，更佳為最長徑為1.2mm以下及最短徑為1.2mm以下。又可帶來下述效果：可有效率地對於小片聚合物多孔質膜所載持的細胞供給氧氣及營養、細胞增殖亦變得良好、產生任意的蛋白質等、胞外體之物質的活性亦明顯變高。又，藉由在培養基中大量應用小片聚合物多孔質膜，小片聚合物多孔質膜聚積，而可提供任意的小片聚合物多孔質膜所載持的細胞移動到另一小片聚合物多孔質膜或是一邊橫跨兩者而接著一邊進行培育的培養環境。因此，在將小片聚合物多孔質膜應用於細胞培養容器的情況，較佳係不將細胞培養容器振盪，反而是靜置培養。小片聚合物多孔質膜若靜置，則會在培養基中沉澱，因此在培養適合低氧條件之細胞的情況，無需使用特別的裝置，僅增加培養基的量而增加深度，即可實現低氧培養系統。

又，添加於細胞培養容器的小片聚合物多孔質膜的數量雖未限定，但較佳係在添加後小片聚合物多孔質膜在培養液中成為彼此多重聚積的狀態。較佳係1個小片聚合物多孔質膜與另一小片聚合物多孔質膜一部分或整體重疊，具體而言，重疊的部分，就每一個小片聚合物多孔質膜而言，可為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%的區域。

根據本發明，使用小片聚合物多孔質膜的細胞培養中，雖亦具有形成多個小片聚合物多孔質膜以各邊在垂直方向上對齊的方式聚積而成的以往聚合物多孔質膜之整形多重結構的情況，但小片聚合物多孔質膜，亦具有形成不規則或不均勻之積層狀態的情況。作為如後者的積層狀態，例如，若以2片小片聚合物多孔質膜簡單地進行說明，則可為一膜的一邊與另一膜的一邊或面接觸而以V字結構、T字結構、y字（小寫）結構等形成微小空間的狀況，非膜彼此的面與面一部分或整體重疊的結構亦可。對於這樣的結構，已接種的細胞在其移動或增殖的過程中，不限於膜的平面，亦可聚集在當膜彼此重疊時所形成之微小空間部分，例如，若為V字結構則為V底的部分或面彼此重疊而形成之階差（膜厚或膜的高度），一方面在小片聚醯亞胺多孔質膜中具有立足之處，一方面細胞彼此進一步聚集，而由細胞本身製作非球狀的立體空間，藉此可長期生存。從產生胞外體這樣的觀點來考量的情況，並非增殖或死亡這種劇烈變化的狀況，而是與長期維持穩定數量之細胞集合狀態的環境相依，而可實現穩定地生產品質均勻之胞外體。關於小片多孔膜及在其中培育之細胞所形成的集合結構，在後述實施例2中，如同由呈現人類間葉系幹細胞之幹性驗證結果時的圖4影像所見，脂肪細胞在膜彼此呈現倒V字結構的頂點部（V字結構底部的相反側）聚積而生存，另一方面，成骨細胞，相較於膜的平面部，具有在膜彼此積層所形成之階差部分立體地形成細胞集合體的傾向。

使用作為以往技術之微載體的細胞培養法中，除了達成高密度培養及細胞增殖這樣的課題以外，亦具有如何將細胞移植及接種至微載體上這樣的課題。為了不使微載體互相凝集，亦即，為了不形成集合體，需要攪拌及擴散手段，此為周知的事實，這可說是細胞培養中另一個負面要件。另一方面，本發明中，除了將小片聚合物多孔質膜用於細胞培養以外，如上所述，分散狀態或互相聚積之狀態，使用小片聚合物多孔質膜的情況，集合體形成不會成為任何問題。

又，培養液中已分散及多重聚積在細胞培養容器的底部，意即停止沉澱的小片聚合物多孔質膜，因為小片本身為輕量，因此可為一小片的頂點、邊或面一方面接觸細胞培養容器的底面或側面或是其他小片的頂點、邊或面，一方面例如隨著培養基的水流搖動的狀態。根據本發明，如上所述，因為小片聚合物多孔質膜一邊搖動一邊立體地分散及多重聚積，再者聚合物多孔質膜具備液體穿透性，因此對於小片聚合物多孔質膜上載持的細胞而言，來自培養基的營養及氧氣源源不絕（具有優良的流通性），因此可不使其振盪而以靜置的方式培養細胞。

目前為止，若在持續使未小片化的聚合物多孔質膜的形態變化的狀態下培養細胞，則會對於在聚合物多孔質膜內培育的細胞施加壓力，而因為凋亡等導致死亡，此已為人所知（WO2018/021367）。其中記載了藉由使用縱0.5cm×橫5cm（縱橫比1：10）的易自我變形之短片型膜作為聚合物多孔質膜，明顯誘發細胞死亡。假設即使是以與上述聚合物多孔質膜相同之縱橫比製作本發明之小片聚合物多孔質膜的情況，小片聚合物多孔質膜的厚度亦與上述聚合物多孔質膜的厚度相同，因此比較兩者之立體形狀的情況，小片聚合物多孔質膜的剛性變高，而能夠輕易推測出其自我變形效率下降。此不限於短片型的膜，亦適用於各種形態的小片聚合物多孔質膜。例如後述比較例1中所證實，將「1cm見方的聚醯亞胺多孔質膜」與「1mm見方的小片聚醯亞胺多孔質膜」使用於人類間葉系幹細胞的培養的結果，使用小片聚合物多孔質膜者，整個培養期間皆高度地消耗葡萄糖，因此可說使用本發明之小片聚合物多孔質膜的細胞培養法，從細胞增殖、物質產生及長期培養的觀點來看，相較於以往的聚合物多孔質膜中的細胞培養法，可說是對於細胞提供容易棲息之環境的方法。

B.細胞培養容器 根據本發明，本發明的細胞培養法，係對於小片聚合物多孔質膜加注經過懸浮的細胞，並使其靜置以進行細胞培養的方法，其不需要在細胞培養容器中應用攪拌機或是使用旋轉器。如上所述，小片聚合物多孔質膜具有分散及/或互相多重聚積而在此狀態下沉入細胞培養容器之底部的性質，只要是可使其在培養基中達成這種狀態的細胞培養容器及細胞培養裝置，則未特別限定。因此，不限於一般用於細胞培養的碟、培養皿、盤、孔（well）、瓶、袋等，又亦未限定材料，例如塑膠製、玻璃製等，而可使用任何容器。又，使用細胞培養裝置的情況，細胞培養容器亦可為裝設於裝置內之培養槽的形態。

再者，小片聚合物多孔質膜，具有分散及/或互相多重聚積而沉入細胞培養容器之底部這樣的性質，又，因為不需要攪拌等，因此只要使用具有間歇或連續更換培養基之手段的細胞培養裝置，則可長期培養細胞。這樣的細胞培養裝置的例子雖未限定，但可列舉：溢流型生物反應器、間歇型生物反應器（WO2018/021359）等。

關於溢流型生物反應器的細胞培養裝置，圖6顯示例示性的該細胞培養裝置。具體而言，溢流型生物反應器係圖6中的細胞培養裝置1a，其特徵如下： 具備： 應用了細胞的小片聚合物多孔質膜200a； 培養槽10，收納該小片聚合物多孔質膜200a； 培養基供給口113，設於該培養槽10，供給培養基； 培養基排出口101，設於該培養槽10的側部，將該培養基排出； 培養基供給槽40，與該培養基供給口113連通，設於該培養槽10的外部；及 培養基回收槽60，與該培養基排出口101連通，將從該培養基排出口101排出的該培養基回收； 該培養基排出口101，使該培養基溢流而排出。若使用這樣的細胞培養裝置，則可持續供給新鮮的培養基，另一方面可因應已供給之培養基的量，從設於培養槽的培養基排出口，連續回收細胞培養後的培養基，而可實現長期細胞培養。又，防止如以往在更換培養基的過程中，對於細胞所產生之細胞增殖等為必要的蛋白質其濃度劇烈變化，並持續供給因培養而消耗的培養基中的營養成分（例如葡萄糖等），而可維持較佳的細胞培養環境。

上述例示性的溢流型生物反應器（圖6），其特徵為從培養基排出口101，使培養基溢流而排出，在用以將來自排出口連接器104的排出之培養基回收至培養基回收槽60而連接的培養基排出管50上具備泵32，藉此亦可強制回收細胞培養後的培養基（參照圖8）。

其他實施型態中提供一種溢流型生物反應器（圖7），其並未如圖6及圖8所示在構成培養槽本體100的側部102上設置培養基排出口101，而是具備導件52，其可使培養基排出管51（例如，內徑1mm外徑2mm的管）在細胞培養液的頂面貫通至內部且能維持。此生物反應器中，可從上側使經過細胞培養後的培養基排液，藉此可調整培養基的高度。

C.使用小片聚合物多孔質膜的細胞培養法 本發明的細胞培養法，係將細胞應用於小片聚合物多孔質膜而進行培養的方法，其特徵為不需要以攪拌等進行振盪。再者，無須回收細胞本體或載持細胞的小片聚合物多孔質膜即能夠供給新鮮的培養基以及簡便地回收培養後的培養基，並且可在靜置狀態下長期進行培養。本說明書中，「培養基」係指用以培養細胞、特別是動物細胞的細胞培養基。培養基與細胞培養液係以相同的意思使用。因此，本發明中所使用的培養基係指液體培養基。培養基的種類可使用一般常用的培養基，可根據培養的細胞種類而適當決定。

根據本發明，將細胞應用於小片聚合物多孔質膜的具體步驟並未特別限定。可採用適合本說明書之步驟或是將細胞應用於小片聚合物多孔質膜的任何手法。雖未限定，但本發明的方法中，將細胞應用於小片聚合物多孔質膜，例如包含以下的態樣。 （A）在已添加至細胞培養容器的小片聚合物多孔質膜上注入細胞懸浮液的態樣； （B）在已注入細胞培養容器的細胞懸浮液中添加小片聚合物多孔質膜的態樣。

已接種至聚合物多孔質膜表面的細胞，接著於小片聚合物多孔質膜而進入多孔的內部。較佳係不特別從外部施加物理或化學的力，細胞就會接著於小片聚合物多孔質膜。已接種至小片聚合物多孔質膜表面的細胞，可在膜的表面及/或內部穩定培育、增殖。細胞可因應進行培育、增殖的膜的位置而形成各種不同的形態。又，亦可預先以細胞培養液或經過滅菌的液體將所使用之小片聚合物多孔質膜潤濕。

雖未限定，但較佳係使活細胞選擇性停留於小片聚合物多孔質膜上。因此，本發明之方法的較佳實施型態中，活細胞停留在該小片聚合物多孔質膜內，死細胞則殘留於細胞懸浮液中，而可藉由使培養基流動或更換培養基來去除死細胞。

上述經滅菌的液體並未特別限定，但為經滅菌的緩衝液或滅菌水。緩衝液為例如(+)及(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及(-)Hank's Balanced Salt Solution等。緩衝液的例子顯示於下表1。

[表1]

成分	濃度（mmol/L）	濃度（g/L）
NaCl	137	8.00
KCl	2.7	0.20
Na2 HPO4	10	1.44
KH2 PO4	1.76	0.24
pH（－）	7.4	7.4

本發明的方法中，將細胞應用於小片聚合物多孔質膜，包含使處於漂浮狀態的接著性細胞與小片聚合物多孔質膜懸浮地共存而藉此使細胞附著於膜的態樣（捕獲）。細胞培養基為液體的情況，聚合物多孔質膜可在細胞培養基中成為漂浮的狀態，但附著有細胞的小片聚合物多孔質膜，會在培養基中迅速下降而互相多重聚積並沉入細胞培養容器的底部而維持此狀態。

又，因為可輕易調整收納有小片聚合物多孔質膜的細胞培養容器（例如上述細胞培養裝置的培養槽）中的培養基之高度（培養基水位），因此例如可藉由提高培養基水位來提升喜好低氧環境之間葉系幹細胞的培養效率。

本發明的細胞培養法，無須以攪拌機等積極使培養基振盪，以及小片聚合物多孔質膜以分散及/或多重聚積的狀態沉入細胞培養容器的底部，因此例如在使用溢流型生物反應器的培養系中，可持續供給新鮮的培養基，另一方面可因應所供給之培養基的量，從設於培養槽的培養基排出口連續地回收細胞培養後的培養基，因此可實現長期細胞培養。這在使用間歇型生物反應器的情況亦相同，可以既定的時間間隔供給新鮮的培養基，並且定期回收細胞培養後的培養基，而能夠進行長期細胞培養。

又，藉由一邊持續進行細胞培養，一邊對於細胞培養容器加注未載持細胞的新鮮小片聚合物多孔質膜，細胞會移動至新加注的小片聚合物多孔質膜並接著於其上，而可進一步增殖（擴大培養）。

如此，本發明的細胞培養法中，藉由使用小片聚合物多孔質膜，培養基的流通性變得良好，而可培養大量的細胞。伴隨於此，可增加預期物質（蛋白質、胞外體等）的產量。如後述實施例1所示，可知已接種至小片聚合物多孔質膜的人類間葉系幹細胞順利增殖，如實施例2所示，對於相同細胞進行長期培養的結果，長期穩定地產生來自該細胞的胞外體。

D.用於細胞培養法的套組 本發明更提供一種包含小片聚合物多孔質膜的、用於細胞培養法的套組。本發明的套組，除了小片聚合物多孔質膜以外，亦可適當包含細胞培養所需的構成要件。例如包含應用於小片聚合物多孔質膜的細胞、細胞培養基、細胞培養裝置、套組的操作說明書等。雖未限定，但作為一態樣，包含具有將經滅菌之小片聚合物多孔質膜保存於透明袋（Pouch）內並可直接用於細胞培養之形態的套件（package）、或是將小片聚合物多孔質膜與滅菌液體一起封入同一袋內而能夠有效率地吸入接種的膜/液體成為一體之形態的套組。

定義 本說明書中，「懸浮的細胞」，例如包含：藉由胰蛋白酶等蛋白質分解酵素，強制使接著細胞漂浮而在培養基中懸浮所得到的細胞，以及藉由習知的馴化步驟而能夠在培養基中漂浮培養的接著細胞等。

可用於本發明的細胞之種類，例如，可選自由動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母菌及細菌所構成之群組。動物細胞大致分為源自屬於脊椎動物門之動物的細胞與源自無脊椎動物（屬於脊椎動物門之動物以外的動物）的細胞。本說明書中，動物細胞的來源並未特別限定。較佳係指源自屬於脊椎動物門之動物的細胞。脊椎動物門，包含無頜上綱（Agnatha）與有顎上綱（Gnathostomata），有顎上綱包含哺乳綱、鳥綱、兩生綱、爬蟲綱等。一般而言，較佳為源自哺乳動物這種屬於哺乳綱之動物的細胞。哺乳動物並未特別限定，較佳為包含小鼠（mouse）、大鼠（rat）、人類、猿猴、豬、狗、綿羊、山羊等。

可用於本發明的動物細胞之種類並未限定，但較佳為選自由多功能幹細胞、組織幹細胞、體細胞、及生殖細胞所構成之群組。

本說明書中「多功能幹細胞」係意指具有可分化為所有組織細胞之能力（多潛能性（multipotency））的幹細胞的統稱。雖未限定，但多功能幹細胞包含胚胎幹細胞（ES細胞）、人工誘導多能幹細胞（iPS細胞）、胚胎生殖幹細胞（EG細胞）、生殖幹細胞（GS細胞）等。較佳為ES細胞或iPS細胞。iPS細胞因為無倫理上之問題的理由而特佳。作為多功能幹細胞，可使用習知的任一者，例如可使用國際公開第2009/123349號（PCT/JP2009/057041）之多功能幹細胞。

「組織幹細胞」係指可分化的細胞系列雖限定於特定組織但仍具有可分化為多樣細胞種類之能力（多潛能性）的幹細胞。例如骨髓中的造血幹細胞成為血球的來源，神經幹細胞分化為神經細胞。除此之外，具有製作肝臟的肝臟幹細胞、成為皮膚組織的皮膚幹細胞等各個種類。組織幹細胞較佳為選自間葉系幹細胞、肝臟幹細胞、胰臟幹細胞、神經幹細胞、皮膚幹細胞、或造血幹細胞。

「體細胞」係指構成多細胞生物的細胞之中除了生殖細胞以外的細胞。在有性生殖中，無法遺傳給下一代。體細胞較佳係選自肝臟細胞、胰臟細胞、肌肉細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、纖維母細胞、胰臟細胞、腎臟細胞、肺臟細胞或淋巴球、紅血球、白血球、單核球、巨噬細胞或巨核球的血球細胞。

「生殖細胞」係指具有在生殖中將遺傳訊息傳遞給下一代之功能的細胞。例如包含用於有性生殖的配子（Gametes），亦即卵子、卵細胞、精子、精細胞、用於無性生殖的胞子等。

細胞亦可選自肉瘤細胞、株化細胞（established cell）及轉型細胞（transformed cell）所構成之群組。「肉瘤」係指在源自骨、軟骨、脂肪、肌肉、血液等非上皮性細胞的結締組織細胞發生的癌，包含軟部肉瘤、惡性骨腫瘤等。肉瘤細胞係源自肉瘤的細胞。「株化細胞」係長期在體外維持、具有一定的穩定性質而能夠半永久繼代培養的培養細胞。存在下述細胞株：PC12細胞（源自大鼠副腎髓質）、CHO細胞（源自中國倉鼠卵巢）、HEK293細胞（源自人類胎兒腎臟）、HL-60細胞（源自人類白血球細胞）、HeLa細胞（源自人類子宮頸癌）、Vero細胞（源自非洲綠猴腎臟上皮細胞）、MDCK細胞（源自狗腎臟尿細管上皮細胞）、HepG2細胞（源自人類肝癌的細胞株）、BHK細胞（新生倉鼠腎臟細胞）、NIH3T3細胞（源自小鼠胎兒纖維母細胞）等源自包含人類的各種生物之各種組織的細胞株。「轉型細胞」意指從細胞外部導入核酸（DNA等）而使遺傳性質變化的細胞。

本說明書中，「接著細胞」，一般係為了增殖而必須使自身接著於適當表面上的細胞，亦稱為附著細胞或錨定依賴性細胞（anchorage-dependent cell）。本發明的數個實施型態中所使用之細胞為接著細胞。本發明中所使用的細胞為接著細胞，更佳為即使在培養基中懸浮的狀態下亦可進行培養的細胞。可進行懸浮培養的接著細胞，可藉由習知的方法將接著細胞馴化至適合懸浮培養之狀態而得，可列舉例如：CHO細胞、HEK293細胞、Vero細胞、NIH3T3細胞等，以及由此等細胞衍生所得到的細胞株。

本發明的細胞培養法中，將細胞應用於小片聚合物多孔質膜並進行培養，藉此大量的細胞在小片聚合物多孔質膜所具有的內部之多面向的連結多孔部分及表面進行培育，而能夠簡便地培養大量的細胞。又，提供一種本發明中所使用的接種至小片聚合物多孔質膜的細胞即使在以往導致死亡的攪拌條件中亦能夠進行培育的環境，而可大量地培養細胞。

本說明書中，不含細胞的小片聚合物多孔質膜包含其內部間隙之體積在內，其在空間中所占的體積稱為「外觀上的小片聚合物多孔質膜體積」。然後，將細胞應用於小片聚合物多孔質膜，小片聚合物多孔質膜的表面及內部載持有細胞的狀態下，小片聚合物多孔質膜、細胞、及浸潤至小片聚合物多孔質膜內部的培養基，整體在空間中占的體積稱為「包含細胞生存區域的小片聚合物多孔質膜體積」。膜厚為25μm的小片聚合物多孔質膜的情況，包含細胞生存區域的小片聚合物多孔質膜體積，其值最多比外觀上的聚合物小片聚合物多孔質膜多出50%左右。本發明的方法中，1個細胞培養容器中可收納多個（至少2個，例如，3、4、5、10、20、30、40、50、100、500、1×10³ 、2×10³ 、3×10³ 、4×10³ 、5×10³ 、7×10³ 、1×10⁴ 、2×10⁴ 、3×10⁴ 、5×10⁴ 、7×10⁴ 、1×10⁵ 、2×10⁵ 、3×10⁵ 、5×10⁵ 、7×10⁵ 、1×10⁶ 、2×10⁶ 、3×10⁶ 、5×10⁶ 、7×10⁶ 、1×10⁷ 個或超過此等）小片聚合物多孔質膜並進行培養，但此情況中，有時僅將「針對各載持有細胞的多個小片聚合物多孔質膜而言包含細胞生存區域之小片聚合物多孔質膜體積的總和」記載為「包含細胞生存區域之小片聚合物多孔質膜體積的總和」。

藉由使用本發明的方法，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存區域之小片聚合物多孔質膜體積之總和的10000倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。又，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基之總體積為包含細胞生存區域之小片聚合物多孔質膜體積之總和的1000倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。再者，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存區域之小片聚合物多孔質膜體積之總和的100倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。然後，即使在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的總體積為包含細胞生存域之小片聚合物多孔質膜體積之總和的10倍或比其更少的條件下，亦可長期良好地培養細胞。

亦即，根據本發明，培養細胞的空間（容器）相較於進行以往二維培養的細胞培養裝置，可小型化至極限。又，欲增加所培養之細胞數量的情況，藉由增加所積層之小片聚合物多孔質膜的片數等簡便的操作，即可彈性地增加培養細胞的體積。只要是具備本發明中所使用的小片聚合物多孔質膜的細胞培養裝置，即可將以培養細胞的空間（容器）與儲存細胞培養基的空間（容器）分離，而能夠因應欲培養之細胞數量準備所需之量的細胞培養基。儲存細胞培養基的空間（容器），可因應目的大型化或小型化，或亦可為可替換的容器，並未特別限定。

本說明書中，細胞的「大量培養」，例如，使用小片聚合物多孔質膜進行培養後細胞培養容器中所包含的細胞之數量，就細胞全部均勻分散在細胞培養容器中所包含的細胞培養基的情況而言，係指在培養基每一公升中，培養至成為1.0×10⁵ 個以上、1.0×10⁶ 個以上、2.0×10⁶ 個以上、5.0×10⁶ 個以上、1.0×10⁷ 個以上、2.0×10⁷ 個以上、5.0×10⁷ 個以上、1.0×10⁸ 個以上、2.0×10⁸ 個以上、5.0×10⁸ 個以上、1.0×10⁹ 個以上、2.0×10⁹ 個以上、或5.0×10⁹ 個以上為止。

另外，作為測量培養中或培養後之細胞數量的方法，可使用各種習知的方法。例如，作為在細胞完全均勻分散於細胞培養容器中所包含之細胞培養基的情況下測量使用小片聚合物多孔質膜進行培養後細胞培養容器中所包含的細胞之數量的方法，可適當使用習知的方法。例如，可理想地採用使用了CCK8（參照下述內容）的細胞數量測量法。具體而言，使用Cell Countinig Kit8；同仁化學研究所製溶液試藥（以下記載為「CCK8」），測量未使用小片聚合物多孔質膜的一般培養中的細胞數量，求出吸光度與實際的細胞數量的相關係數。之後，將應用了細胞並進行培養的小片聚合物多孔質膜移至包含CCK8的培養基，在恆溫箱內保存1～3小時，取出上清液，以460nm的波長測量吸光度，從先前求出的相關係數計算細胞數量。

又，從另一觀點來看，細胞的「大量培養」，係指例如，在使用小片聚合物多孔質膜進行培養後，小片聚合物多孔質膜每一平方公釐所包含的細胞數量培養至成為1.0×10³ 個以上、2.0×10³ 個以上、1.0×10⁴ 個以上、2.0×10⁴ 個以上、5.0×10⁴ 個以上、1.0×10⁵ 個以上、2.0×10⁵ 個以上、5.0×10⁵ 個以上、1.0×10⁶ 個以上、2.0×10⁶ 個以上、或5.0×10⁶ 個以上為止。小片聚合物多孔質膜每一平方公分所包含的細胞數量，可使用上述的CCK8等習知的方法適當測量。

本說明書中所提及的所有文獻，其整體內容藉由引用而納入本說明書。

以下說明的本發明之實施例其目的僅為例示，並未限定本發明的技術範圍。本發明的技術範圍僅由申請專利範圍的記載所限定。在不脫離本發明之主旨的條件下，可進行本發明的變更，例如本發明之構成要件的追加、削除及取代。 [實施例]

以下，根據實施例更具體說明本發明。另外，本發明不限於此等實施例。本領域從業者可根據本說明書之記載輕易對於本發明進行修飾、變更，此等皆包含於本發明的技術範圍。

以下的實施例中，小片聚合物多孔質膜的製作中所使用的聚醯亞胺多孔質膜係藉由下述方法製備：在使包含由作為四羧酸成分的3,3’,4,4’-聯苯四羧酸二酐（s-BPDA）與作為二胺成分的4,4’-二胺基二苯醚（ODA）所得之聚醯胺酸溶液與作為著色前驅物之聚丙烯醯胺的聚醯胺酸溶液組成物成形後，以250℃以上進行熱處理。所得之聚醯亞胺多孔質膜，係包含具有多個孔的表面層A及表面層B以及夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之聚醯亞胺多孔質膜，存在於表面層A的孔的平均孔徑為19μm，存在於表面層B的孔的平均孔徑為42μm，膜厚為25μm，空孔率為74%。

實施例1：使用小片聚合物多孔質膜培養人類間葉系幹細胞的方法及產生胞外體 （1）小片聚醯亞胺多孔質膜的製作 準備塚谷刃物製作所製Flexible Pinnacle Die AP型沖孔用；1mm×1mm（刀刃規格參照下述），以磁力固定於磁板上，使用簡易式沖孔機（RDC FB型），對於宇部興產製聚醯亞胺多孔質膜（厚度25μm）進行切斷加工，藉此準備1mm×1mm的小片聚醯亞胺多孔質膜。 刀刃規格 刀刃高度 0.8mm 刀刃深度 0.4mm 蝕刻深度 0.6mm 基板厚度 0.2mm 刀刃角度 40°

（2）間葉系幹細胞的準備與接種至小片聚醯亞胺多孔質膜 使LONZA公司製人類間葉系幹細胞（Poietics（商標））在IWAKI製膠原蛋白型1塗布碟上進行兩次繼代，並進行胰蛋白酶處理，使細胞（4.0×10⁶ 個細胞）在培養基（KOHJIN BIO公司製Xeno-Free培養基；ADSC-4 4ml）中懸浮。在Corning製150ml滅菌瓶內，在以事先經過滅菌的相同培養基50ml進行潤濕並在恆溫箱內振盪懸浮30分鐘後的聚醯亞胺多孔質膜小片（200cm² ）上加注上述細胞培養。加注後，數次搖動後，於CO₂ 恆溫箱內靜置以開始培養。

（3）培養的持續 以2天或3天1次的頻率，更換在上述培養基（ADSC-4）中加入1000mg/L之葡萄糖而成的培養基50ml，持續培養18天。培養過程中，持續測量葡萄糖消耗量與乳酸產生量，確認了細胞增殖順利（圖1）。

（4）小片聚醯亞胺多孔質膜上的細胞數量確認與從小片多孔質膜回收細胞 在開始培養18天後，利用由同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8而來的顯色反應，驗證在小片聚醯亞胺多孔質膜上培育的細胞數量，結果培育的總細胞數為4.6×10⁶ 個細胞。對於其上培育有細胞的片加注25ml的Thermo Fisher Scientific公司製TrypLE（商標），在恆溫箱內放置50分鐘後回收懸浮液，再以TrypLE（商標）10ml洗淨小片，實施細胞回收。所回收之細胞數量為2.3×10⁶ 個細胞（細胞回收率50%）。所回收之細胞，可在膠原蛋白塗布碟上進行培養。

（5）胞外體數量的測量 使用高速冷卻離心機（久保田商事股份有限公司製，Model 6000），於4℃以10,000g對於所回收之細胞培養液進行離心分離30分鐘，去除殘渣（製備液1）。以藉由使用了0.025μm的過濾器（MERCK公司製，產品名稱：MF-Millipore Membrane filter，型號：VSWP04700）的吸引過濾去除微粒子的PBS（-）（Fuji Film Wako Pure Chemical股份有限公司製，原販售編號：166-23555），用以將「製備液1」稀釋成既定的濃度（製備液2）。接著對於「製備液2」使用0.2μm的針筒過濾器（Sartorius公司製，產品名稱：Minisart，型號：16534K）去除200nm以上的粒子（製備液3）。使用界面電位（zeta-potential）･粒徑分布測量裝置（Microtec股份有限公司製，ZEECOM ZC-3000），從布朗運動軌跡解析，測量「製備液3」所包含的粒子的粒徑分布及胞外體畫分的粒子數。以下示的「式1」算出每一日的胞外體產生量。 式1：粒子數×樣本稀釋倍率×150nm以下之粒子的比例/培養基留置天數

實施例2 （1）使用小片聚醯亞胺多孔質膜的長期培養 使用與實施例1相同的方法進行人類間葉系幹細胞的長期培養，經時地回收培養基以取得胞外體。整個培養期間皆可取得穩定的胞外體（圖2）。培養開始後76天的總細胞數為4.82×10⁶ 個細胞。實驗期間的細胞數量變化顯示於圖3。

（2）小片聚醯亞胺多孔質膜上之細胞的幹性驗證 為了驗證以小片聚醯亞胺多孔質膜進行培養的人類間葉系幹細胞的幹性，回收一部分期間不同的培養樣本，實施分化誘導而成為脂肪細胞及成骨細胞。結果顯示於圖4。確認整個培養期間皆維持幹性。

比較例1：使用人類間葉系幹細胞的聚合物多孔質膜的培養法 （1）使用1cm見方的聚醯亞胺多孔質膜之情況的培養 準備200片1cm見方的聚醯亞胺多孔質膜代替實施例1之1mm見方的小片聚醯亞胺多孔質膜，以相同細胞密度將與實施例1的實驗相同的細胞接種，實施比較實驗。18天後的培養總細胞數量為3.0×10⁶ 個細胞。

（2）從1cm見方的聚醯亞胺多孔質膜回收間葉系幹細胞 與實施例1相同地使用TrypLE（商標）進行細胞回收實驗，所回收之細胞數量為1.0×10⁶ 細胞（細胞回收率33%）。

（3）代謝方面的比較 實施例1及比較例1的葡萄糖消耗的比較資料顯示於圖1。確認在整個培養期間，以小片聚醯亞胺多孔質膜所進行的培養中大量消耗葡萄糖。

實施例3：使用小片聚醯亞胺多孔質膜培養人類皮膚纖維母細胞的方法 （1）皮膚纖維母細胞的準備與細胞接種 使用胰蛋白酶將在60cm² 培養皿中進行培養的人類成人皮膚纖維母細胞剝離、回收，加入LIFELINE公司製Xeno-Free培養基FibroLife 3ml，準備細胞懸浮液（3.0×10⁶ 個細胞）。將上述細胞培養加注於以事先經過滅菌的相同培養基25ml進行潤濕並且在恆溫箱內振盪懸浮30分鐘後的聚醯亞胺多孔質膜小片（300cm² ）。加注後，數次搖動後，於CO₂ 恆溫箱內靜置以開始培養。

（2）皮膚纖維母細胞的小片聚醯亞胺多孔質膜培養 每2天或3天更換培養基，15天以後實施每天更換培養基。使用了CCK8的顯色所得到的總細胞數量之變化顯示於圖5。觀測到穩定的細胞成長。

實施例4：使用小片聚醯亞胺多孔質膜間歇式培養融合瘤（hybridoma）的方法 （1）融合瘤的準備與接種至小片多孔膜 在Corning公司製細胞培養碟（Falcon（商標））及Thermo Fisher Scientific公司製125mL 錐形燒瓶使JCRB cell bank製融合瘤（SC78.H81.C81.A9）八次繼代（在Fuji Film Wako Pure Chemical公司製RPMI-1640中添加Gibco（商標）製ES Cell FBS 10%的培養基四次繼代後，再以於Thermo Fisher Scientific公司製無血清培養基CD Hybridoma中添加Thermo Fisher Scientific公司製GlutaMax（商標）8mM而成的培養基進一步四次繼代），準備活細胞密度1.17×10⁶ 個細胞/mL（活細胞率：87%）的漂浮細胞液。在滅菌的情況下將經過精製水潤濕的1×1mm小片多孔膜120cm² 的γ線滅菌體移送至Thermo Fisher Scientific公司製125mL 錐形燒瓶（型號；4115-0125），加注10mL的上述培養基（添加8mM GlutaMax（商標）的CD Hybridoma），於CO₂ 恆溫箱內振盪30分鐘，完成膜的潤濕。之後，將上述培養基排出去除，完成在錐形燒瓶槽內準備潤濕膜。在槽內加注上述細胞懸浮液20mL，數次搖晃後，於CO₂ 恆溫箱內靜置1天，完成細胞的小片多孔膜吸附步驟。將殘留於槽內的液體部分全數排出去除，加注20mL的上述培養基（添加了8mM GlutaMax（商標）的CD Hybridoma），靜置於CO₂ 恆溫箱內以開始培養。

（2）代謝物及抗體產生量的測量 開始培養後，在第2天與第6天少量採樣細胞培養液，使用Roche公司製CedexBio，測量培養液中的葡萄糖濃度、乳酸濃度及抗體產生量，驗證代謝狀況。確認良好的細胞棲息與增殖（表2），又確認有效率地產生抗體。顯示了能夠以小片多孔膜培養融合瘤，而能應用於連續產生抗體。

[表2]

培養期間（天）	GLC(mg/L)	LAC(mg/L)	MIgG(mg/L)
2	3357	126	4.76
6	2162	1497	27.53

（3）測量小片多孔膜的細胞數量 以Fuji Film Wako Pure Chemical公司製Ham’s F-12培養基（含有麩醯胺酸･酚紅）10mL將對於培養天數第6天的小片多孔膜洗淨2次以去除漂浮細胞後，藉由使用了同仁化學研究所股份有限公司製的Cell Counting Kit-8所形成的顯色反應測量接著於小片多孔膜的活細胞密度，以1.64×10³ 個細胞/cm² 的細胞密度，觀察到總數為1.97×10⁵ 個細胞的活細胞。確認在小片多孔膜上接著、棲息有不會因為洗淨而輕易剝離的細胞。

實施例5：使用小片聚醯亞胺多孔質膜間歇式培養融合瘤的方法 （1）融合瘤的準備與接種至小片多孔膜 以與實施例新1相同的方法準備細胞及小片多孔膜，加注至培養槽後，於CO₂ 恆溫箱內，在Thermo Fisher Scientific公司製振盪機（MaxQ 200 CO2Plus）上，以50rpm振盪24小時，之後轉移至靜置培養。轉移後以與實施例4相同的操作實施培養。

（2）代謝物及抗體產生量的測量 以與實施例4相同的方法取得樣本，測量代謝物及所產生之抗體量，確認細胞的棲息與良好的增殖。確認優良的抗體產生力（表3）。經過使用了運動條件的細胞吸附過程，藉此確認更有效率地實施小片多孔膜培養，而能夠應用於有效率的抗體產生等。

[表3]

培養期間（天）	GLC(mg/L)	LAC(mg/L)	MIgG(mg/L)
2	3305	192	5.38
6	1682	1972	43.43

（3）測量小片多孔膜的細胞數量 以與實施例4相同的方法，測量接著於小片多孔膜的活細胞密度，結果以1.41×103個細胞/cm² 的細胞密度，觀察到總數為1.70×10⁵ 個細胞的活細胞。確認融合瘤在不會因為多次洗淨而輕易剝離的狀態下接著、棲息於小片多孔膜。

實施例6：小片聚醯亞胺多孔質膜連續培養法_融合瘤 （1）融合瘤的準備與接種至小片多孔膜 在Corning公司製細胞培養碟（Falcon（商標））及Thermo Fisher Scientific公司製125mL的錐形燒瓶中使JCRB cell bank製融合瘤（SC78.H81.C81.A9）進行十次繼代（以添加FBS 10%的RPMI-1640培養基進行四次繼代後，以添加8mM GlutaMax（商標）的CD Hybridoma培養基進行六次繼代）而進行漂浮細胞培養，以準備活細胞密度1.11×10⁶ 個細胞/mL（活細胞率：78%）的漂浮細胞液。將上述細胞懸浮液20mL加注於填充有經過精製水潤濕的1×1mm小片多孔膜120cm² 之滅菌體的如圖7所示之溢流反應器。加注後，將培養槽部分搖晃數次後，在CO₂ 恆溫箱內靜置30分鐘而開始培養。又，圖8所示的裝置亦可相同地使用。

（2）實施連續培養 以每1天約20mL的頻率，將上述培養基（添加8mM GlutaMax（商標）的CD Hybridoma）連續供給至反應器內，利用排出泵（AS ONE製管泵）控制液面高度，藉此一邊將培養槽內的培養基量保持於定值，一邊連續地回收培養基。

相同地，使用圖8之裝置的情況，在具有圖式右側之泵的情況作為排出泵，在沒有的情況（圖6）則是自然流出，而能夠以相同的液面控制，以固定量的槽內培養基保持穩定的培養環境。

（3）代謝物的測量 以1天1次的頻率回收所排出之培養液，使用Roche公司製CedexBio，測量回收液中的葡萄糖濃度、乳酸濃度及抗體產生量。結果顯示於表4。確認整個培養期間，穩定且有效率地消耗葡萄糖並產生乳酸，同時穩定且連續地產生良好的抗體。

[表4]

培養期間（天）	回收液量	GLC(mg/L)	LAC(mg/L)	MIgG(mg/L)
1	25	2029	1365	26.10
2	12	2338	1240	21.99
3	24	2748	918	16.05
4	15	2683	995	17.92
5	15	2565	1126	21.04

（4）測量小片多孔膜的細胞數量 在培養天數第5天將反應器內的培養基去除，以Fuji Film Wako Pure Chemical公司製Ham’s F-12培養基（含有麩醯胺酸･酚紅）10mL將殘留的小片多孔膜洗淨2次，去除可能從表面脫離的漂浮細胞後，藉由使用了同仁化學研究所股份有限公司製的Cell Counting Kit-8的顯色反應來測量細胞數量。若以此方法測量細胞密度，確認以1.46×10³ 個細胞/cm² ，總數為1.75×10⁵ 細胞的活細胞以即使洗淨亦不會輕易剝離的狀態接著、棲息於小片多孔膜。

實施例7：藉由小片聚醯亞胺多孔質膜上的皮膚纖維母細胞產生蛋白質 （1）小片多孔膜準備與細胞培養 以Corning公司製細胞培養Falcon dish使人類皮膚纖維母細胞（LONZA公司製；Lot.No.18TL215675）進行五次繼代，進行胰蛋白酶處理，使細胞（1.2×10⁶ 個細胞）在培養基（LONZA公司製FGM-2 BulletKit 1.2ml）中懸浮。在Corning製125ml滅菌瓶內，事先以D-PBS（Fuji Film Wako Pure Chemical股份有限公司）50ml在經過滅菌的恆溫箱內進行潤濕，去除D-PBS後，以上述的培養基（LONZA公司製FGM-2 BulletKit）加注10ml，在恆溫箱內使其潤濕30分鐘後，對於聚醯亞胺小片多孔質膜（120cm² ）加注上述細胞懸浮液1.2ml。加注後，數次搖晃後，於CO₂ 恆溫箱內靜置一晩。隔天以上述培養基（LONZA公司製FGM-2 BulletKit）加注20ml並靜置而開始培養。

（2）持續培養 以每週1次的頻率更換上述培養基（FGM-2 BulletKit）30ml，持續培養18天。培養過程中，持續測量葡萄糖消耗量與乳酸產生量，確認了細胞增殖順利。

（3）測量纖網蛋白（fibronectin）產生量 使用所回收之細胞培養液，使用Fibronectin ELISA kit（Takara製 Cat：MK115）測量第5天、第13天、第18天的纖網蛋白產生量。結果顯示於表5。

[表5]

培養期間 （天）	細胞密度 （細胞/cm2 ）	纖網蛋白產生量 （ng/ml/day）
5	3.0 x 104	526
13	6.4 x 104	747
18	7.1 x 104	1008

實施例8：軟骨細胞的小片多孔膜培養 準備放入有已滅菌之聚醯亞胺多孔質膜小片（1mm×1mm）120cm² 的Corning公司製125ml方型PET製儲存瓶（附45mm蓋）。在該放入有小片多孔膜的方型滅菌瓶中，對於培養基（KOHJIN BIO公司製Xeno-Free培養基；KBM ADSC-4R）加注葡萄糖液（Fuji Film Wako Pure Chemical股份有限公司製；45w/v% D（+）-葡萄糖溶液），並加注總葡萄糖濃度調整為3000mg/L的調整培養基30ml，使小片充分適應培養基。

使用Gibco公司製Trypsin-EDTA（0.05%）、酚紅將在IWAKI 膠原蛋白I塗布碟進行培養的第四次繼代之PromoCell公司製人類軟骨細胞（Y30 female_439Z037.3）剝離，進行離心、細胞回收後，在該調整培養基（加注葡萄糖的KBM ADSC-4R）中懸浮。以每1ml為1.0×10⁶ 個細胞的懸浮細胞密度加注聚醯亞胺多孔質膜小片的面積每1cm² 為1.0×10⁴ 個細胞（Total；1.2×10⁶ 個細胞）的細胞懸浮液。加注後，將包含小片多孔膜的培養槽方型瓶移送至CO₂ 恆溫箱內，開始靜置培養。

以每週2次的頻率更換30ml的培養基，持續培養。在第8天、第15天、第20天、第35天，利用同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成的顯色反應，測量在多孔膜小片培育的總細胞數。增殖狀況顯示於圖9。確認人類軟骨細胞良好的細胞培育狀況。顯示了以小的培養容器進行靜置培養，可簡便且輕易地長期穩定培養大量的細胞。

又，以源自人類之胞外體定量用CD9/CD63ELISA 套組（Cosmo Bio公司製；產品編號_EXH0102EL），將胞外體產生量作為CD63的蛋白質量，測量在培養第19天回收的培養基內的胞外體產生量，結果確認留置3天的情況中，產生了117pg/ml的胞外體。即使與該連續培養系統相同地在間歇培養系統中進行，亦可有效率的且穩定地產生胞外體。

實施例9：人類皮膚纖維母細胞的小片多孔膜培養與細胞回收 （1）小片多孔膜準備與細胞準備 將經過滅菌的聚醯亞胺小片多孔質膜（300cm² ）在滅菌的情況下移至Sumitomo Bakelite公司製50ml離心管（螺蓋錐形管）內，加注PBS12ml以使膜潤濕。1小時後吸引去除PBS，完成膜的準備。

在Corning公司製細胞培養Falcon dish中使人類皮膚纖維母細胞（LONZA公司製；Lot.No.18TL215675）進行兩次繼代，進行胰蛋白酶處理，使細胞（3.0×10⁶ 細胞）在培養基（Lifeline公司製FibroLife® Fibroblast Serum Free Medium Complete Kit 2.0ml）中加入葡萄糖液而調整至2000mg/L的培養基中懸浮。

（2）細胞接種及細胞培養 對於離心管內事先準備的小片多孔膜加入該培養基10ml及上述懸浮細胞，數次和緩地搖晃後，於CO₂ 恆溫箱內放置整晚。隔天，將吸附有細胞的小片聚醯亞胺多孔質膜移送至Corning製150ml滅菌瓶內，再加入20ml的培養基，開始培養。以每週2次的頻率更換培養基（容量30ml），在第2天、第6天、第9天、第14天，利用藉由同仁化學研究所製Cell Counting Kit-8所形成的顯色反應，測量在多孔膜小片中進行培育的總細胞數。測量在各測量日的瓶內於小片聚醯亞胺多孔質膜上培育的人類皮膚纖維母細胞每1cm² 的細胞密度及瓶內的總細胞數量，確認細胞的培育狀況。結果顯示於表6。

[表6]

天數	2	6	9	14
細胞密度 （cells/cm2 ）	7.7 x 103	1.4 x 104	2.5 x 104	2.4 x 104
總細胞數 （cells）	2.3 x 106	4.3 x 106	7.4 x 106	7.3 x 106

（3）從小片多孔膜回收細胞與繼代 在培養開始後第15天，排除瓶內的培養基，以PBS20ml洗淨瓶內的小片多孔膜後，吸引排除該PBS。然後，加注15ml的Thermo Fisher Scientific公司製TrypLE Express（商標），於CO₂ 恆溫箱內放置40分鐘。回收細胞游離而白濁的上清液，再以該培養基25ml洗淨小片多孔膜，回收游離細胞。離心分離後以該培養基3ml使其懸浮，測量細胞數量，確認到3.6x10⁶ 個活細胞。將回收的本細胞接種至培養盤及小片聚醯亞胺多孔質膜，確認細胞的培育。

1a:細胞培養裝置 10:培養槽 100:培養槽本體 101:培養基排出口 102:側部 103:底部 104:排出口連接器 110:培養槽蓋體 111:第一蓋體連接器 112:第一培養基供給管 113:培養基供給口 114:第一通氣管 115:第一通氣過濾器 120:培養後的培養基 121:培養基水位 200a:小片聚合物多孔質膜 30:第二培養基供給管 31:第三培養基供給管 32:泵 40:培養基供給槽 400:新鮮培養基 41:培養基供給槽蓋體 410:第二蓋體連接器 411:第二通氣管 412:第二通氣過濾器 50、51:培養基排出管 52:導件 60:培養基回收槽 61:培養基回收槽蓋體 610:第三蓋體連接器 611:第三通氣管 612:第三通氣過濾器 70:培養槽設置台

圖1係顯示使用小片聚醯亞胺多孔質膜（1mm見方）及非小片聚醯亞胺多孔質膜（1cm見方）進行培養的情況中，人類間葉系幹細胞的葡萄糖消耗經時變化的圖。 圖2係顯示從使用小片聚醯亞胺多孔質膜進行培養的人類間葉系幹細胞長期產生胞外體的圖。 圖3係顯示人類間葉系幹細胞的細胞數量經時變化的圖。 圖4係顯示使用小片聚醯亞胺多孔質膜進行培養的人類間葉系幹細胞之幹性驗證結果的圖（左：脂肪細胞的分化誘導（左欄）；右：分化誘導為成骨細胞及其石灰化）。 圖5係顯示使用小片聚醯亞胺多孔質膜進行培養的人類皮膚纖維母細胞其細胞數量之經時變化的圖。 圖6係顯示例示性的溢流型生物反應器的圖。 圖7係顯示例示性的溢流型生物反應器的圖及影像。 圖8係顯示例示性的溢流型生物反應器的圖。 圖9係顯示使用小片聚醯亞胺多孔質膜進行培養的軟骨細胞其細胞行為（細胞密度及細胞行為）之經時變化的圖。

Claims (14)

1. 一種細胞培養法，包含將細胞應用於小片聚合物多孔質膜並進行培養的步驟且不需要攪拌， 其中該小片聚合物多孔質膜，係包含具有多個孔的表面層A及表面層B、以及夾在該表面層A及表面層B之間的巨孔層的三層結構之小片聚合物多孔質膜；其中存在於該表面層A的孔的平均孔徑小於存在於該表面層B的孔的平均孔徑，該巨孔層具有將該表面層A及B連結的分隔壁與由該分隔壁以及該表面層A及B所圍住的多個巨孔，該表面層A及B中的孔與該巨孔連通； 該表面層A或表面層B的面積在4mm² 以下， 培養液中，該小片聚合物多孔質膜分散及/或小片聚合物多孔膜彼此多重聚積，而在細胞培養容器的底部分散及/或積層。
2. 如請求項1之細胞培養法，其中藉由間歇或連續地更換培養基以進行長期培養。
3. 如請求項1或2之細胞培養法，其中使接著於該小片聚合物多孔質膜的細胞增殖後，藉由酵素處理將細胞剝離，再將未接著有細胞的小片聚合物多孔質膜添加至細胞培養容器，藉此使細胞繼代以進行大量培養。
4. 如請求項1至3中任一項之細胞培養法，其中該小片聚合物多孔質膜具有平均孔徑0.01～100μm的多個細孔。
5. 如請求項1至4中任一項之細胞培養法，其中該表面層A的平均孔徑為0.01～50μm。
6. 如請求項1至5中任一項之細胞培養法，其中該表面層B的平均孔徑為20～100μm。
7. 如請求項1至6中任一項之細胞培養法，其中該小片聚合物多孔質膜的總膜厚為5～500μm。
8. 如請求項1至7中任一項之細胞培養法，其中該小片聚合物多孔質膜為小片聚醯亞胺多孔質膜。
9. 如請求項8之細胞培養法，其中該小片聚醯亞胺多孔質膜係包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯亞胺的小片聚醯亞胺多孔質膜。
10. 如請求項8或9之細胞培養法，其中該小片聚醯亞胺多孔質膜係將包含由四羧酸二酐與二胺所得之聚醯胺酸溶液與著色前驅物之聚醯胺酸溶液組成物成形後，於250℃以上進行熱處理而藉此得到的經著色之小片聚醯亞胺多孔質膜。
11. 如請求項1至10中任一項之細胞培養法，其中包含藉由細胞產生胞外體的步驟。
12. 一種細胞培養裝置，其包含小片聚合物多孔質膜，並用於如請求項1至11中任一項之細胞培養法。
13. 一種套組，其包含小片聚合物多孔質膜，並用於如請求項1至11中任一項之細胞培養法。
14. 一種胞外體，藉由如請求項1至11中任一項之細胞培養法取得。

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