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TW202111126A - 用於治療聖菲利柏氏病及其他病症之組合物及方法 - Google Patents

用於治療聖菲利柏氏病及其他病症之組合物及方法 Download PDF

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TW202111126A
TW202111126A TW109124350A TW109124350A TW202111126A TW 202111126 A TW202111126 A TW 202111126A TW 109124350 A TW109124350 A TW 109124350A TW 109124350 A TW109124350 A TW 109124350A TW 202111126 A TW202111126 A TW 202111126A
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TW109124350A
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艾契 凱倫 皮內特
麥克 奧克米耶
奧利維爾 達諾斯
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法商利索基因公司
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Abstract

本揭示內容提供可用於治療遺傳性疾病、腦病症及神經疾病及病症之新穎載體及方法，包括基因療法載體及對有此需要的個體投與此類基因療法載體之方法。

Description

用於治療聖菲利柏氏病及其他病症之組合物及方法
在一些實施例中，本發明係關於基因療法載體，以及單獨或與一或多種免疫抑制劑組合使用此類基因療法載體治療遺傳性疾病(包括溶酶體儲積症及腦疾病及病症)之方法。
III型黏多醣病(MPSIII)(亦稱為聖菲利柏氏(Sanfilippo)症候群)係一種屬於黏多醣病(MPS)之群之罕見溶酶體儲積症(LSD)。此等溶酶體儲積症(LSD)係由消化蛋白質缺失或功能障礙引起，導致隨後受質積聚在細胞中，導致極嚴重的細胞及器官功能障礙。黏多醣或糖胺聚糖(GAG)係對於正常細胞功能而言頗為重要之不斷再循環大分子。在MPS中，參與GAGs之逐步降解之溶酶體酵素中之一者之缺乏導致其積聚，繼而導致嚴重細胞功能障礙。MPSs構成一組複雜的遺傳性疾病，其遺傳起點、生化及生理干擾及臨床表現有所不同。取決於突變基因，將會阻斷一種或幾種類型之GAGs之分解代謝，某些酵素參與多種GAG物種之降解途徑。
III型黏多醣病(MPSIII)係一種罕見溶酶體儲積症，該儲積症每100,000個活產中影響0.7至1.8個(在法國為0.73及在英國為1.7)且其中體染色體隱性遺傳缺陷導致硫酸乙醯肝素之部分降解之寡糖積聚。
聖菲利柏氏A型症候群或III型A型黏多醣病(MPSIIIA)係由N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)之體染色體隱性遺傳缺陷引起。該酵素在組織中普遍表現且參與硫酸乙醯肝素(HS)之逐步降解。在其不存在下，部分降解之寡糖以毒性水平積聚。
聖菲利柏氏A型症候群係一種影響兒童之嚴重虛弱且危及生命之溶酶體儲積症。臨床表現主要係神經性的且通常在生命的頭5年期間觀測到早期症狀，導致認知能力逐漸惡化。患病兒童在兒童早期需要特殊照護且逐漸發展為嚴重智力發育遲緩，其中體細胞表現最少[1]。死亡通常在15歲之前發生，儘管一些患者在20歲之後還活著。目前尚無可用於患有聖菲利柏氏A型症候群之患者之治療。
MPS中治療性方法之基本原理係基於缺失酵素之傳遞逆轉遺傳缺陷細胞之表型異常之觀測。MPS酵素替代治療仰賴於細胞外酵素藉由缺陷細胞透過結合至甘露糖-6-磷酸酶受體而內化。正在探索酵素替代療法(ERT)，但目前尚不適用於MPSIIIA。
MPS已被公認為是基因療法之首要候選疾病。使用離體 或原位 基因轉移，可產生缺失酵素且藉由一組基因改造細胞分佈至生物體。在MPS之動物模型中之大量研究已描述基因改造組織(包括骨髓、皮膚、肌肉、肝臟及腦)導致產生治療活性酶之效應。然而，當在周邊投與載體時，所產生的酵素不會穿過血腦障壁。循環中僅極高劑量之酵素可導致可偵測到轉運至腦中。基因療法方法之該缺陷不受限於MPS，但亦限制基因療法於治療其他腦疾病及病症之用途。
因此，在此項技術中顯然需要基因療法載體及方法，該等載體及方法提供直接投與至腦中以治療MPSs及其他影響腦之疾病及病症。本發明藉由提供改良之基因療法載體以及其他適用於一般地治療遺傳性疾病及神經性及腦疾病及病症及更具體而言MPSs(包括聖菲利柏氏A型)之改良方法來解決此等需求。
本揭示內容提供可用於治療遺傳性疾病、腦病症及神經性疾病及病症之新穎載體及方法，包括基因療法載體。
在一個實施例中，本揭示內容包括一種複製缺陷型腺相關病毒(AAV)衍生之載體，其包含表現盒，該表現盒以隨後5’至3’順序包含：啟動子序列；編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及多腺苷酸化(polyA)序列。在一些實施例中，載體不包括編碼人類硫酸酯酶修飾因子1(SUMF1)多肽之多核苷酸序列，或其任何活性變體。在某些實施例中，啟動子序列係可操作地連接至編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶多肽之多核苷酸序列，或其活性變體。在一些實施例中，編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶之多核苷酸序列包含根據SEQ ID NO: 13之序列。
在一些實施例中，啟動子序列為CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子。在一些實施例中，CAG啟動子包含根據SEQ ID NO: 12之序列。在一些實施例中，載體不包含IRES序列。在一些實施例中，polyA序列係衍生自人類生長激素1 polyA序列。在一些實施例中，poly A序列包含根據SEQ ID NO: 17之序列。在特定實施例中，載體為AAV血清型rh10。在一些實施例中，載體包含根據SEQ ID NO: 9之序列。在一些實施例中，SEQ ID NO: 9包含被包裹於LYS-SAF302顆粒中之DNA序列。
在載體之某些實施例中，表現盒以隨後5’至3’順序包含：衍生自CAG啟動子序列之啟動子序列；編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及衍生自人類生長激素polyA序列之polyA序列，或由其組成。在載體之特定實施例中，表現盒係經兩個AAV2反向末端重複(ITR)序列側接，其中該兩個AAV2 ITR序列中之一者係位於表現盒的5’及該兩個AAV2 ITR序列中之一者係位於表現盒的3’。在一些實施例中，該兩個ITR末端係為基因組複製及包裝所需的唯一順式作用元件。在一些實施例中，每個ITR包含約100個、約110個、約120個、約130個、約140個、約145個、約150個或約160個核苷酸。在一些實施例中，位於表現盒的5’端之ITR序列包含根據SEQ ID NO: 10之核苷酸序列。在一些實施例中，位於表現盒的3’端之ITR序列包含根據SEQ ID NO: 11之核苷酸序列。
在特定實施例中，載體進一步包含AAVrh.10衣殼或血清型。
在一些實施例中，載體之DNA包含4.07kb或由4.07kb組成及序列分子量為1257.4 kDa。在一些實施例中，SGSH序列包含1.35kb或由1.35kb組成及SGSH DNA之分子量為471.3 kDa。
相關實施例包括本文所述的任何表現盒及包含本文所述的表現盒之質體。其他相關實施例包括包含本文所述的質體或載體之宿主細胞。在特定實施例中，該宿主細胞係離體的。在一個實施例中，該宿主細胞為293細胞，諸如293T細胞。
在另一個實施例中，本揭示內容包括用於產生根據本揭示內容之載體之方法或製程，該方法或製程包括引入包含本文所述的表現盒之質體，其中該表現盒係經兩個AAV2內部末端重複(ITR)序列側接進入至宿主細胞中，及培養該宿主細胞以產生本文所述的載體。在特定實施例中，表現盒以隨後5’至3’順序包含：啟動子序列；編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及多腺苷酸化(polyA)序列，或由其組成。在某些實施例中，該方法或製程進一步包括將輔助質體引入至該宿主細胞中。在特定實施例中，該輔助質體包含編碼以下之多核苷酸序列：衣殼蛋白，例如來自AAVrh.10；複製基因，例如來自AAV2；及輔助功能，例如衍生自腺病毒血清型5。在一些實施例中，本揭示內容包括用於產生根據本揭示內容之載體之方法或製程，該方法或製程包括使用三個質體。在一些實施例中，第一質體包含表現盒，該表現盒以隨後5’至3’順序包含：啟動子序列、編碼人類SGSH多肽之多核苷酸序列或其活性變體、及多腺苷酸化序列，或由其組成。在一些實施例中，該表現盒係經兩個AAV ITR序列側接。在一些實施例中，該表現盒及側接序列一起包含根據SEQ ID NO: 9之序列或由其組成。在一些實施例中，該第一質體包含根據SEQ ID NO: 14之多核苷酸或由其組成。在一些實施例中，第二質體包含編碼衣殼蛋白(例如來自AAVrh10之衣殼蛋白)之多核苷酸序列。在一些實施例中，該第二質體包含根據SEQ ID NO: 15之多核苷酸。在一些實施例中，第三質體提供輔助功能，例如衍生自腺病毒之輔助功能。在一些實施例中，該第三質體包含根據SEQ ID NO: 16之多核苷酸。在一些實施例中，本文所提供的方法及製程包括將第一、第二及第三質體引入至宿主細胞中。例如，在一些實施例中，本文所提供的方法及製程包括將包含根據SEQ ID NO: 14、15及16之序列之質體引入至宿主細胞中。在一些實施例中，將該等質體引入至宿主細胞中及培養該宿主細胞以產生本文所述的載體。在一些實施例中，所產生的載體稱為SAF302(本文中亦稱為LYS-SAF302)。
其他相關實施例包括包含本文所述的載體及醫藥上可接受之載劑之組合物。在一些實施例中，本揭示內容提供包含本文所提供的載體及不含賦形劑或防腐劑之PBS緩衝液之調配物。在一些實施例中，該PBS緩衝液包含KCl、KH2 PO4 、及NaCl、Na2 HPO4 。在其他實施例中，該PBS緩衝液包含約2.67 mM KCl、約1.47 mM KH2 PO4 、約137.9 mM NaCl及約8.05 mM Na2 HPO4 。在一些實施例中，該調配物具有約6.8至約7.8、或約7.0至約7.6、或約7.2至約7.4之pH。在一些實施例中，該調配物係適於儲藏在-80℃±10℃下。在一些實施例中，在投與給個體之前，將本文所提供的調配物濾過0.2微米在線過濾器。
本揭示內容之另一個相關實施例包括一種治療聖菲利柏氏A型症候群之方法，該方法包括對有此需要的個體投與包含本文所述的載體之組合物。在特定實施例中，該載體包含表現盒，該表現盒以隨後5’至3’順序包含：AAV2 ITR序列；CAG啟動子序列；編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及人類生長激素polyA序列；其中該CAG啟動子序列係可操作地連接至編碼SGSH多肽之多核苷酸序列，或由其組成。在某些實施例中，該表現盒不包含編碼SUMF1多肽之多核苷酸序列，或其任何活性變體。在一些實施例中，該表現盒係經兩個AAV2內部末端重複(ITR)序列側接。
在該方法之特定實施例中，組合物係經由腦內注射投與至個體腦內的一或多個位點。在某些實施例中，該組合物係投與至個體腦內的二至二十個位點、四至十六個位點、八至十六個位點或六至十二個位點。例如，在一些實施例中，該組合物係經由每半球2至4次注射投與至個體腦，每個個體總共4至8次注射。在一個實施例中，該組合物係投與至個體腦內的六個位點。在一些實施例中，該組合物係投與每半球三個位點。在某些實施例中，該組合物係經由注射穿過個體頭部內的一或多個鑽孔(burr hole)(例如個體頭部內的六個鑽孔)投與，其中該組合物係穿過在單個深度處之每個鑽孔或徑路(track)投與。每個注射位點可係深的或淺層的。例如，在距皮層表面約1.5 cm至約3.0 cm、或約1.7 cm至約2.5 cm、或約2 cm深度處進行深注射；及在距皮層表面約0.5 cm至約2.0 cm、或約0.7 cm至約1.5 cm、或約1 cm深度處進行淺層注射。在某些實施例中，該等位點係選自以下中之一者或多者：右前淺層、右前深、左前淺層、左前深、右內淺層、右內深、左內淺層、左內深、右後淺層、右後深、左後淺層及左後深。
在某些實施例中，對個體投與總共約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1014 gc、約5.0 x 1010 gc至約5.0 x 1013 gc、約5.0 x 1010 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約5.0 x 1012 gc、約5.0 x 1011 gc至約5.0 x 1012 gc、或約5 x 1010 至約5 x 1013 gc、或約7 x 1010 至約7 x 1013 gc病毒載體。在某些實施例中，對個體投與總共約7.2 x 1012 gc病毒載體。在某些實施例中，對個體的每個位點投與約0.8 x 109 gc至約0.8 x 1013 gc、約0.4 x 1010 gc至約0.4 x 1013 gc、約0.4 x 1010 gc至約0.8 x 1012 gc、約0.8 x 1010 gc至約0.8 x 1012 gc、約0.8 x 1010 gc至約0.4 x 1012 gc、或約0.4 x 1011 gc至約0.4 x 1012 gc病毒載體。在特定實施例中，對個體的每個位點投與約1.2 x 1012 gc病毒載體。在特定實施例中，對個體的腦或白質的六個位點中之各者投與約1.2 x 1012 gc病毒載體，使得投與約7.2 x 1012 gc病毒載體至該個體。在某些實施例中，投與每個位點之包含基因療法載體之組合物之體積為約10 µl至約600 µl。在一些實施例中，投與每個位點之包含基因療法載體之組合物之體積為約500 µ1。在特定實施例中，用於投與包含基因療法載體之組合物之輸注速率為約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、或約0.4 µl/min至約3.0 µl/min、或約5.0 µl/min。在一些實施例中，該方法進一步包括對個體投與免疫抑制方案。在一些實施例中，該免疫抑制方案包括他克莫司(tacrolimus)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)及普賴松(prednisone)。
在一個相關實施例中，本揭示內容包括本文所述的用作治療聖菲利柏氏A型症候群之藥物之載體。在特定實施例中，該用作治療聖菲利柏氏A型症候群之藥物之載體以5’至3’順序包含以下表現盒，其中該CAG啟動子序列係可操作地連接至編碼SGSH之多核苷酸序列：AAV2 ITR序列；CAG啟動子序列；編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；人類生長激素polyA序列；及AAV2 ITR序列。用作藥物之載體係經由本文所提供的方法進行投與。
在用作治療聖菲利柏氏A型症候群之藥物之載體之特定實施例中，該藥物進一步包含醫藥上可接受之擔體、載劑、稀釋劑或賦形劑。在某些實施例中，該藥物係乳液或水溶液。在某些實施例中，該藥物包含不含賦形劑或防腐劑之緩衝液。在其他實施例中，該緩衝液為PBS緩衝液。
在一個相關實施例中，本揭示內容包括用於產生本揭示內容之載體之製程，該製程包括將包含本揭示內容之表現盒之質體引入至宿主細胞中；及培養該宿主細胞以產生載體。在特定實施例中，該質體進一步包含側接表現盒之AAV2 ITRs。
在另一個相關實施例中，本揭示內容包括包含本揭示內容之表現盒之質體。在特定實施例中，該質體進一步包含側接表現盒之AAV2 ITRs。
在另一個相關實施例中，本揭示內容包括包含本揭示內容之載體、質體或表現盒之宿主細胞。在特定實施例中，該宿主細胞為人類胚胎腎細胞，例如293或293T細胞。
在一些實施例中，本揭示內容提供一種套組，其包括(a)包含本文所提供的質體之載體及(b)其使用之使用說明。在一些實施例中，該套組包括包含質體之載體，其中該質體包含如本文所提供的表現盒且進一步包含AAV2 ITRs。
另外，本文所述的任何方法及用途可用於在有此需要的個體中增加SGSH多肽或其變體之表現。在一些實施例中，本文所述的方法及用途增加及/或恢復有此需要的個體的腦中之SGSH活性。在一些實施例中，該等方法及用途恢復個體的腦內的正常SGSH活性之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或更多。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年7月18日申請之美國臨時申請案第62/875,809號之優先權，該案之全部內容係以引用之方式併入本文中。 序列表
與本申請案相關的序列表以文本格式提供以替代紙張複本，且以引用的方式併入本說明書中。包含序列表之文本檔案的名稱為LYSO-003_01WO_SeqList_ST25.txt。文本檔案約為86 KB，其係於2019年7月17日製作，並經由EFS-Web以電子方式提交。
在各種實施例中，本揭示內容提供可用於治療多種疾病及病症(包括但不限於遺傳性疾病(包括彼等由於基因缺失或突變導致表現降低或缺乏表現編碼基因產物、基因產物之改變形式之表現或控制基因產物之表現之調節元件之破壞所致者)、神經系統疾病及病症、及腦之疾病及病症)之新穎組合物及方法。如熟習此項技術者所瞭解，儘管本文中具體列舉某些組合物及方法，但本揭示內容不限於此，而是包括另外實施例及用途，包括但不限於彼等本文中具體描述者。另外，在以下描述中，闡述某些特定細節以便提供對本揭示內容之各種實施例之透徹理解。然而，熟習此項技術者應明瞭，可在沒有此等細節下實踐本揭示內容。定義
除非另有定義，否則本文所用的所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術之一般技術者通常所瞭解者相同的含義。出於本揭示內容之目的，以下術語定義如下。
除非具體指出，否則單詞「一」及「一個」表示一或多個。
「約」意指量、水平、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、用量、重量或長度變化多達參考量、水平、值、數量、頻率、百分比、尺寸、大小、用量、重量或長度之30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在結合術語「約」使用的數值之上下文中論述的任何實施例中，明確涵蓋可省略術語約。
術語「活性變體」指示且包涵「生物活性片段」及「生物活性變體」。代表性生物活性片段及生物活性變體一般參與相互作用，例如分子內或分子間相互作用。分子間相互作用可係特異性結合相互作用或酶促相互作用。酶促相互作用或活性之實例包括但不限於本文所述的脫羥基作用及其他酶促活性。
如應用於參考多核苷酸或多肽序列之片段的術語「生物活性片段」係指具有參考序列之至少一種活性(例如，酶促活性)之至少約20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更高之片段。術語「參考序列」一般係指與另一序列進行比較的核酸編碼序列或胺基酸序列。亦包括序列表中提供的所有序列作為參考序列。本揭示內容之範疇包括長度為至少約10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、120個、140個、160個、180個、200個、220個、240個、260個、280個、300個、320個、340個、360個、380個、400個、500個、600個或更多個連續核苷酸或胺基酸殘基(包括其之間的所有整數)之生物活性片段。
如應用於參考多核苷酸或多肽序列之變體的術語「生物活性變體」係指具有參考序列之活性(例如，酶促活性)之至少約20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、110%、120%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更高之變體。本揭示內容之範疇包括與參考序列具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%一致性(包括其之間的所有整數)之生物活性變體。
「編碼序列」意指有助於編碼基因之多肽產物之任何多核苷酸序列。相對地，術語「非編碼序列」係指對基因之多肽產物之編碼無貢獻之任何多核苷酸序列。
除非本文另外要求，否則在本說明書及申請專利範圍中，單詞「包括(comprise)」及其變體(諸如「包括(comprises)」及「包括(comprising)」)應以開放、包含性含義來解釋，亦即解釋為「包括但不限於」。
「由…組成」意指包括且限於片語「由…組成」之後的任何內容。因此，片語「由…組成」指示所列元素係必需或強制性的，且不可存在其他元素。
「基本上由…組成」意指包括在該片語之後列出的任何元素，且限於不會干擾本揭示內容中針對所列元素所指定的活性或作用或對本揭示內容中針對所列元素所指定的活性或作用無貢獻之其他元素。因此，片語「基本上由…組成」指示所列元素係必需或強制性的，但其他元素係可選的且可取決於其等是否會影響所列元素之活性或作用而存在或不存在。
在本說明書中提及「一個實施例」或「一實施例」意指結合該實施例描述的特定特徵、結構或特性包括在本揭示內容之至少一個實施例中。因此，貫穿本說明書在各個地方出現片語「在一個實施例中」或「在一實施例中」不一定均指涉相同實施例。此外，在一或多個實施例中，可以任何適宜方式組合特定特徵、結構或特性。
如本文所用，術語「功能」及「功能性」及類似者係指生物、酶促或治療功能。
「基因」意指遺傳單位，其佔據染色體上的特定基因座且由轉錄及/或轉譯調節序列及/或編碼區域及/或非轉譯序列(亦即內含子、5’及3’非轉譯序列)組成。
與基因有關的引述「突變」或「刪除」一般係指基因中彼等導致編碼基因產物表現降低或不表現或使基因產物與野生型基因產物相比無功能或功能降低之變化或改變。此類改變之實例包括全部或部分地對標的基因之編碼或調節序列進行的核苷酸取代、刪除或添加，此破壞、消除、下調或顯著降低由該基因編碼之多肽之表現，無論是在轉錄或轉譯水平上，及/或此產生相對無活性(例如，突變或截短)或不穩定多肽。在某些態樣中，可藉由在改變經編碼多肽之胺基酸序列之核苷酸層級上之改變或突變使靶向基因「無功能」，使得經修飾之多肽得以表現，但相對於一或多種酶促活性具有降低之功能或活性，無論是藉由改變該多肽的活性位點、其細胞定位、其穩定性或熟習此項技術者明瞭的其他功能性特徵。
「增加」或「增強」量通常係「統計學顯著」量，且可包括本文所述的量或水平之1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍(例如100倍、500倍、1000倍) (包括其之間且高於1之所有整數及小數點，例如2.1、2.2、2.3、2.4等)的增加。
「減小」或「降低」或「減少」量通常係「統計學顯著」量，且可包括本文所述的量或水平的約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍或50倍或更多倍(例如100倍、500倍、1000倍) (包括其之間且高於1之所有整數及小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的減小。
「自…獲得」意指自特定來源(諸如期望生物或期望生物內的特定組織)分離或衍生自其之樣品，諸如例如多核苷酸或多肽。
如本文所用的術語「可操作地連接」意指將基因置於啟動子之調節控制下，然後該啟動子控制基因之轉錄及視需要之轉譯。在異源啟動子/結構基因組合之構造中，一般較佳將基因序列或啟動子置於距基因轉錄起始位點一距離處，該距離與該基因序列或啟動子與其在其自然環境中控制的基因之間的距離大致相同；亦即基因序列或啟動子所衍生的基因。如此項技術中已知，可適應該距離之一些變化而不損失功能。類似地，調節序列元件相對於意欲置於其控制下之異源基因之較佳定位係藉由該元件在其自然環境中之定位來定義；亦即其所衍生的基因。在大多數條件下，「組成型啟動子」通常具有活性，亦即促進轉錄。「誘導型啟動子」通常僅在某些條件下具有活性，諸如在給定分子因子(例如IPTG)或給定環境條件存在下。在不存在該條件下，誘導型啟動子通常不允許顯著或可測量之轉錄活性水平。許多標準誘導型啟動子將係熟習此項技術者已知的。
「醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑」包括但不限於已經美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准在人類或家畜中使用係可接受之任何佐劑、載劑、賦形劑、滑動劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、香味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。
如本文所用的引述「多核苷酸」或「核酸」表示mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。該術語通常係指核苷酸(核糖核苷酸或去氧核苷酸、或核苷酸之任何一種類型之修飾形式)之至少10個鹼基長度之聚合形式。該術語包括DNA及RNA之單股及雙股形式。
術語「多核苷酸變體」係指展現與參考多核苷酸序列或在定義於下文中之嚴格條件下與參考序列雜交之多核苷酸實質上序列相同之多核苷酸。該術語亦包涵藉由添加、刪除或取代至少一個核苷酸而與參考多核苷酸區分開之多核苷酸。因此，術語「多核苷酸變體」包括其中一或多個核苷酸已經添加或刪除或經不同核苷酸取代之多核苷酸。就此而言，此項技術中熟知，可對參考多核苷酸進行某些改變，包括突變、添加、刪除及取代，藉此該經改變的多核苷酸保留參考多核苷酸之生物功能或活性，或具有與參考多核苷酸有關之增加之活性(亦即最佳化)。多核苷酸變體包括例如與本文所述的參考多核苷酸序列具有至少50%(及至少51%至至少99%及其之間的所有整數百分比，例如90%、95%或98%)序列一致性之多核苷酸。術語「多核苷酸變體」及「變體」亦包括天然存在之對偶基因變體及編碼此等酵素之異種同源物。
關於多核苷酸及多肽，術語「外源」係指不天然存在於野生型細胞或生物中，但通常藉由分子生物技術引入至細胞中之多核苷酸或多肽序列。外源多核苷酸的實例包括編碼期望蛋白質的載體、質體及/或人造核酸構築體。關於多核苷酸及多肽，術語「內源」或「天然」係指可在給定野生型細胞或生物中發現的天然存在的多核苷酸或多肽序列。
「引入之」多核苷酸序列係指添加或引入至細胞或生物中之多核苷酸序列。「引入之」多核苷酸序列可係細胞或生物外源之多核苷酸序列，或其可係已經存在於該細胞或生物中之多核苷酸序列。例如，可藉由分子生物技術將多核苷酸「引入」至已經包含此種多核苷酸序列之微生物中，例如，以產生一種原本天然存在之多核苷酸序列之一或多個另外複本，且藉此促進經編碼多肽之過度表現。
「多肽」、「多肽片段」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物及其變體及合成類似物。因此，此等術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基係合成非天然存在之胺基酸，諸如對應天然存在之胺基酸之化學類似物；以及適用於天然存在之胺基酸聚合物。在某些態樣中，多肽可包括酶促多肽(或「酵素」)，其通常催化各種化學反應(亦即增加各種化學反應之速率)。
引述「多肽變體」係指藉由添加、刪除或取代至少一個胺基酸殘基而與參考多肽序列區分開之多肽。在某些實施例中，多肽變體藉由一或多個取代而與參考多肽區分開，該取代可係保守的或非保守的。在某些實施例中，多肽變體包含保守取代，且就此而言，在此項技術中熟知，一些胺基酸可經改變為具有大致相似性質而不改變該多肽之活性之性質之其他胺基酸。多肽變體亦包涵其中已添加或刪除一或多個胺基酸，或經不同胺基酸殘基置換之多肽。包括與本文所述的任何參考序列(參見例如序列表)具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在特定實施例中，該多肽變體維持參考多肽之至少一種生物活性。
如本文所用，引述「序列一致性」(或例如包括「與…50%相同之序列」)係指在比較窗口上序列在核苷酸基礎或胺基酸基礎上相同之程度。因此，「序列一致性百分比」可藉由在比較窗口上比較兩個最佳比對序列，確定相同核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)於兩個序列中出現的位置數以產生匹配位置數，將該匹配位置數除以比較窗口中之總位置數(亦即窗口大小)，及將該結果乘以100以得到序列一致性百分比來計算得。
用於描述兩個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關係的術語包括「參考序列」、「比較窗口」、「序列一致性」、「序列一致性百分比」及「實質相同」。「參考序列」為長度至少12個但通常為15至18個且常常為至少25個單體單元(包含核苷酸及胺基酸殘基)。因為兩個多核苷酸可各自包含(1)兩個多核苷酸之間相似的序列(亦即僅完整多核苷酸序列之一部分)及(2)兩個多核苷酸之間相異之序列，因此兩個(或更多個)多核苷酸之間的序列比較通常係藉由在「比較窗口」上比較兩個多核苷酸之序列以識別及比較具有序列相似性之局部區域來進行。「比較窗口」係指至少6個連續位置(通常約50至約100個，更通常約100至約150個)之概念性片段，其中將一序列與相同連續位置數之參考序列在最佳比對該兩個序列後進行比較。與該參考序列(其不包含添加或刪除)相比，比較窗口可包含約20%或更少之添加或刪除(亦即缺口)，以達成該兩個序列之最佳比對。用於比對比較窗口之序列的最佳比對可藉由電腦化演算法實施方案(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Wisconsin Genetics套裝軟體7.0版，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或藉由檢查及藉由所選擇的各種方法中之任何者產生的最佳比對(亦即導致在比較窗口上之最高同源性百分比)來實施。亦可參考如例如由Altschul等人，1997，Nucl. Acids Res. 25: 3389揭示的BLAST家族程式。序列分析之詳細論述可見於Ausubel等人之單元19.3，「Current Protocols in Molecular Biology」，John Wiley & Sons Inc，1994至1998，第15章中。
「轉化」係指細胞中由於攝取及併入外來DNA至宿主細胞基因組中或染色體外維持在宿主細胞內引起之永久、可遺傳之改變；以及，外源基因自一個生物轉移至另一生物之基因組中。
如本文所用，術語「治療(treatment/treat/treated/treating)」係指預防及/或療法，特別是其中目標係預防或減慢(減輕)非所欲生理變化或病症，諸如由於突變基因引起之腦病症(諸如例如溶酶體儲積症(LSDs))之發展及/或進展。有益或期望臨床結果包括但不限於症狀減輕，疾病程度減輕，疾病狀態穩定化(亦即不惡化)，疾病進展延遲或減慢，疾病狀態改良或減輕，及緩解(無論是部分或全部)，無論是可偵測或不可偵測。「治療」亦可意指與未接受治療情況下之預期存活期及/或生活品質相比，延長存活期及/或提高生活品質。彼等需要治療者包括彼等已經患有該病狀或病症者(例如由於突變基因引起之腦病症，諸如LSD)以及彼等容易患有該病狀或病症者或彼等意欲預防該病狀或病症者。因此，「治療」亦包括對彼等由於家族史、基因或染色體異常及/或由於存在疾病之一或多個生物標誌物而被認為易患該疾病的個體投與本揭示內容之化合物，例如以抑制、預防或延遲疾病之發作、或降低該疾病發生之可能性。在特定實施例中，治療可包括以下中之任何者：發育退化減少，語言障礙減少或語言發展改良，運動技能障礙減少，智力發育障礙減少，過動症(過度運動活性)減少，睡眠、注意力改良，身體及智力能力障礙(患者喪失完整運動能力(步行、言語、進食等)減少，認知能力、嚴重發作，障礙(諸如氣道阻塞及心臟衰竭)減少，或部分降解之硫酸乙醯肝素之積聚減少。在某些實施例中，「治療」包括使細胞能夠產生缺失酵素從而治療及/或逆轉疾病之後果，例如，針對個體恢復或提供SGSH基因之功能，或分解積聚的硫酸乙醯肝素。
「個體」包括哺乳動物，例如人類，包括需要治療疾病或病症之哺乳動物，諸如已診斷為患有疾病或病症或經確定為處在發展疾病或病症風險中之哺乳動物。在特定實例中，個體為經診斷患有遺傳性疾病、腦病症或神經疾病或病症(諸如溶酶體儲積症，包括MPS，諸如MPSIIIA)之哺乳動物。
「載體」意指多核苷酸分子，例如衍生自例如其中可插入或選殖多核苷酸的質體、噬菌體、酵母或病毒之DNA分子。載體通常含有一或多個獨特限制位點且能夠在限定宿主細胞中自主複製，或可與限定宿主之基因組整合使得經選殖之序列係可再現的。因此，載體可係自主複製載體，亦即呈染色體外實體存在之載體，其複製係獨立於染色體複製，例如線性或封閉環狀質體、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可含有任何用於確保自複製之手段。或者，載體可為在引入至宿主細胞中時會整合至基因組中且與其已整合至其中之染色體一起複製之載體。此種載體可包含允許重組至宿主染色體之特定期望位點中之特定序列。載體系統可包含單個載體或質體、兩個或更多個載體或質體，其共同包含意欲引入至宿主細胞之基因組(或轉位子)中之總DNA。載體之選擇通常將取決於載體與其中欲引入載體之宿主細胞之相容性。「載體」亦包括其中可插入或選殖多核苷酸之病毒及病毒顆粒。此類載體可稱為「病毒載體」。「基因療法載體」為用於傳遞治療性多核苷酸或多肽序列至有此需要的個體之載體，包括病毒載體，該治療性多核苷酸或多肽序列通常係例如由於個體中之基因突變而在個體中缺失、突變或具有失調表現之多核苷酸或多肽序列。
將所關注DNA序列插入至DNA載體中之常用手段涉及使用稱為限制酵素之酵素，該酵素在稱為限制位點之特定位點切割DNA。「盒」或「基因盒」或「表現盒」係指編碼一或多種表現產物，且含有表現此等產物所必需的順式作用元件之多核苷酸序列，其可在限定限制位點插入至載體中。
如本文所用，術語「野生型」係指當自天然存在之來源分離時具有該基因或基因產物之特性之基因或基因產物。野生型基因或基因產物(例如多肽)為在一個群體中最常觀測到且因此被任意設計為該基因之「正常」或「野生型」形式之基因或基因產物。基因療法載體
在某些實施例中，本揭示內容包括用於治療MPSIIIA之基因療法載體。此類基因療法載體可用於傳遞人類SGSH多肽或其活性變體至有此需要的個體內之細胞。如隨附實例中所述，研究已確立本揭示內容之基因療法載體對於治療MPSIIIA既有效又安全。
在不希望受理論約束下，應明瞭，在投與至腦實質中後，基因療法載體顆粒及酵素將局部擴散，以及沿著軸突運輸至遠端解剖腦結構以允許校正延伸之腦區域。進入至細胞中後，編碼SGSH多肽之基因療法載體將被運輸至細胞核中，在該處，其將經歷一系列分子轉化而導致穩定地確立為雙股去氧核糖核酸(DNA)分子。該DNA將被轉錄成信使核糖核酸(mRNA)，其進而將轉譯為SGSH(缺失酵素)。轉導細胞將連續表現及傳遞SGSH酵素，因此構成酵素產生之腦內永久來源以補充缺乏的內源酵素。本文所述的基因療法載體為LYS-SAF302，本文中亦稱為SAF302或AAVrh10-SGSH。如隨附實例中所述，SAF302為第二代產品，其建基於測試第一代產品(稱為LYS-SAF301或SAF301)獲得的資訊。LYS-SAF301由包含含有藉由包裝在AAVrh.10之衣殼中之PGK啟動子驅動之SGSH及SUMF1基因之缺陷型AAV2基因組之複製缺陷型腺相關病毒血清型rh.10 (AAVrh.10)組成。其亦稱為AAVrh.10-hMPS3A。該第一代載體係用於本文所述的在患有MPS IIIA疾病的兒童中之臨床研究中且以7.2E+11病毒基因組(vg)/患者之劑量以在兩個注射深度12次預計劃同步無框立體定位注射(60 μL/注射)方式傳遞至腦白質中。劑量及手術干預耐受良好且未報導相關不良事件。
本揭示內容提供改良之第二代產物LYS-SAF302，其在就自轉導細胞表現方面比第一代產物強2.7倍。另外，本揭示內容提供改良之傳遞系統，其允許以增加之流速注射更高劑量及更大體積而沒有回流。本文所提供的傳遞系統及方法導致廣泛腦分佈及增強之效力。如隨附實例中所述，LYS-SAF301及LYS-SAF302在MPSIIIA小鼠模型中之效力研究顯示本揭示內容之基因療法載體轉導MPSIIIA腦細胞以產生及分泌大量活性SGSH，其進而介導原發性、繼發性及其他神經病理學之高度明顯降低。在腦之一些區域中偵測到大量SGSH，且似乎與其與注射位點之接近程度直接相關。資料指示該載體除下游事件(諸如微神經膠細胞增生)外亦能夠產生足夠量之SGSH以便介導原發性及繼發性儲積病症之高度顯著改良。
已發現，本揭示內容之基因療法載體與彼等先前描述者相比提供意外的優點，包括腦內注射後腦中高水平的SGSH表現。另外，本揭示內容之方法驚人地導致降低之免疫反應。此等優點與增加之效力相關。此外，在某些實施例中，手術時間及麻醉下時間經最小化，從而降低對患者之相關風險。另外，本揭示內容之組合物及方法經由治療性產品之改良表現、更寬廣之表現分佈、及經由更高劑量、更大體積及增加注射流速達成之更有效傳遞而提供增強之效力。
小病毒(Parvovirus)家族之成員腺相關病毒(AAV)為具有4.7千鹼基(kb)至6 kb之單股線性DNA基因組之小型無套膜二十面體病毒。AAV的生命週期包括其中AAV基因組在感染後定點整合至宿主染色體中之潛伏期及其中在腺病毒或單純皰疹病毒感染後經整合之基因組隨後被救援、複製且包裝至傳染性病毒中之感染期。非致病性、廣泛宿主感染性範圍(包括非分裂細胞)及潛在定點染色體整合之性質使AAV成為基因轉移之吸引人的工具。
迄今為止，已自人類或非人類靈長類動物(NHP)分離出至少十二種AAV之其表面性質有所變化之不同血清型並加以表徵。
術語「血清型」係關於具有衣殼之AAV之區別，該衣殼在血清學上不同於其他AAV血清型。血清學獨特性係基於一種AAV血清型與其他AAV血清型相比抗體之間缺乏交叉反應性來確定。本揭示內容之基因療法載體(亦稱為載體)可具有AVV之已知血清型(rh)中之任何一者，例如rh1、rh2、rh3、rh4、rh5、rh6、rh7、rh8、rh9或rh10中之任何一者，較佳係rh10。此等各種AAV血清型亦可稱為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10 (AAVrh.10)。
在某些實施例中，本揭示內容之載體可具有人工AAV血清型。人工AAV血清型包括但不限於具有非天然存在之衣殼蛋白之AAV。此種人工衣殼可藉由任何適宜技術，使用本揭示內容之新穎AAV序列(例如vp1衣殼蛋白之片段)與可自另一種AAV血清型(已知或新穎的)、該相同AAV血清型之非連續部分，自非AAV病毒源，或自非病毒源獲得的異源序列之組合來產生。人工AAV血清型可係，但不限於嵌合AAV衣殼、重組AAV衣殼或「人源化」AAV衣殼。
AAV血清型rh.10 (AAVrh.10)描述於PCT專利申請公開案第WO 2003/042397號中。已顯示AAVrh.10載體可有效穿越血腦障壁且轉導新生小鼠中樞神經系統中之神經元及星形膠質細胞(Zhang, H.等人，Molecular Therapy 19，1440至1448 (2011年8月))。此外，AAVrh.10載體在注入至囓齒動物腦中後具有優良活性[10-12]，且在人類群體中沒有AAV血清型10之天然疾病。
AAV基因組相對簡單，其含有兩個側接短反向末端重複序列(ITR)之開放閱讀框(ORF)。ITR尤其含有病毒複製、救援、包裝及整合所需的順式作用序列。ITR之整合功能允許AAV基因組在感染後整合至細胞染色體中。
非結構或複製(Rep)及衣殼(Cap)蛋白分別由5’及3’開放閱讀框(ORFs)編碼。四個相關蛋白係自rep基因表現；Rep78及Rep68係自p5啟動子轉錄，而下游啟動子p19導引Rep52及Rep40之表現。Rep78及Rep68直接參與AAV複製以及病毒基因表現之調節。cap基因係自第三病毒啟動子p40轉錄。該衣殼由重疊序列之三個蛋白質組成；最小者(VP-3)最豐富。由於反向末端重複序列為順式複製、包裝及整合所需的唯一AAV序列，因此大多數AAV載體省去編碼Rep及Cap蛋白之病毒基因且僅含有插入在末端重複序列之間的外源基因，例如治療性基因。
N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH；亦稱為磺醯胺酶)為參與聖菲利柏氏A型症候群(MPSIIIA，OMIM #252900)之缺陷型蛋白質。N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH，EC 3.10.1.1，MIM 605270)屬於逐步降解葡糖胺聚醣(稱為硫酸乙醯肝素(HS))家族所需的溶酶體水解酶家族。SGSH參與硫酸乙醯肝素(HS)降解之第三步驟。SGSH催化N連接硫酸酯自HS之非還原性末端葡萄胺糖苷殘基之水解。
在某些實施例中，本揭示內容之第一代基因療法載體包含編碼SGSH及SUMF1二者之多核苷酸序列。人類硫酸酯酶修飾因子1 cDNA (SUMF1，MIM 607939)編碼藉由轉譯後修飾增強硫酸酯酶活性之蛋白質。在第一代產品中將SGSH與SUMF1共表現之原因係雙重的。儘管SUMF1存在於細胞中，但當亦引入輔因子時在基因轉移後獲得更高的SGSH活性。SUMF1當在野生型培養細胞中與硫酸酯酶cDNAs共轉染時及當在來自受由於硫酸酯酶缺乏症引起之不同疾病影響之個體之細胞中與硫酸酯酶cDNA經由AAV載體共傳遞時大大地增強硫酸酯酶活性[15-17]。 Fraldi等人顯示使用AAV2/5載體，SUMF1及SGSH之共傳遞導致與溶酶體儲積減少及腦中發炎性標誌物減少相關之SGSH活性協同增加[13]。
假設SGSH之過度表現可大大地降低SUMF1對其他硫酸酯酶之可利用性，且因此影響其功能。該毒性過程以由於SUMF1中突變所引起之多發性硫酸酯酶缺乏症作說明[15]。據報導人類內源性SUMF1之水平在腎臟及肝臟中高，但在腦中極低[18-21]。相對地，小鼠腦中內源性SUMF1之表現中等[22]。內源性SUMF1的量可成為細胞及組織中之限制因素。因此，咸信在經設計來過度表現硫酸酯酶之基因療法載體(諸如彼等設計用於MPSIIIA者)中包含SUMF1係有利的。
本發明者發現，與包含表現SUMF1之多核苷酸之第一代產品相比，本文所述的第二代載體SAF302(其不包含表現SUMF1之多核苷酸)能夠增強SGSH之表現及提高降解HS之有效性。
在某些實施例中，本揭示內容之基因療法載體為包含編碼人類SGSH多肽之多核苷酸序列或其活性變體之AAV血清型rh10載體。在某些實施例中，此等基因療法載體可以複製缺陷型AAVrh.10載體投與有此需要的個體，該載體包含缺陷型AAV2基因組，該缺陷型AAV2基因組包含編碼人類SGSH多肽之藉由啟動子驅動且包裝在AAVrh.10的衣殼中之多核苷酸序列或其活性變體。
在某些實施例中，基因療法載體進一步包含另外的調節序列，諸如啟動子序列、增強子序列及其他有助於準確或有效轉錄或轉譯之序列(諸如內部核糖體結合位點(IRES)或多腺苷酸化(polyA)序列)。在某些實施例中，編碼人類SGSH多肽之多核苷酸序列或其活性變體係可操作性地連接至啟動子序列。在一些實施例中，基因療法載體包含polyA序列，但不包含IRES序列。
在一些實施例中，本揭示內容包括複製缺陷型腺相關病毒(AAV)衍生之載體，其包含多核苷酸序列，例如表現盒，其以5’至3’順序包含下列： 啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 內部核糖體進入位點(IRES)序列； 編碼人類硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及 多腺苷酸化(polyA)序列。
在某些實施例中，該載體進一步包含AAV2 ITRs及AAVrh.10衣殼或血清型。
本揭示內容亦包括本文所述表現盒之用途，但其中編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體及編碼人類硫酸酯酶修飾因子1 (SUMF1)多肽之多核苷酸序列或其活性變體之位置經轉換。
在特定實施例中，本揭示內容包括複製缺陷型腺相關病毒(AAV)衍生之載體，其包含多核苷酸序列，例如表現盒，其以5’至3’順序包含下列： 啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及 多腺苷酸化(polyA)序列； 其中該載體不包含編碼SUMF1之多核苷酸序列且不包含IRES序列。
在某些實施例中，該載體進一步包含AAV2 ITRs及AAVrh.10衣殼或血清型。
多種適宜啟動子序列、IRES序列及polyA序列係此項技術中已知且可獲得的，且可根據本揭示內容使用任何者。
在某些實施例中，該啟動子為組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子(例如腦特異性或神經組織或神經細胞特異性啟動子)或對於個體內源性之啟動子。組成型啟動子之實例包括但不限於CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子、逆轉錄病毒勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子(視需要與RSV增強子一起)、巨大細胞病毒(CMV)啟動子(視需要與CMV增強子一起)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子及EFlα啟動子[lnvitrogen]。在特定實施例中，該啟動子為哺乳動物PGK啟動子，諸如例如鼠類PGK啟動子。在一些實施例中，該啟動子為CAG啟動子，其中該CAG啟動子攜帶CMV IE增強子、CB啟動子、CBA外顯子1、CBA內含子、兔β-內含子及兔β-球蛋白外顯子2。本揭示內容提供一種改良之基因療法載體，其包含編碼SGSH之多核苷酸序列或其活性片段，其中第一代產品之該PGK啟動子已經CAG啟動子置換。在一些實施例中，該CAG啟動子係可操作性地連接至SGSH序列。在一些實施例中，PGK啟動子經CAG啟動子置換驚人地導致SGSH之表現顯著增強。
藉由外源提供的啟動子調節之誘導型啟動子之實例包括鋅誘導型金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(dexamethasone) (Dex)誘導型小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、蛻皮激素昆蟲啟動子、四環素抑制型系統及四環素誘導型系統。誘導型啟動子及誘導型系統可自多種商業來源(包括但不限於lnvitrogen、Clontech及Ariad)獲得。已描述許多其他系統且可由熟習此項技術者容易地選擇。
IRES(內部核糖體進入位點)為結構性RNA元件，其允許轉譯機制在mRNA內募集，同時轉譯起始之主要途徑在mRNA封端的5’端募集核糖體。
細胞使用poly(A)信號將polyA尾3’添加至mRNA上。該尾對於mRNA之細胞核輸出、轉譯及穩定性很重要。在一些實施例中，polyA單元為人類生長激素1 polyA單元。
在本揭示內容之載體之特定實施例中，該啟動子序列係衍生自CAG啟動子序列；及/或該polyA序列係衍生自人類生長激素1 polyA序列。
在一個實施例中，表現盒以隨後5’至3’順序包含： 衍生自CAG啟動子序列之啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 及 衍生自人類生長激素polyA序列之polyA序列。
在本揭示內容之載體之特定實施例中，該表現盒係經兩個AAV內部末端重複(ITR)序列(例如AAV2 ITRs)側接，其中該兩個AAV ITR序列中之一者係位於該表現盒的5’及該兩個AAV ITR序列中之一者係位於該表現盒的3’。ITR序列各包含約145個鹼基。其等之所以如此命名是因為其對稱性，此被證明是有效擴增AAV基因組所必需的。此等序列之另一性質係其形成髮夾之能力，該髮夾有助於所謂的自引發(self-priming)且允許第二DNA股之獨立於之合成。AAV ITRs係基因組複製及包裝所需的唯一順式作用元件。
在一個特定實施例中，本揭示內容包括包含多核苷酸序列之載體，該多核苷酸序列以隨後5’至3’順序包含： AAV2 ITR序列； CAG啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 人類生長激素polyA序列；及 AAV2 ITR序列。
圖1中提供第一代SAF301載體的示意圖。圖3中提供為第二代SAF302載體之本揭示內容之載體構築體的示意圖。
本揭示內容進一步包括包含本揭示內容之基因療法載體之組合物(包括醫藥組合物)以及其單位劑型。
在一個實施例中，本揭示內容包括一種組合物，其包含本文所述的基因療法載體及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此種組合物可稱為醫藥組合物。在一個特定實施例中，該醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑為磷酸鹽緩衝鹽水溶液，其可係無菌及/或GMP臨床等級。在一個特定實施例中，本揭示內容之組合物包括包含多核苷酸序列之載體，該多核苷酸序列以5’至3’順序包含下列： AAV2 ITR序列； CAG啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 人類生長激素1 polyA序列；及 AAV2 ITR序列， 其中該載體係懸浮在磷酸鹽緩衝鹽水溶液中，該溶液可係無菌及/或GMP臨床等級。
在某些實施例中，存在於本揭示內容之組合物中之載體之濃度為約1 x 1010 gc/ml至約1 x 1014 gc/ml、約1 x 1011 gc/ml至約1 x 1013 gc/ml、或約5 x 1011 gc/ml至約5 x 1012 gc/ml。例如，在一些實施例中，存在於組合物中之載體之濃度為約1.9 x 1012 gc/mL至約3.2 x 1012 gc/mL、或約2.4 x 1012 gc/mL。
在特定實施例中，本揭示內容之單位劑型包括含有約100 µl至2 mL之本揭示內容之組合物之小瓶。在某些實施例中，單位劑型包括含有約1.2 mL組合物之小瓶。在特定實施例中，存在於單位劑型中之載體的量為約.05 x 1012 gc至約3 x 1012 gc、或約0.1 x 1012 gc至約0.5 x 1012 gc、或約0.1 x 1012 gc至約2 x 1012 gc。多核苷酸及多肽序列
在某些實施例中，本揭示內容包括包含本文所述的表現盒或由本文所述的表現盒組成之多核苷酸序列、以及包含本文所述的任何表現盒之質體及載體。另外，本揭示內容包括包含本揭示內容之任何多核苷酸序列、載體或質體之細胞。使用標準分子及細胞生物學技術及此項技術中的知識，熟習此項技術者可容易地產生本揭示內容之多核苷酸序列、載體及宿主細胞。
本揭示內容之多核苷酸之組分(例如表現盒)之多核苷酸及多肽序列係已知的。
鼠類PGK啟動子序列係提供在SEQ ID NO: 1之NCBI參考號MI8735位置+ 419至+924及位置+419至+924。
IRES序列係提供在SEQ ID NO: 2之NCBI參考號NC001479位置+13至+575及位置+13至+575。
牛生長激素polyA序列係提供在SEQ ID NO: 3之NCBI參考號M57764位置+2326至+2533及位置+2326至+2533。
CAG啟動子序列係以SEQ ID NO: 12及/或以SEQ ID NO: 9之位置125至1862提供。
人類生長激素1 poly A序列係以SEQ ID NO: 17及/或以SEQ ID NO: 9之位置3414至3923提供。
N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH；亦稱為磺醯胺酶)為參與聖菲利柏氏A型症候群(MPSIIIA, OMIM #252900)之缺陷型蛋白質。N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH，EC 3.10.1.1，MIM 605270)屬於逐步降解葡糖胺聚醣(稱為硫酸乙醯肝素(HS))家族所需的溶酶體水解酶家族。SGSH參與硫酸乙醯肝素降解之第三步驟。SGSH催化N連接硫酸酯自HS之非還原性末端葡萄胺糖苷殘基之水解。野生型人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶cDNA序列係提供在SEQ ID NO: 4之NCBI參考號U30894位置+12至+1521及位置+12至+1521。野生型人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶多肽序列係提供在NP_000190.1 (SEQ ID NO: 5)。野生型人類硫酸酯酶修飾因子1 cDNA序列係提供在SEQ ID NO: 6之NCBI參考號AY208752位置+1至+1125及位置+1至+1125。野生型人類硫酸酯酶修飾因子1多肽序列係提供在NP_877437.2 (SEQ ID NO: 7)。在特定實施例中，SGSH及SUMF1多肽包括其信號序列，而在其他實施例中，一個或兩個均不包含信號序列。在一些實施例中，SGSH序列係以SEQ ID NO: 13及/或以SEQ ID NO: 9之胺基酸1867至3401提供。
AAV cap序列係此項技術中已知的。在PCT專利申請公開案第WO2003/042397號中，示例性AAVrh.10 cap多核苷酸序列係以SEQ ID NO: 59提供，其中序列編碼在核苷酸845至3061之VP1、在核苷酸1256至3061之VP2、及在1454至3061之VP3。示例性AAVrh.10 cap多肽序列係以PCT專利申請公開案第WO2003/042397號之SEQ ID NO: 81之胺基酸1至738提供，其中VP1序列在胺基酸1至738，VP2在胺基酸138至738，及VP3在胺基酸203至738。
在一些實施例中，本揭示內容之一個表現盒及如圖1中所例示的側接ITRs之多核苷酸序列係以SEQ ID NO: 8提供。在一些實施例中，本揭示內容之一個表現盒及如圖3中所例示的側接ITRs之多核苷酸序列係以圖4A至4B及SEQ ID NO: 9提供。在一些實施例中，完整質體p-Lys-SAF-T-5之多核苷酸(其含有SEQ ID NO: 9)係以圖4C至4D及SEQ ID NO: 14提供。
在某些實施例中，包含表現盒之多核苷酸序列係存在於載體或質體(例如選殖載體或表現載體)中，以促進多核苷酸序列之複製或產生。本揭示內容之多核苷酸序列可透過利用在ITR序列或含有限制位點之DNA連接子序列之邊界之相容性限制位點以及熟習此項技術者已知的其他方法插入至載體中。例行用於分子生物學中之質體可用作主鏈，諸如例如pBR322 (New England Biolabs，Beverly，Mass.)、pRep9 (Invitrogen，San Diego，Calif.)、pBS (Stratagene，La Jolla，Calif.)以用於插入表現盒。
本揭示內容之載體或質體可存在於宿主細胞中，例如以便產生用於臨床用途之基因療法載體或病毒顆粒。在特定實施例中，本揭示內容包括包含載體或質體之細胞，該載體或質體包含本揭示內容之表現盒。在特定實施例中，該宿主細胞為293人類胚胎腎臟細胞，諸如例如293T細胞(含有SV40 T抗原之293細胞之高度可轉染衍生物)。其他載體、宿主細胞及產生病毒載體之方法之實例描述於Kotin RM，Hum Mol Genet，2011年4月15日；20(R1): R2-6. Epub 2011 Apr 29)中。
在另外實施例中，本揭示內容包括包含本揭示內容之任何表現盒之基因療法載體或病毒顆粒，其中該基因療法載體或病毒顆粒包括衣殼，例如AAVrh.10衣殼。在特定實施例中，該衣殼包含一或多個AAVrh.10衣殼多肽。
在某些實施例中，本揭示內容之多核苷酸、表現盒及載體可包括一或多個活性多核苷酸或多肽序列之活性變體，諸如啟動子序列、IRES序列或polyA序列之活性變體、或SGSH多肽或SUMF1多肽之活性變體。活性變體包括本文所提供的任何序列之生物活性變體及生物活性片段二者，其可稱為參考序列。在特定實施例中，參考多核苷酸或多肽序列之活性變體與參考多核苷酸或多肽序列具有至少40%、50%、60%、70%，一般至少75%、80%、85%，通常約90%至95%或更高，及通常約97%或98%或99%或更高之序列相似性或一致性，如藉由本文其他地方描述的使用預設參數之序列比對程式確定。例如，在一些實施例中，本揭示內容提供與本文所提供的任何序列(諸如SEQ ID NO: 9、10、11、12、13、14、15、16及/或17)具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之多核苷酸。
在某些實施例中，由於遺傳密碼之簡併性，編碼SGSH或SUMF1之多核苷酸序列之活性變體不同於野生型或天然存在之基因或cDNA序列。因此，儘管多核苷酸序列不同於野生型，但經編碼的SGSH或SUMF1多肽保留野生型序列。因此，本揭示內容涵蓋編碼SGSH或SUMF1多肽或其中的活性變體之任何多核苷酸序列的用途。
在其他實施例中，本身具有活性的多核苷酸序列(例如IRES或polyA序列)之活性變體可在序列上不同於其對應野生型參考序列，儘管其保留其天然活性。參考多核苷酸序列之活性變體一般可與該序列相差多達200個、100個、50個或20個核苷酸殘基，或適當地少至1至15個核苷酸殘基、少至1至10個(諸如6至10個)、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至1個核苷酸殘基。
在某些實施例中，多肽之活性變體具有生物活性，亦即，其等繼續具有參考多肽之酶促活性。此類變體可例如由遺傳多態性及/或由人為操縱產生。參考多肽之活性變體一般可與該多肽相差多達200個、100個、50個或20個胺基酸殘基，或適當地少至1至15個胺基酸殘基、少至1至10個(諸如6至10個)、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至1個胺基酸殘基。在一些實施例中，變體多肽與本文提及的參考序列之區別在於至少一個但少於15個、10個或5個胺基酸殘基。在其他實施例中，其與參考序列之區別在於至少一個殘基但少於20%、15%、10%或5%之殘基。
參考多肽可以多種方式(包括胺基酸取代、刪除、截短及插入)改變以產生活性變體。用於此類操縱之方法一般係此項技術中已知的。例如，可藉由DNA中之突變來製備參考多肽之胺基酸序列變體。用於誘變及核苷酸序列改變之方法係此項技術中熟知的。參見，例如，Kunkel (1985，Proc .Natl .Acad .Sci .USA . 82:488至492)、Kunkel等人(1987，Methods in Enzymol ，154: 367至382)、美國專利第4,873,192號、Watson, J. D.等人(「Molecular Biology of the Gene」，第四版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif.，1987)及其中引用的參考文獻。關於不影響所關注蛋白質之生物活性之適宜胺基酸取代之指南可見於Dayhoff等人(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.，Washington, D.C.)之模型。
在某些實施例中，與參考多肽序列相比，多肽變體在沿著其序列之各個位置含有保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換之胺基酸取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基家族已在此項技術中定義，其一般可細分如下： 酸性：殘基因在生理pH值下失去H離子而具有負電荷及殘基被水溶液吸引以便尋找當該肽在生理pH之水性介質中時其所包含於其中的肽之構象中之表面位置。具有酸性側鏈之胺基酸包括麩胺酸及天冬胺酸；鹼性：殘基因在生理pH下或在其一個或兩個pH單位內與H離子締合而具有正電荷(例如組胺酸)及殘基當該肽在生理pH之水性介質中時被水溶液吸引以便尋找其所包含於其中的肽之構象中之表面位置。具有鹼性側鏈之胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸； 帶電荷：殘基在生理pH下帶電荷，及因此，包括具有酸性或鹼性側鏈之胺基酸(亦即，麩胺酸、天冬胺酸、精胺酸、離胺酸及組胺酸)； 疏水性：殘基在生理pH下不帶電荷及殘基被水溶液排斥以便當該肽在水性介質中時尋找其所包含於其中的肽之構象中之內部位置。具有疏水性側鏈之胺基酸包括酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸及色胺酸；及 中性/極性：殘基在生理pH下不帶電荷，但殘基未充分地被水溶液排斥使得當該肽在水性介質中時其將尋找其所包含於其中的肽之構象中之內部位置。具有中性/極性側鏈之胺基酸包括天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、組胺酸、絲胺酸及蘇胺酸。
胺基酸殘基可進一步細分為環狀或非環狀、及芳族或非芳族(相對於殘基之側鏈取代基之不言自明之分類)、及大的或小的。若殘基含有總共四個碳原子或更少(包含羧基碳)，則該殘基被認為是小的，但限制條件為存在另外的極性取代基；若不是，則為三個或更少。當然，小的殘基總是非芳族的。根據其結構性質，胺基酸殘基可分為兩個或更多個類別。對於天然存在之蛋白質胺基酸，根據該方案之亞分類呈現於表1中。 表1. 胺基酸亞分類
亞類 胺基酸
酸性 天冬胺酸、麩胺酸
鹼性 非環狀：精胺酸、離胺酸；環狀：組胺酸
帶電荷 天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸
小的 甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸、蘇胺酸、脯胺酸
極性/中性 天冬醯胺酸、組胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸
極性/大的 天冬醯胺酸、麩醯胺酸
疏水性 酪胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸
芳族 色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸，
影響鏈定向之殘基 甘胺酸及脯胺酸
保守性胺基酸取代亦包括基於側鏈之分組。例如，具有脂族側鏈之胺基酸組為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；具有脂族羥基側鏈之胺基酸組為絲胺酸及蘇胺酸；具有含醯胺側鏈之胺基酸組為天冬醯胺酸及麩醯胺酸；具有芳族側鏈之胺基酸組為苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；具有鹼性側鏈之胺基酸組為離胺酸、精胺酸及組胺酸；及具有含硫側鏈之胺基酸組為半胱胺酸及甲硫胺酸。例如，可合理地預期將白胺酸替換為異白胺酸或纈胺酸，將天冬胺酸替換為麩胺酸，將蘇胺酸替換為絲胺酸，或將胺基酸類似地替換為結構相關之胺基酸亦不會對所得變體多肽之性質具有重大效應。如本文所述，胺基酸變化是否導致功能性截短及/或變異多肽可容易地藉由分析其酶促活性來確定。保守性取代顯示於表2中的示例性取代標題下方。一般而言，落在本揭示內容之範疇內的胺基酸取代係藉由選擇在其對維持(a)該取代之區域中之肽主鏈之結構，(b)分子在靶位點之電荷或疏水性，或(c)側鏈之大部分之效應方面沒有顯著不同之取代來達成。引入取代後，針對於生物活性篩選變體。 表2.示例性胺基酸取代
原始殘基 示例性取代 較佳取代
Ala Val、Leu、Ile Val
Arg Lys、Gln、Asn Lys
Asn Gln、His、Lys、Arg Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser Ser
Gln Asn、His、Lys， Asn
Glu Asp、Lys Asp
Gly Pro Pro
His Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile Leu、Val、Met、Ala、Phe、Norleu Leu
Leu Norleu、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys Arg、Gln、Asn Arg
Met Leu、Ile、Phe Leu
Phe Leu、Val、Ile、Ala Leu
Pro Gly Gly
Ser Thr Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr Tyr
Tyr Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val Ile、Leu、Met、Phe、Ala、Norleu Leu
因此，參考多肽中之預測非必需胺基酸殘基通常經來自相同側鏈家族之另一胺基酸殘基替換。「非必需」胺基酸殘基為可自一實施例多肽之野生型序列改變而不會消除或實質上改變其活性中之一或多者之殘基。適宜地，該改變實質上不消除此等活性中之一者，例如，該活性係野生型之至少20%、40%、60%、70%或80%、100%、500%、1000%或更高。「必需」胺基酸殘基為當自參考多肽之野生型序列改變時，導致母分子之活性消除，使得存在野生型活性之少於20%之殘基。例如，此類必需胺基酸殘基可包括彼等在來自各種來源之參考多肽之酶促位點中保守之必需胺基酸殘基。
在某些實施例中，本揭示內容亦涵蓋天然存在之參考多肽序列之活性變體，其中該等變體藉由添加、刪除或取代一或多個胺基酸殘基而與天然存在之序列區分開。在某些實施例中，多肽之活性變體包含與本文所述的參考多肽之對應序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或更高序列一致性或相似性之胺基酸序列，且保留該參考多肽之酶促活性。
序列之間的序列相似性或序列一致性(該等術語在本文中可互換使用)之計算係如下進行。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳比較目的比對序列(例如可出於最佳比對在第一及第二胺基酸或核酸序列中之一者或兩者中引入缺口及可出於比較目的忽略非同源序列)。在某些實施例中，出於比較目的而比對的參考序列之長度為參考序列之長度之至少30%，較佳至少40%，更佳至少50%、60%，且甚至更佳至少70%、80%、90%、100%。然後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之一位置被與第二序列中之對應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置係相同的。
兩個序列之間的一致性百分比係將缺口數及每個缺口之長度列入考慮(需引入該等缺口以達成兩個序列之最佳比對)，該等序列共有的相同位置數之函數。
序列之比較及兩個序列之間的一致性百分比之確定可使用數學演算法來達成。在一個實施例中，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比係使用Needleman及Wunsch，(1970，J .Mol .Biol . 48: 444至453)演算法(其已整合至 GCG套裝軟體中之GAP程式中)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣、及16、14、12、10、8、6或4之缺口權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來確定。在又另一個較佳實施例中，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比係使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之缺口權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來確定。一個尤佳參數組(除非另有說明，否則應使用的參數組)為缺口罰分(gap penalty)為12、缺口延伸罰分(gap extend penalty)為4、及移碼缺口罰分(frameshift gap penalty)為5之Blossum 62計分矩陣。用於產生基因療法載體之方法
本揭示內容之基因療法載體可藉由此項技術中已知且先前描述於例如PCT專利申請公開案第WO03042397號及美國專利第6,632,670號中之方法來產生。
AAV基因組為單股去氧核糖核酸(ssDNA)(正義或反義)，其為約4.7千鹼基長。該基因組包含在DNA股兩端之ITRs及兩個開放閱讀框(ORFs)：rep及cap。Rep包含編碼AAV生命週期所需的Rep蛋白之四個重疊基因，及cap包含編碼衣殼蛋白之重疊核苷酸序列：VP1、VP2及VP3，其相互作用以形成二十面體對稱之衣殼。
咸信ITRs係將AAV DNA整合至宿主細胞基因組中且自其救援所必需的，以及對AAV DNA進行有效衣殼化及產生完全組裝的AAV顆粒所必需的。關於基因療法，ITRs似乎是在治療基因旁邊需呈順式的唯一序列，及結構(cap)及包裝(rep)基因可以反式傳遞。因此，經建立用來產生含有治療基因之重組AAV (rAAV)載體之某些方法涉及使用兩個或三個質體。在特定實施例中，第一質體包含表現盒，該表現盒包含編碼治療性多肽之多核苷酸序列，該多核苷酸序列含有側接ITRs。在一些實施例中，第二質體包含rep及cap基因及側接ITRs。在一些實施例中，第三質體提供輔助功能(例如自腺病毒血清型5)。為產生重組AAV載體原種(vector stocks)，標準方法在用於將適宜細胞與編碼治療性多肽之AAV載體質體一起共轉染之質體上提供AAV rep及cap基因產物。在一些實施例中，標準方法在用於將適宜細胞與編碼治療性多肽之AAV載體質體一起及與提供輔助功能之質體一起共轉染之質體上提供AAV rep及cap基因產物。
在特定實施例中，在含有AAV ITR序列之複製質體上提供AAV rep及cap基因。在一些實施例中，rep蛋白活化ITR作為複製起點，導致質體之複製。複製起點可包括但不限於SV40複製起點、Epstein-Barr (EBV)複製起點、ColE1複製起點、以及熟習此項技術者已知的其他起點。例如，在複製起點需要活化蛋白質之情況下，例如SV40起點需要T抗原，EBV起點需要EBNA蛋白質，活化蛋白質可藉由穩定轉染以便產生細胞系來源(例如293T細胞)，或藉由與含有適宜基因之質體瞬時轉染來提供。
在其他實施例中，可在不包含複製起點之非複製質體上提供AAV rep及cap基因。此種非複製質體進一步確保細胞之複製設備經定向以複製重組AAV基因組，以便最佳化病毒之產生。可藉由使用特定啟動子以驅動此等基因之表現來調節藉由此類非複製質體編碼的AAV蛋白之水平。此類啟動子尤其包括AAV啟動子、以及來自外源來源(例如CMV、RSV、MMTV、E1A、EF1a、肌動蛋白、細胞角蛋白14、細胞角蛋白18、PGK)之啟動子、以及熟習此項技術者已知的其他啟動子。藉由此等輔助質體產生的rep及cap蛋白之水平可藉由針對每個基因選擇最適合於所需蛋白質之水平之啟動子來個別地調節。
可採用標準重組DNA技術來構建用於產生本揭示內容之病毒載體之輔助質體(參見例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel., F.等人編，Wiley and Sons，New York 1995)，包括利用在含有限制位點之基因及AAV ITR序列(如果使用的話)或DNA連接子序列之邊界的相容性限制位點、以及熟習此項技術者已知的其他方法。
在一個實施例中，本揭示內容之基因療法載體係藉由將兩個或三個質體轉染至293或293T人類胚胎腎臟細胞系中來產生。在一些實施例中，編碼治療基因之DNA係由一個質體提供，及衣殼蛋白(來自AAVrh.10)、複製基因(來自AAV2)及輔助功能(來自腺病毒血清型5)均由第二質體反式提供。在一些實施例中，編碼治療基因之DNA係由一個質體提供，衣殼蛋白(來自AAVrh.10)及複製基因(來自AAV2)係由第二質體反式提供，及輔助功能(來自腺病毒血清型5)係由第三質體提供。在特定實施例中，該第一質體包含本揭示內容之表現盒，包括側接ITRs。
細胞培養後，藉由冷凍熔融循環自細胞釋放基因療法載體，藉由碘克沙醇(iodixanol)逐步梯度純化，接著在Hi-Trap QHP柱上進行離子交換層析。所得的基因療法載體可藉由離心柱(spin column)濃縮。純化載體可冷凍儲藏(在-60ºC或低於-60ºC)(例如)在磷酸鹽緩衝鹽水中。
最終調配載體之表徵可透過SDS-PAGE及衣殼蛋白之西方墨點、轉基因DNA之實時PCR、西方墨點分析(Western analysis)、活體內及活體外一般及特異性外來病毒及功能性基因轉移之酶促檢定來達成。治療方法
本揭示內容包括治療腦疾病及病症、神經疾病及病症、及遺傳性疾病及病症(包括但不限於溶酶體儲積症，諸如MPS)之方法。
在某些實施例中，本揭示內容提供一種治療MPSIIIA (聖菲利柏氏症候群)之方法，該方法包括對有此需要的個體提供包含經設計為在被個體之細胞吸收時表現SGSH之基因療法載體之組合物。在特定實施例中，該組合物進一步包含醫藥上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑，例如磷酸鹽緩衝鹽水。在某些實施例中，個體為哺乳動物，諸如人類。在特定實施例中，個體已經診斷患有MPSIIIA，例如，透過基因測試以識別個體N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(sgsh)基因中之突變或藉由測量獲自個體之生物樣品之SGSH活性。在一些實施例中，本文所提供的方法恢復個體整個腦中正常SGSH活性之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或更高。
在特定實施例中，基因療法載體包含本揭示內容之任何表現盒。因此，在特定實施例中，本揭示內容包括藉由對有此需要的個體投與包含基因療法載體之組合物來治療MPSIIIA之方法，該基因療法載體包含表現盒，該表現盒以5’至3’順序包含： 啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 及 多腺苷酸化(polyA)序列。
在一些實施例中，該基因療法載體不包含編碼SUMF1之多核苷酸序列，且不包含IRES序列。
在一個實施例中，該表現盒係經ITRs側接，及因此該載體以隨後5’至3’順序包含： AAV2 ITR序列； CAG啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 人類生長激素polyA序列；及 AAV2 ITR序列。
在特定實施例中，SGSH多肽包含野生型人類SGSH多肽或由其組成，及在一個特定實施例中，該表現盒及側接ITRs包含記述於SEQ ID NO: 9的多核苷酸序列。
在某些實施例中，將包含基因療法載體之組合物投與至個體的腦。例如，在一些實施例中，包含基因療法載體之組合物係經由直接注射至腦實質中來投與。在某些實施例中，其係經腦內投與。在一個實施例中，其係藉由腦內注射直接投與至腦中。該技術允許靶向選擇性神經解剖位點來控制載體傳遞。
在不希望受任何特定理論約束下，咸信在注射至腦實質中後，AAV載體顆粒將局部擴散及亦可沿著軸突運輸至遠端解剖腦結構。載體顆粒係藉由神經元細胞、神經膠質細胞或微膠質細胞內化。此等細胞類型中之每一者在MPSIIIA患者中均缺乏SGSH酵素且遭受未降解硫酸乙醯肝素分解代謝物之毒性積聚。進入細胞後，編碼SGSH蛋白之重組基因組經運輸至細胞核中，在此其經歷一系列分子轉化而導致其穩定地確立為雙股去氧核糖核酸(DNA)分子。該DNA藉由細胞機制主動地轉錄為信使核糖核酸(mRNA)。mRNAs經轉譯為SGSH，其將補充細胞之缺乏。
酵素補充及溶酶體儲積之校正據認為是藉由兩種不同機制進行：  (1)該酵素可達到含有並表現AAV攜帶的轉基因且降解積聚的分解代謝物之細胞之溶酶體；或(2)該酵素可在此等細胞外部釋放，藉由遠端細胞再捕獲，及通向其溶酶體。因此，有限群組之基因改造細胞允許校正擴展之腦區域。轉導細胞將連續表現及傳遞酵素，因此構成酵素產生之腦內永久來源。
在特定實施例中，在個體腦內的一或多個(例如兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或十二個)位點進行腦內投與。投與可在腦的一側或兩側進行。例如，在將基因療法載體投與腦的兩個或更多個位點之情況下，可將其投與至腦的兩側，例如每側上之相似或相同位置。在特定實施例中，將基因療法載體投與至個體腦內的選自以下之一或多個位點：右前、左前、右內、左內、右後及左後。
在某些實施例中，透過一或多個鑽孔進行腦內投與，該等鑽孔可在鄰近殼核之白質中。在特定實施例中，基因療法載體係穿過單個鑽孔投與腦或白質內的兩個或更多個位點。例如，基因療法載體之兩個或更多個沉積物可穿過單個鑽孔或徑路投與，其中一個係深的及另一個係淺層的，此可增強實質擴散。在某些實施例中，深注射係在距皮質表面約1.5 cm至約3.0 cm、或約1.7 cm至約2.5 cm、或約2 cm之深度進行。在某些實施例中，淺層注射係在距皮質表面約0.5 cm至約2.0 cm、或約0.7 cm至約1.5 cm、或約1 cm之深度進行。
在某些實施例中，基因療法載體係經由腦內注射投與，其中該注射係在單個深度進行。在一些實施例中，基因療法載體係在單一深度經由雙側注射投與。例如，在一些實施例中，該基因療法載體係經由腦內注射穿過白質中的2個、4個、6個、8個、10個、12個、14個或16個鑽孔投與至個體腦內的2個、4個、6個、8個、10個、12個、14個、16個或更多個位點，其中基因療法載體之單個沉積物係穿過每個鑽孔或徑路投與。在一些實施例中，基因療法載體在單一深度之投與驚人地優於基因療法載體在超過一個深度(例如在兩個深度)之投與。在不希望受理論約束下，當基因療法載體在單一深度投與時，與兩個或更多個深度相比，載體擴散更有效。
在一個特定實施例中，基因療法載體係經由腦內注射穿過白質中的六個鑽孔投與至個體腦內的六個位點，其中基因療法載體之單個沉積物係穿過每個鑽孔或徑路投與。因此，該基因療法載體係在單一深度於每個注射鑽孔內投與。於每個鑽孔內的投與位置可選自：右前、左前、右內、左內、右後及左後。在一些實施例中，於每個鑽孔內的投與位置可選自：右前淺層、右前深、左前淺層、左前深、右內淺層、右內深、左內淺層、左內深、右後淺層、右後深、左後淺層及左後深。在一些實施例中，在距皮質表面約1.5 cm至約3.0 cm、或約1.7 cm至約2.5 cm、或約2 cm深度處進行深注射；及在距皮質表面約0.5 cm至約2.0 cm、或約0.7 cm至約1.5 cm、或約1 cm深度處進行淺層注射。在一些實施例中，可基於MRI影像來選擇深及/或淺層注射。在一些實施例中，可投與深及淺層注射之組合，使得每次注射在單一深度投與，及每次注射係深或淺層注射。在一些實施例中，投與至個體之所有注射係深注射。在一些實施例中，投與至個體之所有注射係淺層注射。
注射可在單個神經外科手術過程中達成。腦內注射可使用輸液泵進行。
在本揭示內容之各種實施例中，術語或單位基因組複本( gc)可與術語或單位病毒基因組(vg)互換使用。
在某些實施例中，對個體投與總共約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1014 gc、約5.0 x 1010 gc至約5.0 x 1013 gc、約5.0 x 1010 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約5.0 x 1012 gc、約5.0 x 1011 gc至約5.0 x 1012 gc、約8.0 x 1011 gc至約8.0 x 1012 、或約7.0 x 1012 gc至約7.4 x 1012 gc病毒載體。在特定實施例中，對個體投與約7.2 x 1012 gc病毒載體。在某些實施例中，對個體的每個位點投與約0.8 x 109 gc至約0.8 x 1013 gc、約0.4 x 1010 gc至約0.4 x 1013 gc、約0.4 x 1010 gc至約0.8 x 1012 gc、約0.8 x 1010 gc至約0.8 x 1012 gc、約0.8 x 1010 gc至約0.4 x 1012 gc、或約0.4 x 1011 gc至約0.4 x 1012 gc病毒載體。在特定實施例中，對個體的每個位點投與約0.6 x 1011 gc病毒載體。在特定實施例中，對個體的腦或白質的十二個位點中之各者投與約0.6 x 1011 gc病毒載體，使得投與約7.2 x 1011 gc病毒載體至該個體。在特定實施例中，對個體的每個位點投與約1.2 x 1012 gc病毒載體。在特定實施例中，對個體的腦或白質的六個位點中之各者投與約1.2 x 1012 gc病毒載體，使得投與約7.2 x 1012 gc總病毒載體至該個體。在一些實施例中，傳遞至個體之病毒載體的量為約6.0 x 109 至約8.0 x 109 gc/公克腦組織(gc/gr)。在一些實施例中，傳遞至個體之病毒載體的量為約7.0 x 109 gc/gr至約7.4 x 109 gc/gr。在一些實施例中，傳遞至個體之病毒載體的量為約7.2 x 109 gc/gr。
在一些實施例中，該基因療法載體係以包含PBS緩衝液之調配物投與。在一些實施例中，該PBS緩衝液不包含任何賦形劑或防腐劑。在一些實施例中，該PBS緩衝液之組合物包含KCl、KH2 PO4 、NaCl及/或Na2 HPO4 。在一些實施例中，該PBS緩衝液之組合物包含約2.67 mM KCl、約1.47 mM KH2 PO4 、約137.9 mM NaCl及約8.06 mM Na2 HPO4 。在一些實施例中，該調配物之pH為約6.8至約7.8、或約7.2至7.4。
在某些實施例中，投與每個位點之包含基因療法載體之組合物的體積為約10 µl至約600 µl、約20 µl至約550 µl、約30 µl至約200 µl、約50 µl、約100 µl、或約150 µl。在一些實施例中，在每次注射中投與每個位點之包含基因療法載體之組合物的體積為約200 µl、約300 µl、約400 µl、約500 µl、約600 µl。在某些實施例中，每次注射之體積為約500 μl。在特定實施例中，包含基因療法載體之組合物之投與之輸液速率為約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.5 µl/min至約5 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、或約0.4 µl/min至約3.0 µl/min或約2.0 µl/min。在一些實施例中，組合物之投與之輸液速率為約5 μl/min。在一些實施例中，包含基因療法載體之組合物係以約5 μl/min之流速經由約500 μl之多次注射來投與。
在哺乳動物(包括人類)中之給藥選擇可係基於以下效力及安全性標準：(1)傳遞至整個腦之載體顆粒的總量應足以在大體積腦中誘導SGSH產生且應防止腦中儲積損傷之發展；及(2)每個沉積物之載體顆粒的量不得引起局部毒性。
於其他MPS模型上之先前臨床前研究提供一些關於效力之資訊。已在MPS之犬類模型(MPSI及MPSIIIB)中，在立體定向注射至腦中後評估AAV載體之劑量。此等研究得出的結論是，8個40 µl x 1.5 x 1012 vg/ml之沉積物(代表每個沉積物6 x 1010 vg)係足以在整個狗腦中有效地傳遞載體。4倍高的給藥係安全的，儘管就腦組織中之載體傳遞而言，其可能並非更有效。此表徵每個沉積物6 x 1010 vg之劑量為安全且有效的。
在一個特定實施例中，本揭示內容提供一種治療MPSIIIA之方法，該方法包括對有此需要的個體(例如經診斷患有MPSIIIA的人類)投與包含病毒載體之組合物，該病毒載體包含表現盒，該表現盒以5’至3’順序包含以下序列，其中該CAG啟動子序列係可操作地連接至編碼SGSH之多核苷酸序列： AAV2 ITR序列； CAG啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 人類生長激素polyA序列；及 AAV2 ITR序列， 其中該組合物係經由腦內注射穿過個體頭部中的六個鑽孔投與至個體腦中的六個位點， 其中該組合物係投與單個位點且在單個深度穿過每個鑽孔或徑路， 其中該六個位點為右前、左前、右內、左內、右後及左後， 其中對該十二個位點中之每個位點投與約0.8 x 109 至0.8 x 1013 gc或約1.2 x 1012 gc病毒載體， 其中投與該十二個位點中之每個位點之組合物的體積為約10 μl至約600 μl、或約500 μl，及 其中投與該組合物之輸液速率為約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、約0.4 µl/min至約3.0 µl/min、或約2.0 µl/min、或約5.0 µl/min。
在某些實施例中，投與係使用輸液泵進行。
用於治療MPSIIIA之方法係有利於將治療劑傳遞至腦及神經系統，及可藉由使用不同治療劑對其進行修飾以治療其他腦疾病或病症或神經疾病或病症。
如隨附實例中進一步描述，本文所提供的基因療法載體LYS-SAF302相對於基因療法載體(諸如LYS-SAF301)提供顯著改良。例如，在一些實施例中，LYS-SAF302在產生SGSH及減少腦內HS的量方面導致優異之表現及效力。LYS-SAF302可安全且有效地在7.2 x 1012 vg之總劑量下以約5.0 µl/min之輸液速度給予。例如，LYS-SAF302分500 µL體積注射(每次注射在單個深度)及5.0 µl/min之6次投與來給予可高效、安全地治療涉及SGSH基因中突變之神經疾病。
因此，在某些實施例中，本揭示內容包括一種於有此需要的個體中治療由突變基因所引起之腦或神經疾病或病症之方法，該方法包括對個體腦內投與基因療法載體，該基因療法載體包含表現盒，該表現盒包含編碼由呈其野生型或非突變形式之該基因編碼的多肽之多核苷酸序列或其活性變體，其中該多核苷酸序列係可操作地連接至啟動子序列，及其中該腦內投與包括投與約5 x 1010 gc至約5 x 1013 gc、或約1.0 x 1011 gc至約1.0 x 1013 gc，分約六個至約十二個劑量，每個劑量總共約5.0 x 109 gc至約5.0 x 1012 gc、或約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1012 gc、或約6 x 1010 gc，體積為約10 µl至500 µl。在某些實施例中，多核苷酸序列係可操作地連接至CAG啟動子。在某些實施例中，每個劑量係以約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、約0.5 µl/min至約5.0 µl/min、約2.0 µl/min、或約5 µL/min之速率投與。在特定實施例中，使用視需要包括導管之傳遞裝置進行腦內投與。在某些實施例中，腦內投與包括穿過白質中鄰近殼核之六個孔投與載體至個體之腦或白質。在特定實施例中，十二個劑量中之兩個係穿過六個孔中之每個孔投與，其中該兩個劑量中之一個係深投與及該兩個劑量中之一個係淺層投與。在某些實施例中，該十二個劑量中之每一個均係經由導管投與。在一個實施例中，腦內投與係使用輸液泵進行。在一些實施例中，腦內投與包括分六個劑量投與載體至個體的腦或白質，其中該等劑量中之每一個係在單個深度投與。
本揭示內容進一步包括一種治療有此需要的個體的腦或神經系統疾病或病症之方法，或一種提供治療劑至有此需要的個體的腦之方法，該方法包括對有此需要的個體(例如人類)投與包含治療劑之組合物，其中該組合物係經由腦內注射穿過個體頭部中的六個鑽孔投與至個體腦中的六個或十二個位點。在一些實施例中，該組合物係穿過每個鑽孔或徑路投與兩個位點，其中該兩個位點中之一個係深的及該兩個位點中之另一個係淺層的，其中該十二個位點係右前淺層、右前深、左前淺層、左前深、右內淺層、右內深、左內淺層、左內深、右後淺層、右後深、左後淺層及左後深，其中投與該十二個位點中之每一個之組合物的體積為約10 µl至約300 µl，及其中投與該組合物之輸液速率為約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、約0.5 µL至約5.0 µL、約0.4 µl/min至約3.0 µl/min、或約2.0 µl/min、或約5.0 µl/min。在某些實施例中，投與係使用輸液泵進行。在一些實施例中，將該組合物投與至個體頭部內的鑽孔，其中該組合物係穿過每個鑽孔或徑路投與單個位點。在一些實施例中，該單個鑽孔係選自深或淺層位點。例如，在一些實施例中，該等投與中之每次投與為深位點。在一些實施例中，該等投與中之每次投與為淺層位點。在一些實施例中，該多次投與為深及淺層位點之混合物，亦即，投與之每個位點係獨立地選擇以進行深或淺層投與。
本揭示內容涵蓋使用任何類型之治療劑，包括但不限於小分子、多肽、抗體及其片段、多核苷酸，例如siRNA、反義RNA、miRNA及病毒載體。在特定實施例中，該治療劑為病毒載體，例如AAV載體，諸如AAVrh.10載體。
在特定實施例中，該方法係用於治療由遺傳缺陷引起之溶酶體儲積症，該遺傳缺陷包括但不限於MPS(包括但不限於聖菲利柏氏C型、聖菲利柏氏D型、S1、Hurler-Scheie、聖菲利柏氏A型、Hunter、Morquio、聖菲利柏氏B型、Maroteaux -Lamy)、高歇氏病(Gaucher)、異染性白質失養症、法布里(Fabry)、克拉布(Krabbe)、龐培氏(Pompe)、胱胺酸症、Tay-Sachs、C型尼曼匹克症(Niemann Pick C)、A型/B型尼曼匹克症、黏脂貯積病(Mucolipidosis)II/III、Gm1神經節苷脂儲積症、桑德霍夫病(Sandhoff)或本文所述的任何其他疾病，其中該治療劑為提供與特定疾病相關聯之缺失或突變酵素之功能或野生型形式之病毒載體。酵素可在AAV病毒載體(諸如彼等本文所述者中之任何者)中提供，但編碼多核苷酸序列之SGSH(及視需要IRES)經替換為編碼所需酵素之多核苷酸序列。此等疾病之遺傳基礎係已知的，及此類酵素及多核苷酸序列係此項技術中已知的且可用的。例如，與MPSII相關之酵素為艾杜糖醛酸(iduronate)-2-硫酸酯酶；與MPS1相關之酵素為α-L-艾杜糖醛酸酶，與MPSIIID相關之酵素為葡萄糖胺-6-硫酸酯酶，與MPSIIIC相關之酵素為N-乙醯基轉移酶；與MPSIIIB相關之酵素為α-N-乙醯基葡萄糖胺脢或葡萄糖醛酸-2-硫酸酯酶，及與MPSVII相關之酵素為β-D-葡萄糖苷酸酶或葡萄糖胺-3-硫酸酯酶。
亦可藉由根據本文所述的方法，包括但不限於本文所述的任何方法，將治療劑傳遞至腦來治療其他腦或神經疾病及病症。使用基因療法及免疫抑制劑之組合進行治療之方法
本揭示內容亦包括使用基因療法載體與一或多種免疫抑制劑之組合來治療遺傳性病症之方法。本揭示內容之驚人且意外之發現是，在投與基因療法載體後使用免疫抑制劑進行的長期治療藉由降低對基因療法載體之發炎性或免疫反應而增強基因療法治療之效力。
在某些實施例中，本揭示內容包括一種治療MPSIIIA之方法，該方法包括對有此需要的個體投與： (1) 基因療法載體，其包含表現盒，該表現盒包含編碼SGSH多肽之多核苷酸序列或其活性變體，其中該多核苷酸序列係可操作地連接至啟動子序列；及 (2) 一或多種免疫抑制劑， 其中該一或多種免疫抑制劑中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少兩個月、至少三個月、至少四個月、至少五個月、至少六個月、至少八個月、至少十個月或至少十二個月之持續時間。在某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑中之至少一者係在個體的剩餘壽命提供至個體，或只要該個體自表現盒產生可偵測水平之SGSH多肽就提供至個體。
在特定實施例中，本文所述的本揭示內容之任何基因療法載體可用於實踐該方法。
在一個特定實施例中，本揭示內容包括一種治療有此需要的個體之MPSIIIA之方法，該方法包括：對有此需要的個體(例如經診斷患有MPSIIIA的人類)投與： (1) 包含病毒載體之組合物，該病毒載體包含表現盒，該表現盒以自5’至3’之順序包含以下序列，其中該CAG啟動子序列係可操作地連接至編碼SGSH之多核苷酸序列： a. AAV2 ITR序列； b. CAG啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； c. 人類生長激素polyA序列；及 d. AAV2 ITR序列；及 (2) 一或多種免疫抑制劑， 其中該一或多種免疫抑制劑中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少兩個月、至少三個月、至少四個月、至少五個月、至少六個月、至少八個月、至少十個月或至少十二個月之持續時間。在某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑中之至少一者係在個體的剩餘壽命提供至個體，或只要該個體自表現盒產生可偵測水平之SGSH多肽就提供至個體。
在此等方法之特定實施例中，此等方法包括以下特徵中之一者或多者：該組合物係經由腦內注射穿過個體頭中的鑽孔投與至個體的腦；該組合物係經由四個至八個鑽孔投與；該組合物係穿過每個鑽孔或徑路投與一個或兩個位點，其中該等位點係獨立地深的或淺層的；該等位點係選自右前淺層、右前深、左前淺層、左前深、右內淺層、右內深、左內淺層、左內深、右後淺層、右後深、左後淺層及左後深，將約0.8 x 109 gc至約0.8 x 1013 gc、約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1013 、或約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1012 gc或約6 x 1010 gc或約1.2 x 1012 gc之病毒載體劑量投與該六個或十二個位點中之各者， 其中投與該十二個位點中之各者之組合物的體積為約10 µl至約600 µl，及/或其中投與該載體之輸液速率為約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、約0.4 µl/min至約3.0 µl/min或約2.0 µl/min、或約5.0 µl/min。在某些實施例中，投與係使用輸液泵進行。在某些實施例中，該組合物係投與以上所列舉的所有十二個位點。在一個實施例中，該方法包括以上所列舉的所有特徵。
在包括提供一或多種免疫抑制劑之方法之特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑包括鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如他克莫司)、大環內酯(例如西羅莫司(sirolimus)或雷帕米汀(rapamicyn))及/或黴酚酸酯。在某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少三個月、至少四個月、至少五個月、至少六個月、至少八個月、至少十個月或至少十二個月之持續時間。在某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑中之至少一者係在投與基因療法載體之前提供至個體持續一段時間。
在一個特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑包含鈣調神經磷酸酶抑制劑，例如他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少十二個月之時間。在一個特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑包含大環內酯，例如西羅莫司，其係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少十二個月之時間。在某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑包括鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如他克莫司)及黴酚酸酯。在某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑包括大環內酯(例如西羅莫司)及黴酚酸酯。在特定實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑或大環內酯係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少十二個月之時間，及該黴酚酸酯係在投與基因療法載體前約兩週開始提供至患者持續約兩個月。
在另一個特定實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以0.05 mg/kg/天至1.0 mg/kg/天或約0.2 mg/kg/天之劑量提供至個體持續至少兩個月或至少三個月。在另一個特定實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至15 ng/ml之血液他克莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在三個月期間的時間。在另一個特定實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成7 ng/ml至10 ng/ml之血液他克莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在四個月至十二個月期間的時間。在特定實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如他克莫司)係在投與基因療法載體後提供至個體持續長達一年、長達兩年、長達三年、長達四年、長達五年、或持續個體的壽命期間。
在另一個實施例中，該大環內酯為西羅莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以3 mg/kg/天或約1.5 mg/kg/每天兩次之劑量提供至個體持續至少兩個月或至少三個月。在另一個特定實施例中，該大環內酯為西羅莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至25 ng/ml之血液西羅莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在三個月期間的時間。在另一個特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑為西羅莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成20 ng/ml之血液西羅莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在第二個月至第六個月期間的時間。在另一個特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑為西羅莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至15 ng/ml之血液西羅莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在六個月內的時間段。
在另一個實施例中，該一或多種免疫抑制劑包含黴酚酸酯，其係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續長達兩個月或約兩個月。在某些實施例中，該黴酚酸酯係以200 mg/m2 /天至1200 mg/m2 /天或約600 mg/m2 /天之劑量提供至個體。
在另一個實施例中，該方法進一步包括在投與基因療法載體後立刻提供普賴蘇穠(prednisolone)至個體持續一段在三天至十天、約五天、約六天、或約七天之間的持續時間。在特定實施例中，該普賴蘇穠係以約0.2 mg/kg/天至約5 mg/kg/天或約1 mg/kg/天之劑量提供至個體。
在特定方法中，該個體係提供：(1)普賴蘇穠，以約1 mg/kg/day之劑量，開始於投與基因療法載體之前或之後的十二小時內且持續約10天；(2)他克莫司，以約0.2 mg/kg/天之起始劑量(例如以兩次分開劑量給予)，在投與基因療法載體前14天開始且在治療7天後調適以在投與基因療法載體後的頭三個月內達成10至15 ng/ml之殘餘劑量及自第四個月直至至少一年達成7至10 ng/ml之殘餘劑量；及(3)黴酚酸酯，以600 mg/m2(最多2次)之劑量每天兩次，在投與基因療法載體前14天開始且在投與基因療法載體後維持兩個月或八週。
在特定方法中，該個體經提供：(1)普賴蘇穠，以約1 mg/kg/天之劑量，開始於投與基因療法載體之前或之後的十二小時內且持續約10天；(2)西羅莫司，以緊接在投與基因療法載體後六個月內的時間段達成10 ng/ml至15 ng/ml之血液西羅莫司濃度的劑量；及(3)黴酚酸酯，以600 mg/m2 (最多2次)之劑量每天兩次，在投與基因療法載體前14天開始且在投與基因療法載體後維持兩個月或八週。
在另一個特定實施例中，本揭示內容包括一種治療MPSIIIA之方法，該方法包括對有此需要的個體(例如經診斷患有MPSIIIA之人類)投與： (1) 包含病毒載體之組合物，該病毒載體包含表現盒及側接序列，該表現盒及側接序列以5’至3’順序包含下列，其中該CAG啟動子序列係可操作地連接至編碼SGSH之多核苷酸序列： a. AAV2 ITR序列； b. CAG啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體 c. 人類生長激素polyA序列；及 d. AAV2 ITR序列， 其中該組合物係經由腦內注射穿過個體頭部內的六個鑽孔投與至個體腦內的十二個位點， 其中該組合物係穿過每個鑽孔或徑路投與一個或兩個位點。
在一些實施例中，該等注射位點係選自由右前淺層、右前深、左前淺層、左前深、右內淺層、右內深、左內淺層、左內深、右後淺層、右後深、左後淺層及左後深組成之群， 其中投與該個體之組合物的總量為約5 x 1010 gc至約5 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1014 gc、約5.0 x 1010 gc至約5.0 x 1013 gc、約5.0 x 1010 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約1.0 x 1013 gc、約1.0 x 1011 gc至約5.0 x 1012 gc、或約5.0 x 1011 gc至約5.0 x 1012 gc，其中將約5.0 x 109 gc至約5.0 x 1012 gc、約1.0 x 1010 gc至約1.0 x 1012 gc、約0.8 x 109 gc至約0.8 x 1013 gc、約0.4 x 1010 gc至約0.4 x 1013 gc、約0.4 x 1010 gc至約0.8 x 1012 gc、約0.8 x 1010 gc至約0.8 x 1012 gc、約0.8 x 1010 gc至約0.4 x 1012 gc、或約0.4 x 1011 gc至約0.4 x 1012 gc或約6 x 1010 gc或約1.0 x 1012 gc或約1.2 x 1012 gc或約1.4 x 1012 gc之病毒載體投與該十二個位點中之各者，其中投與該十二個位點中之各者之組合物的體積為約10 µl至約600 µl，其中投與該載體之之輸液速率為約0.1 µl/min至約10 µl/min、約0.2 µl/min至約8 µl/min、約0.3 µl/min至約6 µl/min、或約0.4 µl/min至約4.0 µl/min、約0.4 µl/min至約3.0 µl/min或約2.0 µl/min或約5.0µl/min；及 (2) 一或多種免疫抑制劑， 其中該一或多種免疫抑制劑包含以下或由以下組成：普賴蘇穠，以約1 mg/kg/天之劑量，開始於投與基因療法載體之前或之後的十二小時內且持續約10天；他克莫司，以約0.2 mg/kg/天之起始劑量(例如以兩次分開劑量給予)在投與基因療法載體前14天開始且在治療7天後調適以在投與基因療法載體後的頭三個月內達成10至15 ng/ml之殘餘劑量及自第四個月直至至少一年達成7至10 ng/ml之殘餘劑量；及黴酚酸酯，以600 mg/m2(最多2次)之劑量每天兩次，在投與基因療法載體前14天開始且在投與基因療法載體後維持兩個月或八週。
熟習此項技術者當明瞭，與共投與一或多種免疫抑制劑相關之以上方法及優點可藉由使用投與突變或缺失基因產物之功能複本之載體之基因療法而經調適用於治療其他遺傳性疾病或病症。
因此，本揭示內容進一步包括一種治療有此需要的個體之由突變或缺失基因引起之疾病或病症之方法，該方法包括： (1) 對個體投與基因療法載體，該基因療法載體包含表現盒，該表現盒包含編碼由呈其野生型或非突變形式之基因編碼的多肽之多核苷酸序列或其活性變體，其中該多核苷酸序列係可操作地連接至啟動子序列；及 (2) 對個體提供一或多種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少兩個月、至少三個月、至少四個月、至少五個月、至少六個月、至少七個月、至少八個月、至少十個月或至少十二個月之持續時間。 在特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑包括鈣調神經磷酸酶抑制劑、視需要之他克莫司或黴酚酸酯、及/或大環內酯(例如西羅莫司或雷帕米汀)。
在其他相關實施例中，本揭示內容包括一種治療有此需要的個體之由突變基因引起之腦病症之方法，該方法包括：對個體投與基因療法載體，該基因療法載體包含表現盒，該表現盒包含編碼由呈其野生型或非突變形式之基因編碼的多肽之多核苷酸序列或其活性變體，其中該多核苷酸序列係可操作地連接至啟動子序列；及對個體提供一或多種免疫抑制劑，其中該免疫抑制劑中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續一段至少兩個月之時間。
在特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑包含彼等本文所述者中之任何者或彼等本文所述者之任何組合，包括在將免疫抑制劑與基因療法載體組合投與以傳遞SGSH多肽之情況下本文所述的任何給藥方案。在一個實施例中，該一或多種免疫抑制劑包括鈣調神經磷酸酶抑制劑、視需要之他克莫司及黴酚酸酯。在另一個實施例中，該一或多種免疫抑制劑包含大環內酯、視需要之西羅莫司及黴酚酸酯。在特定實施例中，在投與基因療法載體後立刻將鈣調神經磷酸酶抑制劑或大環內酯係提供至個體持續一段至少三個月、至少六個月或至少十二個月之時間。
在其中鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司之某些實施例中，其係在投與基因療法載體後立刻以0.05 mg/kg/天至1.0 mg/kg/天或約0.2 mg/kg/天之劑量提供至個體持續至少兩個月或至少三個月。在其中鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司之某些實施例中，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至15 ng/ml之血液他克莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在三個月期間的時間。在其中鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司之某個實施例中，其係在投與基因療法載體後立刻以達成7 ng/ml至10 ng/ml之血液他克莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在第四個月至第十二個月期間的時間。
在其中大環內酯為西羅莫司之某些實施例中，其係在投與基因療法載體後立刻以3 mg/kg/天或約1.5 mg/kg/每天兩次之劑量提供至個體持續至少兩個月或至少三個月。在其中大環內酯為西羅莫司之特定實施例中，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至25 ng/ml之血液西羅莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在三個月期間的時間。在某些實施例中，其中該大環內酯為西羅莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成20 ng/ml之血液西羅莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在第二個月至第六個月期間的時間。在其中大環內酯為西羅莫司之另一個特定實施例中，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至15 ng/ml之血液西羅莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在第六個月內的時間。
在某些實施例中，其中該一或多種免疫抑制劑包含黴酚酸酯，其係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續長達兩個月或約兩個月。在特定實施例中，該黴酚酸酯係以200 mg/m2 /天至1200 mg/m2 /天或約600 mg/m2 /天之劑量提供至個體。
在特定實施例中，該方法進一步包括在投與基因療法載體後立刻提供普賴蘇穠至個體持續一段在三天至十天、約五天、約六天、或約七天之間的持續時間。
另外，以上關於治療MPSIIIA所述的方法之任何特定特徵可存在於更一般地與使用任何基因療法載體相關之方法中，包括但不限於特定的免疫抑制劑或其組合及特定劑量。
本揭示內容之此等方法可使用基因療法載體與一或多種免疫抑制劑之組合來用於治療任何遺傳性疾病或病症，包括彼等由一或多個基因之缺陷(諸如例如基因突變或刪除)引起者。許多病症及疾病之遺傳基礎係已知的。在某些實施例中，使用本揭示內容之方法來治療溶酶體儲積症或病症，包括任何彼等以上所述者。可根據本揭示內容之方法治療的溶酶體儲積症及病症包括但不限於：活化劑缺乏症/GM2神經節苷脂儲積症；α-甘露糖儲積症；天冬胺醯基葡萄糖胺尿症；膽固醇基酯儲積症；慢性己醣胺酶A缺乏症；胱胺酸症；達農(Danon)病；法布里病；法伯(Farber)病；岩藻糖沉積症；半乳糖唾液酸儲積症；高歇氏病(I型、II型、III型)；GM1神經節苷脂儲積症(嬰兒型、嬰兒晚期型/幼年型、成年型/慢性)；I-細胞疾病/II型黏脂貯積病；嬰兒型游離唾液酸儲積症/ISSD；幼年型己醣胺酶A缺乏症；克拉布(Krabbe)病(嬰兒期發作、晚期發作)；異染性白質失養症；黏多醣病(假性哈倫多發性營養不良(Pseudo-Hurler polydystrophy)/黏脂貯積病IIIA；MPSI；MPSI Scheie症候群；MPS I Hurler-Scheie症候群；MPS II Hunter症候群；聖菲利柏氏A型症候群/MPS III A；聖菲利柏氏B型症候群/MPS III B；聖菲利柏氏C型症候群/MPS III C；聖菲利柏氏D型症候群/MPS III D；Morquio A型/MPS IVA；Morquio B型/MPS IVB；MPS IX 玻尿酸酶缺乏症；MPS VI Maroteaux-Lamy；MPS VII Sly症候群；I型黏脂貯積病/唾液酸沈積症；黏脂貯積病IIIC；IV型黏脂貯積病)；多發性硫酸酯酶缺乏症；尼曼-匹克症(A型、B型、C型)；神經元蠟樣脂褐質儲積症(CLN6病(非典型晚期嬰兒型、晚期發作變體、早期幼年型)、Batten-Spielmeyer-Vogt/幼年型NCL/CLN3病、Finnish變體晚期嬰兒型CLN5、Jansky-Bielschowsky病/晚期嬰兒型CLN2/TPP1病、Kufs/成年發作型NCL/CLN4病、北方癲癇(Northern Epilepsy)/變體晚期嬰兒型CLN8、Santavuori-Haltia/嬰兒型CLN1/PPT病、β-甘露糖儲積症)；龐培氏病/II型糖原儲積症；緻密成骨不全症；桑德霍夫(Sandhoff)病/成年發作型/GM2神經節苷脂儲積症；桑德霍夫病/GM2神經節苷脂儲積症–嬰兒型；桑德霍夫病/GM2神經節苷脂儲積症–幼年型；Schindler病；Salla病/唾液酸儲積症；Tay-Sachs/GM2神經節苷脂儲積症；及Wolman病。
在其他實施例中，本揭示內容包括以下之結合： (1) 基因療法載體，其包含表現盒，該表現盒包含編碼由呈其野生型或非突變形式之基因編碼的多肽之多核苷酸序列或其活性變體，其中該多核苷酸序列係可操作地連接至啟動子序列；及 (2) 一種或多種免疫抑制劑化合物，其用作由突變基因導致的腦病症的藥物。
在該結合之特定實施例中，該基因療法載體及該免疫抑制劑係同時或依序地投與。在某些實施例中，該基因療法載體係藉由腦內注射投與。
在該結合之某些實施例中，該免疫抑制劑化合物中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續至少兩個月的持續時間。
在該結合之某些實施例中，該一或多種免疫抑制劑化合物係選自包含鈣調神經磷酸酶抑制劑、大環內酯及黴酚酸酯之群。在特定實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司。在其他實施例中，該大環內酯為西羅莫司。在某些實施例中，該免疫抑制劑化合物中之至少一者係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續至少三個月、至少六個月或至少十二個月之持續時間。在特定實施例中，該化合物為鈣調神經磷酸酶抑制劑或大環內酯。
在其他實施例中，一或多種免疫抑制劑化合物亦在投與基因療法載體之前提供至個體持續一段時間。
在例示性實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以0.05 mg/kg/天至1.0 mg/kg/天或約0.2 mg/kg/天之劑量提供持續至少兩個月或至少三個月。在相關實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成10 ng/ml至15 ng/ml之血清他克莫司濃度之劑量提供至個體持續一段三個月期間的時間。在其他相關實施例中，該鈣調神經磷酸酶抑制劑為他克莫司，其係在投與基因療法載體後立刻以達成7 ng/ml至10 ng/ml之血清他克莫司濃度之劑量提供至個體持續一段在第四個月至第十二個月期間的時間。
在結合之特定實施例中，該一或多種免疫抑制劑包含黴酚酸酯，其係在投與基因療法載體後立刻提供至個體持續長達兩個月或約兩個月。在特定實施例中，該黴酚酸酯係以200 mg/m2 /天至1200 mg/m2 /天之劑量提供。
在結合之其他實施例中，該結合進一步包含普賴蘇穠。
在結合之特定實施例中，由突變基因引起之腦病症為聖菲利柏氏A型症候群。
在結合之各種實施例中，該基因療法載體為複製缺陷型腺相關病毒(AAV)衍生之載體，其包含表現盒，該表現盒以隨後5’至3’順序包含： 啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 及 多腺苷酸化(polyA)序列。
在特定實施例中，該啟動子序列係衍生自CAG啟動子序列；及/或 該polyA序列係衍生自人類生長激素polyA序列。
在結合之某些實施例中，該表現盒以隨後5’至3’順序包含： 衍生自CAG啟動子序列之啟動子序列； 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及 衍生自人類生長激素polyA序列之polyA序列。
在此等結合中之任何者之特定實施例中，該表現盒係經兩個AAV2內部末端重複(ITR)序列側接，其中該兩個AAV2 ITR序列中之一者係位於該表現盒的5’及該兩個AAV2 ITR序列中之一者係位於該表現盒的3’。在此等結合中之任何者之特定實施例中，該載體進一步包含AAVrh.10衣殼、衣殼蛋白或血清型。
在與基因療法載體(包括彼等本文具體描述者中之任何者)及一或多種免疫抑制劑兩者之投與相關之某些實施例中，該基因療法載體係以本文所述的任何劑量投與。
本揭示內容之基因療法載體及組合物可透過此項技術中已知的任何適宜傳遞系統傳遞至個體的腦。在某些實施例中，其可為允許臨床醫生例如藉由腦內注射透過針組件將病毒載體以針尖精度傳遞至腦深處的靶向位點之任何傳遞系統。在某些實施例中，該傳遞系統係經設計成能夠到達腦組織中的一或多個預定深度，該等深度可例如透過改變針組件所連接的頭架弧之位置而被精確且一致地調整，例如，如[55]中所描述。
在某些實施例中，本揭示內容之方法係使用如Souweidane等人「Gene therapy for late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: neurosurgical considerations」，J Neurosurg Pediatr. 2010年8月；6 (2): 115-22)中所述的傳遞裝置及程序來進行，該文獻之全部內容係以引用之方式併入本文中。如其中所述，將基因療法載體輸液至12個不同腦位置(2個深度/鑽孔，75分鐘/輸液及2 µl/分鐘)。使用六個進入位點，每個進入位點具有2個注射深度。可經由傳遞系統之六個導管在所選位置中的6個位置同時進行第一次注射或投與，藉此在該第一組6個腦位置傳遞本揭示內容之組合物。然後，可移動該6個導管中之各者，使得該六個套管的近端分別到達6個其他所選位置。然後，可經由傳遞系統之六個導管在所選位置中的6個位置同時進行第二次注射或投與，藉此在該第二組6個另外腦位置傳遞本揭示內容之組合物。
如Souweidane等人所描述，在特定實施例中，在個體之全身麻醉下進行術前成像及目標計劃，及對個體的腦進行術前MR成像以用於立體定向計劃。可在BrainLAB工作站(BrainLAB USA)上選擇進入位點，及選擇每個腦半球上的3個進入位點。該等孔可如下放置：在額極、中額葉區及頂骨-枕骨區各1個。進行無框導航及進入位點定位。可使用最少5種基準標誌物對患者進行術前MR影像登記。將預計劃的進入位點標記在頭皮上，及在每個進入位點投與局部麻醉。進行導管及基因療法載體輸液。使用20號腰椎穿刺針作為剛性導件以插入撓性、融合二氧化矽聚醯亞胺塗佈導管(內徑150 µm及外徑362 µm(polymicro technology))。每個導管連接至個別的注射器，且插入導管直至其尖端與針尖齊平。在更深之插入之前，將導管在針頂部標記為導管與腦之間的界面點。將腰椎穿刺針固定至頭架之撓性牽開器(retractor)臂且定向成匹配預定立體定向徑路。在打開皮膚之前，將牽開器臂及針均設置成計劃定向。然後將針插入到剛好位於腦膜表面下方且利用剛性固定來緊固牽開器臂。藉由運行輸液系統清除死空間。移去導針，且將導管推進至初始目標深度，該深度一般係距皮質表面2 cm，範圍為1.7至2.5 cm。每個導管在距初始零標記一定距離用Steri-strip折疊，使得將尖端放置在距皮質表面所需深度。套管插入後五分鐘，基因療法載體藉由微灌注泵以2 µl/分鐘平行地注射至6個位點中之各者。完成後五分鐘，將導管縮回1 cm，且進行類似於第一注射的第二注射。第二輸液完成後，移去導管。
在另一個實施例中，該傳遞系統可係根據US 2011/0060285之教示，該案之全部內容係以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本揭示內容之基因療法載體及組合物可透過套管傳遞至個體的腦。例如，在一些實施例中，該基因療法載體及組合物係經由MRI Interventions SMARTFLOW®套管傳遞。使用受控流量套管，以受控流速提供精確、急性輸液。在一些實施例中，該傳遞方法包括使用具有導管之套管。 實例實例 1 AAVrh.10-hMPS3A之生產 (SAF-301)基因療法載體
在GMP控制下藉由將兩個質體轉染至經認證的293T人類胚胎腎臟細胞系中來生產臨床級SAF-301基因療法載體。編碼治療基因之DNA係藉由一個質體(pAAV-PGK-hMPS3A)提供及衣殼蛋白(來自AAVrh.10)、複製基因(來自AAV2)及輔助功能(來自腺病毒血清型5)均藉由第二質體以反式提供。
pAAV-PGK-hMPS3A質體係建構如下。市售pAAV2-lacZ (7270 bp)係獲自Stratagene (La Jolla，CA USA)。藉由次選殖市售康黴素抗性轉位子，刪除pAAV2-lacZ質體中之胺比西林(ampicillin)抗性基因且經康黴素抗性基因(KanR，1119 bp)取代，產生pAAV2-lacZ (KanR)。表現盒係自由Alliance Sanfilippo提供的pAAV-SGSH-IRES-SUMF1次選殖為介於pAAV2-lacZ (KanR)之反向末端重複序列之間。所得質體的圖提供於圖2A中。
輔助質體(pPAK-MArh.10)係基於康黴素抗性複製子且含有Ad血清型5之VA (Genbank M73260之核苷酸9,856至11,548)、E2A及E4 (nt 21,438至35,935)。AAV2 rep基因之表現係藉由小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子(核苷酸583至1325，GenBank AF228552)驅動及AAVrh.10 cap基因之表現係藉由AAV2之內源性p40啟動子驅動。該質體的圖提供於圖2B中。
於培養經轉染之細胞後，藉由冷凍熔融循環自細胞釋放病毒載體，藉由碘克沙醇逐步梯度純化，接著在Hi-Trap QHP柱上進行離子交換層析。使用藉由離心柱之濃縮，將所得的AAVrh.10-hMPS3A載體轉移至臨床調配物中。經純化之載體係冷凍儲藏(在-60ºC或低於-60ºC)在磷酸鹽緩衝鹽水中。
最終調配載體之完全表徵係透過SDS-PAGE及衣殼蛋白之西方墨點、轉基因DNA之實時PCR、西方墨點分析、活體內及活體外一般及特異性外來病毒及功能性基因轉移之酶促檢定來達成。提供批次釋放標準以確保一致性、純度及功能。實例 2 小鼠中SAF-301之活體內效力
利用SAF-301實施活體內研究以證實腦中轉基因之表現。該研究設計允許評估SAF-301注射後基因之表現持續時間及持久性且總結於表3中並在下文進一步描述。 表3：效力研究總結
研究名稱 成年 MPSIIIA 小鼠：臨床研究效力
目標 提供有關基於AAV之基因療法是否可能有效且因此經考慮用於患有MPSIIIA之嬰兒及年輕兒童中之臨床前資料 1) 確立AAVrh.10-hMPS3A是否能夠使得受感染的MPSIIIA新生小鼠神經細胞能夠產生活性重組人類磺醯胺酶及該磺醯胺酶是否能夠分解代謝儲藏的HS衍生之寡糖及將其在經治療之MPSIIIA中之水平標準化。 2) 臨床上、組織學上及生化學上評估AAVrh.10-hMPS3A對MPSIIIA活小鼠疾病過程之效應。
種類 小鼠MPSIIIA (雄性及雌性)
動物數量 每組25隻
載體 / 安慰劑 所測試的產品： SAF-301 ： AAVrh.10-hMPS3A安慰劑： AAVrh.10-GFP
實驗設計： 活體內研究 ￭ 動物：5 週 小鼠 ￭ 載體GFP或SGSH-SUMF1之劑量：7.5 x 109 gc/動物 ￭ 投與途徑：在紋狀體中注射 ￭ 注射次數：單側注射2個深度(2 x  2.5 µl) ￭ 在12、23及30週齡時實施安樂死 ￭ 在15、18及20週齡時進行行為測試
研究參數 1) SGSH蛋白水平(ELISA)及SGSH酶促活性(HPLC) 2) 腦中HS衍生之寡糖之定量 3) 抗rhSGSH抗體之形成 4) 組織病理學：經驗證之疾病標誌物(LIMP-2、GFAP、同工凝集素(Isolectin)B4、泛素、GM神經節苷脂、膽固醇) 5) 行為程序(後肢步態、開放領域運動活動、記憶及空間學習)
結論 在5週齡時將AAVrh.10-hMPS3A傳遞至MPS IIIA小鼠的左側紋狀體導致在該腦區域產生極大量(65 x 正常) (活性) SGSH。儘管在所注射半球之尾側區域及對側半球中，尤其是在更靠近注射位點的R2中，亦偵測到SGSH蛋白(及活性)，但其水平要低得多，且隨著距注射區域距離之增加而降低。與其中已經由直接注射將rhSGSH反覆傳遞至6+週齡小鼠之腦脊髓液中之研究結果相反[5]，在此研究中，於小鼠中未偵測到對SGSH之體液免疫反應。 如所預期，設若將載體局部性傳遞至腦，在23週齡時，在所檢查的所有病理標誌物中，AAV衍生之SGSH介導高度顯著但受限之改良。儘管在較早剔除時間點(12週齡；注射後7週)注意到某些病理形式之改善，但明顯地，在該時間點上治療效應不是最大的。
參考文獻 Cressant等人2004 Sondhi等人2008
活體內效力研究
使五週大的雄性及雌性MPSIIIA小鼠或未患病同窩小鼠接受SAF-301或編碼GFP之對照AAV載體。每組(n=25隻)接受7.5 X 109 個載體基因組複本，共5 μl。劑量係分佈在兩個紋狀體內注射位點[29]。在12、23及30週齡時將動物殺死。
藉由評估進入至腦載玻片中之SGSH的量且測量SGSH活性來評估轉染及產生期望酵素之效力。
藉由分析以下疾病參數來評估注射SAF-301之功能活性： (1) 使用串聯質譜法確定腦/脊髓中HS衍生之寡糖之相對水平；及 (2) 盲法定量免疫組織學評估確定療法對確診MPSIIIA/未患病腦組織中經驗證之疾病標誌物(LIMP-II、GFAP、同工凝集素B4、泛素、GM3神經節苷脂、未酯化膽固醇)之效應。
在5週齡時將SAF-301傳遞至MPS IIIA小鼠的左側紋狀體導致在該腦區域產生極大量(65 x 正常) (活性) SGSH。儘管在所注射半球之尾側區域及對側半球中，尤其是在更靠近注射位點的R2中，亦偵測到SGSH蛋白(及活性)，但其水平要低得多，且隨著距注射區域距離之增加而降低。在該研究中，於小鼠中未偵測到對SGSH之體液免疫反應。
利用AAVrh.10-hMPS3A之治療在23週齡前於儲積材料(HS衍生之寡糖)及繼發性儲積產物(GM3及未酯化膽固醇)兩者中介導大但局部性的減少。除吾人檢查的其他腦區域(諸如杏仁體及無名質(substantia innominata))外，腦切片L2含有紋狀體(注射區域)及上覆(喙側)皮質二者。在考慮檢查左半球切片2中包含的病理標誌物之結果時，很明顯地該腦區域接受足夠的SGSH以介導GlcNS-UA之顯著(86%)降低及GM3及膽固醇之極大程度降低(或標準化)。此外，在該切片之結構(紋狀體及喙側皮層)中亦觀測到LIMP-II之標準化及微神經膠細胞增生在該等區域中係不存在的/標準化。泛素陽性染色大大減少，可能是因為阻止病灶形成。由於在切片2區域中腦左半球中之載體傳遞(AAV-GFP或AAVrh.10-MPS3A)引起的星形膠質細胞增生妨礙在此等區域中檢查治療對該標誌物之效應。在右半球之切片2中，吾人觀測到GlcNS-UA降低41%及GM3及膽固醇水平大大降低，但其等均未標準化。同樣地，LIMP-II表現大大降低，微型-及星形膠質細胞增生及泛素陽性染色亦降低，但未達成標準化。
尾端移動、AAVrh.10-MPS3A處理導致左半球及右半球切片4中GlcNS-UA分別減少50%及21%。該切片包含壓後皮層(retrosplenial cortex)、下丘及導水管周圍灰質、以及未評估的其他區域。吾等資料顯示該療法在腦之該較遠區域中有些混合效果，且在腦左半球(而非右半球)上觀測到GM3及膽固醇均降低，然而，在下丘之左半球或右半球中未觀測到LIMP-II、微型-或星形膠質細胞增生之改良。
資料指示除下游事件(諸如微神經膠細胞增生)外，該載體亦能夠產生足夠量之SGSH以便介導原發性及繼發性儲積病理之高度顯著改良。此在注射區域及鄰近區域中特別明顯。然而，如於SGSH免疫定量檢定、SGSH活性檢定及因此於主要受質檢定(GlcNS-UA)中所觀測到，藉由轉導腦細胞產生SGSH似乎仍舊相對局限於注射區域，及當檢查距注射位點較遠的區域時，其於病理上之影響變得較不明顯。很明顯地，腦之一些區域接收不足的或未接收到SGSH/SUMF1，且因此展現病理標誌物之改良很小或沒有改良。此等區域包括咸信對認知功能至關重要之位點，例如海馬體及壓後皮層之齒狀回。咸信沒有雙側傳遞至此等腦區域是無法改良MPS IIIA小鼠中疾病之臨床參數的原因。
此等發現與Cearley及Wolfe之發現[10] 一致，Cearley及Wolfe報導經由兩個注射徑路(一個包涵喙側皮層及紋狀體及另一個穿過海馬體通向丘腦)單側AAVrh.10載體注射至正常小鼠腦中後之區域性酵素表現。用於該研究中之載體表現β-葡萄糖苷酸酶且在連續腦切片中之酵素染色說明儘管在注射半球中可偵測到大量β-葡萄糖苷酸酶，但酵素「擴散」至對側相當不顯著，例如~55%之大腦皮層在注射側經染色，但僅9%在未注射半球經染色。對側腦之接受最大量β-葡萄糖苷酸酶之區域為丘腦(與注射側上83%經染色相比，經染色區域為35%)。
然而，吾人的觀測與Cressant等人[29]所進行的觀測直接對立，Cressant等人將AAV5載體單側投與至紋狀體中及亦描述有限的載體基因組偵測，但報告隨後於「整個腦中」之神經病理學校正及於MPS IIIB小鼠中之行為改良。實驗結果差異的原因係未知的，但可能與所使用的載體血清型(AAVrh.10相對AAV5)相關，儘管若考慮Sondhi等人[11]之發現則此不太可能。該組檢查在傳遞各種不同AAV血清型至大鼠紋狀體後三肽基肽酶I (TPP-1)蛋白之分佈程度。與AAV2、AAV5及AAV8相比，AAVrh.10產生優異TPP1分佈。為在晚期嬰兒型神經元蠟樣脂褐質儲積症模型中達成TPP1之廣泛分佈，Sondhi等人隨後在患病小鼠中每半球進行四次注射。TPP-1跨小鼠腦之1至27 x 正常水平之表現容許LINCL模型中之神經病理學降低及臨床疾病參數改良(但未標準化)。
總言之，MPS IIIA小鼠研究的結果指示AAVrh.10血清型載體使得轉導MPS IIIA腦細胞(推測為神經元；[10, 11])能夠產生及分泌大量活性SGSH，此進而高度介導原發性、繼發性及其他神經病變之大大降低。在腦之一些區域中偵測到大量SGSH，且似乎與其與注射位點之接近程度直接相關。實例 3 LYS-SAF301之人類臨床研究
實施人類臨床試驗作為安全性評估之I/II期開放標籤、單臂、單中心研究，該試驗亦提供關於效力之資訊。簡言之，在單個神經外科手術過程中，將SAF-301基因療法載體(AAVrh.10-hMPS3A，即編碼人類SGSH及人類SUMF1基因產物之AAV載體)穿過六個影像導引徑路傳遞至腦之兩側，每個徑路具有兩個沉積物。患者在診斷及早期神經症狀發作後早期但在嚴重表現之前接受注射。以下提供臨床試驗之更詳細的描述。基因療法載體
如實例1所述製備SAF-301基因療法載體。研究劑之所有生產、調配及包裝均依照適用現行良好製造實務(Good Manufacturing Practices)且符合適用於人類之標準。使用前，將研究產物儲藏在-80℃下。
每位患者以12次投與接受7.2 x 1011 gc，每人總計60 µl (0.6 x 1011 gc)。提出的臨床劑量之基本原理部分是基於對患有其他類型病症之患者進行的臨床試驗，其中已投與總劑量在5.0 x 109 至3.2 x 1012 vg 範圍內之AAV載體而無報告毒性，以及基於本文所述的動物研究，該動物研究確立0.6 x 1011 vg/沉積物為安全。所使用的體積在50與150 µl之間及載體濃度在0.5與1.5 x 109 vg/µl之間。三種使用AAV注射至腦實質中之人類基因療法試驗描述於參考文獻[32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40]中。患者標準
治療四位患者。
患者之主要入選標準包括： (1) 年齡在18個月至6歲末期之間； (2) 在生命的頭五年內MPSIIIA之臨床症狀發作； (3) 外周血液細胞及/或培養纖維母細胞提取物中之SGSH活性小於對照之10%； (4) 家庭對程序及知情同意書之理解；及 (5) 重要實驗室參數在正常範圍內。
患者之排除標準包括： (1) 基於pr-clusion MRI判斷在皮質-硬腦膜距離超過1 cm時存在腦萎縮； (2) 沒有獨立步行(在無幫助下步行之能力)； (3) 將永久禁忌麻醉之任何病狀； (4) 與MPSIIIA不相關之任何其他永久性醫學病狀； (5) 在研究藥物投與前1個月之任何疫苗接種； (6) 一個月內服用阿斯匹靈(aspirin)； (7)在載體注射前6個月期間給予的旨在改變MPSIIIA之自然過程之任何藥物；及 (8) 將禁止用Prograf®、Cellcept®及Solupred®治療之任何病狀。投與協定
在單個神經外科手術過程中，藉由直接腦內注射穿過六個影像導引徑路(一個深的及一個淺層的)將載體傳遞至腦之兩側。所有注射均在單個手術過程中進行。臨床前研究及公開文獻指示，在單個外科手術過程中傳遞AAV載體係足以在所有保留位點進行有效基因轉移。該12個位點如下： 表4. 載體傳遞位點
右前淺層 右前深 左前淺層 左前深
右內淺層 右內深 左內淺層 左內深
右後淺層 右後深 左後淺層 左後深
組合免疫療法
該治療包括以上所述的基因療法及隨後免疫抑制治療之組合。
除了所注射的載體外，試驗期間使用的藥物包括： (1) 他克莫司(Prograf®)在手術前14天開始且在整個研究中維持。起始劑量為0.2 mg/kg/天(分2個分開劑量給予)且在7天治療後經調適以在頭三個月期間達成10至15 ng/ml之殘餘劑量及自第四個月至至多至少1年達成7至10ng/ml之殘餘劑量； (2) 黴酚酸酯(Cellcept®)係於手術前14天開始且以600 mg/m2 (最多2 g)每天兩次維持兩個月，呈口服溶液1 g/5ml；及 (3) 在自手術前一天起的10天期間，免疫抑制治療與普賴蘇穠(Solupred®)相關聯
在治療一週後進行4小時之簡短藥物動力學研究(H0、H0.75及H4)以便定義給藥之適應性規則。
手術當天，患者禁食。
免疫抑制治療之使用係基於狗模型MPSIIIB及MPSI之研究結果，其中顯示基因療法需要組合有效的免疫抑制劑治療來針對治療性蛋白質及載體病毒抗原防止腦內及腦外免疫反應。
治療後，監測患者。SAF-301投與後1個月及3個月，收集尿液樣品且測量SAF-301基因組滴度。藉由對SAF-301載體之轉基因具有特異性之DNA之qPCR定量進行GMO偵測。
在研究之最初部分中，總計四位患者接受SAF-301。基於在臨床試驗協定中所定義的安全性參數之評估，該藥物耐受性良好且未發生嚴重不良反應或疑似意料外的嚴重不良反應。
總體而言，SAF-301臨床研究之安全性經驗尚未在患有聖菲利柏氏A型症候群之兒童患者中識別可歸因於SAF-301之任何顯著安全性風險。缺乏顯著安全性發現及信號提供SAF-301之安全性概況可接受用於治療患有聖菲利柏氏A型症候群之患者之證據。
四位患者在2至4天內展現尿液中載體完全消除。
術後臨床評估未展現任何無法解釋且持續之發熱、癲癇發作或意料外的神經症狀。
沒有觀測到不良反應。
前三位患者展現以下： -  過動症顯著減少 -  睡眠型態顯著改良 -  專注及社交技能顯著改良。
此等結果證實該治療在人類個體中之有效性。實例 4 LYS-SAF302基因療法載體
LYS-SAF302係一種AAVrh.10載體，其攜載缺陷型AAV2基因組，該缺陷型AAV2基因組含有藉由融合至雞β-肌動蛋白啟動子/兔β球蛋白內含子(CAG啟動子)之巨大細胞病毒增強子驅動之人類SGSH基因。簡言之，經由黏附人類胚胎腎臟(HEK293)細胞之三次瞬時轉染來製備載體。例如，用p-LYS-SAF-T5、pAAV-rh10及pHGTI共轉染HEK293細胞且培養細胞以產生基因療法載體。在細胞收穫及裂解(lysis)步驟之後，使rAAV之粗病毒裂解液經歷幾個純化步驟，包括藉由深度過濾之澄清，使用AVB樹脂之親和層析，及切向流過濾。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)緩衝液中將LYS-SAF302稀釋至目標載體濃度且藉由0.2 µm過濾滅菌。
使用正向引子(CCA GCC CCT CCA CAA TGA)、反向引子(CAC TGG AGT GGC AAC TTC CA)及探針(CAT CCC TGT GAC CCC)，使用經驗證的Taqman qPCR方法測量LYS-SAF302滴度。
LYS-SAF2質體上之啟動子、hSGSH轉基因、poly A序列及側接序列之概視圖如圖3中所提供。每個特徵之SEQ ID NO: 9中之特徵及位置之表提供於下表5中。圖4A及4B提供側接序列及衣殼化於LYS-SAF302顆粒中之DNA之序列(SEQ ID NO: 9)。圖4C至4D呈現質體p-LYS-SAF-T5之完整序列(SEQ ID NO: 14)，其含有包含hSGSH轉基因之表現盒。圖4E至4F呈現含有衣殼rh10之質體之序列(pAAV2-rh10；SEQ ID NO: 15)序列。圖4G至4K呈現輔助質體pHGTI(亦即具有腺病毒之輔助功能之質體)之序列(SEQ ID NO: 16)。 表5. LYS-SAF302組分表
特徵 描述 在 SEQ ID NO: 9 中之位置 SEQ ID NO
L-ITR AAV血清型2之左反向末端重複序列 1至130 10
啟動子 攜載CMV IE增強子之CAG啟動子、CB啟動子、CBA外顯子1、CBA內含子、兔β-內含子、兔β-球蛋白外顯子2 145至1865 12
所關注的基因 人類SGSH 1896至3404 13
Poly A 人類GH1 poly A 3417至3926 17
R-ITR AAV血清型2之右反向末端重複序列 3935至4075 11
該表現盒依次包含CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子、人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶cDNA (hSGSH)及人類生長激素1 poly A單元(hGH1 polyA)。含有145個核苷酸之第一AAV2反向重複序列(ITR)及含有145個核苷酸之第二AAV2 ITR側接表現盒之每一側上。該兩個ITR末端係為基因組複製及包裝所需的唯一順式作用元件。hGH1 poly A單元參與mRNA穩定性及朝向mRNA轉譯之核輸出。值得注意的是，不同於SAF301，SAF302不包含SUMF 1基因或IRES序列。SAF302亦具有與SAF301不同之啟動子(CAG啟動子)。與第一代(SAF301載體)相比，SAF302展現更高酵素表現。
LYS-SAF302 DNA由4.07kb組成，其中序列分子量為1257.4 kDa。SGSH序列由1.53kb組成，且SGSH DNA序列之分子量為471.3 kDa。實例 5 LYS-SAF301及LYS-SAF302之相容性研究
用LYS-SAF302及LYS-SAF301實施研究以證實及比較腦中轉基因之表現及產生及功能活性之達成。在8至14週齡時，使MPS IIIA小鼠(6隻/組)接受以4E+09 vg/動物之劑量雙側腦內注射媒劑(PBS)、LYS-SAF301或LYS-SAF302至尾狀殼核/紋狀體中。
結果顯示，與LYS-SAF301相比，LYS-SAF302提供優異表現。注射後四週，LYS-SAF302導致經注射之小鼠腦中SGSH酶促增加，其比經注射LYS-SAF301之小鼠中高2.7倍(圖5)。利用LYS-SAF301，觀測到總硫酸乙醯肝素(HS)略有降低。相反地，LYS-SAF302治療後，在注射後僅4週，LYS-SAF302導致HS水平自MPS IIIA中之9.2倍WT水平顯著下降至4.7倍(圖6)。因此，與LYS-SAF301相比，LYS-SAF302導致顯著更高之酵素表現及HS水平之顯著下降。
亦實施研究以評估LYS-SAF302之免疫原性以及將其免疫原性與LYS-SAF301之免疫原性進行比較。結果提供於圖7A至7E中且顯示在經LYS-SAF301及LYS-SAF302治療之小鼠中觀測到趨化介素及細胞介素之顯著減少。與WT相比，未治療的MPS IIIA小鼠中MIP-1ɑ、MCP-1及IL-1ɑ蛋白質(分別為圖7A、7B及7C)顯著升高。每個治療組均有朝向降低之MIP-1ɑ之趨勢，然而，與未治療的小鼠相比，經LYS-SAF302治療之小鼠之水平僅顯著降低。在所有治療組中均觀測到MCP-1之顯著降低。所有治療均降低IL-1ɑ之水平，但僅在用LYS-SAF302治療後才觀測到顯著降低。用RANTES及KC未觀測到顯著差異(圖7D及7E)。皮層內注射後，兩種載體均未引起抗體反應。總而言之，結果顯示藉由投與LYS-SAF301或LYS-SAF302減少發炎性細胞介素，但LYS-SAF302在某些細胞介素方面展現更顯著之減少。
總之，將LYS-SAF301與LYS-SAF302進行比較之藥效動力學研究證實，與第一代產品LYS-SAF301相比，第二代產品LYS-SAF302展現更高之酵素表現及更佳之病原性受質及發炎性標誌物之減少，兩者之間的免疫原性概況相當。實例 6 LYS-SAF302之藥理學
開發基於半定量西方墨點(western-blot)及酶促檢定之雙重表現/效價(功能)檢定以評估LYS-SAF302載體之活體外表現及效價。首先，用rAAV2/rh10載體LYS-SAF302以50,000；100,000；及500,000 MOI (感染複數)轉導HeLa細胞(接種於12孔板形式中)。基於下式計算用於細胞感染之載體的量。 載體體積，單位為µL (V) = (MOI x 每個孔的細胞數 x 1000) / (載體滴度，單位為vg/mL)
轉導後約72小時，自培養板收集Hela細胞且離心。利用裂解緩衝液處理細胞顆粒且應用冷凍熔融循環以自細胞提取蛋白質。離心細胞懸浮液且將上清液轉移至新管。
然後將此等樣品轉移至-80℃且隨後用於藉由西方墨點檢定偵測SGSH之表現及藉由效價檢定確定酶促活性。在西方墨點分析之前，藉由BCA檢定(雙辛可寧酸(BiCinchoninic acid)檢定)確定細胞裂解物之總蛋白質含量，因為該總蛋白質定量係用於將限定量之蛋白質加載於電泳凝膠(SDS-Page)上。亦包括使用已知量的hSGSH之標準曲線以允許蛋白質表現定量。在允許蛋白質根據其分子量進行分離之電泳遷移後，將其等轉移至硝酸纖維素膜上。然後使用抗肌動蛋白及抗SGSH抗體及螢光染料結合之二級抗體揭示感興趣的蛋白質。透過在約57 kDa之分子量之螢光信號測量hSGSH蛋白質表現且藉由在約42 kDa下觀測到的肌動蛋白質之螢光信號標準化。表現結果以μg表示。
藉由Karpova等人(1996)開發的酶促檢定確定效價。簡言之，SGSH裂解2-磺酸胺基-2-去氧-d-葡萄哌喃糖苷殘基之N-硫酸根基以產生4MU-αGlcNH2。由於葡萄糖胺殘基上之α-葡萄糖胺酶活性，然後藉由用α-糖苷酶消化釋放4MU部分。效價結果以nmol/h/mg表示。
該兩種檢定之結果提供於圖8及9中。在陰性對照及受感染細胞之間觀測到增加。另外，隨著MOI增加，觀測到表現及輕微效價增加。實例 7 利用LYS-SAF302之動物研究
在MPS IIIA小鼠、狗及非人類靈長類動物(NHP)中實施LYS-SAF302之效力、劑量範圍及毒理學研究。小鼠研究
在5週大的MPS IIIA小鼠中實施LYS-SAF302之效力/毒理學及劑量範圍研究。在5週齡時，使MPS IIIA小鼠(5隻/性別/組)接受雙側腦內注射媒劑(PBS)或三種不同劑量(8.6E+08、4.1E+10及9.0E+10 vg/動物)中之一種劑量之LYS-SAF302至尾狀殼核/紋狀體及丘腦之各者中。經由經聚乙烯管件連接至Hamilton注射器之27G針，以0.2 μl/min之速率使小鼠接受總計8 μL之LYS-SAF302或媒劑(2 µl/位點)。雙側目標位點(相對於囪門)為：試圖包括白色纖維束之紋狀體之後部態樣-A 0.75 mm，L 1.5 mm，V 3 mm及丘腦-P 2 mm，L 1.5 mm，V 3 mm。使小鼠接受0.05 mg/kg丁丙諾啡(buprenorphine)以用於疼痛緩解及接受在生理食鹽水中之4%葡萄糖以用於手術期間之液體更換。5個半冠狀切片之注射位點及位置顯示於圖10中。
所有小鼠在15週齡時均經歷開放領域(行為)測試。在17週齡(手術後12週)時，對預定小鼠同屬群組實施安樂死且進行完整事後剖析分析。剩餘的小鼠在28週齡時經歷開放領域測試且在30週齡(手術後25週)時實施安樂死。在三個腦切片中評估SGSH活性及HS累積：位於腦最前部之切片1；位於注射位點附近之切片3；及含有小腦之切片5。
使用螢光受質4-甲基傘酮基-β-D-N-葡萄胺糖苷(4MU-αGlcNS)測量腦均質物中之SGSH活性。結果表示為與4MU標準曲線相比之pmol/min/mg總蛋白質。
在LYS-SAF302投與後的12週期間內，觀測到SGSH活性之劑量依賴性增加(圖11)及原發性硫酸乙醯肝素(HS)累積之劑量依賴性減少(圖12)，其持續至30週齡(治療後25週)。總體上，與腦最前部(切片1)或含有小腦之切片(切片5)相比，在注射位點附近(切片3)觀測到更高治療效應。
此外，如圖13A至F中所顯示，在LYS-SAF302投與後的12週期間內，觀測到GM2/GM3之繼發性累積、內膜/溶酶體系統擴張、星形膠質細胞增生及微膠質細胞增生及軸突球體之消退，其持續至30週齡(治療後25週)。在幾種MPS疾病(包括MPS IIIA 21)中已報告神經節苷脂之繼發性累積。在治療後12週及25週(注射後25週之切片3之資料呈現於圖13A及13B中)測量腦切片1、3及5 (如圖10中所提供)中之GM2及GM3。所有經媒劑處理之MPS IIIA小鼠在所有三個腦切片中均展現GM2/3之顯著增加，在兩個安樂死年齡中之每個年齡均可觀測到這一結果。在經媒劑處理或經LYS-SAF302處理之同屬群組中之任何者中，性別對神經節苷脂水平似乎沒有影響。三種劑量之LYS-SAF302中之每一種劑量均導致腦切片1及3中之GM2及GM3神經節苷脂水平之標準化(圖13A、13B)。雖然在切片5中神經節苷脂水平未標準化，但治療後GM2及GM3水平有所降低，在兩種較高劑量下尤為明顯。
在治療後12週及25週時，在幾個腦區域評估與MPS IIIA相關之由內膜/溶酶體擴張及球形病灶組成的特徵性神經元形態異常。在17週及30週的剔除組中，在所檢查的絕大多數經MPS IIIA媒劑處理之小鼠腦區域中，由溶酶體整合膜蛋白2 (LIMP2)免疫組織化學所反映的內膜/溶酶體擴張顯著增加(注射後25週之下丘之代表性資料呈現於圖13C中)。跨越腦的喙側-尾側軸觀測到LIMP2染色之劑量依賴性減少且維持至治療後25週，尤其是在經中劑量及高劑量之LYS-SAF302治療之小鼠中。
評估泛素陽性球形病灶＞5 μm的數量且在兩個剔除時間時，與年齡相匹配的未患病經媒劑處理小鼠相比，經媒劑處理之MPS IIIA小鼠腦中所有區域均展現泛素反應性病灶之顯著增加(注射後25週之下丘之代表性資料呈現於圖13D中)。除胼胝體外，所有LYS-SAF302劑量均顯著減少所檢查的所有腦區域中病灶的數量。
使用神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)之免疫組織化學偵測藉由星形膠質細胞活化之存在及使用同工凝集素B4反應性變形蟲狀微神經膠質細胞之組織化學染色藉由活化微神經膠質細胞之存在，來評估與MPS IIIA相關聯之神經發炎。與年齡相匹配的未患病經媒劑處理小鼠相比，在經媒劑處理之MPS IIIA小鼠腦區域中在兩個時間點均觀測到指示星形膠質細胞活化之顯著增加之GFAP表現，但齒狀回及小腦除外。注射後25週下丘之代表性資料呈現於圖13E中。在17週齡時很難分辨出治療效應，且在尾側、丘腦及下丘中未觀測到GFAP表現降低。更遠離注射區域，在早期剔除時間點，腦幹及喙側皮層及下丘中之GFAP染色減少。到30週齡時，下丘之兩個水平均展現GFAP之顯著降低，特別是在兩個較高劑量下(圖13E)。然而，在該時間點，與經低劑量處理之MPS IIIA小鼠相比，在經中劑量及高劑量處理之MPS IIIA小鼠喙側皮層(中線)及尾側注射水平中觀測到顯著更高GFAP。
與經媒劑處理的未患病小鼠腦相比，經媒劑處理之MPS IIIA小鼠腦中明顯可見大量活化微神經膠質細胞。所有三種劑量基本上均導致跨腦之更多個喙側/中央態樣之微膠質細胞形態之標準化(解釋為去活化)。該結果維持至30週齡。注射後25週齒狀回之代表性資料呈現於圖13F中。注意到腦幹及小腦中之劑量依賴性結果，其中在任何一個時間點，低劑量均不能使後者中之微神經膠質細胞去活化。
來自15週齡及28週齡的雌小鼠之開放領域資料指示，與未患病的經媒劑處理之雌小鼠相比，經媒劑處理之MPS IIIA雌小鼠展現特徵性較低開放領域活性，儘管該資料未能達到統計顯著性，可能是由於動力不足。觀測到經LYS-SAF302處理之小鼠之性能之改良，特別是彼等接受中劑量及高劑量之同屬群組。
在15週齡及28週齡時，經媒劑處理之MPS IIIA雄小鼠在該測試中均未能展現特徵性較低開放領域活性。然而，經高劑量處理之MPS IIIA雄小鼠在15週齡時之活性明顯低於其未患病及MPS IIIA媒劑處理對照物。到28週齡時，與未患病的年齡相匹配雄性相比，僅在經高劑量處理之MPS IIIA雄性中之飼養活動證實有統計學上顯著差異。雄小鼠中之異常行為的原因尚不知曉。在組織病理學分析期間未發現可支持此等行為差異之雄性與雌性之間的差異。
總之，來自小鼠研究之資料顯示LYS-SAF302能夠在該實驗之時間框內(亦即投與後25週)介導對MPS IIIA相關腦病理之劑量依賴性效應。在一些情況下，此被解釋為減少先前存在的疾病病灶(HS累積、溶酶體擴張及微神經膠細胞增生，此在給予時將以顯著水平存在)。在其他情況下，其亦被解釋為防止病灶形成(例如，星形膠質細胞增生及軸突球體形成)開始，因為此等類型之病灶發展較慢，且在治療開始時將以較低水平或僅在一些腦區域中存在。LYS-SAF302顯著減少MPS IIIA小鼠腦中微神經膠細胞增生之能力尤其相關，因為據認為由活化微神經膠質細胞介導之神經發炎在MPS發病原理及疾病進展中發揮關鍵作用。LYS-SAF302引起微神經膠質細胞之神經發炎表型之長期逆轉之能力(其據認為可導致並加劇MPS IIIA 23中之神經元損傷)可對其治療潛力具有深遠影響。狗研究
實施非GLP狗生物分佈研究，其中評估各種注射參數。此等研究之目的係使用MRI Interventions SmartFlow套管評估各種輸液體積及速率對成年及幼年腦中分佈之效應。
在成年米格魯犬中進行的一個研究中，將LYS-SAF302與MRI造影劑釓(2至5 mmol)以1.0E+12 vg/mL及10 μL/min之注射速度共輸液至白質中。使四隻動物接受500 μL/半球(總劑量1.0E+12 vg/mL)之一次注射及一隻動物接受500 μL/半球(總劑量2.0E+12 vg/mL)之兩次注射。使用10 µL/min之輸液流速進行注射。分析注射後拍攝的MRI影像以定量示蹤劑之分佈。所有動物均存活至排定的屍檢時間，其中體重沒有變化，沒有臨床發現，及沒有宏觀的與測試物品相關之發現。注射後1週或4週時對動物實施人道安樂死。將腦之右半球及左半球切成4mm厚切片。將偶數片體置於無菌培養皿中且立即取8 mm生檢穿孔(40個/動物)並切成兩半，一半用於qPCR及另一半用於SGSH酵素分析(4週終點組)。
手術後立即進行MRI且使用Osirix 軟體分析所收集的影像以定量釓信號。圖14A係狗腦之左側視圖，其中冠狀部分之位置包括注射位點。然後將每半球釓信號之體積標準化為對應注射體積且表示為釓分佈體積/注射體積之比。圖14B至C係注射前冠狀部分之MRI影像，其中計劃注射位點以紅點表示。圖14D至E係注射後冠狀部分之MRI影像，其中可見釓信號於白質中。圖14F係MRI影像之3D重建之前視圖，其中可見釓信號沿白質之喙側-尾側軸在兩半球中。結果指示，SmartFlow®套管表現良好，未偵測到回流。發現500 μL/測試物品徑路之投與與在喙側及尾側注射徑路兩者中進入至側腦室中之洩漏相關聯。釓分佈體積/注射體積之平均比為3.1 +/- 0.2 (表6)。
藉由TaqMan qPCR利用對轉基因具有特異性之引子及探針進行載體複本分析。基於該(或更高)水平始終與SGSH活性增加相關聯之觀測，設置0.1個載體複本/細胞之閾值。注射LYS-SAF302後4週時，在37% (+/-4)之所測試腦穿孔中發現超過0.1個載體複本/細胞(表6)。
使用螢光受質4-甲基傘酮基-β-D-N-葡萄胺糖苷(4MU-αGlcNS)測量腦均質物中之SGSH活性。將結果表示為內源性活性之%，經確定為來自兩隻不同動物之兩個媒劑注射半球之80個腦穿孔之平均值。在78% (+/-6)之所測試腦穿孔中發現大於20% SGSH活性增加(表6)。 表6：注射後4週狗腦中之生物分佈資料。注射終點後4週來自3隻狗之6個經注射LYS-SAF302之半球之資料。
動物 #106 #108 #109
半球 右側 左側 右側 左側 右側 左側
載體濃度(vg/mL) 1,0E+12 1,0E+12 1,0E+12 1,0E+12 1,0E+12 1,0E+12
每半球之沉積數(nb) 1 1 1 1 2 2
每次沉積之體積(µL) 500 500 500 500 500 500
注射速度(µL/min) 10 10 10 10 10 10
每半球之總劑量(vg) 5,0E+11 5,0E+11 5,0E+11 5,0E+11 1,0E+12 1,0E+12
每半球注射之總體積(vi) (cm3 ) 0,50 0,50 0,50 0,50 1,00 1,00
釓之分佈體積(vd) (cm3 ) 1,56 1,43 1,50 1,39 3,63 2,92
vd釓/vi 3,1 2,9 3,0 2,8 3,6 2,9
用於qPCR分析之穿孔之nb 40 40 40 40 33 33
穿孔之nb ＞0,1 cp/細胞 14 15 13 17 10 14
穿孔之% ＞0,1 cp/細胞 35% 38% 33% 43% 30% 42%
用於酵素分析之穿孔之nb 40 40 40 40 33 33
穿孔＞20%酵素增加之nb 29 33 30 27 30 26
穿孔＞20%酵素增加之% 73% 83% 75% 68% 91% 79%
總之，結果指示MRI干預套管在10 μL/min之注射速度下表現良好且未偵測到回流。在每半球注射一次之動物與每半球注射兩次之動物之間沒有發現重大差異。此反映來自兩個注射位點之擴散重疊，及由於大約75cm3 腦之極狹窄白色纖維束，所注射體積之一部分可能洩漏至側腦室中。儘管由於狗腦中大約75 cm3 之極狹窄白色纖維束，所注射體積之部分洩漏至側腦室中，但該研究顯示，在1.0E+12之載體濃度下500 μL/半球之三次注射應足以覆蓋兒童的腦之大部分，其中治療水平增加至少20%酵素活性。
在12週大的狗中，使用較小體積(高達300 μL)，在5 μL/min之降低注射速度下，進行另一個先導研究。使三(3)隻動物接受每半球注射一次(200μL或300μL)的LYS-SAF302或PBS及1隻動物接受每半球注射兩次(2 x 200 μL)的LYS-SAF302在右半球中或PBS在左半球中(6E+11 vg至1.8E+12 vg之總劑量)。平均比釓分佈體積/注射體積為2.9 (+/-0.5)，在37% (+/-9)之所測試腦穿孔中發現超過0.1個載體複本/細胞及在53%(+/- 8)的所測試腦穿孔中發現超過20% SGSH活性增量。非人類靈長類動物 (NHP) 研究
非人類靈長類動物(NHP)亦是一種用於評估毒性之動物模型，及與狗解剖相比，其腦解剖與人類之相似性更接近。因此，NHP被專門選擇用於GLP毒理學/生物分佈/劑量範圍研究中以提供對人類腦分佈及毒理學結果之更佳預測。與此同時，進行NHP中之非GLP研究以對神經外科醫師提供利用該裝置之動手經驗及確定注射體積及總劑量(相對於腦體積)之生物分佈。
此等研究之目的係使用MRI Interventions SmartFlow套管以類似於彼等待於關鍵臨床試驗中測試者之注射速率、總體積(與腦體積相關)及總劑量(與腦體積相關)來獲得藉由直接注射至白纖維質中投與的LYS-SAF302之NHP安全性及生物分佈資料。此等研究亦對神經外科醫師提供利用使用臨床手術設置之該新裝置之動手經驗。
對三(3)隻雄性石蟹獼猴(Cynomolgus Monkeys/Macaca fascicularis)(4.2至4.5歲)給予LYS-SAF302 (n=2)或PBS (n=1)。LYS-SAF302係與3E+12 vg/mL之MR造影劑釓(0.125mmol/mL)共輸液。在每隻動物(每半球2次)中進行四次50 μL輸液至白質中(總劑量為7.2E+11vg)。在注射後6週測量載體複本數以及溶酶體酵素活性(SGSH)分佈。
使用Taqman qPCR利用對轉基因具有特異性之引子及探針進行載體複本分析。如於狗研究中設置0.1個載體複本/細胞之閾值。投與LYS-SAF302後六週，在11% (+/-1)之所測試腦穿孔中發現超過0.1個載體複本/細胞(表7)。
使用4MU-αGlcNS測量腦均質物中之SGSH活性。結果表示為內源活性之%，經確定為來自一隻PBS注射動物之2個半球之85個穿孔之平均值。亦進行SGSH酵素活性分析且將結果表示為內源活性之%。注射後六週，在97% (+/-2)之所測試腦穿孔中發現大於20% SGSH活性增量(表7及圖15)。 表7.注射後6週NHP腦中之生物分佈資料。注射終點後6週來自2隻NHP之4個經注射LYS-SAF302之半球之資料。
動物 #169I #763E
半球 右側 左側 右側 左側
載體濃度(vg/mL) 3,6E+12 3,6E+12 3,6E+12 3,6E+12
每半球之沉積數(nb) 2 2 2 2
每次沉積之體積(µL) 50 50 50 50
注射速度(µL/min) 10 10 10 10
每半球之總劑量(vg) 3,6E+11 3,6E+11 3,6E+11 3,6E+11
用於qPCR分析之穿孔之nb 46 48 48 43
穿孔＞0,1 cp/細胞之nb 6 5 4 5
穿孔＞0,1 cp/細胞之% 13% 10% 8% 12%
用於酵素分析之穿孔之nb 51 53 52 50
穿孔＞20%酵素增量之nb 50 53 50 46
穿孔＞20%酵素增量之% 98% 100% 96% 92%
當針對注射體積標準化時，與狗研究(37%經注射500 µL或1 mL覆蓋)相比，NHP研究(11%之腦經所注射的100 µL覆蓋)之載體擴散更廣，反映由於NHP腦之白色纖維束較大且注射體積較小，因而注射體積進入至側腦室中之洩漏減少。儘管與狗相比，NHP中載體擴散之絕對水平較低，但SGSH活性更寬泛地分佈在整個NHP腦中(腦之97%中至少20%之活性增量相對狗中之78%)。在兩個研究間觀測到的差異可歸因於可能的物種差異或可反映與狗之4週期間相比在6週期間後NHP腦中之更佳酵素分泌及寬泛擴散。結果指示MRI干預套管在5 μL/min之注射速度下表現良好且未偵測到回流。雖然所測試腦穿孔之11% (±1)具有超過0.1個載體複本/細胞，但所測試腦穿孔之97% (±2)表現超過20% SGSH活性增量，反映6週期間中所有腦中之酵素分泌及擴散。
總言之，動物研究之結果證實LYS-SAF302為MPS IIIA之基因療法之有希望的新候選者。在利用第一代載體LYS-SAF301在4位患有MPS IIIA之兒童中以7.2E+08 vg/g腦之劑量實施之1/2期試驗中，注意到令人鼓舞的改良徵兆。本揭示內容提供本文所述的第二代載體，其效力比第一代載體大約3倍，並且臨床劑量高10倍(7.2E+09 vg/g腦)且使用最佳化傳遞技術。在不希望受理論約束下，本發明研究之結果顯示，相對低劑量之LYS-SAF302應能夠恢復MPS IIIA患者之整個腦之正常SGSH活性之至少20%。在一些實施例中，該酵素活性之恢復水平對疾病進展具有顯著正面影響。實例 8 單個深度注射
為研究相對於如在LYS-SAF301之臨床研究中在兩個深度上傳遞，是否可使用更大注射體積在單個深度下增強分佈，及為評估LYS-SAF302載體之長期表現，產生其中綠色螢光蛋白(GFP)替換轉基因的LYS-SAF302變體)。該載體SAF302GFP與LYS-SAF302相同，只是hSGSH基因被GFP基因替換。注射SAF302GFP後4個月，進行GFP分佈研究以評估小鼠。
MPSIIIA小鼠在8至14週齡時經由雙側注射在單個紋狀體內深度接受立體定向注射AAV-SAF302GFP，其中該載體係以於3 µL中 6.1 x 109 基因組顆粒之劑量在兩個半球中之中線側向2 mm、在3 mm之單個深度處傳遞投與(圖16A；n=5)。然後在約6個月齡時(此為注射後約4個月)將動物殺死。為進行比較，使兩個深度組之MPSIIIA小鼠在8至14週齡時接受立體定向注射AAV-SAF302GFP，其中載體係以4.1 x 109 個基因組顆粒在4 µL中之劑量投與，經由1 µL沉積物在兩個紋狀體內深度(2 mm及3 mm)(各個深度在兩個半球中之中線側向2 mm)傳遞。在手術後約4週將兩個深度組中之小鼠殺死。冠狀及矢狀部分用NeuN、GFP及DAPI共標記以全面概述載體在整個腦中之分佈。
腦部分之成像證實，與在兩個深度接受注射之動物相比，在單個深度接受注射之動物中載體分佈增強。圖16B至16E顯示在單個深度組中收集的資料。最大GFP表現出現在注射位點位置，隨著距該區域的距離增加，範圍及強度減小。冠狀部分2顯示自注射位點放射出的整個紋狀體中之GFP陽性細胞。沿著紋狀體及接觸外囊之白質束之皮層及於胼胝體內亦可見GFP陽性細胞。與兩個深度研究中之小鼠相比，冠狀部分3中之表現明顯更高，其中海馬體內GFP陽性細胞之散佈更廣泛，指示載體之散佈增加。內囊染色亦明顯，其中在由冠狀部分4中之內囊產生之大腦腳(cerebral peduncle)中的載體散佈明顯(圖16B)。
海馬體及紋狀體之高放大倍數影像(由顯示於圖16C中之矢狀截面中之虛線框表示)證實SAF302GFP載體之神經元特異性(分別為圖16D及16E)，其中GFP與神經元核標誌物NeuN具有強共定位，GFP沿著神經元過程延伸。
在兩個深度及單個深度動物中GFP與星形神經膠質細胞標誌物GFAP之共染色指示一定比例之星形神經膠質細胞亦與神經元一起被轉導(圖17A(兩個深度)及17B(單個深度))。然而，與神經元相比，靶向星形神經膠質細胞之比例降低。
在單個深度動物中紋狀體內注射SAF302GFP後，沒有小腦內的細胞經轉導，類似於兩個深度研究組中達成的結果。在使用兩種注射策略後，將GFP跨囪門之表現定量為GFP陽性細胞相對於總腦區域之百分比(圖17C至17E；n=5隻動物/組)。在注射位點附近(囪門 +0.26)，與兩個深度策略相比，單次注射策略導致整體GFP增加(圖17D)。利用單次推注量注射，亦明顯看到注射位點遠端細胞之轉導增加，而藉由在遠端位點之雙倍高度注射，幾乎沒有看見轉導(圖17C及17E)。
該研究之結果指示，儘管利用單個深度策略減少投與體積，但出人意料地，在兩個深度注射LYS-SAF302比在單個深度注射效率更低。載體在兩個深度之注射中沿著注射徑路分佈得更多，而不是在單個注射深度研究中有利地發生之自注射位點末端側向散佈。在不希望受到理論約束下，此可反映在拔出針時載體之回流，而不是可在單個深度傳遞推注量之病毒時達成之產生較大側向壓力。實例 9 SAF-302之人類臨床研究
實施2/3期單臂、開放標籤、多中心、介入性研究以評估腦內投與LYS-SAF302至罹患聖菲利柏氏A型症候群之個體之安全性及效力。該研究包括3年長期隨訪。在腦兩側之小腦幕上區域中對個體投與7.2E+12vg之單劑量(6個注射位點(每半球3個)，每次注射500 μL)。在單個神經外科手術過程中透過6個影像導引小腦幕上徑路注射LYS-SAF302以靶向與核殼相鄰之白質。
在治療後24個月進行主要效力分析。在術後一年進行中期分析以識別效力之潛在早期信號。預期治療效應為至少在經選擇患有可預測疾病過程之研究群體中，基於其年齡及在基線下之DQ阻止疾病進展。藉由比較由基線及24個月間之比(DQ24/DQ0)表示的觀測(手術後)DQ演變來評估效力，且藉由基於來自符合本研究之入選標準之2種自然病史研究中12位患者之資料應用回歸係數計算得預期比(Shapiro等人，2016及來自SAF301之1/2期研究的臨床完成患者)。其將用於計算在不存在治療下在12個月及24個月時之預期認知結果。
對於2/3期臨床研究，在GMP控制下產生臨床級SAF302基因療法載體。將最終產品調配在不含任何賦形劑或防腐劑之PBS緩衝液中。溶液為澄清至微乳白色且可含有小的發白至半透明顆粒。在藥物投與程序期間，經由放置在注射器與Smartflow套管之間的0.2微米在線過濾器減少顆粒之存在，對藥物產品LYS-SAF302之強度或效力沒有可偵測之效應。
PBS緩衝液之組成如下： • 2.67 mM KCl • 1.47 mM KH2PO4 • 137.9 mM NaCl • 8.06 mM Na2HPO4 • pH 7.2-7.4 LYS-SAF302之產品主要包裝由以下組成： • 即用型無菌3 mL (2R)玻璃小瓶，來自Ompi； • 可立即滅菌型13 mm FluroTec塞子，來自West Pharmaceuticals (藉由Novasep蒸汽滅菌)； • 13 mm即用型照射翻蓋，來自West Pharmaceuticals。
將小瓶填充1.2mL 2.4E+12vg/mL目標載體濃度(釋放規格：1.9E+12至3.2E+12 vg/mL)之LYS-SAF302。
治療性載體以約7.2E+12vg/患者之劑量(在約2.4E+12vg/mL之濃度下)於6次預定(藉由MRI)同時無框立體定向腦注射(每次500 μL，亦即1.2E+12vg)中在約100分鐘內(5 µL/min)雙側傳遞於基底神經節之前方、內側及後方之白質內(每半球3個注射位點)。手術由受過訓練之神經外科醫生進行。
患者將接受伴隨之免疫抑制方案(他克莫司、黴酚酸酯及短期普賴蘇穠)以避免消除轉導細胞。研究顯示，經由本文所提供的給予策略傳遞的LYS-SAF302導致與缺乏SGSH相關疾病(諸如聖菲利柏氏A型症候群)之高度臨床有效治療。
本說明書中提及的所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案之全文在與本發明描述無不一致的程度內以引用之方式併入本文中。
自前述當可明瞭，儘管本文出於說明之目的已描述本發明之特定實施例，但可在不脫離本發明之精神及範疇下進行各種修改。 參考文獻  1.    Valstar, M.J.等人,Sanfilippo syndrome: A mini-review. J Inherit Metab Dis, 2008. 2.    Gliddon, B.L.與J.J. Hopwood,Enzyme-replacement therapy from birth delays the development of behavior and learning problems in mucopolysaccharidosis type IIIA mice. Pediatr Res, 2004.56 (1): p. 65-72. 3.    Hemsley, K.M.、B. King及J.J. Hopwood,Injection of recombinant human sulfamidase into the CSF via the cerebellomedullary cistern in MPS IIIA mice. Mol Genet Metab, 2007.90 (3): p. 313-28. 4.    Hemsley, K.M.等人,Effect of high dose, repeated intra-CSF injection of sulphamidase on neuropathology in MPS IIIA mice. Genes Brain Behav, 2008. 5.    Hemsley, K.M.等人,Examination of intravenous and intra-CSF protein delivery for treatment of neurological disease. Eur J Neurosci, 2009.29 (6): p. 1197-214. 6.    Savas, P.S.、K.M. Hemsley及J.J. Hopwood,Intracerebral injection of sulfamidase delays neuropathology in murine MPS-IIIA. 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圖1係腺相關病毒載體構築體(第一代LYS-SAF301基因療法載體)的概視圖。在該圖中，AAV2 ITR係指AAV2內部末端重複序列，muPGK係指鼠類磷酸甘油激酶啟動子，SGSH係指人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶，EMCV ires係指腦心肌炎病毒ires，SUMF1係指人類硫酸酯酶修飾因子1，及BGHpA係指牛生長因子polyA。
圖2A係用於產生第一代LYS-SAF301基因療法載體之pAVV-PGK-HMPS3A質體的概視圖。在該圖中，ITR係指內部末端重複序列，PGK係指磷酸甘油激酶啟動子，SGSH係指人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶，SUMF1係指人類硫酸酯酶修飾因子1，IRES係指內部核糖體進入位點，及KanR係指康黴素抗性。
圖2B係pPAK-MARH10輔助質體的概視圖。在該圖中，AAV2 rep基因係指用於複製AAV2之基因，AAVrh10 cap基因係指編碼AAV恒河猴10衣殼之基因，MMTV啟動子係指小鼠乳房腫瘤病毒啟動子，KanR係康黴素抗性，及Ad5 E4基因係指腺病毒5 E4基因。
圖3係LYS-SAF302表現盒及側接序列的概視圖。
圖4A及4B呈現包裹於LYS-SAF302顆粒中之DNA之序列(SEQ ID NO: 9)。圖4C至4D呈現質體p-LYS-SAF-T5之全序列(SEQ ID NO: 14)。在圖4C及4D中，指示ITRs、CAG啟動子、針對於SGSh之cDNA、poly A位點及AmpR基因。圖4E至4F呈現含有衣殼rh10 (pAAV2-rh10；SEQ ID NO: 15)序列之質體之序列。在圖4E及4F中，指示質體之AAV2 REP、CAP1、Lac O、ColE1起點、AmpR、F1起點及Lac α組分。圖4G至4K呈現輔助質體pHGTI(亦即具有腺病毒之輔助功能之質體)之序列(SEQ ID NO: 16)。在圖4G至4K中，指示質體之VA、Rads、E4、L5、E2A、AmpR及ColE1起點組分。
圖5顯示在注射後4週，LYS-SAF301及LYS-SAF302對跨MPSIIIA小鼠所有腦區域之SGSH活性之效應。資料係相對於WT水平±SEM之平均SGSH活性%；****p ＜ 0.0001，**p ＜ 0.01，及ns=不顯著，除非用頂槓指示，否則給出相對於WT的顯著性。
圖6顯示在注射後4週，LYS-SAF301及LYS-SAF302對跨MPS IIIA小鼠所有腦區域之總HS量之效應。藉由AMAC標記二醣之RP-HPLC進行峰面積定量後，所有腦區域(區域1至5之平均)中HS之平均相對量。資料為平均值±SEM；* p ＜ 0.05 顯著性，相對於WT。
圖7A至E顯示在注射後4週，LYS-SAF301及LYS-SAF302對跨MPS IIIA小鼠所有腦區域之發炎性細胞介素量之效應。MIP-1α (7A)、MCP-1 (7B)、IL-1α (7C)、RANTES (7D)及KC (7E)之蛋白質水平，如藉由所有腦區域之CBA撓性組測得。每個資料點代表各個小鼠之跨所有5個腦區域的值。P值係來自雙向ANOVA與Tukey多重比較檢驗，* = P ＜ 0.05，** = P ＜ 0.01，*** = P ＜ 0.001，**** = P ＜ 0.0001。
圖8顯示在指示MOI下之自LYS-SAF302之SGSH表現。
圖9顯示在指示MOI下自LYS-SAF302產生之SGSH之酶促活性。
圖10顯示MPSIIIA小鼠中LYS-SAF302之實質內注射策略。自側向透視圖顯示注射位點(白色箭頭)及半冠狀腦切片之位置。MPSIIIA小鼠在5週齡時使用Hamilton注射器接受LYS-SAF302之立體定位注射(n=10隻/性別/組)。載體係以8.6E+08 vg (低劑量)、4.1E+10vg (中劑量)或9.0E+10 vg (高劑量)在8 μl中之劑量投與，以0.2 µl/min經由2 µl傳遞至左側及右側紋狀體中之各者及2 μL傳遞至左側及右側丘腦中之各者。呈現五個半冠狀切片之位置。
圖11顯示在注射後12週及25週，LYS-SAF302對MPS IIIA小鼠之腦切片中SGSH活性之劑量依賴性效應。(□雄性；•雌性)。P值係來自post-hoc Bonferroni測試之單向ANOVA，* = P ＜ 0.05，** = P ＜ 0.01，*** = P ＜ 0.001，**** = P ＜ 0.0001。小鼠#225(17週大的MPS IIIA低劑量雄性組)在每次檢定中均為離群值，未展現SGSH活性增加(參考MPS IIIA媒劑小鼠)。在30週同屬群組中，低劑量治療的MPS IIIA雄小鼠#422、#383及#448為離群值，未展現SGSH活性增加(參考MPS IIIA媒劑小鼠)。
圖12顯示在注射後12週及25週，LYS-SAF302對MPS IIIA小鼠之腦切片中HS量之劑量依賴性效應。(□雄性；•雌性)。P值係來自post-hoc Bonferroni測試之單向ANOVA，* = P ＜ 0.05，** = P ＜ 0.01，*** = P ＜ 0.001，**** = P ＜ 0.0001。小鼠#225(17週大的MPS IIIA低劑量雄性組)在每次檢定中均為離群值，未展現HS降低(參考MPS IIIA媒劑小鼠)。在30週同屬群組中，低劑量治療的MPS IIIA雄小鼠#422、#383及#448為離群值，未展現HS降低(參考MPS IIIA媒劑小鼠)。此與針對於此等小鼠樣品記錄的少量SGSH活性保持一致。
圖13顯示治療後25週的MPS IIIA小鼠之神經病理學分析。圖13A及13B顯示根據圖10中所給出的圖譜之腦切片3中之次級溶酶體儲積產物GM2 (A)及GM3 (B)神經節苷脂定量。圖13C顯示藉由下丘中之LIMP2染色評估的內膜/溶酶體(endo/lysosomal)系統擴增。圖13D顯示藉由下丘中之泛素染色評估的軸突球體(axonal spheroids)的數量。圖13E顯示藉由下丘中之GFAP染色評估的星形膠質細胞增生之程度。圖13F顯示藉由齒狀回中之同工凝集素(isolectin) B4染色評估的反應性變形蟲狀微神經膠質細胞的數量。****p ＜ 0.0001及* p ＜ 0.05係自單向ANOVA及Bonferroni多重比較測試計算得。
圖14A至F顯示釓在狗腦中之擴散。該圖呈現狗以10μL/min (總劑量2.0E+12 vg)接受四次注射500 µl (每半球兩次)之具有MRI造影劑釓(5 mmol)之LYS-SAF302至白質中。圖14A係狗腦(其中冠狀部分之位置包括注射位點)之左側視圖。圖14B至C係注射前冠狀部分之MRI影像，其中計劃注射位點以紅點表示。圖14D至E係注射後冠狀部分之MRI影像，其中可見釓信號於白質中。圖14F係MRI影像之3D重建之前視圖，其中可見釓信號沿白質之喙側-尾側(rostro-caudal)軸在兩半球中。比例尺=10 mm。
圖15A至C顯示兩個NHP腦中之SGSH活性分佈，該等NHP以5μL/min (總劑量7.2E+11 vg)接受四次注射50µl (每半球兩次)之LYS-SAF302至白質中。圖15A顯示NHP腦之左側視圖及半冠狀腦切片之位置。喙側注射係在切片4至6之間及尾側注射係在切片8至10之間。注射後6週，在針對於一位NHP所分析的腦穿孔的99%(圖15B)中及針對於另一位NHP所分析的腦穿孔的94%(圖15C)中，觀察到相對於媒劑注射對照組，SGSH活性增加大於20%。
圖16A至16E顯示注射後4個月時小鼠腦中SAF302GFP之表現。圖16A係相對於5個不同腦區域之紋狀體內注射位點的圖。MPSIIIA小鼠使用Hamilton注射器在8至14週齡時接受SAF302GFP之立體定向注射(n = 6)。載體以6.1 x 109 個基因組顆粒在3 µL中之劑量投與，經由雙側注射在兩半球之中線側向3 mm、2 mm之深度傳遞。注射後4個月處死動物，且取出腦以進行組織學分析。將來自囪門+1.7 mm、+0.26 mm、-1.18 mm及-2.62 mm之冠狀腦部分(圖16B)及在中線側向1.2 mm之矢狀部分(圖16C)以NeuN (紅色)、GFP (綠色)及DAPI (藍色)共標記。比例尺=1,000 µm。(16D及16E) (圖16C)虛線框所示區域之高放大率影像顯示海馬體(圖16D)及紋狀體(圖16E)內細胞之轉導。比例尺=50 µm。
圖17A至E顯示在用SAF302GFP處理後注射位點附近的GFAP陽性星形膠質細胞之轉導。MPSIIIA小鼠在兩個深度注射SAF302GFP且在注射後4週收穫(圖17A)或在一個深度注射且在注射後4個月收穫(圖17B)。用GFAP (紅色)、GFP (綠色)及DAPI (藍色)染色在相對於囪門+0.26之冠狀部分。比例尺=1,000 µm。顯示扣帶/皮質(1)、外囊/初級體覺皮質/紋狀體邊界(2)及紋狀體/注射位點(3)之高放大率影像。比例尺=20 µm。在指定囪門之GFP陽性細胞之百分比(作為總腦區域之一比例)之定量(圖17C至17E)。*p ＜ 0.05，使用學生t檢驗(Student's t-test)計算得。顯示代表性影像，其中五隻小鼠在兩半球中注射且每組進行定量。
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Claims (28)

  1. 一種複製缺陷型腺相關病毒血清型rh.10 (AAVrh.10)衍生之載體，其包含表現盒，該表現盒以隨後5’至3’順序包含： a. 啟動子序列； b. 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶多肽之多核苷酸序列或其活性變體； 及 c. 多腺苷酸化(polyA)序列； 其中該載體不包含編碼人類硫酸酯酶修飾因子1之多核苷酸序列或其任何活性變體。
  2. 如請求項1之載體，其中 該啟動子序列係衍生自CMV早期增強子/雞β肌動蛋白(CAG)啟動子序列。
  3. 如請求項1之載體，其中該polyA序列係衍生自人類生長激素1序列。
  4. 如請求項1之載體，其中該載體不包括內部核糖體進入位點(IRES)序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之載體，其中該表現盒係以隨後5’至3’順序由以下組成： a. 衍生自CAG啟動子序列之啟動子序列； b. 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶多肽之多核苷酸序列或其活性變體；及 c. 衍生自人類生長激素1 polyA序列之polyA序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之載體，其中該表現盒係經兩個AAV2內部末端重複(ITR)序列側接，其中該兩個AAV2 ITR序列中之一者係位於該表現盒的5’及該兩個AAV2 ITR序列中之一者係位於該表現盒的3’。
  7. 如請求項6之載體，其中該位於表現盒的5’端之ITR序列包含根據SEQ ID NO: 10之核苷酸序列及該位於表現盒的3’端之ITR序列包含根據SEQ ID NO: 11之核苷酸序列。
  8. 如請求項2之載體，其中該CAG啟動子序列包含根據SEQ ID NO: 12之序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之載體，其中該編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶之多核苷酸序列包含根據SEQ ID NO: 13之序列。
  10. 如請求項1至9中任一項之載體，其中該多腺苷酸化(polyA)序列包含根據SEQ ID NO: 17之序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之載體，其中該載體進一步包含AAVrh.10衣殼或AAVrh.10衣殼蛋白。
  12. 如請求項1至11中任一項之載體，其以隨後5’至3’順序包含下列： a. AAV2 ITR序列； b. 衍生自CAG啟動子序列之啟動子序列； c. 編碼人類N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶多肽之多核苷酸序列或其活性變體； d. 衍生自人類生長激素1 polyA序列之polyA序列；及 e. AAV ITR序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之載體，其包含根據SEQ ID NO: 9之序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之載體，其包含根據SEQ ID NO: 14之序列。
  15. 一種治療聖菲利柏氏(Sanfilippo)A型症候群之方法，該方法包括對有此需要的個體投與如請求項1至14中任一項之載體。
  16. 如請求項15之方法，其中該載體係經由腦內注射投與給個體。
  17. 如請求項15或16之方法，其中該載體係經由腦內注射投與給個體，其中每次注射係在單個注射深度投與。
  18. 如請求項15至17中任一項之方法，其中該載體係經由每半球2至4次注射投與給個體。
  19. 如請求項18之方法，其中該載體係經由每半球3次注射投與給個體。
  20. 如請求項15至19中任一項之方法，其中每次注射係以約500 μL之體積投與。
  21. 如請求項15至20中任一項之方法，其中投與該個體之載體之總劑量為約5 x 1010 至約5 x 1013 vg。
  22. 如請求項21之方法，其中投與給該個體之載體之總劑量為約7.2 x 1012 vg。
  23. 如請求項15至22中任一項之方法，其中該方法進一步包括對該個體投與免疫抑制方案。
  24. 如請求項23之方法，其中該免疫抑制方案包括他克莫司(tacrolimus)、黴酚酸酯(mycophenolate mofetil)及普賴松(prednisone)。
  25. 如請求項1至14之載體，其係用作用於治療聖菲利柏氏A型症候群之藥物。
  26. 如請求項25之載體，其係用作用於治療聖菲利柏氏A型症候群之藥物，其中該藥物進一步包含醫藥上可接受之擔體、載劑、賦形劑或稀釋劑。
  27. 如請求項25或26之載體，其係用作用於治療聖菲利柏氏A型症候群之藥物，其中該藥物為乳液或水溶液。
  28. 一種套組，其包含如請求項1至14中任一項之載體及其使用說明書。
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