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TW202102270A - 製備細胞結合劑-藥物結合物之方法 - Google Patents

製備細胞結合劑-藥物結合物之方法 Download PDF

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TW202102270A
TW202102270A TW109109506A TW109109506A TW202102270A TW 202102270 A TW202102270 A TW 202102270A TW 109109506 A TW109109506 A TW 109109506A TW 109109506 A TW109109506 A TW 109109506A TW 202102270 A TW202102270 A TW 202102270A
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TW
Taiwan
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ala
antibody
antigen
binding fragment
agent
Prior art date
Application number
TW109109506A
Other languages
English (en)
Inventor
史考特 A 西得伯朗德
丹尼爾 Ｆ 密藍諾
Original Assignee
美商伊繆諾金公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)。亦提供藉由本文所述之方法製備之結合物及其醫藥組合物及使用方法。

Description

製備細胞結合劑-藥物結合物之方法
本發明一般而言係關於製備細胞結合劑-藥物結合物之方法，該等細胞結合劑-藥物結合物包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑。
細胞結合劑-藥物結合物(諸如抗體-藥物結合物(ADC))作為在多種癌症中具有功效之一類特效抗腫瘤劑出現。細胞結合劑-藥物結合物(諸如ADC)通常由三種不同要素構成：細胞結合劑(例如抗體)；連接體；及細胞毒性部分。該細胞毒性藥物部分可經由諸如順丁烯二醯亞胺基之硫醇反應性基團共價連接至該抗體上之半胱胺酸硫醇基，以形成位點特異性ADC。經半胱胺酸工程改造之抗體可用於製備位點特異性ADC。然而，在抗體產生期間，經工程改造之半胱胺酸通常藉由諸如半胱胺酸或麩胱甘肽之其他含硫醇部分封端，以形成二硫化物。在與細胞毒性劑結合之前，該等二硫化物需要經還原劑處理以移除封端部分且形成用於與該細胞毒性劑反應之游離硫醇。該處理亦還原抗體鏈間二硫鍵，該等抗體鏈間二硫鍵需要藉由不會再氧化經工程改造之半胱胺酸上的游離硫醇基的選擇性氧化步驟再形成。選擇性氧化藉由使用溫和氧化劑以及移除還原劑及封端劑(諸如半胱胺酸及/或麩胱甘肽)來實現。該等還原及選擇性氧化步驟在用經半胱胺酸工程改造之抗體製備ADC的過程中引入複雜性，且通常需要多個純化步驟，使得該過程變得麻煩且對於ADC之大規模製造不太有效。
因此，需要開發適用於大規模製造過程之用於製備經工程改造之半胱胺酸抗體的ADC之新型有效方法。
本發明係基於如下令人滿意的發現，即包含共價連接至細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體的ADC可藉由在反應步驟之間無需純化之一鍋方法以高純度及反應產率來製備。此外，比較數據顯示當與藉由在反應步驟之間需要純化之多步驟方法製備的ADC相比時，該一鍋方法出乎意料地增加最終ADC產物之單體百分率(參見實例5)。
在某些實施例中，本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b)  使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中未配對半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c)  使該CysCBA與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物，其中步驟(a)中之經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；且步驟(b)中之CysCBA未經純化即用於步驟(c)，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
在某些實施例中，本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b)  使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中未配對半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c)  使該CysCBA與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物， 其中步驟(a)中之經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；步驟(b)中之CysCBA未經純化即用於步驟(c)，且選自步驟(a)至(c)之任一或多個步驟係連續地執行，且其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體
在某些實施例中，本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b)  使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中未配對半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c)  使該CysCBA與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物；及 (d) 移除未結合之式(I)化合物； 其中步驟(a)中之經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；步驟(b)中之CysCBA未經純化即用於步驟(c)，且選自步驟(a)至(d)之任一或多個步驟係連續地執行；且其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體
在某些實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image005
， 該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image007
， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image009
(I11)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)中之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)， 其中：
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
，且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image005
， 該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image007
， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image009
(I11)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，且步驟(a)至(c)係連續地執行，且 其中：
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
，且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image005
， 該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image007
， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化； (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image009
(I11)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC；及 (d) 移除未結合之式(I11)化合物； 其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，且步驟(a)至(d)係連續地執行，且 其中：
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
，且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image017
， 該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image019
以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image020
， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)中之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a)    免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b)   免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image017
， 該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image019
以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image020
(I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)；且步驟(a)至(c)係連續地執行， 其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a)    免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b)   免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image017
， 該方法包括以下步驟： (a)  使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image019
以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image020
(I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC；及 (d) 移除未結合之式(I1a)化合物，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)；且步驟(a)至(d)係連續地執行， 其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a)    免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b)   免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，本文所述之方法中的任一步驟均可在惰性氛圍(例如N2 )下進行。在某些實施例中，本文所述之方法係在惰性氛圍(例如N2 )下進行。在某些實施例中，本文所述之方法中的任一步驟均可在O2 存在下進行。在某些實施例中，本文所述之方法係在O2 存在下進行。
預期除非明確地否認或不適用，否則本文所述之任一實施例，包括僅在本發明之一態樣中描述的彼等(而非在其他態樣中描述，抑或在其他態樣中重複)及僅在實例中描述之彼等，均可與本發明之任一或多個其他實施例組合。
1. 定義
為了促進理解本發明，下文定義多個術語及措辭。
如本文所用，術語「抗體藥物結合物」(ADC)及「免疫結合物」係指連接至細胞結合劑(例如抗體或其抗原結合片段)且由以下通式定義之化合物或其衍生物：D-L-A，其中D =細胞毒性藥物，L =連接體，且A =抗體或抗體片段。ADC亦可以逆序由以下通式定義：A-L-D。ADC可包含每個抗體或其抗原結合片段多個藥物及連接體，例如(D-L)4 -A或A-(L-D)2 。術語「抗體藥物結合物」及「免疫結合物」在本文中可互換使用。
除非另外指示，否則如本文中可互換使用之術語「(人類) IL-3Rα」、「介白素-3受體α」或「CD123」係指任何原生(人類) IL-3Rα或CD123。CD123蛋白係雜二聚細胞介素受體之介白素3特異性次單元(IL-3受體或IL-3R)。IL-3R包含配位體特異性α次單元，及由介白素3 (IL3)、群落刺激因子2 (CSF2 / GM-CSF)及介白素5 (IL5)之受體共享的信號轉導通用β次單元(亦稱作CD131)。CD123/IL-3Rα與IL3之結合取決於該β次單元。該β次單元藉由配位體結合來活化，且係IL3之生物活性所需的。
關於CD123之所有此等上述術語均可指如本文所指示之蛋白質或核酸序列。術語「CD123/IL-3Rα」涵蓋「全長」未加工CD123/IL-3Rα，以及由細胞內之加工產生的任何形式之CD123/IL-3Rα。該術語亦涵蓋CD123/IL-3Rα蛋白或核酸之天然存在之變異體，例如剪接變異體、等位基因變異體及同功異型物。本文所述之CD123/IL-3Rα多肽及聚核苷酸可自多種來源，諸如自人類組織類型或自另一來源分離，或藉由重組或合成方法製備。CD123/IL-3Rα序列之實例包括但不限於NCBI參考編號NP_002174及NM_002183 (針對人類CD123變異體1之蛋白質及核酸序列)，以及NP_001254642及NM_001267713 (針對人類CD123變異體2之蛋白質及核酸序列)。
術語「ADAM9」係指含有去整合素及金屬蛋白酶域之蛋白9，其為ADAM分子家族之成員。其經合成為無活性形式，該無活性形式經蛋白水解裂解以產生活性酶。上游處之加工對於酶原之活化而言尤其重要。ADAM9表現於纖維母細胞(Zigrino, P.等人 (2011) 「The Disintegrin-Like And Cysteine-Rich Domains Of ADAM-9 Mediate Interactions Between Melanoma Cells And Fibroblasts ,」 J. Biol. Chem. 286:6801-6807)、經活化血管平滑肌細胞(Sun, C.等人 (2010) 「ADAM15 Regulates Endothelial Permeability And Neutrophil Migration Via Src/ERK1/2 Signalling ,」 Cardiovasc. Res. 87:348-355)、單核球(Namba, K.等人 (2001) 「Involvement Of ADAM9 In Multinucleated Giant Cell Formation Of Blood Monocytes ,」 Cell. Immunol. 213:104-113)及經活化巨噬細胞(Oksala, N.等人 (2009) 「ADAM-9, ADAM-15, And ADAM-17 Are Upregulated In Macrophages In Advanced Human Atherosclerotic Plaques In Aorta And Carotid And Femoral Arteries – Tampere Vascular Study ,」 Ann. Med. 41:279-290)中。代表性人類ADAM9多肽為NCBI序列NP_003807。在ADAM9多肽之819個胺基酸殘基中，殘基1-28為信號序列，殘基29-697為細胞外域，殘基698-718為跨膜域，且殘基719-819為細胞內域。三個結構域位於細胞外域內：Reprolysin (M12B)家族鋅金屬蛋白酶域(在大約殘基212-406處)；去整合素域(在大約殘基423-497處)；及EGF樣域(在大約殘基644-697處)。多種轉譯後修飾及同功異型物已經鑑別且該蛋白質在其到達質膜以產生成熟蛋白質之前在反面高爾基體網狀結構中經蛋白水解裂解。前域之移除經由兩個不同位點處之裂解而發生。加工最有可能在前域與催化域之間的邊界處(Arg-205/Ala-206)藉由諸如弗林蛋白酶之原蛋白轉化酶而發生。額外上游裂解原蛋白轉化酶位點(Arg-56/Glu-57)在ADAM9之活化中具有重要作用。代表性食蟹獼猴ADAM9多肽為NCBI序列XM_005563126.2，包括可能28個胺基酸殘基之信號序列。該蛋白質之Reprolysin (M12B)家族鋅金屬蛋白酶域在大約殘基212-406處)；該蛋白質之去整合素域在大約殘基423-497處。
術語「抗體」意謂免疫球蛋白分子，其經由該免疫球蛋白分子之可變區內的至少一個抗原識別位點識別且特異性地結合於標靶，諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂質或前述各物之組合。如本文所用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2 及Fv片段)、單鏈Fv (scFv)突變體、多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、包含抗體之抗原決定部分的融合蛋白及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現所需生物活性即可。抗體基於其重鏈恆定域之屬性(分別稱作α、δ、ε、γ及μ)可為免疫球蛋白之五種主要類別中的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其亞類(同型) (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及IgA2)。不同類別之免疫球蛋白具有不同且熟知之次單元結構及三維組態。抗體可為裸的或結合於其他分子，諸如毒素、放射性同位素等。
在一些實施例中，抗體為非天然存在之抗體。在一些實施例中，抗體自天然組分經純化。在一些實施例中，抗體係重組產生的。在一些實施例中，抗體係藉由融合瘤產生的。
術語「抗CD123抗體」、「抗IL-3Rα抗體」或「(特異性地)結合於CD123/IL-3Rα之抗體」係指能夠以充足親和力結合CD123 / IL-3Rα的抗體，以致該抗體可用作靶向CD123/IL-3Rα之診斷及/或治療劑。除非另外規定，否則抗CD123/IL-3Rα抗體與無關、非CD123/IL-3Rα蛋白之結合程度小於該抗體與CD123/IL-3Rα之結合的約10%，如例如藉由放射性免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合於CD123/IL-3Rα之抗體具有≤0.5 nΜ、≤0.3 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM或≤0.01 nM之解離常數(Kd )。在一個實施例中，抗CD123/IL-3Rα抗體不結合通用β鏈CD131。在一個實施例中，抗CD123/IL-3Rα抗體不結合CD123中由諸如7G3 (小鼠IgG2a )、6H6 (小鼠IgG1 )及9F5 (小鼠IgG1 )之已知且市售CD123抗體結合之相同抗原決定基(Sun等人,Blood 87(1): 83-92, 1996)。
本文提供本發明之抗CD123/IL-3Rα抗體及其抗原結合片段之序列。
術語「抗體片段」係指完整抗體之一部分且係指完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab’)2 及Fv 片段、線性抗體、單鏈抗體及由抗體片段形成之多特異性抗體。術語抗體之「抗原結合片段」包括抗體中保持特異性地結合於抗原之能力的一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之某些片段執行。涵蓋於術語抗體之「抗原結合片段」內的結合片段之實例包括(但不限於)：(i) Fab片段，即由VL 、VH 、CL 及CH1 域組成之單價片段(例如，藉由木瓜蛋白酶消化之抗體產生三個片段：兩個抗原結合Fab片段及一個不結合抗原之Fc片段)；(ii) F(ab’)2 片段，即包含由鉸鏈區處之二硫橋連接的兩個Fab片段之二價片段(例如，藉由胃蛋白酶消化之抗體產生兩個片段：二價抗原結合F(ab’)2 片段及不結合抗原之pFc’片段)及其相關F(ab’)單價單元；(iii) Fd 片段，其由VH 及CH1 域組成(亦即，重鏈中包括於Fab中的彼部分)；(iv)由抗體單臂之VL 及VH 域組成的Fv 片段，及相關二硫化物連接之Fv ；(v) dAb (域抗體)或sdAb (單域抗體)片段(Ward等人,Nature 341:544-546, 1989)，其由VH 域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。
「單株抗體」係指牽涉於單一抗原決定子或抗原決定基之高度特異性識別及結合中的均質抗體群體。此與多株抗體形成對照，多株抗體典型地包括針對不同抗原決定子之不同抗體。術語「單株抗體」涵蓋完整及全長單株抗體，以及抗體片段(諸如Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv )、單鏈(scFv)突變體、包含抗體部分之融合蛋白及包含抗原識別位點之任何其他經修飾免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」係指以多種方式製得之該等抗體，該等方式包括但不限於藉由融合瘤、噬菌體選擇、重組表現及基因轉殖動物。
術語「人類化抗體」係指非人類(例如鼠科動物)抗體之形式，該等形式為特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人類(例如鼠科動物)序列之片段。典型地，人類化抗體係其中來自互補決定區(CDR)之殘基由來自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之CDR的殘基置換之具有所需特異性、親和力及能力之人類免疫球蛋白(Jones等人, Nature 321:522-525, 1986；Riechmann等人,Nature 332:323-327, 1988；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536, 1988)。
在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv 構架區(FR)殘基經來自非人類物種之具有所需特異性、親和力及能力之抗體中的相應殘基置換。該人類化抗體可藉由Fv 構架區中及/或經置換非人類殘基內額外殘基之取代進一步經修飾以細化及最佳化抗體特異性、親和力及/或能力。一般而言，人類化抗體將包含實質上全部的至少一個且典型地兩個或三個可變域，該等可變域含有全部或實質上全部的對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，而全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白共有序列之彼等。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區或域(Fc ) (典型地，人類免疫球蛋白之恆定區或域)的至少一部分。用於產生人類化抗體之方法之實例描述於美國專利5,225,539及5,639,641，Roguska等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3):969-973, 1994；及Roguska等人, Protein Eng. 9(10):895-904, 1996 (均以引用之方式併入本文中)中。在一些實施例中，「人類化抗體」為表面重塑抗體。在一些實施例中，「人類化抗體」為CDR移植抗體。
抗體之「可變區」係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區，單獨或組合。重鏈及輕鏈之可變區各自由四個藉由三個互補決定區(CDR) (亦稱作高變區)連接之構架區(FR)組成。各鏈中之CDR藉由FR緊密地保持在一起且與來自另一鏈之CDR一起促進形成抗體之抗原結合位點。存在至少兩種用於測定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列變異性之方法(亦即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)；及(2)基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法(Al-lazikani等人, J. Molec. Biol. 273:927-948, 1997)。此外，此兩種方法之組合有時用於此項技術中以測定CDR。
當提及可變域中之殘基(大約為輕鏈之殘基1-107及重鏈之殘基1-113)時，一般使用Kabat編號系統(例如Kabat等人, Sequences of Immunological Interest , 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。
如Kabat中之胺基酸位置編號係指在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) (以引用之方式併入本文中)中用於抗體之彙編的重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有較少或額外胺基酸，其對應於可變域之FR或CDR的縮短或插入其中。例如，重鏈可變域可包括在H2之殘基52後面的單一胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及在重鏈FR殘基82後面插入之殘基(例如，根據Kabat的殘基82a、82b及82c等)。殘基之Kabat編號可針對既定抗體藉由在該抗體之序列的同源區處與「標準」Kabat編號序列比對來測定。而Chothia指出結構環之位置(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917,1987)。當使用Kabat編號慣例編號時Chothia CDR-H1環之末端在H32與H34之間變化，視該環之長度而定。此係因為Kabat編號方案將插入置於H35A及H35B處—若35A及35B均不存在，則該環在32處結束；若僅35A存在，則該環在33處結束；若35A及35B均存在，則該環在34處結束。AbM高變區表示在Kabat CDR與Chothia結構環之間的折衷，且藉由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用。
環 Kabat AbM Chiothia
L1 L24-L34 L24-L34 L24-L34
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L97
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32..34
   (Kabat 編號 )
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32
   (Chothia 編號 )
H2 H50-H65 H50-H58 H52-H56
H3 H9S-H102 H95-H102 H95-H102
如Kabat或EU編號方案中之EU指數或EU指數係指基於Edelman等人, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85 (以引用之方式併入本文中)之人類IgG1 Eu抗體的編號系統。
術語「人類抗體」意謂由人類產生之抗體，或使用此項技術中已知之任何技術製得的具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的抗體。在某些實施例中，該人類抗體不具有非人類序列。人類抗體之此定義包括完整或全長抗體，或其抗原結合片段。
術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子之胺基酸序列係源於兩種或更多種物種之抗體。典型地，輕鏈及重鏈之可變區對應於源於一種哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特異性、親和力及能力之抗體之可變區，而恆定區與源於另一物種(通常為人類)之抗體中的序列同源以避免或減少在彼物種(例如人類)中引發免疫反應之機會。在某些實施例中，嵌合抗體可包括包含至少一種人類重鏈及/或輕鏈多肽之抗體或其抗原結合片段，諸如包含鼠科動物輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」在本文中可互換使用且係指抗原中能夠由特定抗體識別且特異性地結合之彼部分。當抗原為多肽時，抗原決定基可由連續胺基酸及藉由蛋白質之三重摺疊並置之非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之抗原決定基在蛋白質變性時典型地經保持，而藉由三重摺疊形成之抗原決定基在蛋白質變性時典型地喪失。抗原決定基典型地包括呈獨特空間構形之至少3個且更通常地至少5個或8-10個胺基酸。
「結合親和力」一般係指在分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之合計強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)之間的1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd )或半最大有效濃度(EC50 )表示。親和力可藉由此項技術中已知之常見方法，包括本文所述之彼等來量測。低親和力抗體一般緩慢地結合抗原且傾向於快速地解離，而高親和力抗體一般更快結合抗原且傾向於保持更久結合。此項技術中已知多種量測結合親和力之方法，其中任一者均可用於本發明之目的。本文描述特定說明性實施例。
「特異性地結合」一般意謂抗體經由其抗原結合域結合於抗原決定基，且該結合使得該抗原結合域與該抗原決定基之間需要一些互補性。根據此定義，與抗體將結合於隨機、無關抗原決定基相比，當抗體更容易地經由其抗原結合域結合於一抗原決定基時，據說該抗體「特異性地結合」於彼抗原決定基。術語「特異性」在本文中用於限定特定抗體結合於特定抗原決定基時之相關親和力。例如，抗體「A」可被認為與抗體「B」相比對既定抗原決定基具有較高特異性，或據說與抗體「A」對相關抗原決定基「D」之特異性相比，抗體「A」可以較高特異性結合於抗原決定基「C」。
如本文所用，術語「免疫結合物」、「結合物」或「ADC」係指連接至細胞結合劑(例如抗體或其抗原結合片段)之化合物或其衍生物。
「連接體」係能夠以穩定、共價方式連接諸如本文所述之細胞毒性劑(例如吲哚啉并苯并二氮呯(IGN)化合物)之化合物(通常為藥物)至諸如抗體或其片段之細胞結合劑的任何化學部分。連接體在使該化合物或該抗體保持活性之條件下可易經受或實質上抵抗酸誘導性裂解、光誘導性裂解、肽酶誘導性裂解、酯酶誘導性裂解及二硫鍵裂解。合適連接體為此項技術中熟知的且包括例如二硫基、硫醚基、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。連接體亦包括帶電連接體，及如本文所述及此項技術中已知之其親水形式。
術語「經半胱胺酸工程改造之抗體」包括具有通常未存在於抗體輕鏈或重鏈之既定殘基處的至少一個Cys之抗體。該等Cys亦可稱作「經工程改造之Cys」，可使用任何習知分子生物學或重組DNA技術(例如，藉由用Cys之編碼序列置換在標靶殘基處的非Cys殘基之編碼序列)經工程改造。例如，若初始殘基為具有編碼序列5’-UCU-3’之Ser，則該編碼序列可突變(例如，藉由定點誘變)為5’-UGU-3’，其編碼Cys。在某些實施例中，本發明之經Cys工程改造之抗體在重鏈中具有經工程改造之Cys。在某些實施例中，經工程改造之Cys在重鏈之CH3域中或附近。
術語「未配對半胱胺酸」係指位於細胞結合劑(例如抗體或其抗原結合片段)上之半胱胺酸殘基，其未牽涉於與該細胞結合劑之另一半胱胺酸殘基形成二硫鍵。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段之未配對半胱胺酸係未牽涉於形成鏈間或鏈內二硫鍵之半胱胺酸殘基。在某些實施例中，未配對半胱胺酸係經工程改造之半胱胺酸殘基。
術語「封端劑」係指具有硫醇-SH基團之試劑，其可與CBA之未配對半胱胺酸形成二硫化物。在某些實施例中，封端劑為用於CBA (例如抗體或其抗原結合片段)之產生或純化的含硫醇試劑，諸如用於供產生抗體或其抗原結合片段用之培養基中的一或多種含硫醇試劑。在某些實施例中，封端劑為半胱胺酸、麩胱甘肽、高半胱胺酸或其組合。在某些實施例中，封端劑係經固定含硫醇試劑或硫醇-親和力樹脂(例如硫丙基瓊脂糖6B)。參見Guo, J.等人, Nat Protoc. 2014年1月; 9(1): 64-75，以引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「連續過程」係指如下過程，其中當反應繼續進行時及在已形成至少一種反應產物之後，一或多種反應試劑繼續添加至反應中。當反應繼續進行時，反應產物可繼續自反應中移出。
如本文所用，術語「流式反應器」係指用於連續反應化學之任何反應容器，典型地管狀。流式反應器可由不鏽鋼、玻璃、聚合物等製成。
如本文所用，術語「過濾器」係指允許流體中之物質分離之選擇性障壁。分離係藉由選擇性傳遞(滲透)流體之一或多種物質通過過濾器，同時阻止一或多種其他物質之傳遞來實現。
如本文所用，術語「進料流」係指經進給至過濾器或膜以在該過濾器或膜中分離組分之流體。
如本文所用，術語「滲餘物」係指進料流中未傳遞通過過濾器之部分。
如本文所用，術語「滲透物」係指進料流中傳遞通過過濾器之部分。
如本文所用，術語「切向流過濾」(TFF)係指基於膜之過濾過程，其中進料流平行於膜面傳遞。進料流之一部分傳遞通過膜(滲透物)，而剩餘物(滲餘物)再循環返回進料儲器。TFF亦稱作交叉流過濾。用於執行TFF之系統為已知的且包括例如Pellicon類型系統(Millipore, Billerica, MA)、Sartocon卡匣系統(Sartorius AG, Edgewood, NY)及Centrasette類型系統(Pall Corporation, East Hills, NY)。
如本文所用，術語「單程切向流過濾」(SPTFF)係指切向流過濾過程，其中進料流僅在膜面上傳遞一次。用於執行SPTFF之系統為已知的且包括例如Cadance類型系統(Pall Corporation, Westborough, MA)。用於執行SPTFF之系統及方法揭示於例如美國專利第7,384,549號、美國專利第7,510,654號、美國專利第7,682,511號、美國專利第7,967,987號、美國專利第8,157,999號及美國專利第8,231,787號中，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。
如本文所用，術語「連續透濾」係指如下透濾過程，其中藉由使進料流與稀釋劑混合並將其泵送通過膜，同時移出滲透物及滲餘物而以連續方式實現溶質之選擇性分離。當過濾進行時，產物未形成於容器中；相反，其在過濾過程期間連續地自該系統中抽出。「逆流透濾」係指過程流(例如滲透物或滲餘物)在透濾步驟中再循環之連續透濾過程。
術語「在線監測」係指例如在產生或純化過程期間，即時監測分析物。在線監測不同於不提供即時反饋之過程中取樣或離線分析。
術語「在線過程自動化技術」係指用於在過程期間監測分析物之任何在線量測器件。
如本文所用，術語「分析物」為廣泛術語，且其係指但不限於流體中可經分析之物質或化學組分。分析物可包括天然存在之物質、人工物質、代謝物及/或反應產物。在一些實施例中，用於本文所揭示之方法中的量測之分析物為抗體或其抗原結合片段、藥物、連接體、結合於抗體或其抗原結合片段之連接體、結合於藥物之連接體、抗體-藥物結合物(ADC)、藥物:抗體比率(DAR)及/或雜質。
如本文所用，術語「調配緩衝液」係指允許活性成分具有生物活性且不含對將投與調配物之個體具有不可接受之毒性的額外組分之緩衝液。
術語「癌症」及「癌的」係指或描述哺乳動物中之生理學疾患，其中細胞群體之特徵在於不受調控之細胞生長。「腫瘤」及「贅瘤」係指由於過度細胞生長或增生而產生之一或多種細胞，其為良性(非癌的)或惡性(癌的)，包括癌前病變。
癌症之實例包括肺癌(例如非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌。在某些實施例中，該癌症為非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌或胰臟癌。在某些實施例中，該癌症為非小細胞肺癌(鱗狀細胞癌、非鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌)、結腸直腸癌(腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌)或乳癌(例如三陰性乳癌(TNBC))。在某些實施例中，癌症為淋巴瘤及白血病。在某些實施例中，癌症之實例包括AML、CML、ALL (例如B-ALL)、CLL、骨髓發育不良症候群、母細胞性漿細胞樣DC贅瘤(BPDCN)白血病、B細胞淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphomas，NHL)、前驅體B細胞淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤及成熟B細胞贅瘤，諸如B細胞慢性淋巴球性白血病(B-CLL) /小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、B細胞幼淋巴球性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL) (包括低級、中間級及高級FL)、皮膚濾泡中心淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤(MALT類型、淋巴結及脾類型)、毛細胞白血病(HCL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、漿細胞瘤、漿細胞骨髓瘤、移植後淋巴增生性病症、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)及霍奇金氏白血病(HL)。在某些實施例中，該癌症為BPDCN白血病。在某些實施例中，該癌症為ALL。在其他實施例中，該癌症為AML。
術語「個體」係指欲為特定治療之接受者的任何動物(例如哺乳動物)，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、囓齒動物及其類似動物。典型地，術語「個體」及「患者」在本文中關於人類個體可互換使用。
術語「醫藥組合物」係指呈允許活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投與該組合物之個體具有不可接受之毒性的額外組分之製劑。該組合物可為無菌的。
如本文所揭示之免疫結合物的「治療有效量」為足以進行特定陳述之目的的量。「治療有效量」可關於所陳述之目的憑經驗且以常規方式確定。
如本文所用，「烷基」或「直鏈或分支鏈烷基」係指飽和直鏈或分支鏈單價烴基。在較佳實施例中，直鏈或分支鏈烷基具有三十個或三十個以下碳原子(例如，關於直鏈烷基為C1 -C30 且關於分支鏈烷基為C3 -C30 )，且更佳地二十個或二十個以下碳原子。甚至更佳地，直鏈或分支鏈烷基具有十個或十個以下碳原子(亦即，關於直鏈烷基為C1 -C10 且關於分支鏈烷基為C3 -C10 )。在其他實施例中，直鏈或分支鏈烷基具有六個或六個以下碳原子(亦即，關於直鏈烷基為C1 -C6 且關於分支鏈烷基為C3 -C6 )。烷基之實例包括但不限於甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2 CH(CH3 )2 )、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基)、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基及其類似基團。此外，如本說明書、實例及申請專利範圍中所用之術語「烷基」意欲包括「未經取代烷基」及「經取代烷基」，其中後者係指具有置換烴骨架之一或多個碳上的氫之取代基之烷基部分。如本文所用，(Cx -Cxx )烷基或Cx-xx 烷基意謂具有x-xx個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。
「烯基」或「直鏈或分支鏈烯基」係指具有兩個至二十個碳原子且具有至少一個不飽和位點(亦即，碳-碳雙鍵)之直鏈或分支鏈單價烴基，其中烯基包括具有「順式」及「反式」取向或替代地「E」及「Z」取向之基團。實例包括但不限於乙烯基(ethylenyl或vinyl，-CH=CH2 )、烯丙基(-CH2 CH=CH2 )及其類似基團。較佳地，烯基具有兩個至十個碳原子。更佳地，烷基具有兩個至四個碳原子。
「炔基」或「直鏈或分支鏈炔基」係指具有兩個至二十個碳原子且具有至少一個不飽和位點(亦即，碳-碳參鍵)之直鏈或分支鏈單價烴基。實例包括但不限於乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基及其類似基團。較佳地，炔基具有兩個至十個碳原子。更佳地，炔基具有兩個至四個碳原子。
術語「環狀烷基」及「環烷基」可互換使用。如本文所用，該術語係指飽和碳環之基團。在較佳實施例中，環烷基在其環結構中具有3至10個碳原子，且更佳地在環結構中具有5至7個碳原子。在一些實施例中，該兩個環可共同具有兩個或更多個原子，例如該等環為「稠環」。合適環烷基包括但不限於環庚基、環己基、環戊基、環丁基及環丙基。在一些實施例中，環烷基為單環基團。在一些實施例中，環烷基為二環基團。在一些實施例中，環烷基為三環基團。
術語「環烷基烷基」係指經環烷基取代之上述烷基。
術語「環狀烯基」係指在環結構中具有至少一個雙鍵之碳環基團。
術語「環狀炔基」係指在環結構中具有至少一個參鍵之碳環基團。
如本文所用，術語「芳基」或「芳環」包括經取代或未經取代單環芳族基團，其中該環之每一個原子均為碳。較佳地，該環為5至7員環，更佳地6員環。芳基包括但不限於苯基、苯酚、苯胺及其類似基團。術語「芳基」亦包括「多環基」、「多環」及「多環狀」環系統，其具有兩個或更多個環，其中兩個或更多個原子為兩個鄰接環所共有，例如該等環為「稠環」，其中該等環中之至少一者為芳族，例如其他環可為環烷基、環烯基、環炔基或芳環。在一些較佳實施例中，多環具有2-3個環。在某些較佳實施例中，多環系統具有兩個環，其中該等環均為芳族。多環之每一個環均可經取代或未經取代。在某些實施例中，多環之每一個環在環中含有3至10個碳原子，較佳地5至7個。例如，芳基包括但不限於苯基、甲苯基、蒽基、茀基、茚基、薁基及萘基，以及苯并稠合碳環部分，諸如5,6,7,8-四氫萘基及其類似基團。在一些實施例中，芳基為單環芳族基團。在一些實施例中，芳基為雙環芳族基團。在一些實施例中，芳基為三環芳族基團。
如本文所用，術語「雜環(heterocycle)」、「雜環基」及「雜環(heterocyclic ring)」係指3員至18員環、較佳地3員至10員環、更佳地3員至7員環之經取代或未經取代非芳環結構，其環結構包括至少一個雜原子，較佳地一至四個雜原子，更佳地一或兩個雜原子。在某些實施例中，該環結構可具有兩個環。在一些實施例中，該兩個環可共同具有兩個或更多個原子，例如該等環為「稠環」。雜環基包括例如哌啶、哌𠯤、吡咯啶、嗎啉、內酯、內醯胺及其類似基團。雜環描述於Paquette, Leo A.；「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」 (W. A. Benjamin, New York, 1968)，尤其第1、3、4、6、7及9章；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs」 (John Wiley & Sons, New York, 1950年至今)，尤其第13、14、16、19及28卷；及J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566中。雜環之實例包括但不限於四氫呋喃、二氫呋喃、四氫噻吩、四氫哌喃、二氫哌喃、四氫噻喃、硫代嗎啉、噻㗁烷、高哌𠯤、氮雜環丁烷、氧雜環丁烷、硫雜環丁烷、高哌啶、哌啶、哌𠯤、吡咯啶、嗎啉、氧雜環庚烷、硫雜環庚烷、氧氮呯、二氮呯、硫氮呯、2-吡咯啉、3-吡咯啉、吲哚啉、2H-哌喃、4H-哌喃、二㗁烷、1,3-二氧戊環、吡唑啉、二噻烷、二硫戊環、二氫哌喃、二氫噻吩、二氫呋喃、吡唑啶基咪唑啉、咪唑啶、3-氮雜雙環[3.1.0]己烷、3-氮雜雙環[4.1.0]庚烷及氮雜雙環[2.2.2]己烷。螺部分亦包括於此定義之範圍內。其中環原子經側氧基(=O)部分取代之雜環基團的實例為嘧啶酮及1,1-二側氧基-硫代嗎啉。
如本文所用，術語「雜芳基(heteroaryl)」或「雜芳環(heteroaromatic ring)」係指經取代或未經取代芳族單環結構，較佳地6員至18員環，較佳地5員至7員環，更佳地5員至6員環，其環結構包括至少一個雜原子(例如，O、N或S)，較佳地一至四個或一至三個雜原子，更佳地一或兩個雜原子。當兩個或更多個雜原子存在於雜芳基環中時，其可為相同或不同的。術語「雜芳基」亦包括「多環基」、「多環」及「多環狀」環系統，其具有兩個或更多個環，其中兩個或更多個環原子為兩個鄰接環所共有，例如該等環為「稠環」，其中該等環中之至少一者為雜芳族，例如其他環可為環烷基、環烯基、環炔基、芳基、雜芳族及/或雜環基。在一些較佳實施例中，多環雜芳基具有2-3個環。在某些實施例中，較佳多環雜芳基具有兩個環，其中該等環均為芳族。在某些實施例中，多環之每一個環在環中含有3至10個原子，較佳地在環中含有5至7個原子。例如，雜芳基包括但不限於吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、㗁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡𠯤、嗒𠯤、喹啉、嘧啶、吲𠯤、吲哚、吲唑、苯并咪唑、苯并噻唑、苯并呋喃、苯并噻吩、噌啉、酞𠯤、喹唑啉、咔唑、啡㗁𠯤、喹啉、嘌呤及其類似物。在一些實施例中，雜芳基為單環芳族基團。在一些實施例中，雜芳基為雙環芳族基團。在一些實施例中，雜芳基為三環芳族基團。
在可能的情況下，雜環或雜芳基可為碳(碳連接)或氮(氮連接)附接的。舉例而言且非限制，碳鍵結之雜環或雜芳基鍵結於吡啶之2、3、4、5或6位、嗒𠯤之3、4、5或6位、嘧啶之2、4、5或6位、吡𠯤之2、3、5或6位、呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之2、3、4或5位、㗁唑、咪唑或噻唑之2、4或5位、異㗁唑、吡唑或異噻唑之3、4或5位、氮丙啶之2或3位、氮雜環丁烷之2、3或4位、喹啉之2、3、4、5、6、7或8位或異喹啉之1、3、4、5、6、7或8位。
舉例而言且非限制，氮鍵結之雜環或雜芳基鍵結於氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌𠯤、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑之1位、異吲哚或異吲哚啉之2位、嗎啉之4位及咔唑或O-咔啉之9位。
存在於雜芳基或雜環基中之雜原子包括經氧化形式，諸如NO、SO及SO2 。
在一些實施例中，雜芳環為5至18員環。
術語「鹵基」或「鹵素」係指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)。在一些實施例中，鹵素為氟。在一些實施例中，鹵素為氯。在一些實施例中，鹵素為溴。在一些實施例中，鹵素為碘。如本文所用，術語「鹵烷基」係指如本文所定義之烷基，其由如本文所定義之一或多個鹵基取代。鹵烷基可為單鹵烷基、二鹵烷基或聚鹵烷基。單鹵烷基可具有一個氟、氯、溴或碘取代基。二鹵烷基或聚鹵烷基可經兩個或更多個相同鹵原子或不同鹵基之組合取代。鹵烷基之實例包括但不限於氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基及二氯丙基。
本文所用之「烷氧基」係指烷基-O-，其中烷基定義於上文中。烷氧基之實例包括但不限於甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、第三丁氧基、戊氧基、己氧基及其類似基團。
上文所述之烷基、鹵烷基、烷氧基、烯基、炔基、環狀烷基、環狀烯基、環狀炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基可視情況經一或多個(例如，2、3、4、5、6個或更多個)取代基取代。
除非特定地陳述為「未經取代」，否則本文中對化學部分之提及應理解為亦包括經取代變異體。例如，對「烷基」基團或部分之提及暗含包括經取代及未經取代變異體。化學部分上之取代基的實例包括但不限於鹵素、羥基、羰基(諸如羧基、烷氧羰基、甲醯基或醯基)、硫羰基(諸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、醯氧基、磷醯基、磷酸酯、膦酸酯、胺基、醯胺基、脒、亞胺、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、胺磺醯基、磺醯胺基、磺醯基、雜環基、芳烷基或芳基或雜芳基部分。
「視情況選用之」或「視情況」意謂隨後描述之情形可發生或可不發生，使得該申請案包括其中該情形發生之情況及其中該情形不發生之情況。例如，措辭「視情況經取代」意謂非氫取代基可或可不存在於既定原子上，且因此該申請案包括其中存在非氫取代基之結構及其中不存在非氫取代基之結構。
術語「經取代」係指具有置換一或多個碳、氮、氧或硫原子上的氫之取代基之部分。應理解，「取代」或「經取代」包括暗含限制條件，即該取代與經取代原子及取代基之允許價態一致，且該取代產生穩定化合物，例如該化合物不會自發地經歷諸如藉由重排、環化、消去等導致之轉化。如本文所用，術語「經取代」預期包括有機化合物之所有可允許取代基。在一廣泛態樣中，該等可允許取代基包括有機化合物之無環及環狀、分支及未分支、碳環及雜環、芳族及非芳族取代基。該等可允許取代基可為用於適當有機化合物之一或多者且相同或不同。出於本發明之目的，諸如氮之雜原子可具有氫取代基及/或本文所述之有機化合物的滿足雜原子價態之任何可允許取代基。取代基可包括本文所述之任何取代基，例如鹵素、羥基、羰基(諸如羧基、烷氧羰基、甲醯基或醯基)、硫羰基(諸如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、烷硫基、醯氧基、磷醯基、磷酸酯、膦酸酯、胺基、醯胺基、脒、亞胺、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、胺磺醯基、磺醯胺基、磺醯基、雜環基、芳烷基或芳族或雜芳族部分。為了說明，單氟烷基為經一個氟取代基取代之烷基，且二氟烷基為經兩個氟取代基取代之烷基。應認識到，若取代基上存在超過一個取代，則各非氫取代基可為一致或不同的(除非另外規定)。
若取代基之碳經描述為視情況經取代基清單中之一或多者取代，則該碳上的一或多個氫(就存在一些而言)可獨立地及/或合起來經獨立選擇之視情況選用之取代基置換。若取代基之氮經描述為視情況經取代基清單中之一或多者取代，則該氮上的一或多個氫(就存在一些而言)可各自經獨立選擇之視情況選用之取代基置換。一種例示性取代基可經描繪為-NR’R’’，其中R’及R’’與其所附接之氮原子一起可形成雜環。由R’及R’’與其所附接之氮原子一起形成之雜環可部分地或完全地飽和。在一些實施例中，雜環由3至7個原子組成。在其他實施例中，雜環係選自吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、異㗁唑基、吡啶基及噻唑基。
此說明書可互換地使用術語「取代基」、「基團(radical)」及「基團(group)」。
若取代基之基團共同地經描述為視情況由取代基清單中之一或多者取代，則該基團可包括：(1)不可取代之取代基，(2)可取代之取代基，其未由視情況選用之取代基取代，及/或(3)可取代之取代基，其由視情況選用之取代基中的一或多者取代。
若取代基經描述為視情況經多達特定數目之非氫取代基取代，則彼取代基可(1)未經取代；或(2)由多達彼特定數目之非氫取代基或由多達該取代基上之可取代位置的最大數目之非氫取代基(取較小者)取代。因此，舉例而言，若取代基經描述為視情況經多達3個非氫取代基取代之雜芳基，則具有少於3個可取代位置之任何雜芳基均將視情況經多達僅與該雜芳基具有之可取代位置同樣多的非氫取代基取代。在非限制性實例中，該等取代基可選自具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜芳基、雜環基、鹵素、胍鹽[-NH(C=NH)NH2 ]、-OR100 、NR101 R102 、-NO2 、-NR101 COR102 、-SR100 、由-SOR101 表示之亞碸、由-SO2 R101 表示之碸、磺酸酯基-SO3 M、硫酸酯基-OSO3 M、由-SO2 NR101 R102 表示之磺醯胺、氰基、疊氮基、-COR101 、-OCOR101 、-OCONR101 R102 及聚乙二醇單元(-OCH2 CH2 )n R101 ，其中M為H或陽離子(諸如Na+ 或K+ )；R101 、R102 及R103 各自獨立地選自H、具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元(-OCH2 CH2 )n -R104 (其中n為整數1至24)、具有6至10個碳原子之芳基、具有3至10個碳原子之雜環及具有5至10個碳原子之雜芳基；且R104 為H或具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，其中該等基團中由R100 、R101 、R102 、R103 及R104 表示之烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環基視情況經獨立地選自鹵素、-OH、-CN、-NO2 及具有1至4個碳原子之未經取代直鏈或分支鏈烷基的一或多個(例如，2、3、4、5、6個或更多個)取代基取代。較佳地，用於上文所述之視情況經取代之烷基、烯基、炔基、環狀烷基、環狀烯基、環狀炔基、碳環基、芳基、雜環基及雜芳基的取代基包括鹵素、-CN、-NR102 R103 、-CF3 、-OR101 、芳基、雜芳基、雜環基、-SR101 、-SOR101 、-SO2 R101 及-SO3 M。
基團中之碳原子數目在本文中可由字首「Cx-xx 」或「Cx -Cxx 」規定，其中x及xx為整數。例如，「C1-4 烷基」或「C1-C4烷基」為具有1至4個碳原子之烷基。
術語「化合物」、「細胞毒性劑」或「細胞毒性化合物」可互換使用。其意欲包括如下化合物，其結構或式或任何衍生物已揭示於本發明中或其結構或式或任何衍生物已以引用之方式併入。該術語亦包括本發明中所揭示之所有式之化合物的立體異構體、幾何異構體、互變異構體、溶劑合物、代謝物及鹽(例如，醫藥學上可接受之鹽)。該術語亦包括前述任一者之任何溶劑合物、水合物及多晶型物。在此申請案中描述之本發明的某些態樣中，特定陳述「立體異構體」、「幾何異構體」、「互變異構體」、「溶劑合物」、「代謝物」、「鹽」、「結合物」、「結合物鹽」、「溶劑合物」、「水合物」或「多晶型物」不應解釋為在其中使用術語「化合物」而未陳述此等其他形式的本發明之其他態樣中意欲省略此等形式。
術語「對掌性」係指具有鏡像搭配物之不可重疊特性之分子，而術語「非對掌性」係指在其鏡像搭配物上可重疊之分子。
術語「立體異構體」係指如下化合物，其具有一致化學組成及連接性，但其原子在空間中之不同取向無法藉由繞單鍵旋轉而互變。
「非對映異構體」係指具有兩個或更多個對掌性中心且分子彼此不為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同的物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。非對映異構體之混合物可根據高解析度分析程序，諸如結晶、電泳及層析來分離。
「對映異構體」係指化合物之兩種立體異構體，其彼此為不可重疊鏡像。
本文中使用之立體化學定義及慣例通常遵循S. P. Parker編, McGraw-Hill,Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及Eliel, E.及Wilen, S.,Stereochemistry of Organic Compounds , John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994。本發明化合物可含有非對稱或對掌性中心，且因此以不同立體異構體形式存在。預期本發明化合物之所有立體異構體形式形成本發明之一部分，包括但不限於非對映異構體、對映異構體及位阻異構體，以及其混合物，諸如外消旋混合物。多種有機化合物以光學活性形式存在，亦即，其具有使平面偏振光之平面旋轉的能力。在描述光學活性化合物時，字首D及L或R及S用於表示該分子繞其對掌性中心之絕對組態。字首d及I或(+)及(-)用於指示該化合物使平面偏振光旋轉之符號，其中(-)或1意謂該化合物為左旋的。字首為(+)或d之化合物為右旋的。關於既定化學結構，此等立體異構體為一致的，只是其彼此為鏡像。特定立體異構體亦可稱作對映異構體，且該等異構體之混合物通常稱作對映異構體混合物。對映異構體之50:50混合物係稱作外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或過程中不具有立體選擇或立體特異性之情況下存在。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指兩種對映異構體物質之等莫耳濃度混合物，其缺乏光學活性。
術語「互變異構體」或「互變異構體形式」係指可經由低能障壁互變之具有不同能量之結構異構體。例如，質子互變異構體(亦稱作質子移變互變異構體)包括經由質子遷移實現之互變，諸如酮-烯醇及亞胺-烯胺異構化。價互變異構體包括藉由一些鍵結電子之重組實現之互變。
如本文所用，措辭「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之醫藥學上可接受之有機或無機鹽。例示性鹽包括但不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖質酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽「甲磺酸鹽」、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(亦即，1,1’-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))、鹼金屬(例如，鈉及鉀)鹽、鹼土金屬(例如，鎂)鹽及銨鹽。醫藥學上可接受之鹽可涉及包括另一分子，諸如乙酸鹽離子、丁二酸鹽離子或其他相對離子。相對離子可為使母化合物上之電荷穩定化的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽可在其結構中具有超過一個帶電原子。其中多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽的一部分之情況可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
若本發明化合物為鹼，則所需醫藥學上可接受之鹽可藉由此項技術中可獲得之任何合適方法製備，例如用諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸及其類似物之無機酸，或用諸如乙酸、順丁烯二酸、丁二酸、扁桃酸、反丁烯二酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、哌喃糖酸(諸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羥基酸(諸如檸檬酸或酒石酸)、胺基酸(諸如天冬胺酸或麩胺酸)、芳香酸(諸如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(諸如對甲苯磺酸或乙烷磺酸)或其類似物之有機酸處理游離鹼。
若本發明化合物為酸，則所需醫藥學上可接受之鹽可藉由任何合適方法製備，例如用諸如胺(一級、二級或三級)、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物或其類似物之無機或有機鹼處理游離酸。合適鹽之說明性實例包括但不限於源於諸如甘胺酸及精胺酸之胺基酸、氨水、一級、二級及三級胺及諸如哌啶、嗎啉及哌𠯤之環狀胺的有機鹽，及源於鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁及鋰之無機鹽。
如本文所用，術語「溶劑合物」意謂如下化合物，其進一步包括藉由非共價分子間力結合之化學計量或非化學計量之量的溶劑，諸如水、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺二氯甲烷、2-丙醇或其類似物。化合物之溶劑合物或水合物容易藉由向該化合物中添加至少一莫耳當量之羥基溶劑(諸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水)以產生亞胺部分之溶劑化或水合來製備。
措辭「醫藥學上可接受」指示該物質或組合物必須可在化學上及/或在毒物學上與構成該調配物之其他成分及/或用其治療之哺乳動物相容。
術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸或非天然存在之胺基酸。在一個實施例中，胺基酸由NH2 -C(Raa’ Raa )-C(=O)OH表示，其中Raa 及Raa’ 各自獨立地為H、視情況經取代的具有1至10個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、芳基、雜芳基或雜環基或Raa 及N端氮原子可合起來形成雜環(例如，如在脯胺酸中)。術語「胺基酸殘基」係指當一個氫原子自胺基酸之胺及/或羧基末端移除時之相應殘基，諸如-NH-C(Raa’ Raa )-C(=O)-。
術語「陽離子」係指具有正電荷之離子。陽離子可為單價(例如，Na+ 、K+ 、NH4 + 等)、二價(例如，Ca2+ 、Mg2+ 等)或多價(例如，Al3+ 等)。較佳地，陽離子為單價。
術語「硫醇反應性基團」係指可與硫醇(-SH)基團反應以形成共價鍵之基團。例示性硫醇反應性基團包括但不限於順丁烯二醯亞胺、鹵基乙醯基、鹵基乙醯胺、乙烯基碸、乙烯基磺醯胺或乙烯基吡啶。在一個實施例中，硫醇反應性基團為順丁烯二醯亞胺。
應理解，在本文中用語言「包含」描述實施例之任何情況下，亦提供根據「由......組成」及/或「基本上由......組成」描述之其他類似實施例。
如本文中諸如「A及/或B」之措辭中所用的術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」及「B」。同樣，如諸如「A、B及/或C」之措辭中所用的術語「及/或」意欲涵蓋以下實施例中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。2. 製備免疫結合物之方法
在第一態樣中，本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中未配對半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysCBA與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物，其中步驟(a)中之經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；且步驟(b)中之CysCBA未經純化即用於步驟(c)，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
在第二態樣中，本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中未配對半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysCBA與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物， 其中步驟(a)中之經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；步驟(b)中之CysCBA未經純化即用於步驟(c)，且選自步驟(a)至(c)之任一或多個步驟係連續地執行，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
在一些實施例中，上文所述之第二態樣之方法中的步驟(a)至(c)係連續地執行。
在本文所提供之連續方法中，組分繼續添加至正在進行中的過程中，且產物可在該過程中經移出，而非在該過程結束時整體移出。例如，在上文所述之連續方法的步驟(a) (還原步驟)中，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物(亦即，經還原細胞結合劑)之後，還原劑及/或經封端細胞結合劑(cCysCBA)繼續添加至還原反應中。在上文所述之連續方法的步驟(b) (氧化步驟)中，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物(亦即，CysCBA)之後，經還原細胞結合劑及/或選擇性氧化劑繼續添加至氧化反應中。在上文所述之連續方法的步驟(c) (結合步驟)中，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種結合反應產物(ADC)之後，CysCBA及/或式(I)化合物繼續添加至結合反應中。同樣，在下游連續濃縮、純化及/或緩衝液交換過程中，當彼等過程繼續進行時，ADC、緩衝液及/或其他組分繼續添加至濃縮純化及/或緩衝液交換過程中，且經濃縮、經純化及經緩衝液交換之ADC可連續地自彼等正在進行中的過程中移出。因此，整個ADC過程可為連續的(參見例如圖5及圖6)。
本發明人已證明，本文所述之製備ADC之方法可使用流式反應器連續地執行。當反應繼續進行時及在已形成至少一種反應產物之後，流式反應器允許一或多種試劑連續地添加至反應中。流式反應器在該等連續方法中的使用容許反應之控制及方法之多功能性(例如，快速溫度改變/更嚴格溫度控制、藉由擴散介導之混合因此更均一且無容器約束或套件限制)及方法之經改良可擴展性(亦即，分批加工之習知按比例增加風險不適用且時空產率經最佳化(例如，藉由運轉本發明過程持續較長時間來執行假的按比例增加(增加輸出)))。
在某些實施例中，塞流反應器(PFR)用於本發明之連續方法。
在某些實施例中，在一或多種試劑添加至流式反應器中之前，反應容器(例如連續攪拌槽反應器(CSTR))用於反應物之連續添加。反應容器(例如CSTR)及流式反應器(例如塞流反應器)之連續使用具有如下優勢，即減少總體積需求、改良反應物流之間的混合及增加風險緩解能力(包括較寬滯留時間分佈)。
在某些實施例中，關於本文所述之連續方法中的還原步驟(a)，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物(亦即，經還原細胞結合劑)之後，還原劑及經封端細胞結合劑(cCysCBA)連續地添加(例如，針對還原劑使用進料幫浦且針對cCysCBA使用獨立進料幫浦)至反應容器(例如CSTR)中。反應混合物使用幫浦(例如蠕動幫浦)連續地自反應容器(例如CSTR)中抽出且經由流式反應器(例如PFR)進給。在一些實施例中，自反應容器(例如CSTR)中抽出材料之體積流動速率與將還原劑及cCysCBA添加至CSTR中之組合流動速率相同，亦即進入及離開反應容器(例如CSTR)之流動速率相同。
同樣，關於本文所述之連續方法中的選擇性再氧化步驟(b)，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物(亦即，CysCBA)之後，經還原細胞結合劑及選擇性氧化劑連續地添加(例如，針對經還原細胞結合劑使用進料幫浦且針對選擇性氧化劑使用獨立進料幫浦)至反應容器(例如CSTR)中。反應混合物使用幫浦(例如蠕動幫浦)連續地自反應容器(例如CSTR)中抽出且經由流式反應器(例如PFR)進給。在一些實施例中，自反應容器(例如CSTR)中抽出材料之體積流動速率與將經還原細胞結合劑及選擇性氧化劑添加至CSTR中之組合流動速率相同，亦即進入及離開反應容器(例如CSTR)之流動速率相同。
在一些實施例中，關於本文所述之連續方法中的結合步驟(c)，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物(亦即，ADC)之後，CysCBA及式(I)化合物連續地添加(例如，針對CysCBA使用進料幫浦且針對式(I)化合物使用獨立進料幫浦)至反應容器(例如CSTR)中。反應混合物使用幫浦(例如蠕動幫浦)連續地自反應容器(例如CSTR)中抽出且經由流式反應器(例如PFR)進給。在一些實施例中，自CSTR中抽出材料之體積流動速率與將CysCBA及式(I)化合物添加至反應容器(例如CSTR)中之組合流動速率相同，亦即進入及離開反應容器(例如CSTR)之流動速率相同。
在一些實施例中，產生各反應之動力學數據且規定各反應之所需標靶轉化。基於此等結果，各反應之CSTR及PFR體積係基於所用管之內徑及實現各反應步驟之所需滯留時間所需的體積流動速率經規定。
在第三態樣中，本發明提供一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中未配對半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysCBA與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物； (d) 移除未結合之式(I)化合物；及視情況 (e) 將該結合物交換至穩定緩衝液中； 其中步驟(a)中之經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；步驟(b)中之CysCBA未經純化即用於步驟(c)，選自步驟(a)至(e)之任一或多個步驟係連續地執行，且使用單程切向流過濾(SPTFF)及/或逆流透濾來移除未結合之藥物及/或將ADC交換至穩定緩衝液中；且其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
在一些實施例中，關於第三態樣中所述之連續方法，該方法包括步驟(a)至(d)。在一些實施例中，步驟(a)至(d)係連續地執行。在一些實施例中，僅步驟(d)係連續地執行。
在一些實施例中，關於第三態樣中所述之連續方法，該方法包括步驟(a)至(e)。在一些實施例中，步驟(a)至(e)係連續地執行。在一些實施例中，僅步驟(d)及(e)係連續地執行。
本發明人亦已證明，連續ADC加工可使用單程切向流過濾(SPTFF)來實現，SPTFF可成功地分離未結合之藥物(亦即，式(I)化合物)與ADC)。ADC加工可涉及ADC之結合(形成) (亦即，上文所述之步驟(c))、ADC濃縮、ADC純化及/或ADC調配。儘管特別適用的是自ADC結合至調配之整個過程為連續的，亦有可能組合連續加工步驟與分批加工步驟。另外，有可能上游加工步驟(例如抗體之製備，亦即此處所述之方法中的步驟(a)及(b))為連續的且連續地進給至ADC結合中。
整體(習知)透濾涉及用第一緩衝液A (產物最初所處之緩衝液)起動切向流過濾(TFF)系統。產物接著添加至滲餘物容器中，在滲餘物容器中其與起動體積混合。用於滲餘物容器之進料幫浦自滲餘物經TFF膜泵送產物，在TFF膜中產物經保持(且返回滲餘物)或棄去。另一幫浦(透濾幫浦)將自該容器進給至含於獨立容器中之緩衝液B (產物將交換進入之緩衝液)中，該獨立容器具有自該容器至滲餘物容器中之進料線。兩個幫浦均開始且滲餘物容器中之產物開始經TFF膜傳遞。當緩衝液經由廢物流移除時，滲餘物中之體積藉由添加緩衝液B (相等體積)至滲餘物容器中經維持。結果，產物緩慢地交換至緩衝液B中。
SPTFF使用將最初在緩衝液A中之產物交換至緩衝液B中之相關概念。然而，該產物僅僅曾經完成經該膜之單程，因此必須實現使所有適當體積之緩衝液B達成完全緩衝液交換。為此，SPTFF可經堆疊階段添加緩衝液B。因此，產物僅傳遞通過該等膜一次：進入緩衝液A中且離開緩衝液B中之模塊。
同樣，可使用逆流透濾實現連續ADC加工。逆流透濾涉及兩次或更多次SPTFF (例如模塊1、模塊2等)。在一些實施例中，逆流透濾涉及兩個SPTFF模塊，其中來自模塊1之滲餘物與透濾緩衝液之額外進料組合且接著直接地進給至模塊2中，且來自模塊2之滲透物經再循環且與模塊1之進料組合。例示性逆流透濾顯示於圖6中。未經純化之粗ADC產物與透濾(DF)緩衝液流組合且接著經由逆流TFF純化單元之模塊1進行進給。來自模塊1之滲透物經由廢物流移除且來自模塊1之滲餘物與DF緩衝液之額外進料組合且接著經由模塊2進行進給。經純化ADC自模塊2之滲餘物經回收且來自模塊2之滲透物經再循環且與模塊1之進料組合。
因此，如與分批ADC加工相比，本文所提供之連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流透濾)可減少加工時間，改良產率，及/或改良產物一致性。本文所提供之連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流透濾)亦可消除用於分批結合方法中之保留步驟。本文所提供之連續ADC加工方法(例如，使用SPTFF及/或逆流透濾)亦可容許較小設備之使用。SPTFF亦為有利的，因為對潛在地由剪切力引起之氧化敏感的抗體可更加適用於SPTFF。
SPTFF之使用可容許結合反應中組分之連續添加及/或移除。因此，可使用SPTFF來製備用於ADC結合及用於加工經組裝ADC之試劑。SPTFF可使得能夠進行連續ADC加工，以致於針對特定ADC之全部(或子集)加工步驟(例如，產生、濃縮、純化及/或調配)可同時發生。亦可使用逆流透濾來製備用於ADC結合及用於加工經組裝ADC之試劑。
根據本文所提供之方法，可使用SPTFF來濃縮ADC，純化ADC，及/或調配ADC (例如，藉由將ADC交換至調配緩衝液中)。可使用SPTFF將ADC自第一緩衝液轉移至第二緩衝液。亦可使用逆流透濾來濃縮ADC，純化ADC，及/或調配ADC (例如，藉由將ADC交換至調配緩衝液中)，且亦可使用逆流透濾將ADC自第一緩衝液轉移至第二緩衝液。
在本文所提供之一些方法中，SPTFF用於ADC產生、純化及調配中，使得自ADC產生至調配之整個過程為連續的。在本文所提供之一些方法中，逆流透濾用於ADC產生、純化及調配中，使得自ADC產生至調配之整個過程為連續的。
在本文所提供之一些方法中，SPTFF與習知TFF組合使用，以致該等過程之一些部分為連續的，而其他部分分批執行。例如，抗體或其抗原結合片段可在結合之前使用習知(分批) TFF進行緩衝液交換且接著經進給至連續過程中，其中SPTFF係用於下游過程。逆流透濾可替代SPTFF或與SPTFF組合用於該等方法中。
無論用於使緩衝液中之抗體進行結合之過程係分批或以連續方式執行，在結合反應下游之ADC濃縮及純化過程可使用SPTFF且以連續方式執行，或可使用習知TFF且以分批方式執行。同樣，無論用於使緩衝液中之抗體進行結合之過程係在分批或連續過程中執行，且無論ADC係使用分批或連續過程經濃縮及純化，ADC可使用SPTFF以連續方式或使用習知TFF以分批方式經調配。逆流透濾可替代SPTFF或與SPTFF組合用於該等方法中。
在一些實施例中，ADC過程中之至少兩個步驟係使用SPTFF經執行。例如，在一些實施例中，使用SPTFF將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且在ADC形成之後，使用SPTFF濃縮且純化ADC，而使用SPTFF或TFF將ADC交換至調配緩衝液中。在一些實施例中，使用SPTFF將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且使用SPTFF將經純化ADC交換至調配緩衝液中，而在ADC形成之後，使用SPTFF或TFF濃縮且純化ADC。在一些實施例中，使用SPTFF濃縮且純化ADC且使用SPTFF將經濃縮及純化ADC交換至調配緩衝液中，其中使用SPTFF或TFF將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中。
SPTFF可使用超濾膜，例如在濃縮ADC之方法中。SPTFF可使用透濾膜，例如在純化ADC之方法中及/或在將ADC轉移至緩衝液(例如調配緩衝液)中之方法中。
在一些實施例中，ADC過程中之至少兩個步驟係使用SPTFF及/或逆流透濾經執行。例如，在一些實施例中，使用SPTFF及/或逆流透濾將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且在ADC形成之後，使用SPTFF及/或逆流透濾濃縮且純化ADC，而使用SPTFF、逆流透濾及/或TFF將ADC交換至調配緩衝液中。在一些實施例中，使用SPTFF及/或逆流透濾將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中且使用SPTFF及/或逆流透濾將經純化ADC交換至調配緩衝液中，而在ADC形成之後，使用SPTFF、逆流透濾及/或TFF濃縮且純化ADC。在一些實施例中，使用SPTFF及/或逆流透濾濃縮且純化ADC且使用SPTFF及/或逆流透濾將經濃縮及純化ADC交換至調配緩衝液中，其中使用SPTFF、逆流透濾及/或TFF將抗體或其抗原結合片段轉移至結合緩衝液中。
管柱層析亦可以流通模式用於本文所提供之連續ADC加工方法中(例如，與SPTFF及/或逆流透濾組合)。例如，結合反應(例如連續結合反應)可進給至流通管柱層析中以自該結合反應移除未結合之藥物。經由流通管柱層析純化之ADC可接著進給至SPTFF過程中以緩衝液交換至調配緩衝液中。經由流通管柱層析純化之ADC亦可進給至逆流透濾過程中以緩衝液交換至調配緩衝液中。
在一些情況下，本文所提供之連續方法的反應參數可快速地發生改變或「經脈衝化」。例如，在本文所述之連續方法中，溫度可快速地變化，例如藉由使用水浴、經囊封反應器、加熱器、熱電源及/或使反應流經之線圈及/或管之剖面絕緣。另外，在連續流動結合中，pH可快速地變化，例如藉由添加酸或鹼。因此，在某些情況下，使用脈衝化參數來執行連續反應。脈衝化參數之使用可例如縮短反應時間(亦即，增加反應速度)而不損害產物品質，藉由快速地降低溫度暫時地淬滅或停止反應，在引入另一擾亂(例如，添加另一化學試劑)之前穩定化溶液中之結合物，而較長時間暴露於同一參數可急劇地降低產物品質或產物穩定性。
在某些情況下，使該連續反應暴露於變化之溫度(例如，增加或降低)持續規定之時間增量，持續規定次數。例如，在一種情況下，溫度增加至少2℃、至少3℃、至少4℃或至少5℃。因此，溫度可增加或降低至少5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃。例如，溫度可增加或降低5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或35℃。溫度亦可增加或降低5℃-10℃、10℃-15℃、15℃-20℃、20℃-25℃、25℃-30℃或30℃-35℃。因此，例如，溫度可增加(例如，自約20℃)至25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃之升高溫度。溫度亦可增加(例如，自約25℃)至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃之升高溫度。在某些情況下，溫度不超過55℃。在某些情況下，溫度增加(例如，自20℃)至介於35℃-55℃範圍內之升高溫度或至介於40℃-50℃範圍內之升高溫度。在某些情況下，溫度增加(例如，自20℃)至60℃、70℃、80℃、90℃或100℃之升高溫度(例如持續短時間增量，諸如10秒)。在某些情況下，溫度增加(例如，自20℃)至介於60℃-70℃範圍內、介於70℃-80℃範圍內、介於80℃-90℃範圍內或介於90℃-100℃範圍內之升高溫度(例如持續短時間增量，諸如10秒)。在某些情況下，增加或降低溫度至升高溫度或降低溫度所用之時間係不超過2分鐘。在某些情況下，增加或降低溫度至升高溫度或降低溫度所用之時間係不超過1分鐘。
在某些情況下，使該連續反應暴露於變化之pH (例如，增加或降低)持續規定之時間增量，持續規定次數。例如，在一種情況下，pH增加或降低1、2、3、4或5。在一種情況下，pH增加1-2、2-3、3-4或4-5。因此，例如，pH可增加(例如，自4)至5、6、7、8或9。PH亦可增加(例如，自5)至6、7、8或9。PH亦可降低(例如，自9)至8、7、6、5或4。
在某些情況下，脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或pH)存在30秒、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、1.5小時或2小時。脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或)亦可存在例如30秒-1分鐘、1分鐘-2分鐘、2分鐘-3分鐘、3分鐘-4分鐘、4分鐘-5分鐘、6分鐘-7分鐘、7分鐘-8分鐘、8分鐘-9分鐘或9分鐘-10分鐘。脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或)亦可存在例如1-10分鐘、1-15分鐘、1-30分鐘、1分鐘-1小時、1分鐘-1.5小時或1分鐘-2小時。脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或)亦可存在例如1-5分鐘或5-10分鐘、10-15分鐘、15分鐘-30分鐘、30分鐘-1小時、1小時-1.5小時或1.5小時-2小時。在某些情況下，脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或pH)不超過2小時、1小時、30分鐘、20分鐘或15分鐘。
在某些情況下，脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或pH)發生一次。在某些情況下，脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或)重複兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。在某些情況下，脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或)發生一次至五次。在某些情況下，脈衝(例如，暴露於變化之溫度及/或)發生兩次至二十次，或五次至十次。
連續方法(例如，使用SPTFF及/或逆流透濾)可與在線監測過程(論述於下文)一起或不一起使用。
在第一實施例中，第一、第二或第三態樣或其中所述之任何實施例中的CysCBA係經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段且該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個經工程改造之半胱胺酸殘基之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)或其抗原結合片段反應以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成該CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與式(I)化合物：
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(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)；且步驟(b)中之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
在某些實施例中，第一態樣或第一實施例之方法中的步驟(a)、(b)及(c)係在同一反應容器中進行。
在某些實施例中，關於第一實施例或其中所述之任何實施例之方法，經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)或其抗原結合片段中之一或多個鏈間二硫鍵係在步驟(a)中經還原。在某些實施例中，該一或多個鏈間二硫鍵係在步驟(b)中再形成。
在某些實施例中，關於第一、第二或第三態樣或第一實施例或其中所述之任何實施例之方法，任何合適還原劑均可用於步驟(a)之反應中。用還原劑處理cCysCBA (例如cCysAb或其抗原結合片段)可自未配對半胱胺酸殘基移除封端劑以形成游離硫醇(-SH)基且亦可還原在細胞結合劑之兩個半胱胺酸殘基之間形成的二硫鍵，例如抗體或其抗原結合片段之鏈間及/或鏈內二硫鍵。例示性還原劑包括但不限於(i)基於膦之還原劑，諸如參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、參羥基丙基膦(THPP)、參(2-氰基乙基)膦、二環己基膦基)苯磺酸、雙(對磺酸根基苯基)苯基膦、(二苯基膦基)苯磺酸、(二苯基膦基)苯甲酸、三氟甲磺酸2-(二苯基膦基)-N,N,N-三甲基苯甲基銨、(二苯基膦基)乙胺、2-(二異丙基膦基)乙胺、3-(二苯基膦基)丙胺(DPPA)、3,3',3''-三苯基膦三間磺酸鈉、3-(二苯基膦基)苯磺酸鈉、4-(二苯基膦基)苯磺酸鈉、雙(對磺酸根基苯基)苯基膦二水合物二鉀鹽、雙(對磺酸根基苯基)苯基膦二水合物二鉀鹽、丙酸3,3',3''-次膦基參-,1,1',1''-三甲酯(TmTCEP)、丙腈3,3'-(苯基亞膦基)雙-苯胺(亦稱作N,N-雙(氰基乙基)苯胺)、4-(二乙基膦基)-N,N-二甲基-參(3-甲氧基丙基)膦、2-(二苯基膦基)乙酸、(S) 2-[2-(二苯基膦基)乙基]-吡啶、2-2-(二苯基膦基)-1-苯基乙胺、四氟硼酸2-(二苯基膦基)乙銨、3-(二苯基膦基)-丙酸、(乙酸, 2-(二苯基膦基)-, 乙酯)或4-(二苯基磷烷基)丁酸；(i)基於硫醇之還原劑，諸如二硫蘇糖醇(DTT)、1,4-二硫赤藻糖醇(DTE)、1,4-丁二硫醇、L-1,4-二硫蘇糖醇、(S)-2-胺基丁烷-1,4-二硫醇鹽酸鹽、(2S)-2-胺基丁烷-1,4-二硫醇(DTBA)、2-胺基乙烷硫醇(MEA) (或其鹽酸鹽)，或以下任一者：
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、6,6’-蔗糖二硫化物、HS(CH2 )6 SH、
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、CH3 (CH2 )6 SH、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
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、
Figure 02_image085
、HS(CH2 )8 SH、HS(CH2 )7 SH、
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或
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；(iii)經固定二硫化物還原劑，諸如經固定TCEP二硫化物還原凝膠或樹脂、含有已固定有基於硫醇之還原劑的珠粒狀樹脂之經固定還原劑管柱，或(iv)其他還原劑，諸如硒醇、胍-HCl或尿素。
在某些實施例中，還原劑係基於CBA (例如抗體或其抗原結合片段)之等電點(pI)經選擇。
在某些實施例中，第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一實施例或其中所述之任何實施例之方法進一步包括測定CBA (例如抗體或其抗原結合片段)之pI及基於CBA之pI選擇還原劑。CBA之pI可使用已知之任何合適方法經測定。
在某些實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一實施例或其中所述之任何實施例之方法，任何合適氧化劑均可用於步驟(b)之反應中。該氧化劑選擇性地氧化且再形成在CBA之兩個半胱胺酸殘基之間形成的二硫鍵，而不會再氧化未配對半胱胺酸殘基之游離硫醇。在某些實施例中，該氧化劑選擇性地再形成抗體或其抗原結合片段之鏈間及/或鏈內二硫鍵，而不會再氧化未配對半胱胺酸殘基之游離硫醇。例示性氧化劑包括但不限於去氫抗壞血酸(DHAA)、硫酸銅、氧氣、空氣或Cu(II)-(1,10-鄰二氮雜菲)3 及碘溶液(參見Hamdan, F.F.等人, Biochemistry, 2002, 41(24), 第7647-7658頁，以引用之方式併入本文中)。
在第二實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(a)中之還原劑為TCEP或DPPA。
在第三實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一實施例、第二實施例或其中所述之任何實施例之方法，氧化劑為DHAA。
在第四實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二或第三實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(a)之反應係在5.0與8.5之間的pH下進行。更特定言之，步驟(a)之反應係在6.0與7.5之間的pH下進行。
在某些實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三或第四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(b)之反應係在5.0與8.5之間的pH下進行。更特定言之，步驟(b)之反應係在6.0與7.5之間的pH下進行。
在某些實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三或第四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(c)之反應係在5.0與8.5之間的pH下進行。更特定言之，步驟(c)之反應係在6.0與7.5之間的pH下進行。甚至更特定言之，步驟(c)之反應係在5.5與6.5之間的pH下進行。在另一特定實施例中，步驟(c)之反應係在pH 6.0下進行。在另一特定實施例中，步驟(c)之反應係在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三或第四實施例或其中所述之任何實施例之方法，該方法進一步包括在步驟(c)中使CysCBA與細胞毒性劑反應之前調節步驟(b)之後的反應混合物之pH。
在某些實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三或第四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(b)之後的反應混合物之pH未在步驟(c)中使CysCBA與細胞毒性劑反應之前經調節。
在第五實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三或第四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(a)中之還原劑為TCEP且步驟(a)之反應係在7.0與8.0之間、更特定言之7.3與7.7之間的pH下且甚至更特定言之在pH 7.5下進行。
在某些實施例中，關於第五實施例之方法，氧化劑為DHAA且步驟(b)之反應係在7.0與8.0之間、更特定言之7.3與7.7之間的pH下且甚至更特定言之在pH 7.5下進行。
在某些實施例中，關於第五實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(b)之後的反應混合物之pH係在步驟(c)中使CysCBA與細胞毒性劑反應之前自7.3與7.7之間的pH (例如pH 7.5)經調節至5.8至6.2之間的pH (例如pH 6.0)。
在第六實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三或第四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(a)中之還原劑為DPPA且步驟(a)之反應係在6.0與7.0之間、更特定言之6.3與6.7之間的pH下、甚至更特定言之在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第六實施例之方法，氧化劑為DHAA且步驟(b)之反應係在6.0與7.0之間、更特定言之6.3與6.7之間的pH下、甚至更特定言之在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第六實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(b)之後的反應混合物之pH未在步驟(c)中使CysCBA與細胞毒性劑反應之前經調節且步驟(c)之反應係在6.0與7.0之間、更特定言之6.3與6.7之間的pH下、甚至更特定言之在pH 6.5下進行。
在第七實施例中，關於第一或第二態樣或第一、第二、第三、第四、第五或第六實施例或其中所述之任何實施例之方法，該結合物係藉由切向流過濾(TFF)、吸附層析、非吸附層析、吸附過濾、選擇性沈澱或其組合經純化。更特定言之，該結合物係藉由TFF經純化。
任何合適TFF系統均可用於純化，包括Pellicon類型系統(Millipore, Billerica, Mass.)、Sartocon卡匣系統(Sartorius AG, Edgewood, N.Y.)、TangenX卡匣(TangenX Technology Corporation, Shrewsbury, MA)及Centrasette類型系統(Pall Corp., East Hills, N.Y.)
任何合適吸附層析樹脂均可用於純化，其中該樹脂可保持細胞結合劑-細胞毒性劑結合物且允許雜質之溶離，或保持雜質且允許細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之溶離。較佳吸附層析樹脂包括羥磷灰石層析、疏水性電荷誘導層析(HCIC)、疏水性相互作用層析(HIC)、離子交換層析、混合模式離子交換層析、固定金屬親和力層析(IMAC)、染料配位體層析、親和力層析、逆相層析及其組合。合適羥磷灰石樹脂之實例包括陶瓷羥磷灰石(CHT I型及II型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)、HA Ultrogel羥磷灰石(Pall Corp., East Hills, N.Y.)及陶瓷氟磷灰石(CFT I型及II型，Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適HCIC樹脂之實例為MEP Hypercel樹脂(Pall Corp., East Hills, N.Y.)。合適HIC樹脂之實例包括Butyl-Sepharose、Hexyl-Sepaharose、Phenyl-Sepharose及Octyl Sepharose樹脂(均來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，以及Macro-prep Methyl及Macro-Prep t-Butyl樹脂(Biorad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適離子交換樹脂之實例包括SP-Sepharose、CM-Sepharose及Q-Sepharose樹脂(均來自GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Unosphere S樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適混合模式離子交換劑之實例包括Bakerbond ABx樹脂(JT Baker, Phillipsburg N.J.)合適IMAC樹脂之實例包括Chelating Sepharose樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Profinity IMAC樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適染料配位體樹脂之實例包括Blue Sepharose樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)及Affi-gel Blue樹脂(Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)。合適親和力樹脂之實例包括蛋白A瓊脂糖樹脂(例如MabSelect，GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑為抗體；及凝集素親和力樹脂，例如小扁豆凝集素瓊脂糖樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)，其中細胞結合劑攜帶適當凝集素結合位點。或者，可使用對細胞結合劑具特異性之抗體。該種抗體可經固定至例如Sepharose 4 Fast Flow樹脂(GE Healthcare, Piscataway, N.J.)。合適逆相樹脂之實例包括C4、C8及C18樹脂(Grace Vydac, Hesperia, Calif.)。
任何合適非吸附層析樹脂均可用於純化。合適非吸附層析樹脂之實例包括但不限於SEPHADEXTM G-25、G-50、G-100、SEPHACRYLTM 樹脂(例如S-200及S-300)、SUPERDEXTM 樹脂(例如SUPERDEXTM 75及SUPERDEXTM 200)、BIO-GEL® 樹脂(例如P-6、P-10、P-30、P-60及P-100)，及一般技術者已知之其他樹脂。
在一些實施例中，該結合物係藉由單程切向流過濾(SPTFF)經純化。在一些實施例中，該結合物係藉由逆流透濾經純化。
在一些實施例中，使用SPTFF來移除未結合之藥物及/或將ADC交換至穩定緩衝液中。在一些實施例中，使用流通管柱層析來移除未結合之藥物且使用SPTFF將ADC交換至穩定緩衝液中。
在一些實施例中，使用逆流透濾來移除未結合之藥物及/或將ADC交換至穩定緩衝液中。在一些實施例中，使用流通管柱層析來移除未結合之藥物且使用逆流透濾將ADC交換至穩定緩衝液中。
在一些實施例中，SPTFF使用超濾膜。在一些實施例中，SPTFF使用透濾膜。
在一些實施例中，該方法改良ADC產生之一致性。在一些實施例中，該方法降低用於ADC產生之時間。
在一些實施例中，SPTFF改良ADC產生之一致性。在一些實施例中，SPTFF降低用於ADC濃縮、純化或轉移之時間。在一些實施例中，SPTFF降低所用緩衝液之量。
在一些實施例中，逆流透濾改良ADC產生之一致性。在一些實施例中，逆流透濾降低用於ADC濃縮、純化或轉移之時間。在一些實施例中，逆流透濾降低所用緩衝液之量。
在某些實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七實施例或其中所述之任何實施例之方法，該方法進一步包括在該結合物經純化之前調節步驟(c)之後的反應混合物之pH。在一些實施例中，步驟(c)之後的反應混合物之pH係經調節至4.0與6.0之間、4.0與5.5之間、4.0與5.0之間、4.5與5.0之間或4.6與4.8之間之pH。在一特定實施例中，該pH係經調節至4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在另一特定實施例中，該pH係經調節至4.7。
在第八實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七實施例或其中所述之任何實施例之方法，相對於cCysCBA過量之還原劑用於步驟(a)中。更特定言之，還原劑與cCysCBA (例如抗體或其抗原結合片段)之莫耳比率係在1:1與50:1之間、2:1與30:1之間、5:1與25:1之間或10:1與25:1之間。甚至更特定言之，該莫耳比率係在15:1與20:1之間。
在第九實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(a)中之還原劑與步驟(b)中之氧化劑的莫耳比率係在20:1與1:20之間、10:1與1:10之間、5:1與1:5之間、2:1與1:2之間、1.2:1與1:1.5之間、1:1與1:20之間或1:1與1:10之間。更特定言之，還原劑與氧化劑之莫耳比率係在1:1與1:1.5之間。甚至更特定言之，還原劑與氧化劑之莫耳比率為1:1。或者，還原劑與氧化劑之莫耳比率為1:1.5。
在第十實施例中，關於第一態樣、第二態樣或第三態樣或第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九實施例或其中所述之任何實施例之方法，相對於CysCBA (例如抗體或其抗原結合片段)或其抗原結合片段過量之式(I)化合物用於步驟(c)中。更特定言之，對於每一當量之CysCBA，使用1.1與20之間、1.5與20之間、2與20之間、2與10之間、2與5之間、3.5與5之間、4.2與5之間、4.3與4.9之間、4.4與4.8之間或4.5與4.7之間莫耳當量之式(I)化合物。在一特定實施例中，對於每一當量之CysCBA，使用4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0莫耳當量之式(I)化合物。在另一特定實施例中，對於每一當量之CysCBA，使用4.6莫耳當量之式(I)化合物。
在某些實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)，CysAb係在一或多個位置處具有經工程改造之半胱胺酸殘基的抗體，該一或多個位置選自該抗體之EU/OU編號位置40、43、84、88、103、112、113、114、115、118、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、161、168、172、179、187、209、234、235、236、237、238、239、244、245、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、262、265、267、270、272、274、279、280、282、283、284、285、286、288、289、293、295、297、298、303、305、307、308、309、311、312、313、314、315、316、317、318、325、326、327、328、329、330、332、334、338、339、340、341、343、345、360、361、362、371、373、375、376、377、378、380、382、384、385、386、387、389、390、391、413、422、423、424、427、428、430、431、433、434、435、436、437、438、440、442、443及446。在其他實施例中，CysAb係在一或多個位置處具有經工程改造之半胱胺酸殘基的抗體，該一或多個位置選自Kabat編號位置15、43、106、108、110、112、113、119、120、121、142、144、149、153、156、158、168、173、175、205及207。在某些實施例中，CysAb係在描述於WO 2016/040856及美國專利第7,521,541號中之一或多個位置處具有經工程改造之半胱胺酸殘基的抗體，該等文獻各自以引用之方式併入本文中。更特定言之，CysAb為如下抗體，其在該抗體之重鏈之EU/OU編號位置442處具有經工程改造之半胱胺酸殘基。甚至更特定言之，CysAb係在兩條重鏈之EU/OU編號位置442處均具有經工程改造之半胱胺酸殘基的抗體。
在第十一實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image005
， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image007
， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image009
或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，其中：
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； Cap為封端劑；且 D1 係由下式表示：
Figure 02_image089
。
較佳地，D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
。
在第十二實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image005
， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image007
， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image009
(I11) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC， 其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，且步驟(a)至(c)係連續地執行，且其中：
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； Cap為封端劑；且 D1 係由下式表示：
Figure 02_image089
。
較佳地，D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
。
在第十三實施例中，如本文所述之第十一或第十二實施例之方法進一步包括以下步驟：(d)移除未結合之式(I11)化合物；及視情況(e)將ADC交換至穩定緩衝液中。
在一些實施例中，使用SPTFF來移除未結合之藥物及/或將ADC交換至穩定緩衝液中。在一些實施例中，使用逆流透濾來移除未結合之藥物及/或將ADC交換至穩定緩衝液中。
在某些實施例中，步驟(d)及(e)係連續地執行。
在第十四實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image005
， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image007
， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image009
(I11) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC；及 (d) 藉由逆流透濾移除未結合之式(I11)化合物； 其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，且步驟(a)至(d)係連續地執行，且其中：
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； Cap為封端劑；且 D1 係由下式表示：
Figure 02_image089
。
較佳地，D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，該人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28之重鏈可變域(VH )及輕鏈可變域(VL )。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，該人類化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30之重鏈及輕鏈。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，還原劑為DPPA。在某些實施例中，在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用10與20之間莫耳當量之DPPA。更特定言之，在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用15與17之間莫耳當量之DPPA。甚至更特定言之，在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用16莫耳當量之DPPA。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(a)中之反應係在6.0與7.0之間的pH下或在6.3與6.7之間的pH下進行。更特定言之，步驟(a)中之反應係在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，氧化劑為DHAA。在某些實施例中，在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用20與30之間莫耳當量之DHAA。更特定言之，在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用23與25之間莫耳當量之DHAA。甚至更特定言之，在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用23與25之間莫耳當量之DHAA。甚至更特定言之，在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用24莫耳當量之DHAA。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(b)中之反應係在6.0與7.0之間的pH下或在6.3與6.7之間的pH下進行。更特定言之，步驟(b)中之反應係在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，步驟(c)中之反應係在6.0與7.0之間的pH下或在6.3與6.7之間的pH下進行。更特定言之，步驟(c)中之反應係在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，相對於CysAb (例如抗體或其抗原結合片段)或其抗原結合片段過量之式(I11)化合物用於步驟(c)中。更特定言之，對於每一當量之CysAb，使用1.1與20之間、1.5與20之間、2與20之間、2與10之間、2與5之間、3.5與5之間、4.2與5之間、4.3與4.9之間、4.4與4.8之間或4.5與4.7之間莫耳當量之式(I11)化合物。在一特定實施例中，對於每一當量之CysAb，使用4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0莫耳當量之式(I11)化合物。在另一特定實施例中，對於每一當量之CysAb，使用4.6莫耳當量之式(I11)化合物。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用15與17之間莫耳當量之DPPA；步驟(a)中之反應係在6.3與6.7之間的pH下進行；在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用23與25之間莫耳當量之DHAA；步驟(b)中之反應係在6.3與6.7之間的pH下進行；且步驟(c)中之反應係在6.3與6.7之間的pH下進行。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用16莫耳當量之DPPA；步驟(a)中之反應係在pH 6.5下進行；在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用24莫耳當量之DHAA；步驟(b)中之反應係在pH 6.5下進行；且步驟(c)中之反應係在pH 6.5下進行。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，該方法進一步包括在該結合物經純化之前(例如，在步驟(d)之前)調節步驟(c)之後的反應混合物之pH。在一些實施例中，步驟(c)之後的反應混合物之pH係經調節至4.0與6.0之間、4.0與5.5之間、4.0與5.0之間、4.5與5.0之間或4.6與4.8之間之pH。在一特定實施例中，該pH係經調節至4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在另一特定實施例中，該pH係經調節至4.7。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，該封端劑為半胱胺酸、麩胱甘肽或其組合。
在某些實施例中，關於第十一、第十二、第十三或第十四實施例或其中所述之任何實施例之方法，qc 為2。
在某些實施例中，包含藉由第十一實施例或其中所述之任何實施例之方法製備的免疫結合物之組合物(例如醫藥組合物)具有介於1.0-2.5、1.5-2.5、1.8-2.2或1.9-2.1範圍內之DAR值。在一些實施例中，DAR為1.8、1.9、2.0或2.1。
在第十五實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image017
， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image019
以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image020
(I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
在第十六實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image017
， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image019
以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image020
(I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC， 其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，且步驟(a)至(c)係連續地執行，其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
在第十七實施例中，如本文所述之第十五或第十六實施例之方法進一步包括以下步驟：(d)移除未結合之式(I1a)化合物；及視情況(e)將ADC交換至穩定緩衝液中。
在一些實施例中，使用SPTFF來移除未結合之藥物及/或將ADC交換至穩定緩衝液中。在一些實施例中。在一些實施例中，使用逆流透濾來移除未結合之式(I1a)化合物；及/或將ADC交換至穩定緩衝液中。
在某些實施例中，步驟(d)及(e)係連續地執行。
在第十八實施例中，本發明提供一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
Figure 02_image017
， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
Figure 02_image019
以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中經工程改造之半胱胺酸殘基中的游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
Figure 02_image020
(I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC；及 (d) 藉由逆流透濾移除未結合之式(I1a)化合物； 其中步驟(a)中之經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，且步驟(a)至(d)係連續地執行，其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
Figure 02_image011
係經由位於經工程改造之半胱胺酸殘基上的硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
在某些實施例中，藉由第十五、第十六、第十七及第十八實施例製備之結合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image093
或
Figure 02_image095
， 且該化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image097
或
Figure 02_image099
。
在某些實施例中，該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。在某些實施例中，該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，抗CD123抗體或其抗原結合片段包含VH 序列SEQ ID NO: 7及VL 序列SEQ ID NO:9。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，該抗CD123抗體包含： a) 具有以SEQ ID NO:8陳述之胺基酸序列的重鏈；及 b) 具有以SEQ ID NO:10陳述之胺基酸序列的輕鏈。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，還原劑為DPPA或TCEP。在某些實施例中，還原劑為TCEP。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，步驟(a)中之反應係在5.0與8.5之間、7.0與8.0之間或7.3與7.7之間的pH下進行。更特定言之，步驟(a)之反應係在pH 7.5下進行。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，氧化劑為DHAA。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，步驟(b)中之反應係在5.0與8.5之間、7.0與8.0之間或7.3與7.7之間的pH下進行。更特定言之，步驟(b)之反應係在pH 7.5下進行。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，步驟(c)之反應係在5.0與8.5之間、5.5與6.5之間或5.8與6.2之間的pH下進行。更特定言之，步驟(c)之反應係在pH 6.0下進行。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例或其中所述之任何實施例之方法，相對於CysAb (例如抗體或其抗原結合片段)或其抗原結合片段過量之式(I1a)化合物用於步驟(c)中。更特定言之，對於每一當量之CysAb，使用1.1與20之間、1.5與20之間、2與20之間、2與10之間、2與5之間、3.5與5之間、4.2與5之間、4.3與4.9之間、4.4與4.8之間或4.5與4.7之間莫耳當量之式(I1a)化合物。在一特定實施例中，對於每一當量之CysAb，使用4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0莫耳當量之式(I1a)化合物。在另一特定實施例中，對於每一當量之CysAb，使用4.6莫耳當量之式(I11)化合物。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，還原劑為TCEP；步驟(a)中之反應係在7.3與7.7之間的pH下進行；氧化劑為DHAA；步驟(b)中之反應係在7.3與7.7之間的pH下進行；且步驟(b)之後的反應混合物之pH係在步驟(c)中使CysAb與細胞毒性劑反應之前自7.3與7.7之間的pH經調節至5.8至6.2之間的pH。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，還原劑為TCEP；步驟(a)中之反應係在pH 7.5下進行；氧化劑為DHAA；步驟(b)中之反應係在pH 7.5下進行；且步驟(b)之後的反應混合物之pH係在步驟(c)中使CysAb與細胞毒性劑反應之前自pH 7.5經調節至pH 6.0。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，該方法進一步包括在該結合物經純化之前(例如，在步驟(d)之前)調節步驟(c)之後的反應混合物之pH。在一些實施例中，步驟(c)之後的反應混合物之pH係經調節至4.0與6.0之間、4.0與5.5之間、4.0與5.0之間、4.5與5.0之間或4.6與4.8之間之pH。在一特定實施例中，該pH係經調節至4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0。在另一特定實施例中，該pH係經調節至4.7。
在某些實施例中，關於第十五、第十六、第十七或第十八實施例之方法，該封端試劑為半胱胺酸、麩胱甘肽或其組合。
在某些實施例中，包含藉由第十五、第十六或第十七實施例或其中所述之任何實施例之方法製備的免疫結合物之組合物(例如醫藥組合物)具有介於1.0-2.5、1.5-2.5、1.8-2.2或1.9-2.1範圍內之DAR值。在一些實施例中，DAR為1.8、1.9、2.0或2.1。
藉由本發明方法製備之結合物具有實質上高純度及穩定性。在某些實施例中，藉由本發明方法製備之結合物具有大於90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%之單體百分率。在某些實施例中，藉由本發明方法製備之結合物具有小於約10%、小於約5% (例如，小於或等於約4%、3%、2%、1%或0%)之高分子量物質。如本文所用，術語「高分子量物質」或「HMW」係指具有高分子量之含抗體或含結合物物質。高分子量物質可為藉由該抗體或結合物或其組合之聚集形成之二聚體、三聚體、其他較高級寡聚物。高分子量物質可藉由SEC-HPLC經鑑別且測定其量。
在某些實施例中，該結合物之組合物中之細胞毒性劑與CysCBA的平均莫耳比率(亦即，DAR)為1.0-2.5、1.5-2.5、1.7-2.3、1.8-2.2或1.9-2.1。在另一實施例中，藉由本發明方法製備之結合物之組合物的DAR為1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5。在一個實施例中，DAR為2.0。DAR值可藉由此項技術中已知之任何方法經測定。在一個實施例中，DAR值可藉由UV/Vis光譜法使用在分別針對抗體及細胞毒性劑之波長下的吸光度值經測定。或者，DAR值可藉由質譜法及/或HPLC經測定。
在某些實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七或第十八實施例或其中所述之任何實施例之方法)，步驟(a)、步驟(b)或步驟(c)之反應係在緩衝溶液中進行。任何合適緩衝液均可用於本發明方法中。例示性緩衝液包括但不限於檸檬酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液、丁二酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、MES ((2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸))緩衝液、bis-tris甲烷(2-[雙(2-羥基乙基)胺基]-2-(羥基甲基)丙烷-1,3-二醇)緩衝液、ADA (N-(2-乙醯胺基)亞胺基二乙酸)緩衝液、ACES (N-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、PIPES (哌𠯤-N,N′-雙(2-乙烷磺酸))、MOPSO (β-羥基-4-嗎啉丙烷磺酸)緩衝液、bis-tris丙烷(1,3-雙(參(羥基甲基)甲基胺基)丙烷)緩衝液、BES (N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙烷磺酸)、TES (N-[參(羥基甲基)甲基]-2-胺基乙烷磺酸)緩衝液、HEPES (4-(2-羥基乙基)哌𠯤-1-乙烷磺酸)緩衝液、DIPSO、( 3-(N,N -雙[2-羥基乙基]胺基)-2-羥基丙烷磺酸或N,N -雙(2-羥基乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)、MOBS (4-(N-嗎啉基)丁烷磺酸)緩衝液、TAPSO (3-[[1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙-2-基]胺基]-2-羥基丙烷-1-磺酸)緩衝液、trizma (Tris或2-胺基-2-(羥基甲基)-1,3-丙二醇)緩衝液、HEPPSO (N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N'-(2-羥基丙烷磺酸))緩衝液、POPSO (哌𠯤-1,4-雙-(2-羥基-丙烷-磺酸)去水合物)緩衝液、EPPS (4-(2-羥基乙基)哌𠯤-1-丙烷磺酸)緩衝液、tricine (N-(2-羥基-1,1-雙(羥基甲基)乙基)甘胺酸)緩衝液、gly-gly、bicine (2-(雙(2-羥基乙基)胺基)乙酸)緩衝液、HEPBS (N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(4-丁烷磺酸))緩衝液、TAPS (3-[[1,3-二羥基-2-(羥基甲基)丙-2-基]胺基]丙烷-1-磺酸)緩衝液、AMPD (2-胺基-2-甲基-1,3-丙二醇)緩衝液、TABS (N-參(羥基甲基)甲基-4-胺基丁烷磺酸)緩衝液、 AMPSO (N-(1,1-二甲基-2-羥基乙基)-3-胺基-2-羥基丙烷磺酸)緩衝液或其組合。在某些實施例中，緩衝液為磷酸鹽緩衝液。
在某些實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七或第十八實施例或其中所述之任何實施例之方法)，步驟(a)、步驟(b)或步驟(c)之反應係在少量有機溶劑存在下進行。更特定言之，有機溶劑為二甲基乙醯胺(DMA)。有機溶劑(例如DMA)可以反應混合物之總體積計以1%-20%、1-15%、2-15%、5-15%或5-10%之量存在。
在某些實施例中，關於上文所述之本發明方法，使步驟(a)、步驟(b)或步驟(c)之反應繼續進行至完成或實質性完成，例如持續2分鐘至1週、1小時至48小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至8小時、5小時至15小時、5小時至10小時、1小時至5小時、30分鐘至2小時或5分鐘至30分鐘之時期。在某些實施例中，使步驟(a)之反應繼續進行，持續1小時至12小時、1小時至8小時、2小時至8小時、3小時至7小時或4小時至6小時之時期。在一特定實施例中，使步驟(a)之反應繼續進行，持續5小時。在某些實施例中，使步驟(b)之反應繼續進行，持續1小時至12小時、1小時至8小時、3小時至9小時、4小時至8小時或5小時至7小時之時期。在一特定實施例中，使步驟(b)之反應繼續進行，持續6小時。在某些實施例中，使步驟(c)之反應繼續進行，持續1小時至24小時、5小時至15小時、6小時至14小時、7小時至13小時、8小時至12小時或9小時至11小時之時期。在一特定實施例中，使步驟(c)之反應繼續進行，持續10小時。
在某些實施例中，關於上文所述之本發明方法，步驟(a)、步驟(b)或步驟(c)之反應可在任何合適溫度下進行。在某些實施例中，該反應可在10℃-50℃、10℃-40℃或10℃-30℃之溫度下進行。在某些實施例中，該反應可在15℃-30℃、20℃-30℃、15℃-25℃、16℃-24℃、17℃-23℃、18℃-22℃或19℃-21℃之溫度下進行。在某些實施例中，該反應可在15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃下進行。
在某些實施例中，關於上文所述之本發明方法中的步驟(a)、步驟(b)或步驟(c)之反應，細胞結合劑(例如抗體)之濃度可介於1 mg/mL-50 mg/mL、1 mg/mL-20 mg/mL、1 mg/mL-15 mg/mL、1 mg/mL-10 mg/mL、1 mg/mL-6 mg/mL或2 mg/mL-5 mg/mL範圍內。在某些實施例中，細胞結合劑(例如抗體)之濃度係介於3 mg/mL-5 mg/mL範圍內。
在某些實施例中，關於本文所述之方法，穩定緩衝液為用於ADC之調配緩衝液。3. 在線過程自動化技術 ( 在線 PAT)
本文提供用於本文所述之連續方法(例如，用於形成且加工第一、第二或第三態樣或其中所述之任何實施例中所述的抗體藥物結合物(ADC)之方法)之在線過程自動化技術。該等技術提供直接量測，其可消除離線分析且降低由操作者處置材料。可使用在線監測來監測ADC (蛋白質)濃度以及游離藥物之移除。此可允許基於自在線讀數獲得之數據，而非基於用於該等過程(例如，純化過程)中之透濾體積的具體體積或數字來靶向最終ADC濃度。PAT實施容許增加控制及可偵測性(例如，在產物品質受影響之前可使用穩態操作期間之改變來偵測問題)且多個PAT模塊(例如，FlowVPE、UV感測器、pH計、電導率計、壓力感測器或流量計)之使用可確保個別單元操作中之穩固過程效能。
在線監測可例如用於在例如抗體還原及/或氧化反應及/或ADC結合反應(例如，描述於第一、第二或第三態樣或其中所述之任何實施例中的方法中所述之反應)中監測來自任何幫浦之進料流中的流動速率。在線監測可例如用於監測添加至抗體還原及/或氧化反應及/或ADC結合反應(例如，描述於第一、第二或第三態樣或其中所述之任何實施例中的方法中所述之反應)中之組分的濃度。該監測可確保對該等反應之化學計量的適當控制。在線監測可監測例如抗體或其抗原結合片段、還原劑、氧化劑、細胞毒性劑或細胞毒性劑-連接體化合物(例如由式(I)表示之化合物)及/或結合緩衝液之流動速率或濃度。在線監測可監測抗體或其抗原結合片段濃縮至結合反應緩衝液中之流動速率。
在線監測亦可例如用於測定何時停止結合反應，例如藉由停止添加結合緩衝液，藉由停止結合緩衝液之循環，及/或開始沖洗或移除結合緩衝液。在本文所提供之一些實施例中，可使用未結合之藥物(例如式(I)化合物)之在線監測。未結合之藥物之量測可用於推斷在結合反應中實現的平均藥物數目/抗體(DAR)。因此，當達到標靶DAR時，可停止結合反應。
在線監測亦可用於監測ADC之濃縮及/或純化。濃縮及/或純化可使用過濾(例如超濾、透濾)。該過濾可為切向流過濾，包括SPTFF。該過濾可為逆流透濾。當用於監測過濾時，在線監測可用於量測滲餘物或滲透物中之分析物。因此，例如，滲餘物中的未結合之藥物或未結合之藥物-連接體化合物之在線監測可用於分析ADC的純化程度。未結合之藥物或未結合之藥物-連接體化合物之水準可在結合反應之後不久在滲餘物中為高的，但在純化之後在滲餘物中為低的。滲餘物或滲透物中之ADC之在線監測可用於分析濃縮及/或純化過程期間的ADC損失。
該純化亦可使用層析(例如流通管柱層析)。在層析管柱末端處之在線監測可例如量測ADC水準且可用於測定管柱何時超載或何時存在ADC突破。
在線監測亦可用於量測pH，其可例如用於測定緩衝液交換之完全性。
例示性在線監測技術包括例如傅立葉轉換紅外(FTIR)流動池、高效液相層析(HPLC)或超高效液相層析(UPLC)之使用。
在線監測技術可使用例如FlowVPE或UV感測器。在一些實施例中，使用FlowVPE來執行在線監測。FlowVPE使用流動池來進行連續監測。
切向流過濾(例如單程切向流過濾(SPTFF)之功效可使用FlowVPE、UV感測器、pH計、電導率計、壓力感測器、流量計等進行在線監測。逆流透濾之功效亦可使用FlowVPE、UV感測器、pH計、電導率計、壓力感測器、流量計等進行在線監測。
在線監測過程可與本發明之連續方法(論述於上文)，例如使用單程切向流過濾及/或逆流透濾之連續結合過程，或與分批結合過程(其為此項技術中已知的)組合使用。4. 細胞結合劑 (CysCBA)
本發明之免疫結合物中的細胞結合劑可為目前已知或變成已知之任何種類，包括肽及非肽。一般而言，此等細胞結合劑可為抗體(諸如多株抗體及單株抗體，尤其單株抗體)、淋巴因子、激素、生長因子、維他命(諸如葉酸鹽等，其可結合於其細胞表面受體，例如葉酸鹽受體)、營養物轉運分子(諸如轉鐵蛋白)或任何其他細胞結合分子或物質。
在某些實施例中，細胞結合劑為抗體、單鏈抗體、特異性地結合於標靶細胞之抗體片段、單株抗體、單鏈單株抗體、特異性地結合於標靶細胞之單株抗體片段(或「抗原結合部分」或「抗原結合片段」)、嵌合抗體、特異性地結合於標靶細胞之嵌合抗體片段(或「抗原結合部分」或「抗原結合片段」)、域抗體(例如，sdAb)或特異性地結合於標靶細胞之域抗體片段。
在某些實施例中，細胞結合劑為人類化抗體、人類化單鏈抗體或人類化抗體片段(或「抗原結合部分」或「抗原結合片段」)。
在某些實施例中，細胞結合劑為表面重塑抗體、表面重塑單鏈抗體或表面重塑抗體片段(或「抗原結合部分」或「抗原結合片段」)。
在某些實施例中，細胞結合劑為抗體或其抗原結合部分(包括抗體衍生物)，CBA可結合於標靶細胞上之配位體，諸如細胞表面配位體，包括細胞表面受體。
在某些實施例中，細胞結合劑為經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段為抗葉酸鹽受體抗體或其抗原結合片段、抗EGFR抗體或其抗原結合片段、抗CD33抗體或其抗原結合片段、抗CD19抗體或其抗原結合片段、抗Muc1抗體或其抗原結合片段、抗CD37抗體其抗原結合片段、抗cMet抗體或其抗原結合片段或抗EpCAM抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，細胞結合劑為如下抗體或其抗原結合片段，其：(a)結合人類CD123 / IL3-Rα抗原之胺基酸101-346內的抗原決定基，及(b)抑制抗原陽性TF-1細胞中之IL3依賴性增生(參見WO2017/004026，以引用之方式整體併入本文中)。
在某些實施例中，細胞結合劑係如WO2017/004026 (其以引用之方式併入本文中)中所述之抗CD123抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，抗CD123抗體或其抗原結合片段可包含：a)至少一個輕鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3，其中CDRL 1具有胺基酸序列RASQDINSYLS (SEQ ID NO:1)，CDRL 2具有胺基酸序列RVNRLVD (SEQ ID NO:2)，且CDRL 3具有胺基酸序列LQYDAFPYT (SEQ ID NO:3)；及b)至少一個重鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRH 1、CDRH 2及CDRH 3，其中CDRH 1具有胺基酸序列SSIMH (SEQ ID NO:4)，CDRH 2具有胺基酸序列YIKPYNDGTKYNEKFKG (SEQ ID NO:5)，且CDRH 3具有胺基酸序列EGGNDYYDTMDY (SEQ ID NO:6)。
在某些實施例中，抗CD123抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH )，其具有胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFT SSIMH WVRQAPGQGLEWIG YIKPYNDGTKYNEKFKG RATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EGGNDYYDTMDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7) 及輕鏈可變區(VL )，其具有胺基酸序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDINSYLS WFQQKPGKAPKTLIY RVNRLVD GVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYC LQYDAFPYT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:9)。
在某些實施例中，抗CD123抗體具有重鏈全長序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFT SSIMH WVRQAPGQGLEWIG YIKPYNDGTKYNEKFKG RATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EGGNDYYDTMDY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLCLSPG (SEQ ID NO:8) 及輕鏈全長序列 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDINSYLS WFQQKPGKAPKTLIY RVNRLVD GVPSRFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYC LQYDAFPYT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:10)
在某些實施例中，細胞結合劑係如美國專利第7,342,110號及第7,557,189號(其以引用之方式併入本文中)中所述之抗CD33抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，抗CD33抗體或其抗原結合片段可包含：a)至少一個輕鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3，其中CDRL 1具有胺基酸序列KSSQSVFFSSSQKNYLA (SEQ ID NO:11)，CDRL 2具有胺基酸序列WASTRES (SEQ ID NO:12)，且CDRL 3具有胺基酸序列HQYLSSRT (SEQ ID NO:13)；及b)至少一個重鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRH 1、CDRH 2及CDRH 3，其中CDRH 1具有胺基酸序列SYYIH (SEQ ID NO:14)，CDRH 2具有胺基酸序列VIYPGNDDISYNQKFQG (SEQ ID NO:15)，且CDRH 3具有胺基酸序列EVRLRYFDV (SEQ ID NO:16)。
在某些實施例中，抗CD33抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH )，其具有胺基序列 QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFT SYYIH WIKQTPGQGLEWVG VIYPGNDDISYNQKFQG KATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR EVRLRYFDV WGQGTTVTVSS  (SEQ ID NO:17) 及輕鏈可變區(VL )，其具有胺基酸序列 EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSC KSSQSVFFSSSQKNYLA WYQQIPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYC HQYLSSRT FGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:19)。
在某些實施例中，抗CD33抗體具有重鏈全長序列 QVQLQQPGAEVVKPGASVKMSCKASGYTFT SYYIH WIKQTPGQGLEWVG VIYPGNDDISYNQKFQG KATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR EVRLRYFDV WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLXLSPG (SEQ ID NO:18) 及輕鏈全長序列 EIVLTQSPGSLAVSPGERVTMSC KSSQSVFFSSSQKNYLA WYQQIPGQSPRLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQPEDLAIYYC HQYLSSRT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:20)，其中SEQ ID NO:18中之X為S或C。在一個實施例中，X為C。
在某些實施例中，該抗CD33抗體為huMy9-6抗體。
在某些實施例中，細胞結合劑係如WO2018/119196及美國臨時申請案第62/690052號及第62/691342號(其各自以引用之方式併入本文中)中所述之抗ADAM9抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，抗ADAM9抗體或其抗原結合片段係特異性地結合於人類ADAM9及cyno ADAM9之人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段係經最佳化以具有對cyno ADAM9之結合親和力的至少100倍增強且如與嵌合或鼠科動物親本抗體相比，保持對人類ADAM9之高親和力結合。
在某些實施例中，抗ADAM9抗體或其抗原結合片段(例如，人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段)包含：a)至少一個輕鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3，其中CDRL 1具有胺基酸序列KASQSVDYSGDSYMN (SEQ ID NO:21)，CDRL 2具有胺基酸序列AASDLES (SEQ ID NO:22)，且CDRL 3具有胺基酸序列QQSHEDPFT (SEQ ID NO:23)；及b)至少一個重鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRH 1、CDRH 2及CDRH 3，其中CDRH 1具有胺基酸序列SYWMH (SEQ ID NO:24)，CDRH 2具有胺基酸序列EIIPIFGHTNYNEKFKS (SEQ ID NO:25)，且CDRH 3具有胺基酸序列GGYYYYPRQGFLDY (SEQ ID NO:26)。
在某些實施例中，抗ADAM9抗體或其抗原結合片段(例如，人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段)包含重鏈可變區(VH )，其具有胺基序列 EVQLVESGGG LVKPGGSLRLSCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPIFGHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYPRQGFL DY WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:27) 及輕鏈可變區(VL )，其具有胺基酸序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC KASQSVDYSGDSYMN WYQQKPGQPPKLLIY AASDLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFATYYC QQSHEDPFT FGQGTKLEI K (SEQ ID NO:28)。
在某些實施例中，抗ADAM9抗體具有重鏈全長序列 EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMH WVRQA PGKGLEWVG E IIPIFGHTNY NEKFKS RFTI SLDNSKNTLY LQMGSLRAED TAVYYCAR GG YYYYPRQGFL DY WGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTL Y I T R E PEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLC LS PG  (SEQ ID NO:29) 及輕鏈全長序列 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC KASQSVDYSGDSYMN WYQQKPGQPPKLLIY AASDLES GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYC QQSHEDPFT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:30)。
在某些實施例中，細胞結合劑係如美國臨時申請案第62/751,530號(其以引用之方式併入本文中)中所述之抗EpCAM抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，抗EpCAM抗體或其抗原結合片段可包含：a)至少一個輕鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3，其中CDRL 1具有胺基酸序列RSSRSLLHSDGFTYLY (SEQ ID NO:31)，CDRL 2具有胺基酸序列QTSNLAS (SEQ ID NO:32)，且CDRL 3具有胺基酸序列AQNLELPNT (SEQ ID NO:33)；及b)至少一個重鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRH 1、CDRH 2及CDRH 3，其中CDRH 1具有胺基酸序列NYYIH (SEQ ID NO:34)，CDRH 2具有胺基酸序列WIYPGNVYIQYNEKFKG (SEQ ID NO:35)，且CDRH 3具有胺基酸序列DGPWFAY (SEQ ID NO:36)。
在某些實施例中，抗EpCAM抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH )，其具有胺基序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NYYIH WVRQAPGQRLEYIG WIYPGNVYIQYNEKFKG RATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR DGPWFAY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:37) 及輕鏈可變區(VL )，其具有胺基酸序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISC RSSRSLLHSDGFTYLY WFLQKPGQSPQLLIY QTSNLAS GVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC AQNLELPNT FGQGTKLEIK (SEQ ID N:38)。
在某些實施例中，抗EpCAM抗體具有重鏈全長序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT NYYIH WVRQAPGQRLEYIG WIYPGNVYIQYNEKFKG RATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR DGPWFAY WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLXLSPG (SEQ ID NO:39) 及輕鏈全長序列 DIVLTQTPLSLSVTPGQPASISC RSSRSLLHSDGFTYLY WFLQKPGQSPQLLIY QTSNLAS GVPDRFSSSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC AQNLELPNT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:40)，其中SEQ ID NO:39中之X為S或C。在一個實施例中，X為C。
在某些實施例中，該細胞結合劑為抗葉酸鹽受體抗體。在某些實施例中，細胞結合劑係如美國專利8,709,432、美國專利第8,557,966號及WO2011106528 (其均以引用之方式併入本文中)中所述之抗人類葉酸鹽受體1 (FOLR1)抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，抗FOLR1抗體或其抗原結合片段可包含：a)至少一個輕鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRL 1、CDRL 2及CDRL 3，其中CDRL 1具有胺基酸序列KASQSVSFAGTSLMH (SEQ ID NO:41)，CDRL 2具有胺基酸序列RASNLEA (SEQ ID NO:42)，且CDRL 3具有胺基酸序列QQSREYPYT (SEQ ID NO:43)；及b)至少一個重鏈可變區或其片段，其分別包含三個連續互補決定區(CDR) CDRH 1、CDRH 2及CDRH 3，其中CDRH 1具有胺基酸序列GYFMN (SEQ ID NO:44)或GYTFTGYFMN (SEQ ID NO:47)，CDRH 2具有胺基酸序列RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO:45)或RIHPYDGDTF (SEQ ID NO:48)，且CDRH 3具有胺基酸序列YDGSRAMDY (SEQ ID NO:46)。在某些實施例中，抗FOLR1抗體或其抗原結合片段包含a)輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:41陳述之胺基序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:42陳述之胺基序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:43陳述之胺基序列的CDRL 3；及b)重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:44陳述之胺基序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:45陳述之胺基序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:46陳述之胺基序列的CDRH 3。在某些實施例中，抗FOLR1抗體或其抗原結合片段包含a)輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:41陳述之胺基序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:42陳述之胺基序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:43陳述之胺基序列的CDRL 3；及b)重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:47陳述之胺基序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:48陳述之胺基序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:46陳述之胺基序列的CDRH 3。
在某些實施例中，抗FOLR1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH )，其具有胺基序列 QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYTFTGYFMN WVKQSPGQSLEWIG RIHPYDGDTFYNQKFQG KATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTR YDGSRAMDY WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:49) 及輕鏈可變區(VL )，其具有胺基酸序列 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISC KASQSVSFAGTSLMH WYHQKPGQQPRLLIY RASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYC QQSREYPYT FGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:50)，或 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISC KASQSVSFAGTSLMH WYHQKPGQQPRLLIY RASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYC QQSREYPYT FGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:51)。
在某些實施例中，抗FOLR1抗體具有重鏈全長序列 QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKAS GYTFTGYFMN WVKQSPGQSLEWIG RIHPYDGDTFYNQKFQG KATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTR YDGSRAMDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLXLSPGY (SEQ ID NO:52) 及輕鏈全長序列 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISC KASQSVSFAGTSLMH WYHQKPGQQPRLLIY RASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYC QQSREYPYT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:53)，或 DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISC KASQSVSFAGTSLMH WYHQKPGQQPRLLIY RASNLEA GVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYC QQSREYPYT FGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:54)，其中SEQ ID NO:52中之X為C或S且SEQ ID NO:52中之Y為K或不存在。在一個實施例中，X為C。
在某些實施例中，該抗FOLR1抗體為huMov19或M9346A抗體。
在某些實施例中，本文所述之抗體為鼠科動物、非人類哺乳動物、嵌合、人類化或人類抗體。例如，該人類化抗體可為CDR移植抗體或表面重塑抗體。在某些實施例中，該抗體為全長抗體。在某些實施例中，其抗原結合片段為Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fd 、單鏈Fv或scFv、二硫化物連接之Fv 、V-NAR域、IgNar、內體、IgGΔCH2 、微型抗體、F(ab’)3 、四功能抗體、三功能抗體、雙功能抗體、單域抗體、DVD-Ig、Fcab、mAb2 、(scFv)2 或scFv-Fc。
在某些實施例中，該細胞結合劑為替代蛋白質骨架，諸如Centyrin (基於纖維連接蛋白III型(FN3)重複序列之共有序列的蛋白質骨架；參見美國專利公開案2010/0255056、2010/0216708及2011/0274623，以引用之方式併入本文中)、錨蛋白重複蛋白(例如經設計之錨蛋白重複蛋白，稱作DARPin；參見美國專利公開案第2004/0132028號、第2009/0082274號、第2011/0118146號及第2011/0224100號，以引用之方式併入本文中，且亦參見C. Zahnd等人,Cancer Res. (2010) 70:1595-1605；Zahnd等人,J. Biol. Chem. (2006) 281(46):35167-35175；及Binz, H.K., Amstutz, P.及Pluckthun, A.,Nature Biotechnology (2005) 23:1257-1268，以引用之方式併入本文中)、錨蛋白樣重複蛋白或合成肽(參見例如美國專利公開案第2007/0238667號；美國專利第7,101,675號；WO 2007/147213；及WO 2007/062466，以引用之方式併入本文中)、纖連蛋白(纖維連接蛋白域骨架蛋白；參見美國專利公開案第2007/0082365號；第2008/0139791號，以引用之方式併入本文中)、Avibody (包括雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體；參見美國公開案第2008/0152586號及第2012/0171115號)、雙重受體再靶向(DART)分子(P.A. Moore等人, Blood, 2011; 117(17):4542-4551；Veri MC等人, Arthritis Rheum, 2010年3月30日; 62(7):1933-43；Johnson S等人 J Mol Biol, 2010年4月9日;399(3):436-49)及細胞滲透超電荷蛋白(Methods in Enzymol. 502, 293-319 (2012)。
在某些實施例中，該細胞結合劑為可活化抗體或可活化抗原結合抗體片段(統稱為AA)。在一些實施例中，該可活化抗體或可活化抗原結合抗體片段包含特異性地結合於標靶細胞(或「標靶」)上之配位體的抗體或抗原結合抗體片段(例如，本文所述之抗體或抗原結合抗體片段)，該標靶細胞(或「標靶」)偶合至遮蔽部分(MM)，以致MM之偶合減少該抗體或抗原結合抗體片段結合該標靶之能力。在一些實施例中，該MM經由包括蛋白酶之受質之序列進行偶合，該蛋白酶例如在患病組織中具活性之蛋白酶及/或與該標靶共定位於個體中之治療位點處的蛋白酶。該等可活化抗體較佳地在循環中穩定，在療法及/或診斷之預期位點處但不在正常(例如，健康)組織或治療及/或診斷未靶向之其他組織中經活化，且當經活化時，展現至少可相當於相應、未經修飾抗體之與標靶的結合。在一些實施例中，該等AA係描述於WO 2009/025846、WO 2010/081173、WO 2015/048329、WO 2015/116933及WO 2016/118629中之彼等，該等文獻各自以引用之方式整體併入。
在一些實施例中，該可活化抗體或抗體片段包含： (a) 偶合至該抗體或抗體片段(統稱為「AB」)之可裂解部分(CM)，其中該CM係充當蛋白酶之受質的多肽；及 (b) 偶合至該抗體或抗體片段之遮蔽部分(MM)，其中當該可活化抗體處於未裂解狀態時，該MM抑制該抗體或抗體片段與配位體之結合， 其中處於未裂解狀態之可活化抗體自N端至C端具有如下結構安排：(MM)-(CM)-(AB)或(AB)-(CM)-(MM)。
在一些實施例中，該遮蔽部分(或「遮蔽」)為如下胺基酸序列，其偶合或以其他方式附接於該抗體且定位於可活化抗體構築體內，以致該遮蔽部分減少該抗體特異性地結合該標靶之能力。合適遮蔽部分使用多種已知技術中之任一者經鑑別。例如，肽遮蔽部分使用描述於WO 2009/025846中之方法經鑑別，該文獻之內容以引用之方式整體併入本文中。
經MM修飾之AB針對標靶的Kd 可比未經MM修飾之AB或親本AB針對標靶的Kd 大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍，或在5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之間。相反，經MM修飾之AB針對標靶的結合親和力可比未經MM修飾之AB或親本AB針對標靶的結合親和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍，或在5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之間。
MM針對AB之解離常數(Kd )一般大於AB針對標靶之Kd 。MM針對AB之Kd 可比AB針對標靶之Kd 大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反，MM針對AB之結合親和力一般低於AB針對標靶之結合親和力。MM針對AB之結合親和力可比AB針對標靶之結合親和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。
如與未經MM修飾之AB與標靶之特異性結合或親本AB與標靶之特異性結合相比，當AB經MM修飾且在標靶存在下時，AB與其標靶之特異性結合可減少或受抑制。當如WO 2010/081173所述活體內或在標靶位移活體外免疫吸附劑分析中量測時，當與未經MM修飾之AB與標靶之結合或親本AB與標靶之結合相比時，AB在經MM修飾時結合標靶的能力可減少至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至100%，持續至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更久。
MM可抑制AB與標靶之結合。MM可結合AB之抗原結合域且抑制AB與其標靶之結合。MM可在空間上抑制AB與標靶之結合。MM可別位抑制AB與其標靶之結合。在此等實施例中，當如WO 2010/081173所述活體內或在標靶位移活體外免疫吸附劑分析中量測時，如與未經MM修飾之AB、親本AB或未偶合至MM之AB與標靶的結合相比，當AB經MM修飾或偶合至MM且在標靶存在下時，AB與標靶不結合或實質上不結合，或存在AB與標靶之僅.001%、.01%、.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%結合，持續至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更久。
當AB偶合至MM或由MM修飾時，該MM可『遮蔽』或減少或抑制AB與其標靶之特異性結合。當AB偶合至MM或由MM修飾時，該偶合或修飾可實現結構改變，該結構改變減少或抑制AB特異性地結合其標靶之能力。
偶合至MM或經MM修飾之AB可由以下各式表示(依自胺基(N)端區至羧基(C)端區之次序)： (MM)-(AB) (AB)-(MM) (MM)-L-(AB) (AB)-L-(MM) 其中MM為遮蔽部分，Ab為抗體或標靶結合抗原片段，且L為連接體。在多個實施例中，可需要將一或多個連接體(例如柔性連接體)插入至該組合物中以便提供柔性。
在某些實施例中，該MM不為Ab之天然結合搭配物。在一些實施例中，該MM不含或實質上不含與Ab之任何天然結合搭配物之同源性。在一些實施例中，該MM與Ab之任何天然結合搭配物僅5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%相似。在一些實施例中，該MM與Ab之任何天然結合搭配物僅5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%一致。在一些實施例中，該MM與Ab之任何天然結合搭配物僅25%一致。在一些實施例中，該MM與Ab之任何天然結合搭配物僅50%一致。在一些實施例中，該MM與Ab之任何天然結合搭配物僅20%一致。在一些實施例中，該MM與Ab之任何天然結合搭配物僅10%一致。
本文所提供之可活化抗體亦可包括可裂解部分(CM)。該等AA展現與AB之標靶之可活化/可轉換結合。AA一般包括抗體或抗體片段(AB)，其藉由遮蔽部分(MM)及可修飾或可裂解部分(CM)修飾或偶合至遮蔽部分(MM)及可修飾或可裂解部分(CM)。在一些實施例中，該CM含有充當所關注之蛋白酶之受質的胺基酸序列。在其他實施例中，該CM提供可藉由還原裂解之半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵。在其他實施例中，該CM提供可藉由光解活化之光解受質。
在一些實施例中，該可裂解部分(或「受質」)包括作為蛋白酶、通常細胞外蛋白酶之受質之胺基酸序列。合適受質使用多種已知技術中之任一者經鑑別。例如，肽受質使用描述於美國專利第7,666,817號及第8,563,269號；及WO 2014/026136中之方法經鑑別，該等文獻中每一者之內容均以引用之方式整體併入本文中。(亦參見Boulware等人, Biotechnol Bioeng. 106(3):339-346 (2010))。視情況，該CM包含能夠形成二硫鍵之半胱胺酸-半胱胺酸對，該二硫鍵可藉由還原劑之作用經裂解。該CM係經定位以致當該CM在標靶存在下藉由裂解劑裂解(例如，CM之蛋白酶受質藉由蛋白酶裂解及/或半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵經由藉由暴露於還原劑實現之還原受到破壞)，從而引起裂解狀態時，Ab結合該標靶，且在未裂解狀態中，在標靶存在下，Ab與標靶之結合受到MM抑制。應注意，CM之胺基酸序列可與MM重疊或包括於MM內，以致當該可活化抗體呈未裂解構形時，CM之全部或一部分促進Ab之「遮蔽」。
在一些實施例中，CM可基於與該可活化抗體之所需標靶共定位於組織中之蛋白酶加以選擇。已知其中共定位所關注之標靶與蛋白酶之多種不同條件，其中該蛋白酶之受質為此項技術中已知的。例如，標靶組織可為癌組織，特別地實體腫瘤之癌組織。文獻中已多次報告，具有已知受質之蛋白酶在多種癌症(例如實體腫瘤)中具有增加之水準。參見例如La Rocca等人, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421。
例示性受質可包括但不限於可藉由以下酶中之一或多者裂解之受質：MMP-I、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、血纖維蛋白溶酶、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAMlO、ADAM12、ADAMTS、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14及TACE。
在一些實施例中，該CM為多達15個胺基酸長之多肽。
在一些實施例中，該CM為如下多肽，其包括作為至少一種基質金屬蛋白酶(MMP)之受質的第一可裂解部分(CMl)及作為至少一種絲胺酸蛋白酶(SP)之受質的第二可裂解部分(CM2)。在一些實施例中，CM1-CM2受質之CMl受質序列及CM2受質序列中之每一者均獨立地為多達15個胺基酸長之多肽。
在一些實施例中，該CM為豆莢蛋白、血纖維蛋白溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MTl-MMP、組織蛋白酶、半胱天冬酶、人類嗜中性球彈性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA之受質。
經MM及CM修飾之Ab針對標靶的Kd 可比未經MM及CM修飾之Ab或親本Ab針對標靶的Kd 大至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍，或在5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10- 10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000- 100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之間。相反，經MM及CM修飾之Ab針對標靶的結合親和力可比未經MM及CM修飾之Ab或親本Ab針對標靶的結合親和力低至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000倍或更多倍，或在5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍之間。
如與未經MM及CM修飾之Ab或親本Ab與標靶之特異性結合相比，當Ab經MM及CM修飾且在標靶存在下但不在修飾劑(例如酶、蛋白酶、還原劑、光)存在下時，Ab與其標靶之特異性結合可減少或受抑制。當如WO201008117 (以引用之方式整體併入本文中)所述活體內或在標靶位移活體外免疫吸附劑分析中量測時，當與親本Ab與其標靶之結合或未經MM及CM修飾之Ab與其標靶之結合相比時，Ab在經MM及CM修飾時結合標靶的能力可減少至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及甚至100%，持續至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小時，或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更久。
如本文所用，術語裂解狀態係指在CM之蛋白酶修飾及/或CM之半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵的還原及/或光活化之後AA之狀態。如本文所用，術語未裂解狀態係指在CM之蛋白酶裂解不存在下及/或在CM之半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵的還原不存在下及/或在光不存在下AA之狀態。如上文所論述，術語AA在本文中用於指呈其未裂解(原生)狀態以及呈其裂解狀態之AA。一般技術人員應顯而易見，在一些實施例中，裂解之AA可歸因於CM之蛋白酶裂解，導致至少MM之釋放而缺乏MM (例如，其中MM未藉由共價鍵(例如半胱胺酸殘基之間的二硫鍵)接合於AA)。
可活化或可轉換意謂AA當呈經抑制、經遮蔽或未裂解狀態(亦即，第一構形)時展現第一水準之與標靶之結合，且在未抑制、未遮蔽及/或裂解狀態(亦即，第二構形)下展現第二水準之與標靶之結合，其中該第二水準之標靶結合大於該第一水準之結合。一般而言，標靶對AA之Ab的接近在能夠裂解CM之裂解劑存在下大於該種裂解劑不存在下。因此，當AA係呈未裂解狀態時，Ab經抑制以免於標靶結合且可經遮蔽以免於標靶結合(亦即，第一構形使得Ab無法結合標靶)，且在裂解狀態下，AB關於標靶結合未受抑制或未經遮蔽。
AA之CM及AB可經選擇，使得AB表示用於所關注之標靶的結合部分，且CM表示與標靶共定位於個體中之治療位點處之蛋白酶的受質。或者或另外，該CM為半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵，其可由於此二硫鍵之還原而裂解。AA含有蛋白酶可裂解CM或半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵中之至少一者，且在一些實施例中包括兩個種類之CM。AA可替代地或進一步包括可藉由光源活化之光不穩定受質。本文所揭示之AA發現特定用途，其中例如與非治療位點之組織中(例如健康組織中)相比，能夠裂解CM中之位點的蛋白酶以相對較高水準存在於治療位點之含標靶組織(例如患病組織；例如用於治療性治療或診斷性治療)中。本文所揭示之AA亦發現特定用途，其中例如與非治療非診斷位點之組織中相比，能夠還原CM中之位點的還原劑以相對較高水準存在於治療或診斷位點之含標靶組織中。本文所揭示之AA亦發現特定用途，其中例如能夠光解CM中之位點的光源(例如，藉助於雷射)經引入至治療或診斷位點之含標靶組織。
在一些實施例中，AA可提供減少之毒性及/或不良副作用，若Ab並未經遮蔽或以其他方式經抑制以免於結合其標靶，則該等毒性及/或不良副作用可能原本由非治療位點處之Ab結合引起。在AA含有可藉由促進二硫鍵之還原的還原劑裂解之CM的情況下，該等AA之AB可經選擇以利用Ab之活化，其中所關注之標靶存在於所需治療位點處，該治療位點之特徵在於升高之還原劑水準，以致該環境具有高於例如非治療位點之環境的還原潛力。
一般而言，AA可藉由選擇所關注之Ab且構建AA之剩餘部分而經設計，使得當構形受約束時，MM提供Ab之遮蔽或Ab與其標靶之結合的減少。結構設計準則應考慮提供此功能特徵。
提供與未抑制構形相對，在經抑制構形中展現針對標靶結合之所需動態範圍之可轉換表型的AA。動態範圍一般係指(a)在第一條件集合下參數之最大偵測水準與(b)在第二條件集合下彼參數之最小偵測值的比率。例如，在AA之情況下，動態範圍係指(a)在能夠裂解AA之CM的蛋白酶存在下與AA結合之標靶蛋白之最大偵測水準與(b)在該蛋白酶不存在下與AA結合之標靶蛋白之最小偵測水準的比率。AA之動態範圍可經計算為AA裂解劑(例如酶)治療之平衡解離常數與該AA裂解劑治療之平衡解離常數的比率。AA之動態範圍愈大，AA之可轉換表型愈佳。具有相對較高動態範圍值(例如大於1)之AA展現更可需之轉換表型，以致與裂解劑不存在下相比，AA之標靶蛋白結合在能夠裂解AA之CM的裂解劑(例如酶)存在下以較大程度發生(例如，主要地發生)。
AA可以多種結構組態經提供。AA之例示性式提供於下文。特定地預期，AB、MM及CM之N端至C端次序可在AA內逆轉。亦特定地預期，CM及MM之胺基酸序列可重疊，例如以致CM含於MM內。
例如，AA可由下式表示(依自胺基(N)端區至羧基(C)端區之次序： (MM)-(CM)-(AB) (AB)-(CM)-(MM)，其中MM為遮蔽部分，CM為可裂解部分，且AB為抗體或其片段。應注意，儘管MM及CM經指示為上式中之不同組分，在本文所揭示之所有例示性實施例(包括各式)中，預期MM及CM之胺基酸序列可能重疊，例如以致CM完全地或部分地含於MM內。另外，以上各式提供可定位於AA要素之N端或C端之額外胺基酸序列。
在某些實施例中，可需要將一或多個連接體(例如柔性連接體)插入至AA構築體中以便在MM-CM接頭、CM-AB接頭或兩者中之一或多者處提供柔性。例如，AB、MM及/或CM可未含充足數目之殘基(例如GIy、Ser、Asp、Asn，尤其GIy及Ser，特別地GIy)來提供所需柔性。因而，該等AA構築體之可轉換表型可受益於為了提供柔性連接體而引入之一或多個胺基酸。另外，如下文所述，在AA作為構形受約束之構築體經提供的情況下，柔性連接體可操作性地經插入以促進未裂解AA中之環狀結構之形成及維持。
例如，在某些實施例中，AA包含以下各式之一(其中下式表示呈N端至C端方向或C端至N端方向之胺基酸序列)： (MM)-L1 -(CM)-(AB) (MM)-(CM)-L1 -(AB) (MM)-L1 -(CM)-L2 -(AB) 環[L1 -(MM)-L2 -(CM)-L3 -(AB)] 其中MM、CM及AB係如上文所定義；其中L1 、L2 及L3 各自獨立地且視情況存在或不存在，係包括至少1個柔性胺基酸(例如Gly)之相同或不同柔性連接體；且其中在環存在的情況下，AA歸因於在AA中之一對半胱胺酸之間存在二硫鍵而呈環狀結構之形式。另外，以上各式提供可定位於AA要素之N端或C端之額外胺基酸序列。應理解，在式環[L1 -(MM)-L2 -(CM)-L3 -(AB)]中，負責二硫鍵之半胱胺酸可定位於AA中以容許一個或兩個尾，由此當AA處於二硫化物鍵結之結構(且因此構形受約束之狀態)中時產生套索或ω結構。該(等)尾之胺基酸序列可提供額外AA特徵，諸如結合於標靶受體以促進AA之定位，增加AA之血清半衰期，及其類似特徵。標靶部分(例如，針對存在於標靶組織中之細胞之受體的配位體)及血清半衰期延長部分(例如結合血清蛋白之多肽，諸如免疫球蛋白(例如IgG)或血清白蛋白(例如人類血清白蛋白(HSA))。
適用於本文所述之AA之連接體一般為提供經修飾AB或該AA之柔性以促進對AB與標靶之結合的抑制之連接體。該等連接體一般稱作柔性連接體。合適連接體可容易地經選擇且可具有任何合適之不同長度，諸如1個胺基酸(例如GIy)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸，包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸或7個胺基酸至8個胺基酸，且可為1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。
例示性柔性連接體包括甘胺酸聚合物(G)n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n 、(GSGGS)n 及(GGGS)n ，其中n係至少為1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技術中已知之其他柔性連接體。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對地未結構化，且因此可能夠充當組分之間的中性繫栓。甘胺酸接近甚至比丙胺酸顯著更多之phi-psi空間，且與具有較長側鏈之殘基相比更不受限制(參見Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992))。例示性柔性連接體包括但不限於Gly-Gly-Ser-Gly、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly、GIy- Ser-Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly及其類似連接體。一般技術人員應認識到，AA之設計可包括全部或部分地具柔性之連接體，以致該連接體可包括柔性連接體以及賦予較少柔性結構以提供所需AA結構之一或多個部分。
除了上文所述之要素以外，經修飾AB及AA亦可含有額外要素，諸如AA之胺基酸序列N端或C端。例如，AA可包括靶向部分以促進遞送至所關注之細胞或組織。此外，AA可在骨架蛋白之情況下經提供以促進細胞表面上AA之呈現
在一些實施例中，該可活化抗體亦包括信號肽。在一些實施例中，該信號肽經由間隔體結合於該可活化抗體。在一些實施例中，該間隔體在信號肽不存在下結合於該可活化抗體。在一些實施例中，該間隔體直接地接合於該可活化抗體之MM。在一些實施例中，在自N端至C端具有間隔體-MM-CM-AB之結構安排中，該間隔體直接地接合於該可活化抗體之MM。
合適間隔體及間隔體技術為此項技術中已知的且可常規地用於在所提供之可活化抗體之一些實施例中併入間隔體。參見例如WO 2016/179285 (例如在第52-53頁)，其內容以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，該可活化抗體暴露於蛋白酶且藉由蛋白酶裂解，以致在經活化或裂解狀態中，該可活化抗體包括如下輕鏈序列，該序列在該蛋白酶已裂解CM之後包括LP2及/或CM序列之至少一部分。
該CM由至少一種蛋白酶以約0.001-1500 × 104 M-1 S-1 或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500 × 104 M-1 S-1 之速率特異性地裂解。在一些實施例中，該CM以約100,000 M-1 S-1 之速率特異性地裂解。在一些實施例中，該CM以約l × l02 至約1 × 106 M-1 S-1 (亦即，約l ×102 至約l × l06 M-1 S-1 )之速率特異性地裂解。
關於藉由酶實現之特異性裂解，在該酶與CM之間實現接觸。當包含偶合至MM及CM之Ab (例如抗體或EpCAM結合抗體片段)之可活化抗體係在標靶及充足酶活性存在下時，該CM可裂解。充足酶活性可指該酶與該CM進行接觸且實現裂解之能力。可容易地設想，酶可處於該CM附近，但由於其他細胞因子或該酶之蛋白質修飾而無法裂解。5. 細胞毒性劑 (D) 或細胞毒性劑 - 連接體化合物 ( 式 (I) 化合物
在某些實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的步驟(c)，CysCBA (例如CysAb或其抗原結合片段)與式(I)化合物：
Figure 02_image003
(I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成結合物，其中D為細胞毒性劑，且L為連接體。
在某些實施例中，D為苯并二氮呯化合物，諸如吡咯并苯并二氮呯(PBD)、㗁唑啶并苯并二氮呯(OBD)或吲哚啉并苯并二氮呯(IGN)化合物。
如本文所用，「苯并二氮呯」化合物係具有苯并二氮呯核心結構之化合物。該苯并二氮呯核心可經取代或未經取代，及/或與一或多個環結構稠合。其亦包括具有藉由連接體連接之兩個苯并二氮呯核心之化合物。作為苯并二氮呯核心之一部分之亞胺官能基(-C=N-)可經還原。
如本文所用，「吡咯并苯并二氮呯」(PBD)化合物係具有吡咯并苯并二氮呯核心結構之化合物。吡咯并苯并二氮呯可經取代或未經取代。其亦包括具有藉由連接體連接之兩個吡咯并苯并二氮呯核心之化合物。作為吲哚啉并苯并二氮呯核心之一部分之亞胺官能基(-C=N-)可經還原。
在某些實施例中，該吡咯并苯并二氮呯化合物包含由
Figure 02_image102
表示之核心結構，其可視情況經取代。
在某些實施例中，該等吡咯并苯并二氮呯化合物包含由
Figure 02_image104
表示之核心結構，其可視情況經取代。
如本文所用，「吲哚啉并苯并二氮呯」(IGN)化合物係具有吲哚啉并苯并二氮呯核心結構之化合物。吲哚啉并苯并二氮呯可經取代或未經取代。其亦包括具有藉由連接體連接之兩個吲哚啉并苯并二氮呯核心之化合物。作為吲哚啉并苯并二氮呯核心之一部分之亞胺官能基(-C=N-)可經還原。
在某些實施例中，該吲哚啉并苯并二氮呯化合物包含由
Figure 02_image106
表示之核心結構，其可視情況經取代。
在一些實施例中，該吲哚啉并苯并二氮呯化合物包含由
Figure 02_image108
表示之核心結構，其可視情況經取代。
如本文所用，「㗁唑啶并苯并二氮呯」(OBD)化合物係具有㗁唑啶并苯并二氮呯核心結構之化合物。㗁唑啶并苯并二氮呯可經取代或未經取代。其亦包括具有藉由連接體連接之兩個㗁唑啶并苯并二氮呯核心之化合物。作為㗁唑啶并苯并二氮呯核心之一部分之亞胺官能基(-C=N-)可經還原。
在一些實施例中，該㗁唑啶并苯并二氮呯化合物包含由
Figure 02_image110
表示之核心結構，其可視情況經取代。
在某些實施例中，D為類美登素化合物。
在第一特定實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物，D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image112
(D-IA)；
Figure 02_image114
(D-IB)；
Figure 02_image116
(D-IC)；或
Figure 02_image118
(D-ID)； 其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； L’、L’’及L’’’之一係由下式表示： -Z1 -P1 -Z2 -Rx1 -C(=O)-             (A’)，或 -N(Re )-Rx1 -C(=O)-    (D’)； 且另兩者各自獨立地選自-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、鹵素、胍鹽[-NH(C=NH)NH2 ]、-OR、-NR’R’’、-NO2 、-NR’COR’’、-SR、-SOR’、-SO2 R’、-SO3 H、-OSO3 H、-SO2 NR’R’’、氰基、疊氮基、-COR’、-OCOR’及-OCONR’R’’； Z1 及Z2 之一為-C(=O)-，且另一者為-NR5 -； P1 為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Rx1 為視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基； Re 為-H、直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基或-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ，其中Rk 為-H、具有1至6個碳原子、視情況攜帶二級胺基(例如-NHR101 )或三級胺基(-NR101 R102 )之直鏈、分支鏈環狀烷基、或5員或6員含氮雜環，其中R101 及R102 各自獨立地為直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基； R在每次出現時係獨立地選自由-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環或視情況經取代的含有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環組成之群； R’及R’’係各自獨立地選自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2 、-COR、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 及視情況經取代的具有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環； Rc 為-H或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基； n為整數1至24； X1 係選自-H、胺保護基、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環及視情況經取代的含有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環； Y1 係選自-H、側氧基、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、視情況經取代之6員至18員芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環、視情況經取代的具有1至6個雜原子之3員至18員雜環； R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係各自獨立地選自由-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、鹵素、胍鹽[-NH(C=NH)NH2 ]、-OR、-NR’R’’、-NO2 、-NCO、-NR’COR’’、-SR、-SOR’、-SO2 R’、-SO3 - H、-OSO3 H、-SO2 NR’R’’、氰基、疊氮基、-COR’、-OCOR’及-OCONR’R’’組成之群； R6 為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2 或鹵素； G為-CH-或-N-； A及A’為相同或不同的，且係獨立地選自-O-、側氧基(-C(=O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5 及-CRR’N(R5 )-；且 R5 在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代之直鏈或分支鏈烷基。
在某些實施例中，D係由式(D-IA)或其醫藥學上可接受之鹽表示。
在某些實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，X1 為-H、-OH、(C1 -C3 )烷基、鹵基(C1 -C3 )烷基或苯基；Y1 ’為-H、側氧基、(C1 -C3 )烷基或鹵基(C1 -C3 )烷基，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，X1 為-H、-OH或-Me；且Y1 為-H或側氧基。甚至更特定言之，X1 為-H；且Y1 為-H。
在某些實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，A及A’為相同或不同的，且係選自-O-及-S-，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，A及A’為-O-。
在某些實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，R6 為-OMe，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係獨立地為-H、鹵素、-NO2 、-OH、(C1 -C3 )烷基、鹵基(C1 -C3 )烷基或(C1 -C3 )烷氧基，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’均為-H。
在某些實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，R、R’、R”及R5 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，G為-CH-。
在某些實施例中，D係由式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)表示，其中： R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’均為-H； R6 為-OMe； X1 及Y1 均為-H； A及A’為-O-；且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。在某些實施例中，G為-CH-；且剩餘變數係如上文所述。
在第二特定實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，L’、L’’及L’’’之一係由式(A’)或(D’)表示，且其餘為-H、具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基、鹵素、-OH、(C1 -C6 )烷氧基或-NO2 ，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。在某些實施例中，L’係由式(A’)表示；且L’’及L’’’均為-H。在其他實施例中，L’係由式(D’)表示；且L’’及L’’’均為-H。
在某些實施例中，式(A’)或(D’)中之Rx1 為具有1至6個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基，其視情況經鹵素、-OH、(C1 -C3 )烷基、(C1 -C3 )烷氧基、鹵基(C1 -C3 )烷基或帶電取代基或可離子化基團Q取代；且剩餘變數係如第一或第二特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第三特定實施例中，關於第一或第二特定實施例或其中所述之任何實施例中所述之式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)或(D-ID)，L’係由下式表示： -NR5 -P1 -C(=O)-(CRa Rb )s -C(=O)- (B1’)； -NR5 -P1 -C(=O)-Cy-(CRa Rb )s1’ -C(=O)-       (B2’)； -C(=O)-P1 -NR5 -(CRa Rb )s -C(=O)- (C1’)，或 -C(=O)-P1 -NR5 -Cy-(CRa Rb )s1’ -C(=O)-       (C2’) 其中： Ra 及Rb 在每次出現時各自獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基或帶電取代基或可離子化基團Q； s為整數1至6； s1’為0或整數1至6； Cy為具有5或6個環碳原子之環狀烷基，其視情況經鹵素、-OH、(C1 -C3 )烷基、(C1 -C3 )烷氧基或鹵基(C1 -C3 )烷基取代；且 剩餘變數係如第一或第二特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，式(B2’)及(C2’)中之Cy為環己烷；且s1’為0或1。
在第四特定實施例中，關於式(I)化合物，D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image121
(D-IE)， 且剩餘變數係如第三特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第五特定實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)、(D-ID)或(D-IE)，Ra 及Rb 均為H；且R5 為H或Me，且剩餘變數係如第三或第四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，關於第一、第二、第三或第四特定實施例或其中所述之任何實施例所述的化合物，該帶電取代基或可離子化基團Q為i) -SO3 H、-Z’-SO3 H、-OPO3 H2 、-Z’-OPO3 H2 、-PO3 H2 、-Z’-PO3 H2 、-CO2 H、-Z’-CO2 H、-NR11 R12 或-Z’-NR11 R12 或其醫藥學上可接受之鹽；或者，ii) -N+ R14 R15 R16 X- 或-Z’-N+ R14 R15 R16 X- ；Z’為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸環烷基或視情況經取代之伸苯基；R14 至R16 各自獨立地為視情況經取代之烷基；且X- 為醫藥學上可接受之陰離子。更特定言之，Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
在第六特定實施例中，關於式(D-IA)、(D-IB)、(D-IC)、(D-ID)或(D-IE)，P1 為含有2至10個胺基酸殘基之肽，且剩餘變數係如第一、第二、第三、第四或第五特定實施例或其中所述之任何實施例所述。在某些實施例中，P1 為含有2至5個胺基酸殘基之肽。在某些實施例中，P1 為可藉由蛋白酶裂解之肽。更特定言之，P1 為可藉由在腫瘤組織中表現之蛋白酶裂解之肽。在某些實施例中，P1 為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 56)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 58)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。更特定言之，P1 為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
在第七特定實施例中，關於式(I)化合物，D係由以下結構式表示：
Figure 02_image123
(D1)；
Figure 02_image125
(D2)；
Figure 02_image127
(D3)；或
Figure 02_image129
(D4)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H，Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽，且剩餘變數係如第一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第八特定實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物，-L-係由以下結構式表示：
Figure 02_image131
(L-I)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： s1為共價連接至D之位點；s2為共價連接至順丁烯二醯亞胺基之位點； R23 及R24 在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基； m’為0與10之間的整數； Rh’ 為H或視情況經取代之烷基； 且剩餘變數係如第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，R23 及R24 均為H；且m’為1與6之間的整數，且剩餘變數係如第八特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，Rh’ 為H，且剩餘變數係如第八特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第九特定實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物，-L-係由以下結構式表示：
Figure 02_image133
(L1)， 或其醫藥學上可接受之鹽，且剩餘變數係如第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image135
(I1)，或
Figure 02_image137
(I2)。
在某些實施例中，式(I)化合物係由下式表示：
Figure 02_image139
(I3)。
在第十一特定實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物，D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image141
(D-IIA)；
Figure 02_image143
(D-IIB)；
Figure 02_image145
(D-IIC)；或
Figure 02_image147
(D-IID)， 其中： N與C之間的雙線
Figure 02_image022
表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； X’係選自由-H、-OH、經取代或未經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、苯基及胺保護基組成之群； Y’係選自由-H、側氧基、經取代或未經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基組成之群； A及A’係選自-O-及-S-； W’不存在，或係選自-O-、-N(Re )-、-N(Re )-C(=O)-、-N(C(=O)Re )-、-S-或-CH2 -S-、-CH2 NRe -； Rx 不存在或係選自直鏈、分支鏈或環狀烷基； Re 為-H、直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基或-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ，其中Rk 為-H、具有1至6個碳原子、視情況攜帶二級胺基(例如-NHR101 )或三級胺基(-NR101 R102 )之直鏈、分支鏈環狀烷基、或5員或6員含氮雜環，其中R101 及R102 各自獨立地為直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基； n為整數1至24； G係選自-CH-或-N-； R6 為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2 或鹵素；且 R在每次出現時係獨立地選自由-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環或視情況經取代的含有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環組成之群； R’及R’’係各自獨立地選自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2 、-COR、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 及視情況經取代的具有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環； Rc 為-H或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；且L為連接體。
在某些實施例中，D係由式(D-IIA)或其醫藥學上可接受之鹽表示。
在某些實施例中，D係由式(D-IIA)、(D-IIB)、(D-IIC)或(D-IID)表示，其中： X’及Y’均為-H； A及A’均為-O-； R6 為-OMe； W’為-N(Re )-或-N(Re )-C(=O)-； Re 為-H、具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基或-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ，其中Rk 為-H、具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基； n為整數2至6； Rx 為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基；且剩餘變數係如第十一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十二特定實施例中，關於式(I)化合物，D係由以下結構式表示：
Figure 02_image149
(D-IIE)，或
Figure 02_image151
(D-IIF)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： Re1 為H或(C1 -C6 )烷基； Rxa 為(C1 -C6 )烷基； Re2 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為整數2至6； Rk 為-H或-Me； Rxb 為(C1 -C6 )烷基；且剩餘變數係如第十一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十三特定實施例中，關於式(I)化合物，D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image153
(D5)； 且剩餘變數係如第十一特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十四特定實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物，D係由下式表示：
Figure 02_image155
(D-III)， 其中m’為1或2；R1 及R2 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基；且L為連接體。
在某些實施例中，D係由下式表示：
Figure 02_image157
(D-IIIA)。
在第十五特定實施例中，關於本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物，L係由以下結構式表示：
Figure 02_image159
(L-II)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： s1為共價連接至D之位點，且s2為共價連接至順丁烯二醯亞胺基之位點； E為-(CR10 R11 )q -、環烷基或環烷基烷基； Z係不存在、-SO2 NR9 -、-NR9 SO2 -、-C(=O)-NR9 -、-NR9 -C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-NR9 -(CH2 CH2 O)p -、-NR9 -C(=O)-(CH2 CH2 O)p -、-(OCH2 CH2 )p -C(=O)NR9 -或-(OCH2 CH2 )p -NR9 -C(=O)-； p為整數1至24； Q為H、帶電取代基或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 及R13 在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基； q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數；且剩餘變數係如第十一、第十二、第十三或第十四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，E為-(CR10 R11 )q -，且剩餘變數係如第十五特定實施例所述。
在某些實施例中，E為
Figure 02_image161
，且剩餘變數係如第十五特定實施例所述。
在某些實施例中，Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-，且剩餘變數係如第十五特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十六特定實施例中，關於式(I)化合物，L係由以下結構式表示：
Figure 02_image163
(L-IIA)， 其中R9 、R10 、R11 、R12 及R13 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基；且剩餘變數係如第十五特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，R9 為-H，且剩餘變數係如第十六特定實施例所述。
在某些實施例中，Q’為： i)    H； ii)   -SO3 H、-Z’-SO3 H、-OPO3 H2 、-Z’-OPO3 H2 、-PO3 H2 、-Z’-PO3 H2 、-CO2 H、-Z’-CO2 H、-NR11 R12 或-Z’-NR14 R15 或其醫藥學上可接受之鹽；或者， iii)  -N+ R14 R15 R16 X- 或-Z’-N+ R14 R15 R16 X- ； Z’為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸環烷基或視情況經取代之伸苯基； R14 、R15 及R16 各自獨立地為視情況經取代之烷基；且 X- 為醫藥學上可接受之陰離子，且剩餘變數係如第十六特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，Q’為H或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽，且剩餘變數係如第十六特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，R9 、R10 、R11 、R12 及R13 均為H；且q及r各自獨立地為1與6之間的整數，且剩餘變數係如第十六特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，L係由式(L-IIA)表示，其中： R12 及R13 在每次出現時各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基； Q為H或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽 Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； R9 為H或(C1 -C3 )烷基； R10 及R11 在每次出現時獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 q及r各自為整數1至5；且剩餘變數係如第十六特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十七特定實施例中，關於式(I)化合物，L係由以下結構式中之任一者表示：
Figure 02_image165
(L2)，及
Figure 02_image167
(L3)， 或其醫藥學上可接受之鹽，且剩餘變數係如第十一、第十二、第十三或第十四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第十八特定實施例中，關於式(I)化合物，L係由以下結構式表示：
Figure 02_image169
(L-III)， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中： s1為共價連接至D之位點；s2為共價連接至順丁烯二醯亞胺基之位點； R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基； u及v各自獨立地為0與10之間的整數； Rh 為H或視情況經取代之烷基； PL 為視情況經取代之伸烷基、-(CH2 -CH2 -O)j - (其中氧原子連接至與PL 連接之-(C=O)-基團)、胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；且 j為整數1至24；且剩餘變數係如第十一、第十二、第十三或第十四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，R19 、R20 、R21 及R22 各自為H；且u及v各自獨立地為1與6之間的整數；且剩餘變數係如上文第十八特定實施例所述。
在某些實施例中，PL 為胺基酸殘基或含有2至10個胺基酸殘基之肽且剩餘變數係如上文第十八特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，PL 為含有2至5個胺基酸殘基之肽。在另一更特定實施例中，PL 係選自由以下組成之群：Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Cit-Val. Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:55)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:56)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:57)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala.、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Val-Ala及β-Ala-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:58)。甚至更特定言之，PL 為Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Val-Ala或β-Ala-Gly-Gly-Gly。
在第十九特定實施例中，關於式(I)化合物，L係由以下結構式表示：
Figure 02_image171
(L4)， 或其醫藥學上可接受之鹽，且剩餘變數係如第十一、第十二、第十三或第十四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第二十特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image173
(I4)；或
Figure 02_image175
(I5)。
在某些實施例中，第二十特定實施例中之式(I)化合物係由下式表示：
Figure 02_image177
(I6)。
在第二十一特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image179
(I7)；
Figure 02_image181
(I8)；或
Figure 02_image183
(I9)； 其中DM係由下式表示之藥物部分：
Figure 02_image185
。
在第二十二特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image187
(I-a)， 其中： L2 ’ 為攜帶順丁烯二醯亞胺部分之間隔體； A為胺基酸或包含2至20個胺基酸之肽； R1A 及R2A 各自獨立地為H或C1-3 烷基； L1 為間隔體；且 D-L1 -SH為細胞毒性劑。
在某些實施例中，R1A 及R2A 中之至少為H，且剩餘變數係如第二十二特定實施例所述。
在某些實施例中，R1A 及R2A 各自獨立地為H或Me，且剩餘變數係如第二十二特定實施例所述。
在某些實施例中，R1A 及R2A 為H；且另一者為Me，且剩餘變數係如第二十二特定實施例所述。
在某些實施例中，R1A 及R2A 均為H，且剩餘變數係如第二十二特定實施例所述。
在某些實施例中，L1 為-L1 ’-C(=O)-；且L1 ’為伸烷基或伸環烷基，且剩餘變數係如第二十二特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，L1 ’為C1-10 伸烷基。甚至更特定言之，L1 為-CR3A R4A -(CH2 )1-8 -C(=O)-；R3A 及R4A 各自獨立地為H或Me。在另一更特定實施例中，L1 為-CR3A R4A -(CH2 )3-5 -C(=O)-。在一甚至更特定實施例中，R3A 及R4A 均為Me。
在某些實施例中，L1 為-(CH2 )4-6 -C(=O)-，且剩餘變數係如第二十二特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第二十三特定實施例中，關於式(I-a)，L2 ’係由以下結構式表示：
Figure 02_image189
； 其中： RA 為伸烷基、環烷基伸烷基或伸芳基； RB 及RC 係各自獨立地不存在、伸烷基、伸環烷基或伸芳基； V及V’各自獨立地為-(O-CH2 -CH2 )p1 -或-(CH2 -CH2 -O)p1 -； p1為0或整數1至10； W係不存在、
Figure 02_image191
、
Figure 02_image193
或
Figure 02_image195
，其中s2’指示連接至V、RA 或JCB ’之位點且s3’指示連接至RB 、V’、RC 或JA 之位點； JCB ’ 為
Figure 02_image197
；且 JA 為-C(=O)-；且剩餘變數係如第二十二特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，p1為0且RC 不存在，且剩餘變數係如第二十三特定實施例所述。
在第二十四特定實施例中，關於式(I-a)，L2 ’係由以下結構式表示：
Figure 02_image199
(L2a’)；或
Figure 02_image201
(L2b’)， 其中： Rx 及Ry 在每次出現時獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C1-4 烷基)、-SO3 H、-NR40 R41 R42 + 或視情況經-OH、鹵素、-SO3 H或NR40 R41 R42 + 取代之C1-4 烷基，其中R40 、R41 及R42 各自獨立地為H或C1-4 烷基； l及l1各自獨立地為整數1至10； k1為整數1至12；且剩餘變數係如第二十二特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，Rx 及Ry 均為H，且剩餘變數係如上文第二十四特定實施例所述。
在某些實施例中，l及l1各自為整數2至6，且剩餘變數係如上文第二十四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第二十五特定實施例中，關於式(I-a)，A為可藉由蛋白酶裂解之肽，且剩餘變數係如第二十二、第二十三或第二十四特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，A係可藉由在腫瘤組織中表現之蛋白酶裂解之肽。在另一更特定實施例中，A係具有與-NH-CR1 R2 -S-L1 -D共價連接之胺基酸的肽，該胺基酸選自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val組成之群，各自獨立地呈L或D異構體。更特定言之，與-NH-CR1 R2 -S-L1 -D連接之胺基酸為L胺基酸。
在某些實施例中，A係含有2至5個胺基酸殘基之肽，且剩餘變數係如第二十五特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，A係選自由Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:55)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:56)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:57)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro及D-Ala-tBu-Gly組成之群，其中各肽中之第一個胺基酸連接至L2 基團且各肽中之最後一個胺基酸連接至-NH-CR1 R2 -S-L1 -D。甚至更特定言之，A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
在第二十六特定實施例中，關於式(I-a)，D為類美登素且剩餘變數係如第二十二、第二十三、第二十四或第二十五特定實施例或其中所述之任何實施例所述。更特定言之，D係由下式表示：
Figure 02_image203
。
甚至更特定言之，D係由下式表示：
Figure 02_image013
。
在第二十七特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image206
(I-b)；或
Figure 02_image208
(I-c)； 其中： R3A 及R4A 各自獨立地為H或Me； r1及t1各自獨立地為整數1至6； r2及t2各自獨立地為整數1至7； t3為整數1至12； D1 係由下式表示：
Figure 02_image210
； 且剩餘變數係如第二十五或第二十六特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly，且剩餘變數係如第二十八特定實施例所述。
在某些實施例中，r1為整數2至4；且r2為整數3至5，且剩餘變數係如第二十七特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在第二十八特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式表示：
Figure 02_image212
(I-d)；或
Figure 02_image214
(I-e)； 其中： r1及t1各自為整數2至6； r2及t2各自為整數2至5；且 t3為整數2至12；且剩餘變數係如第二十七特定實施例或其中所述之任何實施例所述。
在某些實施例中，R3A 及R4A 均為Me，且剩餘變數係如第二十八特定實施例所述。
在某些實施例中，R3A 及R4A 均為H，且剩餘變數係如第二十八特定實施例所述。
在第二十九特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
Figure 02_image216
(I-f)；
Figure 02_image218
(I-g)；
Figure 02_image220
(I-h)；
Figure 02_image222
(I-i)；
Figure 02_image224
(I-j)；
Figure 02_image226
(I-k)；
Figure 02_image228
(I-l)；
Figure 02_image230
(I-m)；
Figure 02_image232
(I-n)；
Figure 02_image234
(I-o)；
Figure 02_image236
(I-p)；
Figure 02_image238
(I-q)；
Figure 02_image240
(I-r)；
Figure 02_image242
(I-s)；
Figure 02_image244
(I-t)；
Figure 02_image246
(I-u)；
Figure 02_image248
(I-v)；
Figure 02_image250
(I-w)；
Figure 02_image252
(I-x)；或
Figure 02_image254
(I-y)； 其中： A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly；且 D1 係由下式表示：
Figure 02_image210
。
在第三十特定實施例中，本文所述之方法(例如，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十實施例或其中所述之任何實施例之方法)中的式(I)化合物係由下式表示：
Figure 02_image256
(I10)；
Figure 02_image009
(I11)；
Figure 02_image258
(I12)；
Figure 02_image260
(I13)；
Figure 02_image262
(I14)；或
Figure 02_image264
(I15)， 其中D1 係由下式表示：
Figure 02_image013
。
在某些實施例中，式(I)化合物係由式(I11)表示：
Figure 02_image009
(I11)。 式(I11)化合物亦稱作DM21-C或Mal-LDL-DM或MalC5-LDL-DM。
在某些實施例中，關於上文所述之式(I)化合物，該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。在某些實施例中，關於上文所述之式(I)化合物，該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽。5. 免疫結合物、醫藥組合物及使用方法
本發明亦提供藉由本發明方法製備之本文所述之結合物。亦提供包含本文所述之結合物之醫藥組合物。
本文所述之醫藥組合物可以多種方式經投與以用於局部或全身性治療。投與可為表面(諸如至黏膜，包括陰道及直腸遞送)，諸如經皮貼片、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及散劑；肺(例如藉由散劑或氣霧劑之吸入或吹入，包括藉由噴霧器；氣管內、鼻內、表皮及經皮)；經口；或非經腸，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或顱內(例如鞘內或室內)投與。在一些特定實施例中，該投與為靜脈內。本文所述之醫藥組合物亦可活體外或離體使用。
本發明包括一種抑制哺乳動物(例如人類)中之異常細胞生長或治療增生性病症之方法，其包括向該哺乳動物投與治療有效量的本發明之免疫結合物或醫藥組合物。
在某些實施例中，哺乳動物中之異常細胞生長或增生性病症為癌症，包括血液癌症、白血病或淋巴瘤。在某些實施例中，該增生性病症為淋巴器官之癌症，或血液惡性腫瘤。
例如，該癌症可選自由以下組成之群：急性骨髓白血病(AML，包括CD33低AML、P-醣蛋白陽性AML、復發性AML或難治性AML)、慢性骨髓性白血病(CML) (包括CML之母細胞危象及與CML相關之Abelson致癌基因(Bcr-ABL易位))、骨髓發育不良症候群(MDS)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL) (包括但不限於急性B淋巴母細胞性白血病或B細胞急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL))、慢性淋巴球性白血病(CLL) (包括Richter氏症候群或Richter氏CLL轉化)、毛細胞白血病(HCL)、急性早幼粒細胞性白血病(APL)、B細胞慢性淋巴增生性疾病(B-CLPD)、非典型慢性淋巴球性白血病(較佳地具有經標記CD11c表現)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括套細胞白血病(MCL)及小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、霍奇金氏淋巴瘤、全身性肥大細胞增生症及伯基特氏淋巴瘤。
在某些實施例中，該癌症具有至少一種陰性預後因子，例如P-醣蛋白之過表現、EVI1之過表現、p53變化、DNMT3A突變、FLT3內部串聯重複。
在某些實施例中，該癌症可選自由肺癌(例如非小細胞肺癌)、結腸直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰臟癌、腎細胞癌、前列腺癌、食道癌、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、骨髓癌、黑色素瘤及淋巴癌組成之群。在某些實施例中，該癌症為非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胃癌、乳癌(例如三陰性乳癌(TNBC))或胰臟癌。在其他實施例中，本發明之免疫結合物可用於治療非小細胞肺癌(鱗狀細胞癌、非鱗狀細胞癌、腺癌或大細胞未分化癌)、結腸直腸癌(腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、原發性結腸直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤或鱗狀細胞癌)或乳癌(例如三陰性乳癌(TNBC))實例 1. 還原劑篩選及抗體預加工 還原劑篩選
多種還原劑針對還原含有位點特異性結合位點之抗CD123抗體中的經工程改造之半胱胺酸之能力經篩選。關於所有反應，抗體於20 mM組胺酸(pH 6.0)中之50 mg/mL儲備溶液經稀釋至磷酸鉀pH 6.0緩衝液中以實現50 mM之最終磷酸鉀濃度。所需體積之DMA及溶解於DMA中之適當膦儲備液隨後添加至反應溶液中以實現2.0 mg/mL抗體濃度、10% (v/v) DMA及相對於該抗體經指示數目之當量的膦(mol:mol)。隨後使反應混合物在25℃下反應持續4 h。在該還原反應完成時，使用Alexa Fluor 488順丁烯二醯亞胺於DMA中之10 mM儲備液將相對於該抗體40 (mol:mol)當量之Alexa Fluor 488-順丁烯二醯亞胺引入至反應中。在25℃下培育隔夜之後，藉由SEC層析使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定標記之程度。結果顯示於下表A中。表 A
Figure 02_image266
來自此等數據之結果指示膦2-(二苯基膦基)苯甲酸、TCEP及2-(二苯基膦基)乙胺能夠還原該抗體之二硫化物，從而使其可用於後續經AF488順丁烯二醯亞胺標記。
在一獨立實驗中，兩種特定膦針對其還原含有位點特異性結合位點之抗CD123抗體中的經工程改造之半胱胺酸之能力經篩選。該抗體首先經稀釋至50 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中。向此溶液中添加相對於該抗體適當數目之當量(mol:mol)的所指示還原劑及DMA以實現5 mg/mL之最終抗體濃度及5% (v/v) DMA。使此混合物在25℃下反應持續4 h。在此步驟完成時，移出該經還原抗體之等分試樣，用pH 6.0磷酸鉀緩衝液稀釋且使其與20 mol:mol當量之AF488-mal對抗體在2.5 mg/mL抗體及10% (v/v) DMA下反應。在使該混合物在25℃下反應持續18 h之後，藉由SEC在280 nm及493 nm下監測標記之程度。該還原溶液之剩餘部分亦用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀緩衝液稀釋。DMA及DHAA (作為DMA儲備溶液)在1.5:1之DHAA:還原劑莫耳比率下接著添加至該溶液中。該再氧化反應混合物之最終組成為2.5 mg/mL抗體，具有所指示數目之DHAA當量，及5% (v/v) DMA。在25℃下培育此溶液持續18 h之後，建立結合反應。該反應混合物用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀稀釋。向此溶液中添加DMA及相對於該抗體10莫耳當量之AF488-mal。該結合反應混合物之最終組成為2.0 mg/mL抗體、10莫耳當量之AF488-mal及10% (v/v) DMA。使此反應混合物在25℃下反應持續18 h。在該反應完成時，藉由SEC層析使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定用AF488-mal標記之程度。此研究之結果顯示於下表B中。表 B
Figure 02_image268
此等研究指示2-(二苯基膦基)乙胺及3-(二苯基膦基)丙胺均為能夠還原該抗體之原生鏈間二硫化物及經工程改造之半胱胺酸二硫化物的有效還原劑。另外，在一鍋反應中使用過量DHAA進行再氧化時，可獲得預期之DAR 2結合物。
在一獨立實驗中，藉由在pH 7.5下使用膦及非膦還原劑進行還原來測試該過程。抗CD123抗體首先經稀釋至50 mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.5)中。向此溶液中添加相對於該抗體適當數目之當量(mol:mol)的所指示還原劑及DMA以實現5 mg/mL之最終抗體濃度及5% (v/v) DMA。使此混合物在25℃下反應持續4 h。在此步驟完成時，該反應溶液進一步用維持50 mM緩衝液濃度之pH 7.5磷酸鉀緩衝液稀釋。DMA及DHAA (作為DMA儲備溶液)在1.5:1之DHAA:還原劑莫耳比率下接著添加至該溶液中。該再氧化反應混合物之最終組成為2.5 mg/mL抗體、所指示數目之DHAA當量及5% (v/v) DMA。在25℃下培育此溶液持續18 h之後，建立結合反應。反應混合物pH藉由用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀稀釋而降低。向此溶液中添加DMA及相對於該抗體10莫耳當量之AF488-mal。該結合反應混合物之最終組成為2.0 mg/mL抗體、10莫耳當量之AF488-mal及10% (v/v) DMA。使此反應混合物在25℃下反應持續18 h。在該反應完成時，藉由SEC層析使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定用AF488-mal標記之程度。此研究之結果顯示於下表C中。表 C
反應 還原劑 DTT (相對於Ab之當量數) DHAA (相對於DTT之當量數) AF488-mal (相對於Ab之當量數) AF488標記/Ab
1 DTT 5 1.5 10 1.3
2 DTT 10 1.5 10 1.6
3 DTT 20 1.5 10 1.4
4 TCEP 10 1.5 10 1.7
5 TCEP 15 1.5 10 1.8
6 TCEP 20 1.5 10 2.0
7 2-(二苯基膦基)乙胺 5 1.5 10 1.3
8 2-(二苯基膦基)乙胺 10 1.5 10 1.7
9 2-(二苯基膦基)乙胺 15 1.5 10 1.8
10 3-(二苯基膦基)丙胺 5 1.5 10 2.0
11 3-(二苯基膦基)丙胺 10 1.5 10 1.6
12 3-(二苯基膦基)丙胺 15 1.5 10 2.1
氧化劑及還原劑濃度及對DAR之影響
檢測DHAA:2-二苯基膦基乙胺之比率對DAR之影響。抗CD123抗體首先經稀釋至50 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中。向此溶液中添加相對於該抗體適當數目之當量(mol:mol)的2-(二苯基膦基)乙胺及DMA以實現5 mg/mL之最終抗體濃度及5% (v/v) DMA。使此混合物在25℃下反應持續4 h。在此步驟完成時，移出該經還原抗體之等分試樣，用pH 6.0磷酸鉀緩衝液稀釋且使其與20 mol:mol當量之AF488-mal對抗體在2.5 mg/mL抗體及10% (v/v) DMA下反應。在使該混合物在25℃下反應持續18 h之後，藉由SEC在280 nm及493 nm下監測標記之程度。該還原溶液之剩餘部分亦用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀緩衝液稀釋。DMA及DHAA (作為DMA儲備溶液)在所指示之DHAA:還原劑莫耳比率下接著添加至該溶液中。該再氧化反應混合物之最終組成為2.5 mg/mL抗體，具有所指示數目之DHAA當量，及5% (v/v) DMA。在25℃下培育此溶液持續18 h之後，建立結合反應。該反應混合物用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀稀釋。向此溶液中添加DMA及相對於該抗體10莫耳當量之AF488-mal。該結合反應混合物之最終組成為2.0 mg/mL抗體、10莫耳當量之AF488-mal及10% (v/v) DMA。使此反應混合物在25℃下反應持續18 h。在該反應完成時，藉由SEC層析使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定用AF488-mal標記之程度。此研究之結果顯示於下表D及圖 1 中。表 D
Figure 02_image270
此等數據指示使用2-(二苯基膦基)乙胺發生有效結合。特定言之，當膦之當量增加時，觀察到較高程度之AF-488標記。另外，在1.0-2.0 mol:mol過量之DHAA:膦中，未觀察到AF-488標記之顯著差異，指示該抗體之原生鏈間二硫鍵之完全再氧化。 抗體濃度研究
使用一鍋結合方法評估高抗體濃度對DAR之影響。抗ADAM9抗體首先經稀釋至50 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中。向此溶液中添加相對於該抗體25當量(mol:mol)之所指示之膦及DMA以實現10 mg/mL之最終抗體濃度及5% (v/v) DMA。使此混合物在25℃下反應持續4 h。在此步驟完成時，移出該經還原抗體之等分試樣，用pH 6.0磷酸鉀緩衝液稀釋且使其與25 mol:mol當量之AF488-mal對抗體在4.0或7.5 mg/mL抗體(分別針對低及高濃度反應)及10% (v/v) DMA下反應。在使該混合物在25℃下反應持續4 h之後，藉由SEC在280 nm及493 nm下監測標記之程度。該還原溶液之剩餘部分亦用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀緩衝液稀釋。DMA及DHAA (作為DMA儲備溶液)在1:1之DHAA:還原劑莫耳比率下接著添加至該溶液中。該再氧化反應混合物之最終組成為如所指示之4或7.5 mg/mL抗體，相對於抗體具有25 mol:mol當量DHAA，及7.5% (v/v) DMA。在25℃下培育此溶液持續18 h之後，建立結合反應。該反應混合物用維持50 mM緩衝液濃度之pH 6.0磷酸鉀稀釋。向此溶液中添加DMA及相對於該抗體5莫耳當量之AF488-mal。該結合反應混合物之最終組成為分別針對低及高濃度反應之3.5或7 mg/mL抗體、5莫耳當量之AF488-mal及10% (v/v) DMA。使此反應混合物在25℃下反應持續18 h。在該反應完成時，藉由SEC層析使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定用AF488-mal標記之程度。此研究之結果顯示於下表E中。表 E
反應 膦 還原濃度(mg/mL) 再氧化濃度(mg/mL) 結合濃度(mg/mL) 還原反應之後的AF488-mal標記 最終結合物之AF488-mal標記
1 TCEP 10 4 3.5 8.45 1.53
2 參(羥基丙基)膦 10 4 3.5 9.72 1.88
3 參(羥基丙基)膦 10 7.5 7 9.63 1.97
4 2-(二苯基膦基)乙胺 10 4 3.5 8.76 1.93
5 2-(二苯基膦基)乙胺 10 7.5 7 8.67 1.85
6 3-(二苯基膦基)丙胺 10 4 3.5 9.37 1.94
7 3-(二苯基膦基)丙胺 10 7.5 7 8.98 2.15
8 雙(3-胺基丙基)苯基膦 10 4 3.5 9.51 1.91
9 雙(3-胺基丙基)苯基膦 10 7.5 7 8.28 2.05
在低或高濃度下用不同的膦進行還原、再氧化及結合之後，所有反應均顯示逼近2.0個標記/抗體之目標的AF488-mal標記。 時間及溫度對TCEP還原之影響
使用一鍋結合方法檢測時間及溫度對TCEP還原之影響。在10 mg/mL抗ADAM9抗體濃度下在具有5% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行還原反應。反應用25 mol:mol當量之TCEP建立且在25℃、30℃或35℃下執行2、4、6、8或20小時。在7 mg/mL抗體濃度下在具有8% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行再氧化反應。反應用相對於TCEP 1.5倍過量之DHAA建立且在25℃下執行16-20小時。經再氧化之抗體直接用於建立具有AF488-mal有效載荷之結合反應。在5 mg/mL抗體濃度下在具有10% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行此等結合反應。反應用5.0 mol:mol當量之AF488-mal建立且在25℃下執行16-20 h。在各AF488-mal反應結束時，經由SEC分析樣品之單體及AF488-mal標記之程度。藉由使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定用AF488-mal標記之程度。此等反應之詳情顯示於表F及圖 2 及圖 3 中。表 F
樣品 還原時間(h) 還原溫度(C) 單體% SEC DAR
1 2 25 96.30 1.53
2 4 25 97.44 1.86
3 6 25 97.74 1.92
4 8 25 98.20 2.05
5 20 25 97.13 2.28
6 2 30 97.32 1.75
7 4 30 98.17 2.01
8 6 30 98.41 2.13
9 8 30 98.46 2.19
10 20 30 93.36 2.34
11 2 35 97.79 1.97
12 4 35 98.45 2.18
13 6 35 94.81 2.24
14 8 35 93.51 2.29
15 20 35 85.99 2.42
此研究證明了TCEP還原反應時間及溫度對最終結合物標記程度具有影響，其中最短反應時間轉化成用AF488-mal標記之較低程度。在升高溫度下觀察到對結合物穩定性之額外影響，其中發現該結合物之單體%隨時間降低。 TCEP當量篩選
使用一鍋結合方法及抗ADAM9抗體檢測TCEP濃度對半胱胺酸還原之影響。在10 mg/mL抗體濃度下在具有5% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行還原反應。此等還原反應用相對於該抗體8、10、15、20或25當量之TCEP建立且在25℃下執行8小時。在7 mg/mL抗體濃度下在具有8% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中在相對於TCEP 1.5倍過量之DHAA存在下執行再氧化反應且在25℃下執行16-20小時。經再氧化之抗體反應混合物直接用於建立具有AF-488Mal標記之結合反應。在5 mg/mL抗體濃度下在具有10% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行此等結合反應。反應用相對於該抗體5莫耳當量之AF-488Mal建立且在25℃下執行16-20 h。在該反應完成時，藉由SEC層析使用該抗體在280 nm下之已知消光係數及AF488-mal在280 nm及493 nm下之已知消光係數來測定用AF488-mal標記之程度。此研究之結果顯示於下表G及圖 4 中。表 G
樣品 TCEP當量 還原時間(h) SEC DAR
1 8 8 1.62
2 10 8 1.73
3 15 8 1.91
4 20 8 1.95
5 25 8 2.03
此等數據指示最終結合物有效載荷負載取決於莫耳過量之膦。在pH 6.0下使用TCEP，需要15或更大當量之還原劑來實現大於1.9之標記程度。實例 2 ：使用 TCEP 及 3-( 二苯基膦基 ) 丙胺 (DPPA) 之一鍋結合過程之比較
設計此等實驗以確認及比較以25 mg Ab規模使用抗ADAM9抗體進行之pH 7.5 TCEP還原及pH 6.0 DPPA還原之功效。
關於TCEP一鍋過程，在12 mg/mL抗體濃度下在具有5% DMA之pH 7.5 50 mM KPi中執行還原反應。該反應用相對於抗體27莫耳當量之TCEP建立且在25℃下執行4小時。使用此經還原抗體來建立再氧化反應，該再氧化反應在10 mg/mL抗體濃度下在具有7.5% DMA之pH 7.5 50 mM KPi中執行。該再氧化反應用1:1莫耳比率之DHAA:TCEP建立且在25℃下執行4小時。經再氧化之抗體在結合之前用1 M乙酸調節pH至6.0。在8 mg/mL抗體濃度下在具有15% DMA之pH 6.0 50 mM KPi中執行結合反應。該結合反應用相對於抗體5.4莫耳當量之DM21-C建立且在25℃下執行8-12小時。
關於DPPA一鍋過程，在12 mg/mL抗體濃度下在具有5% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中在相對於抗體16莫耳當量之DPPA存在下執行還原反應且在25℃下執行4小時。使用此經還原抗體來建立再氧化反應，該再氧化反應在10 mg/mL抗體濃度下在具有7.5% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行。該再氧化反應用1:1莫耳比率之DHAA:DPPA建立且在25℃下執行13小時。在8 mg/mL抗體濃度下在具有15% DMA之pH 6.0 25 mM丁二酸鹽中執行結合反應。該結合反應用相對於抗體5.4莫耳當量之DM21-C建立且在25℃下執行8-12小時。經由SEC分析粗結合物之單體及DAR。使用TCEP及DPPA之一鍋結合過程之結果詳述於表H中。表 H
樣品 還原劑 還原pH 再氧化pH 結合pH 膦當量 單體% SEC DAR
1 TCEP 7.5 7.5 6 27.17 98.0 1.82
2 DPPA 6 6 6 16.30 97.7 1.98
此數據支持先前反應集合之發現，從而確認在pH 6.0 DPPA還原下之結合導致高於提供pH 7.5 TCEP還原之結合之DAR值。此兩種還原條件下之單體水準可相當，其中pH 7.5 TCEP還原產生高0.3%之單體水準。實例 3 ：針對使用 TCEP 作為還原劑之一鍋過程之還原反應 pH 篩選
設計此實驗以針對使用作為還原劑之TCEP、抗ADAM9抗體及DM21-C有效載荷之一鍋過程篩選還原反應pH。
引入之抗ADAM9抗體溶液(含25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，9%蔗糖)用適當pH 200 mM磷酸鉀緩衝液稀釋以製備具有50 mM之最終磷酸鉀濃度的不同pH抗體儲備溶液，該等儲備溶液為pH 7.0、8.0及8.5。隨後使用此等抗體溶液來建立相應pH還原反應。在10 mg/mL抗體濃度下在pH 7.0、8.0或8.5之50 mM磷酸鉀及5% DMA中執行還原反應。反應用相對於抗體27莫耳當量之TCEP建立且在25℃下執行4小時。經還原抗體溶液使用1M乙酸調節pH至6.0且接著未經純化即用於建立再氧化反應，該等再氧化反應在9 mg/mL抗體濃度下在具有8% DMA之pH 6.0 50 mM磷酸鉀中執行。反應用相對於TCEP 1.5倍莫耳過量之DHAA建立且在25℃下執行12-16小時。經再氧化之抗體接著直接用於建立結合反應，該等結合反應在8 mg/mL抗體濃度下在含有15% DMA之pH 6.0 50 mM磷酸鉀中執行。反應用5.4當量之DM21-C建立且在25℃下執行8小時。經由SEC分析粗結合物之單體%及DAR。
此實驗之結果顯示於下表I中。詳言之，此等結果指示將還原反應pH自7.0增加至8.5不會顯著地影響最終結合物。表 I
反應 還原pH 再氧化pH 結合pH 單體% SEC DAR
1 7.0 6.0 6.0 97.39 1.81
2 8.0 6.0 6.0 96.42 1.76
3 8.5 6.0 6.0 96.00 1.78
實例 4 ：關於抗 ADAM9 藥物結合物之結合之一鍋結合過程開發 在pH 5.0下而無pH調節之一鍋過程
設計此實驗以測定在含有9%蔗糖之pH 5.0 10 mM乙酸鹽緩衝液中之25 mg/mL抗ADAM9抗體是否適用於一鍋過程中在pH 5.0下而無pH調節之直接結合。
在12 mg/mL抗體濃度下在具有5% DMA之pH 5 10 mM乙酸鹽+ 9%蔗糖中執行還原反應。反應用相對於該抗體所指示之莫耳過量之DPPA建立且在25℃下執行10小時。經還原抗體未經純化即用於建立再氧化反應，該等再氧化反應在10 mg/mL下在含有7.5% DMA之pH 5.0 10 mM乙酸鹽+ 9%蔗糖中執行。反應用1:1莫耳比率之DHAA:DPPA膦建立且在25℃下執行12小時。經再氧化之抗體未經純化即用於建立使用DM21-C之結合反應。在8 mg/mL抗體濃度下在含有15% DMA之pH 5 10 mM乙酸鹽+ 9%蔗糖中執行此等結合反應。反應用5.4當量之DM21-C建立且在25℃下執行12 h。在結合反應結束時，經由SEC分析樣品之單體%及DAR。
此實驗之結果顯示於下表J中。詳言之，此等結果指示DPPA可在一鍋過程中在pH 5.0下用作還原劑以製備DAR 2結合物。表 J
反應 還原劑 DPPA當量 單體% SEC DAR
1 DPPA 11 98.12 2.11
2 DPPA 16 97.54 2.07
3 DPPA 22 97.05 2.17
4 DPPA 27 95.72 2.26
針對使用DPPA之一鍋過程之反應溫度篩選
設計此實驗以針對使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DM21-C有效載荷之一鍋過程篩選反應溫度。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應在所指示之溫度下繼續進行4 h。該反應溫度維持於所指示之值下，持續該一鍋過程之持續時間。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM pH 6.5磷酸鉀稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體5.4莫耳當量之DM21-C。在15%之最終DMA濃度下反應持續8 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表K中。基於此等數據，發現該一鍋過程中在18°與27℃之間之溫度不會對DAR及單體%具有影響。表 K
反應 溫度(C) DAR (SEC) 單體%
1 27 1.97 98.46
2 25 1.96 98.47
3 23 1.98 98.46
4 21 2.00 98.45
5 22 2.04 98.52
6 20 2.01 98.44
7 18 2.02 98.56
針對使用DPPA之一鍋過程之pH篩選
設計此實驗以在25℃下針對使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DM21-C有效載荷之一鍋過程篩選反應pH。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至所指示之pH磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h。該反應pH維持於所指示之值下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。適當pH之磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM適當pH之磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體5.4莫耳當量之DM21-C。在15%之最終DMA濃度下反應持續8 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表L中。表 L
反應 pH DAR (SEC) 單體%
1 6.6 1.98 98.43
2 6.5 1.96 98.47
3 6.4 1.99 98.47
4 6.3 1.99 98.53
針對使用DPPA之一鍋過程之膦濃度篩選
設計此實驗以在25℃下在使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DM21-C有效載荷之一鍋過程中篩選膦之量。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體所指示數目之莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體5.4莫耳當量之DM21-C。在15%之最終DMA濃度下反應持續8 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表M中。表 M
反應 DPPA當量 DAR (SEC) 單體%
1 19 2.03 98.44
2 16 1.96 98.47
3 14 1.95 98.43
針對使用DPPA之一鍋過程之DHAA氧化劑濃度篩選
設計此實驗以在25℃下在使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DM21-C有效載荷之一鍋過程中篩選DHAA氧化劑之量。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA所指示倍數之莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體5.4莫耳當量之DM21-C。在15%之最終DMA濃度下反應持續8 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表N中。表 N
反應 DHAA當量(相對於DPPA) DAR (SEC) 單體%
1 1.7 1.96 98.43
2 1.5 1.96 98.47
3 1.4 1.98 98.43
針對使用DPPA之一鍋過程之有效載荷濃度篩選
設計此實驗以在25℃下在使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體之一鍋過程中篩選DM21-C有效載荷之所需量。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體所指示莫耳當量之DM21-C。在15%之最終DMA濃度下反應持續8 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表O中。表 O
反應 DM21-C當量(相對於Ab) DAR (SEC) 單體%
1 5.4 1.96 98.47
2 5.2 1.94 98.48
3 5.0 1.93 98.50
4 4.8 1.96 98.45
5 4.6 1.93 98.46
6 4.3 1.93 98.44
7 4.1 1.92 98.40
8 3.9 2.00 98.52
9 3.7 2.01 98.47
10 3.5 2.01 98.44
針對使用DPPA之一鍋過程之結合反應時間篩選
設計此實驗以在25℃下在使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體之一鍋過程中篩選所需結合反應時間。
關於此反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行此再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體5.4莫耳當量之DM21-C。用於結合反應之最終DMA濃度為15%。藉由在25℃下在儀器樣品室中保持1.5-10.5 h之反應之重複SEC層析反應來監測反應進展。收集SEC單體%及結合物DAR數據且概述於下表P中。表 P
反應 結合時間(h) DAR (SEC) 單體%
1 1.5 1.86 98.58
2 2.5 1.90 98.56
3 3.5 1.93 98.50
4 4.5 1.91 98.52
5 5.5 1.93 98.51
6 6.5 1.95 98.54
7 7.5 1.97 98.53
8 8.5 1.96 98.50
9 9.5 1.95 98.47
10 10.5 1.94 98.46
針對使用DPPA之一鍋過程之有機共溶劑條件篩選
設計此實驗以在25℃之恆定溫度下在使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DHAA氧化劑之一鍋過程之最終結合步驟期間篩選有機共溶劑含量%。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成50 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.1 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在3.7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行8 h，隨後起始結合反應。在用額外50 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在2.8 mg/mL濃度下之抗體5.4莫耳當量之DM21-C。在所指示之最終DMA濃度下反應持續8 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表Q中。表 Q
反應 結合反應DMA含量(%) DAR (SEC) 單體%
1 16 1.97 98.44
2 15 1.96 98.47
3 13 1.98 98.48
4 12 1.97 98.47
5 11 1.97 98.47
6 10 1.96 98.46
7 9 1.96 98.46
針對使用DPPA之一鍋過程之還原反應時間篩選
設計此實驗以在23℃之恆定溫度下針對使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DHAA氧化劑之一鍋過程之還原反應步驟篩選所需時間。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成30 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.5 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行在1 h與5 h之間的所指示時間，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在4.0 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行6 h，隨後起始結合反應。在用額外30 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在3.5 mg/mL濃度下之抗體4.6莫耳當量之DM21-C。在10%之最終DMA濃度下反應持續13 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表R中。表 R
反應 還原時間(h) DAR (SEC) 單體%
1 1 1.96 98.74
2 2 1.97 98.73
3 3 2.00 98.66
4 4 2.05 98.70
5 5 2.03 98.65
針對使用DPPA之一鍋過程之再氧化反應時間篩選
設計此實驗以在23℃之恆定溫度下針對使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DHAA氧化劑之一鍋過程之再氧化反應步驟篩選所需時間。
關於所有反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成30 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用此等抗體溶液來建立在4.5 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行4 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在4.0 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行在1 h與7 h之間的所指示時間，隨後起始結合反應。在用額外30 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在3.5 mg/mL濃度下之抗體4.6莫耳當量之DM21-C。在10%之最終DMA濃度下反應持續13 h之後，經由SEC分析粗反應混合物之單體%及DAR。此等實驗之結果顯示於下表S中。表 S
反應 再氧化時間(h) DAR (SEC) 單體%
1 1 2.02 98.69
2 2 2.05 97.88
3 3 2.03 98.65
4 4 2.01 98.08
5 5 1.97 98.09
6 6 1.98 98.61
7 7 1.96 98.65
針對使用DPPA之一鍋過程之按比例增加條件
設計此實驗以在23℃之恆定溫度下測試以1.2 g抗體規模使用作為還原劑之DPPA、抗ADAM9抗體及DHAA氧化劑之一鍋反應過程之效能。
關於此反應，引入之抗ADAM9抗體(含約25 mg/mL抗體之10 mM乙酸鈉，pH 5.0，具有9%蔗糖)經稀釋至pH 6.5磷酸鉀緩衝液中以生成30 mM之最終磷酸鉀緩衝液濃度。隨後使用該抗體溶液來建立在4.5 mg/mL抗體之最終抗體濃度下的還原反應。相對於該抗體16莫耳當量之DPPA膦添加至具有5%之最終DMA共溶劑濃度之抗體溶液中。使還原反應繼續進行5 h，且反應pH維持於6.5下，持續該一鍋過程之持續時間而無pH調節。經還原抗體溶液接著未經純化即用於建立再氧化反應。在4.0 mg/mL之最終抗體濃度、相對於DPPA 1.5倍莫耳過量之DHAA氧化劑及7%之最終DMA共溶劑濃度下執行再氧化反應。pH 6.5磷酸鉀儲備緩衝液用於反應之稀釋以實現標靶抗體濃度。使再氧化反應繼續進行6 h，隨後起始結合反應。在用額外30 mM pH 6.5磷酸鉀緩衝液稀釋之後，向經再氧化之抗體溶液中添加相對於在3.5 mg/mL濃度下之抗體4.6莫耳當量之DM21-C。在10%之最終DMA濃度下反應持續12 h之後，粗反應混合物經純化且經調配。在反應完成時，均質反應混合物首先經0.5/0.2 um雙層聚醚碸過濾器過濾。在過濾之後，該反應混合物藉由TFF經純化，針對含有9 w/v%蔗糖之10 mM丁二酸鈉pH 4.7緩衝液持續14個置換體積。在回收之後，經緩衝液交換之結合物經0.5/0.2 um雙層聚醚碸過濾器過濾且在具有9 w/v%蔗糖及0.01%聚山梨醇酯-20之10 mM丁二酸鈉pH 4.7中以7 mg/mL結合物之最終濃度經調配。在1.2 g 規模下該過程之總體產率為93%。使用最終結合物之SEC層析測定單體%及DAR分別為98.71%及1.99。實例 5 ：使用 DPPA 之一鍋結合過程及使用 TCEP 之多步驟過程的比較
關於在500 mg抗體規模下之多步驟過程，在37℃下在50 mM pH 7.6磷酸鉀還原緩衝液中以10 mg/mL抗ADAM9抗體及相對於該抗體27 (mol:mol)當量之TCEP執行還原，持續1 h。在還原之後，執行TFF，其中針對50 mM pH 7.6磷酸鉀還原緩衝液透濾持續10個置換體積以移除殘餘膦、氧化膦及含小分子硫醇之封端分子。此經純化、經還原抗體未經進一步處理即用於準備選擇性再氧化反應。在25℃下以7 mg/mL之最終抗體濃度、相對於抗體15 (mol:mol)當量之DHAA及1% (v/v) DMA執行再氧化，持續4 h。在4℃下保留經再氧化之反應溶液隔夜之後，準備使用DM21-C之結合反應，而未對經再氧化之抗體溶液進行任何額外加工。在25 C下在具有相對於該抗體4.4 (mol:mol)當量之DM21-C有效載荷及10% (v/v) DMA之50 mM pH 7.6磷酸鉀中以6 mg/mL之最終抗體濃度執行結合，持續18 h。在結合之後，粗反應混合物藉由TFF經純化，其中針對含有9% (w/v)蔗糖之10 mM丁二酸鈉pH 5.0緩衝液透濾，持續12個置換體積。
關於在500 mg抗體規模下之一鍋過程，在25℃下在25 mM pH 6.0丁二酸鈉緩衝液及5% (v/v) DMA中以12 mg/mL抗ADAM9抗體及相對於該抗體16 (mol:mol)當量之3-(二苯基膦基)丙胺(DPPA)執行還原，持續4 h。粗經還原抗體溶液接著未經純化即轉入選擇性再氧化反應中。在25℃下以10 mg/mL抗體及相對於該抗體16 (mol:mol)當量之DHAA及7.5% (v/v) DMA進行再氧化，持續23 h。粗經再氧化之抗體溶液接著未經純化即轉入結合反應中。在25℃下在具有相對於該抗體5.4 (mol:mol)當量之DM21-C之25 mM pH 6.0丁二酸鈉緩衝液中以8 mg/mL之最終抗體濃度執行結合，持續20 h。在結合之後，粗反應混合物藉由TFF經純化，其中針對含有9% (w/v)蔗糖之10 mM丁二酸鈉pH 5.0緩衝液透濾，持續12個置換體積。
藉由最終結合物之SEC層析來測定兩個反應之單體及DAR值。DAR值係使用該抗體在280 nm下之消光係數、該抗體之252:280 nm吸光度比率及在252 nm下之有效載荷消光係數經計算。此研究之結果在表T中給出。表 T
反應 單體% SEC DAR
多步驟TCEP過程 86.2 1.7
一鍋DPPA過程 98.2 1.9
實例 6 ： 連續一鍋結合過程
端對端整合連續製造運轉經證明用於該一鍋過程。G4723A抗體用於該研究。經證明之運轉係經設計以整合連續攪拌槽反應器(CSTR)及塞流反應器(PFR)，作為概念驗證用於按比例增加該一鍋連續過程。
連續使用CSTR及PFR之優勢係減少總體積需求、改良反應物流之間的混合且增加風險緩解能力(包括較寬滯留時間分佈)。在各反應步驟中針對CSTR及PFR測定反應體積：還原、再氧化及結合。產生各反應之動力學數據且規定各反應之所需標靶轉化。基於此等結果，各反應之CSTR及PFR體積係基於所用管之內徑及實現各反應步驟之所需滯留時間所需的體積流動速率經規定。連續一鍋結合過程之反應示意圖顯示於圖5中。
首先，以50 mg/mL經調配之經調配G4723A抗體用30 mM磷酸鉀pH 6.5稀釋至4 mg/mL之標靶還原反應濃度。此進料流藉由蠕動幫浦經進給至還原CSTR中。平行地，在DMA中以8.77 mM製備之DPPA儲備溶液藉由注射幫浦經進給至還原CSTR中。此兩個進料流之體積流動速率經設定以致該還原反應在16倍莫耳過量之DPPA:Ab下實現4.0 mg/mL濃度。另外，該還原反應中之DMA之體積濃度為5% (v/v)。
使用蠕動幫浦以與進入還原反應CSTR中之組合流動速率(由Ab及DPPA進料流構成)相同之體積流動速率自還原反應CSTR抽出材料。進入及離開CSTR之流動速率經匹配以使還原反應CSTR之液體水準及滯留時間保持恆定用於穩態操作。自還原反應CSTR抽取之材料經進給通過還原PFR。用於PFR之管之長度係基於標靶所需反應轉化經確定。使用標靶轉化來設定滯留時間且通過PFR之總體積流動速率係經測定以針對PFR反應器設定固定長度。該還原PFR經浸沒於控制溫度之水浴中以確保反應溫度始終恆定。
該還原PFR以與藉由蠕動幫浦自還原CSTR反應器抽出之材料相同之體積流動速率直接地經進給至再氧化CSTR中。此進料流與在DMA中製備之DHAA儲備溶液混合，該DHAA儲備溶液亦藉由注射幫浦經進給至再氧化CSTR。該DHAA儲備溶液在DMA中以55 mM製備且經進給至反應器中以致再氧化反應之最終反應參數為：3.9 mg/mL抗體濃度、24倍莫耳過量之DHAA:Ab及6.5% DMA (v/v)。
進入再氧化CSTR中之兩個進料流的組合流動速率係經測定且用於設定用於以相同流動速率自再氧化CSTR移出材料之額外蠕動幫浦之體積流動速率。與還原CSTR相似，選擇進入及離開CSTR之經匹配流動速率，以致液體水準及滯留時間在穩態操作期間為一致的。藉由幫浦自再氧化CSTR移出之材料直接地經進給至再氧化PFR中。再氧化反應PFR設計方法與先前論述之還原PFR相同。基於動力學數據之所需反應轉化設定反應滯留時間。此滯留時間與通過再氧化反應之體積流動速率相結合用於計算PFR設計準則。該再氧化PFR亦浸沒(與還原PFR相似)於溫度控制之水浴中。
再氧化反應PFR之輸出直接地經進給至結合CSTR中。DM21-C儲備溶液在DMA中以3.20 mM製備且藉由注射幫浦添加至結合CSTR中。該兩個入口流在CSTR中混合，使最終反應條件達到3.8 mg/mL抗體濃度、4.6莫耳過量之DM21:Ab及10% DMA (v/v)。蠕動幫浦以再氧化反應及DM21-C儲備溶液之組合體積流動速率移出結合反應混合物。此蠕動幫浦匹配該流動速率以維持該容器中之液體水準且直接地經進給至結合反應PFR中。該結合反應PFR基於動力學反應數據靶向反應轉化。使用此標靶轉化來定義滯留時間。使用結合之滯留時間及體積流動速率來定義結合PFR之條件。與還原及再氧化PFR兩者相似，該結合反應PFR浸沒於溫度控制之水浴中。
該結合反應PFR溶離未純化之結合反應混合物。此流經進給至逆流TFF純化單元中。引入之粗反應係在大約3.8 mg/mL之濃度及10% DMA (v/v)下。透濾緩衝液(10 mM丁二酸鈉、9% (w/v)蔗糖，pH 4.7)之流與引入的未純化之結合反應混合物組合以稀釋引入之進料流。此進料流與來自如圖6所示之模塊2之滲透物流組合，從而進一步稀釋進入模塊1之結合物的進料濃度。關於模塊1及模塊2，使用Pall Cadence在線濃縮器(ILC)膜。
來自模塊1之滲餘物直接地經進給至模塊2中。DF緩衝液之額外進料在模塊2之入口前面與來自模塊1之滲餘物組合。來自模塊1之滲透物經選路以廢棄處置。自模塊2之滲餘物回收經純化結合物。來自模塊2之滲透物經再循環且與如上文所述之模塊1之進料組合(參見圖6)。此逆流設置有效地自粗反應混合物移除雜質且將該結合物緩衝液交換至DF緩衝液中。為了在逆流TFF純化期間確保有效載荷雜質之移除，藉由游離藥物方法表徵TFF前及經純化樣品。結果顯示該兩個單元中來自引入之未純化進料流之雜質的高度有效移除(＞99%)。最終經純化結合物關於連續運轉及分批控制之結果顯示於表S中。表 S ： 整合 DS 製造運轉之產物品質概述
產物品質屬性 連續結合 ( 逆流 TFF) 分批控制 (NAP 純化 )
HMW (%，藉由SEC) 0.3 0.3
單體(%，藉由SEC) 99.7 99.7
游離藥物移除(%) 99.89 N/A
經純化游離藥物(ug/mL) ＜LOQ N/A
DAR (藉由UV) 1.95 N/A
DAR (藉由SEC-MS) 1.9 N/A
粗反應DAR (藉由SEC) 2.0 2.1
HL (%，藉由Gel Chip) 3 4
H2L2 (%，藉由Gel Chip) 81 82
實例 7. 在惰性氛圍下之一鍋結合過程
為了測試在N2 淨化系統中執行整個一鍋結合過程之影響以較佳模擬GMP製造期間之預期條件。還原及再氧化反應之效能係藉由比較在N2 下及在正常空氣氛圍下之一致反應經測試。在4.5 mg/mL抗體濃度下在具有5% DMA之pH 6.5 30 mL磷酸鉀中執行還原。該反應用16當量之DPPA建立且在23℃下執行5小時。在4.0 mg/mL抗體濃度下在具有7% DMA之pH 6.5 30 mM磷酸鉀中執行再氧化。該反應用24當量之DHAA建立且在23℃下執行6小時。在3.5 mg/mL抗體濃度下在具有10% DMA之pH 6.5 30 mM磷酸鉀中執行結合。該反應用4.6當量之DM21-C建立且在23℃下執行12小時。在EasyMax系統中建立在175 mg規模下之兩個反應，其中內部溫度控制至23.0℃且以70 rpm進行頂部混合。一個反應之頂部空間連續地經N2 淨化，持續該實驗之持續時間。另外，關於此反應，水及30 mM磷酸鉀緩衝溶液經N2 鼓泡持續15-30分鐘，接著將其添加至該反應中。
如表T所示，在經氮氣淨化之系統中運轉該反應與使結合反應容器向大氣開放之間未存在顯著差異。在氮氣下之反應運轉之所有分析數據(SEC單體、SEC DAR、HIC DAR、GelChip)均與使用相同原材料之對照及先前按比例增加運轉一致。
表 T. 產物品質之概述
N2反應(粗物質) 空氣反應(粗物質) 先前按比例增加運轉*
SEC DAR 2.04 2.01 2.04
HIC DAR 1.98 1.97 1.98
單體% 98.35 98.35 98.71
HMW% 1.47 1.54 1.22
LMW% 0.18 0.11 0.07
D0% 未發現 未發現 0.02
D1% 2.56 2.96 2.82
D2% 97.32 97.04 96.90
D4% 0.12 未發現 0.26
HL% 6.18 5.14 5.84
H2L2% 78.36 80.92 78.54
總體產率% NA NA 93.60
*先前按比例增加運轉使用與此處所述之反應相同之Ab批次、DPPA及有效載荷批次
圖 1 顯示所用之氧化劑DHAA及還原劑2-二苯基膦基乙胺的量對DAR之影響。
圖 2 顯示針對TCEP還原之反應時間及溫度對DAR之影響。
圖 3 顯示針對TCEP還原之反應時間及溫度對單體百分率之影響。
圖 4 顯示用於還原反應之TCEP的量對DAR之影響。
圖 5 顯示用於實例5中描述之CD123靶向性抗體藥物結合物(ADC)之整合連續製造過程。Ab係指抗CD123單株抗體G4723A。
圖 6 顯示用於實例5中描述之CD123靶向性ADC之整合製造過程的逆流TFF純化。
圖 7 顯示在線過程自動化技術(PAT)之使用可如何用於增加控制及可偵測性。
圖 8 顯示可能用於在升高溫度下脈衝化結合反應之加熱及冷卻反應器的示意圖。在脈衝反應器(標記為「PR」)中，夾套溫度升高，使得含於線圈內之反應組分暫時地經加熱以誘導短暫溫度漂移。接著，在冷卻反應器(標記為「CR」)中，夾套溫度保持在較冷溫度下以使線圈內之反應組分自升高溫度冷卻下來。此可減少反應期間出現之聚集之量。滯留時間反應器(RTR)維持在脈衝完成之後所需的反應溫度，且其體積可基於所需反應時間。
Figure 109109506-A0101-11-0001-1

Claims (239)

  1. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物之方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中該未配對半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysCBA與式(I)化合物：
    Figure 03_image003
    (I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物，其中步驟(a)中之該經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；且步驟(b)中之該CysCBA未經純化即用於步驟(c)，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
  2. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中該未配對半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysCBA與式(I)化合物：
    Figure 03_image003
    (I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物， 其中步驟(a)中之該經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；步驟(b)中之該CysCBA未經純化即用於步驟(c)，且選自步驟(a)至(c)之任一或多個步驟係連續地執行，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
  3. 如請求項2之方法，其中步驟(a)至(c)係連續地執行。
  4. 一種製備細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該細胞結合劑-細胞毒性劑結合物(ADC)包含具有共價連接至細胞毒性劑的一或多個未配對半胱胺酸殘基之細胞結合劑(CysCBA)，其中該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個未配對半胱胺酸殘基之經封端細胞結合劑(cCysCBA)反應以形成經還原細胞結合劑，其中該封端劑經移除以在該經還原細胞結合劑中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原細胞結合劑與選擇性氧化劑反應以形成該CysCBA，其中該未配對半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysCBA與式(I)化合物：
    Figure 03_image003
    (I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該結合物；及 (d) 移除未結合之式(I)化合物； 其中步驟(a)中之該經還原細胞結合劑未經純化即用於步驟(b)；步驟(b)中之該CysCBA未經純化即用於步驟(c)，選自步驟(a)至(d)之任一或多個步驟係連續地執行；且其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
  5. 如請求項4之方法，其中步驟(a)至(d)係連續地執行。
  6. 如請求項4或5之方法，其中該方法進一步包括步驟(e)將該結合物交換至穩定緩衝液中。
  7. 如請求項6之方法，其中步驟(e)係連續地執行。
  8. 如請求項4至7中任一項之方法，其中使用單程切向流過濾(SPTFF)及/或逆流透濾來移除該未結合之式(I)化合物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  9. 如請求項2至8中任一項之方法，其中在步驟(a)中，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物之後，該cCysCBA及/或該還原劑連續地添加至反應容器中。
  10. 如請求項9之方法，其中該cCysCBA及該還原劑連續地添加至該反應容器中，同時該反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  11. 如請求項10之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該還原劑及該cCysCBA之組合流動速率相同。
  12. 如請求項2至11中任一項之方法，其中在步驟(b)中，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物之後，該經還原細胞結合劑及該選擇性氧化劑連續地添加至反應容器中。
  13. 如請求項12之方法，其中該經還原細胞結合劑及該選擇性氧化劑連續地添加至該反應容器中，同時該反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  14. 如請求項13之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該經還原細胞結合劑及該選擇性氧化劑之組合流動速率相同。
  15. 如請求項2至14中任一項之方法，其中在步驟(c)中，當該反應繼續進行時及在已形成至少一種產物之後，該CysCBA及該式(I)化合物連續地添加至反應容器中。
  16. 如請求項15之方法，其中該CysCBA及該式(I)化合物連續地添加至反應容器中，該反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  17. 如請求項16之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該CysCBA及該式(I)化合物之組合流動速率相同。
  18. 如請求項9至17中任一項之方法，其中該反應容器為連續攪拌槽反應器(CSTR)。
  19. 如請求項10、11、13、14及16至18中任一項之方法，其中該流式反應器為塞流反應器(PFR)。
  20. 如請求項3至19中任一項之方法，其中使用單程切向流過濾(SPTFF)來移除該未結合之藥物。
  21. 如請求項3至19中任一項之方法，其中使用逆流透濾來移除該未結合之藥物。
  22. 如請求項6至21中任一項之方法，其中使用SPTFF及/或逆流透濾將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該CysCBA係經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段且該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與具有經封端劑封端之一或多個經工程改造之半胱胺酸殘基之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)或其抗原結合片段反應以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成該CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與該式(I)化合物：
    Figure 03_image003
    (I) 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)，其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)；且步驟(b)中之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，其中： D為細胞毒性劑；且 L為連接體。
  24. 如請求項1或23之方法，其中該等步驟(a)、(b)及(c)係在同一反應容器中進行。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)或其抗原結合片段中之一或多個鏈間二硫鍵係在步驟(a)中經還原。
  26. 如請求項25之方法，其中該一或多個鏈間二硫鍵係在步驟(b)中再形成。
  27. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該還原劑為參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、參羥基丙基膦(THPP)、參(2-氰基乙基)膦、二硫蘇糖醇(DTT)、二環己基膦基)苯磺酸、雙(對磺酸根基苯基)苯基膦、(二苯基膦基)苯磺酸、(二苯基膦基)苯甲酸、三氟甲磺酸2-(二苯基膦基)-N,N,N-三甲基苯甲基銨、(二苯基膦基)乙胺、2-(二異丙基膦基)乙胺或3-(二苯基膦基)丙胺(DPPA)。
  28. 如請求項27之方法，其中該還原劑為TCEP或DPPA。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中該氧化劑為去氫抗壞血酸(DHAA)、硫酸銅、氧氣或空氣。
  30. 如請求項29之方法，其中該氧化劑為DHAA。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中步驟(a)之反應係在5.0與8.5之間的pH下進行。
  32. 如請求項31之方法，其中步驟(a)之反應係在6.0與7.5之間的pH下進行。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中步驟(b)之反應係在5.0與8.5之間的pH下進行。
  34. 如請求項33之方法，其中步驟(b)之反應係在6.0與7.5之間的pH下進行。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中步驟(c)之反應係在5.0與8.5之間的pH下進行。
  36. 如請求項35之方法，其中步驟(c)之反應係在6.0與7.5之間的pH下進行。
  37. 如請求項1至34中任一項之方法，其中步驟(c)之反應係在5.5與6.5之間的pH下進行。
  38. 如請求項37之方法，其中步驟(c)之反應係在pH 6.0下進行。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該方法進一步包括在步驟(c)中使該CysCBA與該細胞毒性劑反應之前調節步驟(b)之後的該反應混合物之pH。
  40. 如請求項1至38中任一項之方法，其中步驟(b)之後的該反應混合物之pH未在步驟(c)中使該CysCBA與該細胞毒性劑反應之前經調節。
  41. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該還原劑為TCEP且步驟(a)之反應係在6.0與8.0之間的pH下進行。
  42. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該還原劑為TCEP且步驟(a)之反應係在pH 7.5下進行。
  43. 如請求項41或42之方法，其中該氧化劑為DHAA且步驟(b)之反應係在pH 7.5下進行。
  44. 如請求項41至43中任一項之方法，其中步驟(b)之後的該反應混合物之pH係在步驟(c)中使該CysCBA與該細胞毒性劑反應之前自pH 7.5經調節至pH 6.0。
  45. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該還原劑為DPPA且步驟(a)之反應係在6.0與8.0之間的pH下進行。
  46. 如請求項1至26中任一項之方法，其中該還原劑為DPPA且步驟(a)之反應係在pH 6.5下進行。
  47. 如請求項45或46之方法，其中該氧化劑為DHAA且步驟(b)之反應係在pH 6.5下進行。
  48. 如請求項1至47中任一項之方法，其中該結合物係藉由切向流過濾(TFF)、吸附層析、非吸附層析、吸附過濾、選擇性沈澱或其組合經純化。
  49. 如請求項48之方法，其中該結合物係藉由切向流過濾經純化。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中相對於該cCysCBA過量之該還原劑用於步驟(a)中。
  51. 如請求項50之方法，其中該還原劑與其cCysCBA之莫耳比率係在1:1與50:1之間、2:1與30:1之間或5:1與25:1之間。
  52. 如請求項51之方法，其中該還原劑與其cCysCBA之莫耳比率係在15:1與20:1之間。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中步驟(a)中之該還原劑與步驟(b)中之該氧化劑的莫耳比率係在2:1與1:2之間。
  54. 如請求項53之方法，其中該還原劑與該氧化劑之莫耳比率係在1.2:1與1:1.5之間。
  55. 如請求項53之方法，其中該還原劑與該氧化劑之莫耳比率係在1:1與1:1.5之間。
  56. 如請求項55之方法，其中該還原劑與該氧化劑之莫耳比率為1:1。
  57. 如請求項55之方法，其中該還原劑與該氧化劑之莫耳比率為1:1.5。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法，其中相對於其CysCBA過量之該式(I)化合物用於步驟(c)中。
  59. 如請求項58之方法，其中對於每一當量之CysCBA，使用2與5之間莫耳當量的該式(I)化合物。
  60. 如請求項23至59中任一項之方法，其中該CysAb係在一或多個位置處具有經工程改造之半胱胺酸殘基的抗體，該一或多個位置選自該抗體之重鏈的EU/OU編號位置40、43、84、88、103、112、113、114、115、131、132、133、134、135、136、137、138、139、161、168、172、234、235、236、237、238、239、244、245、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、260、262、265、267、270、272、274、279、280、282、283、284、285、286、288、289、293、295、297、298、303、305、307、308、309、311、312、313、314、315、316、317、318、325、326、327、328、329、330、332、334、338、339、340、341、343、345、360、361、362、375、376、377、378、380、382、384、385、386、387、389、390、391、413、422、423、424、427、428、430、431、433、434、435、436、437、438、440、442、443及446。
  61. 如請求項23至59中任一項之方法，其中該CysAb為如下抗體，其在該抗體之重鏈之EU/OU編號位置442處具有經工程改造之半胱胺酸殘基。
  62. 如請求項61之方法，其中該CysAb係在兩條重鏈之EU/OU編號位置442處均具有經工程改造之半胱胺酸殘基的抗體。
  63. 如請求項1至62中任一項之方法，其中該封端劑為半胱胺酸、高半胱胺酸、麩胱甘肽或其組合。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該結合物之大於95%、96%、97%、98%、99%或99.5%為單體。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中D為苯并二氮呯化合物。
  66. 如請求項1至64中任一項之方法，其中D為類美登素化合物。
  67. 如請求項1至64中任一項之方法，其中D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image112
    (D-IA)；
    Figure 03_image114
    (D-IB)；
    Figure 03_image116
    (D-IC)；或
    Figure 03_image274
    (D-ID)； 其中： N與C之間的雙線
    Figure 03_image022
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； L’、L’’及L’’’之一係由下式表示： -Z1 -P1 -Z2 -Rx1 -C(=O)-             (A’)，或 -N(Re )-Rx1 -C(=O)-    (D’)； 且另兩者各自獨立地選自-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、鹵素、胍鹽[-NH(C=NH)NH2 ]、-OR、-NR’R’’、-NO2 、-NR’COR’’、-SR、-SOR’、-SO2 R’、-SO3 H、-OSO3 H、-SO2 NR’R’’、氰基、疊氮基、-COR’、-OCOR’及-OCONR’R’’； Z1 及Z2 之一為-C(=O)-，且另一者為-NR5 -； P1 為胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽； Rx1 為視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基； Re 為-H、直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基或-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ，其中Rk 為-H、具有1至6個碳原子、視情況攜帶二級胺基(例如-NHR101 )或三級胺基(-NR101 R102 )之直鏈、分支鏈環狀烷基、或5員或6員含氮雜環，其中R101 及R102 各自獨立地為直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基； R在每次出現時係獨立地選自由-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環或視情況經取代的含有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環組成之群； R’及R’’係各自獨立地選自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2 、-COR、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 及視情況經取代的具有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環； Rc 為-H或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基； n為整數1至24； X1 係選自-H、胺保護基、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環及視情況經取代的含有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環； Y1 係選自-H、側氧基、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、視情況經取代之6員至18員芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環、視情況經取代的具有1至6個雜原子之3員至18員雜環； R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係各自獨立地選自由-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、鹵素、胍鹽[-NH(C=NH)NH2 ]、-OR、-NR’R’’、-NO2 、-NCO、-NR’COR’’、-SR、-SOR’、-SO2 R’、-SO3 - H、-OSO3 H、-SO2 NR’R’’、氰基、疊氮基、-COR’、-OCOR’及-OCONR’R’’組成之群； R6 為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2 或鹵素； G為-CH-或-N-； A及A’為相同或不同的，且係獨立地選自-O-、側氧基(-C(=O)-)、-CRR’O-、-CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5 及-CRR’N(R5 )-；且 R5 在每次出現時獨立地為-H或視情況經取代之直鏈或分支鏈烷基。
  68. 如請求項67之方法，其中D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image001
    (D-IA)。
  69. 如請求項67或68之方法，其中X1 為-H、-OH、(C1 -C3 )烷基、鹵基(C1 -C3 )烷基或苯基；且Y1 ’為-H、側氧基、(C1 -C3 )烷基或鹵基(C1 -C3 )烷基。
  70. 如請求項69之方法，其中X1 為-H、-OH或-Me；且Y1 為-H或側氧基。
  71. 如請求項69之方法，其中X1 為-H；且Y1 為-H。
  72. 如請求項67至71中任一項之方法，其中A及A’為相同或不同的，且係選自-O-及-S-。
  73. 如請求項72之方法，其中A及A’為-O-。
  74. 如請求項67至73中任一項之方法，其中R6 為-OMe。
  75. 如請求項67至74中任一項之方法，其中R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’係獨立地為-H、鹵素、-NO2 、-OH、(C1 -C3 )烷基、鹵基(C1 -C3 )烷基或(C1 -C3 )烷氧基。
  76. 如請求項75之方法，其中R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’均為-H。
  77. 如請求項67至76中任一項之方法，其中R、R’、R”及R5 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基。
  78. 如請求項67或68之方法，其中： R1 、R2 、R3 、R4 、R1 ’、R2 ’、R3 ’及R4 ’均為-H； R6 為-OMe； X1 及Y1 均為-H；且 A及A’為-O-。
  79. 如請求項67至78中任一項之方法，其中L’、L’’及L’’’之一係由式(A’)或(D’)表示，且其餘為-H、具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基、鹵素、-OH、(C1 -C6 )烷氧基或-NO2 。
  80. 如請求項79之方法，其中L’係由式(A’)表示；且L’’及L’’’均為-H。
  81. 如請求項79之方法，L’係由式(D’)表示；且L’’及L’’’均為-H。
  82. 如請求項67至81中任一項之方法，其中Rx1 為具有1至6個碳原子之直鏈、分支鏈或環狀烷基，其視情況經鹵素、-OH、(C1 -C3 )烷基、(C1 -C3 )烷氧基、鹵基(C1 -C3 )烷基或帶電取代基或可離子化基團Q取代。
  83. 如請求項67至82中任一項之方法，其中L’係由下式表示： -NR5 -P1 -C(=O)-(CRa Rb )s -C(=O)- (B1’)； -NR5 -P1 -C(=O)-Cy-(CRa Rb )s1’ -C(=O)-       (B2’)； -C(=O)-P1 -NR5 -(CRa Rb )s -C(=O)- (C1’)，或 -C(=O)-P1 -NR5 -Cy-(CRa Rb )s1’ -C(=O)-       (C2’) 其中： Ra 及Rb 在每次出現時各自獨立地為-H、(C1 -C3 )烷基或帶電取代基或可離子化基團Q； s為整數1至6； s1’為0或整數1至6；且 Cy為具有5或6個環碳原子之環狀烷基，其視情況經鹵素、-OH、(C1 -C3 )烷基、(C1 -C3 )烷氧基或鹵基(C1 -C3 )烷基取代。
  84. 如請求項83之方法，其中式(B2’)及(C2’)中之Cy為環己烷；且s1’為0或1。
  85. 如請求項83之方法，其中D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image121
    (D-IE)。
  86. 如請求項83至85中任一項之方法，其中Ra 及Rb 均為H；且R5 為H或Me。
  87. 如請求項67至85中任一項之方法，其中該帶電取代基或可離子化基團Q為i) -SO3 H、-Z’-SO3 H、-OPO3 H2 、-Z’-OPO3 H2 、-PO3 H2 、-Z’-PO3 H2 、-CO2 H、-Z’-CO2 H、-NR11 R12 或-Z’-NR11 R12 或其醫藥學上可接受之鹽；或者，ii) -N+ R14 R15 R16 X- 或-Z’-N+ R14 R15 R16 X- ；Z’為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸環烷基或視情況經取代之伸苯基；R14 至R16 各自獨立地為視情況經取代之烷基；且X- 為醫藥學上可接受之陰離子。
  88. 如請求項87之方法，其中Q為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  89. 如請求項67至88中任一項之方法，其中P1 為含有2至10個胺基酸殘基之肽。
  90. 如請求項89之方法，其中P1 為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  91. 如請求項89或90之方法，其中P1 為可藉由蛋白酶裂解之肽。
  92. 如請求項89之方法，其中P1 為可藉由在腫瘤組織中表現之蛋白酶裂解之肽。
  93. 如請求項67至88中任一項之方法，其中P1 為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 56)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 58)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe及Gln-Ala。
  94. 如請求項93之方法，其中P1 為Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala或D-Ala-D-Ala。
  95. 如請求項67之方法，其中D係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image123
    (D1)；
    Figure 03_image125
    (D2)；
    Figure 03_image127
    (D3)；或
    Figure 03_image129
    (D4)， 其中N與C之間的雙線
    Figure 03_image022
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H；且當其為單鍵時，X為-H，Y為-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  96. 如請求項67至95中任一項之方法，其中-L-係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image131
    (L-I)， 其中： s1為共價連接至D之位點；s2為共價連接至順丁烯二醯亞胺基之位點； R23 及R24 在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基； m’為0與10之間的整數；且 Rh’ 為H或視情況經取代之烷基。
  97. 如請求項96之方法，其中R23 及R24 均為H；且m’為1與6之間的整數。
  98. 如請求項96或97之方法，其中Rh ’為H。
  99. 如請求項96之方法，其中L係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image133
    (L1)。
  100. 如請求項67至99中任一項之方法，其中該醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽或鉀鹽。
  101. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image135
    (I1)，或
    Figure 03_image137
    (I2)。
  102. 如請求項101之方法，其中該化合物係由下式表示：
    Figure 03_image139
    (I3)。
  103. 如請求項1至64中任一項之方法，其中D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image141
    (D-IIA)；
    Figure 03_image143
    (D-IIB)；
    Figure 03_image145
    (D-IIC)；或
    Figure 03_image147
    (D-IID)， 其中： N與C之間的雙線
    Figure 03_image022
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H或(C1 -C4 )烷基；且當其為單鍵時，X為-H或胺保護部分，Y為-OH或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽； X’係選自由-H、-OH、經取代或未經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、苯基及胺保護基組成之群； Y’係選自由-H、側氧基、經取代或未經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基組成之群； A及A’係選自-O-及-S-； W’不存在，或係選自-O-、-N(Re )-、-N(Re )-C(=O)-、-N(C(=O)Re )-、-S-或-CH2 -S-、-CH2 NRe -； Rx 不存在或係選自直鏈、分支鏈或環狀烷基； Re 為-H、直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基或-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ，其中Rk 為-H、具有1至6個碳原子、視情況攜帶二級胺基(例如-NHR101 )或三級胺基(-NR101 R102 )之直鏈、分支鏈環狀烷基、或5員或6員含氮雜環，其中R101 及R102 各自獨立地為直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基； n為整數1至24； G係選自-CH-或-N-； R6 為-H、-R、-OR、-SR、-NR’R’’、-NO2 或鹵素；且 R在每次出現時係獨立地選自由-H、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 、視情況經取代的具有6至18個碳原子之芳基、視情況經取代的含有獨立地選自氮、氧及硫之一或多個雜原子之5員至18員雜芳基環或視情況經取代的含有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環組成之群； R’及R’’係各自獨立地選自-H、-OH、-OR、-NHR、-NR2 、-COR、視情況經取代之直鏈、分支鏈或環狀烷基、烯基或炔基、聚乙二醇單元-(CH2 CH2 O)n -Rc 及視情況經取代的具有獨立地選自O、S、N及P之1至6個雜原子之3員至18員雜環； Rc 為-H或視情況經取代的具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。
  104. 如請求項103之方法，其中D係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image292
    (D-IIA)。
  105. 如請求項103或104之方法，其中： X’及Y’均為-H； A及A’均為-O-； R6 為-OMe； W’為-N(Re )-或-N(Re )-C(=O)-； Re 為-H、具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基或-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ，其中Rk 為-H、具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基； n為整數2至6；且 Rx 為具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。
  106. 如請求項103之方法，其中D係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image149
    (D-IIE)，或
    Figure 03_image151
    (D-IIF)， 其中： Re1 為H或(C1 -C6 )烷基； Rxa 為(C1 -C6 )烷基； Re2 為-(CH2 -CH2 -O)n -Rk ； n為整數2至6； Rk 為-H或-Me；且 Rxb 為(C1 -C6 )烷基。
  107. 如請求項106之方法，其中D係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image153
    (D5)。
  108. 如請求項1至64中任一項之方法，其中D係由下式表示：
    Figure 03_image155
    (D-III)， 其中m’為1或2；且R1 及R2 各自獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基。
  109. 如請求項108之方法，其中D係由下式表示：
    Figure 03_image157
    (D-IIIA)。
  110. 如請求項103至109中任一項之方法，其中L係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image159
    (L-II)， 其中： s1為共價連接至D之位點，且s2為共價連接至順丁烯二醯亞胺基之位點； E為-(CR10 R11 )q -、環烷基或環烷基烷基； Z係不存在、-SO2 NR9 -、-NR9 SO2 -、-C(=O)-NR9 -、-NR9 -C(=O)-、-C(=O)-O-、-O-C(=O)-、-C(=O)-NR9 -(CH2 CH2 O)p -、-NR9 -C(=O)-(CH2 CH2 O)p -、-(OCH2 CH2 )p -C(=O)NR9 -或-(OCH2 CH2 )p -NR9 -C(=O)-； p為整數1至24； Q為H、帶電取代基或可離子化基團； R9 、R10 、R11 、R12 及R13 在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基；且 q及r在每次出現時獨立地為0與10之間的整數。
  111. 如請求項110之方法，其中E為-(CR10 R11 )q -。
  112. 如請求項111之方法，其中E為
    Figure 03_image161
    。
  113. 如請求項110至112中任一項之方法，其中Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-。
  114. 如請求項110之方法，其中L係由以下結構式表示：
    Figure 03_image163
    (L-IIA)， 其中R9 、R10 、R11 、R12 及R13 在每次出現時獨立地為-H或(C1 -C3 )烷基。
  115. 如請求項110至114中任一項之方法，其中R9 為-H。
  116. 如請求項110至115中任一項之方法，其中Q’為： i) H； ii) -SO3 H、-Z’-SO3 H、-OPO3 H2 、-Z’-OPO3 H2 、-PO3 H2 、-Z’-PO3 H2 、-CO2 H、-Z’-CO2 H、-NR11 R12 或-Z’-NR14 R15 或其醫藥學上可接受之鹽；或者， iii) -N+ R14 R15 R16 X- 或-Z’-N+ R14 R15 R16 X- ； Z’為視情況經取代之伸烷基、視情況經取代之伸環烷基或視情況經取代之伸苯基； R14 、R15 及R16 各自獨立地為視情況經取代之烷基；且 X- 為醫藥學上可接受之陰離子。
  117. 如請求項116之方法，其中Q’為H或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽。
  118. 如請求項110至117中任一項之方法，其中R9 、R10 、R11 、R12 及R13 均為H；且q及r各自獨立地為1與6之間的整數。
  119. 如請求項114之方法，其中： R12 及R13 在每次出現時各自獨立地為H或(C1 -C3 )烷基； Q為H或-SO3 H或其醫藥學上可接受之鹽 Z為-C(=O)-NR9 -或-NR9 -C(=O)-； R9 為H或(C1 -C3 )烷基； R10 及R11 在每次出現時獨立地為H或(C1 -C3 )烷基；且 q及r各自為整數1至5。
  120. 如請求項119之方法，其中L係由以下結構式中之任一者或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image165
    (L2)，及
    Figure 03_image167
    (L3)。
  121. 如請求項103至109中任一項之方法，其中L係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image169
    (L-III)， 其中： s1為共價連接至D之位點；s2為共價連接至順丁烯二醯亞胺基之位點； R19 、R20 、R21 及R22 在每次出現時獨立地為H或視情況經取代之烷基； u及v各自獨立地為0與10之間的整數； Rh 為H或視情況經取代之烷基； PL 為視情況經取代之伸烷基、-(CH2 -CH2 -O)j - (其中氧原子連接至與PL 連接之-(C=O)-基團)、胺基酸殘基或含有2至20個胺基酸殘基之肽；且 j為整數1至24。
  122. 如請求項121之方法，其中R19 、R20 、R21 及R22 各自為H；且u及v各自獨立地為1與6之間的整數。
  123. 如請求項121或122之方法，其中PL 為胺基酸殘基或含有2至10個胺基酸殘基之肽。
  124. 如請求項123之方法，其中PL 為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  125. 如請求項110之方法，其中PL 係選自由以下組成之群：Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Cit-Val. Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:55)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:56)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:57)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala.、Ala-Met、Met-Ala、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Val-Cit、Ala-Val-Ala及β-Ala-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:58)。
  126. 如請求項125之方法，其中PL 為Gly-Gly-Gly、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Val-Ala或β-Ala-Gly-Gly-Gly。
  127. 如請求項121之方法，其中L係由以下結構式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image171
    (L4)。
  128. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image173
    (I4)；或
    Figure 03_image175
    (I5)。
  129. 如請求項128之方法，其中該化合物係由下式表示：
    Figure 03_image177
    (I6)。
  130. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image179
    (I7)；
    Figure 03_image181
    (I8)；或
    Figure 03_image183
    (I9)； 其中DM係由下式表示之藥物部分：
    Figure 03_image185
    。
  131. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽呈現：
    Figure 03_image187
    (I-a)， 其中： L2 ’ 為攜帶順丁烯二醯亞胺部分之間隔體； A為胺基酸或包含2至20個胺基酸之肽； R1A 及R2A 各自獨立地為H或C1-3 烷基； L1 為間隔體；且 D-L1 -SH為細胞毒性劑。
  132. 如請求項131之方法，其中R1A 及R2A 中之至少為H。
  133. 如請求項131之方法，其中R1A 及R2A 各自獨立地為H或Me。
  134. 如請求項131之方法，其中R1A 及R2A 中之一者為H；且另一者為Me。
  135. 如請求項133之方法，其中R1A 及R2A 均為H。
  136. 如請求項131至135中任一項之方法，其中L1 為-L1 ’-C(=O)-；且L1 ’為伸烷基或伸環烷基。
  137. 如請求項136之方法，其中L1 ’為C1-10 伸烷基。
  138. 如請求項137之方法，其中L1 為-CR3A R4A -(CH2 )1-8 -C(=O)-；R3A 及R4A 各自獨立地為H或Me。
  139. 如請求項138之方法，其中L1 為-CR3A R4A -(CH2 )3-5 -C(=O)-。
  140. 如請求項138或139之方法，其中R3A 及R4A 均為Me。
  141. 如請求項139之方法，其中L1 為-(CH2 )4-6 -C(=O)-。
  142. 如請求項131至141中任一項之方法，其中L2 ’係由以下結構式表示：
    Figure 03_image189
    ； 其中： RA 為伸烷基、環烷基伸烷基或伸芳基； RB 及RC 係各自獨立地不存在、伸烷基、伸環烷基或伸芳基； V及V’各自獨立地為-(O-CH2 -CH2 )p1 -或-(CH2 -CH2 -O)p1 -； p1為0或整數1至10； W係不存在、
    Figure 03_image191
    、
    Figure 03_image193
    或
    Figure 03_image195
    ，其中s2’指示連接至V、RA 或JCB ’之位點且s3’指示連接至RB 、V’、RC 或JA 之位點； JCB ’ 為
    Figure 03_image197
    ；且 JA 為-C(=O)-。
  143. 如請求項142之方法，其中p1為0且RC 不存在。
  144. 如請求項131至142中任一項之方法，其中L2 ’係由以下結構式表示：
    Figure 03_image199
    (L2a’)；或
    Figure 03_image201
    (L2b’)， 其中： Rx 及Ry 在每次出現時獨立地為H、-OH、鹵素、-O-(C1-4 烷基)、-SO3 H、-NR40 R41 R42 + 或視情況經-OH、鹵素、-SO3 H或NR40 R41 R42 + 取代之C1-4 烷基，其中R40 、R41 及R42 各自獨立地為H或C1-4 烷基； l及l1各自獨立地為整數1至10； k1為整數1至12。
  145. 如請求項144之方法，其中Rx 及Ry 均為H。
  146. 如請求項144或145之方法，其中l及l1各自為整數2至6。
  147. 如請求項131至146中任一項之方法，其中A為可藉由蛋白酶裂解之肽。
  148. 如請求項126之方法，其中A為可藉由在腫瘤組織中表現之蛋白酶裂解之肽。
  149. 如請求項131至146中任一項之方法，其中A係具有與-NH-CR1 R2 -S-L1 -D共價連接之胺基酸的肽，該胺基酸選自由Ala、Arg、Asn、Asp、Cit、Cys、硒代-Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及Val組成之群，各自獨立地呈L或D異構體。
  150. 如請求項131至149中任一項之方法，其中該與-NH-CR1 R2 -S-L1 -D連接之胺基酸為L胺基酸。
  151. 如請求項147至150中任一項之方法，其中A為含有2至5個胺基酸殘基之肽。
  152. 如請求項131至147中任一項之方法，其中A係選自由Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、D-Val-Ala、Val-Cit、D-Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Ala、Phe-N9 -甲苯磺醯基-Arg、Phe-N9 -硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Ala-Ala、D-Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala-D-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:56)、β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO:57)、Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO:58)、Val-Arg、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、Gln-Val、Asn-Ala、Gln-Phe、Gln-Ala、D-Ala-Pro及D-Ala-tBu-Gly組成之群，其中各肽中之第一個胺基酸連接至L2 基團且各肽中之最後一個胺基酸連接至-NH-CR1 R2 -S-L1 -D。
  153. 如請求項152之方法，其中A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
  154. 如請求項131至153中任一項之方法，其中D為類美登素。
  155. 如請求項154之方法，其中D係由下式表示：
    Figure 03_image203
    。
  156. 如請求項155之方法，其中D係由下式表示：
    Figure 03_image013
    。
  157. 如請求項131至154中任一項之方法，其中該式(I)化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image206
    (I-b)；或
    Figure 03_image208
    (I-c)； 其中： R3A 及R4A 各自獨立地為H或Me； r1及t1各自獨立地為整數1至6； r2及t2各自獨立地為整數1至7； t3為整數1至12； D1 係由下式表示：
    Figure 03_image210
    。
  158. 如請求項157之方法，其中A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly。
  159. 如請求項157或158之方法，其中r1為整數2至4；且r2為整數3至5。
  160. 如請求項159之方法，其中該式(I)化合物係由下式表示：
    Figure 03_image212
    (I-d)；或
    Figure 03_image214
    (I-e)； 其中： r1及t1各自為整數2至6； r2及t2各自為整數2至5；且 t3為整數2至12。
  161. 如請求項157至160中任一項之化合物，其中R3A 及R4A 均為Me。
  162. 如請求項157至160中任一項之化合物，其中R3A 及R4A 均為H。
  163. 如請求項157之化合物，其中該化合物係由下式或其醫藥學上可接受之鹽表示：
    Figure 03_image216
    (I-f)；
    Figure 03_image218
    (I-g)；
    Figure 03_image220
    (I-h)；
    Figure 03_image222
    (I-i)；
    Figure 03_image224
    (I-j)；
    Figure 03_image226
    (I-k)；
    Figure 03_image228
    (I-l)；
    Figure 03_image230
    (I-m)；
    Figure 03_image232
    (I-n)；
    Figure 03_image234
    (I-o)；
    Figure 03_image236
    (I-p)；
    Figure 03_image238
    (I-q)；
    Figure 03_image240
    (I-r)；
    Figure 03_image242
    (I-s)；
    Figure 03_image244
    (I-t)；
    Figure 03_image246
    (I-u)；
    Figure 03_image248
    (I-v)；
    Figure 03_image250
    (I-w)；
    Figure 03_image252
    (I-x)；或
    Figure 03_image254
    (I-y)； 其中： A為Ala-Ala-Ala、Ala-D-Ala-Ala、Ala-Ala、D-Ala-Ala、Val-Ala、D-Val-Ala、D-Ala-Pro或D-Ala-tBu-Gly；且 D1 係由下式表示：
    Figure 03_image210
    。
  164. 如請求項163之方法，其中該化合物係由下式表示：
    Figure 03_image256
    (I10)；
    Figure 03_image009
    (I11)；
    Figure 03_image258
    (I12)；
    Figure 03_image260
    (I13)；
    Figure 03_image262
    (I14)；或
    Figure 03_image264
    (I15)， 其中D1 係由下式表示：
    Figure 03_image013
    。
  165. 如請求項164之方法，其中該式(I)化合物係由下式表示：
    Figure 03_image009
    (I11)。
  166. 如請求項23至165中任一項之方法，其中該經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段為抗葉酸鹽受體抗體或其抗原結合片段、抗EGFR抗體或其抗原結合片段、抗CD33抗體或其抗原結合片段、抗CD19抗體或其抗原結合片段、抗Muc1抗體或其抗原結合片段、抗CD37抗體或其抗原結合片段、抗cMet抗體或其抗原結合片段或抗EpCAM抗體或其抗原結合片段。
  167. 如請求項23至165中任一項之方法，其中該經半胱胺酸工程改造之抗體或抗原結合片段為抗CD123抗體或其抗原結合片段。
  168. 如請求項167之方法，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含a)免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及b)免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3。
  169. 如請求項167之方法，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含VH 序列SEQ ID NO:7及VL 序列SEQ ID NO:9。
  170. 如請求項167之方法，其中該抗CD123抗體包含：(a)具有以SEQ ID NO:8陳述之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈；及 b) 具有以SEQ ID NO:10陳述之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
  171. 如請求項23至165中任一項之方法，其中該經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段為抗ADAM9抗體或其抗原結合片段。
  172. 如請求項171之方法，其中該抗ADAM9抗體或其抗原結合片段係特異性地結合於人類ADAM9及cyno ADAM9之人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段。
  173. 如請求項172之方法，其中該人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段包含a)免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:24陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:25陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:26陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及b)免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:21陳述之胺基酸序列的CDL R1、具有以SEQ ID NO:22陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:23陳述之胺基酸序列的CDRL 3。
  174. 如請求項172或173之方法，其中該人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變域(VH )序列SEQ ID NO:27及輕鏈可變域(VL) 序列SEQ ID NO:28。
  175. 如請求項174之方法，其中該人類化抗ADAM9抗體或其抗原結合片段包含具有以SEQ ID NO:29陳述之胺基酸序列的重鏈；及具有以SEQ ID NO:30陳述之胺基酸序列的輕鏈。
  176. 如請求項171至175中任一項之方法，其中該人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段係經最佳化以具有對cyno ADAM9之結合親和力的至少100倍增強且如與嵌合或鼠科動物親本抗體相比，保持對人類ADAM9之高親和力結合。
  177. 一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
    Figure 03_image005
    ， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
    Figure 03_image007
    ， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
    Figure 03_image009
    (I11)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)， 其中：
    Figure 03_image011
    係經由位於該經工程改造之半胱胺酸殘基上的該硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； D1 係由下式表示：
    Figure 03_image013
    ，且 Cap為封端劑。
  178. 一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
    Figure 03_image005
    ， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
    Figure 03_image007
    ， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
    Figure 03_image009
    (I11)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，步驟(a)至(c)係連續地執行，且 其中：
    Figure 03_image011
    係經由位於該經工程改造之半胱胺酸殘基上的該硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； D1 係由下式表示：
    Figure 03_image013
    ，且 Cap為封端劑。
  179. 一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
    Figure 03_image005
    ， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
    Figure 03_image007
    ， 以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑(Cap)經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化； (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
    Figure 03_image009
    (I11)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC；及 (d) 移除未結合之式(I11)化合物； 其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，步驟(a)至(d)係連續地執行，且 其中：
    Figure 03_image011
    係經由位於該經工程改造之半胱胺酸殘基上的該硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之經半胱胺酸工程改造之抗體(CysAb)或其抗原結合片段；且其中該CysAb或其抗原結合片段係包含CDRH 1域、CDRH 2域及CDRH 3域以及CDRL 1域、CDRL 2域及CDRL 3域之人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段，該等域分別具有序列SEQ ID NO: 24、25及26以及SEQ ID NO: 21、22、23； qc 為1或2； D1 係由下式表示：
    Figure 03_image013
    ，且 Cap為封端劑。
  180. 如請求項179之方法，其中該方法進一步包括步驟(e)將該結合物交換至穩定緩衝液中。
  181. 如請求項180之方法，其中步驟(e)係連續地執行。
  182. 如請求項179至181中任一項之方法，其中使用單程切向流過濾(SPTFF)及/或逆流透濾來移除該未結合之式(I)化合物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  183. 如請求項179至182中任一項之方法，其中在步驟(d)中使用逆流透濾來移除該未結合之式(I)化合物。
  184. 如請求項178至183中任一項之方法，其中在步驟(a)中，該cCysAb及該還原劑連續地添加至反應容器中，同時反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  185. 如請求項184之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該還原劑及該cCysAb之組合流動速率相同。
  186. 如請求項178至185中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該經還原抗體及該選擇性氧化劑連續地添加至該反應容器中，同時該反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  187. 如請求項186之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該經還原抗體及該選擇性氧化劑之組合流動速率相同。
  188. 如請求項178至187中任一項之方法，其中在步驟(c)中，該CysAb及該式(I11)化合物連續地添加至反應容器中且該反應混合物連續地自該反應容器抽出且經由流式反應器進給。
  189. 如請求項188之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該CysAb及該式(I11)化合物之組合流動速率相同。
  190. 如請求項182至189中任一項之方法，其中該反應容器為連續攪拌槽反應器(CSTR)。
  191. 如請求項182至190中任一項之方法，其中該流式反應器為塞流反應器(PFR)。
  192. 如請求項177至191中任一項之方法，其中該人類化抗ADAM9抗體或其ADAM9結合片段包含分別具有序列SEQ ID NO:27及SEQ ID NO:28之重鏈可變域(VH )及輕鏈可變域(VL )。
  193. 如請求項177至191中任一項之方法，其中該人類化抗ADAM9抗體包含分別具有序列SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:30之重鏈及輕鏈。
  194. 如請求項177至193中任一項之方法，其中該還原劑為DPPA。
  195. 如請求項194之方法，其中在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用10與20之間莫耳當量之DPPA。
  196. 如請求項194之方法，其中在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用15與17之間莫耳當量之DPPA。
  197. 如請求項194之方法，其中在步驟(a)中，對於每一當量之cCysAb，使用16莫耳當量之DPPA。
  198. 如請求項177至197中任一項之方法，其中步驟(a)中之反應係在6.0與7.0之間的pH或6.3與6.7之間的pH下進行。
  199. 如請求項198之方法，其中步驟(a)中之反應係在pH 6.5下進行。
  200. 如請求項177至199中任一項之方法，其中該氧化劑為DHAA。
  201. 如請求項200之方法，其中在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用20與30之間莫耳當量之DHAA。
  202. 如請求項200之方法，其中在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用23與25之間莫耳當量之DHAA。
  203. 如請求項200之方法，其中在步驟(b)中，對於每一當量之cCysAb，使用24莫耳當量之DHAA。
  204. 如請求項177至203中任一項之方法，其中步驟(b)中之反應係在6.0與7.0之間的pH或6.3與6.7之間的pH下進行。
  205. 如請求項204之方法，其中步驟(b)中之反應係在pH 6.5下進行。
  206. 如請求項177至205中任一項之方法，其中步驟(c)中之反應係在6.0與7.0之間的pH或6.3與6.7之間的pH下進行。
  207. 如請求項206之方法，其中步驟(c)中之反應係在pH 6.5下進行。
  208. 如請求項177至207中任一項之方法，其中在步驟(c)中，對於每一當量之CysAb，使用2至10之間莫耳當量的該式(I11)化合物。
  209. 如請求項208之方法，其中對於每一當量之CysAb，使用4.6莫耳當量之該式(I11)化合物。
  210. 如請求項177至209中任一項之方法，其中Cap為半胱胺酸、麩胱甘肽或其組合。
  211. 如請求項177至210中任一項之方法，其中qc 為2。
  212. 一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
    Figure 03_image017
    ， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
    Figure 03_image019
    以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
    Figure 03_image020
    (I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)，其中： N與C之間的雙線
    Figure 03_image022
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
    Figure 03_image011
    係經由位於該經工程改造之半胱胺酸殘基上的該硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之該經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
  213. 一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
    Figure 03_image017
    ， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
    Figure 03_image019
    以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
    Figure 03_image020
    (I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC，其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)；且步驟(a)至(c)係連續地執行， 其中： N與C之間的雙線
    Figure 03_image022
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
    Figure 03_image011
    係經由位於該經工程改造之半胱胺酸殘基上的該硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之該經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
  214. 一種製備抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)之連續方法，該抗體-細胞毒性劑結合物(ADC)由下式表示：
    Figure 03_image017
    ， 該方法包括以下步驟： (a) 使還原劑與由下式表示之經封端的半胱胺酸工程改造之抗體(cCysAb)反應：
    Figure 03_image019
    以形成經還原抗體或其抗原結合片段，其中該封端劑經移除以在該經還原抗體或其抗原結合片段中形成游離硫醇(-SH)基； (b) 使該經還原抗體或其抗原結合片段與選擇性氧化劑反應以形成CysAb，其中該經工程改造之半胱胺酸殘基中的該游離硫醇基未經氧化；及 (c) 使該CysAb與由下式表示之化合物：
    Figure 03_image020
    (I1a)， 或其醫藥學上可接受之鹽反應，由此形成該ADC；及 (d) 移除未結合之式(I1a)化合物，其中步驟(a)中之該經還原抗體或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(b)，且步驟(b)之該CysAb或其抗原結合片段未經純化即用於步驟(c)；且步驟(a)至(d)係連續地執行， 其中： N與C之間的雙線
    Figure 03_image022
    表示單鍵或雙鍵，其限制條件在於當其為雙鍵時，X不存在且Y為-H，且當其為單鍵時，X為-H，且Y為-SO3 M，且M為H+ 或陽離子；
    Figure 03_image011
    係經由位於該經工程改造之半胱胺酸殘基上的該硫醇基共價連接至該細胞毒性劑之該經半胱胺酸工程改造之抗體或其抗原結合片段；其中該經半胱胺酸工程改造之抗體係抗CD123抗體或抗原結合片段，其包含： a) 免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:4陳述之胺基酸序列的CDRH 1、具有以SEQ ID NO:5陳述之胺基酸序列的CDRH 2及具有以SEQ ID NO:6陳述之胺基酸序列的CDRH 3；及 b) 免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有以SEQ ID NO:1陳述之胺基酸序列的CDRL 1、具有以SEQ ID NO:2陳述之胺基酸序列的CDRL 2及具有以SEQ ID NO:3陳述之胺基酸序列的CDRL 3； qc 為1或2；且 Cap為封端劑。
  215. 如請求項214之方法，其中該方法進一步包括步驟(e)將該結合物交換至穩定緩衝液中。
  216. 如請求項215之方法，其中步驟(e)係連續地執行。
  217. 如請求項214至216中任一項之方法，其中使用單程切向流過濾(SPTFF)及/或逆流透濾來移除該未結合之式(I)化合物及/或將該ADC交換至該穩定緩衝液中。
  218. 如請求項214至216中任一項之方法，其中在步驟(d)中使用逆流透濾來移除該未結合之式(I)化合物。
  219. 如請求項213至218中任一項之方法，其中在步驟(a)中，該cCysAb及該還原劑連續地添加至反應容器中，同時反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  220. 如請求項219之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該還原劑及該cCysAb之組合流動速率相同。
  221. 如請求項213至220中任一項之方法，其中在步驟(b)中，該經還原抗體及該選擇性氧化劑連續地添加至該反應容器中，同時該反應混合物連續地經抽出且經由流式反應器進給。
  222. 如請求項221之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該經還原抗體及該選擇性氧化劑之組合流動速率相同。
  223. 如請求項213至222中任一項之方法，其中在步驟(c)中，該CysAb及該式(I1a)化合物連續地添加至反應容器中且該反應混合物連續地自該反應容器抽出且經由流式反應器進給。
  224. 如請求項223之方法，其中自該反應容器抽出該反應混合物之體積流動速率係與正在添加至該反應容器中的該CysAb及該式(I1a)化合物之組合流動速率相同。
  225. 如請求項219至224中任一項之方法，其中該反應容器為連續攪拌槽反應器(CSTR)。
  226. 如請求項219至225中任一項之方法，其中該流式反應器為塞流反應器(PFR)。
  227. 如請求項212至214中任一項之方法，其中該抗CD123抗體或其抗原結合片段包含VH 序列SEQ ID NO: 7及VL 序列SEQ ID NO:9。
  228. 如請求項212至214中任一項之方法，其中該抗CD123抗體包含： a) 具有以SEQ ID NO:8陳述之胺基酸序列的重鏈；及 b) 具有以SEQ ID NO:10陳述之胺基酸序列的輕鏈。
  229. 如請求項212至228中任一項之方法，其中該還原劑為DPPA或TCEP。
  230. 如請求項229之方法，其中該還原劑為TCEP。
  231. 如請求項212至230中任一項之方法，其中步驟(a)中之反應係在5.0與8.5之間、7.0與8.0之間或7.5與7.7之間的pH下進行。
  232. 如請求項231之方法，其中步驟(a)之反應係在pH 7.5下進行。
  233. 如請求項212至232中任一項之方法，其中該氧化劑為DHAA。
  234. 如請求項212至233中任一項之方法，其中步驟(b)中之反應係在5.0與8.5之間、7.0與8.0之間或7.5與7.7之間的pH下進行。
  235. 如請求項233之方法，其中步驟(b)中之反應係在pH 7.5下進行。
  236. 如請求項212至235中任一項之方法，其中步驟(c)之反應係在5.0與8.5之間、5.5與6.5之間或5.8與6.2之間的pH下進行。
  237. 如請求項236之方法，其中步驟(c)之反應係在pH 6.0下進行。
  238. 如請求項212至237中任一項之方法，其中該還原劑為TCEP；步驟(a)中之反應係在pH 7.5下進行；該氧化劑為DHAA；步驟(b)中之反應係在pH 7.5下進行；且步驟(b)之後的該反應混合物之pH係在步驟(c)中使該CysAb與該細胞毒性劑反應之前自pH 7.5經調節至pH 6.0。
  239. 如請求項212至238中任一項之方法，其中該封端試劑為半胱胺酸、高半胱胺酸、麩胱甘肽或其組合。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7368856B2 (ja) 2017-07-25 2023-10-25 トゥルーバインディング，インコーポレイテッド Ｔｉｍ－３とそのリガンドとの相互作用の遮断によるがん治療
CN116063505B (zh) 2019-01-30 2024-05-03 真和制药有限公司 抗gal3抗体及其用途
US12109273B2 (en) 2019-02-15 2024-10-08 Wuxi Xdc Singapore Private Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
JP7232925B2 (ja) 2019-02-15 2023-03-03 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 改善された均一性を有する抗体薬物コンジュゲートの調製するプロセス
US12281166B2 (en) 2020-05-26 2025-04-22 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking Galectin-3
WO2022192134A1 (en) * 2021-03-08 2022-09-15 Immunogen, Inc. Methods for increasing efficacy of immunoconjugates targeting adam9 for the treatment of cancer
JP2024517409A (ja) * 2021-04-16 2024-04-22 ノバルティス アーゲー 抗体薬物結合体及びその作成方法
WO2025010424A1 (en) 2023-07-06 2025-01-09 Vir Biotechnology, Inc. Antibodies against staphylococcus antigens and methods of using the same

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US20080152586A1 (en) 1992-09-25 2008-06-26 Avipep Pty Limited High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US6355780B1 (en) 1995-02-22 2002-03-12 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to the death domain motifs of regulatory proteins
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7417130B2 (en) 2000-09-08 2008-08-26 University Of Zurich Collection of repeat proteins comprising repeat modules
CA2504818C (en) 2002-11-07 2013-04-23 Immunogen, Inc. Anti-cd33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
BRPI0613593A2 (pt) 2005-07-08 2011-01-18 Univ Zuerich método de teste "phage display" filamentoso, vetor de fago ou de fagomìdeo e biblioteca de vetores de fago ou fagomìdeo
EP3896076A1 (en) 2005-08-31 2021-10-20 The Regents of the University of California Cellular libraries of peptide sequences (clips) and methods of using the same
US8623356B2 (en) 2005-11-29 2014-01-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerization-activated therapeutic agents
US7510654B2 (en) 2005-12-29 2009-03-31 Spf Innovations, Llc Method and apparatus for the filtration of biological samples
WO2007098611A1 (en) 2006-03-03 2007-09-07 Queen's University At Kingston Compositions for treatment of cancer
US8301398B2 (en) 2006-06-22 2012-10-30 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Structure of the insulin receptor ectodomain
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CA2700391A1 (en) 2007-09-24 2009-04-02 University Of Zuerich Designed armadillo repeat proteins
US8231787B2 (en) 2008-05-06 2012-07-31 Spf Innovations, Llc Tangential flow filtration system
KR101098335B1 (ko) 2008-07-18 2011-12-26 성균관대학교산학협력단 신코나 기재 이작용성 유기 촉매 및 이를 이용한 메소-고리산무수물의 비대칭 고리 열림 반응을 통한 키랄성헤미에스터의 제조방법
PT2356269T (pt) 2008-10-31 2016-09-13 Janssen Biotech Inc Composições, métodos e usos de scaffolds baseados em domínios de fibronectina tipo iii
CA2749339A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
JP5873335B2 (ja) 2009-02-12 2016-03-01 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド フィブロネクチンｉｉｉ型ドメインに基づくスカフォールド組成物、方法及び使用
JP2013514788A (ja) 2009-12-23 2013-05-02 アビペップ ピーティーワイ リミテッド イムノコンジュゲート及びその作製方法２
TWI796132B (zh) 2010-02-24 2023-03-11 美商免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
KR101671360B1 (ko) * 2010-04-15 2016-11-01 시애틀 지네틱스, 인크. 표적화된 피롤로벤조디아제핀 접합체
ES2730693T3 (es) 2010-04-30 2019-11-12 Janssen Biotech Inc Composiciones del dominio de fibronectina estabilizados, métodos y usos
HRP20180358T1 (hr) 2011-04-01 2018-04-06 Immunogen, Inc. Postupci povećavanja djelotvornosti terapije raka usmjerene protiv folr1
WO2014026136A2 (en) 2012-08-10 2014-02-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
CN118146306A (zh) 2013-09-25 2024-06-07 西托姆克斯治疗公司 基质金属蛋白酶底物和其它可切割部分及其使用方法
JP6835586B2 (ja) 2014-01-31 2021-02-24 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド マトリプターゼ及びｕ‐プラスミノーゲン活性化因子の基質及び他の切断可能部分、並びにその使用方法
CN106459205B (zh) * 2014-04-11 2021-04-09 免疫医疗有限责任公司 包含半胱氨酸工程化抗体的轭合化合物
ES2815353T3 (es) * 2014-09-03 2021-03-29 Immunogen Inc Derivados de benzodiazepina citotóxicos
US9381256B2 (en) * 2014-09-03 2016-07-05 Immunogen, Inc. Cytotoxic benzodiazepine derivatives
KR102638901B1 (ko) * 2014-09-03 2024-02-22 이뮤노젠 아이엔씨 세포-결합제 및 세포독성 약물을 포함하는 콘주게이트
BR112017003236A2 (pt) 2014-09-12 2017-11-28 Genentech Inc anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN107849133B (zh) 2015-05-04 2022-08-23 西托姆克斯治疗公司 抗cd166抗体、可活化抗cd166抗体及其使用方法
TW201709932A (zh) * 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
LT3313845T (lt) * 2015-06-29 2020-12-10 Immunogen, Inc. Cisteino inžinerijos antikūnų konjugatai
CN114672490A (zh) * 2015-06-29 2022-06-28 伊缪诺金公司 抗cd123抗体以及其缀合物和衍生物
PT3334760T (pt) * 2015-08-12 2021-04-23 Pfizer Cisteínas de anticorpos com cap e sem cap e utilizações das mesmas na conjugação de anticorpo-fármaco
CN116813690A (zh) * 2016-11-23 2023-09-29 伊缪诺金公司 苯并二氮䓬衍生物的选择性磺化
TWI783957B (zh) * 2016-12-23 2022-11-21 美商伊繆諾金公司 靶向adam9之免疫共軛物及其使用方法
TWI862991B (zh) * 2017-02-28 2024-11-21 美商伊繆諾金公司 具有自分解肽連接子之類美登素衍生物及其結合物
TW201839001A (zh) * 2017-04-20 2018-11-01 美商伊繆諾金公司 細胞毒性苯并二氮平衍生物及其綴合物
US11274121B2 (en) * 2018-01-12 2022-03-15 Immunogen, Inc. Methods for antibody drug conjugation, purification, and formulation
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