TW202106703A - Cd80變體蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供對它們的同源結合配偶體具有改變的親和力的變體CD80多肽；以及包含該變體CD80多肽的免疫調節融合蛋白。本發明內容還提供包含此類多肽和/或蛋白質的藥物成分；以及調節免疫反應和/或治療癌症、傳染病和/或免疫學疾病的方法。

Description

CD80變體蛋白及其用途

[相關申請的交叉引用]

本申請要求於2019年4月26日提交的美國臨時申請No.62/839,542的優先權權益，其全部內容通過引用整體結合於此以用於所有目的。

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通過電子方式提交的文本文件的內容通過引用全文併入本文：序列表的電腦可讀格式副本(檔案名：CSPL_009_01TW_SeqList_ST25.txt，記錄日期：2020年4月23日，檔大小~44.5千位元組)。

T細胞淋巴細胞通過提供對特定病原體的適應性反應，在細胞介導的免疫中起關鍵作用。T細胞的活化取決於至少兩個訊號通路的活化，一個是抗原特異性的，另一個是抗原非特異性的。T細胞的抗原特異性活化是由與特定T細胞抗原受體相互作用的抗原呈遞細胞上的肽/主要組織相容性複合物介導的。在抗原呈遞細胞上表達的B7相關分子(即CD80(B7-1)和CD86(B7-2))與T細胞上的CD28和/或CTLA-4的結合提供了重要的抗原非特異性共刺激訊號，對最佳免疫反應至關重要。CD80與CD28和CTLA-4的T細胞同型二聚體的結合會在T細胞中產生共刺激和抑制訊號，而CD80與PD-L1的結合中斷了PD-1和PD-L1之間的相互作用，從而消除了T細胞活化的抑制訊號。因為這些訊號傳導途徑決定了T細胞對抗原的反應以及對抗原的下游反應的強度，所以例如通過調節CD80和CD28和/或CTLA4之間的一個或多個相互作用，特異性調節一個或多個共刺激訊號的藥物可以有效治療由細胞介導的免疫反應失調引起的疾病。

CD80是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成員，其細胞外結構域由一個胺基末端Ig可變樣(IgV)和一個膜近端Ig恆定樣(IgC)結構域組成。已經對CD80、CTLA-4、PD-L1和CD28這三種靶蛋白的結合親和力進行了努力調節。(Peach等人，(1995)JBC，270(36)，21181-21187)。

CD28有利於單體配體的結合，而CTLA-4有利於二聚體配體的結合，單體與多聚體形式的CD80的比例可影響隨後的免疫反應。因此，需要提供對CTLA-4、PD-L1和CD28各配體具有增加、降低或增加和降低的親和力的改進的CD80變體，以選擇性地調節T細胞活化以獲得特定的治療效果。本發明提供了與之相關的方法和成分。

本發明提供了變體CD80多肽。在一些實施例中，變體CD80多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少80%相同胺基酸序列的胺基酸序列，其中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含一個或多個胺基酸取代修飾，其中，一個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、165或166處。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含兩個或多個胺基酸取代修飾，且其中，兩個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置130、131、139、155、156、165或166處。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含三個或多個胺基酸取代修飾，並且其中，三個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含四個或多個胺基酸取代修飾，並且其中，四個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含五個或多個胺基酸取代修飾，並且其中，五個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。

在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽具有對CTLA-4、CD28或PD-L1增加或降低的結合親和力。

在其他實施例中，變體CD80多肽還包含能夠二聚的第二多肽。在一些實施例中，第二多肽是免疫球蛋白Fc結構域，其是人IgG1 Fc結構域、人IgG2 Fc結構域、人IgG3 Fc結構域、人IgG4 Fc結構域，小鼠IgG1 Fc結構域、小鼠IgG2a Fc結構域、小鼠IgG2b Fc結構域或小鼠IgG3 Fc結構域。在一些實施例中，變體CD80多肽進一步包含治療活性部分。

本發明還提供了編碼本發明的變體CD80多肽的多核苷酸，其是合成核酸或cDNA。在一些實施例中，多核苷酸可操作地連結至在真核細胞中起作用的轉錄控制元素。

本發明還提供了包含本發明的多核苷酸的載體，其是表達載體、哺乳動物載體或病毒載體。

本發明還提供了包含本發明的載體的細胞，其是包括人細胞的哺乳動物細胞。

本發明進一步提供了藥物成分，其包含本發明的變體CD80多肽，還包含藥學上可接受的賦形劑。在一些實施例中，藥物成分是無菌的。在一些實施例中，試劑盒包含本發明的藥物成分和使用說明書。

本發明還提供了一種製品，其在密封的小瓶中包括本發明的藥物成分。在一些實施例中，試劑盒包括本發明的製品和使用說明書。

本發明進一步提供了一種在受試者中調節免疫反應的方法，其包括向受試者施用本發明的藥物成分。在一些實施例中，調節免疫反應治療受試者的疾病或病症。在一些實施例中，免疫反應增加或降低。在一些實施例中，疾病或病症是腫瘤或癌症。在一些實施例中，疾病或病症是炎性或自體免疫性疾病或病症。

本發明進一步提供了一種治療受試者的疾病或病症的方法，其包括向受試者施用本發明的藥物成分。在一些實施例中，該疾病或病症是感染。在一些實施例中，疾病或病症是腫瘤或癌症。在一些實施例中，疾病或病症是炎性或自體免疫性疾病或病症。

出於所有目的，所有出版物、專利和專利申請，包括其中的任何附圖和附錄均通過引用整體併入本文，其程度與具體地和單獨地指出每個單獨的出版物、專利或專利申請、附圖或附錄均出於所有目的通過引用整體併入本文的程度相同。

儘管本文描述了本發明的各種實施例，但是對於本領域技術人員而言顯而易見的是，僅通過示例的方式提供了這樣的實施例。在不背離本發明的情況下，本文描述的實施例的許多修飾和改變以及變化和取代對於本領域技術人員將是顯而易見的。應當理解，在實踐本發明中可以採用本文所述實施例的各種替代方案。還應理解，本發明的每個實施例可以任選地與本文描述的與該實施例一致的其他實施例中的任何一個或多個組合。

在以列表格式(例如，以馬庫什組)表示元素的情況下，應理解，還公開了元素的每個可能的子組，並且可以從列表或組中移除任何一個或多個元素。

還應理解，除非明確相反地指出，否則在本文描述或要求保護的任何方法中(包括一個以上的動作)，方法的動作的順序不必一定限於所述方法的動作的敘述順序，但本發明包含順序如此受限的實施例。

還應理解的是，通常，在說明書或申請專利範圍中的實施例被稱為包括一個或多個特徵的情況下，本發明還涵蓋由這樣的特徵組成或基本上由這樣的特徵組成的實施例。

還應理解，可以在申請專利範圍中明確地排除本發明的任何實施例，例如在先前技術內找到的任何實施例，而不管說明書中是否列舉了特定的排除。

本文包括標題以供參考並説明定位某些部分。標題無意限制在那些標題下的各部分中描述的實施例和概念的範圍，並且那些實施例和概念可在整個公開中的其他部分中應用。

[I.定義]

雖然以下術語被本領域的普通技術人員很好地理解，但是提出以下定義以促進對當前公開的主題的解釋。除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語，符號以及其他技術和科學術語或術語旨在具有與所要求保護的主題所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。在某些情況下，為了清楚和/或易於參考，在此定義了具有通常理解的含義的術語，並且在本文中包括這樣的定義不應該被解釋為表示與本領域通常理解的實質性區別。

除非另外在特定情況下限制，否則貫穿本說明書使用的術語定義如下。如說明書和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式“一”，“一個”和“該”包括複數物件，除非上下文另外明確指出。除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語，首字母縮寫詞和縮寫具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。除非另有說明，否則，化學和生物化學名稱的縮寫和符號根據IUPAC-IUB命名法。除非另有說明，否則所有數字範圍均包括定義範圍的值以及其間的所有整數值。

在免疫球蛋白超家族結構域的上下文中使用的術語“親和力修飾的”表示具有改變的胺基酸序列(相對於相應的野生型親本或未修飾的IgSF結構域)的哺乳動物免疫球蛋白超家族(IgSF)結構域，使得與親本野生型或未修飾(即非親和力修飾)的IgSF對照結構域相比，其對其至少一個同源結合配偶體(或者是“反結構”)具有增加或降低的結合親和力或親合力。在此上下文中包括親和力修飾的CD80IgSF結構域。在一些實施例中，親和力修飾的IgSF結構域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多個胺基酸差異，例如野生型或未修飾的IgSF結構域中的胺基酸取代。結合親和力或親合力的增加或降低可以使用眾所周知的結合測定法例如流式細胞術來確定。拉森等人的，《美國移植雜誌》，第5卷：443-453(2005)。也參見林斯利等人的，免疫，1：7930801(1994)。蛋白質與其同源結合配偶體的結合親和力或親合力的增加值比野生型IgSF結構域對照的增加值大至少10%，在某些實施例中，比野生型IgSF結構域對照的增加值大至少20%、30%、40%、50%、100%、200%、300%、500%、1000%、5000%或10000%。蛋白質與其至少一個同源結合配偶體的結合親和力或親合力的降低是不大於對照的90%但不小於野生型IgSF結構域對照值的10%，並且在一些實施例中，不大於野生型IgSF結構域對照值的80%、70%、60%、50%、40%、30%或20%，但不少於10%。通過胺基酸殘基的取代、添加或缺失，親和力修飾的蛋白質在一級胺基酸序列中發生改變。術語“親和力修飾的IgSF結構域”不應解釋為對創建親和力修飾的IgSF結構域的任何特定起始成分或方法施加任何條件。因此，本發明的親和力修飾的IgSF結構域不限於野生型IgF結構域，然後通過任何特定的親和力修飾方法將其轉化為親和力修飾的IgSF結構域。親和力修飾的IgSF結構域多肽可以例如從野生型哺乳動物IgSF結構域序列資訊開始生成，然後在電腦類比中建模以與其同源結合配偶體結合，最後重組或化學合成以產生親和力修飾的IgSF結構域成分。在一個替代實例中，可以通過對野生型IgSF結構域進行定點誘變來產生親和力修飾的IgSF結構域。因此，親和力修飾的IgSF結構域表示產物，而不一定是通過任何給定方法產生的產物。可以採用多種技術，包括重組方法、化學合成或其組合。

如本文所用(例如，參考本發明的T細胞調節性多聚多肽與T細胞上的多肽(例如，T細胞受體)的結合)，“結合”是指非-之間的共價相互作用。結合相互作用的特徵通常是解離常數(KD)小於10^-6 M、小於10^-7 M、小於10^-8 M、小於10^-9 M、小於10^-10 M、小於10^-11 M、小於10^-12 M、小於10^-13 M、小於10^-14 M或小於10^-15 M。“親和力”是指結合強度，增加的結合親和力與較低的KD相關。

如本文所用，術語“結合親和力”和“結合親合力”分別是指蛋白質在特定結合條件下針對其反結構的特異性結合親和力和特異性結合親合力。在生化動力學中，親合力是指單個非共價結合相互作用(例如CD80及其反結構CTLA-4，PD-L1和/或CD28之間)的多個親和力的累積強度。因此，親合力不同於親和力，親和力描述了單個交互的強度。相對於未修飾的CD80(例如含有天然或野生型IgSF結構域(例如IgV或IgC結構域)的未修飾CD80)的結合親和力，確定含有親和力修飾的CD80IgSF結構域的變體CD80與其反結構的結合親和力的增加或減弱。確定結合親和力或親合力的方法是本領域已知的。參見例如拉森等人，美國移植雜誌，第5卷：443-453(2005)。在一些實施例中，本發明的變體CD80(即，含有親和力修飾的IgSF結構域的CD80-Fc融合蛋白)與流式細胞儀測量的結合親和力與CTLA-4、PD-L1和/或CD28特異性結合，在結合測定中，結合親和力產生的平均螢光強度(MFI)值比野生型CD80對照大至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。

關於多肽，例如關於變體CD80的IgSF結構域，術語“同源結合配偶體”(與“反結構”互換使用)是指在特定結合條件下，所參照的多肽特異性結合的至少一個分子(通常是天然哺乳動物蛋白)。在一些方面，含有親和力修飾的IgSF結構域的變體CD80特異性結合相應的天然或野生型CD80的反結構，但是親和力增加或減弱。在特定結合條件下識別並特異性結合其同源受體的配體是該受體的反結構或同源結合配偶體的一個實例。“同源細胞表面結合配偶體”是在哺乳動物細胞表面上表達的同源結合配偶體。“細胞表面分子種類”是免疫突觸(IS)的配體的同源結合配偶體，其在形成細胞性突觸的細胞例如哺乳動物細胞上表達並由細胞表達。

如本文所用，“綴合物”，“綴合”或其語法變化形式是指通過本領域已知的任何連接或連結方法，將兩種或更多種化合物連接或連結在一起，從而導致另一種化合物的形成。它也可以指通過將兩種或更多種化合物結合或連結在一起而產生的化合物。例如，直接或間接連結至一個或多個化學部分或多肽的變體CD80多肽是示例性綴合物。此類綴合物包括融合蛋白，通過化學綴合物產生的那些以及通過任何其他方法產生的那些。

如本文所用，術語“保守胺基酸取代”是指其中胺基酸殘基被帶有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的具有側鏈R基團的另一個胺基酸殘基取代的胺基酸取代。具有類似化學性質的側鏈的胺基酸基團的示例包括：1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸和異亮胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸和蘇胺酸；3)含醯胺的側鏈：天冬醯胺和穀胺醯胺；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；5)基本側鏈：賴胺酸、精胺酸和組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸和谷胺酸；7)含硫側鏈：半胱胺酸和蛋胺酸。保守胺基酸取代基是：纈胺酸-亮胺酸-異亮胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、賴胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、谷胺酸-天冬胺酸、和天冬醯胺-穀胺醯胺。

如本文所用，術語“共刺激多肽”包括抗原呈遞細胞(APC)(例如，樹突細胞、B細胞等)上的多肽，該多肽與T細胞上的同源共刺激多肽特異性結合，從而提供一種訊號，該訊號除了通過例如TCR/CD3複合物與載有肽的主要組織相容性複合物(MHC)多肽結合提供的主要訊號外，還介導T細胞反應，包括但不限於增殖、活化、分化等。

如本文所用，術語“降低”或“減弱”或“抑制”是指降低統計學上顯著的量。降低可以是至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。

術語“衍生物”或“衍生化的”是指通過將蛋白質直接或間接地共價連接至成分來修飾蛋白質，以改變諸如生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解度、毒性、效價或功效等特徵，同時保留或增強其治療益處的修飾。本發明內容的免疫調節多肽的衍生物在本發明內容的範圍內，並且可以通過例如糖基化、聚乙二醇化、脂質化或 Fc融合來製備。

如本文所用，結構域(通常是三個或多個，通常是5或7個或多個胺基酸，例如10至200個胺基酸殘基的序列)是指分子的一部分，例如蛋白質或編碼核酸酸，其在結構和/或功能上與分子的其他部分不同，並且是可識別的。例如，結構域包括多肽鏈的那些部分，其可以在由一個或多個結構基序組成的蛋白質內形成獨立折疊的結構和/或由於功能活性例如結合活性而被識別。蛋白質可以具有一個或多個不同的結構域。例如，可以通過一級序列或結構與相關家族成員的同源性，例如與基序的同源性來鑒定、定義或區分結構域。在另一個實例中，結構域可以通過其功能來區分，例如與生物分子例如同源結合配偶體相互作用的能力。結構域獨立地可以表現出生物學功能或活性，使得該結構域可以獨立地或與另一分子融合來執行活性，例如結合。結構域可以是胺基酸的線性序列或胺基酸的非線性序列。許多多肽包含多個結構域。這樣的結構域是已知的，並且可以被本領域技術人員識別。為了本文的示例，提供了定義，但是應該理解，通過名稱識別特定結構域在本領域技術範圍內。如果需要，可以使用適當的軟體來標識結構域。

術語“有效量”或“治療有效量”是指本發明的治療成分的量和/或濃度，包括蛋白質成分或細胞成分，其在單獨(即作為單一療法)或與其他治療劑聯合進行離體給藥(通過與患者細胞接觸)或體內給藥(通過對患者給藥)時，例如通過改善或消除症狀和/或病因，可使疾病進展在統計學上顯著降低。有效量可以是解除、減輕或緩解與疾病或病症有關的至少一種症狀或生物學反應或效應，預防疾病或病症的進展或改善患者的身體機能的量。在細胞療法的情況下，有效量是通過過繼細胞療法施用給患者的細胞的有效劑量或數量。在一些實施例中，患者是哺乳動物，例如非人類靈長類動物或人類患者。

如本文所用，在增加哺乳動物淋巴細胞的免疫活性的情況下，術語“增強”或“增加”是指增加淋巴細胞的一個或多個活性。活性增加可以是細胞存活率、細胞增殖、細胞因子產生或T細胞細胞毒性增加的一個或多個，例如統計學上顯著的量。在一些實施例中，提到增加的免疫活性是指誘導T細胞中IL-2的產生。在一些實施例中，可以通過檢測IL-2釋放來評估免疫活性。在一些實施例中，提及增加的免疫活性是指例如以統計學上顯著的量增加干擾素γ(IFN-γ)的產生。在一些實施例中，可以在混合淋巴細胞反應(MLR)測定中評估免疫活性。進行MLR測定的方法是本領域已知的。王等人的癌症免疫研究2014年9月：2(9)：846-56。評估淋巴細胞活性的其他方法是本領域已知的，包括本文所述的任何測定法。在一些實施例中，增強可以比非零對照值增加至少10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、200%、300%、400%或500%。

如本文所用，術語“改造的細胞”是指已經通過人為干預如重組DNA方法或病毒轉導進行了遺傳修飾的哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞是免疫細胞，例如淋巴細胞(例如T細胞、B細胞、NK細胞)或抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)。該細胞可以是來自患者的原代細胞或可以是細胞系。在一些實施例中，本發明的工程細胞包含本發明的變體CD80，其被改造的以調節表達(變體CD80特異性結合的)CD28、PD-L1或CTLA-4的T細胞的免疫活性。在一些實施例中，變體CD80是跨膜免疫調節蛋白(以下稱為“TIP”)，其包含細胞外結構域或其部分，該部分包含連結至跨膜結構域和任選地細胞內訊號傳導結構域的IgV和/或IgC結構域。在某些情況下，TIP被格式化為包含異源胞質訊號結構域或內結構域的嵌合受體。在一些實施例中，工程細胞能夠表達和分泌如本文所述的免疫調節蛋白。在所提供的工程細胞中，還包含進一步包含工程T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)的細胞。

如本文所用，術語“改造的T細胞”是指T細胞，例如T輔助細胞，細胞毒性T細胞(或者，細胞毒性T淋巴細胞或CTL)，天然殺傷性T細胞，調節性T-細胞，記憶T細胞或γδT細胞，它們已通過人為干預(例如重組DNA方法或病毒轉導方法)進行了遺傳修飾。術語“改造的T細胞受體”或“改造的TCR”是指工程改造為以期望的親和力與主要組織相容性複合物(MHC)/肽靶抗原特異性結合的T細胞受體(TCR)，其被選擇、複製和/或隨後引入T細胞群，通常用於過繼免疫療法。與改造的TCR相比，CAR被改造成以MHC獨立的方式結合靶抗原。

如本文所用，術語“免疫突觸”或“免疫突觸”通常是指適應性免疫反應的兩個相互作用的免疫細胞之間的天然介面，包括例如抗原呈遞細胞(APC)或targeT細胞與效應子細胞(例如淋巴細胞，效應子T細胞，天然殺傷細胞等)之間的介面。APC和T細胞之間的免疫突觸通常由T細胞抗原受體和主要的組織相容性複合物分子的相互作用來引發，例如，如布羅姆利等人的，免疫學年鑒中2001年；19：375-96中所述；通過引用將其公開內容整體併入本文。

免疫球蛋白分子(也稱為 Fc多肽)的 Fc(片段可結晶的)區域或結構域在很大程度上對應於免疫球蛋白重鏈的恆定區，並且負責各種功能，包括抗體的效應子功能。Fc結構域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈結構域的一部分或全部，加上CH2和CH3結構域。Fc結構域可形成通過一個或多個二硫鍵連接的兩條多肽鏈的二聚體。在一些實施例中， Fc是變體 Fc，其表現出減少的(例如減少的大於30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)活性以促進效應子功能。在一些實施例中，通過EU編號系統提及 Fc區中的胺基酸取代，除非參考已知編號的特定的SEQ ID NO：EU描述，並且根據最近更新的IMGTScientificChart(IMGT®，國際ImMunoGeneTics資訊系統®，網址為imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html以及Kabat，E.A.等人在第五版美國衛生與公共服務部，NIH出版號91-3242(1991)的“具有免疫學意義的蛋白質序列”中報導的EU索引)。

免疫球蛋白 Fc融合物(“ Fc-融合物”)，例如免疫調節性 Fc融合蛋白，是包含與免疫球蛋白的 Fc區可操作連結的一個或多個多肽(或一個或多個小分子)的分子。 Fc融合物可包含例如抗體的 Fc區(促進效應子功能和藥代動力學)和變體CD80。免疫球蛋白 Fc區可以間接或直接連結至一個或多個變體CD80或小分子(融合配偶體)。各種連結是本領域已知的，並且可以任選地用於將 Fc連結至融合配偶體以產生 Fc融合物。可以將相同種類的 Fc融合物二聚以形成 Fc融合同二聚體，或使用不同的物種來形成 Fc融合異二聚體。在一些實施例中， Fc是哺乳動物 Fc，例如鼠或人 Fc。

當將這樣的DNA引入細胞內時，該細胞已經被外源DNA例如重組表達載體“遺傳修飾”或“轉化”或“轉染”。外源DNA的存在導致永久或暫時的遺傳改變。轉化DNA可以整合或不整合(共價連接)到細胞基因組中。例如，在原核生物、酵母和哺乳動物細胞中，轉化DNA可以保持在附加型元素如質粒上。對於真核細胞，穩定轉化的細胞是這樣一種細胞，其中，轉化DNA已經整合到染色體中，從而其子細胞通過染色體複製遺傳。

如本文所用，“異源的”是指分別在天然核酸或蛋白質中未發現的核苷酸或多肽。

如本文所用，“hosT細胞”表示體內或體外的真核細胞或來自培養為單細胞實體的多細胞生物的細胞(例如，細胞系)，該真核細胞可以或已經用作核酸的受體(例如，表達載體，其包含編碼本發明內容的多聚體多肽的核苷酸序列)並包括已被核酸遺傳修飾的原始細胞的後代。應當理解，由於自然的、偶然的或故意的突變，單個細胞的後代在形態或基因組或總DNA補體上不一定與原始親本完全相同。術語“hosT細胞”是指可用於表達由重組表達載體編碼的蛋白質的細胞。hosT細胞可以是原核生物，例如大腸桿菌，也可以是真核生物，例如單細胞真核生物(例如酵母或其他真菌)，planT細胞(例如煙草或番茄planT細胞)，動物細胞(例如人細胞、猴子細胞、倉鼠細胞、raT細胞、小鼠細胞或insECT細胞)或雜交瘤。hosT細胞的示例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或它們的衍生物，例如VeggiECHO和在無血清培養基或DHFR缺乏的CHO菌株DX-B11中生長的相關細胞系。在一些實施例中，hosT細胞是哺乳動物細胞(例如人細胞、猴細胞、倉鼠細胞、raT細胞、小鼠細胞或insECT細胞)。

如本文所用，術語“免疫球蛋白”(縮寫為“Ig”)是指哺乳動物免疫球蛋白蛋白，其包括五種人類類別的抗體中的任何一種：IgA(包括亞類IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亞類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。該術語還包括小於全長的免疫球蛋白，無論是全部或部分合成的(例如重組或化學合成)還是天然產生的，例如抗原結合片段(Fab)、含有VH和VL的可變片段(Fv)、包含一條鏈中連結在一起的VH和VL的單鏈可變片段(scFv)，以及其他抗體V區片段，例如Fab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFv雙抗體、 Fc和Fd多肽片段。同雙特異性和異雙特異性雙特異性抗體包括在該術語的含義內。

如本文所用，術語“免疫球蛋白超家族”或“IgSF”是指與細胞的識別、結合或黏附過程有關的細胞表面和可溶性蛋白的組。根據與免疫球蛋白(即抗體)共有的結構特徵，分子被歸類為該超家族的成員；它們都具有稱為免疫球蛋白結構域或折疊的結構域。IgSF的成員包括免疫系統的細胞表面抗原受體、共受體和共刺激分子，涉及抗原向淋巴細胞呈遞的分子、細胞黏附分子、某些細胞因子受體和細胞內肌肉蛋白。它們通常與免疫系統中的角色有關。免疫突觸中的蛋白質通常是IgSF的成員。IgSF也可以基於共用的屬性(例如功能)歸類為“亞家族”。此類亞家族通常由4至30個IgSF成員組成。

如本文所用，術語“IgSF結構域”或“免疫球蛋白結構域”或“Ig結構域”是指IgSF蛋白的結構域。Ig結構域以免疫球蛋白分子命名。它們包含約70-110個胺基酸，並根據其大小和功能進行分類。Ig結構域具有特徵性的Ig折疊，具有由兩片反平行的β鏈形成的三明治狀結構。三明治內側的疏水胺基酸與B和F鏈中半胱胺酸殘基之間形成的高度保守的二硫鍵之間的相互作用穩定了Ig折疊。Ig結構域的一端具有稱為互補決定區的部分，這對於抗體對其配體的特異性很重要。類似於Ig的結構域可以分類為(類)：IgV、IgC1、IgC2或IgI。大多數Ig結構域是可變的(IgV)或恆定的(IgC)。具有9個β鏈的IgV結構域通常比具有7個β鏈的IgC結構域更長。IgSF的一些成員的Ig結構域在胺基酸序列上類似於IgV結構域，但是大小與IgC結構域相似。這些稱為IgC2結構域，而標準IgC結構域稱為IgC1結構域。T細胞受體(TCR)鏈在細胞外部分包含兩個Ig結構域；在N末端有一個IgV結構域，在細胞膜附近有一個IgC1結構域。CD80包含兩個Ig結構域：IgV和IgC。

如本文所用，術語“IgSF種類”是指具有相同或基本相同的一級胺基酸序列的IgSF成員蛋白的集合。每個哺乳動物免疫球蛋白超家族(IgSF)成員都定義了屬於該IgSF成員的所有IgSF種類的唯一身份。因此，每個IgSF家族成員與其他IgSF家族成員都是唯一的，因此，特定IgSF家族成員的每個種類與另一個IgSF家族成員的種類相比是唯一的。然而，由於轉譯後修飾的差異，例如糖基化、磷酸化、泛素化、亞硝基化、甲基化、乙醯化和脂質化，同一種IgSF分子之間可能發生變異。另外，由於基因多態性，單個IgSF種類內的較小序列差異構成了單個IgSF物種內的另一種變異形式，例如由於蛋白水解切割，野生型截短形式的IgSF種類也是如此。“細胞表面IgSF種類”是在細胞(通常是哺乳動物細胞)的表面上表達的IgSF種類。

“免疫調節多肽”是調節免疫活性的多肽。“調節”或“調節”免疫反應是指免疫活性增加或降低。免疫調節多肽可以是單條多肽鏈或至少兩條通過例如鏈間二硫鍵共價鍵合的多肽鏈的多聚體(二聚體或更高階的多聚體)。因此，單體，二聚體和更高階的多聚體多肽在所定義術語的範圍內。多聚體多肽可以是(相同多肽鏈的)同源多聚體或(不同多肽鏈的)異源多聚體。本發明的免疫調節多肽包含變體CD80。

術語“個體”、“受試者”、“宿主”和“患者”在本文可互換使用，並且是指需要對其進行診斷、診治或治療的任何哺乳動物受試者。哺乳動物包括例如人類、非人類靈長類動物、齧齒動物(例如大鼠、小鼠)、兔形動物(例如兔子)、有蹄類動物(例如牛，綿羊、豬、馬、山羊等)等。

如本文所用，術語“淋巴細胞”是指哺乳動物免疫系統中白細胞的三種亞型中的任一種。它們包括天然殺傷細胞(NK細胞)(在細胞介導的細胞毒性先天免疫中起作用)，T細胞(用於細胞介導的細胞毒性適應性免疫)和B細胞(用於體液，抗體驅動的適應性免疫)。T細胞包括：T輔助細胞、細胞毒性T細胞、自然殺傷性T細胞、記憶性T細胞、調節性T細胞或γδT細胞。先天性淋巴細胞(ILC)也包括在淋巴細胞的定義內。

術語“哺乳動物”或“患者”具體包括對以下各項中的至少一種的提及：人、黑猩猩、恆河猴、食蟹猴、狗、貓、小鼠或大鼠。本發明的T細胞調節性多聚體多肽的“調節結構域”或“免疫調節結構域”包含共刺激多肽。

如本文所用，在免疫反應例如哺乳動物免疫反應的上下文中，術語“調節”是指由於施用包含本發明的變體CD80的免疫調節多肽的結果，或者施用工程化細胞表達免疫調節蛋白(例如本發明的變體CD80跨膜免疫調節蛋白)的結果，已發生的或潛在的免疫反應的任何改變，例如增加或降低。因此，它是指與不施用包含變體CD80的免疫調節蛋白或表達這種免疫調節多肽的細胞而發生或存在的免疫反應相比，免疫反應的改變，例如增加或降低。這種調節包括免疫細胞的免疫活性的程度或範圍的任何誘導、活化、抑制或改變。免疫細胞包括B細胞、T細胞、NK(自然殺傷細胞)、NKT細胞、專業抗原呈遞細胞(APC)和非專業抗原呈遞細胞，以及炎症細胞(嗜中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞)。調節包括賦予現有免疫反應、正在發展的免疫反應、潛在的免疫反應或誘導、調節、影響或回應免疫反應的能力的任何變化。調節包括作為免疫反應的一部分的免疫細胞中基因、蛋白質和/或其他分子的表達和/或功能的任何改變。免疫反應的調節或免疫活性的調節包括例如以下：免疫細胞的消除，缺失或隔離；誘導或生成可調節其他細胞(例如自體反應性淋巴細胞、抗原呈遞細胞或炎症細胞)功能的免疫細胞；在免疫細胞中誘導無反應狀態(即無反應)；增強或抑制免疫細胞的活性或功能，包括但不限於改變由這些細胞表達的蛋白質的模式。示例包括某些類別的分子(例如細胞因子，趨化因子，生長因子，轉錄因子，激酶，共刺激分子或其他細胞表面受體)的產生和/或分泌改變，或這些調節事件的任意組合。調節可例如通過改變變體CD80與反結構CTLA-4、PD-L1或CD28的結合親和力和/或親合力來評估。例如，可以通過相對於野生型CD80對照通過IL-2表達的改變或在T細胞中的釋放來評估調節。例如，可以通過在主要T細胞測定中相對於野生型CD80對照的IFN-γ(干擾素γ)表達的改變來評估調節(參見Zhao和Ji，實驗細胞研究.2016Jan.1；340(1)132-138)。例如，相對於用野生型CD80跨膜蛋白工程改造的細胞，可以通過工程改造的細胞的免疫活性的改變，例如工程改造細胞的細胞毒性活性的改變或工程改造細胞的細胞因子分泌的改變來評估調節。

本文可互換使用的術語“多核苷酸”和“核酸”是指任何長度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。因此，該術語包括但不限於單鏈、雙鏈或多鏈DNA或RNA，基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜種，或包含嘌呤和嘧啶鹼基的聚合物或其他天然、化學或生物化學修飾的，非天然或衍生的核苷酸鹼基。除非特別限制，否則該術語包括含有已知的天然核苷酸類似物的核酸，它們具有類似的結合特性，並且以類似於天然核苷酸的方式代謝。除非另有說明，否則特定核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾的變體(例如簡並密碼子取代)和互補核苷酸序列以及明確指出的序列(“參考序列”)。具體地，簡並的密碼子取代可以通過產生序列來實現，其中一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三位置被混合鹼基和/或去氧肌苷殘基取代。術語核酸或多核苷酸涵蓋由基因編碼的cDNA或mRNA。

術語“肽”、“多肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，並且是指任何長度的胺基酸的聚合形式，其可以包括化學或生物化學修飾的編碼和非編碼胺基酸或衍生胺基酸，以及具有修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括多肽的轉譯後修飾，例如糖基化、乙醯化、唾液酸化、磷酸化等。這些術語還包括其中一個或多個胺基酸類似物或非典型或非天然胺基酸可被合成，或使用已知的蛋白質工程技術重組表達的分子。另外，蛋白質可以被衍生化。

多核苷酸或多肽與另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，這意味著比對時，比較兩個序列時鹼基或胺基酸的百分比相同且相對位置相同。序列同一性可以以多種不同方式確定。為了確定序列同一性，可以使用各種方便的方法和電腦程式(例如BLAST，T-COFFEE，MUSCLE，MAFFT等)對序列進行比對，這些程式可以在包括ncbi.nlm.nili.gov/BLAST，ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/，ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/，mafft.cbrc.jp/alignment/software/在內的萬維網上找到，參見，例如，阿爾舒爾等人的(1990)，J.Mol.比奧215：403-10。

如本文所用，“重組”是指特定的核酸(DNA或RNA)是複製、限制，聚合酶鏈反應(PCR)和/或連接步驟的各種組合的產物，從而導致構建體具有結構編碼或不同於天然系統中發現的內源核酸的非編碼序列。可以從cDNA片段或一系列合成的寡核苷酸組裝編碼多肽的DNA序列，以提供能夠從細胞或無細胞轉錄和轉譯系統中包含的重組轉錄單位表達的合成核酸。例如，“重組核酸”是通過例如在複製、親和力修飾、DNA改組或其他眾所周知的分子生物學程式期間重組核酸而製成的。“重組DNA分子”由通過這種分子生物學技術連接在一起的DNA片段組成。如本文所用，術語“重組蛋白”或“重組多肽”是指使用重組DNA分子表達的蛋白質分子。“重組hosT細胞”是包含和/或表達重組核酸的細胞，或者是通過遺傳工程改變的細胞，例如通過將編碼重組蛋白例如本文提供的跨膜免疫調節蛋白的核酸分子引入細胞中來改變。例如，通過將合適的異源核酸(例如真核生物hosT細胞的外源核酸)或重組核酸(在真核細胞中通常找不到這種細胞)引入到合適的真核hosT細胞中來對遺傳修飾的真核hosT細胞進行遺傳修飾。真核生物中的轉錄控制訊號包含“啟動子”和“增強子”元素。啟動子和增強子由短序列的DNA序列組成，這些序列與參與轉錄的細胞蛋白發生特異性相互作用。已經從多種真核來源分離了啟動子和增強子元素，包括酵母、昆蟲、哺乳動物細胞和病毒中的基因(在原核生物中也發現了類似的控制元素，即啟動子)。特定啟動子和增強子的選擇取決於表達感興趣蛋白質的whaT細胞類型。如本文所用，術語“可操作組合”、“可操作順序”和“可操作連結”是指以這樣的方式或方向的核酸序列的連接，使得產生能夠指導給定基因的轉錄和/或所需蛋白質分子的合成的核酸分子。

術語“重組表達載體”或“DNA構建體”在本文可互換使用，是指包含載體和一個插入物的DNA分子。重組表達載體通常是出於表達和/或繁殖插入物和/或表達盒的目的，或用於構建其他重組核苷酸序列的目的而產生的。重組表達載體是指DNA分子，其包含所需的編碼序列和在特定的hosT細胞中表達可操作連接的編碼序列所需的合適的核酸序列。在原核生物中表達所必需的核酸序列包括啟動子、任選的操縱子序列、核糖體結合位點和可能的其他序列。已知真核細胞利用啟動子、增強子以及終止和聚腺苷酸化訊號。分泌訊號肽序列也可以任選地由重組表達載體編碼，可操作地連接至重組蛋白，例如重組融合蛋白的編碼序列，使得，如果需要，重組的hosT細胞可以分泌表達的融合蛋白，從而更容易從細胞中分離出融合蛋白。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體，以及摻入已引入其的hosT細胞基因組中的載體。在載體中是病毒載體，例如慢病毒載體。

“T細胞”包括表達CD3的所有類型的免疫細胞，包括T輔助細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、T調節細胞(Treg)和NK-T細胞。

術語“診治”，“治療”等在本文中通常用來表示獲得期望的藥理和/或生理作用。就完全或部分預防疾病或其症狀而言，該效果可以是預防性的，和/或就部分或完全治癒疾病和/或歸因於該疾病的不良影響而言，該效果可以是治療性的。如本文所用，“治療”涵蓋哺乳動物中疾病或症狀的任何治療，並且包括：(a)防止可能易患該疾病或症狀但尚未被診斷為患有該疾病或症狀的受試者中發生該疾病或症狀；(b)抑制疾病或症狀，即阻止其發展；或(c)減輕疾病，即引起疾病消退。可以在疾病或損傷發作之前，期間或之後施用治療劑。特別令人感興趣的是進行中的疾病的治療，其中該治療穩定或減輕了患者的不良臨床症狀。期望在受影響的組織完全喪失功能之前進行這種治療。理想地，可以在疾病的症狀階段期間以及在某些情況下在疾病的症狀階段之後施用受試者療法。“治療”，“診治”或“療法”還表示在急性或慢性疾病或病症中症狀的嚴重程度降低或復發率降低，例如在自體免疫疾病的復發或緩解過程中，或者在自體免疫疾病的炎症方面，炎症降低。如本文在癌症的上下文中所使用的，術語“診治”或“抑制”，“阻止”或“壓制”是指以下至少一項：根據標準判斷(例如但不限於實體瘤反應評估標準(RECIST))，腫瘤的生長速率在統計學上的顯著降低、腫瘤的生長停止或腫瘤的大小、質量、代謝活性或腫瘤體積的降低、或者無進展生存期(PFS)或總體生存期(OS)的統計顯著增加。在本發明的上下文中使用的疾病或病症的“預防”，“防治”或“防止”是指單獨或與另一種化合物組合給予本發明的免疫調節多肽或工程細胞，以防止疾病或病症的發生或發作，或防止疾病或病症的某些或全部症狀的發生或發作，或降低疾病或病症發作的可能性。

如關於變體CD80使用的術語“變體”(也為“突變”，“突變的”或“修飾的”)是指通過人為干預產生的CD80，例如哺乳動物(例如人或鼠)CD80。變體CD80是相對於未修飾或野生型CD80具有改變的胺基酸序列的多肽。變體CD80是一種多肽，其與野生型CD80同工型序列的區別在於一個或多個胺基酸取代、缺失、添加或其組合。為了本文的目的，變體CD80包含至少一個親和力修飾的結構域，由此一個或多個胺基酸差異出現在IgSF結構域(例如IgC結構域和/或IgV結構域)中。變體CD80可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多的胺基酸差異，例如胺基酸取代。變體CD80多肽通常與野生型或未修飾的CD80細胞外結構域(SEQ ID NO：1)具有至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性。非天然存在的胺基酸以及天然存在的胺基酸都包括在允許的取代或添加的範圍內。變體CD80不限於任何特定的製備方法，並且包括例如從頭化學合成、從頭重組DNA技術或其組合。本發明的變體CD80特異性結合哺乳動物物種的至少一個或多個：CD28、PD-L1或CTLA-4。在一些實施例中，與野生型CD80蛋白相比，改變的胺基酸序列導致與CD28、PD-L1或CTLA-4的結合親和力或親合力改變(即增加或降低)。結合親和力或親合力的增加或降低可以使用眾所周知的結合測定法例如流式細胞術來確定。拉森等人的美國移植雜誌，第5卷：443-453(2005)。也參見林斯利等人的，免疫，1：7930801(1994)。與野生型CD80對照值相比，變體CD80對CD28、PD-L1或CTLA-4的親和力或親合力增加的值至少大5%，在某些實施例中，比野生型CD80對照值至少大10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%。CD80對CD28、PD-L1或CTLA-4的親和力或親合力的降低值不超過野生型CD80對照值的95%，在某些實施例中不大於野生型CD80對照值的80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%或沒有可檢測的結合親和力或親合力。通過取代、添加或缺失胺基酸殘基，在一級胺基酸序列中改變了變體CD80。在變體CD80的上下文中，術語“變體”不解釋為對產生變體CD80的任何特定起始成分或方法施加任何條件。變體CD80可以例如從野生型哺乳動物CD80序列資訊開始生成，然後在電腦上建模以與CD28、PD-L1或CTLA-4結合，最後重組或化學合成以產生本發明的變體CD80。在替代實施例中，變體CD80可通過野生型CD80的定點誘變來產生。因此，變體CD80表示成分，而不一定表示通過任何給定方法生產的產物。可以採用多種技術，包括重組方法、化學合成或其組合。

在進一步描述本發明之前，應理解，本發明不限於所描述的特定實施例，因為這樣當然可以變化。還應理解，本文中使用的術語僅出於描述特定實施例的目的，而無意於進行限制，因為本發明的範圍將僅由所附申請專利範圍限制。

在提供數值範圍的情況下，應理解的是除非上下文另外明確指出，否則在該範圍的上限和下限與該規定範圍內的任何其他所述值或中間值之間的每個中間值均達到下限的十分之一。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地包含在較小範圍中，並且也應包括在本發明內容之內，但受制於所述範圍中任何明確排除的限制。在所述範圍包括一個或兩個極限的情況下，除了那些包括的限制中的一個或兩個之外的範圍也包括在本發明中。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。儘管類似於或等同於本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用於本發明的實踐或測試中，但是現在描述較佳的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用併入本文，以公開和描述與引用出版物相關的方法和/或材料。

必須注意的是，如本文和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式的“一”，“一個”和“該”包括複數物件，除非上下文另外明確指出。因此，例如，提及“多聚體多肽”包括多個這樣的多聚體多肽，並且提及“調節結構域”包括提及本領域技術人員已知的一個或多個調節結構域及其等同物，等。還應注意，申請專利範圍可以被草擬為排除任何可選要素。因此，本聲明旨在作為在陳述索賠要素或使用“否定”限制時使用“僅”、“僅”等專有術語的先行依據。

應當理解，為清楚起見在單獨的實施例的上下文中描述的本發明的某些特徵也可以在單個實施例中組合提供。相反，為簡潔起見，在單個實施例的上下文中描述的本發明的各種特徵也可以單獨地或以任何合適的子組合來提供。與本發明有關的實施例的所有組合都被本發明明確地涵蓋，並且在本文中公開，就好像每個和每個組合都被單獨地並且明確地公開一樣。另外，本發明還明確地涵蓋了各種實施例及其元素的所有子組合，並且在本文中進行公開，就像每個和每個這樣的子組合在本文中被單獨地並且明確地公開一樣。

本文所討論的出版物僅出於其在本申請的提交日期之前的公開而提供。本文中的任何內容均不應解釋為承認本發明由於先前的公開而無權早於該出版物。此外，提供的發佈日期可能與實際發佈日期有所不同，實際發佈日期可能需要獨立確認。

[II.變體CD80多肽]

本發明提供了變體CD80多肽，其對一個或多個CD80同源結合配偶體表現出改變的(增加的或降低的)結合活性或親和力。在一些實施例中，CD80同源結合配偶體是CD28、PD-L1或CTLA-4。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽或包含免疫球蛋白超家族(IgSF)結構域或其特異性結合片段的野生型或未修飾的CD80的一部分，變體CD80多肽在免疫球蛋白超家族(IgSF)結構域(IgD)中包含一個或多個胺基酸修飾，例如一個或多個取代(或者“突變”或“替換”)、缺失或添加。因此，提供的變體CD80多肽是或包含變體IgD(在下文中稱為“vIgD”)，其中一個或多個胺基酸修飾(例如取代)在IgD中。

在一些實施例中，IgD包含IgC結構域或IgV結構域或IgC結構域或IgV結構域的特異性結合片段，或其組合。在一些實施例中，IgD可以僅是IgC，IgC和IgV的組合，包括整個細胞外結構域(ECD)，或CD80的Ig結構域的任何組合。表1提供了對應於CD80的IgC結構域的示例性殘基。

CD80的IgC結構域不與CD80的結合配偶體直接相互作用。本發明人採用基於結構的合理設計來選擇CD80的IgC結構域內的位置以進行誘變。這些選擇的位置位於IgV和IgC之間的結構域間附近，並且位於柔性鉸鏈區域附近。該區域的突變可能會迫使IgC的三級結構發生變化，從而影響CD80二聚體的結構。

本發明人選擇突變在結合後不與靶蛋白直接相互作用的IgC結構域中的胺基酸殘基。他們合理地設計了IgC結構域中的突變，這些突變將改變整個突變蛋白的構象和/或動力學，然後，通過與靶蛋白相互作用來調節其對靶蛋白的結合親和力和/或其生物學功能，例如，調節突變蛋白對CD28活化的功能。通過這種方法，本發明人實現了選擇性地改變CD80蛋白與所選靶蛋白的結合親和力或功能，同時使與另一種目標蛋白質之一或其他兩種目標蛋白質的相互作用受到的影響最小。例如，通過合理的設計，本發明者已獲得對CD28活化具有一系列活性，同時保持對CTLA-4的類似結合親和力的突變。例如，與wtCD80相比，A165F的CD28活性非常低，但其對CTLA-4(通過FACS進行的結合測定，EC₅₀ = 0.046 uM vs EC₅₀ = 0.014 uM wt CD80)和PD-L1(ELISA測定，EC₅₀ = 0.38 uM vs EC₅₀ = 0.98 uM wt CD80)的結合親和力相似；與wt CD80相比，S131I對CTLA-4(通過FACS的結合測定，EC₅₀ = 0.028 uM vs EC₅₀ = 0.014 uM wt CD80)具有類似的CD28活性(IL-2釋放測定，EC₅₀ = 1.13 uM vs EC₅₀ = 0.94 uM wt CD80)和結合親和力，其對PD-L1的結合親和力比wt CD80高四倍(ELISA測定，EC₅₀ = 0.24 uM vs EC₅₀ = 0.98 uM wt CD80)。

在一些實施方案中，相對於未修飾的CD80序列的序列，在一個或多個IgSF結構域中修飾了變體。在一些實施例中，未修飾的CD80序列是野生型CD80。在一些實施例中，未修飾的或野生型CD80具有天然CD80或其直系同源物的序列。在一些實施例中，未修飾的CD80為或包含CD80細胞外結構域(ECD)或其包含的一個或多個IgSF結構域的部分。在一些實施例中，未修飾的或野生型CD80多肽的細胞外結構域包含IgC結構域和/或IgV結構域。然而，變體CD80多肽不必同時包含IgC結構域和IgV結構域。在一些實施例中，變體CD80多肽包含或基本上由IgC結構域或其特異性結合片段組成。在一些實施例中，變體CD80多肽包含或基本上由IgV結構域或其特異性結合片段組成。在一些實施例中，變體CD80是可溶的並且缺乏跨膜結構域。在一些實施例中，變體CD80還包含跨膜結構域，並且在某些情況下還包含細胞質結構域。

在一些實施例中，野生型或未修飾的CD80序列是哺乳動物CD80序列。在一些實施例中，野生型或未修飾的CD80序列可以是哺乳動物CD80，其包括但不限於人、小鼠、食蟹猴或大鼠。在一些實施例中，野生型或未修飾的CD80序列是人的。

在一些實施例中，變體CD80多肽包含與SEQ ID NO：1具有至少80%相同胺基酸序列的胺基酸序列，其中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含一個或多個胺基酸取代修飾，其中，一個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、165或166處。在一些實施方案中，胺基酸取代修飾是除SEQ ID NO：1中的相應野生型胺基酸之外的20個胺基酸中的任何一個。

變體CD80多肽通常與相應的野生型或未修飾的CD80、其成熟序列或其包含SEQ ID NO：1所述細胞外結構域或其IgSF結構域的部分具有至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列一致性。在一些實施例中，變體CD80多肽與包含SEQ ID NO：1所示序列的相應野生型或未修飾的CD80表現出至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性。

在一些實施例中，IgC結構域的特異性結合片段含有與相應的野生型或未修飾的IgC結構域具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施例中，IgV結構域的特異性結合片段含有與相應的野生型或未修飾的IgV結構域具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%序列同一性的胺基酸序列。

在任何這樣的實施例中，變體CD80多肽的一個或多個胺基酸修飾(例如取代)可位於任何一個或多個CD80多肽結構域中。例如，在一些實施例中，一個或多個胺基酸取代位於變體CD80多肽的細胞外結構域中。在一些實施例中，一個或多個胺基酸取代位於IgC結構域或IgC結構域的特異性結合片段中。在一些實施例中，一個或多個胺基酸修飾(例如取代)位於IgV結構域或IgV結構域的特異性結合片段中。

在其他實施例中，變體CD80多肽還包含能夠二聚的第二多肽。在一些實施例中，第二多肽是免疫球蛋白 Fc結構域。在一些實施例中，免疫球蛋白 Fc結構域是人IgG1 Fc結構域、人IgG2 Fc結構域、人IgG3 Fc結構域或人IgG4 Fc結構域。在一些實施例中，免疫球蛋白 Fc結構域是小鼠IgG1 Fc結構域、小鼠IgG2a Fc結構域、小鼠IgG2b Fc結構域或小鼠IgG3 Fc結構域。在一些實施例中，變體CD80多肽進一步包含治療活性部分。

在一些實施例中，本文提供了編碼本發明的變體CD80多肽的多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸是合成核酸。在一些實施例中，多核苷酸是cDNA。在一些實施例中，多核苷酸可操作地連接至轉錄控制元素。在一些實施例中，轉錄控制元素是在真核細胞中起作用的啟動子。

在其他實施例中，本文提供了包含本發明的多核苷酸的載體。在一些實施例中，載體是表達載體。在一些實施例中，載體是哺乳動物載體或病毒載體。

通常，多肽的各種屬性中的每一個在下面分別公開(例如，可溶性、可分泌和可與膜結合的多肽、CD80對CD28、PD-L1和CTLA-4的親和力，每個多肽鏈的變異數，連接的多肽鏈的數目，每個變體CD80的胺基酸改變的數目和性質等)。然而，如本領域技術人員將清楚的是，任何特定的多肽可包含這些獨立屬性的組合。應當理解，提及胺基酸，包括表示為用於描述IgSF結構域的結構域組織的SEQ ID NO所示的特定序列，是出於說明性目的，並不意味著限制所提供實施例的範圍。應當理解，多肽及其結構域的描述是基於同源性分析和與相似分子的比對從理論上匯出的。因此，確切的基因座可以變化，並且每種蛋白質不一定相同。因此，特定的IgSF結構域，例如特定的IgC結構域或IgV結構域，可以是更長或更短的幾個胺基酸(例如一個、兩個、三個或四個)。

此外，經常在如上所述的定義的術語的含義內提供如下所述的本發明的各種實施例。因此，當將定義的術語用於討論本文描述的各個方面和屬性時，以特定定義描述的實施例應解釋為通過引用併入。因此，標題，各個方面和實施例的呈現順序以及每個獨立屬性的單獨公開並不意味著對本發明範圍的限制。

[示範性修飾]

在一些實施例中，在SEQ ID NO：1的位置131處的胺基酸取代修飾是S131A、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D或S131Q。在一些實施例中，在SEQ ID NO：1的位置139處的胺基酸取代修飾是L139V。在一些實施例中，在SEQ ID NO：1的位置155處的胺基酸取代修飾是V155A、V155I或V155T。在一些實施例中，在SEQ ID NO：1的位置165處的胺基酸取代修飾是A165S、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D或A165Q。在一些實施例中，在SEQ ID NO：1的位置166處的胺基酸取代修飾是V166A、V166L或V166T。

在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含兩個或多個胺基酸取代修飾，且其中，兩個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置130、131、139、155、156、165或166處。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾V166L和L139V。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V155A。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V155I。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V155T。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和T130A。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V166A。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156I和A165S。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156I和S131A。在一些實施例中，變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾A165S和S131A。

在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含三個或多個胺基酸取代修飾，並且其中，三個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。在一些實施例中，變體CD80多肽包含三個胺基酸取代修飾S156A、V166L和L139V。在一些實施例中，變體CD80多肽包含三個胺基酸取代修飾S156I、A165S和S131A。

在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含四個或多個胺基酸取代修飾，並且其中，四個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽包含五個或多個胺基酸取代修飾，並且其中，五個或多個取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。

在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽對CTLA-4具有增加或降低的結合親和力。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽對CD28具有增加或降低的結合親和力。在一些實施例中，與SEQ ID NO：1相比，變體CD80多肽對PD-L1的結合親和力增加或降低。

在一些實施例中，本發明的變體CD80多肽被唾液酸化。

本文提供了在野生型或未修飾的CD80多肽中包含的IgSF結構域中包含至少一個親和力修飾的IgSF結構域(例如，IgC或IgV)或其特異性結合片段的變體CD80多肽，使得與野生型或未修飾的CD80多肽相比，變體CD80多肽對一個或多個配體CD28、PD-L1或CTLA-4表現出改變的(增加的或降低的)結合活性或親和力。在一些實施例中，如通過例如固相ELISA免疫測定、流式細胞術或Biacore測定所確定的，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和/或CTLA-4具有不同於野生型或未修飾的CD80多肽控制序列的結合親和力。在一些實施例中，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和/或CTLA-4具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和/或CTLA-4具有降低的結合親和力。CD28、PD-L1和/或CTLA-4可以是哺乳動物蛋白，例如人蛋白或鼠蛋白。

每個同源結合配偶體的結合親和力通常是獨立的；也就是說，在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和/或CTLA-4中的一個、兩個或三個具有增加的結合親和力，並且對CD28、PD-L1和/或CTLA-4中的一個、兩個或三個具有降低的結合親和力。

在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CTLA-4具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CTLA-4具有降低的結合親和力。

在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和PD-L1具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28具有增加的結合親和力而對PD-L1具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和PD-L1具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28具有降低結合親和力，具有對PD-L1增加的結合親和力。

在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和CTLA-4具有的增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28具有增加的結合親和力而對CTLA-4具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和CTLA-4具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28具有降低的結合親和力，而對CTLA-4具有增加的結合親和力。

在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1和CTLA-4具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1具有增加的結合親和力而對CTLA-4具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1和CTLA-4具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1具有降低的結合親和力，而對CTLA-4具有增加的結合親和力。

在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和CTLA-4具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和CTLA-4具有降低的結合親和力。

在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和PD-L1具有增加的結合親和力而對CTLA-4具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和PD-L1具有降低的結合親和力，而對CTLA-4具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和CTLA-4具有增加的結合親和力，而對PD-L1具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對CD28和CTLA-4具有降低的結合親和力，而對PD-L1具有增加的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1和CTLA-4具有增加的結合親和力而對CD28具有降低的結合親和力。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，變體CD80多肽對PD-L1和CTLA-4具有降低的結合親和力低，而對CD28具有增加的結合親和力。

在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽對照相比，對CD28、PD-L1和/或CTLA-4具有增加的或更大的結合親和力的變體CD80多肽的結合親和力增加至少約5%，例如對CD28、PD-L1和/或CTLA-4增加至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，結合親和力的增加大於1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此類實例中，除了它不包含一個或多個胺基酸修飾(例如取代)外，野生型或未修飾的CD80多肽具有與變體CD80多肽相同的序列。

在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽對照相比，對CD28、PD-L1和/或CTLA-4具有減少或降低的結合親和力的變體CD80多肽的結合親和力降低至少5%，例如對CD28、PD-L1和/或CTLA-4降低至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，相對於野生型或未修飾的CD80多肽，結合親和力的降低大於1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此類實例中，除了它不包含一個或多個胺基酸修飾(例如取代)外，野生型或未修飾的CD80多肽具有與變體CD80多肽相同的序列。

在一些實施例中，前述實施例中任一項對CD28，PD-Ll和/或CTLA-4的平衡解離常數(Kd)可以小於1×10^-5 M、1×10^-6 M、1×10^-7 M、1×10^-8 M、1×10^-9 M、1×10^-10 M或1×10^-11 M或1×10^-12 M。

在一些實施例中，變體CD80多肽對CD28具有增加的或更大的結合親和力。在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽對照相比，對CD28具有增加或更大的結合親和力的變體CD80多肽的結合親和力增加至少5%，例如對CD28增加至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，對CD28具有增加或更大的結合親和力的變體CD80多肽具有對於CD28小於200pM、300pM、400pM、500pM或600pM的平衡解離常數(Kd)。在一些實施例中，與未修飾的CD80相比，變體多肽以增加的選擇性特異性結合CD28之一的細胞外結構域。在一些實施例中，增加的選擇性是對CD28的。

在一些實施例中，變體CD80多肽對PD-L1具有增加的或更大的結合親和力。在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽對照相比，對PD-L1具有增加或更大的結合親和力的變體CD80多肽的結合親和力增加至少5%，例如對PD-L1增加至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，對PD-L1具有增加或更大的結合親和力的變體CD80多肽具有對於PD-L1小於200pM、300pM、400pM、500pM或600pM的平衡解離常數(Kd)。在一些實施例中，與未修飾的CD80相比，變體多肽以增加的選擇性特異性結合PD-L1之一的細胞外結構域。在一些實施例中，增加的選擇性是對PD-L1的。

在一些實施例中，變體CD80多肽對CTLA-4具有增加的或更大的結合親和力。在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽對照相比，對CTLA-4具有增加或更大的結合親和力的變體CD80多肽的結合親和力增加至少5%，例如對CTLA-4增加至少約10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，對CTLA-4具有增加或更大的結合親和力的變體CD80多肽具有對於CTLA-4小於200pM、300pM、400pM、500pM或600pM的平衡解離常數(Kd)。在一些實施例中，與未修飾的CD80相比，變體多肽以增加的選擇性特異性結合CTLA-4之一的細胞外結構域。在一些實施例中，增加的選擇性是對CTLA-4的。

在一些實施例中，與未修飾的CD80多肽對一個同源結合配偶體與另一個同源結合配偶體的結合率相比，選擇性的提高包括變體CD80多肽與選自PD-L1，CD28和CTLA4的一個同源結合配偶體相對於另一個同源結合配偶體的更大比例結合。在一些實施例中，該比率至少為或至少約為1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。

野生型或未修飾的CD80序列不一定必須用作產生本文所述的變體CD80多肽的起始成分。因此，使用術語“修飾”，例如“取代”並不意味著本發明的實施例限於製備變體CD80多肽的特定方法。變體CD80多肽可以例如通過從頭肽合成來製備，因此在改變密碼子以編碼該修飾(例如取代)的意義上，不一定需要修飾，例如“取代”。該原理還擴展到胺基酸殘基的術語“添加”和“缺失”，它們同樣並不暗示特定的製備方法。設計或產生變體CD80多肽的方法不限於任何特定方法。然而，在一些實施例中，從野生型或未修飾的CD80遺傳材料誘變野生型或未修飾的CD80編碼核酸，並篩選所需的特異性結合親和力和/或IL-2表達的誘導或其他功能活性。在一些實施例中，利用在任何數量的公眾可獲得的資料庫中可獲得的蛋白質或核酸序列從頭合成變體CD80多肽，然後進行篩選。國家生物技術資訊中心提供了此類資訊，如前所述，其網站可以通過網際網路公開訪問，UniProtKB資料庫也是如此。

除非另有說明，否則如本發明全文中所指出的，胺基酸取代由對應於SEQ ID NO：1所示的未修飾的ECD序列的位置編號的胺基酸位置編號表示。

鑒定CD80多肽中修飾(例如胺基酸取代)的相應位置在技術人員的能力範圍內，包括其包含IgSF結構域(例如IgC或IgV)的部分，例如通過將參考序列與SEQ ID NO：1進行比對。在整個本發明內容的修飾清單中，胺基酸位置在中間，相應的未修飾的(例如野生型)胺基酸在數位之前列出，並且鑒定的變體胺基酸取代在數位之後列出。如果修飾是刪除位置，則表示“del”，如果修飾是插入位置，則表示“ins”。

在一些實施例中，變體CD80多肽在野生型或未修飾的CD80序列中具有一個或多個胺基酸修飾(例如取代)。一個或多個胺基酸修飾(例如取代)可以在野生型或未修飾的CD80序列的細胞外結構域(細胞外結構域)中。在一些實施例中，一個或多個胺基酸修飾(例如取代)是在IgC結構域或其特異性結合片段中。在一些實施例中，一個或多個胺基酸修飾(例如取代)是在IgV結構域或其特異性結合片段中。在變體CD80多肽的一些實施例中，一個或多個胺基酸修飾(例如取代)中的一些在IgC結構域或其特異性結合片段中，而一個或多個胺基酸修飾(例如取代)中的一些在IgV結構域或其特異性結合片段中。

在一些實施例中，變體CD80多肽具有多達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸修飾(例如取代)。修飾(例如取代)可以在IgC結構域或IgV結構域中。在一些實施例中，變體CD80多肽在IgC結構域或其特異性結合片段中具有多達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。在一些實施例中，變體CD80多肽在IgV結構域或其特異性結合片段中具有多達1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸取代。在一些實施例中，變體CD80多肽與野生型或未修飾的CD80多肽或其特異性結合片段，例如與SEQ ID NO：1的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。。

在一些實施例中，變體CD80多肽參考SEQ ID NO：1的編號，在未修飾的CD80或其特異性結合片段中具有一個或多個胺基酸修飾(例如取代)，其對應於位置130、131、139、155、156、165或166。在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽相比，此類變體CD80多肽對CD28、PD-L1和/或CTLA-4中的一種或多種表現出改變的結合親和力。例如，在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽相比，變體CD80多肽對CD28、PD-L1和/或CTLA-4的結合親和力增加。在一些實施例中，與野生型或未修飾的CD80多肽相比，變體CD80多肽對CD28、PD-L1或CTLA-4表現出降低的結合親和力。

在一些實施例中，變體CD80多肽具有一個或多個選自T130A、S131A、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、L139V、V155A、V155I、或V155T、A165S、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D、或A165Q、V166A、V166L或V166T或保守的胺基酸修飾(例如取代)的胺基酸修飾(例如取代)。保守的胺基酸修飾(例如取代)是除野生型或未修飾的胺基酸外，與取代的胺基酸屬於同一類胺基酸的任何胺基酸。胺基酸類別包括脂肪族(甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸和異亮胺酸)，羥基或含硫(絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸和蛋胺酸)，環狀(脯胺酸)，芳香族(苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸)，鹼性(組胺酸、賴胺酸和精胺酸)和酸性/醯胺(天冬胺酸、谷胺酸、天冬醯胺和穀胺醯胺)。

在一些實施例中，變體CD80多肽具有一個或多個選自T130A、S131A、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、L139V、V155A、V155I、或V155T、A165S、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D、或A165Q、V166A、V166L或V166T的胺基酸修飾(例如取代)。

在一些實施例中，一個或多個胺基酸修飾(例如取代)是T130A、S131A、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、L139V、V155A、V155I、或V155T、A165S、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D、或A165Q、V166A、V166L、V166T。

在一些實施例中，變體CD80多肽包含表1中列出的任何突變。如所指出的，對應於給定結構域的確切基因座或殘基可以變化，例如取決於用於鑒定或分類結構域的方法。同樣，在某些情況下，給定結構域(例如IgV)的相鄰N-和/或C-末端胺基酸也可以包含在變體IgSF多肽的序列中，以確保表達時結構域的正確折疊。

在一些實施例中，相對於人CD80蛋白，或在非人蛋白版本中的相應位置，變體CD80多肽包含表1中列出的任何突變。在一些實施例中，變體CD80多肽包含表1中提供的細胞外結構域(ECD)或IgV序列的突變。

表1.示例性的變體CD80多肽

位置	單突變	雙突變	三突變
T130	T130A	T130A/S156A
S131	S131A, S131V, S131I, S131F, S131R, S131E, S131D, S131Q	S131A/S156I S131A/A165S	S131A/S156I/A165S
L139		L139V/V166L	L139V/S156A/V166L
V155	V155A, V155I, V155T	V155A/S156A V155I/S156A V155T/S156A
S156	S156V, S156L, S156I, S156F, S156R, S156E, S156D, S156Q	S156A/V155A S156A/V155I S156A/V155T S156A/T130A S156A/V166A S156I/A165S S156I/S131A	S156A/V166L/L139V S156I/A165S/S131A
A165	A165S, A165V, A165I, A165F, A165R, A165E, A165D, A165Q	A165S/S156I A165S/S131A	A165S/S131A/S156I
V166	V166A, V166T	V166L/L139V V166A/S156A	V166L/L139V/S156A

為了提供用於體內研究的替代模型，可以基於野生型小鼠CD80序列T165E、T165Q、T165R、T165A、T165S、T165V、T165I、T165F、T165D、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131Q、S131A和S131P製備和測試以下小鼠CD80變體多肽。野生型小鼠序列在圖14B中提供，並以SEQ ID NO：15提供。

[III.藥物成分]

本發明提供了包含本發明的變體CD80多肽的藥物成分。在一些實施例中，藥物成分還包含藥學上可接受的賦形劑。在一些實施例中，藥物成分是無菌的。在一些實施例中，試劑盒包含本發明的藥物成分和使用說明書。

在其他實施例中，製品包含在小瓶中的本發明的藥物成分。在一些實施例中，小瓶是密封的。在一些實施例中，試劑盒包括本發明的製品和使用說明書。

除了本發明內容的多聚體多肽之外，本發明內容的藥物成分還可包含一個或多個：鹽，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；緩衝劑，例如Tris緩衝劑，N-(2-羥乙基)呱嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-Morpholino)乙磺酸(MES)、2-(N-Morpholino)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-Morpholino)丙烷磺酸(MOPS)、N-三[羥甲基]甲基-3-胺基丙烷磺酸(TAPS)等；增溶劑；去污劑，例如非離子去污劑如Tween-20等；蛋白酶抑制劑；甘油；等。

藥物成分可以包含藥學上可接受的賦形劑，其多種在本領域中是已知的，並且在本文中不需要詳細討論。藥學上可接受的賦形劑已在各種出版物中充分描述，包括，例如，“雷明頓：藥學的科學與實踐”，第19版(1995)，或最新版本，麥克出版社；A.根納羅(2000)，“雷明頓：藥學的科學與實踐”，第20版，利平科特，威廉姆斯和威爾金斯；藥物劑型和藥物遞送系統(1999)，H.C.安塞爾等人，第7版，利平科特，威廉姆斯和威爾金斯；以及藥物賦形劑手冊(2000)A.H.基貝等，編輯，第三版，阿米爾，製藥協會。

藥物成分可以包含本發明的多聚多肽和藥學上可接受的賦形劑。在某些情況下，受試者藥物成分適合於例如無菌施用給受試者。例如，在一些實施例中，受試者藥物成分適合於施用於人類受試者，例如，其中成分是無菌的並且不含可檢測的熱原和/或其他毒素。

蛋白質成分可以包含其他組分，例如藥用級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、鎂、碳酸鹽等。成分可包含近似生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，例如pH調節劑和緩沖劑、毒性調節劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉、鹽酸鹽、硫酸鹽、溶劑化物(例如混合離子鹽、水、有機物)、水合物(例如水)等。

例如，成分可包括水溶液、粉末形式、顆粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊劑、混懸劑、噴霧劑等。可以根據下述各種給藥途徑配製成分。

當將本發明內容的多肽或多聚體或二聚體蛋白以可注射方式(例如皮下、腹膜內、肌內和/或靜脈內)注射施用至組織中時，製劑可以以即用劑型或非水形式(例如可重構的儲存穩定的粉末)或水性形式提供，例如由藥學上可接受的載體和賦形劑組成的液體。還可以提供含蛋白質的製劑，以提高給藥後受試者蛋白質的血清半衰期。例如，可以以脂質體製劑形式、以膠體形式或其他常規技術提供蛋白質，以延長血清半衰期。如在例如Szoka等人的，1980年，生物物理學報，生恩，9：467美國專利4,235,871、4,501,728和4,837,028所述，有多種方法可用於製備脂質體。製劑也能夠以受控釋放或緩慢釋放形式提供。

適用於腸胃外給藥的製劑的其他實例包括等滲無菌注射溶液、抗氧化劑、抑菌劑和溶質、使製劑與預期受體的血液等滲、懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。例如，受試者藥物成分可以存在於容器例如無菌容器如注射器中。製劑可以存在於單位劑量或多劑量密封的容器中，例如安瓿和小瓶，並且可以在使用前立即以凍乾(凍乾的)狀態保存，只需添加無菌液體賦形劑(例如水)進行注射即可。臨時注射溶液和混懸液可以由無菌粉劑、顆粒劑和片劑製備。

本發明內容的多肽或多聚體或二聚體蛋白在製劑中的濃度可以廣泛地變化(例如，按重量計小於約0.1%，通常為或至少約2%至高達20%至50%或更多)，並且通常將根據所選擇的特定給藥方式和患者的需求，主要根據體液量，黏度和基於患者的因素來選擇濃度。

本發明提供了容器，其包含本發明的成分，例如液體成分。容器可以是例如注射器、安瓿瓶等。在某些情況下，容器是無菌的。在某些情況下，容器和成分都是無菌的。

[IV.使用方法]

在一些實施例中，本文提供了在受試者中調節免疫反應的方法，其包括向受試者施用本發明的藥物成分。在一些實施例中，調節免疫反應治療受試者的疾病或病症。在一些實施例中，免疫反應增加。在一些實施例中，免疫反應降低。

在一些實施例中，疾病或病症是腫瘤或癌症。在一些實施例中，疾病或病症選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液惡性腫瘤、肝癌、腦癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨骼癌、頭頸癌、胃腸道癌、生殖細胞癌或內分泌和神經內分泌癌。在一些實施例中，疾病或病症是炎性或自體免疫性疾病或病症。在一些實施例中，疾病或病症是抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關的血管炎、血管炎、自體免疫性皮膚病、移植、風濕性疾病、炎性胃腸疾病、炎性眼病、炎性神經疾病、炎性肺疾病、炎性內分泌疾病或自體免疫性血液病。在一些實施例中，疾病或病症選自炎性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。

在一些實施例中，本文提供了治療受試者的疾病或病症的方法，其包括向受試者施用本發明的藥物成分。

在一些實施例中，疾病或病症是腫瘤或癌症。在一些實施例中，本文提供的疾病或病症選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液惡性腫瘤、肝癌、腦癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨骼癌、頭頸癌、胃腸道癌、生殖細胞癌或內分泌和神經內分泌癌。

在一些實施例中，疾病或病症是感染。在一些實施例中，疾病或病症是炎性或自體免疫性疾病或病症。在一些實施例中，本文提供的疾病或病症是抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關的血管炎、血管炎、自體免疫性皮膚病、移植、風濕性疾病、炎性胃腸疾病、炎性眼病、炎性神經疾病、炎性肺疾病、炎性內分泌疾病或自體免疫性血液病。在一些實施例中，本文提供的疾病或病症選自炎性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。

在一些實施例中，給患者施用第二治療劑。

[示例]

提出以下實施例以向本領域普通技術人員提供關於如何製作和使用本發明的完整公開和描述，並且既不意圖限制發明人認為其公開的範圍，也不意圖代表以下實驗是全部或唯一進行的實驗。

[示例1]

用於生產突變型CD80-Fc融合蛋白的表達載體的構建以及突變型CD80-Fc融合蛋白的表達/純化(CD80變體)

通過從頭基因合成產生野生型人CD80-人IgG1 Fc表達盒(hCD80-Fc，圖13A)，並將其複製到pcDNA3.4載體(賽默飛世爾科技)中。根據提供商手冊/協定，通過QuikChange Lightning定向誘變試劑盒(Agilent)進行定點誘變或通過DNA合成(GenScript)直接引入位置S131、V155、A165和V166的CD80 IgC結構域突變。表2和表3列出了用於定點誘變的引子，並用於單定點誘變。QuikChange Lightening多定點誘變試劑盒用於多定點誘變。

使用ExpiFECtamine 293轉染試劑(Thermo Fisher Scientific)將含有編碼表1以及圖13A和24中所述的野生型CD80或突變的CD80變體的多核苷酸的構建的pcDNA3.4表達載體轉染到Expi 293F細胞中。轉染20小時後，將ExpiFECtamine 293轉染增強劑1和增強劑2加入孔中。將培養物在加有5%CO₂ 的75%濕度的潮濕培養箱中於37℃培養。轉染後6天收穫轉染的培養物。通過在室溫下培養上清液和樹脂4分鐘，使用GE Healthcare Protein A HP SpinTrap柱純化了從轉染的Expi 293F細胞表達的CD80-Fc融合蛋白。用pH7.2的磷酸鈉緩衝液洗滌柱，並用pH3.0的100mM甘胺酸-HCl洗脫。使用1.0MTris-HCl，pH9.0中和洗脫液。將純化的蛋白在pH7.2的PBS緩衝液中透析，並通過0.2µm膜進行無菌過濾。進行SDS-PAGE分析，並且來自分析的突變CD80-Fc融合蛋白的結果總結在圖15A-15F中。將所有CD80-Fc融合蛋白純化至接近95%的純度。在兩種條件下，在SDS-PAGE凝膠上測試純化的蛋白質；(i)不還原靶融合蛋白中二硫鍵的非還原條件，和(ii)還原靶融合蛋白中二硫鍵的還原條件。載有每種純化的變體CD80-Fc融合蛋白的未還原樣品(圖15A)和還原樣品(圖15B)如下：泳道1：分子量標記；泳道2：S131F，1.5ug/lane；泳道3：S131R，1.5ug/lane；泳道4：S131E，2.0ug/lane；泳道5：S131D，1.6ug/lane；泳道6：S131Q，1.6ug/lane；泳道7：A165V，1.2ug/lane；泳道8：A165I，1.6ug/lane；泳道9：A165F，1.6ug/lane；泳道10：A165R，1.6ug/lane；泳道11：A165D，1.6ug/lane；泳道12：A165Q，1.6ug/lane。載有每種純化的變體CD80-Fc融合蛋白的未還原樣品(圖15C)和還原樣品(圖15D)如下：泳道1：分子量標記；泳道2：V166A，10/lane；泳道3：V166T，10ug/lane；泳道4：V166L/L139V，10ug/lane；泳道5：S156A/V155A，10ug/lane；泳道6：S156A/V155I，10ug/lane；泳道7：S156A/V155T，10ug/lane；泳道8：S156A/T130A，10ug/lane；泳道9：S156A/V166A，10ug/lane；泳道10：S156A/V166L/L139V，10ug/lane。載有每種純化的變體CD80-Fc融合蛋白的未還原樣品(圖15E)和還原樣品(圖15F)如下：泳道1：分子量標記；泳道2：S131V，10ug/lane；泳道3：V155A，10ug/lane；泳道4：V155I，10ug/lane；泳道5：V155T，10ug/lane。

表2.定點誘變引子

S156I-f	CCATCAACACAACCGTGATCCAAGACCCCGAAACAG (SEQ ID NO： 16)
S156I-r	CTGTTTCGGGGTCTTGGATCACGGTTGTGTTGATGG (SEQ ID NO： 17)
A165S-f	CCGAAACAGAGCTCTACAGCGTGAGTAGTAAGCTGG (SEQ ID NO： 18)
A165S-r	CCAGCTTACTACTCACGCTGTAGAGCTCTGTTTCGG (SEQ ID NO： 19)
S131A-f	ATCATCTGCAGTACCGCTGGTGGGTTCCCTG (SEQ ID NO： 20)
S131A-r	CAGGGAACCCACCAGCGGTACTGCAGATGAT (SEQ ID NO： 21)
S156F-f	CATCAACACAACCGTGTTCCAAGACCCCGAAACAGAGCTCTAC (SEQ ID NO： 22)
S156F-r	GTTTCGGGGTCTTGGAACACGGTTGTGTTGATGGCGTTGAG (SEQ ID NO： 23)
S156R-f	CATCAACACAACCGTGAGGCAAGACCCCGAAACAGAGCTCTAC (SEQ ID NO： 24)
S156R-r	GTTTCGGGGTCTTGCCTCACGGTTGTGTTGATGGCGTTGAG (SEQ ID NO： 25)
S156E-f	CATCAACACAACCGTGGAGCAAGACCCCGAAACAGAGCTCTAC (SEQ ID NO： 26)
S156E-r	GTTTCGGGGTCTTGCTCCACGGTTGTGTTGATGGCGTTGAG (SEQ ID NO： 27)
S156D-f	CATCAACACAACCGTGGACCAAGACCCCGAAACAGAGCTCTAC (SEQ ID NO： 28)
S156D-r	GTTTCGGGGTCTTGGTCCACGGTTGTGTTGATGGCGTTGAG (SEQ ID NO： 29)
S156Q-f	CATCAACACAACCGTGCAGCAAGACCCCGAAACAGAGCTCTAC (SEQ ID NO： 30)
S156Q-r	GTTTCGGGGTCTTGCTGCACGGTTGTGTTGATGGCGTTGAG (SEQ ID NO： 31)
S131V-f	CATCTGCAGTACCGTGGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 32)
S131V-r	CAGGGAACCCACCCACGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 33)
S131I-f	CATCTGCAGTACCATCGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 34)
S131I-r	CAGGGAACCCACCGATGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 35)
S131F-f	CATCTGCAGTACCTTCGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 36)
S131F-r	CAGGGAACCCACCGAAGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 37)
S131R-f	CATCTGCAGTACCAGGGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 38)
S131R-r	CAGGGAACCCACCCCTGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 39)
S131E-f	CATCTGCAGTACCGAGGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 40)
S131E-r	CAGGGAACCCACCCTCGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 41)
S131D-f	CATCTGCAGTACCGACGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 42)
S131D-r	CAGGGAACCCACCGTCGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 43)
S131Q-f	CATCTGCAGTACCCAGGGTGGGTTCCCTGAGCCCCATCTC (SEQ ID NO： 44)
S131Q-r	CAGGGAACCCACCCTGGGTACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 45)
A165V-f	GAAACAGAGCTCTACGTGGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 46)
A165V-r	CTTACTACTCACCACGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 47)
A165I-f	GAAACAGAGCTCTACATCGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 48)
A165I-r	CTTACTACTCACGATGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 49)
A165F-f	GAAACAGAGCTCTACTTCGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 50)
A165F-r	CTTACTACTCACGAAGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 51)
A165R-f	GAAACAGAGCTCTACAGGGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 52)
A165R-r	CTTACTACTCACCCTGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 53)
A165E-f	GAAACAGAGCTCTACGAGGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 54)
A165E-r	CTTACTACTCACCTCGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 55)
A165D-f	GAAACAGAGCTCTACGACGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 56)
A165D-r	CTTACTACTCACGTCGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 57)
A165Q-f	GAAACAGAGCTCTACCAGGTGAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 58)
A165Q-r	CTTACTACTCACCTGGTAGAGCTCTGTTTCGGGGTCTTG (SEQ ID NO： 59)

表3.定點誘變引物

引子ID	引子序列
T130A-f	CAGGAGAATCATCTGCAGTGCATCTGGTGGGTTCCCTGAG (SEQ ID NO： 60)
T130A-r	CTCAGGGAACCCACCAGATGCACTGCAGATGATTCTCCTG (SEQ ID NO： 61)
S131V-f	GAGAATCATCTGCAGTACCGTTGGTGGGTTCCCTGAGCC (SEQ ID NO： 62)
S131V-r	GGCTCAGGGAACCCACCAACGGTACTGCAGATGATTCTC (SEQ ID NO： 63)
L139V-f	GTTCCCTGAGCCCCATGTTAGCTGGCTGGAGAACG (SEQ ID NO： 64)
L139V-r	CGTTCTCCAGCCAGCTAACATGGGGCTCAGGGAAC (SEQ ID NO： 65)
V155A-f	CAACGCCATCAACACAACCGCATCCCAAGACCCCGAAACAG (SEQ ID NO： 66)
V155A-r	CTGTTTCGGGGTCTTGGGATGCGGTTGTGTTGATGGCGTTG (SEQ ID NO： 67)
V155I-f	CAACGCCATCAACACAACCATCTCCCAAGACCCCGAAACAG (SEQ ID NO： 68)
V155I-r	CTGTTTCGGGGTCTTGGGAGATGGTTGTGTTGATGGCGTTG (SEQ ID NO： 69)
V155T-f	CAACGCCATCAACACAACCACCTCCCAAGACCCCGAAACAG (SEQ ID NO： 70)
V155T-r	CTGTTTCGGGGTCTTGGGAGGTGGTTGTGTTGATGGCGTTG (SEQ ID NO： 71)
S156A-f	GCCATCAACACAACCGTGGCACAAGACCCCGAAACAGAG (SEQ ID NO： 72)
S156A-r	CTCTGTTTCGGGGTCTTGTGCCACGGTTGTGTTGATGGC (SEQ ID NO： 73)
V166A-f	CGAAACAGAGCTCTACGCCGCAAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC  (SEQ ID NO： 74)
V166A-r	GTTAAAGTCCAGCTTACTACTTGCGGCGTAGAGCTCTGTTTCG (SEQ ID NO： 75)
V166L-f	CCGAAACAGAGCTCTACGCCCTCAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 76)
V166L-r	GTTAAAGTCCAGCTTACTACTGAGGGCGTAGAGCTCTGTTTCGG (SEQ ID NO： 77)
V166T-f	CCGAAACAGAGCTCTACGCCACCAGTAGTAAGCTGGACTTTAAC (SEQ ID NO： 78)
V166T-r	GTTAAAGTCCAGCTTACTACTGGTGGCGTAGAGCTCTGTTTCGG (SEQ ID NO： 79)
S155A/S156A-f	CAACGCCATCAACACAACCGCAGCACAAGACCCCGAAACAGAGC  (SEQ ID NO： 80)
S155A/S156A-r	GCTCTGTTTCGGGGTCTTGTGCTGCGGTTGTGTTGATGGCGTTG (SEQ ID NO： 81)
V155I/S156A-f	CAACGCCATCAACACAACCATCGCCCAAGACCCCGAAACAGAGC (SEQ ID NO： 82)
V155I/S156A-r	GCTCTGTTTCGGGGTCTTGGGCGATGGTTGTGTTGATGGCGTTG (SEQ ID NO： 83)
V155T/S156A-f	CAACGCCATCAACACAACCACCGCCCAAGACCCCGAAACAGAG (SEQ ID NO： 84)
V155T/S156A-r	CTCTGTTTCGGGGTCTTGGGCGGTGGTTGTGTTGATGGCGTTG (SEQ ID NO： 85)

[示例2]

通過ELISA和Biacore評估CD80變體對CTLA-4，PD-L1和CD28的結合親和力

(1)通過ELISA的CD80突變結合親和力：

為了通過ELISA測試結合親和力，首先在4℃下用1ug/mLhCTLA-4(來自中華生物的重組His標籤)包被ELISA板過夜。第二天，除去hCTLA-4溶液，並將板在室溫下用1%BSA封閉1小時。除去1%BSA溶液後，將板用PBST(含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩衝鹽水)洗滌3次。用於該結合測定的純化的CD80變體樣品以100μL/孔一式兩份添加，以4ug/mL的濃度開始以1：3的系列稀釋液稀釋，並在室溫下攪拌培養2小時。用PBST洗滌3次後，加入100uL/孔的HRP-抗-hIgG的1：10,000稀釋度的二抗，並在室溫下攪拌培養1小時。將板用PBST洗滌3次，並添加100uL/孔的TMB底物。將板培養直至顯色。加入終止溶液以終止反應。在OD450處讀取板。

分別對CD28和PD-L1重組蛋白進行了類似的ELISA實驗，不同的是，平板用2ug/mL的重組CD28和PD-L1蛋白(來自中國生物的重組His標籤)包被，並且CD80變體的稀釋液從20ug/mL開始。

通過與每個平板上的野生型CD80的EC₅₀ 相比較來確定與CTLA-4、CD28或PD-L1結合的CD80變體的EC₅₀ 值。

通過ELISA的結合親和力測定的結果顯示在圖16A-16F中(CD80變體對CTLA-4的結合親和力)。表4總結了圖16A-16E中給出的結合測定的結果，其中每個測試的CD80-Fc融合蛋白的最高OD450值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。表5總結了圖16F中所示的結合測定結果，其中包含每個測試的CD80-Fc融合蛋白(例如T130A、S131V、L139V、V155A、V155I、V155T、S156A、V166A、V166L、V166T、V155A/S156A、V155I/S156A、V155T/S156A和CD80-WT)的最高OD450值，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

通過ELISA的結合親和力測定的結果顯示在圖17A-17E中(CD80變體對CD28的結合親和力)。表6總結了圖17A-17E中給出的結合測定的結果，其中每個測試的CD80-Fc融合蛋白的最高OD450值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

通過ELISA的結合親和力測定的結果顯示在圖18A-18E中(CD80變體對PD-L1的結合親和力)。表7總結了圖18A-18E中給出的結合測定的結果，其中每個測試的CD80-Fc融合蛋白的最高OD450值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

表4

表5

表6

表7

(2)通過BIAcore測量的CD80突變結合親和力：

為了通過BIAcore測量結合親和力，在BIAcoreX100型(Biacore/GEHealthcare，Piscataway，NJ)上於25℃進行親和力測量，使用PBST緩衝液(20mM PB + 150 mM NaCl + 0.05%Tween20，pH 7.4)作為運行緩衝液。在一個流通池中以10 ul / min的流速將NTA感測器晶片(目錄BR-1000-07; GE Healthcare)與鎳離子(0.5 mM NiCl2)螯合1分鐘，以捕獲在C端含有多組胺酸標籤的hCTLA-4(目錄11159-H08H；信和生物)。將hCTLA-4溶液以10ul/min的流速注入2分鐘，然後穩定3分鐘。然後將hCD80-Fc融合突變以2倍稀釋系列從亞nM注入幾百nM，以30ul/min的流速注入3分鐘，並監測解離12分鐘。通過以30ul/min的流速注入350mMEDTA緩衝液3分鐘以去除鎳和任何螯合的蛋白質，從而執行再生程式。通過使用製造商提供的BIAevaluation軟體(Biacore)中的1：1Langmuir結合模型同時擬合傳感圖的締合和解離相，進行動力學分析。在每個分析中都應用了雙重參照，以消除來自參照表面和僅緩衝液對照的背景響應。圖19描繪了使用BIAcore模型X100，與野生型和未修飾的CD80-Fc融合蛋白(例如hCD80-hLgG1( FcTm，無效應子 Fc的 Fc三重突變)和hCD80-hIgG1)作對照相比，對包含單突變、雙突變和三突變(例如hCD80(S156A)-hIgG1、hCD80(S156A)-hIgG1( FcTm)、hCD80(A165S)-hIgG1、hCD80(S131A)-hIgG1、hCD80(S156V)-hIgG1、hCD80(S156L)-hIgG1、hCD80(S156I)-hIgG1、hCD80(S131V)-hIgG1、hCD80(V155A)-hIgG1、hCD80(V155I)-hIgG1、hCD80(V155T)-hIgG1、hCD80(V166A)-hIgG1、hCD80(V166T)-hIgG1、hCD80(V166L/L139V)-hIgG1、hCD80(S156A/V155A)-hIgG1、hCD80(S156A/V155I)-hIgG1、hCD80(S156A/V166T)-hIgG1、hCD80(S156A/T130A)-hIgG1、hCD80(S156A/V166A)-hIgG1、hCD80(S156A/V166L/L139V)-hIgG1)的每個變體人CD80-IgG1 Fc融合蛋白與結合配偶體人CTLA-4的結合測定的結果。

如圖19所示，所有CD80變體(突變型hCD80-Fc融合蛋白)對CTLA-4的結合親和力均高於野生型CD80-Fc融合蛋白。

(3)通過生物層干涉法(BLI)生物感測器測量的CD80突變結合親和力

通過ForteBio的Octet RED384系統分析了CD80變體對PD-L1或CD28的動力學親和力。通過捕獲法(感測器類型：HIS1K-Anti-Penta-HIS)將hPD-L1-His或hCD28-His固定在生物感測器的表面。在基線步驟之後，將生物感測器浸入含有不同濃度CD80變體的溶液中。實驗溫度為30℃，轉速為1000rpm/min。運行緩衝液為20mM PB，150mM NaCl，0.05%Tween20，pH7.4，而再生溶液為10mM甘胺酸-HCl，pH1.5。表8總結了CD80變體對hPD-L1的動力學親和力的結果。表9總結了CD80變體對CD28的動力學親和力的結果。

表8. CD80變體對hPD-L1的動力學親和力

樣本 ID	配體	Kd (M)	Kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
WT	hPD-L1-His	2.59E-08	5.28E+04	2.68E-03
S131V	hPD-L1-His	1.75E-07	2.01E+05	3.15E-02
V155A	hPD-L1-His	3.61E-07	2.23E+05	8.04E-02
V155I	hPD-L1-His	7.85E-08	3.03E+05	2.38E-02
V155T	hPD-L1-His	4.96E-08	4.03E+05	2.00E-02
V166A	hPD-L1-His	6.62E-08	3.69E+06	2.44E-02
V166T	hPD-L1-His	2.34E-08	3.61E+06	8.45E-03
V166L/L139V	hPD-L1-His	1.23E-07	2.16E+06	2.65E-02
S156A/V155A	hPD-L1-His	6.87E-05	1.39E+03	9.57E-02
S156A/V155I	hPD-L1-His	2.65E-07	1.95E+05	5.18E-02
S156A/V155T	hPD-L1-His	3.74E-07	2.31E+05	8.66E-02
S156A/T130A	hPD-L1-His	3.91E-07	1.82E+05	7.12E-02
S156A/V166A	hPD-L1-His	low	low	low
S156A/V166L/L139V	hPD-L1-His	2.28E-06	1.70E+05	3.88E-02
S156I	hPD-L1-His	2.15E-08	3.34E+05	7.17E-03
A165S	hPD-L1-His	1.99E-08	2.87E+05	5.71E-03
S131A	hPD-L1-His	low	low	low
S156I/A165S	hPD-L1-His	2.07E-08	2.67E+05	5.53E-03
S156I/S131A	hPD-L1-His	1.39E-08	2.32E+05	3.23E-03
A165S/S131A	hPD-L1-His	4.00E-08	2.42E+05	9.70E-03
S156I/A165S/S131A	hPD-L1-His	3.20E+08	2.49E+05	7.98E-03
S156F	hPD-L1-His	2.56E-08	2.54E+05	6.52E-03
S156R	hPD-L1-His	4.61E-08	2.51E+05	1.16E-02
S156E	hPD-L1-His	3.16E-08	2.76E+05	8.74E-03
S156D	hPD-L1-His	2.60E-08	2.46E+05	6.41E-03
S156Q	hPD-L1-His	low	low	low
S131V	hPD-L1-His	8.95E-08	1.62E+05	1.45E-02
S131I	hPD-L1-His	2.53E-08	2.61E+05	6.59E-03
S131F	hPD-L1-His	3.38E-08	3.42E+05	1.16E-02
S131R	hPD-L1-His	3.40E-08	2.54E+05	8.62E-03
S131E	hPD-L1-His	2.87E-08	2.86E+05	8.20E-03
S131D	hPD-L1-His	4.67E-08	2.39E+05	1.11E-02
S131Q	hPD-L1-His	4.00E-08	2.42E+05	9.67E-03
A165V	hPD-L1-His	1.07E-07	2.73E+05	2.93E-02
A165I	hPD-L1-His	2.47E-08	4.79E-05	1.18E-02
A165F	hPD-L1-His	4.18E-08	3.91E+05	1.63E-02
A165R	hPD-L1-His	3.48E-08	3.29E+05	1.14E-02
A165E	hPD-L1-His	3.70E-08	4.44E+06	1.64E-02
A165D	hPD-L1-His	4.37E-08	3.33E+06	1.45E-02
A165Q	hPD-L1-His	8.26E-08	2.99E+06	2.47E-02

表9. CD80變體對CD28的動力學親和力

樣本 ID	配體	Kd (M)	Kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
WT	hCD28-His	1.81E-08	6.07E+05	0.011
S131V	hCD28-His	1.90E-08	1.79E+06	3.41E-02
V155A	hCD28-His	4.29E-08	1.33E+06	5.72E-02
V155I	hCD28-His	8.63E-09	3.04E+06	2.62E-02
V155T	hCD28-His	9.61E-09	2.41E+06	2.32E-02
V166A	hCD28-His	2.58E-08	1.71E+06	4.42E-02
V166T	hCD28-His	2.58E-08	1.58E+06	4.06E-02
V166L/L139V	hCD28-His	1.36E-08	2.24E+06	3.06E-02
S156A/V155A	hCD28-His	1.68E-07	4.74E+05	7.97E-02
S156A/V155I	hCD28-His	2.77E-08	1.45E+06	4.00E-02
S156A/V155T	hCD28-His	8.26E-09	4.40E+06	3.64E-02
S156A/T130A	hCD28-His	5.39E-09	3.30E+06	1.78E-02
S156A/V166A	hCD28-His	2.32E-07	1.81E+05	4.21E-02
S156A/V166L/L139V	hCD28-His	2.10E-08	1.95E+06	4.10E-02
S156I	hCD28-His	1.50E-08	1.85E+06	2.78E-02
A165S	hCD29-His	1.14E-08	2.32E+06	2.65E-02
S131A	hCD28-His	4.40E-06	2.98E+04	1.31E-01
S156I/A165S	hCD28-His	2.57E-09	3.53E+06	9.07E-03
S156I/S131A	hCD28-His	3.67E-09	3.27E+06	1.20E-02
A165S/S131A	hCD28-His	8.79E-09	2.45E+06	2.15E-02
S156I/A165S/S131A	hCD28-His	3.45E-09	3.02E+06	1.04E-02
S156F	hCD28-His	1.74E-08	2.00E+06	3.48E-02
S156R	hCD28-His	1.11E-08	2.62E+06	2.90E-02
S156E	hCD28-His	5.94E-09	3.45E+06	2.05E-02
S156D	hCD28-His	4.64E-09	3.74E+06	1.73E-02
S156Q	hCD28-His	low	low	low
S131V	hCD28-His	5.32E-09	2.03E+06	1.08E-02
S131I	hCD28-His	6.60E-09	1.78E+06	1.18E-02
S131F	hCD28-His	2.06E-08	1.56E+06	3.20E-02
S131R	hCD28-His	1.17E-08	2.47E+06	2.90E-02
S131E	hCD28-His	7.69E-09	3.44E+06	2.65E-02
S131D	hCD28-His	6.95E-09	3.16E+06	2.20E-02
S131Q	hCD28-His	1.01E-08	2.96E+06	3.00E-02
A165V	hCD28-His	2.04E-08	1.87E+06	3.82E-02
A165I	hCD28-His	1.96E-07	5.28E+05	1.03E-01
A165F	hCD28-His	2.04E-08	1.50E+06	3.06E-02
A165R	hCD28-His	4.03E-08	1.80E+06	7.27E-02
A165E	hCD28-His	2.06E-08	3.01E+06	6.19E-02
A165D	hCD28-His	1.13E-08	3.46E+06	3.91E-02
A165Q	hCD28-His	1.79E-08	3.02E+06	5.41E-02

[示例3]

[流式細胞儀評估CD80變體的細胞表面結合親和力]

(1)使用Flp-InTM細胞系進行FACS測定產生過表達目的靶標的穩定細胞(hCTLA-4、hCD28和hPD-L1)

將含有編碼hCD28、hCTLA-4或hPD-L1的多核苷酸的表達載體用9：1的pOG44：pcDNA™5/FRT質粒共轉染到哺乳動物的Flp-In™ 293 hosT細胞中(Invitrogen)。轉染後二十四小時，洗滌細胞並將新鮮培養基加入細胞中。轉染後48小時，將潮黴素B(終濃度為200ug/mL)加入到轉染的細胞中。每5天更換含有200ug/mL潮黴素B的培養基，直到選擇單個殖株。通過FACS結合測定分析所有單個殖株。分別將hCD28、hCTLA-4和hPD-L1的最佳表達單殖株擴增，並保存在含有D-MEM(高葡萄糖)、10%FBS、2mML-穀胺醯胺和1%Pen-液態氮中的鏈球菌。如下所述通過FACS結合測定來表徵三種穩定的細胞系。

(2)通過FACS的細胞表面結合測定

分別通過FACS確定CD80變體與過表達CD28的Flp-in 293細胞，過表達CTLA4的Flp-in 293細胞和過表達PD-L1的Flp-in 293細胞的結合親和力(EC₅₀ )。FACS結合測定如下進行：用連續稀釋的突變CD80-Fc融合蛋白在冰上將過表達CD28的Flp-in 293細胞，過表達CTLA4的Flp-in 293細胞和過表達PD-L1的Flp-in 293細胞染色1小時，(i)對於過表達CD28的Flp-in 293細胞或過表達PD-L1的Flp-in 293細胞的濃度為100μg/ml、30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、和0.03μg/ml，以及對於過表達CTLA4的Flp-in 293細胞的濃度為3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.03μg/ml、0.01μg/ml、0.03μg/ml、和0.001μg/ml。用染色緩衝液(PBS+2%胎牛血清)洗滌細胞以除去游離的CD80-Fc融合蛋白，然後用AlexFluor488綴合的抗人IgG抗體在冰上染色30分鐘。洗滌細胞並通過FACS分析。

通過FACS進行的細胞表面結合親和力測定的結果顯示在圖20A-20B中(CD80變體與CTLA-4過表達的Flp-in 293細胞的結合親和力)。表10和11總結了圖20A-20B中呈現的細胞表面結合親和力測定的結果，每個測試的CD80-Fc融合蛋白的最高MFI(平均螢光強度)值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

通過FACS進行的細胞表面結合親和力測定的結果顯示在圖21A-21B中(CD80變體與CD28過表達的Flp-in 293細胞的結合親和力)。表12和13總結了圖21A-21B中呈現的細胞表面結合親和力測定的結果，每個測試的CD80-Fc融合蛋白的最高MFI(平均螢光強度)值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

表10

	Top (MFI)	EC50 (ug/ml)
WT	8526	0.034
S156I/A165S	8379	0.040
S156I/S131A	7955	0.013
A165S/S131A	7821	0.036
S156I/A165S/S131A	8071	0.031
S156F	8432	0.068
S156R	8478	0.027
S156E	8794	0.008

表11

	Top (MFI)	EC50 (ug/ml)
WT	11890	0.014
S156D	11950	0.017
S156Q	11958	0.023
S131V	11719	0.038
S131I	11772	0.028
S131F	11911	0.046
S131R	11766	0.034
S131E	12056	0.042
S131D	11728	0.069
S131Q	11827	0.029
A165V	11769	0.081
A165I	10839	0.124
A165F	11308	0.046
A165R	11821	0.032
A165E	11931	0.040
A165D	12118	0.030
A165Q	11980	0.043

通過FACS進行的細胞表面結合親和力測定的結果顯示在圖22A-22B中(CD80變體與PD-L1過表達的Flp-in 293細胞的結合親和力)。表14和15總結了圖22A-22B中呈現的細胞表面結合親和力測定的結果，每個測試的CD80- Fc融合蛋白的最高MFI(平均螢光強度)值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

如圖25-27所示，突變CD80-Fc融合蛋白的FACS結合EC₅₀ 顯示出對CTLA-4、CD28和PD-L1的結合親和力的差異。

表12

	Top (MFI)	EC50 (ug/ml)
WT	12650	10
S156I/A165S	11348	9.2
S156I/S131A	10810	9.2
A165S/S131A	10150	6.3
S156I/A165S/S131A	10155	7.7
S156F	10700	9.2
S156R	9437	12.5
S156E	10252	9.8

表13

	Top (MFI)	EC50 (ug/ml)
WT	11800	8.5
S156D	11050	10.8
S156Q	10562	8.6
S131V	7493	11.4
S131I	8861	8.4
S131F	6007	15.9
S131R	10824	12.2
S131E	11296	7.9
S131D	9064	9.5
S131Q	10113	9.9
A165V	8281	15.2
A165I	4820	41.8
A165F	6674	18.7
A165R	7566	13.9
A165E	12093	10.7
A165D	8417	13.2
A165Q	8894	12.7

表14

	Top (MFI)	EC50 (ug/ml)
WT	7361	3.9
S156I/A165S	7238	7.8
S156I/S131A	6830	4.3
A165S/S131A	7193	9.3
S156I/A165S/S131A	7981	6.7
S156F	7817	19.8
S156R	7921	5.8
S156E	8184	7.7

表15

	Top (MFI)	EC50 (ug/ml)
WT	11020	8.5
S156D	8379	8.3
S156Q	8323	8
S131V	7634	9.2
S131I	8699	8.1
S131F	3902	5.6
S131R	12302	8.1
S131E	6275	16.5
S131D	5994	11.5
S131Q	9317	9.9
A165V	6136	6.9
A165I	3622	8.9
A165F	6053	7.6
A165R	12635	6.3
A165E	6633	13.4
A165D	7152	9.4
A165Q	10717	8.3

[示例4]

[CD80變體對T細胞活化的功能研究]

(1)IL-2釋放測定

為了測試Jurkat T細胞中CD80誘導的IL-2產生，按如下方式進行IL-2釋放測定：將3.2x10⁵ /孔的JurkaT細胞接種在96孔板中。將每種CD80突變蛋白的連續稀釋液添加至30μg/ml、10μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml、0.03μg/ml以及0.01μg/ml的終濃度。將PHA(植物血凝素)添加到每個孔中，最終濃度為10μg/ml。將細胞在37℃下培養24小時，並收集上清液用於ELISA測定。使用人IL-2未包被的ELISA試劑盒(Invitrogen＃88-7025)定量上清液中的IL-2。ELISA平板在4℃下用50μL/孔的捕獲抗體覆蓋過夜。洗滌板並在室溫下封閉1小時。洗滌後，將50μL/孔的上述上清液加入適當的孔中，並在室溫下培養2小時。然後洗滌板，並加入50μL/孔的檢測抗體，並在室溫下培養1小時。洗滌後，加入50μL/孔的抗生物素蛋白-HRP，並在室溫下培養30分鐘。將該板洗滌七次，並向每個孔中加入50μlTMB底物，並通過添加25μl終止溶液終止反應。使用酶標儀測量OD450。

圖23A-23D呈現了IL-2釋放的功能測定的結果，以測試變體CD80-Fc融合蛋白對T細胞活化的能力。表16總結了通過圖23A-23D中呈現的IL2釋放測量的T細胞活化測定的結果，其中每個測試的CD80-Fc融合蛋白的最高OD450值包括單突變、雙突變和三突變(例如S156I/A165S、S156I/S131A、A165S/S131A、S156I/A165S/S131A、S156F、S156R、S156E、S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)，以及EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

來自JurkaT細胞IL-2釋放測定的結果如圖23A-23D所示並示於表16中，其表明IgC結構域的突變可影響CD80活化T細胞的能力。

表16

	Top (OD450)	EC50 (ug/ml)
WT	2.64	0.94
S156I/A165S	2.52	1.26
S156I/S131A	2.43	1.68
A165S/S131A	2.60	1.29
S156I/A165S/S131A	2.47	1.78
S156F	2.03	3.63
S156R	2.29	3.99
S156E	2.23	1.46
S156D	2.56	0.66
S156Q	2.66	0.97
S131V	2.40	4.59
S131I	2.61	1.13
S131F	0.90	66.84
S131R	2.71	0.79
S131E	2.72	0.76
S131D	2.26	4.27
S131Q	2.70	1.04
A165V	2.11	61.46
A165I	0.80	7.43
A165F	1.30	10.65
A165R	2.34	9.85
A165E	2.71	0.54
A165D	2.32	38.12
A165Q	2.61	1.65
hIgG	0.71	--

(2)檢查站封鎖報告員測定：

使用Promega的測定試劑盒通過檢查點封鎖報告員測定評估了CD80變體。對於CTLA-4阻斷測定，將CTLA-4/Jurkat效應子細胞和aAPC/Raji細胞在室溫下融化。將Bio-Glo™螢光素酶測定緩衝液平衡至環境溫度，避光。然後將所有Bio-Glo™螢光素酶測定緩衝液轉移到裝有Bio-Glo™螢光素酶測定底物的琥珀色瓶中，並顛倒混合直至底物完全溶解。如果設置16小時測定，應在無菌細胞培養櫃中使用無菌技術進行CTLA-4效應子細胞的製備和接種。對於6小時的測定，可以在工作臺上進行設置。

將3.2ml預熱的(37℃)測定緩衝液添加到15ml錐形管中。從儲存中取出一小瓶CTLA-4效應子細胞，並在乾冰上轉移至工作臺。將細胞在37℃水浴中加熱直至融化(約2-3分鐘)。輕輕混合細胞懸液，並將細胞(0.8ml)轉移到裝有3.2ml測定緩衝液的15ml錐形管中。通過輕輕倒置或移液1-2次使其充分混合後，將細胞懸液轉移至無菌試劑容器中。使用多通道移液器，將25μl細胞懸浮液立即分配到兩個96孔、固態、白色、平底測定板的60個內部孔中。將75μl測定緩衝液添加至測定板的每個外部孔中。將測定板蓋上蓋子並保持在環境溫度(22-25℃)下。

使用多通道移液器，根據板將25μl適當的抗體稀釋液添加至平板CTLA-4效應子細胞。將測定板蓋上蓋子，並在製備aAPC/Raji細胞時保持在環境溫度(22-25℃)下。

[準備和平板接種aAPC/Raji細胞]

該試劑盒中包括的解凍和使用的aAPC/Raji細胞是敏感的，應嚴格按照所述方法進行細胞解凍和平板接種程式。細胞試劑不應過度混合或過度加熱。將7.2ml預熱(37℃)的測定緩衝液添加到15ml錐形管中。從–140℃下的存儲中取出一小瓶aAPC/Raji細胞，並在乾冰上轉移到工作臺。將細胞在37℃水浴中融化，直至融化(約2-3分鐘)。將細胞(0.8ml)轉移至含有7.2ml測定緩衝液的15ml錐形管中。通過輕輕倒置或移液1-2次使其充分混合後，將細胞懸液轉移至無菌試劑容器中。使用多通道移液器，將25μl細胞懸液立即分配至預鋪板的CTLA-4效應子細胞和抗CTLA-4對照抗體。最終測定體積為75μl。將測定板蓋上蓋子，並在37℃，5%CO₂ 的培養箱中培養6小時。

注意：優化了6小時的測定時間以獲取最大的發光訊號。建議最佳測定時間(6-16小時)以實現最佳測定回應。如圖所示，電鍍CTLA-4效應子細胞和aAPC/Raji細胞將導致效應子：TargeT細胞的比例為2：1。如果需要更高的發光訊號，可以將aAPC/Raji細胞的稀釋體積減半，以達到效應子：TargeT細胞的比例為1：1。

[添加Bio-Glo™試劑]

當添加到測定板上時，Bio-Glo™試劑應處於環境溫度(22-25℃)下。從培養箱中取出測定板，並平衡至環境溫度10-15分鐘。使用手動多通道移液器，將75µlBio-Glo™試劑添加到測定板的內部60個孔中，注意不要產生氣泡。將75µlBio-Glo™試劑添加到每個測定板的B1、C1和D1孔中以測量背景訊號，並在環境溫度下培養5-15分鐘。使用發光計發光板讀取器測量發光。

圖25A-25L呈現了CTLA-4阻斷測定的結果，以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力。表17總結了圖25A-25L中呈現的具有EC₅₀ (ug/ml)值的CTLA-4阻斷測定的結果。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

表17

	EC50 (ug/mL)
WT	0.243
S156I/A165S	0.217
S156I/S131A	0.309
A165S/S131A	0.868
S156I/A165S/S131A	0.227
S156F	1.187
S156R	0.361
S156E	0.363
S156D	0.474
S156Q	1.578
S131V	4.311
S131I	0.485
S131F	0.474
S131R	0.283
S131E	0.431
S131D	0.382
S131Q	0.209
A165V	0.296
A165I	2.432
A165F	0.323
A165R	0.227
A165E	1.039
A165D	0.210
A165Q	0.136
S131V	0.106
V155A	0.126
V155I	0.191
V155T	0.097
V166A	0.541
V166T	0.151
V166L/L139V	0.124
S156A/V155A	0.250
S156A/V155I	0.118
S156A/V155T	0.036
S156A/T130A	0.121
S156A/V166A	0.281
S156A/V166L/L139V	0.187
S156I	0.134
A165S	0.168
S156A	0.311
S131A	0.187
S156V	0.134
S156L	0.168
S156I	0.311

[示例5]

[CD80變體的共刺激活性]

TCR/CD3效應子細胞(IL-2)(Promega)用於評估CD80變體的共刺激活性。

簡要地，在測定設置之前，新鮮擴增TCR/CD3效應子(IL-2)細胞。在含10%FBS的RPMI-1640中以2x10⁶ 細胞/mL的濃度製備TCR/CD3效應子細胞(IL-2)。對於一個96孔板，在5mL細胞懸液中加入1ug/mL小鼠抗人CD3抗體(OKT3，BioLegedCat＃317326)和150uL山羊抗huIgG珠(AbraMag：Cat＃PN544060)。細胞、抗體和珠子的混合物以50uL/孔分佈在不透明的96孔板上。為了製備測試化合物，以30ug/mL的濃度製備了CD80-Fc野生型(WT)和CD80-Fc變體，並重複1：3連續稀釋。將25μl測試化合物轉移至每個孔中，板上的最終體積為75μl/孔。在空白孔中加入75微升培養基，以測量背景讀數。將板在37℃，5%CO₂ 的培養箱中培養6小時。培養後，將75μlBio-Glo™試劑(Promega)添加到測定板的每個孔中，在環境溫度下培養3分鐘。相對發光單位(RLU)讀數是使用發光讀板儀(CLARIOstar，BMGLABTECH)測量的。

使用GraphPadPrism^® 軟體繪製相對發光單位(RLU)讀數，並使用[激動劑]vs.回應程式進行分析-可變斜率(四個參數)-最小二乘法擬合以確定EC₅₀ 值。

圖26A-26H顯示了變體CD80- Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。表18總結了圖26A-26H中呈現的具有EC₅₀ (ug/ml)值的結果。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

表18

	EC50 (ug/ml)
CD80 (WT)	0.4371
S156I/A165S	0.1501
S156I/S131A	0.1439
A165S/S131A	0.1876
S156I/A165S/S131A	0.1631
S156F	0.1596
S156R	0.2163
S156E	0.2038
S156D	0.2357
S156Q	0.2469
S131V	0.2515
S131I	0.2631
S131F	0.3372
S131R	0.3081
S131E	0.2341
S131D	0.2581
S131Q	0.1705
A165V	0.3016
A165I	0.4600
A165F	0.3154
A165R	0.1973
A165E	0.2215
A165D	0.1658
A165Q	0.1259
S156A	0.2442
A165S	0.1369
S131A	0.1450
S156V	0.1298
S156L	0.1023
S131V	0.1216
V155A	0.1239
V155I	0.1241
V155T	0.1718
V166A	0.2139
V166T	0.1839
V166L/L139V	0.1861
S156A/V155A	0.2243
S156A/V155I	0.1467
S156A/V155T	0.0643
S156A/T130A	0.1541
S156A/V166A	0.7127
S156A/V166L/L139V	0.1900
S156I	0.1259
A165S	0.0993

[示例6]

[突變CD80在腫瘤生長中的體內功效評價]

(1)在CT26同系小鼠模型中的抑制

在CT26同系小鼠模型中測試了CD80變體在腫瘤生長抑制中的功效評估。將CT26細胞以1.0x10⁶ 細胞/小鼠皮下接種到7隻Balb/c小鼠中。每週對小鼠進行三次腫瘤生長監測。

當平均腫瘤體積達到約60-100mm³ 時，將小鼠隨機分配至不同組(每實驗組n=7隻小鼠)。這些荷瘤小鼠在第0天、第3天和第7天用1mg/kg的CD80變體通過靜脈內注射治療。每週測量三次腫瘤和體重，以監測療效和毒性。

圖27呈現了在CT26同基因小鼠模型中CD80變體的抗腫瘤活性的結果。

(2)MC-38同系小鼠模型的抑制作用

在MC-38同基因小鼠模型中測試了CD80變體在腫瘤生長抑制中的功效評估。將MC-38細胞以1.0×10⁶ 細胞/小鼠皮下接種到七隻C57BL/6小鼠中。每週兩次監測小鼠的腫瘤生長。

當平均腫瘤體積達到約90mm³ 時，將小鼠隨機分配至不同組(每實驗組n=7隻小鼠)。這些荷瘤小鼠在第1天、第4天和第8天用CD80變體以150μg/小鼠的劑量進行靜脈注射治療。每週兩次測量腫瘤和體重，以監測療效和毒性。

圖28呈現了在MC-38同基因小鼠模型中CD80變體的抗腫瘤活性的結果。

[示例7]

通過ELISA評估小鼠CD80變體對小鼠CD28、小鼠PD-L1和小鼠CTLA-4的結合親和力

以野生型mCD80為對照品，在同一ELISA板上檢測小鼠CD80變體對小鼠CD28、小鼠PD-L1和小鼠CTLA-4的結合情況。這項研究是對人類研究的替代。製成了小鼠CD80的變體，野生型小鼠CD80在圖14B中示出。

通過ELISA的結合親和力測定的結果顯示在圖29A-29D中(小鼠CD80變體對小鼠CD28的結合親和力)。表19總結了圖29A-29D中呈現的結合測定的結果，以及每個受試小鼠CD80- Fc融合蛋白(包括，T165E、T165Q、T165R、T165A、T165S、T165V、T165I、T165F、T165D、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131Q、S131A、和S131P.)的EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

通過ELISA的結合親和力測定的結果顯示在圖30A-30D中(小鼠CD80變體對小鼠PD-L1的結合親和力)。表20總結了圖30A-30D中呈現的結合測定的結果，以及每個受試小鼠CD80- Fc融合蛋白(包括，T165E、T165Q、T165R、T165A、T165S、T165V、T165I、T165F、T165D、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131Q、S131A、和S131P.)的EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

通過ELISA的結合親和力測定的結果顯示在圖31A-31D中(小鼠CD80變體對小鼠CTLA4的結合親和力)。表21總結了圖31A-31D中呈現的結合測定的結果，以及每個受試小鼠CD80- Fc融合蛋白(包括，T165E、T165Q、T165R、T165A、T165S、T165V、T165I、T165F、T165D、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131Q、S131A、和S131P.)的EC₅₀ (ug/ml)值。EC₅₀ (ug/ml)是在結合測定中給出最大回應一半的蛋白質的濃度或值。

表19

	EC50
A. mCD80(WT)	3.606
mCD80(T165E)	10.59
mCD80(T165Q)	3.462
mCD80(T165R)	6.914
mCD80(T165A)	5.705
mCD80(T165S)	1.603
B. mCD80(WT)	3.499
mCD80(T165V)	17.56
mCD80(T165I)	17.69
mCD80(T165F)	18.27
mCD80(T165D	10.37
mCD80(S131V)	11.19
C. mCD80(WT)	5.467
mCD80(S131I)	19.25
mCD80(S131F)	3.485
mCD80(S131R)	5.127
mCD80(S131E)	3.755
mCD80(S131Q)	2.879
D. mCD80(WT)	4.343
mCD80(S131A)	3.709
mCD80(S131P)	15.3

表20

	EC50
A. mCD80(WT)	8.987
mCD80(T165E)	3.865
mCD80(T165Q)	4.261
mCD80(T165R)	4.97
mCD80(T165A)	4.795
mCD80(T165S)	6.856
B. mCD80(WT)	9.688
mCD80(T165V)	5.873
mCD80(T165I)	7.567
mCD80(T165F)	17.13
mCD80(T165D	5.879
mCD80(S131V)	6.079
C. mCD80(WT)	9.914
mCD80(S131I)	8.58
mCD80(S131F)	7.044
mCD80(S131R)	4.661
mCD80(S131E)	9.23
mCD80(S131Q)	8.217
D. mCD80(WT)	8.698
mCD80(S131A)	8.801
mCD80(S131P)	6.098

表21

	EC50
A. mCD80(WT)	0.0535
mCD80(T165E)	0.1206
mCD80(T165Q)	0.0827
mCD80(T165R)	0.1502
mCD80(T165A)	0.1313
mCD80(T165S)	0.0633
B. mCD80(WT)	0.0598
mCD80(T165V)	0.8854
mCD80(T165I)	2.079
mCD80(T165F)	0.172
mCD80(T165D	0.1538
mCD80(S131V)	0.2691
C. mCD80(WT)	0.0508
mCD80(S131I)	0.4419
mCD80(S131F)	0.0782
mCD80(S131R)	0.0748
mCD80(S131E)	0.0713
mCD80(S131Q)	0.0596
D. mCD80(WT)	0.0673
mCD80(S131A)	0.0924
mCD80(S131P)	0.6586

[示例8]

[小鼠CD80變體在腫瘤生長中的體內功效評估]

可以在CT26或MC-38同系小鼠模型中測試CD80變體對腫瘤生長抑制的功效評估。為了進行測試，使用了小鼠CD80蛋白作為人類蛋白的替代物。為了測試，將CT26或MC-38細胞以1.0x10⁶ 細胞/小鼠皮下接種到小鼠中。每週三次監測小鼠腫瘤生長。

當平均腫瘤體積達到約100mm³ 時，將小鼠隨機分配至不同組(例如，每個實驗組n=7隻小鼠)。在第0天、第3天和第7天通過靜脈內注射用1mg/kg的小鼠CD80變體治療這些荷瘤小鼠。每週測量三次腫瘤和體重、以監測療效和毒性。

[通過引用合併]

本文引用的所有參考文獻、文章、出版物、專利、專利出版物和專利申請出於所有目的通過引用整體併入本文。但是，本文引用的任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利出版物和專利申請的提及均不應也不應被視為對它們構成有效的現有技術或構成世界上任何國家的公知常識的承認或任何形式的建議。

無。

圖1提供了從UniProtKB P33681(CD80_HUMAN)獲得的野生型人CD80細胞外結構域(ECD)的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)。胺基酸加粗並加底線以顯示感興趣的取代/突變的位置。

圖2提供了人IgG1 Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)，其部分得自UniProtKB P01857(IGHG1_HUMAN)，免疫球蛋白重常數γ1。

圖3提供了人IgG2 Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：3)，其部分得自UniProtKB P01859(IGHG2_HUMAN)，免疫球蛋白重常數γ2。

圖4提供了人IgG3 Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：4)，其部分得自UniProtKB P01860(IGHG3_HUMAN)，免疫球蛋白重常數γ3。

圖5提供了人IgG4 Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：5)，其部分得自UniProtKB P01861(IGHG4_HUMAN)，免疫球蛋白重常數γ4。

圖6提供了小鼠IgG1 Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：6)，其部分得自UniProtKB P01868(IGHG1_MOUSE)，分泌的是Ig γ-1鏈C區。

圖7提供了小鼠IgG2a Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：7)，其部分得自UniProtKB P01863(GCAA_MOUSE)，Ig γ-2A鏈C區，A等位基因。

圖8提供了小鼠IgG2b Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：8)，其部分得自UniProtKB P01867(IGG2B_MOUSE)的Ig γ-2B鏈C區。

圖9提供了小鼠IgG3 Fc結構域的胺基酸序列(SEQ ID NO：9)，其部分得自UniProtKB P03987(IGHG3_MOUSE)的Ig γ-3鏈C區。

圖10提供了人CD28的胺基酸序列(SEQ ID NO：10)，其得自UniProtKB P10747(CD28_HUMAN)，T細胞特異性表面糖蛋白CD28。

圖11提供了人CTLA-4的胺基酸序列(SEQ ID NO：11)，其得自UniProtKB P16410(CTLA4_HUMAN)，細胞毒性T淋巴細胞蛋白4。

圖12提供了人PD-L1的胺基酸序列(SEQ ID NO：12)，其得自UniProtKB Q9NZQ7(PD1L1_HUMAN)，程式性細胞死亡1配體1。

圖13A描繪了從表達載體編碼本發明中教導的(i)前導序列(圖13B)，(ii)CD80(在本發明中教導的感興趣的野生型人CD80或突變人CD80變體)和(iii)Ig Fc結構域的CD80-Fc表達盒的示意圖。圖13B提供了從人IgG重鏈(GenBank：QBK47409.1)獲得的前導序列的胺基酸序列(SEQ ID NO：13)。圖13C描繪了由兩個經二硫鍵二聚和連接的CD80 Fc融合多肽組成的CD80 Fc融合蛋白的示意圖。

圖14A提供了從hCD80-Fc表達構建體表達的人CD80-Fc融合多肽的胺基酸序列(SEQ ID NO：14)。圖14B提供了野生型小鼠CD80序列的胺基酸序列(SEQ ID NO：15)。

圖15A描繪了在非還原條件下選擇和純化的CD80-Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。圖15B描述了在還原條件下選擇和純化的CD80-Fc融合多肽的SDS-PAGE分析結果。圖15A-15B中載有純化的CD80-Fc融合蛋白的樣品如下；泳道1：分子量標記；泳道2：S131F，1.5ug/lane；泳道3：S131R，1.5ug/lane；泳道4：S131E，2.0ug/lane；泳道5：S131D，1.6ug/lane；泳道6：S131Q，1.6ug/lane；泳道7：A165V，1.2ug/lane；泳道8：A165I，1.6ug/lane；泳道9：A165F，1.6ug/lane；泳道10：A165R，1.6ug/lane；泳道11：A165D，1.6ug/lane；泳道12：A165Q，1.6ug/lane。

圖15C描繪了在非還原條件下選擇和純化的CD80-Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。圖15D描繪了在還原條件下選擇和純化的CD80-Fc融合多肽的SDS-PAGE分析結果。圖15C-15D中載有純化的CD80-Fc融合蛋白的樣品如下；泳道1：分子量標記；泳道2：V166A，10ug/lane；泳道3：V166T，10ug/lane；泳道4：V166L/L139V，10ug/lane；泳道5：S156A/V155A，10ug/lane；泳道6：S156A/V155I，10ug/lane；泳道7：S156A/V155T，10ug/lane；泳道8：S156A/T130A，10ug/lane；泳道9：S156A/V166A，10ug/lane；泳道10：S156A/V166L/L139V，10ug/lane。

圖15E描述了在非還原條件下選擇和純化的CD80-Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析結果。圖15F描繪了在還原條件下選擇和純化的CD80-Fc融合多肽的SDS-PAGE分析結果。圖15E-15F中載有純化的CD80-Fc融合蛋白的樣品如下；泳道1：分子量標記；泳道2：S131V，10ug/lane；泳道3：V155A，10ug/lane；泳道4：V155I，10ug/lane；泳道5：V155T，10ug/lane。

圖16A描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CTLA-4的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)和三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖16B描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CTLA-4的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156(S156F、S156R、S156E、S156D和S156Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖16C描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CTLA-4的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131(S131V、S131I、S131F、S131R和S131E)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖16D描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CTLA-4的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131或A165(S131D、S131Q、A165V、A165I和A165F)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖16E描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CTLA-4的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置A165(A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖16F描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CTLA-4的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：單個胺基酸取代/突變(T130A、S131V、L139V、V155A、V155I、V155T、S156A、V166A、V166L、V166T、V155A/S156A、V155I/S156A和V155T/S156A)。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖17A描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CD28的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)和三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖17B描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CD28的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156(S156F、S156R、S156E、S156D和S156Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖17C描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CD28的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131(S131V、S131I、S131F、S131R和S131E)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖17D描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CD28的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131或A165(S131D、S131Q、A165V、A165I和A165F)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖17E描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體CD28的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置A165(A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖18A描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體PD-L1的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)和三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖18B描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體PD-L1的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156(S156F、S156R、S156E、S156D和S156Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖18C描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體PD-L1的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131(S131V、S131I、S131F、S131R和S131E)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖18D描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體PD-L1的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131或A165(S131D、S131Q、A165V、A165I和A165F)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖18E描繪了通過ELISA進行結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體PD-L1的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置A165(A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖19描述了使用BIAcore模型X100對包括單突變、雙突變和三突變的每個變體CD80-Fc融合蛋白與結合配偶體人CTLA-4的結合測定的結果。

圖20A描繪了通過FACS進行的細胞表面結合測定以測試變體CD80- Fc融合蛋白與表達CTLA-4的Flp-in 293細胞的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)和三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)和一個位置(S156F，S156R和S156E)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖20B描繪了通過FACS進行的細胞表面結合測定以測試變體CD80- Fc融合蛋白與表達CTLA-4的Flp-in 293細胞的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：在位置S156、S131或A165(S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖21A描繪了通過FACS進行的細胞表面結合測定以測試變體CD80- Fc融合蛋白與表達CD28的Flp-in 293細胞的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)，三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)和一個位置(S156F、S156R和S156E)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖21B描繪了通過FACS進行的細胞表面結合測定以測試變體CD80- Fc融合蛋白與表達CD28的Flp-in 293細胞的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156、S131或A165(S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖22A描繪了通過FACS進行的細胞表面結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與表達PD-L1的Flp-in 293細胞的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)，三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)和一個位置(S156F，S156R和S156E)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖22B描繪了通過FACS進行的細胞表面結合測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白與表達PD-L1的Flp-in 293細胞的結合親和力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156，S131或A165(S156D、S156Q、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D、S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖23A描繪了IL-2釋放的功能測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白對T細胞活化的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)和三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖23B描繪了IL-2釋放的功能測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白對T細胞活化的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131(S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D和S131Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖23C描繪了IL-2釋放的功能測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白對T細胞活化的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156(S156F、S156R、S156E、S156D和S156Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖23D描繪了IL-2釋放的功能測定以測試變體CD80-Fc融合蛋白對T細胞活化的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置A165(A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖24示出了與CTLA-4複合的CD80二聚體的晶體結構(由IgC結構域、結構域間鉸鏈和IgV結構域組成)。IgC結構域中的突變位置如下所示：T130、S131、L139、V155、S156、A165和V166。

圖25A描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)的胺基酸取代/突變，CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25B描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)和一個位置S156(S156F，S156R和S156E)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25C描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S156或S131(S156D、S156Q、S131V和S131I)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25D描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131(S131F和S131R)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25E描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131(S131E和S131D)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25F描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131或A165(S131Q、A165V、A165I和A165F)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25G描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置A165(A165R、A165E、A165D和A165Q)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25H描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置V155(V155A、V155I和V155T)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25I描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：一個位置V166(V166A和V166T)和兩個位置(V166L/L139V和S156A/V155A–雙重取代/突變)的胺基酸取代/突變，CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25J描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156A/V155I、S156A/V155T、S156A/T130A和S156A/V166A–雙重取代/突變)的胺基酸取代/突變，CD80-WT蛋白被用作陽性對照。

圖25K描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：三個位置(S156A/V166L/L139V–三重取代/突變)和一個位置S156或A165(S156I、S156A和A165S)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖25L描述了CTLA-4阻斷測定以評估變體CD80-Fc融合蛋白阻斷CTLA-4/CD28相互作用功能的能力的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：位置S131或S156(S131A、S156V、S156L和S156I)的單個胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照，而人IgG1蛋白則是陰性對照。

圖26A描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(S156I/A165S、S156I/S131A和A165S/S131A–雙重取代/突變)，三個位置(S156I/A165S/S131A–三重取代/突變)和一個位置S156(S156F)的胺基酸取代/突變。CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖26B描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：單個位置S156(S156R、S156E、S156D和S156Q)的胺基酸取代/突變。人IgG1蛋白用作陰性對照。

圖26C描繪了變體CD80- Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：單個位置S131(S131V、S131I、S131F、S131R、S131E和S131D)的胺基酸取代/突變。

圖26D描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：單個位置S131或A165(S131Q、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D和A165Q)的胺基酸取代/突變。

圖26E描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：單個位置S156、A165或S131(S156A、A165S、S131A和S156V)的胺基酸取代/突變。

圖26F描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：單個位置V155或V166(V155A、V155I、V155T、V166A和V166T)的胺基酸取代/突變。

圖26G描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：兩個位置(V166L/L139V、S156A/V155A、S156A/V155I、S156A/V155T、S156A/T130A和S156A/V166A–雙重取代/突變)的胺基酸取代/突變。

圖26H描繪了變體CD80-Fc融合蛋白的共刺激活性的結果。本文測試的變體CD80多肽的類型如下：三個位置(S156A/V166L/L139V–三重取代/突變)和一個位置S156或A165(S156I和A165S)的胺基酸取代/突變。

圖27描繪了變體CD80蛋白在CT26同系小鼠模型中的體內功效的結果。

圖28描繪了變體CD80蛋白在MC-38同系小鼠模型中的體內功效的結果。

圖29A描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CD28的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置T165(T165E、T165Q、T165R、T165A和T165S)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖29B描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CD28的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置T165或S131(T165V、T165I、T165F、T165D和S131V)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖29C描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CD28的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置S131(S131I、S131F、S131R、S131E和S131Q)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖29D描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CD28的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置S131(S131A和S131P)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖30A描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠PD-L1的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置T165(T165E、T165Q、T165R、T165A和T165S)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖30B描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠PD-L1的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置T165或S131(T165V、T165I、T165F、T165D和S131V)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖30C描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠PD-L1的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置S131(S131I、S131F、S131R、S131E和S131Q)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖30D描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠PD-L1的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置S131(S131A和S131P)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖31A描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CTLA4的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置T165(T165E、T165Q、T165R、T165A和T165S)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖31B描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CTLA4的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置T165或S131(T165V、T165I、T165F、T165D和S131V)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖31C描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CTLA4的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置S131(S131I、S131F、S131R、S131E和S131Q)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

圖31D描繪了通過ELISA的結合測定，以測試變體小鼠CD80-Fc融合蛋白與固定的結合配偶體小鼠CTLA4的結合親和力。本文測試的變體小鼠CD80多肽的類型如下：位置S131(S131A和S131P)的單個胺基酸取代/突變。小鼠CD80-WT蛋白用作陽性對照。

Claims (63)

1. 一種變體CD80多肽，其包含與SEQ ID NO：1具有至少80%相同胺基酸序列的胺基酸序列，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽包含一個或多個所述胺基酸取代修飾，其中，所述一個或多個所述胺基酸取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、165或166處。
2. 如請求項1所述之變體CD80多肽，其中，在SEQ ID NO：1的位置131處的所述胺基酸取代修飾是S131A、S131V、S131I、S131F、S131R、S131E、S131D或S131Q。
3. 如請求項1或2所述之變體CD80多肽，其中，在SEQ ID NO：1的位置139處的所述胺基酸取代修飾是L139V。
4. 如請求項1至3中任一項所述之變體CD80多肽，其中，在SEQ ID NO：1的位置155處的所述胺基酸取代修飾是V155A、V155I或V155T。
5. 如請求項1至4中任一項所述之變體CD80多肽，其中，在SEQ ID NO：1的位置165處的所述胺基酸取代修飾是A165S、A165V、A165I、A165F、A165R、A165E、A165D或A165Q。
6. 如請求項1至5中任一項所述之變體CD80多肽，其中，在SEQ ID NO：1的位置166處的所述胺基酸取代修飾是V166A、V166L或V166T。
7. 如請求項1至6中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽包含兩個或多個所述胺基酸取代修飾，並且其中，所述兩個或多個所述胺基酸取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置130、131、139、155、156、165或166處。
8. 如請求項1至6中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽包含三個或多個所述胺基酸取代修飾，並且其中，所述三個或多個所述胺基酸取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。
9. 如請求項1至6中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽包含四個或多個所述胺基酸取代修飾，並且其中，所述四個或多個所述胺基酸取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。
10. 如請求項1至6中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽包含五個或多個所述胺基酸取代修飾，並且其中，所述五個或多個所述胺基酸取代修飾位於SEQ ID NO：1的位置131、139、155、156、165或166處。
11. 3、6和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾V166L和L139V。
12. 4和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V155A。
13. 4和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V155I。
14. 4和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V155T。
15. 如請求項1或8所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和T130A。
16. 6和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156A和V166A。
17. 4和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156I和A165S。
18. 2和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾S156I和S131A。
19. 2、5和7中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含兩個胺基酸取代修飾A165S和S131A。
20. 3、6和8中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含三個胺基酸取代修飾S156A、V166L和L139V。
21. 2、5和8中任一項所述之變體CD80多肽，其中，所述變體CD80多肽包含三個胺基酸取代修飾S156I、A165S和S131A。
22. 如請求項1至21中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽具有對CTLA-4增加或降低的結合親和力。
23. 如請求項1至21中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽具有對CD28增加或降低的結合親和力。
24. 如請求項1至21中任一項所述之變體CD80多肽，其中，與SEQ ID NO：1相比，所述變體CD80多肽具有對PD-L1增加或降低的結合親和力。
25. 如請求項1至24中任一項所述之變體CD80多肽，進一步包含能夠二聚的第二多肽。
26. 如請求項25所述之變體CD80多肽，其中，所述第二多肽是免疫球蛋白 Fc結構域。
27. 如請求項26所述之變體CD80多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc結構域是人IgG1 Fc結構域、人IgG2 Fc結構域、人IgG3 Fc結構域或人IgG4 Fc結構域。
28. 如請求項26所述之變體CD80多肽，其中，所述免疫球蛋白Fc結構域是小鼠IgG1 Fc結構域、小鼠IgG2a Fc結構域、小鼠IgG2b Fc結構域或小鼠IgG3 Fc結構域。
29. 如請求項1至28中任一項所述之變體CD80多肽，進一步包含治療活性部分。
30. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至29中任一項所述之變體CD80多肽。
31. 如請求項30所述之多核苷酸，其中，所述多核苷酸是合成核酸。
32. 如請求項30或31所述之多核苷酸，其中，所述多核苷酸是cDNA。
33. 如請求項30至32中任一項所述之多核苷酸，其中，所述多核苷酸可操作地連結至轉錄控制元素。
34. 如請求項33所述之多核苷酸，其中，所述轉錄控制元素是在真核細胞中起作用的啟動子。
35. 一種載體，其包含如請求項30至34中任一項所述之多核苷酸。
36. 如請求項35所述之載體，其中，所述載體是表達載體。
37. 如請求項35或36所述之載體，其中，所述載體是哺乳動物載體或病毒載體。
38. 一種細胞，其包含如請求項35至37中任一項所述之載體。
39. 如請求項38所述之細胞，其中，所述細胞是哺乳動物細胞。
40. 如請求項38或39所述之細胞，其中，所述細胞是人細胞。
41. 一種藥物成分，其包含如請求項1至29中任一項所述之變體CD80多肽。
42. 如請求項41所述之藥物成分，進一步包含藥學上可接受的賦形劑。
43. 如請求項41或42所述之藥物成分，其中，所述藥物成分是無菌的。
44. 一種製品，其在小瓶中包含如請求項41至43中任一項所述之藥物成分。
45. 如請求項44所述之製品，其中，所述小瓶是密封的。
46. 一種試劑盒，其包含如請求項41至43中任一項所述之藥物成分；以及使用說明書。
47. 一種試劑盒，其包含如請求項44或45所述之製品；以及使用說明書。
48. 一種在受試者中調節免疫反應的方法，其包括向所述受試者施用如請求項41至43中任一項所述之藥物成分。
49. 如請求項48所述之方法，其中，調節所述免疫反應治療所述受試者的疾病或病症。
50. 如請求項48或49所述之方法，其中，所述免疫反應係增加。
51. 如請求項48或49所述之方法，其中，所述免疫反應係降低。
52. 如請求項49至51中任一項所述之方法，其中，所述疾病或病症是腫瘤或癌症。
53. 如請求項52所述之方法，其中，所述疾病或病症選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液惡性腫瘤、肝癌、腦癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨骼癌、頭頸癌、胃腸道癌、生殖細胞癌或內分泌和神經內分泌癌。
54. 如請求項49至51中任一項所述之方法，其中，所述疾病或病症是炎性或自體免疫性疾病或病症。
55. 如請求項54所述之方法，其中，所述疾病或病症是抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關的血管炎、血管炎、自體免疫性皮膚病、移植、風濕性疾病、炎性胃腸疾病、炎性眼病、炎性神經疾病、炎性肺疾病、炎性內分泌疾病或自體免疫性血液病。
56. 如請求項54或55所述之方法，其中，所述疾病或病症選自炎性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。
57. 一種治療受試者的疾病或病症的方法，其包含向所述受試者施用如請求項41至43中任一項所述之藥物成分。
58. 如請求項57所述之方法，其中，所述疾病或病症是感染。
59. 如請求項57所述之方法，其中，所述疾病或病症是腫瘤或癌症。
60. 如請求項59所述之方法，其中，所述疾病或病症選自黑素瘤、肺癌、膀胱癌、血液惡性腫瘤、肝癌、腦癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌、結腸直腸癌、脾癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宮癌、胃癌、肌肉骨骼癌、頭頸癌、胃腸道癌、生殖細胞癌或內分泌和神經內分泌癌。
61. 如請求項57所述之方法，其中，所述疾病或病症是炎性或自體免疫性疾病或病症。
62. 如請求項57所述之方法，其中，所述疾病或病症是抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)相關的血管炎、血管炎、自體免疫性皮膚病、移植、風濕性疾病、炎性胃腸疾病、炎性眼病、炎性神經疾病、炎性肺疾病、炎性內分泌疾病或自體免疫性血液病。
63. 如請求項57所述之方法，其中，所述疾病或病症選自炎性腸病、移植、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、多發性硬化症、哮喘、類風濕性關節炎或牛皮癬。

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