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TW202045545A - 白蛋白結合抗體及其用途 - Google Patents

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TW202045545A
TW202045545A TW109105677A TW109105677A TW202045545A TW 202045545 A TW202045545 A TW 202045545A TW 109105677 A TW109105677 A TW 109105677A TW 109105677 A TW109105677 A TW 109105677A TW 202045545 A TW202045545 A TW 202045545A
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albumin
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TW109105677A
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子洋 鐘
葉帆
馬修 希格
嘉寧 黃
艾瑞克 廖
雨敏 李
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美商安維塔生物科學股份有限公司
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Abstract

本發明提供一種抗白蛋白構築體，其等各自包含抗白蛋白單域抗體(single-domain antibody；sdAb)部分。該等抗白蛋白構築體可進一步包含治療劑，諸如抗原結合部分或細胞介素。本發明亦提供用於製備及使用該等抗白蛋白構築體之方法。

Description

白蛋白結合抗體及其用途
本發明係關於包含抗白蛋白單域抗體(sdAb)部分之抗白蛋白構築體，以及其等製備及使用方法。
許多治療劑(特定言之，生物製劑，諸如肽、多肽及聚核苷酸)之效用由於血清半衰期不足而具有侷限性。由於血清半衰期不足，一些治療劑不能實現其所需功效。並且，一些治療劑必須以高頻率及/或較高的劑量投與以維持治療作用所需之血清含量。此類治療劑之頻繁地全身性投藥通常與不合需要的副作用相關聯。舉例而言，頻繁地全身性注射會引起患者顯著不適，造成與投藥相關之高風險感染，且可能需要住院或頻繁地去醫院就診，尤其在靜脈內投與治療劑時。此外，在長期治療中，每天進行靜脈內注射會引起顯著副作用，諸如組織結疤，及由血管之重複穿刺引起之血管病變。已知治療劑之所有頻繁地全身性投藥皆具有類似問題，諸如向糖尿病患者投與胰島素或向多發性硬化患者投與干擾素藥物。所有此等因素引起患者之順應性降低及健康系統之成本增加。因此，需要研發具有延長之血清半衰期之治療劑。
本發明提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白單域抗體(sdAb)部分，其中sdAb部分包含CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
本發明亦提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
本發明亦提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含具有SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
本發明亦提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含具有SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
本發明提供一種經分離抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其分別包含具有SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者中所闡述之序列之重鏈可變域內的CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。
本發明提供一種經分離抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其分別包含具有SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者中所闡述之序列之重鏈可變域內的CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。在某些實施例中，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。在某些實施例中，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
本發明提供一種經分離抗白蛋白構築體，其包含第一多肽，該第一多肽包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31及34中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32及35中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33及36中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31及34中之任一者之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32及35中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33及36中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含：(1)CDR1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(2)CDR1，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(3)CDR1，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(4)CDR1，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(5)CDR1，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(6)CDR1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(7)CDR1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(8)CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；或(9)CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含：(1)包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代變異體；(2)包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(3)包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(4)包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(5)包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(6)包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(7)包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(8)包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；或(9)包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
本發明提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽，該第一多肽包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含具有SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
本發明提供一種經分離抗白蛋白構築體，其包含第一多肽，該第一多肽包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其分別包含具有SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者中所闡述之序列之重鏈可變域內的CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。在某些實施例中，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
本發明提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1，其包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據本文中所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含CDR1，其包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據本文中所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含：(1)CDR1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(2)CDR1，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(3)CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(4)CDR1，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(5)CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(6)CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(7)CDR1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(8)CDR1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；或(9)CDR1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據本文中所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含：(1)包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代變異體；(2)包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(3)包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(4)包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(5)包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(6)包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(7)包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；(8)包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體；或(9)包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列之CDR1、包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列之CDR2及包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
本發明提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含具有SEQ ID NO:99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
本發明提供一種抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含具有SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
本發明提供一種經分離抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其分別包含具有SEQ ID NO:99-101、103-115、149及150中之任一者中所闡述之序列之重鏈可變域內的CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。
本發明提供一種經分離抗白蛋白構築體，其包含第一多肽部分，該第一多肽部分包含結合於白蛋白之抗白蛋白sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1、CDR2及CDR3，其分別包含具有SEQ ID NO:105-115中之任一者中所闡述之序列之重鏈可變域內的CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列。
在某些實施例中，根據本文中所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:99-101、103-115、149及150中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。在某些實施例中，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據本文中所描述之構築體中之任一者，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:105-115中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。在某些實施例中，sdAb部分包含VH H域，其包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，白蛋白為人類血清白蛋白(HSA)、恆河猴血清白蛋白(RhSA)、獼猴血清白蛋白(CySA)或鼠類血清白蛋白(MuSA)。在某些實施例中，白蛋白為人類血清白蛋白。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，構築體以約10-6 M至約10-10 M範圍內之K D 結合於白蛋白。在某些實施例中，構築體以約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，在約pH 7下，構築體以約10-6 M至約10-10 M範圍內之K D 結合於白蛋白。在某些實施例中，在約pH 7下，構築體以約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，在約pH 5.5下，構築體以約10-6 M至約10-10 M範圍內之K D 結合於白蛋白。在某些實施例中，在約pH 5.5下，構築體以約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，結合於白蛋白之sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，構築體進一步包含與第一多肽融合之第二多肽。在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之胺基端(N 端)融合。在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之羧基端(C 端)融合。在某些實施例中，第二多肽經由第一連接子與第一多肽融合。在某些實施例中，第一連接子為可裂解的。在某些實施例中，第一連接子為不可裂解的。在某些實施例中，構築體進一步包含與第一及/或第二多肽融合之第三多肽。在某些實施例中，第三多肽經由第二連接子與第一或第二多肽融合。在某些實施例中，第二連接子為可裂解的。在某些實施例中，第二連接子為不可裂解的。在某些實施例中，第二及/或第三多肽包含抗原結合部分。在某些實施例中，抗原結合部分結合於腫瘤抗原。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在某些實施例中，第二及/或第三多肽包含細胞介素。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合於IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，構築體進一步包含信號傳導肽。
在某些實施例中，根據上文所描述之構築體中之任一者，構築體中之第二多肽及/或第三多肽之血清半衰期比在不存在抗白蛋白sdAb部分之情況下的第二多肽及/或第三多肽之血清半衰期長至少3倍。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含上文所描述之構築體中之任一者。
本發明提供一種用於治療個體中之疾病或病狀之方法，其包含向個體投與有效量之上文所描述之構築體或組合物中之任一者。在某些實施例中，個體為人類。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年2月22日提交之美國臨時申請案第62/809,475號之優先權之權利；其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。 對序列表之參考
本說明書與電腦可讀形式(CRF)之序列表一起提交，該序列表之標題為216A003TW01_SEQLIST_ST25.txt，大小為94,848個位元組且創建於2020年2月10日；其內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於包含抗白蛋白sdAb之抗白蛋白構築體、其製備及用於治療疾病或病狀之方法。
因此，本發明之一個態樣提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體。在某些實施例中，抗白蛋白構築體包含第二多肽。在某些實施例中，第二多肽包含治療劑，諸如細胞介素或結合於腫瘤抗原之抗原結合部分。
亦提供組合物(諸如醫藥組合物)、套組及製品，其各自包含本文中所描述之抗白蛋白構築體；其製備方法，及使用本文中所描述之抗白蛋白構築體治療疾病或病狀(諸如癌症)之方法。
此外，提供組合物、套組及製品，其各自包含本文中所描述之雙特異性抗體，以及其製備及使用方法。I. 定義
為有助於理解本文中所闡述之揭示內容，下文定義多個術語。
通常，本文中使用之命名法及本文中所描述之生物化學、生物學、分子生物學、細胞生物學、免疫學及藥理學中之實驗步驟為此項技術中熟知及常用的。除非另外規定，否則本文中所使用之所有技術及科學術語通常具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。
術語「抗白蛋白構築體」及「抗白蛋白蛋白質」在本文中可互換地用於指例如特異性結合於白蛋白之多肽。
「經分離」之抗體或構築體為已自其產生環境之組分鑑別、分離及/或回收之抗體或構築體(例如天然或重組)。較佳地，經分離抗體或構築體與所有其他來自其產生環境之組分實質上無關。其產生環境之污染物組分(諸如由重組轉染細胞產生之污染物組分)為通常干擾抗體之研究、診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，抗體或構築體經純化：(1)達到超過95重量%之抗體或構築體，在某些實施例中，超過99重量%；(2)達到足以獲得N 端或內部胺基酸序列之至少15個殘基之程度(藉由使用旋杯定序儀)；或(3)達到均質性(藉由使用考馬斯藍(Coomassie blue)或銀染料在非還原或還原條件下進行之SDS-PAGE)。由於抗體之天然環境中之至少一種組分不存在，因此經分離抗體或構築體包括原位位於重組細胞內之抗體。然而，通常，經分離抗體或構築體係藉由至少一個純化步驟製備。
全長抗體包含兩個重鏈及兩個輕鏈。輕鏈及重鏈之可變區負責抗原結合。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH 」及「VL 」。兩種鏈中之可變區通常含有三個高度可變環，稱為互補決定區(CDR)(輕鏈(LC)CDR，包括LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3，及重鏈(HC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3)。本文中所揭示之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、Chothia或Al-Lazikani公約(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)界定或鑑別。重鏈或輕鏈之三個CDR插入稱為構架區(FR)之側接延伸部分之間，該等側接延伸部分之保守性比CDR更高且形成支撐高變環之骨架。重鏈及輕鏈之恆定區不參與抗原結合，但呈現各種效應功能。抗體基於其重鏈恆定區之胺基酸序列分類。抗體之五種主要類別或同型為IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其特徵分別為存在α、δ、ε、γ及μ重鏈。若干主要抗體類別分成子類，諸如IgG1 (γ1重鏈)、IgG2 (γ2重鏈)、IgG3 (γ3重鏈)、IgG4 (γ4重鏈)、IgA1 (α1重鏈)或IgA2 (α2重鏈)。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用以指代相較於抗體片段呈實質上完整形式之抗體。特定言之，全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈之抗體，該等重鏈及輕鏈包括Fc區。全長僅重鏈抗體包括重鏈可變域(諸如VH H)及Fc區。恆定域可為原生序列恆定域(例如人類原生序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在一些情況下，完整抗體可具有一或多種效應功能。
術語抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體之重鏈或輕鏈之胺基端域。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH 」及「VL 」。此等域通常係抗體之可變度最高的部分(相對於同一類別之其他抗體而言)且含有抗原結合位點。來自駱駝物種之僅重鏈抗體具有單一重鏈可變區，其稱為「VH H」。因此，VH H為一種特殊類型之VH 。
如本文中所使用，術語「抗原結合片段」係指抗體片段，包括例如雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段、二硫鍵穩定化Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv (dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定化雙功能抗體(ds雙功能抗體)、單鏈Fv (scFv)、scFv二聚體(二價雙功能抗體)、由包含一或多個CDR之抗體的一部分形成之多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體，或結合於抗原但不包含完整抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠結合於與親本抗體或親本抗體片段(例如親本scFv)所結合相同之抗原。在某些實施例中，抗原結合片段包含來自特定人類抗體之一或多個CDR，該特定人類抗體係移植至來自一或多種不同的人類抗體之構架區。
術語「Fv」係指含有完整抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由緊密及非共價結合之一個重鏈可變區域(variable region domain)及一個輕鏈可變區域之二聚體組成。此兩個域之摺疊產生六個高變環(重鏈及輕鏈各3個環)，其促進胺基酸殘基之抗原結合且向抗體賦予抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性之CDR之Fv之一半)亦能夠識別及結合抗原，但親和力低於完整結合位點。
術語「單鏈Fv」、「sFv」或「scFv」係指包含連接至單一多肽鏈之VH 及VL 抗體域之抗體片段。在某些實施例中，scFv多肽進一步包含介於VH 與VL 域之間的多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。參見Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies , 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)。
術語「僅重鏈抗體」或「HCAb」係指功能性抗體，其包含重鏈，但不具有通常在4鏈抗體中發現之輕鏈。已知駱駝科動物(諸如駱駝、駱馬或羊駝)產生HCAb。
術語「單域抗體(single-domain antibody)」、「單域抗體(single domain antibody)」或「sdAb」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽。單獨的sdAb能夠在不與相應的含有CDR之多肽配對的情況下結合於抗原。在一些情況下，單域抗體係自駱駝HCAb工程改造，且其重鏈可變域在本文中稱為「VH H」(重鏈抗體之重鏈之可變域)。駱駝sdAb為已知的最小抗原結合抗體片段之一。參見例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448 (1993)；Greenberg等人,Nature 374:168-173 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等人,Nanomedicine (Lond.) 8:1013-1026 (2013)。基本VH H自N 端至C 端具有以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別係指構架區1至4，且其中CDR1至CDR3分別係指互補決定區1至3。
術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域中序列具有高變性及/或形成結構上界定之環的區域。一般而言，單域抗體包含三種HVR (或CDR)：HVR1 (或CDR1)、HVR2 (或CDR2)及HVR3 (或CDR3)。HVR3 (或CDR3)顯示三種HVR之大部分多樣性，且咸信在賦予抗體精細特異性中起獨特作用。參見例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448 (1993)；Sheriff等人,Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)。
術語「CDR」或「互補決定區」意欲意謂在重鏈及輕鏈多肽之可變區內發現的非相鄰抗原組合位點。此等特定區域已由以下描述：Kabat等人,J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991)；Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Al-Lazikani B.等人,J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997)；MacCallum等人,J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)；Abhinandan及Martin,Mol. Immunol. 45:3832-3839 (2008)；Lefranc等人,Dev. Comp. Immunol. 27:55-77 (2003)；以及Honegger及Plückthun,J. Mol. Biol. 309:657-670 (2001)；其中在相互比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，使用任一定義來提及抗體或移植抗體之CDR或其變異體意欲屬於如本文中所定義及使用之術語之範疇內。涵蓋如上文所引用之各參考文獻所定義之CDR的胺基酸殘基闡述於下表1中作為比較。CDR預測演算法及界面為此項技術中已知的，包括例如Abhinandan及Martin,Mol. Immunol. 45: 3832-3839 (2008)；Ehrenmann等人,Nucleic Acids Res. 38:D301-D307 (2010)；及Adolf-Bryfogle等人,Nucleic Acids Res. 43:D432-D438 (2015)。表 1. CDR 定義
   Kabat1 Chothia2 MacCallum3 IMGT4 AHo5
VH CDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
VH CDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
VH CDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
VL CDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
VL CDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
VL CDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1 殘基編號遵循Kabat等人, 見上文之命名法2 殘基編號遵循Chothia等人, 見上文之命名法3 殘基編號遵循MacCallum等人, 見上文之命名法4 殘基編號遵循Lefranc等人, 見上文之命名法5 殘基編號遵循Honegger及Plückthun, 見上文之命名法
表述「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人，見上文中用於抗體之編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域之編號系統。使用此編號系統，實際線形胺基酸序列可含有較少或其他胺基酸，其對應於可變域之FR或HVR之縮短或插入可變域之FR或HVR中。舉例而言，重鏈可變域可包括位於H2之殘基52之後的單一胺基酸插入物(殘基52a，根據Kabat)及位於重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源區與「標準」Kabat編號序列進行比對來確定殘基之Kabat編號。
除非本文另外指明，否則免疫球蛋白重鏈中之殘基之編號係如Kabat等人, 見上文中之EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「構架」或「FR」殘基為除如本文所定義之CDR殘基以外的可變域殘基。
非人類(例如嚙齒動物)抗體之「人類化」形式為嵌合抗體，其各自含有來源於非人類抗體之最小序列。通常，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高變區(HVR)之殘基由來自具有所需抗體特異性及親和力之非人類物種(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之高變區(供體抗體)之殘基置換。在某些實施例中，人類免疫球蛋白之某些構架區(FR)殘基由相應的非人類殘基置換。在某些實施例中，人類化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現之殘基。在某些實施例中，人類化抗體包含實質上全部的至少一個(例如兩個)可變域，在其中之每一者中，全部或實質上全部高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且全部或實質上全部FR為人類免疫球蛋白序列之FR。在某些實施例中，人類化抗體進一步包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(例如人類免疫球蛋白Fc)之至少一部分。參見Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
術語「胺基酸序列一致性百分比(%)」係指候選抗體或構築體中之與所比較之抗體或構築體中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。在某些實施例中，使用序列比較電腦程式MUSCLE測定胺基酸序列一致性百分比值。Edgar,Nucleic Acids Res. 32:1792-1797 (2004)；Edgar,BMC Bioinformatics 5:113 (2004)。
術語「恆定域」係指具有比含有抗原結合位點之免疫球蛋白之其他部分(即可變域)更保守的胺基酸序列之免疫球蛋白分子部分。恆定域含有重鏈之CH 1、CH 2及CH 3域(統稱為CH )及輕鏈之CL 域。
來自任何哺乳動物物種之抗體(免疫球蛋白)之輕鏈基於其恆定域之胺基酸序列而分為兩種不同類型中之一種：kappa (「κ」)及lambda (「λ」)。
基於EU編號系統，人類IgG Fc區之CH 1域，亦稱為「H1」域之「C1」，通常自約胺基酸118延伸至約胺基酸215。
術語「鉸鏈區」係指IgG中之對應於人類IgG1之Glu216至Pro230之區域，基於EU編號系統。Burton,Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)。
基於EU編號系統，人類IgG Fc區之CH 2域，亦稱為「H2」域之「C2」，通常自約胺基酸231延伸至約胺基酸340。
基於EU編號系統，人類IgG Fc區之CH 3域，亦稱為「C3」或「H3」域，包含C 端與Fc區中之CH2域之間的殘基，亦即，約胺基酸341至抗體序列之C 端(通常在IgG之胺基酸446或447處)。
術語「Fc區」或「片段可結晶區域」係指免疫球蛋白重鏈之C 端區域。基於EU編號系統，人類IgG重鏈Fc區通常自Cys226或Pro230延伸至C 端。在某些實施例中，移除Fc區之C 端離胺酸。適用於本文中所描述之抗體或構築體之原生序列Fc區包括人類IgG1、IgG2、IgG2A、IgG2B、IgG3及IgG4之Fc區。
術語「Fc受體」或「FcR」係指結合於抗體之Fc區之受體。在某些實施例中，FcR為人類FcR。在某些實施例中，FcR為原生人類FcR。在某些實施例中，FcR為結合於IgG抗體之FcR (例如γ受體)。Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34 (1994)；de Haas等人,J. Lab. Clin. Med. 126:330-341 (1995)。在某些實施例中，FcR為FcγRI受體、FcγRIIA受體(「活化受體」)、FcγRIIB受體(「抑制受體」)、FcγRII受體或FcγRIII受體；或其對偶基因變異體或可替代地剪接形式。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。參見Daëron,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)。
如本文中所使用，在存在等莫耳濃度之第一抗體或其片段之情況下，當第一抗體或其片段抑制第二抗體或其片段之目標抗原結合達至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%時，第一抗體或其片段與第二抗體或其片段「競爭」結合於目標抗原，或反之亦然。基於抗體之交叉競爭而將抗體「分組」之高通量方法描述於WO 03/48731中。
如本文中所使用，術語「細胞介素」應理解為意謂任何蛋白質或肽、其類似物或功能片段，其能夠在哺乳動物中刺激或誘導針對預先選擇之細胞類型(例如癌細胞或病毒感染細胞)之殺細胞免疫反應。因此，預期多種細胞介素可併入本發明中。適用之細胞介素包括例如腫瘤壞死因子(TNF)、介白素(IL)、淋巴介質(L)、群落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)，包括其能夠刺激或誘導此類殺細胞免疫反應之物種變異體及截短型類似物。適用的腫瘤壞死因子包括例如TNFα。適用的淋巴介質包括例如LT。適用的群落刺激因子包括例如GM-CSF及M-CSF。適用的介白素包括例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL22及IL-33。適用的干擾素包括例如IFN-α、IFN-β及IFN-γ。術語「細胞介素」亦理解為涵蓋野生型細胞介素(諸如IL-21、IL-7、IL-15)之任何變異體，其包含修飾且維持其所需功能中之任一者之至少大部分(諸如至少約50%)。
術語「個體」係指動物，包括(但不限於)靈長類動物(例如人類)、牛、豬、綿羊、山羊、馬、犬、貓、兔、大鼠或小鼠。術語「個體(subject/individual)」及「患者」在本文中可互換地用於指例如哺乳動物個體，諸如人類。在一個實施例中，個體為人類。
術語「治療(treat/treating/treatment)」意謂包括緩解或消除病症、疾病或病狀或與病症、疾病或病狀相關之症狀中之一或多者；或緩解或根除病症、疾病或病狀本身之起因。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」意謂包括實現以下目的之方法：延緩及/或阻止病症、疾病或病狀及/或其伴隨症狀之發作；防止個體罹患病症、疾病或病狀；或降低個體罹患病症、疾病或病狀之風險。
術語「緩解(alleviate/alleviating)」係指減輕或減少病症、疾病或病狀之一或多種症狀(例如,疼痛)。該等術語亦可指減少與活性成分相關之副作用。有時，個體自預防劑或治療劑獲得之有利效果不會引起病症、疾病或病狀之治癒。
術語「接觸(contacting/contact)」意指使治療劑與細胞或組織在一起，使得作為此類接觸之結果而產生生理學及/或化學作用。接觸可活體外、離體或活體內進行。在一個實施例中，使治療劑與細胞培養物(活體外)中之細胞接觸以測定治療劑對細胞之作用。在另一實施例中，治療劑與細胞或組織之接觸包括向具有待接觸之細胞或組織之個體投與治療劑。
術語「治療有效量」或「有效量」意謂包括在投與時足以阻止所治療之病症、疾病或病狀之一或多種症狀之發展或在一定程度上緩解該一或多種症狀的化合物之量。術語「治療有效量」或「有效量」亦指足以引起研究人員、獸醫、醫生或臨床醫師所尋求之生物分子(例如蛋白質、酶、RNA或DNA)、細胞、組織、系統、動物或人類之生物學或醫學反應的化合物之量。
術語「IC50 」或「EC50 」係指在量測此類反應之分析法中實現最大反應之50%抑制所需的化合物之量、濃度或劑量。
術語「醫藥學上可接受之載劑」、「醫藥學上可接受之賦形劑」、「生理學上可接受之載劑」或「生理學上可接受之賦形劑」係指醫藥學上可接受之物質、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、溶劑或囊封材料。在一個實施例中，各組分在以下意義上為「醫藥學上可接受的」：與醫藥調配物之其他成分相容且適用於與個體(例如人類或動物)之組織或器官接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應、免疫原性或其他問題或併發症，且與合理的益處/風險比相匹配。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第22版; Allen編; Pharmaceutical Press: London, 2012；Handbook of Pharmaceutical Excipients , 第8版; Sheskey等人編; Pharmaceutical Press: London, 2017；Handbook of Pharmaceutical Additives , 第3版; Ash及Ash編; Synapse Information Resources: 2007；Pharmaceutical Preformulation and Formulation , 第2版; Gibson編; Drugs and the Pharmaceutical Sciences 199; Informa Healthcare: New York, NY, 2009。
術語「約」或「大致」意謂如由一般熟習此項技術者所測定之特定值的可接受之誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。在某些實施例中，術語「約」或「大致」意謂在1、2或3個標準差內。在某些實施例中，術語「約」或「大致」意謂在既定值或範圍之25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.05%內。
在癌症之情況下，術語「治療」包括以下中之任一者或全部：抑制癌細胞生長、抑制癌細胞複製、減小整體腫瘤負荷及改善與疾病相關之一或多種症狀。II. 抗白蛋白構築體
在一個實施例中，提供一種抗白蛋白構築體，其包含特異性結合於白蛋白之單域抗體(sdAb)部分。
在另一實施例中，提供經分離抗白蛋白構築體，其包含特異性結合於白蛋白之sdAb部分。
在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白構築體以約10-6 M至約10-10 M或約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白構築體以約10-5 M至約10-6 M、約10-6 M至約10-7 M、約10-7 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-9 M、約10-9 M至約10-10 M、約10-10 M至約10-11 M、約10-11 M至約10-12 M、約10-6 M至約10-10 M、約10-6 M至約10-12 M、約10-6 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-12 M、約10-9 M至約10-12 M、約10-10 M至約10-12 M、約10-5 M至約10-11 M、約10-7 M至約10-11 M、約10-8 M至約10-11 M、約10-9 M至約10-11 M、約10-5 M至約10-10 M、約10-7 M至約10-10 M、約10-8 M至約10-10 M、約10-5 M至約10-9 M、約10-7 M至約10-9 M、約10-5 M至約10-8 M或約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，在約pH 7下，本文中所提供之抗白蛋白構築體以約10-6 M至約10-10 M或約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，在約pH 7下，本文中所提供之抗白蛋白構築體以約10-5 M至約10-6 M、約10-6 M至約10-7 M、約10-7 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-9 M、約10-9 M至約10-10 M、約10-10 M至約10-11 M、約10-11 M至約10-12 M、約10-6 M至約10-10 M、約10-6 M至約10-12 M、約10-6 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-12 M、約10-9 M至約10-12 M、約10-10 M至約10-12 M、約10-5 M至約10-11 M、約10-7 M至約10-11 M、約10-8 M至約10-11 M、約10-9 M至約10-11 M、約10-5 M至約10-10 M、約10-7 M至約10-10 M、約10-8 M至約10-10 M、約10-5 M至約10-9 M、約10-7 M至約10-9 M、約10-5 M至約10-8 M或約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，在約pH 5.5下，本文中所提供之抗白蛋白構築體以約10-6 M至約10-10 M或約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
在某些實施例中，在約pH 5.5下，本文中所提供之抗白蛋白構築體以約10-5 M至約10-6 M、約10-6 M至約10-7 M、約10-7 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-9 M、約10-9 M至約10-10 M、約10-10 M至約10-11 M、約10-11 M至約10-12 M、約10-6 M至約10-10 M、約10-6 M至約10-12 M、約10-6 M至約10-8 M、約10-8 M至約10-12 M、約10-9 M至約10-12 M、約10-10 M至約10-12 M、約10-5 M至約10-11 M、約10-7 M至約10-11 M、約10-8 M至約10-11 M、約10-9 M至約10-11 M、約10-5 M至約10-10 M、約10-7 M至約10-10 M、約10-8 M至約10-10 M、約10-5 M至約10-9 M、約10-7 M至約10-9 M、約10-5 M至約10-8 M或約10-6 M至約10-8 M範圍內之K D 結合於白蛋白。
本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之K D 可藉由此項技術中已知的方法測定，包括(但不限於)ELISA、放射性配位體結合分析法(RIA)、表面電漿子共振(SPR)技術、親和層析、螢光能量共振轉移(FRET)及等溫滴定量熱法(ITC)。
在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之K on 在約102 至約104 M-1 s-1 、約104 至約106 M-1 s-1 、約106 至約107 M-1 s-1 、約102 至約107 M-1 s-1 、約103 至約107 M-1 s-1 、約104 至約107 M-1 s-1 、約105 至約107 M-1 s-1 、約103 至約106 M-1 s-1 或約104 至約106 M-1 s-1 範圍內。
在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之Koff 在約1至約10-2 s-1 、約10-2 至約10-4 s-1 、約10-4 至約10-5 s-1 、約10-5 至約10-6 s-1 、約1至約10-6 s-1 、約10-2 至約10-6 s-1 、約10-3 至約10-6 s-1 、約10-4 至約10-6 s-1 、約10-2 至約10-5 s-1 或約10-3 至約10-5 s-1 範圍內。
在某些實施例中，在約pH 7下，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之K on 在約102 至約104 M-1 s-1 、約104 至約106 M-1 s-1 、約106 至約107 M-1 s-1 、約102 至約107 M-1 s-1 、約103 至約107 M-1 s-1 、約104 至約107 M-1 s-1 、約105 至約107 M-1 s-1 、約103 至約106 M-1 s-1 或約104 至約106 M-1 s-1 範圍內。
在某些實施例中，在約pH 7下，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之Koff 在約1至約10-2 s-1 、約10-2 至約10-4 s-1 、約10-4 至約10-5 s-1 、約10-5 至約10-6 s-1 、約1至約10-6 s-1 、約10-2 至約10-6 s-1 、約10-3 至約10-6 s-1 、約10-4 至約10-6 s-1 、約10-2 至約10-5 s-1 或約10-3 至約10-5 s-1 範圍內。
在某些實施例中，在約pH 5.5下，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之K on 在約102 至約104 M-1 s-1 、約104 至約106 M-1 s-1 、約106 至約107 M-1 s-1 、約102 至約107 M-1 s-1 、約103 至約107 M-1 s-1 、約104 至約107 M-1 s-1 、約105 至約107 M-1 s-1 、約103 至約106 M-1 s-1 或約104 至約106 M-1 s-1 範圍內。
在某些實施例中，在約pH 5.5下，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於白蛋白之Koff 在約1至約10-2 s-1 、約10-2 至約10-4 s-1 、約10-4 至約10-5 s-1 、約10-5 至約10-6 s-1 、約1至約10-6 s-1 、約10-2 至約10-6 s-1 、約10-3 至約10-6 s-1 、約10-4 至約10-6 s-1 、約10-2 至約10-5 s-1 或約10-3 至約10-5 s-1 範圍內。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與本文中所描述之抗白蛋白sdAb構築體中之任一者競爭結合於白蛋白。在某些實施例中，使用ELISA分析法測定競爭性結合。
在一個實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者之胺基酸序列之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含以下之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含以下之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31或34之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32或35之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33或36之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白。
在另一實施例中，提供包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體，其與包含以下之抗白蛋白sdAb構築體競爭性地特異性結合於白蛋白：CDR1，其包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列。 A.          抗白蛋白單域抗體部分
sdAb與習知的4鏈抗體之不同之處在於其具有單一單體抗體可變域，諸如重鏈可變域(VH H)，其可在無輕鏈之輔助之情況下呈現針對抗原之高親和力。已知駱駝VH H為最小的功能性抗原結合片段，其分子量為約15 kDa。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31及34中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32及35中之任一者之胺基酸序列，其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33及36中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31及34中之任一者之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32及35中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33及36中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31及34中之任一者之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32及35中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33及36中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:116、118、121、124、129、132、135或138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35、119、122、125、127、130、133、136或139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117、120、123、126、128、131、134、137或140之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:122或127之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123或128之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:122或127之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123或128之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:122或127之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:123或128之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列，或其包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。在某些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在另一實施例中，提供包含以下之抗白蛋白sdAb部分：CDR1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列。
在一個實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之變異體。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之變異體。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9、45-53及105-115中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者具有至少約80% (諸如至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列一致性之變異體。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個(諸如1、2或3個)胺基酸取代之變異體。
在一個實施例中，包含VH H域(包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列)之抗白蛋白sdAb部分或其變異體包含CDR (諸如SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之CDR1及/或CDR2及/或CDR3)中之胺基酸取代。
在另一實施例中，包含VH H域(包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列)之抗白蛋白sdAb部分或其變異體包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3，且胺基酸取代係在FR (諸如SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之FR1及/或FR2及/或FR3及/或FR4)中。
在另一實施例中，包含VH H域(包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列)之抗白蛋白sdAb部分或其變異體包含CDR及FR中之胺基酸取代。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供一種抗白蛋白sdAb部分，其包含SEQ ID NO:1-9及45-53中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:105-115中之任一者具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之變異體。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列，或其在VH H域中包含至多約3個，在一個實施例中，1、2或3個胺基酸取代之變異體。
在一個實施例中，包含VH H域(包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列)之抗白蛋白sdAb部分或其變異體包含CDR (諸如SEQ ID NO:105-115中之任一者之CDR1及/或CDR2及/或CDR3)中之胺基酸取代。
在另一實施例中，包含VH H域(包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列)之抗白蛋白sdAb部分或其變異體包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3，且胺基酸取代係在FR (諸如SEQ ID NO:105-115中之任一者之FR1及/或FR2及/或FR3及/或FR4)中。
在另一實施例中，包含VH H域(包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列)之抗白蛋白sdAb部分或其變異體包含CDR及FR中之胺基酸取代。
在另一實施例中，提供包含VH H域之抗白蛋白sdAb部分，該VH H域包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供一種抗白蛋白sdAb部分，其包含SEQ ID NO:105-115中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，抗白蛋白sdAb部分為駱駝、嵌合、人類、部分人類化或完全人類化的。 單域抗體
在一個實施例中，本文中所描述之抗白蛋白構築體為抗白蛋白sdAb。
例示性sdAb包括(但不限於)來自僅重鏈抗體之重鏈可變域(例如駱駝科(Camelidae )中之VH H (重鏈抗體之重鏈之可變域)或軟骨魚中之VNAR (鯊魚新穎抗原受體之可變域))、來源於習知4鏈抗體之單域(諸如VH 或VL )、人類化僅重鏈抗體及由表現人類重鏈區段之基因轉殖小鼠或大鼠產生之人類單域抗體。
在某些實施例中，本文中所描述之sdAb係來源於小鼠、大鼠、人類、駱駝、駱馬、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔或牛。
在某些實施例中，本文中所描述之sdAb係來源於天然存在之單域抗原結合分子，已知其為不含輕鏈之重鏈抗體，亦稱為僅重鏈抗體或「HCAb」。參見例如WO 94/04678及Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448 (1993)。為了清楚起見，來源於天然不含輕鏈之重鏈分子之可變域在本文中稱為VH H，以將其與四鏈免疫球蛋白之習知VH 區分。在某些實施例中，VH H係來源於駱駝科物種(例如駱駝、駱馬、小羊駝、單峰駝、羊駝或栗色駱馬)中產生之抗體。
在某些實施例中，本文中所描述之sdAb係來源於在軟骨魚中發現之免疫球蛋白之可變區。在某些實施例中，本文中所描述之sdAb係來源於在鯊魚之血清中發現的稱為新穎抗原受體(NAR)之免疫球蛋白同型。用於製備來源於NAR (「IgNAR」)之可變區之單域抗體之方法描述於WO 03/014161及Streltsov,Protein Sci. 14:2901-2909 (2005)中。
在某些實施例中，本文中所描述之sdAb為重組、CDR移植、人類化、駱駝化、去免疫或活體外產生(例如藉由噬菌體呈現來選擇)的。在某些實施例中，藉由構架區中之特異性胺基酸殘基之「駱駝化」來改變sdAb之構架區之胺基酸序列。駱駝化係指來自習知4鏈抗體之(天然存在之)VH 域之胺基酸序列中之一或多個胺基酸殘基由重鏈抗體之VH H域中的相應位置處之胺基酸殘基中之一或多者置換或取代。此類「駱駝化」取代較佳在形成及/或存在於VH -VL 界面處之胺基酸位置處及/或在如本文中所定義之所謂的駱駝科標誌殘基處插入。參見例如WO 94/04678，Davies及Riechmann,FEBS Lett. 339:285-290 (1994)；Davies及Riechmann,Protein Engin. 9:531-537 (1996)；Riechmann,J. Mol. Biol. 259:957-969 (1996)；以及Riechmann及Muyldermans,J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999)。
在某些實施例中，本文中所描述之sdAb為由表現人類重鏈區段之基因轉殖小鼠或大鼠產生之人類sdAb。參見例如US 2009/0307787A1、US 2015/0289489A1、U S2010/0122358A1、US 8,754,287及WO 2004/049794。在某些實施例中，本文中所描述之sdAb為親和力成熟的。
在某些實施例中，本文中所描述之針對特定抗原或目標之包含天然存在之VH H域的sdAb係自駱駝VH H序列之原生或免疫庫獲得。參見例如WO 99/37681、WO 01/90190、WO 03/025020及WO 03/035694。在某些實施例中，使用來源於原生或免疫VH H庫之經改良之合成或半合成庫，例如藉由諸如隨機突變誘發及/或CDR改組之技術自原生或免疫VH H庫獲得之VH H庫。參見例如WO 00/43507。
在某些實施例中，本文中所描述之sdAb係由習知4鏈抗體產生。參見例如EP 0 368 684；WO 06/030220；WO 06/003388；Ward等人,Nature 341:544-546 (1989)；及Holt等人,Trends Biotechnol. 21:484-490 (2003)。
由於sdAb之獨特特性，使用VH H域作為單一抗原結合蛋白質或域(亦即，作為較大的蛋白質、多肽或構築體之一部分)與習知VH 及VL 、scFv以及習知抗體片段(諸如Fab或(Fab')2 )相比可提供許多顯著優點：1)僅需要單一域以高親和力結合於抗原，無需具有第二域及確保此兩個域以正確的空間構形及組態存在(例如無需在摺疊期間使重鏈與輕鏈配對或無需使用經特定設計之連接子，諸如用於scFv之連接子)；2)VH H域或sdAb可由單一基因表現，無需轉譯後摺疊或修飾；3)VH H域或sdAb可容易地工程改造成多價及/或多特異性格式(諸如本文中所描述之抗白蛋白構築體)；4)VH H域或sdAb具有高可溶性，由此降低其聚集趨勢(與例如由Ward等人,Nature 341:544-546 (1989)描述之小鼠衍生之「dAb」相比)；5)VH H域或sdAb針對熱、pH值或蛋白酶具有高穩定性；6)即使在大規模下，VH H域或sdAb亦可容易地及相對便宜地製備或產生，諸如使用微生物醱酵，無需使用哺乳動物表現系統(如在產生例如習知抗體片段時需要使用哺乳動物表現系統)；7)與習知4鏈抗體及其抗原結合片段相比，VH H域或sdAb相對較小(約15 kDa或比習知IgG小10倍)，且因此具有(更)高組織滲透能力，例如對於實體腫瘤及密集組織；及8)VH H域或sdAb可呈現所謂的「空腔結合性質」(歸因於其與習知VH 域相比延伸之CDR3環)且因此可到達習知4鏈抗體或其抗原結合片段不可到達之目標或抗原決定基。舉例而言，已證實VH H域或sdAb可抑制酶。參見例如WO 1997/049805；Transue等人,Proteins 32:515-522 (1998)；Lauwereys等人,EMBO J. 17:3512-3520 (1998)。 白蛋白
已使用白蛋白(例如人類血清白蛋白或HSA)延長生物藥物之血清半衰期。參見例如Dennis等人,J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002)；Adams等人,MABS 8:1336-1346 (2016)。舉例而言，已使用HSA。HSA為血液中最豐富之蛋白質且廣泛分佈於組織中且具有非急性功能。其半衰期為19天。因此，在一個實施例中，在本文中使用白蛋白(例如HSA)延長藥物(諸如本文中所描述之抗白蛋白構築體)之半衰期。
在某些實施例中，白蛋白係選自由以下組成之群：HSA、恆河猴血清白蛋白(RhSA)、獼猴血清白蛋白(CySA)及鼠類血清白蛋白(MuSA)。在某些實施例中，白蛋白為HSA。
HSA之少數異構體列舉於以下表2中。參見UniProtKB - P02768 (ALBU_HUMAN)。在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白構築體結合於SEQ ID NO:54、55、56或57。表 2. 人類絲胺酸白蛋白之異構體
類型 胺基酸序列
異構體1 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:54)
異構體2 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:55)
異構體3 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:56)
成熟HSA DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQGLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVGSKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDCLSVFLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNGRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO:57)
在某些實施例中，HSA與SEQ ID NO:54、55、56或57之胺基酸序列至少90%一致。在某些實施例中，HSA與SEQ ID NO:54、55、56或57之胺基酸序列至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致。在某些實施例中，HSA與SEQ ID NO:54、55、56或57相差不超過10個胺基酸。在某些實施例中，HSA與SEQ ID NO:54、55、56或57相差不超過5、4、3、2或1個胺基酸。在某些實施例中，HSA與SEQ ID NO:54、55、56或57之不同之處在於具有例如保守性突變或非保守性區域中之突變且與SEQ ID NO:54、55、56或57之HSA具有實質上相同的生物功能。
在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白構築體結合於上文所描述之白蛋白中之任一者。在某些實施例中，抗白蛋白構築體結合於SEQ ID NO:54、55、56或57之白蛋白。 嵌合或人類化抗體
在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白sdAb部分為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如US 4,816,567；及Morrison等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984)中。在一個實施例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於駱駝科物種(諸如駱馬)之可變區)及人類恆定區。在另一實施例中，嵌合抗體為「類別切換」抗體，其中類別或子類別已自其親本抗體改變。嵌合抗體涵蓋其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。典型地，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR，例如CDR (或其一部分)來源於非人類抗體，且FR (或其一部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代，例如以恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法評述於例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中。可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)使用「最佳擬合」方法選擇之構架區；來源於輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體之共同序列之構架區；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區；及來源於篩選FR文庫之構架區。
在某些實施例中，抗白蛋白sdAb經修飾(諸如人類化)而不降低域對抗原之天然親和力且同時降低其對異源物質之免疫原性。舉例而言，可測定駱馬抗體之抗體可變域(VH H)之胺基酸殘基，且一或多個駱駝胺基酸(例如，構架區中)由在人類共同序列中發現之其人類對應物置換，而不使多肽失去其典型特徵，亦即，人類化不顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝單域抗體之人類化需要單一多肽鏈中之有限量的胺基酸之引入及突變誘發。此與scFv、Fab'、(Fab')2 及IgG之人類化不同，其需要在兩條鏈(輕鏈及重鏈)中引入胺基酸變化且保留兩條鏈之組件。
包含VH H域之SdAb可經人類化以具有人類樣序列。在某些實施例中，本文中使用之VH H域之FR區域與人類VH構架區包含至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%中之任一者或更高的胺基酸序列同源性。一種例示性類別之人類化VH H域之特徵在於VH H在位置45處具有來自由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺或麩醯胺酸組成之群之胺基酸(諸如L45)及在位置103處具有色胺酸，根據Kabat編號。因此，屬於此類別之多肽與人類VH構架區展示高胺基酸序列同源性且該等多肽可直接投與人類而預期不會引起不合需要的免疫反應，且不具有進一步人類化之負擔。
另一種例示性類別之人類化駱駝單域抗體已描述於WO 03/035694中且含有通常在人類來源或來自其他物種之習知抗體中發現之疏水性FR2殘基，但藉由位置103上之帶電精胺酸殘基補償此親水性損失，該帶電精胺酸殘基取代來自雙鏈抗體之VH 中之保守性色胺酸殘基。因此，屬於此兩種類別之肽與人類VH 構架區展示高胺基酸序列同源性且該等肽可直接投與人類而預期不會引起不合需要的免疫反應，且不具有進一步人類化之負擔。 人類域抗體
在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白sdAb部分為人類抗體(稱為人類域抗體或人類DAb)。可使用此項技術中已知的各種技術來產生人類抗體。參見例如Chen,Mol. Immunol. 47:912-21 (2010)。此項技術中已知能夠產生完全人類單域抗體(或DAb)之基因轉殖小鼠或大鼠。參見例如US 2009/0307787A1、US 8,754,287、US 2015/0289489A1、US 2010/0122358A1及WO 2004/049794。
人類抗體可藉由向經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體之轉殖基因動物投與免疫原來製備。此類動物典型地含有人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物之染色體中。在此類基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常不活化。關於用於自基因轉殖動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。來自由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可進一步經修飾，例如藉由與不同的人類恆定區組合。
人類抗體(例如人類DAb)亦可藉由基於融合瘤之方法製得。此項技術中已知用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生之噬菌體呈現庫之Fv純系可變域序列來產生。此類可變域序列接著可與所需人類恆定域組合。用於自抗體庫選擇人類抗體之技術描述於下文中。
一種用於獲得針對特定抗原或目標之VH H序列之技術涉及適當地使能夠表現重鏈抗體之基因轉殖哺乳動物免疫(亦即，以產生針對該抗原或目標之免疫反應及/或重鏈抗體)、自含有該等VH H序列(編碼該等VH H序列之核酸序列)之該基因轉殖哺乳動物獲得適合的生物樣品(諸如血液樣品、血清樣品或B細胞樣品)，且接著使用本身已知的任何適合的技術(諸如本文中所描述之方法中之任一者或融合瘤技術)，以該樣品為起始物質產生針對該抗原或目標之VH H序列。舉例而言，為達成此目的，可使用表現重鏈抗體之小鼠以及WO 02/085945、WO 04/049794及WO 06/008548以及Janssens等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:15130-15135 (2006)中描述之其他方法及技術。舉例而言，此類表現重鏈抗體之小鼠可表現具有任何適合的(單一)可變域之重鏈抗體，該可變域諸如來自天然來源之(單一)可變域(例如人類(單一)可變域、駱駝(單一)可變域或鯊魚(單一)可變域)，以及例如合成或半合成(單一)可變域。 庫衍生之抗體
本發明之抗體可藉由針對具有所需活性之抗體篩選組合庫來分離。舉例而言，此項技術中已知多種用於產生噬菌體呈現庫及針對具有所需結合特徵之抗體篩選此類庫之方法。已描述用於構築單域抗體庫之方法，例如參見US 7,371,849。
在某些噬菌體呈現方法中，VH 及VL 基因之譜系係分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體庫中隨機重組，其接著可如Winter等人,Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994)中所述，針對抗原結合噬菌體進行篩選。VH H基因之譜系可藉由PCR類似地選殖，在噬菌體庫中隨機重組且針對抗原結合噬菌體進行篩選。噬菌體典型地以scFv片段形式或以Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫之來源之庫提供針對免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖(例如自人類)原生譜系以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人,EMBO J. 12:725-734 (1993)所描述。最終，原生庫亦可以合成方式藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列以編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排之PCR引子來製得，如由Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)所描述。
自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。 生物活性1. 血清半衰期
在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白sdAb部分之生物活性係由其延長包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體之血清半衰期之能力決定。在某些實施例中，在投與個體時，抗白蛋白構築體之半衰期為至少約15天、約14天、約13天、約12天、約11天、約10天、約9天、約8天、約7天、約6天、約5天、約4天、約3天、約2天、約24小時、約22小時、約20小時、約18小時、約16小時、約14小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約3小時、約2小時或約1小時。抗白蛋白構築體可經由各種途徑投與，例如靜脈內、經口、皮下或腹膜內。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體之血清半衰期比參考構築體之血清半衰期長(諸如長至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%)。在某些實施例中，抗白蛋白構築體之血清半衰期為參考構築體之血清半衰期之至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。在某些實施例中，參考構築體不具有抗白蛋白sdAb部分，但包含與抗白蛋白構築體相同的其他功能性部分。2. 穩定性
在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白sdAb部分之生物活性可由其改良包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體之穩定性之能力決定。在某些實施例中，抗白蛋白構築體之穩定性高於參考構築體。在某些實施例中，參考構築體不具有抗白蛋白sdAb部分，但包含與抗白蛋白構築體相同的其他功能性部分。
在某些實施例中，穩定性包含熱穩定性。
在某些實施例中，藉由抗白蛋白構築體在既定條件下儲存之後保持可接受的程度之化學結構或生物功能之程度來評估穩定性。在某些實施例中，即使抗白蛋白構築體在儲存既定時間量之後未保持100%的其化學結構或生物功能，但其仍具有高穩定性。在某些實施例中，在儲存既定時間量之後，保持如本文中所描述之抗白蛋白構築體之約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的結構或功能可視為具有高穩定性。
穩定性可尤其藉由測定在既定溫度下儲存既定時間量之後保持於調配物(液體或復原)中之原生(非聚集或降解)抗白蛋白構築體之百分比來量測。天然抗白蛋白構築體之百分比可尤其藉由尺寸排阻層析(例如尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC))測定，使得原生意謂非聚集及非降解。在某些實施例中，在既定溫度下儲存既定時間量之後，可在調配物中偵測到至少約90% (諸如至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的抗白蛋白構築體之原生形式。在某些實施例中，在室溫(約25℃)下，在至少約6小時、至少約8小時、至少約10小時、至少約12小時、至少約14小時、至少約16小時、至少約18小時、至少約20小時、至少約22小時、至少約24小時、至少約26小時、至少約28小時、至少約30小時、至少約32小時、至少約34小時、至少約36小時、至少約38小時、至少約40小時、至少約42小時、至少約44小時、至少約46小時或至少約48小時之後，可在調配物中偵測到至少約90% (諸如至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的抗白蛋白構築體之原生形式。
穩定性可尤其藉由測定在既定溫度下儲存既定時間量之後，在調配物(液體或復原)內形成聚集體之抗白蛋白構築體之百分比來量測，其中穩定性與形成之聚集體百分比成反比。可尤其藉由尺寸排阻層析(例如尺寸排阻高效液相層析(SE-HPLC))來測定聚集之抗白蛋白構築體之百分比。在某些實施例中，在既定溫度下儲存既定時間量之後，小於約10% (較佳小於約5%)的抗白蛋白構築體以聚集物形式存在於調配物中。在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白構築體實質上不聚集，舉例而言，在既定溫度下儲存既定時間量之後，例如在室溫(約25℃)下，在至少約6小時、至少約8小時、至少約10小時、至少約12小時、至少約14小時、至少約16小時、至少約18小時、至少約20小時、至少約22小時、至少約24小時、至少約26小時、至少約28小時、至少約30小時、至少約32小時、至少約34小時、至少約36小時、至少約38小時、至少約40小時、至少約42小時、至少約44小時、至少約46小時或至少約48小時之後，可在調配物中之聚集物中偵測到至多約6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%的抗白蛋白構築體。
量測抗白蛋白構築體針對其目標之結合親和力亦可用於評估穩定性。舉例而言，若在例如室溫(約25℃)下儲存既定時間量(例如6小時、12小時、24小時、36小時或48小時)之後，抗原結合域之親和力為在該儲存之前抗體之結合親和力之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高，則本發明之抗白蛋白構築體可視為穩定的。結合親和力可藉由任何方法，諸如ELISA或電漿子共振測定。抗白蛋白構築體與此類細胞之結合可直接量測，諸如經由FACS分析。3. 臨床特性
在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白sdAb部分之生物活性由其改良包含抗白蛋白sdAb部分之抗白蛋白構築體之臨床性質或特性之能力決定。在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白構築體與參考構築體相比具有改良之臨床特性。在某些實施例中，參考構築體不具有抗白蛋白sdAb部分，但包含與抗白蛋白構築體相同的其他功能性部分。在某些實施例中，抗白蛋白構築體與參考構築體相比呈現改良之細胞毒性活性。在某些實施例中，抗白蛋白構築體與參考構築體相比呈現更高的抗腫瘤作用(諸如降低腫瘤負荷及/或改良存活率)。a) 細胞毒性
可藉由多種分析法測試本文中所描述之抗白蛋白構築體針對細胞之細胞毒性(諸如ADCC活性)。舉例而言，在96孔盤中將表現可由抗白蛋白構築體識別之抗原之癌細胞株與效應細胞(例如PBMC細胞)混合在一起。添加不同濃度之抗白蛋白構築體。在培育之後，可測定EC50 (表示ADCC活性)。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體與參考構築體相比呈現改良之針對細胞之ADCC活性。在某些實施例中，對細胞具有特異性的抗白蛋白構築體之EC50 不超過約50%、40%、30%、20%、10%或小於參考構築體。在某些實施例中，細胞為腫瘤細胞。b) 治療癌症
在某些實施例中，抗白蛋白構築體治療個體中之癌症(例如，藉由抑制腫瘤生長)。在某些實施例中，抗白蛋白構築體與參考構築體相比呈現增強之針對癌症之抗腫瘤作用。舉例而言，在某些實施例中，與參考構築體相比，投與抗白蛋白構築體可引起降低之腫瘤負荷(諸如腫瘤體積減小至少約10%、20%、30%、40%或50%)。在某些實施例中，癌症為實體腫瘤。在某些實施例中，癌症為液體腫瘤。 B.          各自包含抗白蛋白sdAb部分之構築體
在某些實施例中，抗白蛋白構築體包含有包含抗白蛋白sdAb部分之第一多肽及第二多肽。 抗白蛋白融合蛋白質
在某些實施例中，抗白蛋白構築體包含與第一多肽融合之第二多肽，該第一多肽包含抗白蛋白sdAb部分。
在某些實施例中，第二多肽包含抗原結合部分。在某些實施例中，抗原結合部分結合於腫瘤抗原。在某些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為選自由以下組成之群之癌症：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤、白血病、頭頸癌、肝癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在某些實施例中，癌症表現大量腫瘤抗原。舉例而言，在某些實施例中，癌症之表現量為參考組織之至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在某些實施例中，參考組織為同一名個體中之不包含癌細胞之組織。
在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。
在某些實施例中，腫瘤抗原為間皮素。在某些實施例中，抗原結合部分包含單鏈抗體，其包含重鏈可變區(抗MSLN VH )，其中抗MSLN VH 包含CDR1、CDR2及CDR3，其中：a)CDR1包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:93之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列，或其在CDR中包含總共3、2或1個胺基酸取代之變異體；或b)CDR1包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列且CDR3包含GRY之胺基酸序列，或其在CDR中包含總共3、2或1個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，抗原為免疫檢查點蛋白質。在某些實施例中，免疫檢查點蛋白質係選自由以下組成之群：PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、TIGIT、GITR、TIM3、LAG3、CD27、4-1BB及B7H4。
在某些實施例中，抗原結合部分為抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，本文中所提供之抗體或其抗原結合片段可免疫特異性結合於表現於癌細胞上之抗原之多肽、多肽片段或抗原決定基。在一個實施例中，抗體結合於人類癌症抗原。在某些實施例中，本文中所提供之抗體或其抗原結合片段結合於癌症抗原之細胞外域(ECD)。在某些實施例中，抗體結合於癌症抗原之ECD中之抗原決定基。在某些實施例中，癌症抗原表現於實體腫瘤癌細胞上。
結合於本文中所提供之癌症抗原之抗體可為(但不限於)合成抗體、單株抗體、以重組方式產生之抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、單鏈Fv (scFv)(例如包括單特異性及雙特異性)、駱駝化抗體或其人類化變異體、Fab片段、F(ab')片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、抗個體基因型(抗Id)抗體及其抗原決定基結合片段。
在某些實施例中，本文中所提供之抗體包括免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即，含有免疫特異性結合於癌症抗原(例如實體腫瘤癌症抗原)之抗原結合位點之分子。本文中所提供之免疫球蛋白分子可具有免疫球蛋白分子之任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或子類別。在特定實施例中，本文中所提供之抗體為IgG抗體，諸如IgG1抗體。
包括保留特異性結合於癌症抗原之抗原決定基之能力的抗體片段之抗體之變異體及衍生物亦包括於本發明中。例示性片段包括Fab片段；Fab'；F(ab')2 ；雙特異性Fab；包含可變區之單鏈Fab鏈，亦稱為sFv；二硫鍵連接之Fv，或dsFv；駱駝化VH；雙特異性sFv；雙功能抗體；及三功能抗體。抗體之衍生物亦包括抗體組合位點之一或多個CDR序列。當存在兩個或更多個CDR序列時，CDR序列可在骨架上連接在一起。在某些實施例中，本文中所提供之抗體包含單鏈Fv (「scFv」)。已研發各種技術以用於製備抗體片段，如上述章節中簡要描述。
在某些實施例中，抗原結合部分為結合於腫瘤抗原之單一可變域抗體(sdAb)(諸如VH H抗體)。某些類型的生物體(駱駝科及軟骨魚)具有安裝於Fc等效域結構上之高親和力單一V樣域作為其免疫系統之一部分。Woolven等人,Immunogenetics 50:98-101 (1999)；及Streltsov等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:12444-12449 (2004)。V樣域(駱駝中稱為VH H且鯊魚中稱為V-NAR)通常呈現長表面環，其實現目標抗原之空腔之滲透。其亦藉由遮罩疏水性表面貼片而使經分離之VH域穩定。
在某些實施例中，第二多肽包含細胞介素、生長因子或蛋白質激素。
在某些實施例中，第二多肽包含細胞介素。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合於IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在某些實施例中，第二多肽包含IL-21。在某些實施例中，IL-21為人類IL-21。在某些實施例中，IL-21包含SEQ ID NO:97或98之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO:97或98具有至少80% (諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%中之任一者)一致性之變異體。在某些實施例中，IL-21為不具有SEQ ID NO:97之胺基酸序列中的S124與S133之間的約1至約10個胺基酸之變異體。
在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5、R9、K73或R76處的由二十種天然胺基酸中之分別除R、R、K及R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5處的由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R9處的由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置K73處的由二十種天然胺基酸中之除K以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R76處的由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。
在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5、R9、K73及/或R76處的兩個、三個或四個各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R、R、K及R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5及R9處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5及K73處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R及K以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R9及K73處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R及K以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R9及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置K73及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除K及R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5、R9及K73處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R、R及K以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5、R9及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之除R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5、K73及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R、K及R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R9、K73及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R、K及R以外的一種進行之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置R5、R9、K73及R76處的各自獨立地由二十種天然胺基酸中之分別除R、R、K及R以外的一種進行之取代。
在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R5A、R5E、R5N、R9A、R9E、R9N、K73A、K73E、K73N、R76A、R76E或R76N之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R5A、R5E或R5N之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R9A、R9E或R9N之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之K73A、K73E或K73N之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R76A、R76E或R76N之取代。
在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R5A、R5E、R9A、R9E、K73A、K73E、R76A或R76E之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R5A或R5E之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R9A或R9E之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之K73A或K73E之取代。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之R76A或R76E之取代。
在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之以下之取代：(i)R5N及(ii)M7S或M7T。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之以下之取代：(i)R9N及(ii)R11S或R11T。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之以下之取代：(i)K73N及(ii)K75S或K75T。在某些實施例中，IL-21為一種突變蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之以下之取代：(i)R76N及(ii)P78S或P78T。
在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:97、98及151至167中之任一者之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:97之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:98之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:151之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:152之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:153之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:154之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:155之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:156之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:157之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:158之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:159之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:160之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:161之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:162之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:163之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:164之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:165之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:166之胺基酸序列。在某些實施例中，IL-21具有SEQ ID NO:167之胺基酸序列。
其他IL-21序列包括US 2019/0046611 A1中描述之序列，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個實施例中，IL-21係經糖基化的。在另一實施例中，IL-21係經N- 糖基化的。
在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NXT或NXS之胺基酸序列，其中各X獨立地為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y。在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NXT或NXS之胺基酸序列，其中各X獨立地為H、K、L或M。
在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NHT、NHS、NKT、NKS、NLT、NLS、NMT或NMS之胺基酸序列。在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NHT或NHS之胺基酸序列。在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NKT或NKS之胺基酸序列。在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NLT或NLS之胺基酸序列。在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有NMT或NMS之胺基酸序列。
在一個實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有在SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置5處開始的NHT或NHS之胺基酸序列。在另一實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含N- 糖基化位點，其具有在SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置9處開始的NMT或NMS之胺基酸序列。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21包含N -糖基化位點，其具有在SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置73處開始的NLT或NLS之胺基酸序列。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21包含N -糖基化位點，其具有在SEQ ID NO:97之胺基酸序列中之位置76處開始的NKT或NKS之胺基酸序列。
在一個實施例中，經N- 糖基化之IL-21包含胺基酸取代R5N，其中位置5處之天冬醯胺經N- 糖基化。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21包含胺基酸取代R9N，其中位置9處之天冬醯胺經N -糖基化。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21包含胺基酸取代K73N，其中位置73處之天冬醯胺經N -糖基化。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21包含胺基酸取代R76N，其中位置76處之天冬醯胺經N -糖基化。在某些實施例中，經N- 糖基化之IL-21具有SEQ ID NO:160至167中之任一者之胺基酸序列。
在一個實施例中，經N- 糖基化之IL-21具有一個聚糖。在另一實施例中，經N- 糖基化之IL-21具有一個連接至天冬醯胺殘基之側鏈中之氮之聚糖。
在一個實施例中，經N- 糖基化之IL-21具有兩個聚糖。在另一實施例中，經N- 糖基化之IL-21具有兩個聚糖，其中至少一個聚糖連接至天冬醯胺殘基之側鏈中之氮。在另一實施例中，經N- 糖基化之IL-21具有兩個聚糖，其各自連接至天冬醯胺殘基之側鏈中之氮。
在一個實施例中，經N -糖基化之IL-21具有三個聚糖。在一個實施例中，聚糖為N- 聚糖。
在一個實施例中，經N- 糖基化之IL-21上之N- 聚糖為寡甘露糖型。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21上之N -聚糖為複合物型。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21上之N -聚糖為氫化物型。
在一個實施例中，經N -糖基化之IL-21上之N -聚糖為雙觸角複合物型。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21上之N -聚糖為三觸角複合物型。在另一實施例中，經N -糖基化之IL-21上之N -聚糖為四觸角複合物型。
在一個實施例中，經N -糖基化之IL-21上之N -聚糖為Szabo等人,J. Proteome. Res. 2018 , 17, 1559-1574中所描述之聚糖中之一者，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，IL-21進一步包括一或多個其他取代、缺失及/或插入；及/或一或多個其他轉譯後修飾。
在某些實施例中，本文中所提供之融合蛋白質針對SEQ ID NO:167之人類IL-21Rα之解離常數在約1 pM至約200 nM、約10 pM至約100 nM、約20 pM至約50 nM或約50 pM至約20 nM範圍內。
在某些實施例中，第二多肽與包含抗白蛋白sdAb部分之第一多肽之N 端融合。在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之C 端融合。在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之N 端及C 端融合。在某些實施例中，第一多肽與第二多肽之N 端及C 端融合。
在某些實施例中，第二多肽經由第一連接子與第一多肽融合。在某些實施例中，第一連接子為肽連接子。在某些實施例中，第一連接子為可裂解的。在某些實施例中，第一連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性。在某些實施例中，第一連接子係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:73-91。在某些實施例中，第一連接子為不可裂解的。在某些實施例中，第一連接子係選自由以下組成之群：GSG及SEQ ID:58-72。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體包含a)第一多肽，其包含抗白蛋白sdAb部分；b)第二多肽，其中第二肽與第一多肽融合(「第二肽-ALBM」)；及c)第三多肽，其與第二肽-ALBM融合。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體包含a)第一多肽，其包含抗白蛋白sdAb部分；b)第二多肽，其包含細胞介素，其中第二多肽與第一多肽融合(「細胞介素-ALBM」)；及c)第三多肽，其與細胞介素-ALBM融合。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合於IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。在某些實施例中，第三多肽包含抗原結合部分。在某些實施例中，抗原為腫瘤抗原。在某些實施例中，抗原係選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在某些實施例中，第三多肽包含第二細胞介素。在某些實施例中，第一細胞介素及第二細胞介素各自獨立地選自由以下組成之群：IL-7、IL-15、結合於IL-15Rα之IL-15或其片段及IL-21。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體包含a)第一多肽，其包含抗白蛋白sdAb部分；b)第二多肽，其包含抗原結合部分，其中第二多肽與第一多肽融合(「ABM-ALBM」)；及c)第三多肽，其與ABM-ALBM融合。在某些實施例中，抗原為腫瘤抗原。在某些實施例中，抗原係選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在某些實施例中，第三多肽包含第二抗原結合部分。在某些實施例中，第二抗原為腫瘤抗原。在某些實施例中，第三多肽包含成像劑。在某些實施例中，第三多肽包含細胞介素。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合於IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。
在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之N 端融合。在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之C 端融合。在某些實施例中，第二多肽與第一多肽之N 端及C 端融合。在某些實施例中，第一多肽與第二多肽之N 端及C 端融合。在某些實施例中，第二多肽經由如本文中所描述之第一連接子與第一多肽融合。在某些實施例中，第三多肽與第二肽-ALBM之N 端融合。在某些實施例中，第三多肽與第二肽-ALBM之C 端融合。在某些實施例中，第三多肽與第二肽-ALBM之N 端及C 端融合。在某些實施例中，第二肽-ALBM與第三多肽之N 端及C 端融合。在某些實施例中，第三多肽經由第二連接子與第二肽-ALBM融合。在某些實施例中，第二連接子為肽連接子。在某些實施例中，第一連接子為不可裂解的且第二連接子為可裂解的。在某些實施例中，第一連接子及第二連接子皆為不可裂解的。在某些實施例中，第一連接子及第二連接子皆為可裂解的。在某些實施例中，第一連接子及/或第二連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性。在某些實施例中，第一連接子及/或第二連接子各自獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID NO:73-91。在某些實施例中，第一連接子及/或第二連接子各自獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID:58-72。在某些實施例中，第一連接子及/或第二連接子各自獨立地選自由以下組成之群：SEQ ID:58-91。
在某些實施例中，構築體進一步包含信號傳導肽。
在一個實施例中，本文中提供一種融合蛋白質，其包含介白素-21域、VH H單域抗體域及視情況存在之肽連接子；其中介白素-21域之C 端直接或經由肽連接子連接至VH H單域抗體域之N 端。
在另一實施例中，本文中提供一種融合蛋白質，其包含介白素-21域，其具有SEQ ID NO:97、98及151至168中之任一者之胺基酸序列；一個VH H單域抗體域，其具有SEQ ID NO:1至9、45至53及105至115之胺基酸序列；及視情況存在之一個肽連接子，其具有GSG或SEQ ID NO:58至73中之一者之胺基酸序列；其中介白素-21域之C 端直接或經由肽連接子連接至VH H單域抗體域之N 端。 連接子
上文所描述之抗白蛋白構築體可包含一或多個連接子(諸如上文所描述之第一連接子及第二連接子)。
在某些實施例中，第一連接子及/或第二連接子為肽連接子。抗白蛋白構築體中使用之肽連接子之長度、可撓性程度及/或其他特性可能對特性具有一些影響，包括(但不限於)對一或多種特定抗原或抗原決定基之親和力、特異性或親合力。舉例而言，可選擇較長的肽連接子以確保兩個相鄰域在空間上彼此無干擾。在一些實施例中，肽連接子包含可撓性殘基(諸如甘胺酸及絲胺酸)，使得相鄰域可相對於彼此自由移動。舉例而言，甘胺酸-絲胺酸二聯體可為適合的肽連接子。
肽連接子可具有任何適合之長度。在某些實施例中，肽連接子之長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多個胺基酸中之任一者。在某些實施例中，肽連接子之長度為不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少個胺基酸中之任一者。在某些實施例中，肽連接子之長度為以下中之任一者：約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸長、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸或約1個胺基酸至約100個胺基酸。
在某些實施例中，肽連接子之長度為約一至四十(諸如一至三十五、一至三十、一至二十五、一至二十、四至二十或四至十六)個胺基酸。
在某些實施例中，第一連接子及/或第二連接子為非肽連接子。
其他連接子考慮因素包括對所得化合物之物理或藥物動力學特性的影響，諸如溶解度、親脂性、親水性、疏水性、穩定性(更穩定或更不穩定以及計劃降解)、剛性、可撓性、免疫原性、抗體結合調節及併入微胞或脂質體中之能力。1. 肽連接子
肽連接子可具有天然存在之序列或非天然存在之序列。舉例而言，來源於僅重鏈抗體之鉸鏈區之序列可用作連接子。參見例如WO 1996/34103。
肽連接子可具有任何適合之長度。在某些實施例中，肽連接子之長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多個胺基酸中之任一者。在某些實施例中，肽連接子之長度為不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少個胺基酸中之任一者。在某些實施例中，肽連接子之長度為以下中之任一者：約1個胺基酸至約10個胺基酸、約1個胺基酸至約20個胺基酸、約1個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約15個胺基酸、約10個胺基酸至約25個胺基酸、約5個胺基酸至約30個胺基酸、約10個胺基酸至約30個胺基酸長、約30個胺基酸至約50個胺基酸、約50個胺基酸至約100個胺基酸或約1個胺基酸至約100個胺基酸。
此類肽連接子之基本技術特徵在於該肽連接子不包含任何聚合活性。肽連接子之特徵(其包含不存在二級結構之促進)為此項技術中已知的且描述於例如Dall'Acqua等人,Biochem. 37:9266-9273 (1998)；Cheadle等人,Mol. Immunol. 29:21-30 (1992)；以及Raag及Whitlow,FASEB 9:73-80 (1995)中。在「肽連接子」之情形下，尤佳胺基酸為Gly。此外，不促進任何二級結構之肽連接子係較佳的。域彼此之連接可藉由例如基因工程改造來提供。用於製備稠合及可操作地連接之融合蛋白質組分且在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法為此項技術中熟知的。參見例如WO 99/54440；Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989及1994或Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001。
肽連接子可為穩定的連接子，其不可由蛋白酶，尤其不可由基質金屬蛋白酶(MMP)裂解。在某些實施例中，連接子係選自由以下組成之群：GSG及SEQ ID:58-72。
在某些實施例中，連接子為可裂解的。在某些實施例中，連接子為基質金屬蛋白酶、豆莢蛋白、間質蛋白酶或尿激酶敏感性。在某些實施例中，連接子係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:73-91。
連接子亦可為可撓性連接子。例示性可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n 、(GSGS)n (SEQ ID NO:65)、(GGSG)n (SEQ ID NO:66)、(GGGGS)n (SEQ ID NO:60)，其中n為至少一之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技術中已知的其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物為相對非結構化的，且因此能夠充當各組分之間之中性繫鏈。甘胺酸甚至比丙胺酸存取顯著更多的φ-ψ空間，且所受限制比具有較長側鏈之殘基少得多(參見Scheraga,Rev. Computational Chem. 11:173-142 (1992))。一般熟習此項技術者將認識到，抗體融合蛋白質之設計可包括完全或部分可撓的連接子，使得連接子可包括可撓性連接子部分以及一或多個賦予較小可撓性之結構的部分，以得到所需抗體融合蛋白質結構。2. 非肽連接子
上文所描述之組分的偶合可藉由任何將結合兩個分子之化學反應實現，只要兩種組分分別保留其各別活性即可，亦即結合於細胞介素受體、白蛋白或目標抗原。此連接可包括許多化學機制，例如共價結合、親和力結合、插入、配位結合及複合。在某些實施例中，結合為共價結合。共價結合可藉由現有側鏈之直接縮合或藉由併入外部橋連分子來實現。在此情形中，許多二價或多價連接劑可適用於偶合蛋白質分子。舉例而言，代表性偶合劑可包括有機化合物，諸如硫酯、碳化二亞胺、丁二醯亞胺酯、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯及六亞甲基二胺。此清單不意欲窮舉此項技術中已知的偶合劑之各種類別，而實情為例示較常見之偶合劑。參見例如Killen及Lindstrom,J. Immunol. 133:2549-2553 (1984)；Jansen等人,Immunol. Rev. 62:185-216 (1982)；及Vitetta等人, Science 238:1098-1104 (1987)。
可用於本發明中之連接子描述於文獻中(參見例如Ramakrishnan等人,Cancer Res. 44:201-208 (1984)，其描述MBS (間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N -羥基丁二醯亞胺酯)之用途)。在某些實施例中，本文中使用之非肽連接子包括：(i)EDC (1-乙基-3-(3-二甲基胺基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽；(ii)SMPT (4-丁二醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co.，目錄號21558G)；(iii)SPDP (丁二醯亞胺基-6[3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co.，目錄號21651G)；(iv)磺酸基-LC-SPDP (磺基丁二醯亞胺基6[3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯胺]己酸酯(Pierce Chem. Co.，目錄號2165-G)；及(v)與EDC結合之磺酸基-NHS (N-羥基磺基-丁二醯亞胺，Pierce Chem. Co.，目錄號24510)。
上文所描述之連接子含有具有不同屬性之組分，因此可產生具有不同物理化學特性之融合蛋白質。舉例而言，烷基羧酸之磺酸基-NHS酯的穩定性大於芳族羧酸之磺酸基-NHS酯。含有NHS-酯之連接子之溶解度低於磺酸基-NHS酯。此外，連接子SMPT含有位阻二硫鍵，且可形成穩定性增強之抗體融合蛋白質。二硫鍵之穩定性通常小於其他鍵，因為二硫鍵在活體外裂解，使得抗體融合蛋白質之可用性較差。特定言之，磺酸基-NHS可增強碳化二亞胺偶合之穩定性。碳化二亞胺偶合(諸如EDC)在結合磺酸基-NHS使用時，形成的酯對水解之抗性大於單獨的碳化二亞胺偶合反應。 C.          抗白蛋白構築體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文中所提供之抗白蛋白構築體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要改良抗白蛋白構築體之全部或任何組件中之抗白蛋白構築體之結合親和力及/或其他生物特性。抗白蛋白構築體之胺基酸序列變異體可藉由將適合的修飾引入編碼抗白蛋白構築體之核酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗白蛋白構築體之胺基酸序列內之缺失及/或插入及/或殘基之取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵。1. 取代、插入、缺失及變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗白蛋白構築體變異體。用於取代型突變誘發之相關位點包括白蛋白結合分子及/或抗原結合部分之HVR及FR。保守性取代展示於表3中。更多的實質性變化提供於標題「例示性取代」下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。可將胺基酸取代引入抗白蛋白構築體之組分中且針對所需活性(例如保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC)來篩選產物。表 3. 胺基酸取代
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp、Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu及Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn及Gln； (3) 酸性：Asp及Glu； (4) 鹼性：His、Lys及Arg； (5) 影響鏈定向之殘基：Gly及Pro；及 (6) 芳族：Trp、Tyr及Phe。
非保守性取代將必然伴有將此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
一種類型之取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，所選擇的用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修飾(例如改良)(例如親和力提高及/或免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。一種例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文中所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基發生突變，且在噬菌體上呈現變異型抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
改變(例如取代)可在HVR中進行以例如改良抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)))及/或SDR(a-CDR)中用待測試結合親和力之所得變異型VH或VL進行此類變化。藉由自二級庫構築及再選擇來進行之親和力成熟描述於例如Hoogenboom等人,Methods Mol. Biol. 178:1-37 (2001)中。在親和力成熟之某些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸導引之突變誘發)中之任一者將多樣性引入所選擇的用於成熟之可變基因中。隨後產生二級庫。隨後篩選該庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。另一種引入多樣性之方法涉及將若干HVR殘基(例如，每次4-6個殘基)隨機分組之HVR引導方法。可特異性地鑑別抗原結合所涉及之HVR殘基，例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化。尤其通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此類變化不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守性變化(例如本文所提供之保守性取代)。此類變化可在HVR「熱點」或CDR外。
一種適用於鑑別突變誘發可靶向之抗體之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells,Science , 244:1081-1085 (1989)所描述。在此方法中，鑑別殘基或一組目標殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以測定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N 端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N 端或C 端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。2. 衍生物
在某些實施例中，本文中所提供之抗白蛋白構築體可進一步經修飾以含有此項技術中已知及易於獲得之其他非蛋白質部分。適用於抗白蛋白構築體之衍生之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其在水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支鏈或未分支的。連接至抗白蛋白構築體之聚合物的數目可變化，且若連接超過一個聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物的數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改良之抗白蛋白構築體之特定特性或功能、抗白蛋白構築體衍生物是否將用於既定條件下之療法之考慮因素來確定。
在某些實施例中，提供抗白蛋白構築體與可藉由暴露於輻射而選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在某些實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管。Kam等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102:11600-11605 (2005)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至殺死抗白蛋白構築體非蛋白質部分附近之細胞之溫度的波長。III. 醫藥組合物
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本文中所描述之抗白蛋白構築體中之任一者及視情況選用之醫藥學上可接受之載劑。可藉由混合具有所需純度之本文中所描述之抗白蛋白構築體與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編 (1980))來製備呈凍乾調配物或水性溶液形式之醫藥組合物。
醫藥組合物較佳為穩定的，其中本文中所描述之抗白蛋白構築體在儲存後基本上保留其物理及化學穩定性及完整性。此項技術中可獲得用於量測蛋白質穩定性之各種分析技術且評述於Peptide and Protein Drug Delivery , 247-301, Lee編, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991)及Jones,Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)中。可在所選溫度下持續所選時間段量測穩定性。對於快速篩選，調配物可在40℃下保持2週至1個月，此時量測穩定性。在調配物欲儲存於2-8℃下時，調配物通常應在30℃或40℃下穩定至少1個月，及/或在2-8℃下穩定至少2年。當調配物欲儲存於30℃下時，調配物通常應在30℃下穩定至少2年，及/或在40℃下穩定至少6個月。舉例而言，在儲存期間之聚集程度可用作蛋白質穩定性之指標。在某些實施例中，本文中所描述之抗白蛋白構築體之穩定調配物可包含小於約10% (較佳小於約5%)的以聚集物形式存在於調配物中之抗白蛋白構築體。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對受體為無毒性的且包括緩衝液；抗氧化劑，包括抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E、偏亞硫酸氫鈉；防腐劑；等張劑(例如氯化鈉)；穩定劑；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；螯合劑，諸如EDTA；及/或非離子性界面活性劑。
生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)或苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEEN™、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
緩衝液可用於將pH值控制在最佳化治療有效性之範圍內，尤其在穩定性為pH值依賴性之情況下。緩衝液較佳以約50 mM至約250 mM範圍內之濃度存在。用於本發明之適合的緩衝劑包括有機及無機酸以及其鹽，例如檸檬酸鹽、磷酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽及乙酸鹽。此外，緩衝液可包含組胺酸及三甲胺鹽，諸如Tris。
添加防腐劑以延緩微生物生長，且通常以0.2%-1.0% (w/v)之範圍存在。防腐劑之添加可例如促進多次使用(多劑量)調配物之生產。適用於本發明之防腐劑包括十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯甲烴銨鹵化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)；苄索氯銨；硫柳汞；苯酚；丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚。
可存在張力劑(有時稱為「穩定劑」)以調節或維持液體在組合物中之張力。當與大型帶電生物分子(諸如蛋白質及抗體)一起使用時，其通常稱為「穩定劑」，因為其可與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，藉此減小分子間及分子內相互作用之可能性。考慮其他成分之相對量，張力劑可以0.1重量%至25重量%，較佳1%至5%之間的任何量存在。較佳張力劑包括多羥基糖醇，較佳包括三元醇或高級糖醇，諸如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
其他賦形劑包括可充當以下中之一或多者之試劑：(1)膨化劑，(2)溶解性增強劑，(3)穩定劑，及(4)防止變性或黏著至容器壁之試劑。此類賦形劑包括：多羥基糖醇(以上列舉)；胺基酸，諸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸及蘇胺酸；有機糖或糖醇，諸如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌肉肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)及聚乙二醇；含有硫之還原劑，諸如脲、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，諸如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；單醣(例如木糖、甘露糖、果糖及葡萄糖)；雙醣(例如乳糖、麥芽糖及蔗糖)；三醣，諸如棉子糖；及多醣，諸如糊精或聚葡萄糖。
可存在非離子性界面活性劑或清潔劑(亦稱為「濕潤劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白質避免攪拌誘導之聚集，其亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不引起活性治療性蛋白質或抗體之變性。非離子性界面活性劑係以約0.05 mg/mL至約1 mg/mL，較佳約0.07 mg/mL至約0.2 mg/mL之範圍存在。
適合的非離子性界面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65或80)、聚氧化物(184或188)、PLURONIC®多元醇、TRITON®、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20或TWEEN®-80)、聚桂醇400、聚乙二醇40硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50或60、甘油單硬脂酸酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素及羧甲基纖維素。可使用之陰離子性清潔劑包括月桂基硫酸鈉、磺琥珀酸鈉二辛酯及磺酸鈉二辛酯。陽離子性清潔劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了使醫藥組合物用於活體內投藥，其必須為無菌的。可藉由經無菌過濾膜過濾而使醫藥組合物為無菌的。通常將本文中之醫藥組合物置放於具有無菌接取口之容器中，例如具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
投藥途徑係根據已知及可接受之方法，諸如藉由以適合的方式在長時段內之單次或多次快速注射或輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內或關節內途徑之注射或輸注，局部投藥，吸入或藉由持續釋放或緩釋方法。在某些實施例中，醫藥組合物係局部投與，諸如瘤內或玻璃體內。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合的實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(US 3,773,919)、L-麩胺酸與乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOTTM (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)之可降解之乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
本文中之醫藥組合物亦可含有超過一種為所治療之特定適應症所需之活性化合物，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之互補活性的活性化合物。或者或另外，組合物可包含細胞毒性劑、化學治療劑、細胞介素、免疫抑制劑或生長抑制劑。此類分子宜以可有效達成所欲目的之量之組合形式存在。
活性成分亦可包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中，例如分別在膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或在巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第18版中。
本文中所揭示之抗白蛋白構築體可調配為免疫脂質體。含有抗白蛋白構築體之脂質體係藉由此項技術中已知之方法製備，諸如Epstein等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692 (1985)；Hwang等人,Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. , 77:4030-4034 (1980)；以及US 4,485,045及US 4,544,545中描述之方法。具有增強之循環時間之脂質體揭示於US 5,013,556中。
尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發方法，用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經具有既定孔徑之過濾器擠出以產生具有所需直徑之脂質體。
在某些實施例中，醫藥組合物係包含在單次用小瓶，諸如單次用密封小瓶中。在某些實施例中，醫藥組合物包含在多次用小瓶中。在某些實施例中，醫藥組合物包含在容器中之主體中。在某些實施例中，醫藥組合物係冷凍保存的。IV. 治療方法
本發明之一個態樣提供使用本文中所描述之抗白蛋白構築體或醫藥組合物治療個體中之疾病或病狀之方法。
在某些實施例中，提供一種用於治療個體中之疾病或病狀之方法，其包含向個體投與有效量之如本文中所描述之構築體或醫藥組合物。在某些實施例中，提供一種用於治療個體中之疾病或病狀之方法，其包含向個體投與有效量之抗白蛋白構築體，其包含有包含抗白蛋白sdAb部分之第一多肽及第二多肽，其中第二多肽包含治療劑。在某些實施例中，治療劑包含抗原結合部分(諸如結合於腫瘤抗原之抗體或其片段)。在某些實施例中，抗原為腫瘤抗原。在某些實施例中，腫瘤為實體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤為液體腫瘤。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：間皮素(「MSLN」)、GPA33、Her-2、EGFR、CD20、CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。在某些實施例中，藥劑為免疫檢查點蛋白質。在某些實施例中，治療劑包含細胞介素。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-21、IL-7、IL-15、結合於IL-15Rα之IL-15或其片段、IL-33及IL-22。 疾病或病症
本文中所描述之方法可用於治療疾病或病症。在某些實施例中，疾病或病狀為癌症、發炎性病狀或感染。
在某些實施例中，疾病或病狀為發炎性疾病。在某些實施例中，疾病係選自由以下組成之群：潰瘍性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)或潰瘍性回腸炎，及腸道移植物抗宿主病。
在某些實施例中，疾病或病狀為癌症。在某些實施例中，癌症為實體腫瘤。在某些實施例中，癌症為液體腫瘤。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、乳癌、卵巢癌、胰臟癌、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、白血病(諸如急性骨髓性白血病)、頭頸癌、肝癌、腎癌、腎臟癌、食道癌、胃癌及結腸直腸癌。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：間皮瘤、肺癌、卵巢癌及胃癌。 組合療法
在某些實施例中，該方法進一步包含投與第二藥劑。在某些實施例中，第二藥劑包含治療性抗體、免疫檢查點抑制劑、第二細胞介素、化學治療劑、酪胺酸激酶抑制劑或免疫細胞。
在某些實施例中，第二藥劑為治療性抗體。在某些實施例中，治療性抗體結合於腫瘤抗原。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：間皮素、GPA33、Her-2、EGFR及CD20。在某些實施例中，腫瘤抗原係選自由以下組成之群：CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA及BCMA。
在某些實施例中，腫瘤抗原為間皮素。在某些實施例中，第二藥劑為抗間皮素抗體或其片段。在某些實施例中，抗間皮素抗體或其片段包含單鏈抗體，其包含抗間皮素重鏈可變區(抗MSLN VH )，其中抗MSLN VH 包含CDR1、CDR2及CDR3，其中：a)CDR1包含SEQ ID NO:92之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:93之胺基酸序列且CDR3包含SEQ ID NO:94之胺基酸序列，或其在CDR中包含總共3、2或1個胺基酸取代之變異體；或b)CDR1包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:96之胺基酸序列且CDR3包含GRY之胺基酸序列，或其在CDR中包含總共3、2或1個胺基酸取代之變異體。
在某些實施例中，第二藥劑為免疫檢查點調節劑。在某些實施例中，免疫檢查點調節劑為選自由以下組成之群之免疫檢查點蛋白質之抑制劑：PD-L1、CTLA4、PD-L2、PD-1、CD47、白蛋白、GITR、TIM3、LAG3、CD27及B7H4。
在某些實施例中，免疫檢查點蛋白質為PD-1。在某些實施例中，第二藥劑為抗PD-1抗體或其片段。
在某些實施例中，第二藥劑為第二細胞介素。在某些實施例中，抗白蛋白構築體中之細胞介素為IL-21，且其中第二細胞介素係選自由以下組成之群：IL-7、IL-15及結合於IL-15Rα之IL-15或其半衰期延長之變異體。
在某些實施例中，第二藥劑為免疫細胞。在某些實施例中，免疫細胞包含T細胞或NK細胞。在某些實施例中，免疫細胞包含表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞、表現經修飾之T細胞受體(TCR)之T細胞或自腫瘤分離之T細胞。
在某些實施例中，第二藥劑為酪胺酸激酶抑制劑。
在某些實施例中，第二藥劑為化學治療劑(諸如索拉非尼(sorafenib))。 給藥方案
抗白蛋白構築體及/或第二藥劑可使用任何適合之劑量及投藥途徑向個體投與。在某些實施例中，抗白蛋白構築體及/或第二藥劑係非經腸投與個體。投藥途徑係根據已知及可接受方法，諸如藉由以適合之方式，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、病灶內、關節內、瘤內或經口途徑注射或輸注而在一段時間內單次或多次快速注射或輸注。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體及第二藥劑係同時、並行或依序投與個體。
確定適合的劑量或投藥途徑完全在一般熟習此項技術者之技能內。動物實驗為確定用於人類診斷應用之有效劑量提供可靠指導。有效劑量之種間按比例調整可遵循由Mordenti及Chappell, 「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,Toxicokinetics and New Drug Development , Yacobi等人編, Pergamon Press, New York 1989, 第42-46頁主張之原理來進行。
在某些實施例中，抗白蛋白構築體約每三週投與一次至約一週投與兩次(諸如約每三週一次至約每兩週一次、約每兩週一次至約每週一次或約每週一次至約一週兩次)。在某些實施例中，抗白蛋白構築體以不少於約每三週一次、約每兩週一次、約每週一次或約一週兩次投與。在某些實施例中，抗白蛋白構築體以不超過約每三週一次、約每兩週一次、約每週一次或約一週兩次投與。在某些實施例中，抗白蛋白構築體以約每三週一次、約每兩週一次、約每週一次或約一週兩次投與。
在某些實施例中，對於每個治療週期，投與抗白蛋白構築體保持至少約一週至六個月(諸如一週至兩、三或四週；一週至一、兩、三、四、五或六個月；一個月至兩、三、四、五或六個月；三個月至四、五或六個月)。
在某些實施例中，用此每次投藥之抗白蛋白構築體之量為約100 ng/kg至約10 mg/kg (例如約100 ng/kg至約500 ng/kg、約500 ng/kg至約1 μg/kg、約1 μg/kg至約5 μg/kg、約5 μg/kg至約10 μg/kg、約10 μg/kg至約50 μg/kg、約50 μg/kg至約100 μg/kg、約100 μg/kg至約500 μg/kg、約500 μg/kg至約1 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg或約5 mg/kg至約10 mg/kg)。
在某些實施例中，約每月一次至約每週兩次(諸如約每月一次至一個月兩次、三次或四次、約每兩週一次、約每三週一次、約每週一次或每週兩次)投與第二藥劑(諸如結合於間皮素之治療性抗體或PD-1之抑制劑)。
在某些實施例中，用於每次投藥之第二藥劑(諸如結合於間皮素之治療性抗體或PD-1之抑制劑)之量為約100 ng/kg至約100 mg/kg (例如約100 ng/kg至約500 ng/kg、約500 ng/kg至約1 μg/kg、約1 μg/kg至約5 μg/kg、約5μg/kg至約10 μg/kg、約10 μg/kg至約50 μg/kg、約50 μg/kg至約100 μg/kg、約100 μg/kg至約500 μg/kg、約500 μg/kg至約1 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約5mg/kg至約10 mg/kg、約10 mg/kg至約50 mg/kg或約50 mg/kg至約100 mg/kg)。VI. 製備方法
本文中所描述之抗白蛋白構築體可使用此項技術中已知或如本文中所描述之任何方法製備。參見例如實例1-5。在某些實施例中，提供一種用於製備抗白蛋白構築體之方法，其包含：(a)在可有效表現經編碼之抗白蛋白構築體之條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼本文中所描述之抗白蛋白構築體之經分離核酸或載體；及(b)自該宿主細胞獲得經表現之抗白蛋白構築體。在某些實施例中，步驟(a)之方法進一步包含製備包含編碼本文中所描述之抗白蛋白構築體之經分離核酸或載體之宿主細胞。
已描述用於製備sdAb之方法。參見例如Els Pardon等人,Nat. Protoc. 9:674-693 (2014)。SdAb (諸如VH H)可使用此項技術中已知之方法獲得，諸如藉由使駱駝科物種(諸如駱駝或駱馬)免疫且自其獲得融合瘤，或藉由使用此項技術中已知的分子生物學技術選殖單域抗體庫且隨後藉由用未經選擇之庫之個別純系進行ELISA或藉由使用噬菌體呈現來進行選擇。
對於sdAb之重組產生，分離編碼單域抗體之核酸且插入可複製之載體中以用於進一步選殖(DNA之擴增)或用於表現。編碼單域抗體之DNA可輕易地使用習知程序分離及定序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。許多載體為可用的。載體之選擇部分地視所用宿主細胞而定。通常，較佳宿主細胞具有原核或真核(通常哺乳動物)來源。在某些實施例中，編碼本文中所描述之抗白蛋白構築體之經分離核酸包含編碼SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之核酸序列。在某些實施例中，編碼本文中所描述之抗白蛋白構築體之經分離核酸包含編碼SEQ ID NO:1-9、45-53、99-101、103-115、149及150中之任一者之核酸序列。1. 原核細胞中之重組產生 a) 載體構築
可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之聚核酸序列。所需聚核酸序列可自產生抗體之細胞(諸如融合瘤細胞)分離及定序。或者，可使用核苷酸合成器或PCR技術合成聚核苷酸。在獲得之後，將編碼多肽之序列插入能夠在原核宿主中複製及表現異源聚核苷酸之重組載體中。此項技術中可獲得且已知的許多載體皆可用於本發明之目的。適合的載體之選擇將主要視插入載體中的核酸之尺寸及用載體轉型之特定宿主細胞而定。各載體含有各種組分，此視其功能(異源聚核苷酸之擴增或表現)及與其駐存之特定宿主細胞之相容性而定。載體組分通常包括(但不限於)複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
通常，將含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列之質體載體與此等宿主結合使用。載體通常攜帶複製位點以及能夠在經轉型之細胞中提供表現型選擇之標記序列。
此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可作為轉型載體與此等宿主結合使用。舉例而言，諸如GEM™-11之細菌噬菌體可用於製備重組載體，其可用於使諸如大腸桿菌(E. coli )LE392之敏感宿主細胞轉型。
本發明之表現載體可包含兩個或更多個啟動子-順反子對，其編碼多肽組分中之每一者。啟動子為位於順反子上游(5')之調節其表現之未經轉譯之調節序列。原核啟動子典型地分為兩類：誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其控制下，回應於培養條件之變化(例如存在或不存在營養物或溫度之變化)而引發順反子之轉錄量增加之啟動子。
已熟知由多種潛在宿主細胞所識別之許多啟動子。所選擇之啟動子可藉由經由限制酶消化自源DNA移除啟動子且將經分離之啟動子序列插入本發明之載體中來可操作地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。原生啟動子序列及許多異源啟動子皆可用於引導目標基因之擴增及/或表現。在某些實施例中，與原生目標多肽啟動子相比，由於異源啟動子通常實現經表現之目標基因之更多的轉錄及更高的產量，因此使用異源啟動子。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括PhoA啟動子、半乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子，諸如tac或trc啟動子。然而，其他在細菌中具有功能性之啟動子(諸如其他已知的細菌或噬菌體啟動子)亦為適合的。其核酸序列已公開，藉此使得熟練工作者能夠可操作地使用連接子或接附子將該等核苷酸序列與編碼目標輕鏈及重鏈之順反子接合，以提供任何所需的限制位點。Siebenlist等人,Cell 20:269-281 (1980)。
在一個態樣中，重組載體內的每個順反子包含分泌信號序列組分，其引導跨越膜之經表現之多肽之易位。通常，信號序列可為載體之組分，或其可為插入載體中之目標多肽DNA之一部分。為了本發明之目的而選擇的信號序列應為被宿主細胞識別及處理(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別及處理異源多肽之原生信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列經選自由例如以下組成之群的原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II (STII)前導子、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之某些實施例中，用於表現系統之兩個順反子之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在某些實施例中，根據本發明之抗白蛋白構築體之產生可在宿主細胞之細胞質中進行，且因此無需每個順反子內存在分泌信號序列。在某些實施例中，多肽組分(諸如編碼視情況與第一抗原結合部分融合之第二抗原結合部分之VH 域之多肽，及編碼視情況與第一抗原結合部分融合之第二抗原結合部分之VL 域之多肽)在細胞質內經表現、摺疊及組裝以形成功能性抗體。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB- 菌株)提供有利於二硫鍵形成的細胞質條件，藉此實現經表現之蛋白質子單元之正確的摺疊及組裝。Proba及Pluckthun,Gene 159:203-207 (1995)。
本發明提供一種表現系統，其中可調節定量比率之經表現之多肽組分以最大化經分泌及適當組裝之本發明之抗體之產量。此類調節係至少部分地藉由同時調節多肽組分之轉譯強度來實現。一種用於調節轉譯強度之技術揭示於US 5,840,523中。其利用順反子內之轉譯起始區(TIR)之變異體。對於既定TIR，可產生具有一系列轉譯強度的一系列胺基酸或核酸序列變異體，藉此提供適宜的方式，從而根據特定鏈之所需表現量來調節此因子。儘管核酸序列中之緘默變化較佳，但可藉由習知突變誘發技術產生TIR變異體，該等突變誘發技術引起可改變胺基酸序列之密碼子變化。TIR中之變化可包括例如夏因-達爾加諾序列(Shine-Dalgarno sequence)之數目或間距之變化，以及信號序列之變化。一種用於產生突變體信號序列之方法為在不改變信號序列之胺基酸序列的編碼序列始端產生「密碼子庫」(亦即變化為緘默的)。此可藉由改變各密碼子之第三核苷酸位置來實現；此外，一些胺基酸(諸如白胺酸、絲胺酸及精胺酸)具有多個第一及第二位置，其可在製備該庫時增加複雜度。
較佳地，產生其中各順反子具有一系列TIR強度之一組載體。此有限群組提供各鏈之表現量以及所需蛋白質產物在各種TIR強度組合下之產量的比較。可藉由對報導基因之表現量進行定量來測定TIR強度，如US 5,840,523中詳細描述。基於轉譯強度比較，選擇所需個別TIR以在本發明之表現載體構築體中組合。b) 原核宿主細胞
適用於表現本發明之抗體之原核宿主細胞包括太古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(gram-negative)或革蘭氏陽性(gram-positive)生物體。適用的細菌之實例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌)、桿菌(Bacilli )(例如枯草桿菌(B. subtilis ))、腸內細菌(Enterobacteria)、假單胞菌(Pseudomonas )種(例如綠膿桿菌(P. aeruginosa ))、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans )、克雷伯氏菌(Klebsiella )、變形桿菌(Proteus )、志賀桿菌屬(Shigella )、根瘤菌屬(Rhizobia )、透明顫菌屬(Vitreoscilla )或副球菌屬(Paracoccus )。在某些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在某些實施例中，使用大腸桿菌細胞作為宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE) degP41 kanR 之菌株33D3 (US 5,639,635)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌1776 (ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308 (ATCC 31,608)亦為適合的。此等實例為說明性而非限制性的。考慮複製子在細菌之細胞中之可複製性，選擇適合的細菌通常為有必要的。舉例而言，當使用熟知質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供應複製子時，宜使用大腸桿菌、沙雷氏菌屬(Serratia )或沙門氏菌(Salmonella )物種作為宿主。
通常，宿主細胞應分泌最少量的蛋白水解酶，且可能需要在細胞培養物中併入其他蛋白酶抑制劑。c) 蛋白質產生
宿主細胞用上述表現載體轉型且在視需要經改良之習知營養物培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。轉型意謂將DNA引入原核宿主，使得DNA可以染色體外元件形式或由染色體整合體複製。視所用宿主細胞而定，轉型係使用適於此類細胞之標準技術進行。使用氯化鈣之鈣處理通常用於含有實質性細胞壁障壁之細菌細胞。另一種轉型方法使用聚乙二醇/DMSO。另一種所用技術為電致孔。
用於產生本發明之抗體之原核細胞在此項技術中已知且適用於培養所選擇的宿主細胞之培養基中生長。適合的培養基之實例包括魯利亞培養液(luria broth；LB)加必需的營養物補充劑。在某些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築而選擇的選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將安比西林(ampicillin)添加至培養基中以用於表現安比西林抗性基因之細胞之生長。
除碳、氮及無機磷酸鹽源以外，亦可包括適合的濃度之任何必需補充劑，其係單獨或以與諸如複合氮源之其他補充劑或培養基之混合物形式引入。視情況地，培養基可含有一或多種選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇組成之群之還原劑。在適合的溫度下培養原核宿主細胞。舉例而言，對於大腸桿菌生長，較佳溫度在約20℃至約39℃，更佳約25℃至約37℃範圍內，甚至更佳在約30℃下。主要視宿主生物體而定，培養基之pH值可為約5至約9範圍內之任何pH值。對於大腸桿菌，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適用於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本發明之一個態樣中，使用PhoA啟動子控制多肽之轉錄。因此，經轉型之宿主細胞在用於誘導之磷酸鹽限制性培養基中培養。較佳地，磷酸鹽限制性培養基為C.R.A.P培養基。根據所用載體構築體，可使用多種其他誘導劑，如此項技術中已知。
經表現之本發明之抗白蛋白構築體分泌至宿主細胞之周質中且自其中回收。蛋白質回收典型地涉及破壞微生物，通常藉由諸如滲壓衝擊、音波處理或溶胞之手段。在細胞破壞後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或完全細胞。可進一步純化蛋白質，例如藉由親和樹脂層析。或者，可將蛋白質轉運至培養基中且自其中分離。可自培養物移除細胞，且過濾且濃縮培養物上清液以進一步純化所產生之蛋白質。經表現之多肽可使用通常已知的方法(諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點分析法(Western blot assay))進一步分離及鑑別。
或者，可藉由醱酵過程進行大量的蛋白質產生。可使用各種大規模分批饋料醱酵程序來產生重組蛋白質。大規模醱酵具有至少1,000公升容量，較佳約1,000至100,000公升容量。此等醱酵器使用攪拌器葉輪分配氧及營養物，尤其葡萄糖(較佳碳/能量源)。小規模醱酵通常係指在體積容量不超過約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵器中醱酵。
在醱酵過程期間，典型地在細胞已在適合的條件下生長至所需密度(例如約180-220之OD550 )之後開始誘導蛋白質表現，在此階段，細胞處於早期固定相。根據所用載體構築體，可使用多種誘導劑，如此項技術中已知及上文所描述。細胞在誘導之前可生長更短的時段。細胞通常誘導約12-50小時，但可使用更長或更短的誘導時間。
為了改良本發明之抗體之產量及品質，可修改各種醱酵條件。舉例而言，為了改良所分泌之多肽之正確組裝及摺疊，可使用過表現伴隨蛋白質之其他載體(諸如Dsb蛋白質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及或DsbG)或FkpA (具有伴隨蛋白質活性之肽基脯胺醯基順,反-異構酶))以共同轉型宿主原核細胞。已證明伴隨蛋白質可促進細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白質之正確摺疊及溶解性。
為了使經表現之異源蛋白質(尤其對蛋白水解敏感之異源蛋白質)的蛋白水解最小化，本發明可使用某些蛋白水解酶缺失型宿主菌株。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以在編碼已知細菌蛋白酶(諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合)之基因中實現基因突變。
蛋白水解酶缺失型且經過表現一或多種伴隨蛋白質之質體轉型之大腸桿菌菌株可用作編碼本發明之抗體之表現系統中之宿主細胞。d) 蛋白質純化
進一步純化本文中產生之抗白蛋白構築體以獲得實質上均質的製劑，以用於其他分析法及用途。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化方法。以下程序舉例說明適合的純化程序：免疫親和或離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上之層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱，及使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾。
在某些實施例中，使用固定在固相上之蛋白質A進行本發明之包含Fc區之抗體之免疫親和純化。蛋白質A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas )之41KD細胞壁蛋白質，其以高親和力結合於抗體之Fc區。Lindmark等人,J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)。固定蛋白質A的固相較佳為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，或受控微孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱已經諸如甘油之試劑塗佈，以試圖防止污染物之非特異性附著。接著，洗滌固相以移除非特異性結合於固相之污染物。最終，藉由溶離自固相回收相關抗體。2. 真核細胞中之重組產生
對於真核表現，載體組分通常包括(但不限於)以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因及強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。a) 信號序列組分
用於真核宿主之載體亦可為編碼信號序列之插入物或在成熟蛋白質或多肽之N 端具有特異性裂解位點之其他多肽。所選擇的異源信號序列較佳為經宿主細胞識別及處理(亦即，藉由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌性前導子，例如單純疱疹gD信號。
此類前驅體區域之DNA在閱讀框架中與編碼本發明之抗體之DNA接合。b) 複製起點
通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。c) 選擇基因組分
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選標記物。典型選擇基因編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如安比西林、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline))之抗性；(b)補充營養缺陷型缺乏；或(c)供應不可自複合培養基獲得之關鍵營養物，例如編碼用於桿菌之D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇流程之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞之生長。此等經異源基因成功轉型之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質且因此在選擇療法中存活。此類顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)及潮黴素(hygromycin)。
適用於哺乳動物細胞之可選標記物之另一實例為實現能夠溶解編碼本發明之抗體之核酸的細胞之鑑別之可選標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及金屬硫蛋白-II(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶或鳥胺酸脫羧酶。
舉例而言，首先藉由將所有轉型體在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)的培養基中培養來鑑別經DHFR選擇基因轉型之細胞。當使用野生型DHFR時，適合的宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)細胞株(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可藉由在含有用於可選標記物之選擇劑(諸如胺基醣苷抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G418)之培養基中進行細胞生長來選擇經多肽編碼DNA序列、野生型DHFR蛋白質及另一種可選標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))轉型或共同轉型之宿主細胞(特定言之，含有內源性DHFR之野生型宿主)。d) 啟動子組分
表現及選殖載體通常含有啟動子，其由宿主生物體識別且可操作地連接至編碼所需多肽序列之核酸。幾乎所有的真核基因皆具有富含AT之區域，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因之轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一個序列為CNCAAT區域，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'端處係AATAAA序列，其可為將聚A尾區添加至編碼序列之3'端之信號。可將所有此等序列插入真核表現載體中。
適於與原核宿主一起使用之啟動子包括phoA啟動子、內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子，諸如tac啟動子。然而，其他已知的細菌啟動子為適合的。用於細菌系統中之啟動子亦將含有可操作地連接至編碼抗體之DNA之夏因-達爾加諾(S.D.)序列。
舉例而言，藉由自以下獲得之啟動子控制哺乳動物宿主細胞中之自載體之多肽轉錄：病毒之基因組，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、乙型肝炎病毒，且最佳為猴病毒40 (SV40)；異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；熱休克啟動子，限制條件為此類啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子宜以HindIII E限制性片段形式獲得。用於在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體表現DNA之系統揭示於US 4,419,446中。此系統之修改描述於US 4,601,978中。關於在來自單純疱疹病毒之胸苷激酶啟動子的控制下，在小鼠細胞中表現人類-干擾素cDNA，亦參見Reyes等人,Nature 297:598-601 (1982)。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。e) 強化子元件組分
藉由高級真核生物進行的編碼本發明之抗體之DNA之轉錄可藉由將強化子序列插入載體中而增加。現已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之許多強化子序列。然而，通常將使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點(100-270 bp)後的SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、複製起點後的多瘤病毒強化子，及腺病毒強化子。強化子可剪接至位於多肽編碼序列之5'或3'位置處之載體中，但較佳位於啟動子之位點5'處。f) 轉錄終止組分
真核宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞、人類細胞或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中使用的表現載體亦將含有轉錄終止及使mRNA穩定所需之序列。此類序列通常可獲自真核或病毒DNA或cDNA之5'及偶爾3'未轉譯區。此等區域含有經轉錄為多肽編碼mRNA之未經轉譯之部分中之聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種適用的轉錄終止組分係牛生長激素聚腺苷酸化區域。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。g) 宿主細胞之選擇及轉型
本文中適用於在載體中選殖或表現DNA之宿主細胞包括本文中所描述之高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已變成常規程序。適用的哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40轉型之猴腎臟CV1細胞株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎細胞株(293或經次選殖以在懸浮培養物中生長之293細胞，Graham等人,J. Gen Virol. 36:59-74 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:4216-4620 (1980))；鼠類塞特利氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather,Biol. Reprod. 23:243-252 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；鼠類乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等人,Ann. N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
宿主細胞經用於產生抗體的上述表現或選殖載體轉型且在視需要經調節之習知營養物培養基中培養以誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因。h) 培養宿主細胞
可在多種培養基中培養用於產生本發明之抗體之宿主細胞。市售培養基(諸如Ham's F10 (Sigma)、最小必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜貝克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM，Sigma))適用於培養宿主細胞。培養基可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCIN™藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量源。亦可以熟習此項技術者已知之適合的濃度包括任何其他必需補充劑。培養條件(諸如溫度及pH值)為先前用於經選擇以用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。i) 蛋白質純化
當使用重組技術時，抗體可於細胞內、周質間隙中產生或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步驟，可例如藉由離心或超濾來移除微粒碎片(宿主細胞或溶解片段)。Carter等人,Biotechnology (N.Y.) 10:163-167 (1992)描述分離分泌至大腸桿菌之周質間隙的抗體的程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯氟(PMSF)存在下經約30分鐘融化細胞漿料。可藉由離心來移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情形下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物之生長。
由細胞製備之蛋白質組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，其中親和層析為較佳純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適合性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同型而定。蛋白質A可用於純化基於含有1、2或4條重鏈之人類免疫球蛋白之抗體。建議蛋白質G用於所有小鼠同型及人類3。與親和配位體連接之基質最常為瓊脂糖，但可利用其他基質。與瓊脂糖可實現的相比，機械穩定基質(諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)實現更快的流動速率及更短的處理時間。在抗體包含CH 3域之情況下，Bakerbond ABX™樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可使用其他蛋白質純化技術，諸如離子交換管柱上之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSE™層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何基本的純化步驟之後，包含相關抗體及污染物之混合物可經歷使用溶離緩衝液在約2.5-4.5之間的pH值下，較佳在低鹽濃度(例如約0-0.25 M鹽)下進行之低pH值疏水性相互作用層析。 3.      多株抗體
通常藉由相關抗原及佐劑之多次皮下(s.c.)或腹膜內(i.p.)注射來在動物中產生多株抗體。其可能適用於使用雙功能或衍生試劑(例如順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基磺基丁二醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N -羥基丁二醯亞胺(經由離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2 或R1 N=C=NR，其中R及R1 獨立地為低碳烷基)使相關抗原與在待經免疫之物種中具有免疫原性之蛋白質(例如匙孔螺血氰蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)結合。可使用之佐劑之實例包括弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)及MPL-TDM佐劑(單磷醯基脂質A、合成海藻糖二黴菌酸酯)。可由熟習此項技術者在無不當實驗之情況下選擇免疫接種方案。
藉由組合例如100 μg或5 μg蛋白質或結合物(分別用於兔或小鼠)與3倍體積之弗氏完全佐劑且在多個位點處皮內注射溶液來使動物對抗原、免疫原性結合物或衍生物免疫。一個月後，用含1/5至1/10之原始量之肽或結合物之弗氏完全佐劑，藉由多個位點處之皮下注射對動物進行增強免疫。七至十四天後，對動物進行抽血且分析血清之抗體效價。對動物進行增強免疫直至效價平線區。亦可在重組細胞培養物中以蛋白質融合物形式製得結合物。又，聚集劑(諸如礬)適合於增強免疫反應。關於駱駝中之免疫接種，亦參見實例1。 4.      單株抗體
自實質上均質抗體之群體(亦即，除可能少量存在之有可能的天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外，組成該群體之個別抗體為相同的)獲得單株抗體。因此，修飾語「單株」指示抗體不為離散抗體之混合物之特徵。舉例而言，單株抗體可使用首先由Kohler等人,Nature 256:495-497 (1975)描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法(US 4,816,567)製得。在融合瘤方法中，如上文所述使小鼠或其他適合的宿主動物(諸如倉鼠或駱馬)免疫以產生淋巴細胞，該等淋巴細胞產生或能夠產生將特異性結合用於免疫接種之蛋白質之抗體。或者，可活體外使淋巴細胞免疫。接著，使用適合的融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , 第59-103頁 (Academic Press, 1986))。關於駱駝中之免疫接種，亦參見實例1。
免疫劑將通常包括抗原性蛋白質或其融合變異體。通常，若需要人類來源之細胞，則使用末梢血液淋巴細胞(「PBL」)，或若需要非人類哺乳動物來源，則使用脾細胞或淋巴結細胞。接著，使用適合的融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與永生化細胞株融合以形成融合瘤細胞。Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice , Academic Press (1986), 第59-103頁。
永生化細胞株通常為經轉型之哺乳動物細胞，尤其嚙齒動物、牛及人類來源之骨髓瘤細胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞株。將由此製備之融合瘤細胞接種且在適合的培養基中生長，該培養基較佳含有一或多種抑制未融合、親本骨髓瘤細胞之生長或存活之物質。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞不含酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於融合瘤之培養基將典型地包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，該等物質阻止HGPRT缺失型細胞之生長。
較佳永生化骨髓瘤細胞為有效融合、支持由所選擇的產抗體細胞進行之穩定的大量抗體產生且對培養基(諸如HAT培養基)具有敏感性之永生化骨髓瘤細胞。其中，較佳為鼠類骨髓瘤株，諸如可自Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA獲得之來源於MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤之鼠類骨髓瘤株，及可自American Type Culture Collection, Manassas, Va. USA獲得之SP-2細胞(及其衍生物，例如X63-Ag8-653)。
分析其中生長融合瘤細胞之培養基中的針對抗原之單株抗體之產生情況。較佳地，由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性係藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析法(諸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯結免疫吸附分析法(ELISA))來測定。
接著，可針對單株抗體之存在來分析其中培養融合瘤細胞之培養基，該等單株抗體係針對所需抗原。較佳地，可藉由免疫沈澱或藉由活體外結合分析法(諸如放射免疫分析法(RIA)或酶聯結分析法(ELISA))來測定單株抗體之結合親和力及特異性。此類技術及分析法為此項技術中已知的。舉例而言，可藉由Munson等人,Anal. Biochem. 107:220-239 (1980)之史卡查分析(Scatchard analysis)來測定結合親和力。
在鑑別產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞之後，純系可藉由限制稀釋程序次選殖且藉由標準方法生長(Goding, 見上文)。用於此目的之適合的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，融合瘤細胞可以哺乳動物中之腫瘤形式活體內生長。
藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，自培養基、腹水液或血清適當地分離由次純系分泌之單株抗體。
亦可藉由重組DNA方法製備單株抗體。編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序分離及定序(例如藉由使用能夠特異性結合於編碼鼠類抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。融合瘤細胞充當此類DNA之較佳來源。在分離之後，可將DNA置放於表現載體中，接著將其轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，以在此類重組宿主細胞中合成單株抗體。
在另一實施例中，可自使用McCafferty等人,Nature 348:552-554 (1990)中所描述之技術產生之抗體噬菌體庫分離抗體。Clackson等人,Nature 352:624-628 (1991)及Marks等人,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)分別描述使用噬菌體庫分離鼠類及人類抗體。後續出版物描述藉由鏈改組來產生高親和力(nM範圍)人類抗體(Marks等人,Biotechnology (N.Y.) 10:779-783 (1992))以及組合性感染與活體內重組作為用於構築極大型噬菌體庫之策略(Waterhouse等人,Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993))。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術之可行替代物。
亦可例如藉由用編碼序列取代人類重鏈及輕鏈恆定域而非同源鼠類序列(US 4,816,567；Morrison等人,Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984))或藉由使非免疫球蛋白多肽之所有或一部分編碼序列共價接合至免疫球蛋白編碼序列來修飾DNA。典型地，用此類非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定域，或用其取代抗體之一個抗原結合位點之可變域以產生嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包含一個對抗原具有特異性之抗原結合位點及另一個對不同抗原具有特異性之抗原結合位點。
本文中所描述之單株抗體可為單價的，其製備方法為此項技術中熟知的。舉例而言，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈及經修飾之重鏈之重組表現。通常在Fc區中之任一點處截短重鏈以防止重鏈交聯。或者，相關半胱胺酸殘基可經另一胺基酸殘基取代或缺失以防止交聯。活體外方法亦適用於製備單價抗體。可使用此項技術中已知之常規技術實現抗體之消化以產生其片段，特定言之，Fab片段。
嵌合或雜交抗體亦可使用合成蛋白質化學之已知方法(包括涉及交聯劑之方法)在活體外製備。舉例而言，免疫毒素可使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築。適用於此目的之試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯。
關於單株sdAb產生，亦參見實例1。 5.      人類化抗體
非人類(例如鼠類)抗體之人類化形式為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或抗體之其他抗原結合子序列)，其含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列。人類化抗體包括人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之CDR之殘基由具有所需特異性、親和力及能力之來自非人類物種(供體抗體)之CDR之殘基置換，該等非人類物種諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝或駱馬。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架殘基由相應的非人類殘基置換。人類化抗體亦可包含在受體抗體中及在所引入之CDR或構架序列中皆未發現之殘基。通常，人類化抗體可包含實質上全部至少一個且通常兩個可變域，其中全部或實質上全部CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且全部或實質上全部FR區為人類免疫球蛋白共同序列之FR區。在某些實施例中，人類化抗體將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之至少一部分。參見例如Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
用於人類化非人類抗體之方法為此項技術中熟知的。通常，人類化抗體具有一或多個自非人類來源引入其中之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基通常稱為「輸入」殘基，其典型地獲自「輸入」可變域。人類化可基本上根據Winter及同事, Jones等人,Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536 (1988)之方法或經由用嚙齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列。因此，此類「人類化」抗體為嵌合抗體(US 4,816,567)，其中實質上小於完整人類可變域已經來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人類化抗體典型地為其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基經來自嚙齒動物抗體中之類似位點的殘基取代之人類抗體。
選擇用於製備人類化抗體之人類可變域(輕鏈與重鏈)對於降低抗原性而言極其重要。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知的人類可變域序列之整個庫篩選嚙齒動物抗體之可變域之序列。由此，認可與嚙齒動物之序列最接近的人類序列作為人類化抗體之人類構架(FR)。Sims等人,J. Immunol. 151:2296-2308 (1993)；Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)。另一種方法使用來源於輕鏈或重鏈之特定子組的所有人類抗體之共同序列之特定構架。若干種不同的人類化抗體可使用相同構架。
亦重要的是，經人類化之抗體保留對抗原之高親和力及其他有利的生物特性。為了達成此目標，根據一種較佳方法，人類化抗體係藉由一種使用親本及人類化序列的三維模型分析親本序列及各種概念性人類化產物之方法製備。通常可獲得三維免疫球蛋白模型且為熟習此項技術者所熟悉。可使用說明且顯示所選擇之候選免疫球蛋白序列之可能的三維構形結構之電腦程式。檢驗此等顯示使得可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中之可能作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力之殘基。以此方式，可自受體及輸入序列選擇及組合FR殘基，使得獲得所需抗體特徵，諸如增加之對目標抗原之親和力。通常，CDR殘基直接且最實質性涉及影響抗原結合。
在某些實施例中，sdAb經修飾(諸如人類化)而不降低域對抗原之原生親和力且同時降低其對異源物質之免疫原性。舉例而言，可測定駱馬抗體之抗體可變域(VH H)之胺基酸殘基且一或多個駱駝科胺基酸(例如在構架區中)由其人類對應物(如在人類共同序列中發現)置換而不使多肽喪失其典型特徵，亦即，人類化不顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝科sdAb之人類化需要單一多肽鏈中之有限量的胺基酸之引入及突變誘發。此與scFv、Fab'、(Fab')2及IgG之人類化(其需要在兩條鏈(輕鏈及重鏈)中引入胺基酸變化且保留兩條鏈之組件)不同。 6.      人類抗體
作為人類化之替代方案，可產生人類抗體。舉例而言，目前有可能產生在免疫接種後能夠在不產生內源性免疫球蛋白的情況下產生完整人類抗體譜系之基因轉殖動物(例如小鼠)。舉例而言，已描述嵌合及生殖系突變型小鼠中之抗體重鏈接合區(JH )基因之同型接合缺失引起完全抑制內源性抗體產生。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此類生殖系突變型小鼠中將引起在抗原攻擊時產生人類抗體。
或者，可使用噬菌體呈現技術以由來自未經免疫之供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系活體外產生人類抗體及抗體片段。McCafferty等人,Nature 348:552-553 (1990)；Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)。根據此技術，將抗體V域基因同框選殖至諸如M13或fd之絲狀噬菌體之主要或次要鞘蛋白基因中，且使其在噬菌體粒子之表面上呈現為功能性抗體片段。因為絲狀粒子含有噬菌體基因體之單股DNA複本，所以基於抗體之功能特性的選擇亦引起編碼顯示此等特性之抗體之基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多種形式進行。V基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人,Nature 352:624-628 (1991)。可構築未經免疫之人類供體之V基因譜系，且可基本上根據由Marks等人,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)或Griffith等人,EMBO J. 12:725-734 (1993)所描述之技術分離針對一系列不同抗原(包括自身抗原)之抗體。亦參見US 5,565,332及US 5,573,905。
Cole等人(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, 第77頁 (1985))及Boerner等人(J. Immunol. 147:86-95 (1991))之技術亦可用於製備人類單株抗體。類似地，可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入基因轉殖動物(例如，內源性免疫球蛋白基因已部分或完全不活化之小鼠)中來製備人類抗體。在攻擊之後，觀測人類抗體產生，其在所有方面與在人類中所見極其類似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如US 5,545,807；US 5,545,806；US 5,569,825；US 5,625,126；US 5,633,425；及US 5,661,016；以及Marks等人,Biotechnology (N.Y.) 10:779-783 (1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859 (1994)；Morrison,Nature 368:812-813 (1994)；Fishwild等人,Nat. Biotechnol. 14:845-851 (1996)；Neuberger,Nat. Biotechnol. 14:826 (1996)；Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)中。舉例而言，在某些實施例中，可藉由人類HCAb小鼠之免疫來產生人類抗體(例如人類DAb)。舉例而言，可藉由使其中已消除內源性鼠類抗體表現且已引入人類轉殖基因之基因轉殖小鼠免疫來產生HCAb (例如sdAb-Fc融合蛋白質)。HCAb小鼠揭示於US 8,883,150；US 8,921,524；US 8,921,522；US 8,507,748；US 8,502,014；US 2014/0356908；US 2014/0033335；US 2014/0037616；US 2014/0356908；US 2013/0344057；US 2013/0323235；US 2011/0118444；及US 2009/0307787中，其所有關於僅重鏈抗體及其在基因轉殖小鼠中之製備方法之揭示內容皆以引用之方式併入本文中。使HCAb小鼠免疫且使所得預致敏之脾細胞與鼠類骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤。接著，可藉由用人類序列置換鼠類CH2及CH3區域來使所得HCAb成為完全人類型。
最終，亦可藉由活體外活化B細胞(參見US 5,567,610及US 5,229,275)或藉由使用此項技術中已知的各種技術，包括噬菌體呈現庫(Hoogenboom及Winter,J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)；Marks等人,J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))來產生人類抗體。VII. 製品及套組
在某些實施例中，提供一種含有適用於治療個體中之疾病或病狀之物質之製品，其係用於向個體投與抗白蛋白構築體。製品可包含容器及容器上或容器隨附之標籤或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶及注射器。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。通常，容器容納對於治療本文中所描述之疾病或病症有效之組合物，且可具有無菌接取口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本文中所描述之抗白蛋白構築體。標籤或藥品說明書指示該組合物用於治療特定病狀。標籤或藥品說明書進一步包含用於向患者投與抗白蛋白構築體之說明書。亦涵蓋包含本文中所描述之組合療法的製品及套組。
藥品說明書係指治療性產品之商業封裝中通常包括之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌及/或關於使用此類治療性產品之警告的資訊。在某些實施例中，藥品說明書指示組合物係用於治療疾病或病狀(諸如癌症或發炎性疾病)。
此外，製品可進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點出發而所需的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
亦提供適用於各種目的之套組，例如用於治療本文中所描述之疾病或病狀(諸如癌症或發炎性疾病)、用於向個體投與抗白蛋白構築體(視情況與製品組合)。本發明之套組包括一或多個包含抗白蛋白構築體組合物(或單位劑型及/或製品)之容器且在某些實施例中，進一步包含另一種藥劑(諸如本文中所描述之藥劑)及/或根據本文中所描述之方法中之任一者之使用說明書。套組可進一步包含選擇適用於治療之個體之說明。本發明之套組中提供之說明書通常為在標籤或藥品說明書(例如套組中所包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁化或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。
舉例而言，在某些實施例中，套組包含有包含抗白蛋白構築體之組合物。在某些實施例中，套組包含a)包含抗白蛋白構築體之組合物，及b)有效量之至少一種如本文中所描述之其他藥劑。在某些實施例中，套組包含a)包含抗白蛋白構築體之組合物，及b)用於向個體投與抗白蛋白構築體組合物以進行治療之說明書。在某些實施例中，套組包含a)包含抗白蛋白構築體之組合物，b)有效量之至少一種如本文中所描述之其他藥劑，及c)用於向個體投與抗白蛋白構築體組合物及其他藥劑以進行治療之說明書。抗白蛋白構築體及其他藥劑可存在於獨立容器或單一容器中。舉例而言，套組可包含一種相異的組合物或兩種或更多種組合物，其中一種組合物包含抗白蛋白構築體且另一種組合物包含另一種藥劑。
本發明之套組係在適合的封裝中。適合的封裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性封裝(例如密封Mylar或塑膠袋)。套組可視情況提供諸如緩衝液之其他組分及說明性資訊。因此，本發明亦提供製品，其包括小瓶(諸如密封小瓶)、瓶子、罐及可撓性封裝。
與抗白蛋白構築體組合物之使用相關的說明書通常包括關於用於所欲治療之劑量、給藥時程及投藥途徑之資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量封裝)或子單位劑量。舉例而言，可提供套組，其含有足夠劑量的如本文中所揭示之抗白蛋白構築體，以持續長時段，諸如一週、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2週、3週、4週、6週、8週、3個月、4個月、5個月、7個月、8個月、9個月或更長時間中之任一者向個體提供有效治療。套組亦可包括多個單位劑量之抗白蛋白構築體及醫藥組合物及使用說明書且以對於在藥房，例如醫院藥房及配藥房中儲存及使用而言足夠之量封裝。
熟習此項技術者將認識到，在本發明之範疇及精神內，若干實施例為可能的。現將參考以下非限制性實例來更詳細地描述本發明。以下實例進一步說明本發明，但當然不應將其解釋為以任何方式限制其範圍。 實例
以下實例意欲為本發明之示例且因此不應視為以任何方式限制本發明之範疇。 實例1. 產生抗HSA單域抗體
使用自稻米表現之人類血清白蛋白(HSA)(Sigma, #A9731)對駱馬進行免疫接種以產生抗HSA單域抗體(VH H抗體)。在免疫接種之後，分離外周單核細胞(PBMC)以用於RNA提取。用編碼抗體基因之mRNA/cDNA構築VH H抗體噬菌體呈現庫。經由與抗原之多輪親和力結合來篩選所構築之噬菌體呈現庫。經由OCTET®親和力量測(OCTET® RED96)來鑑別陽性純系。陽性純系之抗體基因經定序及選殖至UCOE®載體(EMD Millipore, #CS221284)中以用於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表現。
表4列舉根據上文所描述之方法產生之例示性抗HSA單域(例如VH H)抗體(例如抗體A1 至A18 )。此等例示性VH H抗體之CDR序列列舉於表5中。在此等抗體中，抗體A8 與人類、食蟹獼猴及小鼠血清白蛋白相互作用。抗體A1 至A7 及A9 與人類及食蟹獼猴血清白蛋白相互作用。表 4. 抗 HSA VH H 抗體之胺基酸序列
抗體編號 SEQ ID NO: 胺基酸序列
A1 1 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSTYAMGWFRQPPGKEREFVASINRSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMSSLKPEDTAVYYCAADSDGIGWFNSFEYDYWGRGTQVTVSS
A2 2 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSVSLYHVGWFRHTPGKEREFVAATAWHDGSTSYADSVKGRFTISRNNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCAGEAKLGGIYSRWRDYEYWGQGTQVTVSS
A3 3 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSIYDMGWFRQAPGKEREFVAATNLRGVSTRYADSVKGRFTISGDNAKNTVSLQMNSLIPEDTAVYYCAAAVSNWLAKDPSAYSYWGQGTQVTVSS
A4 4 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSTYAMGWFRQPPGKEREFVASINRSGDSTYYADSVKGRFTISRDDAKNMGYLQMSSLKPEDTAVYYCAADSDGIGWFNSFEYDYWGRGTQVTVSS
A5 5 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGPIFSTYAMGWFRQPPGKEREFVASINRSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMSSLKPEDTAVYYCAADSDGIGWFNSFEYDYWGRGTQVTVSS
A6 6 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSVSLYHVGWFRHTPGKEREFVAATAWHDGSTSYADSVKGRFTISRNNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCAGEAKLGGIYSRWRDYEYWGQGTQVTVSS
A7 7 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSVSLYHVGWFRHTPGKEREFVAATAWHDGSTSYADSVKGRFTISRDSAKNTVFLQMSSLQPEDTAVYYCAADPGGSSWSQPWYDYWGQGTQVTVSS
A8 8 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSS
A9 9 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNDAMGWFRQAPGKERVFVATISWKSSTYYADSVKGRFTISRDHAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCVADPYGLGFNPSDYDYWGQGTQVTVSS
A10 105 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWKSSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLTPEDTAVYYCAADPTGSYDQPWYDYWGQGTQVTVSS
A11 106 QVQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGMSSANVMGWYRQVPGNQRELVARITSSGRTMYSDSVLGRFTISRGGAGNTADLQMNMLKPEDTAIYICNIRILGSFDPDSGYWGQGTQVTVSS
A12 107 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRGFGMSWVRRAPGKEFEWVSSINGGGEDTRYSDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDSAVYYCAIGGPGATPSGPGTQVTVSS
A13 108 QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRNFNPMGWFRQAPGKQRESVAAIGTDGSTKYADSVKGRFTISRDNGKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCNVGGWGISWFPWGRGTQVSVSS
A14 109 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRGFGMSWVRQAPGKGFEWVSSINSGGEDTRYSDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAIGGAGATPSGQGTQVTVSS
A15 110 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFRGFGMSWVRQAPGKGFEWVSSINNGGSDTRYADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAIGGPGASPSGQGTQVTVSS
A16 111 QVQLVESGGGLVQAGGTLRLSCTASGSTFRGNGMAWHRQAPGKEREFVAYMGMTDRITYAESVKGRFTLSRDDAKNRVYLHMNNLEVEDTAVYYCTAFGSWGQGTQVTVSS
A17 112 QVQLVESGGELVQAGGSLRLSCVVSGRTFRTRTMGWFRQAPGKEREYVAHISANGPITDYSDSVKGRFAISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCALHNGIGVRTVPSQYDSWGQGTQVTVSS
A18 113 QEQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASTRTINIYAMAWFRQAPGKEREFVAAVTWSGLTRDYADSVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLQPEDTAVYYCAAGRYSTGTHDYDYWGQGTQVTVSS
A19 114 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTLVTVSS
A20 115 QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFRGFGMSWVRQAPGKGLEWVSSINNGGSDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIGGPGASPSGQGTQVTVSS
表 5. 抗 HSA VH H 抗體之 CDR 序列
抗體編號 CDR1 (IMGT®) CDR2 (IMGT®) CDR3 (IMGT®)
A1 GRIFSTYA (SEQ ID NO:10) INRSGDST (SEQ ID NO:11) AADSDGIGWFNSFEYDY (SEQ ID NO:12)
A2 GRSVSLYH (SEQ ID NO:13) TAWHDGST (SEQ ID NO:14) AGEAKLGGIYSRWRDYEY (SEQ ID NO:15)
A3 GRTFSIYD (SEQ ID NO:16) TNLRGVST (SEQ ID NO:17) AAAVSNWLAKDPSAYS (SEQ ID NO:18)
A4 GRIFSTYA (SEQ ID NO:19) INRSGDST (SEQ ID NO:20) AADSDGIGWFNSFEYDY (SEQ ID NO:21)
A5 GPIFSTYA (SEQ ID NO:22) INRSGDST (SEQ ID NO:23) AADSDGIGWFNSFEYDY (SEQ ID NO:24)
A6 GRSVSLYH (SEQ ID NO:25) TAWHDGST (SEQ ID NO:26) AGEAKLGGIYSRWRDYE (SEQ ID NO:27)
A7 GRSVSLYH (SEQ ID NO:28) TAWHDGST (SEQ ID NO:29) AADPGGSSWSQPWYD (SEQ ID NO:30)
A8 GSTWSINT (SEQ ID NO:31) ISSGGST (SEQ ID NO:32) YAQSTWYPPS (SEQ ID NO:33)
A9 GRTFSNDA (SEQ ID NO:34) ISWKSST (SEQ ID NO:35) VADPYGLGFNPSDYD (SEQ ID NO:36)
A10 GGTFSSYA (SEQ ID NO:116) ISWKSST (SEQ ID NO:35) AADPTGSYDQPWYDY (SEQ ID NO:117)
A11 GMSSANV (SEQ ID NO:118) ITSSGRT (SEQ ID NO:119) NIRILGSFDPDSGY (SEQ ID NO:120)
A12 GFTFRGFG (SEQ ID NO:121) INGGGEDT (SEQ ID NO:122) AIGGPGATP (SEQ ID NO:123)
A13 GRNFNP (SEQ ID NO:124) IGTDGST (SEQ ID NO:125) NVGGWGISWFP (SEQ ID NO:126)
A14 GFTFRGFG (SEQ ID NO:121) INSGGEDT (SEQ ID NO:127) AIGGAGATP (SEQ ID NO:128)
A15 GFAFRGFG (SEQ ID NO:129) INNGGSDT (SEQ ID NO:130) AIGGPGASP (SEQ ID NO:131)
A16 GSTFRGNG (SEQ ID NO:132) MGMTDRI (SEQ ID NO:133) TAFGS (SEQ ID NO:134)
A17 GRTFRTRT (SEQ ID NO:135) ISANGPIT (SEQ ID NO:136) ALHNGIGVRTVPSQYDS (SEQ ID NO:137)
A18 TRTINIYA (SEQ ID NO:138) VTWSGLTR (SEQ ID NO:139) AAGRYSTGTHDYDY (SEQ ID NO:140)
A19 GRTFSNDA (SEQ ID NO:34) ISWKSST (SEQ ID NO:35) VADPYGLGFNPSDYD (SEQ ID NO:36)
A20 GFAFRGFG (SEQ ID NO:129) INNGGSDT (SEQ ID NO:130) AIGGPGASP (SEQ ID NO:131)
實例2. 產生人類化抗HSA單域抗體
針對IMGT® 資料庫將抗HSA單域抗體(sdAb)之各駱馬序列母細胞化以鑑別最佳匹配之人類IGHV3生殖細胞系。當多個生殖細胞系具有類似同源性時，使用IGMT® 編號系統中之FR2之位置52處之胺基酸之相似性來測定採用哪個生殖細胞系作為人類化骨架。接著，採用來自所選擇的生殖細胞系之FR1及FR3作為「人類化」FR1及FR3。對於FR2，除其中保留各別駱馬序列之位置42及52以外，採用大部分人類序列。表6展示各抗HSA抗體之例示性人類FR區序列。對於人類FR4，人類化抗體A1 -A9 、A19 及A20 各自獨立地具有WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:145)、WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:146)或SGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:147)之胺基酸序列。在一個實施例中，對於人類FR4，人類化抗體A1 -A9 各自具有WGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:145)之胺基酸序列。在另一實施例中，對於人類FR4，人類化抗體A19 具有WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:146)之胺基酸序列。在另一實施例中，對於人類FR4，人類化抗體A19 具有SGQGTQVTVSS (SEQ ID NO:147)之胺基酸序列。表 6. 人類化抗 HSA VH H 抗體之構架區
抗體編號 匹配之人類生殖細胞系 人類 FR1 人類 FR2 人類 FR3
A1 IGHV3-23*04 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO:37) MSWVRQAPGKGLEWVSA (SEQ ID NO:40) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A2 IGHV3-64*04 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSAS (SEQ ID NO:38) MHWVRQAPGKGLEYVSA (SEQ ID NO:41) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A3 IGHV3-64*04 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSAS (SEQ ID NO:38) MHWVRQAPGKGLEYVSA (SEQ ID NO:41) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A4 IGHV3-23*04 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO:37) MSWVRQAPGKGLEWVSA (SEQ ID NO:40) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A5 IGHV3-23*04 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO:37) MSWVRQAPGKGLEWVSA (SEQ ID NO:40) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A6 IGHV3-64*04 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSAS (SEQ ID NO:38) MHWVRQAPGKGLEYVSA (SEQ ID NO:41) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A7 IGHV3-64*04 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSAS (SEQ ID NO:38) MHWVRQAPGKGLEYVSA (SEQ ID NO:41) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A8 IGHV3-66*01 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:39) MSWVRQAPGKGLEWVSV (SEQ ID NO:42) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT (SEQ ID NO:44)
A9 IGHV3-23*04 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG (SEQ ID NO:37) MSWVRQAPGKGLEWVSA (SEQ ID NO:40) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43)
A19    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:39) LAWYRQAPGKQRDLVAR (SEQ ID NO:142) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:144)
A20    QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:141) MSWVRQAPGKGLEWVSS (SEQ ID NO:143) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO:144)
實例3. 抗白蛋白抗體之解離常數(K D )
評估VH H抗白蛋白抗體在用於模擬酸化內體之pH值的不同pH值(例如pH 7.4或pH 5.5)下與人類、猴及小鼠血清白蛋白相互作用之能力。簡言之，VH H抗白蛋白抗體融合至人類IgG1-Fc上。接著，將經表現之蛋白質裝載至蛋白質A生物感測器(OCTET® RED96)上。接著，將生物感測器浸漬於含有三種或更多種不同濃度(例如50、100或200 nM或100、200或400 nM)之人類、猴或小鼠血清之溶液中。藉由整體擬合來分析原始實驗資料以測定解離常數(K D )。結果概述於表7(pH 5.5)及表8 (pH 7.4)中，其中A表示不超過10 nM之值，B表示大於10 nM但不超過100 nM之值且C表示大於100 nM但不超過500 nM之值。表 7. 在 pH 5.5 下， 針對人類及猴血清白蛋白之抗白蛋白抗體之解離常數 (K D )
抗體編號 人類 猴
A8 A B
A10 B B
A20 B B
表 8. 在 pH 7.4 下， 針對人類、猴及小鼠血清白蛋白之抗白蛋白抗體之解離常數 (K D )
抗體編號 人類 猴 小鼠
A1 A A NA
A2 A A NA
A3 A B NA
A4 B A NA
A6 A A NA
A7 C C NA
A8 B B B
A9 A B NA
A10 B B NA
A11 NA NA NA
A12 B B NA
A13 B B NA
A14 B B NA
A15 B B NA
A16 B NA NA
A17 B NA NA
A18 NA NA NA
A19 B A B
A20 B B NA
NA - 未偵測到結合
表8中之結果表明抗體A19 (抗體A8 之一種人類化抗白蛋白抗體)保持其與人類、猴及小鼠血清白蛋白之結合。表7及8中之結果亦表明，抗白蛋白抗體在低pH值下保持其與人類及猴血清白蛋白之結合，表明此類抗體適用於酸性環境(例如酸化內體)。 實例4. IL-21-抗HSA構築體之分子選殖
本文中例示IL-21-抗HSA構築體表現載體之構築。使用GENEART® Gene Synthesis (ThermoFisher Scientific)，藉由基因合成來獲得編碼人類IL-21全長(SEQ ID NO:97)之cDNA序列。此等基因之密碼子使用係針對中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之表現最佳化。人類IL-21之C 端經由肽連接子與抗HSA VH H抗體之N 端融合。藉由組裝選殖(New England BioLabs，#E5520S)或類似的活體外重組方法將編碼人類IL-21之DNA序列、肽連接子及抗HSA VH H抗體無縫地組裝在一起。將IL-21-抗HSA融合蛋白質之寡核苷插入UCOE®表現載體CET1019-AS-Puro (EMD Millipore，#CS221284)中以用於CHO細胞表現。表9列舉人類IL-21之序列。表10列舉適用於IL-21-抗HSA構築體之例示性肽連接子。表 9. 介白素 -21 (IL-21)
名稱 SEQ ID NO: 胺基酸序列
人類IL-21全長 97 QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
人類IL-21截短 98 QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHL
表 10. 肽連接子
連接子 SEQ ID NO: 胺基酸序列
GSG連接子(n = 1、2、3或4) 58 (GSG)n 不可裂解
G3S連接子(n = 1、2、3或4) 59 (G3S)n
G4S連接子(n = 1、2、3或4) 60 (G4S)n
EAAAK連接子(n = 1、2、3或4) 61 (EAAAK)n
PAPAP連接子(n = 1、2、3或4) 62 (PAPAP)n
VLVH連接子 63 IKRTVAAP
SIRPα連接子 64 RAKPS
UPA連接子 74 SGRSA 可裂解
MMP連接子 75 PVGLIG
實例5. IL-21-抗白蛋白構築體之表現及純化
在EXPICHO-S™細胞(GIBCO™，#A29127)中短暫表現編碼IL-21-抗白蛋白構築體之DNA序列。簡言之，在第-1天，在通風的Erlenmeyer搖瓶中，用EXPICHO™表現培養基(GIBCO™，#A2910001)以3-4×106 個細胞/毫升接種EXPICHO-S™且在具有8% CO2 之37℃培育箱中置放於125 rpm定軌振盪器上。在第0天，將質體DNA與AN EXPIFECTAMINE™ CHO試劑混合。接著，將混合物緩慢添加至細胞中。在16小時之後，將細胞轉移至具有5% CO2 之32℃培育箱中。在第1及5天向細胞供應EXPICHO™進料(GIBCO™，#A29129)兩次。在第8-12天收集CHO細胞以用於親和管柱純化。 實例6. IL-21-抗HSA構築體：與重組人類IL-21類似之IL-21信號傳導效能
普菲弗(Pfeiffer)細胞維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在含有10 mM HEPES之漢克氏平衡鹽溶液(Hanks'balanced salt solution)中，在37℃及5% CO2 下，用所指示之濃度之重組人類IL-21 (rhIL-21)(SEQ ID NO:97)、小鼠IL-21-抗HSA構築體C1 (SEQ ID NO:99)或人類IL-21-抗HSA構築體C2 (SEQ ID NO:100)處理普菲弗細胞(100,000)30分鐘。二氧磷基-STAT3係使用二氧磷基-STAT3 (Tyr705)均相時間解析螢光(HTRF)分析法(Cisbio)根據製造商說明書來量測。將665 nm/620 nm之信號比率乘以1,000，標繪且使用劑量反應曲線針對所計算的EC50 擬合(Graphpad Prism)。結果概述於表11中，表明IL-21-抗HSA構築體C1 及C2 以及重組hIL-21具有類似效能。在表11中，構築體C1 為小鼠IL-21-抗HSA融合蛋白質，其包含SEQ ID NO:148之小鼠IL-21 (mIL-21)部分、SEQ ID NO:8之抗HSA抗體部分及(GSG)4 之肽連接子(SEQ ID NO:58)；其中mIL-21之C 端經由肽連接子連接至抗HSA抗體之N 端。構築體C2 (SEQ ID NO:100)為人類IL-21-抗HSA融合蛋白質，其包含SEQ ID NO:97之人類IL-21 (hIL-21)部分、SEQ ID NO:8之抗HSA抗體部分及(GSG)4 之肽連接子(SEQ ID NO:58)；其中hIL-21之C 端經由肽連接子連接至抗HSA抗體之N 端。表 11. 不同 IL-21 變異體之 EC50
蛋白質 EC50 (pM)
rhIL-21 150
C1 88
C2 111
實例7. ADCC活性
將NCI-N87及NCI-H226癌細胞株維持於含有10%胎牛血清及青黴素/鏈黴素之RPMI-1640中。在第0天，在96孔平底盤中，在培養基中塗佈NCI-N87細胞(10,000個/孔)及NCI-H226細胞(5,000個/孔)。在第1天，使用ROSETTESEP™ NK分離套組(Stemcell Technologies)自人類白血球層分離NK細胞。接著，將NK細胞(100,000個/孔)與所指示之處理劑一起添加至癌細胞中。
在分別在37℃及5% CO2 下培育NCI-N87及NCH-H226細胞24小時或48小時之後，細胞用4%多聚甲醛固定且用SYTOX™橙進行細胞核染色。藉由使用CYTATION™ 1 (Biotek)對各孔中之剩餘的癌細胞核之數目進行來計數計算剩餘癌細胞之數目。較低細胞計數指示較佳的NK介導之細胞殺傷。
如圖1及2中所示，在與抗MSLNB1 組合時，mIL-21-抗HSA構築體C1 (SEQ ID NO:99)及hIL-21-抗HSA構築體C2 (SEQ ID NO:100)增強NK細胞ADCC活性。IL-21-抗HSA構築體C1 及C2 與rhIL-21之間的增強之ADCC之量值類似。在圖1及2中，抗MSLNB1 ，一種單域抗MSLN抗體，包含SEQ ID NO:92之CDR1、SEQ ID NO:93之CDR2及SEQ ID NO:94之CDR3。C5 表示SEQ ID NO:102之人類IL-15。構築體C6 (SEQ ID NO:103)表示IL-15Rα-抗HSA構築體，其包含人類IL-15Rα (hIL-15Rα)之片段(SEQ ID NO:102)及SEQ ID NO:8之抗HSA抗體部分，以及(G4S)4 之肽連接子(SEQ ID NO:60)。
如圖3及4中所示，在與抗MSLNB1 組合時，IL-21-抗HSA構築體(i)C1 ，(ii)C2 ，(iii)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C6 組合，及(iv)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C7 組合展示降至0.6 ng/mL或更低之ADCC功效。構築體C7 (SEQ ID NO:104)表示IL-15Rα-抗HSA構築體，其包含人類IL-15Rα之片段及SEQ ID NO:8之抗HSA抗體部分，以及(G4S)4 之肽連接子(SEQ ID NO:60)。 實例8. 同基因型小鼠模型中之活體內抗腫瘤活性
在第0天，將MC38鼠類結腸癌細胞(3×106 個細胞)皮下植入C57BL/6小鼠之側腹中。在第4、8、12及16天，用PBS、抗mPD-1 (100 µg)、mIL-21-抗HSA構築體C1 (25 µg)、抗mPD-1 (100 µg)及mIL-21-抗HSA構築體C1 (25 µg)或抗mPD-1 (100 µg)及mIL-21-抗HSA構築體C1 (5 µg)處理小鼠。在所指示之天數使用測徑規量測腫瘤尺寸且接著計算腫瘤體積。
如圖5中所示，mIL-21-抗HSA構築體C1 單藥療法顯著減緩腫瘤生長。mIL-21-抗HSA構築體C1 與抗mPD-1之組合在所有小鼠中消除或縮小腫瘤。 實例9. hIL-21-抗HSA構築體C2之小鼠PK研究
在時間0時，向Balb/c小鼠腹膜內注射hIL-21-抗HSA構築體C2 。在所指示之時間點時，經由隱靜脈收集血液(100 μL)。將血液置放於EDTA血液收集管中，置放於冰上且離心。接著，將血漿轉移至1.5 mL試管中，冷凍且儲存在-80℃下。為了量測hIL-21濃度，將血漿樣品解凍且使用人類IL-21 ELISA (Invitrogen)根據製造商說明書進行測試。如圖6中所示，基於活體外劑量反應資料視為有效之IL-21濃度保持至少3-4天。測定在每劑量3及30 µg情況下之hIL-21-抗HSA構築體C2 之PK參數且概述於表12中。表 12. 小鼠中 hIL-21- 抗 HSA 構築體 C2 之 PK 參數
hIL-21- 抗HSA 構築體C2
3 µg劑量 30 µg劑量
Cmax (ng/mL) 142 2,300
T1/2 (h) 14 12
AUC (ng∙h/mL) 1,400 37,000
實例10. 基因轉殖小鼠中IL-21-抗HSA構築體之PK研究
向經基因改造之小鼠(Genoway)投與hIL-21-抗HSA構築體C3 (SEQ ID NO:149)(3 µg)或hIL-21-抗HSA構築體C4 (SEQ ID NO:150)(3 µg)，該等小鼠具有人類血清白蛋白及人類新生Fc受體之基因轉殖表現以及小鼠白蛋白及小鼠新生Fc受體之基因剔除。在1、24、48、96、168及336小時之後，自小鼠收集血液且使用EDTA作為抗凝劑處理成血漿。使用市售ELISA套組(Thermo Fisher)分析樣品之IL-21濃度。測定在每劑量3 µg情況下之hIL-21-抗HSA構築體C3 及C4 之PK參數且概述於表13中。與抗HSAA19 相比，當與抗HSAA20 結合時，IL-21之Cmax 及t1/2 更大。表 13. 基因轉殖小鼠中 IL-21- 抗 HSA 構築體 C3 及 C4 之 PK 參數
構築體C3 構築體C4
Cmax (ng/mL) 770 270
T1/2 (h) 22 18
AUC (ng∙h/mL) 17,000 3,500
本文中所描述之序列提供於以下序列表中。序列表
SEQ ID NO: 說明 胺基酸序列
1 AbA1 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSTYAMGWFRQPPGKEREFVASINRSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMSSLKPEDTAVYYCAADSDGIGWFNSFEYDYWGRGTQVTVSS
2 AbA2 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSVSLYHVGWFRHTPGKEREFVAATAWHDGSTSYADSVKGRFTISRNNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCAGEAKLGGIYSRWRDYEYWGQGTQVTVSS
3 AbA3 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSIYDMGWFRQAPGKEREFVAATNLRGVSTRYADSVKGRFTISGDNAKNTVSLQMNSLIPEDTAVYYCAAAVSNWLAKDPSAYSYWGQGTQVTVSS
4 AbA4 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSTYAMGWFRQPPGKEREFVASINRSGDSTYYADSVKGRFTISRDDAKNMGYLQMSSLKPEDTAVYYCAADSDGIGWFNSFEYDYWGRGTQVTVSS
5 AbA5 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGPIFSTYAMGWFRQPPGKEREFVASINRSGDSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTGYLQMSSLKPEDTAVYYCAADSDGIGWFNSFEYDYWGRGTQVTVSS
6 AbA6 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSVSLYHVGWFRHTPGKEREFVAATAWHDGSTSYADSVKGRFTISRNNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCAGEAKLGGIYSRWRDYEYWGQGTQVTVSS
7 AbA7 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSVSLYHVGWFRHTPGKEREFVAATAWHDGSTSYADSVKGRFTISRDSAKNTVFLQMSSLQPEDTAVYYCAADPGGSSWSQPWYDYWGQGTQVTVSS
8 AbA8 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSS
9 AbA9 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNDAMGWFRQAPGKERVFVATISWKSSTYYADSVKGRFTISRDHAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYYCVADPYGLGFNPSDYDYWGQGTQVTVSS
10 AbA1 CDR1 GRIFSTYA
11 AbA1 CDR2 INRSGDST
12 AbA1 CDR3 AADSDGIGWFNSFEYDY
13 AbA2 CDR1 GRSVSLYH
14 AbA2 CDR2 TAWHDGST
15 AbA2 CDR3 AGEAKLGGIYSRWRDYEY
16 AbA3 CDR1 GRTFSIYD
17 AbA3 CDR2 TNLRGVST
18 AbA3 CDR3 AAAVSNWLAKDPSAYS
19 AbA4 CDR1 GRIFSTYA
20 AbA4 CDR2 INRSGDST
21 AbA4 CDR3 AADSDGIGWFNSFEYDY
22 AbA5 CDR1 GPIFSTYA
23 AbA5 CDR2 INRSGDST
24 AbA5 CDR3 AADSDGIGWFNSFEYDY
25 AbA6 CDR1 GRSVSLYH
26 AbA6 CDR2 TAWHDGST
27 AbA6 CDR3 AGEAKLGGIYSRWRDYE
28 AbA7 CDR1 GRSVSLYH
29 AbA7 CDR2 TAWHDGST
30 AbA7 CDR3 AADPGGSSWSQPWYD
31 AbA8 CDR1 GSTWSINT
32 AbA8 CDR2 ISSGGST
33 AbA8 CDR3 YAQSTWYPPS
34 AbA9 CDR1 GRTFSNDA
35 AbA9 CDR2 ISWKSST
36 AbA9 CDR3 VADPYGLGFNPSDYD
37 人類FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG
38 人類FR1 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSAS
39 人類FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
40 人類FR2 MSWVRQAPGKGLEWVSA
41 人類FR2 MHWVRQAPGKGLEYVSA
42 人類FR2 MSWVRQAPGKGLEWVSV
43 人類FR3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
44 人類FR3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDT
45 人類化A1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGRIFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAINRSGDST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAADSDGIGWFNSFEYDY WGRGTQVTVSS
46 人類化A2 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGRSVSLYH MHWVRQAPGKGLEYVSATAWHDGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGEAKLGGIYSRWRDYEY WGQGTQVTVSS
47 人類化A3 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGRTFSIYD MHWVRQAPGKGLEYVSATNLRGVST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAAAVSNWLAKDPSAYS YWGQGTQVTVSS
48 人類化A4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGRIFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAINRSGDST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAADSDGIGWFNSFEYDY WGRGTQVTVSS
49 人類化A5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGPIFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAINRSGDST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAADSDGIGWFNSFEYDY WGRGTQVTVSS
50 人類化A6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGRIFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAINRSGDST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAGEAKLGGIYSRWRDYE YWGQGTQVTVSS
51 人類化A7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGRIFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAINRSGDST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAADPGGSSWSQPWYD YWGQGTQVTVSS
52 人類化A8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINT MSWVRQAPGKGLEWVSVISSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTYAQSTWYPPS WGQGTQVTVSS
53 人類化A9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGRIFSTYA MSWVRQAPGKGLEWVSAINRSGDST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAADSDGIGWFNSFEYDY WGQGTQVTVSS
54 HSA同功異型物1 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
55 HSA同功異型物2 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
56 HSA同功異型物3 MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
57 成熟HSA DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQGLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVGSKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDCLSVFLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNGRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
58 GSG連接子 (GSG)n (n = 2、3、4、5或6)
59 G3S連接子 (GGGS)n (n = 1、2、3、4、5或6)
60 G4S連接子 (GGGGS)n (n = 1、2、3、4、5或6)
61 EAAAK連接子 (EAAAK)n (n = 1、2、3、4、5或6)
62 PAPAP連接子 (PAPAP)n (n = 1、2、3、4、5或6)
63 VLVH.連接子 IKRTVAAP
64 SIRPα連接子 RAKPS
65 GSGS連接子 (GSGS)n (n = 1、2、3或4)
66 GGSG連接子 (GGSG)n (n = 1、2、3或4)
67 PAPA連接子 (PAPA)n (n = 1、2或3)
68 PQPQ連接子 (PQPQ)n (n = 1、2或3)
69 VL-CL原生連接子 IKRADAAP
70 形成螺旋之連接子 AEAAAKEAAAKA
71 單峰駝IgG3鉸鏈 GTNEVCKCPKCP
72 單峰駝IgG2a鉸鏈 EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP
73 F2A (可裂解) RRKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
74 UPA連接子(可裂解) SGRSA
75 MMP連接子(可裂解) PVGLIG
76 可裂解連接子 KGPQGIAGQ
77 可裂解連接子 FGPQGLAGQ
78 可裂解連接子 RGPQGIFGQ
79 可裂解連接子 IGPQGIWGQ
80 可裂解連接子 MGPQGILGQ
81 可裂解連接子 KGPQSIAGQ
82 可裂解連接子 FGPQSLAGQ
83 可裂解連接子 RGPQSIFGQ
84 可裂解連接子 IGPQSIWGQ
85 可裂解連接子 MGPQSILGQ
86 可裂解連接子 KGPRTIAGQ
87 可裂解連接子 FGPQTLAGQ
88 可裂解連接子 RGPQTIFGQ
89 可裂解連接子 IGPRTIWGQ
90 可裂解連接子 FRPRSITGQ
91 可裂解連接子 MGPQTILGQ
92 抗MSLNB1 CDR1 GITFPVNA
93 抗MSLNB1 CDR2 ISAGGTT
94 抗MSLNB1 CDR3 QRRIGMLRDY
95 抗MSLNB2 CDR1 GRTLESYV
96 抗MSLNB2 CDR2 INWSSGRL
97 人類IL-21 (全長) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
98 人類IL-21 (截短) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHL
99 構築體C1 (mIL-21-抗HSA VH H) QGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLSGSGGSGGSGGSGQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSS
100 構築體C2 (hIL-21-抗HSA VH H) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGSGGSGGSGGSGQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSS
101 抗HSA VH H-hIL-15R sushi-人類IL-15 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPRRKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
102 人類IL-15Rα MGWSLILLFLVAVATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
103 構築體C6 (hIL-15Rα-抗HSA VH H) MGWSLILLFLVAVATRVHSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
104 構築體C7 (hIL-15Rα-抗HSA VH H) MGWSLILLFLVAVATRVHSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTHYADSVKGRFTVSRDNAENTLVLQMNSLKPEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPP
105 AbA10 QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCLASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWKSSTYYTDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLTPEDTAVYYCAADPTGSYDQPWYDYWGQGTQVTVSS
106 AbA11 QVQVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGMSSANVMGWYRQVPGNQRELVARITSSGRTMYSDSVLGRFTISRGGAGNTADLQMNMLKPEDTAIYICNIRILGSFDPDSGYWGQGTQVTVSS
107 AbA12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRGFGMSWVRRAPGKEFEWVSSINGGGEDTRYSDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDSAVYYCAIGGPGATPSGPGTQVTVSS
108 AbA13 QVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASGRNFNPMGWFRQAPGKQRESVAAIGTDGSTKYADSVKGRFTISRDNGKNTVYLQMNSLKSEDTAVYYCNVGGWGISWFPWGRGTQVSVSS
109 AbA14 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRGFGMSWVRQAPGKGFEWVSSINSGGEDTRYSDSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAIGGAGATPSGQGTQVTVSS
110 AbA15 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFRGFGMSWVRQAPGKGFEWVSSINNGGSDTRYADSVKGRFTISRDNARNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAIGGPGASPSGQGTQVTVSS
111 AbA16 QVQLVESGGGLVQAGGTLRLSCTASGSTFRGNGMAWHRQAPGKEREFVAYMGMTDRITYAESVKGRFTLSRDDAKNRVYLHMNNLEVEDTAVYYCTAFGSWGQGTQVTVSS
112 AbA17 QVQLVESGGELVQAGGSLRLSCVVSGRTFRTRTMGWFRQAPGKEREYVAHISANGPITDYSDSVKGRFAISRDNAKNTVNLQMNSLKPEDTAVYYCALHNGIGVRTVPSQYDSWGQGTQVTVSS
113 AbA18 QEQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASTRTINIYAMAWFRQAPGKEREFVAAVTWSGLTRDYADSVKGRFTISRDNPKNTLYLQMNSLQPEDTAVYYCAAGRYSTGTHDYDYWGQGTQVTVSS
114 AbA19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTLVTVSS
115 AbA20 QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFRGFGMSWVRQAPGKGLEWVSSINNGGSDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIGGPGASPSGQGTQVTVSS
116 AbA10 CDR1 GGTFSSYA
117 AbA10 CDR3 AADPTGSYDQPWYDY
118 AbA11 CDR1 GMSSANV
119 AbA11 CDR2 ITSSGRT
120 AbA11 CDR3 NIRILGSFDPDSGY
121 AbA12 CDR1 GFTFRGFG
122 AbA12 CDR2 INGGGEDT
123 AbA12 CDR3 AIGGPGATP
124 AbA13 CDR1 GRNFNP
125 AbA13 CDR2 IGTDGST
126 AbA13 CDR3 NVGGWGISWFP
127 AbA14 CDR2 INSGGEDT
128 AbA14 CDR3 AIGGAGATP
129 AbA15 CDR1 GFAFRGFG
130 AbA15 CDR2 INNGGSDT
131 AbA15 CDR3 AIGGPGASP
132 AbA16 CDR1 GSTFRGNG
133 AbA16 CDR2 MGMTDRI
134 AbA16 CDR3 TAFGS
135 AbA17 CDR1 GRTFRTRT
136 AbA17 CDR2 ISANGPIT
137 AbA17 CDR3 ALHNGIGVRTVPSQYDS
138 AbA18 CDR1 TRTINIYA
139 AbA18 CDR2 VTWSGLTR
140 AbA18 CDR3 AAGRYSTGTHDYDY
141 人類FR1 QVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS
142 人類FR2 LAWYRQAPGKQRDLVAR
143 人類FR2 MSWVRQAPGKGLEWVSS
144 人類FR3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
145 人類FR4 WGQGTQVTVSS
146 人類FR4 WGQGTLVTVSS
147 人類FR4 SGQGTQVTVSS
148 小鼠IL-21 QGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS
149 構築體C3 (hIL-21-抗HSA VH H) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGSGGSGGSGGSGQVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFAFRGFGMSWVRQAPGKGLEWVSSINNGGSDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIGGPGASPSGQGTQVTVSS
150 構築體C4 (hIL-21-抗HSA VH H) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSGSGGSGGSGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTWSINTLAWYRQAPGKQRDLVARISSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCYAQSTWYPPSWGQGTLVTVSS
151 hIL-21突變型蛋白質(R5E) QGQDEHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
152 hIL-21突變型蛋白質(R9E) QGQDRHMIEMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
153 hIL-21突變型蛋白質(K73E) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKELKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
154 hIL-21突變型蛋白質(R76E) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKEKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
155 hIL-21突變型蛋白質(R5) QGQDX5 HMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (X5 為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y)
156 hIL-21突變型蛋白質(R9) QGQDRHMIX9 MRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (X9 為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y)
157 hIL-21突變型蛋白質(K73) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKX73 LKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (X73 為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y)
158 hIL-21突變型蛋白質(R76) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKX76 KPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (X76 為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y)
159 hIL-21突變型蛋白質(R5、R9、K73、R76) QGQDX5 HMIX9 MRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKX73 LKX76 KPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (X5 獨立地為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y； X9 獨立地為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y； X73 獨立地為A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y； 且X76 獨立地為A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y)
160 hIL-21突變型蛋白質(R5N、M7T) QGQDNHTIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
161 hIL-21突變型蛋白質(R5N、M7S) QGQDNHSIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
162 hIL-21突變型蛋白質(R9N、R11T) QGQDRHMINMTQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
163 hIL-21突變型蛋白質(R9N、R11S) QGQDRHMINMSQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
164 hIL-21突變型蛋白質(K73N、K75T) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKNLTRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
165 hIL-21突變型蛋白質(K73N、K75S) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKNLSRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
166 hIL-21突變型蛋白質(R76N、P78T) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKNKTPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
167 hIL-21突變型蛋白質(R76N、P78S) QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKNKSPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
168 hIL-21Rα CPDLVCYTDYLQTVICILEMWNLHPSTLTLTWQDQYEELKDEATSCSLHRSAHNATHATYTCHMDVFHFMADDIFSVNITDQSGNYSQECGSFLLAESIKPAPPFNVTVTFSGQYNISWRSDYEDPAFYMLKGKLQYELQYRNRGDPWAVSPRRKLISVDSRSVSLLPLEFRKDSSYELQVRAGPMPGSSYQGTWSEWSDPVIFQTQS
*   *   *   *   *
提供上述實例以向一般熟習此項技術者提供如何製備及使用所主張之實施例之全部揭示內容及說明，且不意欲限制本文中所揭示之內容之範疇。熟習此項技術者可顯而易見的變化意欲屬於以下申請專利範圍之範疇內。本說明書中所引用之所有公開案、專利案及專利申請案皆以引用之方式併入本文中，如同各此類公開案、專利案或專利申請案特定地且個別地指示以引用之方式併入本文中一般。
圖1展示在存在以下之情況下及在存在0.2、2、20或200 ng/mL之抗間皮素抗體B1 之情況下，NK細胞針對N87細胞之ADCC活性：(i)重組人類IL-21 (rhIL-21)(30 ng/mL)；(ii)小鼠IL-21-抗HSA構築體C1 (SEQ ID NO:99)(60 ng/mL)；(iii)人類IL-21-抗HSA構築體C2 (SEQ ID NO:100)(60 ng/mL)；或(iv)rhIL-15C5 (SEQ ID NO:102)/hIL-15Rα-抗HSA構築體C6 (SEQ ID NO:103)組合(60 ng/mL)，其中抗體B1 包含SEQ ID NO:92之CDR1、SEQ ID NO:93之CDR2及SEQ ID NO:94之CDR3。
圖2展示在存在以下之情況下及在存在0.2、2、20或200 ng/mL之抗間皮素抗體B1 之情況下，NK細胞針對H226細胞之ADCC活性：(i)rhIL-21 (30 ng/mL)；(ii)mIL-21-抗HSA構築體C1 (60 ng/mL)；(iii)hIL-21-抗HSA構築體C2 (60 ng/mL)；或(iv)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C6 組合(60 ng/mL)。
圖3展示在存在各種濃度之以下之情況下及在存在3 ng/mL之抗間皮素抗體B1 之情況下，NK細胞針對N87細胞之ADCC活性：(i)重組人類IL-15 (rhIL-15)；(ii)mIL-21-抗HSA構築體C1 ；(iii)hIL-21-抗HSA構築體C2 ；(iv)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C6 組合；或(v)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C7 (SEQ ID NO:104)組合。
圖4展示在存在各種濃度之以下之情況下及在存在20 ng/mL之抗間皮素抗體B1 之情況下，NK細胞針對H226細胞之ADCC活性：(i)rhIL-15 (rhIL-15)；(ii)mIL-21-抗HSA構築體C1 ；(iii)hIL-21-抗HSA構築體C2 ；(iv)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C6 組合；或(v)rhIL-15C5 /hIL-15Rα-抗HSA構築體C7 (SEQ ID NO:104)組合。
圖5展示在MC38同基因型小鼠模型中，在存在或不存在抗小鼠PD-1抗體之情況下，mIL-21-抗HSA構築體C1 之抗腫瘤活性。
圖6展示小鼠中hIL-21-抗HSA構築體C2 之藥物動力學概況。
圖7展示hIL-21-抗HSA構築體C3 (SEQ ID NO:149)及hIL-21-抗HSA構築體C4 (SEQ ID NO:150)之藥物動力學概況。
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Claims (51)

  1. 一種包含單域抗體(single-domain antibody；sdAb)部分之經分離抗白蛋白構築體，該單域抗體部分包含以下：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；其中該抗白蛋白構築體結合於白蛋白。
  2. 如請求項1之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含以下：CDR1，其包含SEQ ID NO:10、13、16、19、22、25、28、31、34、116、118、121、124、129、132、135或138中之任一者之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:11、14、17、20、23、26、29、32、35、119、122、125、127、130、133、136或139中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:12、15、18、21、24、27、30、33、36、117、120、123、126、128、131、134、137或140中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區中包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
  3. 如請求項1或2之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含： (1)   CDR1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (2)   CDR1，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (3)   CDR1，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (4)   CDR1，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (5)   CDR1，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (6)   CDR1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (7)   CDR1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (8)   CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (9)   CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (10) CDR1，其包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:117之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (11) CDR1，其包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:119之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:120之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (12) CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:122之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:123之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (13) CDR1，其包含SEQ ID NO:124之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:125之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:126之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (14) CDR1，其包含SEQ ID NO:121之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:127之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:128之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (15) CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (16) CDR1，其包含SEQ ID NO:132之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:133之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:134之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； (17) CDR1，其包含SEQ ID NO:135之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:136之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:137之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；或 (18) CDR1，其包含SEQ ID NO:138之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體； CDR2，其包含SEQ ID NO:139之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:140之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變異體。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含： (1)   CDR1，其包含SEQ ID NO:10之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:11之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:12之胺基酸序列； (2)   CDR1，其包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:14之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列； (3)   CDR1，其包含SEQ ID NO:16之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:17之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列； (4)   CDR1，其包含SEQ ID NO:19之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:20之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:21之胺基酸序列； (5)   CDR1，其包含SEQ ID NO:22之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:23之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:24之胺基酸序列； (6)   CDR1，其包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:26之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列； (7)   CDR1，其包含SEQ ID NO:28之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:30之胺基酸序列； (8)   CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列； (9)   CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列；或 (10) CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列。
  5. 如請求項4之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含： (1)   CDR1，其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:32之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列； (2)   CDR1，其包含SEQ ID NO:34之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列；或 (3)   CDR1，其包含SEQ ID NO:129之胺基酸序列； CDR2，其包含SEQ ID NO:130之胺基酸序列；及 CDR3，其包含SEQ ID NO:131之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分係經駱駝化、嵌合化、人類或人類化的。
  7. 如請求項6之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分係經人類化的。
  8. 如請求項6或7之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分進一步包含以下：FR1，其具有SEQ ID NO:37、38、39或141之胺基酸序列；FR2，其具有SEQ ID NO:40、41、42、142或143之胺基酸序列；FR3，其具有SEQ ID NO:43、44或144之胺基酸序列；及/或FR4，其具有SEQ ID NO:145、146或147之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含具有SEQ ID NO:1至9、45至53、99至101、103至115、149及150中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域；或其與SEQ ID NO:1至9、45至53、99至101、103至115、149及150中之任一者具有至少約80%序列一致性之變異體。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含具有SEQ ID NO:1至9、45至53、114及115中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含具有SEQ ID NO:45至53、114及115中之任一者之胺基酸序列之重鏈可變域。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗白蛋白構築體，其中該sdAb部分包含具有SEQ ID NO:52、114或115之胺基酸序列之重鏈可變域。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗白蛋白構築體，其中該白蛋白為人類血清白蛋白、恆河猴血清白蛋白、獼猴血清白蛋白及鼠類血清白蛋白。
  14. 如請求項1至13中任一項之抗白蛋白構築體，其中該白蛋白為人類血清白蛋白。
  15. 如請求項14之抗白蛋白構築體，其中該人類血清白蛋白具有SEQ ID NO:54、55、56或57之胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項之抗白蛋白構築體，其中該構築體在約pH 7下以約10-6 M至約10-10 M範圍內之K D 結合於該白蛋白。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗白蛋白構築體，其中該構築體在約pH 5.5下以約10-6 M至約10-10 M範圍內之K D 結合於該白蛋白。
  18. 如請求項1至17中任一項之抗白蛋白構築體，其進一步包含第二多肽部分。
  19. 如請求項18之抗白蛋白構築體，其中該第二多肽部分之C 端與該sdAb部分之N 端融合。
  20. 如請求項18之抗白蛋白構築體，其中該第二多肽部分之N 端與該sdAb部分之C 端融合。
  21. 如請求項18至20中任一項之抗白蛋白構築體，其中該第二多肽部分經由肽連接子與該sdAb部分融合。
  22. 如請求項21之抗白蛋白構築體，其中該肽連接子為可裂解的。
  23. 如請求項21或22之抗白蛋白構築體，其中該肽連接子包含SEQ ID NO:73至91中之任一者之胺基酸序列。
  24. 如請求項21之抗白蛋白構築體，其中該肽連接子為不可裂解的。
  25. 如請求項21或24之抗白蛋白構築體，其中該肽連接子包含SEQ ID NO:58至72中之任一者之胺基酸序列。
  26. 如請求項18至25中任一項之抗白蛋白構築體，其中該第二多肽部分包含抗原結合部分。
  27. 如請求項26之抗白蛋白構築體，其中該抗白蛋白構築體經由該抗原結合部分結合於腫瘤抗原。
  28. 如請求項27之抗白蛋白構築體，其中該腫瘤抗原為間皮素、GPA33、Her-2、EGFR或CD20。
  29. 如請求項27或28之抗白蛋白構築體，其中該腫瘤抗原為間皮素。
  30. 如請求項27至30中任一項之抗白蛋白構築體，其中該抗原結合部分包含單域抗體部分，該單域抗體部分包含以下：CDR1，其包含SEQ ID NO:92或95之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO:93或96之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO:94或GRY之胺基酸序列。
  31. 如請求項27之抗白蛋白構築體，其中該腫瘤抗原為CEA、MUC16、MUC1、AFP、EPCAM、CD19、CD21、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、PSMA或BCMA。
  32. 如請求項18至25中任一項之抗白蛋白構築體，其中該第二多肽部分包含細胞介素或其片段之胺基酸序列。
  33. 如請求項32之抗白蛋白構築體，其中該細胞介素為IL-7、IL-15、IL-21、IL-22或IL-33；或其片段。
  34. 如請求項32或33之抗白蛋白構築體，其中該細胞介素為IL-7、IL-15或IL-21；或其片段。
  35. 如請求項32至34中任一項之抗白蛋白構築體，其中該細胞介素為IL-7。
  36. 如請求項32至34中任一項之抗白蛋白構築體，其中該細胞介素為IL-15。
  37. 如請求項1或36之抗白蛋白構築體，其具有SEQ ID NO:101之胺基酸序列。
  38. 如請求項32至34中任一項之抗白蛋白構築體，其中該細胞介素為IL-21。
  39. 如請求項1或38之抗白蛋白構築體，其具有SEQ ID NO:99、100、149或150之胺基酸序列。
  40. 如請求項18至25中任一項之抗白蛋白構築體，其中該第二多肽部分包含細胞介素受體或其片段之胺基酸序列。
  41. 如請求項36之抗白蛋白構築體，其中該細胞介素受體為IL-15Rα。
  42. 如請求項1或41之抗白蛋白構築體，其具有SEQ ID NO:103或104之胺基酸序列。
  43. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至42中任一項之抗白蛋白構築體及醫藥學上可接受之賦形劑。
  44. 如請求項43之藥物組合物，其中該醫藥組合物呈單一劑型形式。
  45. 如請求項43或44之藥物組合物，其中該醫藥組合物為固體。
  46. 如請求項43或44之藥物組合物，其中該醫藥組合物呈非經腸劑型形式。
  47. 如請求項46之藥物組合物，其中該醫藥組合物呈靜脈內劑型形式。
  48. 如請求項43、44、46及47中任一項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為溶液。
  49. 一種方法，用於治療、預防或改善個體中之癌症之一或多種症狀，該方法包含向該個體投與治療有效量之如請求項1至42中任一項之抗白蛋白構築體或如請求項42至48中任一項之醫藥組合物。
  50. 如請求項49之方法，其中該癌症為胃癌瘤或肺鱗狀癌瘤。
  51. 如請求項49或50之方法，其中該個體為人類。
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