TW202033766A - 一種人白細胞介素１０變體及其衍生物 - Google Patents

Abstract

本公開涉及一種人白細胞介素10變體及其衍生物。具體而言，本公開涉及具有一個或多個胺基酸突變的人白細胞介素10及其PEG化衍生物，這些突變增加了蛋白的穩定性和/或提高了人白介素10的細胞增殖活性，為蛋白的成藥性提供了良好的基礎。

Description

一種人白細胞介素10變體及其衍生物

本申請要求2018年11月26日提交的中國專利申請《一種人白細胞介素10變體或其衍生物》(申請號CN201811418270.9)的優先權，其內容藉由引用併入此處。

本公開涉及具有一個或多個胺基酸突變的人白細胞介素-10變體或其衍生物，該突變使得人白細胞介素-10具有增強的穩定性和/或活性。

人白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)，其基因位於1號染色體(q31-32)，共5.1kb長。IL-10的基因序列包含5個外顯子。IL-10由178個胺基酸殘基組成，構成“V”字型的同型二聚體，分子量約35kD。

IL-10屬於IL-10家族，家族成員包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22/IL-TIF、IL-24/MDA-7、IL-26等。

Fiorentino最初在1989年發現，IL-10是由鼠輔助性T細胞Th2亞型細胞分泌的一種細胞因子，能抑制Th1亞型細胞分泌的腫瘤 壞死因子γ(TNF-γ)等細胞因子，所以最初被命名為細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)。IL-10增強抗炎性因子的釋放，如IL-1受體拮抗劑和溶解性TNF-α受體；IL-10抑制1型輔助T細胞產生的幾種細胞因子(例如γ-干擾素、IL-2和TNF-α)的合成，抑制細胞介導的免疫應答調節劑，並抑制抗原呈遞細胞依賴性T細胞應答，抑制單核細胞/巨噬細胞產生的其它細胞因子，例如IL-1、IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)和TNF-α；IL-10抑制IL-12的合成，從而阻礙Th1免疫反應。

IL-10通常在T細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞、肥大細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞、角質形成細胞、上皮細胞以及各種腫瘤中表達，其參與多種細胞(如免疫細胞、炎症細胞、腫瘤細胞)的生物調節。

由於IL-10的多效活性，已對其進行多種臨床應用的研究，包括自身免疫性疾病、嚴重感染性疾病、腫瘤及移植免疫等。

目前已有的IL-10包括單-或雙-聚乙二醇化的IL-10，該IL-10可以是PEG化的(WO2002/026265；WO2010/077853)。PEG化的IL-10可用作藥物治療腫瘤或癌症，該腫瘤為上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑素瘤、肉瘤或畸胎癌，或用於治療肺部腫瘤或轉移性肺癌，或淋巴瘤(WO2008/054585；EP2468293B；EP2821078B)；以及可藉由給予患者有效量的PEG化的IL-10、葉酸類似物、5-FU和鉑類藥物治療腫瘤(US9833514B)。IL-10還可以用於治療或預防心血管病症、血栓性病症或炎性病症，或高血脂(WO2015/031316；US20160193300A)。IL-10還可以與免疫檢查點抑制 劑(如PD-1)或IL-15聯合治療或預防癌症或腫瘤(WO2015/070060；WO2017/035232)。IL-10還可治療肝病，如非酒精性脂肪肝、丙肝(WO2015/187295；WO2015/108785)。IL-10可以與IL-7聯合治療病症(WO2016/196211)，以及與CAR-T細胞一起調節T細胞介導的免疫應答(WO2016/191587)。

已有的IL-10突變研究顯示，S51、E81、K88、A120等位置引入半胱胺酸，可獲得具有免疫抑制活性而沒有免疫刺激活性的IL-10(WO2004/044006)。I87A位置的突變使得IL-10與其受體的結合親和力降低(WO2015/117930)。F129S位置的突變能保留IL-10的抗炎特性，但不保留血小板細胞調節和細胞增殖活性(WO2006/130580)。Q62R、K58E、E160Q、D162H的突變使得IL-10與受體結合和功能活性降低，同時保持免疫原性(WO2012/135177)等。Ding Y等人指明IL-10的免疫刺激活性是由第87位的單一胺基酸異亮胺酸決定的(J.Exp.Med.191(2),213-223，2000)。WO2012146628A1公開了一種抗體和IL-10的融合蛋白，其中將第87位的胺基酸替代為I87A，發現經改造的融合蛋白展現降低的對IL-10受體的親和力，但是改善了靶向效率、降低了由IL-10免疫刺激活性所引起的副作用。然而，現有技術中仍然缺少具有更高穩定性、更高活性的IL-10變體。提供這樣的IL-10變體，是本領域中亟需解決的問題。

本公開涉及人白介素10(IL-10)序列具有一個或多個胺基酸突變的變體或其衍生物。

第一方面，本公開提供IL-10變體，其是在野生型人IL-10序列(SEQ ID NO：2)的第10位天冬醯胺(N)或/和第39位甲硫胺酸(M)或/和第92位天冬醯胺(N)位點上，將野生型胺基酸殘基突變為其它胺基酸，其中該位點按人野生型IL-10的成熟蛋白進行編號。該變體相較於野生型人IL-10具有提高的穩定性和/或活性。

一些實施方案中，該IL-10變體或其衍生物包含第10位突變為Gln(Q)和/或第39位突變為Thr(T)和/或第92位突變為Gln(Q)。

一些具體實施方案中，IL-10變體包含第10位Asn突變為Gln(N10Q)和/或第39位是Met突變為Thr(M39T)和/或第92位是Asn突變為Gln(N92Q)；或包含選自以下的組合：N10Q和M39T、M39T和N92Q、N10Q和M39T和N92Q。

一些具體實施方案中，IL-10變體或其衍生物可以包含選自以下序列所示的多肽：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14。該胺基酸序列如下表所示。

表1. 人白介素10野生型及變體序列

本公開中，IL-10變體的衍生物包括涉及本公開IL-10變體的全長、部分蛋白或在該變體的基礎上進一步突變獲得的突變蛋白、功能性衍生物、功能性片段、生物活性肽、融合蛋白、同種型或其鹽。

一些具體實施方案中，IL-10變體衍生物包括IL-10變體的融合蛋白、IL-10變體的截短體、及包含該截短體的融合蛋白、IL-10變體的單體或二聚物或三聚物或多聚物、經修飾的IL-10變體(如聚乙二醇化(PEG化)、糖基化、白蛋白綴合或融合、羥乙基化、與抗體或其抗原結合片段融合)、以及IL-10變體在各物種中的同源物。

一些實施方案中，與IL-10變體融合的抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或駱駝抗體或其抗原結合片段。一些具體的實施方案中，抗原結合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、單鏈Fv(sFv)、VHH或VH/VL結構域。

一些實施方案中，IL-10變體或衍生物是IL-10的同二聚體，每一個單體包含178個胺基酸，其中的前18個胺基酸為信號肽。一些具體實施方案中，包括缺少信號肽的成熟IL-10(如US6217857中的)的變體，或成熟的PEG化IL-10的變體。該變體可展示與野生型人IL-10相當或比其優越的活性。該變體可展示比與野生型人IL-10相當或比其高的穩定性。因而，技術人員能夠理解，根據本公開的IL-10變體或其衍生物可以不含信號肽，而(統計學意義上)不改變期望的活性，作為非限制 性示例，在選自以下序列的基礎上去除信號肽：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14。

一些實施方案中，IL-10變體或其衍生物可以是經修飾的，以調節一個或多個性質(例如，藥物代謝動力學參數、功效等)，包括其可以是單體或二聚物或三聚物的形式，和/或是PEG化的，和/或糖基化的，和/或白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA))綴合和融合，和/或羥乙基化(hesylation)的。該IL-10的修飾不會導致對免疫原性的治療相關的不利影響，並且在部分實施方案中，經修飾的IL-10可以比未修飾的IL-10的免疫原性低。

在一些實施方案中，IL-10變體或衍生物是PEG化的(表示為PEG-IL-10)，例如是單或雙PEG化的IL-10變體或衍生物。PEG-IL-10變體或衍生物包括SC-PEG連接基。在另一些實施方案中，PEG-IL-10變體或衍生物包括甲氧基-PEG-醛(mPEG-ALD)連接基。在某些實施方案中，PEG部分的平均分子量在約5KD至約50KD，具體地5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50KD；或約5KD至約40KD，或約10KD至約30KD，或約10KD至約20KD之間，或約10KD至約15KD之間。某些具體實施方案中，mPEG-ALD連接基包括具有選自下列平均分子量的PEG分子：5KDa、12KDa或20KDa。在某些實施方案中，mPEG-ALD的醛基可以是乙醛、丙醛或丁醛等。

具有10位和/或39位和/或92位突變的IL-10變體相對於野生型IL-10具有提高的穩定性和/或活性。這些突變減少或防止了IL-10的脫氨和氧化，增加了蛋白的穩定性同時細胞增殖活性不降低或提高了細 胞增殖活性，為蛋白成藥提供了良好的基礎。一些具體方案中，該變體包含N10Q/M39T或M39T/N92Q或N10Q/M39T/N92Q的組合。

第二方面，提供分離的核酸分子，其編碼本公開IL-10變體或其衍生物。該核酸分子可以包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13所示的多核苷酸。

一些實施方案中，提供含有上述核酸分子的表達載體。

一些實施方案中，提供表達上述載體的宿主細胞。該宿主細胞可以是原核或真核細胞。一些具體實施方案中，宿主細胞為細菌或酵母菌或哺乳動物細胞(例如CHO、COS、BHK21、NIH3T3、HeLa、C2C12、HEK)，例如，為巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母。宿主細胞不包含能夠發育成植株的細胞，不涉及人受精卵、人生殖細胞，也不涉及能夠發育成動物的細胞。

第三方面，提供一種醫藥組成物，其包含本公開IL-10變體或其衍生物，其含有：

- 根據本公開的IL-10變體或其衍生物，和

- 視需要，可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。

在一些實施方案中，該醫藥組成物的單位劑量含有1mg至1000mg根據本公開的IL-10變體或其衍生物。在一些實施方案中，該醫藥組成物中的IL-10變體或其衍生物的濃度為1mg/L至1000mg/L。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有緩衝劑，其含量可以為1mM至1000mM。在一些實施方案中，該醫藥組成物可以為凍乾製劑或可注射溶液。

第四方面，提供本公開的IL-10變體或其衍生物或其醫藥組成物用於製備治療增生性疾病、免疫性疾病、心血管病症、血栓性病症、高血脂症、炎性病症、肝病、調節T細胞介導的免疫應答的藥物中的用途。

一些實施方案中，增生性疾病可以是腫瘤或癌，例如上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、肉瘤或畸胎癌、肺部腫瘤或轉移性肺癌、淋巴瘤、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、惡性膠質瘤和白血病。

一些實施方案中，免疫性疾病是糖尿病，例如是胰島素依賴型糖尿病。

一些實施方案中，心血管病症為動脈粥樣硬化、高血壓、心肌病。

一些實施方案中，血栓性病症是可以引起中風或心肌梗塞的病症。

一些實施方案中，炎性病症可以為脈管炎。

一些實施方案中，肝病可以為非酒精性脂肪肝或C型肝炎。

一些實施方案中，腫瘤或癌是子宮癌、宮頸癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、陰莖癌、胃腸道癌，例如食道癌、口咽癌、胃癌、小或大腸癌、結腸癌或直腸癌、腎癌、腎細胞癌、膀胱癌、骨骼癌、骨髓癌、皮膚癌、腦或頸癌、皮膚癌、肝癌、膽囊癌、心臟癌、肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌、甲狀腺癌、腦癌(例如神經膠質瘤、神經節、中樞神經系統(CNS)和周圍神經系統(PNS))和免疫系統(例如脾或胸腺)。腫瘤或癌還可以是免疫原性腫瘤、非免疫原性腫瘤、休眠腫瘤、 病毒引起的癌例如上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒、腺癌、淋巴瘤、癌腫、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化學引起的癌、轉移病變和血管生成的方法。

第五方面，提供一種抑制或降低腫瘤或癌的生長和/或治療患有癌或腫瘤的患者的方法，該方法包括使受試者與有效量的本公開的IL-10變體或衍生物接觸。該IL-10變體或衍生物可以抑制腫瘤或癌的生長，或該IL-10變體或衍生物可以降低腫瘤或癌的大小。例如，藉由調節調控T細胞(Treg)和/或CD8+T細胞的活性，預計本公開的IL-10變體或衍生物還可以降低對腫瘤細胞或癌細胞抗原的耐受性。

一些實施方案中，當與非PEG化的IL-10變體或衍生物相比時，PEG化的IL-10變體或衍生物可以提高CD8+T細胞進入靶標(例如贅生物、病灶)的滲透性。在另一些實施方案中，PEG化的IL-10變體或衍生物可以提高至少一種炎性細胞因子的表達，其可以選自IFN γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-配體(RANK-L)。在某些實施方案中，PEG化的IL-10變體或衍生物是與至少一種化學治療劑共同給予的。化學治療劑可以在給予PEG化的IL-10變體或衍生物之前、與其同時、或在其之後給予。

一些實施方案中，被治療的患者或受試者是人。

一些實施方案中，每日至少2次、每日至少1次、每48小時至少1次、每72小時至少一次、每週至少一次、每2週至少一次、每個月至少一次、每2個月至少一次或每3個月至少一次向受試者施用IL-10變體或衍生物的方法。可藉由任何有效途徑施用IL-10變體或衍生物，例如，藉由腸胃外注射(包括皮下注射)施用IL-10。具體實施方案涉及包含藥學上可接受的量的IL-10變體或衍生物(例如，治療有效量)連同 一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑(例如，等滲注射溶液)的醫藥組成物。該醫藥組成物通常為適於人施用的醫藥組成物。此外，在一些實施方案中，該醫藥組成物包含至少一種另外的預防劑或治療劑。一些實施方式含有：上述醫藥組成物之一、視需要地一種或多種另外的組分、以及無菌容器。

第六方面，提供了一種製備IL-10變體或衍生物的方法，包括：

- 向野生型人IL-10中引入選自以下的突變：N10Q和M39T、M39T和N92Q、N10Q和M39T和N92Q；或

- 使前述核酸分子進行表達；或

- 使前述表達載體進行表達；或

- 使前述宿主細胞進行表達。

第七方面，提供PEG化IL-10變體或其衍生物結構及其製備方法。

一些實施方案中，提供單PEG化IL-10變體或其衍生物，其包含：

藉由接頭，共價連接至IL-10變體或其衍生物的一個PEG分子。PEG可與IL-10變體或其衍生物的賴胺酸殘基或N端胺基酸殘基連接。一些具體實施方案中，該IL-10變體或其衍生物為同二聚體，20KD或12KD的單PEG連接至同二聚體的單體之一。

另一些實施方案中，提供雙PEG化IL-10變體或其衍生物，其包含：

藉由接頭，共價連接至IL-10變體或其衍生物的兩個PEG分子。PEG可與IL-10變體或其衍生物的賴胺酸殘基或N端胺基酸殘基連接。一些具 體實施方案中，該IL-10變體或其衍生物為同二聚體，20KD或12KD的單PEG分別連接至同二聚體的兩個單體。

一些實施方案中，PEG-IL-10變體或衍生物的結構如下：

[XO-(CH₂CH₂O)_n]_b-L-NH-IL-10變體或衍生物，

其中，X是H或C_1-4烷基，n是20至2300，b是1至9，L是α-π烷基連接體(也作接頭)，L共價連接在IL-10變體或其衍生物的胺基末端，當b大於1時，n的總和不超過2300。一些具體方案中，L是“-CH₂CH₂CH₂-”。

一些具體的實施方案中，PEG結構是CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂CH₂-CHO。

在另一些具體的實施方案中，PEG-丁醛的醛基與IL-10變體或其衍生物的N端甲硫胺酸的胺基成鍵，結構如下：

CH₃O-(CH₂CH₂O)n-CH₂CH₂CH₂-CH₂-NH-IL-10變體或衍生物。

一些實施方案中，提供製備單、雙PEG-IL-10的方法，包括步驟：

在還原劑存在下使IL-10變體或衍生物與活化的PEG-醛接頭接觸，形成單或雙PEG-IL-10，其中單個PEG-醛接頭與IL-10變體或衍生物的一個胺基酸殘基共價連接。

第1圖為IL-10變體及20KD-、12KD-的單、雙PEG化IL-10變體對人原代CD8+T細胞的增殖實驗結果。其中，20KD單PEG化是指綴合有單PEG的IL-10二聚體，該PEG的平均分子量為20KD，綴合至二聚體中的單體之一；20KD雙PEG化是指綴合有兩個PEG的IL-10 二聚體，該PEG的平均分子量為20KD，兩個PEG分別綴和至二聚體中的兩個單體；12KD單PEG化是指綴合有單PEG的IL-10二聚體，該PEG的平均分子量為12KD，綴合至二聚體中的單體之一；12KD雙PEG化是指綴合有兩個PEG的IL-10二聚體，該PEG的平均分子量為12KD，兩個PEG分別綴和至二聚體中的兩個單體。

第2圖為IL-10變體及20KD-、12KD-的單、雙PEG化IL-10變體對人原代CD8+T細胞的激活實驗結果。

第3圖為小鼠皮下給藥後，IL-10變體的血漿濃度結果圖。

第4圖為IL-10變體及其20KD、12KD的單、雙PEG化衍生物抑制CT26小鼠結腸癌移植瘤生長的結果圖。

第5圖為IL-10變體及其20KD、12KD的單、雙PEG化衍生物對CT26小鼠體重影響的結果圖。

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中該。

術語

“衍生物”旨在被廣義地解釋，包括任意IL-10相關的產品。包括但不限於人和非人的IL-10同系物、片段或截短體、融合蛋白(如與信號肽融合或其他活性、非活性成份融合，活性成份例如抗體或其 抗原結合片段)、修飾形式(如PEG化、糖基化、白蛋白綴合/融合、羥乙基化等)、和保守修飾的蛋白等。

“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體包括鼠源抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、駱駝抗體。

“抗原結合片段”，指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、單鏈Fv(即sFv)、奈米抗體(即VHH)、VH/VL結構域。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恒定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。

“保守修飾”適用於胺基酸和核苷酸序列。對於特定的核苷酸序列，保守改性是指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸，或在核苷酸不編碼胺基酸序列的情況下，是指基本上相同的核苷酸序列。對於胺基酸序列，“保守修飾”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員 知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molec μ lar Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。

“PEG化”是指至少一個PEG分子與另一個分子(例如治療性蛋白)連接。例如，批准Adagen(腺苷脫氨酶的PEG化製劑)用於治療嚴重聯合免疫缺陷病。已經顯示，聚乙二醇的連接可以防止蛋白水解作用(參見，例如，Sada等人，(1991)J.Fermentation Bioengineering 71：137-139)。

在最常見形式中，PEG是在一端與羥基連接的直鏈或支鏈聚醚，並且具有下列常規結構：HO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-OH。為了使PEG與分子(多肽、多糖、多核苷酸和小的有機分子)偶聯，可以藉由製備在一個或兩個末端具有官能團的PEG的衍生物來活化PEG。蛋白的PEG綴合的常見途徑是用官能團活化PEG，該官能團適合與賴胺酸和N-末端胺基酸基團的反應。尤其是，參與綴合的常見反應基團是賴胺酸的α或ε胺基。聚乙二醇化連接基與蛋白的反應可導致PEG部分主要在下列位點處的連接：蛋白的N-末端的α胺基、賴胺酸殘基側鏈上的ε胺基、或組胺酸殘基側鏈上的咪唑基。由於大部分重組蛋白質具有單個α和許多ε胺基和咪唑基，可以根據連接基團的化學性質，產生許多位置異構體。

第一代活化單甲氧基PEGs(mPEGs)是琥珀醯亞胺基碳酸酯PEG(SC-PEG；參見例如，Zalipsky等人，(1992)Biotehnol.Appl.Biochem 15：100-114；和Miron和Wilcheck，(1993)Bioconjug.Chem.4：568-569)和苯並三唑碳酸酯PEG(BTC-PEG；參見例如US 5650234)，其優先與賴胺酸殘基反應，形成胺基甲酸酯連接 基，但還已知其與組胺酸和酪胺酸殘基反應。IFN α上的組胺酸殘基的連接基已經被證明是一種水解不穩定的咪唑胺基甲酸酯連接基(參見例如US5985263)。

第二代聚乙二醇化技術是避免不穩定的連接基以及在殘基反應中缺乏選擇性，使用PEG-醛連接基可以藉由還原胺化來靶向多肽的N-末端上的單個位點。可以使用不同類型的連接基和pH值，PEG化IL-10，以得出各種形式的PEG化的分子(參見例如US5252714，US5643575，US 5919455，US5932462，US5985263，US7052686)。

“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“施用”、“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，諸如包含本公開的任一種IL-10變體及其衍生物或包含該變體或衍生物的組合物，該受試者確診患有、疑似患有、易感於一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床不可測量的程度。

有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“化學治療劑”是用於治療贅生性疾病的化合物。化學治療劑的例子包括烷基化劑，例如硫替派和環磷醯胺(CYTOXAN)；烷基磺酸鹽，例如白消安，英丙舒凡(Improsulfan)和保釋芬；氮丙啶，例如苯佐替哌(benzodopa)，卡波醌，美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；氮丙啶和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺，曲他胺，三亞乙基磷醯胺，三亞乙基硫代磷醯胺和三甲基三聚氰胺氮芥例如苯丁酸氮芥(chiorambucil)，萘氮芥，膽磷醯胺(cholophosphamide)，雌莫司汀，異環磷醯胺，二氯甲二乙胺，二氯甲二乙胺氧化物鹽酸鹽，苯丙胺酸氮芥，新氮芥，苯乙酸氮芥膽甾醇酯，松龍苯芥，氯乙環磷醯胺，尿嘧啶氮 芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀，吡葡亞硝脲，福莫司汀，環己亞硝脲，嘧啶亞硝脲，雷莫司汀(Ranimustine)；抗生素，例如阿克拉黴素，納黴素，胺茴黴素(authramycin)，偶氮絲胺酸，博來黴素，放線菌素C，刺孢黴素，去甲柔紅黴素，洋紅黴素，嗜癌黴素，色黴素，放線菌素，柔紅黴素，地托比星，6-重氮基-5-氧代-L-正亮胺酸，多柔比星，表柔比星，依索比星，伊達比星，麻西羅黴素，絲裂黴素，黴酚酸，諾加黴素，橄欖黴素，硫酸培洛黴素，紫菜黴素(potfiromycin)，嘌呤黴素，三鐵阿黴素，羅多比星，鏈黑菌素，鏈脲黴素，殺結核菌素，烏苯美司，新制癌菌素，佐柔比星；抗代謝物例如胺甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸，胺甲喋呤，蝶羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱，阿紮胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氮尿苷，5-FU；雄激素，例如卡普睾酮，屈他雄酮丙酸鹽，環硫雄醇，美雄烷，睾內酯；抗腎上腺藥，例如胺魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；安吖啶；貝司特布司(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙；秋水仙胺；地吖醌；依氟鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨；依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明；丙脒腙；米托蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁；蛋胺氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基異煙醯肼；普魯苄肼；PSK.；丙亞胺；西佐喃；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三乙撐亞胺苯醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；尿烷；去乙醯長春醯胺；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；雙溴丙基哌嗪；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；環磷醯胺；硫替派；紫杉類藥物，例如太平洋紫杉醇(TAXOLBristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他賽(doxetaxel)(Taxotere，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物，例如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；絲裂黴素C；米托蒽醌；長春花新堿；長春瑞賓；溫諾平；諾安托；表鬼臼毒噻吩糖苷；柔毛黴素；胺基蝶呤；希羅達(xeloda)；依班膦酸鹽；CPT11；局部異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸；埃斯培拉黴素(esperamicins)；卡培他濱；和上述任一項的可藥用鹽、酸或衍生物。還包括在該定義中的是對腫瘤發揮調節或抑制激素作用的抗激素藥劑，例如抗雌激素，包括例如它莫西芬，雷諾昔酚，抑制4(5)-咪唑的芳香酶，4-羥基它莫西芬，曲沃昔芬，雷洛西芬(keoxifene)，LY117018，奧那司酮(onapristone)，和枸櫞酸托瑞米芬(fareston)；和抗雄激素，例如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙瑞林，和戈舍瑞林；和上述任一項的可藥用鹽、酸或衍生物。

不論是否與聚乙二醇綴合或非綴合形式，本公開中使用的“白細胞介素-10”或“IL-10”是包含兩個相同的非共價連接形成二體的亞單元的蛋白。除非另有陳述，本文中使用的“白細胞介素-10”和“IL-10”可以指的是人或小鼠IL-10(Genbank Accession Nos.NP 000563；M37897；或US6217857)，還稱其為“hIL-10”或“mIL-10”。

“PEG化的IL-10”或“PEG-IL-10”是具有一個或多個聚乙二醇分子的IL-10分子(無論是單體還是二聚體形式)，聚乙二醇藉由連接基與一個或一個以上IL-10蛋白的胺基酸殘基共價連接，因此該連接是穩定的。

術語“單PEG化的IL-10”和“單-PEG-IL-10”是指一個聚乙二醇分子藉由連接基與IL-10二聚體的亞單元上的單個胺基酸殘基共價連接(而無論IL-10是單體還是二聚體形式)。PEG部分的平均分子量在約5KD至約50KD，或約5KD至約40KD，或約10KD至約30KD，或約10KD至約20KD之間，或約10KD至約15KD之間。對PEG與IL-10連接的方法或位點不做限制性要求，然而技術人員理解PEG與IL-10的連接不應改變(或僅僅最低限度地改變)IL-10變體或衍生物的活性。

本公開全文引入US7052686中所描述的IL-10的PEG化方法和PEG化結構和活性、功能檢測方法，可用於PEG化本公開的IL-10變體並獲得相應PEG化IL-10變體。

“半衰期”或“血清半衰期”是指消除半衰期，即待測物的血清濃度達到其初始或最大值的一半所需要的時間。對於合成藥劑，本公開中使用的術語“半衰期提高”是指合成藥劑比非合成的、內源性的藥劑或其重組產生的形式，以更慢的速度被清除。

實施例

以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。

實施例1：野生型IL-10及變體的構建和表達

1.基因合成及重組表達載體構建

野生型IL-10核酸序列如SEQ ID NO.1所示，在5’端加了一個Nde I酶切位點，在3’端添加了一個BamH I酶切位點。

(SEQ ID NO.1)；

(斜體部分分別是NdeI和BamHI酶切位點)

對應的蛋白序列如下所示：

(SEQ ID NO.2)；

所使用的表達載體是購自Novagen公司的大腸桿菌表達載體pET-9a(Novagen，Cat.69431-3)。IL-10核酸序列合成後，構建重組表達載體，得到野生型IL-10的表達載體。

2.在野生型IL-10胺基酸序列中引入本公開中所限定的胺基酸突變

在一種變體中，10位的天冬醯胺(N)置換成穀胺醯胺(Q)，將其對應的核苷酸序列28-30位處的密碼子AAC變為CAG。突變後的核酸序列如下：

(SEQ NO ID.3)；

其對應的胺基酸序列如下所示，即IL-10-01變體序列：

(SEQ NO ID.4)；

在一種變體中，將39位的甲硫胺酸(M)置換成蘇胺酸(T)，將其對應的核苷酸序列115-117位處的密碼子ATG變為ACC。突變後的核酸序列如下所示：

(SEQ NO ID.5)；

其對應的胺基酸序列如下所示，即IL-10-02變體序列：

(SEQ NO ID.6)；

在一種變體中，將92位的天冬醯胺(N)置換成穀胺醯胺(Q)；將其對應的核苷酸序列274-276位處的密碼子AAC變為CAA。突變後的核酸序列如下所示：

(SEQ NO ID.7)；

其對應的胺基酸序列如下所示，即IL-10-03變體序列：

(SEQ NO ID.8)；

在一種變體中，10位的天冬醯胺(N)置換成穀胺醯胺(Q)，將其對應的核苷酸序列28-30位處的密碼子AAC變為CAG；39位的甲硫胺酸(M)置換成蘇胺酸(T)，將其對應的核苷酸序列115-117位處的密碼子ATG變為ACC。突變後的核酸序列如下所示：

(SEQ NO ID.9)；

其對應的胺基酸序列如下所示，即IL-10-04變體序列：

(SEQ NO ID.10)；

在一種變體中，39位的甲硫胺酸(M)置換成蘇胺酸(T)，將其對應的核苷酸序列115-117位處的密碼子ATG變為ACC；92位的天冬醯胺(N)置換成穀胺醯胺(Q)；將其對應的核苷酸序列274-276位處的密碼子AAC變為CAA。突變後的核酸序列如下所示：

(SEQ NO ID.11)；

其對應的胺基酸序列如下所示，即IL-10-05變體序列：

(SEQ NO ID.12)；

在一種變體中，10位的天冬醯胺(N)置換成穀胺醯胺(Q)，將其對應的核苷酸序列28-30位處的密碼子AAC變為CAG；39位的甲硫胺酸(M)置換成蘇胺酸(T)，將其對應的核苷酸序列115-117位處的密碼子ATG變為ACC；92位的天冬醯胺(N)置換成穀胺醯胺(Q)；將其對應的核苷酸序列274-276位處的密碼子AAC變為CAA。突變後的核酸序列如下所示：

(SEQ NO ID.13)；

其對應的胺基酸序列如下所示，即IL-10-06變體序列：

(SEQ NO ID.14)；

上述變體的基因序列經合成後，與表達載體pET-9a相連，形成重組表達載體。

3．野生型IL-10及變體的重組表達與製備

將上述重組表達載體轉化到從Novagen公司購買的BL21(DE3)菌株(Novagen，Cat.69450-3)，得到野生型IL-10及變體的重組菌，將重組菌塗布在含Kan抗性的LB平板進行篩選。

挑取Kan篩選後的單菌落於10mL LB培養基，37℃，220rpm培養至OD₆₀₀為1.2±0.2，加入50%甘油至終濃度為10%，分裝至凍存管中(1mL/管)，保存於-80℃。

取凍存的甘油管1支，於37℃水浴中復蘇，接種至1L LB培養基中，37℃，220rpm培養至OD₆₀₀為0.6至1.0，加入1M IPTG使其終濃度為1mM，37℃，220rpm誘導培養4h。誘導結束後，收集菌體。

菌體經破碎，包涵體變性、復性、純化獲得目的蛋白。

實施例2：野生型IL-10及變體的穩定性研究

野生型IL-10樣品(緩衝體系為10mM Tris-HCl，pH7.4)，置於37℃，進行穩定性研究，藉由液質聯用對取樣繪製肽圖，分析降解情況。

檢測方法：取樣品0.2mL加入0.2mL變性溶液(8mol/L鹽酸胍，0.2mol/L Tris-HCl，pH7.5)，加入5μl 1mol/L DTT(二硫蘇糖醇)混勻，25℃水浴1h。然後加入30μl 0.5mol/L IAM(碘乙醯胺)25℃水浴1h。經PD-10管柱將樣品置換在酶解緩衝液(50mmol/L碳酸氫銨，1mol/L鹽酸胍，pH8.0)中。取置換緩衝液後的樣品0.4mL加入 40μg V8蛋白酶，25℃水浴18h，加鹽酸終止反應，藉由液質聯用繪製肽圖。

檢測結果發現，含有N10和M39的片段出現降解。

在變體研究的過程中，考察了分別含有N10Q和M39T突變位點的兩個變體的穩定性。取樣檢測降解情況，方法同野生型IL-10。結果見表2。實驗結果表明，N10和M39位點的突變分別降低了兩個位點所在片段的脫氨和氧化情況，說明突變體比野生型更加穩定，符合設計預期。

表2. IL-10變體的穩定性結果

其中，D代表天。

實施例3：野生型IL-10及變體的活性測定

在不同IL-10的濃度下，其細胞依賴株MC-9(Master Cell-9)細胞存活率不同，以此檢測IL-10的生物學活性。

基礎培養液：DMEM(高糖)+10%FBS+1%P/S(青鏈黴素)+0.05mM beta ME；

完全培養基：DMEM+10%FBS+ 1%P/S(青鏈黴素)+5ng/mL的mIL-4+2.5ng/mL hIL-10+0.05mM beta ME(beta-巰基乙醇)；

MTT溶液：稱取MTT 0.1g，加無菌PBS(磷酸鹽緩衝液，PH7.4)溶解並稀釋至20mL，經0.22μm濾膜過濾除菌；

裂解液：15%十二烷基硫酸鈉溶液。

對照品溶液的製備：取重組人白介素-10對照品，用基礎培養液(含30ng/mL的mIL-4)稀釋至每1mL含30ng。在96孔細胞培養板中，做3倍系列稀釋，共8個梯度，每個稀釋度做2孔。每孔分別留50μL溶液，棄去孔中多於溶液，以上操作均在無菌條件下進行。

待測樣品溶液的製備：取重組人IL-10待測樣品，用基礎培養基(含30ng/mL的mIL-4)稀釋成每1mL含30ng。在96孔板細胞培養板中，做3倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個稀釋度2孔。每孔分別留50μL待測樣品溶液，棄去孔中多餘溶液，以上操作在無菌條件下進行。

IL-10活性測定方法：MC-9細胞用完全培養液於37℃、5%二氧化碳條件下培養至足夠量；離心收集MC-9細胞，用DMEM培養液洗滌3次；重新懸浮於基礎培養液中配製成每1mL含5.0×10⁵個細胞的細胞懸液；於37℃、5%二氧化碳條件下備用。在加有標準品溶液和待測樣品溶液的96孔板細胞培養板中，每孔加入細胞懸液50μl，於37℃、5%二氧化碳條件下培養42至48小時；然後每孔加入MTT溶液20μl，於37℃、5%二氧化碳條件下培養4-6小時後，每孔加入裂解液150μl，於37℃、5%二氧 化碳條件下保溫18-24小時，以上操作均在無菌條件下進行。混勻細胞板中的液體，放入酶標儀，以630nm為參比波長，在波長570nm處測定吸光度，記錄測定結果。

數據採用計算機程序或四參數回歸計算法進行處理，並按下式進行計算結果：待測樣品的相對生物學活性(%)=對照品EC₅₀/待測樣品EC₅₀(EC₅₀：半最大效應濃度)。

實施例1中突變體的活性數據見表3。

表3. IL-10野生型及其變體的活性

實施例4：PEG化的IL-10變體的製備

1.所使用的實驗儀器均為常規，如：

細胞活力分析儀(Cellometer，型號NC200)；流式細胞儀(Invitrogen，型號Attune NxT)。

2.所使用的材料均為常規，如：

DMEM、FBS、RPMI1640(均購自Gibco)；Trypsin-EDTA(0.25%)、CellTrace^TM Violet(均購自Invitrogen)；DMSO(購自Sigma)；Rat T-STIM(購自Becton Dickenson)；IL-4(購自Peprotech)；CellTiter-Glo(購自Promega)；Pen-Strep(購自Gibco)；FITC鼠抗人CD8、Alexa Fluor® 647鼠抗人顆粒酶(Granzyme)B、人IL-10 ELISA KIT2(均購自BD)；Fc受體封閉劑(Human TruStain FcX)、抗鼠CD20抗體(均購自biolegend)；ImmunoCult^TM人CD3/CD28 T細胞激活劑、EasySep人CD8+ T細胞分離試劑盒(均購自Stemcell)；Brefeldin A溶液，透化緩衝液(10×Permeabilization Buffer)，IC固定緩衝液(均購自eBioscience)；PMBC(購自Schbio)。

3．IL-10變體的PEG修飾

- 取IL-10野生型或其變體，蛋白濃度為3-4mg/mL，所處的緩衝體系為50mM PB/0.1M NaCl，pH 6.0-6.3；

- 向IL-10溶液中加入濃度為2mM的mPEG-丁醛水溶液，mPEG丁醛的物質的量為IL-10量的1倍，攪拌均勻；

- 向反應體系中加入500mM的氰基硼氫化鈉水溶液，使其終濃度為15mM；

- 25℃攪拌反應約16小時後，加入濃度為1M的甘胺酸水溶液終止反應，甘胺酸的終濃度為30mM。

上述過程中，PEG-丁醛的醛基與IL-10的N端甲硫胺酸的胺基成鍵。

4．PEG化-IL-10變體的純化

PEG化反應終止後，將反應體系對10mM Tris-HCl pH8.7緩衝液進行置換，開始層析純化。

純化用填料為Q sepharose^TM High Performance(GE lifescience)；

純化所用緩衝液：緩衝液A為10mM Tris-HCl pH8.7，緩衝液B為10mM Tris-HCl/0.5M NaCl pH8.7。

平衡：緩衝液B先用高鹽預平衡，緩衝液A再平衡，待紫外、電導、pH均穩定，將紫外歸零，150cm/h；

上樣：樣品過濾後上樣，150cm/h，載量1-2mg/mL；

梯度沖提參數：0-20% B，梯度沖提，20CV，75cm/h；出峰後收集目的蛋白峰。RP-HPLC和SE-HPLC檢測目的蛋白純度。經檢測獲得了PEG化的IL-10變體。

實施例5：MC-9細胞增殖實驗

實驗方法參考實施例3，結果如表4所示。

表4. IL-10的MC-9細胞增殖實驗

結果顯示，未修飾的IL-10突變體IL-10-06及其PEG化後的樣品均能不同程度促進MC-9細胞的增殖。

實施例6：CD8+T細胞增殖及顆粒黴素釋放實驗

1.實驗步驟：將凍存的PBMC用EasySep Human CD8+T細胞分離試劑盒負選得到CD8+T細胞，加入CD3/CD28 T細胞激活劑(25ul/1E6 cells/mL)培養48小時後離心收集CD8+T細胞。調整T細胞密度為2.5E6細胞/mL，種入96孔板中，每孔200μl培養液，培養液為1640含有1%青黴素-鏈黴素和10%FBS，再加入不同濃度的IL-10待測樣品培養72小時。在CD8+T細胞增殖實驗中，直接加入Cell Titer-Glo後測定活細胞數目。結果見第1圖所示。

2.在顆粒黴素釋放實驗中，在用流式檢顆粒黴素釋放前，在IL-10作用72小時後的CD8+T細胞中加入蛋白轉運抑制劑Brefeldin A溶液和CD3/CD28 T細胞激活劑，作用16小時。收集CD8+T細胞；按細胞內染色方法兩步法依次用FITC鼠抗人CD8和Alexa Fluor® 647鼠抗人顆粒酶B標記細胞，流式檢測；結果以CD8陽性的T細胞顆粒酶B流式MFI值作為細胞激活指標。IL-10促進CD8+T細胞顆粒黴素釋放的EC₅₀值用如上公式I的四參數logit方法。結果見第2圖所示。

結果顯示，由於IL-10受體只在活化的CD8細胞上表達，因此本實施例將人的CD8+T細胞激活後，加入IL-10作用。由第1圖可知，未修飾的IL-10突變體IL-10-06及其PEG化衍生物均能不同程度地，劑量依賴性地促進活化CD8+T細胞的增殖。

此外，IL-10不僅能促進活化CD8+T細胞的增殖，並且能促進CD8+T細胞的功能，如顆粒黴素的釋放。第2圖中，未修飾的IL-10 突變體IL-10-06能刺激CD8+T細胞分泌顆粒黴素，EC₅₀為1.63ng/mL，PEG化IL-10-06均能劑量依賴地促進人CD8+T細胞分泌顆粒黴素。其中，20KD-單PEG-IL-10-06的EC₅₀為16.1ng/mL；20KD-雙PEG-IL-10-06的EC₅₀為105ng/mL；12KD-單PEG-IL-10-06的EC₅₀為13.7ng/mL；20KD-雙PEG-IL-10-06的EC₅₀為33.4ng/mL。

實施例7：小鼠體內藥物代謝動力學實驗

實驗步驟：6-8週C57BL/6小鼠，雄性(上海靈暢生物科技有限公司)，小鼠的飼養環境為SPF級別。環境溫度控制在20-26℃，濕度40-70%，12小時黑暗和12小時光照，小鼠自由取食(標準飼料)和飲水。隻有經過健康檢查合格的動物將用於本實驗。

皮下給予60微克IL-10樣品，分別在給藥前和給藥後4、8、24、48、72、96和120小時取血加入肝素鈉抗凝血，立即存入-80度冰箱。所有血漿收集完成後用ELISA的方法分別檢測小鼠血漿內的IL-10含量。結果如第3圖所示。

第3圖中，未修飾的IL-10-06體內半衰期很短，給藥24小時後，血漿中的IL-10已經低於檢測限，而PEG化可以顯著延長IL-10-06體內半衰期，其中12KD-單PEG-IL-10-06體內半衰期是7.9小時，12KD-雙PEG-IL-10-06體內半衰期是10.5小時，20KD-單PEG-IL-10-06單修飾體內半衰期9.37小時。

實施例8：小鼠結腸癌CT-26細胞皮下同種移植腫瘤模型在BALB/c小鼠的體內藥效

實驗步驟：小鼠結腸癌CT-26細胞(CT-26-C2，ATCC)，培養條件為RPMI1640培養基中加10%胎牛血清，37ºC 5% CO₂孵箱培養。當細胞飽和度為80%-90%，數量到達要求時，收取細胞，計數。0.1mL(0.3×10⁶個)CT-26細胞皮下接種於每隻小鼠的右後背皮下(BALB/c小鼠，雌性，6-8週齡，購自上海靈暢生物科技有限公司)。小鼠的飼養環境為SPF級別。環境溫度控制在20-26℃，濕度40-70%，12小時黑暗和12小時光照，小鼠自由取食(標準飼料)和飲水。只有經過健康檢查合格的動物將用於本實驗。當小鼠腫瘤平均體積達到約0-100mm³時開始分組給藥。為了防止小鼠產生抗人IL-10的抗體從而拮抗其抗腫瘤活性，在正式給藥前24小時給予每隻小鼠200μg小鼠CD20抗體。然後一天兩次皮下給予不同濃度的待測樣品。觀測19天，每週兩次測量腫瘤體積及小鼠體重的變化。結果如第4圖和第5圖所示。

結果顯示，給予PEG化的IL-10-06 19天後能夠抑制CT26小鼠結腸癌移植瘤的生長。其中12KD雙PEG-IL-10-06 0.1mpk給藥組瘤體積比對照組小鼠瘤體積(T/C)為61.4%，12KD雙PEG-IL-10-06 0.3mpk，給藥19天後T/C值為83.6%，六隻小鼠中一隻小鼠的腫瘤完全消退。20KD單PEG-IL-10-06 0.1mpk，給藥19天後T/C值為49.93%，20KD單PEG-IL-10-06 0.3mpk，給藥19天後T/C值為18.72%，其中6隻小鼠中3隻小鼠腫瘤完全消退。但是未PEG修飾的IL-10-06在給藥10天左右有抑制腫瘤的趨勢，但是在給藥19天後，T/C為102.9%，並無抗腫瘤活性。

對照組小鼠和IL-10-06給藥組在給藥期間體重持續上升(第5圖)，可能由於腫瘤的持續生長造成的體重增長。在12KD雙PEG-IL10-06和20KD單PEG-IL10-06給藥組體重增長程度較弱，可能是 腫瘤生長被抑制造成的。並且給藥組在給藥後19天與給藥前相比，並未出現明顯的體重下降，提示給藥組並未產生難以耐受的毒副作用。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司 上海盛迪醫藥有限公司

<120> 一種人白細胞介素10變體及其衍生物

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> 野生型IL-10核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 1

<210> 2

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> 野生型IL-10胺基酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> IL-10-01核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 3

<210> 4

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> IL-10-01胺基酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> IL-10-02核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 5

<210> 6

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> IL-10-02胺基酸序列

<400> 6

<210> 7

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> IL-10-3核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 7

<210> 8

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> IL-10-03胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> IL-10-4核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 9

<210> 10

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> IL-10-04胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> IL-10-5核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 11

<210> 12

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> IL-10-05胺基酸序列

<400> 12

<210> 13

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(498)

<223> IL-10-6核苷酸序列，5’端帶Nde I酶切位點，3’端帶BamH I酶切位點

<400> 13

<210> 14

<211> 161

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(161)

<223> IL-10-06胺基酸序列

<400> 14

Claims (34)

1. 一種IL-10(人白細胞介素10)變體或其衍生物，其在選自以下的一個或多個位點上包含胺基酸突變：第10位、第39位、第92位。
2. 如申請專利範圍第1項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，在第10位上的胺基酸殘基突變為穀胺醯胺殘基Q。
3. 如申請專利範圍第1項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，在第39位上的胺基酸殘基突變為蘇胺酸殘基T。
4. 如申請專利範圍第1項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，在第92位上的胺基酸殘基突變為穀胺醯胺殘基Q。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的IL-10變體或其衍生物，其包含選自以下組合的胺基酸突變：

   10Q和39T；

   39T和92Q；

   10Q和39T和92Q。
6. 如申請專利範圍第5項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，相較於野生型人IL-10，該IL-10變體或其衍生物包含選自以下組合的胺基酸突變：

   N10Q和M39T；

   M39T和N92Q；

   N10Q和M39T和N92Q。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的IL-10變體或其衍生物，其包含選自以下任一項所示的多肽或由其組成：

   SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14。
8. 如申請專利範圍第1至7項中任意一項所述的IL-10變體或其衍生物，其中：

   該IL-10變體或其衍生物是選自以下任一項的形式：單體、二聚物、三聚物；

   該IL-10變體的衍生物體現為選自以下任一項的形式或其組合：

   PEG化的、糖基化的、羥乙基化的、綴合有白蛋白、融合至白蛋白、融合至抗體或其抗原結合片段、截短的。
9. 如申請專利範圍第8項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該IL-10變體或其衍生物是PEG化的IL-10變體或其衍生物。
10. 如申請專利範圍第9項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該PEG化位於所述IL-10變體或其衍生物的N末端。
11. 如申請專利範圍第10項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該PEG化的IL-10變體或其衍生物是選自以下的任一項：

    - 綴合有PEG的IL-10二聚體，其中該PEG的平均分子量為20KD，該PEG為單PEG，其綴合至該二聚體中的單體之一；

    - 綴合有PEG的IL-10二聚體，其中該PEG的平均分子量為20KD，該PEG為兩個PEG，兩個PEG分別綴和至該二聚體中的兩個單體；

    - 綴合有PEG的IL-10二聚體，其中該PEG的平均分子量為12KD，該PEG為單PEG，其綴合至該二聚體中的單體之一；

    - 綴合有PEG的IL-10二聚體，其中該PEG的平均分子量為12KD，該PEG為兩個PEG，兩個PEG分別綴和至該二聚體中的兩個單體。
12. 如申請專利範圍第8項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該二聚體是同二聚體。
13. 如申請專利範圍第8項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該截短是指缺少信號肽。
14. 如申請專利範圍第8至13項中任一項所述的IL-10變體或其衍生物，其是單PEG化的或雙PEG化的。
15. 如申請專利範圍第14項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該PEG化位於所述IL-10變體或其衍生物的N末端。
16. 如申請專利範圍第14項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該PEG的平均分子量為約5KD至約50KD。
17. 如申請專利範圍第16項所述的IL-10變體或其衍生物，其中，該PEG的平均分子量為約10KD至約30KD。
18. 一種醫藥組成物，其含有：

    - 申請專利範圍第1至17項中任意一項所述的IL-10變體或其衍生物，

    - 視需要地，藥學上可接受的稀釋劑、載體或助劑。
19. 一種分離的核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至17項中任意一項所述的IL-10變體或其衍生物。
20. 如申請專利範圍第19項所述的分離的核酸分子，其包含選自以下任一項所示的多核苷酸或由其組成：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13。
21. 一種表達載體，其包含申請專利範圍第19或20項所述分離的核酸分子。
22. 一種宿主細胞，其表達申請專利範圍第21項所述的表達載體；

    該宿主細胞為原核或真核細胞。
23. 如申請專利範圍第22項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為細菌、或酵母菌、或哺乳動物細胞。
24. 如申請專利範圍第23項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為大腸桿菌。
25. 一種申請專利範圍第1至17項中任意一項所述的IL-10變體或其衍生物、申請專利範圍第18項所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途；

    該藥物用於治療選自以下的疾病：增生性疾病、免疫性疾病、心血管病症、血栓性病症、高血脂症、炎性病症、肝病、調節T細胞介導的免疫應答。
26. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該增生性疾病是腫瘤或癌。
27. 如申請專利範圍第26項所述的用途，其中，該腫瘤或癌選自：上皮細胞癌、內皮細胞癌、鱗狀細胞癌、乳頭狀瘤病毒引起的癌、腺癌、癌腫、黑色素瘤、肉瘤、畸胎癌、肺部腫瘤、轉移性肺癌、淋巴瘤。
28. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該免疫性疾病是糖尿病。
29. 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中，該免疫性疾病是胰島素依賴型糖尿病。
30. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該心血管病症選自：動脈粥樣硬化、高血壓、心肌病。
31. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該血栓性病症是引起中風或心肌梗塞的病症。
32. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該炎性病症為脈管炎。
33. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中，該肝病為非酒精性脂肪肝或C型肝炎。
34. 一種製備IL-10變體或其衍生物的方法，包括：

    向野生型人IL-10中引入申請專利範圍第1至7項中任意一項中所述的IL-10變體或其衍生物所包含的突變，或

    使用申請專利範圍第19或20項所述的核酸分子進行表達，或

    使用申請專利範圍第21項所述的表達載體進行表達，或

    使用申請專利範圍第22項所述的宿主細胞進行表達。

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