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TW202031297A - 用於經口遞送異種負載之衍生自cholix的載體 - Google Patents

用於經口遞送異種負載之衍生自cholix的載體 Download PDF

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TW202031297A
TW202031297A TW108132886A TW108132886A TW202031297A TW 202031297 A TW202031297 A TW 202031297A TW 108132886 A TW108132886 A TW 108132886A TW 108132886 A TW108132886 A TW 108132886A TW 202031297 A TW202031297 A TW 202031297A
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TW
Taiwan
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seq
load
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complex
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Application number
TW108132886A
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English (en)
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蘭德 Ｊ 瑪西
查理斯 歐森
德瑞克 麥克萊恩
莎莉 波斯爾思韋特
艾瑪 柏瑞特
艾爾柏特 希特
泰爾 瑪哈穆德
麥克爾 希克爾
茱莉亞 德恩 麥凱
克義 劉
偉軍 馮
湯瑪士 卡爾 哈德
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美商應用分子運輸公司
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Publication date
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Abstract

本發明提供遞送構築體，其包含偶合於異種負載之載體，其中該載體與該負載之偶合使得將該負載轉運至完整極化上皮細胞中及/或轉運穿過該等完整極化上皮細胞。該遞送構築體可為醫藥組合物之部分，可向個體經口投與該醫藥組合物以提供用於治療例如發炎疾病或自體免疫疾病的經改良有效療法。

Description

用於經口遞送異種負載之衍生自CHOLIX的載體
腸道上皮阻礙了經口投與諸如蛋白質之較大治療分子的努力，此係因為蛋白質不能夠擴散穿過完整上皮障壁或經由緊密連接穿過障壁。一旦由上皮細胞吸收，則治療蛋白進入破壞性溶酶體遷移途徑或釋放回至腸內腔中。在研發商業上可行之口服調配物方面，尤其對於基於多肽之治療劑，此種不能易於轉運穿過腸上皮之能力仍然為限制因素。常見解決方案為使用非經腸投與，諸如靜脈內或皮下投與，但此等投與途徑可能通常引起大量副作用，降低治療功效，且降低患者便利性，其可不利地影響遵從性。需要用於將治療劑轉運至上皮(例如，腸道上皮)中或穿過上皮的經改良組合物及方法。藉由引用併入
本文中所揭示之所有參考物出於所有目的特此以其全文引用之方式併入。
在一個態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體能夠在該載體胞吞後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之頂端室中，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該載體能夠在該載體胞吞後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該頂端室中。在一些實施例中，該載體能夠在該載體胞吞後至少15分鐘累積於該極化上皮細胞之該頂端室中。
在一些實施例中，該極化上皮細胞包含腸胃極化上皮細胞。在一些實施例中，該極化上皮細胞包含大鼠腸胃極化上皮細胞。
在另一態樣中，本發明包括載體-負載複合物，其包含載體，該載體能夠在將該載體腔內施加至哺乳動物之胃腸道後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之頂端室中，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該頂端室中。在一些實施例中，該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道載體後至少15分鐘累積於極化上皮細胞之該頂端室中。
在一些實施例中，該腔內施加包含腔內注射至大鼠空腸中。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體能夠在該載體胞吞後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之核上室中，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該載體能夠在該載體胞吞後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該核上室中。在一些實施例中，該載體能夠在該載體胞吞後至少15分鐘累積於該極化上皮細胞之該核上室中。
在一些實施例中，該極化上皮細胞包含腸胃極化上皮細胞。在一些實施例中，該極化上皮細胞包含大鼠腸胃極化上皮細胞。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體能夠在將該載體腔內施加至哺乳動物之胃腸道後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之核上室中，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該核上室中。在一些實施例中，該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道載體後至少15分鐘累積於極化上皮細胞之該核上室中。
在一些實施例中，該腔內施加包含腔內注射至大鼠空腸中。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體能夠在該載體胞吞後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之基底室中，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該載體能夠在該載體胞吞後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該基底室中。在一些實施例中，該載體能夠在該載體胞吞後至少15分鐘累積於該極化上皮細胞之該基底室中。
在一些實施例中，該極化上皮細胞包含腸胃極化上皮細胞。在一些實施例中，該極化上皮細胞包含大鼠腸胃極化上皮細胞。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體能夠在將該載體腔內施加至哺乳動物之胃腸道後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之基底室中，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，載體能夠在將該載體腔內施加該該哺乳動物之胃腸道後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該基底室中。在一些實施例中，該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道載體後至少15分鐘累積於極化上皮細胞之該基底室中。
在一些實施例中，該腔內施加包含腔內注射至大鼠空腸中。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置195-347中之任一者處具有C端截斷，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置195-266中之任一者處。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的序列中之任一者之位置195-266中之任一者處。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置206、245、251或266中之任一者處。在一些實施例中，該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78的位置206、245、251或266中之任一者處。
在一些實施例中，該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者之位置206處。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 131或184中的胺基酸序列組成。在一些實施例中，該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者之位置245處。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 132或183中的胺基酸序列組成。在一些實施例中，該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78之位置251處。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 133或182中的胺基酸序列組成。在一些實施例中，該C端截斷在SEQ ID NO:1-2或4-78之位置266處。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 134或181中的胺基酸序列組成。在一些實施例中，該載體由在位置195-347中之任一者處具有截斷的闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的序列組成，且在SEQ ID NO: 1-2或4-78之位置1-40、133-151、152-187或188-206中之任一者處具有不超過5、4、3、2或1個胺基酸變異。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體由闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之N端位置1-41中之任一者至C端位置150-195中之任一者的胺基酸殘基組成，或由闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之N端位置35-40中之任一者至C端位置150-205中之任一者的胺基酸殘基組成，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，在將該載體胞吞至極化上皮細胞中之後，該載體能夠保持與頂端進入受體締合。在一些實施例中，該頂端進入受體為TMEM132受體(例如，TMEM132A)。
在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之N端位置40至C端位置150-205中之任一者的胺基酸殘基組成。在一些實施例中，該載體在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置150或186處具有C端截斷。
在一些實施例中，該載體能夠將該負載轉運至極化上皮細胞中之基底室或核上室。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 136中的胺基酸序列組成。在一些實施例中，該載體能夠將該負載轉運至極化上皮細胞中之頂端室。
在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 137-139中之任一者中的胺基酸序列組成。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其能夠胞吞至極化上皮細胞中或胞移轉送極化上皮細胞之片段，該載體偶合於異種負載。
在一些實施例中，該載體包含位置3處之麩胺酸及位置4處之丙胺酸。
在一些實施例中，該載體為無毒的。
在一些實施例中，該載體能夠將該異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞。
在一些實施例中，該載體包含能夠胞移轉送極化上皮細胞之片段，其中該載體在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者中的序列之位置195至C端殘基中之任一者處具有C端截斷。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者中的序列之位置195-386中之任一者處。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的序列中之任一者之位置386處。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2中的序列中之任一者之位置386處。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 135中的胺基酸序列組成。
在另一態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其包含載體，該載體衍生自不包含SEQ ID NO: 179且不由SEQ ID NO: 126組成之Cholix多肽，該載體與異種負載複合，其中該載體能夠將該異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞；或將該異種負載轉運至該極化上皮細胞中。
在一些實施例中，該載體包含與闡述於SEQ ID NO: 130中的序列或其片段的至少75%序列一致性。在一些實施例中，該載體包含與闡述於SEQ ID NO: 130中的Cholix變體或其片段的至少90%序列一致性。在一些實施例中，該Cholix多肽為闡述於SEQ ID NO: 130中的序列或其片段。在一些實施例中，該載體包含位置3處之麩胺酸及位置4處之丙胺酸。
在一些實施例中，該載體為無毒的。
在一些實施例中，該載體能夠將該異種負載胞移轉送而穿過該極化上皮細胞。
在一些實施例中，該載體在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置195-633中之任一者處具有C端截斷。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置195-386中之任一者處。在一些實施例中，該載體在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的序列中之任一者之位置195-386中之任一者處具有C端截斷。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的序列中之任一者之位置386處。在一些實施例中，該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2中的序列中之任一者之位置386處。在一些實施例中，該載體-負載複合物包含N端甲硫胺酸。
在一些實施例中，該載體以合成方式結合於該異種負載。在一些實施例中，該載體與該異種負載基因融合。
在一些實施例中，該異種負載為治療負載。在一些實施例中，該治療負載為細胞介素、抗體、激素或核酸。在一些實施例中，該治療負載為細胞介素。在一些實施例中，該細胞介素為介白素。
在一些實施例中，該介白素為IL-10。在一些實施例中，該IL-10包含與闡述於SEQ ID NO: 145中的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，該介白素為IL-22。在一些實施例中，該IL-22包含與闡述於SEQ ID NO: 142中的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該治療負載為抗體。在一些實施例中，該抗體為抗TNF抗體。在一些實施例中，該治療負載為激素。在一些實施例中，該治療負載為人類生長激素。
在一些實施例中，該異種負載共價偶合於該載體。在一些實施例中，該異種負載偶合於該載體之C端。在一些實施例中，該異種負載偶合於該載體之N端。在一些實施例中，該載體經由間隔子偶合於該異種負載。
在一些實施例中，該間隔子為不可裂解間隔子。在一些實施例中，該間隔子包含1個與100個之間的胺基酸殘基。在一些實施例中，該間隔子包含GS、GGS、GGGS、GGGGS、GGGGGS或其組合之至多15個重複。在一些實施例中，該間隔子包含闡述於SEQ ID NO: 175中的胺基酸序列。在一些實施例中，該間隔子由闡述於SEQ ID NO: 176中的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，該異種負載非共價偶合於該載體。在一些實施例中，該異種負載經由奈米粒子與該載體複合。
在一個態樣中，本發明包括一種聚核苷酸，其編碼本文中所描述之該等載體-負載複合物(例如，遞送構築體)中之任一者，例如包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之彼等：闡述於SEQ ID NO: 147-150、152-159或188中的胺基酸序列中之任一者。
在一個態樣中，本發明包括一種載體，其包含編碼本發明之載體-負載複合物(例如，遞送構築體)的此等聚核苷酸中之任一者。
在一個態樣中，本發明包括一種將異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞之方法，其包含：(a)使該極化上皮細胞之頂端膜與載體-負載複合物接觸；及(b)將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過該極化上皮細胞，其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列，或其能夠將該載體負載複合物胞移轉送而穿過該極化上皮細胞之片段，該載體偶合於該異種負載。在一些實施例中，使該極化上皮細胞之該頂端膜與該載體-負載複合物接觸包含使該載體與頂端進入受體TMEM132相互作用。在一些實施例中，該載體與膜蛋白TMEM132之相互作用引起該載體-負載複合物之受體介導之胞吞。在一些實施例中，與TMEM132相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基135-151，或與其具有至少90%序列一致性的序列。在一些實施例中，該載體-負載複合物穿過該極化上皮細胞之該胞移轉送包含使該載體與GRP75 (例如，GRP75B)、ERGIC-53及串珠素中之任何一或多者相互作用。在一些實施例中，該載體-負載複合物穿過該極化上皮細胞之該胞移轉送進一步包含將該載體-負載複合物與COPI、EEA1及Rab7中之任何一或多者共定位於該上皮細胞之頂端側處，且與Rab11a共定位於該上皮細胞之基底側處。在一些實施例中，與GRP7或ERGIC-53相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基1-40及152-187，或與其具有至少90%序列一致性的序列。在一些實施例中，與串珠素相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基188-205，或與其具有至少90%序列一致性的序列。在一些實施例中，該方法進一步包含在(b)之後將該載體-負載複合物遞送至固有層(lamina propria )中。在一些實施例中，該極化上皮細胞為極化腸道上皮細胞。
在一個態樣中，本發明包括一種向個體經口遞送異種負載之方法，其包含：向個體經口投與載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此向個體遞送該異種負載，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
在一個態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其用於藉由包含以下之方法向個體經口遞送異種負載：向個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
在一個態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物用於藉由包含以下之方法向個體經口遞送異種負載之用途：向該個體經口投與該載體-負載複合物；其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
在一個態樣中，本發明包括一種治療個體之疾病的方法，其包含：向該個體經口投與載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
在一個態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物，其用於藉由包含以下之方法治療個體之疾病：向該個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之該疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
在一個態樣中，本發明包括一種載體-負載複合物在製造用於藉由包含以下之方法來治療個體之疾病之藥劑中的用途：向該個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之該疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。在一些實施例中，該方法進一步包含使該異種負載與固有層中之受體結合。在一些實施例中，該方法進一步包含將該異種負載遞送至全身循環中。在一些實施例中，該載體為衍生自Cholix之多肽。在一些實施例中，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。在一些實施例中，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1至2中之任一者中的序列之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。在一些實施例中，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 131-135或180-184中的胺基酸序列中之任一者。在一些實施例中，該極化上皮為極化腸道上皮。在一些實施例中，該疾病為潰瘍性結腸炎、囊炎、直腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、多發性硬化症(Multiple sclerosis；MS)、全身性紅斑性狼瘡症(Systemic lupus erythematosus；SLE)、移植體對抗宿主疾病(Graft versus host disease；GVHD)、類風濕性關節炎或牛皮癬。在一些實施例中，該疾病為潰瘍性結腸炎。在一些實施例中，該潰瘍性結腸炎為輕微至中度或中度至重度。在一些實施例中，該疾病為克羅恩氏病。在一些實施例中，該克羅恩氏病為瘻管性克羅恩氏病。在一些實施例中，該負載為介白素。在一些實施例中，該介白素包含SEQ ID NO: 142或145之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明包括一種將異種負載轉運至極化上皮細胞中之方法，其包含：(a)使該極化上皮細胞之頂端膜與載體-負載複合物接觸；及(b)將該載體-負載複合物轉運至該極化上皮細胞中，其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其能夠將該載體-負載複合物轉運至該上皮細胞中之片段，該載體偶合於該異種負載。在一些實施例中，使該極化上皮細胞之該頂端膜與該載體-負載複合物接觸包含使該載體與頂端進入受體TMEM132相互作用。在一些實施例中，該載體與該頂端進入受體TMEM132之相互作用引起該載體-負載複合物之受體介導之胞吞。在一些實施例中，該方法進一步包含將該異種負載轉運至頂端室或基底室。在一些實施例中，該載體-負載複合物之該載體在胞吞之後保持與TMEM132締合。在一些實施例中，與TMEM132相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基135-151，或與其具有至少90%序列一致性的序列。在一些實施例中，該載體為衍生自Cholix之多肽。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之胺基酸殘基1-151、1-187、41-187或40-205組成。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 1-2中的序列之胺基酸殘基1-151、1-187、41-187或40-205組成。在一些實施例中，該載體由闡述於SEQ ID NO: 136-139中的胺基酸序列中之任一者組成。在一些實施例中，該載體經由奈米粒子非共價偶合於該異種負載。在一些實施例中，該奈米粒子上之該異種負載與該載體之比為至少15,000:1。在一些實施例中，該異種負載為葡萄糖降低劑。在一些實施例中，該葡萄糖降低劑與該奈米粒子非共價締合。在一些實施例中，該異種負載為siRNA。在一些實施例中，該siRNA與該奈米粒子非共價締合。在一些實施例中，該載體共價鍵聯至該奈米粒子或在該奈米粒子上經噴霧乾燥。
交叉參考
本申請案主張2019年3月8日申請之PCT申請案第PCT/US2019/021474號以及2019年8月16日申請之美國臨時申請案第62/888,144號、2019年8月16日申請之第62,888,400號、2019年8月16日申請之第62/888,133號、2019年3月8日申請之第62/816,022號及2018年11月7日申請之第62/756,889號的權益，該等申請案出於所有目的以其全文引用之方式併入本文中。I. 介紹
在某些實施例中，本文中提供遞送構築體(例如，載體-負載複合物)，其能夠例如藉由胞吞將一或多個異種負載分子(例如，一或多個治療負載)轉運至上皮細胞(例如，極化腸道上皮細胞)中或藉由(例如藉由)胞移轉送將其轉運穿過上皮細胞(例如，極化腸道上皮細胞)。遞送構築體可包含偶合於異種負載之載體。載體可能夠使用內源遷移途徑將異種負載轉運至上皮細胞中或穿過上皮細胞。與使用被動擴散相反，利用內源遷移途徑可允許載體迅速地(例如，至少10-6 cm/sec、10-5 cm/sec)及有效地(例如，將至少5%、10%、20%、25%或50%之材料施加至頂端表面)使異種負載穿梭至上皮細胞中或穿過上皮細胞，同時不損害此等細胞之障壁功能或異種負載之生物活性。II. 載體
本文中提供之遞送構築體之載體部分可為能夠增加遞送至及/或遞送穿過上皮的異種負載(例如，治療負載)之速率及/或量的任何分子(例如，小分子、多肽、核酸等)。
本文中之載體可具有眾多屬性。在一些實施例中，相對於諸如SEQ ID NO: 3之天然存在的Cholix多肽，本文中之載體可具有降低(例如，至少50%降低)或消融之ADP核糖基化活性(例如，延長因子2之核糖基化)。
在一些實施例中，本文中之載體利用內源遷移途徑以將偶合於其之異種負載轉運穿過極化上皮細胞。此載體在本文中可稱為胞移轉送載體。在一些情況下，本文中之載體可利用內源遷移途徑以將偶合於其之異種負載轉運至極化上皮細胞中。此載體在本文中可稱為胞吞載體。在胞吞載體內，可存在將偶合於其之負載遞送至極化上皮細胞內之特定區域中的載體，該等特定區域諸如頂端室、核上室或基底室。
本文中之載體中之任一者可藉由與此上皮之一或多種內源蛋白相互作用及/或共定位來轉運偶合於其之分子。一或多種內源蛋白可為能夠將載體移動至上皮細胞中或穿過上皮細胞之受體或酶。與上皮細胞之一或多種內源蛋白相互作用及/或共定位可為載體提供一或多種功能，包括胞吞至上皮細胞中、回避溶酶體破壞途徑、自頂端室遷移至基底室及/或自上皮細胞之基底膜胞外分泌至黏膜下層室(諸如固有層)中。
此載體與內源蛋白之相互作用可為選擇性相互作用。此選擇性相互作用可為pH依賴性相互作用。在載體與兩種或多於兩種內源蛋白相互作用之例項中，此類相互作用可為依序相互作用，其中第一相互作用蛋白將載體移交至第二相互作用蛋白。此類依序相互作用可在不同pH (例如，pH 5.5、7.0、7.5等)下發生。載體與內源蛋白之間的相互作用可為共價或非共價相互作用。非共價相互作用包括氫鍵結、凡得瓦爾相互作用(van der Waals interaction)、離子鍵、π-π相互作用等。
在一些情況下，可與載體相互作用的內源蛋白中之一者可為頂端進入受體。此類頂端進入受體可為跨膜蛋白132 (TMEM132)。載體與此類頂端進入受體之相互作用可使得載體能夠經由受體介導之胞吞進入上皮細胞。
載體亦可與溶酶體回避受體相互作用。與溶酶體回避受體之此類相互作用可在上皮細胞內部且在胞吞之後發生。溶酶體回避受體可為葡萄糖調節蛋白75 (GRP75，例如GRP75B)。載體與此類溶酶體回避受體之相互作用可使得載體能夠避免或規避溶酶體降解。此類能力可允許載體顯著地降低偶合於達至細胞之溶酶體之載體的負載之量，大部分治療蛋白一旦由腸道上皮吸收所面臨的結局。
此外，載體可與頂端至基底遷移蛋白相互作用。此類相互作用可在上皮細胞內部且在胞吞之後發生。此類頂端至基底遷移蛋白可為內質網高爾基體中間室(ERGIC)蛋白，諸如ERGIC-53。載體與ERGIC蛋白之相互作用可使得載體能夠自頂端室移動至核上室或基底室。
胞移轉送載體亦可與能夠促進載體自上皮細胞之基底位點胞外分泌的基底釋放蛋白相互作用。此類相互作用可在上皮細胞之基底位點處且在自頂端室移動至基底室之後發生。此類基底釋放蛋白可為串珠素(在本文中亦稱為基底膜特異性硫酸乙醯肝素蛋白聚糖核心蛋白或HSPG)。載體與串珠素之相互作用可使得載體能夠進入基底再循環系統，該基底再循環系統允許載體自基底室釋放至黏膜下層室(諸如固有層)中。
因此，本文中之胞移轉送載體可為能夠與內源蛋白TMEM132 (例如，TMEM132A)、GRP75 (例如，GRP75B)、ERGIC (例如，ERGIC-53)及串珠素(HSPG)相互作用的分子，從而使得此類載體能夠將偶合於其之負載分子轉運穿過極化上皮(例如，極化腸道上皮)。
本文中之胞吞載體可為能夠與內源蛋白TMEM132相互作用的分子，從而允許頂端進入此類載體。胞吞載體可在胞吞之後保持與TMEM132締合(例如，相較於可在胞吞之後與TMEM132解離以與例如GRP75或ERGIC蛋白相互作用的胞移轉送載體)且保持在細胞(例如，極化上皮細胞)之頂端區域及室內。在一些情況下，此類胞吞載體亦可與GRP75相互作用。與TMEM132及/或GRP75之此類相互作用可允許載體及偶合於其之負載避免或至少顯著地降低(例如，相較於在其不偶合於載體時之負載分子小於約50%)溶酶體降解。在一些情況下，相較於可在頂端(例如，內腔)施加後例如約5、10、15或30分鐘展示幾乎所有頂端施加分子之完整胞移轉送的胞移轉送載體，胞吞載體可在頂端(例如，內腔)施加載體後例如至少約5、10、15、30、60或120分鐘保持在頂端室中且不展示至基底室之顯著位移。在一些情況下，至少約50%、75%或90%之載體分子在內腔施加載體後5分鐘保持在頂端室中。在一些情況下，至少約50%、75%或90%之載體分子在內腔施加載體後10分鐘保持在頂端室中。在一些情況下，至少約50%、75%或90%之載體分子在內腔施加載體後15分鐘保持在頂端室中。在一些情況下，至少約50%、75%或90%之載體分子在內腔施加載體後30分鐘保持在頂端室中。保持在上皮細胞之頂端室中的載體分子之百分比可藉由將在各別時間點處在細胞之基底室中量測的螢光信號之強度除以在細胞之頂端室中量測的螢光信號之強度來測定。
在其他情況下，能夠將負載轉運至核上室或基底室的胞吞載體可與ERGIC蛋白及/或可允許載體進入上皮細胞內部之此類室的另一ER-高爾基體遷移蛋白複合物相互作用。
胞吞或胞移轉送載體可為多肽。此類載體可衍生自由諸如霍亂弧菌(Vibrio cholerae )之細菌分泌的多肽(本文中衍生自Cholix之多肽)。載體可為衍生自兩種或多於兩種不同細菌多肽的嵌合多肽。此兩種或多於兩種不同細菌多肽可衍生自兩種或多於兩種不同細菌(例如，霍亂弧菌、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)等)且/或衍生自細菌之兩種或多於兩種不同菌株(例如，霍亂弧菌、綠膿桿菌等之兩種或多於兩種不同菌株)。
載體可為具有由此類細菌分泌的多肽之天然或非天然存在之多肽。
非天然存在之多肽可包括具有C端及/或N端修飾之彼等多肽。
在一個實例中，相對於天然存在之多肽(例如，SEQ ID NO: 3)或相對於共有序列(例如，SEQ ID NO: 130)，多肽包含一或多個胺基酸取代及/或一或多個胺基酸缺失及/或一或多個胺基酸添加。
本文中所注目之取代之實例包括一或多種胺基酸之保守性取代。以下六個組各自含有彼此為保守性取代的胺基酸：(1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)及蘇胺酸(T)；(2)天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)；(3)天冬醯胺(N)及麩醯胺酸(Q)；(4)精胺酸(R)及離胺酸(K)；(5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)及纈胺酸(V)；以及(6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)。
另外或可替代地，例如相對於闡述於SEQ ID NO: 1、2或130中的序列， 本文中所注目之載體之突變包括以下中之一或多者：V1L、L1V、D3E、E4A、E581A等(數字表示胺基酸位置，數字之前的字母表示經修飾胺基酸，且數字之後的字母表示經取代胺基酸)。在一些情況下，載體包含在載體中的位置1處之纈胺酸、位置1處之白胺酸、位置3處之天冬胺酸、位置3處之麩胺酸、位置4處之麩胺酸或位置4處之丙胺酸(相對於SEQ ID NO: 1中之位置進行編號)。
缺失之實例包括N端截斷及C端截斷。
如本文中所使用，當C端截斷稱為出現於胺基酸位置「處」時，此胺基酸包括於截斷多肽中。當N端截斷稱為出現於胺基酸位置「處」時，此胺基酸不包括於截斷多肽中。舉例而言，在一種情況下，載體包含在位置386處具有C端截斷之SEQ ID NO: 1。此類載體在其C端處之SEQ ID NO: 1之胺基酸386 (A)處終止。另外，以上載體可進一步在其N端處之位置20處截斷，由此具有脯胺酸(P)之N端胺基酸(其為SEQ ID NO: 1之參考序列中的位置21)。
N端截斷包括移除本文中之Cholix序列(例如，SEQ ID NO: 1-3或130中之任一者)之N端處的至多10、20、30、39或40個胺基酸之彼等。C端截斷可為本文中所描述之彼等。此類N端及/或C端截斷可產生不同功能。截斷可經描述為相對於野生型序列(例如，SEQ ID NO: 3)、相對於非天然存在之序列(例如，SEQ ID NO: 1)或相對於共有序列(例如，SEQ ID NO: 130)，其中自N端至C端對殘基進行編號。舉例而言，相對於SEQID NO: 1在位置266處具有C端截斷之載體包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-266。
添加之實例包括：信號肽序列、純化肽序列或其他N端修飾。信號肽序列可包含1至約40個胺基酸。在一些情況下，載體包含N端甲硫胺酸。如本文中所使用，在數值或範圍之情形下，除非另外規定，否則術語「約」一般係指所敍述或所主張之數值或範圍的±10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
載體可與天然存在之多肽(例如，SEQ ID NO: 3)、非天然存在之多肽(例如，SEQ ID NO: 1-2)或與本文中所描述之功能片段(例如，SEQ ID NO: 160-168)中之任一者具有顯著序列一致性(例如，約或大於50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%序列一致性，或100%序列一致性)。
如本文中所使用，術語「序列一致性」或序列一致性之百分比(%)為在比對該等序列且引入間隙(視需要)以達成最大序列一致性百分比且不考慮作為序列一致性之部分的任何保守性取代之後，與所選序列中之殘基一致的候選序列中的殘基之百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式實現，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括用以在所比較序列之全長內實現最大比對所需的任何演算法。
本文中之載體(例如，胞吞或胞移轉送載體)可衍生自由霍亂弧菌細菌分泌之多肽(例如，包含SEQ ID NO: 3-125或127-129中之任一者之序列的彼等)。此類載體可稱作衍生自Cholix之多肽。衍生自Cholix多肽之載體可包括天然及非天然存在之Cholix多肽序列，以及與本文中所描述之天然(例如，SEQ ID NO: 3至78)或非天然(例如，SEQ ID NO: 1至2)存在之Cholix多肽具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性的彼等序列。衍生自Cholix多肽之載體亦可包括天然及非天然存在之Cholix多肽序列之胞吞及/或胞移轉送片段(例如，Cholix多肽之N端及/或C端截斷)，其中此類胞吞及/或胞移轉送片段可與此類天然或非天然存在之Cholix多肽序列中之任一者具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%序列一致性。
表 1 提供例示性全長Cholix及衍生自Cholix之序列。表 1 - 例示性 Cholix 多肽序列
SEQ ID NO 胺基酸序列 描述
SEQ ID NO: 1    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 非天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 2    LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 非天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 3 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 4 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 5 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 6 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYERLTPAEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 7 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYERLTPAEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 8 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKQIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEKKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 9 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 10 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVSTHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 11 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEKKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 12 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIHRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 13 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 14 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 15 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 16 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRMLFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 17 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARLKKGTGNAELPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITHVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEVLAIDEEAVAEEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 18 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVFFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVTERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIHRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 19 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 20 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVALNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 21 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQAPEVAERLSALRQINENNPGVVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 22 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITDVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 23 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAIMVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRYLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISPKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 24 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKDGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSAIRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 25 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKDGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKHCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 26 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWRTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 27 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSNGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 28 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLLENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 29 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQKNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 30 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 31 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 32 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 33 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQKNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 34 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 35 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITDVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 36 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIHWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 37 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATIRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
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SEQ ID NO: 46 VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 47 VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMETLAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 48 VEDELNIFDECRSPCLLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 49 VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVIPGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMETLAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 50 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 51 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSQKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 52 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 53 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 54 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 55 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGIPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 56 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGIPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 57 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 58 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIYNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEKEEEWGGVYVATHAELAHRYARIKEGTGENGLPTTEEKKSRGVMLRVYLPRASLERFYRTNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPESAGGEDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 59 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIYNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEKEEEWGGVYVATHAEVNHRYARIKEGTGENGLPTTEEKKSRGVMLRVYLPRASLERFYRTNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPESAGGEDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 60 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAQKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIYNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEKEEEWGGVYVATHAELAHRYARIKEGTGENGLPTTEKKKSRGVMLKVYLPRASLERFYRTNIPLENADEHVTQVIGHPLPLRNEAFTGPESAGGENETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEHDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 61 VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 62 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVIPGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEGLTTDEEAVVKEAIAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
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SEQ ID NO: 66 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEQSIAISWPSVSYNAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 67 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 68 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 69 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKMYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 70 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQKRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEEPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPEAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLQDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 71 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 72 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPLLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 73 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 74 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLFIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAIEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 75 VEDELNIFDECRSPCSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWYGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDTDKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 76 VEDELKIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 77 VEDELKIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQAPEVAERLSDLRRINEDNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELETTHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 78 VEDELKIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKAVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 79 TPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGVAIPSTIPGNSYAQLPIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 80 SIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 81 MTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 82 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFTINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETIIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 83 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 84 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 85 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKAVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKEQKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 86 MTINDEQNDIKDEDKGESIITIGDFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 87 CSLTPEPGKPIQSQLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 88 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 89 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 90 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLIPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 91 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITDVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 92 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVALNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 93 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAIMVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRYLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 94 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKDGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSAIRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 95 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKDGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYLTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 96 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 97 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYTRIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 98 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFYPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 99 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 100 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQKNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 101 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 102 CSLTPELGKPIQSKLSISSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 103 CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 104 CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLEEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 105 CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASDNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 106 CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINVESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEREARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAERHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 107 CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPERVDGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 108 CSLTPELGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDDQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKPCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQNIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 109 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIMDEGKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAKQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFFEDPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTLLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 110 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 111 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHAAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 112 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 113 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQAPEVAERLSDLRRINEDNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELETTHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 114 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGNGGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIYAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 115 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEIDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWFTTSPKVTLCFYEDPAQCTYGDDWHGGAYKTVAGIPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAEQETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 116 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEEPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPGAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 117 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQKRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEEPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPEAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 118 CSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIIIIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRVVITPQGVTNWTYQELDATHQALTREDYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERETRGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 119 CSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 120 CSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPEVVLCFFEDPELCTYGDDWHGGAYKTVAGTPKAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSASAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITQQGVTNWTYQELEATHQALTQEGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRISPVPRGSDTESERAWGGLYVSTDASVAYGYARIQEGTADGGGLTPAERKARGVMLRVYLPQASLERFYRINADLEKERNLVERVIGHPLPLRNEAFTGTDAEEGSDETAIGWDMAIHGVAIPS 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 121 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKQIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVINLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCVYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEKKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRV 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 122 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAEKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIYNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLLCPDADGSCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEKEEEWGG 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 123 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSFNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWETQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAEKDGARHKRWAHWHTGLALCWLVPLDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGMEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARGRKPRDLTDDLQCAYQAQNIVSLFLATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLTDLRRINENNPGMVTQVLTIARQIYNDYVTEHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADESCVASNSDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEAKHQTLTREGYVFVGYHGTNHVAAQSIVNRITPVPRGNNTEKEEEWGG 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 124 YSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSNGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 125 VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQKRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWENQGNVSFAVTRPEQSIAISWPSVSYKAAHKNGSRHKRWANWLTTLPKVVLCFYEEPELCTYGEDWHGGAYKTVAGTPEAITVKQGIEQKTVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLQDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHV 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 126 VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPGDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVSQDAPFGVINLDITTENGTKTYSFNRKESEFAINWLVPIGEDSPASIKISIDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPIDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKAITVKQGIEQKPVEQRIHFSKKNAMEALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLPDDLSCAYNAQQIVSLFLATRILFTHIDSIFTLNLDGQEPEVAERLDDLRRINENNPGMVIQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNSDQANINIES 非天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 127 LFSHLDSVFTLNLHEQEPAVAERLSALRQINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISAKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 128 AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK 天然存在之Cholix多肽
SEQ ID NO: 129 AVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDEL 天然存在之Cholix多肽
表 2 提供可用作載體的衍生自Cholix之多肽之共有序列。表 2- 式 I
SEQ ID NO: 130 X1-E-X3-X4-L-X6-I-F-D-E-C-R-S-P-C-X16-L-T-P-E-X21-G-K-X24-I-Q-S-K-L-X30-I-P-X33-D-V-V-L-D-E-G-V-L-Y-Y-S-M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D-E-X59-K-G-E-S-I-I-T-X67-G-E-F-A-T-X73-R-A-T-R-H-Y-V-X81-Q-D-A-P-F-G-V-I-X90-L-D-I-T-T-E-N-G-T-K-X101-Y-S-X104-N-R-K-X108-X109-E-F-X112-I-X114-W-L-V-X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I-K-I-S-X131-D-E-X134-D-Q-X137-R-N-I-I-E-V-P-K-L-Y-S-I-D-L-D-N-Q-T-L-E-Q-W-X160-X161-Q-G-N-V-X166-F-X168-V-T-R-P-E-X174-X175-I-A-I-S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K-X191-G-X193-R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205-X206-X207-X208-X209-L-X211-X212-X213-X214-X215-X216-X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223-X224-C-T-X227-G-X229-X230-W-X232-G-G-X235-Y-X237-T-V-A-G-X242-P-X244-X245-I-X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-K-X256-V-E-Q-R-I-H-F-S-X265-X266-N-A-X269-X270-X271-L-A-A-H-R-V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-P-R-X293-L-X295-D-D-L-X299-C-X301-Y-X303-A-Q-X306-I-V-S-L-F-X312-A-T-R-X316-L-F-X319-H-X321-D-S-X324-F-T-L-N-L-X330-X331-Q-X333-P-X335-V-X337-E-R-L-X341-X342-X343-R-X345-I-N-E-X349-N-P-G-X353-V-X355-Q-V-L-T-X360-A-R-Q-I-Y-N-D-Y-V-T-X371-H-P-X374-L-X376-P-E-Q-T-S-A-X383-A-Q-A-A-D-I-L-S-L-X393-X394-P-D-X397-D-X399-X400-C-V-A-X404-X405-X406-D-Q-A-N-I-N-X413-E-S-R-S-G-R-S-Y-L-X423-E-N-R-A-V-I-T-X431-Q-G-V-T-N-W-T-Y-Q-E-L-X443-X444-X445-H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V-F-V-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I-X475-P-V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487-X488-W-G-G-X492-Y-V-X495-T-X497-A-X499-X500-X501-X502-X503-Y-X505-R-X507-X508-X509-G-T-X512-X513-X514-X515-X516-X517-T-X519-X520-X521-X522-X523-X524-R-G-V-M-L-X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-E-R-F-Y-R-X544-N-X546-X547-L-E-X550-X551-X552-X553-X554-X555-X556-X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-N-E-A-F-T-G-X573-X574-X575-X576-X577-G-X579-X580-E-T-X583-I-G-W-D-X588-A-I-X591-X592-V-A-I-P-S-T-I-P-G-N-X603-Y-X605-X606-L-X608-X609-X610-E-E-A-X614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622-K-P-P-Y-K-E-X629-X630-D-E-L-K；其中X1選自由V及L組成之群；X3選自由E及D組成之群；X4選自由A及E組成之群；X6選自由N及K組成之群；X16選自由S及L組成之群；X21選自由P及L組成之群；X24選自由P及Q組成之群；X30選自由S及F組成之群；X33選自由S及G組成之群；X56選自由K及M組成之群；X59選自由D及G組成之群；X67選自由I及F組成之群；X73選自由V及I組成之群；X81選自由N及S組成之群；X90選自由H及N組成之群；X101選自由T及M組成之群；X104選自由Y及F組成之群；X108選自由E及D組成之群；X109選自由G及S組成之群；X112選自由A及T組成之群；X114選自由N及H組成之群；X118選自由P及I組成之群；X119選自由I及P組成之群；X131選自由V及I組成之群；X134選自由L及I組成之群；X137選自由Q及K組成之群；X160選自由K及E組成之群；X161選自由T及N組成之群；X166選自由S及F組成之群；X168選自由S及A組成之群；X174選自由H及Q組成之群；X175選自由N、S、SIAKQS及SIAKQSIAKQS組成之群；X186選自由K及N組成之群；X189選自由Q、E及H組成之群；X191選自由E、N及D組成之群；X193選自由S及A組成之群；X200選自由H及N組成之群；X202選自由H、L、F及R組成之群；X204選自由G及T組成之群；X205選自由L及S組成之群；X206選自由A及P組成之群；X207選自由L、E及K組成之群；X208選自由C及V組成之群；X209選自由W、V及T組成之群；X211選自由V及無胺基酸組成之群；X212選自由P及無胺基酸組成之群；X213選自由M、I、L及無胺基酸組成之群；X214選自由D及無胺基酸組成之群；X215選自由A及無胺基酸組成之群；X216選自由I及無胺基酸組成之群；X217選自由Y及C組成之群；X218選自由N及F組成之群；X219選自由Y及F組成之群；X220選自由I及E組成之群；X221選自由T及D組成之群；X222選自由Q及P組成之群；X223選自由Q、E及A組成之群；X224選自由N、L及Q組成之群；X227選自由L及Y組成之群；X229選自由D及E組成之群；X230選自由N及D組成之群；X232選自由F、H及Y組成之群；X235選自由S及A組成之群；X237選自由E及K組成之群；X242選自由T及I組成之群；X244選自由K、E及G組成之群；X245選自由V及A組成之群；X247選自由T及M組成之群；X252選自由I及M組成之群；X256選自由P、T及A組成之群；X265選自由K、Q及N組成之群；X266選自由G及K組成之群；X269選自由M及I組成之群；X270選自由S及E組成之群；X271選自由A及T組成之群；X288選自由S及G組成之群；X293選自由D及Y組成之群；X295選自由T、P及Q組成之群；X299選自由S及Q組成之群；X301選自由A及V組成之群；X303選自由Q及N組成之群；X306選自由N及Q組成之群；X312選自由V及L組成之群；X316選自由I及M組成之群；X319選自由S及T組成之群；X321選自由L及I組成之群；X324選自由V及I組成之群；X330選自由D、E及H組成之群；X331選自由E及G組成之群；X333選自由E及A組成之群；X335選自由E及A組成之群；X337選自由A及T組成之群；X341選自由S、D及T組成之群；X342選自由D及A組成之群；X343選自由L及I組成之群；X345選自由R及Q組成之群；X349選自由N及D組成之群；X353選自由M及V組成之群；X355選自由T及I組成之群；X360選自由V及I組成之群；X371選自由H及E組成之群；X374選自由G及L組成之群；X376選自由T及I組成之群；X383選自由G及S組成之群；X393選自由F及L組成之群；X394選自由C及Y組成之群；X397選自由A及T組成之群；X399選自由K、E及G組成之群；X400選自由S、P及H組成之群；X404選自由S及L組成之群；X405選自由N及D組成之群；X406選自由N及S組成之群；X413選自由I及V組成之群；X423選自由P及L組成之群；X431選自由P及Q組成之群；X443選自由E及D組成之群；X444選自由A及T組成之群；X445選自由T及K組成之群；X448選自由A及T組成之群；X451選自由R及Q組成之群；X453選自由G及D組成之群；X465選自由V及A組成之群；X469選自由T、S及N組成之群；X475選自由A、S及T組成之群；X481選自由N及S組成之群；X482選自由N及D組成之群；X485選自由N、S及K組成之群；X487選自由E、R及K組成之群；X488選自由K、A及E組成之群；X492選自由L及V組成之群；X495選自由A及S組成之群；X497選自由H及D組成之群；X499選自由E及S組成之群；X500選自由V及L組成之群；X501選自由A及N組成之群；X502選自由H及Y組成之群；X503選自由G及R組成之群；X505選自由A及T組成之群；X507選自由I及L組成之群；X508選自由K及Q組成之群；X509選自由E及K組成之群；X512選自由G及A組成之群；X513選自由E、D及N組成之群；X514選自由Y、G、A及N組成之群；X515選自由G及E組成之群；X516選自由L及G組成之群；X517選自由P及L組成之群；X519選自由R、P及T組成之群；X520選自由A及E組成之群；X521選自由E及K組成之群；X522選自由R、Q及K組成之群；X523選自由D、K及E組成之群；X524選自由A、T及S組成之群；X530選自由R及K組成之群；X533選自由I及L組成之群；X534選自由P及H組成之群；X535選自由R及Q組成之群；X544選自由T及I組成之群；X546選自由T、A及I組成之群；X547選自由P及D組成之群；X550選自由N及K組成之群；X551選自由A及E組成之群；X552選自由E、R及D組成之群；X553選自由E、N及R組成之群；X554選自由H及L組成之群；X555選自由I及V組成之群；X556選自由T及E組成之群；X557選自由Q、R、H及D組成之群；X562選自由S及P組成之群；X573選自由P及T組成之群；X574選自由E及D組成之群；X575選自由S、A及R組成之群；X576選自由A、E及V組成之群；X577選自由G、E及D組成之群；X579選自由E及S組成之群；X580選自由D及N組成之群；X583選自由V及A組成之群；X588選自由M及I組成之群；X591選自由H及Y組成之群；X592選自由A及G組成之群；X603選自由A及S組成之群；X605選自由E及A組成之群；X606選自由E、A、Q、G、V及R組成之群；X608選自由A、P及T組成之群；X609選自由I、T及P組成之群；X610選自由D及A組成之群；X614選自由V及VVKEAI組成之群；X616選自由K及E組成之群；X622選自由T、A及P組成之群；且X629選自由R、Q及H組成之群；且X630選自由K及無胺基酸組成之群。
載體可包括相對於天然存在之Cholix多肽(諸如具有SEQ ID NO: 3之序列的一者)具有降低或消融之ADP核糖基化活性(例如，延長因子2之核糖基化)的所有衍生自Cholix之多肽。此類載體可稱作無毒載體。此類衍生自Cholix之多肽之實例包括具有闡述於SEQ ID NO: 1至10中之任一者中的序列的可具有位置581處之缺失(例如，如SEQ ID NO: 189中之E581缺失)、位置581處之取代(例如，E581A取代)或呈現載體無毒性之替代性缺失或取代的多肽中之任一者。在一些情況下，載體具有在位置581處具有突變的SEQ ID NO: 130之胺基酸序列。在一些情況下，載體具有在位置581處具有突變的SEQ ID NO: 1-3中之任一者之胺基酸序列。
在一些情況下，載體包含表 1 或表 2 中之任一者之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成，該胺基酸序列具有C端缺失、取代及/或添加，由此產生降低或消融之ADP核糖基化活性。此類缺失、取代及/或添加維持轉運功能性，諸如胞移轉送或胞吞。如此，本文中之載體中之一些單獨或與異種負載一起胞移轉送，而本文中之載體中之一些單獨或與異種負載一起胞吞。
在一些情況下，相較於衍生自第二Cholix多肽之第二載體，衍生自第一Cholix多肽之第一載體可具有不同特性。此類特性可包括載體將異種負載轉運穿過極化上皮細胞(或細胞層)之能力、載體之穩定性(例如，活體內穩定性或活體外穩定性，諸如貯藏壽命)、載體在諸如大腸桿菌(E. coli )或CHO細胞之表現系統中進行功能表現的能力、載體例如使用層析方法進行純化之能力。其可出人意料地展示，相較於具有SEQ ID NO: 3及/或126之序列的衍生自Cholix多肽之第二載體，具有SEQ ID NO: 1之序列的衍生自Cholix多肽之第一載體可具有以下特性中之一或多者：(i)增強之胞移轉送功能(例如，用於將負載轉運穿過上皮細胞之增加的轉運速率)；(ii)在大腸桿菌及/或CHO細胞中展示經改良功能表現(例如，較高生產率)；(iii)經改良純化特性(例如，較高純度及回收率)；及(iv)增強之活體內穩定性(例如，增加之蛋白酶及/或pH穩定性)。
胞移轉送載體可將偶合於其之負載轉運穿過上皮細胞。此類轉運可在試管內進行，例如使用上皮細胞單層，諸如Caco-2或SMI-100細胞單層。在其他情況下，此類轉運可在活體內進行，例如穿過個體(例如，嚙齒動物或人類)之腸道上皮至黏膜下層室(諸如固有層)中。
胞移轉送載體之作用機制可涉及以下中之一或多者：經由與TMEM132、LMAN1及/或GPR75相互作用受體介導之胞吞至極化上皮細胞中、經由與GRP75相互作用回避溶酶體破壞途徑、經由與ERGIC受體(例如，ERGIC-53)相互作用的頂端至基底轉運，以及經由與串珠素(HSPG)相互作用自基底膜釋放至黏膜下層室(諸如固有層)中。
胞移轉送載體可為與以下內源蛋白中之一或多者相互作用的載體：TMEM132A、GPR75、ERGIC蛋白及串珠素(HSPG)，如實例 10 及實例 12 中所展示。胞移轉送載體與諸如TMEM132A之頂端進入受體的相互作用可使得載體能夠頂端進入至極化上皮細胞中。胞移轉送載體與諸如GRP75之溶酶體回避受體的相互作用可使得載體及偶合於其之負載能夠避免溶酶體降解，由此允許轉運未更改且功能完整之載體及負載。胞移轉送載體與諸如ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)之頂端至基底轉運蛋白的相互作用可在胞吞時允許載體移動至上皮細胞之基底位點。胞移轉送載體與諸如串珠素之基底釋放蛋白的相互作用可使得載體能夠進入基底再循環系統，且將載體胞外分泌至諸如黏膜下層室(例如，固有層)之基側室中。
此外，胞移轉送載體可與中之任一者或多者共定位：用於攔截內源頂端至基底轉運機構之包衣蛋白I (COPI)早期核內體抗原1 (EEA1)；及用於進入基底分泌系統之上皮細胞之基底側處的Ras相關蛋白11a (Rab11a)，如實例 10 中所展示。
在一些情況下，胞移轉送載體在轉運穿過此上皮細胞期間不與Ras相關蛋白7 (Rab7)及/或溶酶體結合膜蛋白1 (LAMP1)共定位，從而使得此載體能夠避免溶酶體降解，如實例 10 中所展示。
胞移轉送載體之實例包括具有SEQ ID NO 1-78或130中之任一者之C端截斷的彼等，其中C端截斷可出現於在位置195處之C端殘基之後的任何胺基酸位置處之多肽之C端處(例如，在SEQ ID NO: 1-2之位置195-634中之任一者處的截斷)。截斷之胺基酸位置可使用與共有序列SEQ ID NO: 130或參考序列SEQ ID NO: 1、2或3中之任一者比對的序列來測定。下表 3 藉由鑑別此類載體之各種胺基酸殘基序列及SEQ ID NO 1-78或130可於此經截斷之C端位置來說明例示性載體。在一些情況下，胞移轉送載體包括具有SEQ ID NO 1-2或4-78中之任一者之C端截斷的彼等。表 3- 鑑別 SEQ ID NO: 1-78 或 130 中 之任一者之胺基酸殘基的例示性胞移轉送載體
AA 殘基 AA 殘基 AA 殘基
1-195 1-246 1-297
1-196 1-247 1-298
1-197 1-248 1-299
1-198 1-249 1-300
1-199 1-250 1-301
1-200 1-251 1-302
1-201 1-252 1-303
1-202 1-253 1-304
1-203 1-254 1-305
1-204 1-255 1-306
1-205 1-256 1-307
1-206 1-257 1-308
1-207 1-258 1-309
1-208 1-259 1-310
1-209 1-260 1-311
1-210 1-261 1-312
1-211 1-262 1-313
1-212 1-263 1-314
1-213 1-264 1-315
1-214 1-265 1-316
1-215 1-266 1-317
1-216 1-267 1-318
1-217 1-268 1-319
1-218 1-269 1-320
1-219 1-270 1-321
1-220 1-271 1-322
1-221 1-272 1-323
1-222 1-273 1-324
1-223 1-274 1-325
1-224 1-275 1-326
1-225 1-276 1-327
1-226 1-277 1-328
1-227 1-278 1-329
1-228 1-279 1-330
1-229 1-280 1-331
1-230 1-281 1-332
1-231 1-282 1-333
1-232 1-283 1-334
1-233 1-284 1-335
1-234 1-285 1-336
1-235 1-286 1-337
1-236 1-287 1-338
1-237 1-288 1-339
1-238 1-289 1-340
1-239 1-290 1-341
1-240 1-291 1-342
1-241 1-292 1-343
1-242 1-293 1-344
1-243 1-294 1-345
1-244 1-295 1-346
1-245 1-296 1-347
此類胞移轉送載體可進一步在其達至N端位置20之胺基酸位置處的N端處經截斷(例如，在N端位置17 (開始於位置18)處截斷的SEQ ID NO: 79)。
本文中亦涵蓋此類與表 3 中所展示之載體序列中之任一者具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胞移轉送載體。
在一種情況下，載體包含在位置386處具有C端截斷之SEQ ID NO: 1。在一種情況下，載體包含在位置386處具有C端截斷之SEQ ID NO: 2。在一種情況下，載體包含在位置386處具有C端截斷之SEQ ID NO: 4-79。在一種情況下，載體包含在位置386處具有C端截斷之SEQ ID NO: 130。在此類情況下，序列不包括在位置386處具有C端截斷之SEQ ID NO: 3。在此類情況下，序列不包括SEQ ID NO: 126。
當衍生自Cholix之載體在位置386處具有C端截斷時，其在本文中可稱為Cholix386 。「386」表示當序列為SEQ ID NO: 130之部分或與其比對時，在與位置386最接近比對的胺基酸之後的C端截斷。cholix386 不需要多肽中具有386個胺基酸。舉例而言，SEQ ID NO: 79在位置386處之截斷產生短於386個胺基酸殘基之載體。Cholix386 載體分子之實例包括在其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 130比對或其針對最高序列一致性與SEQ ID NO: 1-3中之任一者比對時，在位置386處截斷的SEQ ID NO: 1-79或130中之任一者，例如以胺基酸殘基「AQA」結束。
Cholix386 亦可包括維持與SEQ ID NO: 180實質上相同功能但具有一或多個添加/缺失/取代且與本文中所描述之Cholix386 分子具有至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的多肽。
胞移轉送衍生自Cholix之載體之另一實例為Cholix266 。在一種情況下，Cholix266 由SEQ ID NO: 181之胺基酸序列組成。其他Cholix266 片段可包括在其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 130比對或其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 1-3中之任一者比對時，在胺基酸位置266處截斷的SEQ ID NO: 1-78中之任一者之彼等。可替代地，載體可具有在位置266處之C端處截斷的式 I (SEQ ID NO: 130)之任何序列。
胞移轉送衍生自Cholix之載體之另一實例為Cholix251 。在一種情況下，Cholix251 由SEQ ID NO: 182之胺基酸序列組成。其他Cholix251 片段可包括在其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 130比對或其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 1-3中之任一者比對時，在胺基酸位置251處截斷的SEQ ID NO: 1至78中之任一者之彼等。可替代地，載體可具有在位置251處之C端處截斷的式 I (SEQ ID NO: 130)之任何序列。
胞移轉送衍生自Cholix之載體之另一實例為Cholix245 。在一種情況下，Cholix245 由SEQ ID NO: 183之胺基酸序列組成。其他Cholix245 片段包括在其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 130比對或其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 1-3中之任一者比對時，在胺基酸位置245處截斷的SEQ ID NO: 1-79中之任一者之彼等。可替代地，載體可具有在位置245處之C端處截斷的式 I (SEQ ID NO: 130)之任何序列。
胞移轉送衍生自Cholix之載體之另一實例為Cholix206 。在一種情況下，Cholix206 由SEQ ID NO: 184之胺基酸序列組成。其他Cholix206 片段包括在其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 130比對或其針對最高序列一致性與SEQ ID NO 1-3中之任一者比對時，在胺基酸位置206處截斷的SEQ ID NO: 1-78中之任一者之彼等。可替代地，載體可具有在位置206處之C端處截斷的式 I (SEQ ID NO: 130)之任何序列。
載體之其他實例包括在闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的序列之胺基酸位置195-634中之任一者處具有C端截斷的彼等。較佳地，此截斷在闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的序列之195-347中之任一者之胺基酸位置處。
在N端處，胞移轉送載體可具有SEQ ID NO: 1-78或130之胺基酸1-20中之任一者。在一些實施例中，載體之N端具有SEQ ID NO: 1或2之胺基酸殘基1-20 (在位置1-20處的100%序列一致性)，或與SEQ ID NO: 1或2之胺基酸殘基1-20具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，N端處之前四個胺基酸為VEEA (SEQ ID NO: 185)。在一些實施例中，此載體不包含SEQ ID NO: 126。在一些實施例中，載體之N端具有式 I (SEQ ID NO: 130)之胺基酸殘基1-20。此載體中之任一者可視情況具有如本文中所描述之N端修飾。此N端修飾可為N端甲硫胺酸。此類載體之實例為包含闡述於SEQ ID NO: 131-135中之任一者中的胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成的彼等。
如此，胞移轉送載體可包含以下、基本上以下組成或由以下組成：與闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的胺基酸序列之位置1至位置205-275中之任一者處的胺基酸殘基中之任一者的胺基酸殘基具有至少約80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性或具有100%序列一致性的胺基酸序列。
在此類情況下，胞移轉送載體由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的胺基酸殘基之胺基酸殘基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205。在各種情況下，此載體可由以下組成或基本上由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-78中之任一者中的相同胺基酸殘基之胺基酸殘基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205。
特定言之，在一些情況下，此胞移轉送載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列之胺基酸殘基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205。
可替代地，在一些情況下，此胞移轉送載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 2中的胺基酸序列之胺基酸殘基1-275、1-266、1-265、2-265、3-265、4-265、5-265、1-251、1-250、2-250、3-250、4-250、5-250、1-245、2-245、3-245、4-245、5-245、1-206、1-205、2-205、3-205、4-205或5-205。
載體可進一步在其N端處經修飾。此類N端修飾包括可增強多肽之表現及/或穩定性的官能基。此類端修飾可由以下名稱「FG-載體」說明，其中FG為連接至載體之N端的官能基。本文中涵蓋之官能基之實例包括用於細菌表現之甲硫胺酸及用於在CHO細胞或HEK-293細胞中表現之其他信號序列。具有N端甲硫胺酸之胞移轉送載體之實例包括具有闡述於SEQ ID NO: 131-135中之任一者中的胺基酸序列的彼等(表 4 )。應注意，官能基亦可偶合於載體之C端。表 4 - 例示性胞移轉送 衍生自 Cholix 之載體
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO: 131    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLA
SEQ ID NO: 132    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKV
SEQ ID NO: 133    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQG
SEQ ID NO: 134    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
SEQ ID NO: 135    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
SEQ ID NO: 184    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLA
SEQ ID NO: 183    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKV
SEQ ID NO: 182    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQG
SEQ ID NO: 181    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
SEQ ID NO: 180    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
SEQ ID NO: 178    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK
SEQ ID NO: 191    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESCENLFQ
SEQ ID NO: 192    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQACENLFQ
SEQ ID NO: 193    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESCENLFQSGTCHHHHHH
SEQ ID NO: 194 MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQACENLFQSGTCHHHHHH
使用具有SEQ ID NO: 178之胺基酸序列的衍生自Cholix之載體的晶體結構資訊，鑑別出可在胞吞及胞移轉送中起作用之少數區域。此類區域在本文中稱為X1 、X2 、X3 、X4 、X5 。X1 橫跨胺基酸殘基17-25，具有SEQ ID NO: 160之胺基酸序列，且可例如藉由允許載體與ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)之相互作用而在載體之頂端至基底轉運中起作用。X2 橫跨胺基酸殘基170-176，具有SEQ ID NO: 161之胺基酸序列，且可例如藉由允許載體與ERGIC蛋白之相互作用而在載體進入核上室及自上皮細胞之頂端移動至基底位點中起作用。X3 橫跨胺基酸殘基186-202，具有SEQ ID NO: 162之胺基酸序列，且可例如藉由允許載體與基底釋放蛋白(諸如串珠素)之相互作用而在將載體基底釋放至基側室中起作用。X4 橫跨胺基酸殘基31-39，具有SEQ ID NO: 163之胺基酸序列，且可例如藉由允許載體與ERGIC蛋白之相互作用而在將載體自上皮細胞之頂端位點移動至基底位點中起作用。X5 橫跨胺基酸殘基135-139，具有SEQ ID NO: 164之胺基酸序列，且可例如藉由允許載體與頂端進入受體(諸如TMEM132)之相互作用而在載體頂端進入至上皮細胞中起作用。
因此，在一些實施例中，胞移轉送載體包括在X1 、X2 、X3 、X4 及/或X5 處的SEQ ID NO: 1-78或130中之任一者之胺基酸殘基。舉例而言，本文中之載體可具有SEQ ID NO: 1或2之胺基酸1-266或與其具有顯著序列一致性的序列；然而，限制條件為X1 、X2 、X3 、X4 及X5 中之任何一或多者與SEQ ID NO: 1或2之彼等一致。在一個實施例中，X1 、X2 、X3 、X4 、X5 中之所有與SEQ ID NO: 1或2之彼等一致。對於本文中所描述之所有其他載體及衍生自Cholix之載體(諸如表 3 或表 4 中所提供之彼等)同樣可如此表達。
在一些實施例中，胞移轉送載體不包括具有闡述於SEQ ID NO: 1-78或130中的Cholix序列多肽中之任何一或多者之序列的彼等。在一些情況下，不包括具有以下之彼等多肽：闡述於SEQ ID NO: 3中的序列或在殘基425-348、291、266、265、251、250、245、244、234、206、205、187、186、151、150、134、133處具有C端截斷之經截斷SEQ ID NO: 3，以及由SEQ ID NO: 3之殘基40-187組成的片段。在一些實施例中，胞移轉送載體不包括包含SEQ ID NO: 126之序列、基本上由其組成或由其組成的彼等。
出人意料地，亦鑑別出短於胞移轉送載體的載體可將異種負載轉運至極化上皮細胞中而不顯著將此負載轉運穿過上皮細胞。此類載體在本文中可稱為「胞吞載體」。胞吞載體可在上皮細胞之胞內囊泡或胞溶質中結束。
胞吞載體之實例包括具有式 I (SEQ ID NO: 130)之位置1-40中之任一者至位置145-194中之任一者的胺基酸殘基的彼等。在一些實施例中，胞吞載體具有SEQ ID NO: 1-80或82-120中之任一者的的胺基酸序列，其在胺基酸位置145-194中之任一者處具有C端截斷。
此外，胞吞載體中之任一者可進一步具有N端截斷。此N端截斷可自載體之N端移除至多40個胺基酸。舉例而言，本文中涵蓋分別在表示SEQ ID NO: 130之胺基酸位置41-44及40-44的在N端處具有胺基酸VLYY (SEQ ID NO: 186)或GVLYY (SEQ ID NO: 187)的載體。在一些情況下，相較於闡述於SEQ ID NO: 1-80或82-120或SEQ ID NO: 130中之任一者中的胺基酸序列之胺基酸41至C端(例如，在選自位置145-194之胺基酸殘基處的C端)，載體在位置1-40處包含較高程度之序列差異。載體最佳包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的胺基酸序列之位置1-20中之任一者至位置150-187中之任一者，或位置21-41處之胺基酸殘基中之任一者至位置187或205處之胺基酸殘基的胺基酸殘基。表 5 提供例示性胺基酸殘基，胞吞載體可包含該等例示性胺基酸殘基、基本上由其組成或由其組成。表 5-SEQ ID NO: 1-78 或 130 中之 任一者之 Cholix 載體之例示性胺基酸殘基
Cholix AA 殘基 Cholix AA 殘基
1-150 1-178
1-151 1-179
1-152 1-180
1-153 1-181
1-154 1-182
1-155 1-183
1-156 1-184
1-157 1-185
1-158 1-186
1-159 1-187
1-160 22-187
1-161 23-187
1-162 24-187
1-163 25-187
1-164 26-187
1-165 27-187
1-166 28-187
1-167 29-187
1-168 30-187
1-169 31-187
1-170 32-187
1-171 33-187
1-172 34-187
1-173 35-187
1-174 38-187
1-175 39-187
1-176 40-187
1-177 41-187
在一些情況下，此載體在式 I (SEQ ID NO: 130)之位置39處具有N端截斷。在其他情況下，此載體在式 I (SEQ ID NO: 130)之位置40處具有N端截斷。當此載體亦在闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的序列之位置145-206處之胺基酸殘基中之任一者處的其C端處截斷(亦即，具有殘基145-206中之任一者之C端殘基)時，此載體可用於將負載胞吞至上皮細胞中且將此負載轉運至此上皮細胞之頂端室(參見例如實例 4 )。本文中所描述之此等胞吞載體中之任一者亦可包含N端修飾，諸如N端甲硫胺酸。此載體之實例為包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的彼等：SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 137)之胺基酸殘基41-187或SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 138)之胺基酸殘基40-205。
在一些實施例中，胞吞載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-78或130中的序列中之任一者之胺基酸殘基1-150。在一些實施例中，胞吞載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-78或130中的序列中之任一者之胺基酸殘基1-151。在一些實施例中，胞吞載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-78或130中的序列中之任一者之胺基酸殘基1-186。在一些實施例中，胞吞載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-78或130中的序列中之任一者之胺基酸殘基1-187。在一種情況下，載體具有SEQ ID NO: 1之胺基酸1-150、1-151、1-186或1-187。在另一情況下，載體具有SEQ ID NO: 2之胺基酸1-150、1-151、1-186、1-187。
本文中之胞吞載體中之任一者可具有連接至其N端的官能基(諸如甲硫胺酸)。具有N端甲硫胺酸之胞吞載體之實例包括具有闡述於SEQ ID NO: 136或139中之任一者中之序列的彼等。
在其他情況下，此胞吞載體包含闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的胺基酸序列之位置40或41至位置187-206處之胺基酸殘基中之任一者的胺基酸殘基。
在此類情況下，胞吞載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-80、82-120或130中的序列中之任一者之胺基酸殘基40-187或41-187。在其他情況下，能夠將異種負載轉運至極化上皮細胞中之載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1-80、82-120或130中的序列中之任一者之胺基酸殘基40-205或41-205。
此載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基40-187、41-187、40-205或41-205。此類載體之例示性胺基酸序列包括由闡述於SEQ ID NO: 137及138中的胺基酸序列組成、基本上由其組成或包含其的彼等。此類載體可能夠將負載轉運至極化上皮細胞之頂端室而非轉運至基底室，此係因為彼等載體缺失可在頂端至基底轉運中起作用的胺基酸殘基1-39。
胞吞載體可包含由闡述於式I (SEQ ID NO: 130)中的胺基酸序列之位置134至位置151之胺基酸殘基組成的胞吞片段。在一些情況下，此功能片段具有闡述於SEQ ID NO: 165中的序列或與其具有高(例如，＞90%)序列一致性。例示性載體包括可由闡述於SEQ ID NO: 136-139中之任一者中的胺基酸序列組成、基本上由其組成或包含其的彼等(表 6 )。缺失具有SEQ ID NO: 166-167 (表 11 )之一個或兩個功能片段的載體可將異種負載轉運至上皮細胞之頂端室，該等頂端室可包括頂端囊泡中、細胞之頂端胞溶質中及/或頂端再循環系統 (諸如頂端再循環核內體)中之位置。此載體可與諸如TMEM132 (例如，TMEM132A)之頂端進入受體相互作用，但不或不顯著與基底遷移蛋白或串珠素(HSPG)相互作用，且可在胞吞後與Rab11a共定位於上皮細胞之頂端室中。在一些情況下，此載體可由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：闡述於SEQ ID NO: 137-139 (表 6 )中之任一者中的胺基酸序列。表 6- 例示性胞吞 衍生自 Cholix 之載體
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO: 136    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA
SEQ ID NO: 137    MVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA
SEQ ID NO: 138    MGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGL
SEQ ID NO: 139    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDL
在其他實施例中，胞吞載體可包含分別由闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的胺基酸序列之位置1至位置40及位置152至位置187之胺基酸殘基組成的功能片段。在一些情況下，此類片段具有分別闡述於SEQ ID NO: 166及167中之胺基酸序列，或與此類功能片段中之一者或兩者具有高(例如，＞90%)序列一致性。此載體可與頂端至基底遷移受體相互作用，但不顯著與串珠素相互作用。此遷移受體使得此載體能夠將負載轉運至極化上皮細胞之核上室及/或基底室。此載體可由以下組成、基本上由以下組成或包含以下：SEQ ID NO: 130之胺基酸1-187。此載體之一實例為具有闡述於SEQ ID NO: 136中之序列的載體。
在一些情況下，胞吞載體不為闡述於SEQ ID NO: 3中之序列的片段。在一些情況下，此載體不為闡述於SEQ ID NO: 4-80或82-120中之序列中之任一者的片段。在此類情況下，載體不包含以下或不由以下組成：SEQ ID NO: 3之胺基酸殘基1-151、1-187或40-187。D. 載體之功能序列區域
在本文中之實施例中之任一者中，載體序列內之一或多個功能序列區域可與發現於式 I (SEQ ID NO: 130)中之彼等區域中的胺基酸殘基具有局部較高(例如，＞90%)序列一致性以便維持眾多多肽及實施例之功能性。在一些情況下，彼等區域中之胺基酸殘基可能受限於發現於天然存在之Cholix多肽中的彼等，諸如具有闡述於SEQ ID NO: 1-80或82-120中之任一者中之序列的彼等。1. 胞吞域
在一些情況下，載體包含允許載體進入頂端位點上之上皮細胞(例如，極化上皮細胞)的域。在一些情況下，此域允許載體與頂端進入受體相互作用。此頂端進入受體可為TMEM132或TMEM132A。此TMEM132相互作用域可具有式 I (SEQ ID NO: 130)之胺基酸殘基135-殘基151或SEQ ID NO: 1-120中之任一者的位置135-151之胺基酸殘基的共有序列。TMEM132A為負責使載體頂端進入至上皮細胞中之跨膜蛋白。為維持載體與TMEM132A之相互作用，在一些實施例中，本文中之載體包括闡述TMEM132A相互作用域之共有序列的SEQ ID NO: 165。可替代地，本文中之載體可包括SEQ ID NO: 1-120或130中之任何一或多者的胺基酸殘基135-151作為其TMEM132相互作用域。
此外，出人意料地假定，TMEM132相互作用域內之子區可尤其與載體之頂端進入相關。因此，本文中之載體可經由相互作用區域與頂端進入受體(諸如TMEM132)相互作用，該相互作用區域具有具SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基135-139的胺基酸基序(例如，SEQ ID NO: 1；SEQ ID NO: 164之「DQQRN」)。因此，本文中之載體中之任一者(包括其多肽)可包括此類基序或整個TMEM132相互作用域(例如，SEQ ID NO: 165)以便提供至頂端側上之上皮細胞中的進入。因為此類區域可在載體內具有功能，故此類區域中之胺基酸序列可為保守性的，或僅具有作為取代、插入及/或缺失之至多1、2或3個胺基酸殘基。
本文中之載體中之任一者可包括TMEM132相互作用域或受體相互作用區域以便進入上皮細胞。舉例而言，包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-151的載體(其包括SEQ ID NO: 165之TMEM132相互作用域)可進入頂端側上之上皮細胞。類似地，Cholix266 載體(諸如包含SEQ ID NO: 1 (例如，SEQ ID NO: 181)之胺基酸殘基1-266的載體)包括TMEM132域，且可經由TMEM132域進入上皮細胞之頂端側且將異種負載轉運穿過極化上皮細胞。包含TMEM132相互作用域之其他例示性載體為Cholix187 、Cholix206 、Cholix245 、Cholix251 及Cholix386 (例如，SEQ ID NO: 136及180-184)。在一些情況下，載體為具有SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-187、1-206、1-245、1-251、1-266或1-386的載體。
另一方面，缺乏TMEM132相互作用域之載體(諸如具有SEQ ID NO: 140之M-Cholix134 )可保持在腸內腔中，且不或不顯著(例如，將少於10%之載體材料施加至頂端表面)進入上皮細胞(參見例如實例 6 )。2. 核上室及基底室靶向域
在一些情況下，載體包含闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的序列之N端胺基酸殘基1-40。在將載體胞吞至細胞中之後，此載體可用於將異種負載自上皮細胞之頂端室轉運至核上室或基底室(且若載體亦可與諸如串珠素之基底釋放蛋白相互作用，則至黏膜下層室中)。此類載體之實例包括包含闡述於SEQ ID NO: 131-135中之胺基酸序列的彼等(表 4 )。
在一些情況下，載體包含闡述於式 I (SEQ ID NO: 130)中的序列之胺基酸殘基17-25及/或31-39。此類區域可能受限於發現於天然存在之Cholix多肽中的彼等胺基酸殘基，或包括至多1、2、3或4個胺基酸取代、插入及/或缺失。取代可為一或多個保守性或非保守性取代。1、2、3或4個胺基酸取代、插入及/或缺失可保留胺基酸17-25及/或31-39之功能。在一些情況下，載體在17-25及/或31-39處具有天然存在之序列。在此類情況下，載體之胺基酸17-25可具有SEQ ID NO: 160之序列，且/或載體之胺基酸31-39可具有SEQ ID NO: 163之序列。胺基酸17-25及31-39之功能可為頂端至基底轉運。此功能可如本文中別處所描述例如藉由產生在此類殘基處包含N端截斷之載體來測定且將此等載體之頂端至基底轉運能力與不具有N端截斷的彼等進行比較(參見例如實例 5 及實例 6 )。包含此類區域且能夠進行頂端至核上及/或基底轉運的例示性載體可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 1中的序列之胺基酸殘基1-187、1-206、1-245、1-251、1-266及1-386。在此類情況下，載體可由闡述於SEQ ID NO: 131至136中之任一者中的胺基酸序列組成。
在一些情況下，載體使用額外域來進入核上室及/或基底室。此域可具有式 I (SEQ ID NO: 130)之胺基酸殘基152-187或SEQ ID NO: 1-120中之任一者之位置152-187之胺基酸殘基的共有序列。此域之功能可為進入上皮細胞內之核上區域，達至上皮細胞內之基底室，及/或用於使載體與反式高爾基體網狀物之元件(諸如包衣蛋白I (COPI))共定位。
舉例而言，包括此核上及基底靶向區的諸如Cholix187 或Cholix206 之載體(例如，分別具有闡述於SEQ ID NO: 136及131中之序列的載體)可能夠進入上皮細胞內之核上區域及基底室，而諸如Cholix151 之不具有此域之載體(例如SEQ ID NO: 139)保持在上皮細胞之頂端側處且不顯著進入核上區域或基底室(參見例如實例 6 )。
咸信，SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基170-176之序列(例如，「TRPEHNI」，SEQ ID NO: 161)可尤其與將進入此類核上室及基底室且與COPI共定位的載體相關。
因此，在一些情況下，載體包含核上及基底靶向域，或式I (SEQ ID NO: 130)之胺基酸殘基170-176之共有序列，或SEQ ID NO: 161 (對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基170-176)。此載體亦可包括如上文所描述之TMEM132A相互作用域。
核上及基底靶向域為可具有最小序列變化之域。如此，本文中之載體可包含具有天然存在之多肽之胺基酸殘基(諸如具有SEQ ID NO: 3-120之彼等)的核上及基底靶向域，或可相對於天然存在之多肽之殘基(諸如具有SEQ ID NO: 3-120之彼等)僅包含作為取代、插入及/或缺失之至多1、2或3個胺基酸殘基。
包含核上靶向域之例示性載體為Cholix187 、Cholix206 、Cholix245 、Cholix251 、Cholix266 及Cholix386 。在一些情況下，載體為具有SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-187、1-206、1-245、1-251、1-266或1-386的載體。3. 胞移轉送域
在一些情況下，載體包含胞移轉送域。此域較佳地可包括式 I (SEQ ID NO: 130)之胺基酸殘基188-206或SEQ ID NO: 1-120中之任一者之位置188-206之胺基酸殘基的共有序列。胺基酸殘基188-206之功能可為多重的，且可在胞移轉送中起作用。胞移轉送區域可允許載體以pH依賴性及/或依序方式與如相互作用配偶體(在本文中亦稱為「TRIP」)、內質網高爾基體中間室53 (ERGIC-53，在本文中亦稱為LMAN1)、葡萄糖調節蛋白75 (GRP75)及串珠素的轉運受體相互作用。此類相互作用可允許載體進入基底再循環系統，該等基底再循環系統將載體(與偶合於其之任何異種負載一起)自上皮細胞之基底膜釋放至基側室(例如，固有層)中。
能夠進行胞移轉送之載體之實例包括衍生自Cholix之載體，諸如Cholix206 、Cholix245 、Cholix251 、Cholix266 及Cholix386 。在一些情況下，此類載體具有具SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266及1-386的彼等之胺基酸序列。在一些情況下，此類載體具有具SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266及1-386的彼等之胺基酸序列。在一些情況下，此類載體具有具SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266及1-386的彼等之胺基酸序列。具有官能基N端甲硫胺酸之此類載體之實例提供於SEQ ID NO: 131- SEQ ID NO: 135中。此載體(例如，Cholix206 、Cholix245 、Cholix251 、Cholix266 及Cholix386 )可用於迅速地(例如，至少10-6 cm/sec、10-5 cm/sec)且有效地(例如，將至少5%、10%、20%、25%或50%之材料施加至頂端表面)將負載轉運穿過上皮細胞(參見例如實例 5 )。
假定具有其一或多個組胺酸殘基的胺基酸殘基188-206 (例如，「AQKEGSRHKRWAHWHTGLA」SEQ ID NO: 168)之序列可充當pH開關，由此允許載體以依序及/或pH依賴性方式與諸如TMEM132之TRIP、LMAN1、GRP75及串珠素相互作用。
下表 7 展示本文中所描述的額外衍生自Cholix之多肽序列。表 7 - 衍生自 Cholix 之多肽序列之額外實例
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO: 140    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDEL
SEQ ID NO: 179    VEDELNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINE
SEQ ID NO: 189    VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDTVIGWDMAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKERKDELK
III. 異種負載
本文中涵蓋之異種負載可具有任何性質，包括治療、診斷及成像。負載可為遞送構築體之部分。遞送構築體可包括偶合於異種負載之載體。負載可直接或間接、共價或非共價地偶合於載體。當共價連接時，負載可直接或經由間隔子連接至載體。
異種負載可為小分子、核酸、多肽、蛋白質、奈米粒子，或其組合。 治療負載
在一些情況下，治療負載為多肽，諸如例如細胞介素、激素、生長因子、治療抗體、核酸、抗原、酶、凝血因子、神經傳遞素或聚合物。
本文中提供之細胞介素包括趨化介素及介白素(本文中亦縮寫為「IL」)。介白素可為IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36、IL-37、IL-38、IL-39或IL-40。
在一些情況下，介白素為IL-10或IL-22。介白素可來自任何物種(例如，來自人類或嚙齒動物)，且較佳地來自意欲向其投與負載或包含此負載之遞送構築體的生物體。因此，在一些情況下，介白素為人類介白素。本文中提供之介白素可為成熟、所分泌介白素之前驅體。此前驅體介白素可包含信號肽序列。舉例而言，在一些情況下，治療負載可為成熟、所分泌蛋白之前驅體。在其他情況下，治療負載為所分泌蛋白。舉例而言，在一些情況下，負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO 141，其為IL-22之全長前驅體。在其他情況下，負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 142，其為IL-22之分泌形式。在另一實例中，負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO 144，其為IL-10之全長前驅體。在其他情況下，負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO: 145，其為IL-10之分泌形式。
異種負載可包含N端甲硫胺酸。舉例而言，IL-22負載可包含N端甲硫胺酸。在此類情況下，IL-22可具有SEQ ID NO: 143之序列。
在一些實施例中，治療負載為IL-22。IL-22可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 141或SEQ ID NO: 142中之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，或其功能片段。在一些實施例中，治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 142中之胺基酸序列。
在一些實施例中，治療負載為IL-10。IL-10可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 144或SEQ ID NO: 145中之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，或其功能片段。在一些實施例中，治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：闡述於SEQ ID NO: 145中之胺基酸序列。
本文中提供之激素可包括肽及多肽激素。此類激素可包括生長激素，例如人類生長激素(在本文中亦稱為hGH或促生長素)；垂體激素，例如絨膜促性腺激素、促皮質素(cosyntropin)、促生育素(menotropins)、促腎上腺皮質激素(iorticotropin)、促甲狀腺素釋放激素(protirelin)、促甲狀腺激素(thyrotropin)、升壓素(vasopressin)、賴胺酸加壓素(lypressin)；副甲狀腺激素；甲狀腺激素；睾丸激素；腸胃激素，例如抑胃多肽、表皮生長因子尿抑胃激素、抑胃多肽、胃泌素釋放肽、胃泌素、五肽胃泌素、四肽胃泌素、腸動素、神經肽Y、肽YY、腸泌素、血管活性腸肽、辛卡利特(sincalide)；促胰島素激素，例如升糖素樣肽-1 (GLP-1)及葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)；代謝激素，例如胰島素；及其任何衍生物或片段。
在一些實施例中，激素為人類生長激素，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 146或190中之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，或其片段。
在一些實施例中，治療負載為葡萄糖降低劑。在此類情況下，負載可為GLP-1藥劑或GLP-1促效劑。此類促效劑可為艾塞那肽或利拉魯肽(Liraglutide)。在其他情況下，葡萄糖降低劑可為促胰島素、升糖素前蛋白、升糖素樣肽(例如，除GLP-1以外)、胰高糖素相關多肽、艾生丁(exendin)-3、艾生丁-4、利司那肽(lixisenatide) (商標Adlyxin®及Lyxumia®，Sanofi)、利拉魯肽(商標Victoza®，Novo Nordisk A/S)、司美魯肽(semaglutide) (商標Ozempic®，Novo Nordisk A/S)、阿必魯肽(albiglutide) (商標Tanzeum®、GlaxoSmithKline；融合於白蛋白之GLP-1二聚體)、度拉糖肽(dulaglutide) (商標Trulicity®，Eli Lilly)、葡萄糖依賴性促胰島素多肽、泰帕肽(Tirzepatide) (Eli Lilly)、雙重澱粉素降鈣素受體促效劑DACRA-089、甘精胰島素(Glargine)/Lantus®、葡萄糖苷(Glulisin)/Apidra®、甘精胰島素(Glarine)/Toujeo®、Insuman®、地特胰島素(Detemir)/Levemir®、賴脯胰島素(Lispro)/Humalog®/Liprolog®、Humulin®、鄰傑他(Linjeta)、SuliXen®、NN1045、胰島素加辛姆林TM、PE0139、快效及短效胰島素(例如，鄰傑他、PH20、NN1218、亨絲貝特(HinsBet))、(APC-002)水凝膠、經口、可吸入、經皮及舌下胰島素(例如，Exubera®、Nasulin®、Afrezza®、Tregopil®、TPM 02、卡普蘇林(Capsulin)、Oral-lyn®、Cobalamin®、經口胰島素、ORMD-0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab及奧莎迪(Oshadi)經口胰島素)。
在一些情況下，治療負載為治療抗體或其結合片段。治療抗體可包括抗TNFα抗體。此類抗TNFα抗體可為人類化或人類抗體。抗TNFα藥劑可包括英利昔單抗(infliximab) (Remicade®)、阿達木單抗(adalimumab) (Humira®)或依那西普(etanercept) (ENBREL®)。
在一些情況下，負載為抗贅生性劑。抗腫瘤劑可包括：亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈黴素(strepzotocin)；甲基肼，例如丙卡巴肼(procarbazine)、達卡巴嗪(dacarbazine)；甾類激素，例如糖皮質素、雌激素、孕激素、雄激素、四氫去氧皮質固酮(tetrahydrodesoxycaricosterone)；免疫活性化合物，諸如免疫抑制劑，例如乙胺嘧啶、三甲基蝶呤、青黴胺、環孢靈(cyclosporine)、硫唑嘌呤(azathioprine)；及免疫刺激劑，例如左旋咪唑(levamisole)、二乙基二硫胺基甲酸鹽、腦啡肽(enkephalin)、內啡肽(endorphin)；抗微生物化合物，諸如抗生素，例如β-內醯胺、青黴素(penicillin)、頭孢菌素(cephalosporin)、碳青黴烯(carbapenims)及單醯胺菌素(monobactam)、β-內醯胺酶抑制劑、胺基糖苷、大環內酯、四環素、大觀黴素(spectinomycin)；抗瘧疾藥、抗阿米巴(amebicide)；抗原蟲劑(antiprotazoal)；抗真菌劑，例如兩性黴素-β，抗病毒劑，例如阿昔洛韋(acyclovir)、碘苷(idoxuridine)、利巴韋林(ribavirin)、三氟尿苷、阿糖腺苷(vidarbine)、更昔洛韋(gancyclovir)；殺寄生蟲劑；驅腸蟲藥(antihalmintic)；放射性藥物；腸胃藥物；血液科化合物；免疫球蛋白；血液凝固蛋白，例如抗嗜血性因子、因子IX複合物；抗凝劑，例如雙香豆素(dicumarol)、肝素Na；溶纖維劑抑制劑，例如胺甲環酸；心血管藥物；周邊抗腎上腺素藥物；中央作用抗高血壓藥物，例如甲基多巴(methyldopa)、甲基多巴HCl；抗高血壓直接血管擴張劑，例如二氮嗪、肼酞嗪HCl；影響腎素血管緊張素系統之藥物；周邊血管擴張劑，例如芬托拉明(phentolamine)；抗心絞痛藥物；強心苷；強心擴張劑，例如胺利酮(amrinone)、米利酮(milrinone)、依諾昔酮(enoximone)、芬諾昔酮(fenoximone)、伊馬唑旦(imazodan)、硫馬唑(sulmazole)；抗節律紊亂藥；鈣進入阻斷劑；影響血脂之藥物，例如雷尼替丁(ranitidine)、波生坦(bosentan)、瑞株林(rezulin)；呼吸藥物；擬交感藥物，例如沙丁胺醇(albuterol)、甲磺酸比托特羅(bitolterol mesylate)、多巴酚丁胺(dobutamine) HCl、多巴胺HCl、麻黃素鈉(So)、腎上腺素、氟苯丙胺HCl、異丙基腎上腺素HCl、美速胺(methoxamine) HCl、酒石酸氫去甲腎上腺素(norepinephrine bitartrate)、苯腎上腺素HCl、利托君(ritodrine) HCl；擬膽鹼藥物，例如乙醯膽鹼HCl；抗膽鹼酯酶劑，例如艾卓酚(edrophonium)氯化物(Cl)；膽鹼酯酶再活化劑；腎上腺素阻斷藥物，例如醋丁洛爾(acebutolol) HCl、阿替洛爾(atenolol)、艾司洛爾(esmolol) HCl、拉貝洛爾(labetalol) HCl、美托洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、甲磺酸酚妥拉明(phentolamine mesylate)、普萘洛爾(propanolol) HCl；抗毒蕈鹼藥物，例如甲基溴化辛托品(anisotropine methylbromide)、阿托品(atropine)、可利啶(clinidium)溴化物(Br)、格隆溴銨(glycopyrrolate)、異丙托銨(ipratropium) Br、莨菪鹼(scopolamine) HBr；肌神經阻斷藥物；去極化藥物，例如苯磺酸阿曲庫銨(atracurium besylate)、己芴(hexafluorenium) Br、甲筒箭毒(metocurine)碘化物、琥珀醯膽鹼Cl、管箭毒素(tubocurarine) Cl、維庫溴銨(vecuronium) Br；中央作用肌肉鬆弛劑，例如巴氯芬(baclofen)；神經傳遞素及神經傳遞素藥劑，例如乙醯膽鹼、腺苷、三磷酸腺苷；胺基酸神經傳遞素，例如興奮性胺基酸、GABA、甘胺酸；生物胺神經傳遞素，例如多巴胺、腎上腺素、組胺、去甲腎上腺素、章魚胺、血清素、酪胺、神經肽、氧化氮；抗帕金森藥物，例如阿馬替丁(amaltidine) HCl、甲磺酸苯紮托品(benztropine mesylate)、卡比多巴(carbidopa)；利尿劑藥物，例如二氯苯磺胺、醋甲唑胺、苄氟甲噻嗪、多噻嗪；抗偏頭痛藥物，例如甲磺酸卡前列素緩血酸胺(carboprost tromethamine mesylate)或順丁烯二酸二甲麥角新鹼(methysergide maleate)，或其功能衍生物。
在一些情況下，負載為酶，諸如玻尿酸酶、鏈激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、尿激酶、PGE-腺苷脫胺酶；靜脈內麻醉劑，諸如氟哌啶、依託咪酯(etomidate)、檸檬酸芬太尼(fetanyl citrate)/氟哌啶、環己巴比妥(hexobarbital)、氯胺酮HCl、美索比妥(methohexital) Na、硫戊巴比妥(thiamylal) Na、、硫噴妥(thiopental) Na；抗癲癇劑，例如卡馬西平(carbamazepine)、可那氮平(clonazepam)、雙丙戊酸鈉Na、乙琥胺(ethosuximide)、美芬妥英(mephenyloin)、甲乙雙酮(paramethadione)、苯妥英(phenyloin)、普里米酮(primidone)。在各種實施例中，生物活性負載為選自以下之酶：玻尿酸酶、鏈激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、尿激酶或PGE-腺苷脫胺酶。
表 8 展示本文中提供的例示性治療負載之胺基酸序列。表 8- 例示性治療負載之胺基酸序列
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO: 141    MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
SEQ ID NO: 142    APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
SEQ ID NO: 143    MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
SEQ ID NO: 144    MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO: 145    SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO: 146    FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 190    MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 195    H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnMetGluGluGlu AlaValArgLeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAla ProProProSer-NH2
IV. 間隔 子
載體可經由間隔子偶合於異種負載。本文中提供之間隔子可提供空間可撓性、準確摺疊及/或適當生物活性以及載體及負載兩者之功能。
間隔子可包含一或多個胺基酸殘基。在一些情況下，間隔子為基於胺基酸之間隔子。此間隔子可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：至少約5、10、15、20、25、35、50、75或100個胺基酸殘基。在一些情況下，間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：至多約30、25、20、15或10個胺基酸殘基。
間隔子可為可裂解或不可裂解間隔子。在一些情況下，可裂解間隔子可藉由酶(例如，蛋白酶)裂解。不可裂解間隔子可能不可藉由此酶裂解。舉例而言，不可裂解間隔子可用於其中負載之較高全身性濃度為目標的情況中。
間隔子可包含甘胺酸-絲胺酸寡肽序列之一或多個重複。因此，在一些情況下，載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：胺基酸序列(GS)x (SEQ ID NO: 169)、(GGS)x (SEQ ID NO: 170)、(GGGS)x (SEQ ID NO: 171)、(GGGGS)x (SEQ ID NO: 172)或(GGGGGS)x (SEQ ID NO: 173)，其中x=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些情況下，間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：胺基酸序列(GGGGS)x (SEQ ID NO: 174)，其中x=2、3、4或5。
本文中提供之間隔物之實例為包含以下、基本上由以下組成或由以下組成的彼等：與GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 175)、GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 176)或GGGGSNLQGGLRQPR (SEQ ID NO: 177)具有至少50%、75%、90%或99%序列一致性之胺基酸序列、以上中之任一者之片段或以上中之任一者之組合。在一些情況下，以上間隔子中之任一者可在N端及/或C端處包含額外甘胺酸或絲胺酸殘基。
在一些實施例中，將載體偶合於治療負載之間隔子包含與SEQ ID NO: 175-176具有至少50%、75%、90%或99%序列一致性的胺基酸序列。V. 遞送構築體
本文中提供遞送構築體(例如，載體-負載複合物)，其可包含偶合於異種負載之載體。載體可共價或非共價地(例如，經由離子相互作用、凡得瓦爾相互作用、π-π相互作用等)偶合於此負載。載體可直接或間接地偶合於異種負載。
異種負載可偶合於載體之N端及/或C端。在一些情況下，異種負載藉由在載體之C端羧基與異種負載之N端胺之間形成共價醯胺鍵而直接且共價地偶合於載體之C端。在一些情況下，異種負載經由間隔子間接且共價地偶合於載體。
因此，在一些情況下，當載體共價偶合於負載時，遞送構築體可根據式II：C-S-P或式III：P-S-C來表示，其中C為載體，S為間隔子或視情況為鍵，且P為異種負載。遞送構築體可進一步包含其N端及/或C端上之一或多個修飾。此修飾可包括N端甲硫胺酸殘基。因此，式II及式III亦可包括N端甲硫胺酸(例如，M+C-S-P)或(例如，M+P-S-C)。
載體可經由化學/合成結合(例如，使用醯胺偶合反應)或藉由在細菌中(例如，大腸桿菌中)或哺乳動物(例如，中國倉鼠卵巢(CHO))細胞中重組表現而作為融合蛋白偶合於異種負載。
遞送構築體或其部分(例如，載體及/或間隔子)可為多肽。如本文中所使用，術語「多肽」可包括天然胺基酸及非天然胺基酸兩者。
本文中提供之遞送構築體可以高通量率經由載體與一或多種轉運受體樣相互作用配偶體(TRIP)之一或多種適度親和性、高容量動態及/或pH依賴性相互作用而胞移轉送而穿過極化上皮細胞。此類TRIP可為內源遷移途徑之元件，且如此可允許載體將異種負載轉運穿過上皮細胞障壁而不損害障壁自身且不顯著更改(例如，以化學方式/以酶方式修飾)載體或負載。
此外，與TRIP之相互作用可允許載體以至少約10-6 cm/sec、10-5 cm/sec或10-4 cm/sec之轉運速率將負載轉運穿過完整上皮(例如，極化腸道上皮)。
在一些情況下，載體間接且非共價地偶合於負載。在此類情況下，可使奈米粒子(例如，脂質體、金屬奈米粒子、基於聚合物之奈米粒子等)裝載(例如，在粒子之內部上及/或表面上)裝載有負載分子(例如，IL-10、IL-22、GLP-1等)，且可使衍生自Cholix之載體分子偶合於此類奈米粒子(例如，偶合至其表面上)。在一些情況下，負載與載體之比可為至少約15000:1、10000:1、5000:1、2500:1、1000:1、500:1、250:1、100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2.5:1、1:1。此可允許使用附著於表面的衍生自Cholix之載體將此類含負載奈米粒子轉運至極化上皮細胞(例如，極化腸道上皮細胞)中或穿過極化上皮細胞。在一些情況下，奈米粒子可在胞移轉送或胞內遞送之後釋放負載。在使奈米粒子轉運穿過上皮細胞之情況下，所釋放負載可與黏膜下層組織(例如，固有層)內之受體結合，且/或可進入全身循環且因此全身性地提供某一功能(例如，治療或診斷功能)。在奈米粒子釋放上皮細胞內部之負載的其他情況下，負載(例如，核酸)可提供某些胞內功能，例如在此等細胞內產生轉基因、調節基因表現等。 例示性遞送構築體
在各種實施例中，遞送構築體或載體-負載複合物包含：(a)載體，其包含不包含SEQ ID NO: 179且不由SEQ ID NO: 126組成的Cholix多肽，該載體與(b)異種負載複合，其中載體能夠(i)將異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞；或(ii)將異種負載轉運至極化上皮細胞中。
在一些實施例中，遞送構築體包含衍生自Cholix之載體，該載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 1或2中的胺基酸序列之胺基酸殘基1-386具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，遞送構築體包含衍生自Cholix之載體，該載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列之位置1-40中之任一者至位置150-347處之胺基酸殘基中之任一者的胺基酸殘基具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，此載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列之位置1-151、1-187、41-187、1-206、1-245、1-251或1-266的胺基酸殘基具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在其他情況下，載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 2中的胺基酸序列之位置1-151、1-187、41-187、1-206、1-245、1-251或1-266的胺基酸殘基具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
此類載體中之任一者可偶合於治療負載，該治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 141、142、144、145及146中的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
此治療負載可經由間隔子偶合於衍生自Cholix之載體，該間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 175)具有至少66%、73%、80%、86%、93%或100%序列一致性的胺基酸序列。
因此，在一些情況下，遞送構築體包含載體，該載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 134具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，該載體經由間隔子偶合於治療負載，該治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 142具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 175具有至少66%、73%、80%、86%、93%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在其他情況下，遞送構築體包含載體，該載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 135具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，該載體經由間隔子偶合於治療負載，該治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 142具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 175具有至少66%、73%、80%、86%、93%或100%序列一致性的胺基酸序列。
在一些情況下，遞送構築體包含載體，該載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 134具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，該載體經由間隔子偶合於治療負載，該間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 175具有至少66%、73%、80%、86%、93%或100%序列一致性的胺基酸序列。此治療負載可為細胞介素、激素或治療抗體或其功能結合片段。在一些情況下，治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 145或SEQ ID NO: 146具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些情況下，遞送構築體包含載體，該載體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 135具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，該載體經由間隔子偶合於治療負載，該間隔子包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 176具有至少66%、73%、80%、86%、93%或100%序列一致性的胺基酸序列。此治療負載可為細胞介素、激素或治療抗體或其功能結合片段。在一些情況下，治療負載包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與SEQ ID NO: 145具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些情況下，遞送構築體包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：與闡述於SEQ ID NO: 147-150、152-159或188中之任一者中的胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，遞送構築體由闡述於SEQ ID NO: 147中之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，遞送構築體由闡述於SEQ ID NO: 149中之胺基酸序列組成。
在一些實施例中，遞送構築體由闡述於SEQ ID NO: 188中之胺基酸序列組成。
例示性遞送構築體之胺基酸序列展示於表 9 中。表 9- 例示性遞送構築體之胺基酸序列
SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO:147    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
SEQ ID NO:148    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
SEQ ID NO:149    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO:150    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSNLQGGLRQPRFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 151    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 152    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 153    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 154    MVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 155       MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLAGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 156    MGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFHHHHHH
SEQ ID NO: 157    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 158    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 159    MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO: 188    MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI
VI. 使用方法
在一些實施例中，本文提供遞送構築體，其包含偶合於異種負載之載體。本文中提供之載體可用於將此負載(例如，治療負載)轉運至上皮細胞內部之各種位置，諸如頂端側(例如，頂端再循環系統)、基底側及/或核上室。遞送穿過極化腸道上皮可包括遞送至黏膜下層室(例如，固有層及/或其他黏膜下層腸室)及/或全身循環(例如，經由肝門系統)。A. 治療方法
本文中提供之載體穿過完整上皮障壁(例如，極化腸道上皮)的高通量轉運能力可用於向有需要之個體(例如，人類或嚙齒動物)遞送治療及/或診斷負載分子。舉例而言，將治療負載遞送至黏膜下層室(例如，固有層)可允許治療及/或診斷定位於及/或來源於胃腸(GI)道中之此類位置處的疾病或病況，而全身遞送負載可用於在生物體內之各種細胞、組織或器官中提供治療有效的濃度。
可使用本發明之遞送構築體治療的疾病可包括發炎疾病、自體免疫疾病、癌症、代謝疾病、神經退化性疾病及神經疾病、病毒性疾病或感染及心血管疾病。
在一些情況下，發炎疾病可包括發炎性腸病、牛皮癬、細菌敗血症、克羅恩氏病(例如，瘻管性克羅恩氏病)、潰瘍性結腸炎(例如，中至重度潰瘍性結腸炎或輕微至中度潰瘍性結腸炎)、膠原性結腸炎、淋巴球性結腸炎、缺血性結腸炎、改道性結腸炎、白塞氏症候群(Behcet's syndrome)、不確定型結腸炎、胰臟炎、肝臟炎症(例如，肝炎)、囊炎、直腸炎及上皮細胞損傷。
在一些情況下，自體免疫疾病可包括全身性紅斑性狼瘡症(SLE)、尋常天疱瘡、重症肌無力、溶血性貧血、血小板減少紫癜症、格雷氏病(Grave's disease)、休格連氏病(Sjogren's disease)、皮肌炎、橋本氏病(Hashimoto's disease)、多發性肌炎、多發性硬化症、糖尿病、類風濕性關節炎及硬皮病。
在一些情況下，癌症可包括非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphomas；NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、多發性骨髓瘤、膀胱癌、腎臟癌、卵巢癌、宮頸癌、乳癌、肺癌或鼻咽癌、惡性黑色素瘤、利妥昔單抗(rituximab)耐藥性NHL及白血病。
在一些情況下，代謝病症可包括糖尿病、肥胖引起之糖尿病、高血糖症、血脂異常、高三酸甘油酯血症、症候群X、抗胰島素症、葡萄糖耐量異常(impaired glucose tolerance；IGT)、糖尿病血脂異常、高脂質血症、脂肪肝病、非酒精性脂肪變性肝炎、肥胖症、葡萄糖耐量異常、升高之空腹葡萄糖、抗胰島素症、泌尿白蛋白分泌、中心型肥胖症、高血壓、升高之甘油三酯、升高之LDL膽固醇及/或降低之HDL膽固醇、高血糖症、高胰島素血症、血脂異常、丙酮血、高三酸甘油酯血症、症候群X、抗胰島素症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐量異常(IGT)、糖尿病血脂異常、葡糖新生、過量肝糖病、糖尿病酮酸中毒、高三酸甘油酯血症、高血壓、糖尿病腎病變、腎功能衰竭、腎衰竭、攝食過量、肌肉萎縮、糖尿病神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病昏迷、動脈硬化、冠心病、周邊動脈疾病及高脂質血症。
在一些情況下，心血管疾病可包括血管疾病、心臟病及中風。
可使用本發明之遞送構築體治療的其他疾病及病況可包括生長激素缺陷(growth hormone deficiency；GHD)、特納症候群(Turner syndrome；TS)、努南症候群(Noonan syndrome)、普拉德-威利症候群(Prader-Willi syndrome)、含有矮小身材同源盒之基因(SHOX)缺陷、慢性腎功能衰竭、特發性矮小身材、短腸侯症群、過敏、移植物抗宿主疾病、貧血、造血細胞之病症及內分泌系統或生殖系統之疾病。
此外，遞送構築體可作為醫藥組合物投與至有需要之個體。本文中之遞送構築體可經調配為用於增加治療功效之醫藥組合物。舉例而言，遞送構築體可經調配以使其在個體之胃腸道中或周圍的特定位置處釋放。在一些情況下，遞送構築體可經調配以增加其用於使免疫細胞參與胃腸道中或周圍之各部分(諸如迴腸)中的生物活性。
遞送構築體可經由各種投與途徑來投與。在一些情況下，投與包括經口投與遞送構築體。在一些情況下，遞送構築體作為錠劑或膠囊經口投與。B. 實驗方法
本文中提供用於胞移轉送測試及評估Cholix載體相互作用蛋白(例如，TRIP)之方法。1. 胞移轉送測試
可取決於遞送構築體經由胞移轉送而穿過上皮膜(例如，極化腸道上皮)之能力來測試經分離遞送構築體之胞移轉送功能。可非限制性地由熟習此項技術者所已知的任何方法來測試遞送構築體之胞移轉送活性。在各種實施例中，可藉由評定遞送構築體進入與其結合之非極化細胞的能力來測試胞移轉送活性。在衍生自Cholix之載體的情況下，且不意欲受任何特定理論或作用機制束縛，本文中描述允許遞送構築體穿過極化上皮細胞之胞移轉送功能及進入駐留於相同域或區域(亦即SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-266)中之非極化細胞的功能。因此，可例如藉由偵測構築體在細胞內部中的實體存在來評定遞送構築體進入細胞之能力。舉例而言，可使用例如螢光標記物來標記遞送構築體，且將遞送構築體暴露於細胞。接著，可洗滌細胞，移除尚未進入細胞之任何遞送構築體，且可測定細胞中所殘留的標記之量。例如使用顯微法來偵測此等細胞內之標記指示遞送構築體已進入細胞。
可藉由評定遞送構築體穿過極化上皮細胞之能力來測試遞送構築體之胞移轉送能力。舉例而言，遞送構築體可用例如螢光標記物(例如，RFP)來標記且與上皮細胞之層之頂端膜接觸。在另一實例中，可使用針對遞送構築體或其部分(諸如衍生自Cholix之載體或負載)之抗體(例如，單株及/或多株抗體)來偵測遞送構築體。在由上皮細胞形成之膜之基側(例如，如圖 1 中所說明之基側室或在活體內實驗中之固有層)上偵測到的螢光指示載體之胞移轉送能力完整。
活體內胞移轉送可使用雄性威斯塔大鼠來測試。雄性威斯塔大鼠可以12/12 h光照/黑暗週期每籠圈養3-5隻且在置於研究時可為225-275 g (大約6-8週大)。可在光照階段期間使用非恢復方案進行實驗，該非恢復方案使用連續異氟醚麻醉。可進行暴露中間空腸區域之4-5 cm正中腹切割。可在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中製備在3.86 × 10-5 M下之測試製品的儲備溶液，其中藉由腔內注射(ILI)使用29規格針頭投與50 µL (每250 g大鼠)。可接著使用永久性標記物來標記注射部位腸系膜。在研究終止時，可將捕獲所標記腸片段之3-5 mm區域分離且處理以用於顯微評定。可根據1986年之英國動物(科學程序)法案(U.K. Animals (Scientific Procedures) Act)、1986年之歐洲共同體理事會指令(European Communities Council Directive) (86/609/EEC)及巴斯大學(University of Bath's)倫理審查程序來執行活體內實驗。2. 評估 Cholix 載體相互作用蛋白 ( 亦即 ， TRIP)
為鑑別Cholix相互作用配偶體(例如，受體、酶等)且建立其與Cholix多肽(例如，Cholix序列之殘基1-266或其截斷型式)相互作用之囊泡室，可執行一系列下拉分析以鑑別可隨後進行以下的潛在相互作用配偶體：使用表面電漿子進行共振電子雜交締合、使用可達成特定目標之基因敲落極化Caco-2人類腸上皮細胞進行試管內胞移轉送研究以及可將Cholix元件與特異性受體共定位於所確立囊泡結構中之活體內胞移轉送研究。不受任何理論束縛，假定胞移轉送過程可涉及正常受限於極化腸上皮細胞之特異性囊泡元件內但可由例如衍生自Cholix之載體募集或「攔截」的元件，以在自細胞釋放至基側室(例如，經由頂端再循環機制、頂端受體介導之胞泄作用等)中之後保留晚期核內體且避免溶酶體降解。3. 量測載體與細胞蛋白質之共定位
可藉由螢光顯微法來測定本文中描述之載體或載體-負載複合物與一或多種細胞蛋白質之共定位。舉例而言，衍生自Cholix之載體可施加至極化上皮細胞(例如，Caco-2)之頂端膜或腸上皮組織。在受體介導之胞吞之後，可藉由螢光顯微法，例如藉由使用經標記抗Cholix載體抗體或經染料標記之載體或藉由使用抗負載抗體來測定載體至細胞中之更新。樣本或組織切片可進一步藉由對諸如Rab7、Rab11之細胞蛋白具有特異性之標記物染色，例如如實例 7 中所描述。可接著使用各種影像分析技術來測定載體與細胞蛋白質之相對位置(參見例如實例 6 )。實例
以下實例僅說明本發明且不意欲以任何方式限制本發明。實例 1 產生 衍生自 Cholix 之遞送構築體
在此實例中，描述將遞送構築體製備為包含Cholix載體序列、間隔子序列及治療負載之單個胺基酸序列。
首先，藉由PCR來擴增遞送構築體之基因，從而在PCR產物之兩個末端處併入NdeI與EcoRI、PstI與PstI、AgeI與EcoRI或PstI與EcoRI位點之限制酶對。在限制酶消化之後，將PCR產物選殖至用於細胞表現之適當質體中，該質體經對應限制酶對消化。所得構築體包含闡述於SEQ ID NO: 147中之胺基酸序列且亦在蛋白質之N端處經6-His基序標記以促進純化。藉由限制酶消化及DNA測序來驗證最終質體。
遞送構築體表現如下：將大腸桿菌BL21(DE3) pLysS勝任細胞(Novagen, Madison, Wis.)在適當質體之存在下使用標準熱休克方法轉化以產生遞送構築體表現細胞，在含胺苄青黴素之培養基上選擇，且分離並與抗生素一起在盧里亞-貝爾塔尼(Luria-Bertani)培養液(Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)中生長，接著藉由在OD 0.6下添加1 mM異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)來誘導蛋白質表現。在IPTG誘導後兩小時，藉由以5,000 rpm離心10 min來採集細胞。在細胞分解之後分離包涵體，且將蛋白質溶解於含有100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2 mM EDTA、6 M胍HCl及65 mM二硫蘇糖醇之緩衝液中。經溶解遞送構築體在0.1 M Tris、pH=7.4、500 mM L-精胺酸、0.9 mM GSSG、2 mM EDTA之存在下再摺疊。藉由Q瓊脂糖離子交換及Superdex 200凝膠過濾層析(Amersham Biosciences, Inc., Sweden)來純化再摺疊蛋白質(SEQ ID NO: 147)。藉由SDS-PAGE及分析型HPLC (Agilent, Inc. Palo Alto, Calif.)來評定蛋白質之純度。
評估遞送構築體以關於其預期分子大小驗證適當摺疊。在誘導之後，自包涵體收集所表現蛋白質。藉由西方墨點來驗證遞送構築體之表現程度，且將表觀分子量與所計算質量進行比較。
結果顯示以高產率及純度穩定且有效的產生功能遞送構築體。實例 2 用於評定轉運穿過上皮細胞單層的試管內模型
此實例顯示經設計以評估本文中描述之遞送構築體之轉運特性的試管內模型。
圖 1 示意性地展示包含上皮細胞單層上方之頂端室及此上皮細胞單層下方之基底室的設置。
對於頂端至基側滲透性，將測試製品(例如，遞送構築體、負載等)添加至頂端(A)側，且在基側(B)側上測定滲透之量。對於基側至頂端透性，將測試製品添加至基側(B)側，且在頂端(A)側上測定滲透之量。
資料可根據以下等式表述為滲透性(Pap p )：Pap p =(dQ/dt)/(C0 *A)。Q/dt為滲透之速率，C0 為測試製品之初始濃度，且A為單層之面積。可根據以下等式計算流出轉運率(Re )：(Re )=Papp (B-A)/Papp (A-B)。Re ＞2可指示P-gp或其他主動流出轉運體之潛在基質。
SMI-100或Caco-2細胞可用於評定載體或遞送構築體在試管內之胞移轉送功能。
對於Caco-2細胞，執行ELISA分析以評估載體或遞送構築體經由胞移轉送移動穿過Caco-2細胞單層之能力。在37℃下在5% CO2 中，使Caco-2 (ATCC HTB-37™)細胞維持於完整培養基中：補充有10%胎牛血清、2.5 mM麩醯胺酸、100 U之青黴素/毫升及100 μg之鏈黴素/毫升的達爾伯克改良伊格爾(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養基F12 (DMEM F12) (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.)。每2至3天用此培養基(指定完全培養基)飼餵細胞且每5至7天傳代。為分析，將細胞接種至24或96孔培養盤中且使其生長至匯合。
使Caco-2細胞作為匯合單層在包覆有膠原蛋白之0.4-μm孔徑聚碳酸酯膜跨孔載體(Corning-Costar, Cambridge, MA)上生長，且在獲得如使用chopstick Millicell-ERS®電壓表(Millipore)所量測之＞250 Ω·cm2的跨上皮電阻(TER)後18-25天使用。藉由在37℃下在遞送構築體之例如4.7 nM、23.6 nM及236 nM頂端施加之後的某些時間點(例如，15、30及45分鐘)處量測所轉運蛋白質之量來測定載體或遞送構築體穿過此等單層之頂端至基側(A→B)轉運。TER量測值及10 kDa螢光聚葡萄糖之範圍(使用HPLC粒徑排阻協定來量測)用於在研究之過程期間驗證單層障壁特性。藉由在基於細胞之細胞毒性分析中滴定所收集培養基來測定遞送構築體之轉運程度。藉由使用用於捕獲及偵測之抗體(例如，抗載體或抗負載，諸如抗IL-22抗體)之酶鍵聯免疫吸附分析(ELISA)來量測所轉運遞送構築體。
使在細胞培養物插入物上建立的人類小腸組織之匯合單層(SMI-100, MatTek Corporation; Ashland, MA, USA)在使用之前在37℃下穩定24 h。僅將具有＞400 Ω•cm2 之跨上皮電阻(TEER)的插入物視為具有用於研究中的充足單層整合性。藉由評定70 kD聚葡萄糖轉運之遏制來執行單層整合性之次級分析。用轉運緩衝液(PBS)洗滌該等室一次。將以20 µg /mL之濃度製備的測試分子(例如，遞送構築體、負載等)以100 µL體積施加至插入物之頂端表面。在各時間點處置換500 µL PBS之基側體積以用於轉運研究。重複三次各實驗條件執行。實例 3 IL-22 穿過極化腸道上皮細胞的載體介導之轉運
此實例顯示，SEQ ID NO: 134之載體可活體外將IL-22負載(SEQ ID NO: 142)轉運穿過極化腸道上皮細胞。此實例進一步顯示，具有SEQ ID NO: 134之載體可活體內將生物活性IL-22負載轉運穿過極化腸道上皮細胞且至固有層。
根據實例 2 且如圖 1 中針對頂端(A)至基底(B)轉運所說明，藉由將遞送構築體施加至上皮細胞之頂端膜來測試遞送構築體(SEQ ID NO: 147)穿過Caco-2細胞單層及小腸上皮組織(在本文中亦稱為SMI-100)之轉運。重複三次運行實驗，且在頂端施加後15、30及45分鐘時收集來自基側室之樣本以測定轉運蛋白之量。使用ELISA分析來量測所胞移轉送蛋白之量。
圖 2 及圖 3 中之資料展示，在與不偶合於載體之IL-22 (SEQ ID NO: 143)進行比較時，在偶合於IL-22時，具有SEQ ID NO: 134之載體使得以時間依賴性方式將IL-22負載(SEQ ID NO: 142)轉運穿過Caco-2 (圖 2 )及SMI-100 (圖 3 )單層兩者，且遞送構築體使得約2-3倍多的IL-22穿過上皮細胞。
對於活體內實驗，使用雄性威斯塔大鼠測試胞移轉送。雄性威斯塔大鼠以12/12 h光照/黑暗週期每籠圈養3至5隻且在置於研究時為225-275 g (大約6-8週大)。在光照階段期間使用非恢復方案進行實驗，該非恢復方案使用連續異氟醚麻醉。進行暴露中間空腸區域之4-5 cm正中腹切割。在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中製備在3.86 × 10-5 M下之遞送構築體的儲備溶液，其中藉由腔內注射(ILI)使用29規格針頭投與50 µL (每250 g大鼠)。接著使用永久性標記物來標記注射部位腸系膜。在研究終止時，將捕獲所標記腸片段之3-5 mm區域分離且處理以用於顯微評定。
具有SEQ ID NO: 147的遞送構築體之胞移轉送活性之結果展示於圖 4 中，顯示當作為包括衍生自Cholix之載體的遞送構築體之部分提供時，大量IL-22負載(SEQ ID NO: 142)活體內穿過完整且極化之腸道上皮。此顯微影像展示，在將SEQ ID NO: 147之遞送構築體內腔施加至威斯塔大鼠之空腸之後，IL-22負載(SEQ ID NO: 142)自腸道上皮之頂端位點(由白色箭頭1號突出顯示)轉運至上皮細胞之基底位點且進入至固有層(3) (縮寫為「l.p.」)中。影像進一步展示，IL-22與定位於固有層內之細胞上及極化上皮之外基底膜(由白色箭頭2號突出顯示)上之IL-22受體相互作用且在顯著程度上結合，從而顯示IL-22負載在轉運之後為生物活性的。IL-22定位由白色箭頭及綠色螢光指示，藍色螢光指示DAPI染色。
此外，圖 5 展示在胞移轉送之後在基側室處偵測由闡述於SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 148中之胺基酸序列組成的遞送構築體。西方墨點實驗之分析確認兩種遞送構築體均未經更改。
後續實驗亦展示，包含衍生自Cholix之載體的遞送構築體之胞移轉送可視GRP75 (圖 6 )及基底膜特異性硫酸乙醯肝素蛋白聚糖核心蛋白(HSPG) (圖 7 ) (在本文中亦稱為「串珠素」)兩者之存在而定。圖 6 及圖 7 展示，胞移轉送功能在分別缺乏GRP75 (圖 6 ，亦即Caco-2GRP75- 細胞)及HSPG (圖 7 ，亦即Caco-2HSPG- 細胞)之Caco-2細胞中顯著降低。此指出，GRP75及HSPG兩者皆為可在頂端至基底胞移轉送期間與衍生自Cholix之載體相互作用的TRIP。
總之，此等資料顯示，相較於單為負載，本文中描述之衍生自Cholix的載體以顯著增加之轉運速率及總體轉運效率(例如，至少約2-3倍增加)將諸如IL-22之治療負載有效(例如，將至少5%、10%、20%、25%或50%之材料施加至頂端表面)轉運穿過極化上皮層。實例 4 使用 衍生自 Cholix 之載體進行至極化上皮細胞中之活體內轉運研究
此實例顯示所截斷的衍生自Cholix之載體將負載轉運至極化上皮細胞中的能力。
圖 8 描繪在使用大鼠腔內注射模型進行腔內注射後15 min上皮細胞內之頂端室(用白色箭頭2號突出顯示)中的遞送構築體(SEQ ID NO: 154)之螢光顯微偵測(白色箭頭1號突出顯示頂端表面，白色箭頭3號突出顯示基底膜，且白色箭頭4號突出顯示固有層)。資料顯示，衍生自Cholix41-187 (例如，SEQ ID NO: 137)之載體能夠將負載轉運至上皮細胞之頂端室，但不穿過上皮細胞。紅色螢光展示Cholix載體之定位，綠色螢光展示hGH (SEQ ID NO: 146)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色。
圖 9 描繪在使用大鼠腔內注射模型進行腔內注射後15 min上皮細胞之頂端室(用白色箭頭2號突出顯示)中的遞送構築體(SEQ ID NO: 156)之螢光顯微偵測(白色箭頭1號突出顯示頂端表面，白色箭頭3號突出顯示基底膜，且白色箭頭4號突出顯示固有層)。資料顯示，衍生自Cholix40-205 (SEQ ID NO: 138)之載體能夠將負載(例如，hGH)轉運至上皮細胞之頂端室，但不穿過上皮細胞至固有層中。此等資料進一步表明，SEQ ID NO: 1之殘基1-40可在胞移轉送中起作用，但可能不為胞吞Cholix載體所必需。紅色螢光展示Cholix載體之定位，綠色螢光展示hGH (SEQ ID NO: 146)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色。
圖 10A 描繪在向大鼠空腸腔內注射遞送構築體後5 min上皮細胞內部的頂端室中之遞送構築體(SEQ ID NO: 153)之螢光顯微偵測。在圖 10A 至圖 10C 中，紅色螢光展示Cholix載體之定位，綠色螢光展示hGH (SEQ ID NO: 146)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色；白色箭頭1號突出顯示頂端室，且白色箭頭2號突出顯示核上室。
圖 10B 描繪在腔內注射後10 min遞送構築體(SEQ ID NO: 153)之螢光顯微偵測。資料顯示，隨時間推移載體將hGH負載自頂端室轉運至核上室及基底室。
圖 10C 描繪在腔內注射後15 min遞送構築體(SEQ ID NO: 153)之螢光顯微偵測。資料顯示，隨時間推移載體將負載自頂端室轉運至核上室及基底室。
此等資料顯示，分別在SEQ ID NO: 1之位置187或205處具有C端截斷且在SEQ ID NO: 1之位置40或41處具有N端截斷的衍生自Cholix之載體可將負載轉運至極化上皮細胞中。此等資料進一步表明，Cholix載體之N端39個胺基酸可在胞移轉送中起作用但不足以轉運至基側胞內囊泡，且1-187不足以胞移轉送但足以將負載轉運至上皮細胞中(例如，轉運至核上室及基底室中)。實例 5 衍生自 Cholix 之載體的活體外胞移轉送功能
此實例顯示經由間隔子使用如上文在實例 1 中所描述之重組表現偶合於人類生長激素的各種衍生自Cholix之載體的活體外頂端至基底胞移轉送功能。
針對其穿過極化人類小腸上皮細胞單層之能力評估以下載體(表 10 )：表 10- 所 測試遞送構築體
SEQ ID NO Cholix 標號( 相對於SEQ ID NO: 1)
SEQ ID NO: 151 M+Cholix1-134 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 152 M+Cholix1-151 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 153 M+Cholix1-187 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 154 M+Chx41-187 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 155 M+Cholix1-206 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 156 M+Cholix40-205 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 157 M+Cholix1-245 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 158 M+Cholix1-251 -(G4 S)3 -hGH
SEQ ID NO: 159 M+Cholix1-266 -(G4 S)3 -hGH
圖 11A 至圖 11B 描繪僅人類生長激素(hGH，SEQ ID NO: 190)相較於使用偶合於載體之hGH的頂端至基底轉運。藉由C端截斷相對於參考SEQ ID NO: 1來指示載體長度(亦即「134」指示具有SEQ ID NO: 1之殘基1-134的載體)。所有載體進一步包括N端甲硫胺酸。hGH之西方墨點法定性地評定此等蛋白質在2 h之後活體外穿過原代人類小腸上皮細胞之極化單層之頂端至基底轉運的能力。頂端施加之材料之量對於hGH含量以莫耳計係等效的，且在分析之前將基底收集物濃縮約10倍。
圖 11A 展示僅hGH (SEQ ID NO: 190)之頂端至基底轉運相對於針對具有闡述於SEQ ID NO: 151 - SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO: 159中的在SEQ ID NO: 1之位置134、151、187、41-187及266處分別具有C端截斷的序列的遞送構築體所量測的彼頂端至基底轉運之比較。資料顯示，相較於具有在SEQ ID NO: 1之266處具有C端截斷之Cholix載體(SEQ ID NO: 159)的構築體，在SEQ ID NO: 1之位置134、151、187處具有C端截斷或在SEQ ID NO: 1之41處具有N端截斷且在187處具有C端截斷的Cholix載體展示顯著減少的所結合hGH之頂端至基底轉運。
圖 11B 展示，具有SEQ ID NO: 155及SEQ ID NO: 157 - SEQ ID NO: 159的包括分別在SEQ ID NO: 1之位置206 (SEQ ID NO:131)、245 (SEQ ID NO: 132)、251 (SEQ ID NO: 133)及266 (SEQ ID NO: 134)處具有C端截斷的Cholix載體的遞送構築體顯示有效的所結合hGH (SEQ ID NO: 146)之頂端至基底轉運。儘管在位置245及251處具有CholixC端截斷的載體顯示與在位置266處具有C端截斷的載體之彼頂端至基底轉運相當的hGH (SEQ ID NO: 146)之頂端至基底轉運，但相較於在位置245、251及266處具有C端截斷的載體，在位置206處具有Cholix C端截斷的載體展示hGH之頂端至基底轉運之顯著增強。
此等結果表明，Cholix之殘基1-266足以進行頂端至基底轉運，且其可用作將各種異種負載遞送穿過上皮細胞之胞移轉送元件。另外，其顯示，由闡述於SEQ ID NO: 1中之序列組成的Cholix多肽之前206個胺基酸殘基內之元件足以進行胞移轉送功能，且因此可用於使諸如治療及/或診斷負載之異種負載分子有效地(例如，將至少5%、10%、20%、25%或50%之材料施加至頂端表面)穿梭穿過上皮細胞層(例如，腸道上皮)，由此使得能夠經口投與將以其他方式僅經由非經腸投與途徑(例如，皮下或靜脈內)投與的負載。實例 6 衍生自 Cholix 之載體之活體內胞移轉送功能
此實例顯示經由間隔子使用如上文在實例 1 中所描述之重組表現偶合於人類生長激素的各種衍生自Cholix之載體之活體內頂端至基底胞移轉送功能。
在ILI至大鼠空腸中之後針對其活體內胞移轉送之能力檢驗實例 5 之表 10 中所展示的所選Cholix載體。
在此等實驗中獲得之資料展示穿過各自包括不同Cholix載體的六個遞送構築體之大鼠空腸中之極化腸道上皮細胞的頂端至基底轉運之程度。藉由免疫螢光顯微法分別使用多株抗Cholix及單株抗hGH抗體來顯示Cholix載體(紅色螢光)及hGH (綠色螢光)之定位(圖 12A 至圖 12F )。白色箭頭指示頂端膜，「l-p」係指固有層，「GC」係指杯狀細胞，且空心箭頭指示存在於固有層中之遞送構築體。
圖 12A 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO:146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 140)的遞送構築體(SEQ ID NO: 151)後15 min的頂端至基底轉運之程度。圖 12A 展示載體不能使得遞送構築體進入上皮細胞，表明具有SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基134-151的功能序列片段可在胞吞至極化上皮細胞時起作用(相比之下，圖 12B 顯示具有SEQ ID NO: 139之載體使得細胞能夠經由胞吞進入各別遞送構築體)。
圖 12B 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 139)的遞送構築體(SEQ ID NO: 152)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12B 展示此構築體確實進入上皮細胞(與具有圖 12A 中描述的具有SEQ ID NO: 151之構築體相反)，但主要殘留於頂端，且在一定程度上殘留於基底囊泡池中，但未進入固有層，由此使得能夠將負載遞送至上皮細胞之頂端室及基底室。
圖 12C 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 136)的遞送構築體(SEQ ID NO: 153)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12C 展示此構築體進入上皮細胞，達至頂端室及基底室且亦達至細胞之核上區域，但仍殘留於上皮細胞內部，表明由SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基152-187組成之序列片段可允許進入及遞送至核上區域，以及允許定位於基底室中。
圖 12D 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 137)的遞送構築體(SEQ ID NO: 154)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12D 展示此構築體進入上皮細胞，但殘留於頂端室中，且似乎未達至基底室或核上室。
圖 12E 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 131)的遞送構築體(SEQ ID NO: 155)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12E 展示此構築體完成如由達至固有層之遞送構築體所指示之胞移轉送過程(見空心箭頭)，表明由闡述於SEQ ID NO: 1中的序列之胺基酸殘基188-206組成之序列片段可使得載體(及包含此類載體之構築體)能夠參與基底再循環過程，該等基底再循環過程允許將載體或各別構築體自上皮細胞釋放至基側室(例如，固有層)中。
圖 12F 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)後15 min穿過活體內大鼠空腸上皮單層的轉運，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12F 展示此構築體完成如由達至固有層之遞送構築體所指示的胞移轉送過程(見空心箭頭)。
因此，此等結果與自實例 5 中描述之活體外胞移轉送實驗獲得的資料一致，且顯示在闡述於SEQ ID NO: 1中的Cholix序列之殘基206-266中之任一者處具有C端截斷的載體可將負載分子(例如治，療蛋白)迅速地(例如，至少10-6 cm/sec、10-5 cm/sec)且有效地(例如，將至少5%、10%、20%、25%或50%之材料施加至頂端表面)轉運穿過上皮細胞(例如，穿過個體之極化腸道上皮細胞)。此外，此等結果展示，在闡述於SEQ ID NO: 1中的Cholix序列之殘基151-187中之任一者處具有C端截斷及/或在SEQ ID NO: 1之殘基1-40中之任一者處具有N端截斷的載體可用於將各種異種負載遞送至上皮細胞中。
基於此等資料，針對衍生自SEQ ID NO: 1之Cholix多肽的載體鑑別以下功能Cholix序列片段。表 11- 例示性 Cholix 序列片段及其在 SEQ ID NO: 1 之 Cholix 多肽內的功能
SEQ ID NO 序列 功能
SEQ ID NO: 165 135 DQQRNIIEVPKLYSIDL151 胞吞
SEQ ID NO: 166 1 VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEG40   頂端-基底位移
SEQ ID NO: 167 151 LDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKA187 核上定位
SEQ ID NO: 168 188 AQKEGSRHKRWAHWHTGLA206 基底釋放
實例 7 衍生自 Cholix 之載體與 Rab11a 之 共定位
此實例顯示衍生自Cholix之載體與Ras相關蛋白Rab11a (Rab11a或Rab11)共定位。載體與Rab11a之共定位可在上皮細胞之頂端側或基底側上進行。經展示，載體與Rab11a在上皮細胞之頂端側處之共定位可將載體導引至頂端再循環核內體及/或至腸內腔中。載體與Rab11a在上皮細胞之基底側處的共定位指示載體可利用基底再循環機制以供將其自基底細胞膜釋放至基側室(例如，固有層)中。
藉由在四個不同遞送構築體之PBS中腔內注射(ILI) 50 µL之3.86 × 10-5 M溶液來測試四個遞送構築體與Rab11a之共定位。此類遞送構築體由闡述於SEQ ID NO: 152-154及SEQ ID NO: 159中之胺基酸序列組成。
圖 13A 、圖 13B 及圖 13C 展示分別具有SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 152及SEQ ID NO: 153之遞送構築體與Rab11a共定位於上皮細胞之頂端側上。資料亦展示，具有SEQ ID NO: 152及SEQ ID NO: 154之構築體未顯著定位於基底側處，但主要殘留於頂端側處。具有SEQ ID NO: 153之構築體確實定位於頂端及基底側兩者處，然而，僅與Rab11a共定位於頂端側處且不共定位於基底側處(亦見圖 13C 之子影像3a及3b，其展示相較於基底位點在頂端位點處之增加的定位)。總之，此等結果表明，不能夠進行頂端至基底胞移轉送之載體可進入上皮細胞內之頂端再循環系統，如由與Rab11a在頂端位點處之共定位所顯示。在腔內注射後15 min進行量測。綠色螢光展示hGH之定位，紅色螢光展示Rab11a (或Rab11)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色(實驗描述與圖 13D 一致)。
圖 13D 展示具有SEQ ID NO: 159之遞送構築體與Rab11a共定位於極化上皮細胞之基底側上但不顯著共定位於頂端側上。此表明能夠進行胞移轉送之載體可利用基底再循環系統以供將其自上皮細胞釋放至固有層中(亦見圖13D 之子影像4a及4b，其展示相較於基底位點在頂端位點處之增加的定位)。
此等資料顯示，使得基底能夠與Rab11a共定位以進入基底再循環系統的Cholix之功能片段可至少駐留於SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基187-266內。
此外，此等資料實現可將負載轉運至上皮細胞內部之各種位置或穿過此上皮細胞的載體之合理設計。舉例而言，包含以下或由以下組成的衍生自Cholix之載體可用於上皮內負載遞送：闡述於SEQ ID NO: 1中的胺基酸序列之胺基酸殘基1-151、1-187、41-187、41-187、40-205或41-205，而包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-266的衍生自Cholix之載體可用於將負載轉運穿過此上皮細胞障壁且至固有層中。實例 8 用於評定 Cholix 載體相互作用配偶體 (TRIP) 之類型及位置的細胞室特異性蛋白標記物
此實例描述用於測定在所處理胞吞及/或胞移轉送期間與衍生自Cholix之載體相互作用的蛋白的上皮細胞室特異性蛋白標記物。
以下表 12 展示本文中所使用之例示性細胞室特異性蛋白標記物。舉例而言，在實驗期間使用針對IL-10之單株抗體(mAb)及/或針對Cholix載體(例如，包含SEQ ID NO: 1殘基1-266或1-386的載體)培養之多株抗體(pAb)來追蹤包含IL-10作為異種負載的衍生自Cholix之遞送構築體。表 12- 細胞室特異性蛋白標記物
目標 pAb/mAb 物種反應性 宿主 IHC 之 稀釋(P) 備註 儲存 目錄 號
Cholix載體 pAb    兔 1/500 全抗血清 -20℃ -
IL-10 mAb；pAb 人類 小鼠、山羊 1/25    -20℃ -
EEA1 pAb 小鼠、大鼠、人類 兔 1/200 早期核內體 -20℃ Ab2900
Rab7 mAb 小鼠、大鼠、人類 兔 1/100 晚期核內體 -20℃ Ab1267712
Rab11a pAb 小鼠、大鼠、人類、兔、犬 兔 1/500 回收核內體 -20℃ Fisher71-5300
LAMP1 pAb 小鼠、大鼠、人類 兔 1/500 溶酶體標記物 -20℃ Ab24170
GM130 pAb 小鼠、大鼠、人類 兔 1/500 順式高爾基體 -20℃ -
巨蛋白 mAb 大鼠、人類 小鼠 1/20 高爾基體 -20℃ Ab37266
58K 高爾基 蛋白 mAb 小鼠、大鼠、人類 小鼠 1/100 高爾基體 -20℃ Nb600-4512
TGN38 mAb 小鼠、大鼠、人類 小鼠 1/1000 反式高爾基體 -20℃ Nb300-575
鈣聯蛋白 pAb 小鼠、大鼠、人類 兔 1/500 內質網 -20℃ Ab22595
網格蛋白 mAb 小鼠、大鼠、人類 小鼠 1/500 網格蛋白介導之胞吞 -20℃ Ab2731
實例 9 試管內胞移轉送研究揭露用於 衍生自 Cholix 之載體的轉運受體相互作用配偶體 (TRIP)
此實例顯示對在胞移轉送而穿過極化上皮細胞期間與衍生自Cholix之載體相互作用的TRIP之測定。此實例進一步顯示可在Cholix胞移轉送中起作用之關鍵相互作用配偶體。
圖 14A 至圖 14C 分別展示K8、HSPG (串珠素)及GRP75對具有SEQ ID NO: 150之遞送構築體之胞移轉送功能的基因敲除作用，該遞送構築體包括具有闡述於SEQ ID NO: 134中之序列的經由間隔子(其序列闡述於SEQ ID NO: 177中)偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)的衍生自Cholix之載體。將缺乏特異性候選蛋白K8 (Caco-2K8- )、HSPG (Caco-2HSPG- )及GRP75 (Caco-2GRP75- )之表現的Caco-2細胞之穩定細胞株用作活體外單層以驗證其經由活性及選擇性內源轉運機制在載體(例如，Cholix載體)胞移轉送中的參與性。
將Caco-2細胞、親代或K8、HSPG(串珠素)或GRP74阻斷基因表現(KO)穩定細胞以1.5 × 105 個細胞/毫升接種於各跨孔中。在第18天，將含有呈20 µg/ml之遞送構築體(SEQ ID NO: 150)或相同莫耳對照hGH (SEQ ID NO: 190)之100 µl PBS添加至頂端側上且將500 µl PBS添加於基底室中。在37℃下1小時之後，藉由西方墨點法分析基底溶液中的蛋白質之量。使用抗hGH mAb探測墨點。
圖 14A 展示K8基因敲除未顯著降低遞送構築體(SEQ ID NO: 150)之胞移轉送功能。
圖 14B 展示HSPG (串珠素)基因敲除確實顯著降低遞送構築體(SEQ ID NO: 150)之胞移轉送功能。
圖 14C 展示GRP75基因敲除確實顯著降低遞送構築體(SEQ ID NO: 150)之胞移轉送功能。
隨後，評估Cholix蛋白與GRP75之間的相互作用之pH依賴性。圖 15A 展示用於檢驗Cholix載體-GRP75相互作用之此pH依賴性的Biacore™結合相互作用(例如，表面電漿子共振)。為此，將生物素偶合於全長Cholix蛋白(其序列闡述於SEQ ID NO: 1中)之C端，且隨後使用生物素-抗生蛋白鏈菌素生物結合附著於表面(例如，晶片表面、塑膠96孔培養盤等)，且與純化GRP75蛋白在分別處於pH 5.5、6.5及7.5之緩衝溶液中一起培育。在pH 6.5下量測此相互作用之最高結合親和性。圖 15A 展示相較於pH 7.5或pH 5.5，Cholix蛋白對GPR75之親和性在pH 6.5下高約20-25倍。
此外，圖 15B 展示衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 189)與頂端受體(例如，TMEM132)、溶酶體回避受體(例如，GRP75)、遷移受體(例如，ERGIC-53)及基底受體(例如，串珠素)之相互作用的pH依賴性。受體相互作用之此pH依賴性指示，衍生自Cholix之載體可依序且視其位置而與某些受體相互作用。舉例而言，此等資料展示，衍生自Cholix之載體在pH 7.5下對胞吞及早期遷移受體(諸如頂端進入受體及溶酶體回避受體)具有顯著較高的親和性。一旦pH下降至約5.5，則Cholix載體對於此等早期遷移受體之親和性減小，而其對於頂端-基底遷移受體ERGIC-53及基底釋放蛋白串珠素之親和性在彼pH下顯著增加，從而使得在囊泡胞移轉送過程期間將Cholix載體「移交」至遷移及基底釋放受體。
圖 16 展示全長Cholix蛋白(其序列闡述於SEQ ID NO: 1中)與串珠素及GRP75之顯著且依序的Biacore™結合相互作用，顯示Cholix與兩種蛋白相互作用。對於結合實驗，在Biacore SA晶片表面上捕獲20 µl之呈50 nM的cholix生物素蛋白。以30 µl/min之速度將60 µl之呈200 nM的人類串珠素(HSPG)蛋白注射穿過晶片表面。接著以30 µl/min之速度將60 µl之呈100 nM的人類GRP75蛋白注射穿過晶片表面。藉由在pH 1.5下注射50 µl之10 mM甘胺酸以移除所有結合蛋白質來再生成晶片表面。
圖 17 展示全長Cholix蛋白(其序列闡述於SEQ ID NO: 1中)與GRP75、串珠素及TMEM132A之顯著且依序的Biacore™結合相互作用，顯示Cholix與全部三種蛋白相互作用。對於結合實驗，在Biacore SA晶片表面上捕獲20 µl之呈50 nM的cholix生物素蛋白。以30 µl/min之速度將30 µl之呈100 nM的人類GRP75蛋白注射穿過晶片表面。接著以30 µl/min之速度將60 µl之呈200 nM的人類串珠素蛋白注射穿過晶片表面，隨後注射30 µl之呈200 nM的人類TMEM132A蛋白。藉由在pH1.5下注射50 µl之10 mM甘胺酸以移除所有經結合蛋白來再生成晶片表面。
此等資料顯示，GRP75及串珠素可在衍生自Cholix之載體之胞移轉送功能中起作用，且Cholix蛋白結合GRP75、串珠素、TMEM132蛋白。實例 10 胞移轉送而穿過極化上皮細胞的衍生自 Cholix 之 載體可並不與 LAMP1+ 或 Rab7+ 共定位且可在頂端至基底胞移轉送期間經導引遠離溶酶體
此實例顯示，衍生自Cholix多肽之載體在胞移轉送期間經導引遠離溶酶體且因此不與允許載體未更改且全功能地胞移轉送而穿過極化上皮細胞的溶酶體再循環途徑相互作用。
圖 18A 至圖 18D 展示，將藉由腔內注射(ILI，內腔表面指示為圖 18A 至圖 18F 中之白色箭頭)活體內投與至大鼠空腸中之人類生長激素(hGH，SEQ ID NO: 190)的結局首先評估為預期在細胞攝取之後轉運至溶酶體的陰性對照實驗。
圖 18A 展示在注射(ILI)後15分鐘，hGH (SEQ ID NO: 190)之定位受限於上皮細胞之頂端區域中之小囊泡群，如藉由綠色免疫螢光偵測所顯示。
圖 18B 、 圖 18C 及圖 18D 展示，在ILI後15 min，hGH (SEQ ID NO: 190)與溶酶體相關膜蛋白1 (LAMP1，紅色螢光) (圖 18B )及Ras相關蛋白(Rab7，紫色螢光) (圖 18C )以常駐LAMP1+ 、Rab7+ 溶酶體(圖 18D )之約相同頻率及特性共定位，指示hGH在攝取至上皮細胞中之後不久經導引至溶酶體破壞性(例如，再循環)途徑。
圖 18E 及圖 18F 展示包括經由間隔子(SEQ ID NO: 175)偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)經導引遠離溶酶體途徑，且因此未展示與LAMP1 (圖 18E )或Rab7 (圖 18F )之共定位，由此使得能夠將功能負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞至固有層中。
圖 19A 展示在內腔注射包括經由間隔子(SEQ ID NO: 175)偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之前，包衣蛋白I (COPI，紅色螢光)分佈受限於上皮細胞之內腔頂端膜及頂端囊泡室。相比而言，圖 19B 展示在頂端腔內注射(ILI，內腔表面指示為圖 19A 至圖 19D 中之白色箭頭)遞送構築體(SEQ ID NO: 159)誘導COPI重佈至核上位置，指示含有具有SEQ ID NO: 159之遞送構築體及COPI兩者的囊泡之共定位。藍色螢光指示DAPI染色。在ILI後15分鐘進行圖 19A 至圖 19D 中之量測。
圖 19C 展示在注射遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之前，LMAN1 (綠色螢光)與COPI (紅色螢光)共定位於極化上皮細胞之頂端區域(由白色箭頭突出顯示)中。
圖 19D 展示，在遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之頂端ILI (由白色箭頭突出顯示)之後，LMAN1與遞送構築體相互作用且與遞送構築體一起分佈至上皮細胞之基底區域，該基底區域鄰近於固有層(標示為「l-p」)。因此，LMAN1重佈似乎由Cholix載體使用以自上皮細胞之頂端側移動至基底室。
跟蹤實驗展示，衍生自Cholix之載體可利用ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)以在胞吞之後自頂端室遷移至基底室。
圖 19E 至圖 19H 展示，在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)後5 min (圖 19F )、10 min (圖 19G )及15 min (圖 19H )，Cholix載體(SEQ ID NO: 134)自上皮細胞中之頂端(由白色箭頭1號指示)室遷移至基底(由白色箭頭2號指示)室。Cholix載體定位由綠色螢光展示，ERGIC受體定位由紅色螢光展示，且ER-高爾基體遷移蛋白複合物之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與ERGIC受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與ER-高爾基體遷移蛋白複合物之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、ERGIC受體及ER高爾基體遷移蛋白複合物之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 19E 展示未經處理之極化腸道上皮細胞。
圖 19F 展示在頂端室中內腔注射後5分鐘，Cholix載體(SEQ ID NO: 134)與ER-高爾基體遷移蛋白複合物之定位及相互作用，如由頂端室中之粉色螢光信號所指示。
圖 19G 展示在內腔注射隨後將載體(及構築體)基底釋放至固有層(金箭頭)中後10分鐘，與ERGIG-53締合之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)遷移至基底膜。此等資料顯示，衍生自Cholix之載體利用與ERGIC蛋白之特異性相互作用來「攔截」自極化上皮細胞之頂端室至基底室的囊泡遷移。
圖 19H 展示在內腔注射後15分鐘，增加量的存在於固有層中之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)。
圖 19I 至圖 19K 展示，Cholix載體(SEQ ID NO: 134)利用基底蛋白分泌機制來遷移穿過極化上皮細胞至固有層中。在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)後15 min獲取螢光顯微影像，且展示出基底囊泡可含有Cholix載體及ERGIC-53受體、Cholix載體及基底分泌蛋白或Cholix載體、ERGIC-53受體及基底分泌蛋白中之全部三者。Cholix載體定位由綠色螢光展示(使用抗Cholix載體抗體)，ERGIC-53受體定位由紅色螢光展示，且基底分泌蛋白之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與ERGIC-53受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與基底分泌蛋白之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、ERGIC-53受體及基底分泌蛋白之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 19I 展示基底室囊泡含有Cholix載體(SEQ ID NO: 134)及ERGIC-53受體，如由黃色螢光所指示。
圖 19J 展示基底室囊泡含有Cholix載體(SEQ ID NO: 134)及基底分泌蛋白，如由粉色螢光所指示。
圖 19K 展示基底室囊泡含有Cholix載體(SEQ ID NO: 134)、ERGIC-53受體及基底分泌蛋白，如由白色斑點(例如，綠色、紅色及紫色螢光之重疊)所指示。
圖 20 A 展示在遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之缺失下，另一內質網-高爾基體-中間室(ERGIC)元件SEC22b之分佈。在未經處理(亦即，未注射遞送構築體)組織中，SEC22b及LMAN1廣泛地共定位於頂端室中，而單獨地觀測到僅LMAN1靠近頂端質膜。在圖 20A 至圖 20D 中，紅色螢光展示LMAN1之定位，紫色螢光展示SEC22b之定位，綠色螢光展示hGH之定位，白色箭頭指示頂端表面，且「G」指示杯狀細胞。
圖 20 B 展示在包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之ILI後5分鐘，LMAN1、SEC22b及hGH共定位於上皮細胞之頂端室中，但不顯著共定位於基底室中。
圖 20 C 展示在ILI後10 min，觀測到遞送構築體(SEQ ID NO: 159)與LMAN1共定位於不具有SEC22b的上皮細胞之基底室中，從而確認LMAN1在囊泡內部與遞送構築體相互作用且與遞送構築體一起自上皮細胞之頂囊泡室移動至基底囊泡室。
圖 20 D 展示在ILI後15 min，遞送構築體(SEQ ID NO: 159)與LMAN1共定位於基底室中之程度增加，其中隨時間推移大量hGH達至固有層。
圖 20 E 至圖 20 H 展示如上文所描述且展示於圖 20A 至圖 20D 中之相同組織切片，但僅展示LMAN1及SEC22b信號(無hGH信號)。此等顯示，回應於遞送(SEQ ID NO: 159)之頂端施加，LMAN1至基底室之深刻重佈而無SEC22b之重佈。此等資料進一步顯示，包含衍生自Cholix之載體的遞送構築體可利用內源Cholix遷移途徑，該等途徑允許藉由將此類負載偶合於載體而迅速及有效的轉運負載穿過腸道上皮。
總而言之，此等資料展示，衍生自Cholix之載體利用內源細菌遷移機制來實現頂端至基底胞移轉送，從而允許此類載體及包含此類載體之遞送構築體自腸內腔遷移至固有層，而不損害腸道上皮之障壁功能且在此轉運期間不以酶方式或化學方式修飾。此上皮轉運機制可使得能夠經口投與包含偶合於治療負載的衍生自Cholix之載體的治療遞送構築體且將治療負載轉運穿過完整且極化之上皮膜。實例 11 衍生自 Cholix 之 載體之表面模型
此實例展示具有SEQ ID NO: 178之Cholix多肽之結構序列元件。
圖 21A 至圖 21E 展示由SEQ ID NO: 178 (包括SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-265及N端甲硫胺酸)組成的衍生自Cholix之載體之例示性表面模型，該例示性表面模型用於突出顯示可在與頂端至基底胞移轉送相關的某些功能中起作用的所關注選定區域，以及其在蛋白質表面上的相對位置及接近度。定位於殘基V1 及E39 內之胺基酸區域鄰近於暴露胺基酸D150 -K186 及K186 -L205 之表面。特定言之，L17 -I25 (區域X1，SEQ ID NO: 160)與T170 -I176 (區域X2，SEQ ID NO: 161)配位以形成由若干負電荷包圍之凹穴。類似地，K186 -H202 (區域X3，SEQ ID NO: 162)與I31 -E39 (區域X4，SEQ ID NO: 163)配位以形成連續隆脊結構。另外，表面模型展示殘基D135 -N139 (區域X5，SEQ ID NO: 164)，且天冬醯胺殘基(例如，潛在糖基化位點)以紫色突出顯示。
圖 21A 展示具有SEQ ID NO: 178之Cholix多肽之胺基酸序列。圖 21B 展示區域X1、X3及X4之位置。圖 21C 展示區域X1及X2以及區域X3及X4之位置。圖 21D 展示區域X1、X2、X4及X5之位置。
此結構資料展示，SEQ ID NO: 1之Cholix序列內之功能序列片段可與彼此具有緊密接近，諸如區域X3與X4及區域X1與X2。實例 12 衍生自 Cholix 之 遞送構築體在胞移轉送期間使用不同室與各種標記物蛋白相互作用及 / 或共定位
此實例顯示，衍生自Cholix之載體可利用不同室以供使用各種標記物蛋白遷移至上皮細胞中及穿過(例如，經由胞移轉送)上皮細胞(參見例如實例 8 )。此等資料指示，衍生自Cholix之載體構築體可利用或「攔截」特異性及內源Cholix遷移途徑(圖 24 )。在此實例中描述之研究使用衍生自Cholix之遞送構築體來進行，該遞送構築體具有闡述於SEQ ID NO: 149中的包括經由具有闡述於SEQ ID NO: 176中之序列的間隔子偶合於IL-10 (SEQ ID NO: 145)之載體(SEQ ID NO: 135)的序列。
圖 22A 至圖 22L 說明所衍生遞送構築體(SEQ ID NO: 149)之遷移途徑分析。在圖 22A 至圖 22L 中，白色箭頭1號突出顯示頂端表面，白色箭頭2號突出顯示基底表面，且白色箭頭3號突出顯示固有層。
圖 22A 展示在與上皮細胞之頂端室及基底室兩者處之遷移一致的細胞位置中，遞送構築體(SEQ ID NO: 149)與EEA1抗原堅固地共定位，表明衍生自Cholix之遞送構築體存在於早期核內體室中。紅色螢光展示EEA1抗原之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位。
圖 22B 展示遞送構築體 (SEQ ID NO: 149)與Rab7 (左上方)主要堅固地共定位於上皮細胞之頂端室中，但在固有層內之細胞中僅具有受限的共定位，表明衍生自Cholix之遞送構築體存在於晚期核內體室中(左下方展示白光影像，且右下方展示合併染色，其中DAPI染色以藍色展示，紅色螢光展示EEA1抗原之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位)。
圖 22C 展示在與不含遞送構築體(SEQ ID NO: 149)之成熟溶酶體一致的較大特異性囊泡中鑑別出LAMP1 (白色箭頭，紅色螢光展示EEA1抗原之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位)。然而，遞送構築體(SEQ ID NO: 149)與LAMP1抗原共定位於除溶酶體樣結構以外之細胞位置中，與上皮細胞之頂端室及基底室兩者處之囊泡遷移一致，表明衍生自Cholix之遞送構築體存在於晚期核內體室中。
圖 22D 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)構築體亦與網格蛋白包覆之囊泡堅固地共定位(尤其在鄰近於胞核之區域中)，且與Rab11a主要共定位於上皮細胞之基底室中以及固有層內之所選細胞中。DAPI染色以藍色展示，紅色螢光展示IL-10抗原之定位，且綠色螢光展示網格蛋白之定位。
圖 22E 展示，遞送構築體(SEQ ID NO: 149)如由鈣聯蛋白(紅色螢光展示鈣聯蛋白之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位)所顯示與內質網共定位於鄰近於上皮細胞中之胞核的圖案中及固有層內的細胞之較大部分中。特定言之，與內質網高爾基體中間室(ERGIC)及LMAN1抗原堅固地共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)似乎回應於載體胞吞及胞移轉送而重佈，如注射後5分鐘(圖 22F )、10分鐘(圖 22G )及15分鐘(圖 22H )所展示。
圖 22F 展示與內質網高爾基體中間室53 (ERGIC-53)及LMAN1抗原(紅色螢光展示ERGIC-53及LMAN1之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位，藍色螢光展示DAPI染色)堅固地共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)似乎回應於載體胞吞及胞移轉送而重佈，如注射後5分鐘所展示。
圖 22G 展示注射後10分鐘與LMAN1抗原共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)構築體。資料展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)在固有層中之顯著定位。
圖 22H 展示注射後15分鐘與LMAN1抗原共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)構築體。資料展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)在固有層中之顯著定位。
圖 22I 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)未與存在於上皮細胞中的低水準之巨蛋白共定位(紅色螢光展示IL-10之定位，且綠色螢光展示定位巨蛋白，藍色螢光展示DAPI染色)。一些巨蛋白與存在於固有層中的細胞之子集中的構築體共定位，表明衍生自Cholix之載體不與高爾基體室一起定位。
圖 22J 展示58K抗原定位於胞核頂端之位點處之上皮細胞中，且遞送構築體(SEQ ID NO: 149)以表明穿過此室之簡要移動的方式展示與此蛋白質之一些共定位(紅色螢光展示IL-10之定位，且綠色螢光展示定位58K高爾基體抗原，藍色螢光展示DAPI染色)。在固有層內之細胞中未觀測到58K抗原。
圖 22K 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149，左上方，IL-10定位)展示出與TGN38抗原(右上方)之一些水準的共定位，其展示受限於上皮細胞中之核之頂端側且鄰近於固有層內之少數細胞之胞核的細胞分佈。左下方影像展示白光影像，且右下方展示與IL-10 (紅色)、TGN38 (綠色)及DAPI信號(藍色螢光)合併(重疊)。
圖 22L 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149) (由綠色螢光展示之IL-10定位，右上方)與Rab11a (左上方，由紅色螢光展示之定位)主要堅固地共定位於上皮細胞之基底室中及固有層內之所選細胞中。左下方影像展示白光影像，且右下方展示與IL-10 (綠色)、Rab11a (紅色)及DAPI信號(藍色螢光)合併(重疊)。
圖 23A 至圖 23C 展示顯微影像，該等顯微影像顯示在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後的各個時間點處，IL-10穿過威斯塔大鼠之極化腸道上皮細胞的胞移轉送。遞送構築體(SEQ ID NO: 149)包括經由具有闡述於SEQ ID NO: 176中的胺基酸序列之間隔子偶合於具有闡述於SEQ ID NO: 145中的胺基酸之IL-10負載的具有SEQ ID NO: 135之載體。綠色螢光指示IL-10之存在(經由用抗IL-10抗體染色)。藍色螢光指示DAPI染色(其標記DNA)，且紅色螢光指示CK-8 (細胞角蛋白-8)之存在，藉由其衍生自Cholix之載體可在胞移轉送期間共定位(例如，在上皮細胞之核上區域中)。白色箭頭1號突出顯示上皮細胞之頂端膜，且白色箭頭2號突出顯示上皮細胞之基底膜。
圖 23A 顯示，在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後一分鐘，IL-10之胞移轉送之程度。資料展示，IL-10負載自頂端至基底位點及至固有層中的轉運早在施加遞送構築體後1分鐘發生。白色箭頭3號指示IL-10存在於固有層中。
圖 23B 顯示，在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後五分鐘，IL-10之胞移轉送之程度。資料展示，在內腔施加遞送構築體後5分鐘存在於固有層(見例如白色箭頭3號)中的增加量之經轉運IL-10負載。
圖 23C 顯示，在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後十分鐘，IL-10之胞移轉送之程度。資料展示，在內腔施加遞送構築體後10分鐘存在於固有層(見例如白色箭頭3號)中的甚至更高量之經轉運IL-10負載。
已進行利用螢光顯微法之額外遷移實驗以闡明包括於具有SEQ ID NO: 149之遞送構築體中的具有SEQ ID NO: 135的Cholix載體之胞移轉送機制。
圖 23D 至圖 23F 展示在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於IL-10 (SEQ ID NO: 145)的具有SEQ ID NO: 135之Cholix載體的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後1 min，具有SEQ ID NO: 135之Cholix載體在上皮細胞中之頂端胞吞及早期遷移。資料展示，衍生自Cholix之載體藉由與溶酶體回避受體相互作用來回避溶酶體破壞途徑。Cholix載體定位由綠色螢光展示，頂端進入受體(例如，TMEM132)定位由紅色螢光展示；且溶酶體回避受體之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與頂端進入受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與溶酶體回避受體之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、頂端進入受體及溶酶體回避受體之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 23D 展示Cholix載體(SEQ ID NO: 135)在極化上皮細胞之頂端膜(由白色箭頭1號指示)處之定位。基底膜由白色箭頭2號指示，且固有層由白色箭頭3號指示。
圖 23E 展示Cholix載體(SEQ ID NO: 135)與頂端進入受體(例如TMEM132)之相互作用，如由在頂端膜處且圍繞頂端膜之黃色螢光所指示。
圖 23F 展示Cholix載體(SEQ ID NO: 135)、頂端進入受體及溶酶體回避受體在頂端膜處緊密接近，如由白色箭頭所指示之白色斑點(例如，綠色、紅色及紫色螢光之重疊)所展示。假定溶酶體回避受體可靠近Cholix載體頂端進入受體複合物，隨後歸因於pH環境及此等Cholix載體-受體相互作用之pH依賴性的變化，Cholix載體與頂端進入受體解離且Cholix載體與溶酶體回避受體締合，如例如圖 15B 中所展示。
圖 23G 至圖 23H 展示在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於IL-10 (SEQ ID NO: 145)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 135)的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後5及15 min，Cholix載體(SEQ ID NO: 135)自上皮細胞中之頂端室遷移至核上室。Cholix載體定位由綠色螢光展示，ERGIC受體定位由紅色螢光展示，頂端進入受體(例如，TMEM132)定位由橙色螢光展示；且溶酶體回避受體之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與ERGIC受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與溶酶體回避受體之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、頂端進入受體及溶酶體回避受體之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 23G 展示在內腔注射遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後5分鐘，Cholix載體(SEQ ID NO: 135)在極化腸道上皮細胞中之定位。資料展示，在頂端受體介導之胞吞後，Cholix載體與溶酶體回避受體及靠近頂端膜之頂端進入受體形成複合物(由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)指示且由白色箭頭突出顯示)且亦開始與ERGIC受體相互作用，如由在細胞內略微更接近於核上區域的黃色螢光(及黃色箭頭)所顯示。
圖 23H 展示在內腔注射遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後15分鐘，Cholix載體(SEQ ID NO: 135)在極化腸道上皮細胞中之定位。資料展示，載體在與ERGIC (見黃色箭頭)締合時自頂端室移動至核上室，其中相較於注射後5分鐘，黃色螢光強度增加，指示隨時間推移增加的Cholix載體自頂端移動至核上區域。資料進一步展示Cholix載體在基底膜處及固有層(金箭頭)中之定位。
總之，此等資料顯示，衍生自Cholix之載體可利用內源Cholix遷移途徑來胞移轉送而穿過極化上皮細胞且因此可用於將負載(例如，治療蛋白，諸如介白素)迅速且有效地轉運穿過上皮細胞障壁而不損害此負載之生物活性。實例 13 抗 TNFα 藥劑穿過上皮細胞層之轉運
此實例展示衍生自Cholix多肽之載體可將抗TNFα藥劑轉運穿過完整上皮細胞層。
針對腸上皮轉運如下測試遞送構築體：使野生型大鼠(Sprague Dawley®，約200-250公克，約6週大，購自Charles River)空腹整夜以清腸；製備含有4%甲醛之微量離心套管、用於組織保藏之套管、用於血液收集之微量離心套管、用於血清收集之微量離心套管、PBS及測試製品；準備實驗用動物(用異氟醚麻醉動物，且剃削腹部)；為各動物製備注射液(各動物接受4次注射(2×空腸及2×結腸)；打開腹腔，用區別性顏色定位且標記注射之部位；將測試製品緩慢注射至內腔中(注射在結腸中進行10分鐘且在空腸中進行40分鐘)，且動物每次注射接受35 μg的呈1 μg/μL之濃度的蛋白質；在50分鐘時將動物安樂死；經由心臟穿刺收集最終血液；移除空腸及結腸且置於塑膠襯裡工作表面上；使用PBS清除空腸及結腸之內容物並捨棄；自注射部位切除1 cm長度之腸道；將所切除組織切成兩半，且將1個切片置於4%甲醛中。隨後將殘留組織縱向切開且立即置於微量離心套管中並冷凍。可對所有注射部位重複此過程。移除肝(約1 cm3 )且分割為2片。 將肝之1個切片置於甲醛中，且將第二切片即時冷凍儲存。在40 min結束時收集腸、肝與血清樣本。離心血液樣本且將血清轉移至容器以供儲存。將樣本轉運於乾冰上且在-80℃下儲存。給藥策略如下： Chx386 -抗TNFα      100 µL，490 pmol/98 µg (4.9 uM) Chx415 -抗-TNFα     100 µL，490 pmol/99.5 µg (4.9 uM) 抗TNFα       100 µL，490 pmol/76 µg (4.9 uM)
使用小鼠IgG1 ELISA套組(abcam®，目錄號ab133045)如下執行Cholix-抗TNF-α構築體之腸上皮轉運之生物分析：自Brains On-line獲得組織樣本；將300 μL分析緩衝液1×添加至含有組織樣本之各套管；自分析緩衝液移除組織且置於無菌潔淨的細胞培養物蓋板上；用細胞清除器平緩地廢棄腸樣本，謹慎避免收集腸系膜；以類似方式用額外浸解及均質化來處理肝樣本；將所得細胞均質物轉移回至原始套管中；用100 μL緩衝液(2×)沖洗殘留組織樣本及工作區域；以最大力離心細胞均質物溶液5分鐘；根據製造商之說明書將上澄液施加至ELISA板。在-20℃下儲存殘留上澄液以供後續使用。
圖 25 展示衍生自Cholix386 之載體(例如，SEQ ID NO: 135或180)及衍生自Cholix415 之載體(例如，包含SEQ ID NO: 1之殘基1-415)兩者在10分鐘及在40分鐘時將抗TNFα藥劑(例如，抗TNFα抗體或其功能片段)轉運穿過腸上皮細胞。此外，Cholix386 -抗TNFα構築體以僅抗TNF-α之約12×速率轉運，且Cholix415 -抗TNFα以僅抗TNF-α之約7×速率轉運。
此等資料顯示，衍生自Cholix之載體能夠將諸如抗TNFα藥劑之多種負載分子轉運穿過完整且極化之上皮細胞層。實例 14 製備包含艾塞那肽之遞送構築體
艾塞那肽(SEQ ID NO: 195)為具有由C端胺及N端H穩定之GLP-1樣生物活性的肽。在此實例中，製備兩種非天然存在之經分離構築體且針對活體內腸上皮轉運對其進行測試，該等構築體包含：1)處理為具有SEQ ID NO: 192之載體且與SEQ ID NO: 195交聯的具有SEQ ID NO: 194之載體，及2)處理為具有SEQ ID NO: 193之載體且與SEQ ID NO: 195交聯的具有SEQ ID NO: 191之載體。如本文中所描述來製備具有SEQ ID NO: 191及SEQ ID NO: 192之載體，且自ProSpec-Tany Technogene Ltd. PO Box 6591, East Brunswick, NJ 08816購得艾塞那肽(SEQ ID NO: 195) (目錄號HOR-246)。自ThermoFisher購得包含Sulfo-SMCC交聯劑之PierceTM 對照蛋白質-蛋白質聯套組(目錄號23456)。負載及載體活化及交聯：
將艾塞那肽(10 mg)溶解於5 mL H2 O中以形成2 mg/mL溶液。將Sulfo-SMCC (2 mg)溶解於2 mL之PBS中。緊隨其後，將0.088 mL (約5倍莫耳過量)之Sulfo-SMCC溶液添加至1.0 mL艾塞那肽溶液，且在室溫下培育30分鐘。藉由將1.0 mL之順丁烯二醯亞胺艾塞那肽反應混合物施加至用PBS平衡之去鹽管柱，用PBS溶離，且收集0.5 mL溶離份來移除未反應之Sulfo-SMCC。量測在280 nm處之各溶離份之吸收率以定位蛋白質峰值。混合含有大部分蛋白質之峰溶離份。經彙集活化艾塞那肽之濃度藉由將其在280 nm處之吸收率與原始蛋白質溶液之吸收率進行比較來測定。
具有SEQ ID NO: 193及SEQ ID NO: 194之載體具有C端延長，包含由形成二硫鍵及C端His6 標記之兩個半胱胺酸殘基側接的TEV裂解位點。使用標準方法在HisTrap管柱上純化具有SEQ ID NO: 193及SEQ ID NO: 194之載體。藉由在30℃下用2 μl之0.1M二硫蘇糖醇及5 μl之TEV蛋白酶處理兩小時來活化含2 mg蛋白質(10 mg/ml之200 μL)之PBS (pH 7.4)。將裂解及減少之蛋白質施加至用PBS平衡之1-ml HisTrap管柱。C端片段結合至管柱，且在流通物中收集其中無半胱胺酸接近其C端的活化N端SEQ ID NO: 191或SEQ ID NO: 192產物。
將順丁烯二醯亞胺活化之艾塞那肽與載體(巰基-SEQ ID NO: 191蛋白質或巰基-SEQ ID NO: 192蛋白質)以相同莫耳量混合，且接著在室溫下培育60分鐘。在經庫馬斯染色之SDS凝膠上評定SMCC交聯之SEQ ID NO: 192-艾塞那肽複合物之純度。複合物大約為校正分子量且具有＞90%純度(圖 26 )。接著在4℃下儲存交聯之遞送構築體。實例 15 艾塞那肽遞送構築體之活體內胞移轉送
針對腸上皮轉運如下測試遞送構築體：使野生型Sprague Dawley®大鼠(約200-250公克，約6週大，購自Charles River)空腹整夜以清除其腸道。製備以下材料：含有4%甲醛之微量離心套管、用於組織保藏之套管、用於血液收集之微量離心套管、用於血清收集之微量離心套管、PBS及測試製品。藉由用異氟醚麻醉且剃削其腹部來準備實驗用動物。為各動物製備四次注射液(每空腸2次且每結腸2次)。打開腹腔。用區別性顏色定位且標記注射部位。將測試製品緩慢注射至內腔中，對於結腸歷經10分鐘，且對於空腸歷經40分鐘。動物每次注射接受35 μg的呈1 μg/μL之濃度的蛋白質。在50分鐘時將動物安樂死。經由心臟穿刺收集最終血液。將空腸及結腸移除，且置於塑膠襯裡工作表面上。使用PBS沖洗空腸及結腸之內容物且捨棄。自注射部位切除1 cm長度之腸道。將所切除組織切成兩半。將一個切片置於4%甲醛中。接著縱向切開殘留組織且立即置於微量離心套管中並冷凍。對所有注射部位重複此過程。移除肝(約1 cm3 )且分割為2片。對於儲存，將肝之一個切片置於甲醛中且立即冷凍第二切片。在注射後40 min時收集腸、肝與血清樣本。離心血液樣本，且將所得血清轉移至容器以供儲存。將樣本轉運於乾冰上且在-80℃下儲存。給藥策略如下： SEQ ID NO: 192-艾塞那肽 100 µL，490 pmol/29.4 µg (4.9 μM) SEQ ID NO: 191-艾塞那肽 100 µL，490 pmol/30.9 µg (4.9 μM) SEQ ID NO: 195         100 µL，490 pmol/2 µg (4.9 μM)
使用艾生丁-4 ELISA套組(Phoenix Pharma，目錄號EK-070-94)如下執行SEQ ID NO: 192-艾塞那肽、SEQ ID NO: 191-艾塞那肽及SEQ ID NO: 195 (艾塞那肽)之腸上皮轉運之生物分析：自Brains On-line獲得組織樣本；將300 μL分析緩衝液(1×)添加至含有組織樣本之各套管；自分析緩衝液移除組織且置於無菌潔淨細胞培養物蓋板上；用細胞清除器平緩地廢棄腸樣本，謹慎避免收集腸系膜；以類似方式用額外浸解及均質化來處理肝樣本；將所得細胞均質物轉移回至原始套管中；用100 μL緩衝液(2×)沖洗殘留組織樣本及工作區域；以最大力離心細胞均質物溶液5分鐘；根據製造商之說明書將上澄液施加至ELISA板；在-20℃下儲存殘留上澄液以供後續使用。
如圖 27 中所描繪，在10分鐘及在40分鐘時觀測到SEQ ID NO: 192-艾塞那肽及SEQ ID NO: 191-艾塞那肽兩者穿過腸上皮細胞之轉運。此外，以比僅SEQ ID NO: 195 (艾塞那肽)更高的速率轉運SEQ ID NO: 192-艾塞那肽及SEQ ID NO: 191-艾塞那肽兩者，尤其在40分鐘時。
本文中所揭示及主張之所有制品及方法均可根據本發明來做出且執行而無需過多實驗。雖然已針對較佳實施例描述本發明之製品及方法，但熟習此項技術者將顯而易見，可在不脫離本發明之精神及範疇的情況下將變化應用於製品及方法。對於熟習此項技術者顯而易見，無論為目前存在或以後研發，所有此類變化及等效物均認為在由所附申請專利範圍界定的本發明之精神及範疇內。說明書中所提及之所有專利、專利申請案及公開案指示本發明涉及之領域中一般熟習此項技術者的水準。所有專利、專利申請案及公開案出於所有目的且在相同程度上以全文引用之方式併入本文中，如同各單獨公開案出於任何及所有目的特別且單獨指示為以全文引用之方式併入本文中一般。本文中說明性描述之揭示內容適當地可在無本文中未特定揭示之任何要素的情況下實踐。已採用之術語及表達用作描述而非限制之術語，且在使用此類術語及表達中不意欲排除所展示及描述之特徵的任何等效物或其部分，但應認識到，在本發明所主張之範疇內，各種修改係可能的。因此，應理解，儘管本發明已由較佳實施例及視情況選用之特徵特定揭示，但熟習此項技術者可採取本文中所揭示之概念的修改及變化，且此類修改及變化應視為屬於所附申請專利範圍所界定的本發明之範疇內。
本發明之各種特徵在所附申請專利範圍中細緻闡述。本專利或申請案檔案含有至少一張彩製圖。在請求且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。將參考闡述利用本發明原理之說明性態樣及其隨附圖式(本文中亦稱「圖(Figure)」及「圖(FIG.)」)的以下詳細描述來獲得對本發明之特徵及優點的較佳理解：
圖 1 示意性地展示包含上皮細胞單層上方之頂端室及此上皮細胞單層下方之基底室的設置。對於頂端至基側滲透性(例如，胞移轉送)，將測試物品(例如，載體、遞送構築體、負載等)施加至頂端(A)側，且在基側(B)側上測定(例如，使用西方墨點法、層析等)所滲透(例如，胞移轉送)材料之量。
圖 2 展示具有SEQ ID NO: 147之遞送構築體，其包含載體(SEQ ID NO: 134)及IL-22負載(SEQ ID NO: 142)，以時間依賴性方式將IL-22負載轉運穿過完整極化之Caco-2腸道上皮細胞單層(在將遞送構築體施加至如上文在圖 1 中所描述的單層之頂端膜後15、30及45分鐘量測基側位點上蛋白質之量)。資料進一步展示，相較於在將不偶合於載體之IL-22 (SEQ ID NO: 143)施加至Caco-2上皮細胞時，在將包含SEQ ID NO: 134之載體及SEQ ID NO: 142之IL-22負載的遞送構築體(SEQ ID NO: 147)施加至Caco-2上皮細胞時，約2-3倍多的IL-22穿過Caco-2上皮細胞單層。
圖 3 展示具有SEQ ID NO: 147之遞送構築體，其包含載體(SEQ ID NO: 134)及IL-22負載(SEQ ID NO: 142)，使得以時間依賴性方式將IL-22負載轉運穿過完整且極化之SMI-100腸道上皮細胞單層(在將遞送構築體施加至單層之頂端膜後15、30及45分鐘時量測基側室中的蛋白質之量)。資料進一步展示，相較於在將不偶合於載體之IL-22 (SEQ ID NO: 143)施加至SMI-100上皮細胞時，在將包括偶合於SEQ ID NO: 142之IL-22負載的SEQ ID NO: 134之載體的遞送構築體施加至SMI-100上皮細胞時，約2-3倍多的IL-22穿過SMI-100上皮細胞單層。
圖 4 顯示，具有SEQ ID NO: 147之遞送構築體使得將IL-22 (SEQ ID NO: 142)大量活體內轉運穿過完整且極化之腸道上皮。上皮之頂端位點由白色箭頭1號突出顯示。固有層縮寫為「l.p.」極化上皮之外部基底膜由白色箭頭2號突出顯示。IL-22定位由白色箭頭及綠色螢光(例如，白色箭頭3號)指示，藍色螢光指示DAPI染色。
圖 5 展示第一遞送構築體(SEQ ID NO: 147)及第二遞送構築體(SEQ ID NO: 148)將IL-22負載轉運穿過Caco-2單層(「在轉運之後」係指在轉運穿過Caco-2單層之後將蛋白質定位於基側室中)。西方墨點資料進一步展示遞送構築體在轉運之後為完整的，例如，如由低分子量降解產物之缺失所示。在載體之缺失下相對於IL-22對照蛋白(SEQ ID NO: 143)之轉運展示具有遞送構築體SEQ ID NO: 147及SEQ ID NO: 148的IL-22負載之轉運。對照蛋白IL-22由闡述於SEQ ID NO: 143中的胺基酸序列組成。
圖 6 展示在胞移轉送之後在Caco-2上皮細胞單層之基側室中偵測到的遞送構築體(SEQ ID NO: 147)及IL-22 (SEQ ID NO: 143)之量。蛋白質量經標準化。資料展示，包括衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 147)穿過極化上皮細胞之轉運係視葡萄糖調節蛋白75 (GRP75，例如GRP75B)而定。相較於表現GRP75之細胞(指示為Caco-2)，基因敲落GRP75之Caco-2細胞(指示為Caco-2GRP75- )展示出顯著減少的遞送構築體(SEQ ID NO: 147)之轉運。相較於表現GRP75之細胞，藉由在GRP75基因敲落細胞中之基側室中偵測到的減少的遞送構築體之量來指示對GRP75之轉運依賴性。僅IL-22 (SEQ ID NO: 143)之轉運不受GRP75基因敲落影響。
圖 7 展示將遞送構築體(SEQ ID NO: 147)轉運穿過極化上皮細胞係視基底膜特異性硫酸乙醯肝素蛋白聚糖核心蛋白(HSPG)而定。相較於表現HSPG之細胞(指示為Caco-2)，基因敲落此蛋白質之Caco-2細胞(指示為Caco-2HSPG- )展示出顯著減少的遞送構築體(SEQ ID NO: 147)之轉運。相較於表現HSPG之細胞，藉由在HSPG基因敲落細胞中之基側室中偵測到的減少量的遞送構築體來指示對HSPG之轉運依賴性。僅IL-22 (SEQ ID NO: 143)(亦即，不偶合於載體)之轉運並不視HSPG而定。
圖 8 描繪在使用大鼠腔內注射模型進行腔內注射後15 min上皮細胞內之頂端室(用白色箭頭2號突出顯示)中的遞送構築體(SEQ ID NO: 154)之螢光顯微偵測(白色箭頭1號突出顯示頂端表面，白色箭頭3號突出顯示基底膜，且白色箭頭4號突出顯示固有層)。資料顯示，衍生自Cholix41-187 之一實例(例如，SEQ ID NO: 137)的載體能夠將負載轉運至上皮細胞之頂端室，但不穿過上皮細胞。紅色螢光展示Cholix載體之定位，綠色螢光展示hGH (SEQ ID NO: 146)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色。
圖 9 描繪在使用大鼠腔內注射模型進行腔內注射後15 min上皮細胞之頂端室(用白色箭頭2號突出顯示)中的遞送構築體(SEQ ID NO: 156)之螢光顯微偵測(白色箭頭1號突出顯示頂端表面，白色箭頭3號突出顯示基底膜，且白色箭頭4號突出顯示固有層)。資料顯示，衍生自Cholix40-205 之一實例(SEQ ID NO: 138)的載體能夠將負載(例如，hGH)轉運至上皮細胞之頂端室，但不穿過上皮細胞至固有層中。此等資料進一步表明，SEQ ID NO: 1之殘基1-39可在胞移轉送中起作用，但可能不為胞吞Cholix載體所必需。紅色螢光展示Cholix載體之定位，綠色螢光展示hGH (SEQ ID NO: 146)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色。
圖 10A 描繪在向大鼠空腸腔內注射遞送構築體後5 min上皮細胞內部的頂端室中之遞送構築體(SEQ ID NO: 153)之螢光顯微偵測。在圖 10A 至圖 10C 中，紅色螢光展示Cholix載體之定位，綠色螢光展示hGH (SEQ ID NO: 146)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色；白色箭頭1號突出顯示頂端室，且白色箭頭2號突出顯示核上室。
圖 10B 描繪在腔內注射後10 min遞送構築體(SEQ ID NO: 153)之螢光顯微偵測。資料顯示，隨時間推移載體將hGH負載自頂端室轉運至核上室及基底室。
圖10C 描繪在腔內注射後15 min遞送構築體(SEQ ID NO: 153)之螢光顯微偵測。資料顯示，隨時間推移載體將負載自頂端室轉運至核上室及基底室。
圖 11A 至圖 11B 描繪僅人類生長激素(hGH，SEQ ID NO: 190)相較於偶合於載體之hGH (SEQ ID NO: 146)的頂端至基底轉運。藉由C端截斷相對於參考SEQ ID NO: 1來指示載體長度(例如，「134」指示具有SEQ ID NO: 1之殘基1-134的載體)。所有載體進一步包括N端甲硫胺酸。hGH之西方墨點法定性地評定此等蛋白質在2 h之後活體外穿過原代人類小腸上皮細胞之極化單層之頂端至基底轉運的能力。頂端施加之材料之量對於hGH含量以莫耳計係等效的，且在分析之前將基底收集物濃縮約10倍。
圖 11A 展示僅hGH (SEQ ID NO: 190)之頂端至基底轉運相對於針對具有闡述於SEQ ID NO: 151 - SEQ ID NO: 154及SEQ ID NO: 159中的在位置134、151、187、41-187及266處分別具有截斷的序列的遞送構築體所量測的彼頂端至基底轉運之比較。資料顯示，相較於具有在266處具有C端截斷之Cholix載體(SEQ ID NO: 159)的構築體，在SEQ ID NO: 1之位置134、151、187處具有C端截斷或在SEQ ID NO: 1之41處具有N端截斷且在187處具有C端截斷的Cholix載體展示顯著減少的所結合hGH之頂端至基底轉運。
圖 11B 展示，具有SEQ ID NO: 155及SEQ ID NO: 157 - SEQ ID NO: 159且包括分別在位置206 (SEQ ID NO:131)、245 (SEQ ID NO: 132)、251 (SEQ ID NO: 133)及266 (SEQ ID NO: 134)處具有C端截斷的Cholix載體的遞送構築體相較於SEQ ID NO: 1顯示有效的所結合hGH (SEQ ID NO: 146)之頂端至基底轉運。儘管在位置245及251處具有Cholix C端截斷的載體顯示與在位置266處具有C端截斷的載體之彼頂端至基底轉運相當的結合hGH (SEQ ID NO: 146)之頂端至基底轉運，但相較於在位置245、251及266處具有C端截斷的載體，在位置206處具有Cholix C端截斷的載體展示hGH之頂端至基底轉運之顯著增強。
圖 12A 至圖 12F 展示穿過各自包括不同Cholix載體的六個遞送構築體之大鼠空腸中之極化腸道上皮細胞的頂端至基底轉運之程度。藉由免疫螢光顯微法分別使用多株抗Cholix及單株抗hGH抗體來顯示Cholix載體(紅色螢光)及hGH (綠色螢光)之定位。白色箭頭指示頂端膜，「l-p」係指固有層，「GC」係指杯狀細胞，且空心箭頭指示存在於固有層中之遞送構築體。
圖 12A 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO:146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 140)的遞送構築體(SEQ ID NO: 151)後15 min的頂端至基底轉運之程度。圖12A 展示載體不能使得遞送構築體進入上皮細胞，表明具有SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基135-151的功能序列片段可在胞吞至極化上皮細胞中起作用(相比之下，圖 12B 顯示具有SEQ ID NO: 139之載體使得細胞能夠經由胞吞進入各別遞送構築體)。
圖 12B 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 139)的遞送構築體(SEQ ID NO: 152)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12B 展示此構築體確實進入上皮細胞(與具有圖 12A 中描述的具有SEQ ID NO: 151之構築體相反)，但主要殘留於頂端，且在一定程度上殘留於基底囊泡池中，但未進入固有層，由此使得能夠將負載遞送至上皮細胞之頂端室及基底室。
圖 12C 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 136)的遞送構築體(SEQ ID NO: 153)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12C 展示此構築體進入上皮細胞，達至頂端室及基底室且亦達至細胞之核上區域，但仍殘留於上皮細胞內部，表明由SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基152-187組成之序列片段可允許進入及遞送至核上區域，以及允許定位於基底室中。
圖 12D 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 137)的遞送構築體(SEQ ID NO: 154)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12D 展示此構築體進入上皮細胞，但殘留於頂端室中，且似乎未達至基底室或核上室。
圖 12E 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 131)的遞送構築體(SEQ ID NO: 155)後15 min的頂端至基底轉運之程度，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12E 展示此構築體完成如由達至固有層之遞送構築體所指示之胞移轉送過程(見空心箭頭)，表明由闡述於SEQ ID NO: 1中的序列之胺基酸殘基188-206組成之序列片段可使得載體(及包含此類載體之構築體)能夠參與基底再循環過程，該等基底再循環過程允許將載體或各別構築體自上皮細胞釋放至基側室(例如，固有層)中。
圖 12F 展示在腔內注射包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)後15 min穿過活體內大鼠空腸上皮單層的轉運，如藉由免疫螢光顯微法所顯示。圖 12F 展示此構築體完成如由達至固有層之遞送構築體所指示的胞移轉送過程(見空心箭頭)。
圖 13A 、 圖 13B 及圖 13C 展示分別具有SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 152及SEQ ID NO: 153之遞送構築體與Rab11a共定位於上皮細胞之頂端側上。資料亦展示，具有SEQ ID NO: 152及SEQ ID NO: 154之構築體未顯著定位於基底側處，但主要殘留於頂端側處。具有SEQ ID NO: 153之構築體確實定位於頂端側及基底側兩者處，然而，僅與Rab11a共定位於頂端側且不共定位於基底側處(圖 13C 之子影像3a及3b)。總之，此等結果表明，不能夠胞移轉送之載體可進入上皮細胞之頂端再循環系統。在腔內注射後15 min進行量測。綠色螢光展示hGH之定位，紅色螢光展示Rab11a (或Rab11)之定位，且藍色螢光指示DAPI染色(實驗描述包括圖 13D )。
圖 13D 展示具有SEQ ID NO: 159之遞送構築體與Rab11a共定位於極化上皮細胞之基底側上但不顯著共定位於頂端側上。此表明能夠胞移轉送之載體可利用基底再循環系統以供將其自上皮細胞釋放至固有層中(見圖 13D 之子影像4a及4b)。
圖 14A 至圖 14C 分別展示相較於僅hGH (SEQ ID NO: 190)，K8、HSPG (串珠素)及GRP75對具有SEQ ID NO: 150之遞送構築體之胞移轉送功能的基因敲除作用，該遞送構築體包括具有闡述於SEQ ID NO: 134中之序列的經由間隔子(其序列闡述於SEQ ID NO: 177中)偶合於hGH的衍生自Cholix之載體。將缺乏特異性候選蛋白K8 (Caco-2K8- )、HSPG (Caco-2HSPG- )及GRP75 (Caco-2GRP75- )之表現的Caco-2細胞之穩定細胞株用作活體外單層以驗證其經由活性及選擇性內源轉運機制在載體(例如，Cholix載體)胞移轉送中的參與性。
圖 14A 展示K8基因敲除未顯著降低遞送構築體(SEQ ID NO: 150)之胞移轉送功能。
圖 14B 展示HSPG (串珠素)基因敲除確實顯著降低遞送構築體(SEQ ID NO: 150)之胞移轉送功能。
圖 14C 展示GRP75基因敲除確實顯著降低遞送構築體(SEQ ID NO: 150)之胞移轉送功能。
圖 15A 展示用於檢驗Cholix載體-GRP75相互作用之pH依賴性的Biacore™結合相互作用。為此，將生物素偶合於全長Cholix蛋白(其序列闡述於SEQ ID NO: 1中)之C端，且隨後使用生物素-抗生蛋白鏈菌素生物結合附著於表面(例如，晶片表面、塑膠96孔培養盤等)，且與純化GRP75蛋白在分別處於pH 5.5、6.5及7.5之緩衝溶液中一起培育。在pH 6.5下量測此相互作用之最高結合親和性。
圖 15B 展示衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 189，在位置581處具有麩胺酸殘基之缺失的SEQ ID NO: 1之全長Cholix序列)與頂端受體(例如，TMEM132，諸如TMEM132A)、溶酶體回避受體(例如，GRP75)、遷移受體(例如，ERGIC-53)及基底受體(例如，串珠素)之相互作用的pH依賴性。如在電漿子共振分析中所測定，受體相互作用之此pH依賴性指示，衍生自Cholix之載體可視其位置而定依序與某些受體相互作用。舉例而言，此等資料展示，衍生自Cholix之載體在pH 7.5下對胞吞及早期遷移受體(諸如頂端進入受體及溶酶體回避受體)具有顯著較高的親和性。一旦pH下降至約5.5，則Cholix載體對於此等早期遷移受體之親和性減小，而其對於頂端-基底遷移受體ERGIC-53及基底釋放蛋白串珠素之親和性在彼pH下顯著增加，從而使得在囊泡胞移轉送過程期間將Cholix載體「移交」至遷移及基底釋放受體。
圖 16 展示全長Cholix蛋白(其序列闡述於SEQ ID NO: 1中)與串珠素及GRP75之顯著Biacore™結合相互作用。
圖 17 展示全長Cholix蛋白(其序列闡述於SEQ ID NO: 1中)與GRP75、串珠素及TMEM132A之顯著Biacore™結合相互作用。
圖 18A 至圖 18D 展示，將藉由腔內注射(ILI，內腔表面指示為圖 18A 至圖 18F 中之白色箭頭)活體內投與至大鼠空腸中之人類生長激素(hGH，SEQ ID NO: 190)的結局首先評估為預期在細胞攝取之後轉運至溶酶體的陰性對照。
圖 18A 展示在注射(ILI)後15分鐘，hGH (SEQ ID NO: 190)之定位受限於上皮細胞之頂端區域中之小囊泡群，如藉由綠色免疫螢光偵測所顯示。
圖 18B 、 圖 18C 及圖 18D 展示，在ILI後15 min，hGH (SEQ ID NO: 190)與溶酶體相關膜蛋白1 (LAMP1，紅色螢光) (圖 18B )及Ras相關蛋白(Rab7，紫色螢光) (圖 18C )以常駐LAMP1+ 、Rab7+ 溶酶體(圖 18D )之約相同頻率及特性共定位，指示hGH在攝取至上皮細胞中之後不久經導引至溶酶體破壞性(例如，再循環)途徑。
圖 18E 及圖 18F 展示包括經由間隔子(SEQ ID NO: 175)偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)經導引遠離溶酶體途徑，且因此未展示與LAMP1 (圖 18E )或Rab7 (圖 18F )之共定位，由此使得能夠將功能負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞至固有層中。
圖 19A 展示在內腔注射包括經由間隔子(SEQ ID NO: 175)偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之前，包衣蛋白I (COPI，紅色螢光)分佈受限於上皮細胞之內腔頂端膜及頂端囊泡室。相比而言，在頂端腔內注射(ILI，內腔表面指示為圖 19A 至圖 19D 中之白色箭頭)遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之後，圖 19B 展示COPI重佈至核上位置，指示含有具有SEQ ID NO: 159之遞送構築體及COPI兩者的囊泡之共定位。藍色螢光指示DAPI染色。在ILI後15分鐘進行圖 19A 至圖 19D 中之量測。
圖 19C 展示在注射遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之前，LMAN1 (綠色螢光)與COPI (紅色螢光)共定位於極化上皮細胞之頂端區域(由白色箭頭突出顯示)中。
圖 19D 展示，在遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之頂端ILI (由白色箭頭突出顯示)之後，LMAN1與遞送構築體相互作用且與遞送構築體一起分佈至上皮細胞之基底區域，該基底區域鄰近於固有層(標示為「l-p」)。因此，LMAN1重佈機制似乎由Cholix載體使用以自上皮細胞之頂端側移動至基底室。
圖 19E 至圖 19H 展示，在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)後5 min (圖 19F )、10 min (圖 19G )及15 min (圖19H )，Cholix載體(SEQ ID NO: 134)自上皮細胞中之頂端(由白色箭頭1號指示)室遷移至基底(由白色箭頭2號指示)室。Cholix載體定位由綠色螢光展示，ERGIC受體定位由紅色螢光展示，且可在頂端至基底遷移中起作用的ERGIC之另一標記物(在本文中亦稱為ER-高爾基體(Golgi)遷移蛋白複合物)之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與ERGIC受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與ER-高爾基體遷移蛋白複合物之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、ERGIC受體及ER-高爾基體遷移蛋白複合物之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 19E 展示未經處理之極化腸道上皮細胞。
圖 19F 展示在頂端室中內腔注射後5分鐘，Cholix載體(SEQ ID NO: 134)與ER-高爾基體遷移蛋白複合物之定位及相互作用，如由頂端室中之粉色螢光信號所指示。
圖 19G 展示在內腔注射隨後將載體(及構築體)基底釋放至固有層(金箭頭)中後10分鐘，與ERGIG-53締合之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)遷移至基底膜。此等資料顯示，衍生自Cholix之載體可利用與ERGIC蛋白(例如，ERGIC-53)之特異性相互作用來「攔截(hijack)」自極化上皮細胞之頂端室至基底室的囊泡遷移。
圖 19H 展示在內腔注射後15分鐘，增加量的存在於固有層中之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)。
圖 19I 至圖 19K 展示，Cholix載體(SEQ ID NO: 134)利用基底蛋白分泌機制來遷移穿過極化上皮細胞至固有層中。在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)後15 min獲取螢光顯微影像，且展示出基底囊泡(在不同上皮細胞中由白色圓形及數字「1-3」突出顯示)可含有Cholix載體及ERGIC-53受體、Cholix載體及基底分泌蛋白或Cholix載體、ERGIC受體及基底分泌蛋白中之全部三者。Cholix載體定位由綠色螢光展示(使用抗Cholix載體抗體)，ERGIC-53受體定位由紅色螢光展示，且基底分泌蛋白之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與ERGIC-53受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與基底分泌蛋白串珠素之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、ERGIC-53受體及串珠素之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 19I 展示基底室囊泡含有Cholix載體(SEQ ID NO: 134)及ERGIC-53受體，如由黃色螢光所指示。
圖 19J 展示基底室囊泡含有Cholix載體(SEQ ID NO: 134)及串珠素，如由粉色螢光所指示。
圖 19K 展示基底室囊泡含有Cholix載體(SEQ ID NO: 134)、ERGIC-53受體及串珠素，如由白色斑點(例如，綠色、紅色及紫色螢光之重疊)所指示。
圖 20 A 展示在遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之缺失下，另一內質網-高爾基體-中間室(ERGIC)元件SEC22b之分佈。在未經處理(亦即，未注射遞送構築體)組織中，SEC22b及LMAN1廣泛地共定位於頂端室中，而單獨地觀測到僅LMAN1靠近頂端質膜。在圖 20A 至圖 20D 中，紅色螢光展示LMAN1之定位，紫色螢光展示SEC22b之定位，綠色螢光展示hGH之定位，白色箭頭指示頂端表面，且「G」指示杯狀細胞。
圖 20 B 展示在包括偶合於hGH (SEQ ID NO: 146)之Cholix載體(SEQ ID NO: 134)的遞送構築體(SEQ ID NO: 159)之ILI後5分鐘，LMAN1、SEC22b及hGH共定位於上皮細胞之頂端室中，但不顯著共定位於基底室中。
圖 20 C 展示在ILI後10 min，觀測到遞送構築體(SEQ ID NO: 159)與LMAN1共定位於不具有SEC22b的上皮細胞之基底室中，從而確認LMAN1在囊泡內部與遞送構築體相互作用且與遞送構築體一起自上皮細胞之頂囊泡室移動至基底囊泡室。
圖 20 D 展示在ILI後15 min，遞送構築體(SEQ ID NO: 159)與LMAN1共定位於基底室中之程度增加，其中隨時間推移增加的hGH達至固有層。
圖 20 E 至圖 20 H 展示如上文所描述且展示於圖 20A 至圖 20D 中之相同組織切片，但僅展示LMAN1及SEC22b信號(無hGH信號)。此顯示，回應於遞送(SEQ ID NO: 159)之頂端施加，LMAN1至基底室之深刻重佈而無SEC22b之重佈。此等資料顯示，包含衍生自Cholix之載體的遞送構築體可利用內源Cholix遷移途徑，該等途徑允許藉由將此類負載偶合於載體而迅速且有效的轉運負載穿過腸道上皮。
圖 21A 至圖 21E 展示由SEQ ID NO: 178 (包括SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1-265及N端甲硫胺酸)組成的衍生自Cholix之載體之例示性表面模型，該例示性表面模型用於突出顯示可在與頂端至基底胞移轉送相關的某些功能中起作用的所關注選定區域，以及其在蛋白質表面上的相對位置及接近度。定位於殘基V1 及E39 內之胺基酸區域鄰近於暴露胺基酸D150 -K186 及K186 -L205 之表面。特定言之，L17 -I25 (區域X1，SEQ ID NO: 160)與T170 -I176 (區域X2，SEQ ID NO: 161)配位以形成由若干負電荷包圍之凹穴。類似地，K186 -H202 (區域X3，SEQ ID NO: 162)與I31 -E39 (區域X4，SEQ ID NO: 163)配位以形成連續隆脊結構。另外，表面模型展示殘基D135 -N139 (區域X5，SEQ ID NO: 164)，且天冬醯胺殘基(例如，潛在糖基化位點)以紫色突出顯示。
圖 21A 展示具有SEQ ID NO: 178之Cholix多肽之胺基酸序列。
圖 21B 展示區域X1、X3及X4之位置。
圖 21C 展示區域X1及X2以及區域X3及X4之位置。
圖 21D 展示區域X1、X2、X4及X5之位置。
圖 21E 展示區域X1、X2、X3、X4及X5之位置。
圖 22A 至圖 22L 說明所衍生遞送構築體(SEQ ID NO: 149)之遷移途徑分析。遞送構築體包含經由甘胺酸-絲胺酸間隔子(SEQ ID NO: 176)偶合於活性經分泌形式之IL-10 (SEQ ID NO: 145)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 135)。在圖 22A 至圖 22L 中，白色箭頭1號突出顯示頂端表面，白色箭頭2號突出顯示基底表面，且白色箭頭3號突出顯示固有層。
圖 22A 展示在與上皮細胞之頂端室及基底室兩者處之遷移一致的細胞位置中，遞送構築體(SEQ ID NO: 149)與EEA1抗原堅固地共定位，表明衍生自Cholix之遞送構築體存在於早期核內體室中。紅色螢光展示EEA1抗原之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位。
圖 22B 展示遞送構築體 (SEQ ID NO: 149)與Rab7 (左上方)主要堅固地共定位於上皮細胞之頂端室中，但在固有層內之細胞中僅具有受限的共定位，表明衍生自Cholix之遞送構築體存在於晚期核內體室中(左下方展示白光影像，且右下方展示合併染色，其中DAPI染色以藍色展示，紅色螢光展示EEA1抗原之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位)。
圖 22C 展示在與不含遞送構築體(SEQ ID NO: 149)之成熟溶酶體一致的較大特異性囊泡中鑑別出LAMP1 (白色箭頭，紅色螢光展示EEA1抗原之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位)。然而，遞送構築體(SEQ ID NO: 149)與LAMP1抗原共定位於除溶酶體樣結構以外之細胞位置中，與上皮細胞之頂端室及基底室兩者處之囊泡遷移一致，表明衍生自Cholix之遞送構築體存在於晚期核內體室中。
圖 22D 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)構築體亦與網格蛋白包覆之囊泡堅固地共定位(尤其在鄰近於胞核之區域中)，且與Rab11a主要共定位於上皮細胞之基底室中以及固有層內之所選細胞中。DAPI染色以藍色展示，紅色螢光展示IL-10抗原之定位，且綠色螢光展示網格蛋白之定位。
圖 22E 展示，遞送構築體(SEQ ID NO: 149)如由鈣聯蛋白(紅色螢光展示鈣聯蛋白之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位)所顯示與內質網共定位於鄰近於上皮細胞中之胞核的圖案中及固有層內的細胞之較大部分中。特定言之，與內質網高爾基體中間室(ERGIC)及LMAN1抗原堅固地共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)似乎回應於載體胞吞及胞移轉送而重佈，如注射後5分鐘(圖 22F )、10分鐘(圖 22G )及15分鐘(圖 22H )所展示。
圖 22F 展示與內質網高爾基體中間室53 (ERGIC-53)及LMAN1抗原(紅色螢光展示ERGIC-53及LMAN1之定位，且綠色螢光展示IL-10之定位，藍色螢光展示DAPI染色)堅固地共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)似乎回應於載體胞吞及胞移轉送而重佈，如注射後5分鐘所展示。
圖 22G 展示注射後10分鐘與LMAN1抗原共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)構築體。資料展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)在固有層中之顯著定位。
圖 22H 展示注射後15分鐘與LMAN1抗原共定位的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)構築體。資料展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)在固有層中之顯著定位。
圖 22I 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149)未與存在於上皮細胞中的低水準之巨蛋白共定位(紅色螢光展示IL-10之定位，且綠色螢光展示定位巨蛋白，藍色螢光展示DAPI染色)。一些巨蛋白與存在於固有層中的細胞之子集中之構築體共定位，表明衍生自Cholix之載體不與高爾基體室一起定位。
圖 22J 展示58K抗原定位於胞核頂端之位點處之上皮細胞中，且遞送構築體(SEQ ID NO: 149)以表明穿過此室之簡要移動的方式展示與此蛋白質之一些共定位(紅色螢光展示IL-10之定位，且綠色螢光展示定位58K高爾基體抗原，藍色螢光展示DAPI染色)。在固有層內之細胞中未觀測到58K抗原。
圖 22K 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149，左上方，IL-10定位)展示出與TGN38抗原(右上方)之一些水準的共定位，其展示受限於上皮細胞中之核之頂端側且鄰近於固有層內之少數細胞之胞核的細胞分佈。左下方影像展示白光影像，且右下方展示與IL-10 (紅色)、TGN38 (綠色)及DAPI信號(藍色螢光)合併(重疊)。
圖 22L 展示遞送構築體(SEQ ID NO: 149) (由綠色螢光展示之IL-10定位，右上方)與Rab11a (左上方，由紅色螢光展示之定位)主要堅固地共定位於上皮細胞之基底室中及固有層內之所選細胞中。左下方影像展示白光影像，且右下方展示與IL-10 (綠色)、Rab11a (紅色)及DAPI信號(藍色螢光)合併(重疊)。
圖 23A 至圖 23C 展示顯微影像，該等顯微影像顯示在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後的各個時間點處，IL-10穿過威斯塔(Wistar)大鼠之極化腸道上皮細胞的胞移轉送。遞送構築體(SEQ ID NO: 149)包括經由具有闡述於SEQ ID NO: 176中的胺基酸序列之間隔子偶合於具有闡述於SEQ ID NO: 145中的胺基酸之IL-10負載的具有SEQ ID NO: 135之載體。綠色螢光指示IL-10之存在(經由用抗IL-10抗體染色)。藍色螢光指示DAPI染色(其標記DNA)，且紅色螢光指示CK-8 (細胞角蛋白-8)之存在，藉由其衍生自Cholix之載體可在胞移轉送期間共定位(例如，在上皮細胞之核上區域中)。白色箭頭1號突出顯示上皮細胞之頂端膜，且白色箭頭2號突出顯示上皮細胞之基底膜。
圖 23A 顯示，在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後一分鐘，IL-10之胞移轉送之程度。資料展示，IL-10負載自頂端至基底位點及至固有層中的轉運早在施加遞送構築體後1分鐘發生。白色箭頭3號指示IL-10存在於固有層中(見例如白色箭頭3號)。
圖 23B 顯示，在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後五分鐘，IL-10之胞移轉送之程度。資料展示，在內腔施加遞送構築體後5分鐘存在於固有層(見例如白色箭頭3號)中的增加量之經轉運IL-10負載。
圖 23C 顯示，在向大鼠空腸內腔施加具有闡述於SEQ ID NO: 149中的序列之遞送構築體後十分鐘，IL-10之胞移轉送之程度。資料展示，在內腔施加遞送構築體後10分鐘存在於固有層(見例如白色箭頭3號)中的甚至更高量之經轉運IL-10負載。
圖 23D 至圖 23F 展示在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於IL-10 (SEQ ID NO: 145)的具有SEQ ID NO: 135之Cholix載體的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後1 min，具有SEQ ID NO: 135之Cholix載體在上皮細胞中之頂端胞吞及早期遷移。資料展示，衍生自Cholix之載體藉由與溶酶體回避受體相互作用來回避溶酶體破壞途徑。Cholix載體定位由綠色螢光展示，頂端進入受體TMEM132定位由紅色螢光展示；且溶酶體回避受體之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與頂端進入受體TMEM132之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與溶酶體回避受體之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、頂端進入受體TMEM132及溶酶體回避受體之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 23D 展示Cholix載體(SEQ ID NO: 135)在極化上皮細胞之頂端膜(由白色箭頭1號指示)處之定位。基底膜由白色箭頭2號指示，且固有層由白色箭頭3號指示。
圖 23E 展示Cholix載體(SEQ ID NO: 135)與頂端進入受體TMEM132之相互作用，如由在頂端膜處且圍繞頂端膜之黃色螢光所指示。
圖 23F 展示Cholix載體(SEQ ID NO: 135)、頂端進入受體TMEM132及溶酶體回避受體在頂端膜處緊密接近，如由白色箭頭所指示之白色斑點(例如，綠色、紅色及紫色螢光之重疊)所展示。假定溶酶體回避受體(GRP75)可靠近Cholix載體頂端進入受體複合物，隨後歸因於pH環境及此等Cholix載體-受體相互作用之pH依賴性的變化，Cholix載體與頂端進入受體TMEM132解離且Cholix載體與溶酶體回避受體GRP75締合，如例如圖 15B 中所展示。
圖 23G 至圖 23H 展示在於大鼠空腸中內腔注射包含偶合於IL-10 (SEQ ID NO: 145)的衍生自Cholix之載體(SEQ ID NO: 135)的遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後5及15 min，Cholix載體(SEQ ID NO: 135)自上皮細胞中之頂端室遷移至核上室。Cholix載體定位由綠色螢光展示，ERGIC受體定位由紅色螢光展示，頂端進入受體(例如，TMEM132)定位由橙色螢光展示；且溶酶體回避受體之定位由紫色螢光展示；因此Cholix載體與ERGIC受體之相互作用由黃色螢光展示，Cholix載體與溶酶體回避受體之相互作用由粉色螢光展示，且Cholix載體、頂端進入受體及溶酶體回避受體之相互作用及/或共定位由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)展示。DAPI染色由藍色螢光指示。
圖 23G 展示在內腔注射遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後5分鐘，Cholix載體(SEQ ID NO: 135)在極化腸道上皮細胞中之定位。資料展示，在頂端受體介導之胞吞後，Cholix載體與溶酶體回避受體及靠近頂端膜之頂端進入受體形成複合物(由白色斑點(綠色、紅色及紫色螢光之重疊)指示且由白色箭頭突出顯示)且亦開始與ERGIC受體相互作用，如由在細胞內略微更接近於核上區域的黃色螢光(及黃色箭頭)所顯示。
圖 23H 展示在內腔注射遞送構築體(SEQ ID NO: 149)後15分鐘，Cholix載體(SEQ ID NO: 135)在極化腸道上皮細胞中之定位。資料展示，載體在與ERGIC (見黃色箭頭)締合時自頂端室移動至核上室，其中相較於注射後5分鐘，黃色螢光強度增加，指示隨時間推移增加的Cholix載體自頂端移動至核上區域。資料進一步展示Cholix載體在基底膜處及固有層(金箭頭)中之定位。
圖 24 展示涉及本文中所描述之載體之頂端至基底胞移轉送的胞內室元件(例如，載體之細胞區域、室及受體，諸如轉運受體相互作用配偶體(或TRIP))之圖式。示意性地描述歷經15分鐘時程之胞移轉送過程。舉例而言，能夠胞移轉送的衍生自Cholix之載體在胞吞之後可並不或可並不顯著地進入溶酶體或頂端再循環途徑(例如，如由再循環核內體或「RE」所描繪)。在頂端施加衍生自Cholix之載體後重佈COPI及LMAN1而非SEC22b以及進入基底室再循環途徑經展示為衍生自Cholix之載體之途徑特性。因此，本文中所描述之衍生自Cholix之載體可利用一系列胞內囊泡室以遷移穿過可在頂端至基底胞移轉送中達到頂點的極化腸上皮細胞，且允許此等載體迅速且有效地(例如，將至少5%、10%、20%、25%或50%材料施加至頂端表面)使負載(例如，治療蛋白)穿梭至固有層中。
圖 25 展示衍生自Cholix386 之載體(例如，SEQ ID NO: 135或180)及衍生自Cholix415 之載體(例如，包含SEQ ID NO: 1之殘基1-415)兩者在10分鐘及在40分鐘時將抗TNFα藥劑(例如，抗TNFα抗體或其功能片段)轉運穿過腸上皮細胞。此外，Cholix386 -抗TNFα構築體以僅抗TNF-α之約12×速率轉運，且Cholix415 -抗TNFα以僅抗TNF-α之約7×速率轉運。
圖 26 展示SEQ ID NO: 192-艾塞那肽(Exenatide) (與艾塞那肽(SEQ ID NO: 195)交聯之SEQ ID NO: 192)在經庫馬斯藍(Coomassie Blue)染色之SDS-PAGE凝膠上運行的純度。
圖 27 展示與載體SEQ ID NO: 191或SEQ ID NO: 192交聯之艾塞那肽穿過史泊格多利大鼠(Sprague Dawley Rat)之空腸的活體內胞移轉送。在處理後10分鐘及40分鐘時量測轉運穿過腸組織的艾塞那肽之量(以pM計)。資料展示，SEQ ID NO: 191-艾塞那肽及SEQ ID NO: 192-艾塞那肽兩者在10分鐘及在40分鐘時均可以比僅艾塞那肽更高的速率轉運。

Claims (146)

  1. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其能夠在該載體胞吞後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之頂端室中，該載體偶合於 b)     異種負載。
  2. 如請求項1之載體-負載複合物，其中該載體能夠在該載體胞吞後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該頂端室中。
  3. 如請求項1之載體-負載複合物，其中該載體能夠在該載體胞吞後至少15分鐘累積於該極化上皮細胞之該頂端室中。
  4. 如請求項1至3中任一項之載體-負載複合物，其中該極化上皮細胞包含腸胃極化上皮細胞。
  5. 如請求項4之載體-負載複合物，其中該極化上皮細胞包含大鼠腸胃極化上皮細胞。
  6. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其能夠在將該載體腔內施加至哺乳動物之胃腸道後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之頂端室中，該載體偶合於 b)     異種負載。
  7. 如請求項6之載體-負載複合物，其中該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該頂端室中。
  8. 如請求項6之載體-負載複合物，其中該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道載體後至少15分鐘累積於極化上皮細胞之該頂端室中。
  9. 如請求項6至8中任一項之載體-負載複合物，其中該腔內施加包含腔內注射至大鼠空腸中。
  10. 一種載體-負載複合物，其包含 c)     載體，其能夠在該載體胞吞後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之核上室中，該載體偶合於 d)     異種負載。
  11. 如請求項10之載體-負載複合物，其中該載體能夠在該載體胞吞後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該核上室中。
  12. 如請求項10之載體-負載複合物，其中該載體能夠在該載體胞吞後至少15分鐘累積於該極化上皮細胞之該核上室中。
  13. 如請求項10至12中任一項之載體-負載複合物，其中該極化上皮細胞包含腸胃極化上皮細胞。
  14. 如請求項13之載體-負載複合物，其中該極化上皮細胞包含大鼠腸胃極化上皮細胞。
  15. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其能夠在將該載體腔內施加至哺乳動物之胃腸道後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之核上室中，該載體偶合於 b)     異種負載。
  16. 如請求項13之載體-負載複合物，其中該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該核上室中。
  17. 如請求項13之載體-負載複合物，其中該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道載體後至少15分鐘累積於極化上皮細胞之該核上室中。
  18. 如請求項13至15中任一項之載體-負載複合物，其中該腔內施加包含腔內注射至大鼠空腸中。
  19. 一種載體-負載複合物，其包含 e)     載體，其能夠在該載體胞吞後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之基底室中，該載體偶合於 f) 異種負載。
  20. 如請求項1之載體-負載複合物，其中該載體能夠在該載體胞吞後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該基底室中。
  21. 如請求項1之載體-負載複合物，其中該載體能夠在該載體胞吞後至少15分鐘累積於該極化上皮細胞之該基底室中。
  22. 如請求項19至21中任一項之載體-負載複合物，其中該極化上皮細胞包含腸胃極化上皮細胞。
  23. 如請求項22之載體-負載複合物，其中該極化上皮細胞包含大鼠腸胃極化上皮細胞。
  24. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其能夠在將該載體腔內施加至哺乳動物之胃腸道後至少5分鐘累積於極化上皮細胞之基底室中，該載體偶合於 b)     異種負載。
  25. 如請求項13之載體-負載複合物，其中該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道後至少10分鐘累積於該極化上皮細胞之該基底室中。
  26. 如請求項13之載體-負載複合物，其中該載體能夠在將該載體腔內施加至該哺乳動物之該胃腸道載體後至少15分鐘累積於極化上皮細胞之該基底室中。
  27. 如請求項13至15中任一項之載體-負載複合物，其中該腔內施加包含腔內注射至大鼠空腸中。
  28. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置195-347中之任一者處具有C端截斷，該載體偶合於 b)     異種負載。
  29. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置195-266中之任一者處。
  30. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的序列中之任一者之位置195-266中之任一者處。
  31. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之位置206、245、251或266中之任一者處。
  32. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78之位置206、245、251或266中之任一者處。
  33. 如請求項32之載體-負載複合物，其中該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者之位置206處。
  34. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 131或184中的胺基酸序列組成。
  35. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者之位置245處。
  36. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 132或183中的胺基酸序列組成。
  37. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78之位置251處。
  38. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 133或182中的胺基酸序列組成。
  39. 如請求項28之載體-負載複合物，其中該C端截斷在SEQ ID NO: 1-2或4-78之位置266處。
  40. 如請求項27之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 134或181中的胺基酸序列組成。
  41. 載體-負載複合物28，其中該載體由在位置195-347中之任一者處具有截斷的闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的該序列組成，且在SEQ ID NO: 1-2或4-78之位置1-40、133-151、152-187或188-206中之任一者處具有不超過5、4、3、2或1個胺基酸變異。
  42. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其由闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之N端位置1-41中之任一者至C端位置150-195中之任一者的胺基酸殘基組成，或由闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之N端位置35-40中之任一者至C端位置150-205中之任一者的胺基酸殘基組成，該載體偶合於 b)     異種負載。
  43. 如請求項42之載體-負載複合物，其中在該載體胞吞至極化上皮細胞中之後，該載體能夠保持與頂端進入受體締合。
  44. 如請求項43之載體-負載複合物，其中該頂端進入受體為TMEM132受體。
  45. 如請求項43之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之該N端位置40至該等C端位置150-205中之任一者的胺基酸殘基組成。
  46. 如請求項42之載體-負載複合物，其中該載體在闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之位置150或186處具有C端截斷。
  47. 如請求項42至46中任一項之載體-負載複合物，其中該載體能夠將該負載轉運至極化上皮細胞中之基底室或核上室。
  48. 如請求項42之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 136中的胺基酸序列組成。
  49. 如請求項42至48中任一項之載體-負載複合物，其中該載體能夠將該負載轉運至極化上皮細胞中之頂端室。
  50. 如請求項42之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 137-139中之任一者中的胺基酸序列組成。
  51. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其能夠胞吞至極化上皮細胞中或胞移轉送極化上皮細胞之片段，該載體偶合於 b)     異種負載。
  52. 如請求項51之載體-負載複合物，其中該載體包含位置3處之麩胺酸及位置4處之丙胺酸。
  53. 如請求項51至52中任一項之載體-負載複合物，其中該載體為無毒的。
  54. 如請求項51至53中任一項之載體-負載複合物，其中該載體能夠將該異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞。
  55. 如請求項51之載體-負載複合物，其中該載體包含能夠胞移轉送極化上皮細胞之片段，其中該載體在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者中的該序列之位置195至C端殘基中之任一者處具有C端截斷。
  56. 如請求項55之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中之任一者中的該序列之位置195-386中之任一者處。
  57. 如請求項56之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的該等序列中之任一者之位置386處。
  58. 如請求項57之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2中的該等序列中之任一者之位置386處。
  59. 如請求項58之載體-負載複合物，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 135中的胺基酸序列組成。
  60. 一種載體-負載複合物，其包含 a)     載體，其衍生自不包含SEQ ID NO: 179且不由SEQ ID NO: 126組成的Cholix多肽，該載體與以下複合 b)     異種負載， 其中該載體能夠 i)  將該異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞； 或 ii)將該異種負載轉運至該極化上皮細胞中。
  61. 如請求項60之載體-負載複合物，其中該載體包含與闡述於SEQ ID NO: 130中的序列或其片段的至少75%序列一致性。
  62. 如請求項61之載體-負載複合物，其中該載體包含與闡述於SEQ ID NO: 130中的Cholix變體或其片段的至少90%序列一致性。
  63. 如請求項60之載體-負載複合物，其中該Cholix多肽為闡述於SEQ ID NO: 130中的序列或其片段。
  64. 如請求項60至63中任一項之載體-負載複合物，其中該載體包含位置3處之麩胺酸及位置4處之丙胺酸。
  65. 如請求項60至64中任一項之載體-負載複合物，其中該載體為無毒的。
  66. 如請求項60至65中任一項之載體-負載複合物，其中該載體能夠將該異種負載胞移轉送而穿過該極化上皮細胞。
  67. 如請求項66之載體-負載複合物，其中該載體在闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之位置195-633中之任一者處具有C端截斷。
  68. 如請求項67之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之位置195-386中之任一者處。
  69. 如請求項68之載體-負載複合物，其中該載體在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的該等序列中之任一者之位置195-386中之任一者處具有C端截斷。
  70. 如請求項69之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1-2或4-78中的該等序列中之任一者之位置386處。
  71. 如請求項70之載體-負載複合物，其中該C端截斷在闡述於SEQ ID NO: 1至2中的該等序列中之任一者之位置386處。
  72. 如請求項1至71中任一項之載體-負載複合物，其中該載體-負載複合物包含N端甲硫胺酸。
  73. 如請求項1至72中任一項之載體-負載複合物，其中該載體以合成方式結合於該異種負載。
  74. 如請求項1至72中任一項之載體-負載複合物，其中該載體與該異種負載基因融合。
  75. 如請求項1至74中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載為治療負載。
  76. 如請求項75之載體-負載複合物，其中該治療負載為細胞介素、抗體、激素或核酸。
  77. 如請求項76之載體-負載複合物，其中該治療負載為細胞介素。
  78. 如請求項77之載體-負載複合物，其中該細胞介素為介白素。
  79. 如請求項78之載體-負載複合物，其中該介白素為IL-10。
  80. 如請求項79之載體-負載複合物，其中該IL-10包含與闡述於SEQ ID NO: 145中的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
  81. 如請求項78之載體-負載複合物，其中該介白素為IL-22。
  82. 如請求項81之載體-負載複合物，其中該IL-22包含與闡述於SEQ ID NO: 142中的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
  83. 如請求項76之載體-負載複合物，其中該治療負載為抗體。
  84. 如請求項83之載體-負載複合物，其中該抗體為抗TNF抗體。
  85. 如請求項76之載體-負載複合物，其中該治療負載為激素。
  86. 如請求項85之載體-負載複合物，其中該治療負載為人類生長激素。
  87. 如請求項1至86中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載共價偶合於該載體。
  88. 如請求項1至87中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載偶合於該載體之C端。
  89. 如請求項1至87中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載偶合於該載體之N端。
  90. 如請求項1至87中任一項之載體-負載複合物，其中該載體經由間隔子偶合於該異種負載。
  91. 如請求項90之載體-負載複合物，其中該間隔子為不可裂解間隔子。
  92. 如請求項90至91中任一項之載體-負載複合物，其中該間隔子包含1與100個之間的胺基酸殘基。
  93. 如請求項92之載體-負載複合物，其中該間隔子包含GS、GGS、GGGS、GGGGS、GGGGGS或其組合之至多15個重複。
  94. 如請求項90之載體-負載複合物，其中該間隔子包含闡述於SEQ ID NO: 175中的胺基酸序列。
  95. 如請求項90之載體-負載複合物，其中該間隔子由闡述於SEQ ID NO: 176中的胺基酸序列組成。
  96. 如請求項1至86中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載非共價偶合於該載體。
  97. 如請求項1至86之載體-複合物，其中該異種負載經由奈米粒子與該載體複合。
  98. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至96中任一項之載體-負載複合物。
  99. 一種載體，其包含如請求項98之聚核苷酸。
  100. 一種將異種負載胞移轉送而穿過極化上皮細胞之方法，其包含： (a)    使該極化上皮細胞之頂端膜與載體-負載複合物接觸；及 (b)    將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過該極化上皮細胞， 其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過該極化上皮細胞之片段，該載體偶合於該異種負載。
  101. 如請求項100之方法，其中使該極化上皮細胞之該頂端膜與該載體-負載複合物接觸包含使該載體與頂端進入受體TMEM132相互作用。
  102. 如請求項101之方法，其中該載體與膜蛋白TMEM132之相互作用引起該載體-負載複合物之受體介導之胞吞。
  103. 如請求項101之方法，其中與TMEM132相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基135-151，或與其具有至少90%序列一致性的序列。
  104. 如請求項100至102中任一項之方法，其中該載體-負載複合物穿過該極化上皮細胞之該胞移轉送包含該載體與GRP75、ERGIC-53及串珠素中之任何一或多者的相互作用。
  105. 如請求項100至102中任一項之方法，其中該載體-負載複合物穿過該極化上皮細胞之該胞移轉送進一步包含將該載體-負載複合物與COPI、EEA1及Rab7中之任何一或多者共定位於該上皮細胞之頂端側處，且與Rab11a共定位於該上皮細胞之基底側處。
  106. 如請求項100至102中任一項之方法，其中與GRP7或ERGIC-53相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基1-40及152-187，或與其具有至少90%序列一致性的序列。
  107. 如請求項100至102中任一項之方法，其中與串珠素相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基188-205，或與其具有至少90%序列一致性的序列。
  108. 如請求項100之方法，其進一步包含在(b)之後將該載體-負載複合物遞送至固有層(lamina propria )中。
  109. 如請求項100至108中任一項之方法，其中該極化上皮細胞為極化腸道上皮細胞。
  110. 一種向個體經口遞送異種負載之方法，其包含： 向該個體經口投與載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此向該個體遞送該異種負載，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
  111. 一種載體-負載複合物，其用於藉由包含以下之方法向個體經口遞送異種負載： 向該個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
  112. 一種載體-負載複合物用於藉由包含以下之方法向個體經口遞送異種負載之用途： 向該個體經口投與該載體-負載複合物；其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
  113. 一種治療個體之疾病之方法，其包含： 向該個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
  114. 一種載體-負載複合物，其用於藉由包含以下之方法來治療個體之疾病： 向該個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之該疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
  115. 一種載體-負載複合物在製造用於藉由包含以下之方法來治療個體之疾病之藥劑中的用途： 向該個體經口投與該載體-負載複合物，其中該載體能夠將該載體-負載複合物胞移轉送而穿過極化上皮，由此治療該個體之該疾病，且其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其胞移轉送片段，該載體偶合於該異種負載。
  116. 如請求項110至115中任一項之方法，其進一步包含使該異種負載與固有層中之受體結合。
  117. 如請求項110至115中任一項之方法，其進一步包含將該異種負載遞送至全身循環中。
  118. 如請求項110至117中任一項之方法，其中該載體為衍生自Cholix之多肽。
  119. 如請求項118之方法，其中該載體包含闡述於SEQ ID NO: 130中的該序列之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。
  120. 如請求項119之方法，其中該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2中的該序列之胺基酸殘基1-206、1-245、1-251、1-266或1-386。
  121. 如請求項120之方法，其中該載體包含闡述於SEQ ID NO: 131-135或180-184中的胺基酸序列中之任一者。
  122. 如請求項110至121中任一項之方法，其中該極化上皮為極化腸道上皮。
  123. 如請求項111至122中任一項之方法，其中該疾病為潰瘍性結腸炎、囊炎、直腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、多發性硬化症(Multiple sclerosis；MS)、全身性紅斑性狼瘡症(Systemic lupus erythematosus；SLE)、移植體對抗宿主疾病(Graft versus host disease；GVHD)、類風濕性關節炎或牛皮癬。
  124. 如請求項123之方法，其中該疾病為潰瘍性結腸炎。
  125. 如請求項124之方法，其中該潰瘍性結腸炎為輕微至中度或中度至重度。
  126. 如請求項123之方法，其中該疾病為克羅恩氏病。
  127. 如請求項126之方法，其中該克羅恩氏病為瘻管性克羅恩氏病。
  128. 如請求項110至127中任一項之方法，其中該負載為介白素。
  129. 如請求項128之方法，其中該介白素包含SEQ ID NO: 142或145之胺基酸序列。
  130. 一種將異種負載轉運至極化上皮細胞中之方法，其包含： (a)    使該極化上皮細胞之頂端膜與載體-負載複合物接觸；及 (b)    將該載體-負載複合物轉運至該極化上皮細胞中， 其中該載體-負載複合物包含載體，該載體包含闡述於SEQ ID NO: 1-2、4-125或127-129中之任一者中的Cholix多肽之胺基酸序列或其能夠將該載體-負載複合物轉運至該上皮細胞中之片段，該載體偶合於該異種負載。
  131. 如請求項130之方法，其中使該極化上皮細胞之該頂端膜與該載體-負載複合物接觸包含使該載體與頂端進入受體TMEM132相互作用。
  132. 如請求項131之方法，其中該載體與該頂端進入受體TMEM132之相互作用引起該載體-負載複合物之受體介導之胞吞。
  133. 如請求項130至132中任一項之方法，其進一步包含將該異種負載轉運至頂端室或基底室。
  134. 如請求項130至133中任一項之方法，其中在胞吞之後，該載體-負載複合物之該載體保持與TMEM132締合。
  135. 如請求項130至134中任一項之方法，其中與TMEM132相互作用之該載體包含SEQ ID NO: 130之胺基酸殘基135-151，或與其具有至少90%序列一致性的序列。
  136. 如請求項130至135中任一項之方法，其中該載體為衍生自Cholix之多肽。
  137. 如請求項136之方法，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 130中的序列之胺基酸殘基1-151、1-187、41-187或40-205組成。
  138. 如請求項137之方法，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 1-2中的該序列之胺基酸殘基1-151、1-187、41-187或40-205組成。
  139. 如請求項138之方法，其中該載體由闡述於SEQ ID NO: 136-139中的胺基酸序列中之任一者組成。
  140. 如請求項130至139之方法，其中該載體經由奈米粒子非共價偶合於該異種負載。
  141. 如請求項140之載體-負載複合物，其中該奈米粒子上的該異種負載與該載體之比為至少15,000:1。
  142. 如請求項140至141中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載為葡萄糖降低劑。
  143. 如請求項142之載體-負載複合物，其中該葡萄糖降低劑與該奈米粒子非共價締合。
  144. 如請求項140至141中任一項之載體-負載複合物，其中該異種負載為siRNA。
  145. 如請求項144之載體-負載複合物，其中該siRNA與該奈米粒子非共價締合。
  146. 如請求項141至145中任一項之載體-負載複合物，其中該載體共價鍵聯至該奈米粒子或在該奈米粒子上經噴霧乾燥。
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