TW202039842A

TW202039842A - 治療黃斑退化之組合治療

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Publication number: TW202039842A
Application number: TW108143360A
Authority: TW
Inventors: 魯本阿凡瑞茲山查茲; 羅伯特伊康; 彼得哈吉朵恩; 蘇珊卡麥樂; 索倫歐特森; 辛德瑞陶史迪生; 海蒂萊胡朵布希; 萊可佩得森; 馬可巴雷拉; 安德魯斯迪克曼
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-11-01
Also published as: WO2020109343A1

Abstract

本發明係關於高效Htra1寡核苷酸拮抗劑與另一治療劑(諸如抗血管生成劑或補體路徑拮抗劑)組合治療黃斑退化之用途。

Description

治療黃斑退化之組合治療

本發明係關於高效Htra1寡核苷酸拮抗劑與諸如抗血管生成劑或補體路徑拮抗劑之另一治療劑組合治療黃斑退化之用途。

濕性年齡相關之黃斑退化(wAMD)之照護標準為抗血管生成藥物，諸如抗VEGF抗體治療劑，諸如LUCENTIS™ (雷珠單抗(ranibizumab))。wAMD之其他治療包括雷射療法及光動力雷射療法。

對於乾性年齡相關之黃斑退化(dAMD)，諸如地圖狀萎縮(geographic atrophy，GA)，不存在審批通過的治療。正在開發用於治療黃斑退化之多種補體系統拮抗劑(綜述於Ricklin及Lambris, Semin Immunol. Author manuscript；在PMC 2017年6月16日可用)。用於治療地圖狀萎縮之組合治療包括CLG561 (抗因子B抗體)與LFG316 (補體因子5拮抗劑)之組合。WO2013/055998係關於抗Htra1抗體及其在例如抗VEGF藥劑之組合療法中之用途。

WO2018/00205及PCT/2018/064221描述靶向HTRA1之反義寡核苷酸，及其經由眼內注射治療黃斑退化之用途。

發明目的

本發明係關於藉由HTRA1之某些反義寡核苷酸拮抗劑與諸如抗血管生成劑或補體路徑拮抗劑之另一治療劑之組合使用來治療性治療黃斑退化，諸如年齡相關之黃斑退化，諸如乾性AMD及/或地圖狀萎縮。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與另一治療劑。

在一些實施例中，該另一治療劑為抗血管生成劑，諸如VEGF拮抗劑，或為補體系統之抑制劑，諸如補體組分之拮抗劑或抗血小板衍生生長因子。

在一些實施例中，該另一治療劑為補體系統拮抗劑，諸如經典補體路徑之拮抗劑或替代補體路徑之拮抗劑。在一些實施例中，該另一治療劑選自由以下組成之群：補體因子D拮抗劑、補體因子B拮抗劑、拮抗劑補體因子C5、拮抗劑補體因子C3、拮抗劑補體因子P (備解素(properdin))、補體因子I拮抗劑及補體因子H拮抗劑。

在一些實施例中，該另一治療劑為抗血小板衍生生長因子。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與另一治療劑。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與另一治療劑。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與另一治療劑。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯，其用於製造用於治療乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮之藥劑，其中該藥劑用於與另一治療劑之組合治療使用。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯，其用於製造用於治療乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮之藥劑，其中該藥劑用於與另一治療劑之組合治療使用。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯，其用於製造用於治療乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮之藥劑，其中該藥劑用於與另一治療劑之組合治療使用。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；用於治療個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與抗血管生成治療劑。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；用於治療個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與VEGF拮抗劑。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；用於治療個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與該補體系統之拮抗劑。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；用於治療個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子D。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；用於治療個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子B。

本發明提供選自以下之群之反義寡核苷酸，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；用於治療個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子C5。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與抗血管生成劑。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與VEGF拮抗劑。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與該補體系統之拮抗劑。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子D。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子B。

本發明提供式TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向個體投與拮抗劑補體因子C5。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與抗血管生成劑。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與VEGF拮抗劑。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與該補體系統之拮抗劑。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子D。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子B。

本發明提供式CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子C5。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與抗血管生成劑。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與VEGF拮抗劑。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與該補體系統之拮抗劑。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子D。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子B。

本發明提供式TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與拮抗劑補體因子C5。

本發明提供HTRA1之反義寡核苷酸拮抗劑，其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與抗血管生成劑。

本發明提供HTRA1之反義寡核苷酸拮抗劑，其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與VEGF之拮抗劑。

本發明提供HTRA1之反義寡核苷酸拮抗劑，其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與補體系統之拮抗劑。

本發明提供HTRA1之反義寡核苷酸拮抗劑，其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與補體因子D之拮抗劑。

本發明提供HTRA1之反義寡核苷酸拮抗劑，其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與補體因子B之拮抗劑。

本發明提供HTRA1之反義寡核苷酸拮抗劑，其用於治療個體之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與補體因子C5之拮抗劑。

本發明提供用於治療需要治療之個體之諸如地圖狀萎縮之乾性年齡相關之黃斑退化的方法，該方法包含向該個體投與有效量之反義寡核苷酸TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且進一步向該個體投與有效量之另一治療劑。

本發明提供一種用於治療需要治療之個體中之諸如地圖狀萎縮之乾性年齡相關之黃斑退化之方法，該方法包含向該個體投與有效量之反義寡核苷酸CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且進一步向該個體投與有效量之另一治療劑。

本發明提供用於治療需要治療之個體中之乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮之方法，該方法包含投與有效量之反義寡核苷酸TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)，其中大寫字母表示β-D-LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且向該個體進一步投與有效量之另一治療劑。

定義

寡核苷酸 如本文中所使用之術語「寡核苷酸」定義為，熟習此項技術者一般將其理解為包含兩個或兩個以上共價鍵之核苷之分子。此類共價結合核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化而製得。當提及寡核苷酸之序列時，提及共價連接核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸係人造的，且係化學合成的，且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸。

反義寡核苷酸 如本文中所使用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至目標核酸、尤其雜交至目標核酸上之連續序列而調節目標基因表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸基本上不為雙股，且因此不為siRNA或shRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸係單鏈。應理解，本發明之單鏈寡核苷酸可形成髮夾結構或分子間雙螺旋結構(同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙螺旋)，只要寡核苷酸之全長內之序列內或序列間自身互補程度小於50%。

連續核苷酸序列 術語「連續核苷酸序列」係指寡核苷酸中與目標核酸互補之區。該術語在本文中可與術語「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成連續核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸序列，諸如F-G-F'間隙體(gapmer) 區，且可視情況包含其他(一或多個)核苷酸，例如可用以將官能基連接至連續核苷酸序列之核苷酸連接區。核苷酸連接區可與目標核酸互補或可不與其互補。冒險地，連續核苷酸序列與目標核酸100%互補。

核苷酸 核苷酸係寡核苷酸及聚核苷酸之構築嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在及非天然存在之核苷酸兩者。在本質上，核苷酸(諸如DNA及RNA核苷酸)包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基團(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。

經修飾之核苷 如本文中所使用之術語「經修飾之核苷」或「核苷修飾」係指與當量DNA或RNA核苷相比，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而經修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾之「單體」互換使用。具有未經修飾之DNA或RNA糖部分之核苷在本文中稱為DNA或RNA核苷。若在DNA或RNA核苷之鹼基區中具有修飾的核苷允許沃森克里克鹼基配對，則其一般仍稱為DNA或RNA。

經修飾之核苷間鍵聯 術語「經修飾之核苷間鍵聯」定義為，熟習此項技術者一般理解為除磷酸二酯(PO)鍵聯以外的鍵聯，其將兩個核苷共價偶合在一起。本發明之寡核苷酸可因此包含經修飾之核苷間鍵聯。在一些實施例中，與磷酸二酯鍵聯相比，經修飾之核苷間鍵聯提高寡核苷酸之抗核酸酶性。就天然存在之寡核苷酸而言，核苷間鍵聯包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵聯之磷酸酯基團。經修飾之核苷間連結尤其適用於使活體內使用之寡核苷酸穩定，且可用以在本發明之寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區處，例如在間隙體寡核苷酸之間隔區內，以及在經修飾之核苷區，諸如F及F'區中防止核酸酶裂解。

在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經天然磷酸二酯修飾之核苷間鍵聯，諸如例如更能抵抗核酸酶攻擊之一或多個經修飾之核苷間鍵聯。抗核酸酶性可藉由在血清中培育寡核苷酸或藉由使用抗核酸酶性分析(例如蛇毒液磷酸二酯酶(SVPD))來測定，兩者皆為此項技術中所熟知。能夠增強寡核苷酸之抗核酸酶性之核苷間鍵聯稱為抗核酸酶核苷間鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%核苷間鍵聯經修飾，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%或諸如至少90%核苷間鍵聯為抗核酸酶核苷間鍵聯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵聯係抗核酸酶核苷間鍵聯。將認識到，在一些實施例中將本發明之寡核苷酸連接至非核苷酸官能基(諸如共軛物)之核苷可為磷酸二酯。

較佳經修飾之核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。

硫代磷酸酯核苷間鍵聯由於抗核酸酶性、有益之藥代動力學及製造簡易性而尤其適用。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中之至少50%核苷間鍵聯為硫代磷酸酯，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%或諸如至少90%核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯。

諸如硫代磷酸酯鍵聯之抗核酸酶鍵尤其適用於能夠在用目標核酸形成雙螺旋時募集核酸酶之寡核苷酸區，諸如用於間隙體之G區。然而，硫代磷酸酯鍵聯亦可適用於非核酸酶募集區及/或親和力增強區，諸如用於間隙體之F及F'區。在一些實施例中，間隙體寡核苷酸可包含F或F'區或F及F'區兩者中之一或多個磷酸二酯鍵聯，其中G區中之核苷間鍵聯可完全為硫代磷酸酯。

有利地，寡核苷酸之連續核苷酸序列中之所有核苷間鍵聯係硫代磷酸酯鍵聯。

應認識到，如EP2 742 135中所揭示，反義寡核苷酸可包含其他核苷間鍵聯(除磷酸二酯及硫代磷酸酯以外)，例如膦酸烷酯/膦酸甲酯核苷間，其根據EP2 742 135可例如在另外DNA硫代磷酸酯間隔區中耐受。

核鹼基 術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交中形成氫鍵。在本發明之上下文中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾之核鹼基，其可不同於天然存在之核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此上下文中，「核鹼基」係指天然存在之核鹼基，諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤，以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1中。

在一些實施例中核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾之嘌呤或嘧啶而經修飾，經修飾之嘌呤或嘧啶為諸如經取代之嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。

核鹼基部分可藉由每一對應核鹼基之字母代碼(例如A、T、G、C或U)指示，其中各字母可視情況包括當量功能的經修飾之核鹼基。舉例而言，在例示性寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隙體，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

經修飾之寡核苷酸 術語經修飾之寡核苷酸描述包含一或多個經糖修飾核苷及/或經修飾核苷間鍵聯之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸係已在文獻中用以描述具有經修飾的核苷之寡核苷酸之術語。

互補性 術語「互補性」描述核苷/核苷酸之沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對之能力。沃森-克里克為鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。將理解寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因而術語互補性涵蓋未經修飾及經修飾核鹼基之間的沃森克里克鹼基配對(參見例如Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1)。

如本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如目標核酸或目標序列)之給定位置處之連續核苷酸序列互補(亦即與其形成沃森克里克鹼基對)的核苷酸數目的百分比。藉由如下方式計算該百分比：(當與目標序列5'-3'及寡核苷酸序列3'-5'比對時)對兩個序列之間形成對的經對準鹼基之數目進行計數，將其除以寡核苷酸中核苷酸的總數目且乘以100。在此類比較中，未對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為失配。較佳地，在計算連續核苷酸序列之互補%時不允許插入及刪除。

術語「完全互補」係指100%互補性。

一致性 如本文中所使用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中連續核苷酸序列之跨越連續核苷酸序列的核苷酸比例(以%為單位表示)與參考序列(例如序列基元)相同。因此，一致性百分比藉由以下計算：計數兩個序列之間相同(匹配)的經對準鹼基之數目(例如本發明化合物之連續核苷酸序列及參考序列中)，將該數目除以經對準區中核苷酸之總數且乘以100。因此，一致性百分比=(匹配×100)/經對準區(例如連續核苷酸序列)之長度。在計算連續核苷酸序列之一致性%時不允許插入及刪除。應理解，在測定一致性時，忽略核鹼基之化學修飾，只要保持核鹼基形成沃森克里克鹼基配對之官能性能力即可(例如出於計算一致性%之目的，5-甲基胞嘧啶視為與胞嘧啶相同)。

雜交如本文中所用之術語「雜交(hybridizing/hybridize)」應理解為兩個核酸股(例如寡核苷酸及目標核酸)在相對股上之鹼基對之間形成氫鍵，從而形成雙螺旋。兩個核酸股之間的結合親和力為雜交之強度。通常描述，就熔融溫度(T_m )而言定義為一半寡核苷酸與目標核酸成雙螺旋時之溫度。在生理條件下T_m 不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯(Gibbs)自由能ΔG°係結合親和力之更精確表示，且經由ΔG°=-RTln(K_d )與反應之解離常數(K_d )相關，其中R係氣體常數且T係絕對溫度。因此，寡核苷酸與目標核酸之間的反應之極低ΔG°反映寡核苷酸與目標核酸之間的強雜交。ΔG°係與水性濃度為1 M、pH為7且溫度為37℃之反應相關之能量。寡核苷酸與目標核酸之雜交為自發性反應且就自發性反應而言，ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC)，如Hansen 等人, 1965,Chem . Comm . 36-38及Holdgate 等人, 2005,Drug Discov Today 中所描述。熟習此項技術者將知曉商業設備可供用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA . 95: 1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto等人, 1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue等人, 2004,Biochemistry 43:5388-5405描述之適當導出的熱力學參數來在數值上估算。為了具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸既定核酸目標的可能性，本發明之寡核苷酸針對10-30個核苷酸長度之寡核苷酸雜交至ΔG°估計值低於-10 kcal之目標核酸。在一些實施例中，雜交度或雜交強度係藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°量測。針對8-30個核苷酸長度之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至ΔG°估計值低於-10 kcal範圍、諸如低於-15 kcal、諸如低於-20 kcal及諸如低於-25 kcal之目標核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至ΔG°估計值為-10至-60 kcal、諸如-12至-40、諸如-15至-30 kcal、或-16至-27 kcal、諸如-18至-25 kcal的目標核酸。

目標序列 寡核苷酸包含連續核苷酸區，該區與目標核酸分子之子序列互補或雜交。如本文中所使用，術語「目標序列」係指存在於目標核酸中之核苷酸之序列，該序列包含與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸區或序列互補的核鹼基序列。在一些實施例中，目標序列由目標核酸上之區組成，該區與本發明之寡核苷酸之連續核苷酸區或序列互補。在一些實施例中，目標序列長於單個寡核苷酸之互補序列，且可例如代表目標核酸之較佳區，該區可經由本發明之若干寡核苷酸靶向。

本發明之寡核苷酸包含與目標核酸(諸如目標序列)互補之連續核苷酸區。

寡核苷酸包含具有至少10個核苷酸之連續核苷酸區，該區與存在於目標核酸分子中之目標序列互補或雜交。連續核苷酸區(及因此目標序列)包含至少10個連續核苷酸、諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22個連續核苷酸、諸如12-22、諸如14-18個連續核苷酸。

在一些實施例中，目標序列存在於選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及118組成之群的序列內。

目標核酸 根據本發明，目標核酸係編碼哺乳動物HTRA1之核酸，且可為例如基因、RNA、mRNA及前體mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。目標可因此稱作HTRA1目標核酸。

適合地，目標核酸編碼HTRA1蛋白質，尤其哺乳動物HTRA1，諸如人類HTRA1 (參見例如表1及表2，其提供人類及大鼠HTRA1之mRNA及前體mRNA序列)。

在一些實施例中，目標核酸係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1或2，或其天然存在之變體(例如編碼哺乳動物HTRA1蛋白質之序列。

目標細胞係表現HTRA1目標核酸之細胞。在較佳實施例中，目標核酸係HTRA1 mRNA，諸如HTRA1前體mRNA或HTRA1成熟mRNA。針對反義寡核苷酸靶向，通常忽略HTRA1 mRNA之聚A尾。

若在研究或診斷中採用本發明之寡核苷酸，則目標核酸可為cDNA或衍生自DNA或RNA之合成核酸。

目標序列可為目標核酸之子序列。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與HTRA1子序列完全互補或僅包含該子序列之一或兩個失配，諸如選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117或231組成之群的序列。

目標序列可為目標核酸之子序列。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與諸如選自由SEQ ID NO 124-230組成之群的序列之HTRA1子序列完全互補，或僅包含一或兩個失配。在一些實施例中，寡核苷酸或連續核苷酸區與HTRA1子序列SEQ ID NO 231完全互補，或僅包含一或兩個失配。

與目標或其子序列互補在寡核苷酸或其連續核苷酸區之長度中量測。

對於活體內或活體外應用，本發明之寡核苷酸通常能夠抑制表現HTRA1目標核酸之細胞中HTRA1目標核酸之表現。本發明之寡核苷酸之核鹼基的連續序列通常與HTRA1目標核酸互補，如在寡核苷酸之整個長度中量測，視情況除了一或兩個失配之外，且視情況排除可將寡核苷酸連接至視情況存在之官能基(諸如共軛物)的核苷酸類連接區，或其他非互補末端核苷酸(例如D區)。在一些實施例中，目標核酸可為RNA或DNA，諸如信使RNA，諸如成熟mRNA或前體mRNA。在一些實施例中，目標核酸為編碼諸如人類HTRA1、例如人類HTRA1 mRNA序列、諸如揭示為SEQ ID NO 1 (NM_002775.4，GI:190014575)之彼序列之哺乳動物HTRA1蛋白質的RNA或DNA。例示性目標核酸之其他資訊提供於表1及2中。表 1. 人類及食蟹獼猴HTRA1之基因組及總成資訊。

物種	Chr.	股	基因組座標起始結束	總成	NCBI 參考序列 * mRNA 寄存編號
人類	10	Fwd	122461525	122514908	GRCh38.p2 release 107	NM_002775.4
食蟹獼猴	9	Fwd	121764994	121817518	Macaca_fascicularis_5.0	NC_022280.1**

Fwd=正股。基因組座標提供前體mRNA序列(基因組序列)。NCBI參考提供mRNA序列(cDNA序列)。

*美國國家生物技術信息中心(The National Center for Biotechnology Information)參考序列資料庫係包括基因組、轉錄物及蛋白質之參考序列之全面的、整合的、非冗餘的、充分註釋的集合。其在www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq上代管。

**在參考序列中，位置126至位置227存在一致性未知之一串100個核苷酸。在SEQ ID NO 3及4中，此串已經出現在此區中之人類及恆河猴HTRA1 premRNA序列兩者中的核苷酸置換。表 2. 人類及食蟹獼猴HTRA1之序列細節。

物種	RNA 類型	長度 (nt)	SEQ ID NO
人類	mRNA	2138	1
人類	premRNA	53384	2
食蟹獼猴	mRNA	2123	3
食蟹獼猴	premRNA	52575	4

天然存在之變體 術語「天然存在之變體」係指HTRA1基因或轉錄物之變體，其源自與目標核酸相同之基因座，但可例如藉助於基因密碼之簡併而不同，該簡併導致大量密碼子編碼相同胺基酸，或歸因於前體mRNA之替代性拼接、或存在多型性(諸如單核苷酸多型性)及對偶基因變體而不同。基於存在寡核苷酸之充足互補序列，本發明之寡核苷酸可因此靶向目標核酸及其天然存在之變體。在一些實施例中，天然存在之變體與諸如選自由SEQ ID NO 1、2、3及4組成之群的目標核酸之哺乳動物HTRA1目標核酸具有至少95%、諸如至少98%或至少99%同源性。

調節表現 如本文所使用之術語「調節表現」應理解為寡核苷酸改變目標核酸或目標蛋白之量的能力之總術語，諸如當與投與寡核苷酸之前目標HTRA1之量相比時HTRA1之含量。可替代地，表現之調節可藉由參考不投與本發明之寡核苷酸的對照實驗來測定。調節之一種類型係寡核苷酸例如藉由使mRNA降解或阻斷轉錄而抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1表現的能力。本發明之反義寡核苷酸能夠抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、預防、減輕、降低、避免或終止HTRA1表現。

高親和力經修飾之核苷 高親和力經修飾核苷為經修飾之核苷酸，其在併入至寡核苷酸中時增強寡核苷酸對其互補目標之親和力，例如如藉由熔融溫度(T_m )所量測。本發明之高親和力經修飾之核苷較佳導致熔融溫度升高如下，每個經修飾的核苷，在+0.5至+12℃之間、更佳在+1.5至+10℃之間且最佳在+3至+8℃之間。大量高親和力經修飾核苷為此項技術中已知的，且包括例如多種經2'取代之核苷以及鎖核酸(locked nucleic acid；LNA) (參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213)。

糖修飾 本發明之寡聚物可包含一或多個具有經修飾之糖部分(亦即當與在DNA及RNA中發現之核糖部分相比時糖部分之修飾)之核苷。已製得大量具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良寡核苷酸的某些特性，諸如親和力及/或抗核酸酶性。

此類修飾包括其中核糖環結構經修飾之彼等，例如藉由用以下替代：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳之間具有雙基團(biradicle)橋；或非連鎖核糖環，其通常缺乏C2與C3碳之間的鍵(例如UNA)。其他糖經修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO2011/017521)或三環核酸(WO2013/154798)。經修飾之核苷亦包括糖部分經非糖部分替代之核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情形下。

糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基改變成除氫以外之基團，或DNA及RNA核苷中天然發現之2'-OH基團而得到的修飾。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入。

2 ' 糖經修飾之核苷 2'糖經修飾之核苷為在2'位置處具有除H或-OH以外的取代基之核苷(2'經取代之核苷)，或包含能夠在2'碳與核糖環中之第二碳之間形成橋鍵的2'連接雙基團的核苷，諸如LNA (2'-4'雙基團橋接)核苷。

實際上，大量焦點已聚集在開發2'經取代核苷上，且已發現許多2'經取代核苷在併入寡核苷酸中時具有有益特性。舉例而言，2'經修飾之糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之抗核酸酶性。2'經取代之經修飾核苷之實例為2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。對於其他實例，請參見例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213，以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937。以下為一些2'經取代之經修飾核苷之圖示。

關於本發明，2'經取代者不包括如LNA之2'橋接分子。

鎖核酸 ( LNA ) 「LNA核苷」為2'-經修飾之核苷，其包含連接該核苷之核糖環之C2'與C4'的雙基團(亦稱為「2'-4'橋鍵」)，其限制或鎖定核糖環之構形。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。當LNA併入互補RNA或DNA分子之寡核苷酸中時，核糖之構形鎖定與增加的雜交親和力(雙螺旋穩定)相關聯。此可常規地藉由量測寡核苷酸/補體雙螺旋之熔融溫度而測定。

非限制性、例示性LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人, Bioorganic及Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁、Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238，以及Wan及Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645−9667中。

其他非限制性例示性LNA核苷揭示於方案1中。方案 1 ：

特定LNA核苷為β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA，諸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA (ScET)及ENA。

尤其有利的LNA為β-D-氧基-LNA。

RNase H 活性及募集 反義寡核苷酸之RNase H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋時，反義寡核苷酸募集RNase H之能力。WO01/23613提供用於測定核糖核酸酶H活性之活體外方法，其可用於判定募集核糖核酸酶H之能力。通常，當提供有互補目標核酸序列時，認為寡核苷酸在具有如下初始速率(如以pmol/l/min為單位所量測)時能夠募集RNase H，該初始速率為使用與所測試的經修飾寡核苷酸具有相同鹼基序列但僅含有其中寡核苷酸中之所有單體之間為硫代磷酸酯鍵聯的DNA單體的寡核苷酸，且使用WO01/23613 (在此以引用之方式併入)之實例91至95所提供之方法測定的初始速率的至少5%，諸如至少10%，或超過20%。用於測定RHase H活性之重組人類RNase H1可購自Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerland。

間隙體 本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可為間隙體。反義間隙體通常用於經由RNase H介導之降解以抑制目標核酸。間隙體寡核苷酸包含至少三個不同結構區，5'-側接、間隔及3'-側接，F-G-F'呈5'-＞3'定向。「間隔」區(G)包含使寡核苷酸能夠募集RNase H之一段連續DNA核苷酸。間隔區側接包含一或多個糖經修飾之核苷(有利地為高親和力糖經修飾之核苷)之5'側接區(F)且側接包含一或多個糖經修飾之核苷(有利地為高親和力糖經修飾之核苷)之3'側接區(F')。F及F'區中之一或多個糖經修飾核苷增強寡核苷酸對目標核酸之親和力(亦即，其為增強親和力的糖經修飾核苷)。在一些實施例中，F及F'區中之一或多個糖經修飾核苷為2'糖經修飾核苷，諸如高親和力2'糖修飾，諸如獨立地選自LNA及2'-MOE。

在間隙體設計中，間隔區之5'及3'最末核苷為DNA核苷，且分別位於緊鄰5' (F)或3' (F')區之糖經修飾之核苷。側接序列可藉由使至少一個糖經修飾之核苷位於距間隔區最遠的末端處，亦即位於5'側接序列之5'端及3'側接序列之3'端處而進一步經界定。

F-G-F'區形成連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可包含具有式F-G-F'之間隙體區。

間隙體設計F-G-F'之總體長度可為例如12至32個核苷，諸如13至24，諸如14至22個核苷，諸如14至17個，諸如16至18個核苷。

藉助於實例，本發明之間隙體寡核苷酸可由下式表示： F_1-8 -G_5-16 -F'_1-8 ，諸如 F_1-8 -G_7-16 -F'_2-8 其限制條件為間隙體F-G-F'區之總體長度為至少12個，諸如至少14個核苷酸長度。

F、G及F'區在下文進一步加以定義，且可併入至F-G-F'式中。

間隙體 -G 區間隙體之G區(間隔區)為使得寡核苷酸能夠募集RNaseH (諸如人類RNase H1)之核苷區，通常為DNA核苷。RNaseH為識別DNA與RNA之間的雙螺旋且酶促裂解RNA分子之細胞酶。適當地，間隙體可具有至少5或6個連續DNA核苷、諸如5-16個連續DNA核苷、諸如6-15個連續DNA核苷、諸如7-14個連續DNA核苷、諸如8-12個連續DNA核苷酸、諸如8-12個連續DNA核苷酸長度之間隔區(G)。

儘管傳統間隙體具有DNA間隔區，但存在用於間隔區內時允許核糖核酸酶H募集之經修飾核苷之諸多實例。已報導在包括於間隔區內時能夠募集RNaseH的經修飾核苷包括例如α-L-LNA、C4'烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300中所描述，兩者皆以引用之方式併入本文中)、如ANA及2'F-ANA之阿拉伯糖衍生之核苷(Mangos等人 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (未鎖定核酸) (如Fluiter等人, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所描述，其以引用之方式併入本文中)。UNA為未鎖定核酸，通常其中核糖之C2與C3之間的鍵已移除，從而形成未鎖定的「糖」殘基。此類間隙體中所使用之經修飾核苷在引入間隔區中時可為採用2'內型(DNA樣)結構(亦即允許RNaseH募集之修飾)之核苷。在一些實施例中，本文中所描述之DNA間隔區(G)可視情況含有1至3個在引入至間隔區中時採用2'內型(DNA類)結構之糖經修飾之核苷。

G 區 - 「間隔阻斷子 (Gap-breaker) 」可替代地，有許多將賦予3'內型(endo)構形之經修飾核苷插入間隙體之間隔區中但保留一些RNaseH活性的報導。此類具有包含一或多個3'內型經修飾核苷的間隔區之間隙體被稱為「間隔阻斷子」或「間隔中斷」間隙體，參見例如WO2013/022984。間隔阻斷子寡核苷酸在間隔區內保留充分的DNA核苷區，以允許RNaseH募集。間隔阻斷子寡核苷酸設計募集RNaseH之能力通常具有序列或甚至化合物特異性，參見Rukov等人 2015 Nucl. Acids Res. 第43卷第8476-8487頁，其揭示募集RNaseH之「間隔阻斷子」寡核苷酸，該等寡核苷酸在一些情況下提供目標RNA之更特異性裂解。間隔阻斷子寡核苷酸之間隔區內所使用的經修飾核苷可例如為賦予3'內型構形之經修飾核苷，諸如2'-O-甲基(OMe)或2'-O-MOE (MOE)核苷，或β-D LNA核苷(核苷之核糖環之C2'與C4'之間的橋鍵呈β構形)，諸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。

間隙體 - 側接區， F 及 F ' F區位於緊鄰G區之5' DNA核苷。F區之3'最末(3' most)核苷為糖經修飾之核苷，諸如高親和力糖經修飾之核苷，例如2'經取代核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。

F'區位於緊鄰G區之3' DNA核苷。F'區之5'最末(5' most)核苷為糖經修飾之核苷，諸如高親和力糖經修飾之核苷，例如2'經取代核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。

F區為1至8個連續核苷酸長度，諸如2至6個、諸如3至4個連續核苷酸長度。有利地，F區之5'最末核苷為糖經修飾之核苷。在一些實施例中，F區之兩個5'最末核苷為糖經修飾之核苷。在一些實施例中，F區之5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，F區之兩個5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，F區之兩個5'最末核苷為2'經取代之核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，F區之5'最末核苷為2'經取代之核苷，諸如MOE核苷。

F'區為2至8個連續核苷酸長度，諸如3至6個、諸如4至5個連續核苷酸長度。有利地，在一些實施例中，F'區之3'最末核苷為糖經修飾之核苷。在一些實施例中，F'區之兩個3'最末核苷為糖經修飾之核苷。在一些實施例中，F'區之兩個3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，F'區之3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，F'區之兩個3'最末核苷為2'經取代之核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，F'區之3'最末核苷為2'經取代之核苷，諸如MOE核苷。

應注意，當F或F'區之長度為一時，其有利地為LNA核苷。

在一些實施例中，F及F'區獨立地由糖經修飾之核苷之連續序列組成或包含糖經修飾之核苷之連續序列。在一些實施例中，F區之糖經修飾之核苷可獨立地選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元，及2'-氟-ANA單元。

在一些實施例中，F及F'區獨立地包含LNA及2'經取代修飾之核苷兩者(混合翼設計)。

在一些實施例中，F及F'區僅由一類糖經修飾之核苷組成，諸如僅由MOE或僅由β-D-氧基LNA或僅由ScET組成。此類設計亦稱為均一側接或均一間隙體設計。

在一些實施例中，區F或F'或者F及F'中之所有核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些實施例中，F區由1-5個、諸如2-4個、諸如3-4個，諸如1、2、3、4或5個連續LNA核苷組成。在一些實施例中，F及F'區中之所有核苷為β-D-氧基LNA核苷。

在一些實施例中，區F或F'或者F及F'中之所有核苷為2'經取代核苷，諸如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，F區由1、2、3、4、5、6、7或8個連續OMe或MOE核苷組成。在一些實施例中，側接區中僅一者可由2'經取代之核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成。在一些實施例中，5' (F)側接區由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而3' (F')側接區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些實施例中，3' (F)側接區由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而5' (F')側接區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。

在一些實施例中，F及F'區中之所有經修飾核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中區F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側接序列，更多細節參見此等之定義)。在一些實施例中，F及F'區中之所有經修飾核苷為β-D-氧基LNA核苷，其中區F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側接序列，更多細節參見此等者之定義)。

在一些實施例中，F及F'區之5'最末及3'最末核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。

在一些實施例中，F區與G區之間的核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，F'區與G區之間的核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，區F或F'、F及F'之核苷之間的核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

LNA 間隙體 LNA間隙體為其中區F及F'中之一者或兩者包含或由LNA核苷組成之間隙體。β-D-氧基間隙體為其中區F及F'中之一者或兩者包含或由β-D-氧基LNA核苷組成之間隙體。

治療如本文中所使用之術語「治療」係指對現有疾病(例如如在本文中稱為疾病或病症)之治療或疾病之預防(亦即防治)兩者。因此將認識到，如本文中所提及之治療在一些實施例中可為預防性的。

Htra1 寡核苷酸拮抗劑 Htra1寡核苷酸拮抗劑為靶向HTRA1之反義寡核苷酸，諸如哺乳動物HTRA1，較佳人類HTRA1。可用於本發明中之靶向Htra1之例示性反義寡核苷酸包括實例中作為化合物ID NO #5,1-#112,1列舉之彼等反義寡核苷酸。用於本發明中之HTRA1之較佳反義寡核苷酸拮抗劑可選自以下化合物之群： T_s T_s ^m C_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s a_s T_s T_s G (SEQ ID NO 67,1)，^m C_s T_s T_s ^m C_s t_s t_s c_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s A_s T (SEQ ID NO 73,1)， T_s A_s ^m C_s T_s t_s t_s a_s a_s t_s a_s g_s c_s T_s ^m C_s A_s A (SEQ ID NO 86,1)， T_s A_s T_s t_s t_s a_s c_s c_s t_s g_s g_s t_s T_s G_s T_s T (SEQ ID NO 232，化合物A) A_s t_s A_s T_s t_s t_s a_s c_s c_s t_s g_s G_s T_s T_s g_s T_s T (SEQ ID NO 233，化合物B) 其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且^m c表示5甲基胞嘧啶DNA核苷。

本發明係關於能夠抑制HTRA1表現之寡核苷酸。調節可藉由雜交至編碼HTRA1之目標核酸或涉及調控HTRA1之目標核酸來達成。目標核酸可為哺乳動物HTRA1序列，諸如選自由SEQ ID 1、2、3或4組成之群的序列。

在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸能夠經由抑制或下調目標之表現而調節目標表現。較佳地，此類調節產生與目標之正常表現量相比表現之至少20%抑制，諸如與目標之正常表現量相比至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%抑制。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1 mRNA之至少60%或70%表現量。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1 mRNA之至少60%或70%表現量。在一些實施例中，在活體外使用ARPE-19細胞，本發明之化合物可能夠抑制HTRA1蛋白質之至少50%表現量。適合地，實例提供可用於量測HTRA1 RNA或蛋白質抑制之分析。目標調節藉由寡核苷酸之連續核苷酸序列與目標核酸之間的雜交觸發。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸在寡核苷酸與目標核酸之間包含失配。儘管存在失配，但與目標核酸之雜交仍可足以展示HTRA1表現之所需調節。由失配產生之減少的結合親和力可有利地藉由寡核苷酸中增加之核苷酸數目及/或增加之能夠提高與目標的結合親和力之經修飾之核苷(諸如2'經修飾的核苷，包括存在於寡核苷酸序列內之LNA)數目來補償。

本發明之一態樣係關於反股寡核苷酸，其包含具有10至30個核苷酸長度之連續核苷酸區，該區具有與HTRA1目標序列之至少90%互補性，諸如與HTRA1目標序列(例如選自由SEQ ID NO 1、2、3及4組成之群的核酸)完全互補。

在一些實施例中，寡核苷酸包含連續序列，該序列與目標核酸之區至少90%互補，諸如至少91%、諸如至少92%、諸如至少93%、諸如至少94%、諸如至少95%、諸如至少96%、諸如至少97%、諸如至少98%或100%互補。

在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸序列與目標核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與目標核酸之間可包含一或兩個失配。

本發明之Htra1寡核苷酸拮抗劑為靶向哺乳動物HTRA1核酸之寡核苷酸，亦即，能夠抑制HTRA1表現且可用於治療或預防與HTRA1之功能相關的疾病。靶向HTRA1之寡核苷酸為反義寡核苷酸，亦即，與其HTRA1核酸目標互補。寡核苷酸可呈醫藥學上可接受之鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽或銨鹽，諸如鈉鹽。在一些實施例中，寡核苷酸溶解於醫藥學上可接受之溶劑中，諸如眼部可接受之溶液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水。

反股寡核苷酸可包含具有10-30個核苷酸長度之連續核苷酸序列，該序列與哺乳動物HTRA1核酸(諸如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4)至少90%互補，諸如完全互補。

反義寡核苷酸可為LNA反義寡核苷酸，諸如LNA間隙體寡核苷酸，其包含具有10-30個核苷酸長度之連續核苷酸序列，該序列與HTRA1核酸(諸如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4)至少90%互補，諸如完全互補。

反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 113至少90% (諸如100%)互補。

反義寡核苷酸可為10-30個核苷酸長度，其中該反義寡核苷酸具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 113至少90% (諸如100%)互補。SEQ ID NO 113之反向互補展示於SEQ ID NO 119中。

反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 114至少90% (諸如100%)互補。

具有10-30個核苷酸長度之反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 114至少90% (諸如100%)互補。SEQ ID NO 114之反向互補序列為SEQ ID NO 120中。

反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 115至少90% (諸如100%)互補。

具有10-30個核苷酸長度之反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12至22個)核苷酸之連續核苷酸區，該核苷酸區與SEQ ID NO 115至少90% (諸如100%)互補。SEQ ID NO 115之反向互補展示於SEQ ID NO 121中。

反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 116至少90% (諸如100%)互補。

具有10-30個核苷酸長度之反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 116至少90% (諸如100%)互補。SEQ ID NO 116之反向互補序列為SEQ ID NO 122。

反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 117至少90% (諸如100%)互補。

具有10-30個核苷酸長度之反義寡核苷酸可包含具有10-30個(諸如12-22個)核苷酸之連續核苷酸區，其中該連續核苷酸區與SEQ ID NO 117至少90% (諸如100%)互補。SEQ ID NO 117之反向互補序列為SEQ ID NO 123。

在一些實施例中，反義寡核苷酸包含存在於SEQ ID NO 118：5' CTTCTTCTATCTACGCATTG 3'中之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個連續核苷酸之連續核苷酸區。SEQ ID NO 118之反向互補序列為SEQ ID NO 231: CAATGCGTAGATAGAAGAAG。

本發明提供包含與SEQ ID NO 231互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個連續核苷酸的連續核苷酸區之反義寡核苷酸。

本發明係指包含存在於SEQ ID NO 67中之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。

本發明提供包含存在於SEQ ID NO 86中之至少10個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。

本發明提供包含存在於SEQ ID NO 73中之至少10個、或至少12個、或至少13個、或至少14個、或至少15個、或至少16個、或至少17個或18個連續核苷酸之連續核苷酸區的反義寡核苷酸。

本發明提供包含與SEQ ID NO 186互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸的連續核苷酸區之反義寡核苷酸。

本發明提供包含與SEQ ID NO 205互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個或16個連續核苷酸的連續核苷酸區之反義寡核苷酸。

本發明提供包含與SEQ ID NO 192互補之至少10個、或至少12個、至少13個、或至少14個、或至少15個或至少16或至少17或18個連續核苷酸的連續核苷酸區之反義寡核苷酸。

在一些實施例中，本發明係指一種寡核苷酸，其包含選自由以下組成之群的寡核苷酸或由其組成： T_s T_s ^m C_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s a_s T_s T_s G (SEQ ID NO 67,1)，^m C_s T_s T_s ^m C_s t_s t_s c_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s A_s T (SEQ ID NO 73,1)，及 T_s A_s ^m C_s T_s t_s t_s a_s a_s t_s a_s g_s c_s T_s ^m C_s A_s A (SEQ ID NO 86,1)；其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且^m c表示5甲基胞嘧啶DNA核苷。

本發明之一態樣係關於反義寡核苷酸，其包含具有10-30個核苷酸長度之連續核苷酸區，該區具有與HTRA1目標序列之至少90%互補性，諸如與HTRA1目標序列(例如選自由SEQ ID NO 1、2、3及4組成之群的核酸)完全互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 119、120、121、122或123組成之群的序列之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 124-230組成之群的序列之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少13個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少13個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少13個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及231組成之群的序列完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少15個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少15個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少15個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及231組成之群的序列完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 186之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16、諸如16、17或18個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 192之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與SEQ ID NO 205之區至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 113、114、115、116、117及231組成之群的序列完全(或100%)互補。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與選自由SEQ ID NO 124 - 230組成之群的序列完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與SEQ ID NO 186完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與SEQ ID NO 192完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區與SEQ ID NO 205完全(或100%)互補。

應理解，寡核苷酸基元序列可經修飾以例如提高抗核酸酶性及/或與目標核酸之結合親和力。修飾描述於定義及「寡核苷酸設計」部分中。

在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或其連續核苷酸區與目標核酸之區完全互補(100%互補)，或在一些實施例中在寡核苷酸與目標核酸之間可包含一或兩個失配。在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與標靶核酸序列至少90%互補，諸如完全(或100%)互補。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少12個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的序列具有100%一致性。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少14個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的序列具有100%一致性。

在一些實施例中，寡核苷酸或其至少16個核苷酸之連續核苷酸序列與選自由SEQ ID NO 5-111組成之群的序列具有100%一致性。

在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸區包含選自SEQ ID NO 5-111之序列或由其組成。

在一些實施例中，本發明之寡核苷酸係選自以下群組(注意，目標子序列為寡核苷酸基元之反向互補序列)：

SEQ ID NO	基元	化合物設計	目標子序列 SEQ ID	目標子序列
5	agttaaaggaggagacaaat	AGTTaaaggaggagacAAAT	124	atttgtctcctcctttaact
6	tcagttaaaggaggagacaa	TCAgttaaaggaggagaCAA	125	ttgtctcctcctttaactga
7	ctcagttaaaggaggagaca	CTCagttaaaggaggagaCA	126	tgtctcctcctttaactgag
8	ctcagttaaaggaggagac	CTCagttaaaggaggaGAC	127	gtctcctcctttaactgag
9	actcagttaaaggaggagac	ACTCagttaaaggaggagAC	128	gtctcctcctttaactgagt
10	actcagttaaaggaggaga	ACTCagttaaaggaggaGA	129	tctcctcctttaactgagt
11	actcagttaaaggaggag	ACtcagttaaaggaGGAG	130	ctcctcctttaactgagt
12	gatgactcagttaaaggagg	GAtgactcagttaaaggAGG	131	cctcctttaactgagtcatc
13	atgatgactcagttaaagga	ATGAtgactcagttaaagGA	132	tcctttaactgagtcatcat
14	tgatgactcagttaaagg	TGAtgactcagttaAAGG	133	cctttaactgagtcatca
15	gatgatgactcagttaaagg	GAtgatgactcagttaAAGG	134	cctttaactgagtcatcatc
16	gatgatgactcagttaaag	GATGatgactcagttaAAG	135	ctttaactgagtcatcatc
17	tatcgactgcattagttgg	TATcgactgcattagttGG	136	ccaactaatgcagtcgata
18	gtatcgactgcattagttgg	GtatcgactgcattagttGG	137	ccaactaatgcagtcgatac
19	tcgactgcattagttg	TCGactgcattagTTG	138	caactaatgcagtcga
19	tcgactgcattagttg	TCGactgcattagtTG	138	caactaatgcagtcga
19	tcgactgcattagttg	TCGActgcattaGTTG	138	caactaatgcagtcga
20	tatcgactgcattagttg	TAtcgactgcattaGTTG	139	caactaatgcagtcgata
21	gtatcgactgcattagttg	GTAtcgactgcattagtTG	140	caactaatgcagtcgatac
22	tgtatcgactgcattagttg	TGtatcgactgcattagtTG	141	caactaatgcagtcgataca
23	atcgactgcattagtt	ATCgactgcattaGTT	142	aactaatgcagtcgat
23	atcgactgcattagtt	ATCGactgcattAGTT	142	aactaatgcagtcgat
23	atcgactgcattagtt	ATCGactgcattaGTT	142	aactaatgcagtcgat
24	tatcgactgcattagtt	TATCgactgcattaGTT	143	aactaatgcagtcgata
25	gtatcgactgcattagtt	GTATcgactgcattagTT	144	aactaatgcagtcgatac
26	tgtatcgactgcattagtt	TGTatcgactgcattagTT	145	aactaatgcagtcgataca
27	ttgtatcgactgcattagtt	TTGtatcgactgcattagTT	146	aactaatgcagtcgatacaa
28	tatcgactgcattagt	TATcgactgcattaGT	147	actaatgcagtcgata
28	tatcgactgcattagt	TATCgactgcatTAGT	147	actaatgcagtcgata
29	gtatcgactgcattagt	GTATcgactgcattaGT	148	actaatgcagtcgatac
30	tgtatcgactgcattagt	TGTatcgactgcattaGT	149	actaatgcagtcgataca
31	gtatcgactgcattag	GTAtcgactgcatTAG	150	ctaatgcagtcgatac
31	gtatcgactgcattag	GTAtcgactgcattAG	150	ctaatgcagtcgatac
31	gtatcgactgcattag	GTATcgactgcaTTAG	150	ctaatgcagtcgatac
32	tgtatcgactgcattag	TGtatcgactgcaTTAG	151	ctaatgcagtcgataca
33	ttgtatcgactgcattag	TTGtatcgactgcatTAG	152	ctaatgcagtcgatacaa
34	attgtatcgactgcattag	ATtgtatcgactgcaTTAG	153	ctaatgcagtcgatacaat
35	tgtatcgactgcatta	TGTatcgactgcaTTA	154	taatgcagtcgataca
35	tgtatcgactgcatta	TGTAtcgactgcATTA	154	taatgcagtcgataca
36	attgtatcgactgcatta	ATTGtatcgactgcaTTA	155	taatgcagtcgatacaat
37	ttgtatcgactgcatt	TTGtatcgactgcaTT	156	aatgcagtcgatacaa
37	ttgtatcgactgcatt	TTGtatcgactgCATT	156	aatgcagtcgatacaa
38	attgtatcgactgcat	ATTgtatcgactgCAT	157	atgcagtcgatacaat
38	attgtatcgactgcat	ATTgtatcgactgcAT	157	atgcagtcgatacaat
38	attgtatcgactgcat	ATTGtatcgactGCAT	157	atgcagtcgatacaat
39	acgcattgtatcgact	ACGcattgtatcgACT	158	agtcgatacaatgcgt
39	acgcattgtatcgact	ACGCattgtatcGACT	158	agtcgatacaatgcgt
40	tacgcattgtatcgac	TACgcattgtatcGAC	159	gtcgatacaatgcgta
40	tacgcattgtatcgac	TACGcattgtatCGAC	159	gtcgatacaatgcgta
41	ctacgcattgtatcgac	CTacgcattgtatCGAC	160	gtcgatacaatgcgtag
42	tctacgcattgtatcgac	TCTAcgcattgtatcgAC	161	gtcgatacaatgcgtaga
43	atctacgcattgtatcgac	ATCtacgcattgtatcgAC	162	gtcgatacaatgcgtagat
44	tatctacgcattgtatcgac	TAtctacgcattgtatcGAC	163	gtcgatacaatgcgtagata
45	ctacgcattgtatcga	CTAcgcattgtatCGA	164	tcgatacaatgcgtag
45	ctacgcattgtatcga	CTACgcattgtaTCGA	164	tcgatacaatgcgtag
46	tatctacgcattgtatcga	TAtctacgcattgtatCGA	165	tcgatacaatgcgtagata
47	tctacgcattgtatcg	TCTacgcattgtaTCG	166	cgatacaatgcgtaga
47	tctacgcattgtatcg	TCTacgcattgtatCG	166	cgatacaatgcgtaga
47	tctacgcattgtatcg	TCTAcgcattgtATCG	166	cgatacaatgcgtaga
48	atctacgcattgtatcg	ATCTacgcattgtaTCG	167	cgatacaatgcgtagat
49	tatctacgcattgtatcg	TATCtacgcattgtatCG	168	cgatacaatgcgtagata
50	tctatctacgcattgtatcg	TCtatctacgcattgtatCG	169	cgatacaatgcgtagataga
51	atctacgcattgtatc	ATCtacgcattgtATC	170	gatacaatgcgtagat
51	atctacgcattgtatc	ATCTacgcattgTATC	170	gatacaatgcgtagat
52	tatctacgcattgtatc	TATctacgcattgTATC	171	gatacaatgcgtagata
53	ctatctacgcattgtatc	CTatctacgcattgTATC	172	gatacaatgcgtagatag
54	tctatctacgcattgtatc	TCTatctacgcattgtaTC	173	gatacaatgcgtagataga
55	ttctatctacgcattgtatc	TTCtatctacgcattgtaTC	174	gatacaatgcgtagatagaa
56	tatctacgcattgtat	TATctacgcattgTAT	175	atacaatgcgtagata
56	tatctacgcattgtat	TATCtacgcattGTAT	175	atacaatgcgtagata
57	ctatctacgcattgtat	CTAtctacgcattGTAT	176	atacaatgcgtagatag
58	tctatctacgcattgtat	TCtatctacgcattGTAT	177	atacaatgcgtagataga
59	ttctatctacgcattgtat	TTCtatctacgcattgTAT	178	atacaatgcgtagatagaa
60	ctatctacgcattgta	CTAtctacgcattGTA	179	tacaatgcgtagatag
60	ctatctacgcattgta	CTATctacgcatTGTA	179	tacaatgcgtagatag
61	tctatctacgcattgta	TCTatctacgcattGTA	180	tacaatgcgtagataga
62	ttctatctacgcattgta	TTCtatctacgcattGTA	181	tacaatgcgtagatagaa
63	ttctatctacgcattgt	TTCtatctacgcatTGT	182	acaatgcgtagatagaa
64	tcttctatctacgcattgt	TCttctatctacgcattGT	183	acaatgcgtagatagaaga
65	ttcttctatctacgcattgt	TtcttctatctacgcattGT	184	acaatgcgtagatagaagaa
66	ttcttctatctacgcattg	TTCttctatctacgcatTG	185	caatgcgtagatagaagaa
67	ttctatctacgcattg	TTCtatctacgcaTTG	186	caatgcgtagatagaa
68	cttctatctacgcatt	CTTCtatctacgCATT	187	aatgcgtagatagaag
69	tcttctatctacgcatt	TCTtctatctacgCATT	188	aatgcgtagatagaaga
70	ttcttctatctacgcatt	TTCTtctatctacgcATT	189	aatgcgtagatagaagaa
71	tcttctatctacgcat	TCTTctatctacgCAT	190	atgcgtagatagaaga
72	ttcttctatctacgcat	TTCTtctatctacgCAT	191	atgcgtagatagaagaa
73	cttcttctatctacgcat	CTTCttctatctacgcAT	192	atgcgtagatagaagaag
74	ttcttctatctacgca	TTCttctatctacGCA	193	tgcgtagatagaagaa
75	cttcttctatctacgca	CTTCttctatctacgCA	194	tgcgtagatagaagaag
76	gcttcttctatctacgca	GcttcttctatctacgCA	195	tgcgtagatagaagaagc
77	cttcttctatctacgc	CTtcttctatctACGC	196	gcgtagatagaagaag
78	gcttcttctatctacg	GCTtcttctatctACG	197	cgtagatagaagaagc
79	cgtggggcttcttcta	CGTggggcttcttCTA	198	tagaagaagccccacg
80	tgacttggagaaaagcacaa	TGacttggagaaaagcacAA	199	ttgtgcttttctccaagtca
81	ctgacttggagaaaagcac	CtgacttggagaaaagcAC	200	gtgcttttctccaagtcag
82	agagtcatcgtgctcc	AGAgtcatcgtgcTCC	201	ggagcacgatgactct
83	aagtactttaatagctcaaa	AAGTactttaatagctCAAA	202	tttgagctattaaagtactt
84	aagtactttaatagctcaa	AAGTactttaatagcTCAA	203	ttgagctattaaagtactt
85	gaagtactttaatagctcaa	GAAGtactttaatagctCAA	204	ttgagctattaaagtacttc
86	tactttaatagctcaa	TACTttaatagcTCAA	205	ttgagctattaaagta
87	aagtactttaatagctca	AAGTactttaatagcTCA	206	tgagctattaaagtactt
88	gaagtactttaatagctca	GAAGtactttaatagcTCA	207	tgagctattaaagtacttc
89	agaagtactttaatagctc	AGAAgtactttaatagCTC	208	gagctattaaagtacttct
90	aagaagtactttaatagctc	AAGAagtactttaatagCTC	209	gagctattaaagtacttctt
91	gaagtactttaatagct	GAAGtactttaatAGCT	210	agctattaaagtacttc
92	taagaagtactttaatagct	TAAgaagtactttaatAGCT	211	agctattaaagtacttctta
93	agaagtactttaatagc	AGAAgtactttaaTAGC	212	gctattaaagtacttct
94	taagaagtactttaatagc	TAAGaagtactttaaTAGC	213	gctattaaagtacttctta
95	gtaagaagtactttaatagc	GTaagaagtactttaaTAGC	214	gctattaaagtacttcttac
96	taagaagtactttaatag	TAAGaagtactttaATAG	215	ctattaaagtacttctta
97	gtaagaagtactttaatag	GTAAgaagtactttaATAG	216	ctattaaagtacttcttac
98	tgtaagaagtactttaatag	TGTAagaagtactttaATAG	217	ctattaaagtacttcttaca
99	aatgtgtaagaagtacttt	AATGtgtaagaagtaCTTT	218	aaagtacttcttacacatt
100	caatgtgtaagaagtacttt	CAATgtgtaagaagtaCTTT	219	aaagtacttcttacacattg
101	atgtgtaagaagtactt	ATGTgtaagaagtACTT	220	aagtacttcttacacat
102	aatgtgtaagaagtactt	AATGtgtaagaagtACTT	221	aagtacttcttacacatt
103	caatgtgtaagaagtactt	CAATgtgtaagaagtACTT	222	aagtacttcttacacattg
104	gcaatgtgtaagaagtactt	GCaatgtgtaagaagtACTT	223	aagtacttcttacacattgc
105	atgtgtaagaagtact	ATGtgtaagaagtACT	224	agtacttcttacacat
105	atgtgtaagaagtact	ATGTgtaagaagTACT	224	agtacttcttacacat
106	gcaatgtgtaagaagtact	GCAAtgtgtaagaagtACT	225	agtacttcttacacattgc
107	aatgtgtaagaagtac	AATGtgtaagaaGTAC	226	gtacttcttacacatt
107	aatgtgtaagaagtac	AATgtgtaagaaGTAC	226	gtacttcttacacatt
108	caatgtgtaagaagtac	CAATgtgtaagaaGTAC	227	gtacttcttacacattg
109	gcaatgtgtaagaagtac	GCAatgtgtaagaaGTAC	228	gtacttcttacacattgc
110	caatgtgtaagaagta	CAAtgtgtaagaaGTA	229	tacttcttacacattg
110	caatgtgtaagaagta	CAAtgtgtaagaAGTA	229	tacttcttacacattg
110	caatgtgtaagaagta	CAATgtgtaagaAGTA	229	tacttcttacacattg
111	gcaatgtgtaagaagta	GCAatgtgtaagaAGTA	230	tacttcttacacattgc

或其共軛物；其中對於名稱為化合物設計之欄，大寫字母為LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，胞嘧啶核苷視情況為5甲基胞嘧啶，且核苷間鍵聯為至少80%、諸如至少90%或100%經修飾之核苷間鍵聯，諸如硫代磷酸酯核苷間鍵聯。在一些實施例中，上表中之化合物設計欄中之化合物的所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。基元及目標子序列為核鹼基序列。

本發明提供以下寡核苷酸：

CMP ID NO	化合物
5.1	AGTTaaaggaggagacAAAT
6.1	TCAgttaaaggaggagaCAA
7.1	CTCagttaaaggaggagaCA
8.1	CTCagttaaaggaggaGAC
9.1	ACTCagttaaaggaggagAC
10.1	ACTCagttaaaggaggaGA
11.1	ACtcagttaaaggaGGAG
12.1	GAtgactcagttaaaggAGG
13.1	ATGAtgactcagttaaagGA
14.1	TGAtgactcagttaAAGG
15.1	GAtgatgactcagttaAAGG
16.1	GATGatgactcagttaAAG
17.1	TAT^m cgactgcattagttGG
18.1	Gtat^m cgactgcattagttGG
19.1	TCGactgcattagTTG
19.2	TCGactgcattagtTG
19.3	TCGActgcattaGTTG
20.1	TAt^m cgactgcattaGTTG
21.1	GTAt^m cgactgcattagtTG
22.1	TGtat^m cgactgcattagtTG
23.1	ATCgactgcattaGTT
23.2	ATCGactgcattAGTT
23.3	ATCGactgcattaGTT
24.1	TATCgactgcattaGTT
25.1	GTAT^m cgactgcattagTT
26.1	TGTat^m cgactgcattagTT
27.1	TTGtat^m cgactgcattagTT
28.1	TAT^m cgactgcattaGT
28.2	TATCgactgcatTAGT
29.1	GTAT^m cgactgcattaGT
30.1	TGTat^m cgactgcattaGT
31.1	GTAt^m cgactgcatTAG
31.2	GTAt^m cgactgcattAG
31.3	GTAT^m cgactgcaTTAG
32.1	TGtat^m cgactgcaTTAG
33.1	TTGtat^m cgactgcatTAG
34.1	ATtgtat^m cgactgcaTTAG
35.1	TGTat^m cgactgcaTTA
35.2	TGTAt^m cgactgcATTA
36.1	ATTGtat^m cgactgcaTTA
37.1	TTGtat^m cgactgcaTT
37.2	TTGtat^m cgactgCATT
38.1	ATTgtat^m cgactgCAT
38.2	ATTgtat^m cgactgcAT
38.3	ATTGtat^m cgactGCAT
39.1	ACGcattgtat^m cgACT
39.2	ACGCattgtat^m cGACT
40.1	TACgcattgtat^m cGAC
40.2	TACGcattgtatCGAC
41.1	CTa^m cgcattgtatCGAC
42.1	TCTA^m cgcattgtat^m cgAC
43.1	ATCta^m cgcattgtat^m cgAC
44.1	TAtcta^m cgcattgtatcGAC
45.1	CTA^m cgcattgtatCGA
45.2	CTACgcattgtaTCGA
46.1	TAtcta^m cgcattgtatCGA
47.1	TCTa^m cgcattgtaTCG
47.2	TCTa^m cgcattgtatCG
47.3	TCTA^m cgcattgtATCG
48.1	ATCTa^m cgcattgtaTCG
49.1	TATCta^m cgcattgtatCG
50.1	TCtatcta^m cgcattgtatCG
51.1	ATCta^m cgcattgtATC
51.2	ATCTa^m cgcattgTATC
52.1	TATcta^m cgcattgTATC
53.1	CTatcta^m cgcattgTATC
54.1	TCTatcta^m cgcattgtaTC
55.1	TTCtatcta^m cgcattgtaTC
56.1	TATcta^m cgcattgTAT
56.2	TATCta^m cgcattGTAT
57.1	CTAtcta^m cgcattGTAT
58.1	TCtatcta^m cgcattGTAT
59.1	TTCtatcta^m cgcattgTAT
60.1	CTAtcta^m cgcattGTA
60.2	CTATcta^m cgcatTGTA
61.1	TCTatcta^m cgcattGTA
62.1	TTCtatcta^m cgcattGTA
63.1	TTCtatcta^m cgcatTGT
64.1	TCttctatcta^m cgcattGT
65.1	Ttcttctatcta^m cgcattGT
66.1	TTCttctatcta^m cgcatTG
67.1	TTCtatcta^m cgcaTTG
68.1	CTTCtatcta^m cgCATT
69.1	TCTtctatcta^m cgCATT
70.1	TTCTtctatcta^m cgcATT
71.1	TCTTctatcta^m cgCAT
72.1	TTCTtctatcta^m cgCAT
73.1	CTTCttctatcta^m cgcAT
74.1	TTCttctatctacGCA
75.1	CTTCttctatcta^m cgCA
76.1	Gcttcttctatcta^m cgCA
77.1	CTtcttctatctACGC
78.1	GCTtcttctatctACG
79.1	CGTggggcttcttCTA
80.1	TGacttggagaaaagcacAA
81.1	CtgacttggagaaaagcAC
82.1	AGAgtcat^m cgtgcTCC
83.1	AAGTactttaatagctCAAA
84.1	AAGTactttaatagcTCAA
85.1	GAAGtactttaatagctCAA
86.1	TACTttaatagcTCAA
87.1	AAGTactttaatagcTCA
88.1	GAAGtactttaatagcTCA
89.1	AGAAgtactttaatagCTC
90.1	AAGAagtactttaatagCTC
91.1	GAAGtactttaatAGCT
92.1	TAAgaagtactttaatAGCT
93.1	AGAAgtactttaaTAGC
94.1	TAAGaagtactttaaTAGC
95.1	GTaagaagtactttaaTAGC
96.1	TAAGaagtactttaATAG
97.1	GTAAgaagtactttaATAG
98.1	TGTAagaagtactttaATAG
99.1	AATGtgtaagaagtaCTTT
100.1	CAATgtgtaagaagtaCTTT
101.1	ATGTgtaagaagtACTT
102.1	AATGtgtaagaagtACTT
103.1	CAATgtgtaagaagtACTT
104.1	GCaatgtgtaagaagtACTT
105.1	ATGtgtaagaagtACT
105.2	ATGTgtaagaagTACT
106.1	GCAAtgtgtaagaagtACT
107.1	AATGtgtaagaaGTAC
107.2	AATgtgtaagaaGTAC
108.1	CAATgtgtaagaaGTAC
109.1	GCAatgtgtaagaaGTAC
110.1	CAAtgtgtaagaaGTA
110.2	CAAtgtgtaagaAGTA
110.3	CAATgtgtaagaAGTA
111.1	GCAatgtgtaagaAGTA

其中在上表之化合物中，大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，所有LNA胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶(如由上標^m 所指示)，小寫字母表示DNA核苷，小寫字母c前之上標m表示5甲基胞嘧啶DNA核苷。所有核苷間鍵聯係硫代磷酸酯核苷間鍵聯。

醫藥組合物 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含前述寡核苷酸及/或寡核苷酸共軛物中之任一者及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽及/或佐劑。醫藥學上可接受之稀釋劑包括磷酸鹽-緩衝鹽水(PBS)及醫藥學上可接受之鹽，包括但不限於鈉鹽及鉀鹽。在一些實施例中，醫藥學上可接受之稀釋劑係無菌磷酸鹽緩衝鹽水。在一些實施例中，寡核苷酸係以50 - 300 µM溶液之濃度用於醫藥學上可接受之稀釋劑中。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸以10 - 1000 µg之劑量投與。

WO 2007/031091提供醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑及佐劑之適合及較佳實例(以引用之方式併入本文中)。WO2007/031091中亦提供適合之劑量、調配物、投與途徑、組合物、劑型、與其他治療劑之組合、前藥調配物。

本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合以用於製備醫藥組合物或調配物。用於調配醫藥組合物之組合物及方法視多個指標而定，包括但不限於投與途徑、疾病程度或待投與之劑量。

在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物係前藥。特定言之，關於寡核苷酸共軛物，在前藥傳遞至作用部位，例如目標細胞時，共軛部分自寡核苷酸裂解。

本發明提供一種治療患有眼部疾病，諸如黃斑退化，諸如濕性或乾性年齡相關之黃斑退化(例如wAMD、dAMD、地圖狀萎縮、中期dAMD)或糖尿病性視網膜病變之個體的方法，該方法包含向該個體投與有效量之本發明之寡核苷酸、共軛物或組合物的步驟，其中該方法進一步包含向該個體投與另一治療劑，諸如抗血管生成劑(例如VEFG拮抗劑)或補體系統之抑制劑。

在本發明之治療患有眼部疾病，諸如黃斑退化，諸如濕性或乾性年齡相關之黃斑退化(例如wAMD、dAMD、地圖狀萎縮、中期AMD)或糖尿病性視網膜病變之個體的方法之一些實施例中，該方法包含以自約10 µg-200 µg劑量以眼內注射方式投與至少二劑量之HTRA1寡核苷酸拮抗劑，諸如反義寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽，其中在連續投與之間之劑量區間為至少4週(亦即劑量區間≥4週)，或至少每月一次(亦即劑量區間≥1個月)。

補體系統 術語「補體組分」、「補體系統」、「補體蛋白」或「補體組分蛋白」係指涉及補體系統不活化之分子(參見圖15)。經典路徑組分包括例如C1q、C1r、C1s、C4、C2、C3、C5、CG、C7、C8、C9及C5b-9複合物(攻膜複合物：MAC)。替代性路徑組分包括例如因子B、因子D、備解素、因子H及因子I。

補體系統為先天性免疫之強大效應子。在包括年齡相關之黃斑退化的許多臨床情境中，補體系統的防禦功能可能由於誘發或加重免疫、發炎及退化過程以及病狀而有害。目前，許多補體系統拮抗劑處於臨床開發中(參見例如Ricklin及Lambris, Semin. Magazine》2017)，其包括但不限於補體因子D拮抗劑、補體因子B拮抗劑、補體因子C5拮抗劑、補體因子C3拮抗劑、補體因子P (亦稱為備解素)拮抗劑。

其他治療劑 ( Further Therapeutics )/ 其他治療劑 Further Therapeutic Agents ) 本發明係關於HTRA1寡核苷酸拮抗劑之用途，其用於與另一治療劑，諸如選自由抗血管生成劑、VEGF拮抗劑或補體系統拮抗劑組成之群的另一治療劑組合治療或預防乾性年齡相關之黃斑退化，諸如地圖狀萎縮。

在一些實施例中，其他治療劑為抗血管生成劑，諸如VEGF拮抗劑，或為補體系統之抑制劑，諸如補體組分之拮抗劑。

在一些實施例中，該另一治療劑為補體系統拮抗劑，諸如經典補體路徑之拮抗劑或替代補體路徑之拮抗劑。在一些實施例中，該另一治療劑選自由以下組成之群：補體因子D拮抗劑、補體因子B拮抗劑、拮抗劑補體因子C5、拮抗劑補體因子C3、拮抗劑補體因子P (備解素)、補體因子I拮抗劑及補體因子H拮抗劑。

該另一治療劑可例如為小分子治療劑、肽治療劑、蛋白質治療劑、抗體治療劑或寡核苷酸治療劑。對於HTRA1寡核苷酸拮抗劑及另一治療劑(其為蛋白質治療劑)及抗體治療劑(諸如單株抗體、抗體片段或抗體融合蛋白)或肽治療劑之組合用途。

在一些實施例中，由於硫代磷酸酯寡核苷酸之蛋白質結合能力，故單獨投與HTRA1寡核苷酸拮抗劑及另一治療劑可為有利的。

在一些實施例中，該另一治療劑為寡核苷酸治療劑，諸如反義寡核苷酸、siRNA或適體。

抗血管生成劑，亦稱為血管生成抑制劑，為抑制血管生長之治療劑。血管生成抑制劑以若干方式干擾血管生長中之各種步驟。一些為特異性識別且結合於VEGF之單株抗體。當VEGF連接於此等藥物時，其不能活化VEGF受體。其他血管生成抑制劑結合於VEGF及/或其受體以及內皮細胞表面上之其他受體或下游信號傳導路徑中之其他蛋白質，從而阻斷其活性。一些血管生成抑制劑為免疫調節藥物—刺激或抑止免疫系統之藥劑—其亦具有抗血管生成特性。最常見血管生成抑制劑為VEGF之拮抗劑。

VEGF 拮抗劑 VEGF為經充分表徵之信號蛋白，其刺激血管生成。在一些實施例中，VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體治療劑，諸如雷珠單抗(Lucentis®)或貝伐單抗(Avastin®)。

在一些實施例中，經由眼內注射，諸如經由玻璃體內注射投與VEGF拮抗劑。投與VEGF拮抗劑，諸如抗VEFG抗體通常有利於避免全身性副作用，諸如出血。在一些實施例中，VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體，諸如雷珠單抗(Lucentis®)或貝伐單抗(Avastin®)。

在一些實施例中，其他治療劑為VEGF拮抗劑治療劑，其為抗VEGF抗體，諸如雷珠單抗或貝伐單抗。

在一些實施例中，該另一治療劑為VEGF拮抗劑治療劑，其為適體，諸如聚乙二醇化派加替尼(pegaptanib) (Macugen®)。在一些實施例中，該另一治療劑為VEGF拮抗劑治療劑，為VEGF之小分子抑制劑，諸如西地尼布(cediranib)、拉帕替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)及帕佐泮尼(pazopanib)。下文提供此等結構及化學式：西地尼布：

4-[(4-氟-2-甲基-1H -吲哚-5-基)氧基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯啶-1-基)丙氧基]喹唑啉拉帕替尼：

N -[3-氯-4-(3-氟苄氧基)苯基]-6-[5-({[2-(甲磺醯基)=乙基]胺基}甲基)-2-呋喃基] 喹唑啉-4-胺舒尼替尼：

N -[2-(二乙基胺基)乙基]-5-[(Z )-(5-氟基-2-側氧基-1,2-二氫-3H -3-亞吲哚)甲基]-2,4-二甲基-1H -吡咯-3-甲醯胺索拉非尼：

4-(4-{3-[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]脲基}苯氧基)-N² -甲基吡啶-2-甲醯胺阿西替尼：N -甲基-2-({3-[(1E )-2-(吡啶-2-基)乙烯基]-1H -吲唑-6-基}硫基)苯甲醯胺帕佐泮尼：

5-({4-[(2,3-二甲基-2H -吲唑-6-基)甲胺基]嘧啶-2-基}胺基)-2-甲基苯磺醯胺

在一些實施例中，該另一治療劑為VEGF拮抗劑，為重組融合蛋白VEGF抑制劑，諸如阿柏西普(aflibercept) (Eylea)—阿柏西普由人類VEGF受體1及2之細胞外域之血管內皮生長因子(VEGF)結合部分構成，該等部分與人類IgG1免疫球蛋白之Fc部分融合。

通常，每月一次或兩月一次經由玻璃體內注射向眼睛投與VEGF(抗VEGF)之抗體抑制劑(例如參見US9220631)。抗VEGF抗體之其他實例揭示於WO96/30046、WO2006/047325及WO2008/063932中

雷珠單抗，CAS編號=347396-82-1，揭示於WO98/45331及WO9845332且包含序列SEQ A (SEQ ID NO 234)之輕鏈免疫球蛋白及序列B (SEQ ID NO 235)之重鏈免疫球蛋白。＞雷珠單抗輕鏈(SEQ A )

＞雷珠單抗重鏈(SEQ B )

貝伐單抗，CAS編號=216974-75-3，包含序列SEQ C (SEQ ID NO 236)之輕鏈免疫球蛋白及SEQ D (SEQ ID NO 237)之重鏈免疫球蛋白。＞「貝伐單抗輕鏈」SEQ C

＞「貝伐單抗重鏈」SEQ D

在一些實施例中，該另一治療劑為抗VEGF抗體、布羅盧西珠單抗(brolucizumab) (CAS編號=1531589-13-5)，其在臨床開發中用於治療wAMD。布羅盧西珠單抗包含以下胺基酸序列(SEQ ID NO 238)：

在一些實施例中，該另一治療劑為阿柏西普(Eylea®) (Holash等人(2002) PNAS USA 99:11393-98；Riely及 Miller (2007) Clin Cancer Res 13:4623-7s)。阿柏西普為VEGF之重組融合蛋白拮抗劑，其由來自人類VEGF受體1及2之細胞外域之血管內皮生長因子(VEGF)結合部分構成，該等部分與人類IgG1免疫球蛋白之Fc部分融合，以用於玻璃體內投與(參見US7306799、US7531173、US7374758、US7608261、US7070959及US7374757)。阿柏西普蛋白質序列(SEQ ID NO F-SEQ ID NO 239)

YTQKSLSLSPG；二硫橋鍵可在各單體內之殘基30-79、124-185、246-306及352-410之間及在單體之間的殘基211-211及214-214之間形成。

在一些實施例中，該另一治療劑為小分子VEGF抑制劑，諸如選自由以下組成之群的分子：西地尼布、拉帕替尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼及帕佐泮尼(此等為抗血管生成藥物，其用於癌症治療)。

補體因子 D 抑制劑 在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子D (CFD)之拮抗劑。在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子D (抗CFD抗體)，諸如蘭帕珠單抗(lampalizumab) (CAS編號=1278466-20-8)之抗體拮抗劑。補體因子D之抗體抑制劑之其他實例揭示於WO2017/075173及WO2017/075252中。抗CFD抗體可經由例如每月一次或兩月一次經由玻璃體內注射向眼睛投與。

蘭帕珠單抗係針對Genentech開發之補體因子D之人類化單株抗體之抗原結合片段(Fab) (參見例如Yaspan等人, Sci Transl Med. 2017 Jun 21;9(395)) (NCT02247479)。蘭帕珠單抗包含序列SEQ G (SEQ ID NO 240)之輕鏈免疫球蛋白及SEQ H (SEQ ID NO 241)之重鏈免疫球蛋白。蘭帕珠單抗重鏈(SEQ G)：

蘭帕珠單抗輕鏈(SEQ H)：

在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子D之小分子抑制劑，諸如選自由以下組成之群的小分子：ACH-4471、ACH-5228或ACH-5548 (如US10106563B2、US10092584B2、US10011612B2及US10000516B2中所揭示)。 ACH-4471 (CAS編碼：1903768-17-1)

ACH-5228揭示於US9598446。

CFD之此等小分子抑制劑(靶向)結合至CFD且阻斷CFD之活性，且從而在補體級聯之替代路徑中抑制補體因子B裂解為Ba及Bb。此抑制CFD介導之信號傳導及替代補體路徑(ACP)之活化，阻斷陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)中之補體介導之溶血，且防止ACP誘發之組織損傷。其可經口投與。

補體因子 B ( CFB ) 拮抗劑 在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子B之拮抗劑(抑制劑)。

人類補體因子B基因發現於人類染色體CHR_HSCHR6_MHC_MANN_CTG1: 31,985,034-31,990,148個正向鏈(GRCh38: GL000253.2)上。

本文中提供人類補體因子B前體mRNA序列作為SEQ ID NO 242：

陰影粗體文字區為成熟mRNA序列。

諸如靶向補體因子B之反義寡核苷酸的治療性寡核苷酸可包含至少12個或至少14個核苷酸之連續核苷酸序列，該核苷酸序列與人類補體因子B前體mRNA或mRNA互補，諸如與人類補體因子B前體mRNA或mRNA完全互補。治療性siRNA或shRNA通常包含至少17-25個連續核苷酸之區，該等連續核苷酸與人類補體因子B mRNA互補，諸如完全互補。

WO15038939及WO15168635揭示靶向人類補體因子B前體mRNA及GalNAc共軛物的反義寡核苷酸。靶向補體因子前體mRNA之反義寡核苷酸處於臨床開發中：在一些有利實施例中，該另一治療劑為IONIS-FB-Lrx，亦稱為ISIS 696844。

IONIS-FB-Lrx作為ISIS 696844揭示於WO15168635中且包含具有以下序列之反義寡核苷酸：ATCCCACGCCCCTGTCCAGC (SEQ ID NO 243). IONIS-FB-Lrx反義寡核苷酸具有間隙體5-10-5： 5'- A_s T_s ^m C_s ^m C_s ^m C_s a_s ^m c_s g_s ^m c_s ^m c_s ^m c_s ^m c_s t_s g_s t_s ^m C_s ^m C_s A_s G_s ^m C - 3'，其中各大寫字母為2'-O-甲氧基乙基(MOE) RNA核苷，各小寫字母為DNA核苷，所有胞嘧啶為5-甲基胞嘧啶(由前述上標^m 表示)，且核苷間鍵聯為硫代磷酸酯(指定為下標_s )。5'核苷(A)經由磷酸酯鍵聯與三價共軛物部分共軛。IONIS-FB-Lrx之化學式呈現如下：

IONIS-FB-Lrx可經由例如皮下、靜脈內或肌肉內注射或輸注向個體投與。GalNAc共軛物之存在增強反義寡核苷酸至肝細胞中之吸收。

在某些實施例中，補體因子B反義寡核苷酸非經腸投與。舉例而言，在某些實施例中，經由注射或輸注投與補體因子B反義寡核苷酸，諸如皮下投與、靜脈內投與、肌肉內投與、動脈內投與或腹膜內投與。在一些有利實施例中，IONIS-FB-Lrx係皮下注射投與，諸如每月一次或兩月一次注射。

在一些實施例中，HTRA1拮抗劑為式T_s T_s ^m C_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s a_s T_s T_s G (SEQ ID NO 67,1)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且^m c表示5甲基胞嘧啶DNA核苷，且另一治療劑為IONIS-FB-Lrx。

在一些實施例中，HTRA1拮抗劑為式^m C_s T_s T_s ^m C_s t_s t_s c_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s A_s T (SEQ ID NO 73,1)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且另一治療劑為IONIS-FB-Lrx。

在一些實施例中，HTRA1拮抗劑為式T_s A_s ^m C_s T_s t_s t_s a_s a_s t_s a_s g_s c_s T_s ^m C_s A_s A (SEQ ID NO 86,1)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標_s 表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且另一治療劑為IONIS-FB-Lrx。

在一些實施例中，HTRA1拮抗劑為式T_s A_s T_s t_s t_s a_s c_s c_s t_s g_s g_s t_s T_s G_s T_s T (SEQ ID NO 232)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且另一治療劑為IONIS-FB-Lrx。在一些實施例中，HTRA1拮抗劑為式A_s t_s A_s T_s t_s t_s a_s c_s c_s t_s g_s G_s T_s T_s g_s T_s T (SEQ ID NO 233)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且另一治療劑為IONIS-FB-Lrx。

補體因子 P ( 備解素 ， CFP ) 拮抗劑 在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子P之拮抗劑，諸如抗CFP抗體，諸如CLG-561或NM9401。

在一些實施例中，該另一治療劑為CLG-561 (亦寫成CLG 561)，其在臨床開發中係單株抗體以與LFG316 (特斯多魯單抗(Tesidolumab)，抗補體因子C5抗體)組合使用。CLG-561可每月一次或兩月一次經由玻璃體內注射投與。

在一些實施例中，另一治療劑為靶向CFP之抗體，諸如NM9401 (US8664362)：其包含展示於SEQ 244中之重鏈及展示於SEQ 245中之輕鏈：重鏈SEQ ID NO 244，

重鏈SEQ ID NO 245

補體因子 C3 拮抗性 在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子C3之拮抗劑或抑制劑(可互換使用)，諸如APL-2或CB2782。

APL-2為特異地結合至C3及C3b以抑制C3裂解及活化為式之C3a及C3b的TCR環肽共軛物(參見WO2014078731及WO2018/075357)：

CB2782為衍生自人類膜型絲胺酸蛋白酶1 (MTSP-1)之新穎蛋白酶，其選擇性地裂解C3且已表明其完全抑制C3 (US9290757及US9359598)。在一些實施例中，該另一治療劑為選自SEQ ID No 252、253、254及255之經修飾之MTSP-1蛋白酶(如EP2402437中所揭示)。

補體因子 C5 拮抗劑 在一些實施例中，該另一治療劑為補體因子C5之拮抗劑或抑制劑(可互換使用)，諸如抗補體因子C5抗體，諸如LFG316(WO2017/12375中所揭示之特斯多魯單抗，CAS編號=1531594-08-7)或艾庫組單抗(Eculizumab) (solris, CAS編號=219685-50-4)，及抗補體因子C5適體，諸如阿伐辛卡培格(avacincaptad pegol) (Zimura®，亦稱為ARC1905)。

在一些實施例中，該另一治療劑為經由玻璃體內注射投與處於臨床開發(NCT02515942)中之特斯多魯單抗。特斯多魯單抗包含SEQ J (SEQ ID NO 246)及SEQ K (SEQ ID NO 247)之重鏈及輕鏈免疫球蛋白： SEQ J：

SEQ K：

在一些實施例中，該另一治療劑為艾庫組單抗(Eculizumab，其為包含SEQ L (SEQ ID NO 248)之輕鏈及SEQ M (SEQ ID NO 249)之重鏈的人類化單株(IgG2/4κ)抗體(WO2017/12375)。

輕鏈：SEQ L

重鏈：SEQ M

在一些實施例中，該另一治療劑為阿伐辛卡培格(Zimura®，亦稱為ARC1905)。阿伐辛卡培格(CAS-1491144-00-3)係作為由Ophthotech (WO 2007103549)開發之抗C5適體(NCT02686658)：阿伐辛卡培格包含適體序列SEQ N (SEQ ID NO 250)： SEQ N：

根據Toxnet，阿伐辛卡培格化學名稱為聚(氧基-1,2-乙二基)、α-氫-β-甲氧基-、具有RNA之5'-醚((2'-脫氧-2'-氟)C-Gm-(2'-脫氧-2'-氟)C-(2'-脫氧-2'-氟)C-G-(2'-脫氧-2'-氟)C-Gm-Gm-(2'-脫氧-2'-氟)U-(2'-脫氧-2'-氟)C-(2'-脫氧-2'-氟)U-(2'-脫氧-2'-氟)C-Am-Gm-Gm-(2'-脫氧-2'-氟)C-G-(2'-脫氧-2'-氟)C-(2'-脫氧-2'-氟)U-Gm-Am-Gm-(2'-脫氧-2'-氟)U-(2'-脫氧-2'-氟)C-(2'-脫氧-2'-氟)U-Gm-Am-Gm-(2'-脫氧-2'-氟)U-(2'-脫氧-2'-氟)U-(2'-脫氧-2'-氟)U-A-(2'-脫氧-2'-氟)C-(2'-脫氧-2'-氟)C-(2'-脫氧-2'-氟)U-Gm-(2'-脫氧-2'-氟)C-Gm-(3'->3')-dT) 5'-(6-(((2,3-二羥基丙氧基) 羰基)胺基)己基氫磷酸酯), 鈉鹽 (2:1:39)

抗血小板衍生生長因子 ( PGDF ) 治療劑。 在一些實施例中，該另一治療劑為PGDF拮抗劑(例如PGFD-B拮抗劑)，例如抗PGDF適體之拮抗劑，諸如Fovista (派勒蘭尼(pegpleranib))。派勒蘭尼處於臨床試驗中，用於與Lucentis®組合治療dAMD。派勒蘭尼具有式(序列)： (3'-5')-R-dC-dA-dG-dG-dC-dUfl-dA-dCfl-Gm3'-17Xp1- 5'dC-dG-dT-dA-Gm-dA-Gm-dC-dA-dUfl-dCfl-Am3'- 17Xp1-5'dT-dG-dA-dT-dCfl-dCfl-dUfl-Gm3'-3'dT (SEQ ID NO 251)

d (作為前綴) = 2'-脫氧基 fl (作為後綴) = 2'-氟 m (作為後綴) = 2'-O -甲基

抗體治療 在一些實施例中，該另一治療劑為抗體治療劑。用於治療黃斑退化抗體可經由玻璃體內注射，諸如經由每月一次或兩月一次玻璃體內注射直接向眼睛投與。

術語抗體在本文中用於指能夠以足夠親和力結合於目標(抗「目標」)以使得抗體適用作靶向目標之治療劑的抗體(例如抗VEGF或抗補體組分，諸如抗CFD、抗CFC3、抗CFC5、抗CFP等)。在一個態樣中，抗抗體結合至不相關非蛋白質之程度小於抗體結合之約10%，例如藉由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)所量測。在某些態樣中，結合至抗體之解離常數(KD)為≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更少，例如自10-8 M至10-13 M，例如自10-9 M至10-13 M)。據稱抗體在抗體之KD為1 μM或更小時「特異性結合」。對於用於人類療法中，抗體靶向人類目標。然而，在某些態樣中，抗抗體結合至來自不同物種之保守者的抗原決定基。

術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。

「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv及scFab)；單域抗體(dAb)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。關於某些抗體片段之評述，參見Holliger及Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。

投與 HTRA1 拮抗劑 / 反義寡核苷酸治療劑 在一些實施例中，本發明係關於寡核苷酸(諸如HTRA1拮抗劑或反義寡核苷酸治療劑)在治療選自諸如黃斑退化(包括年齡相關之黃斑退化(AMD)，諸如乾性AMD或濕性AMD)之疾病或病症及糖尿病性視網膜病變的用途。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸共軛物或醫藥組合物可用於治療地圖狀萎縮或中期dAMD或dAMD。

根據本發明之HTRA1拮抗劑/反義寡核苷酸治療劑通常以有效量投與。通常經由玻璃體內注射投與，諸如在包含一定劑量(單位劑量)之眼用溶液中，例如每眼5 µg-200 µg，諸如每眼10 µg-100 µg，諸如每眼20 µg-50 µg。在一些實施例中，投與各眼睛之眼用溶液之體積為例如約25 µl-約100 µl，諸如約50 µl。

眼用溶液 眼用溶液為包含Htra1拮抗劑或反義寡核苷酸治療劑之溶液，諸如溶解於與經由注射(諸如玻璃體內注射)至眼睛中之投與相容之溶劑中的HTRA1寡核苷酸拮抗劑。溶劑適合地為緩衝水溶液，諸如pH為約7-約7.5之磷酸鹽緩衝鹽水，諸如約pH 7.4。可使用其他眼用可接受之緩衝溶液。眼用溶液為滅菌的。溶劑適合地為緩衝水溶液，諸如pH為約7-約7.5，諸如約7.4之磷酸鹽緩衝鹽水。

在一些實施例中，劑量區間，亦即連續給藥之間的時間段係至少每月一次，諸如至少兩月一次，或至少三月一次。

實施例 1. 反義寡核苷酸選自以下之群，該群選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)、TATttacctggtTGTT(SEQ ID NO 232)、AtATttacctgGTTgTT(SEQ ID NO 233)，其中大寫字母表LNA核苷，LNA C視情況為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯；其用於治療個體中之地圖狀萎縮，其中該治療進一步包含向該個體投與另一治療劑。 2. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為式T_s T_s ^m C_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s a_s T_s T_s G (SEQ ID NO 67,1)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標_s 表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且^m c表示5甲基胞嘧啶DNA核苷。 3. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為式T_s T_s ^m C_s t_s a_s t_s c_s t_s a_s ^m c_s g_s c_s a_s T_s T_s G (SEQ ID NO 73,1)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標_s 表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且^m c表示5甲基胞嘧啶DNA核苷。 4. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為式T_s A_s ^m C_s T_s t_s t_s a_s a_s t_s a_s g_s c_s T_s ^m C_s A_s A (SEQ ID NO 86,1)之反義寡核苷酸，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，下標_s 表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯，且^m C表示5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷。 5. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為T_s A_s T_s t_s t_s a_s c_s c_s t_s g_s g_s t_s T_s G_s T_s T (SEQ ID NO 232)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，且下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 6. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為A_s t_s A_s T_s t_s t_s a_s c_s c_s t_s g_s G_s T_s T_s g_s T_s T (SEQ ID NO 233)，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷，且下標s表示硫代磷酸酯核苷間鍵聯。 7. 如實施例1至6中任一項之反義寡核苷酸之用途，其用於製造供治療地圖狀萎縮之藥劑，其中該藥劑用於與另一治療劑組合治療。 8. 一種用於治療需要治療之個體之地圖狀萎縮的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如實施例1至6中任一項之反義寡核苷酸，且進一步向該個體投與有效量之另一治療劑。 9. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑治療劑，諸如抗VEGF抗體治療劑。 10. 如實施例9之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該VEGF拮抗劑治療劑為雷珠單抗。 11. 如實施例9之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該VEGF拮抗劑治療劑為貝伐單抗。 12. 如實施例9之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該VEGF拮抗劑治療劑為派加替尼。 13. 如實施例9之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該VEGF拮抗劑治療物為VEGF之小分子抑制劑，諸如選自由以下組成之群之分子：西雙拉尼、拉帕替尼、舒尼替尼、索拉非尼、阿西替尼及帕佐泮尼。 14. 如實施例9之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該VEGF拮抗劑治療劑為重組融合蛋白VEGF抑制劑，諸如阿柏西普。 15. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為補體因子D (CFD)之拮抗劑。 16. 如請求項15之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為抗CFD抗體治療劑，諸如蘭帕珠單抗。 17. 如請求項15之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為補體因子D之小分子抑制劑，諸如選自由以下組成之群的分子：ACH-4447、ACH-5228及ACH-5548。 18. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為補體因子B之拮抗劑。 19. 如實施例1至8或18中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為補體因子B之寡核苷酸拮抗劑，諸如靶向補體因子B編碼RNA之反義寡核苷酸或siRNA (例如，CFB之核酸抑制劑，其包含與SEQ ID NO 242完全互補之至少12個或至少14個連續核苷酸之序列)。 20. 如實施例18或19之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為IONIS-FB-Lrx。 21. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為補體因子C3之拮抗劑。 22. 如實施例21之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為APL-2。 23. 如實施例21之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為經修飾之MTSP-1蛋白酶，諸如CB2782。 24. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為補體因子C5 (CFC5)之拮抗劑，諸如抗CFC5抗體治療劑。 25. 如實施例24之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為特斯多魯單抗。 26. 如實施例24之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為阿伐辛卡培格(avacincaptad pegol)。 27. 如實施例24之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為艾庫組單抗。 28. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸、用途或方法，其中該另一治療劑為抗血小板衍生生長因子(PGDF)，諸如抗PGDF抗體、PGDF之適體抑制劑。

實例實例 1. 以 單一濃度測試 U251 細胞株中之 LNA 寡核苷酸的活體外功效。 針對HTRA1鑑別有前景之「熱點」區。在U251細胞株中以5 µM篩選治療6天之n=231 HTRA1 LNA寡核苷酸庫。自此庫，吾等鑑別如圖1中所展示之位置53113-53384之間的靶向人類HTRA1 前mRNA之一系列活性寡核苷酸(SEQ ID NO 116或117)。

人類神經膠母細胞瘤U251細胞株購自ECACC且如由供應商所推薦保持於37℃下具有5% CO₂ 之含濕氣培育箱中。針對分析，在饑餓培養基(培養基由供應商推薦，除了1% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種15000個U251細胞/孔。細胞培育24小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸濃度：5 µM。在添加寡核苷酸3-4天之後，移除培養基且添加新培養基(無寡核苷酸)。在添加寡核苷酸6天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體(decamer) RETROscript、核糖核酸酶抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之水(Gibco)來合成。對於基因表現分析，qPCR使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)在doublex設置中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP，來自Life Technologies之Hs4326322E (VIC-MGB)。n=2個獨立生物複本。將表中之剩餘HTRA1 mRNA表現量展示為對照(經PBS處理之細胞)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	mRNA 含量
19	19.1	16
31	31.1	2
38	38.1	9
47	47.1	3
78	78.1	4
79	79.1	21
82	82.1	35
107	107.1	17
110	110.1	24
112	112.1	15

實例 2. 以單一濃度測試 U251 細胞株中之 LNA 寡核苷酸的活體外功效。 進一步在U251細胞株中以5 µM篩選之新n=210個HTRA1 LNA寡核苷酸庫中證實描述於實例1中之「熱點」區53113-53384。n=33個LNA寡核苷酸靶向位置53113-53384之間的人類HTRA1前體mRNA，且此等寡核苷酸與如圖2中所展示之其餘寡核苷酸相比為相對活性的。

如實例1中所描述進行分析。n=2個獨立生物複本。將表中之剩餘HTRA1 mRNA表現量展示為對照(經PBS處理之細胞)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	mRNA 含量
19	19.2	3
19	19.3	16
23	23.1	1
23	23.2	44
28	28.1	2
28	28.2	19
31	31.2	0.4
31	31.3	9
35	35.1	24
35	35.2	5
37	37.1	0.3
37	37.2	7
38	38.2	1
38	38.3	17
39	39.1	5
39	39.2	17
40	40.1	6
40	40.2	34
45	45.1	4
45	45.2	23
47	47.2	1
47	47.3	4
51	51.1	6
51	51.2	13
56	56.1	2
56	56.2	12
60	60.1	2
60	60.2	5
105	105.1	30
105	105.2	76
107	107.2	25
110	110.2	27
110	110.3	20

實例 3. 以單一濃度測試 U251 及 ARPE19 細胞株中之 LNA 寡核苷酸的活體外功效。 在U251及ARPE19細胞株中分別以5 µM及25 µM篩選之新n=305個HTRA1 LNA寡核苷酸庫中進一步證實描述於實例1及2中之「熱點」區53113 - 53384。n=95個LNA寡核苷酸靶向位置53113-53384之間的人類HTRA1 前體mRNA，且此等寡核苷酸與如圖3中所展示之其餘寡核苷酸相比為相對活性的。

人類視網膜色素上皮ARPE19細胞株購自ATCC且在37℃下具有5% CO₂ 之含濕氣培育箱中保持於DMEM-F12 (Sigma，D8437)、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(pen/strep)中。U251細胞株描述於實例1中。針對分析，在供應商推薦之培養基中在96多孔盤中接種2000個U251或ARPE19細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞2小時。寡核苷酸濃度在U251及ARPE19細胞中分別為5及25 µM。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA提取如實例1中所描述進行，cDNA合成及qPCR使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。針對U251及ARPE19細胞在douplex設置中使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，GAPDH，Hs4310884E (VIC-MGB)。所有引子組皆購自Life Technologies。n=1個生物複本。將表中之相對HTRA1 mRNA表現量展示為對照(經PBS處理之細胞)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	ARPE19 mRNA 含量	U251 mRNA 含量
5	5.1	90	56
6	6.1	107	60
7	7.1	92	74
8	8.1	83	57
9	9.1	98	64
10	10.1	77	67
11	11.1	71	56
12	12.1	81	43
13	13.1	84	65
14	14.1	36	20
15	15.1	37	29
16	16.1	55	28
17	17.1	53	43
18	18.1	69	59
20	20.1	41	42
21	21.1	24	22
22	22.1	38	51
23	23.3	53	37
24	24.1	52	27
25	25.1	27	18
26	26.1	16	26
27	27.1	28	42
29	29.1	24	16
30	30.1	18	22
31	31.2	23	3
32	32.1	14	23
33	33.1	11	23
34	34.1	14	34
35	35.1	8	3
36	36.1	12	18
37	37.1	24	5
41	41.1	51	26
42	42.1	39	26
43	43.1	53	42
44	44.1	67	49
46	46.1	59	43
47	47.2	16	8
48	48.1	23	15
49	49.1	39	29
50	50.1	45	42
51	51.1	14	28
52	52.1	15	22
53	53.1	32	23
54	54.1	12	31
55	55.1	46	36
56	56.1	9	11
57	57.1	62	38
58	58.1	77	30
59	59.1	29	31
60	60.1	47	22
61	61.1	25	18
62	62.1	32	26
63	63.1	32	17
64	64.1	67	43
65	65.1	51	78
66	66.1	24	18
67	67.1	11	0,7
68	68.1	37	17
69	69.1	36	17
70	70.1	23	12
71	71.1	34	15
72	72.1	16	15
73	73.1	16	14
74	74.1	17	8
75	75.1	29	13
76	76.1	74	43
77	77.1	58	13
80	80.1	127	98
81	81.1	119	104
83	83.1	49	49
84	84.1	52	31
85	85.1	29	10
86	86.1	13	5
87	87.1	32	28
88	88.1	29	15
89	89.1	28	16
90	90.1	21	14
91	91.1	74	53
92	92.1	76	51
93	93.1	40	22
94	94.1	33	20
95	95.1	10	31
96	96.1	49	35
97	97.1	34	20
98	98.1	16	21
99	99.1	66	43
100	100.1	51	21
101	101.1	87	66
102	102.1	52	32
103	103.1	49	24
104	104.1	79	51
106	106.1	71	49
108	108.1	47	32
109	109.1	59	48
111	111.1	66	41
A	A	21	28

化合物A = SEQ ID NO 232

實例 4 . 在 U251 及 ARPE19 細胞株中以劑量反應曲線測試所選擇化合物之活體外濃度及功效。 U251及ARPE19細胞株分別描述於實例1及3中。如實例1中所描述進行U251分析。如下進行ARPE19分析：在由供應商所推薦之培養基(除了5% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種5000個ARPE19細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞2小時。寡核苷酸濃度：自50 μM，半對數稀釋，8個點。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA提取、cDNA合成及qPCR如實例1中所描述進行。n=2個獨立生物複本。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA含量展示為對照(PBS)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	ARPE19	U251
EC50 (µM)	KD最大值處mRNA含量	EC50 (µM)	KD最大值處mRNA含量
19	19.2	2.3	54	0.6	3
31	31.2	2.3	12	0.40	0.2
37	37.1	4.0	11	0.46	0.2
38	38.2	7.4	19	0.70	0.2
47	47.2	4.6	8	0.62	0.2
23	23.1	6.8	25	0.80	1
35	35.1	3.5	4	0.38	0.1

實例 5. 在 U251 及 ARPE19 細胞株中以劑量反應曲線測試所選擇化合物之活體外濃度及功效。 如實例3中所描述進行分析。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。分別針對U251及ARPE19，n=2及n=1個獨立生物複本。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA含量展示為對照(PBS)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	ARPE19	U251
EC50 (µM)	KD最大值處mRNA含量	EC50 (µM)	KD最大值處mRNA含量
31	31.2	3.2	15	0.90	0.38
37	37.1	11	22	1.3	0.75
47	47.2	2.8	13	0.89	0.83
35	35.1	2.6	8.3	0.79	0.40
85	85.1	8.2	24	0.48	3.6
90	90.1	3.3	16	0.50	2.2
95	95.1	0.55	28	1.0	4.1
98	98.1	1.7	24	0.86	4.5
30	30.1	1.2	20	1.00	2.2
32	32.1	1.7	22	1.6	1.4
26	26.1	1.1	14	1.4	0.45
33	33.1	0.75	28	0.66	0.63
34	34.1	0.44	21	0.80	0.35
36	36.1	5.2	28	1.1	0.80
52	52.1	2.1	28	1.1	1.1
54	54.1	0.79	25	0.62	1.4
72	72.1	2.9	33	0.71	1.7
70	70.1	1.9	36	0.52	1.5
74	74.1	0.78	24	0.35	1.1
73	73.1	0.78	11	0.59	0.33
75	75.1	1.7	22	0.60	0.80
86	86.1	1.7	6.5	0.47	0.65
67	67.1	0.59	4.3	0.38	0.23
A	A	6.5	24	1.2	3.6
B	B	8.1	30	0.79	4.2

化合物A = SEQ ID NO 232 化合物B = SEQ ID NO 233

實例 6 . 在 U251 細胞株中以劑量反應曲線測試所選擇化合物之活體外濃度及功效。 如實例3中所描述進行分析。寡核苷酸濃度：自50 µM，半對數稀釋，8個點。n=2個獨立生物複本。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA含量展示為對照(PBS)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	U251
EC50 (µM)	KD最大值處mRNA含量
38	38.1	3.3	3
78	78.1	0.58	2
31	31.2	1.2	0.4
37	37.1	1.6	0.6
47	47.2	0.91	0.6
35	35.1	0.52	0.3
39	39.1	0.82	3
40	40.1	1.3	4
45	45.1	0.89	3
51	51.1	2.7	2
56	56.1	2.7	1
60	60.1	2.1	1
37	37.2	8.0	24
31	31.3	2.8	10
35	35.2	1.3	4
47	47.3	0.86	4
60	60.2	1.3	3
26	26.1	0.52	1
73	73.1	0.24	0.7
86	86.1	0.27	0.9
67	67.1	0.46	0.2
A	A	1.1	3.1
B	B	1.2	3.3

實例 7 . 在 U251 細胞株中以劑量反應曲線測試所選擇化合物之活體外濃度及功效。 ARPE19細胞株描述於實例3中。針對分析，在饑餓培養基(如由供應商推薦之培養基，除1%FBS而非10%以外)中在96多孔盤中以100 µL接種ARPE19細胞、24000個細胞/孔。在添加溶解於PBS中之寡核苷酸之前，培育細胞2小時。寡核苷酸濃度：自50 μM，半對數稀釋，8個點。在添加寡核苷酸化合物第4天及7天之後，將無寡核苷酸之75 μL新鮮饑餓培養基添加至細胞(在不移除舊培養基之情況下)。RNA萃取、cDNA合成及qPCR如實例3中所描述進行。n=2個獨立生物複本。將表中之50 µM下之EC50值及剩餘HTRA1 mRNA含量展示為對照(PBS)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	ARPE19
EC50 (µM)	KD最大值處mRNA含量
30	30.1	0.31	1
33	33.1	0.60	0.5
35	35.1	0.58	1
35	35.2	2.7	4
36	36.1	0.97	2
37	37.1	1.0	4
40	40.1	3.8	21
45	45.1	1.6	3
56	56.1	5.8	2
67	67.1	0.84	1
73	73.1	0.36	2
86	86.1	0.59	4
90	90.1	0.75	5
95	95.1	0.74	3
A	A	1.3	1.9
B	B	0.84	1.5

實例 8. 在人類初級 RPE 細胞中測試活體外功效。 人類初級視網膜色素上皮(hpRPE)細胞購自Sciencell (目錄號6540)。針對分析，在培養基(EpiCM，Sciencell目錄號4101)中在層黏連蛋白(層黏連蛋白521，BioLamina目錄號LN521-03)塗佈之96多孔盤中接種5000個hpRPE細胞/孔。其藉由此培養基擴增一週，且使用以下培養基分化2週：補充有N1補充劑(Sigma目錄號N-6530)、麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素(Sigma目錄號G-1146)、非必需胺基酸(NEAA，Sigma目錄號M-7145)、牛磺酸(Sigma目錄號T-0625)、氫皮質酮(Sigma目錄號H-03966)、三碘-甲狀腺胺酸(Sigma目錄號T-5516)及牛血清白蛋白(BSA，Sigma目錄號A-9647)之MEM α培養基(Sigma目錄號M-4526)。細胞在37℃下具有5% CO2之含濕氣培育箱中培養。

在實驗當天，細胞用新鮮分化培養基培育1小時，隨後添加寡核苷酸。此等寡核苷酸溶解於PBS中且在第0天及第4天塗覆在細胞上。在第7天，改變培養基，且在第10天，以具有β-氫硫基-乙醇(Qiagen目錄號79216)之50 µl RLT緩衝液收集細胞。RNA之萃取根據Qiagen RNeasy微型套組(目錄號74104；批號151048073)之使用者手冊進行，該微型套組包括脫氧核糖核酸酶I處理(目錄號79254；批號151042674)。RNA品質控制藉由Agilent生物分析儀奈米套組(Agilent；目錄號5067-1511；批號1446)進行。總RNA逆轉錄成cDNA (cDNA合成)使用基於無規六聚體寡核苷酸之高容量cDNA逆轉錄套組，根據製造商說明(Thermo Fisher Scientific，目錄號4368814，批號00314158)進行。cDNA樣品之量測以一式三份在7900HT 即時PCR儀器(Thermo Fisher Scientific)上在384孔盤形式中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1及Hs00170197_m1，管家基因，GAPDH，Hs99999905_m1及PPIA，Hs99999904_m1，來自Life Technologies。n=3個生物複本。將圖4及下表中之剩餘HTRA1 mRNA表現量展示為對照(細胞)之百分比。

SEQ ID NO	CMP ID NO	mRNA 含量
50µM	10µM	1µM
37	37.1	32	60	77
35	35.1	9	20	64
85	85.1	22	49	46
90	90.1	22	39	61
95	95.1	20	47	74
98	98.1	14	27	55
30	30.1	19	41	75
32	32.1	14	25	53
26	26.1	21	39	73
33	33.1	18	70	58
34	34.1	16	35	63
52	52.1	13	31	61
54	54.1	7	20	53
72	72.1	7	18	56
70	70.1	8	18	53
74	74.1	3	12	40
73	73.1	13	13	65
75	75.1	7	15	55
86	86.1	8	27	70
67	67.1	8	27	77
A	A	31	57	72

實例 9. 食蟹獼猴活體內藥代動力學及藥力學研究，治療 21 天，玻璃體內 (IVT) 注射，單次劑量。 針對在位置53113-53384之間靶向人類HTRA1前體mRNA中之「熱點」的3種HTRA1 LNA寡核苷酸，在視網膜中在mRNA下及在視網膜及玻璃體中在蛋白質含量下觀測阻斷基因表現(參見圖5)。

動物所有實驗皆對食蟹獼猴(Macaca fascicularis)進行。

在各組研究中包括四隻動物，總共20隻。

化合物及給藥過程 丁基原啡因鎮痛在測試化合物注射之前及兩天之後投與。動物藉由肌肉內注射氯胺酮及甲苯噻嗪麻醉。在研究第1天在局部施用四卡因(tetracaine)麻醉劑之後在麻醉動物兩個眼中均玻璃體內投與測試物件及陰性對照(PBS) (每次投與50 μL)。

安樂死 在活體階段結束時(第22天)，所有猴藉由腹膜內注射過度劑量戊巴比妥安樂死。

寡核苷酸含量量測及藉由 qPCR 之 Htra1 RNA 表現之量化 緊接在安樂死之後，在冰上快速且謹慎地解剖出眼組織且儲存於-80℃下直至運送為止。視網膜樣品溶解於700 μL MagNa純96 LC RNA分離組織緩衝劑中，且藉由每2 ml管添加1個不鏽鋼珠粒，使用precellys evolution均質機均質化2 × 1.5 min，隨後在RT下培育30 min。樣品以13000 rpm離心5 min。保留一半用於生物分析，且針對另一半直接繼續RNA萃取。

對於生物分析，將樣品稀釋10-50倍用於藉由雜交ELISA方法之寡核苷酸含量量測。生物素標記之LNA擷取探針及地高辛(digoxigenin)-共軛LNA偵測探針(兩者均為35 nM於5×SSCT中，各者與待偵測之LNA寡核苷酸之一個末端互補)與經稀釋之勻漿或相關之標準物混合，在RT下培育30分鐘，且隨後添加至抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidine)塗佈之ELISA盤(Nunc目錄號436014)。

盤在室溫下培育1小時，在2×SSCT (300 mM氯化鈉、30 mM檸檬酸鈉及0.05% v/v Tween-20，pH 7.0)中洗滌。所擷取之LNA雙螺旋使用與鹼性磷酸酶共軛之抗DIG抗體(Roche Applied Science目錄號11093274910)及鹼性磷酸酶受質系統(Blue Phos受質，KPL產品碼50-88-00)偵測。寡核苷酸複合物之量在Biotek讀取器上量測為615 nm下之吸光度。

對於RNA提取，在MagNA純96系統中藉由程式：Tissue FF標準LV3.1根據製造商說明使用細胞RNA大容量套組(05467535001，Roche)，包括脫氧核糖核酸酶處理。RNA品質控制及濃度用Eon讀取器(Biotek)量測。RNA濃度在整個樣品中標準化，且後續cDNA合成及qPCR在一步反應中使用qScript XLT一步RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100 (Quanta Biosciences)進行。在singplex反應中使用以下TaqMan引子分析：Htra1，Mf01016150_，Mf01016152_m1及Rh02799527_m1及管家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1及Rh01058485_m1，及ARL1，Mf02795431_m1，來自Life Technologies。qPCR分析在ViiA7機器(Life Technologies)上執行。眼/組：n=3隻眼。各眼視為單獨樣品。將相對Htra1 mRNA表現量展示為對照(PBS)之百分比。

組織學 移除眼球且固定於10%中性緩衝福馬林中24小時，修整且包埋於石蠟中。

針對ISH分析，經福馬林固定、石蠟包埋之4 μm厚視網膜組織切片使用完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色模組(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152)使用RNAscope 2.5 VS 探針-Mmu-HTRA1，REF 486979，Advanced Cell Diagnostics, Inc.處理。所使用色原體係堅牢紅(Fastred)，蘇木精II對比染色。

使用盤基免疫沈澱質譜 (IP-MS) 方法之 HTRA1 蛋白質量化 樣品製備，視網膜 視網膜在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之4個體積(w/v)之RIPA緩衝液(50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%脫氧膽酸，1% NP-40，1mM EDTA，Millipore)中使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)

樣品製備，玻璃體 玻璃體液(300 μl)用具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA，Roche)之5 × RIPA緩衝液(最終濃度：50 mM 參-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.25%脫氧膽酸，1% NP-40，1mM EDTA)稀釋，且使用Precellys 24 (5500，15 s，2次循環)均質化。將勻漿離心(13,000 rpm，3 min)且測定上清液之蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質分析)

盤基 HTRA1 免疫沈澱及胰蛋白酶分解 96孔盤(Nunc MaxiSorp)塗佈有抗HTRA1小鼠單株抗體(R&D MAB2916，於50 μl PBS中500 ng/孔)且在4℃下培育隔夜。盤用PBS (200 μl)洗滌兩次，且在20℃下藉由於PBS中之3% (w/v) BSA阻斷30 min，隨後兩次PBS洗滌。使樣品(於50 μl PBS中75 μg視網膜、100 μg玻璃體)隨機化且添加至盤，隨後在振盪器(150 rpm)上在4℃下隔夜培育。盤隨後用PBS洗滌兩次且用水洗滌一次。隨後將於50 mM TEAB (30 μl)中之10 mM DTT添加至各孔，隨後在20℃下培育1 h，以減少半胱胺酸硫氫基。隨後將於50 mM TEAB (5 μl)中之150 mM碘乙醯胺添加至各孔，隨後在20℃下在暗處培育30 min，以便阻斷半胱胺酸硫氫基。將10 μl分解溶液添加至各孔(最終濃度：1.24 ng/μl胰蛋白酶，20 fmol/μl BSA肽，26 fmol/μl同位素標記之HTRA1肽，1 fmol/μl iRT肽，Biognosys)，隨後在20℃下培育隔夜。

藉由定向質譜 ( 選擇反應監測， SRM) 之 HTRA1 肽量化 質譜分析在耦接至TSQ Quantiva三重四極質譜儀(Thermo Scientific)之Ultimate RSLCnano LC上進行。樣品(20 μL)直接自96孔盤注射用於IP，且在加樣緩衝液(0.5% v/v甲酸，2% v/v ACN)中以5 μL/min持續6 min裝載於Acclaim Pepmap 100阱管柱(100 μm × 2 cm，C18，5 μm，100 Å，Thermo Scientific)上。肽隨後在PepMap Easy-SPRAY分析型管柱(75 μm × 15 cm，3 μm，100 Å，Thermo Scientific)上分解，其中積體電噴射發射器使用以下梯度以250 nL/min之速率加熱至40℃：6 min，98%緩衝液A (2% ACN，0.1%甲酸)，2%緩衝液B (ACN + 0.1%甲酸)；36 min，30%緩衝液B；41 min，60%緩衝液B；43 min，80%緩衝液B；49 min，80%緩衝液B；50 min，2%緩衝液B。TSQ Quantiva在SRM模式下用以下參數操作：循環時間，1.5 s；噴射電壓，1800 V；碰撞氣體壓力，2毫托(mTorr)；Q1及Q3解析度，0.7 FWHM；離子轉移管溫度300℃。針對HTRA1肽「LHRPPVIVLQR」及同位素標記(L-[U-13C, U-15N]R)合成型式(其使用內標)獲取SRM躍遷。使用Skyline 3.6版進行資料分析。

西方墨點法 0.5 Precellyses管(CK14_0.5ml，Bertin Technologies)中之解剖視網膜樣品經裂解且在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA蛋白酶-抑制劑微型，11 836 170 001，Roche)之RIPA溶胞緩衝液(20-188，Milipore)中均質化。添加至0.5 Precellyses管(CK14_0.5ml，Bertin Technologies)中之玻璃體樣品經裂解且在具有蛋白酶抑制劑(完全無EDTA蛋白酶-抑制劑微型，11 836 170 001，Roche)之1/4 × RIPA溶胞緩衝液(20 - 188，Milipore)中均質化。

樣品(視網膜20 µg蛋白質，玻璃體40 µg蛋白質)關於4-15%梯度凝膠(#567-8084 Bio-Rad)在還原條件下分析且使用來自Bio-Rad之Trans-Blot Turbo Device轉移至Nitrocellulose (#170-4159 Bio-Rad)。

初級抗體：家兔抗人類HTRA1 (SF1)為Sascha Fauser (University of Cologne)所贈，小鼠抗人類Gapdh (#98795 Sigma-Aldrich)。二級抗體：山羊抗家兔800CW及山羊抗小鼠680RD來自Li-Cor。

墨點經成像且在來自Li-Cor之Odyssee CLX上分析。

實例 10 - 食蟹獼猴活體內評定：前房液中之 HTRA1 蛋白質測定及與視網膜中之 HTRA1 mRNA 及蛋白質抑制的比較 實驗方法：參見上文實例。採用前房液樣品，且樣品根據實例9製備為玻璃體液樣品。食蟹獼猴前房液樣品(AH)以分析方法上之大小類分析分析：毛細電泳法系統(Peggy Sue^TM ，Proteinsimple)。

將樣品解凍且未經稀釋使用。對於量化，重組型HTRA1-S328A突變(Origene #TP700208)。如由提供者所描述製備。

初級家兔抗人類HTRA抗體SF1由教授Dr.Sascha Fauser提供且稀釋1:300使用。所有其他試劑來自Proteinsimple。

樣品以技術一式三份處理，校準曲線一式兩份地使用12-230 kDa分離模組。峰值下之區使用Xlfit (IDBS軟體)計算及分析。

結果

圖號	化合物 ID	mRNA_視網膜	蛋白質_視網膜	蛋白質_AH
PBS	-	82	101	95
PBS	-	107	99	118
# 15,3	B	56	73	51
# 15,3	B	52	53	68
# 17	# 73,1	23	41	47
# 17	# 73,1	26	44	44
# 18	# 86,1	32	29	44
# 18	# 86,1	23	28	64
# 19	# 67,1	34	39	44
# 19	# 67,1	34	61	42

注意-圖12-14中所展示之化合物ID利用不同編號系統作為實例之其餘部分。上表與用於先前實例及本文中其他處之圖號相比提供編號使用圖12-14之關鍵。

圖12A展示以化合物B及#73,1投與之猴的前房液中之HTRA1蛋白質含量之觀測，樣品在注射後第3、8、15及22天取得。圖12B提供用於計算HTRA1蛋白質含量之校準曲線。圖12C提供在注射後對照時間標繪之個別動物之前房液的所計算之HTRA1含量。

圖13說明前房液中之HTRA1蛋白質的含量與視網膜中之HTRA1 mRNA的含量之間的直接相關性。前房液HTRA1蛋白質含量可因而用作HTRA1視網膜mRNA含量或HTRA1視網膜mRNA抑制之生物標記。

圖14說明視網膜中之HTRA1蛋白質含量與前房液中的HTRA1蛋白質含量之間亦存在相關性，儘管在此實驗中，相關性並不如視網膜中之HTRA1 mRNA抑制與前房液中的HTRA1蛋白質含量之間的相關性一樣強，指示前房液HTRA1蛋白質含量其適合作為HTRA1 mRNA拮抗劑之生物標記。

圖 1. 在U251細胞株中以5 µM篩選n=231 HTRA1 LNA寡核苷酸庫。剩餘HTRA1 mRNA表現量藉由qPCR來量測且展示為對照(經PBS治療之細胞)之百分比。位於位置53113-53384之間的n = 10寡核苷酸為相對活性的。圖 2. 在U251細胞株中以5 µM篩選n = 210 HTRA1 LNA寡核苷酸庫。剩餘HTRA1 mRNA表現量藉由qPCR來量測且展示為對照(經PBS治療之細胞)之百分比。位於位置53113-53384之間的n=33個寡核苷酸為相對活性的。圖 3. 在U251及ARPE19細胞株中分別以5及25 µM篩選n=305 HTRA1 LNA寡核苷酸庫。剩餘HTRA1 mRNA表現量藉由qPCR來量測且展示為對照(經PBS治療之細胞)之百分比。位於位置53113-53384之間的n=95個寡核苷酸與其餘部分相比為相對活性的。圖 4. 在以LNA寡核苷酸治療人類初級RPE細胞治療10天時之HTRA1 mRNA含量的劑量回應。亂序的為具有不與Htra1標靶序列相關之亂序序列的對照寡核苷酸。圖 5A-G. NHP PK/PD研究，IVT投與，25 µg/眼。A)藉由qPCR在視網膜中量測之HTRA1 mRNA含量。B)藉由寡核苷酸ELISA在視網膜中量測寡核苷酸含量。C)藉由ISH說明之HTRA1 mRNA含量。D-E)藉由IP-MS分別量化視網膜及玻璃體中之HTRA1蛋白質含量。點展示個別動物之資料。誤差條展示技術重複(n=3)之標準差。F-G)分別藉由西方墨點說明之視網膜及玻璃體中之HTRA1蛋白質含量減少。圖 6. 本發明之化合物(化合物ID NO 67,1)。化合物可呈醫藥鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。圖 7. 本發明之化合物(化合物ID NO 86,1)。化合物可呈醫藥鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。圖 8. 本發明之化合物(化合物ID NO73,1)。化合物可呈醫藥鹽之形式，諸如鈉鹽或鉀鹽。圖 9. 化合物67,1醫藥鹽之實例：M+為適合陽離子，通常為陽性金屬離子，諸如鈉或鉀離子。陽離子與寡核苷酸陰離子之化學計量比將視所使用陽離子之電荷而定。適合地，陽離子具有一個、兩個或三個正電荷(可使用M⁺ 、M⁺⁺ 或M⁺⁺⁺ )。出於說明性目的，與二價陽離子(諸如Ca²⁺ )相比，需要兩倍的單+電荷陽離子(單價)，諸如Na⁺ 或K⁺ 。圖 10. 化合物86,1之醫藥鹽之實例：對於陽離子M⁺ 之描述參見圖9之圖例。圖 11. 化合物73,1之醫藥鹽之實例：對於陽離子M⁺ 之描述參見圖9之圖例。圖 12A. 將化合物#15,3及#17玻璃體內投與於食蟹獼猴中，且在注射後第3、8、15及22天時收集前房液樣品。藉由毛細電泳法使用Peggy Sue裝置(Protein Simple)分析來自未經稀釋之樣品的蛋白質。使用訂製多株家兔抗血清檢測HTRA1。呈現來自動物#J60154 (媒劑)、J60158 (C.Id#15,3)、J60162 (C.Id#17)之資料。圖 12B. 藉由與經純化重組型(S328A突變) HTRA1蛋白質(Origene, #TP700208)比較來量化信號強度。此處展示校準曲線。圖 12C. 上圖：將來自個別動物之所計算HTRA1前房液濃度相對於注射後時間標繪。下圖：確定在每個時間點時媒劑組之平均HTRA1濃度及所計算經治療動物中之對應相對濃度。空心圓：個別值，實心圓：組平均值。指示第22天HTRA1減少百分比。圖 13. 相對於用靶向HTRA1轉錄之各種LNA分子治療的食蟹獼猴中之前房液(藍色菱形)或視網膜(紅光方形)中之HTRA1蛋白質含量標繪HTRA1 mRNA。值表達為與PBS對照組標準化之百分比。圖 14. 前房液中之HTRA1蛋白質與(A)視網膜中之HTRA1蛋白質及(B)用靶向HTRA1轉錄的各種LNA分子治療之食蟹獼猴中之視網膜中的HTRA1 mRNA之相關性。值表達為與PBS對照組標準化之百分比。圖 15. 補體系統之示意圖(來自Morgan等人, Nat. Rev. Drug Discovery 2015)。

Claims

一種反義寡核苷酸，其選自TTCtatctacgcaTTG (SEQ ID NO 67)、CTTCttctatctacgcAT (SEQ ID NO 73)及TACTttaatagcTCAA (SEQ ID NO 86)之群，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，LNA C為5-甲基C，小寫字母為DNA核苷，且所有核苷間鍵聯為硫代磷酸酯核苷間鍵聯。
如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為TTCtatctacgca TTG (SEQ ID NO 67)。
如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為CTTCttctatcta cgcAT (SEQ ID NO 73)。
如請求項1之反義寡核苷酸，其中該反義寡核苷酸為TACTttaatagc TCAA (SEQ ID NO 86)。
一種如請求項1至4中任一項之反義寡核苷酸之用途，其用於製造供治療地圖狀萎縮之藥劑，其中該藥劑用於與另一治療劑組合治療。
如請求項5之用途，其中該另一治療劑為血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑治療劑。
如請求項6之用途，其中VEGF拮抗劑治療劑為抗VEGF抗體或抗VEGF適體(aptamer)。
如請求項6之用途，其中該VEGF拮抗劑治療劑為VEGF之小分子抑制劑。
如請求項5之用途，其中該另一治療劑為補體系統之拮抗劑(補體靶向療法)，諸如補體因子D拮抗劑、補體因子B拮抗劑、補體因子C5拮抗劑、補體因子C3拮抗劑、補體因子P(備解素(properdin))拮抗劑、補體因子I拮抗劑及補體因子H拮抗劑。
如請求項9之用途，其中補體系統之拮抗劑為補體因子D之拮抗劑，諸如抗補體因子D抗體、補體因子D之小分子抑制劑。
如請求項9之用途，其中補體系統之拮抗劑為補體因子C之拮抗劑，諸如補體因子B之寡核苷酸抑制劑。
如請求項11之用途，其中該另一治療劑為包含與SEQ ID NO 242完全互補之至少14個連續核苷酸之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列包含經修飾之核苷。
如請求項11之用途，其中該另一治療劑為包含序列ATCCCACGCCCCTGTCCAGC (SEQ ID NO 243)之反義寡核苷酸。
如請求項9之用途，其中該補體系統之拮抗劑為備解素之拮抗劑，諸如抗備解素抗體。
如請求項9之用途，其中補體系統之拮抗劑為補體因子C3之拮抗劑，諸如C3之環狀肽抑制劑。
如請求項9之用途，其中補體系統之拮抗劑為補體因子C5之拮抗劑，諸如抗C5抗體。
如請求項9之用途，其中補體系統之拮抗劑為補體因子C5、補體因子B或補體因子D之寡核苷酸抑制劑。
如請求項5之用途，其中該另一治療劑為抗血小板衍生生長因子(PGDF)，諸如抗PGDF抗體或PGDF之適體抑制劑。