TW202039575A

TW202039575A - 新穎之抗ｃｃｒ８抗體

Info

Publication number: TW202039575A
Application number: TW108148111A
Authority: TW
Inventors: 児玉舞; 高橋竜也; 小野田順二; 今井直; 中村悦男; 古川健太郎; 宮内継夫; 吉田哲也; 柳樂盛男; 田中淳; 大倉永也; 坂口志文; 和田尚; 河嶋厚成
Original assignee: 日商鹽野義製藥股份有限公司; 國立大學法人大阪大學
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2019-12-27
Publication date: 2020-11-01
Also published as: EP3903817A1; JP6894086B2; CA3124332A1; KR20210108996A; SG11202106214YA; BR112021011431A2; AU2019415395A1; MX2021007576A; JP2024059872A; SA521422394B1; EP3903817A4; JPWO2020138489A1; CN113260381A; WO2020138489A1; JP7452818B2; JP2021101710A; US20220064312A1

Abstract

本發明係揭示新穎之抗CCR8抗體。該抗體可用於治療或預防癌症等。

Description

新穎之抗CCR8抗體

本發明係有關新穎之抗CCR8抗體及含有該抗體之醫藥組成物。

以腫瘤微環境內之調節性T細胞(Treg細胞)當媒介之免疫抑制作為代表之強力之負調節機構，係對於腫瘤之治療造成重大之障礙(非專利文獻1)。

例如，浸潤於腫瘤之CD4陽性Treg細胞，係有強力阻礙抗腫瘤免疫反應之可能性，可能對於有效的癌症治療造成很大之障礙。

CD4陽性FoxP3陽性Treg細胞當媒介之腫瘤免疫抑制，係已被動物腫瘤模型所充分證實，會藉由除去包含腫瘤內之全身性Treg細胞而獲得抗腫瘤效果，但另一方面，亦有報告指出在除去50%左右之腫瘤內浸潤Treg細胞時則未見有效果(非專利文獻2)。

另有報告指出，關於人類，在以肺、乳房及卵巢腫瘤為代表之各種癌症病患之腫瘤內，有檢測出全CD4陽性T細胞集團中之CD4陽性CD25陽性Treg細胞比(包含Treg細胞之細胞集團)的增大，並且，存在比與病患生存率呈現負相關(非專利文獻3至8)。

使用抗CD25抗體而從腫瘤內除去CD4陽性CD25陽性Treg細胞，藉此而確認到抗腫瘤效果。但是，由於CD25亦會表現於CD4陽性CD25陽性Treg細胞及另經活化之效應T細胞(effector cell)之細胞表面，故難言是專一性地除去Treg細胞。此外，對於小鼠，藉由投予抗CD25抗體而得之抗腫瘤效果是有限定性的，只有於腫瘤移植前投予抗體才會顯示治療效果，各種腫瘤模型皆已證明在將腫瘤植入小鼠後才投予抗體之情況下幾乎無治療效果。於移植後第1天才開始投予抗CD25抗體之情況下，抗腫瘤效果減弱，於移植後第2天以後才開始投予之情況下，幾乎未見到抗腫瘤效果(非專利文獻9)。

至今，以除去Treg細胞為目的，雖實施了對於小鼠投予抗CD25抗體之藥效試驗，惟幾乎無報告顯示有抗腫瘤效果，非常難以確認由移植後投予抗體所導致之除去Treg細胞之抗腫瘤治療效果(非專利文獻10)。

CCR8係亦被稱為CY6、CKR-L1或TER1之在胸腺或脾臟等表現之G蛋白共軛型七次穿膜型之CC趨化因子受體蛋白質，其基因係於人類染色體而存在於3p21。人類CCR8係由355個胺基酸所構成(非專利文獻11)。己知CCL1為對於CCR8之內因性配位基(非專利文獻12)。人類CCR8 Cdna係由Genbank ACC No.NM_005201.3表示之鹼基序列所構成，小鼠CCR8 cDNA係由Genbank ACC No.NM_007720.2表示之鹼基序列所構成。

CCR8亦專一性地表現於腫瘤內浸潤Treg細胞，在將乳癌細胞移植至CCR8缺損小鼠及野生型小鼠時，相較於野生型小鼠，CCR8缺損小鼠中之乳癌之增殖及轉移係顯示受到抑制(專利文獻1及非專利文獻13)。再者，已揭示藉由對於癌症模型動物投予抗CCR8抗體而顯示抗腫瘤效果(專利文獻2及3)。

專利文獻4揭示有用於治療過敏性疾病及HIV感染之抗CCR8抗體。該文獻已揭示414B、414C、414E、433H、459M、464A、464B、433B及455AL表示之抗CCR8抗體。該等之中，BD生物科學公司(BD Bioscience)有販售433H之抗CCR8抗體。惟未揭示該抗體之CDR序列。此外，未揭示抗CCR8抗體係具有抗腫瘤活性而有用於治療癌症。

於非專利文獻14揭示3B10、2D10及5B11表示之抗CCR8抗體。此外，BioLegend公司有販售產品編號L263G8之抗CCR8抗體。R & D公司有販售產品編號191704之抗CCR8抗體。惟未揭示該抗體之CDR序列。另外，未揭示抗CCR8抗體係具有抗腫瘤活性而有用於治療癌症。

專利文獻5及非專利文獻15至19記載CCR8會參與癌症之病態。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]美國專利第10087259號說明書

[專利文獻2]國際公開第2018/181425號

[專利文獻3]國際公開第2018/112032號

[專利文獻4]國際公開第2007/044756號

[專利文獻5]國際公開第2017/198631號

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Nat. Rev. Immunol., 2006年，第6卷，第4號，p.295-307

[非專利文獻2]Eur. J. Immunol., 2010年，第40卷，p.3325-3335

[非專利文獻3]J. Clin. Oncol., 2006年，第24卷，p.5373-5380

[非專利文獻4]Nat. Med., 2004年，第10卷，p.942-949

[非專利文獻5]J. Clin. Oncol., 2007年，第25卷，p.2586-2593

[非專利文獻6]Cancer, 2006年，第107卷，p.2866-2872

[非專利文獻7]Eur. J. Cancer, 2008年，第44卷，p.1875-1882

[非專利文獻8]Cell. Mol. Immunol.2011年，第8卷，p.59-66

[非專利文獻9]Cancer Res., 1999年，第59卷，第13號，p.3128-33

[非專利文獻10]Cancer Res., 2010年，第70卷，第7號，p.2665-74

[非專利文獻11]J. Immunol., 1996年，第157卷，第7號，p.2759-63

[非專利文獻12]J. Biol. Chem., 1997年，第272卷，第28號，p.17251-4

[非專利文獻13]Cancer Res., 2016年，第76卷，第4號，Supp.1,P4-04-11

[非專利文獻14]J. Exp. Med., 2004年，第200卷，第10號，p1231-1241

[非專利文獻15]Immunity, 2016年，第45卷，p1122-1134

[非專利文獻16]Immunity, 2016年，第45卷，p1135-1147

[非專利文獻17]Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2018年，第115卷，第45號，p10672-10681

[非專利文獻18]Targeting of CCR8 induces antitumor activity as a monotherapy that is further enhanced in combination with a Listeria-based immunotherapy, ASCO 2018, Daniel O Villarreal, et al. https：//www.advaxis.com/wp-content/uploads/2018/04/KeystonePosterCCR8-combo-posterFINAL.pdf

[非專利文獻19]Cancer Res., 2018年，第78卷，第18號，p5340-5348

本發明之目的為提供新穎之抗CCR8抗體或其抗體片段。再者，提供可作為癌症治療藥而利用之新穎之抗CCR8抗體或其抗體片段。

本發明人等經過深入研究，結果發現一種單株抗體，其係專一性結合於人類CCR8，並阻礙CCR8與CCR8配位基之結合。此外，發現可將辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸的單株抗體或其抗體片段用於阻礙CCR8與CCR8配位基之結合。再者，發現本發明之單株抗體具有抗腫瘤活性，可用於治療癌症。另外，發現辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸的單株抗體或其抗體片段係具有抗腫瘤活性，可用於治療癌症。亦即，本發明之單株抗體或其抗體片段可用於阻礙CCR8 與CCR8配位基之結合。再者，本發明之單株抗體或其抗體片段可作為中和抗體使用。

本發明係關於以下事項。

(1)一種抗體或其抗體片段，其係結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，其辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸。

(2)如(1)所述之抗體或其抗體片段，其為中和抗體。

(3)如(1)或(2)所述之抗體或其抗體片段，其更進一步辨識序列編號1表示之胺基酸序列第94位至107位中之1個以上之胺基酸。

(4)如(1)至(3)中任一項所述之抗體或其抗體片段，其更進一步辨識序列編號1表示之胺基酸序列第172位至202位中之1個以上之胺基酸。

(5)如(1)至(4)中任一項所述之抗體或其抗體片段，其辨識序列編號1表示之胺基酸序列第20位之異白胺酸、第22位之絲胺酸、第35位之賴胺酸(lysine)、第181位之白胺酸、第183位之半胱胺酸及第188位之天冬醯胺(asparagine)中之1個以上之胺基酸。

(6)如(1)至(5)中任一項所述之抗體或其抗體片段，其為人類化單株抗體或其抗體片段。

(7)一種抗體或其抗體片段，其係結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)或6)：

1)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號2之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號3之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號4之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號5之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號6之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號7之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

2)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號8之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

3)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號9之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號10之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號11之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

(此處，亦可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第2位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第3位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第5位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺(asparagine)置換序列編號10之胺基酸序列第2位之麩醯胺(glutamine)，

E)以絲胺酸置換序列編號8之胺基酸序列第1位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第14位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第18位之賴胺酸，

H)以麩胺酸(glutamic acid)置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸(aspartic acid)，

I)以麩醯胺置換序列編號11之胺基酸序列第5位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號11之胺基酸序列第12位之酪胺酸)；

4)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號12之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號13之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

5)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號14之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號15之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號16之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號17之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號18之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號19之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；或

6)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號20之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號21之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號22之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號23之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號24之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號25之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3。

(8)如(7)所述之抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)或6)：

1)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號4之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號5之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號7之胺基酸序列構成之CDR3，

(此處，亦可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號3之胺基酸序列第5位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第4位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第6位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第16位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸)；

2)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號4之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號8之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號7之胺基酸序列構成之CDR3；

3)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號9之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號10之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號8之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號11之胺基酸序列構成之CDR3；

4)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號10之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號12之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號13之胺基酸序列構成之CDR3；

5)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號14之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號15之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號16之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號17之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號18之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號19之胺基酸序列構成之CDR3；或

6)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號20之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號21之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號22之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號23之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號24之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號25之胺基酸序列構成之CDR3。

(9)如(8)所述之抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號4之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號5之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號7之胺基酸序列構成之CDR3；

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號3之胺基酸序列第5位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第4位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第6位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第16位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸。

(10)如(9)所述之抗體或其抗體片段，其具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺。

(11)如(9)或(10)所述之抗體或其抗體片段，其中，序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺係以麩醯胺置換，

再者，亦可具有以下之任1種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸。

(12)如(11)所述之抗體或其抗體片段，其中，序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺係以麩醯胺置換，再者，序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸係以精胺酸置換。

(13)如(8)所述之抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號9之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號10之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號8之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號11之胺基酸序列構成之CDR3；，

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第2位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第3位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第5位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號10之胺基酸序列第2位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號8之胺基酸序列第1位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第14位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第18位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號11之胺基酸序列第5位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號11之胺基酸序列第12位之酪胺酸。

(14)如(7)至(13)中任1項所述之抗體或抗體片段，其為人類化單株抗體或其抗體片段。

(15)如(14)所述之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列，或與序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成；

該重鏈可變區域係由序列編號41或46之胺基酸序列，或與序列編號41或46之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成。

(16)如(14)或(15)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)、6)、7)、8)、9)、10)、11)或12)：

1)具有序列編號40之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

2)具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

3)具有序列編號43之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

4)具有序列編號44之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

5)具有序列編號45之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

6)具有序列編號47之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

7)具有序列編號40之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

8)具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

9)具有序列編號43之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

10)具有序列編號44之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

11)具有序列編號45之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，或

12)具有序列編號47之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第59位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第97位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第99位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號41或46之胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號41或46之胺基酸序列第68位之天冬胺酸。

(17)如(16)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其具有1種以上之下述之任一種置換：

(18)如(17)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域，及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第59位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第97位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第99位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號41之胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號41之胺基酸序列第68位之天冬胺酸。

(19)如(17)或(18)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域，以及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，該輕鏈可變區域及重鏈可變區域具有1種以上之下述之任1種置換：

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺。

(20)如(17)至(19)中任1項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域，以及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺；

再者，亦可具有以下之任1種置換：

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第34位之甘胺酸。

(21)如(20)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，以麩醯胺置換序列編號42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，以精胺酸置換序列編號42之胺基酸序列第34位之甘胺酸。

(22)如(20)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號59之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域。

(23)如(14)所述之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號54、55或56之胺基酸序列，或與序列編號54、55或56之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成；

該重鏈可變區域係由序列編號57或58之胺基酸序列，或與序列編號57或58之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成。

(24)如(14)或(23)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)、6)：

1)具有序列編號54之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域，

2)具有序列編號55之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域，

3)具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域，

4)具有序列編號54之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域，

5)具有序列編號55之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域，或

6)具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第25位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第26位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第28位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第95位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第31位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第63位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第67位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第68位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號57或58之胺基酸序列第99位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第105位之酪胺酸。

(25)如(24)所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，亦可具有1種以上之下述之任1種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第25位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第26位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第28位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號56之胺基酸序列第95位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第31位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第63位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第67位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第68位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號57之胺基酸序列第99位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第105位之酪胺酸。

(26)如(14)至(25)中任1項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其更包含：具有序列編號52之胺基酸序列之輕鏈恒定區域、及具有序列編號53之胺基酸序列之重鏈恒定區域，

並且，可於序列編號53之C末端加成或不加成賴胺酸。

(27)一種醫藥組成物，其含有(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段。

(28)一種醫藥組成物，其含有(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段係用於阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合。

(29)一種醫藥組成物，其含有(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段係作為中和抗體使用。

(30)一種醫藥組成物，其含有(1)至(26)中任1項所述之結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段係用於辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸。

(31)如(30)所述之醫藥組成物，其係用於阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合。

(32)如(27)至(31)中任1項所述之醫藥組成物，其中，抗體具有ADCC活性者。

(33)如(27)至(31)中任1項所述之醫藥組成物，其中，抗體為IgG抗體。

(34)如(27)至(33)中任1項所述之醫藥組成物，其係用於治療癌症。

(35)一種多核苷酸，其編碼(7)至(18)中任1項所述之抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域。

(36)一種表現載體，其含有(35)所述之多核苷酸。

(51)一種結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，其辨識由如(7)至(19)中任1項所述之抗體所辨識之抗原上之部位。

(55)如(51)所述之抗體或其抗體片段，其為中和抗體。

(53)如(51)或(52)所述之抗體或抗體片段，其為人類化單株抗體或其抗體片段。

(54)一種單株抗體或其抗體片段，其對於人類CCR8具有中和活性，並且，關於與人類CCR8之結合，其係與「如(7)至(26)中任1項所述之抗體」競爭。

(55)一種單株抗體或其抗體片段，其對於人類CCR8具有中和活性，並且，關於與人類CCR8之結合，其係與「包含具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域的抗體」競爭。

(56)一種單株抗體或其抗體片段，其辨識與「包含具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域的抗體的抗原表位(epitope)」為全部或部分性相同之抗原表位。

(57)一種單株抗體或其抗體片段，其對於人類CCR8具有中和活性，並且，關於與人類CCR8之結合，其係與「包含具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，並以麩醯胺置換序列編號42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，且以精胺酸置換序列編號42之胺基酸序列第34位之甘胺酸的抗體」競爭。

(58)一種單株抗體或其抗體片段，其辨識與「包含具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，並以麩醯胺置換序列編號42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，且以精胺酸置換序列編號42之胺基酸序列第34位之甘胺酸的抗體的抗原表位」為全部或部分性相同之抗原表位。

(59)如(54)至(58)中任1項所述之單株抗體或抗體片段，其係辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸的抗體或其抗體片段。

(60)如(59)所述之抗體或其抗體片段，其更進一步辨識序列編號1表示之胺基酸序列第94位至第107位中之1個以上之胺基酸。

(61)如(59)或(60)所述之抗體或其抗體片段，其更進一步辨識序列編號1表示之胺基酸序列第172位至第202位中之1個以上之胺基酸。

(62)如(59)至(61)中任1項所述之抗體或其抗體片段，其辨識序列編號1表示之胺基酸序列第20位之異白胺酸、第22位之絲胺酸、第35位之賴胺酸、第181位之白胺酸、第183位之半胱胺酸及第188位之天冬醯胺中之1個以上之胺基酸。

(63)如(54)至(62)中任1項所述之單株抗體或抗體片段，其為人類化單株抗體或其抗體片段。

(64)一種醫藥組成物，其含有上述(54)至(63)中任1項所述之單株抗體或其抗體片段。

(71)如(1)至(5)或(7)至(13)中任1項所述之抗體或其抗體片段，其產生會產生抗體之融合瘤，該融合瘤係以人類CCR8基因作為抗原而製作。

(81)一種單株抗體或抗體片段，其係結合於人類CCR8之單株抗體或其抗體片段(惟以下之抗體除外)，並辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸：

a)WO2007/044756所記載之414B、414C、414E、433H、459M、464A、464B、433B及455AL表示之抗CCR8抗體，

b)Qu人等之論文(J.Exp.Med.,(2004),200(10),1231-1241)所記載之3B10、2D10及5B11表示之抗CCR8抗體，

c)BioLegend公司之產品編號L263G8之抗CCR8抗體，

d)R & D公司之產品編號191704之抗CCR8抗體。

(91)一種阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合的方法，係使用(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段。

(92)一種癌症的治療方法，係投予(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段。

(93)一種辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸的方法，係使用(7)至(26)中任1項所述之結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段。

(94)一種(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段的用途，係用以製造阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合的藥劑。

(95)一種(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段的用途，係用以製造癌症的治療劑。

(96)一種(1)至(26)中任1項所述之結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段的用途，係用以製造辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸的藥劑。

(97)如(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段，其係用於阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合。

(98)如(1)至(26)中任1項所述之抗體或其抗體片段，其係用於治療癌症。

(99)如(1)至(26)中任1項所述之結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，其係用於辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸。

由於本發明之單株抗體或其抗體片段係專一性結合於人類CCR8，因此，可用於檢測生體試料中之人類CCR8。再者，由於本發明之單株抗體或其抗體片段具有選擇性阻礙人類CCR8之活性，因此，含有本發明之單株抗體或其抗體片段之醫藥組成物在作為醫藥品時，尤其是在作為治療或預防人類CCR8相關疾病之醫藥時為非常有用。

第1圖係將人類CCR8、人類CCR4及相當於人類CCR8之細胞外區域之N末端區域、loop1區域、loop2區域或loop3區域，與經置換為各自對應之人類CCR4之N末端區域、loop1區域、loop2區域或loop3區域之各嵌合體之胺基酸序列加以比較。

第2圖係10A11、27G1、1H4、19D7、8F7及2C7之輕鏈可變區域之Kabat numbering及比對(alignment)結果。

第3圖係10A11、27G1、1H4、19D7、8F7及2C7之重鏈可變區域之Kabat numbering及比對結果。

第4圖係10A11之輕鏈可變區域、IGKV4-1、IGKV3-20、IGKV1-39、IGKV2-40、IGKV2-28及IGKV1-16之Kabat numbering及比對結果。

第5圖係10A11之重鏈可變區域、IGHV3-15 T94R及IGHV3-73之Kabat numbering及比對結果。

第6圖係19D7之輕鏈可變區域、IGKV3-15、IGKV2-18及IGKV3-20之Kabat numbering及比對結果。

第7圖係19D7之重鏈可變區域、IGHV3-15 T94R及IGHV3-73之Kabat numbering及比對結果。

第8圖係針對經移植有源自大腸癌之CT26細胞的人類CCR8敲入小鼠，藉由測定移植後之腫瘤體積，來評估抗人類CCR8抗體之抗腫瘤活性。顯著水準**係根據Welch’s t test而**表示p<0.01，***表示p<0.001。

於本說明書中使用之用語，除非特別提及，不然即為於該領域通常使用之意思。

於本發明中，可利用於該領域公知之抗體製作手法。可列舉例如Immunochemistry in Practice(Blackwell Scientific Publiations)中記載之方法等。

此外，可利用於該領域公知之基因操作手法。可列舉例如Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Forth Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)、Current Protocols Essential Laboratory Techniques,Current Protocols(2012)中記載之方法等。

人類CCR8之胺基酸序列，係表示於UniProtKB/Swiss-Prot：P51685(序列編號1)。人類CCR8之膜外區域，係由第1至35位胺基酸構成之N末端區域、由第94至107位胺基酸構成之loop1區域、由第172至202位胺基酸構成之loop2區域、由第264至280位胺基酸構成之loop3區域。人類CCR8之胺基酸序列中之第17位為酪胺酸，小鼠CCR8之胺基酸序列中之第17位為缺損。本發明之單株抗體或其抗體片段係如實施例3之表2所示，對於小鼠CCR8不具有結合活性。

關於針對小鼠CCR8之單株抗體，BioLegend公司有販售抗體SA214G2。該抗體具有小鼠CCR8之中和活性。本發明人等已確認該抗體對於人類CCR8未顯示結合活性，不會辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸。此外，亦確認該抗體會辨識小鼠CCR8之胺基酸序列第27位之苯基丙胺酸，關於針對小鼠CCR8之中和活性之表現，該胺基酸為重要之胺基酸。小鼠CCR8之胺基酸序列第27位之胺基酸，係在比對上為相當於人類CCR8之胺基酸序列第29位之胺基酸。人類CCR8之胺基酸序列第29位之胺基酸為白胺酸。依據此差異，認為對於小鼠CCR8具有中和活性之單株抗體係對於人類CCR8未顯示結合活性。

產生本發明之抗CCR8抗體之融合瘤，可藉由以人類CCR8蛋白質、編碼人類CCR8全長之基因、人類CCR8表現細胞等作為免疫原而製作之。以編碼人類CCR8全長之基因作為免疫原時，例如，可藉由使以該基因作為抗原而DNA免疫之小鼠之脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，而獲得產生抗CCR8抗體之融合瘤。

關於本發明單株抗體或其抗體片段之1種態樣，可列舉本說明書所述之具有CDR或重鏈可變區域/輕鏈可變區域之單株抗體或該抗體之片段。該抗體或抗體片段可源自免疫球蛋白分子之任意等級(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA。較佳為IgG)或亞等級，可由包含例如小鼠、大鼠、鯊魚、兔子、豬、倉鼠、駱駝、大羊駝、山羊或人類之任意種類而取得。該抗體或抗體片段較佳為人類化單株抗體或人類化單株抗體之抗體片段。

本說明書中，抗原表位係指藉由以其抗原作為標的之抗體而結合之抗原之區域，抗原為蛋白質時，則包含直接與抗體接觸之特定胺基酸。本發明不僅包含辨識與本發明之單株抗體或其抗體片段為完全相同之抗原表位的單株抗體或其抗體片段，而且亦包含辨識部分性相同之抗原表位的單株抗體或其抗體片段。

本發明之單株抗體或其片段為會辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸，且為結合於人類CCR8之單株抗體或其抗體片段。

再者，上述之單株抗體或其抗體片段中，較佳為以下之單株抗體或其抗體片段：

一種結合於人類CCR8之單株抗體或其抗體片段，其辨識相當於人類CCR8之loop1的該胺基酸序列第94位至107位中之1個以上之胺基酸；

，一種結合於人類CCR8之單株抗體或其抗體片段，其辨識相當於人類CCR8之loop2的該胺基酸序列第172位至第202位中之1個以上之胺基酸；

一種結合於人類CCR8之單株抗體或其抗體片段，其辨識人類CCR8之胺基酸序列第20位之異白胺酸、第22位之絲胺酸、第35位之賴胺酸、第181位之白胺酸、第183位之半胱胺酸及第188位之天冬醯胺中之1個以上之胺基酸。

此處，於上述之較佳情況下，亦可辨識任意選自上述表示之抗原表位中之複數個抗原表位。此外，本發明之單株抗體或其抗體片段亦可更進一步辨識人類CCR8之胺基酸序列中之上述胺基酸以外之胺基酸。

本發明之單株抗體，只要是能辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸者即可，並無特別限制，在1種態樣中，本發明之單株抗體之CDR序列較佳為具有以下之序列：

(1)輕鏈CDR1：序列編號2、14或20，

(2)輕鏈CDR2：序列編號3、9、15或21，

(3)輕鏈CDR3：序列編號4、10、16或22，

(4)重鏈CDR1：序列編號5、8、12、17或23，

(5)重鏈CDR2：序列編號6、18或24，

(6)重鏈CDR3：序列編號7、11、13、19或25。

更佳為具有以下之序列：

(1)輕鏈CDR1：序列編號2，

(2)輕鏈CDR2：序列編號3或9，

(3)輕鏈CDR3：序列編號4或10，

(4)重鏈CDR1：序列編號5、8或12，

(5)重鏈CDR2：序列編號6，

(6)重鏈CDR3：序列編號7、11或13。

最佳為具有以下之序列：

(1)輕鏈CDR1：序列編號2，

(2)輕鏈CDR2：序列編號3，

(3)輕鏈CDR3：序列編號4，

(4)重鏈CDR1：序列編號5，

(5)重鏈CDR2：序列編號6，

(6)重鏈CDR3：序列編號7。

此外，於上述之各胺基酸序列(序列編號2至25)中，可有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成。

此處，於本發明之單株抗體之CDR序列中，可以麩醯胺或賴胺酸置換天冬醯胺，以麩胺酸置換天冬胺酸，以異白胺酸置換白胺酸，以苯基丙胺酸置換酪胺酸，以蘇胺酸置換絲胺酸，以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換甘胺酸。

較佳可具有1種以上之下述之任意置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號3之胺基酸序列第5位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第4位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第6位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第16位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸。

更佳可具有1種以上之下述之任意置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺。

特佳為以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺，

再者，可具有1種以上之下述之任意置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

此外，本發明之單株抗體在具有以下之序列時，

(1)輕鏈CDR1：序列編號2，

(2)輕鏈CDR2：序列編號9，

(3)輕鏈CDR3：序列編號10，

(4)重鏈CDR1：序列編號8，

(5)重鏈CDR2：序列編號6，

(6)重鏈CDR3：序列編號11，

亦可具有1種以上之下述之任意置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第2位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第3位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第5位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號10之胺基酸序列第2位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號8之胺基酸序列第1位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第14位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第18位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號11之胺基酸序列第5位之天冬醯胺，

於本發明中，「單株抗體之抗體片段」係指本發明之單株抗體之一部分，並且其係與該單株抗體同樣地專一性結合於人類CCR8且選擇性阻礙人類CCR8之片段。本發明之單株抗體之抗體片段會辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸。

具體而言，可列舉例如對於人類CCR8為專一性結合之Fab(抗原結合片段，fragment of antigen binding)、Fab’、F(ab’)₂、單鏈抗體(single chain Fv；以下標記為scFv)、二硫化物安定化抗體(disulfide stabilized Fv；以下標記為dsFv)、二聚物V區域片段(以下標記為Diabody)、含有CDR之肽等(Expert Opinion on Therapeutic Patents，第6卷，第5號，第441至456頁，1996年)。

Fab為分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段，其係藉由將在IgG鉸鏈區域交聯有2支H鏈之2個雙硫鍵(S-S鍵)之上部之肽部分以酵素木瓜蛋白酶進行分解而獲得，並且由H鏈N末端側約一半及L鏈全體所構成。本發明所使用之Fab，可藉由將本發明之單株抗體進行木瓜蛋白酶處理而獲得。此外，亦可藉由將編碼本發明單株抗體之Fab的DNA插入至細胞用表現載體中，將該載體導入至細胞並表現，而製造Fab。

Fab’為藉由將F(ab’)₂鉸鏈間之S-S鍵切斷而成之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。本發明所使用之Fab’，可藉由將本發明之單株抗體之F(ab’)₂進行還原劑二硫蘇糖醇處理而獲得。此外，亦可藉由將編碼本發明單株抗體之Fab’的DNA插入至細胞用表現載體中，將該載體導入至大腸菌、酵母或動物細胞中並表現，而製造Fab’。

F(ab’)₂為分子量約10萬之具有抗原結合活性之抗體片段，其係藉由將IgG之鉸鏈區域之2個S-S鍵之下部以酵素胃蛋白酶進行分解而獲得，並且2個Fab’區域是以鉸鏈部分進行結合而構成。本發明所使用之F(ab’)₂，可藉由將本發明之單株抗體進行胃蛋白酶處理而獲得。此外，可藉由將編碼本發明單株抗體之F(ab’)₂的DNA插入至細胞用表現載體中，將該載體導入至大腸菌、酵母或動物細胞中並表現，而製造F(ab’)₂。

scFv為具有抗原結合活性之抗體片段，其係藉由將1支VH與1支VL使用適當之肽連接鏈(peptide linker，以下標記為P)而連結成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽。本發明所使用之scFv中所含有之VH及VL，只要是本發明之單株抗體即可。本發明所使用之scFv，亦可藉由使用編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA來構築表現scFv之載體，將其導入至大腸菌、酵母或動物細胞中並表現，而製造之。

dsFv為將多肽經由S-S鍵而結合者，其中係將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換成半胱胺酸殘基。關於要被置換成半胱胺酸殘基之胺基酸殘基，可依照Reiter人等所示之方法(Protein Engineering,7,697(1994))，依據抗體之立體構造預測而加以選擇。本發明所使用之dsFv中含有之VH或VL，只要是本發明之單株抗體即可。本發明所使用之dsFv，可藉由使用編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA，插入至適當之表現載體中來構築表現dsFv之載體，將該表現載體導入至大腸菌、酵母或動物細胞中並表現，而製造之。

Diabody為由抗原結合專一性相同或不同之scFv形成二聚物而成之之抗體片段，且為具有對於相同抗原之2價抗原結合活性或對於不同抗原之2種專一性抗原結合活性的抗體片段。例如，對於本發明之單株抗體為專一性反應之2價之Diabody，係可藉由使用編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA，來構築編碼具有3至10個殘基之肽連接鏈的scFv的DNA，將該DNA插入至細胞用表現載體中，將該表現載體導入至大腸菌、酵母或動物細胞中並表現Diabody，而製造之。

含有CDR之肽，係由含有VH或VL之CDR之至少1個區域以上而構成。複數個CDR可直接或經由適當之肽連接鏈而結合。本發明所使用之含有CDR之肽，可藉由使用編碼本發明單株抗體之VH及VL的cDNA來構築編碼CDR之DNA，將該DNA插入至動物細胞用表現載體中，將該載體導入至大腸菌、酵母或動物細胞中並表現，而製造之。此外，含有CDR之肽可藉由Fmoc法(茀甲氧基羰基法)、tBoc法(第三丁氧基羰基法)等化學合成法而製造之。

本發明之單株抗體或其抗體片段之特徵為結合於人類CCR8。較佳為專一性結合者。

專一性結合之特徵可為至少約1×10^-6M以下之平衡解離常數(例如Kd越小，則表示更緊密結合)。Kd值較佳為1×10^-7M以下，更佳為1×10^-8M以下，特佳為1×10^-9M以下。關於測定2個分子是否有專一性結合之方法，係於該技術領域為周知，可列舉競爭ELISA法、表面電漿子共振(surface plasmon resonance)及同樣者。

本發明中，關於對於人類CCR8之結合，包含與本說明書中記載之單株抗體或其抗體片段競爭之單株抗體或其抗體片段。

「競爭之單株抗體或其抗體片段」係指阻礙本發明之單株抗體或其抗體片段(較佳為本說明書之實施例所述之抗體。更佳為10A11。例如一種抗體，其包含：具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；一種抗體，其包含：具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，並且以麩醯胺置換序列編號42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，以精胺酸置換序列編號42之胺基酸序列第34位之甘胺酸)專一性結合於人類CCR8的抗體或其抗體片段。決定某一單株抗體或其抗體片段是否與本發明之單株抗體或其抗體片段競爭。在經確認於同型對照組抗體(Isotype control antibody)共存下與抗原(人類CCR8)結合之抗體中，可將「於本發明單株抗體或其抗體片段共存下之結合訊號顯著降低之抗體」鑑定為與本發明之單株抗體或其抗體片段競爭之抗體。該結合訊號之降低較佳為50%，更佳為70%。此外，「與本發明之單株抗體或其抗體片段競爭之抗體」的相對於「該本發明之單株抗體或其抗體片段與抗原之結合」之Ki值較佳為1×10^-7M以下，更佳為1×10^-8M以下，再更佳為1×10^-9M以下。

由如此操作而獲得之與本發明之單株抗體或其抗體片段競爭之抗體之人類CCR8之中和活性，較佳為IC50值為10nM以下。

本發明之單株抗體或其抗體片段之特徵為阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合。「CCR8配位基」只要是CCL1、CCL8、CCL18等結合於CCR8之物質即可，並無特別限制，較佳為CCL1、CCL18，更佳為CCL1。

關於CCR8與CCR8配位基之結合阻礙能力，例如若為人類CCL1，則使用人類CCR8表現293細胞，測定因添加人類CCL1所致之Ca²⁺流入，以未添加人類CCL1時之訊號作為阻礙率100%，並以添加人類CCL1及未添加抗體時之訊號作為阻礙率0%，計算IC50值而決定之。關於其他之CCR8配位基之結合阻礙能力，亦以與上述人類CCL1之情況相同之方式決定。

人類CCL1具有UniProtKB/Swiss-Prot No.P22362等表示之胺基酸序列。人類CCL8具有GenBank No.AAI26243.1等表示之胺基酸序列。人類CCL18具有GenBank No.EAW80102.1等表示之胺基酸序列。

本發明之單株抗體，可使用本說明書所述之CDR或重鏈可變區域/輕鏈可變區域並藉由該技術區域之常法而製作之。

本發明之單株抗體亦包含嵌合體、人類化、完全人類、抗體低分子複合體(ADC)及雙重專一性抗體。

人類化單株抗體係由於在人類體內之抗原性降低，故可在以治療為目的等投予於人類時使用。人類化單株抗體係藉由將人類以外之哺乳動物(例如小鼠)抗體之互補性決定區域(CDR；complementarity determining region)移植到人類抗體之框架區域(FR；framework region)而成者。因此，人類化單株抗體之FR係源自人類。適當之FR可參照Kabat E.A.人等文獻而加以選擇。此時之FR係選擇使CDR可形成良好之抗原結合部位者。必要時，可以使再構成之人類化單株抗體之CDR形成適當之抗原結合部位的方式，將抗體之可變區域之FR之胺基酸置換(Sato、K.人等，Cancer Res.1993年，第53卷，851頁)。經置換之FR之胺基酸之比例為全FR區域之0至15%，較佳為0至5%。

本發明之人類化單株抗體較佳為包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

該輕鏈可變區域係由序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列，或與序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成；

更佳為包含下述1)、2)、3)、4)、5)、6)、7)、8)、9)、10)、11)或12)：

並且，可具有1種以上之下述之任意置換：

再更佳為包含下述1)或2)：

1)具有序列編號40之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，或

2)具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，可具有1種以上之下述之任意置換：

G)以蘇胺酸置換序列編號41之胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號41之胺基酸序列第68位之天冬胺酸。

更佳為包含下述1)或2)：

1)具有序列編號40之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；或

並且，可具有1種以上之下述之任意置換：

最佳為包含下述1)或2)：

並且，以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

再者，可具有下述之任1種置換：

最佳為一種人類化單株抗體，其包含：具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；並且，以麩醯胺置換序列編號42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，以精胺酸置換序列編號42之胺基酸序列第34位之甘胺酸。

本發明之人類化單株抗體中之輕鏈可變區域及重鏈可變區域之序列，可列舉例如表1之組合。

此處，於上述表1之「置換之種類」中之各符號係分別意指以下之置換：

(1)具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域：

A)以賴胺酸置換胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B1)以麩醯胺置換胺基酸序列第34位之甘胺酸，

B2)以蘇胺酸置換胺基酸序列第34位之甘胺酸，

B3)以丙胺酸置換胺基酸序列第34位之甘胺酸，

B4)以賴胺酸置換胺基酸序列第34位之甘胺酸，

B5)以白胺酸置換胺基酸序列第34位之甘胺酸，

B6)以精胺酸置換胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換胺基酸序列第59位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換胺基酸序列第97位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換胺基酸序列第99位之酪胺酸；

(2)具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域：

G)以蘇胺酸置換胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換胺基酸序列第68位之天冬胺酸。

本發明之人類化單株抗體之其他態樣，係包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列，或與序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成，該胺基酸序列第26位為絲胺酸、第27位為賴胺酸、第30位為白胺酸、第98位為麩胺酸；

該重鏈可變區域係由序列編號41或46之胺基酸序列，或與序列編號41或46之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成，該胺基酸序列第33位為丙胺酸、第35位為酪胺酸、第52位為精胺酸、第56位為天冬醯胺、第62位為酪胺酸、第102位為精胺酸、第103位為苯基丙胺酸、第104位為酪胺酸、第109位為甘胺酸、第113位為天冬胺酸。

更佳為包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號40或42之胺基酸序列，或與序列編號40或42之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成，該胺基酸序列第26位為絲胺酸、第27位為賴胺酸、第30位為白胺酸、第98位為麩胺酸；

再較佳為包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號42之胺基酸序列，或與序列編號42之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成，該胺基酸序列第26位為絲胺酸、第27位為賴胺酸、第30位為白胺酸、第98位為麩胺酸；

更佳為包含下述1)、2)、3)、4)、5)、6)：

5)具有序列編號55之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域，

並且，可具有1種以上之下述之任意置換：

再較佳為包含：具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域；並且，可具有1種以上之下述之任意置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第25位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第26位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第28位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號56之胺基酸序列第95位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第31位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第63位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第67位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第68位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號57之胺基酸序列第99位之天冬醯胺，

此外，本發明之人類化單株抗體係使用人類抗體之恒定區域。較佳之人類抗體之恒定區域中，重鏈可列舉Cγ，例如Cγ1，Cγ2，Cγ3，Cγ4，輕鏈可使用Cκ、Cλ。另外，為了改善抗體或其產生之安定性，可將人類抗體之C區域加以修飾。人類化時所使用之人類抗體可為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何同型之人類抗體，惟於本發明中較佳為使用IgG，更佳為IgG1或IgG4。

本發明之人類化單株抗體可於重鏈恒定區域之C末端加成或未加成賴胺酸。較佳為具有序列編號52之胺基酸序列之輕鏈恒定區域及序列編號53之胺基酸序列之重鏈恒定區域，並且於序列編號53之C末端加成或未加成賴胺酸。

人類化單株抗體可藉由一般之製造方法製造(例如參照WO95/14041號公報、WO96/02576號公報等)。具體而言，首先，使用經製作成使末端部具有重疊部分之數個寡核苷酸，藉由PCR法，而合成編碼「經設計成使小鼠抗體之CDR與人類抗體之FR連結的可變區域」之DNA序列(參照WO98/13388號公報)。將獲得之DNA與編碼人類抗體之恒定區域的DNA連結，其次，編入至表現載體中。或是編碼抗體之可變區域的DNA編入至含有抗體之恒定區域之DNA的表現載體中。若欲製造本發明所使用之抗體，則要將抗體基因編入至表現載體中，以在表現控制區域(例如增強子/啟動子之控制處)表現。接著，藉由該表現載體將宿主細胞轉形，而可使抗體表現。

上述轉形體之宿主細胞可列舉例如COS細胞、CHO細胞等脊椎動物細胞、原核細胞、酵母等。轉形體可依照發明所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法進行培養，藉由該培養，在轉形體細胞內或細胞外產生本發明之單株抗體。該培養所使用之培養基，可對應所採用之宿主細胞而適當選擇慣用之各種培養基，例如為COS細胞時，可使用於RPMI-1640培養基或達爾伯克改良伊格爾最低限度必需培養基(Dulbecco's modified Eagles medium，DMEM))等培養基中，視需要時添加牛胎兒血清(FBS)等血清成分者。培養該轉形體時，培養溫度只要是不使細胞內之蛋白質合成能力顯著降低之溫度即可，較佳為32至42℃，更佳為於37℃進行培養。此外，可視需要而於含有1至10%(v/v)之二氧化碳氣體的空氣中進行培養。

含有如上述般在轉形體之細胞內或細胞外產生之本發明之單株抗體的區分(fraction)，可藉由利用該蛋白質之物理性質或化學性質等各種公知之分離操作法而分離/精製之。相關之方法，具體而言，可採用例如藉由通常之蛋白質沈澱劑所進行之處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析、高速液體層析(HPLC)等各種層析、透析法及該等之組合等。藉由該方法，可容易地以高收率、高純度製造本發明之單株抗體。

本發明之單株抗體或其抗體片段，可更進一步藉由聚乙二醇(PEG)、放射性物質、毒素等各種分子加以修飾。抗體之修飾方法可利用該領域公知之方法。

此外，就本發明之單株抗體而言，於其N末端或C末端可融合有其他蛋白質(Clinical Cancer Research,2004,10,1274-1281)。發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當選擇融合之蛋白質。

本發明之單株抗體中，包含在抗體之Fc區域結合有N-糖苷結合糖鏈之抗體。另外，於該N-糖苷結合糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺，可不結合岩藻糖。關於在抗體之Fc區域結合有N-糖苷結合糖鏈且於該N-糖苷結合糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺未結合有岩藻糖之抗體，可列舉例如使用缺損α1,6-岩藻糖轉移酵素基因之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)而製作之抗體。在抗體之Fc區域結合有N-糖苷結合糖鏈且於該N-糖苷結合糖鏈之還原末端之N-乙醯葡萄糖胺未結合有岩藻糖之本發明之抗體，係具有高ADCC活性。

本發明之單株抗體或其抗體片段，從除去Treg細胞或巨噬細胞之觀點而言，較佳為對於表現CCR8之細胞具有ADCC(Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity；抗體依存性細胞所媒介之細胞毒性)活性之抗體或其抗體片段。ADCC活性係指於生體內，標的細胞等之細胞表面抗原等上所結合之抗體，係藉由抗體之Fc區域與存在於作用細胞(effector cell)表面上之Fc受體的結合，將作用細胞予以活化，而傷害標的細胞等之活性。作用細胞可列舉自然殺手細胞、經活化之巨噬細胞等。此外，於本發明中，亦包含下述情況：於生體內，Treg細胞或巨噬細胞等之細胞表面抗原(CCR8)所結合之抗體，係藉由抗體之Fc區域與存在於作用細胞表面上之Fc受體之結合，將作用細胞予以活化，而傷害Treg細胞或巨噬細胞等，結果傷害腫瘤細胞等。

本發明之單株抗體或其抗體片段較佳為CCR8之中和抗體或中和抗體片段。所謂CCR8之中和抗體或中和抗體片段，係指對於CCR8具有中和活性之抗體或抗體片段。對於CCR8是否具有中和活性，例如可藉由測定是否會抑制CCR8配位基之任一者(例如CCL1)對於CCR8之生理作用來判定。關於其例子，可列舉測定CCL1對於CCR8之結合、或由CCL1所致之CCR8表現細胞之遊走、或對於細胞內Ca²⁺增加或CCL1刺激有感受性之基因之表現變動等，惟不只限於此等例。此外，可依據後述實施例所述之方法來測定之。

本發明之單株抗體或其抗體片段對於CCR8與CCL1之結合的中和活性，可藉由對於已預先攝入Ca²⁺指示劑之人類CCR8表現293細胞，添加經培養基稀釋之抗體稀釋液而測定之。關於CCR8與CCR8配位基之親和性，CCL1為最強，對於CCL1具有高阻礙活性之抗體為有用。

本發明之單株抗體或其抗體片段之中和活性較佳係IC50值為10nM以下。中和活性更佳係IC50值為5nM以下，又更佳為2nM以下，特佳為1nM以下，最佳為0.5nM以下。

於辨識人類CCR8之抗CCR8抗體或其抗體片段中，以強力辨識人類CCR8之抗體或其抗體片段為較佳。於選擇強力辨識人類CCR8之抗體或其抗體片段時，若以中和活性之強度作為指標來選擇抗體或其抗體片段，則可選擇更強力辨識人類CCR8之抗體或其抗體片段。

辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸的抗CCR8抗體或其抗體片段，會阻礙CCR8與CCL1之結合，有用於作為具有中和活性之抗CCR8抗體或其抗體片段。此外，於選擇更強力辨識人類CCR8之抗體或其抗體片段之觀點來看，較佳為中和活性高之抗體或其抗體片段。例如，較佳為如以下之抗體或其抗體片段：

更佳為一種抗體或其抗體片段，其除了辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸之外，更進一步辨識相當於人類CCR8之loop1之該胺基酸序列第94位至107位中之1個以上之胺基酸及/或相當於人類CCR8之loop2之該胺基酸序列第172位至202位中之1個以上之胺基酸；

此外，更佳為一種抗體或其抗體片段，其除了辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸之外，更進一步辨識人類CCR8之胺基酸序列第20位之異白胺酸、第22位之絲胺酸、第35位之賴胺酸、第181位之白胺酸、第183位之半胱胺酸及第188位之天冬醯胺中之1個以上之胺基酸。

關於辨識人類CCR8之抗體，已知有以下之抗體：

a)WO2007/044756記載之414B、414C、414E、433H、459M、464A、464B、433B及455AL表示之抗CCR8抗體；

b)Qu人等之論文(J.Exp.Med.,(2004),200(10),1231-1241)記載之3B10、2D10及5B11表示之抗CCR8抗體；

c)BioLegend公司之產品編號L263G8之抗CCR8抗體；

d)R & D公司之產品編號191704之抗CCR8抗體。

關於a)之抗CCR8抗體，WO2007/044756揭示藉由抗原表位解析而知其與人類CCR8之胺基酸序列第1位至39位結合。惟，對於詳細之抗原表位部位則完全未分析亦未揭示。

關於b)至d)之抗CCR8抗體，對於抗原表位部位完全未揭示。亦即，關於可將辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸的單株抗體或其抗體片段用於阻礙CCR8與CCR8配位基(例如CCL1)之結合一事，於任一文獻都未揭示亦未暗示。

本發明之單株抗體或其抗體片段較佳為具有除去腫瘤內浸潤Treg細胞之作用。關於本發明之單株抗體是否具有除去腫瘤內浸潤Treg細胞之作用，可依據例如專利文獻2之實施例所述之方法測定。

本發明之單株抗體或其抗體片段較佳為具有除去腫瘤內浸潤巨噬細胞之作用者。關於本發明之抗體或其抗體片段是否具有除去腫瘤內浸潤巨噬細胞之作用，可依據例如專利文獻2之實施例所述之方法測定。

本發明之單株抗體或其抗體片段係有用於作為醫藥組成物。尤其是辨識人類CCR8之胺基酸序列第17位之酪胺酸的單株抗體或其抗體片段係非常有用於作為醫藥組成物。因此，含有本發明之單株抗體或其抗體片段的醫藥組成物可以經口或非經口之方式對於全身或局部進行投予。非經口的投予可選擇例如點滴等靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、鼻腔內投予、吸入等。

本發明之醫藥組成物係非常有用於作為治療及/或預防CCR8相關疾病之醫藥。尤其是非常有用於作為治療及/或預防發生CCR8表現Treg細胞之腫瘤內浸潤的癌症之醫藥。例如，非常有用於作為治療及/或預防例如乳癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大腸癌、腎癌、非霍奇金氏淋巴瘤、泌尿上皮癌、肉瘤、血球癌(白血病、淋巴瘤等)、膽管癌、膽囊癌、甲狀腺癌、睪丸癌、胸腺癌、肝臟癌等癌症，較佳為乳癌、子宮癌、卵巢癌、肺癌、大腸癌、腎癌及肉瘤，更佳為乳癌、大腸癌、腎癌及肉瘤之醫藥。

本發明之「癌症治療用醫藥組成物」中之「癌症」包含所有之固形癌及血液癌。具體而言，可列舉乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、頭頸部鱗狀細胞癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大腸癌、腎癌、非霍奇金氏淋巴瘤、泌尿上皮癌、肉瘤、血球癌(白血病、淋巴瘤等)、膽管癌、膽囊癌、甲狀腺癌、睪丸癌、胸腺癌、肝臟癌等。較佳可列舉乳癌、子宮體癌、卵巢癌、肺癌、大腸癌、腎癌、肉瘤，更佳可列舉乳癌、肺癌、大腸癌、腎癌、肉瘤。

此外，本發明之「癌症治療用醫藥組成物」中之「癌症」較佳為表現腫瘤特異抗原之癌症。

另外，本說明書所述之「癌症」不僅意指卵巢癌、胃癌等上皮性之惡性腫瘤，亦意指包含慢性淋巴性白血病或霍奇金氏淋巴瘤等造血器癌之非上皮性之惡性腫瘤，於本說明書中，「癌症(cancer)」、「惡性腫瘤(carcinoma)」、「腫瘤(tumor)」、「贅生物(neoplasm)」等用語互相無區別，可互相交換。

本發明之單株抗體或其抗體片段為了下述三種目的而可與其他藥劑加以組合並作為併用劑投予：

(1)補齊及/或增強本發明之醫藥組成物之治療效果；

(2)針對本發明之醫藥組成物，改善其動態、吸收，或減低投予量；及/或

(3)減輕本發明之醫藥組成物之副作用。

由本發明之單株抗體或其抗體片段與其他藥劑所成之併用劑，可以將兩成分調配於1個製劑中之調配劑之形態來投予，亦可採用分別作成不同製劑而投予之形態。分別作成不同製劑而投予時，包含同時投予及有時間差之投予。此外，關於有時間差之投予，係可先投予本發明之單株抗體或其抗體片段後再投予其他藥劑，亦可先投予其他藥劑後再投予本發明之單株抗體或其抗體片段，各自之投予方法可相同亦可不同。

可與本發明之單株抗體或其抗體片段併用之其他藥劑係可列舉例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體。較佳為抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體，更佳為抗PD-1抗體。

於本發明中，抗PD-1抗體可列舉例如尼莫單抗(Nivolumab)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)。

於本發明中，抗PD-L1抗體可列舉例如阿特朱單抗(Atezolizumab)、阿維魯單抗(Avelumab)、度伐魯單抗(Durvalumab)。

於本發明中，抗CTLA-4抗體可列舉例如伊匹單抗(Ipilimumab)。

本發明之醫藥組成物之對象病患，係癌症病患或被認為有其疑慮者。本發明醫藥組成物之有效投予量，以每次每體重1kg計，係從0.01mg至100mg之範圍選擇。或是可選擇每位病患為5至5000mg(較佳為10至500mg)之投予量。惟，含有本發明之單株抗體或其抗體片段之醫藥組成物不只限於該等投予量。此外，投予期間可根據病患之年齡、症狀而適當選擇。依據投予路徑，本發明之醫藥組成物亦可一起含有醫藥上容許之擔載體或添加物。該等擔載體及添加物之例，可列舉水、醫藥上容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、海藻酸鈉、水溶性右旋糖酐、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、酪蛋白、二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人類血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為醫藥添加物而容許之界面活性劑等。使用之添加物可因應劑型而從上述例之中適當選擇組合，惟不只限於此等。

本發明包含編碼本發明單株抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域的多核苷酸。本發明更包含含有該多核苷酸之表現載體。

就該多核苷酸而言，只要編碼本發明單株抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域，即無特別限制，為由複數種去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等核苷酸所構成之聚合物。亦可含有天然以外之鹼基。本發明之多核苷酸，可用於以基因工學手法製造抗體。此外，為了篩選具有與本發明之單株抗體同等機能之抗體，可作為探針使用。亦即，使用編碼本發明單株抗體的多核苷酸或其一部分作為探針，藉由雜交、基因增幅技術 (例如PCR)等技術，獲得與該多核苷酸於嚴苛條件下雜交且編碼具有與本發明單株抗體同等活性之抗體的DNA。如此之DNA亦包含於本發明之多核苷酸中。

雜交技術(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2^nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)為發明所屬技術領域中具有通常知識者熟知之技術。雜交之條件可列舉例如低嚴苛條件。低嚴苛條件係指於雜交後之洗淨中例如42℃、0.1×SSC、0.1%SDS之條件，較佳為50℃、0.1×SSC、0.1%SDS之條件。更佳之雜交條件可列舉高嚴苛條件。高嚴苛條件係指例如65℃、5×SSC及0.1%SDS之條件。於該等條件下，溫度越上昇，越可期待有效率地獲得具有高相同性之多核苷酸。惟，關於影響雜交嚴苛性之要素，可認為是溫度或鹽濃度等複數種要素，只要是發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可適當選擇該等要素而實現同樣之嚴格性。

將藉由該等雜交技術或基因增幅技術而獲得之多核苷酸予以編碼且與本發明之單株抗體在機能性上為同等之抗體，通常與該等抗體在胺基酸序列中具有高的相同性。本發明之單株抗體中，包含與本發明之單株抗體在機能性上為同等且與該抗體之胺基酸序列具有高相同性之抗體。所謂高相同性，係指於胺基酸水平中通常至少有75%以上之同一性，較佳為85%以上之同一性，更佳為95%以上之同一性。若欲決定多肽之相同性，可依照文獻(Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80,726-730)所記載之演算法。

本發明之單株抗體或其抗體片段係因專一性結合於CCR8，故可用於檢測生體試料中之CCR8。生體試料可列舉血液、血漿、血清、尿、臟器、組織、骨髓、淋巴節等。因此，含有本發明之單株抗體之套組，可利用於作為CCR8檢測用套組。該套組包含本發明之單株抗體或其抗體片段，再者，亦可包含作為標識二次抗體、標識之檢測所需之基質、擔載體、洗淨緩衝液、試料稀釋液、酵素基質、反應停止液、作為經精製之標準物質的CCR8蛋白質、使用說明書等。

於本發明中，亦包含辨識本發明之單株抗體或其抗體片段所辨識之抗原上之部位且結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段。亦即，關於對於CCR8之結合，與本發明之單株抗體或其抗體片段競爭之單株抗體或其抗體片段亦包含於本發明中。例如，使用實施例3之clone No.10A11等抗體或於輕鏈及長鏈可變區域具有本說明書所述之CDR序列的抗體，藉由進行競爭實驗，可選擇上述抗體。

[實施例]

以下，列舉本發明之實施例以對本發明更進一步詳細說明，惟本發明不只限於該等例。

實施例1：製作產生抗人類CCR8抗體之小鼠融合瘤

將編碼人類CCR8(UniProtKB/Swiss-Prot：P51685)全長之基因作為抗原，對於A/J Jms Slc雌性小鼠進行DNA免疫。DNA免疫係以2週間隔而反覆進行2次或3次，於最終免疫1週後於腹腔內投予人類CCR8表現Expi293細胞而進行加強。在其3日後摘出脾臟，將脾臟細胞及小鼠骨髓瘤細胞(p3×6363-Ag8.、東京腫瘤研究所)使用PEG法進行融合，於含有次黃嘌呤、胺蝶呤及胸苷之培養基進行選擇。抗人類CCR8抗體及抗人類CCR8中和抗體係使用該培養上清液並藉由下述之方法進行選拔。

關於抗人類CCR8抗體，係使培養上清液分別與人類CCR8表現Expi293細胞及人類CCR4表現Expi293細胞進行反應，以Alexa488標識抗小鼠IgG抗體(賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司製造)進行檢測，選拔出只對於人類CCR8專一性結合之殖株(clone)。

關於抗人類CCR8中和抗體，係對於已預先攝入Ca²⁺指示劑之人類CCR8表現293細胞使培養上清液充分反應後，藉由FLIPR測定因添加200nM hCCL1(BioLegend公司製造)所致之Ca²⁺流入，選拔出會阻礙因hCCL1刺激所致之Ca²⁺流入的殖株。

將顯示特別強的中和活性之殖株(% inhibition>80%)與不具有中和活性之殖株予以分別選殖，樹立融合瘤。

實施例2：製作產生抗人類CCR8抗體之大鼠融合瘤

關於作為免疫原之人類CCR8表現Rat-1細胞，係藉由將在pQCXIP(Clontech公司製造)選殖有人類CCR8基因之表現載體轉染至Rat-1細胞後，以嘌呤黴素(Puromycin)(1ug/ml)於1個月間選擇藥劑而製作之。

將人類CCR8表現Rat-1細胞對於大鼠進行1次免疫，約2週後回收淋巴節，藉由常法製作融合瘤。

關於抗人類CCR8抗體，係使融合瘤培養上清液對於人類CCR8表現293細胞及293細胞分別進行反應，以Alexa647標識抗大鼠IgG抗體(賽默飛世爾科技公司製)進行檢測，選拔出對於人類CCR8可專一性結合之殖株。

實施例3：抗人類CCR8中和抗體及非中和抗體之抗原表位解析

對於實施例1所樹立之產生抗人類CCR8抗體之融合瘤，從無血清培養基的培養上清液中，藉由ProteinG精製及凝膠過濾精製而獲得40種殖株之精製抗體。在所獲得之40種殖株中，使用27種中和抗體及13種非中和抗體之精製抗體，藉由使用下述方法實施抗原結合試驗，而鑑定對於中和活性為重要之抗原表位。關於各殖株之中和活性，係以實施例1所述之方法，藉由FLIPR測定對於因添加100nM hCCL1(BioLegend公司製造)所致之Ca²⁺流入的阻礙活性。就各中和抗體而言，對於因100nM hCCL1刺激所致之Ca²⁺流入的阻礙活性的IC50值為2nM以下。

將編碼人類CCR8(UniProtKB/Swiss-Prot：P51685，序列編號1)全長之基因、及編碼人類CCR4(UniProtKB/Swiss-Prot：P51679，序列編號48)全長之基因、編碼小鼠CCR8(UniProtKB/Swiss-Prot：P56484，序列編號39)全長之基因，分別選殖至pcDNA3.4載體。藉由將此進行轉染，而製作暫時性表現人類CCR8、人類CCR4、小鼠CCR8之Expi293細胞。藉由將各殖株之精製抗體之稀釋系列與該細胞進行反應，以Alexa488標識抗小鼠IgG抗體(賽默飛世爾科技公司製)進行檢測，評估其結合性。結果，任一抗體皆會結合至人類CCR8，惟完全未結合至人類CCR4、小鼠CCR8。

此處，製作將相當於人類CCR8之細胞外區域的N末端區域(序列編號1之第1至35位胺基酸)、loop1區域(序列編號1之第94至107位胺基酸)、loop2區域(序列編號1之第172至202位胺基酸)、loop3區域(序列編號1之第264至280位胺基酸)置換成其對應之人類CCR4之N末端區域(序列編號48之第1至39位胺基酸)、loop1區域(序列編號48之第98至111位胺基酸)、loop2區域(序列編號48之第176至206位胺基酸)、loop3區域(序列編號48之第268至284位胺基酸)之嵌合體(第1圖)，藉由與上述方法相同之方法評估各抗體之結合性。

評估在5ug/mL、0.5ug/mL、0.05ug/mL時之結合，與野生型之人類CCR8(hCCR8)做比較，結合活性顯著低者係以△表示，結合降低至檢測極限以下者係以×表示。空白欄係指表示與野生型之人類CCR8(hCCR8)同程度之結合活性。

其結果如表2所示，具有中和活性之抗體係皆藉由將N末端區域置換成人類CCR4(N-ter hCCR4-hCCR8)而使其結合活性成為檢測極限以下，並且可明確得知N末端區域係在發揮中和活性上為重要之抗原表位。再者，對於loop1人類CCR4置換人類CCR8及loop2人類CCR4置換人類CCR8，結合活性亦降低。從以上之結果可認為，具有強力中和活性之抗CCR8抗體會強力辨識N末端區域，且進行也結合至loop1及loop2之立體構造辨識。

此外，使用不辨識人類CCR8、人類CCR4及小鼠CCR8之任一者的抗體作為對照組，對照組抗體不會與各抗原結合。另外，於各抗原之N末端賦予標籤，藉由檢測出抗標籤抗體，而確認CCR8之表示不會因變異而降低。

再者，對於具有強力中和之所有殖株，針對屬於共通之抗原表位區域的N末端區域作更詳細之解析，製作表2所示之人類CCR8點突變體。以與上述方法相同之方法評估各殖株對於此突變體之結合活性，結果，上述27種中和抗體，對於將人類CCR8之第17位之Y置換成A之突變體(hCCR8(Y17A))的結合活性皆顯著降低而成為檢測極限以下，因此，可認為係辨識第17位之Y。此外，表2僅顯示clone No.8F7，惟亦存在有複數個中和抗體其對於將人類CCR8之第20位之I置換成A之突變體(hCCR8(I20A))的結合活性降低，故可認為亦存在有會進行也結合至第20位之異白胺酸的立體構造辨識的中和抗體。

另一方面，由於上述13種非中和抗體對於hCCR8(Y17A)之結合活性未降低，故可認為雖辨識相同之N末端區域，但不辨識第17位之Y。由此可認為第17位之Y於發揮中和活性上為極重要的胺基酸。對於代表性之中和抗體(clone No.10A11,27G1,1H4,8F7,2C7)及非中和抗體(clone No.5B5)之結果係表示於表2。

[表2]

實施例4：抗體序列之決定

在所樹立之殖株中，對於表3表示之小鼠抗體及表4表示之大鼠抗體，藉由融合瘤細胞，依照常法決定抗體之輕鏈可變區域及重鏈可變區域之胺基酸序列。

[表3]

[表4]

實施例5：抗體序列之比對

對於實施例4記載之源自小鼠融合瘤的抗人類CCR8中和抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列，與使用抗體序列解析軟體abYsis之Kabat numbering實施比對(第2圖、第3圖)。結果，10A11、27G1、1H4、19D7，8F7之胺基酸序列係如下所述，為含有類似於CDR之序列者。

輕鏈之CDR1係由序列編號2之16個胺基酸所構成。

輕鏈之CDR2係由R-Xaa1-S-N-L-A-S(此處，Xaa1為M或V：序列編號49)之7個胺基酸所構成(序列編號3或9)。

輕鏈之CDR3係由M-Q-H-L-E-Y-P-Xaa1-T(此處，Xaa1為L或F：序列編號50)之9個胺基酸所構成(序列編號4或10)。

重鏈之CDR1係由Xaa1-Y-A-Xaa2-Y(此處，Xaa1為T或P，Xaa2為L或M：序列編號51)之5個胺基酸所構成(序列編號5、8或12)。

重鏈之CDR2係由序列編號6之19個胺基酸所構成。

重鏈之CDR3具有10A11、27G1、1H4共通之序列，由序列編號7之14個胺基酸所構成。

實施例6：中和活性評估

將所樹立之融合瘤以無血清培養基進行培養，將其培養上清液進行ProteinG親和層析精製及凝膠過濾精製，獲得精製抗體。對於該精製抗體，以下述方法測定中和活性。

對於預先攝入Ca²⁺指示劑之人類CCR8表現293細胞，添加經培養基稀釋之抗體稀釋液，藉由FLIPR測定因添加200nM hCCL1(BioLegend公司製造)所致之Ca²⁺流入。將未添加hCCL1時之訊號作為阻礙率100%，將有添加hCCL1及未添加抗體時之訊號作為阻礙率0%計算之，並將表示 50%阻礙率之抗體濃度作為IC50。進行至少3次評估，將IC50標記為Average±SD。(表5)

[表5]

實施例7：抗體之人類化(10A11、2C7)

對於10A11、2C7，以下述方法實施人類化。

使用抗體序列解析軟體abYsis，實施Kabat之numbering及CDR之定義。以序列解析軟體Absis查詢與小鼠抗體胺基酸序列之重鏈及輕鏈之V基因區域序列類似的人類生殖系受體序列，並選擇之。此外，對於J鏈區域，以IMGT(http：//www.imgt.org/)查詢與小鼠抗體DNA序列為相同性高之序列，作為人類框架序列。對於該人類框架序列，將經Kabat numbering(Wu，T.T.and Kabat,E.A.,J Exp.Med.Aug1；132(2)：211-50.(1970))所定義之小鼠抗體重鏈CDR1、CDR2、CDR3及小鼠抗體輕鏈CDR1、CDR2、CDR3進行移植，設計人類化單株抗體序列(輕鏈；第4圖、重鏈；第5圖)。藉由實施例6表示之方法測定中和活性，結果，表6表示之人類化單株抗體顯示與小鼠抗體同等以上之親和性。

[表6]

實施例7-2：抗體之人類化(19D7)

對於19D7，以與實施例7相同之方法實施人類化(輕鏈；第6圖、重鏈；第7圖)。藉由實施例6表示之方法測定中和活性，結果，表7表示之人類化單株抗體顯示與小鼠抗體同等以上之親和性。

[表7]

實施例8：對於人類化10A11之活性為重要之胺基酸的特定

對於第4圖及第5圖表示之人類化10A11，製作在相當於CDR之胺基酸中導入點變異之突變體，藉由實施例6表示之方法，算出各突變體之中和活性。對於各突變體進行複數次中和活性評估，將其IC50值以與WT之IC50值之比而標記為IC50 ratio(WT IC50/突變體IC50)。

結果表示於表8及表9。n.d.(=無法檢測(not detectable))係表示突變體之IC50值為測定系統之極限值10nM以上，活性降低至檢測極限以下。中和活性評估之結果，關於輕鏈，在由Kabat之numbering所測得之L26、L27、L27c、L93胺基酸部位具有變異之S26T、K27R、L27cI、E93D之各突變體係活性降低10倍以上(表8)。關於重鏈，在由Kabat之numbering所測得之H33、H35、H52、H53、H59、H96、H97、H98、H100c、H101 胺基酸部位具有變異之A33V、Y35F、R52K、N53Q、Y59F、R96K、F97L、Y98F、G100cA、D101E之各突變體係活性降低10倍以上(表9)。該等胺基酸係對於活性為極重要之胺基酸。

[表8]

[表9]

實施例8-2：對於人類化19D7之活性為重要之胺基酸的特定

對於第6圖及第7圖表示之人類化19D7，製作在相當於CDR之胺基酸中導入點變異之突變體，藉由實施例6表示之方法，算出各突變體之中和活性。對於各突變體進行複數次之中和活性評估，將該IC50值以與WT之IC50值之比而標記為IC50 ratio(WT IC50/突變體IC50)。

結果表示於表10及表11。n.d.(=無法檢測(not detectable)係表示突變體之IC50值為測定系統之極限值10nM以上，活性降低至檢測極限以下。

[表10]

[表11]

實施例9：人類化10A11之活性提升

在實施例7所發現之人類化框架中，將實施例8所發現之活性提升變異、以及相對於相當於脫醯胺化風險序列之由Kabat之numbering所測得之L28胺基酸部位之N及L29胺基酸部位之G的變異加以組合，進行人類化10A11之最佳化(optimisation)。結果，發現表12表示之人類化10A11突變體。

[表12]

實施例9-2：人類化19D7之活性提升

在實施例7-2所發現之人類化框架中導入點變異，進行人類化19D7之最佳化。結果，發現表13表示之人類化19D7突變體。

[表13]

實施例10：在腫瘤移植人類CCR8敲入小鼠(以下稱為hCCR8-KI(KI/KI)小鼠)中之抗人類CCR8抗體之抗腫瘤活性

(1)製作hCCR8-KI(KI/KI)小鼠

小鼠CCR8基因(Gene ID：12776)及人類CCR8基因(Gene ID：1237)皆為由2個外顯子所構成，於第2個外顯子內含有ORF(Open Reading Frame，開放閱讀框)全長。在移除小鼠CCR8基因之ORF(CCDS ID：23621.1)全長之同時，亦插入人類CCR8基因之ORF(CCDS ID：2684.1)全長，藉此而製作將表現之CCR8蛋白質予以完全人類化之hCCR8-KI(KI/KI)小鼠。

作為同源重組臂使用之DNA片段，係藉由將小鼠CCR8基因之ORF上流下流各約2kb(千鹼基)之小鼠基因組序列進行PCR增幅而取得，源自小鼠之基因組序列係設計成只移除ORF。於先前之人類CCR8基因之ORF 全長序列前後，將同源重組臂分別以無接縫的方式連接，藉此而製作靶向載體(targeting vector)，供於同源重組，製作hCCR8-KI(KI/+)Balb/c小鼠。對於製作之hCCR8-KI(KI/+)Balb/c小鼠，藉由PCR及DNA鹼基序列解析來確認小鼠CCR8基因之ORF全長與人類CCR8基因之ORF全長是否正確置換且無多餘之序列之插入或缺失。將hCCR8-KI(KI/+)Balb/c小鼠以通常交配而繁殖，製作hCCR8-KI(KI/KI)小鼠。

(2)確認在hCCR8-KI(KI/KI)小鼠中之大腸癌CT26細胞株腫瘤內浸潤細胞之人類CCR8表現

將3.5×10⁵個(50μL)之CT26細胞移植到hCCR8-KI(KI/KI)小鼠(6週齡、雌性)之背部皮內，於移植第17日時從5例之個體回收腫瘤(N=5)。將CT26細胞之腫瘤塊以剪刀切細，使用市售之套組(Tumor Dissociation Kit,mouse,Miltenyi公司製造及The gentleMACS(TM)Dissociator,Miltenyi公司製造)，依照附帶的套組指南(kit protocol)，製備腫瘤浸潤細胞。

製備之細胞係在通過70um之細胞過濾器後，以10mM HEPES/HBSS/2%FBS洗淨2次。然後，以紅血球溶解液(BD Biosciences公司製造)處理5分鐘，除去紅血球，更進一步以2%FBS/10mM HEPES/HBSS緩衝液洗淨2次。腫瘤浸潤細胞係藉由以下之方法及抗體進行染色。

於冰中，使用Zombie NIR Fixable Viability Kit(BioLegend公司製造)試劑，將浸潤細胞進行染色30分鐘。以2%FBS/10mM HEPES/HBSS洗淨1次後，使用Bv510標識抗小鼠CD45(30-F11、Biolegend)、FITC標識抗小鼠CD4(RM4-4、BioLegend)、PE/Cy7標識抗小鼠CD8(53-6.7、BioLegend)、PerCP/Cy5.5標識抗小鼠TCRβ(H57-597、BioLegend)、PE 標識抗小鼠CD25(PC61、BioLegend)、BV421標識抗人類CCR8抗體(433H、BD Biosciences)(或BV421標識同型對照組抗體)進行染色。染色係於冰中實施30分鐘。以2%FBS/HEPES/HBSS洗淨2次後，使用流式細胞儀解析細胞。

解析CD45+TCRβ+CD4+CD25+T細胞中之人類CCR8表現。藉由使用同型對照組抗體之染色來決定陰性細胞區域，將在使用抗人類CCR8抗體時會成為陽性之細胞作為人類CCR8+細胞，於移植17日後算出存在頻率。結果，於小鼠腫瘤內之CD45+TCRβ+CD4+CD25+細胞中之約47%檢測出人類CCR8。

(3)藉由使用源自大腸癌之CT26細胞來評估由抗人類CCR8抗體投予所致之抗腫瘤效果

將4x10⁵個源自大腸癌之CT26細胞(50uL)移植到hCCR8-KI(KI/KI)小鼠(8週齡、雌性)之背部皮內。於腫瘤移植第4日及第11日時，在靜脈內投予人類化10A11抗體(輕鏈可變區域：IGKV4-1 N53Q+G29R(序列編號59)/重鏈可變區域：IGHV3-15 T94R(序列編號41))100μg(100μL)或200μg(100μL)(N=10)。對照組則投予介質(磷酸緩衝生理食鹽水)100μL(N=10)。於腫瘤移植4、7、10、11、14、16、18、21、24日後，測定腫瘤體積。腫瘤體積(mm³)係以長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2來計量。

結果，於移植第11日、第14日、第16日、第18日、第21日、第24日，任一用量之抗人類CCR8抗體投予群之腫瘤體積都顯著縮小(第8圖，顯著水平係使用Welch’s t test，於任一用量都在第10日為**；p<0.01，第11日以後為***；p<0.001)。此外，於抗人類CCR8抗體投予群中出現顯示完全萎縮之個體，於第24日時，於100μg抗人類CCR8抗體投予群中係10隻中有5隻之腫瘤幾乎完全消失，於200μg抗人類CCR8抗體投予群中係10隻中有6隻小鼠之腫瘤幾乎完全消失。

實施例11：與10A11競爭之抗人類CCR8抗體之篩選

使用人類化10A11抗體(輕鏈可變區域：IGKV4-1/重鏈可變區域：IGHV3-15 T94R)，針對與hCCR8之結合，實施與其競爭之抗體之篩選。

以與實施例1所述之方法相同之方法，將編碼人類CCR8(UniProtKB/Swiss-Prot：P51685)全長之基因作為抗原，對於A/J Jms Slc雌性小鼠進行DNA免疫，製作融合瘤。將製作之融合瘤播種於96洞盤，對於培養9日後獲得之培養上清液中之176洞實施與人類化10A11抗體之競爭結合試驗。就競爭試驗而言，係藉由對於以實施例1之方法製作之人類CCR8表現Expi293細胞，將培養上清液與10nM之人類化10A11抗體或同型對照組混合，於室溫進行反應3小時，以PBS洗淨3次後，以Alexa488標識抗小鼠IgG抗體(賽默飛世爾科技公司製)進行檢測，而實施之。將在同型對照組之共存下可確認到源自融合瘤之抗體之結合者定義為通常之人類CCR8結合抗體。此外，在人類CCR8結合抗體中，將在人類化10A11抗體共存下之結合訊號顯著降低之抗體鑑定為與人類化10A11抗體競爭之抗體。結果，170洞中有56洞為人類CCR8結合抗體。另一方面，該56洞中有7洞為與人類化10A11抗體競爭之抗體。

再者，在經鑑定為競爭抗體者之中，將作為代表之3殖株進行殖株化，從經殖株化後之融合瘤培養上清液中獲得精製抗體。對於該精製抗體，藉由實施例之方法，測定對於人類CCL1-人類CCR8之中和活性。結果，任一種抗體都具有中和活性(表14)，並且與人類化10A11抗體競爭之抗體顯示為強力的中和抗體。

[表14]

實施例12 人類化單株抗體之抗原表位解析

與實施例3所述之內容同樣地，對於人類化10A11抗體、人類化19D7抗體實施抗原表位之驗證。除了對於實施例3製作之人類CCR4之嵌合體、人類CCR8 N末端區域之點突變體實施結合評估之外，亦對於人類CCR8 loop1、loop2區域之點突變體實施結合評估。就結合評估而言，係藉由使各突變體於Expi293細胞中暫時性表現，將人類化10A11抗體(輕鏈可變區域：IGKV4-1/重鏈可變區域：IGHV3-15 T94R)或人類化19D7抗體(輕鏈可變區域：IGKV3-20/重鏈可變區域：IGHV3-15 T94R)從20μg/mL以每3倍逐次分成8階段稀釋調製之抗體溶液進行反應，而實施之。於室溫進行反應3小時後，與Alexa488標識anti-human IgG抗體(賽默飛世爾科技公司)進行反應，實施流式細胞術解析。此外，各突變體之表現量，係藉由對於各突變體之N末端賦予標籤，以同樣之方法使用抗標籤抗體進行檢測，而補正之。

結果表示於表15及表16。與人類CCR8比較，其結合活性成為70%以下之突變體係以△表示，成為20%以下之突變體係以×表示。

[表15]

[表16]

[產業上之利用可能性]

本發明之單株抗體或其抗體片段，可用於檢測生體試料中之CCR8。再者，含有本發明之單株抗體或其抗體片段的醫藥組成物，係非常有用於作為治療或預防CCR8相關疾病之醫藥。

<110> 日商鹽野義製藥股份有限公司國立大學法人大阪大學

<120> 新穎之抗CCR8抗體

<130> 19P00085WO

<150> JP2018-245044

<151> 2018-12-27

<150> JP2019-099923

<151> 2019-05-29

<160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 355

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VL的CDR1

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VL的CDR2

<400> 3

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VL的CDR3

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VH的CDR1

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VH的CDR2

<400> 6

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VH的CDR3

<400> 7

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27G1 VH的CDR2

<400> 8

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7 VL的CDR2

<400> 9

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7 VL的CDR3

<400> 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7 VH的CDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 8F7 VH的CDR1

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 8F7 VH的CDR3

<400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VL的CDR1

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VL的CDR2

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VL的CDR3

<400> 16

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VH的CDR1

<400> 17

<210> 18

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VH的CDR2

<400> 18

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VH的CDR3

<400> 19

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VL的CDR1

<400> 20

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VL的CDR2

<400> 21

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VL的CDR3

<400> 22

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VH的CDR1

<400> 23

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VH的CDR2

<400> 24

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VH的CDR3

<400> 25

<210> 26

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VL

<400> 26

<210> 27

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11 VH

<400> 27

<210> 28

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27G1 VH

<400> 28

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1H4 VL

<400> 29

<210> 30

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1H4 VH

<400> 30

<210> 31

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7 VL

<400> 31

<210> 32

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7 VH

<400> 32

<210> 33

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 8F7 VL

<400> 33

<210> 34

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 8F7 VH

<400> 34

<210> 35

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VL

<400> 35

<210> 36

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2C7 VH

<400> 36

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VL

<400> 37

<210> 38

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-7B VH

<400> 38

<210> 39

<211> 353

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 39

<210> 40

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV3-20

<400> 40

<210> 41

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGHV3-15 T94R

<400> 41

<210> 42

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV4-1

<400> 42

<210> 43

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV1-39

<400> 43

<210> 44

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV2-40

<400> 44

<210> 45

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV1-16

<400> 45

<210> 46

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGHV3-73

<400> 46

<210> 47

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV2-28

<400> 47

<210> 48

<211> 360

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL的CDR2共通序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可為任何自然存在的胺基酸

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL的CDR3共通序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可為任何自然存在的胺基酸

<400> 50

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH的CDR1共通序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa可為任何自然存在的胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可為任何自然存在的胺基酸

<400> 51

<210> 52

<211> 105

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h10A11 CL

<400> 52

<210> 53

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h10A11 CH

<400> 53

<210> 54

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7-IGKV3-15

<400> 54

<210> 55

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7-IGKV2-18

<400> 55

<210> 56

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7-IGKV3-20

<400> 56

<210> 57

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7-IGHV3-15 T94R

<400> 57

<210> 58

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 19D7-IGHV3-73

<400> 58

<210> 59

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 10A11-IGKV4-1 N53Q+G29R

<400> 59

Claims

一種抗體或其抗體片段，其係結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，其辨識序列編號1所示之胺基酸序列第17位之酪胺酸。
如申請專利範圍第1項所述之抗體或其抗體片段，其為中和抗體。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之抗體或其抗體片段，其更進一步辨識序列編號1表示之胺基酸序列第94位至107位中之1個以上之胺基酸。
如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之抗體或其抗體片段，其更進一步辨識序列編號1表示之胺基酸序列第172位至202位中之1個以上之胺基酸。
如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之抗體或其抗體片段，其辨識序列編號1表示之胺基酸序列第20位之異白胺酸、第22位之絲胺酸、第35位之賴胺酸、第181位之白胺酸、第183位之半胱胺酸及第188位之天冬醯胺中之1個以上之胺基酸。
如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述之抗體或其抗體片段，其為人類化單株抗體或其抗體片段。
一種抗體或其抗體片段，其係結合於CCR8之單株抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)或6)：

1)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號2之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號3之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號4之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號5之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號6之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號7之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

2)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號2之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號3之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號4之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號8之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號6之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號7之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

3)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號2之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號9之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號10之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號8之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號6之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號11之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

4)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號2之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號3之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號10之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號12之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號6之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號13之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；

5)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號14之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號15之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號16之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號17之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號18之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號19之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3；或

6)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由可於序列編號20之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號21之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號22之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由可於序列編號23之胺基酸序列中1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR1，

由可於序列編號24之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR2，及

由可於序列編號25之胺基酸序列中有1或2個胺基酸缺失、置換、插入及/或加成之胺基酸序列構成之CDR3。
如申請專利範圍第7項所述之抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)或6)：

1)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號4之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號5之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號7之胺基酸序列構成之CDR3，

此處，亦可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號3之胺基酸序列第5位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第4位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第6位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第16位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸；

2)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號4之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號8之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號7之胺基酸序列構成之CDR3；

3)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號9之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號10之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號8之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號11之胺基酸序列構成之CDR3，

此處，亦可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第2位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第3位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第5位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號10之胺基酸序列第2位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號8之胺基酸序列第1位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第14位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第18位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號11之胺基酸序列第5位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號11之胺基酸序列第12位之酪胺酸；

4)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號10之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號12之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號13之胺基酸序列構成之CDR3；

5)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號14之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號15之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號16之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號17之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號18之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號19之胺基酸序列構成之CDR3；或

6)下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號20之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號21之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號22之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號23之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號24之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號25之胺基酸序列構成之CDR3。
如申請專利範圍第8項所述之抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號3之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號4之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號5之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號7之胺基酸序列構成之CDR3；

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號3之胺基酸序列第5位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第4位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號4之胺基酸序列第6位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第16位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸。
如申請專利範圍第9項所述之抗體或其抗體片段，其具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺。
如申請專利範圍第9項或第10項所述之抗體或其抗體片段，其中，序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺係以麩醯胺置換，

再者，亦可具有以下之任1種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第10位之天冬醯胺，

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸。
如申請專利範圍第11項所述之抗體或其抗體片段，其中，序列編號3之胺基酸序列第4位之天冬醯胺係以麩醯胺置換，再者，序列編號2之胺基酸序列第11位之甘胺酸係以精胺酸置換。
如申請專利範圍第8項所述之抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域，

其中，該輕鏈可變區域含有

由序列編號2之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號9之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號10之胺基酸序列構成之CDR3，

該重鏈可變區域含有

由序列編號8之胺基酸序列構成之CDR1、

由序列編號6之胺基酸序列構成之CDR2、及

由序列編號11之胺基酸序列構成之CDR3；

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第2位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第3位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號2之胺基酸序列第5位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號10之胺基酸序列第2位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號8之胺基酸序列第1位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第14位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第18位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號6之胺基酸序列第19位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號11之胺基酸序列第5位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號11之胺基酸序列第12位之酪胺酸。
如申請專利範圍第7項至第13項中任1項所述之抗體或其抗體片段，其為人類化單株抗體或其抗體片段。
如申請專利範圍第14項所述之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列，或與序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成；

該重鏈可變區域係由序列編號41或46之胺基酸序列，或與序列編號41或46之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成。
如申請專利範圍第14項或第15項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)、6)、7)、8)、9)、10)、11)或12)：

1)具有序列編號40之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

2)具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

3)具有序列編號43之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

4)具有序列編號44之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

5)具有序列編號45之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

6)具有序列編號47之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域，

7)具有序列編號40之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

8)具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

9)具有序列編號43之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

10)具有序列編號44之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，

11)具有序列編號45之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域，或

12)具有序列編號47之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號46之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第59位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第97位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第99位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號41或46之胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號41或46之胺基酸序列第68位之天冬胺酸。
如申請專利範圍第16項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第59位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第97位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號40、42、43、44、45或47之胺基酸序列第99位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號41或46之胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號41或46之胺基酸序列第68位之天冬胺酸。
如申請專利範圍第17項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以麩醯胺、蘇胺酸、丙胺酸、賴胺酸、白胺酸或精胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

D)以異白胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第59位之白胺酸，

E)以異白胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第97位之白胺酸，

F)以苯基丙胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第99位之酪胺酸，

G)以蘇胺酸置換序列編號41之胺基酸序列第65位之絲胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號41之胺基酸序列第68位之天冬胺酸。
如申請專利範圍第17項或第18項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第34位之甘胺酸，

C)以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺。
如申請專利範圍第17項至第19項中任1項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號40或42之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，以麩醯胺置換序列編號40或42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，

再者，亦可具有以下之任1種置換：

A)以賴胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第33位之天冬醯胺，

B)以白胺酸或精胺酸置換序列編號40或42之胺基酸序列第34位之甘胺酸。
如申請專利範圍第20項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號42之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，以麩醯胺置換序列編號42之胺基酸序列第58位之天冬醯胺，以精胺酸置換序列編號42之胺基酸序列第34位之甘胺酸。
如申請專利範圍第20項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號59之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號41之胺基酸序列之重鏈可變區域。
如申請專利範圍第14項所述之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述輕鏈可變區域及重鏈可變區域；

其中，該輕鏈可變區域係由序列編號54、55或56之胺基酸序列，或與序列編號54、55或56之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成；

該重鏈可變區域係由序列編號57或58之胺基酸序列，或與序列編號57或58之胺基酸序列有95%以上之同一性之胺基酸序列所構成者。
如申請專利範圍第14項或第23項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含下述1)、2)、3)、4)、5)、6)：

1)具有序列編號54之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域，

2)具有序列編號55之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域，

3)具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域，

4)具有序列編號54之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域，

5)具有序列編號55之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域，或

6)具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域及具有序列編號58之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，可具有1種以上之下述之任一種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第25位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第26位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第28位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號54、55或56之胺基酸序列第95位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第31位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第63位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第67位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第68位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號57或58之胺基酸序列第99位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號57或58之胺基酸序列第105位之酪胺酸。
如申請專利範圍第24項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其包含：具有序列編號56之胺基酸序列之輕鏈可變區域、及具有序列編號57之胺基酸序列之重鏈可變區域；

並且，亦可具有1種以上之下述之任1種置換：

A)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第25位之絲胺酸，

B)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第26位之絲胺酸，

C)以蘇胺酸置換序列編號56之胺基酸序列第28位之絲胺酸，

D)以天冬醯胺置換序列編號56之胺基酸序列第95位之麩醯胺，

E)以絲胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第31位之蘇胺酸，

F)以纈胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第63位之丙胺酸，

G)以精胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第67位之賴胺酸，

H)以麩胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第68位之天冬胺酸，

I)以麩醯胺置換序列編號57之胺基酸序列第99位之天冬醯胺，

J)以苯基丙胺酸置換序列編號57之胺基酸序列第105位之酪胺酸。
如申請專利範圍第14項至第25項中任1項所述之作為抗體之人類化單株抗體或其抗體片段，其更包含：具有序列編號52之胺基酸序列之輕鏈恒定區域、及具有序列編號53之胺基酸序列之重鏈恒定區域；

並且，可於序列編號53之C末端加成或不加成賴胺酸。
一種醫藥組成物，其含有申請專利範圍第1項至第26項中任1項所述之抗體或其抗體片段。
一種醫藥組成物，其含有申請專利範圍第1項至第26項中任1項所述之抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段係用於阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合。
一種醫藥組成物，其含有申請專利範圍第1項至第26項中任1項所述之抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段係作為中和抗體使用。
一種醫藥組成物，其含有結合於如申請專利範圍第1項至第26項中任1項所述之CCR8之單株抗體或其抗體片段，該抗體或其抗體片段係用於辨識序列編號1表示之胺基酸序列第17位之酪胺酸。
如申請專利範圍第30項所述之醫藥組成物，其係用於阻礙CCR8與CCR8配位基之任一者的結合。
如申請專利範圍第27項至第31項中任1項所述之醫藥組成物，其中，抗體為具有ADCC活性者。
如申請專利範圍第27項至第31項中任1項所述之醫藥組成物，其中，抗體為IgG抗體。
如申請專利範圍第27項至第33項中任1項所述之醫藥組成物，其係用於治療癌症。
一種多核苷酸，其編碼申請專利範圍第7項至第24項中任1項所述之抗體之輕鏈可變區域或重鏈可變區域。
一種表現載體，其含有如申請專利範圍第35項所述之多核苷酸。