TW202039537A

TW202039537A - 用於治療癌症之質體建構體和使用方法

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Publication number: TW202039537A
Application number: TW108142956A
Authority: TW
Inventors: 克里斯多夫崔蒂; 安南達洛穆赫帕哈; 大衛坎登; 妙君韓; 艾瑞卡布朗寧
Original assignee: 美商昂科賽克醫療公司
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-11-01
Also published as: WO2020112987A1; AU2019386131A1; KR20210084648A; JP7514231B2; TWI850282B; EP3887528A1; US20220041724A1; EP3887528A4; BR112021008179A2; US12479918B2; JP2022512942A; SG11202104362SA; CA3120564A1; IL282776A; CN113412334A

Abstract

本發明描述編碼CD3-half-BiTE、CXCL9及CTLA-4 scFv的表現卡匣。所描述之表現卡匣可用於治療個體之癌症。本發明亦描述經由直接腫瘤內注射及電穿孔投遞該表現卡匣至腫瘤之方法。

Description

用於治療癌症之質體建構體和使用方法

本發明關於用於治療癌症之質體建構體和使用方法。相關申請案交叉引用

本申請案主張於2018年11月27日提出申請的美國臨時申請案第62/771,928號及於2019年3月29日提出申請的美國臨時申請案第62/826,439號之優先權，其各自經由引用合併至本案。序列表

在文件522631_序列表_ST25中序列表的大小為143 KB，建於2019年11月22日，在此引用作為參考。

癌症免疫編輯係負責消除腫瘤並重塑(sculpting)腫瘤的免疫原性表現型，所述腫瘤的免疫原性表現型在腫瘤逃脫(escape)免疫破壞後最終在具有免疫能力的宿主中形成。免疫系統與腫瘤的相互作用被假定為發生在三個連續的階段：消減、平衡及逃脫。消減需要T淋巴細胞破壞腫瘤細胞。在平衡中，出現免疫抵抗性腫瘤細胞群。在逃脫過程中，腫瘤已發展出逃避免疫檢測或破壞的策略。腫瘤抗原的丟失或無效呈遞，抑制性細胞因子的分泌或主要組織相容性複合物分子的向下調節可能導致逃脫。

癌症免疫療法係針對在引起導致癌症消減的成功的T細胞反應。已經做出了各種努力來激活效應T細胞反應，例如通過抗原呈遞細胞(APC)呈遞腫瘤抗原，成功地將T細胞成功標定並浸潤腫瘤以及增強浸潤T細胞以結合MHCI-胜肽複合物激活細胞毒性T細胞反應。

研究表示，與腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的存在相關的生存益處。有證據顯示免疫刺激細胞因子，例如IL-12，可以增加實體腫瘤中免疫細胞的浸潤。然而，IL-12的全身施予具有較窄的治療指數，並且常常伴隨著不良反應的不可接受的程度。IL-12全身性投予的局限性可經由導致IL-12局部表現的治療(例如編碼IL 12的質體的腫瘤內電穿孔)來克服。

儘管IL-12可以增加TIL的數量，但是仍然需要增加腫瘤中腫瘤特異性T細胞的存在及數量。CD3(分化簇3)T細胞共受體有助於激活細胞毒性T細胞(CD8+初始T細胞)及T輔助細胞(CD4+初始T細胞)。由於其在激活T細胞反應中的作用，抗CD3抗體已被研究用作免疫抑制劑。已經開發出雙特異性抗體，包括雙特異性T細胞接合劑(BiTE)、標靶CD3及癌症抗原(腫瘤標記)來將T標靶細胞標記為癌細胞。

本發明所述編碼CXCL9、CXCL9加(plus)IL-12、抗-CTLA-4 scFv、抗-CTLA-4 scFv加IL-12、CD3 half-BiTE以及CD3 half-BiTE加IL-12的表現卡匣。所述的表現卡匣可用於癌症治療。亦描述該表現卡匣用以治療癌症的方法，包含癌症及轉移性癌症。所述的表現卡匣，當傳遞至腫瘤時，例如經由電穿孔，會導致該編碼蛋白在局部腫瘤中表現，進而導致T細胞募集及抗腫瘤活性。在一些實施態樣中，該方法亦導致明顯作用，如一或多個未治療腫瘤的消減。在一些實施態樣中，消減包含實體腫瘤的減瘤(debulking)。

所述編碼CXCL9的表現卡匣。在一些實施態樣中，編碼CXCL9的表現卡匣進一步編碼IL-12。所述CXCL9表現卡匣從腫瘤內、腫瘤周圍、傳遞至淋巴結、經皮內及/或肌內。在一些實施態樣中，CXCL9及IL12編碼序列在來自單一啟動子的多順反子(multicistronic)表現卡匣上表現，並被IRES或2A轉譯修飾元件分開。在一些實施態樣中，該2A元件為P2A元件。IL-12為具有IL-12A (p35)及IL-12B(p40)亞基兩者的異二聚體細胞因子。編碼的IL-12可包含編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白(IL12 p70)的融合建構體。在一些實施態樣中，IL-12 p35及p40編碼序列由來自單一啟動子的多順反子表現卡匣並被IRES或2A元件分開。在一些實施態樣中，該2A元件為P2A元件。在一些實施態樣中，所述多順反子表現卡匣，包含經由IRES或2A元件分開的CXCL9、IL12 p35、以及IL-12 p40 編碼區。在一些實施態樣中，該2A元件為P2A元件。

所述編碼抗-CTLA-4 scFv的表現卡匣。抗-CTLA-4 scFv包含抗‑CTLA-4單鏈可變片段。所述抗-CTLA-4 scFv、經皮內及/或肌內從腫瘤內、腫瘤周圍傳遞至淋巴結。淋巴結可以是引流淋巴結。抗-CTLA-4 scFv表現卡匣也可以在腫瘤與引流淋巴結之間的腫瘤周圍區域中遞送。對於抗-CTLA-4 scFv表現卡匣的腫瘤內、腫瘤周圍、至淋巴結、皮內及/或肌內遞送中的每一種，可以經由電穿孔來促進遞送。與全身予抗CTLA-4抗體相比，抗CTLA-4 scFv表現卡匣的直接表現可導致較少的副作用和/或毒性。所述抗CTLA-4 scFv表現卡匣有助於遞送局部但有效劑量的抗-CTLA-4。

所述CD3 half-BiTEs及編碼CD3 half-BiTEs的表現卡匣。CD3 half-BiTEs包含融合至跨膜結構域(TM)的抗‑CD3單鏈可變片段(scFv)。在一些實施態樣中，編碼CD3 half-BiTE的表現卡匣進一步編碼單一胜肽。經編碼的單一胜肽可操作地連接至抗‑CD3單鏈可變片段編碼序列之5'端。在一些實施態樣中，編碼CD3 half-BiTE的表現卡匣進一步編碼IL-12。所述CD3 half-BiTE表現卡匣腫瘤內、腫瘤周圍、至淋巴結，皮內及/或肌內遞送。在一些實施態樣中，該CD3 half-BiTE及IL12編碼序列在來自單一啟動子的多順反子表現卡匣上表現，並被IRES或2A轉譯修飾元件分開。在一些實施態樣中，該2A元件為P2A元件。IL-12為具有IL-12A(p35)及IL-12B(p40)亞基兩者的異二聚體細胞因子。編碼的IL-12可包含編碼IL-12 p35-IL-12 p40融合蛋白(IL12 p70)的融合建構體。在一些實施態樣中，IL-12 p35及p40編碼序列由來自單一啟動子的多順反子表現卡匣並被IRES或2A元件分開。在一些實施態樣中，該2A元件為P2A元件。在一些實施態樣中，所述多順反子表現卡匣，包含經由IRES或2A元件分開的CD3 half-BiTE、IL12 p35、以及IL-12 p40編碼區。在一些實施態樣中，該2A元件為P2A元件。

所述治療癌症的方法，其包括經由腫瘤內電穿孔(IT-EP)向個體施予包含治療有效量的一或多種所述表現卡匣的組成物。將組成物注射到腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中，並且將電穿孔治療應用於腫瘤、腫瘤微環境及/或腫瘤邊緣組織中。電穿孔治療可以經過本領域已知的任何合適的電穿孔系統來應用。在一些實施態樣中，電穿孔的場強為約60 V/cm至約1500 V/cm，持續時間為約10微秒至約20毫秒。在一些實施態樣中，電穿孔結合電化學阻抗譜(EIS)。個體可以是哺乳動物。哺乳動物可以是但不限於人、犬、貓或馬。

在一些實施態樣中，該方法進一步包含施予個體有效治療量之免疫刺激細胞因子(immunostimulatory cytokine)。該免疫刺激細胞因子可為編碼免疫刺激細胞因子的表現卡匣經IT-EP傳遞。該免疫刺激細胞因子可為，但不限於IL-12。該免疫刺激細胞因子可在所述CXCL9、CTLA-4 scFv以及CD3 half-BiTE的表現卡匣的一或多個之前、之後或同時遞送。

在一些實施態樣中，該方法進一步包含施予一或多個其他的治療。該一或多個其他的治療可為，但不限於免疫檢查點治療。免疫檢查點治療可為，但不限於施予一或多個免疫檢查抑制劑。「免疫檢查點」分子是指誘導T細胞功能障礙及凋亡的免疫細胞表面受體/配體(ligand)。這些免疫抑制標靶可減弱過度的免疫反應及確保自我耐受性。腫瘤細胞利用這些檢查點分子的抑制作用。免疫檢查點標靶分子包含，但不限於細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配體1(PD-L1)、淋巴細胞激活基因-3(LAG-3)、T細胞免疫球黏蛋白-3(TIM3)、殺手細胞免疫球樣受體(MR)、B-及T-淋巴細胞衰減器(BTLA)、腺苷A2a受體(A2aR)、以及泡疹病毒進入介體(HVEM)。「免疫檢查點抑制劑」包含經由阻斷免疫檢查點分子的作用而防止免疫抑制的分子。免疫檢查點抑制劑包含，但不限於抗體及抗體片段、奈米抗體、雙抗體、檢查點分子的可溶性結合伴侶、小分子治療劑、以及胜肽結抗劑。免疫檢查點抑制劑包含，但不限於PD-1以及/或PD-L1結抗劑。PD-1以及/或PD-L1結抗劑可為，但不限於抗-PD-1或抗-PD-L1抗體。抗-PD-1/PD-L1抗體包含，但不限於尼沃單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、匹利珠單抗(pidilizumab)、以及阿替珠單抗(atezolizumab)。

所述為個體中治療腫瘤的方法，包含：施予個體至少一個治療週期，該週期包含：經由IT-EP對該腫瘤施予包含治療有效的一或多種所述CXCL9、CXCL9加IL-12(如IL12~CXCL9)、抗-CTLA-4 scFv、抗-CTLA-4 scFv加IL-12、CD3 half-BiTE、或CD3 half-BiTE加IL-12(如CD3 half-BiTE~IL12)表現卡匣的組成物。在一些實施態樣中，該週期為三週的週期。在一些實施態樣中，該週期為四、五、或六個週的週期。該組成物可經由IT-EP在週期的第1、2、3、4、5、或6天施予。在一些實施態樣中，該組成物經由IT-EP在每個週期的第1天施予。在一些實施態樣中，該組成物經由IT-EP在每個週期的第1及5±2天施予。在一些實施態樣中，該組成物經由IT-EP在每個週期的第1及8±2天施予。在一些實施態樣中，該組成物經由IT-EP在每個週期的第1、5±2、以及8±2天施予。可以根據治療對象的需要重複進行多次週期。在一些實施態樣中，一個週期進一步包括給予其他的治療劑。該其他的治療劑可為，但不限於免疫檢查點治療。在一些實施態樣中，該免疫檢查點治療在每個週期的第1、2、或3天施予至該個體。

在一些實施態樣中，使用一個或多個所述的表現卡匣經由IT-EP治療的一或多個週期對個體進行治療。可以在隨後的週期中重複上述任何週期。隨後的週期可以是連續週期或交替週期。交替週期可以有一個或多個中間週期，沒有其他替治療的治療方法(例如，免疫檢查點治療)。例如，可以在交替週期的第1、5±2和8±2天(例如，根據需要的週期1、3、5等等)施予上述任何一種表現卡匣，並且可以施予替代治療，例如，在連續週期的第1、2或3天(例如，根據需要的週期1、2、3、4、5等等)。

在一些實施態樣中，對個體施予任何所述CXCL9、CTLA-4 scFv及/或CD3 half-BiTE表現卡匣的IT-EP的交替週期，有或沒有免疫檢查點抑制劑治療、以及免疫檢查點抑制劑治療。換句話說，可以經由IT-EP向個體施予包含治療有效量的一或多種所述CXCL9、CXCL9加IL-12、抗-CTLA-4 scFv、抗-CTLA-4 scFv加IL-12、CD3 half-BiTE、或CD3 half-BiTE加IL-12表現卡匣並可選擇以奇數週期(週期1、3等等)施予免疫檢查點抑制劑治療，並以偶數週期(週期2、4等等)施予免疫檢查點抑制劑治療。或者，可以在奇數週期(週期1、3等等)對患者施予免疫檢查點抑制劑治療，並經由IT-EP施予包含治療有效量的一或多種所述CXCL9、CXCL9加IL-12、抗-CTLA-4 scFv、抗-CTLA-4 scFv加IL-12、CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE 加IL-12表現卡匣的組成物，並任意地在偶數週期(週期2、4等等)施予免疫檢查點抑制劑。

該表現卡匣及方法可用於治療患有晚期、轉移性、難治性腫瘤的患者。難治性腫瘤可為，但不限於免疫檢查點抑制劑難治性腫瘤、荷爾蒙難治性腫瘤、放射難治性腫瘤、以及化學療法難治性腫瘤。在一些實施態樣中，該患者對至少一個免疫檢查點抑制劑療法療程無效。在一些實施態樣中，該個體正在進行或已經進行一或多個抗癌症治療，例如但不限於檢查點抑制劑療法。

該表現卡匣及方法可用於治療預期對一或多種抗癌症治療難治或無反應之個體。在一些實施態樣中，該個體具有低的腫瘤浸潤淋巴細胞、低的部分細胞毒性淋巴球細胞、或經耗盡的T細胞。在一些實施態樣中，該個體在一或多種癌症治療之前具有晚期癌症。

I. 定義

「核酸」包含兩者RNA及DNA。RNA以及DNA包含，但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、縮合核酸、以陽離子脂質配製成核酸、以胜肽或陽離子聚合物配製成核酸、RNA以及mRNA。核酸亦包含經修飾的RNA或DNA。

「表現卡匣」表示係指RNA或DNA編碼序列或編碼表現產物的RNA或DNA的片段(如，胜肽(例如多胜肽或蛋白質或RNA)。表現卡匣可存在於質體中。表現卡匣能夠在細胞(例如哺乳動物細胞)中表現一或多種胜肽。表現卡匣可包含經編碼表現產物的表現所需之一或多個序列。表現卡匣可包含一或多個加強子、啟動子、終止子、以及多個A(polyA)序列可操作地連接DNA編碼序列。

該術語「質體」表示包含至少一個編碼多胜肽(能夠在哺乳動物細胞中表現)序列之核酸(例如任何所述表現卡匣)。質體可為封閉的環狀DNA分子。多種序列可併入至質體以改變該編碼序列的表現進而促進質體在細胞中的複製。序列可用以影響轉錄、信使RNA(mRNA)的穩定性、RNA加工、或轉譯效果。該序列包含，但不限於5′非轉譯區(5'UTR)、啟動子、內含子、以及3′非轉譯區(3′UTR)。質體可以大量及/或高產量的製造。質體可進一步使用cGMP製造來製備。質體可被轉殖至細菌，例如大腸桿菌(E. coli )。DNA質體可配製成安全及有效用以注射至哺乳動物個體。

「蛋白質」、「胜肽」、或「多胜肽」包含二或多個一連串的胺基酸。「蛋白質序列」、「胜肽序列」、「多胜肽序列」或、「胺基酸序列」是指在蛋白質、胜肽或多胜肽中的二或多個胺基酸。

術語「表現(動詞)」以及「表現(名詞)」表示允許或引起在基因、RNA或DNA序列的訊息以變得明顯；例如，產生經由激活涉及相對應基因的轉錄或轉譯的細胞功能來產生蛋白質。DNA序列在細胞中或經由細胞表現以形成表現產物，例如RNA(如mRNA)或蛋白質。表現產物本身亦可碩是稱為經由細胞表現。

「可操作性地連接」係指二或多個組件的並列(如，啟動子以及另一個序列元件)已使兩個組件功能均正常且允許至少一個組件可調解功能的可能性，該功能附加在至少一個其他組件上。例如，與編碼序列可操作性連接的啟動子將引導調解編碼序列轉錄為RNA(包含mRNA)的RNA聚合酶，然後可將其剪切(如果包含內含子)以及任意地轉譯成經由編碼序列編碼的蛋白質。編碼序列可與一或多個轉錄或轉譯控制序列「可操作性地連接」。可操作地與基因連接的終止子/polyA信號終止基因轉錄成RNA，並引導polyA信號添加至RNA上。

「啟動子」為在細胞中能夠結合細胞中RNA聚合酶的DNA調節區(如，直接地或經由其他啟動子結合的蛋白質或物質)以及啟動編碼序列的轉錄。啟動子可包含一或多個影響轉錄起始速率的其他區或元件，包含但不限於加強子。啟動子可為，但不限於構成性激活啟動子、條件啟動子、可誘導形啟動子、或細胞類型特異性啟動子。啟動子的實施例可在WO 2013/176772中找到。該啟動子可為，但不限於CMV啟動子、Igκ啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白(β-actin)啟動子、SRα啟動子、皰疹性胸苷激酶(herpes thymidine kinase)啟動子、單純皰疹性病毒(HSV)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、以及EF1α啟動子。該CMV啟動子可為，但不限於CMV立即早期啟動子、人類CMV啟動子、老鼠CNV啟動子、以及猴子CMV啟動子。

「轉譯修飾元件」能夠從單一轉錄二或多個基因的轉譯。轉譯修飾元件包含內部核醣體進入位點(IRES)，其允許從mRNA內部區轉譯開始，以及衍生自小核糖核酸病毒的2A胜肽，其會使核糖體跳過在元件C-末端的胜肽鍵之合成。轉譯調節元件的併入能夠導致從單一多順反子mRNA共表現二或多個多胜肽。2A調節器包含，但不限於P2A、T2A、E2A或F2A。2A調節器包含PG/P裂解位點。

「同源」序列(如，核酸序列或胺基酸序列)係指與已知參考序列相似或實質上相同的序列任一者，使得其例如為至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同於已知序列。序列一致性可經由使用運算法(algorithms)比對序列，例如使用Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0的BESTFIT、FASTA、以及 TFASTA、遺傳學計算機群組、575 Science Dr., Madison, Wis.)、使用缺陷缺口參數(using default gap parameters)、或經由檢查以及最佳比對(如會導致比較窗口中產生的序列相似性最高百分比)來確認。序列一致性的百分比係經由比較窗口比對兩個最佳比對序列、確定兩個序列中出現相同殘基的位置的數目以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以總數，來計算序列同一性的百分比匹配和不匹配的位置不計算比較窗口中的缺口(即窗口大小)，並將結果乘以100得出序列同一性百分比。除非另有說明，否則兩個序列之間的比較窗口由兩個序列中較短者的整個長度來定義。

「免疫刺激細胞因子」包含可調節或加強對外來抗原(包括病毒、細菌或腫瘤抗原)該免疫反應的細胞因子。免疫刺激細胞因子可包含，但不限於：TNFα、IL-1、IL-10、IL-12、IL-12 p35、IL-12 p40、IL-15、IL-15Rα、IL-23、IL-27、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-21、以及TGFβ。

該術語「癌症」包含通常以不適當的細胞增生、異常或過度細胞增生為特徵的多種疾病。癌症的實施例包含但不限於乳癌、三陰性乳癌、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、腎癌、腦癌或肉瘤。

「難治性癌症」為對至少一種先前的醫學治療沒有反正或尚未反應的癌症。在一些實施態樣中，難治性表示對治療反應不足或缺乏部份或完全反應。例如，患者在接受至少2劑治療後仍未表現出至少部份反應，則可認為該患者對治療無效(例如，檢查點抑制劑療法，例如PD-1或PD-L1抑制劑治療)。

「腫瘤微環境」係指腫瘤周圍的環境且包含幫助腫瘤的生長及/或存活(例如經由向腫瘤提供氧氣、生長因子及營養)的非惡性血管及基質組織，或抑制對腫瘤的免疫泛應。腫瘤微環境包含存在腫瘤的細胞環境，包含周圍血管、免疫細胞、成纖維細胞、骨髓源性炎症細胞、淋巴細胞、信號分子以及細胞外基質。

「腫瘤邊緣」或「邊緣組織」為緊鄰或圍繞腫瘤的視覺正常組織。通常，邊緣組織在組織的0.1-2cm之內的視覺正常組織。當手術切除腫瘤時，常會切除腫瘤邊緣組織。

術語「處理」包括但不限於用於抑制或減少癌細胞的增生、癌細胞的破壞、防止癌細胞的增生、防止惡性細胞的起始、阻止或逆轉惡性前細胞發展為惡性疾病、或疾病的改善的藥物或治療。

術語「電穿孔」係指使用電穿孔脈衝來促進例如質體、核酸、或藥物的生物物分子進入細胞。

「引流淋巴結」係過濾來自特定區或器官的淋巴之淋巴結。在腫瘤或腫瘤處理的情況下，引流淋巴結直接位於腫瘤的下游。

「表位標識(epitope tag)」係為與高親和力抗體鍵結的短胺基酸序列(或編碼短胺基酸序列的核酸序列)。實施例的表位標識包含，但不限於V5-標識、Myc-標識、HA-標識、Spot-標識、T7-標識以及NE-標識。表位標識可用於促進免疫檢測。 II. CXCL9

C-X-C基元(Motif)趨化因子配體9(CXCL9)係屬於CXC趨化因子家族的小細胞因子。CXCL9亦已知為Gamma干擾素誘導的單核因子(MIG)。CXCL9為T-細胞趨化劑(chemoattractant)，且可促進腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的趨化募集。小鼠及人類CXCL9胺基酸序列分別由SEQ ID NO: 35 及SEQ ID NO: 58代表。在一些實施態樣中，CXCL9包含：(a)SEQ ID NO: 35或58的胺基酸序列或其功能等同物；或(b)具有與SEQ ID NO: 35或58之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的胺基酸序列。 III. 抗-CTLA-4 scFv

抗-CTLA-4 scFv包含具有對CTLA-4細胞外結構域的親和力及/或抑制CTLA-4訊號的抗-CTLA-4單鏈可變片段(scFv)。scFv包含與短連接子(linker)接合之免疫球的重鏈(VH)以及輕鏈(VL)的可變區之融合蛋白。實施例的小鼠抗-CTLA-4重鏈可變區胺基酸序列由SEQ ID NO: 39及43代表。實施例小鼠抗-CTLA-4輕鏈可變區胺基酸序列由SEQ ID NO:37及41代表。

抗-CTLA-4 scFv可從噬菌體表現中鑑定。抗-CTLA-4 scFv亦為經由已知的抗-CTLA-4抗體(例如從融合瘤)次選殖(subcloning)VH以及VL而產生。已知抗-CTLA-4抗體例如在20190048096、20130136749、20120148597、20140099325、20150104409、20110296546、以及20080233122等之中已描述。已知抗-CTLA-4抗體包含，但不限於尹匹木單抗(ipilimumab)以及曲美單抗(tremelimumab)。在一些實施態樣中，抗-CTLA-4 scFv的VH以及/或VL結構域可被人源化。人源化抗體(或抗體片段或結構域)係來自非人類物種的抗體，其蛋白質序列已經過修飾以增加其與人類天然產生的抗體變體的相似性。在一些實施態樣中，人源化的抗體可經由將抗-CTLA-4抗體的相關互補決定區(CDRs，亦稱為高可變區(HVRs))插入至人類的VH及VL結構域。

抗-CTLA-4 scFv可經由連接VH鏈的C‑末端與VL的N-末端而形成。或者，VL的C-末端可與VH的N-末端連接。該胜肽連接子可為約10至約25個胺基酸。在一些實施態樣中，scFv胜肽連接子為富含甘胺酸。scFv胜肽連接子可為，但不限於(G₄ S)_x ，其中x為從2至5(含)的整數。在一些實施態樣中，scFv胜肽連接子包含Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (如，亦稱為[(Gly)₄ Ser]₃ 、(G₄ S)₃ 或G₄ S(×3))。在一些實施態樣中，scFv胜肽連接子可包含由G₄ S(×3)所組成。在一些實施態樣中，編碼的抗-CTLA-4 scFv多胜肽包含訊號胜肽(例如Igκ訊號胜肽)。實施例的抗-CTLA-4 scFv胺基酸序列經由SEQ ID NO:70及72代表。在一些實施態樣中，抗-CTLA-4 scFv包含：(a)SEQ ID NO:70或72胺基酸序列或功能等同物；或(b)具有與SEQ ID NO:70或72之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致性的胺基酸序列。 IV. CD3 half-BiTE

A CD3 half-BiTE包含融合至跨膜結構域(TM)的抗‑CD3單鏈可變片段(scFv)。scFv包含與短連接子(linker)接合之免疫球的重鏈(VH)以及輕鏈(VL)的可變區之融合蛋白。實施例的抗-CD3重鏈可變區胺基酸序列為經由SEQ ID NO:8及47代表。實施例的小鼠抗-CD3輕鏈可變區胺基酸序列為經由SEQ ID NO:11及50代表。

抗-CD3 scFv可從噬菌體顯示中鑑定。抗-CD3 scFv亦可為經由已知的抗-CD3抗體(例如從融合瘤)次選殖(subcloning)VH以及VL而產生。已知抗-CD3抗體例如在US20180117152、US20140193399、US20100183554、以及US20060177896。已知抗-CD3抗體包含，但不限於OKT3(米莫單抗(Muromonab)-CD3)、145-2C11、17A2、SP7、以及UCHT1。在一些實施態樣中，抗-CD3 scFv的VH以及/或VL結構域可被人源化。人源化抗體(或抗體片段或結構域)係來自非人類物種的抗體，其蛋白質序列已經過修飾以增加其與人類天然產生的抗體變體的相似性。在一些實施態樣中，人源化的抗體可經由將抗-CD3抗體的相關互補決定區(CDRs，亦稱為高可變區(HVRs))插入至人類的VH及VL結構域之架構中。

抗-CD3 scFv可經由連接VH鏈的C‑末端與VL的N-末端而形成。或者，VL的C-末端可與VH的N-末端連接。胜肽連接子可為約10至約25個胺基酸。在一些實施態樣中，scFv胜肽連接子為富含甘胺酸。scFv胜肽連接子可為，但不限於(G4S)_x ，其中x為從2至5(含)的整數。在一些實施態樣中，scFv胜肽連接子包含Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(如，亦稱為[(Gly)₄ Ser]₃ 、(G₄ S)₃ 或G₄ S(×3))。在一些實施態樣中，scFv胜肽連接子可包含由G₄ S(×3)所組成。

跨膜結構域(TM)包含能插入生物脂質雙層(膜)且錨定CD3 half-BiTE至該膜胜肽。TM為本領域已知且通常主要包含由非極性胺基酸組成。該跨膜結構域可為，但不限於PDGFRβ跨膜結構域或PDGFRα跨膜結構域(PDGFR為衍生自生長因子受體的血小板)。在一些實施態樣中，間隔區(spacer)包含在抗-CD3 scFv與該跨膜結構域之間。在一些實施態樣中，該TM結構域包含選自於以下胺基酸序列之群組，包含：VGQDTQEVIVVPHSL PFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR(SEQ ID NO: 25)、 AVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR (SEQ ID NO: 27)、 PDGFRβ: VVISAILALVVLTVISLIILI (SEQ ID NO: 83)、PDGFRβ: VVISAILALVVLTIISLIILI (SEQ ID NO: 84)、PDGFRα: AAVLVLLVIVIISLIVLVVIW (SEQ ID NO: 85)、以及PDGFRα: AAVLVLLVIVIVSLIVLVVIW (SEQ ID NO: 86)。在一些實施態樣中，該TM結構域經由選自於以下核酸序列之群組來編碼，包含：gtgggccaggacacgcaggaggt catcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt (SEQ ID NO: 24)、gctgtgggccaggacacgcaggaggtca tcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt (SEQ ID NO: 26)、PDGFRβ: tggtgatctcagccatcct ggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatc (SEQ ID NO: 87)、PDGFRβ:gtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatca tctcccttatcatcctcatc (SEQ ID NO: 88)、PDGFRα: gctgcagt cctggtgctgttggtgattgtgatcatctcacttattgtcctggttgtcatttggaa(SEQ ID NO: 89)。

在一些實施態樣中，經編碼的抗-CD3 half-BiTE胜肽包含例如是Igκ訊號胜肽的訊號胜肽。

實施例的CD3 half-BiTE胺基酸序列經由SEQ ID NO: 60、62、74、以及76表示。在一些實施態樣中，CD3 half-BiTE包含：(a) SEQ ID NO: 60、62、74、或76之胺基酸序列或其功能等同物；或(b)具有與SEQ ID NO: 60、62、74、或76之胺基酸序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性。 V. 表現卡匣

所述任何胜肽，CXCL9、CD3 half-BiTE、抗-CTLA4 scFv、以及IL-12，可在核酸上編碼。該核酸可為，但不限於表現卡匣。該表現卡匣可在質體上。術語「質體」包含含有細菌載體、病毒載體、附加型(episomal)質體、或整合質體、或噬菌體質體的任何核酸載體。如本文所使用的表現卡匣的傳遞包含含有表現卡匣的質體或核酸載體之傳遞(如稱為「表現載體」或「載體」)。

經編碼的胜肽可為連接，表現卡匣至編碼第二多胜肽的序列。在一些實施態樣中，表現卡匣編碼融合蛋白質。術語「融合蛋白」係指包含二或多個經由胜肽鍵或其他化學鍵連接在一起之多胜肽的蛋白質。在一些實施態樣中，融合蛋白為重組地表現為含有兩個多胜肽的單鏈多胜肽。二或多個多胜肽可為直接連接或經由含有一或多個胺基酸的連接子連接。

表現卡匣或質體可含有多順反子表現卡匣。多順反子表現卡匣表現二或多個從相同mRNA分離的蛋白質且含有一或多個轉譯修飾元件。

在一些實施態樣中，所述表現卡匣編碼從單一啟動子表現的二或三個多胜肽，其具有一或多個轉譯修飾元件以允許二或三個多胜肽從單一mRNA表現。在一些實施態樣中，該表現卡匣表現：

其中P為啟動子，A編碼CXCL9或CD3 half-BiTE，B及B′編碼細胞因子或細胞因子亞基(subunit)，以及T為轉譯修飾元件。

啟動子可為，但不限於構成性激活啟動子、條件啟動子、可誘導形啟動子、或細胞類型特異性啟動子。啟動子的實施例可在WO 2013/176772中找到。該啟動子可為，但不限於CMV啟動子、Igκ啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、α-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、皰疹性胸苷激酶啟動子、單純皰疹性病毒(HSV)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、以及EF1α啟動子。該CMV啟動子可為，但不限於CMV立即早期啟動子、人類CMV啟動子、老鼠CNV啟動子、以及猴子CMV啟動子。

在一些實施態樣中，T為內部核糖體進入位點(IRES)元件或核糖體跳躍調節劑。核糖體跳躍調節劑可為，但不限於2A元件(亦稱為2A胜肽或2A自我切割胜肽)。該2A元件可為，但不限於P2A(SEQ ID NO: 29)、T2A、E2A或F2A元件。

CXCL9可為，但不限於小鼠CXCL9及人類CXCL9、或其功能等同物。

CD3 half-BiTE可為，但不限於：抗-CD3 scFv-跨膜結構域(TM)；表位標識(ET)-抗-CD3 scFv-ET-TM、ET-抗-CD3 scFv-TM、抗-CD3、scFv-ET-TM、HA-抗-CD3 scFv-Myc-TM、HA-抗-CD3 scFv-TM、抗-CD3、scFv-Myc-TM、抗-CD3 scFv-TM、或抗-CD3 scFv-TM。該抗-CD3 scFv可為抗-小鼠CD3 scFv或抗-人類CD3 scFv。彼等各自可包含單一胜肽。該單一胜肽可為，但不限於Igκ訊號胜肽。該TM可為，但不限於PDGFR TM。該抗-CD3 scFv可為，但不限於2C11或OKT3。

在一些實施態樣中，該細胞因子可為免疫刺激細胞因子。在一些實施態樣中，該免疫刺激細胞因子為介白素。細胞因子包含，但不限於IL-1、IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-23、IL-27、IL-35、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、以及TGF-β。在一些實施態樣中，B及/或B′編碼IL-12、IL-12 p35‒IL-12 p40融合體、IL-12 p70、IL-12 p35、或IL-12 p40多胜肽。該IL-12、IL-12 p35‒IL-12 p40融合體、IL-12 p70、IL-12 p35、或IL-12 p40 多胜肽可為，但不限於小鼠或人類IL-12、IL-12 p35‒IL-12 p40融合體、IL-12 p70、IL-12 p35、或IL-12 p40多胜肽。在一些實施態樣中，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼CXCL9，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼人類CXCL9，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼小鼠CXCL9，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼Igκ-HA-抗-CD3 scFv-PDGFR TM CD3 half-BiTE，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼Igκ-抗-CD3 scFv-PDGFR TM CD3 half-BiTE，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼Igκ-HA-2C11-PDGFR TM CD3 half-BiTE，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼Igκ-2C11-PDGFR TM CD3 half-BiTE，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼Igκ-HA-OCT3-PDGFR TM CD3 half-BiTE，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，P為CMV啟動子，A編碼Igκ-OKT3-PDGFR TM CD3 half-BiTE，T為P2A元件，B編碼IL-12 p35以及B′編碼IL-12 p40。

在一些實施態樣中，B編碼IL-12 p35，T為P2A元件，以及B′編碼IL-12 p40。在一些實施態樣中，B編碼IL-12 p35，T為IRES元件，以及B′編碼IL-12 p40。該啟動子可為，但不限於CMV啟動子。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 60、62、74、或76之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 60、62、74、或76之胺基酸序列70%一致性的多胜肽之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣編碼含有具有與SEQ ID NO: 60、62、74、或76之胺基酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之多胜肽，其中該經編碼多胜肽保留CD3 half-BiTE多胜肽之功能活性。

在一些實施態樣中，我們描述編碼SEQ ID NO: 64、66、78、或70之胺基酸序列、或具有與SEQ ID NO: 64、66、78、或70之胺基酸序列至少70%一致性的多胜肽之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣編碼包含具有與SEQ ID NO: 64、66、78、或70之胺基酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性的多胜肽，其中該經編碼多胜肽保留CD3 half-BiTE多胜肽以及IL-12多胜肽之功能活性。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 35或58之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 35或58之胺基酸序列至少70%一致性的多胜肽之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣編碼包含具有與SEQ ID NO: 35 或58之胺基酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之多胜肽，其中該經編碼多胜肽保留CXCL9多胜肽之功能活性。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 68或82之胜肽序列或具有與SEQ ID NO: 68或82至少70%一致性的多胜肽之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣編碼包含具有與SEQ ID NO: 68或82之胺基酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之多胜肽，其中該經編碼多胜肽保留CXCL9多胜肽及IL-12多胜肽之功能活性。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 70或72之胺基酸序列或具有與SEQ ID NO: 70或72之胺基酸序列至少70%一致性的多胜肽之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣編碼包含具有與SEQ ID NO: 70或72之胺基酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之多胜肽，其中該經編碼多胜肽保留抗-CTLA-4 scFv多胜肽之功能活性。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 59、61、73、或75之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 59、61、73、或75之核苷酸序列至少70%一致性的序列之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣包含具有與SEQ ID NO: 59、61、73、或75之核苷酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之序列且編碼具有CD3 half-BiTE多胜肽之功能活性之多胜肽。在一些實施態樣中，SEQ ID NO: 59、61、73、或75之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 59、61、73、或75之核苷酸序列至少70%一致性之核苷酸序列為可操作性連接CMV啟動子。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 63、65、77、或79之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 63、65、77、或79之核苷酸序列至少70%一致性的多胜肽之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣包含具有與 SEQ ID NO: 63、65、77、或79之核苷酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之序列，且編碼具有CD3 half-BiTE多胜肽及IL-12多胜肽之功能活性之多胜肽。在一些實施態樣中，SEQ ID NO: 63、65、77、或79之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 63、65、77、或79之核苷酸序列至少70%一致性之核苷酸序列為可操作性連接CMV啟動子。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 34或57之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 34或57之核苷酸序列至少70%一致性的核苷酸序列之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣包含具有與SEQ ID NO: 34或57之核苷酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之序列，且編碼具有CXCL9多胜肽之功能活性之多胜肽。在一些實施態樣中，SEQ ID NO: 34或57之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 34或57之核苷酸序列至少70%一致性之核苷酸序列為可操作性連接CMV啟動子。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 67或81之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 67或81之核苷酸序列至少70%一致性的核苷酸序列之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣包含具有與SEQ ID NO: 67或81之核苷酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之序列且編碼具有CXCL9多胜肽及IL-12多胜肽之功能活性之多胜肽。在一些實施態樣中，SEQ ID NO: 67或81之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 67或81之核苷酸序列至少70%一致性之核苷酸序列為可操作性連接CMV啟動子。

在一些實施態樣中，我們描述編碼包含SEQ ID NO: 69或71之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 69或71之核苷酸序列至少70%一致性的核苷酸序列之表現卡匣。在一些實施態樣中，表現卡匣包含具有與SEQ ID NO: 69或71之核苷酸序列大於70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%、或99%一致性之序列且編碼具有抗-CTLA-4 scFv多胜肽之功能活性之多胜肽。在一些實施態樣中，SEQ ID NO: 69或71之核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 69或71至少70%一致性之核苷酸序列為可操作性連接CMV啟動子。 VI. 處理方法

所描述的在個體中處理腫瘤之方法，包含：施予含有效劑量之一或多個所述CXCL9、CD3 half-BiTE、以及/或CTLA-4 scFv表現卡匣之組成物至腫瘤、腫瘤微環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療腫瘤、腫瘤微環境、及/或腫瘤邊緣組織(IT-EP治療)。該CXCL9或CD3 half-BiTE表現卡匣可進一步編碼IL-12。

經治療的腫瘤可為皮膚腫瘤、皮下腫瘤、或內臟腫瘤。該腫瘤可為癌性的或非癌性的。該腫瘤可為，但不限於實體腫瘤、表面病變、非表面病變、體表15cm以內的病變或內臟病變。在一些實施態樣中，所述的方法或表現載體可用於治療原發性腫瘤及遠處(如未治療)及轉移癌。在一些實施態樣中，提供所述的方法用於患有癌症之個體以減少腫瘤大小或抑制腫瘤成長、抑制癌細胞生長、抑制或減少轉移、減少或抑制轉移性癌症的發展、及/或減少癌症復發。該腫瘤不限於特定類型的腫瘤或癌症。

在一些實施態樣中，該方法進一步包含施予有效劑量的免疫刺激細胞因子。該免疫刺激細胞因子可經由編碼細胞因子的表現卡匣之IT-EP來施予。在一些實施態樣中，該細胞因子在編碼CXCL9或CD3 half-BiTE表現卡匣上編碼。在一些實施態樣中，該細胞因子在第二表現載體上編碼且經由IT-EP傳遞至癌性腫瘤。在一些實施態樣中，該細胞因子為IL-12。在一些實施態樣中，該表現卡匣包含B-T-B′，其中B編碼IL-12 p35，T為P2A元件，以及B′編碼IL-12 p40。該細胞因子可在IT-EP CXCL9治療或IT-EP CD3 half-BiTE治療之前、同時、或之後施予。

IT-EP CXCL9治療或處理包含注射有效劑量之所述編碼CXCL9之表現卡匣至腫瘤、腫瘤圍環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療至腫瘤。

IT-EP IL12~CXCL9治療或處理包含注射有效劑量之所述編碼CXCL9及IL-12之表現卡匣至腫瘤、腫瘤圍環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療至腫瘤。

IT-EP CD3 half-BiTE治療或處理包含注射有效劑量之所述編碼CD3 half-BiTE之表現卡匣至腫瘤、腫瘤圍環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療至腫瘤。

IT-EP CD3 half-BiTE~IL-12治療或處理包含注射有效劑量之所述編碼CD3 half-BiTE及IL-12之表現卡匣至腫瘤、腫瘤圍環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療至腫瘤。

IT-EP抗-CTLA-4 scFv治療或處理包含注射有效劑量之所述編碼抗-CTLA-4 scFv之表現卡匣至腫瘤、腫瘤圍環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療至腫瘤。

IT-EP IL12治療或處理包含注射有效劑量之所述編碼IL-12之表現卡匣至腫瘤、腫瘤圍環境、及/或腫瘤邊緣組織且施予電穿孔治療至腫瘤。在一些實施例中，編碼IL-12 之表現卡匣包含IL12-2A(mIL12-2A以及hIL12-2A；圖1)。

在一些實施態樣中，所述之表現卡匣、含有所述之表現卡匣的質體、以及方法可用於治療一或多個腫瘤、腫瘤細胞、或腫瘤病變。該腫瘤細胞可為，但不限於癌細胞。術語「癌症」包含通常以不適當的細胞增殖、異常或過度的細胞增殖為特徵的多種疾病。癌症可為，但不限於實體癌症、肉瘤、及淋巴瘤。該癌症可為，但不限於胰腺、皮膚、腦、肝、膽囊、胃、淋巴結、乳、肺、頭頸、喉、咽、唇、喉嚨、心臟、腎臟、肌肉、結腸、前列腺、胸腺、睪丸、子宮、卵巢、皮膚、及皮下癌。皮膚癌可為，但不限於黑色素瘤及基底細胞癌。乳癌可為，但不限於ER陰性乳癌、以及三陰性乳癌。在一些實施態樣中，所述之方法可用於治療細胞增生異常。術語「細胞增生異常」表示惡性及非惡性細胞群，其在形態上及基因型上常看起來與周圍組織不同。在一些實施態樣中，所述之方法可用於治療人類。在一些實施態樣中，所述之方法可用於非人類之動物或哺乳動物。非人類之動物可為，但不限於小鼠、大鼠、兔、狗、貓、豬、牛、羊及馬。

所述之表現卡匣及方法考慮用於患有癌症或其他非癌症(良性)生長之個體。以本實施態樣的方法治療之腫瘤可為任何非侵入性的、侵入性的、淺表性、乳頭狀、扁平、轉移性、局部性、單中心性、多中心性、低度和高度腫瘤。這些生長可能表現為以下任何一種：病變、息肉、腫瘤(例如乳頭尿路上皮腫瘤)、乳頭瘤、惡性腫瘤、腫瘤(例如Klatskin腫瘤、肺門(hilar)腫瘤、無創乳頭尿路上皮腫瘤、生殖細胞腫瘤、Ewing氏腫瘤、Askin腫瘤，原始性神經外胚瘤(primitive neuroectodermal tumor)、Leydig細胞腫瘤、Wilms腫瘤、Sertoli細胞瘤)、肉瘤、癌(例如鱗狀細胞癌、泄殖腔癌、腺癌、腺鱗癌、膽管癌、肝細胞癌、浸潤性乳頭尿路上皮癌、扁平尿路上皮癌)、腫塊、或任何其他類型的癌性或非癌性生長。表現卡匣和方法可用於治療晚期、轉移性或難治性癌症。

本文所述之表現卡匣和方法被考慮用於例如腎上腺皮質癌、肛門癌、膽管癌(例如周圍性癌、遠端膽管癌、肝內膽管癌)膀胱癌、良性和癌性骨癌(例如骨瘤、類骨瘤、成骨細胞瘤、骨軟骨瘤、血管瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、骨鉅細胞瘤、脊索瘤、淋巴瘤、多發性骨髓瘤)、腦和中樞神經系統癌症(例如腦膜瘤、星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、室管膜瘤、神經膠質瘤、髓母細胞瘤、神經節膠質瘤、神經鞘瘤、生殖細胞瘤、顱咽管瘤)、乳癌（例如原位導管癌、浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、乳小葉原位癌、男性女乳症)、Castleman病(例如巨淋巴結增生、血管濾泡性淋巴結增生)、宮頸癌、大腸癌、子宮內膜癌(例如子宮內膜腺癌、腺癌、乳頭狀漿液性腺癌、透明細胞)食道癌、膽囊癌(黏蛋白腺癌、小細胞癌)、胃腸道類癌（例如絨毛膜癌，絨毛膜腺瘤)、霍奇金氏(Hodglin)病、非霍奇金淋巴瘤、Kaposai肉瘤、腎癌(例如腎細胞癌)、喉和下嚥癌、肝癌(例如血管瘤、肝腺瘤、局灶性結節性增生、肝細胞癌)、肺癌(例如小細胞肺癌，非小細胞肺癌)、間皮瘤、漿細胞瘤、鼻腔和鼻旁竇癌(例如食管神經母細胞瘤(esophioneuroblastoma)、中線肉芽腫)、鼻咽癌、神經母細胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤(例如胚胎性橫紋肌瘤、肺泡橫紋肌肉瘤、多形橫紋肌肉瘤)、唾液腺癌、皮膚癌(包括黑色素瘤和非黑色素瘤皮膚癌)、胃癌、睾丸癌（例如精原細胞瘤、非精原細胞瘤生殖細胞癌)、胸腺癌、甲狀腺癌（例如濾泡癌、間變性癌、低分化癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺淋巴瘤)、陰道癌、外陰癌和子宮癌（例如子宮平滑肌肉瘤)。

在一些實施態樣中，個體具有低腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)及/或受損的腫瘤IFNγ信號。

所描之方法可用於引起以下一種多種：使腫瘤發炎、誘導T細胞向腫瘤或腫瘤微環境的浸潤(增加腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的數量)、增強全身性T細胞應答、誘導腫瘤特異性T細胞活化、增加抗原特異性T細胞應答、增加抗原特異性T細胞增殖、增加多選殖T細胞應答，增強針對已治療和/或未治療腫瘤的免疫應答、減少T細胞衰竭、增加一或多種治療或未經治療的腫瘤中的淋巴細胞和單核細胞表面標識、增加一或多種治療或未經治療的腫瘤中的腫瘤內INFγ調節基因的量、增加個體血液中增殖的效應記憶T細胞、增加個體血液中短時效應細胞、增加癌性腫瘤中活化的自然殺傷細胞中存在的基因的表現、增加在癌性腫瘤中與抗原呈現功能相關的基因的表現、增加在癌性腫瘤中在T細胞存活及T細胞調節的細胞毒性中起作用的基因的表現、誘導已治療及/或未治療腫瘤的消減、誘導已治療及/或未治療腫瘤的減滅、並改善對第二種療法的反應，例如但不限於免疫檢查點抑制劑療法。在一些實施態樣中，對腫瘤的免疫反應的增強會導致個體的存活率增加。

在一些實施態樣中，所述之方法，包含處理患有癌性腫瘤之個體，注射有效劑量之編碼CXCL9的質體至癌性腫瘤，且施予電穿孔治療至腫瘤。在一些實施態樣中，所述方法，包含處理患有癌性腫瘤個體包含：注射有效劑量之編碼CD3 half-BiTE的質體至惡性腫瘤，且施予電穿孔治療至腫瘤。在一些實施態樣中，所述之方法，包含處理患有癌性腫瘤的個體包含：注射有效劑量之編碼抗-CTLA-4 scFv的質體至惡性腫瘤，且施予電穿孔治療至腫瘤。在一些實施態樣中，該質體實質上同時與電穿孔治療施予。術語「實質上同時」表示相對時間，如在電脈衝對細胞做減弱之前，合理地將分子及電穿孔處理緊密地一起施予。

在一些實施態樣中，所述之方法會導致腫瘤或腫瘤微環境中NK細胞及T細胞群的增加。CXCL9、IL12~CXCL9、CD3 half-BiTE~IL12、及/或CD3 half-BiTE的IT-EP會增加腫瘤特異性T細胞導向腫瘤、會增加腫瘤特異性T細胞的激活及/或增生、及/或會增加CD8+T細胞、NK細胞、以及NKT細胞向腫瘤圍環境的募集。T細胞的激活可到至活化的T細胞對腫瘤細胞的殺傷增加。

在一些實施態樣中，經由IT-EP施予IL-12治療可增強腫瘤的T細胞浸潤。在腫瘤中CD3 half-BiTE的後續表現可激活T細胞，進而增強抗源特異性T細胞的群體。

在一些實施態樣中，IT-EP CXCL9治療可增強IL-12效應會導致腫瘤特異性淋巴細胞的有效運輸(trafficking)增加。

在一些實施態樣中，IT-EP CXCL9治療可抑制在腫瘤或腫瘤圍環境中的血管新生。在一些實施態樣中，合併IT-EP CXCL9與IL-12治療會增加腫瘤特異性淋巴細胞至腫瘤的運輸。

在一些實施態樣中，編碼CXCL9的表現卡匣的腫瘤內電穿孔可以與其他治療實體一起施予。在一些實施態樣中，IT-EP CXCL9治療是合併IL-12治療。IL-12治療可能發生在IT-EP CXCL9治療之前、同時及/或之後。IL-12治療可以在IT-EP CXCL9治療之前及同時發生。IL-12治療可以在IT-EP CXCL9治療之前及之後發生。IL-12治療可以與IT-EP CXCL9治療同時發生，也可以在IT-EP CXCL9治療之後發生。IL-12治療可能在IT-EP CXCL9治療之前、同時及之後發生。IT-EP CXCL9治療可以在IL-12治療之前、同時及/或之後發生。IT-EP CXCL9治療可能在IL-12治療之前及同時發生。IT-EP CXCL9治療可能在IL-12治療之前及之後發生。IT-EP CXCL9治療可能在IL-12治療之前、同時和之後發生。在一些實施態樣中，IL-12治療是經由編碼IL-12表現卡匣之IT-EP來施予。CXCL9和IL-12可以由單個表現卡匣或質體表現，也可以由多個表現卡匣或質體表現。在一些實施態樣中，對於同時治療，IT-EP CXCL9-IL12治療、CXCL9和IL-12從單個表現卡匣或質體表現。

在一些實施態樣中，編碼CD3 half-BiTE的表現卡匣的腫瘤內電穿孔可以與其他治療實體一起施予。在一些實施態樣中，IT-EP CD3 half-BiTE治療是合併IL-12治療。IL-12治療可能發生在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前、同時及/或之後。IL-12治療可以在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前及同時發生。IL-12治療可以在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前及之後發生。IL-12治療可以與IT-EP CD3 half-BiTE治療同時及之後發生。IL-12治療可能在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前、同時及之後發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可以在IL-12治療之前、同時及/或之後發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可以在IL-12治療之前及同時發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可以在IL-12治療之前發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可以在IL-12治療同時及之後發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可以在IL-12治療之前、同時及之後發生。在一些實施態樣中，IL-12治療是經由編碼IL-12表現卡匣表現之IT-EP來施予。CD3 half-BiTE和IL-12可以由單個表現卡匣或質體表現，或可以由多個表現卡匣或質體表現。在一些實施態樣中，對於同時治療，IT-EP CD3 half-BiTE-IL12治療、CD3 half-BiTE及IL-12從單個表現卡匣或質體表現。

在一些實施態樣中，IT-EP CXCL9治療與IT-EP CD3 half-BiTE治療合併。在一些實施態樣中，IT-EP CXCL9及/或IT-EP CD3 half-BiTE治療與IL-12治療合併。IT-EP CD3 half-BiTE治療可在IT-EP CXCL9治療之前、同時及/或之後發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可在IT-EP CXCL9治療之前及同時發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可在IT-EP CXCL9治療之前及之後發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可在IT-EP CXCL9治療同時及之後發生。IT-EP CD3 half-BiTE治療可在IT-EP CXCL9治療之前、同時及之後發生。IT-EP CXCL9治療可在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前、同時及/或之後發生。IT-EP CXCL9治療可在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前及同時發生。IT-EP CXCL9治療可在IT-EP CD3 half-BiTE治療之前及之後發生。IT-EP CXCL9治療可在IT-EP CD3 half-BiTE治療同時及之後發生。IT-EP CXCL9治療可在IT-EP CD3 half-BiTE之前、同時及之後發生。CXCL3或CD half-BiTE治療任一者與IL-12治療合併，例如經由分別編碼CXCL9及IL-12或CD3-hallf-BiTe與IL-12兩者的表現卡匣或質體之IT-EP(如IT-EP IL12~CXCL9及IT-EP CD3 half-BiTE~IL12治療)。

在一些實施態樣中，IT-EP CD3 half-BiTE 治療或IT-EP CD3 half-BiTE~IL-12治療與一或多個IT-EP IL12治療、IT-EP CXCL9治療、以及IT-EP IL12~CXCL9治療共施予。

在一些實施態樣中，將所述之表現卡匣與一或多種藥學上可接受的賦形劑合併。藥學上可接受的賦形劑(excipients)是除活性藥物成分(API，治療產品)外有意包含在API(分子)中的物質。賦形劑不以或不以預期劑量發揮治療作用。賦形劑可起到以下作用：a)在製造過程中協助API的加工； b)保護、支持或增強API的穩定性，生物利用度或個體可接受性； c)協助產品識別；及/或d)在存儲或使用過程中增強API的其他任何屬性以提供API的總體安全性、有效性。藥學上可接受的賦形劑可為或可非為惰性物質。賦形劑包括，但不限於：吸收加強子、抗黏劑、消泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩沖劑、載體、包衣劑、著色劑、遞送加強子、遞送聚合物、右旋糖酐、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、助流劑、濕潤劑、潤滑劑、油、聚合物、防腐劑、鹽水、鹽、溶劑、糖、懸浮劑、緩釋基質、甜味劑、增稠劑、張度劑、媒介物、防水劑及濕潤劑。 VII. 治療方案/週期

所述之IT-EP治療可在各種間隔施予，取決於這些因素，例如腫瘤的性質、個體的狀況、分子大小及化學特徵以及分子半衰期。

在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含施予IT-EP IL12治療，接者進行IT-EP CXCL9以及/或IT-EP IL12~CXCL9治療。IT-EP CXCL或IT-EP IL12~CXCL9治療可增加腫瘤特異性T細胞向腫瘤或腫瘤圍環境之募集及/或T細胞的激活。在一些實施態樣中，給予腫瘤IT-EP IL12治療的第0天(±1天)及給予腫瘤IT-EP CXCL9治療的第4天(±2天)及第7天(±2天)。在一些實施態樣中，給予腫瘤IT-EP IL12治療的第0天及給予IT-EP IL12~CXCL9治療至腫瘤的第4天(±2天)及第7天(±2天)。

在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含施予IT-EP IL12治療，接者進行IT-EP CD3 half-BiTE及/或CD3 half-BiTE~IL12治療。在一些實施態樣中，給予腫瘤IT-EP IL12治療的第0天(±1天)及給予腫瘤IT-EP CD3 half-BiTE治療的第4天(±2天)及第7天(±2天)。在一些實施態樣中，給予腫瘤IT-EP IL12治療的第0天及給予腫瘤IT-EP CD3 half-BiTE~IL12治療的第4天(±2天)及第7天(±2天)。

在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含IT-EP IL12治療，接者進行IT-EP CXCL或IT-EP IL12~CXCL9治療、及/或IT-EP CD3 half-BiTE或IT-EP CD3 half-BiTE~IL-12治療。

在一些實施態樣中，首先施予IT-EP IL12治療以增加腫瘤浸潤淋巴細胞。該腫瘤之後以IT-EP CXCL9或IL12~CXCL9治療及/或IT-EP CD3 half-BiTE或IT-EP CD3 half-BiTE~IL-12治療來處理。

治療週期可包含1-6 IT-EP治療。在一些實施態樣中，治療週期包含1、2、或3 IT-EP治療。週期可從約1週至約6週、或從約2週至約5週。在一些實施態樣中，週期為約3週。

在一些實施態樣中，週期包含1-3 IT-EP處理。該處理可在第1天(±2天)、第5天(±2天)及/或第8天(±2天)發生(如第0天(±2天)、第4天(±2天)及/或第7天(±2天))。每個處理可包含一或多個IT-EP IL2、IT-EP CXCL9、IT-EP IL12~CXCL9、IT-EP CD3 half-BiTE、IT-EP CD3 half-BiTE~IL12、以及IT-EP抗-CTLA4 scFv。

在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含：在週期的第1天施予IT-EP IL12治療及在週期的第5天(±2天)及第8天(±2天)施予IT-EP CXCL9或IT-EP IL12~CXCL9。在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含：在週期的第1天施予IT-EP IL12治療及在週期的第5天(±2天)及第8天(±2天)施予IT-EP CD3 half-BiTE、IT-EP CD3 half-BiTE~IL12。在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含：在週期的第1天施予IT-EP IL12治療及在週期的第5天(±2天)及第8天(±2天)施予一或多種IT-EP CXCL9、IT-EP IL12~CXCL9、IT-EP CD3 half-BiTE、以及IT-EP CD3 half-BiTE~IL12。

在一些實施態樣中，描述一種用於處理腫瘤的方法，包含：a) 在第一週期施予IT-EP IL12治療，b)在第二週期施予IT-EP CXCL9或IT-EP IL12~CXCL9治療，以及c) 在第三週期施予IT-EP CD3 half-BiTE或IT-EP CD3 half-BiTE~IL-12治療。每個週期可包含相對於IT-EP治療的1-3次施予。

所述之劑量方案包含施予IT-EP IL12治療合併IT-EP CXCL9治療及/或IT-EP CD3 half-BiTE治療。亦描述劑量方案包含施予IT-EP CXCL9或IL12~CXCL9治療與IT-EP CD3 half-BiTE或IT-EP CD3 half-BiTE~IL12治療。該治療可同時、之後、或分別施予。在一些實施態樣中，IT-EP IL12治療可在第一週期施予及IT-EP CXCL9治療或IT-EP IL12~CXCL9治療在第二週期施予。在一些實施態樣中，IT-EP IL12治療在第一週期施予及IT-EP CD3 half-BiTE治療或IT-EP CD3 half-BiTE-IL12治療在第二週期施予。在一些實施態樣中，IT-EP IL12治療在第一週期施予，IT-EP CXCL9治療或IT-EP CXCL9-IL12治療在第二週期施予，以及IT-EP CD3 half-BiTE治療或IT-EP CD3 half-BiTE-IL12治療在第三週期施予。該IT-EP治療可各週期的第1天傳遞。必要時可重複一或多個週期。在週期內，該IT-EP治療可在週期的至少第一、二、或三天施予。例如，施予表現卡匣可在第1天、第5天(±2天)及/或第8天(±2天)施予。

在一些實施態樣中，CXCL9或IL12~CXCL9加IL-12之表現卡匣在週期的第1天、第5±2天、及第8±2天施予。在一些實施態樣中，CTLA-4 scFv或抗-CTLA-4 scFv加IL-12之表現卡匣在週期的第1天、第5±2天、及第8±2天施予。在一些實施態樣中，CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣在週期的第1天、第5±2天、及第8±2天施予。

在一些實施態樣中，CXCL9或CXCL9加IL-12之表現卡匣(如IL12~CXCL9)在週期的第1天、及第5±2天施予，以及CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣(如CD3 half-BiTE~IL12)在週期的第8±2天施予。在一些實施態樣中，CXCL9或CXCL9加IL-12之表現卡匣在週期的第1天施予，以及CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣在週期的第5±2天及第8±2天施予。在一些實施態樣中，CXCL9或CXCL9加IL-12之表現卡匣在週期的第1天及第8±2天施予，及CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣在週期的第5±2天施予。

在一些實施態樣中，CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣在週期的第1天及第5±2天施予，以及CXCL9或CXCL9加IL-12之表現卡匣在週期的第8±2天施予。在一些實施態樣中，CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣在週期的第1天施予，以及CXCL9或CXCL9加IL-12之表現卡匣在週期的第5±2天及第8±2天施予。在一些實施態樣中，CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE加IL-12之表現卡匣在週期的第1天及第8±2天施予，以及CXCL9或CXCL9加IL-12之表現卡匣在週期的第5±2天施予。

在一些實施態樣中，IL-12-2A之表現卡匣在週期的第1天施予，以及CXCL9或L12~CXCL9之表現卡匣在週期的第5±2天以及第8±2天施予。在一些實施態樣中，IL-12-2A之表現卡匣在週期的第1天及第5±2天施予，以及CXCL9或IL12~CXCL9之表現卡匣在週期的第8±2天施予。

在一些實施態樣中，IL-12-2A之表現卡匣在週期的第1天施予，以及CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE~IL-12之表現卡匣在週期的第5±2天及第8±2天施予。在一些實施態樣中，IL-12-2A之表現卡匣在週期的第1天及第5±2天施予，以及CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE~IL-12之表現卡匣在週期的第8±2天施予。

在一些實施態樣中，IL12-2A表現卡匣在週期的第1天施予，CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE~IL-12之表現卡匣在週期的第5±2天施予，以及CXCL9或IL12~ CXCL9之表現卡匣在週期的第8±2天施予。在一些實施態樣中，IL-12-2A之表現卡匣在週期的第1天施予，CXCL9或IL12~CXCL9之表現卡匣在週期的第5±2天，以及CD3 half-BiTE或CD3 half-BiTE~IL-12之表現卡匣在週期的第8±2天。

在一些實施態樣中，在第0、4(±2天)、以及7(±2天)天施予個體IT-EP IL-12~CXCL9治療或IT-EP CD3 half-BiTE~IL12治療任一者，前提是該個體者接受至少一種IT-EP處理與IL-12~CXCL9及一種IT-EP處理與CD3 half-BiTE~IL12。

在一些實施態樣中，可每個週期或每個其他週期進行一次治療。可重複週期以使得投予個體2或多個週期。經重複的週期可與一或多個治療週期連續、交替施予，或與一或多個不同治療週期同時進行。任何上述治療可與其他癌症治療合併。例如，可將IT-EP週期與檢查點抑制劑療法合併。 VIII.合併治療

在一些實施態樣中，治療方法包含合併治療。合併治療包含治療分子或處理的組合。治療處理包含，但不限於電脈衝(如電穿孔)、放射線、抗體治療、檢查點抑制劑療法、以及化學治療。在一些實施態樣中，合併治療的施予為僅經由電穿孔即可實現。在一些實施態樣中，合併治療的施予為經由電穿孔及全身傳遞之組合來實現。在一些實施態樣中，合併治療的施予為經由電穿孔及放射線之組合來實現。在一些實施態樣中，合併治療的施予為經由電穿孔及口服藥物之組合來實現。治療性電穿孔可與一或多種其他的治療處理組合或一起施予。一或多種其他的治療可經由全身性傳遞、種瘤內注射、電穿控腫瘤內注射、及/或放射線來傳遞。一或多種其他的治療可在CXCL9及/或CD3 half-BiTE電穿孔治療之前、同時或之後施予。

在一些實施態樣中，描述一種用於處理癌症的方法，包含：在3-6週之週期的第1天、第1及5天(±2天)、第1及8天(±2天)、或第1、5(±2天)、及8天(±2天)施予IT-EP治療以及在3-6週之週期的第1天施予其他治療處理。在一些實施態樣中，描述一種用於處理癌症的方法，包含：每其他週期(即每6週)的第1天、第1及5天(±2天)、第1及8天(±2天)、或第1、5天(±2天)、及第8天(±2天)施予IT-EP治療以及每3週週期的第1天施予其他治療處理(如每3週)。在一些實施態樣中，其他的治療處理包含檢查點抑制劑。 IX. 電穿孔(EP)治療

電穿孔治療包含對細胞、組織、或腫瘤施予至少一種電穿孔脈衝。電穿孔治療可使用任何已知適用於哺乳類動物個體的電穿孔裝置進行。所述之表現卡匣可在施予電脈衝之前、期間或之後施予至個體。表現卡匣可在個體腫瘤處或附近施予。所述之表現卡匣可使用皮下注射針頭注射至腫瘤。

在一些實施態樣中，電穿孔治療包含一或多個電壓脈衝。待產生的電場的性質由組織的性質、所選擇組織的大小及其位置來確定。可以傳遞至腫瘤的電壓脈衝可為約100V/cm至約1500V/cm。在一些實施態樣中，該電壓脈衝為約700V/cm至1500V/cm。在一些實施態樣中，該電壓脈衝可為約600V/cm、650V/cm、700V/cm、750V/cm、800V/cm、850V/cm、900V/cm、950V/cm、1000V/cm、1050V/cm、1100V/cm、1150V/cm、1200V/cm、1250V/cm、1300V/cm、1350V/cm、1400V/cm、1450V/cm、或1500V/cm。在一些實施態樣中，該電壓脈衝為約10V/cm至700V/cm。在一些實施態樣中，該電力為約100V/cm、150V/cm、200V/cm、250V/cm、300V/cm、350V/cm、或400V/cm、450V/cm、500V/cm、550V/cm、600V/cm、650V/cm、或700V/cm。

電穿孔脈衝的脈衝持續時間可以從10μsec到1秒。在一些實施態樣中，脈衝持續時間從約10μsec到約100毫秒(ms)。在一些實施態樣中，脈衝持續時間為100μsec、1ms、10ms或100ms。脈衝組之間的間隔可以是任何期望的時間，例如一秒。該波形、電場強度和脈衝持續時間還可取決於細胞的類型和經由電穿孔進入細胞的分子的類型。

脈衝產生器提供電信號的波形可亦在指數衰減脈衝、方型脈衝、單極振盪脈衝串、雙極震振脈衝串、或該些形式中的任何一種的組合。方形波的電穿孔系統傳遞受控制的電脈衝，這些電脈衝會迅速上升到設定電壓，在設定的時間段(脈衝長度)內保持在該水平、然後迅速下降到零。

可施予1至100脈衝。在一些實施態樣中，可施予1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個脈衝。在一些實施態樣中，施予6個脈衝。在一些實施態樣中，施予6×0.1msec脈衝。在一些實施態樣中，施予6個脈衝。在一些實施態樣中，以1300-1500V/cm施予6×0.1msec脈衝。在一些實施態樣中，施予8個脈衝。在一些實施例中，施予8×10msec脈衝。在一些實施態樣中，以300-500V/cm施予8×10msec脈衝。

該電穿孔裝置可包含單個針狀電極，一對針狀電極及多個或針狀電極列。在一些實施態樣中，該電穿孔裝置可包含皮下注射針或等同物。在一些實施態樣中，電穿孔裝置可包含電洞裝置(「EKD裝置」)能夠基於使用者的控制及脈衝參數之輸入在陣列中的電極之間產生一系列可編成的恆定電流脈衝圖案。

適用於所述之化合物、組成物、及方法的電穿孔裝置，包含但不限於美國專利第7245963號、第5439440號、第6055453號、第6009347號、第9020605號及第9037230、及美國專利公開第2005/0052630號、第2019/0117964、專利申請第PCT/US2019/030437號及美國專利申請第16/269,022號。實施態樣列表：

1. 一種表現卡匣，其包含：編碼CD3 half-BiTE的第一核苷酸序列，其中該CD3 half-BiTE包含抗‑CD3 scFv及跨膜結構域(transmembrane domain)，其中該跨膜結構域係與該抗‑CD3 scFv的C末端連接。

2. 實施態樣1之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列與啟動子可操作地連接。

3. 實施態樣2之表現卡匣，其中該啟動子係選自以下所組成之群組：CMV啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、皰疹性胸苷激酶啟動子、單純皰疹性病毒(HSV)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子及EF1α啟動子。

4. 實施態樣1-3中任一個之表現卡匣，其中該抗-CD3 scFv包含OKT3(莫羅莫那(Muromonab)-CD3)、145-2C11、17A2、SP7或UCHT1抗體的VH及VL結構域的CDR。

5. 實施態樣4之表現卡匣，其中該抗-CD3 scFv包含OKT3(莫羅莫那(Muromonab)-CD3)、145-2C11、17A2、SP7或UCHT1抗體或其人化抗體的VF及VL結構域。

6. 實施態樣1-5中任一個之表現卡匣，其中該跨膜結構域係選自以下所組成之群組：PDGFRα跨膜結構域及PDGFRβ跨膜結構域。

7. 實施態樣1-6中任一個之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO: 60、62、74或76的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 60、62、74或76至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。

8. 實施態樣1-7中任一個之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 59、61、73或75的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 59、61、73或75至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核苷酸序列。

9. 實施態樣2-8中任一個之表現卡匣，其進一步包含編碼IL‑12的第二核苷酸序列。

10. 實施態樣9之表現卡匣，其中該編碼IL‑12的第二核苷酸序列包含編碼IL-12 p35的第一編碼序列及編碼IL-12 p40的第二編碼序列。

11. 實施態樣10之表現卡匣，其中該表現卡匣包含下式： P – A – T – B – T – B′ 其中P為該啟動子，A編碼該CD3 half-BiTE，T為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35且B′編碼IL‑12 p40。

12. 實施態樣11之表現卡匣，其中T編碼選自以下所組成群組之2A胜肽：P2A胜肽、T2A胜肽、E2A胜肽及F2A胜肽。

13. 實施態樣12之表現卡匣，其中A編碼包含SEQ ID NO: 60、62、74或76的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 60、62、74或76至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；B編碼包含SEQ ID NO: 31或53的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 31或53至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；且B′編碼包含SEQ ID NO: 33或56的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 33或56至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。

14. 實施態樣12之表現卡匣，其中A包含SEQ ID NO: 59、61、73或75的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 59、61、73或75的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；B 包含SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列或具有與SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；且B′包含SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。

15. 實施態樣1-14中任一個之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO: 64、66、78或80的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 64、66、78或80至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。

16. 實施態樣1-15中任一個之表現卡匣，其中該表現卡匣包含SEQ ID NO: 63、65、77或79的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 63、65、77或79的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。

17. 實施態樣1-14中任一個之表現卡匣，其中該表現卡匣進一步編碼與抗-CD3 scFv的N-末段或C-末段任一者連接的標識(tag)序列。

18. 實施態樣17之表現卡匣，其中該標識序列包含至少一個選自以下標識序列所成的群組：HA標識及Myc標識。

19. 一種表現CD3 half-BiTE之質體，其包含如實施態樣1-18中任一個之表現卡匣。

20. 一種CD3 half-BiTE，其包含與跨膜結構域融合的抗-CD3單鏈可變片段(scFv)。

21. 如實施態樣1-18中任一個之表現卡匣或如實施態樣19之質體，其係用於治療癌症。

22. 一種如下式表示之表現卡匣： P – B – T – B′ – T – A 其中P為啟動子，A編碼CXCL9，T為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35且B′編碼IL‑12 p40。

23. 如實施態樣22之表現卡匣，其中T編碼選自以下所組成群組之2A胜肽：P2A胜肽、T2A胜肽、E2A胜肽及F2A胜肽。

24. 如實施態樣22或23之表現卡匣，其中A編碼包含SEQ ID NO: 35或58的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 35或57至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；B編碼包含SEQ ID NO: 31或53的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 31或53至少 70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；且B′編碼包含SEQ ID NO: 33或56的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 33或56至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。

25. 如實施態樣22-24中任一個之表現卡匣，其中A包含SEQ ID NO: 34或57的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 34或57的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；B包含SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；且B′包含SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。

26. 如實施態樣22-25中任一個之表現卡匣，其中該表現卡匣編碼包含SEQ ID NO: 68或82的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 68或82至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。

27. 如實施態樣22-26中任一個之表現卡匣，其中該表現卡匣包含SEQ ID NO: 67或81的核苷酸序列或包含具有與至少SEQ ID NO: 67或81的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性核苷酸序列。

28. 一種表現CXCL9及IL-12之質體，其包含如實施態樣22-27中任一個之表現卡匣。

29. 如實施態樣22-27中任一個之表現卡匣或如實施態樣28之質體，其係用於治療癌症。

30. 一種用於治療癌症的編碼CD3 half-BiTE之表現卡匣及編碼CXCL9之表現卡匣，其中該等表現卡匣係經配製以供腫瘤內電穿孔治療。

31. 一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含以有效劑量的至少一種如實施態樣19或28之質體注射至該腫瘤及對該腫瘤施予電穿孔治療。

32. 如實施態樣31之方法，其中該電穿孔治療包含在約100微秒至約1毫秒的持續時間內施予至少一個電壓脈衝。

33. 如實施態樣32之方法，其中該電穿孔治療包含施予1-6個電壓脈衝。

34. 如實施態樣32或33之方法，其中該1-10個電壓脈衝具有約200V/cm至約1500V/cm的場強度。

35. 如實施態樣31-34中任一個之方法，其中該至少一個質體注射至該腫瘤，且在第1天、第5±2天及第8±2天對該腫瘤施予該電穿孔治療。

36. 如實施態樣31-34中任一個之方法，其中 (a) 如實施態樣19之質體注射至該腫瘤且在第1及5±2天施予該電穿孔治療，且如實施態樣28之質體注射至該腫瘤且在第8±2天施予該電穿孔治療； (b) 如實施態樣19之質體注射至該腫瘤且在第1及8±2天施予該電穿孔治療，且如實施態樣28之質體注射至該腫瘤且在第5±2天施予該電穿孔治療； (c) 如實施態樣19之質體注射至該腫瘤且在第5±2及8±2天施予該電穿孔治療，且如實施態樣28之質體注射至該腫瘤且在第1天施予該電穿孔治療； (d) 如實施態樣28之質體注射至該腫瘤且在第1及5±2天施予該電穿孔治療，且如實施態樣19之質體注射至該腫瘤且在第8±2天施予該電穿孔治療； (e) 如實施態樣28之質體注射至該腫瘤且在第1及8±2天施予該電穿孔治療，且如實施態樣19之質體注射至該腫瘤且在第5±2天施予該電穿孔治療；及 (f) 如實施態樣28之質體注射至該腫瘤且在第5±2及8±2天施予該電穿孔治療，且如實施態樣19之質體注射至該腫瘤且在第1天施予該電穿孔治療。

37. 如實施態樣31-36中任一個之方法，其進一步包含施予該個體至少一種其他治療。

38. 如實施態樣31-37中任一個之方法，其中該方法導致下述之一或多者：增加腫瘤浸潤性淋巴細胞、增加腫瘤特異性T細胞之激活及/或增生、經治療的腫瘤之消減及一或多種未經治療的腫瘤之消減。

39. 如實施態樣37之方法，其中該至少一種其他治療包含施予IT-EP抗-CLTA-4 scFv治療。

40. 一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含以有效劑量的至少一種編碼抗-CTLA-4 scFv的質體注射至該腫瘤及對該腫瘤施予電穿孔治療。

41. 如實施態樣40之方法，其中該方法進一步包含下述之一或多者：IT-EP IL12治療、IT-EP CXCL9治療、IT-EP IL12~CXCL9治療、IT-EP CD3 half-BiTE治療及IT-EP CD3 half-BiTE~IL12治療。表 1. 序列 (在括號中的核苷酸或胺基酸可存在或不存在)

Igκ 訊號胜肽核酸序列 (SEQ ID NO: 1)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac

Igκ 訊號胜肽胺基酸序列 (SEQ ID NO: 2)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGD

HA 標識核酸序列 (SEQ ID NO: 3)

tatccatatgatgttccagattatgct

HA 標識胺基酸序列 (SEQ ID NO: 4)

YPYDVPDYA

Myc 標識核酸序列 (SEQ ID NO: 5)

gaacaaaaactcatctcagaagaggatctg

Myc 標識胺基酸序列 (SEQ ID NO: 6)

EQKLISEEDL

2C11 可變重鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 7)

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggaaagtccctgaaactctcctgtgaggcctctggattcaccttcagcggctatggcatgcactgggtccgccaggctccagggagggggctggagtcggtcgcatacattactagtagtagtattaatatcaaatatgctgacgctgtgaaaggccggttcaccgtctccagagacaatgccaagaacttactgtttctacaaatgaacattctcaagtctgaggacacagccatgtactactgtgcaagattcgactgggacaaaaattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctcaggtggcggt

2C11 可變重鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 8) EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGG

2C11 可變輕鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 9)

atgacccagtctccatcatcactgcctgcctccctgggagacagagtcactatcaattgtcaggccagtcaggacattagcaattatttaaactggtaccagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctattatacaaataaattggcagatggagtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggagagattcttctttcactatcagcagcctggaatccgaagatattggatcttattactgtcaacagtattataactatccgtggacgttcggacctggcaccaagctggaaatcaaa

2C11 可變輕鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 10)

atgacccagtctccatcatcactgcctgcctccctgggagacagagtcactatcaattgtcaggccagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctattatacaaataaattggcagatggagtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggagagattcttctttcactatcagcagcctggaatccgaagatattggatcttattactgtcaacagtattataactatccgtggacgttcggacctggcaccaagctggaaatcaaa

2C11 可變輕鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 11)

MTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIK

連接子核酸序列 (SEQ ID NO: 12)

agtggctctggagggggctctggcggtggatctgggggtggaagt

連接子胺基酸序列 (SEQ ID NO: 13

SGSGGGSGGGSGGGS

連接子核酸序列 (SEQ ID NO: 14)

ggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct

連接子胺基酸序列 (SEQ ID NO: 15)

GGGGSGGGGSGGGGS

連接子核酸序列 (SEQ ID NO: 16)

ggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct

連接子胺基酸序列 (SEQ ID NO: 17)

GSGGGGSGGGG

連接子核酸序列 (SEQ ID NO: 18)

ggcagtgggagtgggagtgggagtggg

連接子胺基酸序列 (SEQ ID NO: 19)

GSGSGSGSG

連接子核酸序列 (SEQ ID NO: 20)

ggcagtgggagtggg

連接子胺基酸序列 (SEQ ID NO: 21)

GSGSG

連接子核酸序列 (SEQ ID NO: 22)

tctagtggatccggt

連接子胺基酸序列 (SEQ ID NO: 23)

SSGSG

PDGFR TM 片段核酸序列 (SEQ ID NO: 24) gtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt

PDGFR TM 片段胺基酸序列 (SEQ ID NO: 25)

VGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR

PDGFR TM 片段核酸序列 (SEQ ID NO: 26)

gctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt

PDGFR TM 片段胺基酸序列 (SEQ ID NO: 27)

AVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR

P2A 核酸序列 (SEQ ID NO: 28)

ggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggcccc

P2A 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 29)

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP

mIL12-p35 核酸序列 (SEQ ID NO: 30)

(ggtacc或atg)gtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttgg ccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctTgacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgcc

mIL12-35 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 31)

(M)VSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAAAA

mIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 32)

tgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttctTgatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaGaatttcaaGaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatcc(tag 或 tcg)

mIL12-p40 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 33)

CPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS(S)

mCXCL9 核酸序列 (SEQ ID NO: 34)

(atg)aagtccgctgttcttttcctcttgggcatcatcttcctggagcagtgtggagttcgaggaaccctagtgataaggaatgcacgatgctcctgcatcagcaccagccgaggcacgatccactacaaatccctcaaagacctcaaacagtttgccccaagccccaattgcaacaaaactgaaatcattgctacactgaagaacggagatcaaacctgcctagatccggactcggcaaatgtgaagaagctgatgaaagaatgggaaaagaagatcagccaaaagaaaaagcaaaagagggggaaaaaacatcaaaagaacatgaaaaacagaaaacccaaaacaccccaaagtcgtcgtcgttcaaggaagactaca(taa)

mCXCL9 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 35)

(M)KSAVLFLLGIIFLEQCGVRGTLVIRNARCSCISTSRGTIHYKSLKDLKQFAPSPNCNKTEIIATLKNGDQTCLDPDSANVKKLMKEWEKKISQKKKQKRGKKHQKNMKNRKPKTPQSRRRSRKTT

Mouse 抗 -CTLA-4 9D9 可變輕鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 36)

gacattgtgatgacacagaccacactcagtctccccgtttcccttggtgatcaagcctccatatcctgtaggtctagtcaatctatcgtccactccaacggcaatacctatctggaatggtatcttcaaaagcccggacaatcaccaaagcttcttatctataaggtgagcaatagatttagcggggtccctgaccgattctctggaagtggctctggcacagactttaccttgaaaatctccagagttgaggctgaggaccttggtgtatactactgcttccaaggctctcatgttccctacactttcggaggcggaacaaaactggagataaaacgagccgacgcagcccccactgtg

Mouse 抗 -CTLA-4 9D9 可變輕鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 37)

DIVMTQTTLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTV

Mouse 抗 -CTLA-4 9D9 可變重鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 38)

gaggcaaagcttcaggaatctggtccagtgttggtgaaaccaggtgcatccgtgaaaatgtcctgcaaagcaagcggttacacttttactgactattatatgaactgggtaaagcaatcccacggcaaatccctggaatggattggtgtcatcaacccttacaacggtgatacaagttacaaccaaaagttcaaaggtaaggctacattgaccgtagataagagtagcagtactgcatacatggaacttaactctcttacatccgaggactccgctgtttactattgtgcacgctactacgggagctggttcgcttactggggtcaaggcaccctgataacagtgtccacagccaaaaccacacctccctccgtctatcctctcgctcca

Mouse 抗 -CTLA-4 9D9 可變重鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 39)

EAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSTAKTTPPSVYPLAP

Mouse 抗 -CTLA-4 9H10 可變輕鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 40)

gacattgtgatgacacagagtccttcatcccttgcagtcagtgtcggcgaaaaagtaacaatttcatgcaagtctagtcaatctctgttgtacggctcctctcattacctcgcatggtatcaacaaaaagtgggtcaatctcccaaattgttgatatactgggcttcaactagacacactggaatccctgacaggttcattggtagcggatcagggactgactttacactgtccctcagcagcgtacaagcagaagacatggccgactatttctgccaacaatactttagtacaccatggacctttggggctgggaccagagttgagataaaa

Mouse 抗 -CTLA-4 9H10 可變輕鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 41)

DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTISCKSSQSLLYGSSHYLAWYQQKVGQSPKLLIYWASTRHTGIPDRFIGSGSGTDFTLSLSSVQAEDMADYFCQQYFSTPWTFGAGTRVEIK

Mouse 抗 -CTLA-4 9H10 可變重鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 42)

caagtgcagctgcttcaatccgaatcagaactcgtgaagccaggcgcttcagtgaaattgtcttgtaagacttcaggatacactttcactgattactatatacactgggttaagcagaagcctggtcagggtcttgaatggattggcctcatcaatcccaataacgatggcacaaactacaaccagaaatttcaaggaaaagccacacttaccgcagacaaatccagttctaccgcatacatggaacttaatagtctcacttttgatgactcagtaatatatttctgtgccagggccagtagccgacttagaatggctaggactacctctgactactatgccatggactattggggacagggcattcaagtgaccgtgagctct

Mouse 抗 -CTLA-4 9H10 可變重鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 43)

QVQLLQSESELVKPGASVKLSCKTSGYTFTDYYIHWVKQKPGQGLEWIGLINPNNDGTNYNQKFQGKATLTADKSSSTAYMELNSLTFDDSVIYFCARASSRLRMARTTSDYYAMDYWGQGIQVTVSS

mIgG1 Fc 結構域核酸序列 (SEQ ID NO: 44)

ggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga

mIgG1 Fc 結構域胺基酸序列 (SEQ ID NO: 45)

GCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

OKT3 可變重鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 46)

caggtgcagctgcagcaatctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccacactcaccgtctcctca

OKT3 可變重鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 47)

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS

OKT3 可變輕鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 48)

Cagattgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggttaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagatcaatcgt

OKT3 可變輕鏈核酸序列 (SEQ ID NO: 49)

cagattgtgctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggttaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtatcagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagatcaatcgt

OKT3 可變輕鏈胺基酸序列 (SEQ ID NO: 50)

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR

hIL12-p35 核酸序列 (SEQ ID NO: 51)

tggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc

hIL12-p35 核酸序列 (SEQ ID NO: 52)

(atg)tggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctcgaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggaccctaagaggcaaatcttcctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttctacaagactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaatccgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcc

hIL12-p35 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 53)

(M)WPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS

hIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 54)

Tgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccctgaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcgaggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaattctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagt(tag)

hIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 55)

tgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccctgaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcgaggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaactctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagttcg

hIL-12p40 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 56)

CHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

Human CXCL9 (hCXCL9) 核酸序列 (SEQ ID NO: 57)

(atg)aagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaagaagactacataa

Human CXCL9 (hCXCL9) 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 58)

(M)KKSGVLFLLGIILLVLIGVQGTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT

Igκ-HA-2C11VHC- 連接子 -C211VLC-Myc-PDGFR 核酸序列 (SEQ ID NO: 59)

Atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggaaagtccctgaaactctcctgtgaggcctctggattcaccttcagcggctatggcatgcactgggtccgccaggctccagggagggggctggagtcggtcgcatacattactagtagtagtattaatatcaaatatgctgacgctgtgaaaggccggttcaccgtctccagagacaatgccaagaacttactgtttctacaaatgaacattctcaagtctgaggacacagccatgtactactgtgcaagattcgactgggacaaaaattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacatccagatgacccagtctccatcatcactgcctgcctccctgggagacagagtcactatcaattgtcaggccagtcaggacattagcaattatttaaactggtaccagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctattatacaaataaattggcagatggagtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggagagattcttctttcactatcagcagcctggaatccgaagatattggatcttattactgtcaacagtattataactatccgtggacgttcggacctggcaccaagctggaaatcaaagtcgacgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgtacactgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt(tag

Igκ-HA-2C11VHC- 連接子 -C211VLC-Myc-PDGFR 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 60)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKVDEQKLISEEDLYTVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR

IgK-HA-2C11VHC- 連接子 -2C11VLC- 連接子 -PDGFR 核酸序列 (SEQ ID NO: 61)

Atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggaaagtccctgaaactctcctgtgaggcctctggattcaccttcagcggctatggcatgcactgggtccgccaggctccagggagggggctggagtcggtcgcatacattactagtagtagtattaatatcaaatatgctgacgctgtgaaaggccggttcaccgtctccagagacaatgccaagaacttactgtttctacaaatgaacattctcaagtctgaggacacagccatgtactactgtgcaagattcgactgggacaaaaattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacatccagatgacccagtctccatcatcactgcctgcctccctgggagacagagtcactatcaattgtcaggccagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctattatacaaataaattggcagatggagtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggagagattcttctttcactatcagcagcctggaatccgaagatattggatcttattactgtcaacagtattataactatccgtggacgttcggacctggcaccaagctggaaatcaaaggcagtgggagtgggagtgggagtgggaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt(TAG)

IgK-HA-2C11VHC- 連接子 -2C11VLC- 連接子 -PDGFR 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 62)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKGSGSGSGSGNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR

Igκ-HA-2C11VHC- 連接子 -2C11VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-mIL12-p35-P2A-mIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 63)

Atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggaaagtccctgaaactctcctgtgaggcctctggattcaccttcagcggctatggcatgcactgggtccgccaggctccagggagggggctggagtcggtcgcatacattactagtagtagtattaatatcaaatatgctgacgctgtgaaaggccggttcaccgtctccagagacaatgccaagaacttactgtttctacaaatgaacattctcaagtctgaggacacagccatgtactactgtgcaagattcgactgggacaaaaattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacatccagatgacccagtctccatcatcactgcctgcctccctgggagacagagtcactatcaattgtcaggccagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctattatacaaataaattggcagatggagtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggagagattcttctttcactatcagcagcctggaatccgaagatattggatcttattactgtcaacagtattataactatccgtggacgttcggacctggcaccaagctggaaatcaaaggcagtgggagtgggaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgtggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccggtaccgtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattcttgacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccgcggccgcaggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccggatcctgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttcttgatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaagaatttcaagaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatcctag

Igκ-HA-2C11VHC- 連接子 -2C11VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-mIL12-p35-P2A-mIL12-p40 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 64)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKGSGSGNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGTVSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAAAAGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGSCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS

Igκ-2C11VHC- 連接子 -2C11VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-mIL12-p35-P2A-mIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 65)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacggggcccagccggccagatctgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcagcctggaaagtccctgaaactctcctgtgaggcctctggattcaccttcagcggctatggcatgcactgggtccgccaggctccagggagggggctggagtcggtcgcatacattactagtagtagtattaatatcaaatatgctgacgctgtgaaaggccggttcaccgtctccagagacaatgccaagaacttactgtttctacaaatgaacattctcaagtctgaggacacagccatgtactactgtgcaagattcgactgggacaaaaattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacatccagatgacccagtctccatcatcactgcctgcctccctgggagacagagtcactatcaattgtcaggccagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagggaaagctcctaagctcctgatctattatacaaataaattggcagatggagtcccatcaaggttcagtggcagtggttctgggagagattcttctttcactatcagcagcctggaatccgaagatattggatcttattactgtcaacagtattataactatccgtggacgttcggacctggcaccaagctggaaatcaaaggcagtgggagtgggaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgtggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccggtaccgtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattcttgacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccgcggccgcaggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccggatcctgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttcttgatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaagaatttcaagaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatcctag

Igκ-2C11VHC- 連接子 -2C11VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-mIL12-p35-P2A-mIL12-p40 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 66)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGAQPARSEVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKGSGSGNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGTVSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAAAAGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGSCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS

mIL12-p35-P2A-mIL12-p40-P2A-mCXCL9 核酸序列 (SEQ ID NO:67)

atggtcagcgttccaacagcctcaccctcggcatccagcagctcctctcagtgccggtccagcatgtgtcaatcacgctacctcctctttttggccacccttgccctcctaaaccacctcagtttggccagggtcattccagtctctggacctgccaggtgtcttagccagtcccgaaacctgctgaagaccacagatgacatggtgaagacggccagagaaaaactgaaacattattcctgcactgctgaagacatcgatcatgaagacatcacacgggaccaaaccagcacattgaagacctgtttaccactggaactacacaagaacgagagttgcctggctactagagagacttcttccacaacaagagggagctgcctgcccccacagaagacgtctttgatgatgaccctgtgccttggtagcatctatgaggacttgaagatgtaccagacagagttccaggccatcaacgcagcacttcagaatcacaaccatcagcagatcattctTgacaagggcatgctggtggccatcgatgagctgatgcagtctctgaatcataatggcgagactctgcgccagaaacctcctgtgggagaagcagacccttacagagtgaaaatgaagctctgcatcctgcttcacgccttcagcacccgcgtcgtgaccatcaacagggtgatgggctatctgagctccgccGCGGCCGCAggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccGGATCCtgtcctcagaagctaaccatctcctggtttgccatcgttttgctggtgtctccactcatggccatgtgggagctggagaaagacgtttatgttgtagaggtggactggactcccgatgcccctggagaaacagtgaacctcacctgtgacacgcctgaagaagatgacatcacctggacctcagaccagagacatggagtcataggctctggaaagaccctgaccatcactgtcaaagagtttcttgatgctggccagtacacctgccacaaaggaggcgagactctgagccactcacatctgctgctccacaagaaggaaaatggaatttggtccactgaaattttaaaGaatttcaaGaacaagactttcctgaagtgtgaagcaccaaattactccggacggttcacgtgctcatggctggtgcaaagaaacatggacttgaagttcaacatcaagagcagtagcagttcccctgactctcgggcagtgacatgtggaatggcgtctctgtctgcagagaaggtcacactggaccaaagggactatgagaagtattcagtgtcctgccaggaggatgtcacctgcccaactgccgaggagaccctgcccattgaactggcgttggaagcacggcagcagaataaatatgagaactacagcaccagcttcttcatcagggacatcatcaaaccagacccgcccaagaacttgcagatgaagcctttgaagaactcacaggtggaggtcagctgggagtaccctgactcctggagcactccccattcctacttctccctcaagttctttgttcgaatccagcgcaagaaagaaaagatgaaggagacagaggaggggtgtaaccagaaaggtgcgttcctcgtagagaagacatctaccgaagtccaatgcaaaggcgggaatgtctgcgtgcaagctcaggatcgctattacaattcctcatgcagcaagtgggcatgtgttccctgcagggtccgatcctCgTCTAGAggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccaagtccgctgttcttttcctcttgggcatcatcttcctggagcagtgtggagttcgaggaaccctagtgataaggaatgcacgatgctcctgcatcagcaccagccgaggcacgatccactacaaatccctcaaagacctcaaacagtttgccccaagccccaattgcaacaaaactgaaatcattgctacactgaagaacggagatcaaacctgcctagatccggactcggcaaatgtgaagaagctgatgaaagaatgggaaaagaagatcagccaaaagaaaaagcaaaagagggggaaaaaacatcaaaagaacatgaaaaacagaaaacccaaaacaccccaaagtcgtcgtcgttcaaggaagactacataa

mIL12-p35-P2A-mIL12-p40-P2A-mCXCL9 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 68)

MVSVPTASPSASSSSSQCRSSMCQSRYLLFLATLALLNHLSLARVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAAAAGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGSCPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSSPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSSSRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPKSAVLFLLGIIFLEQCGVRGTLVIRNARCSCISTSRGTIHYKSLKDLKQFAPSPNCNKTEIIATLKNGDQTCLDPDSANVKKLMKEWEKKISQKKKQKRGKKHQKNMKNRKPKTPQSRRRSRKTT

Igκ-HA-9D9 VLC- 連接子 -9D9 VHC- 連接子 -mIgG1 Fc 結構域 (抗 -CTLA-4 scFv) 核酸序列 (SEQ ID NO: 69)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctgacattgtgatgacacagaccacactcagtctccccgtttcccttggtgatcaagcctccatatcctgtaggtctagtcaatctatcgtccactccaacggcaatacctatctggaatggtatcttcaaaagcccggacaatcaccaaagcttcttatctataaggtgagcaatagatttagcggggtccctgaccgattctctggaagtggctctggcacagactttaccttgaaaatctccagagttgaggctgaggaccttggtgtatactactgcttccaaggctctcatgttccctacactttcggaggcggaacaaaactggagataaaacgagccgacgcagcccccactgtgagtggctctggagggggctctggcggtggatctgggggtggaagtgaggcaaagcttcaggaatctggtccagtgttggtgaaaccaggtgcatccgtgaaaatgtcctgcaaagcaagcggttacacttttactgactattatatgaactgggtaaagcaatcccacggcaaatccctggaatggattggtgtcatcaacccttacaacggtgatacaagttacaaccaaaagttcaaaggtaaggctacattgaccgtagataagagtagcagtactgcatacatggaacttaactctcttacatccgaggactccgctgtttactattgtgcacgctactacgggagctggttcgcttactggggtcaaggcaccctgataacagtgtccacagccaaaaccacacctccctccgtctatcctctcgctccagtcgactctagtggatccggtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga

Igκ-HA-9D9 VLC- 連接子 -9D9 VHC- 連接子 -mIgG1 Fc 結構域 (抗 -CTLA-4 scFv) 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 70)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSDIVMTQTTLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSGSGGGSGGGSGGGSEAKLQESGPVLVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGVINPYNGDTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELNSLTSEDSAVYYCARYYGSWFAYWGQGTLITVSTAKTTPPSVYPLAPVDSSGSGGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

Igκ-HA-9H10 VLC- 連接子 -9H10 VHC- 連接子 -mIgG1 Fc 結構域 (抗 -CTLA-4 scFv) 核酸序列 (SEQ ID NO: 71)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctgacattgtgatgacacagagtccttcatcccttgcagtcagtgtcggcgaaaaagtaacaatttcatgcaagtctagtcaatctctgttgtacggctcctctcattacctcgcatggtatcaacaaaaagtgggtcaatctcccaaattgttgatatactgggcttcaactagacacactggaatccctgacaggttcattggtagcggatcagggactgactttacactgtccctcagcagcgtacaagcagaagacatggccgactatttctgccaacaatactttagtacaccatggacctttggggctgggaccagagttgagataaaaagtggctctggagggggctctggcggtggatctgggggtggaagtcaagtgcagctgcttcaatccgaatcagaactcgtgaagccaggcgcttcagtgaaattgtcttgtaagacttcaggatacactttcactgattactatatacactgggttaagcagaagcctggtcagggtcttgaatggattggcctcatcaatcccaataacgatggcacaaactacaaccagaaatttcaaggaaaagccacacttaccgcagacaaatccagttctaccgcatacatggaacttaatagtctcacttttgatgactcagtaatatatttctgtgccagggccagtagccgacttagaatggctaggactacctctgactactatgccatggactattggggacagggcattcaagtgaccgtgagctctgtcgactctagtggatccggtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga

Igκ-HA-9H10 VLC- 連接子 -9H10 VHC- 連接子 -mIgG1 Fc 結構域 (抗 -CTLA-4 scFv) 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 72)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSDIVMTQSPSSLAVSVGEKVTISCKSSQSLLYGSSHYLAWYQQKVGQSPKLLIYWASTRHTGIPDRFIGSGSGTDFTLSLSSVQAEDMADYFCQQYFSTPWTFGAGTRVEIKSGSGGGSGGGSGGGSQVQLLQSESELVKPGASVKLSCKTSGYTFTDYYIHWVKQKPGQGLEWIGLINPNNDGTNYNQKFQGKATLTADKSSSTAYMELNSLTFDDSVIYFCARASSRLRMARTTSDYYAMDYWGQGIQVTVSSVDSSGSGGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

Igκ-HA-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC-Myc-PDGFR 核酸序列 (SEQ ID NO: 73)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctcaggtgcagctgCAGCAAtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaAgatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccACACTCaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGattgtgCTCacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggttaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagatcaaTcgtgtcgacgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt(tag)

Igκ-HA-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC-Myc-PDGFR 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 74)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRVDEQKLISEEDLNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR

Igκ-HA-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC- 連接子 -PDGFR 核酸序列 (SEQ ID NO: 75)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctcaggtgcagctgCAGCAAtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaAgatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccACACTCaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGattgtgCTCacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggttaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaTcagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagatcaaTcgtGGCAGTGGgAGTGGgAGTGGgAGTGGgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgt(tag)

Igκ-HA-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC- 連接子 -PDGFR 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 76)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGSGSGSGSGNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPR

Igκ-HA-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-hIL12-p35-P2A-hIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 77)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgactatccatatgatgttccagattatgctggggcccagccggccagatctcaggtgcagctgCAGCAAtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaAgatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccACACTCaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGattgtgCTCacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggttaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaTcagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagatcaaTcgtGGCAGTGGgAGTGGgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgtggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccGGTACCtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttccggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggcccctgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccctgaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcgaggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaattctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagttag

Igκ-HA-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-hIL12-p35-P2A-hIL12-p40 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 78)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPDYAGAQPARSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGSGSGNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGTWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

Igκ-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-hIL12-p35-P2A-hIL12-p40 核酸序列 (SEQ ID NO: 79)

atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacggggcccagccggccagatctcaggtgcagctgCAGCAAtctggggctgaactggcaagacctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctacacctttactaggtacacgatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatcctagccgtggttatactaattacaatcagaagttcaaggacaaggccacattgactacagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaAgatattatgatgatcattactgccttgactactggggccaaggcaccACACTCaccgtctcctcaggtggcggtggctccggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctCAGattgtgCTCacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggttaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaTcagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcacttcaggggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcggcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtaacccattcacgttcggctcggggaccaagctggagatcaaTcgtGGCAGTGGgAGTGGgaatgctgtgggccaggacacgcaggaggtcatcgtggtgccacactccttgccctttaaggtggtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatcatgctttggcagaagaagccacgtggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccGGTACCtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatctttctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttttataaaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaattcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttccggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggcccctgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccctgaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcgaggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaattctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagttag

Igκ-OKT3 VHC- 連接子 -OKT3 VLC- 連接子 -PDGFR-P2A-hIL12-p35-P2A-hIL12-p40 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 80)

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDGAQPARSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGSGSGNAVGQDTQEVIVVPHSLPFKVVVISAILALVVLTIISLIILIMLWQKKPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGTWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS

hIL12-p35-P2A-hIL12-p40-P2A-hCXCL9 核酸序列 (SEQ ID NO: 81)

atgtggccccctgggtcagcctcccagccaccgccctcacctgccgcggccacaggtctgcatccagcggctcgccctgtgtccctgcagtgccggctcagcatgtgtccagcgcgcagcctcctccttgtggctaccctggtcctcctggaccacctcagtttggccagaaacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagacaaactctcgaattttacccttgcacttctgaagagattgatcatgaagatatcacaaaagataaaaccagcacagtggaggcctgtttaccattggaattaaccaagaatgagagttgcctaaattccagagagacctctttcataactaatgggagttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgccttagtagtatttatgaagacttgaagatgtaccaggtggagttcaagaccatgaatgcaaagcttctgatggaccctaagaggcaaatcttcctagatcaaaacatgctggcagttattgatgagctgatgcaggccctgaatttcaacagtgagactgtgccacaaaaatcctcccttgaagaaccggatttctacaagactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcagaatCcgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttccGCGGCCGCAggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccGGATCCtgtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtggccatatgggaactgaagaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcccctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggaccttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggcaaaaccctgaccatccaagtcaaagagtttggagatgctggccagtacacctgtcacaaaggaggcgaggttctaagccattcgctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaggaccagaaagaacccaaaaataagacctttctaagatgcgaggccaagaattattctggacgtttcacctgctggtggctgacgacaatcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagcagaggctcttctgacccccaaggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagagagagtcagaggggacaacaaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaaaactacaccagcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttgcagctgaagccattaaagaaCtctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggcaagagcaagagagaaaagaaagatagagtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgcaaaaatgccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaatgggcatctgtgccctgcagttCgTCTAGAggatctggggccaccaacttttcattgctcaagcaggcgggcgatgtggaggaaaaccctggccccaagaaaagtggtgttcttttcctcttgggcatcatcttgctggttctgattggagtgcaaggaaccccagtagtgagaaagggtcgctgttcctgcatcagcaccaaccaagggactatccacctacaatccttgaaagaccttaaacaatttgccccaagcccttcctgcgagaaaattgaaatcattgctacactgaagaatggagttcaaacatgtctaaacccagattcagcagatgtgaaggaactgattaaaaagtgggagaaacaggtcagccaaaagaaaaagcaaaagaatgggaaaaaacatcaaaaaaagaaagttctgaaagttcgaaaatctcaacgttctcgtcaaaagaagactacataa

hIL12-p35-P2A-hIL12-p40-P2A-hCXCL9 胺基酸序列 (SEQ ID NO: 82)

MWPPGSASQPPPSPAAATGLHPAARPVSLQCRLSMCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASAAAGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPGSCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSSSRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPKKSGVLFLLGIILLVLIGVQGTPVVRKGRCSCISTNQGTIHLQSLKDLKQFAPSPSCEKIEIIATLKNGVQTCLNPDSADVKELIKKWEKQVSQKKKQKNGKKHQKKKVLKVRKSQRSRQKKTT

PDGFRβ 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 83)

VVISAILALVVLTVISLIILI

PDGFRβ 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 84)

VVISAILALVVLTIISLIILI

PDGFRα 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 85)

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PDGFRα 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 86)

AAVLVLLVIVIVSLIVLVVIW

PDGFRβ 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 87)

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PDGFRβ 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 88)

gtggtgatctcagccatcctggccctggtggtgctcaccatcatctcccttatcatcctcatc

PDGFRα 跨膜結構域 (SEQ ID NO: 89)

gctgcagtcctggtgctgttggtgattgtgatcatctcacttattgtcctggttgtcatttggaa

儘管出於清楚理解的目的已經詳細描述本發明，但是可以在所附請求項的範圍內進行某些修改。在本申請中引用的所有出版物、登錄號、網站、專利文件等，為了所有目的以引用的方式整體併入本文，其程度與單獨引用它們的程度相同。就不同的資訊在不同的時間相關引述而言，是指從本申請的有效申請日起所存在的資訊。除非從上下文中可以明顯看出，否則本發明的任何要件、實施態樣、步驟、特徵或方面都可以與任何其他方式組合進行。實施例CXCL9

實施例 1 .CXCL9 質體建構體。 小鼠CXCL9 (mCXCL9)或人類CXCL9(hCXCL9)核酸序列係使用標準分子生物學技術選殖至表現載體。或者，mCXCL9或hCXCL9係選殖小鼠(mIL12-2A)或人類(hIL12-2A)IL12 p35-P2A-IL12 p40之下流以產生mIL12~mCXCL9以及hIL12~hCXCL9(圖1A-B)。IL12 p35-P2A-IL12 p40建構體基本上如WO2017/106795或WO2018/229696描述所製造。

含有IL-12 p35、IL-12 p40以及CXCL9之產生質體，所有表現均來自相同啟動子，並帶有插入外顯子跳躍(P2A)基元以允許從單個多順反子信息表現所有三個蛋白質。使用相似方法製備mCXCL9~mCherry。

實施例 2. 蛋白質表現。該mIL12-2A、mCXCL9、以及mIL12~mCXCL9表現載體活體外轉染(transfected)至HEK293細胞。轉染後96小時，收集上清液並經由ELISA測定IL12及CXCL9蛋白質表現。該結果顯示於圖2，表示儘管在使用mIL12~mCXCL9表現載體轉染的細胞中之表現是減少的，但是會產生IL12及CXCL9兩者可檢測之量。圖27顯示在經使用hIL-12~hCXCL9表現在經轉染的細胞中顯示大量的分泌的hIL12及hCXCL9。

同樣地，hIL12-2A、hCXCL9、以及hIL12~hCXCL9表現載體係活體外轉染至HEK293細胞。轉染後96小時，收集上清液並經由ELISA測定IL12及CXCL9蛋白質表現。從hIL12-2A(1.59μg/mL)及hIL12~hCXCL9(1.37μg/mL)表現載體兩者，hIL12有接近相同的表現(圖10A)。但相較於使用hCXCL9表現載體(5.19μg/mL)轉染的細胞，使用hIL12~hCXCL9表現載體(1.75μg/mL)的轉染細胞之hCXCL9表現為減少的但仍在安全量(圖10B)。

進一步測試從mIL12~mCXCL9表現載體產生的mIL12蛋白質的活性。使用mIL12-2A或mIL12~mCXCL9表現載體轉染的細胞產生的mIL12與HEK-藍IL-12細胞一起培育。HEK-藍IL-12細胞用以檢測具有生物活性的人類及小鼠IL-12。HEK-藍IL-12細胞用以驗證重組天然或工程化人類或小鼠IL-12之功能性。具功能性的IL-12與在HEK-藍IL-12細胞中IL-12受體鍵結並活化STAT-4路徑及STAT4-誘導型SEAP受體基因。測定SEAP表現。經由處理後的細胞在630nm處的OD除以未處理的細胞在630nm處的OD來計算反應比。結果如圖3所示，表示從mIL12-2A或mIL12〜mCXCL9表現載體任一者產生的IL-12是具有功能性的。

同樣的，亦測試從hIL12〜hCXCL9表現載體產生的hIL12蛋白的活性。使用hIL12〜hCXCL9表現載體轉染的細胞產生的hIL12與HEK-Blue IL-12細胞一起培育。結果如圖11所示，表示由hIL12-2A表現載體產生的IL-12是具有功能性。

實施例 3 . 活體外CXCL9-誘導T細胞遷移。使用CXCL9表現載體(CXCL9或IL12~CXCL9)轉染哺乳動物(HEK293)細胞。OT-I小鼠脾細胞使用1μg/mL SIINFEKL 胜肽脈衝處理24小時，然後使其恢復72小時。然後經由具有5.0微米孔的聚碳酸酯膜分析CXCL9轉染細胞對SIINFEKL-脈衝的OT‑I脾細胞的細胞趨化性(chemotaxis)之誘導。遷移指數定義為觀察到的趨化性細胞之數目，標準化為OptiMEM陰性對照中經由膜被動遷移的細胞數。結果顯示於圖4A、4B、以及4C。從mCXCL9及mIL12~mCXCL9表現載體產生的mCXCL9會分別導致趨化細胞增加約7倍及約3倍。細胞趨化性的增加會經由CXCL9中和性抗體的添加而被抑制，表示該反應取決於mCXCL9的作用。

實施例 4 . 活體內的mCXCL9表現。CT-26(結腸癌)腫瘤植入小鼠。腫瘤隨後使用IT-EP pUMCV3對照載體或IT-EP mCXCL9表現載體處理。IT-EP之後48小時，將腫瘤均質化並經由ELISA(DuoSet ELISA DY392；n=3；*P＜0.05；使用Welch校正進行T檢驗)分析CXCL9表現。結果顯示於圖5，IT-EP處理的腫瘤會表現CXCL9。

實施例 5 . 使用mIL12-2A以及mCXCL9處理的小鼠中的腫瘤消減。小鼠被植入腫瘤細胞。將麻醉的小鼠皮下注射細胞至右及/或左腹部。經由數位卡尺測量受監控腫瘤生長直到平均腫瘤體積達到~100mm³ 。

在第0天，使用IT-EP對照載體或IT-EP IL12-2A表現載體處理以及在第4天及第7天使用IT-EP對照載體或IT-EP CXCL9(可選用mcherry報告蛋白)處理腫瘤。監控腫瘤體積及存活。當原發性及對側(contralateral)腫瘤負荷達到2000mm³ 時，對小鼠進行安樂死。

該數據顯示於圖6，相較於未處理的小鼠、使用對照控制組處理的小鼠、或僅使用IT-EP mIL12-2A處理的小鼠，使用IT-EP mIL12-2A加mCXCL9治療處理的小鼠表現出增加的存活。使用IT-EP mIL12-2A加mCXCL9~mCherry治療處理的荷瘤腫瘤的小鼠亦表現出減少的原發性(處理)及對側(未處理)的腫瘤進展(圖7A-B)。

實施例 6 . IT-EP IL12-2A+IT-EP CXCL9驅動抗原特異性CD8及短壽命效應細胞(SLECs)的系統性擴增。在8天前，將小鼠如上述方式植入腫瘤。在第0天，使用IT-EP mIL12-2A處理腫瘤。在第4及7天，如上述，使用IT-EP以對照質體或mCXCL9(n=3/群組)處理小鼠。在第9天，收集脾臟並經由FACS分析CD3⁺ CD8⁺ 細胞。圖8顯示在以IL12-2A+CXCL9處理的小鼠中CD3⁺ T細胞群顯著地增加。AH1+CD8+T細胞數目的倍數增加顯示於圖9。

實施例 7. 腫瘤內CXCL9與IL-12協同以調節腫瘤圍環境、擴展抗原特異性T細胞，以及控制對側腫瘤生長。使用小鼠模型評估電穿孔後腫瘤內表現。

在7天前，將CT26腫瘤植入小鼠。使用單一腫瘤模組，進行基於流量的NanoString分析。在第1天使用IT-EP及次優劑量的IL12-2A處理小鼠，然後在第4和第7天以100μg mCXCL9或pUMVC3任一者使用IT-EP處理。然後監測腫瘤和免疫反應。在最後EP(即第9天)之後2天收集腫瘤和脾細胞，進行基於流量的NanoString分析。或者，每週測量三次腫瘤體積以進行回歸/生存研究。經由NanoStringn Counter®技術評估電穿孔CT26病變中的基因表現變化。電穿孔後48小時，使用ELISA證實在荷瘤CT26腫瘤的小鼠的腫瘤裂解液中進行mCXCL9的腫瘤內表現(n=3；*P＜0.05；使用使用Welch校正進行T檢驗)。

在用單獨的CXCL9或合併IL12-2A的CXCL9處理的小鼠中產生顯示每個基因的p值和log2倍變化的火山圖(圖28A)。細胞類型評分的分析表明，反應CXCL9或IL12-2A的處理後細胞毒性免疫細胞增加。當將CXCL9與IL12-2A合併施予時，進一步觀察到細胞毒性免疫細胞評分的協同增加。「細胞毒性免疫細胞」細胞類型評分如圖28B。

流式細胞術分析用於分析治療小鼠中的脾細胞。經由四聚體分析(Immudex)測量抗原特異性AH1+ CD8+T細胞。將細胞限制在Singlets＜Live＜CD3+CD4-脾細胞上(圖8)。與空載體對照相比較，AH1+CD8+T細胞數量增加幾倍(N=2個獨立實驗，每組3-5隻動物/群組；*P＜0.05，**P＜0.005；單因子變異數分析(One-way ANOVA))。僅使用對照質體處理的小鼠中，0.79%的AH1四聚體為CD8+。在使用IT-EP IL12-2A處理的小鼠中，1.43%的AH1四聚體為CD8+。在使用IT-EP IL12-2A及CXCL9處理的小鼠中，有3.22%的AH1四聚體為CD8+。AH1+CD8+T細胞數量的增加倍數如圖9所示。

該結果顯示IT-EP CXCL9可顯著增強在預先以次優劑量的IT-EP IL12-2A動物中的抗-腫瘤免疫反應。CD3 half-BiTE

實施例 8 . The Half-BiTE表現卡匣以與上述用於產生CXCL9質體的方法相似的方式製備(圖12A及12B)。

實施例 9 . 蛋白質表現。將OKT3 scFv及2C11 scFv表現載體體外轉染到HEK293細胞中。將HA-2C11 scFv及HA-2C11 scFv〜mIL12轉染到B16-F10腫瘤細胞中。轉染後24小時，收集上清液，並經由凝膠電泳分離蛋白質。經由西方墨點分析法檢測CD3 scFv、鈣黏著蛋白質(膜蛋白)及Hsp90。如圖13所示的結果表示表現載體表現CD3 scFv蛋白質。CD3 scFv蛋白質主要係位於膜部分。

HA-OKT3 scFv、OKT3 scFv〜hIL12表現載體在體外被轉染到HEK293細胞中。轉染72小時後，經由FACS分析細胞以檢測CD3 scFv(圖14A-C)。將HA-2C11 scFv及HA-2C11 scFv〜mIL12表現載體轉染到B16-F10細胞中。經由FACS分析細胞以檢測CD3 scFv的表面表現(圖14D)。來自IL12-2A及HA-2C11scFv〜mIL12表現載體的IL12的表現如圖14E所示。

HA-OKT3 scFv〜hIL12及OKT3 scFv〜hIL12表現載體在體外被轉染到HEK293細胞中。轉染72小時後，收集細胞上清液並經由ELISA測定IL12p70。結果證實，以HA-OKT3 scFv〜hIL12及OKT3 scFv〜hIL12表現載體轉染的細胞表現並分泌hIL12p70(圖15)。

體內表現：在7天前以B16F10黑素瘤細胞或4T1乳癌細胞接種小鼠。在第0天，以IT-EP HA-2C11 scFv〜hIL12處理腫瘤(圖16)。圖16A-B顯示在IT-EP之後，CD3 half-BiTE在黑素瘤和乳癌腫瘤的表面上表現。圖16C顯示在HA-OKT3 scFv〜hIL12的IT-EP之後，表現載體亦會表現IL-12。

實施例 10 . 活體外功能測定。在有或沒有重組小鼠IL12的情況下，用對照載體及2C11 scFv表現載體在體外轉染B16F10細胞。然後將轉染的B16F10細胞與初始(naïve)的小鼠脾細胞共培養23、48或72小時。共培養後，測定上清液中的IFNγ，並通過經由FACS評估細胞增殖。將結合抗CD3的培養盤作陽性對照。結果如圖17所示，表示當脾細胞與表現2C11 scFv的B16F10共培養時，IFNγ表現增加。將初始小鼠脾細胞與活體外轉染的B16F10細胞共培養後，進行FACS分析以分析CFSE標記的CD3+CD45+T細胞的增殖，該B16F10細胞係與對照載體(Tfx對照)、荷瘤或未荷瘤重組小鼠IL12的2C11 scFv表現載體、或結合抗-CD3(陽性對照)的培養盤轉染(圖18)。

實施例 11 . 活體內功能測定。在9天前，將B16-OVA細胞植入小鼠(n=8/群組)。在第0天，經由IT-EP以2C11 scFv表現載體或空載體(陰性對照)處理腫瘤。在第0天，還經由過繼性轉移(adoptive transfer)將OT-1(GFP)CD8⁺ 細胞T細胞及初始小鼠淋巴細胞以1：1混合物植入小鼠體內。在第5天，經由FACS檢查脾臟及引流淋巴結(DLN)中過繼性轉移的T細胞增殖。亦經由FACS檢查腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)中的內源性T細胞群體及SIINFEKL表現。在使用IT-EP 2C11 scFv處理的小鼠中，觀察到DLN中多選殖T細胞增殖的增加(圖19)。在使用IT-EP 2C11 scFv處理的小鼠的脾細胞中，也觀察到OT-1和多選殖T細胞群體的增加。在使用2C11 scFv IT-EP處理的B16-OVA腫瘤模型小鼠中，觀察到TIL中CD45.1+活細胞中CD8+T細胞的增加(圖20)。在使用2C11 scFv IT-EP處理的B16-OVA腫瘤模型小鼠中，觀察到TIL中抗原特異性(SIINFEKL +)CD8+T細胞的增加(圖21)。結果表明，使用2C11的IT-EP導致多選殖T細胞增殖及增強腫瘤中腫瘤的特異性T細胞反應。

實施例 12 . 活體內細胞毒性T細胞殺傷分析。從初始的小鼠中收集淋巴細胞並用CFSE標記。然後標記的淋巴細胞使用OVA胜肽脈衝以激活T細胞(CFSE^hi ，處理)或不進行處理(CFSE^lo ，未脈衝)。CFSE^hi 和CFSE^lo 淋巴細胞以約1：1的比例合併，以施予至荷瘤小鼠。

在7天前，將B16-OVA腫瘤細胞(表現卵清蛋白的B16黑色素瘤細胞)植入c57/bl/6小鼠的腹側面。在第1天，使用IT-EP抗-2C11 scFv或空載體(pUMVC3)處理小鼠。在第2天，經由過繼性轉移施予小鼠脈衝標靶細胞(2μg/ml以1μM CFSE(5(6)羧基螢光素N-羥基琥珀醯亞胺酯)標記的SIINFEKL胜肽)以及未脈衝細胞。過繼性轉移後18小時，收集並分析脾臟及引流淋巴結。

西方墨點分析法表示腫瘤表現CD3 half-BiTE。在過繼性轉移後18小時的第3天，分離出DLN。然後經由FACS分析DLN中CFSE^lo 和CFSE^hi 細胞的存在。結果如圖22所示，表示CFSE^hi 細胞數量顯著減少，表示顯示OVA胜肽的細胞被抗原特異性殺傷。使用以下公式對減少進行定量：

結果顯示在圖23中，表示脾細胞(SP)及DLN中CFSE^hi 細胞的裂解增加。CFSE細胞的FACS分析如圖24所示。在對照小鼠中，CFSE^hi 細胞的裂解百分比為54.63±12.79%。在接受IT-EP CD3 half-BiTE治療的小鼠中，CFSE^hi 細胞的裂解百分比為82.44±11.35%。在使用IT-EP CD3 half-BiTE處理的小鼠中特異性殺傷的OVA表現細胞，表示抗原特異性細胞毒性T細胞反應增強。激活的T淋巴細胞優先保留在表現CD3 half-BiTE的腫瘤中。因此，編碼CD3 half-BiTE的核酸的電穿孔提供有效的腫瘤治療。

CD3 half-BiTE的IT-EP導致T細胞對腫瘤細胞的標靶攻擊增加。脾臟及引流淋巴結中細胞的流式細胞儀分析顯示在IT-EP抗-CD3(2C11)群組中有明顯的抗原特異性殺傷作用(圖23及26)。實施例 13 . 腫瘤消減

A.黑色素瘤：在7天前，將B16黑色素瘤細胞植入小鼠體內。在第0天，以IT-EP使用對照空載體、編碼IL12-2A的表現載體，對小鼠進行處理。在第4天及第7天，以IT-EP對照載體或IT-EP 2C11(CD3 half-BiTE)表現載體治療小鼠。每三天監測一次腫瘤進展。結果顯示，與單獨使用IL12-2A治療相比，使用IL12-2A加CD3 half-BiTE治療的小鼠具有改善的對側(未治療)腫瘤消退(圖25A及25B)。

B.乳癌：在7天前，將4T1乳癌細胞植入小鼠體內。在第0天，以IT-EP使用對照載體、或IT-EP IL12-2A對小鼠進行處理。在第4天和第7天，以IT-EP使用對照載體或IT-EP 2C11(CD3 half-BiTE)表現載體，對小鼠進行處理。每三天監測一次腫瘤進展。結果顯示，將IT-EP IL12-2A與CD3 half-BiTE治療相合併可改善乳癌的腫瘤消減(圖26A)。IL12-2A加CD3 half-BiTE治療亦有效治療4T1乳癌模型小鼠的肺轉移結節(圖26B)。在圖26C中顯示在4T1乳癌模型小鼠中每μL外周血液的效應T細胞(CD127-CD62L-CD3+)的絕對數量。CXCL9/CD3 half-BiTE 合併治療

實施例 14 . CXCL9加CD3 half-BiTE合併治療。將B16.F10腫瘤荷瘤小鼠使用具有10 μg IL-12表現質體、100μg IL-12表現質體或100μg IL-12〜CXCL9/CD3 half-BiTE〜IL12的IT-EP(第1、5和8天)處理。對於IL-12〜CXCL9/CD3 half-BiTE~IL12，在第1天、第5天及第8天無論施予IL-12~CXCL9或CD half-BiTE~IL12的個體接受至少一種具有IL-12〜CXCL9的IT-EP處理及一種具有CD3 half-BiTE~IL12的IT-EP處理。IT-EP後48小時在腫瘤裂解液中證實IL-12的腫瘤內表現(ELISA)(n=8隻動物)。IL29 70表現如圖29A所示。在IT-EP治療後12天測量原發性(電穿孔病變)及對側(非電穿孔病變)B16.F10病變的生長(圖29B-C)。關於IL12 p70的表現，使用具有10μg IL12-2A的IT-EP處理之動物表現出與使用具有100μg IL-12-CXCL9/CD3 half-BiTE-IL12處理的動物相同量的IL12(圖29A)。與10μg IL12-2A處理的小鼠相比，IL-12〜CXCL9/CD3 half-BiTE〜IL12處理的對側腫瘤明顯更小(8-10隻動物/群組；統計學意義使用雙向ANOVA*p＜0.05)，圖式說明使用IT-EP IL-12〜CXCL9/CD3 half BiTE〜IL12治療可增強腫瘤的消減。CLTA-4 scFv

實施例 15 . 抗CTLA4 scFv的腫瘤內表現。在RENCA腫瘤裂解物上進行小鼠IgG1 ELISA(ab133045)，以定量抗CTLA4 scFv的腫瘤內表現。僅在腫瘤中檢測到抗-CTLA4 scFv的表現，而在血清中則未檢測到，這突顯腫瘤內電穿孔後抗體的局部表現。

質體編碼抗-CTLA4 scFv與重組CTLA4蛋白結合的。評估轉染衍生的分泌抗CTLA4(scFv)與CTLA-4的結合能力。將重組小鼠CTLA-4/人類IgG1嵌合體(R&D Systems)固定在96孔盤(1或5μg/孔、或50μg/孔或250μg/孔)在室溫下放置18小時。使用含0.1%Tween的PBS洗滌孔3次，並用含1%BSA的PBS進行封閉。將使用在9H10-scFv(168ng/mL)或9D9-scFv(130ng/mL)轉染的HEK293細胞的條件培養基添加到孔中，並在室溫下培育2小時。將孔洗滌3次，並加入抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶(Jackson ImmunoResearch，0.2μg/mL)，並在室溫下培育1.5小時。將孔再次洗滌3次，用HRP底物試劑(R&D Systems)顯影並用終止溶液2N硫酸(R&D Systems)終止反應。在450nm下測量每個孔的光密度。顯示每個條件群組的平均OD值的圖形表示，表示質體衍生的抗CTLA4 scFv與重組CTLA4蛋白的結合之質體(圖30A)。

對RENCA腫瘤裂解物進行小鼠IgG1 ELISA (ab133045)，以定量抗CTLA4 scFv的腫瘤內表現。在腫瘤中檢測到抗-CTLA4 scFv的表現(圖30B)。在血清中未觀察到統計學上顯著抗-CTLA4 scFv的量，表示在腫瘤內電穿孔時抗體的局部表現。

將理解到以上僅經由示例性的方式描述本發明。實施例無意於限制本發明的範圍。在不脫離僅由所附請求項限定的本發明的範圍和精神的情況下，可以進行各種修改和實施態樣。

[圖1A]為mCXCL9~mCherry(mCXCL9-PTA- mCherry)、mCXCL9、mIL12-2A (mIL-12 p35-P2A-mIL-12 p40)、mIL12~mCXCL9 (mIL-12 p35-P2A-mIL-12 p40-P2A-mCXCL9)表現建構體之圖式。

[圖1B]為hCXCL9、hIL12-2A(hIL-12 p35-P2A-hIL-12 p40)、hIL12~hCXCL9 (hIL-12 p35-P2A-hIL-12 p40-P2A-hCXCL9)表現建構體之圖式。

[圖2]為說明在使用mIL12-2A、mCXCL9、以及mIL12~mCXCL9表現載體轉染之HEK293細胞中的(A)mIL12p70蛋白質表現，及(B)mCXCL9蛋白質表現之圖形。

[圖3]為說明在小鼠IL-12或小鼠IL-12-CXC建構體轉染的HEK293細胞中對mIL-12p70劑量反應之圖形。兩個建構體編碼具有生物活性的IL-12。

[圖4A]為說明經由具有5.0微米孔的聚碳酸酯膜(Costar 3421)在轉染衍生的小鼠CXCL9誘導的SIINFEKL-脈衝(24小時@ 1 μg/mL，72小時恢復)對OT-1脾細胞的趨化性(chemotaxis)之圖形。遷移指數定義為在37℃下2.5小時後觀察到的趨化細胞的數量，並標準化為OptiMEM陰性對照中經由膜被動遷移的細胞數量。經由抗-mCXCL9中和性單選殖抗體(BioXCell BE0309)的預培育觀察到趨化性的終止。

[圖4B]為說明經由具有5.0微米孔的聚碳酸酯膜(Costar 3421)在轉染衍生的(HEK293)人類CXCL9-誘導的SIINFEKL-脈衝(24小時@1μg/mL，72小時恢復)對OT-1脾細胞的趨化性(chemotaxis)之圖形。遷移指數定義為在37℃下2小時後觀察到的趨化細胞的數量，並標準化為OptiMEM陰性對照中經由膜被動遷移的細胞數量。

[圖4C]為說明經由具有5.0微米孔的聚碳酸酯膜(Costar 3421)在轉染衍生的(HEK293)人類CXCL9-誘導人類外周單核細胞(從冷凍保存中融化，在X-VIVO15培養基中放置24小時)之圖形。遷移指數定義為在37℃下2小時後觀察到的趨化細胞的數量，並標準化為OptiMEM陰性對照中經由膜被動遷移的細胞數量。

[圖5]為說明在電穿孔後48小時，來自CT26腫瘤荷瘤小鼠的腫瘤裂解液中使用ELISA進行腫瘤內mCXCL9(DuoSet ELISA DY392)的表現之圖形(n=3；*P＜0.05；使用Welch校正進行T檢驗)。

[圖6]為說明未處理的小鼠、使用對照控制組、僅使用IT-EP mIL12-2A、或使用IT-EP mIL12-2A與IT-EP CXCL9合併處理的小鼠之Kaplan–Meir曲線圖形(**P＜0.005;對數秩(log-rank)(Mantel-Cox)檢驗)。

[圖7]為說明相較於僅用對照質體的IL-12治療，使用具有mIL12-2A加mCXCL9的IT-EP治療(A)減少腫瘤體積、以及(B)減少對側(未處理)的腫瘤體積之圖形。

[圖8]為在第0天使用IT-EP pUMCV3或IL12-2A以及在第4及7天使用IT-EP pUMVC3或mCXCL9處理的小鼠脾細胞的流式細胞分析。

[圖9]為說明使用對照載體(pUMC3)、IT-EP IL12(IL-12 p35–P2A–IL-12 p40)、或IT-EP IL12加IT-EP CXCL9處理的小鼠腫瘤中AH1+CD8+T細胞數量的增加倍數之圖形。使用3-5隻動物/群組，N=2獨立實驗；*P＜0.05，**P＜0.005；單因子變異數分析(One-way ANOVA)。

[圖10]為說明(A)在轉染hIL12-2A及hIL12~　hCXCL9表現載體的HEK293細胞之hIL-12蛋白質表現以及(B)在轉染hCXCL9及hIL12~hCXCL9表現載體的HEK293細胞之hCXCL9蛋白質表現之圖形。

[圖11]為說明在HEK-藍IL-12細胞中使用重組人類IL-12(rhIL12，陽性對照)、或從表現hIL12-2A表現載體的細胞產生的hIL12的激活STAT4路徑之圖形。

[圖12A]說明小鼠對HA-2C11-Myc scFv、HA-2C11 scFv、2C11 scFv、以及2C11 scFv~hIL12的CD3 half-BiTE表現卡匣。

[圖12B]說明人類對HA-OKT3-Myc scFv、HA-OKT3 scFv、OKT3 scFv、HA-OKT3 scFv~hIL12、以及OKT3 scFv~hIL12的CD3 half-BiTE表現卡匣。

[圖13]為西方墨點分析：(A)在轉染HA-OKT3 scFv以及HA-2C11 scFv CD3 half-BiTE表現載體的HEK293細胞的抗-CD3 scFv表現，以及(B)在轉染HA-2C11 scFv以及HA-2C11 scFv~mIL12表現載體的B16-F10細胞的CD3 half-BiTE表現。

[圖14A-C]顯示在轉染HA-OKT3 scFv以及HA-OKT3 scFv~hIL12表現載體的HEK 293細胞中的抗-CD3 scFv表面表現的流式細胞分析。

[圖14D-E]為(D)在轉染HA-2C11 scFv以及HA-2C11 scFv~mIL12表現載體的B16-F10細胞中的抗-CD3 scFv表面表現的流式細胞分析。(E)說明在轉染mIL12-2A、HA-2C11 scFv~mIL12表現載體之後的B16-F10細胞中的IL12p70表現之圖形。

[圖15]為說明在轉染hIL12-2A、HA-OKT3 scFv~hIL12、以及OKT3 scFv~hIL12表現載體之後的HEK293細胞中的IL12p70表現之圖形。

[圖16A-B] (A)活體內腫瘤內HA-2C11 scFv電穿孔後在B16F10黑素瘤細胞或4T1乳癌細胞中CD3 scFv之表現的西方墨點分析。(B)活體內腫瘤內HA-2C11 scFv電穿孔後在4T1乳癌細胞中CD3 scFv表面表現的流式細胞分析。

[圖16C]為說明mIL12-2A以及HA-2C11 scFv~mIL12表現載體腫瘤內電穿孔之後B16-F10細胞的IL12p70表現之圖形。

[圖17]為說明在初始(naïve)小鼠脾細胞與以活體外轉染對照載體(EV對照)、有或沒有重組小鼠IL12的2C11 scFv表現載體的B16F10細胞共培養後、或具有結合抗-CD3的培養盤(陽性對照)的INFγ表現的誘導之圖形。

[圖18]為說明CFSE標記CD3+CD45+T細胞與初始小鼠脾細胞與活體外轉染對照載體(Tfx對照)、有或沒有重組小鼠IL12的2C11 scFv表現載體的B16F10細胞共培養後、或具有結合抗-CD3的培養盤(陽性對照)的增值的FACS分析之圖形。

[圖19]為說明在活體內以2C11 scFv IT-EP或陰性對照處理的B16-OVA腫瘤小鼠模型中引流淋巴結(DLN)中的OT-1及多選殖T細胞的增殖之圖形。

[圖20]為說明在活體內以2C11 scFv IT-EP或陰性對照處理的B16-OVA腫瘤小鼠模型中TIL中CD45.1+活細胞中CD8+T細胞的增加之圖形。

[圖21]為說明以2C11 scFv IT-EP 或陰性對照處理的B16-OVA腫瘤小鼠模型中增加TIL中抗原特定(SIINFEKL+)CD8+T細胞之圖形。

[圖22]為掃描CFSE細胞的顯示(Hi)或不顯示(Lo)OVA_257-264 胜肽的FACS分析，顯示相較於陰性轉染對照，含有B16-OVA腫瘤的經2C11 scFv IT-EP處理的小鼠中顯示OVA_257-264 胜肽的CFSE細胞裂解增加。

[圖23]為說明在用IT-EP CD3 half-BiTE處理的B16-OVA腫瘤小鼠中，過繼性轉移顯示OVA_257-264 的CFSE細胞裂解增加。在脾臟和驅動淋巴結兩者中觀察到增加的T細胞殺傷能力之圖形。

[圖24]為表示以IT-EP CD3 half-BiTE處理的小鼠中OVA表現細胞的增加腫瘤特異性殺傷力的CFSE細胞的FACS分析。

[圖25]為說明以對照、IL-12、或IL-12加CD3 half-BiTE IT-EP治療處理的黑色素瘤模型小鼠中的已處理腫瘤的腫瘤進展。

[圖26] (A)為說明以對照、IL-12、或IL-12加CD3 half-BiTE IT-EP治療處理的乳癌模型小鼠的腫瘤進展之圖形。(B)為說明以對照、IL-12A、或IL-12A加2C11 IT-EP治療處理的4T1乳癌模型小鼠中的肺轉移結節之圖形。(C)為說明以對照、L12-2A或IL12-2A加2C11 IT-EP治療處理的4T1乳癌模型小鼠中每μL外周血中效應T細胞(CD127-CD62L-CD3+)的絕對數量之圖形。

[圖27]為說明以hIL12-2A、hCXCL9及hIL12〜hCXCL9表現載體轉染後，HEK293細胞中(A)hIL12p70蛋白質分泌，以及(B)hCXCL9蛋白質分泌。經由ELSIA檢測的蛋白質，n=5。

[圖28A]為表示基因的p值及log2倍數變化之火山圖。在單獨以mCXCL9處理的小鼠(上圖)及以mCXCL9與IL12合併處理的小鼠(下圖)中檢查差異基因的表現。水平線指示錯誤發現率(FDR)閥值。

[圖28B]為說明「細胞毒性免疫細胞」的細胞類型評分之圖形。每個細胞類型評分(對數2評分)具有中值0。

[圖29A]為說明電穿孔後48小時內來自將在第1、5及8天以10μg或100μg IL12-2A(TAVO)或在第1、5及8天以100μg IL12~CXCL9或CD3 half-BiTE~IL12(SPARK)處理後每個B16.F10腫瘤荷瘤小鼠的腫瘤裂解物中IL12 p70表現之圖形(n=8個動物；DuoSet ELISA DY419)。

[圖29B-C]為說明在第1、5及8天以10μg或100μg IL12-2A(TAVO)或在第1、5及8天以100μg IL12~CXCL9或CD3 half-BiTE~IL12(SPARK)處理後B16.F10腫瘤荷瘤小鼠的原發性(B)及繼發性(C)腫瘤的生長之圖形(在第0天及第12天從左到右：10μg IL12-2A、SPARK、100μg IL12-2A)。

[圖30]說明(A)與重組mCTLA-4/Fc結合的抗-CTLA4 scFv轉染上清液，以及(B)在RENCA腫瘤裂解液中檢測抗-CLTA-4 scFv。

Claims

一種表現卡匣，其包含：編碼CD3 half-BiTE的第一核苷酸序列，其中該CD3 half-BiTE包含抗‑CD3 scFv及跨膜結構域，其中該跨膜結構域係與該抗‑CD3 scFv的C末端連接。
如請求項1之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列與啟動子可操作地連接。
如請求項2之表現卡匣，其中該啟動子係選自以下所組成之群組：CMV啟動子、mPGK、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、SRα啟動子、皰疹性胸苷激酶啟動子、單純皰疹性病毒(HSV)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子及EF1α啟動子。
如請求項1至3中任一項之表現卡匣，其中該抗-CD3 scFv包含OKT3(莫羅莫那(Muromonab)-CD3)、145-2C11、17A2、SP7或UCHT1抗體的VH及VL結構域的CDR。
如請求項4之表現卡匣，其中該抗-CD3 scFv包含OKT3(莫羅莫那(Muromonab)-CD3)、145-2C11、17A2、SP7或UCHT1抗體或其人化抗體的VF及VL結構域。
如請求項1至5中任一項之表現卡匣，其中該跨膜結構域係選自以下所組成之群組：PDGFRα跨膜結構域及PDGFRβ跨膜結構域。
如請求項1至6中任一項之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO: 60、62、74或76的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 60、62、74或76至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。
如請求項1至7中任一項之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列包含SEQ ID NO: 59、61、73或75的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 59、61、73或75至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項2至8中任一項之表現卡匣，其進一步包含編碼IL‑12的第二核苷酸序列。
如請求項9之表現卡匣，其中該編碼IL‑12的第二核苷酸序列包含編碼IL-12 p35的第一編碼序列及編碼IL-12 p40的第二編碼序列。
如請求項10之表現卡匣，其中該表現卡匣包含下式： P – A – T – B – T – B′ 其中P為該啟動子，A編碼該CD3 half-BiTE，T為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35且B′編碼IL‑12 p40。
如請求項11之表現卡匣，其中T編碼選自以下所組成群組之2A胜肽：P2A胜肽、T2A胜肽、E2A胜肽及F2A胜肽。
如請求項12之表現卡匣，其中A編碼包含SEQ ID NO: 60、62、74或76的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 60、62、74或76至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；B編碼包含SEQ ID NO: 31或53的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 31或53至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；且B′編碼包含SEQ ID NO: 33或56的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 33或56至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。
如請求項12之表現卡匣，其中A包含SEQ ID NO: 59、61、73或75的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 59、61、73或75的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；B包含SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；且B′包含SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
如請求項1至14中任一項之表現卡匣，其中該第一核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO: 64、66、78或80的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 64、66、78或80至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。
如請求項1至15中任一項之表現卡匣，其中該表現卡匣包含SEQ ID NO: 63、65、77或79的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 63、65、77或79的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
如請求項1至14中任一項之表現卡匣，其中該表現卡匣進一步編碼與抗-CD3 scFv的N-末段或C-末段任一者連接的標識(tag)序列。
如請求項17之表現卡匣，其中該標識序列包含至少一個選自以下標識序列所成的群組：HA標識及Myc標識。
一種表現CD3 half-BiTE之質體，其包含如請求項1至18中任一項之表現卡匣。
一種CD3 half-BiTE，其包含與跨膜結構域融合的抗-CD3單鏈可變片段(scFv)。
如請求項1至18中任一項之表現卡匣或如請求項19之質體，其係用於治療癌症。
一種如下式表示之表現卡匣： P – B – T – B′ – T – A 其中P為啟動子，A編碼CXCL9，T為轉譯修飾元件，B編碼IL-12 p35且B′編碼IL‑12 p40。
如請求項22之表現卡匣，其中T編碼選自以下所組成群組之2A胜肽：P2A胜肽、T2A胜肽、E2A胜肽及F2A胜肽。
如請求項22或23之表現卡匣，其中A編碼包含SEQ ID NO: 35或58的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 35或57至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；B編碼包含SEQ ID NO: 31或53的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 31或53至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽；且B′編碼包含SEQ ID NO: 33或56的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 33或56至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。
如請求項22至24中任一項之表現卡匣，其中A包含SEQ ID NO:34或57的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 34或57的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；B包含SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 30、51或52的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列；且B′包含SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列或包含具有與SEQ ID NO: 32、54或55的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
如請求項22至25中任一項之表現卡匣，其中該表現卡匣編碼包含SEQ ID NO: 68或82的胺基酸序列之多胜肽或編碼具有與SEQ ID NO: 68或82至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%的胺基酸序列一致性之多胜肽。
如請求項22至26中任一項之表現卡匣，其中該表現卡匣包含SEQ ID NO: 67或81的核苷酸序列或包含具有與至少SEQ ID NO: 67或81的核苷酸序列至少70%、72%、75%、78%、80%、82%、83%、85%、87%、88%、90%、92%、93%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之核苷酸序列。
一種表現CXCL9及IL-12之質體，其包含如請求項22至27中任一項之表現卡匣。
如請求項22至27中任一項之表現卡匣或如請求項28之質體，其係用於治療癌症。
一種用於治療癌症的編碼CD3 half-BiTE之表現卡匣及編碼CXCL9之表現卡匣，其中該等表現卡匣係經配製以供腫瘤內電穿孔治療。
一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含以有效劑量的至少一種如請求項19或28之質體注射至該腫瘤及對該腫瘤施予電穿孔治療。
如請求項31之方法，其中該電穿孔治療包含在約100微秒至約1毫秒的持續時間內施予至少一個電壓脈衝。
如請求項32之方法，其中該電穿孔治療包含施予1-6個電壓脈衝。
如請求項32或33之方法，其中該1-10個電壓脈衝具有約200V/cm至約1500V/cm的場強度。
如請求項31至34中任一項之方法，其中該至少一個質體注射至該腫瘤，且在第1天、第5±2天及第8±2天對該腫瘤施予該電穿孔治療。
如請求項31至34中任一項之方法，其中 (g) 如請求項19之質體注射至該腫瘤且在第1及5±2天施予該電穿孔治療，且如請求項28之質體注射至該腫瘤且在第8±2天施予該電穿孔治療； (h) 如請求項19之質體注射至該腫瘤且在第1及8±2天施予該電穿孔治療，且如請求項28之質體注射至該腫瘤且在第5±2天施予該電穿孔治療； (i) 如請求項19之質體注射至該腫瘤且在第5±2及8±2天施予該電穿孔治療，且如請求項28之質體注射至該腫瘤且在第1天施予該電穿孔治療； (j) 如請求項28之質體注射至該腫瘤且在第1及5±2天施予該電穿孔治療，且如請求項19之質體注射至該腫瘤且在第8±2天施予該電穿孔治療； (k) 如請求項28之質體注射至該腫瘤且在第1及8±2天施予該電穿孔治療，且如請求項19之質體注射至該腫瘤且在第5±2天施予該電穿孔治療；及 (l) 如請求項28之質體注射至該腫瘤且在第5±2及8±2天施予該電穿孔治療，且如請求項19之質體注射至該腫瘤且在第1天施予該電穿孔治療。
如請求項31至36中任一項之方法，其進一步包含施予該個體至少一種其他治療。
如請求項31至37中任一項之方法，其中該方法導致下述之一或多者：增加腫瘤浸潤性淋巴細胞、增加腫瘤特異性T細胞之激活及/或增生、經治療的腫瘤之消減及一或多種未經治療的腫瘤之消減。
如請求項37之方法，其中該至少一種其他治療包含施予IT-EP抗-CLTA-4 scFv治療。
一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含以有效劑量的至少一種編碼抗-CTLA-4 scFv的質體注射至該腫瘤及對該腫瘤施予電穿孔治療。
如請求項40之方法，其中該方法進一步包含下述之一或多者：IT-EP IL12治療、IT-EP CXCL9治療、IT-EP IL12~CXCL9治療、IT-EP CD3 half-BiTE治療及IT-EP CD3 half-BiTE~IL12治療。