TW202035682A

TW202035682A - 表現hla-g之肝先驅細胞及取得包含該等細胞之此等細胞組成物之方法與其用途

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Publication number: TW202035682A
Application number: TW108145621A
Authority: TW
Inventors: 伊麗莎科里托雷; 朱塞佩馬札; 娜塔莉貝爾蒙特; 艾蒂安索卡爾; 穆斯塔法納吉米; 凱薩琳隆巴德
Original assignee: 比利時商普羅米修亞生物科技股份有限公司
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2020-10-01
Also published as: WO2020120666A1

Abstract

本發明是關於經分離的肝先驅細胞、其細胞株，包含此等之細胞群體以及包含此等之組成物，其中該等肝先驅細胞呈HLA-G陽性。此外，本發明是關於一種用於製備此等肝先驅細胞的方法，其中該方法包含向肝先驅細胞或幹細胞之培養物的細胞培養基添加一或多種細胞激素的步驟。

Description

表現HLA-G之肝先驅細胞及取得包含該等細胞之此等細胞組成物之方法與其用途

本發明是關於源自肝臟之經分離肝先驅細胞或幹細胞，及其在醫學、肝臟學、移植，肝衰竭和纖維發炎性肝臟疾病中之用途的技術領域。

肝臟是執行許多重要功能的關鍵器官。多種肝臟功能之一者受損會對健康產生重大影響。依據世界衛生組織，急性或慢性肝臟疾病的全球發病率是死亡原因的第5名以及第9名。肝臟細胞移植(LCT)是一項用於治療肝病正在臨床研究中的程序，旨在肝臟修復/再生(Najimi et al.,Stem Cells Translational Medicine,2016)。儘管努力要使供體與在免疫學上盡可能相近的個體配對，但肝臟細胞移植後出現有關免疫系統排斥的問題仍然是細胞療法，組織移植(且特別是LCT)後的一個重大問題。間質幹細胞(MSC)是一種多效性細胞，能夠根據細胞外環境(特別是那些含有細胞激素的環境)而有不同表現(Spees et al.,Stem Cells research and therapy,2016)。研究已證明，MSC具有低免疫原性，可以抑制免疫反應的生成，並使各種免疫細胞群體從促發炎性轉向抗發炎性/調節性表現型(Najar et al.,Inflammation research,2018)。在基線水平下，MSC具有最低的免疫抑制性。儘管如此，細胞在暴露於特定的環境信號(cue)後仍可以採取免疫抑制性表現型(Kouroupis et al.,Tissue engineering Part B,2018)。可惜，取決於個別患者的內部信號，這些幼稚MSC中只有一小部分在注射後變為免疫抑制性的。基於這些原因，需要開發帶有免疫抑制特性獲得改善的新穎MSC表現型。

免疫功能和移植排斥的關鍵在於主要組織相容性抗原，在人類中通常被稱為HLA複合體。編碼第I型HLA蛋白的基因簇集在人類染色體6p21的端粒末端。這些包括經典的第Ia型蛋白HLA-A，HLA-B和HLA-C，它們普遍表現且高度多型性。相反，非經典的第Ib型蛋白HLA-E，HLA-F和HLA-G則相對不變，並選擇性地被表現。HLA第Ib型分子的主要功能是藉由與在不同免疫效應細胞(諸如T淋巴球和B淋巴球，NK細胞和抗原呈現細胞)上表現的特定抑制性受體交互作用來調節免疫反應。

衍生自骨骼，軟骨或脂肪組織的MSC已經被描述為會表現低水平的人類白血球抗原(HLA)第Ia型蛋白。它們可以透過表現可溶性因子來展現免疫調節特性，該等可溶性因子包括HLA-Ib蛋白，尤其是HLA-G(Morandi et al.,Stem Cells,2008)。但是，培養條件的擴增已證明會降低HLA-G細胞質內水平(Pratama et al.,PLoS One,2011)，伴隨著MSC抑制功能降低。

WO2008121894描述一種具有HLA-G陽性細胞，或HLA-E陽性細胞，或HLA-G和HLA-E陽性細胞之富集群體之分離自脂肪組織或骨髓的MSC的細胞組成物，及其在治療退化性疾病和移植之免疫調節中的潛在用途。WO2014022423揭示表現細胞表面HLA-G的經遺傳修飾哺乳動物細胞，特別是經遺傳修飾人類胚幹細胞。WO2018081514描述免疫抑制性間質基質細胞，其是在活體外透過於缺氧培養條件下將促發炎性細胞激素混合物施加至間質基質細胞而獲得。

ADHLSC和HHALPC(也稱為HALPC，人類同種異體肝先驅細胞，以更大規模生產用於臨床研究，是在GMP條件下生產的)是未分化的先驅細胞，是正常成體肝臟經膠原蛋白酶消化並初代培養間質部分後獲得。HHALPC展現出自我更新的能力，並具有表現間質和肝細胞標記以及展現晚期肝原分化潛能的特質。這些細胞對於靶向人類肝臟疾病尤為受到關注，人類肝臟疾病包括肝纖維化、非酒精性脂肪肝炎(NASH)和慢性肝衰竭急性惡化(ACLF)以及其他人類疾病。依據Raicevic et al.(Cytotherapy, 2015)，在ADHLSC中沒有偵測到HLA-G的膜表現，而測量到細胞內聚集。發炎混合物處理歷時18小時並不會在這些細胞中誘發HLA-G的膜與細胞內表現。

Mehdi Najar et al.,2018揭示發炎誘發的ADHLSC。這份文獻沒有提到HLA-G在發炎誘發的ADHLSC中表現。Mehdi Najar完全沒有提及可能與HLA-G表現細胞組成物有關的益處。

Hoda El-Kehdy et al.,2017也揭示發炎誘發的ADHLSC，並分析HLA-ABC，HLA-DR和HLA-G在(未)分化ADHLSC中於組成性與誘發狀態下的表現，顯示HLA-G或HLA-DR表現並沒有受到顯著誘導表現。

這些先前技術文獻都沒有揭示需要獲得肝臟幹細胞或先驅細胞之HLA-G表現群體以供臨床上的用途。本技藝中仍然需要具有免疫調節以及增強的免疫抑制劑及/或免疫逃避活性的新穎或經改良的同種異體細胞療法，例如用於預防或治療發炎，自體免疫疾病和移植物排斥，特別是用於治療與肝臟疾病有關之病理學。

本發明提供如請求項1之經分離肝先驅細胞或幹細胞。更具體而言，本發明提供呈HLA-G陽性之經分離肝先驅細胞或幹細胞，其細胞株或包含該等細胞的細胞群體。在本發明之細胞中的HLA-G表現可能是在細胞內，如同細胞表面標記，及/或如同可溶性蛋白質。在本發明的一個較佳具體例中，所偵測到的HLA-G水平是在細胞之細胞培養物上清液中的可溶性蛋白質。

在本發明的一個具體例中，如請求項3提供經分離肝先驅細胞或幹細胞。更具體而言，相較於在未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G表現，本發明提供具有HLA-G表現水平升高之經預處理(preconditioned)，經分離肝先驅細胞或幹細胞。

在又一個較佳具體例中，本發明依據請求項4提供經分離肝先驅細胞或幹細胞。更具體而言，相較於未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G表現，本發明提供具有HLA-G表現水平升高之經分離肝先驅細胞或幹細胞。

在又一個較佳具體例中，本發明依據請求項5提供經分離肝先驅細胞或幹細胞。更具體而言，相較於未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G分泌，本發明提供具有HLA-G分泌水平升高之經分離肝先驅細胞或幹細胞。

在經分離肝臟衍生之先驅細胞中誘導HLA-G表現咸信會明顯提高其免疫抑制及/或免疫逃避性質。這些細胞尤其適於用來治療或預防涉及不樂見免疫反應的病症，例如但不限於發炎，自體免疫疾病和移植物排斥反應，以及用於治療肝臟疾病。

咸信本發明之該等經分離肝先驅細胞保有其增生能力，這連同其肝臟特異性導致對肝臟細胞移植的效力和安全性增加。此外，由於其成體來源，這些幹細胞消除了與胚細胞有關的免疫學，倫理學和致癌性問題(Volarevic et al.,International Journal of Medical sciences,2018)。

由於HLA-G表現，先驅細胞的經增強免疫抑制特性有助於降低細胞療法及/或組織移植的免疫反應相關風險，這個風險在同種異體細胞移植期間尤高。因此，本發明的HLA-G陽性肝臟衍生之先驅細胞對於多種肝臟病症來說，更可能因為對患者的效力與耐受性獲得改善而成功作為細胞療法。

在本發明的又一個具體例中，肝先驅細胞也可以對HLA-E呈陽性，或可以具有升高的HLA-E表現水平(與未經預處理肝臟衍生之先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-E表現水平相較之下)。HLA-E和HLA-G的合作被認為可能進一步提高對應肝先驅細胞的免疫抑制作用，使其更適用於細胞療法中(Morandi,Pistoia,Frontiers in Immunology 2014)。

在本發明的又一個具體例中，相較於在未經預處理肝臟衍生之先驅細胞或幹細胞中偵測到的基礎前列腺素E2(PGE2)分泌水平，肝臟衍生的先驅細胞更具有升高的PGE2分泌水平。在本發明的另一個具體例中，相較於在未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中偵測到的基礎吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)酶活性水平，肝臟衍生的先驅細胞更具有升高的IDO酶活性水平。

在本發明的又另一個具體例中，相較於在未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中偵測到的基礎表現水平，肝臟衍生的先驅細胞進一步具有升高之屬於以下組成之群之一或多種細胞激素或免疫調節因子的表現水平：IDO、前列腺素-內過氧化物合成酶2(PTGS2)。

在本發明的又另一個具體例中，肝臟衍生的先驅細胞還對至少一種間質標記呈陽性。間質標記包括但不限於α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、波形蛋白(vimentin)、CD13、CD90、CD73、CD44，CD140-b及CD29。在又另一個具體例中，本發明肝臟衍生的先驅細胞分泌HGF。在又另一個具體例中，本發明肝臟衍生的先驅細胞對HLA-DR呈陰性。在又一個具體例中，本發明肝臟衍生的先驅細胞視情況對至少一種肝標記呈陽性及/或視情況具有至少一種肝臟特異性活性。肝標記包括但不限於白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1，CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。肝臟特異性活性包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合，α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。

在第二個態樣中，本發明依據請求項25提供一種用於製備HLA-G陽性肝先驅細胞或幹細胞的方法。更具體來說，該方法包括預處理細胞的步驟，該預處理是指將一或多種細胞激素添加至肝先驅細胞或幹細胞之培養物的細胞培養基。

在又一個態樣中，本發明依據請求項15提供一種組成物或細胞群體。更具體而言，本發明提供一種組成物或細胞群體，其中至少60%的該等先驅細胞或幹細胞分泌HLA-G。

在又一個具體例中，至少65%，至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，更佳至少85%，更佳至少90%，更佳至少95%的該等先驅細胞或幹細胞表現細胞表面標記HLA-G或分泌HLA-G。此等組成物在技藝中並非周所皆知。

在一個較佳具體例中，本發明依據請求項19至24提供適合使用之本發明組成物，細胞群體或細胞。更具體來說，提供本發明之組成物用於治療一些疾病，其中其免疫抑制特性尤為有益。

在另一個態樣中，本說明書還描述一種治療及/或預防病症與疾病的方法，其中如本文揭示之細胞，細胞群體及/或組成物的免疫抑制特性尤其有益，其中該病症與疾病包括具有不樂見免疫反應的病症，纖維化病症和肝臟疾病。不樂見免疫反應包括(例如)，但不限於發炎，自體免疫疾病和移植物排斥。

更具體而言，本發明提供一種方法，其包含將本發明之先驅細胞或幹細胞、其細胞株，細胞群體及/或組成物投與給需要此治療的個體。這樣的投藥通常呈治療有效量，即大體上提供期望的局部或全身作用和性能的量。

在又另一個態樣中，本揭示內容還描述本發明之先驅細胞或幹細胞、其細胞株，細胞群體及/或組成物在療法中的用途，及/或在製備下列之藥劑的用途：用於治療及/或預防具有不樂見免疫反應之病症、用於治療及/或預防纖維化病症，以及用於治療及/或預防肝臟疾病。此類疾病可包括影響肝臟組織的疾病，影響肝細胞生存力及/或功能的疾病以及由纖維發炎性反應引起的慢性肝衰竭。另外，由於免疫調節和免疫抑制特性，提供本發明之先驅細胞或幹細胞、其細胞株，細胞群體及/或組成物用於療法中的用途及/或用於製造供治療要避免不樂見免疫反應之疾病之藥劑的用途。

圖1及圖2顯示根據本發明之不同具體例的HLA-G陽性肝先驅細胞的基因表現概況。

圖1呈現RT-PCR數據，顯示在三種不同培養條件下，與未經處理的對照條件(基線)相比，HLA-G和HLA-E基因表現的增加倍數：IL-1β/TNFα/IFNγ組合，IL-10單獨和IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10組合(「全部一起」條件)。

圖2呈現RT-PCR數據，顯示與未經處理的對照(基線)相比，在依據本發明具體例之經預處理肝先驅細胞中的IDO1、HGF、PTGS2，IL-6和IL-10基因表現的增加倍數。當細胞經選自下列的促發炎性細胞激素預處理時，確認IDO1、PTGS2，IL-6及IL-10的基因表現水平增加：IFNγ、TNFα、IL-1β，IL-10或其組合。

圖3顯示根據本發明的一個具體例，定量由呈HLA-G陽性之經分離肝先驅細胞所分泌的HLA-G蛋白質。

圖3呈現分泌分析數據，顯示從以下不同培養條件回收而來的上清液中，可偵測到的可溶性HLA-G水平：未經處理(對照條件)，IL-1β/TNFα/IFNγ組合處理，IL-10單獨或IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10組合(「全部一起」)處理。人類黑色素瘤鮑斯細胞(human melanoma Bowes cells，HMBCs)，經帶有人類HLA-G序列的質體轉染，被用作為陽性對照(「經轉染的HMBCs」)。這些數據證實，根據本發明的具體例，經預處理、經分離肝先驅細胞的HLA-G分泌升高。

圖4顯示在本發明的不同具體例中，於包含HLA-G陽性肝先驅細胞的細胞群體中的PGE2分泌。

顯示在從不同條件而來的上清液中，可偵測到的PGE2水平的分泌分析呈現在圖4中。不同條件包括未經處理的肝先驅細胞(對照條件)，以及已經用下列預處理的肝先驅細胞：IL-1β/TNFα/IFNγ組合，IL-10單獨或IL-Iβ/TNFα/IFNγ/IL-10組合(「全部一起」)。與未經處理的條件相比，根據本發明的具體例，在經預處理細胞中觀察到分泌水平增強。

圖5顯示在本發明的不同具體例中，於包含HLA-G陽性肝先驅細胞的細胞群體中，IDO1酶活性水平升高。

在酶分析中獲得的數據呈現在圖5中，顯示來自不同實驗條件的上清液中，可偵測到的IDO活性水平。不同條件包括未經處理的肝先驅細胞(對照條件)，以及已經用下列預處理的肝先驅細胞：IL-1β/TNFα/IFNγ組合，IL-10單獨或IL-1β/TNFα/IFNγ/IL-10組合(「全部一起」)。根據本發明的具體例，在經預處理細胞中觀察到IDO活性增強。

本發明涉及呈HLA-G陽性的經分離肝臟衍生之先驅細胞或幹細胞、一種製備此等細胞的方法，包含此等細胞的組成物和其供治療或預防涉及不樂見免疫反應(諸如發炎，自體免疫疾病和移植物排斥)之病症及治療肝臟疾病的用途。

除非另有定義，否則用於揭示本發明的所有術語(包括技術和科學術語)均具有本發明所屬領域中習於技藝者一般所理解的含義。透過進一步的指引，納入術語定義以便更為充份地理解本發明的教示。

如本文所用，下列術語具有以下含義：

除非上下文另有明確指出，否則如本文所用的「一(a、an)」及「該(the)」均指單數和複數指代物。舉例來說，「隔室(compartment)」是指一個或超過一個隔室。

如本文所用，「約」是指可測量值(諸如參數、量，暫時持續時間及類似者)，意在含括與指定值相差+/-20%或更少，較佳+/-10%或更少，更佳+/-5%或更少，甚至更佳+/-1%或更少，且又更佳+/-0.1%或更少的變化程度，就目前而言，這樣的變化程度對於在揭示之本發明中實施來說是合宜的。然而，應當理解，修飾語「約」所指的值本身也被具體揭示。

如本文所用，「包含(comprise、comprising及comprises，和comprised of)」與「包括(include，including，includes)」或「含有(contain，containing，contains)」同義，並且是包含性的或開放性術語，其指明之後存在者(例如組分)，並且不排除或屏除存在技藝中已知或其中揭示的額外未引用的組分、特徵、元件、構件、步驟。

透過端點來列舉的數值範圍包括該範圍內所含的所有數字和分數，以及所列舉的端點。

除非另有定義，否則在本文以及整個說明書中，詞句「%以重量計」、「重量百分比」，「%wt」或「wt%」是指個別組分基於配方總重量的相對重量。

如本文所用，術語「經分離細胞」通常是指不與一或多個細胞或一或多種細胞在活體內所結合之細胞組分結合的細胞。例如，經分離細胞可能已經從其天然環境中移出，或者可能是由於已經從其天然環境中移出的細胞增殖(例如離體增殖)而產生。

如本文所用，術語「在活體外」是指動物或人體以外或外部。如本文所用，術語「在活體外」應理解為包括「離體」。術語「離體」通常是指從動物或人體取出並在體外(例如培養容器中)維持或增殖的組織或細胞。

術語「肝先驅細胞」是指透過培養從肝臟分離之細胞產生的未特化並具有增生能力的細胞，且該等細胞或其後代可以產生至少一種相對更為特化的細胞類型。肝先驅細胞產生後代，這些後代可以沿一或多個譜系分化以產生越來越特化的細胞(但較佳是肝細胞或肝活性細胞)，其中此類後代本身就可能是先驅細胞，或甚至可以產生終末分化的肝臟細胞(例如完全特化的細胞，特別是呈現與初代人類肝細胞之型態和功能特徵相似的細胞)。

術語「幹細胞」是指能夠自我更新的先驅細胞，意即可以在不分化的情況下增生，從而幹細胞的後代或其至少一部分基本上保留了母幹細胞的未特化或相對較不特化的表現型，分化潛能和增生能力。該術語含括能夠基本上無限自我更新的幹細胞(即，其中與母細胞相比，後代或其一部分進一步增生的能力基本上沒有降低)，以及表現出有限自我更新的幹細胞(即其中與母細胞相比，後代或其一部分進一步增生的能力明顯降低)。

基於產生多種細胞類型的能力，先驅細胞或幹細胞通常可被描述為全能、多能(pluripotent)，多能(multipotent)或單能。單個「全能」細胞被定義為能夠生長(即發育)成一個完整的生物體。「多能(pluripotent)」細胞不能生長成一個完整的生物體，但是能夠產生源自所有三個胚層(即中胚層，內胚層和外胚層)的細胞類型，並且可能能夠產生生物體的所有細胞類型。「多能(multipotent)」細胞能夠從生物體的兩個或更多個不同器官或組織中的每一者產生至少一種細胞類型，其中該等細胞類型可能源自相同或不同的胚層，但是不能產生生物體的所有細胞類型。「單能」細胞能夠分化為僅只一種細胞譜系的細胞。

術語「間質幹細胞」應理解為主要從間質或從基質細胞衍生或分離而來的多能基質細胞。該等間質幹細胞能夠分化各種細胞類型，包括但不限於肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞，肌腱細胞和脂肪細胞。

術語「肝細胞」含括上皮和實質肝臟細胞，包括但不限於大小或倍數不同(例如二倍體、四倍體、八倍體)的肝細胞。

如本文所使用，術語「HLA-G陽性」是指表現或分泌可偵測水平之HLA-G蛋白的肝先驅細胞或幹細胞。HLA-G表現可能在細胞內，在細胞表面上及/或呈可溶性蛋白質，最後被分泌到環境(通常為細胞生長或存在其中的細胞培養基)中。若說到某一個細胞對特定標記呈陽性時，這意味著習於技術者將推定存在明顯信號或有明顯信號的證據，例如當進行適當測量時與合適的對照相比較，抗體可偵測到或可透過逆轉錄聚合酶鏈反應或流動式細胞測量術偵測。當偵測方法允許對標記進行定量評估時，陽性細胞平均可產生與對照顯著有別的訊號，例如(但不限於)比由對照細胞所產生的訊號高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍，例如高至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍，至少50倍或甚至更高。若是分泌的因子，則偵測方法可包括篩選細胞環境(諸如細胞培養基)中的分泌因子，其中所偵測到的訊號又再明顯有別於對照，例如(但不限於)比由對照細胞所產生的訊號高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍，例如高至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍，至少50倍或甚至更高。該訊號可以是在環境中所量化的分泌因子濃度。

術語「升高的」當與表現，分泌或酶活性升高有關時，如本文所用，定義表現，分泌或酶活性的水平為預處理的結果，其高於在未接受任何處理(諸如例如預處理)的類似細胞中的表現，分泌或酶活性的基礎水平，例如(但不限於)比由對照細胞所產生的訊號高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍，例如高至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍，至少50倍或甚至更高。

術語「肝臟」是指肝臟器官。術語「肝臟的一部分」通常是指衍生自肝臟器官的任何部分的組織樣本，而對其所源自之肝臟器官的該部分或區域的數量沒有任何限制。較佳地，存在於肝臟器官中的所有細胞類型也可以呈現在肝臟的該部分中。肝臟的一部分之量可以至少部分地基於需求實際考慮，獲得足夠的初代肝臟細胞以供合理地實施本發明的方法。因此，肝臟的一部分可以代表肝臟器官的百分比(例如至少1%、10%、20%、50%、70%，90%或更多，通常呈w/w)。在其他非限制性實例中，肝臟的一部分可以按重量定義(例如，至少1g、10g、100g、250g，500g或更多)。例如，肝臟的一部分可以是肝葉(例如右葉或左葉)，或包含在分割肝臟手術期間或在肝臟生檢中切除之包含大量細胞的任何節段或組織樣本。

術語「成體(adult)肝臟」是指出生後(即出生後任何時間)，較佳足月的個體的肝臟，並且可以是例如出生後至少1天、1週，1個月或超過1個月，或至少1歲、5歲、10歲或更大。因此，可以在人類個體中發現「成體肝臟」或成熟肝臟，否則將以常規術語「嬰兒」、「兒童」，「青少年」或「成年」來說明。習於技藝者將認知到，在不同的動物物種中，肝臟可以在出生後的不同時間間隔內達到相當的發育成熟度，並且可以針對每種物種適當地解釋術語「成體肝臟」。

術語「哺乳動物」包括這樣分類的任何動物，包括但不限於人類、馴養和農場動物、動物園動物、運動動物、寵物動物，伴侶動物和實驗動物，諸如例如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬，豬和靈長類動物(例如猴子和猿)。

如本文所用，術語「解離」通常是指部分或完全破壞組織或器官的細胞組織(organization)，即部分或完全破壞細胞與組織或器官的細胞組分之間的結合。如習於技藝者可以理解的，解離組織或器官之目的是要從該組織或器官獲得細胞(或細胞群體)的懸浮液。懸浮液可包含單獨細胞或單一細胞，以及經物理附接以形成兩個或更多細胞之簇(cluster)或叢(clump)的細胞。解離較佳不會導致細胞生存力降低，或導致細胞生存力降低盡可能地小。

如本文所用，術語「初代細胞」包括存在於從個體之組織或器官(例如肝臟)獲得的細胞懸浮液中的細胞，該細胞懸浮液是透過採用適當技術使存在於此等經移出組織或器官中的細胞解離而獲得。

術語「培養」在本技藝中是常見的，並且廣泛地指細胞及/或其後代的維持及/或生長。

術語「繼代」在本技藝中是常見的，並且是指將培養的細胞與培養基質彼此分離和解離。為簡明起見，在本發明的方法中，於附著培養條件下使細胞首次生長後進行的繼代在本文中稱為「第一代」(或第1代，P1)。細胞可以繼代至少一次，較佳兩次或更多次。在本文中，第1代之後的每個繼代均以1遞增，例如第2、3、4、5代或P1、P2、P3、P4、P5等。

如本文所用，術語「匯聚(confluence)」是指培養細胞的密度，其中細胞彼此接觸，基本上覆蓋了所有可用於生長的表面(即，完全匯聚)。

術語「血漿」是如慣例定義，並指不形成人體或動物體一部分的組成物。

如慣例定義，術語「血清」是由全血樣本獲得的，先在樣本中發生凝血，然後透過適當技術(通常是透過離心)將由此形成的血塊和血液樣本的細胞組分與液體組分(血清)分離。惰性催化劑(例如玻璃珠或粉末)可以促進凝血。有利地，可以使用血清分離器(SST)製備血清，該血清分離器包含針對哺乳動物的惰性催化劑。

術語「細胞培養基(cell medium或cell culture medium)或培養基」是指一種含有營養物質的水性液體或膠狀物質，其可被用於細胞的維持或生長。細胞培養基可以含有血清或不含血清。

如本文所用，術語「生長因子」是指一種生物活性物質，其影響不同細胞類型的增生、生長、分化，存活及/或遷移，並且可單獨或在受到其他物質調節時在生物體中影響發育，型態和功能變化。生長因子通常可以透過作為配體結合至細胞內存在的受體(例如，表面或細胞內受體)而發揮作用。生長因子在本文中可以特別地是包含一或多個多肽鏈的蛋白質實體。術語「生長因子」含括纖維母細胞生長因子(FGF)家族、骨型態發生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生長因子(PDGF)家族、轉型生長因子β(TGF-beta)家族、神經生長因子(NGF)家族、表皮生長因子(EGF)家族、胰島素相關生長因子(IGF)家族、肝細胞生長因子(HGF)家族、介白素6(IL-6)家族(例如抑瘤素M)、造血生長因子(HeGF)、血小板衍生內皮細胞生長因子 (PD-ECGF)、血管生成素、血管內皮生長因子(VEGF)家族或糖皮質激素的成員。當該方法用於人類肝臟細胞時，本方法中使用的生長因子可以是人類或重組生長因子。較佳在本方法中使用人類和重組生長因子，因為預期此等生長因子會對細胞功能引起期望效用。

如本文所用，術語「經預處理(preconditioned)」之肝先驅細胞或幹細胞被定義為在活體外暴露於一或多種信號傳導分子的肝先驅細胞或幹細胞。較佳地，將該等分子添加到該等細胞的細胞培養基中歷時一段預定時間段。

如本文所用，術語「細胞激素」是指信號傳導分子，諸如由免疫或其他細胞分泌的生長，分化或化學營養因子，其作用是針對免疫系統的細胞或針對多能細胞，諸如但不限於T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、多能細胞(包括造血細胞、間質幹細胞和先驅細胞)或其他細胞類型。代表性的細胞激素包括但不限於，吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、肝細胞生長因子(HGF)、由介白素組成之群(諸如但不限於介白素-1α(IL-1α)、介白素-1β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-6(IL-6)、介白素-10(IL-10))、干擾素(諸如干擾素-α(IFNα)和干擾素-γ(IFNγ))、腫瘤壞死因子α(TNFα)，和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子。

術語「細胞群體(cell population與population of cells)」通常是指一群細胞。除非另有說明，否則該術語是指基本上由如本文定義之細胞組成或包含如本文定義之細胞的細胞群。細胞群體可以基本上由具有共同表現型的細胞組成，或者可以包含至少一部分具有共同表現型的細胞。當細胞在一或多個可證明特徵(包括但不限於型態外觀，特定細胞組分或產物(例如，RNA或蛋白質)的表現水平、某些生化路徑的活性，增生能力及/或動力學、分化潛能及/或在活體外培育期間對分化訊號或行為的反應(例如黏附或單層生長))基本上相似或相同時，細胞是具有共同的表現型。因此，這種可證明特徵可以定義一個細胞群體或其一部分。如果基本上多數細胞具有共同的表現型，則細胞群體可以是「基本上均質的」。「基本上均質的」細胞群體可能包含至少60%，例如至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至至少99%具有共同表現型的細胞，表現型諸如是特別指明的表現型 (例如，本發明的肝先驅細胞或幹細胞的表現型，或本發明的肝先驅細胞或幹細胞的後代的表現型)。此外，細胞群體基本上可能由具有共同表現型(諸如本發明的肝先驅細胞或幹細胞的表現型)的細胞(即本發明肝先驅細胞或幹細胞的後代)組成，若群體中存在之任何其他細胞不會改細胞群體之整體特性或對細胞群體之整體特性沒有關鍵性影響，則可以將其定義為細胞株。

如本文所用，術語「醫藥上可接受之載劑」是指不會對個體造成明顯刺激並且不會消除所投與組成物的生物學活性和特性的載劑或稀釋劑。載劑的實例為(不限於)丙二醇、食鹽水，乳液和有機溶劑與水的混合物。

術語「足量」是指足以產生期望和可測量效果的量，例如足以改變蛋白質表現概況的量。

術語「治療有效量」是有效改善疾病症狀之量。治療有效量可以是「預防有效量」，因為預防可以被視為療法。

術語「治療」是指治療性處理和預防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的在於預防或減緩(減輕)目標病理學病況或病症。需要治療的那些人包括已經患有病症者以及容易罹患該病症者或要預防該病症者。

如本文所用，術語「同種異體」表示捐贈的材料來自與受體不同的個體。同種異體幹細胞移植是指一種程序，其中一人接收來自基因相似，但不同的供體之幹細胞。

如本文所用，術語「纖維化」是指在修復或反應過程中，於器官或組織中形成過量的纖維結締組織。

術語「肝臟纖維化」是指在急性或慢性肝臟損傷之後，間質或「瘢痕」細胞外基質的積累。肝硬化是進行性纖維化的晚期，特徵在於隔膜形成和圍繞肝細胞結節的瘢痕環。通常，纖維化需要數年或數十年才能在臨床上變得明顯，但是明顯例外是肝硬化發展數月可能包括小兒肝臟疾病(例如膽道閉鎖)，藥物誘發的肝臟疾病以及肝臟移植後與免疫抑制相關的病毒性肝炎。

術語「rMFI」或相對中值螢光強度是透過使用針對特定標靶的抗體測得的螢光強度與自對照抗體(同型對照)獲得的強度之間的比率。

術語「遺傳工程」、「遺傳修飾」或「遺傳操作」是使用生物技術來直接操作生物體的基因。它是用來改變細胞遺傳組成的一套技術，包括在物種邊界內和跨物種邊界轉移基因以產生改良的或新穎的生物體。透過使用重組DNA方法分離和複製感興趣的遺傳物質，或透過人工合成DNA來獲得新的DNA。通常創造出一個建構體，並將其用於將此DNA插入宿主生物體內。

術語「基因體編輯」或「基因體工程」是一種類型的基因工程，其中在活生物體的基因體中插入、刪除，修飾或置換DNA。不同於將遺傳材料隨機插入宿主基因體內的早期基因工程技術，基因體編輯將插入靶向至部位特異性位置。

在第一個態樣中，本發明提供呈HLA-G陽性之經分離肝先驅細胞或幹細胞。在HLA-G陽性細胞中的HLA-G表現可能是在細胞內，如同細胞表面標記，及/或如同可溶性蛋白質。在一個較佳具體例中，HLA-G陽性細胞被認為是在環境中分泌HLA-G蛋白質的細胞。

在經分離肝臟衍生之間質先驅細胞中誘導HLA-G表現/分泌咸信顯著增強其免疫抑制特性。不希望受到理論所囿限，HLA-G陽性肝先驅細胞的免疫抑制特性被認為是由HLA-G調節自然殺手細胞的細胞毒性活性的能力所造成。因此，HLA-G陽性肝先驅細胞特別適用於治療及/或預防涉及不樂見免疫反應的病症，例如但不限於發炎，自體免疫疾病和移植物排斥，包括多種肝臟病症。

咸信這些先驅細胞能夠保有其增生能力，並且在特定培養基中培育使細胞特異地分化為肝臟特異性細胞類型。其增生能力和其肝臟特異性導致肝臟細胞移植的功效和安全性獲得提高。此外，由於它們的成體來源，這些幹細胞消除了與胚細胞相關的免疫，倫理和致癌性問題。

本發明之先驅細胞的經增強免疫抑制特徵有助於降低細胞療法及/或組織移植的免疫反應相關風險，這個風險在同種異體細胞移植期間尤高。因此，本發明HLA-G陽性肝臟衍生的先驅細胞更可能因為對患者的效力與耐受性獲得改善而成功作為細胞療法用於帶有不樂見免疫反應的病症，不樂見免疫反應為例如，但不限於發炎，自體免疫疾病和移植物排斥。

在一個較佳具體例中，本發明提供人類肝先驅細胞，其為HLA-G陽性，較佳為HLA-G陽性的人類成體肝先驅細胞。

就本發明之目的來說，術語「HLA-G的表現」或「HLA-G陽性細胞」被定義為一種比在未經處理初代細胞中可觀察到的基礎HLA-G表現或分泌更高的表現及/或分泌。因此，當與未經處理之先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-E表現相比，該等細胞的HLA-G表現及/或分泌水平升高。因此，本發明同樣提供了一種從肝臟分離的先驅細胞或幹細胞的組成物，其與基礎水平相比具有升高的HLA-G表現及/或分泌水平。基礎HLA-G表現/分泌可與在不存在增強HLA-G表現的刺激的情況下的無表現/分泌以及最低表現/分泌有關。表現水平升高是指，例如但不限於表現/分泌水平經測量比對照細胞的表現測量結果高至少0.5倍，至少1倍，至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍，至少50倍或甚至更高。

在又一個較佳具體例中，本發明提供一種經分離肝先驅細胞或幹細胞，相較於未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G分泌，其具有升高的HLA-G分泌水平。

參與誘導免疫耐受性的另一個蛋白質是HLA-E。與HLA-G一樣，HLA-E也可以結合抑制性自然殺手細胞受體並發揮免疫抑制功能。據報導HLA-E和HLA-G可以協同工作，且預處理肝先驅細胞可進一步在這些細胞中誘發HLA-E表現。因此，且在本發明的又一個具體例中，肝先驅細胞進一步對HLA-E呈陽性。HLA-E和HLA-G的合作更為增強對應肝先驅細胞的免疫抑制作用，使其更適於細胞治療方法。

在另一個或又一個具體例中，本發明是有關肝先驅細胞或幹細胞，其中如透過流動式細胞測量術測量，HLA-E表現細胞具有至少6.5的HLA-E相對中值螢光強度(rMFI)。rMFI是透過將目標的中值螢光強度除以對照的中值螢光強度所得之比率。通常將rMFI視為不受變化影響的穩定參數。在本發明的上下文中，使用抗(人類)HLA-E抗體。合適抗體的實例是來自Miltenyi的抗HLA-E抗體純系REA1031。可能的流式細胞儀是MACSQuant®分析儀。

在又一個具體例中，如透過流動式細胞測量術測量，HLA-E表現細胞展現出至少7，更佳至少8，更佳至少9，更佳至少10的HLA-E相對中值螢光強度(rMFI)。在另一個具體例中，該rMFI在6.5與15之間，更佳在6.5與14之間，更佳在6.5與13之間，更佳在6.5與13之間，更佳在6.5與12之間。

在本發明的又一個具體例中，當與在未經預處理的肝臟衍生的先驅細胞或幹細胞中偵測到的基礎前列腺素E2(PGE2)分泌水平相比，肝臟衍生的先驅細胞更具有升高的PGE2分泌水平。

在本發明的又另一個具體例中，當與在未經預處理的肝先驅細胞或幹細胞中偵測到的基礎酶活性相比，肝臟衍生的先驅細胞更具有升高的吲哚胺2,3-加氧酶(IDO)酶活性水平。

在本發明的又另一個具體例中，當與在未經預處理的肝先驅細胞或幹細胞中偵測到的基礎表現水平相比，肝臟衍生的先驅細胞更具有升高的一或多種細胞激素或免疫調節因子的表現水平，該等細胞激素或免疫調節因子屬於由IDO，前列腺素-內過氧化物合成酶2(PTGS2)，介白素-6(IL-6)及/或IL-10組成之群。

PTGS2參與PGE2的生成，而IDO、PGE2、IL-6，IL-10和HGF是具有免疫調節特性的分泌型因子。它們表現，分泌及/或酶活性的個別或合併水平升高進一步有助於本發明的肝臟衍生的先驅細胞的免疫抑制和免疫調節特性。因此，根據上述具體例的細胞具有更強的免疫調節特性，並且在細胞療法中(特別是在涉及同種異體細胞移植的療法中)使用更為安全。

在本發明的又另一個具體例中，肝臟衍生的先驅細胞更對至少一種間質標記呈陽性。間質標記包括，但不限於α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44，CD140b和CD29。在又另一個具體例中，本發明肝臟衍生的先驅細胞分泌HGF。在又另一個具體例中，本發明肝臟衍生的先驅細胞對HLA-DR呈陰性。在又一個具體例中，本發明肝臟衍生的先驅細胞視情況對至少一種肝標記呈陽性及/或視情況具有一種肝臟特異性活性。肝標記包括但不限於白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1，CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。肝臟特異性活性包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合、α-1-抗胰蛋白酶分泌、CYP3A4活性。

在一個具體例中，該等細胞的特徵還可以是

a.對α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)，CD140b和視情況白蛋白(ALB)呈陽性；

b.對含蘇西結構域(Sushi domain)蛋白2(SUSD2)和細胞角蛋白-19(CK-19)呈陰性。

在又一個或其他具體例中，該等細胞的特徵還可以是或經測量對以下呈陽性

a.至少一個選自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9，CYP2E1和CYP3A4的肝標記及視情況白蛋白；

b.至少一個選自波形蛋白、CD90、CD73，CD44和CD29的間質標記；

c.至少一個選自尿素分泌、膽紅素接合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝臟特異性活性；

d.至少一個選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP，CD46和CD81的標記；及/或

e.至少一個選自MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN，KCNK2和HMCN1的標記。

在又一個具體例中，進一步測試細胞並確定其對標記CD133、CD45，CK19及/或CD31呈陰性。

可以經由各種方法獲得根據本發明的細胞，組成物和細胞群體。

在一個具體例中，本發明且存在於組成物或細胞群體中的該等幹細胞或先驅細胞包含編碼HLA-G的外源性核酸。人類HLA-G的序列依據NCBI中的基因ID 3135是已知的。該外源性核酸的引入可以透過本技藝中常規已知的遺傳工程技術來進行。該外源性核酸可以是例如核酸建構體，包含載體、誘導型啟動子、編碼感興趣蛋白產物的序列等。用於將序列遞送至細胞中的多種載體(例如質體、表現載體、逆轉錄病毒載體等)是本技藝中已知的。在一個具體例中，載體是逆轉錄病毒或慢病毒載體。

本技藝中已知的多種技術可以用來轉染目標細胞，例如電穿孔、經鈣沉澱的DNA、融合、轉染，脂轉染及類似方法。引入DNA的特定方式對於實施本發明來說並非關鍵。可以使用逆轉錄病毒和合適包裝株的組合，其中衣殼蛋白將具有感染目標細胞的功能。通常，將細胞和病毒在培養基中培育至少約24小時。常用的逆轉錄病毒載體是「有缺陷的」，即不能產生有效感染所需的病毒蛋白。載體的複製需要在包裝細胞株中生長。

還可以選定感興趣的蛋白產物以幫助偵測及/或選出本文所述的先驅細胞群體。為了偵測或選出幹細胞，將偵測建構體引入被懷疑是或包含幹細胞的細胞或細胞群體中。引入表現建構體後，將細胞維持一段足以表現可偵測標記的時間段，通常至少約12個小時且不超過約2週，並且可為約1天至約1週。

擴增後，可以自目標細胞去除遺傳建構體。這可以透過使用瞬時載體系統或透過納入側接編碼所需蛋白質之序列的異源重組位點來實現。較佳地，表現載體中納入可偵測標記，例如綠色螢光蛋白、螢光素酶、適於抗體篩選方法的細胞表面蛋白等，使得在建構體缺失後，可以容易地分離缺乏外源性序列的細胞。

可以使用提供在哺乳動物細胞中瞬時或長期表現的表現載體。通常，瞬時表現涉及使用能夠在宿主細胞中有效率複製的表現載體，使得宿主細胞累積表現載體的許多複本，並進而合成高水平的由該表現載體編碼的所需多肽。包括合適表現載體和宿主細胞的瞬時表現系統允許方便短期擴增細胞，但不影響細胞的長期基因型。

在一些具體例中，將選定的細胞維持培養至少一代，通常至少約兩代；至少約三代；或更多代，且最多不超過約10代，通常不超過約七代。在這樣培養之後，如上所述針對可偵測標記的表現來對細胞進行分選。

在一個具體例中，該外源性核酸經由靶向基因體編輯被引入該等細胞中。用於靶向基因體編輯的常用方法是使用核酸酶，例如聚核酸酶、鋅指核酸酶、基於轉錄活化因子樣效應子的核酸酶(TALEN)和成簇規則間隔的短回文重複序列(CRISPR/Cas9)系統。在一個較佳具體例中，使用CRISPR/Cas9系統將HLA-G引入該等幹細胞或先驅細胞中。

本發明同樣提供一種用於製備HLA-G陽性肝先驅細胞或幹細胞的方法，其包含預處理細胞的步驟，這是指將一或多種細胞激素添加至肝先驅細胞或幹細胞之培養物的細胞培養基。

在一個較佳具體例中，該方法包含以下步驟：

(a)解離成體肝臟或其一部分以形成初代肝臟細胞的群體；

(b)產生(a)的初代肝臟細胞的製備物；

(c)將(b)的製備物中所含的細胞培養至撐體(support)上，該撐體允許細胞附著至其並生長且出現細胞群體；

(d)使(c)的細胞繼代至少一次；

(e)在步驟(d)的一代時，較佳在步驟(d)的最後一次繼代，用一或多種細胞激素預處理該等細胞；及

(f)收取在(e)的預處理後獲得的細胞群體。

在又一個具體例中，視情況測量在步驟(f)中獲得的細胞中的HLA-G表現，並且若需要，對這些細胞進行進一步篩選。

基礎HLA-G表現可與培養基中不存在外源性細胞激素的情況下無表現以及表現最小有關。

關於方法的步驟(a)，該解離步驟涉及獲得肝臟或其一部分，該肝臟或其一部分包含與完全分化肝細胞一起的某量的初代細胞，其可用於產生肝先驅細胞或幹細胞。

肝臟或其一部分是得自「個體」，「供體個體」或「供體」，可互換地指脊椎動物，較佳哺乳動物，更佳為人類。肝臟的一部分可以是衍生自肝臟任一部分的組織樣本，並且可以包含存在於肝臟中的不同細胞類型。根據本發明的細胞較佳地從哺乳動物肝臟或肝臟的一部分分離而來，其中術語哺乳動物是指被分類為哺乳動物的任何動物，包括人類，馴養和農場動物，以及動物園、實驗室、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛、小鼠、大鼠、兔等。更佳地，肝先驅細胞或幹細胞是從人類肝臟或其一部分分離而來，較佳人類成體肝臟或其一部分。根據本發明從成體人類個體的肝臟衍生而來的肝先驅細胞或細胞株或其後代可以有利地用於例如罹患涉及不樂見免疫反應之病症的患者(特別是人類患者)的研究和療法中，不樂見免疫反應為例如但不限於發炎，自體免疫疾病和移植物排斥，包括肝臟疾病。與其他幹細胞來源(諸如例如易於產生腫瘤生長的胚幹細胞)相反，衍生自成體肝臟的幹細胞可降低致癌性偏差的風險，從而使其更為安全地用於細胞移植。

在本發明的一個替代性具體例中，成體肝臟或其一部分可以來自非人類動物個體，較佳非人類哺乳動物個體。如本文所述衍生自非人類動物或非人類哺乳動物個體的肝臟的先驅細胞或幹細胞或細胞株或其後代可以有利地用於例如相同，相關或其他非人類動物或非人類哺乳動物物種之成員的肝臟疾病的研究和療法中，或甚至在患有肝臟疾病(例如異種移植，包含非人類動物或非人類哺乳動物細胞的生物人工肝臟裝置)之人類患者的療法中。借助於實例而非限制，用於人類療法尤其合適的非人類哺乳動物細胞可能源自豬。

如依據本技藝中公認的標準所確定，諸如例如「心肺」標準(通常涉及循環和呼吸功能不可逆轉的停止)或「腦死」標準(通常涉及整個腦部(包括腦幹)所有功能不可逆轉的停止)，供體個體可能是活的或死的。收取可能涉及本技藝中已知的程序，諸如例如生檢，截除或切除。

習於技藝者將理解，從供體個體收取肝臟或其一部分的至少一些態樣可能要遵從對應的法律和道德規範。作為例示而非限制，從活著的人類供體收取肝臟組織可能需要兼顧維持供體的進一步生命。因此，通常可以例如使用生檢或截除從活著的人類供體僅僅移除一部分肝臟，從而在供體中維持足夠水平的生理肝臟功能。在另一方面，從非人類動物收取肝臟或其一部分可能但不必然兼顧非人類動物的進一步存活。例如，可以在收取組織之後人道地撲殺非人類動物。這些與類似的考量對習於技藝者來說將是顯而易見的，並且反映了法律和道德標準。

肝臟或其一部分可得自具有持續循環(例如跳動的心臟)並且具有持續呼吸功能(例如，呼吸的肺或人工通氣)的供體，較佳為人類供體。在遵守道德和法律規範的情況下，供體可能必須是腦死或不必要為腦死(例如，可能會容許在腦死的人中移除整個肝臟或其一部分，這將無法兼顧人類供體的進一步存活)。從這樣的供體收取肝臟或其一部分是有利的，因為組織沒有遭受通常因為局部缺血(循環停止)引起的實質性缺氧(缺乏氧合(oxygenation))。

或者，可從供體(較佳為人類供體)獲得肝臟或其一部分，該供體在收取組織時已停止循環(例如心臟無跳動)及/或已停止呼吸功能(例如肺已無呼吸且無人工通氣)。儘管來自這些供體的肝臟或其一部分可能受到至少某種程度的缺氧，但也可以從此等組織中分離出可用的先驅細胞或幹細胞。可以在供體的循環(例如心跳)停止後約24小時內(例如在約20h內，例如在約16h內，更佳在約12h內，例如在約8h內，甚至更佳在約6h內，例如約5h內，約4h內或約3h內，又更佳約2h內，且最佳約1h內，諸如在供體的循環(例如心跳)停止後約45、30或15分鐘內)，收取肝臟或其一部分。

所收取的組織可被冷卻至約室溫，或至低於室溫的溫度，但通常要避免組織或其部分凍結，尤其是這樣的凍結可能將導致成核形成或冰晶生長。例如，組織可以維持在約1℃與室溫之間，約2℃與室溫之間，約3℃與室溫之間或約4℃與室溫之間的任何溫度下，並且可有利地維持在約4℃下。如本技藝中已知的，也可以將組織保持「在冰上」。可以在全部或部分缺血時間，即在供體停止循環後的時間內，冷卻組織。也就是說，組織可以經歷熱缺血，冷缺血或熱和冷缺血的組合。所收取的組織可以在處理之前保持例如至多48小時，較佳少於24小時，例如少於16小時，更佳少於12小時，例如少於10小時，少於6小時，少於3小時，少於2小時或少於1小時。

所收取的組織可有利地但不必然被保持(例如完全或至少部分地浸沒)在合適的培養基中，及/或可以但可不必然用合適的培養基灌注，然後進一步處理組織。習於技藝者能夠選擇合適的培養基，該培養基可以在處理之前的時期期間支持組織細胞的存活。

根據本技藝中已知的方法，例如如EP1969118、EP3039123，EP3140393或WO2017149059中所述，從肝臟或部分肝臟分離先驅細胞或幹細胞。

簡言之，首先從肝臟或其一部分解離而獲得肝臟初代細胞群體，從該肝臟或其一部分形成初代細胞群體。隨後，在附著條件下培養此製備物中所含的細胞，較佳地使細胞附著並生長在撐體上。接下來，使這些細胞繼代至少一次，較佳在70%匯聚下。最後，分離出對至少一種肝標記和至少一種間質標記呈陽性且具有至少一種肝臟特異性活性的細胞。

用於解離肝臟或其一部分以自其獲得初代細胞群體(懸浮液)的合適方法可以是本技藝中眾所周知的任何方法，包括但不限於酶消化、機械分離、過濾，離心及其組合。

關於該方法的步驟(b)，如所定義並在此透過解離肝臟或其一部分而獲得之初代細胞群體通常可能是異質的，即其可包含屬於一或多種屬於任何構成肝臟之細胞類型之細胞類型的細胞，包括先驅細胞或幹細胞，它們可能存在於肝臟實質及/或肝臟非實質部分中。例示性構成肝臟之細胞類型包括，但不限於肝細胞、膽管細胞(cholangiocyte)(膽管細胞(bile duct cell))、庫佛氏細胞，肝星狀細胞(Ito細胞)，卵圓形細胞(oval cell)和肝內皮細胞。以上術語具有經本技藝確認的含義，並且在本文中被廣泛地解釋為含括這樣分類的任何細胞類型。

根據解離肝臟的方法及/或任何用於分離或富集肝細胞及/或其他細胞類型之初始製備物的方法，基於物理特性(尺寸，型態)、生存力，細胞培養條件或細胞表面標記表現，透過應用任何合適的技術，初代細胞群體可包含不同比例的肝細胞(佔總細胞的0.1%、1%，10%或更多)。

如所定義或透過解離肝臟(或部分肝臟)而獲得的初代細胞群體可立刻用於建立細胞培養物，成為新鮮的初代肝臟細胞，或者較佳使用長期保存的慣常技術被儲存為經冷凍保存的初代肝臟細胞製備物。

關於步驟(c)，接著將步驟(b)中所獲得的肝臟初代細胞製備物直接培養在完全合成撐體(例如塑膠或任何聚合物質)上，或預先塗佈有飼養細胞，蛋白質萃取物或允許相似的初代細胞附著並增生以及出現具有所需標記的成體肝先驅細胞群體的任何其他生物學來源的材料的合成撐體，這些標記較佳是透過免疫組織化學、流動式細胞測量術或其他基於抗體的技術在蛋白質層次上進行鑑別。初代細胞被培養在維持其附著和增生，還有出現均質細胞群體的細胞培養基中。如上所定義的初代肝臟細胞的這個培養步驟導致培養物中出現肝先驅細胞並增生，且可以持續直到肝先驅細胞或幹細胞充分增生。例如，可以持續培養直至細胞群體已經達到某種程度的匯聚(例如，至少50%、70%，或至少90%或更為匯聚)。

在步驟(c)獲得的肝先驅細胞或幹細胞可以透過允許在這個階段(即，如步驟(d)所示的繼代細胞之前)偵測相關標記的技術來進一步特徵鑑定，如EP3140393或WO2017149059中所述。在用於識定此等標記，並測量它們為陽性或陰性的技術中，西方墨點、流動式細胞測量術，免疫細胞化學和ELISA是較佳的，因為這些允許即便少量肝先驅細胞可供使用於此步驟的情況下以蛋白質層次來偵測標記。

然後可以基於陽性標記的存在來分離肝先驅細胞，該等肝先驅細胞對至少一種間質標記呈陽性。間質標記包括但不限於波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140-b。另外，肝先驅細胞可能分泌HGF。另外，肝先驅細胞可視情況對至少一種肝標記呈陽性及/或具有至少一種肝臟特異性活性。例如，肝標記包括但不限於白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1，CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。肝臟特異性活性包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合，α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。

關於方法的步驟(d)，將初代細胞培養在維持其附著並增生，且在至少一次繼代之後出現漸漸富含肝先驅細胞或幹細胞之均質細胞群體的細胞培養基中。這些肝先驅細胞可快速擴增以產生足夠的細胞供獲得具有所需特性的後代(如EP3140393或WO2017149059中所述)，其中細胞可在48-72小時內倍增並維持具有所需特性的肝先驅細胞持續至少2、3、4、5代或更多代。

將經分離的肝先驅細胞鋪在允許細胞附著至其的基質上，並在維持其進一步增生的培養基中進行培養，該培養基通常為液體培養基，其可含血清或可不含血清。大體上，允許細胞附著至其的基質可以是任何基本上親水的基質。用於生長附著細胞的現有標準實務可能涉及在添加或不添加牛，人類或其他動物血清的情況下使用限定化學培養基。這些可以補充有機或無機化合物之適當混合物的培養基，除了提供營養及/或生長促進劑外，還可以促進特定細胞類型的生長/附著或消除/分離。除了提供營養及/或生長促進劑外，添加的血清還可以透過在處理過的塑膠表面上塗覆一層讓細胞更充分附著的基質來促使細胞附著。如習於技藝者所理解的，可以對細胞進行計數以便於隨後以所需密度將細胞舖盤。

舖有細胞的環境可至少包含細胞培養基，在本發明的方法中通常為液體培養基，其支持經分離肝先驅細胞的存活及/或生長。可以在將細胞引入之前，同時或之後將液體培養基添加至系統。

通常，培養基將包含技藝中熟知的基礎培養基配方。許多基礎培養基配方可用於培養本文的初代細胞，包括但不限於依格氏最低必需培養基(Eagle’s Minimum Essential Medium，MEM)、經杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)、α經改良最低必需培養基(alpha-MEM)、基礎必需培養基(BME)、經依考夫氏改良的杜貝可氏培養基(IMDM)、BGJb培養基、F-12營養混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、必需經改良依格氏培養基(EMEM)、RPMI-1640、培養基199、Waymouth氏MB 752/1或Williams Medium E，及其改良及/或組合。上述基礎培養基的組成是本技藝中眾所周知的，並且根據所培養細胞的需要來修改或調節培養基及/或培養基補充劑的濃度落在習於技藝者的能力範圍內。較佳的基礎培養基配方可以是市售可取得的那些，例如Williams Medium E，IMDM或DMEM，據報導它們可以維持成體肝臟細胞的活體外培養，並且包括供其適當地生長、增生、維持所需標記及/或生物活性或長期保存的生長因子混合物。另一種較佳的培養基是支持肝先驅細胞生長的可商購無血清培養基，諸如例如來自Miltenyi的StemMacs^TM。

這樣的基礎培養基配方含有本身已知的哺乳動物細胞發育所必需的成分。借助說明而非限制，這些成分可以包括無機鹽(特別是含有Na、K、Mg、Ca、Cl，P以及可能的Cu、Fe、Se和Zn的鹽)、生理緩衝劑(例如HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸，核苷及/或核酸鹼基、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素、抗氧化劑(例如麩胺硫)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸(例如丙酮酸鈉)、乙酸鹽(例如乙酸鈉))等。同樣明顯的是，有或沒有丙酮酸鈉的許多培養基都可以作為低葡萄糖配方來使用。

供培養使用，基礎培養基可以補充一或多種其他成分。例如，可以使用額外補充劑為細胞提供必要的微量元素和物質，以實現最佳的生長和擴增。此類補充劑包括胰島素、運鐵蛋白，硒鹽及其組合。這些成分可以併入鹽溶液中，諸如但不限於漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)、Earle氏鹽溶液。可以添加其他抗氧化劑補充劑，例如β-巰基乙醇。儘管許多基礎培養基已經含有胺基酸，但稍後可以補充一些胺基酸，例如L-麩醯胺酸，其已知在溶液中較不穩定。培養基可進一步補充抗生素及/或抗真菌化合物，諸如典型地青黴素和鏈黴素的混合物，及/或其它化合物，例如但不限於兩性黴素、胺芐青黴素、慶大黴素、博來黴素、潮黴素、卡那黴素、絲裂黴素、黴酚酸、萘啶酸、新黴素、制黴菌素、巴龍黴素、多黏菌素、嘌呤黴素、利福平、觀黴素、四環素，泰黴素和吉歐黴素。

激素也可以有利地用於細胞培養中，且包括(但不限於)D-醛固酮、己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)、地塞米松(dexamethasone)、雌二醇(estradiol)、氫化可體松(hydrocortisone)、胰島素、催乳素、孕酮(progesterone)、抑體素/人類生長激素(HGH)、促甲狀腺素、甲狀腺素、L-甲狀腺胺酸，表皮生長因子(EGF)和肝細胞生長因子(HGF)。肝細胞還可以受益於與三碘甲狀腺素，α-生育酚乙酸酯和升糖素一同培養。

脂質和脂質載劑也可以用於補充細胞培養基。此類脂質和載劑可包括但不限於環糊精、膽固醇，與白蛋白接合的亞麻油酸、與白蛋白接合的亞麻油酸和油酸、未接合的亞麻油酸、與白蛋白接合的亞麻油酸-油酸-花生油酸、未接合或與白蛋白接合的油酸等。白蛋白可同樣用於不含脂肪酸的配方中。

還考慮到用哺乳動物血漿或血清來補充細胞培養基。血漿或血清通常含有生存力和擴增所必需的細胞因子以及組分。也考慮使用合適的血清替代物。可用於如本文所述之培養基的合適血清或血漿可包括人類血清或血漿，或來自非人類動物，較佳地非人類哺乳動物，諸如例如非人類靈長類動物(例如，狐猴、猴子、猿)的血清或血漿、胎兒或成體牛、馬、豬、羔羊、山羊、狗、兔，小鼠或大鼠血清或血漿等。在另一個具體例中，上述血漿及/或血清的任何組合可用於細胞培養基中。

在正常條件下，已報導過在注射至患者中之後，HLA-G於間質幹細胞上的表現，但是表現侷限在所注射之細胞群體內的一個小小細胞子群。發明人破解了誘發HLA-G表現的機制。因此，在本發明的又一個具體例中，經分離肝先驅細胞經一或多種細胞激素預處理。較佳地，將該等細胞激素添加至肝先驅細胞或幹細胞之培養物的細胞培養基中。所採用的細胞可以是新鮮的，經冷凍的或已經進行過先前培養。

關於步驟(e)，用於預處理的培養基組成可以具有與在分離肝先驅細胞期間使用的培養基之組成相同的特徵，或可能相同或基本上相同。或者，培養基可能不同。

因此，依據本發明的一個具體例，經分離的肝先驅細胞的預處理涉及透過向細胞培養基添加一或多種對應信號傳導分子(在這個情況下為細胞激素)，而在活體外使細胞暴露於細胞激素。適用於預處理的細胞激素可以是促發炎性細胞激素及抗發炎性細胞激素，並包括但不限於介白素-1α(IL-1α)、介白素-1β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-6(IL-6)、介白素-10(IL-10)；干擾素，諸如干擾素-α(INFα)和干擾素-γ(INFγ)；腫瘤壞死因子-α(TNFα)與顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子。

可以使用技藝中已知的任何合適免疫學技術(諸如流動式細胞測量術、免疫細胞化學或親和吸附、西方墨點分析、ELISA等)，或透過測量標記mRNA之量的任何合適技術(例如北方墨點、半定量或定量RT-PCR等)來偵測特定標記(諸如HLA-G或HLA-E)的表現。若考慮分泌型蛋白質的水平，則在目前HLA-G的情況下，可能需要分析細胞存在其中之細胞培養基。用於分泌型蛋白質的合適量化技術包括ELISA和西方墨點。

如上所述，利用細胞激素在活體外處理經分離的先驅細胞會誘導HLA-G表現/分泌。因此，在本發明的又一個具體例中，與未經預處理的肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G表現相比，經預處理細胞具有升高的HLA-G表現/分泌水平。因此，本發明同樣提供一種透過向細胞培養基添加一或多種細胞激素來製備從肝臟分離之經預處理先驅細胞的方法，該等經預處理先驅細胞與基礎水平相比具有升高的HLA-G表現/分泌水平。基礎HLA-G表現可能與培養基中外源性細胞激素不存在時無表現以及表現/分泌最小有關。表現/分泌水平升高是指，例如但不限於，表現水平經測量比對照細胞的表現測量結果高至少0.5倍，至少1倍，至少1.5倍，例如至少2倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍，至少50倍或甚至更高。

較佳地，細胞激素(即INFγ、TNFα、IL-1β，IL-10及其組合)被用於誘導HLA-G表現及後續分泌。因此，在本發明的又一個具體例中，較佳地利用選自以下的細胞激素來進行成體肝先驅細胞或幹細胞的預處理：INFγ、TNFα、IL-1β，IL-10及其任何組合。發現這些細胞激素在肝先驅細胞中可有效地誘導HLA-G表現。在一個具體例中，該等細胞激素為至少INFγ與TNFα。在一個較佳具體例中，混合物還包含IL-1β及/或IL-10。這些特定的細胞激素組合顯示，在肝先驅細胞或幹細胞中誘導HLA-G表現的效率增高。

在一個具體例中，被添加到細胞之細胞培養基的細胞激素的最終總濃度介於5ng/ml與400ng/ml之間，較佳介於10ng/ml與360ng/ml之間，更佳介於20ng/ml與240ng/ml之間。在本發明的另一個或又一個具體例中，細胞培養基中的個別細胞激素濃度介於5與100ng/ml之間，更佳介於10與80ng/ml之間，最佳介於20與60ng/ml之間。

更具體而言，當細胞經預處理歷時1小時至72小時，更佳歷時12小時至60小時，更佳歷時24小時至60小時以及最佳歷時24至48小時，用細胞激素預處理肝先驅細胞的有效性對HLA-G表現/分泌最為有效。

所提及的濃度和處理持續時間範圍被認為足以在該等細胞中誘導可接受的HLA-G表現。

關於上述步驟(f)，與未經預處理的肝先驅細胞或幹細胞相比，在本發明的又一個具體例中，對具有升高的HLA-G水平的細胞視情況施用分離細胞群體。

在第二個態樣中，本發明提供一種包含具有上述特徵(且視情況進一步經修飾，例如遺傳修飾)之經分離肝先驅細胞或幹細胞的細胞群體或組成物。在一個具體例中，該細胞群體可包含約5%或更多，例如約10%或更多的該等先驅細胞或幹細胞，約20%或更多、約30%或更多、約40%或更多、約50%或更多、約60%或更多、約65%或更多、約70%或更多、約75%或更多，約80%，約85%或更多或約90%或更多的先驅細胞或幹細胞，或該等先驅細胞或幹細胞為基本上均質或是均質群體。透過在該群體中增加先驅細胞或幹細胞的量，可以進一步增強細胞群體的免疫抑制特性。

在一個具體例中，依據本發明的細胞群體或組成物包含肝先驅細胞或幹細胞，其中至少50%，至少60%，至少65%，更佳至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，更佳至少85%，更佳至少90%，更佳至少95%的該等先驅細胞或幹細胞表現及/或分泌細胞表面標記HLA-G。

本發明還有關一種組成物，其包含本發明之對HLA-G呈陽性的經分離肝先驅細胞或幹細胞，其細胞株或包含其的細胞群體，或其後代，包括已分化後代，尤其是肝細胞或肝細胞樣細胞，視情況經遺傳修飾。

在本發明的一個具體例中，該組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。選定醫藥上可接受之載劑或稀釋劑，其中本發明的細胞保持生存力並維持其免疫調節特性。載劑可以是醫藥上可接受的溶劑或分散介質，其含有例如水、食鹽水、磷酸鹽緩衝食鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇與類似物)及其合適的混合物。因此，本發明揭示了一種醫藥組成物，其包含如上所述的經分離肝先驅細胞或幹細胞，其細胞株或包含其等的細胞群體。

較佳地，本發明之包含該等經分離肝先驅細胞的組成物可包含至少10³、10⁶、10⁹或更多個細胞(例如，每次劑量或投藥為5百萬和5億之間，或5百萬和2.5億之間，或5千萬與5億之間，或5千萬與2.5億之間，或1億與5億之間，或1億與2.5億之間的細胞)。這樣基於細胞的組成物還可以包括其他生物來源的製劑(例如抗體或生長因子)或化學來源的製劑(例如藥物，細胞保存或標記化合物)，它們可以提供進一步的治療，診斷或任何其他有用的作用。文獻提供了與基於細胞的醫藥組成物相容的選用添加劑、賦形劑，媒劑及/或載劑的幾個實例，該等醫藥組成物可包括更多特定緩衝劑，生長因子或佐劑，其中限定組成物的每種組分的量(以微克/毫克，體積或百分比表示)，以及將它們與肝先驅細胞結合的方式。

在又一個具體例中，本發明的組成物可以作為醫藥組成物提供，其可呈組成物形式(包括新鮮細胞或適於長期儲存之細胞(例如冷凍保存細胞)的細胞)用於活體內(在人體內或動物模型內)投藥，或活體外施用的治療方法中。

在另一個或又一個具體例中，本發明的組成物可以呈細胞懸浮液，海綿或細胞可以在活體外及/或活體內生長和分化之其他三維結構的形式提供，包括生物人工肝臟裝置、天然或合成基質，或其他允許細胞在適當位置植入和發揮功能的系統(包括表現趨化因子的發炎或組織損傷區域，這些趨化因子有助於細胞的歸巢和植入)。具體而言，本發明的組成物可以經由注射(也含括導管投藥，靜脈內或動脈內)或植入來投藥，例如局部注射、全身注射、脾內注射、關節內注射、腹膜內注射、門脈內注射，注射到肝漿(例如在肝囊下面)、非經腸投藥或子宮內注射到胚或胎中。

在又一個態樣中，本發明提供一種如上所述用於治療肝臟疾病的組成物，肝臟疾病包括但不限於：

-(同種異體)肝臟細胞移植，以便治療肝代謝缺陷，肝臟退化性疾病或暴發性肝衰竭，

-製備生物人工肝臟裝置，

-由於將根據本發明的經分離先驅細胞或幹細胞或其群體移植到動物中，從而製備了人類肝臟疾病的動物模型，

-製備毒理學，藥理學的活體外和動物模型，

-對依據本發明之經分離先驅細胞或幹細胞或其群體測試新藥物，包括人類肝炎病毒的抗病毒藥物。

因此，本發明細胞可用於治療肝臟相關疾病，包括但不限於肝衰竭，肝炎和先天性代謝錯誤。本發明的組成物由於其免疫調節特性而特別適合用於治療與發炎或免疫反應有關的肝臟疾病。涉及肝臟細胞移植的治療(其含括可能的免疫相關風險)也受益於包含本發明肝先驅細胞之組成物的突出免疫調節特性。

本發明還揭示經分離先驅細胞或幹細胞，其群體或包含該群體的組成物供以下目的之用途：

-治療具有不樂見免疫反應的病症，例如但不限於發炎，自體免疫疾病和移植物排斥，

-在免疫療法中，

-治療纖維化病症，包括但不限於肝纖維化病症、肺纖維化、腎纖維化、前列腺纖維化、乳房纖維化，心臟肌肉纖維化和涉及纖維化特異性標記增加的其他病症，纖維化特異性標記為任何生化，血清學標記或任何其他可能與纖維化疾病，肝纖維化及/或慢性纖維發炎性疾病(包括纖維發炎性慢性肝衰竭)出現相關的臨床或回聲儀特徵，

-肝先驅細胞或幹細胞移植，以便治療基於肝臟的先天性代謝缺陷：這些疾病的非窮盡性實例包括苯丙酮尿症和其他胺基酸病、血友病和其他凝血因子缺陷、家族性高膽固醇血症和其他脂質代謝病症、尿素循環病症、肝醣病、半乳糖血症、果糖血症、酪胺酸血症、蛋白質和碳水化合物代謝缺陷、有機酸尿症、粒線體疾病、過氧小體與溶小體病症、蛋白質合成異常、肝臟細胞轉運蛋白缺陷、糖基化缺陷及類似者，

-治療後天性進行性肝臟退化性疾病，

-治療暴發性肝衰竭和急性或慢性肝衰竭，

-在生物人工肝臟裝置和肝臟輔助裝置中，

-人類肝臟疾病的動物模型

本發明之HLA-G陽性肝先驅細胞或其細胞群體或包含它們的組成物可經由在肝內或肝外位置的肝臟細胞移植(LCT)用於組織工程和細胞療法(包括用於調節對先前或後續肝臟或其他器官與組織移植的免疫反應)。使用這個方法，還可以透過將本發明的經分離人類肝先驅細胞或包含它們的組成物移植到動物中來獲得人類肝臟疾病的動物模型，其中可以更有效地評估化合物對人類肝細胞的影響並與動物模型中的影響予以區別。

-製備人類親肝性病毒感染的動物模型(HBV、HAV、HCV、HEV、HDV…)中

-研究天然病史、傳播、抗藥性、治療效果，抗病毒藥物的使用或使用本發明之經移植肝先驅細胞或幹細胞的任何研究，

-使用依據本發明之肝先驅細胞或幹細胞製備毒理學，藥理學和藥物遺傳學的活體外細胞模型和活體內動物模型，

-對依據本發明之肝先驅細胞或幹細胞測試新藥物，

-基因療法，透過將病毒序列插入依據本發明之肝先驅細胞或幹細胞中，其接而可以在活體外擴增，

-研究人類肝臟細胞代謝的動物模型，

-同種異體細胞的耐受性

-根據本發明的肝先驅細胞或幹細胞供避免，預防或治療肝臟或肝臟細胞同種異體移植物排斥的用途。

如上所述，由於本發明之肝先驅細胞的免疫抑制特性，可以將本發明的組成物投與至感興趣組織以保護該組織免於發炎，免於纖維化和免於隨後的破壞。在不樂見免疫反應通常具有不利後果的細胞置換療法期間，這是特別有利的。因此，本發明的組成物可以用於細胞置換療法。可以將先驅細胞投與至個體的感興趣組織(較佳肝臟組織)，以補充具功能的細胞或置換已經失去功能的細胞，並且避免發炎導致纖維化和組織破壞。因此，先驅細胞、其細胞株，其細胞群體以及包含細胞群體的組成物特別適於治療纖維化病症，包括但不限於肝纖維化疾病、肺纖維化、腎纖維化、前列腺纖維化、乳房纖維化、心臟肌肉纖維化和涉及纖維化特異性標記增加的其他病症，纖維化特異性標記為任何生化，血清學標記或任何其他可能與纖維化疾病(特別是纖維發炎性慢性肝臟疾病)出現相關的臨床或回聲儀特徵，其中肝臟中的纖維發炎性反應常導致慢性肝衰竭。肝臟衍生之先驅細胞的免疫抑制特性有助於減少或預防當下造成肝臟功能逐漸喪失的纖維發炎性反應。另一方面，肝先驅細胞再生和分化成肝臟細胞類型的能力有助於肝臟再生，因此有助於預防慢性肝衰竭。

特徵為導致肝臟質量及/或功能喪失之肝臟纖維化，並且可受益於具有HLA-G水平升高之本發明肝先驅細胞或幹細胞的疾病狀態或缺陷包括但不限於阿拉吉歐症候群(Alagille syndrome)、酒精性肝臟疾病(酒精引起的肝硬化)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症(所有表現型)、高血脂症和其他脂質代謝病症、自體免疫肝炎、布-加症候群(Budd-Chiari syndrome)、膽道閉鎖、進行性家族性膽汁鬱積第I，II和III型、肝癌，卡羅利氏病(Caroli Disease)、Crigler-Najjar症候群、果糖血症、半乳糖血症、碳水化合物缺乏的糖基化缺陷、其他碳水化合物代謝病症、雷夫蘇姆氏病(Refsum disease)和其他過氧小體疾病、尼曼匹克病(Niemann Pick disease)、伍爾曼氏病(Wolman disease)和其他溶小體病症、酪胺酸血症、三重H(triple H)和其他胺基酸代謝病症、杜賓-強森症候群(Dubin-Johnson syndrome)、包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)的脂肪肝病、慢性肝衰竭、慢性肝衰竭急性惡化(ACLF)、吉爾伯特症候群(Gilbert Syndrome)、肝醣貯積病I和III、血色素沉著症、A-G肝炎、卟啉病，原發性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、酪胺酸血症、凝血因子缺乏症、B型血友病、苯丙酮尿症、威爾遜氏病(Wilson’s Disease)、暴發性肝衰竭、肝切除術後肝衰竭、粒線體呼吸鏈疾病。此外，該等細胞還可用來治療因為病毒感染引起的後天性肝臟病症。

因此，提供本發明之先驅細胞或幹細胞、其細胞株，細胞群體及/或組成物在療法中及/或用於製造供治療肝臟疾病之藥劑中的用途。此等疾病可包括影響肝臟組織的病症、影響肝細胞生存力及/或功能的疾病，以及由纖維發炎性反應引起的慢性肝衰竭。另外，由於免疫調節和免疫抑制特性，提供了本發明的先驅細胞或幹細胞、其細胞株，細胞群體及/或組成物在療法中及/或用於製造藥劑的用途，供治療要避免不樂見免疫反應的疾病。投與根據本發明的細胞可以導致個體中的組織重建或再生。以允許細胞移植或遷移到預期組織部位並重建或再生功能缺陷區域，或保護該區域免於發炎反應可能引起的進一步損害的方式來投與細胞。

本說明書中還說明一種用於預防及/或治療肝臟疾病的方法，其包含向有需要此治療的個體投與本發明組成物。這樣的投與通常呈治療有效量，意即呈通常提供期望局部或全身效用和成果的量。

在又一個態樣中，本發明是有關一種醫藥組成物，其包含本發明之成體肝先驅細胞或幹細胞，其細胞株或包含其的細胞群體。借助舉例而非限制，本發明的經分離肝先驅細胞或幹細胞，其細胞株或包含其或其後代的細胞群體可以有利地經由注射(也含括導管投藥)或植入(例如局部注射、全身注射、脾內注射)(亦參見Gupta et al.,Seminars in Liver Disease 12：321,1992)、注射至門靜脈、注射至肝漿(例如肝囊下)、非經腸投藥或子宮內注射至胚胎或胎兒中來進行投藥。

本發明之源自肝臟的先驅細胞或幹細胞、其細胞株或包含其的細胞群體，或其後代(視情況經遺傳修飾)，或包含這些的醫藥組成物，可以進一步經由肝臟細胞移植(LCT)用於組織工程和細胞療法。肝臟細胞移植和肝臟幹細胞移植(LSCT)是指以任何導致進入肝(hepatic access)並移植細胞的方式(較佳經由門靜脈)來輸注成熟肝細胞或肝先驅細胞(包括本發明細胞)的技術，不過也可以藉由直接肝注射或藉由脾內注射。

例如，在分離程序之後或在冷凍保存後解凍之後，可以將細胞以細胞懸浮液的形式提供於任何保存培養基(較佳含人類白蛋白)中。

在一個具體例中，本發明預期使用患者自有的肝臟組織來分離本發明的先驅細胞或幹細胞。這樣的細胞對於患者來說是自體的，並且可以容易地投與給患者。然而，如果患者有例如造成特定病理學病況的遺傳缺陷，則此缺陷可以透過遺傳操作所獲得的細胞，或透過使用從並非患者自有之組織分離而來的先驅細胞或幹細胞(在技藝中已知為同種異體幹細胞移植)而避開。

在考慮向患者投與此等細胞時，可能偏好選擇經過本發明方法以獲得先驅細胞或幹細胞的肝臟組織，以使得至少在可達到的限制範圍內使患者與所投與細胞之間的組織相容性達到最大。儘管做出了這些努力，但是所投與的細胞因為患者的免疫系統所致的排斥風險仍然很高(例如，移植物抗宿主排斥)。根據本發明之包含肝臟衍生的先驅細胞的組成物進一步降低了同種異體LCT或LSCT排斥的風險，因此在另一個具體例中，本發明提供一種用於同種異體移植的組成物。

關於本發明的先驅細胞或幹細胞的治療用途的問題在於要達到最佳效用所必需的細胞數量。投與劑量可能是可變的，可包括初始投藥以及隨後的後續投藥，並且可以由習於技藝者利用本發明來確認。通常，一或多個投藥劑量將提供治療有效量的細胞，意即達到所需局部或全身效用和成果之量。此外，習於技藝者可以容易地確定要被投與給個體之本發明醫藥組成物中視情況選用的添加劑，媒劑及/或載劑。通常，任一種添加劑(除了活性先驅細胞或幹細胞及/或細胞激素以外)在磷酸鹽緩衝食鹽水中以0.001至50%(w/w或w/v)溶液之量存在，而活性成分通常可以呈微克至毫克的量級存在，諸如約0.0001至約5%(w/w或w/v)，較佳約0.0001至約1%，最佳約0.0001至約0.05%或約0.001至約20%，較佳約0.01至約10%，且最佳約0.05至約5%。

當投與包含HLA-G陽性肝先驅細胞或其群體的治療組成物時，通常可以將其調配為單位劑量。在另一個或又一個具體例中，可能有利地包括試劑及/或採用已知方法向患者投與細胞，以確保本發明細胞或其細胞群體的生存力，例如透過將細胞併入生物聚合物或合成聚合物中。合適的生物聚合物實例包括但不限於纖網蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、凝血酶，膠原蛋白和蛋白聚醣層連結蛋白、黏附分子、蛋白聚醣、透明質酸、醣胺聚醣鏈、幾丁聚醣、藻酸鹽，天然或合成經修飾肽(其衍生自蛋白質)，以及合成、可生物降解和生物相容聚合物。這些組成物可以懸浮液或以細胞被包埋其中之三維凝膠形式投與。

無菌可注射溶液可以透過將實施本發明時所用的細胞併入所需量的適當溶劑與視情況不同量的其他成分而製得。這樣的組成物可以進一步與合適的載劑，稀釋劑或賦形劑(例如無菌水、生理食鹽水、葡萄糖、右旋糖或類似物)混合。取決於投藥途徑和所需的製備物，組成物可含有輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、膠凝劑或增黏劑、防腐劑、調味劑，染料及類似物。

透過以下非限制性實例進一步說明本發明，該等非限制性實例進一步例示說明本發明，並且不希望於也不應解釋為限制本發明的範疇。

實例

1.經預處理的HLA-G陽性肝先驅細胞或幹細胞的製備

(a)製備肝先驅細胞

如EP 3 140 393或WO 2017 149 059中所述，從健康的屍體或非心臟跳動供體的肝臟分離出人類成體肝先驅細胞。

簡言之，將肝臟細胞製備物重新懸浮於補充有10% FBS、10mg/ml INS、1mM DEX的Williams’s E培養基中。初代細胞培養在Corning^® CellBIND^®燒瓶中，並在37℃下於含有5% CO₂完全濕潤氣氛中培養。24小時後，更換培養基以淘汰非黏附細胞，且此後一週更換兩次，而每天都在顯微鏡下密切觀察培養物。12至16天後將培養基切換成補充有9% FBS的高葡萄糖DMEM。出現具有間質樣型態的細胞類型並增生。當達到70至95%匯聚時，將細胞用重組胰蛋白酶和1mM EDTA予以胰蛋白酶消化，並以1-10 x 10³細胞/cm²的密度重新鋪盤。在每次繼代時，在80至90%匯聚度下用胰蛋白酶處理細胞。

(b)肝先驅細胞的預處理

在P5時，利用以下對達到80至90%匯聚的細胞進行發炎引發(inflammation priming)歷時48小時：IL-1β(5-100ng/mL,peprotech,ref：200-1B)、IFNγ(5-100ng/mL,prospec,ref：CYT-206)、TNFα(5-100ng/mL,prospec,ref：CYT-223)、IL-10(5-100ng/mL,peprotech,ref：200-10-10UG)及/或其組合，其中「全部一起(All together)」被用來指用IL-1β、IFNγ，TNFα與IL-10的組合處理細胞。之後，收取上清液並用重組胰蛋白酶(trypLE；LifeTech)和1mM EDTA對細胞進行胰蛋白酶處理以供分析。

2.藉由即時逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)定量基因表現

如實例1中所述製備經預處理的成體肝先驅細胞和對照細胞。

使用RT-PCR來對基因表現進行特徵鑑定。使用商業套組根據製造商說明書來合成cDNA。樣本以二重複在即時PCR儀器上運行。透過將訊號強度相對於內源對照轉錄本進行正規化(normalizing)來建立基因表現的相對定量。正規化後，將數據作圖並在經不同細胞激素組合預處理的肝先驅細胞群體之間進行比較。

更詳細來說，針對總RNA萃取，使用GenElute^TM Mammalian Total RNA Miniprep Kit(Sigma-RTN070)來回收細胞。在RNA萃取期間，使用On-Column DNase I Digestion Set(Sigma ref：DNASE70)進行DNAse處理。然後使用NanoDrop(Thermo Scientific)定量RNA。第一股cDNA是使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche-04897030001)依據製造商說明書來進行合成。PCR擴增混合物(20μl最終體積)含有模板cDNA、Taqman Master Mix緩衝液(10μL；Applied Biosystems)，以及正向與反向引子。PCR以二重複運行並在ViiA 7 Real-Time PCR System(Applied Biosystems)上進行。循環條件包含在95℃下10分鐘聚合酶活化，在95℃下歷時15s以及在60℃下歷時1分鐘的40個循環。相對於管家基因GAPDH來對定量進行正規化。

用於目前研究的商業用引子和探針列在下文(所有產品來自Thermo Fisher)：GAPDH-Hs99999905_m1、HLA-G-Hs00365950_g1、HLA-E-Hs03045171_m1、IDO1-Hs00984148_m1、HGF-Hs00300159_m1、PTGS2-Hs00153133_m1、IL-6-Hs00174131_m1、IL-10-Hs00961622_m1。

圖1顯示經預處理的肝先驅細胞對HLA-G呈陽性。當與未經預處理肝先驅細胞中的基礎HLA-G表現相比，經預處理肝先驅細胞具有升高的HLA-G表現水平。另外，圖1顯示經預處理的HLA-G陽性細胞更可以對HLA-E呈陽性。結果表示為平均值±SEM(n=3)。藉由Prism 5軟體分析所有數據。

當與未經預處理肝先驅細胞或幹細胞(對照)中偵測到的基礎表現水平相比，呈HLA-G陽性或HLA-G水平升高的肝先驅細胞還具有一或多種升高之帶有免疫調節特性的細胞激素及/或因子的基因表現水平。圖2顯示，在本發明經預處理肝先驅細胞群體中，吲哚胺2,3-二氧酶1(IDO1)、前列腺素-內過氧化物合成酶2(PTGS2)，IL-6和IL-10基因表現水平升高。對分離自三名不同供體(n=3)的肝先驅細胞或幹細胞進行了測試。結果表示為平均值±SEM。

3. HLA-G分泌：藉由CLIA(化學發光夾心原理)對可溶性HLA-G進行定量

如實例1中所述製備經預處理的肝先驅細胞。

在從經預處理肝先驅細胞收取的上清液中測量可溶性蛋白的表現。如下所述，使用商業用酶聯免疫分析(ELISA)套組進行可溶性HLA-G蛋白定量。

可溶性HLA-G ELISA是使用CLIA套組：人類HLA-G ELISA Kit(CLIA)-LS-F30041來進行。將100μL細胞培養物上清液或標準品與捕獲抗體在37℃下培育歷時90分鐘。培育後，在37℃下在每個孔中加入100μl經生物素化偵測抗體歷時1小時。洗滌步驟後，將100μL/w的接合HRP在37℃下培育歷時30分鐘。洗滌五次後，將盤與化學發光受質於37℃下避光培育歷時5分鐘。在培育時間結束時，立刻使用微量盤光度計對盤進行分析，以確定每孔的相對光單位(RLU)。分析的偵測範圍是0.16-10ng/ml的sHLA-G。每個樣本以二重複進行測試。

圖3中呈現的結果顯示，當與在「未經處理(untreated)」非預處理(non-preconditioned)細胞中的基礎HLA-G分泌水平相比，HLA-G表現呈陽性之經預處理的肝先驅細胞在其上清液中具有升高的HLA-G分泌。

4.免疫調節性細胞激素及/或免疫調節因子在HLA-G陽性肝先驅細胞或幹細胞中的表現

如實例1中所述製備經預處理的HLA-G陽性肝先驅細胞。

使用商業用酶聯免疫分析(ELISA)套組測量可溶性蛋白的表現。如相較於基礎HLA-G表現，HLA-G陽性肝先驅細胞或具有HLA-G表現水平升高的肝先驅細胞進一步具有水平升高的前列腺素E2(PGE2)分泌，如與在未經預處理肝臟衍生先驅細胞或幹細胞(未經處理)中所偵測到的PGE2基礎水平相較之下。

圖4證實，根據本發明的具體例，在用選自IFNγ、TNFα，IL-1β及/或IL-10的一或多種細胞激素進行預處理後，在具有HLA-G水平升高的肝先驅細胞中，免疫調節因子PGE2的分泌升高。對分離自三名不同供體(n=3) 的肝先驅細胞進行測試。結果表示為平均值±SEM。藉由Prism 5軟體分析所有數據。

5.根據本發明的一個具體例，在HLA-G成體肝先驅細胞中的IDO1活性提高

如實例1中所述製備經預處理的HLA-G陽性肝先驅細胞。

使用螢光顯影劑測量IDO1的酶活性，該螢光顯影劑與化合物N-甲醯基犬尿胺酸(NFK)選擇性反應以產生高螢光產物(Ex/Em=402/488nm)。NFK的形成與IDO酶活性之量直接相關。

如圖5中所示，與未經預處理肝先驅細胞(未經處理)中的IDO1基礎酶活性相比，在經預處理肝先驅細胞中的IDO1酶活性提高。對分離自三名不同供體(n=3)的肝先驅細胞進行測試。結果表示為平均值±SEM。藉由Prism 5軟體分析所有數據。

假定本發明不受限於先前描述的任何實施形式，並且可以在不重新評估隨附申請專利範圍的情況下對所提出的製造實例進行若干修改。

Claims

一種經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其呈HLA-G陽性。
如請求項1之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其中該細胞為人類肝臟細胞，較佳成體人類肝臟細胞。
如前述請求項中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該細胞經一或多種細胞激素預處理。
如請求項3之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，相較於未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G表現及/或分泌，其具有升高的HLA-G表現及/或分泌水平。
如請求項3之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，相較於未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎HLA-G分泌，其具有升高的HLA-G分泌水平。
如請求項4至5中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該等細胞激素是選自IFNγ、TNFα、IL-1β，IL-10及其任何組合。
如請求項4至6中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該等細胞激素以介於5ng/ml與400ng/ml之間的總濃度被添加至該細胞的細胞培養基。
如請求項4至7中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於細胞培養基中的個別細胞激素濃度介於5ng/ml與100ng/ml之間。
如請求項4至8中任一項之經分離肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該等細胞激素為至少IFNγ與TNFα。
如請求項9之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其中該等細胞激素進一步包含IL-1β及/或IL-10。
如請求項4至10中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該細胞經預處理歷時1小時至72小時，更佳12至60小時。
如前述請求項中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該細胞進一步對HLA-E呈陽性。
如前述請求項中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其特徵在於該細胞與未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎IDO酶活性相比，進一步具有升高的PGE2分泌水平，如與未經預處理肝先驅細胞或幹細胞中的基礎PGE2分泌相比；及/或升高的IDO酶活性水平。
如前述請求項中任一項之經分離之肝先驅細胞或幹細胞，其中該等細胞對選自以下的至少一種間質標記呈陽性：波形蛋白(Vimentin)、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29，α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)及/或CD140-b。
一種包含表現HLA-G之人類成體肝臟衍生的先驅細胞或幹細胞的細胞群體或組成物，其中表現及/或分泌HLA-G之經分離之肝先驅細胞或幹細胞是如前述請求項1至14中任一項之細胞。
如請求項15之包含人類成體肝臟衍生的先驅細胞或幹細胞的細胞群體或組成物，其特徵在於至少60%的該等先驅細胞或幹細胞表現及/或分泌HLA-G。
如請求項15或16之細胞群體或組成物，其中至少65%，至少70%，更佳至少75%，更佳至少80%，更佳至少85%，更佳至少90%，更佳至少95%的該等先驅細胞或幹細胞表現及/或分泌HLA-G。
如前述請求項15至17中任一項之組成物，其特徵在於該組成物進一步包含醫藥上可接受之載劑。
如請求項15至18中任一項之組成物、如請求項1至14中任一項之經分離之肝先驅細胞或如請求項15至17中任一項之細胞群體，其用於免疫療法中及/或用於治療具有不樂見免疫反應的病症中。
如請求項15至18中任一項之組成物、如請求項1至14中任一項之經分離之肝先驅細胞或如請求項15至17中任一項之細胞群體，其用於治療纖維化病症中。
如請求項15至18中任一項之組成物、如請求項1至14中任一項之經分離之肝先驅細胞或如請求項15至17中任一項之細胞群體，其用於治療肝臟疾病中。
如請求項21使用之組成物、經分離之細胞或細胞群體，其特徵在於該肝臟疾病為纖維發炎性慢性肝臟疾病。
如請求項21至22中任一項使用之組成物、經分離之細胞或細胞群體，其特徵在於該肝臟疾病選自下列組成之清單：阿拉吉歐症候群(Alagille syndrome)、酒精性肝臟疾病(酒精引起的肝硬化)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症(所有表現型)、高血脂症和其他脂質代謝病症、自體免疫肝炎、布-加症候群(Budd-Chiari syndrome)、膽道閉鎖、進行性家族性膽汁鬱積第I，II和III型、肝癌，卡羅利氏病(Caroli Disease)、Crigler-Najjar症候群、果糖血症、半乳糖血症、碳水化合物缺乏的糖基化缺陷、其他碳水化合物代謝病症、雷夫蘇姆氏病(Refsum disease)和其他過氧小體疾病、尼曼匹克病(Niemann Pick disease)、伍爾曼氏病(Wolman disease)和其他溶小體病症、酪胺酸血症、三重H(triple H)和其他胺基酸代謝病症、杜賓-強森症候群(Dubin-Johnson syndrome)、包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)的脂肪肝病、慢性肝衰竭、慢性肝衰竭急性惡化(ACLF)、吉爾伯特症候群(Gilbert Syndrome)、肝醣貯積病I和III、血色素沉著症、A-G肝炎、卟啉病，原發性膽汁性肝硬化、硬化性膽管炎、酪胺酸血症、凝血因子缺乏症、B型血友病、苯丙酮尿症、威爾遜氏病(Wilson’s Disease)、暴發性肝衰竭、肝切除術後肝衰竭、粒線體呼吸鏈疾病。
如請求項15至18中任一項之組成物、如請求項1至14中任一項之經分離之肝先驅細胞或如請求項15至17中任一項之細胞群體，其用於細胞移植中，較佳為同種異體移植。
一種獲得經預處理之HLA-G陽性肝先驅細胞或幹細胞的方法，該方法包含向肝先驅細胞或幹細胞之培養物的細胞培養基添加一或多種細胞激素的步驟。
如請求項25之方法，其特徵在於該等細胞激素是選自由IFNγ、TNFα、IL-1β，IL-10及其任何組合組成之群組。
如請求項25至26中任一項之方法，其特徵在於該等細胞激素以介於5ng/ml與400ng/ml之間的總濃度被添加，及/或其中個別細胞激素濃度介於5與200ng/ml之間。
如請求項25至27中任一項之方法，其特徵在於該等細胞激素為至少IFNγ與TNFα，並視情況選用IL-1β及/或IL-10。