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TW202035422A - 作為ｃｄｋ抑制劑的大環化合物、其製備方法及其在醫藥上的應用 - Google Patents

作為ｃｄｋ抑制劑的大環化合物、其製備方法及其在醫藥上的應用 Download PDF

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TW202035422A
TW202035422A TW108146435A TW108146435A TW202035422A TW 202035422 A TW202035422 A TW 202035422A TW 108146435 A TW108146435 A TW 108146435A TW 108146435 A TW108146435 A TW 108146435A TW 202035422 A TW202035422 A TW 202035422A
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halogen
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永奇 鄧
健 孫
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英商凱復製藥有限公司
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Abstract

本發明涉及作為CDK抑制劑的大環化合物、其製備方法及其在醫藥上的應用。具體而言，本發明涉及一種通式(I)所示的新的大環化合物、其製備方法及含有該化合物的醫藥組成物以及其作為治療劑，特別是作為CDK抑制劑的用途以及用於治療癌症、炎症、病毒感染、心臟肥大或HIV的用途，其中通式(I)的各取代基與說明書中的定義相同。

Description

作為CDK抑制劑的大環化合物、其製備方法及其在醫藥上的應用
本發明涉及屬於醫藥領域，涉及一種通式(I)所示的新的大環化合物、其製備方法及含有該衍生物的醫藥組成物以及其作為治療劑，特別是作為CDK抑制劑在治療過度增殖性疾病中的用途。
近年來，腫瘤已超越心血管疾病，成為全球第一大死亡疾病，抗腫瘤藥物研究具有重要的學術和現實意義。過度活化、持續的細胞增殖是腫瘤的一個基本特徵，因此誘導細胞週期阻滯可有效抑制腫瘤的生長。細胞週期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)屬於絲/蘇胺酸蛋白激酶家族，是參與細胞週期調節的關鍵激酶。目前已報導有20個不同的CDK，根據CDK功能的不同，可以將其主要分為兩大類。一類CDK參與細胞週期調控，主要包括CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等。另一大類CDK參與轉錄調節，主要包括CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11等。在腫瘤細胞中，細胞週期蛋白(cyclin)過表達或過度活化、 CDKI活性被抑制、上游分裂信號持續激活等都會引起CDK的活性改變。CDK活性失調會直接或間接引起細胞增殖失控、基因組不穩定(DNA突變增加，染色體缺失等)和染色體不穩定(染色體數目變化)等，參與腫瘤的發生發展。由於CDK活性為細胞分裂所必需，而在腫瘤細胞中又常有CDK活性增強，因此長期以來，CDK一直被認為是抗腫瘤及其他增殖失調疾病藥物研發的較好靶點。
LY2835219(也稱作Bemaciclib或Abemaciclib)是由禮來(Eli Lilly)公司開發的一種以抑制細胞週期依賴性激酶4和6(CDK4/6)為機理的乳腺癌治療藥物。其結構式為
Figure 108146435-A0101-12-0002-4
。一期臨床數據表明該藥單藥治療轉移性乳腺癌患者早期療效較好，尤其對於那些激素受體陽性的乳腺癌患者，臨床獲益率可達61%，這意味著患者疾病控制的時間超過了24周，或腫瘤大小下降30%以上。目前，美國FDA已經批准禮來(Eli Lilly)的波瑪西林(Abemaciclib)(VERZENIO)聯合非甾體芳香酶抑制劑(non-steroidal aromatase inhibitors,NSAI)來曲唑或阿那曲唑用於一線治療絕經後激素受體(HR)陽性，人表皮生長因子受體2(HER2)陰性的晚期或轉移性乳腺癌。非小細胞肺癌的臨床研究也已開始。
PD0332991(也稱作Ibrance或帕博西林(Palbociclib))是由輝瑞(Pfizer)公司開發的CDK4/6抑制劑。其結構式為
Figure 108146435-A0101-12-0003-5
。2015年2月3日，FDA加速批准了PD0332991的上市申請，與來曲唑聯用治療雌激素受體(ER)陽性、人表皮生長因子受體2(HER2)陰性的絕經後婦女轉移性乳腺癌。
CDK抑制劑也可用於治療心血管病症如再狹窄和動脈粥樣硬化和由異常細胞增殖所致的其他血管病症。細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑蛋白的過表達抑制氣囊血管成形術之後的血管平滑肌增殖和內膜增生。而且，嘌呤CDK2抑制劑CVT-313(Ki=95nM)使得大鼠新內膜生成的抑制大於80%。
CDK抑制劑可用於治療由多種感染性物質引起的疾病，包括真菌、原生動物寄生蟲如惡性瘧原蟲和DNA與RNA病毒。
最近，CDK9與HIV複製的預防有關，因此新CDK生物學的發現繼續湧現出CDK抑制劑的新治療適應症。
CDK在嗜中性粒細胞介導的炎症中非常重要，且CDK抑制劑促進動物模型中炎症的消退。因此，包括CDK9抑制劑的CDK抑制劑可用作抗炎劑。
選擇性CDK抑制劑可用於改善各種自身免疫性病症的影響。慢性炎性疾病-類風濕性關節炎的特徵為滑液組織增生；滑液組織增殖的抑制應將炎症降到最小並預防關節破壞。在大鼠關節炎模型中，藉由用表達CDK抑制劑蛋白p16的腺病毒治療而基本上抑制了關節腫痛。CDK 抑制劑對抗細胞增殖的其他病症是有效的，包括銀屑病(其特徵為角質化細胞過度增殖)、腎小球腎炎、慢性炎症和狼瘡。
目前已有的CDK抑制劑專利申請包括，如WO2015101293A1、WO2016015605A1、WO2016194831A1、WO2008079933A2等等。由於巨大的市場需求，所以仍有必要繼續研發低毒、高效的CDK抑制劑。
大環素已被公認為藥物發現中的重要結構類別。對於相同數量的重原子，大環化合物本身具有比其非環狀類似物更少數量的可旋轉鍵，這是口服生物利用度的有益特徵(Mallinson,J.；Collins,I.Macrocycles in new drug discovery.Future Med.Chem.2012,4,1409-1438)。結果，大環化合物比其非環狀類似物更具構象限制，這可能賦予更高的靶標結合和選擇性並改善口服生物利用度。
天然產物大環化合物的開發已經產生了幾種腫瘤藥物，這些藥物被批准用於臨床或已經達到後期臨床開發，例如mTOR抑制劑Torisel®(temsirolimus)[Kwitkowski VE,Prowell TM,Ibrahim A et al.FDA approval summary：temsirolimus as treatment for advanced renal cell carcinoma.Oncologist 15(4),428-435(2010)]，微管蛋白穩定劑Ixempra®(伊沙匹隆)和Hsp90抑制劑17-烯丙基胺基-格爾德黴素[Mcdonald E,Workman P,Jones K.Inhibitors of the HSP90 molecular chaperone：attacking the master regulator in cancer.Curr.Top.Med.Chem.6(11),1091-1107(2006)]。許多合成大環化合物已進入臨床開發階段，例如雙重JAK2/FLT3抑制劑pacritinib，目前正在進行II期臨床試驗[Hart S,Goh KC,Novotny-Diermayr V et al.SB1518,a novel macrocyclic pyrimidinebased JAK2 inhibitor for the treatment of myeloid and lymphoid malignancies.Leukemia 25(11),1751-1759(2011)]，II期臨床試驗中的CDK2/JAK2/FLT3抑制劑SB1317[William AD,Lee ACH,Goh KC et al.Discovery of kinase spectrum selective macrocycle(16E)-14-methyl-20oxa5,7,14,26-tetraazatetracyclo[19.3.1.1(2,6).1(8,12)]heptacosal(25),2(26),3,5,8(27),9,11,16,21,23-decaene(SB1317/TG02),a potent inhibitor of cyclin dependent kinases(CDKs),janus kinase 2(JAK2),and Fms-like tyrosine kinase-3(FLT3)for the treatment of cancer.J.Med.Chem.55(1),169-196(2012)]和西侖吉肽(cilengitide)，一種用於治療膠質母細胞瘤的III期臨床試驗中的合成環肽[Stupp R,Van Den Bent MJ,Erridge SC et al.Cilengitide in newly diagnosed glioblastoma with MGMT promoter methylation：Protocol of a multicenter,randomized,open-label,controlled phase III trial(CENTRIC).J.Clin.Oncol.28(15s),TPS152(2010)]。泛CDK抑制劑化合物M是作為開發候選物提出的合成大環化合物的另一個實例[Hirai H,Takahashi-Suziki I,Shimomura T et al.Potent anti-tumor activity of a macrocycle-quinoxalinone class pan-Cdk inhibitor in vitro and in vivo.Invest.New Drugs 29(4),534-543(2011)]。
本發明的目的在於提供具有優異CDK抑制活性的化合物，發明人為了達到該目的反復進行了認真研究，結果發現經過分子內成環反應獲得了一類新穎的具有優異CDK抑制活性的大環化合物，從而完成了本發明。
本發明更特別地涉及下面通式(I)的化合物：
Figure 108146435-A0101-12-0006-6
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽，其中：
A和B各自獨立地選自CH和N原子；
U、V、W、X和Y各自獨立地選自CH和N原子；
Q選自一個鍵、C1-4伸烷基和-C(=O)-，該C1-4伸烷基視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
G選自一個鍵、-O-、-N(R7)-、-C(=O)-、C1-4伸烷基、C2-4烯基、-S-、-SO-、-SO2-和3-6員雜環基，其中該C1-4伸烷基、C2-4烯基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
J選自一個鍵、-O-、-N(R7)-、-C(=O)-、C1-4伸烷基、C2-4烯基、-S-、-SO-、-SO2-和3-6員雜環基，其中該C1-4伸烷基、C2-4烯基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
L選自一個鍵、-C(=O)-、C1-4伸烷基、C2-4烯基、-S-、-SO-、-SO2-和3-6員雜環基，其中該C1-4伸烷基、C2-4烯基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
R1選自H原子、C1-4烷基、氰基、C2-4烯基和C2-4炔基，其中該C1-4烷基、C2-4烯基和C2-4炔基各自獨立地視需要被選自鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
R2選自H原子和C1-4烷基，其中該C1-4烷基視需要被選自鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
或者，R1和R2與其相連接的原子一起形成C3-6環烷基或3-6員雜環基，該C3-6環烷基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
R3和R6各自獨立地選自H原子和C1-4烷基，其中該烷基視需要被選自C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代
R4和R5各自獨立地選自H原子、C1-4烷基、鹵素、羥基和C1-4烷氧基，其中該C1-4烷基和C1-4烷氧基各自獨立地視需要被選自鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；和
R7選自H原子和C1-4烷基，其中該烷基視需要被選自C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代。
在一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，-G-J-L-選自-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-、-NH-C(=O)-CH2-和-C(=O)-NH-CH2-。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，A和B各自獨立地為N原子。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，Q為一個鍵或亞甲基。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，U選自CH和N原子。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，V、X和Y各自獨立地為CH。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，W為N原子。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，R1和R2各自獨立地選自H原子和C1-4烷基，或者，R1和R2與其相連接的原子一起形成C3-6環烷基。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，R3和R6各自獨立地為C1-4烷基，較佳地R3為甲基，且R6為乙基。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，R4和R5各自獨立地為鹵素，較佳F原子。
在另一個較佳實施例方案中，在通式(I)所示的化合物中，R7為H原子。
本發明的典型化合物包括但不限於：
Figure 108146435-A0101-12-0009-7
Figure 108146435-A0101-12-0010-8
Figure 108146435-A0101-12-0011-9
 或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽。
本發明還涉及一種製備通式(I)所示的化合物的方法，其包括：
Figure 108146435-A0101-12-0011-10
通式(IA)化合物在縮合劑存在下發生分子內成環反應形成通式(I)化合物，
其中：
LG1和LG2各自獨立地為離去基；
A、B、U、V、W、G、J、L、R1至R6如通式(I)中所定義。
在一個較佳實施例方案中，該縮合劑選自2-(7-氧基苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N,N'-二環己基碳化二亞胺、N,N'-二異丙基碳二醯亞胺、O-苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽、1-羥基苯並三唑、1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑、O-苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸鹽、2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯並三氮唑-1-基氧基三(二甲基胺基)磷鎓六氟磷酸鹽和六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷，較佳2-(7-氧基苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)。
在另一個較佳實施例方案中，LG1和LG2各自獨立地選自H原子、OH、鹵素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯和對甲苯磺酸酯；較佳地，LG1和LG2各自獨立地選自H原子、OH、Cl原子和Br原子；更佳地，LG1為H原子，LG2為OH原子。
在另一個較佳實施例方案中，G為-NH-，LG1為H原子，J為-C(=O)-，且-LG2為OH原子。
本發明還涉及一種醫藥組成物，其包含治療有效量的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在一個較佳實施例方案中，該醫藥組成物還包含一種或多種額外的抗腫瘤劑、抗炎劑、免疫抑制劑和/或免疫檢測點抑制劑。
在另一個較佳實施例方案中，該醫藥組成物還包含以下一種或多種：PTK抑制劑、環孢菌素A、CTLA4-Ig、選自抗-ICAM-3、抗-IL-2受體、抗-CD45RB、抗-CD2、抗-CD3、抗-CD4、抗-CD80、抗-CD86和單株抗體OKT3的抗體、CVT-313、阻斷CD40與gp39之間相互作用的活性劑、由CD40和gp39構建的融合蛋白、NF-κ B功能抑制劑、非甾體抗炎劑、類固醇、金化合物、FK506、麥考酚酸嗎啉乙酯、細胞毒性藥、TNF-α抑制劑、抗-TNF抗體或可溶性TNF受體、TNF α、TRAIL、HDAC抑制劑、格列衛和其他涉及細胞增殖的信號轉導途徑的抑製劑、細胞低氧應答抑制劑、雷帕黴素、來氟米特、環氧合酶-2抑制劑、紫杉醇、順鉑、卡鉑、阿黴素、去甲柔紅黴素、柔紅黴素、胺基蝶呤、胺甲蝶呤、甲基葉酸、絲裂黴素C、海鞘素743、泊非黴素、5-氟尿嘧啶、6-巰嘌呤、吉西他濱、阿糖胞苷、鬼臼毒素、依託泊苷、磷酸依託泊苷、替尼泊苷、美法侖、長春鹼、長春新鹼、異長春鹼、埃坡黴素、長春地辛、環氧長春鹼、PD-1、PDL-1或其衍生物。
本發明還涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽，或包含其的醫藥組成物在製備治療CDK相關病症的藥物中的用途。
本發明還涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽，或包含其的醫藥組成物，其用作藥物。
本發明還涉及通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽，或包含其的醫藥組成物，其用於治療CDK相關病症。
本發明還涉及一種治療CDK相關病症的方法，包括給予所需患者治療有效量的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體或其混合物形式，或其藥學上可接受的鹽，或包含其的醫藥組成物。
在一個較佳實施例方案中，該CDK相關病症選自癌症、炎症、病毒感染、心臟肥大和HIV。
在一個更佳實施例方案中，該癌症選自膀胱癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、腦癌、喉癌、淋巴系統癌、造血系統癌、泌尿生殖道癌、胃腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、骨癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、結腸直腸癌和胰腺癌；
該炎症與類風濕性關節炎、狼瘡、1型糖尿病、糖尿病性腎病變、多發性硬化、腎小球腎炎、慢性炎症和器官移植排斥有關；
該病毒感染與HIV病毒、人乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒、痘病毒、EB病毒、新培斯病毒或腺病毒相關。
根據本發明的化合物可以被口服施用、舌下施用、腸胃外施用、皮下施用、肌內施用、靜脈內施用、經皮施用、局部施用或直腸施用。
在本發明的藥用化合物中，對於口服施用、舌下施用、腸胃外施用、皮下施用、肌內施用、靜脈內施用、經皮施用、局部施用或直 腸施用而言，活性成分可以與常規的藥用載體混合在一起，以施用單位的形式施用於動物或人類。適合的施用單位形式包含口服形式如片劑、凝膠膠囊劑、粉劑、顆粒劑和口服的溶液劑或混懸劑，舌下或口腔施用形式，腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、鼻內或眼內施用形式和直腸施用形式。
當固體組合物被製備成片劑形式時，主要活性成分與藥用載體如明膠、澱粉、乳糖、硬脂酸鎂、滑石、阿拉伯膠等混合。片劑可以採用蔗糖或其他適合的材料包衣或者以如此的方式處理以至於其具有延長的或延遲的活性並且連續釋放預定量的活性成分。
藉由將活性成分與稀釋劑混合並藉由將獲得的混合物傾倒入軟質或硬質膠囊中來獲得凝膠膠囊製劑。
糖漿劑或酊劑形式的製劑可以包含活性成分連同甜味劑、防腐劑以及芳香劑和適當的著色劑。
可分散於水中的粉劑或顆粒劑可以包含活性成分，其與分散劑、潤濕劑或懸浮劑以及與矯味劑或甜味劑混合在一起。
栓劑用於直腸施用，其採用在直腸溫度下熔化的黏合劑，例如，可可脂或聚乙二醇來製備。
水性混懸劑、等滲的生理鹽水溶液劑或無菌的且可注射的溶液劑(其包含藥理學上可兼容的分散劑和/或潤濕劑)用於腸胃外、鼻內或眼內施用。
活性成分(可能與一種或多種添加劑載體一起)也可以被配製成微囊劑。
本發明的化合物能夠以介於0.01mg/天和1000mg/天之間的劑量來使用，以單一劑量/天的方式來提供或者以全天內若干劑量的方式來施用，例如，相同劑量每天兩次。所施用的日劑量有利地介於0.1mg和100mg之間，甚至更有利地介於2.5mg和50mg之間。使用超出這些範圍的劑量可能是需要的，本領域技術人員自身將會意識到這一點。
在本發明的一個特定實施方案中，醫藥組成物也可以被配製用於外部施用。它可以被引入到該施用類型的常用形式(即，特別是洗劑、泡沫劑、凝膠劑、分散劑、噴霧劑)中，所述常用形式具有賦形劑，所述賦形劑特別地能夠穿透皮膚，以便於改善活性成分的性質和可接近性。除了根據本發明的組成物之外，這些組成物通常進一步包含生理上可接受的介質，該介質通常包含水或溶劑，例如，醇、醚或乙二醇。所述組合物還可以包含表面活性劑、防腐劑、穩定劑、乳化劑、增稠劑、產生互補效果或可能的協同效果的其他活性成分、微量員素、精油、香料、著色劑、膠原蛋白、化學或礦物過濾劑。
定義
除非有相反陳述，否則下列用在說明書和申請專利範圍中的術語具有下述含義。
在本發明的含義內，“立體異構體”是指幾何異構體(或構型異構體)或旋光異構體。
幾何異構體由雙鍵上不同位置的取代基所導致，然後其可以具有Z或E構型，也被稱作順式或反式。
光學異構體特別地由碳原子上不同空間位置的取代基所導致，所述碳原子包含四個不同的取代基。這個碳原子則構成手性中心或不對稱中心。光學異構體包括非對映異構體和對映異構體。彼此為不可重疊的鏡像的光學異構體被稱作“對映異構體”。彼此不為可重疊的鏡像的光學異構體被稱作“非對映異構體”。
含有等量的、相反手性的兩種單獨的對映異構體形式的混合物被稱作“外消旋混合物”。
在本發明的含義內，“互變異構體”是指藉由質子轉移重排(prototropie)，即藉由氫原子的遷移和雙鍵的位置的改變而獲得的化合物的結構異構體。化合物的不同互變異構體通常是可互相轉化的，並且按比例平衡地存在於溶液中，所述比例可以根據所使用的溶劑、溫度或pH而變化。
在本發明中，“藥學上可接受的”被理解為是指其用於製備醫藥組成物，所述組合物一般是安全的，無毒的，在生物學或其他方面滿足需要並且所述組合物可以被接受用於獸類和人類藥物用途。
在本發明中，化合物的“藥學上可接受的鹽”被理解為指代下列鹽，其是藥學上可接受的(如本文所定義的)鹽並且其具備預期的母體化合物的藥理活性。這種鹽包括：
(1)與無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等形成的酸加成鹽，或與有機酸如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙磺酸、富馬酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷胺酸、乙醇酸、羥萘酸、2-羥基乙磺酸、乳酸、馬來酸、蘋果酸、扁桃酸、甲磺酸、黏康酸、2-萘磺酸、 丙酸、水楊酸、琥珀酸、二苯甲醯基-L-酒石酸、酒石酸、對甲苯磺酸、三甲基乙酸、三氟乙酸等形成的酸加成鹽；和
(2)當母體化合物中存在的酸質子被金屬離子，例如，鹼金屬離子(例如，Na+、K+或Li+)，鹼土金屬離子(如Ca2+或Mg2+)或鋁離子代替；或者與有機鹼或無機鹼配位時形成的鹽。可接受的有機鹼包括二乙醇胺、乙醇胺、N-甲基葡糖胺、三乙醇胺、胺丁三醇等。可接受的無機鹼包括氫氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉和氫氧化鈉。
在本發明中，術語“鹵素”是指氟、溴、氯或碘原子。
術語“C1-4烷基”是指包含1至4個碳原子的飽和的直鏈或支鏈的烴鏈。代表性的例子包括，但不限於，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基基團。
術語“C1-4伸烷基”指包含1至4個碳原子的二價烴鏈。代表性的例子包括，但不限於，CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-等。
術語“C2-4烯基”是指具有至少一個雙鍵並且具有2個至4個碳原子的直鏈或支鏈烴鏈。代表性的例子包括，但不限於，乙烯基、丙烯基、丁烯基等。
術語“C2-4炔基”是指具有至少一個三鍵並且具有2個至4個碳原子的直鏈或支鏈烴鏈。代表性的例子包括，但不限於，乙炔基、丙炔基、丁炔基等。
術語“C1-4烷氧基”是指-O-(C1-4烷基)，其中C1-4烷基的定義如上所述。非限制性實施例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
術語“鹵C1-4烷基”是指C1-4烷基被一個或多個鹵素取代，其中C1-4烷基、鹵素的定義如上所述。
術語“鹵C1-4烷氧基”是指C1-4烷氧基被一個或多個鹵素取代，其中C1-4烷氧基、鹵素的定義如上所述。
術語“C3-6環烷基”指包含3至6個碳原子的飽和或部分不飽和單環烴系統，代表性的例子包括，但不限於，環己基、環戊基、環丁基、環丙基、環己烯基等。
術語“3-6員雜烷基”指包含3至6個環原子，其中1-3個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是是0、1或2)的雜原子的飽和或部分不飽和單環烴系統，代表性的例子包括，但不限於，吡咯烷基、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、二氫咪唑基、二氫呋喃基、二氫吡唑基、二氫吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基等。
術語“羥基”是指-OH基團。
術語“硝基”指-NO2。
術語“胺基”是指-NH2。
術語“氰基”是指-CN。
術語“一個鍵”指用“一”表示的一個共價鍵。
術語“離去基”是指在親核取代反應期間可以容易地被親核試劑置換的化學基團，例如H原子、OH、鹵素原子如氯原子或溴原子、或磺酸酯。磺酸酯可以特別地為甲磺酸酯(-OS(O2)-CH3)、三氟甲磺酸酯(-OS(O)2-CF3)或對甲苯磺酸酯(-OS(O)2-(p-Me-C6H4))。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
藉由閱讀下列實施例，本領域技術人員將會更好地理解本發明。這些實施例僅用於解釋本發明。
本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或/和質譜(MS)来確定的。NMR化學位移(δ)以10-6(ppm)的單位給出。測定溶劑為氘代氯仿(CDCl3)，內標為四甲基矽烷(TMS)。使用下列縮寫：s為單峰，bs為寬單峰，d為二重峰，t為三重峰，qdt為四重峰，m為多重峰或大量峰，dd為雙二重峰等。
液質聯用儀：Agilent LCMS1260/MSD6120，色譜管柱：Agilent ZORBAX SB-C18，2.1*50mm，1.8μm，流動相：A：H2O(0.1%FA)，B：乙腈，梯度沖提，0.5mL/min，45.0℃，電離模式：API-ES，極性：正。
核磁共振儀：Bruker ARX-500型和Bruker ARX-400型。
MTT檢測儀器：Thermo Scientific Multiskan GO全波長酶標儀。
薄層層析矽膠板使用青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純產品採用的規格是0.4mm~0.5mm。
管柱曾析一般使用烟台黄海矽膠200~300目矽膠為載體。
實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。
實施例中的反應進程的監測採用薄層色譜法(TLC)。
實施例1
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮1
Figure 108146435-A0101-12-0022-11
第一步
4-(苄胺基)-6-氯-煙酸甲酯102
將4,6-二氯煙酸甲酯101(6g，29.1mmol)，苄胺(3.4g，32mmol)和三乙胺(9.5g，87.3mmol)溶於30mL DMF中，室溫攪拌過夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)檢測，反應結束後，加入200mL水，攪拌30分鐘，過濾，水洗，抽乾。獲得標題化合物，白色固體7.6g，收率94.1%。
MS(ESI)：277.7[M+1]+。
第二步
(4-(苄胺基)-6-氯吡啶-3-基)甲醇103
將氫化鋁鋰(2.1g，54.9mmol)懸浮於70mL四氫呋喃中，冷卻至-20℃下，加入4-(苄胺基)-6-氯-煙酸甲酯102(7.6g，27.4mmol)，在-20℃下反應2小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=3：1)檢測，反應結束後，依次加入2.1mL水、3.2mL 10%氫氧化鈉溶液、10.2mL水，攪拌30分鐘，乾燥，過濾，旋乾。獲得標題化合物，白色固體7.5g，收率100%。
MS(ESI)：249.7[M+1]+。
第三步
4-(苄胺基)-6-氯煙鹼醛104
將(4-(苄胺基)-6-氯吡啶-3-基)甲醇103(7.5g，30.2mmol)溶於100mL二氯甲烷中，冷卻至0℃下，分批加入DMP(戴斯-馬丁氧化劑，15.3g，36.3mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(乙酸乙酯)檢測，反應結束後，加入100mL 10%NaOH溶液攪拌30分鐘，分液，二氯甲烷萃取，合 併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(PE：EA=3：1)，獲得標題化合物，黃色油狀物6.5g。收率87.1%。
MS(ESI)：247.7[M+1]+。
第四步
N-苄基-2-氯-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-4-胺105
將4-(苄胺基)-6-氯煙鹼醛104(6.5g，26.3mmol)和N-乙基哌嗪溶於50mL二氯甲烷(3.6g，31.6mmol)中，冷卻至0℃下，分批加入三乙醯氧基硼氫化鈉(8.3g，39.45mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(乙酸乙酯)檢測，反應結束後，加入100mL飽和碳酸氫鈉溶液攪拌30分鐘，分液，二氯甲烷萃取(100mL×3)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(乙酸乙酯：甲醇=10：1)，獲得標題化合物，無色油狀物7.8g。收率85.9%。
MS(ESI)：348.5[M+1]+。
第五步
N4-苄基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2,4-二胺106
在氮氣下，將中間體N-苄基-2-氯-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-4-胺105(6g，17.4mmol)、二苯甲酮亞胺(3.7g,20.8mmol)、第三丁醇鈉(2.34g,24.36mmol)、Pd2(dba)3(1.6g,1.74mmol)和BINAP(3.24g,5.22mmol)溶於100mL甲苯中，在100℃下反應14小時。TLC(DCM：MeOH=10：1)檢測，反應結束後，加入100mL甲基第三丁基醚攪拌30分鐘，過濾，洗滌，旋乾獲得粗品。將粗品溶於50mL THF和20mL甲醇中，加入10mL濃鹽酸室溫攪拌2小時。TLC(二氯甲烷：甲醇= 10：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，加入飽和碳酸氫鈉，乙酸乙酯萃取，保留水相，二氯甲烷萃取，合併有機相，乾燥，旋乾。獲得標題化合物，白色固體3g，收率52.9%。
MS(ESI)：326.2[M+1]+。
第六步
3-胺基丁酸甲酯108
在0℃下，將二氯亞碸(8.4mL,116.4mmol)滴入40mL甲醇中，攪拌1小時，3-胺基丁酸107(4g,38.8mmol)加入反應體系中，室溫攪拌5小時。TLC(二氯甲烷：甲醇=5：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，甲醇帶乾2次。獲得標題化合物，無色油狀物5g，收率100%。
第七步
3-((5-溴-3-氟-2-硝基苯基)胺基)丁酸甲酯109
將1,3-二氟-5溴-2-硝基苯(2g,8.4mmol)和3-胺基丁酸甲酯108(0.98g,8.4mmol)溶於20mL DMF中，加入DIEA(3,25g,25,2mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)檢測，反應結束後，加入水50mL水，乙酸乙酯萃取(3×25mL)，合併，水洗，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=50：1)，獲得標題化合物，黃色固體2.4g，收率84.5%。
MS(ESI)：336.1[M+1]+。
第八步
3-((2-胺基-5-溴-3氟苯基)胺基)丁酸甲酯110
將3-((5-溴-3-氟-2-硝基苯基)胺基)丁酸甲酯109(2g,5.9mmol)溶於15mL DMF中，加入氯化亞錫(6.7g,29.8mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)檢測，反應結束後，加入水50mL水，乙酸乙酯萃取(3×25mL)，合併，水洗，乾燥，旋乾。獲得標題化合物，橙黃色油狀物2.2g，收率100%。
MS(ESI)：306.2[M+1]+。
第九步
3-(6-溴-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯111
將3-((2-胺基-5-溴-3氟苯基)胺基)丁酸甲酯110(2.2g,5.9mmol)溶於9mL原甲酸三甲酯和6mL醋酸中，在90℃下反應8小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，加入飽和碳酸氫鈉溶液，乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合併，水洗，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品溶於10mL石油醚：乙酸乙酯=1：10的溶液中，攪拌1小時，過濾，石油醚洗滌，抽乾，獲得標題化合物，白色固體1.2g，收率61.2%。
MS(ESI)：330.1[M+1]+。
第十步
3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯113
在氮氣保護下，將3-(6-溴-4氟-2甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯111(2.5g,8mmol)、聯硼酸頻那醇酯(2.3g,9.1mmol)、醋酸鉀(2.4g,24mmol)和Pd(dppf)Cl2(326mg,0.4mmol)溶於70mL二噁烷中，在100℃下反應2小時。HPLC檢測反應，反應結束後，將中間體2,4-二氯- 5氟嘧啶(1.7g,10.4mmol)、碳酸銫(7.8g,24mmol)、Pd(dppf)Cl2(326mg,0.4mmol)和7mL水加入反應液，在110℃下反應14小時。LC-MS檢測反應，原料不再減少時，停止反應，旋乾反應液，加入水，乙酸乙酯萃取(3×25mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=1：1)，獲得標題化合物，黃色固體1g，收率32.5%。
MS(ESI)：381.1[M+1]+。
第十一步
3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-4氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯114
在氮氣保護下，將3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯113(0.7g,1.8mmol)、N4-苄基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2,4-二胺(0.72g,2.2mmol)、Pd2(dba)3(82mg,0.09mmol)、2-二環己基磷-2,4,6-三異丙基聯苯(X-phos)(128mg，0.27mmol)和碳酸鉀(0.745g，5.4mmol)懸浮於70mL二噁烷中，在100℃下反應12小時。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，旋乾反應液，加入水，二氯甲烷萃取(3×25mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=5：1)，獲得標題化合物，棕黃色固體0.5g，收率38.9%。MS(ESI)：670.7[M+1]+。
第十二步
3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯115
在0℃下，將3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-4氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯114(0.5g，0.7mmol)溶於4mL濃硫酸中，攪拌30分鐘。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，將反應液倒入碎冰中，用10%氫氧化鈉調節pH=8-9，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合併，乾燥，旋乾獲得標題化合物0.4g，棕色固體，收率100%。
MS(ESI)：580.6[M+1]+。
第十三步
3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸116
將3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯115(0.4g，6.9mmol)，溶於5mL甲醇和5mL10%氫氧化鈉中，室溫攪拌過夜。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，用濃鹽酸調節pH=4-5，旋乾，乾燥，加入50mL乙醇攪拌5小時，過濾，洗滌，旋乾，獲得標題化合物，0.8g黃色固體，收率100%。
MS(ESI)：566.6[M+1]+。
第十四步
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮1
將3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸116(0.8g，0.7 mmol)、三乙胺(212mg，2.1mmol)溶於50mL二氯甲烷中，加入HATU(323mg，0.85mmol)，室溫攪拌過夜。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，加入水，二氯甲烷萃取(3×20mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經製備矽膠板(DCM：MeOH=5：1)純化，獲得標題化合物，白色固體32mg。
MS(ESI)：548.6[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3))δ 10.41(s,1H),10.21(s,1H),9.73(s,1H),8.89-8.47(m,2H),8.12(s,1H),7.59(d,J=11.8Hz,1H),5.23(s,1H),4.02(m,1H),3.65-3.35(m,2H),3.10-2.55(m,9H),2.47-2.08(m,5H),1.79(d,J=6.4Hz,3H),1.03(t,J=6.5Hz,3H)。
實施例2
(R)-45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮2
Figure 108146435-A0101-12-0029-12
Figure 108146435-A0101-12-0030-13
第一步
(R)-3-胺基丁酸甲酯202
在0℃下，二氯亞碸(5.1g,43mmol)滴入40mL甲醇中，攪拌1小時，(R)-3-胺基丁酸201(3g,29mmol)加入反應體系中，室溫攪拌5小時。TLC(二氯甲烷：甲醇=5：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，甲醇帶乾2次。獲得標題化合物，無色油狀物4.0g，收率100%。所得產品直接用於下一步反應。
第二步
(R)-3-((5-溴-3-氟-2-硝基苯基)胺基)丁酸甲酯203
將1,3-二氟-5溴-2-硝基苯(6.8g，29mmol)和(R)-3-胺基丁酸甲酯202(4.0g，29mmol)溶於50mL DMF中，加入DIEA(11.2g，87mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)檢測，反應結束後，加入水100mL水，乙酸乙酯萃取(3×25mL)，合併，水洗，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=50：1)，獲得標題化合物，黃色固體9g，收率90.3%。
MS(ESI)：335.2[M+1]+。
第三步
(R)-3-((2-胺基-5-溴-3氟苯基)胺基)丁酸甲酯204
將(S)-3-((5-溴-3-氟-2-硝基苯基)胺基)丁酸甲酯203(9g，26.8mmol)溶於50mL DMF中，加入氯化亞錫(30.3g，34mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)檢測，反應結束後，加入水100mL水，乙酸乙酯萃取(3×50mL)，合併，水洗，乾燥，旋乾。獲得標題化合物，橙黃色油狀物10g，收率100%。
MS(ESI)：306.2[M+1]+。
第四步
(R)-3-(6-溴-4氟-2甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯205
將(S)-3-((2-胺基-5-溴-3氟苯基)胺基)丁酸甲酯204(10g，26.8mmol)溶於45mL原甲酸三甲酯和30mL醋酸中，在90℃下反應8小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，加入飽和碳酸氫鈉溶液，乙酸乙酯萃取(3×25mL)，合併，水洗，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品溶於20mL乙酸乙酯：石油醚=1：10的溶液中，攪 拌1小時，過濾，石油醚洗滌，抽乾，獲得標題化合物，白色固體6.2g，收率69.7%。
MS(ESI)：330.1[M+1]+。
第五步
(R)-3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯207
在氮氣保護下，將(R)-3-(6-溴-4氟-2甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯205(5g，15.1mmol)、聯硼酸頻那醇酯(4.6g，18.2mmol)、醋酸鉀(4.84g，45.3mmol)和Pd(dppf)Cl2(0.64g，0.75mmol)溶於120mL二噁烷中，在100℃下反應2小時。HPLC檢測反應，反應結束後，將中間體2,4-二氯-5氟嘧啶(3.2g，19.6mmol)、碳酸銫(14.7g，45.3mmol)、Pd(dppf)Cl2(0.61g，0.7mmol)和12mL水加入反應液，在110℃下反應14小時。LC-MS檢測反應，原料不再減少時，停止反應，旋乾反應液，加入水，乙酸乙酯萃取(3×40mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=1：1)，獲得標題化合物，黃色固體3.1g，收率53.6%。
MS(ESI)：381.1[M+1]+。
第六步
(R)-3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-4氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯208
在氮氣保護下，將(R)-3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯207(1.1g，2.95mmol)、N4-苄基-5-((4- 乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2,4-二胺(0.8g，2.46mmol)、Pd2(dba)3(112mg，0.12mmol)、X-phos(175mg，0.37mmol)和碳酸鉀(1.02g，7.38mmol)懸浮於100mL二噁烷中，在100℃下反應12小時。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，旋乾反應液，加入水，二氯甲烷萃取(3×30mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=5：1)，獲得標題化合物，棕黃色固體0.4g，收率20.3%。
MS(ESI)：670.7[M+1]+。
第七步
(R)-3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯209
在0℃下，將(R)-3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-4氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯208(0.4g，0.6mmol)溶於4mL濃硫酸中，攪拌30分鐘。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，將反應液倒入碎冰中，用10%氫氧化鈉調節到pH=8-9，乙酸乙酯萃取(3×30mL)，合併，乾燥，旋乾獲得標題化合物0.4g，棕色固體，收率100%。
第八步
(R)-3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸210
將(R)-3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸甲酯209(0.4g，6.9 mmol)，溶於5mL甲醇和5mL10%氫氧化鈉中，室溫攪拌過夜。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，用濃鹽酸調節pH=4-5，旋乾，乾燥，加入50mL乙醇攪拌5小時，過濾，洗滌，旋乾，獲得標題化合物，0.5g黃色固體，收率100%。
MS(ESI)：566.6[M+1]+。
第九步
(R)-45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮2
將(R)-3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丁酸210(0.5g，0.69mmol)、三乙胺(212mg，2.1mmol)溶於50mL二氯甲烷中，加入HATU(323mg，0.85mmol)，室溫攪拌過夜。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，加入水，二氯甲烷萃取(3×30mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經製備矽膠板(二氯甲烷：甲醇=5：1)純化，獲得標題化合物，白色固體24mg，收率：7.4%。
MS(ESI)：548.6[M+1]+。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 10.41(s,1H),10.21(s,1H),9.73(s,1H),8.89-8.47(m,2H),8.12(s,1H),7.59(d,J=11.8Hz,1H),5.23(s,1H),3.85(d,J=13.2Hz,1H),3.65-3.35(m,2H),3.10-2.55(m,9H),2.47-2.08(m,5H),1.79(d,J=6.4Hz,3H),1.03(t,J=6.5Hz,3H)。
實施例3
(S)-45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮3
Figure 108146435-A0101-12-0035-14
依據實施例2中描述的方法，用(S)-3-胺基丁酸甲酯作為起始原料，獲得(S)-45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮3，白色固體。
MS(ESI)：548.6[M+1]+。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ 10.41(s,1H),10.21(s,1H),9.73(s,1H),8.89-8.47(m,2H),8.12(s,1H),7.59(d,J=11.8Hz,1H),5.23(s,1H),3.85(d,J=13.2Hz,1H),3.65-3.35(m,2H),3.10-2.55(m,9H),2.47-2.08(m,5H),1.79(d,J=6.4Hz,3H),1.03(t,J=6.5Hz,3H)。
實施例4
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12-甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮4
Figure 108146435-A0101-12-0035-15
Figure 108146435-A0101-12-0036-16
第一步
胺基丁酸甲酯402
在0℃下，將二氯亞碸(10g,84mmol)滴入40mL甲醇中，攪拌1小時，胺基丁酸(5g,56mmol)加入反應體系中，室溫攪拌5小時。TLC(DCM：MeOH=5：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，MeOH帶乾2次。獲得標題化合物，無色油狀物6g，收率100%。所得產品直接用於下一步反應。
第二步
3-((5-溴-3-氟-2-硝基苯基)胺基)丙酸甲酯403
將1,3-二氟-5溴-2-硝基苯402(13.3g(56mmol)和3-胺基丙酸甲酯(6g(56mmol)溶於100mL DMF中，加入DIEA(21.6g(168mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(PE：EA=5：1)檢測，反應結束後，加入水150mL水，等體積乙酸乙酯萃取2次，合併有機相，水洗，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(PE：EA=50：1)，獲得標題化合物，橙黃色固體14g，收率77.8%。
MS(ESI)：322.1[M+1]+。
第三步
3-((2-胺基-5-溴-3-氟苯基)胺基)丙酸甲酯404
將3-((5-溴-3-氟-2-硝基苯基)胺基)丙酸甲酯403(14g,43.6mmol)溶於150mL DMF中，加入氯化亞錫(49g,218mmol)，室溫攪拌過夜。TLC(石油醚：乙酸乙酯=5：1)檢測，反應結束後，加入水500mL水，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合併有機相，水洗，乾燥，旋乾。獲得標題化合物，白黃色油狀物12g，收率100%。
MS(ESI)：292.2[M+1]+。
第四步
3-(6-溴-4氟-2甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯405
將3-((2-胺基-5-溴-3氟苯基)胺基)丙酸甲酯404(12g,41mmol)溶於90mL原乙酸三甲酯和54mL醋酸中，在90℃下反應8小時。TLC(石油醚：乙酸乙酯=1：1)檢測，反應結束後，旋乾反應液，加入約100ml飽和碳酸氫鈉溶液，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合併有機相，水洗，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品溶於10mL乙酸乙酯：石油醚=1：10的溶 液中，攪拌1小時，過濾，石油醚洗滌，抽乾，獲得標題化合物，白色固體6.8g，收率52.3%。
MS(ESI)：316.1[M+1]+。
第五步
3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯407
在氮氣保護下，將3-(6-溴-4氟-2甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯405(5g,15.9mmol)、聯硼酸頻那醇酯(4.8g,19.1mmol)、醋酸鉀(4.7g,47.7mmol)和Pd(dppf)Cl2(650mg,0.8mmol)溶於100mL二噁烷中，在100℃下反應2小時。HPLC檢測反應，反應結束後，將中間體2,4-二氯-5氟嘧啶(3.4g,20.4mmol)、碳酸銫(15.5g,47.7mmol)、Pd(dppf)Cl2(650mg,0.8mmol)和15mL水加入反應液，在110℃下反應14小時。LC-MS檢測反應，原料不再減少時，停止反應，旋乾反應液，加入約100ml水，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合併有機相，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=1：1)，獲得標題化合物，棕色固體2.8g，收率48.2%。
MS(ESI)：367.1[M+1]+。
第六步
3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-4氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯408
在氮氣保護下，將3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯407(2.8g，7.6mmol)、N4-苄基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2,4-二胺(2g，6.3mmol)、Pd2(dba)3(580mg，0.63 mmol)、X-phos(900mg，1.89mmol)和碳酸鉀(2.6g，18.9mmol)懸浮於70mL二噁烷中，在100℃下反應12小時。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，旋乾反應液，加入約70ml水，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合併有機相，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經矽膠管柱層析純化(DCM：MeOH=5：1)，獲得標題化合物，棕色油狀物1.5g，收率30.9%。
MS(ESI)：656.7[M+1]+。
第七步
3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯409
在0℃下，將3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-4氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯408(1.5g，2.1mmol)溶於4mL濃硫酸中，攪拌30分鐘。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，將反應液倒入約100g碎冰中，用10%氫氧化鈉條件pH=8-9，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合併有機相，乾燥，旋乾獲得標題化合物0.9g，棕色固體，收率63.6%。
MS(ESI)：566.6[M+1]+。
第八步
3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸410
將3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸甲酯409(0.9 g，1.6mmol)，溶於5mL甲醇和5mL 10%氫氧化鈉中，室溫攪拌過夜。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，用濃鹽酸調節pH=4-5，旋乾，乾燥，加入50mL乙醇攪拌5小時，過濾，洗滌，濾液旋乾，獲得標題化合物，1.6g灰白色固體，收率100%。
MS(ESI)：552.6[M+1]+。
第九步
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12-甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮4
將3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)哌啶-2-基)胺基)5-氟嘧啶-4-基)-4-氟-2-甲基-1H-苯並[d]咪唑-1-基)丙酸410(1.6g，0.9mmol)、三乙胺溶(270mg，2.7mmol)於50mL二氯甲烷中，加入HATU(510mg，1.3mmol)，室溫攪拌過夜。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，加入約50ml水，分液，乙酸乙酯萃取(50ml×3)，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經製備矽膠板(DCM：MeOH=5：1)純化，獲得標題化合物，白色固體35mg。
MS(ESI)：534.6[M+1]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 10.68(s,1H),10.11(s,1H),9.52(s,1H),8.67(d,J=4.1Hz,1H),8.39(s,1H),8.08(s,1H),7.58(d,J=11.8Hz,1H),4.71(s,2H),3.97-3.41(m,2H),3.03-2.60(m,9H),2.48-1.93(m,6H),1.02(s,3H).
實施例5
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃5
Figure 108146435-A0101-12-0041-17
在45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮1(100mg,0.182mmol)的THF(5mL)溶液中，在0℃下加入LiAlH4(10mg,0.26mmol)。室溫攪拌過夜。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，在0℃下加入約10ml飽和氯化銨水溶液，分液，乙酸乙酯萃取(10ml×3)，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經製備矽膠板(DCM：MeOH=5：1)純化，獲得標題化合物，白色固體60mg。
MS(ESI)：534.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3))δ 10.41(s,1H),10.21(s,1H),9.73(s,1H),8.89-8.47(m,2H),8.12(s,1H),7.59(d,J=11.8Hz,1H),5.23(s,1H),3.85(d,J=13.2Hz,1H),3.32-3.20(m,2H),3.10-2.55(m,9H),2.47-2.08(m,5H),2.00-1.84(m,2H),1.79(d,J=6.4Hz,3H),1.03(t,J=6.5Hz,3H)。
實施例7
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-25-氟-8-甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-吲哚雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮7
Figure 108146435-A0101-12-0042-18
第一步
3-(6-溴-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-1
6-溴吲哚(1.0g,5.1mmol)、3-溴丁酸甲酯(1.38g,7.65mmol)、氫氧化鈉(0.43g,7.65mmol)中加入N,N-二甲基甲醯胺(DMF,10mL)，在氮氣保護下70℃反應10小時。反應液中加入水(50mL)/乙酸乙酯(50mL)攪拌萃取，有機相乾燥、過濾、濃縮後過矽膠管柱(沖提劑：乙酸乙酯/石油醚：1/30-1/10)得白色固體7-1(1.2g，收率80%。MS(ESI)：296.1[M+1]+。
第二步
3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-3
在氮氣保護下，將3-(6-溴-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-1(2.4g,8mmol)、聯硼酸頻那醇酯(2.3g,9.1mmol)、醋酸鉀(2.4g,24mmol)和Pd(dppf)Cl2(326mg,0.4mmol)溶於70mL二噁烷中，在100℃下反應2小時。HPLC檢測反應，反應結束後，將中間體2,4-二氯-5氟嘧啶(1.7g,10.4mmol)、碳酸銫(7.8g,24mmol)、Pd(dppf)Cl2(326mg,0.4mmol)和7mL水加入反應液，在110℃下反應14小時。LC-MS檢測反應，原料不再減少時，停止反應，旋乾反應液，加入水，乙酸乙酯萃取(3×25mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=1：1)，獲得標題化合物，黃色固體1g，收率32.5%。
MS(ESI)：348.1[M+1]+。
第三步
3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-4
在氮氣保護下，將3-(6-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-3(0.63g,1.8mmol)、N4-苄基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2,4-二胺(0.72g,2.2mmol)、Pd2(dba)3(82mg,0.09mmol)、2-二環己基磷-2,4,6-三異丙基聯苯(X-phos)(128mg，0.27mmol)和碳酸鉀(0.745g，5.4mmol)懸浮於70mL二噁烷中，在100℃下反應12小時。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，旋乾反應液，加入水，二氯甲烷萃取(3×25mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經管柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=5：1)，獲得標題化合物，棕黃色固體0.45g，收率40%。
MS(ESI)：637.1[M+1]+。
第四步
3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-5
在0℃下，將3-(6-(2-((4-(苄胺基)-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-4(0.45g，0.7mmol)溶於4mL濃硫酸中，攪拌30分鐘。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，將反應液倒入碎冰中，用10%氫氧化鈉調節pH=8-9，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合併，乾燥，旋乾獲得標題化合物0.4g，棕色固體，收率100%。
MS(ESI)：547.1[M+1]+。
第五步
3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基-)丁酸7-6
將3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸甲酯7-5(0.38g，6.9mmol)，溶於5mL甲醇和5mL10%氫氧化鈉中，室溫攪拌過夜。TLC檢測(二氯甲烷：甲醇=5：1)，反應完全後，停止反應，用濃鹽酸調節pH=4-5，旋乾，乾燥，加入50mL乙醇攪拌5小時，過濾，洗滌，旋乾，獲得標題化合物，0.38g黃色固體，收率100%。
MS(ESI)：551.1[M+1]+。
第六步
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-吲哚雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮7
將3-(6-(2-((4-胺基-5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)胺基)-5-氟嘧啶-4-基)-1H-吲哚-1-基)丁酸7-6(0.38g，0.7mmol)、三乙胺(212mg，2.1mmol)溶於50mL二氯甲烷中，加入HATU(323mg，0.85mmol)，室溫攪拌過夜。TLC檢測(DCM：MeOH=5：1)，反應完全後，停止反應，加入水，二氯甲烷萃取(3×20mL)，合併，乾燥，旋乾獲得粗品。粗品經製備矽膠板(DCM：MeOH=5：1)純化，獲得標題化合物7，白色固體120mg。
MS(ESI)：515.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3))δ 10.23(s,1H),10.01(s,1H),9.21(s,1H),8.45-8.20(m,2H),8.12(d,J=11.8Hz,1H),7.82(s,1H),7.59(d,J=11.8Hz,1H),7.33(d,J=12.1Hz,1H),6.41(d,J=12.1Hz,1H),5.23(s,1H),4.5(br,1H),4.06(m,1H),3.65(s,2H),2.84-2.62(m,2H),2.47-2.08(m,8H),1.68(d,J=6.2Hz,3H),1.01(t,J=6.5Hz,3H)。
實施例8
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8,8-三甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮8
Figure 108146435-A0101-12-0045-30
依據實施例1中描述的方法，將第六步中的反應原料3-胺基丁酸107換為3-胺基-3-甲基丁酸，獲得45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8,8-三甲基-11H-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-6-酮8，白色固體。
MS(ESI)：562.2[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3))δ 10.31(s,1H),10.01(s,1H),9.73(s,1H),8.89-8.47(m,2H),8.12(s,1H),7.62(d,J=11.8Hz,1H),3.75(s,2H),3.35(q,J=6.5Hz,2H),2.64(s,2H),2.51(s,3H),2.47-2.35(m,8H),1.43(s,6H),1.03(t,J=6.5Hz,3H)。
實施例9
5'-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-4',5'-二氟-2'-甲基螺[環丙烷-1,8'-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃]-6'-酮9
Figure 108146435-A0101-12-0046-20
依據實施例1中描述的方法，將第六步中的反應原料3-胺基丁酸107換為2-(1-胺基環丙基)乙酸，獲得5'-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-4',5'-二氟-2'-甲基螺[環丙烷-1,8'-3,5-二氮雜-1(6,1)-苯并[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃1-6'-酮9，白色固體。
MS(ESI)：560.1[M+1]+。
1H NMR(400MHz,CDCl3))δ 10.34(s,1H),10.24(s,1H),9.71(s,1H),8.89-8.47(m,2H),8.12(s,1H),7.62(d,J=11.8Hz,1H),3.75(s, 2H),3.35(q,J=6.5Hz,2H),2.84(s,2H),2.62(s,3H),2.47-2.35(m,8H),1.03(t,J=6.5Hz,3H),0.76-0.74(m,2H),0.52-0.48(m,2H)
實施例6、10和11
依據實施例1-3中描述的方法，用適當的化合物作為起始原料，獲得如下化合物：
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-5-氧雜-3-氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃6；
45-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,6-二氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-5-酮10；
45-(4-乙基哌嗪-1-基)-14,25-二氟-12,8-二甲基-11H-3,6-二氮雜-1(6,1)-苯並[d]咪唑雜-2(4,2)-嘧啶雜-4(2,4)-吡啶雜環八蕃-5-酮11。
測試例1 CDK4/Cyclin D1抑制作用的測定
關於CDK4/Cyclin D1的IC50測定法是按如下步驟進行的。使用96孔過濾平板(MilliporeMADVN6550)。總體積為0.1ml，含有緩衝液A(20mMTRIS(三[羥甲基]胺基甲烷)(pH7.4)，50mMNaCl，1mM二硫蘇糖醇，10mMMgCl2)、25μM ATP(含有0.25μ Ci[32P]ATP)、20ng CDK4、1μg視網膜母細胞瘤蛋白和供試化合物的適當比例緩衝液A稀釋液。採用沒有加入供試化合物的單獨緩衝液A作為沒有抑制作用的對照。使用含有過量EDTA的緩衝液A測定在沒有酶活性存在下的背景32P水平。 向小孔加入除ATP以外的所有組分，將平板置於平板混合機上達2分鐘。加入[32P]ATP引發反應，將平板在25℃下孵育15分鐘。加入0.1ml20%三氯乙酸(TCA)終止反應。使平板在4℃下保持至少1小時，以便受質沉澱出來。然後將小孔用0.2ml10% TCA洗滌5次，利用β平板計數器(wallacInc.，Gaithersburg，MD)測定32P的結合。利用中位效應法測定供試化合物的IC50(Chou,T-C and Talalay P.Applications of the median effect principle for the assessmentof low-dose risk of carcinogens and for the quantitation ofsynergism and antagonism of chemotherapeutic agents.In New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy(Eds.Harrap,K.T.and Connors,T.A.),pp.37-64.Academic Press,New York,1987)。
實驗方法：採用Caliper遷移率(MobilityShift)方法進行CDK4/6激酶的抑制活性測定
1、1倍激酶緩衝液的配製：
1)、1倍CDK4激酶緩衝液的配製
分別取800μL母液濃度為1000mM的pH 7.5的HEPES、40μL母液濃度為10%的TritonX-100，加入到39160μL的超純水中，混勻。
2)、1倍CDK6激酶緩衝液的配製
分別取50mL母液濃度為1000mM的pH 7.5的HEPES、50μL母液濃度為30%的Brij-35，加入到949.95mL的超純水中，混勻。
2、終止液的配製
分別取25mL母液濃度為4%的包被液CoatingReagent#3(Caliper儀器所使用的12-吸頭芯片(sipperchip)中自 帶)、50mL母液濃度為1000mMpH 7.5的HEPES、50mL母液濃度為0.5M的EDTA、0.25mL母液濃度為30%的Brij-35，加入到374.75mL的超純水中，混勻。
3、2.5倍激酶溶液的配製
1)、2.5倍CDK4/D3激酶溶液的配製
分別取7μLCDK4/D3酶溶液、9μL母液濃度為1M的DTT，加入到1784μL1倍CDK4激酶緩衝液中，混勻。
2)、2.5倍CDK6/D3激酶溶液的配製
分別取18μLCDK6/D3酶溶液、14μL母液濃度為1M的DTT，加入到2768μL1倍CDK6激酶緩衝液中，混勻。
4、2.5倍多肽溶液的配製
1)、2.5倍CDK4/D3多肽溶液的配製
分別取10μL母液濃度為100mM的ATP溶液、45μL母液濃度為1M的MgCl2，45μLFAM標記的多肽8，加入到1700μL1倍CDK4激酶緩衝液，混勻。
2)、2.5倍CDK6/D3多肽溶液的配製
分別取23μL母液濃度為100mM的ATP溶液、75μL母液濃度為1M的MgCl2，75μLFAM標記的多肽8，加入到2827μL1倍CDK6激酶緩衝液，混勻。
5、5倍測試物溶液配製：
取10mM測試物的DMSO儲備液，用DMSO稀釋製成濃度為50μM的溶液，作為母液。用DMSO將上述母液四倍逐級稀釋製成12.5 μM、3.125μM、0.78μM、0.195μM、0.0488μM、12.2nM、3nM、0.76nM、0.19nM的溶液，然後每個濃度分別用1倍激酶緩衝液稀釋10倍，製成5倍化合物溶液。
6、CDK4/6酶學反應：
1)、384孔板中相對應的孔中分別加入5μL配製好的5倍測試物溶液、10μL配製好的2.5倍激酶溶液，室溫孵育10分鐘。
2)、相對應的孔中再分別加入10μL配製好的2.5倍多肽溶液，啟動酶反應，28℃孵育5小時。
7、酶學檢測：
每個相對應的孔中分別加入25μL終止液，終止反應。
8、Caliper儀器讀取數據，並藉由下式計算抑制率，然後採用GraphPad5.0軟體進行曲線擬合，得出IC50值。
Figure 108146435-A0101-12-0050-31
測試例2 本發明化合物的體外細胞學抑制活性
實驗方法：採用BrdU方法(BrdU細胞增殖試驗試劑盒，CellSignalingTechnology公司)進行細胞增殖檢測
1、試劑和化合物配製
1倍洗液配製：
將母液濃度為20倍的洗液用超純水稀釋成1倍洗液。
1倍檢測抗體溶液配製：
將母液濃度為100倍的BrdU檢測抗體用檢測抗體稀釋液稀釋成1倍檢測抗體溶液。
1倍HRP標記的二抗溶液配製：
將母液濃度為100倍的抗小鼠IgG，HRP標記抗體用HRP標記抗體稀釋液稀釋成1倍HRP標記的二抗溶液。
10倍BrdU溶液：
將母液濃度為1000倍的BrdU溶液用細胞對應的培養基稀釋成10倍BrdU溶液。
配製測試化合物：
配製測試化合物母液：用100%DMSO配製成10mM的母液。
配製測試化合物梯度稀釋溶液：取10mM的測試化合物母液用DMSO4倍連續梯度稀釋，濃度分別為2.5mM、625μM、156μM、39μM、9.8μM、2.5μM。分別取2μL的DMSO稀釋的化合物加到198 μL含10% FBS的培養液中配製成10倍測試物，測試物最高濃度為100μM，DMSO濃度為1%，共7個濃度梯度。
培養基配製：
MCF-7培養基：DMEM+10% FBS+0.01mg/mL胰島素
2、試驗步驟
(1)胰酶消化生長至80%的細胞(對數生長期)，離心收集細胞。用不含FBS的培養基重新懸浮MDA-MB-435S和U87MG細胞，計數並調整接種96孔板，MDA-MB-435S細胞接種3000個/孔/81μL，U87MG細胞接種4000個/孔/81μL；用含1%FBS的培養基重新懸浮MCF-7細胞，計數並調整接種96孔板，接種4000個/孔/82μL，置於37℃細胞培養箱中培養；
(2)培養24小時後MDA-MB-435S和U87MG細胞每孔添加FBS(9μL)，MCF-7細胞每孔添加8μLFBS，使FBS終濃度為10%；
(3)每孔加入不同濃度的10倍測試物(10μL)，使測試物終濃度分別為10μM、2.5μM、625nM、156nM、39nM、9.8nM、2.5nM，3複孔/組，37℃培養72小時；
溶劑對照：0.1% DMSO
空白對照：只加培養基，沒有細胞
正常細胞對照：沒有任何處理的正常細胞
(4)每孔加入10倍BrdU溶液(10μL)，細胞培養箱中孵育4小時後棄去培養基；
(5)每孔加入固定/變性液(10μL)，室溫孵育30分鐘，棄去溶液；
(6)每孔加入1倍檢測抗體溶液(100μL)，室溫孵育1小時，棄去溶液，用1倍洗液200μL/孔洗3次；
(7)每孔加入1倍HRP標記的二抗溶液(100μL)，室溫孵育30分鐘，棄去溶液，用1倍洗液200μL/孔洗3次；
(8)每孔加入TMB受質溶液(100μL)，室溫孵育30分鐘；
(9)每孔加入終止液(100μL)，酶標儀450nm檢測OD值。
3、數據處理
1)細胞存活率(%)=(OD測試物-OD空白對照)/(OD正常細胞對照-OD空白對照)×100%，
OD空白對照：空白對照值，OD正常細胞對照：正常細胞對照值；
2)數據使用GraphPadPrism5軟體處理，得到曲線及IC50值。
Figure 108146435-A0101-12-0053-22
Figure 108146435-A0101-11-0002-3

Claims (21)

  1. 一種通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，
    Figure 108146435-A0101-13-0001-32
     其中：
    A和B各自獨立地選自CH和N原子；
    U、V、W、X和Y各自獨立地選自CH和N原子；
    Q選自一個鍵、C1-4伸烷基和-C(=O)-，該C1-4伸烷基視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    G選自一個鍵、-O-、-N(R7)-、-C(=O)-、C1-4伸烷基、C2-4烯基、-S-、-SO-、-SO2-和3-6員雜環基，其中該C1-4伸烷基、C2-4烯基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    J選自一個鍵、-O-、-N(R7)-、-C(=O)-、C1-4伸烷基、C2-4烯基、-S-、-SO-、-SO2-和3-6員雜環基，其中該C1-4伸烷基、C2-4烯基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    L選自一個鍵、-C(=O)-、C1-4伸烷基、C2-4烯基、-S-、-SO-、-SO2-和3-6員雜環基，其中該C1-4伸烷基、C2-4烯基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    R1選自H原子、C1-4烷基、氰基、C2-4烯基和C2-4炔基，其中該C1-4烷基、C2-4烯基和C2-4炔基各自獨立地視需要被選自鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    R2選自H原子和C1-4烷基，其中該C1-4烷基視需要被選自鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    或者，R1和R2與其相連接的原子一起形成C3-6環烷基或3-6員雜環基，該C3-6環烷基和3-6員雜環基各自獨立地視需要被選自C1-4烷基、鹵C1-4烷基、C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；
    R3和R6各自獨立地選自H原子和C1-4烷基，其中該烷基視需要被選自C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代
    R4和R5各自獨立地選自H原子、C1-4烷基、鹵素、羥基和C1-4烷氧基，其中該C1-4烷基和C1-4烷氧基各自獨立地視需要被選自鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代；和
    R7選自H原子和C1-4烷基，其中該述烷基視需要被選自C1-4烷氧基、鹵C1-4烷氧基、鹵素、胺基、硝基、羥基和氰基中的一個或多個基團所取代。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合 物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該-G-J-L-選自-NH-CH2-CH2-、-O-CH2-CH2-、-NH-C(=O)-CH2-和-C(=O)-NH-CH2-。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該Q為一個鍵或亞甲基。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該V、X和Y各自獨立地為CH。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中W為N原子。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該R1和R2各自獨立地選自H原子和C1-4烷基，或者，R1和R2與其相連接的原子一起形成C3-6環烷基。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該R3和R6各自獨立地為C1-4烷基。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構 體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該R4和R5各自獨立地為鹵素。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該R4和R5各自獨立地為F原子。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽，其中，該通式(I)所示的化合物選自：
    Figure 108146435-A0101-13-0004-33
  11. 一種製備如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽的方法，其包括：
    Figure 108146435-A0101-13-0005-34
    通式(IA)化合物在縮合劑存在下發生分子內成環反應形成通式(I)化合物，
    其中：
    LG1和LG2各自獨立地為離去基；
    A、B、U、V、W、X、Y、G、J、L、R1至R6如申請專利範圍第1項中所定義。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中，該縮合劑選自2-(7-氧基苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N,N'-二環己基碳化二亞胺、N,N'-二異丙基碳二醯亞胺、O-苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽、1-羥基苯並三唑、1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑、O-苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲脲六氟磷酸鹽、2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、苯並三氮唑-1-基氧基三(二甲基胺基)磷鎓六氟磷酸鹽和六氟磷酸苯並三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷；
    LG1和LG2各自獨立地選自H原子、OH、鹵素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯和對甲苯磺酸酯。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中，該縮合劑選自佳2-(7-氧基苯並三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽。
  14. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中，該LG1和LG2各自獨立地選自H原子、OH、Cl原子和Br原子。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的方法，其中，該LG1為H原子，LG2為OH原子。
  16. 如申請專利範圍第11至15項中任一項所述的方法，其中，該G為-NH-，LG1為H原子，J為-C(=O)-，且-LG2為OH原子。
  17. 一種醫藥組成物，其包含治療有效量的如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的醫藥組成物，其中，該醫藥組成物還包含一種或多種額外的抗腫瘤劑、抗炎劑、免疫抑制劑和/或免疫檢測點抑制劑。
  19. 一種申請專利範圍第1至10項中任一項所述的通式(I)所示的化合物或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式、或其藥學上可接受的鹽或如申請專利範圍第17或18項所述的醫藥組成物在製備治療CDK相關病症的藥物中的用途。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的用途，其中，該CDK相關病症選自癌症、炎症、病毒感染、心臟肥大和HIV。
  21. 如申請專利範圍第19或20項所述的用途，其中，該癌症選自膀胱癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌、腦癌、喉癌、淋巴系統癌、造血系統癌、泌尿生殖道癌、胃腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、骨癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、結腸直腸癌和胰腺癌；
    該炎症與類風濕性關節炎、狼瘡、I型糖尿病、糖尿病性腎病變、多發性硬化、腎小球腎炎、慢性炎症和器官移植排斥有關；
    該病毒感染與HIV病毒、人乳頭狀瘤病毒、皰疹病毒、痘病毒、EB病毒、新培斯病毒或腺病毒相關。
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