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TW202021945A - 陽離子性脂質 - Google Patents

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TW202021945A
TW202021945A TW108128296A TW108128296A TW202021945A TW 202021945 A TW202021945 A TW 202021945A TW 108128296 A TW108128296 A TW 108128296A TW 108128296 A TW108128296 A TW 108128296A TW 202021945 A TW202021945 A TW 202021945A
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linear
heptadecadienyl
methyl
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TW108128296A
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松本悟
大森良真
峯野雅
澤井泰宏
杮本望
帆足保孝
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日商武田藥品工業股份有限公司
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Abstract

本發明係提供可將活性成分，尤其是核酸，以優異的效率導入細胞的技術以及使用於此之陽離子性脂質等。本發明之陽離子性脂質係式(I)所示之化合物或其鹽。n1表示2至6之整數，n2表示0至2之整數，n3表示0至2之整數，L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，Ra表示直鏈狀C5-13烷基、直鏈狀C13-17烯基或直鏈狀C17二烯基，Rb表示直鏈狀C2-9烷基，Rc表示氫原子或直鏈狀C2-9烷基，Rd表示氫原子或直鏈狀C2-9烷基，Re表示直鏈狀C2-9烷基，Rf表示直鏈狀C2-9烷基。

Description

陽離子性脂質
本發明係關於可將作為活性成分之核酸導入多種類細胞、組織或臟器之陽離子性脂質。再者，本發明係關於含有該陽離子性脂質之脂質粒子，以及含有該脂質粒子和核酸之組成物。
近年來，含有核酸作為活性成分之核酸醫藥的研究開發正積極地進行。例如，具有包含siRNA、miRNA、miRNA mimic或反義核酸等核酸之標的mRNA之分解作用或機能抑制作用之核酸醫藥的研究正多數進行著。又，包含編碼目的蛋白質之mRNA等，用以使目的蛋白質在細胞內表現之核酸醫藥的研究也正進行。與此等的研究開發相關，正開發用以將核酸以高效率導入細胞、組織或臟器之技術作為藥物送達系(DDS)技術。
作為上述DDS技術，以往已知係將核酸和脂質混合形成複合體後，透過上述複合體而使核酸送入細胞的技術。作為使用於形成上述複合體之脂質以往已知有陽離子性脂質、親水性聚合物脂質、輔助者脂質等。作為上述陽離子性脂質已知有例如如下之先行技術文獻中所記載之化合物。
在專利文獻1中記載由下述式所示之化合物或其鹽等。
Figure 108128296-A0202-12-0002-4
式中規定，R1係各別獨立地選自由可經取代之C8至C24烷基以及可經取代之C8至C24烯基所構成的群；R2以及R3係各別獨立地選自由氫、可經取代之C1至C8烷基、可經取代之芳基烷基等所構成的群；Y1以及Y2係各別獨立地選自由氫、可經取代之C1至C6烷基、可經取代之芳基烷基等所構成的群；Y3在存在時，係各別獨立地選自由氫、可經取代之C1至C8烷基、可經取代之芳基烷基等所構成的群；m係1至4之任一整數，n係0至3之任一整數，p係0或1，而m、n以及p之合計係4；k係1至5之任一整數；q係0或1等。
在專利文獻2中記載由下述式所示之化合物或其鹽等。
Figure 108128296-A0202-12-0002-5
式中，W表示式-NR1R2或式-N+R3R4R5(Z-)，R1及R2各自獨立地表示C1-4烷基或氫原子，R3、R4及R5各自獨立地表示C1-4烷基，Z-表示陰離子，X表示可經取代之C1-6伸烷基，YA、YB及YC各自獨立地表示可經取代之次甲基，LA、LB及LC各自獨立地表示可經取代之亞甲基或鍵結，RA1、RA2、RB1、RB2、RC1及RC2各自獨立地表示可經取代之C4-10烷基。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2003/102150號公報
[專利文獻2]WO2016/021683號公報
可將核酸以高效率導入細胞之陽離子性脂質被期待以藥效表現、安全性(低毒性)的方面而言具有優異的、治療上優異效果之核酸醫藥的創新上有所貢獻。又，可將核酸導入各種細胞之陽離子性脂質亦被期待，針對各種的組織所產生之各種疾患的核酸醫藥之創新成為可能。然而，在現狀尚未發現能夠充分滿足此等需求者。
本發明之目的係提供可將核酸以優異的效率導入細胞的技術以及使用於此之陽離子性脂質等。又，以其他的觀點而言，本發明之目的係提供可將核酸導入各種細胞的技術以及使用於此之化合物等。
本發明者們為解決上述課題進行積極研究的結果，發現藉由使用由下述式所示之化合物或其鹽可解決上述之課題，遂而完成本發明。
亦即，本發明係關於至少以下之發明。
[1]
一種式(I)所示之化合物或其鹽：
Figure 108128296-A0202-12-0004-6
[式中，n1表示2至6之整數，n2表示0至2之整數，n3表示0至2之整數，
L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
Ra表示直鏈狀C5-13烷基、直鏈狀C13-17烯基或直鏈狀C17二烯基，
Rb表示直鏈狀C2-9烷基，
Rc表示氫原子或直鏈狀C2-9烷基，
Rd表示氫原子或直鏈狀C2-9烷基，
Re表示直鏈狀C2-9烷基，
Rf表示直鏈狀C2-9烷基。]
[2]
一種化合物或其鹽，該化合物為4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲胺基)戊醯 基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
[3]
一種化合物或其鹽，該化合物為二癸酸2-(((4,5-二丁基壬醯基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯。
[4]
一種化合物或其鹽，該化合物為4,5-二丁基壬酸3-((6-(二甲胺基)己醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
[5]
一種化合物或其鹽，該化合物為4,5-二戊基癸酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
[6]
一種化合物或其鹽，該化合物為4-庚基十一酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
[7]
一種脂質粒子，其含有如[1]所述之化合物或其鹽。
[8]
一種核酸導入用組成物，其含有核酸以及如[7]所述之脂質粒子。
[9]
如[8]所述之組成物，其中該核酸為RNA。
[10]
如[9]所述之組成物，其中該RNA為mRNA或siRNA。
再者，在本說明書中，將「式(I)所示之化合物」記載為「化合物(I)」。將「式(I)所示之化合物或其鹽」稱為「本發明之化合物」。將 「含有式(I)所示之化合物或其鹽(本發明之化合物)的脂質粒子」稱為「本發明之脂質粒子」。將「含有核酸以及本發明之脂質粒子之核酸導入用組成物」稱為「本發明之組成物」。
依照本發明，可將核酸以優異的效率導入細胞、組織或臟器。又，依照本發明，可將核酸導入多種類的細胞、組織或臟器(例如，癌細胞)。依照本發明，可取得將核酸導入多種類的細胞、組織或臟器之醫藥或研究用試藥。並且，依照本發明，將核酸導入細胞、組織或臟器時，該核酸所具有的活性(例如，藥效)之表現效率高。
以下，關於本說明書中所用的各取代基之定義加以詳述。只要未特別記載，各取代基具有以下之定義。
本說明書中，就「直鏈狀C5-13烷基」而言，例如，可列舉戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十三基。
本說明書中，就「直鏈狀C13-17烯基」而言，例如，可列舉1-十三烯基、2-十三烯基、3-十三烯基、4-十三烯基、5-十三烯基、6-十三烯基、7-十三烯基、8-十三烯基、9-十三烯基、10-十三烯基、11-十三烯基、12-十三烯基；1-十四烯基、2-十四烯基、3-十四烯基、4-十四烯基、5-十四烯基、6-十四烯基、7-十四烯基、8-十四烯基、9-十四烯基、10-十四烯基、11-十四烯基、12-十四烯基、13-十四烯基；1-十五烯基、2-十五烯基、3-十五烯基、4-十五烯基、5-十五烯基、6-十五烯基、7-十五烯基、8-十五烯 基、9-十五烯基、10-十五烯基、11-十五烯基、12-十五烯基、13-十五烯基、14-十五烯基；1-十六烯基、2-十六烯基、3-十六烯基、4-十六烯基、5-十六烯基、6-十六烯基、7-十六烯基、8-十六烯基、9-十六烯基、10-十六烯基、11-十六烯基、12-十六烯基、13-十六烯基、14-十六烯基、15-十六烯基；1-十七烯基、2-十七烯基、3-十七烯基、4-十七烯基、5-十七烯基、6-十七烯基、7-十七烯基、8-十七烯基、9-十七烯基、10-十七烯基、11-十七烯基、12-十七烯基、13-十七烯基、14-十七烯基、15-十七烯基、16-十七烯基。此等直鏈狀C13-17烯基由於包含1個碳-碳雙鍵，可採取順式及反式之構造，然而任一種構造均可。
本說明書中，就「直鏈狀C17二烯基」而言，例如，可列舉1,3-十七碳二烯基、1,4-十七碳二烯基、1,5-十七碳二烯基、1,6-十七碳二烯基、1,7-十七碳二烯基、1,8-十七碳二烯基、1,9-十七碳二烯基、1,10-十七碳二烯基、1,11-十七碳二烯基、1,12-十七碳二烯基、1,13-十七碳二烯基、1,14-十七碳二烯基、1,15-十七碳二烯基、1,16-十七碳二烯基、2,4-十七碳二烯基、2,5-十七碳二烯基、2,6-十七碳二烯基、2,7-十七碳二烯基、2,8-十七碳二烯基、2,9-十七碳二烯基、2,10-十七碳二烯基、2,11-十七碳二烯基、2,12-十七碳二烯基、2,13-十七碳二烯基、2,14-十七碳二烯基、2,15-十七碳二烯基、2,16-十七碳二烯基、3,5-十七碳二烯基、3,6-十七碳二烯基、3,7-十七碳二烯基、3,8-十七碳二烯基、3,9-十七碳二烯基、3,10-十七碳二烯基、3,11-十七碳二烯基、3,12-十七碳二烯基、3,13-十七碳二烯基、3,14-十七碳二烯基、3,15-十七碳二烯基、3,16-十七碳二烯基、4,6-十七碳二烯基、4,7-十七碳二烯基、4,8-十七碳二烯基、4,9-十 七碳二烯基、4,10-十七碳二烯基、4,11-十七碳二烯基、4,12-十七碳二烯基、4,13-十七碳二烯基、4,14-十七碳二烯基、4,15-十七碳二烯基、4,16-十七碳二烯基、5,7-十七碳二烯基、5,8-十七碳二烯基、5,9-十七碳二烯基、5,10-十七碳二烯基、5,11-十七碳二烯基、5,12-十七碳二烯基、5,13-十七碳二烯基、5,14-十七碳二烯基、5,15-十七碳二烯基、5,16-十七碳二烯基、6,8-十七碳二烯基、6,9-十七碳二烯基、6,10-十七碳二烯基、6,11-十七碳二烯基、6,12-十七碳二烯基、6,13-十七碳二烯基、6,14-十七碳二烯基、6,15-十七碳二烯基、6,16-十七碳二烯基、7,9-十七碳二烯基、7,10-十七碳二烯基、7,11-十七碳二烯基、7,12-十七碳二烯基、7,13-十七碳二烯基、7,14-十七碳二烯基、7,15-十七碳二烯基、7,16-十七碳二烯基、8,10-十七碳二烯基、8,11-十七碳二烯基、8,12-十七碳二烯基、8,13-十七碳二烯基、8,14-十七碳二烯基、8,15-十七碳二烯基、8,16-十七碳二烯基、9,11-十七碳二烯基、9,12-十七碳二烯基、9,13-十七碳二烯基、9,14-十七碳二烯基、9,15-十七碳二烯基、9,16-十七碳二烯基、10,12-十七碳二烯基、10,13-十七碳二烯基、10,14-十七碳二烯基、10,15-十七碳二烯基、10,16-十七碳二烯基、11,13-十七碳二烯基、11,14-十七碳二烯基、11,15-十七碳二烯基、11,16-十七碳二烯基、12,14-十七碳二烯基、12,15-十七碳二烯基、12,16-十七碳二烯基、13,15-十七碳二烯基、13,16-十七碳二烯基、14,16-十七碳二烯基。此等直鏈狀C11二烯基由於包含2個碳-碳雙鍵，可分別互相獨立地採取順式及反式之構造，任一種構造均可。
本說明書中，就「直鎖狀C2-9烷基」而言，例如，可列舉乙基、丁基、丙基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基。
式(I)中之n1、n2、n3、L、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、及Rf之各個較佳例如以下所述。
n1較佳為3至5之整數。
n2較佳為0至2之整數。
n3較佳為0至2之整數。
L較佳為-C(O)O-。
Ra較佳為直鏈狀C5-9烷基、直鏈狀C13-17烯基或直鏈狀C17二烯基。
Rb較佳為直鏈狀C4-8烷基。
Rc較佳為氫原子或直鏈狀C4-7烷基。
Rd較佳為氫原子或直鏈狀C3-6烷基。
Re較佳為直鏈狀C3-6烷基。
Rf較佳為直鏈狀C3-7烷基。
化合物(I)之較佳具體例如以下所述。
化合物(I-A)：n1為3至5之整數，n2為0，n3為0至2之整數，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C5-9烷基，Rb為直鏈狀C4-8烷基，Rc為氫原子，Rd為氫原子，Re為直鏈狀C3-6烷基，Rf為直鏈狀C3-7烷基之化合物。
化合物(I-B)：n1為3至5之整數，n2為0或1，n3為0或1，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C5-9烷基，Rb為直鏈狀C4-8烷基，Rc為直鏈狀C5-7烷基，Rd為氫原子，Re為直鏈狀C3-6烷基，Rf為直鏈狀C3-7烷基之化合物。
化合物(I-C)：n1為3至5之整數，n2為0或1，n3為0至2之整數，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C5-9烷基，Rb為直鏈狀C4-8烷基，Rc為氫原子，Rd為直鏈狀C3-6烷基，Re為直鏈狀C3-6烷基，Rf為直鏈狀C3-7烷基之化合物。
化合物(I-D)：n1為3至5之整數，n2為0或1，n3為0至2之整數，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C13-17烯基或直鏈狀C17二烯基，Rb為直鏈狀C3-6烷基，Rc為直鏈狀C3-6烷基，Rd為氫原子，Re為直鏈狀C2-6烷基，Rf為直鏈狀C2-7烷基之化合物。
化合物(I)之更佳具體例如以下所述。
化合物(a)：n1為3或4，n2為0，n3為0或2，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C7烷基，Rb為直鏈狀C6烷基，Rc為氫原子，Rd為氫原子，Re為直鏈狀C5-6烷基，Rf為直鏈狀C6-7烷基之化合物。
化合物(b)：n1為3至5之整數，n2為0或1，n3為0或1，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C6-7烷基，Rb為直鏈狀C5-6烷基，Rc為直鏈狀C5-6烷基，Rd為氫原子，Re為直鏈狀C4-5烷基，Rf為直鏈狀C5-6烷基之化合物。
化合物(c)：n1為3至5之整數，n2為0，n3為2，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C5-9烷基，Rb為直鏈狀C4-8烷基，Rc為氫原子，Rd為直鏈狀C3-5烷基，Re為直鏈狀C3-5烷基，Rf為直鏈狀C3-5烷基之化合物。
化合物(d)：n1為3至5之整數，n2為0或1，n3為0至2之整數，L為-C(O)O-，Ra為直鏈狀C13-17烯基或直鏈狀C17二烯基，Rb為直鏈狀 C3-5烷基，Rc為直鏈狀C3-5烷基，Rd為氫原子，Re為直鏈狀C3-6烷基，Rf為直鏈狀C3-7烷基之化合物。
化合物(I)之特佳具體例如以下所述。
4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯；
癸二酸2-(((4,5-二丁基壬醯基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯；
4,5-二丁基壬酸3-((6-(二甲胺基)己醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯；
4,5-二戊基癸酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯；
4-庚基十一酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
就化合物(I)之鹽而言，以藥理學上可容許之鹽為較佳，例如，可列舉與無機鹼之鹽、與有機鹼之鹽、與無機酸之鹽、與有機酸之鹽、與鹼性或酸性胺基酸之鹽。
就與無機鹼之鹽之較佳例而言，可列舉鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；鋁鹽、銨鹽。較佳為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽，更佳為鈉鹽、鉀鹽。
就與有機鹼之鹽之較佳例而言，可列舉與三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺丁三醇[參(羥基甲 基)甲基胺]、三級丁基胺、環己基胺、苄基胺、二環己基胺、N,N-二苄基伸乙基二胺之鹽。
就與無機酸之鹽之較佳例而言，可列舉與氫氟酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、硫酸、磷酸之鹽。較佳為與鹽酸之鹽、與磷酸之鹽。
就與有機酸之鹽之較佳例而言，可列舉與甲酸、乙酸、三氟乙酸、酞酸、富馬酸、草酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸之鹽。
就與鹼性胺基酸之鹽之較佳例而言，可列舉與精胺酸、離胺酸、鳥胺酸之鹽。
就與酸性胺基酸之鹽之較佳例而言，可列舉與天冬胺酸、麩胺酸之鹽。
本發明中，本發明之化合物可作為陽離子性脂質使用。陽離子性脂質在溶劑或分散介質中能夠與複數的分子共同形成複合體。上述複合體中除本發明之化合物以外，亦可含有其他的成分。就上述其他的成分之例而言，可列舉其他的脂質成分以及核酸。
就上述其他的脂質成分而言，可列舉如可構成脂質粒子之構造脂質。
就此種構造脂質而言，例如，可使用選自下列所構成之群組中的至少1種：
固醇類(例如，膽固醇、膽固醇酯、膽固醇半琥珀酸等)；
磷脂質(例如，磷脂膽鹼(例如，二棕櫚醯基磷脂膽鹼、二硬脂醯基磷脂膽鹼、溶血磷脂膽鹼、二油醯基磷脂膽鹼、棕櫚醯基油醯基磷脂膽鹼、二 棕櫚醯基磷脂膽鹼、二亞麻油醯基磷脂膽鹼、MC-1010(NOF公司)、MC-2020(NOF公司)、MC-4040(NOF公司)、MC-6060(NOF公司)、MC-8080(NOF公司)等)、磷脂絲胺酸(例如，二棕櫚醯基磷脂絲胺酸、二硬脂醯基磷脂絲胺酸、二油醯基磷脂絲胺酸、棕櫚醯基油醯基磷脂絲胺酸等)、磷脂乙醇胺(例如，二棕櫚醯基磷脂乙醇胺、二硬脂醯基磷脂乙醇胺、二油醯基磷脂乙醇胺、棕櫚醯基油醯基磷脂乙醇胺、溶血磷脂乙醇胺等)、磷脂肌醇、磷脂酸等)；及
聚乙二醇脂質(PEG脂質)(例如，PEG-DAA、PEG-DAG、PEG-磷脂質接合物(phospholipid conjugate)、PEG-Cer、PEG-膽固醇(cholesterol)、PEG-C-DOMG、2KPEG-CMG、GM-020(NOF公司)、GS-020(NOF公司)、GS-050(NOF公司)等)。本發明中，就構造脂質而言，以全部使用下述3種為較佳：固醇類(尤其膽固醇)、磷脂質(尤其磷脂膽鹼)及聚乙二醇脂質。
形成本發明之脂質粒子之混合脂質成分中，本發明之化合物與構造脂質之比例，可依照目的或用途而適宜調節。例如，相對於1莫耳之本發明之化合物，構造脂質通常為0.008至4莫耳之比例，較佳為0.4至1.5莫耳之比例。又，若採取其他規定之方法，混合脂質成分中，本發明之化合物通常為1至4莫耳，固醇類通常為0至3莫耳、磷脂質通常為0至2莫耳、聚乙二醇脂質通常為0至1莫耳之比率。在將本發明之化合物與其他脂質成分混合使用之情況的更佳態樣，為本發明之化合物1至1.5莫耳、固醇類0至1.25莫耳、磷脂質0至0.5莫耳及聚乙二醇脂質0至0.125莫耳之比率。
本發明之化合物，可使用於用以製造本發明之脂質粒子。本發明之脂質粒子，意指上述複合體之中，不含有核酸之複合體。本發明之脂質粒子的形狀無特別限定，例如，包含本發明之化合物等所構成球形而集合之複合體，不構成特定的形狀而集合之複合體，溶解於溶劑之複合體，在分散介質中分散為均一或不均一之複合體等。
本發明之脂質粒子(例如，藉由本發明之化合物及其以外的構造脂質所構成之脂質粒子)，可使用例如，用於製造含有該脂質粒子與核酸(尤其，對於醫藥的用途或研究目的用途有用的物質之核酸)的本發明之組成物。本發明之組成物可使用作為醫藥或試藥。本發明之組成物中，盡量越高的比例之核酸內封於脂質粒子(亦即內封率高)者較佳。
「核酸」若為核苷酸及具有與該核苷酸同等功能之分子聚合的分子，任何者皆可，例如，可列舉為核糖核酸之聚合物的RNA、為去氧核糖核酸之聚合物的DNA、核糖核酸及去氧核糖核酸混合之聚合物、及包含核苷酸類似物之核苷酸聚合物，再者，亦可為包含核酸衍生物的核苷酸聚合物。又，核酸可為單股核酸或雙股核酸。又，雙股核酸亦包含針對其中一鏈，另一鏈於嚴苛條件下進行雜交的雙股核酸。
就核苷酸類似物而言，若為與RNA或DNA比較，使核酸酶耐性之提高或安定化，或為提高與互補鏈核酸之親和性，或為提高細胞透過性，或使其可視化，而對核糖核酸、去氧核糖核酸、RNA或DNA施行修飾的分子，任何分子皆可。就核苷酸類似物而言，可為天然存在之分子，亦可為非天然之分子，例如，可列舉糖部修飾核苷酸類似物或磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物等。
就糖部修飾核苷酸類似物而言，若為針對核苷酸之糖之化學構造的一部分或全部，加成或置換任何化學構造物質者，任何者皆可，就其具體例而言，可列舉以2’-O-甲基核糖置換之核苷酸類似物、以2’-O-丙基核糖置換之核苷酸類似物、以2’-甲氧基乙氧基核糖置換之核苷酸類似物、以2’-O-甲氧基乙基核糖置換之核苷酸類似物、以2’-O-[2-(胍鎓)乙基]核糖置換之核苷酸類似物、以2’-氟核糖置換之核苷酸類似物、將糖部置換為N-嗎啉基環之核酸類似物(N-嗎啉基核酸)、藉由在糖部導入架橋構造而具有2個環狀構造之架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)，更具體而言，2’位之氧原子及4’位之碳原子經由亞甲基架橋的鎖人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、及伸乙基架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research,32,e175(2004)]、2’位之碳原子及4’位之碳原子經由醯胺鍵架橋的醯胺架橋構造型人工核酸(Amide-Bridged Nucleic Acids)(AmNA)，再者可列舉肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.,32,624(1999)]、氧基肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.,123，4653(2001)]、及肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.,122,6900(2000)]等。
就磷酸二酯鍵修飾核苷酸類似物而言，只要針對核苷酸之磷酸二酯鍵的化學構造之一部分或全部，加成或置換任何化學物質者，任何者皆可，就其具體例而言，可列舉被硫代磷酸酯鍵置換之核苷酸類似物、被N3’-P5’胺基磷酸酯鍵置換之核苷酸類似物等[細胞工學，16,1463-1473(1997)][RNAi法及反義法，講談社(2005)]。
就核酸衍生物而言，若為了與核酸相比，使核酸酶耐性提高，或為使其安定化，或為提高與互補鏈核酸之親和性，或為提高細胞透過性，或為使其可視化，在該核酸加成其他化學物質的分子，任何分子皆可，就其具體例而言，可列舉5’-多胺加成衍生物、膽固醇加成衍生物、類固醇加成衍生物、膽汁酸加成衍生物、維生素加成衍生物、Cy5加成衍生物、Cy3加成衍生物、6-FAM加成衍生物、及生物素加成衍生物等。
就本發明中之核酸而言，無特別限定，例如，可以為將疾患、症狀、障害，或病的狀態的改善，以及，疾患、症狀、障害或病態的輕減或其發病的予防等(本說明書中，有稱作為「疾患的治療等」)作為目的之核酸，也可以為不寄與在疾患的治療等者而是作為研究用有用之用以調節期望的蛋白質表現之核酸。
關連於疾患之基因或核糖核酸(本說明書中，有稱作為「疾患關連基因」)的情報，可由例如，McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore,Md.)以及National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine(Bethesda,Md.)等取得。
就本發明中之核酸的具體例而言，可列舉例如siRNA、miRNA、miRNA mimic、反義核酸、核糖核酸酵素、mRNA、誘餌(decoy)核酸、適配體(aptamer)。就核酸而言，siRNA、mRNA等RNA或此等經人為的修飾之類似物或衍生物較佳。
本發明中，「siRNA」意指10至30個鹼基(較佳為15至25鹼基)之雙股RNA或其類似物，包含互補的序列者。siRNA較佳為在3’末 端具有1至3個鹼基，再佳為具有2個鹼基之突出鹼基。互補的序列部分可以含有完全地互補的或非互補的鹼基，但較佳為完全地互補的鹼基。
本發明中之siRNA無特別限定，例如，可使用針對疾患關連基因而用以將基因表現減弱(knockdown)之iRNA。疾患關連基因係指與非疾患對照的組織或細胞比較，在患部組織來源的細胞中在異常的程度或在異常的形態中使轉錄或轉譯產物產生任意的基因或核糖核酸。又，就本發明中之siRNA而言，可使用在研究方面有用之用以調節期望的蛋白質的表現之siRNA。
在本發明中，「mRNA」意指包含可轉譯為蛋白質之鹼基序列的RNA。就本發明中之mRNA而言，只要能於細胞內表現期望之蛋白質的mRNA即可，無特別限定。就上述mRNA而言，在醫藥的用途(例如，疾患治療用途)以及/或研究目的用途方面有用之mRNA較佳，就此種mRNA而言，例如，可列舉用以使如螢光素酶之標記蛋白質在細胞內表現之mRNA。
就上述的疾患而言，無特別限定，例如，可列舉以下所述之疾患。「()」內除了記載具體的疾患例的情況之外，表示疾患關連基因之例。就本發明中之核酸而言，也可列舉調節此等疾患的關連基因(或，該等編碼的蛋白質)的表現量之核酸。
(1)血液系疾患〔貧血(CDAN1、CDA1、RPS19、DBA、PKLR、PK1、NT5C3、UMPH1、PSN1、RHAG、RH50A、NRAMP2、SPTB、ALAS2、ANH1、ASB、ABCB7、ABC7、ASAT)，裸淋巴球症候群(TAPBP、TPSN、TAP2、ABCB3、PSF2、RING11、MHC2TA、C2TA、RFX5)，出血不凝 症(TBXA2R、P2RX1、P2X1)、H因子以及類H因子1(Factor-H-like protein 1,FHL-1)因子缺乏症(HF1、CFH、HUS)、V因子以及VIII因子缺乏症(MCFD2)、VII因子缺乏症(F7)、X因子缺乏症(F10)、XI因子缺乏症(F11)、XII因子缺乏症(F12、HAF)、XIIIA因子缺乏症(F13A1、F13A)、XIIIB因子缺乏症(F13B)、范康尼氏頑固性貧血(先天性骨髓發育不全症)(Fanconi's anemia)(FANCA、FACA、FA1、FA、FAA、FAAP95、FAAP90、FLJ34064、FANCB、FANCC、FACC、BRCA2、FANCD1、FANCD2、FANCD，FACD，FAD，FACE，FACE，FANCF，XRCC9，FANCG，BRIP1，BACH1、FANCJ、PHF9、FANCL、FANCM、KIAA1596)、噬血球性淋巴組織球增生症(PRF1、HPLH2、UNC13D、MUNC13-4、HPLH3、HLH3、FHL3)、血友病A(F8、F8C、HEMA)、血友病B(F9、HEMB)、出血性異常(PI、ATT、F5)、白血球缺損(ITGB2、CD18、LCAMB、LAD、EIF2B1、EIF2BA、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B5、LVWM、CACH、CLE、EIF2B4)、鐮狀細胞性貧血(HBB)、地中海型貧血(HBA2、HBB、HBD、LCRB、HBA1)等〕；
(2)炎症性/免疫性疾患〔AIDS(KIR3DL1、NKAT3、NKB1、AMB11、KIR3DS1、IFNG、CXCL12、SDF1)、自體免疫淋巴增生症候群(TNFRSF6、APT1、FAS、CD95、ALPS1A)、合併性免疫功能不全疾病(IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4)、人類免疫不全病毒感染(CCL5、SCYA5、D17S135E、TCP228、IL10、CSIF、CMKBR2、CCR2、DMKBR5、CCCKR5、CCR5)、免疫力不全病(CD3E、CD3G、AICDA、AID、HIGM2、TNFRSF5、CD40、UNG、DGU、HIGM4、TNFSF5、CD40LG、HIGM1、IGM、FOXP3、IPEX、AIID、XPID、PIDX、TNFRSF14B、TACI)、炎症(IL10、IL-1、IL-13、IL-17、IL-23、CTLA4)、嚴重合併性免疫缺失病(JAK3、JAKL、DCLRE1C、 ATREMIS、SCIDA、RAG1、RAG2、ADA、PTPRC、CD45、LCA、IL7R、CD3D、T3D、IL2RG、SCIDX1、SCIDX、IMD4)、關節性風濕病、乾癬、炎症性腸病(例如：克隆氏症、潰瘍性大腸炎等)、薛格連氏症候群、貝西氏病、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、圓盤狀紅斑狼瘡、卡釿特曼氏病、僵直性脊椎炎、多發性肌炎、皮膚肌炎、結節性多發性動脈炎、混合型結締組織疾病、硬皮症、深部紅斑性狼瘡、慢性甲狀腺炎、葛瑞夫氏病、自體免疫性胃炎、I型以及II型糖尿病、自體免疫溶血性貧血、自體免疫性嗜中性球減少症、血小板減少症、異位性皮膚炎、慢性活動性肝炎、重症肌無力症、移植物抗宿主病、愛迪生氏病、異常免疫反應、關節炎、皮膚炎、放射性皮膚炎、原發性膽汁性肝硬化等〕；
(3)代謝/肝臟/腎臟疾患〔類澱粉蛋白神經病變(TTR，PALB)、類澱粉沉積症(APOA1、APP、AAA、CVAP、AD1、GSN、FGA、LYZ、TTR、PALB)，非酒精性脂肪肝炎以及肝纖維症(COL1A1)，肝硬化(KRT18、KRT8、CIRH1A、NAIC、TEX292、KIAA1988)，囊腫纖維化症(CFTR、ABCC7、CF、MRP7)，肝糖貯積症(Glycogen storage disease)(SLC2A2、GLUT2、G6PC、G6PT、G6PT1、GAA、LAMP2、LAMPB、AGL、GDE、GBE1、GYS2、PYGL、PFKM)，肝細胞腺瘤(TCF1、HFN1A、MODY3)、肝衰竭(SCOD1、SCO1)、肝性脂解酵素缺乏症(LIPC)、肝母細胞瘤(CTNNB1、PDFGRL、PDGRL、PRLTS、AXIN1、AXIN、TP53、P53、LFS1、IGF2R、MPRI、MET、CASP8、MCH5)，髓質嚢腫腎病(UMOD、HNFJ、FJHN、MCKD2、ADMCKD2)，苯酮尿症(PAH、PKU1、QDPR、DHPR、PTS)、多囊腫腎及肝的病變(FCYT、PKHD1、APRKD、PDK1、PDK2、PDK4、PDKTS、PRKCSH、G19P1、PCLD、SEC63)2/3〕；
(4)神經系疾患〔ALS(SOD1、ALS2、STEX、FUS、TARDBP、VEGF)、阿茲海默氏症(APP、AAA、CVAP、AD1、APOE、AD2、PSEN2、AD4、STM2、APBB2、FE65L1、NOS3、PLAU、URK、ACE、DCP1、ACE1、MPO、PACIP1、PAXIP1L、PTIP、A2M、BLMH、BMH、PSEN1、AD3)，自閉症(BZRAP1、MDGA2、GLO1、MECP2、RTT、PPMX、MRX16、MRX79、NLGN3、NLGN4、KIAA1260、AUTSX2)，脆弱X染色體症候群(FMR2、FXR1、FXR2、mGLUR5)、杭丁頓氏症(HD、IT15、PRNP、PRIP、JPH3、JP3、HDL2、TBP、SCA17)、帕金森氏症(NR4A2、NURR1、NOT、TINUR、SNCAIP、TBP、SCA17、SNCA、NACP、PARK1、PARK4、DJ1、DBH、NDUFV2)、雷特氏症候群(MECP2、RTT、PPMX、MRX16、MRX79、CDKL5、STK9)、思覺失調症(GSK3,5-HTT、COMT、DRD、SLC6A3、DAOA、DTNBP1)、分泌酶相關障礙(APH-1)等〕；
(5)眼疾患〔老年黃斑部病變(Abcr、Ccl2、cp、Timp3、組織蛋白酶(cathepsin)D、Vldlr、Ccr2)、白內障(CRYAA、CRYA1、CRYBB2、CRYB2、PITX3、BFSP2、CP49、CP47、PAX6、AN2、MGDA、CRYBA1、CRYB1、CRYGC、CRYG3、CCL、LIM2、MP19、CRYGD、CRYG4、BSFP2、CP49、CP47、HSF4、CTM、MIP、AQP0，CRYAB，CRYA2、CTPP2、CRYBB1、CRYGD、CRYG4、CRYA1、GJA8、CX50、CAE1、GJA3、CX46、CZP3、CAE3、CCM1、CAM、KRIT1)、角膜混濁(APOA1、TGFB1、CSD2、CDGG1、CSD、BIGH3、CDG2、TASTD2、TROP2、M1S1、VSX1、RINX、PPCD、PPD、KTCN、COL8A2、FECD、PPCD2、PIP5K3、CFD)、先天性遺傳性扁平角膜(KERA、CNA2)、青光眼(MYOC、TIGR、GLC1A、JOAG、GPOA、OPTN、GLC1E、FIP2、HYPL、NRP、CYP1B1、GLC3A、OPA1、NTG、NPG、CYP1B1、GLC3A)、萊伯氏先天性黑蒙症(CRB1、RP12、CRX、 CORD2、CRD、RPGRIP1、LCA6、CORD9、RPE65、RP20、AIPL1、LCA4、GUCY2D、GUC2D、LCA1、CORD6、RDH12、LCA3)、黃斑部失養症(ELOVL4、ADMD、STGD2、STGD3、RDS、RP7、PRPH2、PRPH、AVMD、AOFMD、VMD2)等〕；
(6)腫瘤性疾病〔惡性腫瘤、新生血管性青光眼、嬰幼兒血管瘤、多發性骨髓瘤、慢性肉瘤、轉移性黑色素瘤、卡波西氏肉瘤、血管增生、惡病質、乳癌轉移等、癌(例如，大腸癌(例如，家族性大腸癌、遺傳性非息肉大腸直腸癌、胃腸道基質瘤等)、肺癌(例如，非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮細胞瘤等)、間皮瘤、胰臟癌(例如，胰管癌等)、胃癌(例如，乳突腺癌、黏液性腺癌、腺鱗狀上皮癌細胞等)、乳癌(例如，浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、發炎性乳癌等)、卵巣癌(例如，卵巢上皮細胞癌、性腺外生殖細胞瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、卵巢低惡性瘤等)、前列腺癌(例如，賀爾蒙依賴性前列腺癌、賀爾蒙非依賴性前列腺癌等)、肝臟癌(例如，原發性肝癌、肝外膽管癌等)、甲狀腺癌(例如：甲狀腺髓質癌等)、腎臟癌(例如，腎細胞癌、腎盂和輸尿管之過濾性上皮細胞癌等)、子宮癌、腦腫瘤(例如，松果體星細胞瘤、毛狀星細胞瘤、瀰漫性星形細胞瘤、退行性星細胞瘤等)、黑色素瘤、肉瘤、膀胱癌、包含多發性骨髓瘤之血液癌等，垂體腺瘤、神經膠質瘤、聽神經瘤、網膜肉瘤、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺瘤、食道癌、十二指腸癌、結腸癌、直腸癌、肝細胞癌、胰臟神經內分泌腫瘤、膽管癌、膽囊癌、陰莖癌、輸尿管癌、睪丸瘤、陰門癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮肉瘤、絨毛性疾病、陰道癌、皮膚癌、蕈狀肉芽腫、基底細胞癌、軟組織肉瘤、惡性淋巴肉瘤、霍奇金氏病、骨髓增生異常症候群、成年型T細胞 白血病、慢性骨髓增生性疾病、胰臟神經內分泌腫瘤、纖維性組織細胞瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、原發位置不明癌症等)、白血病(例如，急性白血病(例如，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病等)、慢性白血病(例如，慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病等)、骨髓形成症候群等)、子宮肉瘤(例如，子宮中胚葉混合瘤、子宮平滑肌肉瘤、子宮內膜基質肉瘤等)、骨髓纖維化等〕。
就醫藥而言的本發明之組成物，可使用藥學上許容的担體，在製劑技術領域中藉由公知的方法製造。就上述醫藥的劑型而言，例如，可列舉配合緩衝劑以及/或安定劑等慣用助劑之非經口投與用製劑(例如，注射劑等的液劑)、慣用的醫藥用担體所配合的軟膏、乳霜、液劑或膏藥等局部用製劑。
本發明之組成物可使用來將活性成分導入多數種類的細胞、組織或臟器。就可適用本發明之組成物的細胞而言，例如，可列舉脾細胞、神經細胞、神經膠細胞、胰臟B細胞、骨髓細胞、繫膜細胞、蘭格漢氏細胞、表皮細胞、上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、纖維細胞、肌細胞(例如，骨格肌細胞、心肌細胞、肌母細胞、肌衛星細胞)、脂肪細胞、免疫細胞(例如，巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺手細胞、肥胖細胞、嗜中性白血球、嗜鹼性球、嗜酸性球、單核球、巨核細胞)、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨母細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞或間質細胞、卵細胞、精細胞、或可分化誘導為此等細胞之前驅細胞、幹細胞(包含例如，誘導多能性幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞))、造血細胞、卵母細胞、受精卵。又，就可適用本發明之組成物的組織或臟器而言，為上述的 細胞存在之所有組織或臟器，例如，可列舉腦、腦的各部位(例如，嗅球、扁桃狀核、大腦基底核、海馬迴、視丘、下視丘、下視丘核、大腦皮質、延髓、小腦、枕葉、額葉、顳葉、殼核、尾狀核、胼胝體、黑質)、脊髓、垂體、胃、胰臟、腎臟、肝臟、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化管(例如，大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾臟、頜下腺、末梢血液、末梢血球、前列腺、睪丸、精巢、卵巣、胎盤、子宮、骨骼、關節以及骨骼肌。此等的細胞、組織或臟器可為癌化的癌細胞或癌組織等。
在本發明的一個實施態樣中，本發明之組成物係用以將作為活性成分的核酸導入心肌細胞以外的細胞、心臟以外的組織或臟器而使用。
本發明之組成物，尤其，將核酸導入癌細胞的效率優異。
本發明之化合物、脂質粒子以及組成物，由於安定且低毒性可安全地使用。將本發明之組成物在活體內(in vivo)使用的情況，乃至作為醫藥使用的情況，針對投與對象(例如，人類或非人類哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、犬、牛、羊、猴)(較佳為人類))，核酸的有效量係以送達至作為標的的細胞而投與該組成物即可。
本發明之組成物在活體內(in vivo)使用的情況，乃至作為醫藥使用的情況，可以藉由例如，錠劑(包含糖衣錠、膜塗佈錠、舌下錠、口腔內崩散錠)、散劑、顆粒劑、膠囊錠(包含軟膠囊、微膠囊)、液劑、口含錠、糖漿、乳劑、懸濁劑、注射劑(例如，皮下注射劑、靜脈內注射劑、肌肉內注射劑、腹腔內注射劑等)、外用劑(例如，經鼻投與製劑、經皮製劑、 軟膏劑)、栓劑(例如，直腸栓劑、陰道栓劑)、小粒、經鼻劑、經肺劑(吸入劑)、點滴劑等醫藥製劑，以經口的或非經口的(例如，局部、直腸、靜脈投與等)方式安全地投與。此等的製劑可以為速釋性製劑或緩釋性製劑等釋出調控製劑(例如，緩釋性微膠囊)。
以下，關於本發明之化合物的製造方法加以說明。
以下之製造方法中各步驟所用之原料或試藥，以及所得的化合物，可分別形成鹽。就此種鹽而言，例如，可列舉與前述之本發明之化合物中的鹽相同者。
在各步驟中所得到之化合物為游離化合物的情況，可依照周知之方法，變換為目的之鹽。相反地在各步驟中所得到之化合物為鹽的情況，可依照周知之方法，變換為游離體或為目的之其他種類的鹽。
各步驟中所得到之化合物，可以反應液原樣，或得到粗生成物後，用於後續之反應，或者亦可將各步驟中所得到之化合物，依照常法，從反應混合物中藉由濃縮、晶析、再結晶、蒸餾、溶劑萃取、分餾、層析等分離手段進行單離及/或精製。
在各步驟之原料或試藥之化合物為市售的情況，可原樣使用市售品。
在各步驟之反應中，反應時間雖可隨所用之試藥或溶劑而異，然而在無特別記載之情況，通常為1分鐘至48小時，較佳為10分鐘至8小時。
在各步驟之反應中，反應溫度雖可隨所用之試藥或溶劑而異，然而在無特別記載之情況，通常為-78℃至300℃，較佳為-78℃至150℃。
在各步驟之反應中，壓力雖可隨所用之試藥或溶劑而異，然而在無特別記載的情況，通常為1氣壓至20氣壓，較佳為1氣壓至3氣壓。
在各步驟之反應中，例如，使用Biotage公司製Initiator等微波(Microwave)合成裝置。反應溫度雖可隨所用的試藥或溶劑而異，然而在無特別記載之情況，通常為室溫至300℃，較佳為室溫至250℃，更佳為50℃至250℃。反應時間雖可隨所用之試藥或溶劑而異，然而在無特別記載的情況，通常為1分鐘至48小時，較佳為1分鐘至8小時。
在各步驟之反應中，試藥在無特別記載的情況，相對於基質，可使用0.5當量至20當量，較佳為0.8當量至5當量。在將試藥作為觸媒使用的情況，試藥相對於基質，可使用0.001當量至1當量，較佳為0.01當量至0.2當量。在試藥兼為反應溶劑之情況，試藥可以溶劑量使用。
在各步驟之反應中，無特別記載的情況，此等反應可於無溶劑，或溶解或懸浮於適當溶劑中而進行。就溶劑之具體例而言，可列舉實施例中記載的溶劑，或以下者。
醇類：甲醇、乙醇、異丙醇、異丁醇、三級丁醇、2-甲氧基乙醇等；
醚類：二乙基醚、二異丙基醚、二苯基醚、四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、環戊基甲基醚等；
芳香族烴類：氯苯、甲苯、二甲苯等；
飽和烴類：環己烷、己烷、庚烷等；
醯胺類：N,N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮等；
鹵化烴類：二氯甲烷、四氯化碳等；
腈類：乙腈等；
亞碸類：二甲基亞碸等；
芳香族有機鹼類：吡啶等；
酸酐類：乙酸酐等；
有機酸類：甲酸、乙酸、三氟乙酸等；
無機酸類：鹽酸、硫酸等；
酯類：乙酸乙酯、乙酸異丙酯等；
酮類：丙酮、甲基乙基酮等；
水。
上述溶劑亦可將二種以上以適宜之比例混合而使用。
在各步驟之反應中使用鹼的情況，例如，可使用以下所示之鹼、或實施例所記載之鹼。
無機鹼類：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂等；
鹼性鹽類：碳酸鈉、碳酸鈣、碳酸氫鈉等；
有機鹼類：三乙基胺、二乙基胺、N,N-二異丙基乙基胺、吡啶、4-二甲基胺基吡啶、N,N-二甲基苯胺、1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷、1,8-二氮雜雙環[5.4.0]-7-十一烯、咪唑、哌啶等；
金屬烷氧化物類：乙醇鈉、三級丁醇鉀、三級丁醇鈉等；
鹼金屬氫化物類：氫化鈉等；
金屬胺化物類：胺化鈉、二異丙基胺化鋰、六甲基二矽基胺化鋰等；
有機鋰類：正丁基鋰、二級丁基鋰等。
在各步驟之反應中使用酸或酸性觸媒的情況，例如，可使用以下所示之酸或酸性觸媒、或實施例所記載的酸或酸性觸媒。
無機酸類：鹽酸、硫酸、硝酸、氫溴酸、磷酸等；
有機酸類：乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、對甲苯磺酸、10-樟腦磺酸等；
路易士酸：三氟化硼二乙基醚錯合物、碘化鋅、無水氯化鋁、無水氯化鋅、無水氯化鐵等。
各步驟之反應，只要無特別記載，能以周知之方法，例如，第5版實驗化學講座，13卷至19卷(日本化學會編)；新實驗化學講座，14卷至15卷(日本化學會編)；精密有機化學改定第2版(L.F.Tietze，Th.Eicher，南江堂)；改訂有機人名反應、其結構及要點(東郷秀雄著，講談社)；ORGANIC SYNTHESES Collective Volume I至VII(John Wiley & Sons Inc)；Modern Organic Synthesis in the Laboratory A Collection of Standard Experimental Procedures(Jie Jack Li著，OXFORD UNIVERSITY出版)；Comprehensive Heterocyclic Chemistry III，Vol.1至Vol.14(Elsevier Japan股份有限公司)；按人名反應學習之有機合成戰略(富岡清監譯，化學同人發行)；Comprehensive Organic Transformations(VCH Publishers Inc.)1989年刊等記載的方法、或實施例記載的方法為基準而進行。
在各步驟中，官能基之保護或脫保護反應，可依照周知之方法，例如，Wiley-Interscience公司2007年刊「Protective Groupsin Organic Synthesis，4th Ed.」(Theodora W.Greene，PeterG.M.Wuts著)；Thieme公司2004年刊「Protecting Groups 3rd Ed.」(P.J.Kocienski著)等記載之方法，或實施例中記載的方法為基準而進行。
醇等羥基或酚性羥基之保護基而言，例如，可列舉甲氧基甲基醚、苄基醚、對甲氧基苄基醚、三級丁基二甲基矽基醚、三級丁基二苯基矽基醚、四氫哌喃基醚等醚型保護基；乙酸酯等羧酸酯型保護基；甲磺酸酯等磺酸酯型保護基；碳酸三級丁酯等碳酸酯型保護基等。
就醛之羰基之保護基而言，例如，可列舉二甲基縮醛等縮醛型保護基；環狀1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0028-65
烷等環狀縮醛型保護基等。
就酮之羰基之保護基而言，例如，可列舉二甲基縮酮等縮酮型保護基；環狀1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0028-66
烷等環狀縮酮型保護基；O-甲基肟等肟型保護基；N,N-二甲基腙等腙型保護基等。
就羧基之保護基而言，例如，可列舉甲酯等酯型保護基；N,N-二甲基醯胺等醯胺型保護基等。
就硫醇之保護基而言，例如，可列舉苄基硫醚等醚型保護基；硫代乙酸酯、硫代碳酸酯、硫代胺甲酸酯等酯型保護基等。
就胺基、或咪唑、吡咯、吲哚等芳香族雜環之保護基而言，例如，可列舉苄基胺甲酸酯等胺甲酸酯型保護基；乙醯胺等醯胺型保護基；N-三苯基甲基胺等烷基胺型保護基、甲磺醯胺等磺醯胺型保護基等。
保護基之除去，可採用周知之方法，例如，使用酸、鹼、紫外光、肼、苯基肼、N-甲基二硫胺甲酸鈉、四丁基銨氟化物、乙酸鈀、三烷基矽基鹵化物(例如，三甲基矽基碘化物、三甲基矽基溴化物)的方法或還原法等而進行。
在各步驟中，進行還原反應之情況，就所使用的還原劑而言，可列舉氫化鋁鋰、氫化三乙醯氧基硼鈉、氫化氰基硼鈉、氫化二異丁基鋁(DIBAL-H)、氫化硼鈉、氫化三乙醯氧基硼四甲基銨等金屬氫化物類；硼烷四氫呋喃錯合物等硼烷類；蘭尼鎳；蘭尼鈷；氫；甲酸等。例如，可在氫或甲酸存在下，使用蘭尼鎳或蘭尼鈷。在將碳-碳雙鍵或參鍵還原之情況，為使用鈀-碳或林德拉(Lindlar)觸媒等觸媒的方法。
在各步驟中，進行氧化反應之情況，就所使用的氧化劑而言，可列舉間氯過苯甲酸(MCPBA)、過氧化氫、三級丁基氫過氧化物等過氧類；過氯酸四丁基銨等過氯酸鹽類；氯酸鈉等氯酸鹽類；亞氯酸鈉等亞氯酸鹽類；過碘酸鈉等過碘酸類；氧碘基苯等高原子價碘試藥；二氧化錳、過錳酸鉀等具有錳的試藥；四乙酸鉛等鉛類；氯鉻酸吡啶鎓(PCC)、二鉻酸吡啶鎓(PDC)、瓊斯(Jones)試藥等具有鉻的試藥；N-溴琥珀醯亞胺(NBS)等鹵素化合物類；氧；臭氧；三氧化硫‧吡啶錯合物；四氧化鋨；二氧化硒；2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)等。
在各步驟中，進行自由基環化反應之情況，就所使用的自由基起始劑而言，可列舉偶氮雙異丁腈(AIBN)等偶氮化合物；4-4’-偶氮雙-4-氰基戊酸(ACPA)等水溶性自由基起始劑；空氣或氧存在下之三乙基硼；苄 醯基過氧化物等。又，就所使用之自由基反應試劑而言，可列舉三丁基錫烷、參三甲基矽基矽烷、1,1,2,2-四苯基二矽烷、二苯基矽烷、碘化釤等。
在各步驟中，進行威悌(Wittig)反應之情況，就所使用的威悌(Wittig)試藥而言，可列舉亞烷基磷烷(alkylidene phosphorane)類等。亞烷基磷烷類可依照周知之方法，例如，使鏻鹽與強鹼反應而調製。
在各步驟中，進行霍納爾-埃蒙斯(Horner-Emmons)反應之情況，就所使用的試藥而言，可列舉二甲基磷醯基乙酸甲酯、二乙基磷醯基乙酸乙酯等磷醯基乙酸酯類；鹼金屬氫化物類、有機鋰類等鹼。
在各步驟中，進行傅-克反應(Friedel-Crafts reaction)之情況，就所使用的試藥而言，可列舉路易士酸、醯氯化物或烷基化劑(例如鹵化烷基類、醇、烯烴類等)。或者，亦可使用有機酸或無機酸代替路易士酸，亦可使用乙酸酐等酸酐代替醯氯化物。
在各步驟中，進行芳香族親核置換反應之情況，就試藥而言，可列舉親核劑(例如胺類、咪唑等)及鹼(例如鹼性鹽類、有機鹼類等)。
在各步驟中，進行藉由碳陰離子之親核加成反應、藉由碳陰離子之親核1,4-加成反應(Michael加成反應)、或藉由碳陰離子之親核置換反應的情況，就用於產生碳陰離子之鹼而言，可列舉有機鋰類、金屬烷氧化物類、無機鹼類、有機鹼類等。
在各步驟中，進行格里納(Grignard)反應之情況，就格里納試藥而言，可列舉溴化苯基鎂等鹵化芳基鎂類；溴化甲基鎂、溴化異丙基鎂等鹵化烷基鎂類。格里納試藥，可依照周知之方法，例如以醚或四氫呋喃作為溶劑，藉由使其與鹵化烷基或鹵化芳基，及金屬鎂反應而調製。
在各步驟中進行克腦文蓋爾(Knoevenagel)縮合反應之情況，就試藥而言，可使用持有二個電子吸引基的活性亞甲基化合物(例如丙二酸、丙二酸二乙酯、丙二腈等)及鹼(例如有機鹼類、金屬烷氧化物類、無機鹼類)。
在各步驟中，進行維爾斯邁爾-哈克(Vilsmeier-Haack)反應之情況，就試藥而言，可使用磷醯氯及醯胺衍生物(例如N,N-二甲基甲醯胺等)。
在各步驟中，進行醇類、鹵化烷基類、磺酸酯類之疊氮化反應的情況，就所使用之疊氮化劑而言，可列舉二苯基磷酸基疊氮化物(DPPA)、三甲基矽基疊氮化物、疊氮化鈉等。例如，在將醇類疊氮化之情況，可為使用二苯基磷酸基疊氮化物及1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)之方法或使用三甲基矽基疊氮化物及路易士酸的方法等。
在各步驟中，進行還原性胺基化反應之情況，就所使用之還原劑而言，可列舉氫化三乙醯氧基硼鈉、氫化氰基硼鈉、氫、甲酸等。在基質為胺化合物之情況，就所使用的羰基化合物而言，除三聚甲醛之外，可列舉乙醛等醛類、環己酮等酮類。在基質為羰基化合物之情況，就所使用的胺類而言，可列舉氨、甲基胺等1級胺；二甲基胺等2級胺等。
在各步驟中，進行光延反應之情況，就試藥而言，可使用偶氮二羧酸酯類(例如偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)、偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD)等)及三苯基膦。
在各步驟中，進行酯化反應、醯胺化反應、或脲化反應之情況，就所使用的試藥而言，可列舉醯氯化物、醯溴化物等鹵化醯基體；酸 酐、活性酯體、硫酸酯體等活化羧酸類。就羧酸之活化劑而言，可列舉1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(WSCD)等碳化二亞胺系縮合劑；氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 108128296-A0202-12-0032-63
-2-基)-4-甲基嗎啉鎓-n-水合物(DMT-MM)等三
Figure 108128296-A0202-12-0032-64
系縮合劑；1,1-羰基二咪唑(CDI)等碳酸酯系縮合劑；二苯基磷酸疊氮(DPPA)；苯并三唑-1-基氧基-參二甲基胺基鏻鹽(BOP試藥)；碘化2-氯-1-甲基-吡啶鎓(向山試藥)；亞硫醯氯；氯甲酸乙酯等鹵甲酸低級烷基酯；O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)；硫酸；或此等之組合等。在使用碳化二亞胺系縮合劑之情況、亦可添加1-羥基苯并三唑(HOBt)、N-羥基琥珀醯亞胺(HOSu)、二甲基胺基吡啶(DMAP)等添加劑進一步反應。
在各步驟中，進行偶合反應之情況，就所使用的金屬觸媒而言，可列舉乙酸鈀(II)、肆(三苯基膦)鈀(0)、二氯雙(三苯基膦)鈀(II)、二氯雙(三乙基膦)鈀(II)、參(二亞苄基丙酮)二鈀(0)、氯化1,1’-雙(二苯基膦基)二茂鐵鈀(II)、乙酸鈀(II)等鈀化合物；肆(三苯基膦)鎳(0)等鎳化合物；氯化參(三苯基膦)銠(III)等銠化合物；鈷化合物；氧化銅、碘化銅(I)等銅化合物；鉑化合物等。再者，亦可於反應中加鹼，就此種鹼而言，可列舉無機鹼類、鹼性鹽類等。
在各步驟中，進行硫羰基化反應之情況，就此種硫羰基化劑而言，可使用五硫化二磷為代表，然而除五硫化二磷之外，亦可使用2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二硫雜二磷雜環丁烷-2,4-二硫化物(勞森試藥)等具有1,3,2,4-二硫雜二磷雜環丁烷-2,4-二硫化物構造的試藥。
在各步驟中，進行沃爾-齊格勒(Wohl-Ziegler)反應之情況，就所使用的鹵化劑而言，可列舉N-碘琥珀醯亞胺、N-溴琥珀醯亞胺(NBS)、N-氯琥珀醯亞胺(NCS)、溴、硫醯氯等。再者，藉由於反應中施加熱、光、苄醯基過氧化物、偶氮雙異丁腈等自由基起始劑，可使反應加速。
在各步驟中，進行羥基之鹵化反應的情況，就所使用之鹵化劑而言，為氫鹵酸及無機酸之醯鹵化物，具體而言，氯化方面可列舉鹽酸、亞硫醯氯、氧氯化磷等，溴化方面可列舉48%氫溴酸等。又，亦可使用藉由三苯基膦與四氯化碳或四溴化碳等之作用，從醇得到鹵化烷基體之方法。或者，亦可使用經由2階段反應，即將醇變換為磺酸酯後，與溴化鋰、氯化鋰或碘化鈉反應，合成鹵化烷基體的方法。
在各步驟中，進行阿爾布佐夫(Arbuzov)反應之情況，就所使用之試藥而言，可列舉溴乙酸乙酯等鹵化烷基類；亞磷酸三乙酯或亞磷酸三異丙酯等亞磷酸酯類。
在各步驟中，進行磺酯化反應之情況，就所使用之磺化劑而言，可列舉甲磺醯氯、對甲苯磺醯氯、甲磺酸酐、對甲苯磺酸酐、三氟甲磺酸酐等。
在各步驟中，進行水解反應之情況，就試藥而言，可使用酸或鹼。又，在進行三級丁酯之酸水解反應的情況，為將副產出之三級丁基陽離子以還原方式捕捉，添加甲酸或三乙基矽烷等。
在各步驟中，進行脫水反應之情況，就所使用之脫水劑而言，可列舉硫酸、五氧化二磷、氧氯化磷、N,N’-二環己基碳化二亞胺、礬土、聚磷酸等。
化合物(I)可依照例如以下之製法製造。在本發明中，尤其在酯化時，藉由根據為目的之化合物(I)的構造使用適當之原料，可合成期望之構造的化合物(I)。又，化合物(I)之鹽，可藉由與無機鹼、有機鹼、有機酸、鹼性或酸性胺基酸之適當混合而得到。
Figure 108128296-A0202-12-0034-7
Figure 108128296-A0202-12-0035-8
 以上之式中，P1、P2、P3、P4及P6，各自獨立地表示保護基，
化合物(A)表示式：
Figure 108128296-A0202-12-0035-9
化合物(B)表示：
Figure 108128296-A0202-12-0035-10
、R1表示
Figure 108128296-A0202-12-0035-11
，
化合物(C)表示：
Figure 108128296-A0202-12-0036-12
、R2表示
Figure 108128296-A0202-12-0036-13
，其他各記號表示與前述相同意義。
以下，記載關於含有本發明之化合物的脂質粒子，及含有該脂質粒子及作為活性成分的核酸之核酸導入(轉染)用組成物之製造方法。
本發明之脂質粒子，就陽離子性脂質而言，可將本發明之化合物視需要與其他脂質成分混合後、藉由用於從脂質成分調製脂質粒子的周知方法製造。例如，藉由將上述之(混合)脂質成分溶解於有機溶劑，再將所得到之有機溶劑溶液與水或緩衝液混合(例如，乳化法)，可製造所形成的脂質粒子分散液。上述混合，可使用微小流體混合系統(例如，NanoAssemblr裝置(Precision NanoSystems公司))進行。所得到之脂質粒子，可付諸於脫鹽或透析及滅菌過濾。又，視需要可進行pH調整、滲透壓調整。
化合物(I)可藉由式(I)之n1、n2、n3、L、Ra、Rb、Rc、Rd、Re、及Rf之定義的組合，取得複數種構造。在脂質粒子之製造中，就化合物(I)而言，可單獨使用具有特定構造的1種化合物，亦可形成構造相異之複數種化合物的混合物使用。
就「其他脂質成分」而言，如前述構造脂質，例如，可列舉固醇類、磷脂質、聚乙二醇脂質。「其他脂質成分」，例如，相對於1莫耳之本發明之化合物，可使用0.008至4莫耳。本發明之化合物，與其他脂質成分(尤其膽固醇、磷脂膽鹼、及聚乙二醇脂質)混合使用為較佳。使用 本發明之化合物與其他脂質成分混合之情況的較佳態樣，為本發明之化合物1至4莫耳、固醇類0至3莫耳、磷脂質0至2莫耳及聚乙二醇脂質0至1莫耳之混合物。使用本發明之化合物與其他脂質成分混合之情況的更佳態樣，為本發明之化合物1至1.5莫耳、固醇類0至1.25莫耳、磷脂質0至0.5莫耳及聚乙二醇脂質0至0.125莫耳之混合物。
前述之有機溶劑溶液中的本發明之化合物，或本發明之化合物與其他脂質成分之混合物的濃度，較佳為0.5至100mg/mL。
就有機溶劑而言，例如，可列舉甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、三級丁醇、丙酮、乙腈、N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、或此等之混合物。有機溶劑亦可含有0至20%之水或緩衝液。
就緩衝液而言，可列舉酸性緩衝液(例如，乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)緩衝液、磷酸緩衝液)、中性緩衝液(例如，4-(2-羥基乙基)-1-哌
Figure 108128296-A0202-12-0037-62
乙磺酸(HEPES)緩衝液、參(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS))。
在使用微小流體混合系統進行混合之情況，相對於有機溶劑溶液1容積份，以混合水或緩衝液1至5容積份為較佳。又，在該系統中，混合液(有機溶劑溶液與水或與緩衝液之混合液)流速為例如0.01至20mL/分鐘，較佳為0.1至10mL/分鐘，溫度為例如5至60℃，較佳為15至45℃。
本發明之組成物，在製造脂質粒子或脂質粒子分散液時，藉由在水或緩衝液中添加核酸，可製造包含核酸之脂質粒子分散液。核酸以 在水或緩衝液中之核酸的濃度為例如0.01至20mg/mL，較佳為0.05至2.0mg/mL之情況添加為較佳。
又，本發明之組成物，與脂質粒子或脂質粒子分散液、及核酸或其水溶液，藉由周知之方法混合，亦可製造包含活性成分的脂質粒子分散液。脂質粒子分散液，可藉由使脂質粒子分散於適當分散介質中而調製。又，活性成分之水溶液可藉由使活性成分溶解於適當溶劑中而調製。
除分散介質及溶劑外的本發明之組成物中的本發明之化合物之含量，通常為10至70重量%，較佳為40至70重量%。
除分散介質及溶劑外的本發明之組成物中的核酸之含量，通常為0.1至25重量%，較佳為1至20重量%。
包含脂質粒子分散液或組成物的分散液之分散介質，可藉由透析置換為水或緩衝液。透析方面係使用分劃分子量10至20K之超過濾膜，於4℃至室溫實施。亦可重複進行透析。分散介質之置換，亦可使用切向流動過濾(TFF)。又，分散介質之置換後，視需要可進行pH調整、滲透壓調整。就pH調整劑而言，可列舉例如氫氧化鈉、檸檬酸、乙酸、三乙醇胺、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等。又，就滲透壓調整劑而言，可列舉例如氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀等無機鹽類；甘油、甘露醇、山梨醇等多元醇類；葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖等糖類。pH通常調整至6.5至8.0，較佳為7.0至7.8。滲透壓較佳為調整至250至350Osm/kg。
本發明之組成物中，視需要可包含脂質粒子及核酸以外之成分。就此種成分而言，例如，可列舉適量之安定化劑及抗氧化劑。
就安定化劑而言，無特別限定，例如，可列舉甘油、甘露醇、山梨醇；如果糖、或蔗糖之糖類。
就抗氧化劑而言，可列舉例如抗壞血酸、尿酸、半胱胺酸、生育酚同族體(維生素E、生育酚α、β、γ、δ之4個異構物等)、EDTA、半胱胺酸等。
以下，記載含有本發明之化合物的脂質粒子、及含有該脂質粒子及核酸之組成物的分析方法。
(組成物中之)脂質粒子之粒徑，可藉由周知之手段測定。例如，可使用基於動態光散射測定技術之粒徑測定裝置，Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，藉由本身相關函數之累積量解析，以Z平均粒徑算出。(組成物中之)脂質粒子之粒徑(平均粒徑)，為例如10至200nm，較佳為60至170nm。
本發明之組成物中的核酸(例如siRNA、mRNA)之濃度及內封率，可藉由周知之手段測定。例如，使用Quant-iTTM RiboGreen(註冊商標)(Invitrogen)將核酸進行螢光標識，藉由測定其螢光強度，可求得濃度及內封率。組成物中的核酸之濃度，可使用從已知濃度之核酸水溶液所作成的標準曲線算出，內封率可基於Triton-X100(用於使脂質粒子崩散之界面活性劑)之有無添加導致螢光強度之不同而算出。再者，組成物中之核酸的濃度，意指脂質粒子中所內封之核酸及未內封之核酸的合計濃度，內封率意指組成物中之全部核酸中被脂質粒子內封者的比例。
[實施例]
本發明進一步藉由以下之實施例、製造例及試驗例而詳細地說明，此等並非限定本發明者，又，只要不超出本發明的範圍，可有各種變化。
以下實施例中之「室溫」通常表示約10℃至約35℃。混合溶劑中所示之比，只要無特別說明，表示容量體積。%只要無特別說明，表示重量%。
實施例之管柱層析中的溶出，只要未特別提及，係在藉由TLC(Thin Layer Chromatography，薄層層析)之觀察下進行。在TLC觀察中，就TLC板而言，使用默克(Merck)公司製之60F254，就展開溶劑而言，係使用管柱層析中作為溶出溶劑所用的溶劑。又，檢測方面採用UV檢測器，視需要使用TLC顯色試藥觀察。在矽凝膠管柱層析中，記載為NH之情況，使用胺基丙基矽烷結合矽凝膠，於記載為Diol之情況，使用3-(2,3-二羥基丙氧基)丙基矽烷結合矽凝膠。在分取HPLC(高速液體層析)中，記載為C18之情況，使用十八基結合矽凝膠。溶出溶劑中所表示之比，若非特別聲明，係表示體積比。
1HNMR係以傅立葉(Fourier)變換型NMR測定。1HNMR之解析方面，使用ACD/SpecManager(商品名)軟體等。關於羥基或胺基等之質子峰為非常緩和之峰，並未記載。
MS係藉由LC/MS及MALDI/TOFMS測定。就離子化法而言，使用ESI法、APCI法或、MALDI法。就基質而言，使用CHCA。數據係記載實測值(found)。通常，分子離子峰可觀測，然而亦有形成片段離 子被觀測。在鹽之情況，通常可觀測游離體之分子離子峰、陽離子物種、陰離子物種或片段離子峰。
在以下之實施例中，使用下述之簡稱。
MS：質譜
M：莫耳濃度
N：當量濃度
CDCl3：重氯仿
DMSO-d6：重二甲基亞碸
1HNMR：質子核磁共振
LC/MS：液體層析質量分析計
ESI：電噴灑離子化
APCI：大氣壓下化學離子化
MALDI：基質輔助雷射脫附/離子化
TOFMS：飛行時間質譜術
CHCA：α-氰基-4-羥基桂皮酸
DMF：N,N-二甲基甲醯胺
THF：四氫呋喃
DMAP：4-二甲基胺基吡啶
TBAF：氟化四丁基銨
DIBAL-H：氫化二異丁基鋁
DBU：1,8-二氮雜雙環[5,4,0]十一碳-7-烯
[實施例1]4-庚基十一酸3-((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙酯
A)2-庚基壬酸甲酯
在氮氣流冰冷下，將60%氫化鈉(含有礦油)(3.78g)之脫水DMF(100mL)懸浮液攪拌10分鐘。然後，將丙二酸二甲酯(5.0g)於10℃以下滴入。於同溫度攪拌10分鐘後，滴入1-碘庚烷(18.3mL)，並升溫至室溫。4小時後，將反應混合物以6N鹽酸中和後，以乙酸乙酯稀釋，以飽和食鹽水洗淨2次後，以無水硫酸鈉乾燥，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物溶解於DMSO(75mL)，添加水(0.68mL)、氯化鋰(3.21g)，並升溫至165℃。於同溫度攪拌16小時後，加水，並以乙酸乙酯稀釋。以飽和食鹽水洗淨2次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(8.14g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.90(6 H,m),1.20-1.32(20 H,m),1.36-1.47(2 H,m),1.54-1.62(2 H,m),2.33(1 H,tt,J=9.0,5.4Hz),3.67(3 H,s)
B)2-庚基壬-1-醇
在氮氣流冰冷下，於氫化鋁鋰(2.15g)之脫水THF(92mL)懸浮液中，將2-庚基壬酸甲酯(7.67g)之脫水THF(50mL)溶液滴入，並於10℃以下攪拌1小時。然後升溫至室溫，攪拌3小時。再度冷卻至10℃以下後，少量逐次添加硫酸鈉‧10水合物。以乙酸乙酯稀釋後，將不溶物以矽藻土過濾，減壓餾去溶劑，得到標題化合物(6.91g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.86-0.91(6 H,m),1.16-1.34(25 H,m),1.41-1.49(1 H,m),3.54(2 H,t,J=5.2Hz)
C)2-庚基壬醛
在氮氣流下，將草醯氯(4.9mL)之二氯甲烷(30mL)溶液冷卻至-70℃，並將二甲基亞碸(6.1mL)之二氯甲烷(30mL)溶液保持-60℃以下，同時滴入。於-70℃攪拌15分鐘後，將2-庚基壬-1-醇(6.9g)之二氯甲烷(25mL)溶液保持於-60℃以下，同時滴入。於-70℃攪拌2小時後，添加三乙基胺(23.8mL)並升溫至室溫。添加飽和氯化銨水溶液進行分液操作後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(6.06g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.85-0.92(6 H,m),1.19-1.33(20 H,m),1.37-1.47(2 H,m),1.56-1.65(2 H,m),2.18-2.25(1 H,m),9.55(1 H,d,J=3.2Hz)
D)4-庚基十一碳-2-烯酸乙酯
在氮氣流冰冷下，將60%氫化鈉(含有礦油)(1.4g)之脫水THF(70mL)懸浮液攪拌10分鐘。然後，將(二乙氧基磷酸基)乙酸乙酯(16.8g)於10℃以下滴入。在同溫度攪拌10分鐘後，滴入2-庚基壬醛(6.0g)之脫水THF(60mL)溶液，並升溫至室溫。短暫攪拌後，升溫至50℃。攪拌6小時後，將反應混合物調至5℃以下，添加水後，以乙酸乙酯稀釋，以飽和食鹽水洗淨2次後、以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(5.4g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.87(6 H,t,J=6.0Hz),1.16-1.34(25 H,m),1.37-1.45(2 H,m)2.07-2.15(1 H,m),4.19(2 H,q,J=7.5Hz),5.75(1 H,d,J=16.0Hz),6.75(1 H,dd,J=16.0,10.0Hz)
E)4-庚基十一酸
在4-庚基十一碳-2-烯酸乙酯(5.40g)之乙醇(100mL)溶液中，於室溫添加10%Pd/碳(1.08g)，並於氫蒙氣下，攪拌20小時。反應後，過濾除去Pd/碳後，於減壓下餾去溶劑。在所得到之殘餘物中添加8N氫氧化鈉水溶液(6.38mL)之乙醇(20mL)溶液，並於60℃攪拌5小時。於減壓下餾去溶劑後，以6N鹽酸調成酸性。將殘餘物以己烷稀釋，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下餾去溶劑，得到標題化合物(4.73g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.88(6 H,t,J=7.5Hz),1.17-1.41(25 H,m),1.16-1.34(2 H,m),2.22-2.34(2 H,m)
F)2-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2-(羥基甲基)丙-1,3-二醇
在2,2-雙(羥基甲基)丙-1,3-二醇(5.0g)、1H-咪唑(2.5g)及DMF(200mL)之混合物中，於室溫添加三級丁基氯二苯基矽烷(5.1g)之DMF(10mL)溶液。攪拌18小時後，將反應混合物於減壓下濃縮。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以水洗淨3次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(6.4g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 1.07(9 H,s),2.34(3 H,t,J=5.5Hz),3.67(2H,s),3.74(6 H,d,J=5.7Hz),7.39-7.48(6 H,m),7.63-7.67(4 H,m)
G)(5-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0044-61
烷-5-基)甲醇
在2-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2-(羥基甲基)丙-1,3-二醇(3.5g)、2,2-二甲氧基丙烷(1.5g)之丙酮(35mL)溶液中，於室溫添加對甲苯磺酸一水合物(89mg)。攪拌2小時後，在反應混合物中添加稀氨水中和後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(2.7g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 1.07(9 H,s),1.27(3 H,s),1.41(3 H,s),2.12-2.18(1 H,m),3.69-3.78(8 H,m),7.38-7.47(6 H,m),7.65-7.69(4 H,m)
H)4-庚基十一酸(5-(羥基甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0045-59
烷-5-基)甲酯
在(5-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0045-60
烷-5-基)甲醇(3.56g)、DMAP(1.37g)及4-庚基十一酸(3.18g)之DMF(30mL)溶液中，於50℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(2.47g)。攪拌6小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。在所得到之殘餘物(6.15g)之THF(20mL)溶液中，於室溫添加TBAF之THF溶液(1M,10.3mL)。攪拌4小時後，將反應混合物減壓下濃縮。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以水洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(2.34g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.88(6 H,t,J=6.9Hz),1.22-1.32(25 H,m),1.42(6 H,s),1.57-1.62(2 H,m),2.30-2.35(2 H,m),3.48(2 H,d,J=6.6Hz),3.71-3.73(4 H,m),4.25(2 H,s)
I)4-庚基十一酸(5-(((5-二甲基胺基)戊醯基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0046-56
烷-5-基)甲酯
在4-庚基十一酸(5-(羥基甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0046-57
烷-5-基)甲酯(1.2g)、DMAP(0.94g)及5-(二甲基胺基)戊酸鹽酸鹽(0.74g)之DMF(30mL)溶液中，於40℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.94g)。攪拌4小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(1.37g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.88(6 H,t,J=6.9Hz),1.20-1.32(25 H,m),1.42(6 H,s),1.45-1.52(2 H,m),1.54-1.67(4 H,m),2.21(6 H,s),2.23-2.31(4 H,m),2.35(2 H,t,J=7.5Hz),3.75(4 H,s),4.11(2 H,s),4.12(2 H,s)
J)4-庚基十一酸3-((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯氧基)甲基)丙酯
在4-庚基十一酸(5-(((5-二甲基胺基)戊醯基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0046-58
烷-5-基)甲酯(1.37g)中添加乙酸(6.85mL)、水(3.43mL)，並於70℃攪拌2小時後，於減壓下餾去溶劑。在殘餘物中添加乙酸乙酯、飽和碳酸氫鈉水溶液，攪拌2小時。以水洗淨2次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於 減壓下餾去溶劑。在所得到之殘餘物(400mg)中，添加DMAP(478mg)及辛酸(327mg)之DMF(4mL)溶液後，於50℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(478mg)。攪拌4小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以飽和碳酸鈉水溶液洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(300mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.86-0.91(12 H,m),1.15-1.34(45 H,m),1.45-1.52(2 H,m),1.53-1.66(4 H,m),2.20(6 H,s),2.23-2.36(10 H,m),4.11(8 H,s)
[實施例8]雙(2-己基辛酸)2-(((6-(二甲基胺基)己醯基)氧基)甲基-2-((辛醯基氧基)甲基)丙-1,3-二酯
A)2-己基辛酸
在氮氣流冰冷下，將60%氫化鈉(含有礦油)(3.78g)之脫水DMF(90mL)懸浮液攪拌10分鐘。然後，將丙二酸二甲酯(5.0g)於10℃以下滴入。在同溫度攪拌10分鐘後，滴入1-碘己烷(16.8mL)，並升溫至室溫。8小時後，在反應混合物中添加乙酸(1mL)後，以乙酸乙酯稀釋，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物溶解於EtOH(80mL)，添加8N氫氧化鈉水溶液(25mL)，並於60℃攪拌6小時。以6N鹽酸中和後，以乙酸乙酯稀釋，以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物於160℃加熱1.5小時，冷卻至室溫後，藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(7.45g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.92(6 H,m),1.22-1.35(16 H,m),1.38-1.52(2 H,m),1.56-1.67(2 H,m),2.34(1 H,ddd,J=8.7,5.4,3.3Hz)
B)(2-(4-甲氧基苯基)-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0048-54
烷-5,5-二基)二甲醇
將2,2-雙(羥基甲基)丙-1,3-二醇(506g)之水(2.0L)溶液於50℃攪拌。添加濃鹽酸(18mL)，將對甲氧基苄醛(474mL)於約30℃以3小時滴入。然後，將反應液於25℃攪拌5小時。添加2N氫氧化鈉水溶液(120mL)，並攪拌1小時。過濾結晶，以水洗淨後，以乙酸乙酯/己烷再結晶，得到標題化合物(769g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ ppm 3.24(2 H,d,J=5.0Hz),3.67(2 H,d,J=5.4Hz),3.74(3 H,s),3.77(2 H,d,J=11.3Hz),3.88(2 H,t,J=11.3Hz),4.53(1 H,t,J=5.4Hz),4.62(1 H,t,J=5.0Hz),5.34(1 H,s),6.90(2 H,d,J=8.9Hz),7.33(2 H,d,J=8.9Hz)
C)9-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-2,4,8,10-四氧雜螺[5.5]十一烷
在(2-(4-甲氧基苯基)-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0048-55
烷-5,5-二基)二甲醇(2.00g)、2,2-二甲氧基丙烷(2.46g)之DMF(8mL)溶液中，於室溫添加吡啶鎓對甲苯磺酸鹽(20mg)。攪拌4小時後，將反應混合物以乙酸乙酯稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨2次後，以無水硫酸鎂乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物以乙酸乙酯/己烷再結晶，得到標題化合物(1.62g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ ppm 1.34(6 H,s),3.33(2 H,s),3.63(2 H,d,J=11.7Hz),3.74(3 H,s),3.99(2 H,s),4.12(2 H,d,J=11.7Hz),5.37(1 H,s),6.90(2 H,d,J=8.8Hz),7.34(2 H,d,J=8.8Hz)
D)(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0049-51
烷-5-基)甲醇
在9-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-2,4,8,10-四氧雜螺[5.5]十一烷(22.0g)之甲苯(200mL)懸浮溶液中，將1.5M DIBAL-H溶液(60mL)於5至20℃滴入，並於15℃攪拌3小時。添加甲醇(22mL)後，依序滴入2N氫氧化鈉水溶液(100mL)、4N氫氧化鈉水溶液(200mL)。攪拌1.5小時後，分取甲苯層，以5%食鹽水洗淨。於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(14.7g)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ ppm 1.29(3 H,s),1.29(3 H,s),3.35(2 H,s),3.39(2 H,d,J=5.1Hz),3.61(4 H,s),3.74(3 H,s),4.38(2 H,s),4.59(1 H,t,J=5.1Hz),6.90(2 H,d like,J=7.5Hz),7.24(2 H,d like,J=7.5Hz)
E)辛酸(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0049-52
烷-5-基)甲酯
在(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0049-53
烷-5-基)甲醇(2.00g)、DMAP(412mg)及辛烷酸(1.27g)之DMF(20mL)溶液中，於50℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(1.94g)。攪拌4小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨 1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(2.78g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.91(3 H,m),1.22-1.33(8 H,m),1.40(6 H,s),1.53-1.61(2 H,m),2.26(2 H,t,J=7.6Hz),3.39(2 H,s),3.68-3.74(2 H,m),3.76-3.80(2 H,m),3.80(3 H,s),4.15(2 H,s),4.42(2 H,s),6.87(2 H,d,J=7.8Hz),7.20-7.24(2 H,m)
F)辛酸3-羥基-2-(羥基甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯
在辛酸(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0050-50
烷-5-基)甲酯(754mg)之THF(6mL)溶液中，添加1N鹽酸(6mL)，並於室溫攪拌6小時。添加飽和碳酸氫鈉水溶液或2N氫氧化鈉水溶液(4mL)後，以乙酸乙酯萃取，以水及飽和食鹽水洗淨。將此一連串操作重複4次，至脫保護完成為止。反應完成後，於減壓下餾去溶劑，得到標題化合物(608mg)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ ppm 0.85(3 H,t,J=7.3Hz),1.15-1.30(9 H,m),1.40-1.50(2 H,m),2.22(2 H,t,J=7.5Hz),3.31(2 H,s),3.39(4 H,d,J=5.4Hz),3.76(3 H,s),3.95(2 H,s),4.35(2 H,s),4.43(2 H,t,J=5.4Hz),6.89(2 H,d,J=6.6Hz),7.21(2 H,d,J=6.6Hz)
G)雙(2-己基辛酸)2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2-((辛醯基氧基)甲基)丙-1,3-二酯
在辛酸3-羥基-2-(羥基甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯(2.0g)、DMAP(0.64g)及2-己基辛酸(2.63g)之DMF(20mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(2.41g)。在室溫攪拌 15小時後，於反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(3.48g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.91(15 H,m),1.19-1.33(42 H,m),1.37-1.47(4 H,m),1.51-1.61(4 H,m),2.24(2 H,t,J=7.6Hz),2.32(2 H,br t,J=5.4Hz),3.41(2 H,s),3.80(3 H,s),4.08-4.16(6 H,m),4.39(2 H,s),6.86(2 H,d,J=7.6Hz),7.19(2 H,d,J=8.8Hz)
H)雙(2-己基辛酸)2-(羥基甲基)-2-((辛醯氧基)甲基)丙-1,3-二酯
在雙(2-己基辛酸)2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2-((辛醯基氧基)甲基)丙-1,3-二酯(3.48g)之乙醇(30mL)溶液中，於室溫添加10%Pd/碳(280mg)，並於氫蒙氣下攪拌7小時。反應後，將Pd/碳過濾除去後，於減壓下餾去溶劑。藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(1.68g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.91(15 H,m),1.19-1.33(42 H,m),1.41-1.51(4 H,m),1.54-1.63(4 H,m),2.30-2.38(4 H,m),2.61-2.64(1 H,m),3.48(2 H,d,J=7.3Hz),4.08-4.14(6 H,m)
I)雙(2-己基辛酸)2-(((6-(二甲基胺基)己醯基)氧基)甲基-2-((辛醯基氧基)甲基)丙-1,3-二酯
在雙(2-己基辛酸)2-(羥基甲基)-2-((辛醯基氧基)甲基)丙-1,3-二酯(600mg)、DMAP(54mg)及6-(二甲基胺基)己酸(280mg)之DMF(6mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(303 mg)。在40℃攪拌15小時後，於反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。藉由矽凝膠管柱層析(NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(513mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.92(15 H,m),1.19-1.34(42 H,m),1.39-1.50(6 H,m),1.52-1.73(8 H,m),2.21(6 H,s),2.21-2.35(8 H,m),4.10(8 H,s)
[實施例10]4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙酯
A)3-丁基庚-2-烯酸乙酯
在氮氣流冰冷下，將60%氫化鈉(含有礦油)(3.94g)之脫水THF(100mL)懸浮液攪拌10分鐘。然後，將(二乙氧基磷酸基)乙酸乙酯(23.7g)於10℃以下滴入。在同溫度攪拌10分鐘後，添加壬-5-酮(10.0g)並升溫至室溫。短暫攪拌後，升溫至50℃。攪拌10小時後，將反應混合物調至5℃以下，添加水後，以乙酸乙酯稀釋，以飽和食鹽水洗淨2次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(4.47g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.92(6 H,td,J=7.3,3.2Hz),1.25-1.47(11 H,m),2.14(2 H,td,J=7.6,1.1Hz),2.57-2.62(2 H,m),4.14(2 H,q,J=7.1Hz),5.62(1 H,s)
B)3-丁基庚酸乙酯
在3-丁基庚-2-烯酸乙酯(5.80g)之乙醇(25mL)溶液中，於室溫添加10%Pd/碳(1.50g)，並在氫蒙氣下，攪拌5小時。反應後，將Pd/碳過濾除去後，於減壓下餾去溶劑，得到標題化合物(5.49g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.93(6 H,m),1.21-1.33(15 H,m),1.80-1.88(1 H,m),2.22(2 H,d,J=6.9Hz),4.12(2 H,q,J=7.1Hz)
C)2,3-二丁基庚酸乙酯
在氮氣流下，將二異丙基胺(11.8mL)之脫水THF(59mL)溶液冷卻至-10℃，將1.6M n-BuLi己烷溶液(35.2mL)緩慢滴入。滴入終了後，將反應液調至0℃，攪拌10分鐘。再度冷卻至-10℃，滴入3-丁基庚酸乙酯(5.49g)之脫水THF(16mL)溶液，並於-5℃附近攪拌30分鐘。然後，滴入1-碘丁烷(9.43g)，短暫攪拌後調至室溫。攪拌3小時後，以6N鹽酸中和後，以乙酸乙酯稀釋，以10%硫代硫酸鈉水溶液洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(5.57g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.93(9 H,m),1.17-1.41(20 H,m),1.51-1.65(2 H,m),2.34(1 H,ddd,J=10.6,6.5,3.8Hz),4.07-4.19(2 H,m)
D)2,3-二丁基庚-1-醇
在氮氣流冰冷下，在氫化鋰鋁(1.54g)之脫水THF(66mL)懸浮液中，將2,3-二丁基庚酸乙酯(5.50g)之脫水THF(10mL)溶液滴入。滴入終了後，攪拌10分鐘，回到室溫。攪拌2小時後冷卻至5℃以下，並少量逐次添加 硫酸鈉.10水合物。發泡不再出現後，以乙酸乙酯稀釋，並以矽藻土過濾不溶物。於減壓下餾去溶劑，得到標題化合物(4.67g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.86-0.93(9 H,m),1.12-1.34(19 H,m),1.37-1.46(1 H,m),1.47-1.61(1 H,m),3.49-3.62(2 H,m)
E)2,3-二丁基庚醛
在氮氣流下，將2,3-二丁基庚-1-醇(4.60g)及DBU(6.02mL)之二氯甲烷(46mL)溶液冷卻至-10℃，將N-三級丁基苯亞磺醯亞胺醯氯(6.52g)之二氯甲烷(20mL)溶液保持-5℃以下，同時滴入。於-10℃攪拌3小時後，以1N鹽酸調成酸性。進行分液操作後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(4.11g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.96(9 H,m),1.15-1.39(16 H,m),1.52-1.60(1 H,m),1.62-1.74(2 H,m),2.22-2.27(1 H,m),9.64(1 H,d,J=2.8Hz)
F)4,5-二丁基壬-2-烯酸乙酯
在氮氣流冰冷下，將60%氫化鈉(含有礦油)(1.0g)之脫水THF(41mL)懸浮液攪拌10分鐘。然後，將(二乙氧基磷酸基)乙酸乙酯(6.10g)於10℃以下滴入。在同溫度攪拌10分鐘後，滴入2,3-二丁基庚醛(4.10g)之脫水THF(8mL)溶液，並升溫至室溫。短暫攪拌後，升溫至50℃。攪拌5小時後，將反應混合物調至5℃以下，並添加水後，以乙酸乙酯稀釋，以飽和食 鹽水洗淨2次後，以無水硫酸鈉乾燥，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(4.14g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.97(9 H,m),1.14-1.38(22 H,m),2.16-2.30(1 H,m),4.10-4.22(2 H,m),5.72-5.78(1 H,m),6.80(1 H,dd,J=15.6,9.6Hz)
G)4,5-二丁基壬-2-烯酮酸
將4,5-二丁基壬-2-烯酸乙酯(4.10g)及8N氫氧化鈉水溶液(6.1mL)之乙醇(30mL)溶液於60℃攪拌2小時。於減壓下餾去溶劑，以1N鹽酸調至酸性。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(2.80g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.81-0.93(9 H,m),1.06-1.47(19 H,m),2.16-2.33(1 H,m),5.75-5.80(1 H,m),6.92(1 H,dd,J=15.8,9.8Hz)
H)4,5-二丁基壬-2-烯酸3-羥基-2-(羥基甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯
在(5-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0055-49
烷-5-基)甲醇(600mg)、DMAP(240mg)及4,5-二丁基壬-2-烯酮酸(706mg)之DMF(4mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(582mg)。攪拌一晚後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。使所得到之殘餘物溶解於THF(12mL)後，添加1N鹽酸(6mL)，並攪拌3 日。在反應混合物中添加乙酸乙酯，以5%碳酸氫鈉水溶液洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(870mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.93(9 H,m),1.13-1.36(18 H,m),1.40-1.47(1 H,m),2.21(1 H,dt,J=9.3,4.8Hz),2.69(2 H,td,J=6.6,2.5Hz),3.48(2 H,s),3.55-3.67(4 H,m),3.80-3.82(3 H,m),4.23-4.32(2 H,m),4.45(2 H,s),5.74-5.79(1 H,m),6.82-6.91(3 H,m),7.21-7.25(2 H,m)
I)4,5-二丁基壬-2-烯酸3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-雙((辛醯氧基)甲基)丙酯
4,5-二丁基壬-2-烯酸3-羥基-2-(羥基甲基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)丙酯(870mg)、DMAP(210mg)及辛酸(545mg)之DMF(6mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(757mg)。於60℃攪拌4小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，並於減壓下餾去溶劑。藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(1.26g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.93(15 H,m),1.13-1.45(35 H,m),1.52-1.61(4 H,m),2.17-2.31(5 H,m),3.43(2 H,s),3.80(3 H,s),4.10-4.22(6 H,m),4.40(2 H,s),5.73(1 H,d,J=15.4Hz),6.78-6.90(3 H,m),7.19(2 H,d,J=7.9Hz)
J)4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙酯
在4,5-二丁基壬-2-烯酸3-((4-甲氧基苄基)氧基)-2,2-雙((辛醯氧基)甲基)丙酯(1.26g)之乙醇(10mL)與乙酸乙酯(10mL)之混合溶液中，於室溫添加10%Pd/碳(110mg)，並在氫蒙氣下攪拌一晚。反應後，過濾除去Pd/碳後，於減壓下餾去溶劑。在殘餘物(500mg)、DMAP(95mg)及5-(二甲基胺基)戊酸鹽酸鹽(170mg)之DMF(4mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(194mg)。於50℃攪拌7小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，然後於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(250mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.91(15 H,m),1.09-1.31(37 H,m),1.42-1.52(2 H,m),1.54-1.66(6 H,m),1.76-1.97(1 H,m),2.21(6 H,s),2.24-2.35(10 H,m),4.07-4.13(8 H,m)
[實施例14]二癸酸2-(((4,5-二丁基壬醯基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)甲基)丙-1,3-二酯
A)4,5-二丁基壬酸乙酯
在4,5-二丁基壬-2-烯酸乙酯(2,50g)之乙醇(20mL)溶液中，於室溫添加10%Pd/碳(0.54g)，並在氫蒙氣下攪拌5小時。反應後，將Pd/碳過濾除去後，於減壓下餾去溶劑，得到標題化合物(2.49g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.82-1.00(9 H,m),1.10-1.33(23 H,m),1.46-1.63(2 H,m),2.19-2.36(2 H,m),4.06-4.19(2 H,m)
B)4,5-二丁基壬酸
將4,5-二丁基壬酸乙酯(2.49g)及8N氫氧化鈉水溶液(3.55mL)之乙醇(12.5mL)溶液於60℃攪拌7小時。於減壓下餾去溶劑，以1N鹽酸調成酸性。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥。於減壓下餾去溶劑，得到標題化合物(2.36g)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.83-0.94(9 H,m),0.95-1.33(20 H,m),1.49(1 H,ddt,J=13.7,9.3,6.8,6.8Hz),1.56-1.74(1 H,m),2.26-2.42(2 H,m)
C)4,5-二丁基壬酸(5-(羥基甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0058-47
烷-5-基)甲酯
在(5-(((三級丁基(二苯基)矽烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0058-48
烷-5-基)甲醇(800mg)、DMAP(306mg)及4,5-二丁基壬酸(678mg)之DMF(8mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(555mg)。於50℃攪拌8小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製。在此化合物之THF(4mL)溶液中，於室溫添加TBAF之THF溶液(1M,2.32mL)。在室溫攪拌一晚後，將反應混合物於減壓下濃縮。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(680mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.89(9 H,t,J=6.8Hz),1.09-1.31(20 H,m),1.42(6 H,s),1.45-1.54(1 H,m),1.57-1.62(1 H,m), 2.29-2.37(3 H,m),3.48(2 H,d,J=6.6Hz),3.70-3.75(4 H,m),4.25(2 H,d,J=1.9Hz)
D)4,5-二丁基壬酸(5-(((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0059-44
烷-5-基)甲酯
在4,5-二丁基壬酸(5-(羥基甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0059-45
烷-5-基)甲酯(680mg)、DMAP(388mg)及5-(二甲基胺基)戊酸鹽酸鹽(576mg)之DMF(7mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(669mg)。在50℃攪拌7小時後，於反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，然後於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(740mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.89(9 H,t,J=6.9Hz),1.09-1.31(21 H,m),1.42(6 H,s),1.48(3 H,dt,J=15.1,7.6Hz),1.60-1.66(2 H,m),2.21(6 H,s),2.22-2.32(4 H,m),2.35(2 H,t,J=7.6Hz),3.75(4 H,s),4.09-4.13(4 H,m)
E)二癸酸2-(((4,5-二丁基壬醯基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)甲基)丙-1,3-二酯
在4,5-二丁基壬酸(5-(((5-(二甲基胺基)戊醯基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0059-46
烷-5-基)甲酯(1.68g)中添加乙酸(8.4mL)及水(4.2mL)，並於75℃攪拌2小時。減壓餾去溶劑，添加乙酸乙酯及飽和氫氧化鈉水溶液，並攪拌2小時。將有機層用飽和氫氧化鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後、以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。在殘餘物(700mg)、DMAP(497 mg)及癸酸(701mg)之DMF(7mL)溶液中，於室溫添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(859mg)。在50℃攪拌7小時後，於反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷、乙酸乙酯/甲醇及NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(405mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.93(15 H,m),1.10-1.32(44 H,m),1.40-1.54(3 H,m),1.54-1.66(7 H,m),2.21(6 H,s),2.23-2.35(10 H,m),4.11(8 H,s)
[實施例18]4,5-二丁基壬酸3-(((4-(二甲基胺基)丁基)胺甲醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯氧基)甲基)丙酯
在4,5-二丁基壬酸(5-(羥基甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0060-43
烷-5-基)甲酯(0.50g)之四氫呋喃溶液(7.5mL)中，於室溫添加1,1-羰基二咪唑(0.28g)。攪拌1小時後，將反應混合物於減壓下濃縮。將殘餘物以己烷稀釋，除去不溶物後，將濾液於減壓下濃縮。在殘餘物中，於室溫添加四氫呋喃(10mL)、(4-胺基丁基)二甲基胺(0.20g)、三乙基胺(0.24mL)。攪拌20小時後，以乙酸乙酯稀釋，以水、氯化銨水溶液、碳酸氫鈉水溶液依序洗淨，於減壓下餾去溶劑。在殘餘物中添加乙酸(3.3mL)、水(1.7mL)，並於65℃攪拌5小時。在室溫冷卻後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以碳酸氫鈉水溶液、水依序洗淨，於減壓下餾去溶劑。在殘餘物中添加N,N-二甲基甲醯胺(4mL)、DMAP(61mg)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(288mg)、辛酸(0.19mL)。於60℃攪拌3小時後， 在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水、食鹽水依序洗淨後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(215mg)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ ppm 0.88(15 H,t,J=7.09Hz)1.10-1.33(32 H,m)1.40-1.62(14 H,m)2.21(6 H,s)2.25-2.32(8 H,m)3.16(2 H,m)4.10(8 H,s)5.84(1 H,m)
[實施例20](9Z)-十六碳-9-烯酸3-((3-丁基庚醯基)氧基)-2-(((3-丁基庚醯基)氧基)甲基)-2-(((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)甲基)丙酯
A)(9Z)-十六碳-9-烯酸(5-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0061-41
烷-5-基)甲酯
在氮蒙氣下，於(5-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0061-42
烷-5-基)甲醇(1.50g)、DMAP(0.49g)及棕櫚油酸(1.01g)之DMF(15mL)溶液中，於50℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.83g)。攪拌21小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(2.11g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ ppm 0.85-0.94(3 H,m),1.01-1.10(9 H,m),1.24-1.35(16 H,m),1.40(6 H,d,J=10.3Hz),1.52-1.61(2 H,m),1.97-2.07(4 H,m),2.25(2 H,t,J=7.6Hz),3.66(2 H,s),3.77 (4 H,q,J=11.8Hz),4.18(2 H,s),5.35(2 H,ddd,J=5.8,3.4,2.7Hz),7.36-7.47(6 H,m),7.65-7.69(4 H,m)
B)(9Z)-十六碳-9-烯酸3-((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)-2,2-雙(((3-丁基庚醯基)氧基)甲基)丙酯
在氮蒙氣下，於(9Z)-十六碳-9-烯酸(5-(((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-1,3-二
Figure 108128296-A0202-12-0062-39
烷-5-基)甲酯(2.11g)中添加乙酸(10.6mL)、水(5.3mL)，並於75℃攪拌8小時。冷卻至室溫後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，以飽和碳酸氫鈉水溶液、水依序洗淨，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑，得到殘餘物(1.95g)。在氮蒙氣下，秤取殘餘物(0.95g)，溶解於DMF(9.5mL)溶液後，添加DMAP(0.42g)及3-丁基庚酸(0.64g)，並短暫攪拌。然後，於50℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.69g)。攪拌6小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(0.71g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ ppm 0.84-0.93(15 H,m),1.05(9 H,s),1.18-1.37(40 H,m),1.51-1.60(2 H,m),1.78(2 H,br d,J=5.2Hz),1.97-2.07(4 H,m),2.17-2.26(6 H,m),3.63(2 H,s),4.10-4.17(6 H,m),5.35(2 H,ddd,J=5.6,3.5,2.2Hz),7.35-7.48(6 H,m),7.60-7.65(4 H,m)
C)(9Z)-十六碳-9-烯酸3-((3-丁基庚醯基)氧基)-2-(((3-丁基庚醯基)氧基)甲基)-2-(((4-(二甲基胺基)丁醯基)氧基)甲基)丙酯
在(9Z)-十六碳-9-烯酸3-((三級丁基(二苯基)矽基)氧基)-2,2-雙(((3-丁基庚醯基)氧基)甲基)丙酯(0.71g)之THF(2.1mL)溶液中，於室溫添加TBAF之THF溶液(1M,0.9mL)。在室溫攪拌一晚後，將反應混合物於減壓下濃縮。將殘餘物以乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨1次，用飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥，並於減壓下餾去溶劑。將殘餘物溶解於DMF(5.3mL)溶液後，添加DMAP(0.14g)及4-(二甲基胺基)丁烷酸鹽酸鹽(0.19g)，並短暫攪拌。然後，於50℃添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(0.24g)。攪拌8小時後，在反應混合物中添加乙酸乙酯，以水洗淨1次，以飽和食鹽水洗淨1次後，以無水硫酸鈉乾燥後，於減壓下餾去溶劑。將殘餘物藉由矽凝膠管柱層析(NH，乙酸乙酯/己烷)精製，得到標題化合物(0.31g)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)d ppm 0.85-0.94(15 H,m),1.20-1.37(40 H,m),1.55-1.66(2 H,m),1.66-1.86(4 H,m),1.97-2.08(4 H,m),2.21(6 H,s),2.22-2.39(10 H,m),4.08-4.17(8 H,m),5.35(2 H,ddd,J=5.6,3.5,2.1Hz)
依照上述之各合成例中所示之方法，或以彼等為基準之方法的任一者，可製造以下之表中的合成例2至7、9、11至13、15至17、19及21。關於此等合成例，將合成例1、8、10、14、18及20，以及化合物之名稱、構造式、1H NMR化學位移及製造時所實施的質量數(表中，以MS表示)示於表3中。
[表1-1]
Figure 108128296-A0202-12-0064-16
Figure 108128296-A0202-12-0065-18
Figure 108128296-A0202-12-0066-19
[製造例1]siRNA內封脂質奈米粒子的製造例
將脂質混合物(陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GS-020=60：10.6：28：1.4，莫耳比)溶解於90% EtOH、10% 25mM乙酸緩衝液pH 4.0中，得到7.4mg/ml之脂質溶液。Luciferase(luc)siRNA(參照表2)係溶解於25mM乙酸緩衝液pH4.0中，得到0.15mg/ml之核酸溶液。將所得到之脂質溶液及核酸溶液於室溫，藉由Asia microfluidic system(Syrris)，以流速比1ml/分鐘：5ml/分鐘混合，得到包含組成物之分散液。所得到之分散液，使用Slyde-A-Lyzer(20K之分劃分子量，Thermo scientific)，於室溫對水進行1小時透析，於室溫對PBS進行18小時透析。繼而，使用0.2μm之針筒過濾器(Iwaki)進行過濾，並於4℃保存。分析結果示於表3。以下，組成物中之脂質粒子之粒徑，係使用基於動態光散射測定技術的粒徑測定裝置Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)，藉由本身相關函數之累積量解析算出，作為Z平均粒徑。
[表2]
Figure 108128296-A0202-12-0067-20
N：RNA
n：DNA
[mN]：2'-OMe RNA
[ns]：硫代磷酸酯鍵
[表3]
Figure 108128296-A0202-12-0068-21
[製造例2]mRNA內封脂質奈米粒子的製造例
將脂質混合物(陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GM-020=60：10.6：28：1.4，莫耳比)溶解於90% EtOH、10%水中，得到8.5mg/ml之脂質溶液。Luciferase(luc)siRNA係溶解於10mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)緩衝液(pH4.0)中，得到0.22mg/ml之核酸溶液。將所得到之脂質溶液及核酸溶液於室溫，藉由Nanoassemblr裝置(Precision Nanosystems)，以流速比3ml/分鐘：6ml/分鐘混合，得到包含組成物之分散液。所得到之分散液，使用Slyde-A-Lyzer(20K之分劃分子量，Thermo scientific)，於室溫對水進行1小時透析，於4℃對PBS進行48小時透析。繼而，使用0.2μm之針筒過濾器(Iwaki)進行過濾，並於4℃保存。分析結果示於表4。
[表4]
Figure 108128296-A0202-12-0069-22
[試驗例1]對培養細胞之siRNA轉染試驗例
將安定表現螢光素酶之人類肝癌來源細胞株Hep3B以6000細胞/孔的細胞密度培養於96-孔盤，24小時後將含有luciferase siRNA之脂質粒子10μl添加於培養基中。自siRNA的添加起48小時後，luciferase之表現減弱(knockdown)量係使用Picagene LT2.0套組(TOYOBO公司)測定。根據測定結果將所算出之50%減弱所必要之siRNA濃度示於表5。
[表5]
Figure 108128296-A0202-12-0070-23
[試驗例2]對培養細胞之mRNA轉染試驗例
將人類大腸癌來源細胞株HCT116以6000細胞/孔的細胞密度培養於96-孔盤，24小時後將含有10ng luciferase mRNA之脂質粒子10μl添加於培養基中。自mRNA的添加起24小時後，在HCT116的培養盤中添加Picagene LT2.0套組(TOYOBO公司)的試藥，使用發光讀取盤EnVision(Perkin-Elmer)測定luciferase發光量(Luminescence(count per sec(cps)))。測定的結果示於表6至表10。
[表6]
Figure 108128296-A0202-12-0070-24
[表7]
Figure 108128296-A0202-12-0071-25
[表8]
Figure 108128296-A0202-12-0071-26
[表9]
Figure 108128296-A0202-12-0071-27
[表10]
Figure 108128296-A0202-12-0072-28
[製造例3]siRNA內封脂質奈米粒子的製造例
將脂質混合物(陽離子性脂質：DPPC：膽固醇：GS-020=60：10.6：28：1.4，莫耳比)溶解於90% EtOH、10% 25mM乙酸緩衝液pH 4.0中，得到7.4mg/ml之脂質溶液。針對Collagen1a1(Col1a1)之siRNA，以及針對Factor VII(FVII)之siRNA係分別以等重量溶解於25mM乙酸緩衝液pH 4.0中，得到0.15mg/ml之核酸溶液。此外，Col1a1 siRNA與FVII siRNA之序列係分別引用自Hepatology,Vol.672,No.4,2015，以及Silence,Vol.1,No.16,2010。各siRNA序列示於表11。將所得到之脂質溶液及核酸溶液，藉由微通道混合裝置Nanoassemblr(Precision Nanosystems)，以流速比1ml/分鐘：5ml/分鐘混合，得到包含組成物之分散液。所得到之分散液，使用Slyde-A-Lyzer(20K之分劃分子量，Thermo scientific)，於室溫對水進行1小時透析，於4℃對PBS進 行18小時透析。繼而，使用0.2μm之針筒過濾器(Iwaki)進行過濾，並於4℃保存。siRNA內封脂質奈米粒子的分析結果示於表12。使用本發明化合物之siRNA內封脂質奈米粒子的形成非常良好。
[表11]
Figure 108128296-A0202-12-0073-29
N：RNA
n：DNA
[mN]：2'-OMe RNA
[ns]：硫代磷酸酯鍵
[fN]：2'-F RNA
[表12]
Figure 108128296-A0202-12-0073-30
[試驗例3]CCl4肝纖維化模型小鼠中肝Collagen1a1基因減弱試驗例
對於8週齢雄性Balb/c小鼠將內封0.1mg/kg的Col1a1 siRNA之脂質奈米粒子由眼窩靜脈叢內的方式投與，在3小時後將混合於玉米油之CCl4以0.1mL/kg(10mL/kg)的用量由單次強制經口的方式投與(各群n=6)。siRNA內封脂質奈米粒子的投與4日後，由在麻醉下經安樂死之小鼠採取其肝，藉由定量的PCR進行基因表現解析。Col1a1基因表現量與FVII基因表現量係藉由GAPDH的現量標準化，將針對siRNA非投與群之Col1a1基因表現減低量作為減弱率。所得到之結果示於表13。使用本發明化合物而將形成之siRNA內封脂質奈米粒子由靜脈投與之小鼠中，與肝實質細胞的標記基因之FVII的減弱率比較，觀察到活性化星細胞的標記基因之Col1a1基因的減弱較強。
[表13]
Figure 108128296-A0202-12-0074-31
[產業上的利用可能性]
本發明之化合物、脂質粒子或組成物係可針對各種的細胞、組織或臟器有效率地將核酸導入。因此，本發明之化合物、脂質粒子或組成物可利用作為核酸醫藥中的DDS技術。又，本發明之化合物、脂質粒子或組成物亦可利用作為研究用核酸導入試藥。
[序列表自由正文]
序列編號1以及2：在製造例2中所使用，用以抑制螢光素酶基因的表現之siRNA(正義股以及反義股，參照表2)。
序列編號3以及4：在製造例3中所使用，用以抑制膠原蛋白1A1基因的表現之siRNA(正義股以及反義股，參照表11)。
序列編號5以及6：在製造例3中所使用，用以抑制第VII因子基因的表現之siRNA(正義股以及反義股，參照表11)。
<110> 日商武田藥品工業股份有限公司
<120> 陽離子性脂質
<130> PT38-5035TW
<150> JP2018-151583
<151> 2018-08-10
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Luc siRNA(正義股)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 序列包含RNA及DNA鹼基，有些為經修飾鹼基 〞t〞表示為2’-去氧胸腺嘧啶核苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (3)..(3)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (5)..(5)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> The〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 核酸(t and t)係由硫代磷酸酯鍵鍵結
<400> 1
Figure 108128296-A0202-12-0077-32
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Luc siRNA(反義股)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 序列包含RNA及DNA鹼基，有些為經修飾鹼基 〞t〞表示為2’-去氧胸腺嘧啶核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(42)
<223> 核酸(n and n)係由硫代磷酸酯鍵鍵結
<400> 2
Figure 108128296-A0202-12-0077-33
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Col1a1 siRNA(正義股)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 序列包含RNA及DNA鹼基，有些為經修飾鹼 〞t〞表示為2’-去氧胸腺嘧啶核苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (3)..(3)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (10)..(10)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (12)..(12)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (13)..(13)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 核酸(t and t)係由硫代磷酸酯鍵鍵結
<400> 3
Figure 108128296-A0202-12-0079-34
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Col1a1 siRNA(反義股)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 序列包含RNA及DNA鹼基，有些為經修飾鹼基 〞t〞表示為2’-去氧胸腺嘧啶核苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (9)..(9)
<223> 〞c〞表示為2’-O-甲基胞嘧啶核苷(cm)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 〞u〞表示為2’-O-甲基尿嘧啶核苷(um)
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (20)..(21)
<223> 核酸(t and t)係由硫代磷酸酯鍵鍵結
<400> 4
Figure 108128296-A0202-12-0079-35
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Factor VII siRNA(正義股)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 序列包含RNA及DNA鹼基，有些為經修飾鹼基 〞t〞表示為2’-去氧胸腺嘧啶核苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (4)..(4)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (5)..(5)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (9)..(9)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (10)..(10)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (15)..(15)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (16)..(16)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟胞苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 核酸(t and t)係由硫代磷酸酯鍵鍵結
<400> 5
Figure 108128296-A0202-12-0081-36
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> Factor VII siRNA(反義股)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 序列包含RNA及DNA鹼基，有些為經修飾鹼基 〞t〞表示為2’-去氧胸腺嘧啶核苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (2)..(2)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (7)..(7)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟胞苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (8)..(8)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (9)..(9)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (14)..(14)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (17)..(17)
<223> 〞u〞表示為2’-去氧-2’-氟尿苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (18)..(18)
<223> c〞表示為2’-去氧-2’-氟胞苷
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (19)..(19)
<223> 〞c〞表示為2’-去氧-2’-氟胞苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 核酸(t and t)係由硫代磷酸酯鍵鍵結
<400> 6
Figure 108128296-A0202-12-0082-37
Figure 108128296-A0202-11-0003-3

Claims (10)

  1. 一種式(I)所示之化合物或其鹽，
    Figure 108128296-A0202-13-0001-38
    式中，n1表示2至6之整數，n2表示0至2之整數，n3表示0至2之整數，
    L表示-C(O)O-或-NHC(O)O-，
    Ra表示直鏈狀C5-13烷基、直鏈狀C13-17烯基或直鏈狀C17二烯基，
    Rb表示直鏈狀C2-9烷基，
    Rc表示氫原子或直鏈狀C2-9烷基，
    Rd表示氫原子或直鏈狀C2-9烷基，
    Re表示直鏈狀C2-9烷基，
    Rf表示直鏈狀C2-9烷基。
  2. 一種化合物或其鹽，該化合物為4,5-二丁基壬酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
  3. 一種化合物或其鹽，該化合物為二癸酸2-(((4,5-二丁基壬醯基)氧基)甲基)-2-(((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)甲基)丙烷-1,3-二基酯。
  4. 一種化合物或其鹽，該化合物為4,5-二丁基壬酸3-((6-(二甲胺基)己醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
  5. 一種化合物或其鹽，該化合物為4,5-二戊基癸酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
  6. 一種化合物或其鹽，該化合物為4-庚基十一酸3-((5-(二甲胺基)戊醯基)氧基)-2,2-雙((辛醯基氧基)甲基)丙基酯。
  7. 一種脂質粒子，其含有如申請專利範圍第1項所述之化合物或其鹽。
  8. 一種核酸導入用組成物，其含有核酸以及如申請專利範圍第7項所述之脂質粒子。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之核酸導入用組成物，其中該核酸為RNA。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之核酸導入用組成物，其中該RNA為mRNA或siRNA。
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