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TW202005981A - 高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑及其用途 - Google Patents

高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑及其用途 Download PDF

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TW202005981A
TW202005981A TW108124516A TW108124516A TW202005981A TW 202005981 A TW202005981 A TW 202005981A TW 108124516 A TW108124516 A TW 108124516A TW 108124516 A TW108124516 A TW 108124516A TW 202005981 A TW202005981 A TW 202005981A
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阿彼錫 達塔
艾倫 卡庇里
湯瑪斯 舒爾柏夫
康史坦斯 馬丁
凱文 Ｂ 戴格貝
克里斯多福 查浦隆
史特凡 瓦韋西克
克里斯多夫 利特菲爾德
格雷戈瑞 Ｊ 卡紛
亞倫 巴寇勒
珊珊 林
賈斯丁 Ｗ 傑克森
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美商供石公司
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Abstract

本發明揭示能夠以高效力選擇性抑制TGFβ1之單株抗體及其抗原結合片段。本發明亦揭示相關組合物、方法及治療用途。

Description

高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑及其用途
轉型生長因子β1 (TGFβ1)連同兩種其他結構相關之異構體(亦即TGFβ2及TGFβ3)為生長因子之TGFβ超家族之成員，其中每一者係由獨立基因編碼。此等TGFβ充當調節細胞增殖、分化、免疫調節(例如，應變性免疫反應)以及內穩定與疾病情形兩者中的其他各種生物過程的多效性細胞介素。三種TGFβ異構體經由相同細胞表面受體進行信號傳遞且觸發類似典型下游信號轉導事件，包括SMAD2/3路徑。然而，小鼠中之基因基因剔除研究顯示各種表型，其表明各異構體在活體內起離散作用。此可在某種程度上藉由三種異構體之差異表現譜來達成。
TGFβ1之生物功能具有多樣性。在免疫系統內，T細胞識別為TGFβ之主要直接目標。TGFβ信號傳遞對效應細胞增殖以及效應T細胞及調節T細胞分化之調控很重要。舉例而言，TGFβ為Th1及Th2效應T細胞之強效抑制因子。亦顯示細胞毒性T細胞之效應功能經由多個機制受TGFβ抑制。此外，證據表明，免疫系統之其他細胞類型，諸如樹突狀細胞(諸如朗格罕氏細胞(Langerhans cell))及天然殺手(NK)細胞亦受TGFβ信號傳遞路徑調控。TGFβ調節異常與多種疾病病狀相關，諸如癌症、纖維化及免疫病症。
出於此等及其他原因，TGFβ已作為針對免疫病症、各種增生性病症及纖維性病狀之治療的引人注目之治療目標。然而，來自臨床前研究(包括大鼠及狗中之研究)之觀測結果已顯示，與活體內TGFβ之全身性抑制相關的嚴重毒性。另外，儘管到目前為止已研發出若干TGFβ抑制劑，但大多數靶向TGFβ之臨床程序歸因於嚴重副作用之風險已中斷(概述於例如WO 2017/156500中)。因此，儘管有多種直接及間接證據指向在諸如癌症及纖維化之疾病的進展中涉及TGFβ信號傳遞，但到目前為止尚不存在安全及有效的市售TGFβ抑制劑。
此前，申請人描述一類以新穎作用機制起作用來調節生長因子信號傳遞之單克隆抗體(參見例如WO 2014/182676)。此等抗體設計成利用以下事實，TGFβ1以包含前域及生長因子之潛伏前蛋白複合物形式表現，該潛伏前蛋白複合物需要將生長因子自潛伏複合物釋放之活化步驟。新穎種類之抑制性抗體特異性靶向無活性前體前蛋白複合物自身，以便在配位體-受體相互作用上游搶先阻斷活化步驟，而非採取在活化後直接靶向成熟生長因子自身之傳統方法(諸如中和抗體)。推論出此獨特作用機制應提供獲得空間益處及時間益處兩者之優點，此係因為其在來源處起作用，亦即，藉由在活化發生前靶向疾病微環境內之潛伏前TGFβ1複合物。
使用此方法，產生特異性結合TGFβ1且以異構體選擇性方式抑制其活化(亦即，自潛伏複合物釋放成熟生長因子)之單株抗體(參見，WO 2017/156500)。其中所展示之資料支持以下觀點：對TGFβ之異構體特異性 抑制(相對於泛 抑制)可使活體內拮抗TGFβ之安全概況得到改良。考慮到此，申請人隨後試圖開發TGFβ1抑制劑作為由多層面TGFβ1效應及其調節異常驅動之病狀的治療劑，該等抑制劑i)具異構體特異性；且ii)能夠廣泛靶向與不同呈遞分子締合之多個TGFβ1信號傳遞複合物，
此類抗體隨後描述於PCT/US2018/012601 (2018年1月5日申請)中。實際上，其中所描述之異構體特異性抑制性藥劑能夠靶向ECM締合之TGFβ1及免疫細胞締合之TGFβ1兩者，藉此阻斷多個生物學背景 下之TGFβ1之多個來源 ，同時保持異構體特異性。揭示來自多個活體內模型的顯示異構體選擇性TGFβ1活化抑制劑之功效及安全性的資料，其證明此類抑制劑適用於治療涉及活體內ECM締合之TGFβ1及免疫細胞締合之TGFβ1兩者之調節異常的疾病。
儘管上文所提及的先前工作展現能夠結合已知前TGFβ1複合物中之每一者且具有活體外及活體內抑制活性兩者之抗體的效用，但觀測到此等TGFβ1抑制劑在四種抗原複合物間展現親和性的某些偏向 ，其視哪一呈遞分子結合至前TGFβ1而定。對於某些臨床應用，具有較均一 結合概況之抗體(因此「非情形依賴性 」抑制劑)較佳。
本發明提供一種新穎種類之高親和性、異構體選擇性抗體，其能夠以高效力抑制TGFβ1活化。此等包括能夠以相等親和性結合至所有四種已知呈遞分子-前TGFβ1複合物之抗體(包括免疫球蛋白及其抗原結合片段或部分)。此類抗體被稱為非情形依賴性 或無偏向 的。由本發明達成的結合活性之均一性為將此等抗體作為治療涉及TGFβ1調節異常之多個方面之疾病(諸如癌症)的強效治療劑提供機會。
申請人此前揭示TGFβ1異構體選擇性單株抗體，其能夠特異性結合至四種已知呈遞分子-前TGFβ1複合物(被稱作「大型潛伏複合物」或「LLC」)，亦即，LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。然而，儘管具有寬廣結合能力，但此等先前抗體顯示對某些前TGFβ1複合物超過其他前TGFβ1複合物之偏斜或不均勻結合活性，此特徵被稱作「偏向 」。在一些情況下，針對不同抗原複合物之相對親和性的偏向顯著，通常在KD 值中存在許多倍的差異。儘管此類抗體識別抗原(前TGFβ1)之相同抗原決定基，但其與特定呈遞分子之相互作用可能引起構形改變，導致在與不同呈遞分子締合之不同抗原複合物中所觀測到的差異性親和性，或偏向 。舉例而言，Ab3，一種先前所描述之TGFβ1活化的異構體選擇性抑制劑，顯示相比於對結締組織細胞外基質(ECM)中富集的LTBP複合物之高親和性(例如，亞奈莫耳範圍)，與免疫細胞締合之複合物(GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1)特異性但明顯地較弱的結合。
為治療涉及強TGFβ1依賴性免疫組分之疾病(諸如癌症及纖維化)，抑制劑之期望特徵係其可以足夠親和性(例如，亞奈莫耳KD )有效靶向基質締合及免疫細胞締合之TGFβ1複合物兩者。為此，本發明之發明人試圖產生相比於先前所描述之TGFβ1抑制劑，不僅具廣泛抑制性且亦遍及TGFβ1信號傳遞之各種生物學背景較均一有效的抗體。
在產生本發明之前TGFβ1抗體時考慮以下選擇標準：1)異構體選擇性；2)寬度/非情形依賴性；3)遍及多個抗原複合物之均一性/無偏向親和性(例如，對每一目標之亞奈莫耳親和性)；4)對四種抗原複合物(或，基質締合及 細胞締合類別)中之每一者的高親和性；及5)穩健抑制活性/效力。基於該等標準，本發明之發明人鑑別一類高親和性、非情形依賴性單株抗體及其片段，該等單株抗體及其片段能夠以異構體選擇性及非情形依賴性方式以高親和性特異性結合前TGFβ1複合物。相比於顯示對一或多種複合物超過其他之偏向或優先活性之先前揭示的抗體，本文所揭示之新穎種類之抗體顯示遍及所有目標複合物的高親和性(各自具有亞奈莫耳KD)。在較佳實施例中，此類抗體遍及不同前TGFβ1複合物為無偏向 的。相關組合物、製劑、調配物、製程及方法由本發明涵蓋。
因此，在一些實施例中，本發明包括如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，能夠以≤ 10 nM之KD結合至以下人類LLC複合物中之每一者的單株抗體或其抗原結合片段：LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。較佳地，抗體對複合物中之每一者具有1 nM或更小之KD。在一些實施例中，抗體或片段結合包含複合物之潛伏套索(Latency Lasso)的一或多個胺基酸殘基，其中視情況，抗原決定基進一步包含生長因子域之一或多個胺基酸殘基。此類抗原決定基因此可為組合性抗原決定基。
本發明之TGFβ1抑制劑為功能性抗體，此係因為其具有對TGFβ1之抑制活性。此類抗體之效力為異構體特異性的，如藉由適合活體外效力分析(諸如基於細胞之報導體分析)所量測。
本發明之TGFβ1抑制劑能夠阻斷成熟生長因子自潛伏LLC複合物釋放。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑可抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及/或TGFβ1之蛋白酶依賴性活化。在一些實施例中，蛋白酶為激肽釋放酶(Kallikrein)、纖維蛋白溶酶(Plasmin)或MMP蛋白酶。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可對細胞締合之LLC施加雙重抑制活性。在一種機制中，此類抑制劑抑制與GARP及/或LRRC33締合之TGFβ1的活化步驟。在第二機制中，此類抑制劑可在目標接合後，誘導LLC自細胞表面抗體依賴性內化，藉此降低生態棲位處之TGFβ1信號傳遞。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可有效降低疾病相關基因之表現，該等基因諸如Acta2、Col1a1、Col3a1、Fn1、Itga11、Lox、Loxl2及Mmp2。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可活體內有效降低下游效應子SMAD2/3之磷酸化。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可有效治療TGFβ1相關適應症。此類適應症包括涉及異常基因表現之疾病、涉及ECM調節異常之疾病、涉及間葉細胞轉化之疾病、涉及蛋白酶之疾病、涉及異常幹細胞增殖及/或分化之疾病等。在一些實施例中，TGFβ1相關適應症為增生性病症，諸如骨髓增生病及伴隨實體腫瘤之癌症。在一些實施例中，TGFβ1相關適應症為纖維性病症。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可有效達成腫瘤控制，其中腫瘤視情況為免疫排除表型。在一些實施例中，當與癌症療法，諸如檢查點阻斷療法、化學療法及放射療法結合使用時，TGFβ1抑制劑可達成協同抗腫瘤效應。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可有效達成患有實體腫瘤之個體的存活益處，其中實體腫瘤視情況為局部晚期或轉移性癌症。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可藉由誘導T細胞記憶功能，有效達成持久抗腫瘤效應。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可在主要表現TGFB1及/或TGFb3之腫瘤中有效達成抗腫瘤效應。在一些實施例中，共表現TGFβ1及TGFβ3之腫瘤為癌瘤。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑能夠克服腫瘤對癌症療法之原發抗性。在一些實施例中，此類腫瘤經免疫抑制細胞類型浸潤，該等細胞類型諸如調節T細胞、M2型巨噬細胞及/或骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑促進效應細胞浸潤至腫瘤中。在一些實施例中，效應細胞可經腫瘤血管進入腫瘤。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑可有效治療骨髓纖維化。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑達成患有骨髓纖維化之個體之骨髓的抗纖維性效應。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑可有效標準化某些血液參數。
在一些實施例中，在臨床前安全性/毒理學研究中，當以至多100、200或300 mg/kg劑量每週投配一次，持續至少4週時，本發明之TGFβ1抑制劑具有良好耐受性。此類研究可在已知對TGFβ抑制敏感之動物模型(諸如大鼠及非人類靈長類動物)中進行。在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑不造成與TGFβ之泛抑制相關的可觀測毒性，諸如心血管毒性(例如，瓣膜病)及上皮細胞增生及此項技術中已知的其他毒性。
在一些實施例中，本發明之TGFβ1抑制劑達成足夠的治療窗，此係因為由活體內功效研究顯示之抑制劑的有效量遠低於(諸如至少3倍、至少6倍或至少10倍)導致可觀測毒性之量或濃度。在一些實施例中，抑制劑之治療有效量在每週約1 mg/kg與約30 mg/kg之間。
相關申請
本申請案主張以下美國臨時申請案之權益及優先權：2018年7月11日申請之62/696,752；2018年8月13日申請之62/718,196；2018年9月27日申請之62/737,534；2018年11月9日申請之62/758,180；2019年2月25日申請之62/810,263及2019年4月1日申請之62/827,552，各自題為「高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑及其用途(High-Affinity, Context-Independent TGFβ1 Inhibitors and Use Thereof)」，其各自之全部內容以明確引用之方式併入本文中。定義
為了使本發明可較易於理解，首先定義某些術語。此等定義應根據本發明之其餘部分來閱讀且如一般熟習此項技術者所理解。除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有如一般熟習此項技術者通常理解之相同的含義。在通篇[實施方式]中，闡述其他定義。
晚期癌症、晚期惡性疾病 ： 如本文所用，術語「晚期癌症」或「晚期惡性疾病」具有相關技術中所理解之含義，例如在診斷或治療患有癌症之個體/患者之情形下如由腫瘤學家理解之含義。伴隨實體腫瘤之晚期惡性疾病可為局部晚期或轉移性的。術語「局部晚期癌」用於描述已生長至癌症開始出現之器官外，但尚未擴散至身體之遠端部位的癌症(例如，腫瘤)。因此，該術語包括已自癌症開始出現處擴散至鄰近組織或淋巴結的癌症。相比之下，「轉移癌」為已自癌症開始出現之身體部位(原發位點)擴散至身體之其他部位(例如，遠端部位)的癌症。
親和性 ：親和性為分子(諸如抗體)與其配位體(諸如抗原)之結合強度。其通常藉由平衡解離常數(KD )來量測及報導。在抗體-抗原相互作用之情形下，KD 為抗體解離速率(「解離速率(off rate)」或Koff ) (抗體自其抗原解離之快速程度)與抗體之抗體締合速率(「締合速率(on rate)」或Kon ) (其結合至其抗原之快速程度)的比率。舉例而言，經適合活體外結合分析測定，親和性為≤ 5 nM之抗體的KD 值為5 nM或更低(亦即，5 nM或更高親和性)。可使用適合活體外分析來量測抗體對於其抗原之KD值，諸如生物層干涉術(BLI)及溶液平衡滴定(例如，MSD-SET)。
抗體 ：術語「抗體」涵蓋任何天然存在、重組、經修飾或經工程改造之免疫球蛋白或類免疫球蛋白結構或其抗原結合片段或部分，或其衍生物，如本文中其他處進一步所述。因此，該術語係指特異性結合至目標抗原之免疫球蛋白分子，且包括嵌合、人類化、完全人類及雙特異性抗體。完整抗體通常將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少鏈，諸如駱駝中天然存在之抗體可僅包含重鏈。抗體可僅源自單一來源，或可為「嵌合」的，亦即，抗體之不同部分可源自兩種不同抗體。抗體或其抗原結合部分可在融合瘤中，藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解產生。如本文所用，術語抗體分別包括單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成性抗體(有時在本文中稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物(有時在本文中稱為「抗體結合物」)。在一些實施例中，該術語亦涵蓋肽體。
抗原 ：術語「抗原」術語「抗原」廣義上包括在抗體或片段特異性結合的一或多個結合區中包含抗原決定子之任何分子。抗原可為單一單元分子(諸如蛋白質單體或片段)或由多重組分構成之複合物。抗原提供抗原決定基，例如分子或分子之一部分，或分子或分子之部分的複合物，其能夠經選擇性結合劑，諸如抗原結合蛋白(包括抗體)結合。因此，選擇性結合劑可特異性結合至由兩種或更多種組分形成的呈複合物形式之抗原。在一些實施例中，抗原能夠用於動物中以產生能夠結合至彼抗原之抗體。抗原可具有一或多個能夠與不同抗原結合蛋白，例如抗體相互作用之抗原決定基。在本發明之情形下，適合抗原為含有與呈遞分子締合之前TGF (前TGF)二聚體的複合物(例如，由相締合之多重組分構成的多聚複合物)。前TGF二聚體之各單體包含前域及生長因子域，其藉由弗林蛋白酶(furin)裂解序列分隔。兩種此類單體形成前二聚體複合物(參見圖 19 )。此轉而經由二硫鍵與呈遞分子共價締合，其涉及接近於前TGF單體中之每一者之N端存在的半胱胺酸殘基。藉由結合至呈遞分子之前TGF二聚體所形成的此多重複合物一般稱作大型潛伏複合物。適用於篩選抗體或抗原結合片段之抗原複合物例如包括大型潛伏複合物之呈遞分子組分。此類呈遞分子組分可為全長呈遞分子或其一或多個片段。呈遞分子之所需最小部分通常含有呈遞分子多肽之至少50個胺基酸，但更佳至少100個胺基酸，該呈遞分子多肽包含能夠形成與前TGFβ1二聚體之共價鍵的兩個半胱胺酸殘基。
抗原結合部分 / 片段 ：如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」係指保留特異性結合至抗原(例如，TGFβ1)之能力的抗體之一或多個片段。抗原結合部分包括(但不限於)特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在、可酶促獲得、合成性或經基因工程改造之多肽或糖蛋白。在一些實施例中，抗體之抗原結合部分可例如使用任何適合之標準技術自完整抗體分子衍生，該等技術諸如蛋白水解消化或重組基因工程改造技術，其涉及編碼抗體可變域及視情況存在之恆定域之DNA之操縱及表現。抗原結合部分之非限制性實例包括：(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，包含經鉸鏈區處之二硫橋鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由VH及CH1域組成；(iv)Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH域組成；(v)單鏈Fv (scFv)分子(參見例如Bird等人 (1988) SCIENCE 242:423-426；及Huston等人 (1988) PROC. NAT'L. ACAD. SCI. USA 85:5879-5883)；(vi)dAb片段(參見例如Ward等人 (1989) NATURE 341: 544-546)；及(vii)最小識別單位，其由模仿抗體之高變區(例如，經分離之互補決定區(CDR))的胺基酸殘基組成。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。術語抗體之抗原結合部分包括「單鏈Fab片段」，另外稱為「scFab」，其包含抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子，其中該等抗體域及該連接子沿N端至C端方向具有以下次序中之一者：a) VH-CH1-連接子-VL-CL；b) VL-CL-連接子-VH-CH1；c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為至少30個胺基酸，較佳在32與50個胺基酸之間的多肽。
( LAP 之 ) 臂 ：如本文所用，臂為前TGFβ1之LAP內，C端緊接潛伏套索且N端緊接生長因子域之域。臂之C末端為將臂域與生長因子域隔開之弗林裂解位點。人類前TGFβ1之臂域含有呈未突變形式之以下胺基酸序列：EAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRR (SEQ ID NO: 150)
偏向： 在本發明之情形下，術語「偏向」係指對或針對抗體能夠特異性結合之一小類抗原的偏斜或不勻親和性。舉例而言，當對一種抗原複合物之親和性及對另一抗原複合物之親和性不等時，則稱抗體具有偏向 。本發明之非情形依賴性抗體具有對此類抗原複合物之相等親和性(亦即，無偏向)。
結合區 ：如本文所用，「結合區」為抗原之一部分，當結合至抗體或其片段時，其可形成抗體-抗原相互作用之界面。抗體結合後，結合區變得受保護而避免表面暴露，其可由適合技術，諸如HDX-MS偵測。抗體-抗原相互作用可經由多個(例如，兩個或更多個)結合區介導。結合區可包含抗原決定子或抗原決定基。
生物層干涉術 (BLI)：BLI為用於光學量測例如固定在生物感測器尖端表面上之配位體與溶液中之分析物之間的生物分子相互作用的無標記技術。BLI提供精確且準確監測結合特異性、締合及解離速率或濃度之能力。BLI平台儀器可例如自ForteBio商購且通常稱作Octet®系統。
癌症： 如本文所用，術語「癌症」係指多細胞真核生物中，通常以不受調控之細胞增殖及惡性疾病為特徵的生理病狀。該術語廣義上涵蓋實體及液體惡性疾病，包括腫瘤、血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤及骨髓瘤)以及骨髓纖維化。
細胞締合之前 TGF β 1 ：該術語係指經膜結合(例如，繫留至細胞表面)之TGFβ1或其信號傳遞複合物(例如，前TGFβ1/潛伏TGFβ1))。典型地，此類細胞為免疫細胞。藉由GARP或LRRC33呈遞之TGFβ1為細胞締合之TGFβ1。GARP及LRRC33為在特定細胞之細胞表面上表現的跨膜呈遞分子。GARP-前TGFβ1及LRRC33-可統稱為「細胞締合之」(或「細胞表面」)前TGFβ1複合物，其介導細胞前TGFβ1締合之(例如，免疫細胞締合之)TGFβ1活化/信號傳遞。可計算抗體(或其片段)對GARP-前TGFβ1複合物及LRRC33-前TGFβ1複合物之平均KD值以共同表示對細胞締合之(例如，免疫細胞締合之)前TGFβ1複合物的親和性。參見例如表8，欄(G)。呈遞分子或呈遞分子複合物之人類對應物可由蛋白質或蛋白質複合物之前的「h」指示，例如「h GARP」、「h GARP-前TGFβ1」、「h LRRC33」及「h LRRC33-前TGFβ1」。除阻斷活性TGFβ1生長因子自細胞繫留複合物釋放以外，細胞締合之前TGFβ1可為內化(例如，內吞作用)及/或細胞殺滅(諸如表現此類細胞表面複合物之目標細胞的ADCC、ADCP或ADC介導之耗乏)的目標。
檢查點抑制劑： 在本發明之情形下，檢查點抑制劑係指免疫檢查點抑制劑且帶有如此項技術中理解之含義。通常，目標為T細胞或NK細胞上之受體分子或抗原呈遞細胞(APC)或腫瘤細胞上之相應細胞表面配位體。免疫檢查點在免疫細胞中活化會阻止針對「自體」產生的發炎免疫力。因此，經由檢查點抑制改變免疫系統之平衡應允許其充分活化以偵測及消除癌症。涉及免疫反應之控制的最佳已知抑制受體為細胞毒性T淋巴球抗原-4 (CTLA-4)、計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1)、PD-L1、T細胞免疫球蛋白域及黏蛋白域-3 (TIM3)、淋巴球活化基因3 (LAG3)、殺手細胞類免疫球蛋白受體(KIR)、糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)及T細胞活化的含V域免疫球蛋白(Ig)之抑制因子(VISTA)。檢查點抑制劑之非限制性實例包括：納武單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)、BMS-936559、阿特珠單抗(Atezolizumab)、艾維路單抗(Avelumab)、德瓦魯單抗(Durvalumab)、伊匹單抗(Ipilimumab)、曲美單抗(Tremelimumab)、IMP-321、BMS-986016及利瑞路單抗(Lirilumab)。Keytruda®為PD-1抑制劑之一個實例。採用免疫檢查點抑制劑中之一或多者的療法可稱為檢查點阻斷療法(CBT)。
臨床益處： 如本文所用，術語「臨床益處」意欲包括療法之功效及安全性兩者。因此，達成期望臨床益處之治療性治療為有效(例如，達成治療有利效果)且安全的(例如，伴隨可耐受或可接受量之毒性或不良事件)。
組合療法： 「組合療法」係指包含兩種或更多種治療劑的針對臨床適應症之治療方案。因此，該術語係指其中結合包含第二組合物(活性成分)之第二療法向患者投與包含第一組合物(例如，活性成分)之第一療法的治療方案，其意欲治療相同或重疊的疾病或臨床病狀。第一及第二組合物可均對相同細胞目標或對離散細胞目標起作用。在組合療法之情形下，片語「結合」意謂在接受組合療法之個體中，第一療法之治療作用暫時及/或在空間上與第二療法之治療作用重疊。因此，組合療法可調配為用於療法之同時投與之單一調配物或用於療法之連續投與的獨立調配物。當向已用治療疾病之第一療法治療的個體投與第二療法以治療相同疾病時，該第二療法可稱為附加療法 或輔助療法 。
組合 ( combinatory / combinatorial ) 抗原決定基 ： 組合抗原決定基為在一位點經組合抗體識別且結合之抗原決定基(亦即，抗原決定子)，其係藉由抗原之一或多種組分的非相鄰部分形成，該等部分以三維結構形式緊靠在一起以形成抗原決定基。因此，本發明之抗體可結合藉由前TGFβ1/潛伏TGFβ1複合物之兩種或更多種組分(例如，部分或區段)形成的抗原決定基。組合抗原決定基可包含來自複合物之第一組分的一或多個胺基酸殘基及來自複合物之第二組分的一或多個胺基酸殘基等。各組分可具有抗原複合物之單一蛋白質或兩種或更多種蛋白質。組合抗原決定基係由抗原或抗原複合物之兩種或更多種組分(例如，部分或區段，諸如胺基酸殘基)經結構比重形成。
競爭 或交叉競爭 ；交叉阻斷 ：當用於為同一抗原決定基競爭之抗原結合蛋白(例如，抗體或其抗原結合部分)之情形下時，術語「競爭」意謂抗原結合蛋白之間的競爭，如藉由其中所測試之抗原結合蛋白阻止或抑制(例如，降低)參考抗原結合蛋白特異性結合至共同抗原(例如，TGFβ1或其片段)的分析所測定。可使用多種類型之競爭結合分析來判定一種抗原結合蛋白是否與另一抗原結合蛋白競爭，例如：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)；固相直接或間接酶免疫分析(EIA)；夾心競爭分析；固相直接生物素-抗生蛋白EIA；固相直接標記分析及固相直接標記夾心分析。通常,當競爭抗原結合蛋白過量存在時，其將抑制(例如，降低)參考抗原結合蛋白特異性結合至共同抗原至少40至45%、45至50%、50至55%、55至60%、60至65%、65至70%、70至75%或75%或更多。在一些情況下，結合被抑制至少80至85%、85至90%、90至95%、95至97%或約97%或更多。
在一些實施例中，第一抗體或其抗原結合部分及第二抗體或其抗原結合部分相對於相同抗原彼此「交叉阻斷 」，舉例而言，如由Biacor或Octet®，使用標準測試條件，例如根據製造商之說明書(例如，在室溫，約20至25℃下分析之結合)所分析。在一些實施例中，第一抗體或其片段及第二抗體或其片段可具有相同抗原決定基。在其他實施例中，第一抗體或其片段及第二抗體或其片段可具有不相同但重疊之抗原決定基。在又其他實施例中，第一抗體或其片段及第二抗體或其片段可具有獨立(不同)抗原決定基，其在三維空間中極為接近，使得抗體結合經由位阻交叉阻斷。「交叉阻斷」意謂第一抗體結合至抗原阻止第二抗體結合至同一抗原，且類似地，第二抗體與抗原之結合阻止第一抗體結合至同一抗原。
可進行抗體分組(有時稱作抗原決定基分組或抗原決定基定位)以對針對目標蛋白或蛋白複合物(亦即，抗原)製得之單株抗體的集合(例如，「庫」)進行表徵及分選。將針對相同目標之此類抗體針對庫中之所有其他抗體以成對方式進行測試，以評估抗體是否阻斷彼此與抗原之結合。緊密相關之分組概況表明抗體具有相同或緊密相關(例如，重疊)抗原決定基，且「分組」在一起。分組提供在相同抗原內共用類似結合區之抗體的適用結構-功能概況，此係因為藉由抗體與其目標之結合實現的生物活性(例如，干預；效力)可能轉入至相同分組中之另一抗體。因此，在相同抗原決定基組內之抗體中，具有較高親和性(較低KD)之彼等通常具有更大效力。
互補決定區 ： 如本文所用，術語「CDR」係指在抗體可變序列內之互補決定區。重鏈及輕鏈之可變區中各自存在三個CDR，對於各可變區，該等CDR命名為CDR1、CDR2及CDR3。如本文中所用，術語「CDR組」係指存在於可結合抗原之單一可變區中的一組三個CDR。此等CDR之準確邊界已根據不同系統以不同方式加以界定。Kabat (Kabat等人(1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.)所述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區的明確殘基編號系統，而且亦提供界定該三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917；Chothia等人 (1989) Nature 342: 877-883)發現，Kabat CDR內之某些子部分採用幾乎一致的肽主鏈構形，儘管在胺基酸序列層面下具有極大的多樣性。此等次部分表示為L1、L2及L3或H1、H2及H3，或L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3或H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等區可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139及MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45所述。又其他CDR邊界定義可不嚴格遵循本文系統中之一者，但仍然將與Kabat CDR重疊，儘管其可根據特定殘基或殘基基團或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現經縮短或延長(參見例如：Lu X等人, MAbs. 2019年1月;11(1):45-57)。本文中所用之方法可利用根據此等系統中之任一者經界定之CDR，但某些實施例使用經Kabat或Chothia界定之CDR。
構形抗原決定基 ： 構形抗原決定基為呈三維構形，而非呈相同胺基酸序列之未摺疊肽的經構形抗體識別且結合之抗原決定基。構形抗原決定基可稱為構形特異性抗原決定基、構形依賴性抗原決定基或構形敏感性抗原決定基。特異性結合此類抗原決定基之相應抗體或其片段可稱為構形特異性抗體、構形選擇性抗體或構形依賴性抗體。抗原結合至構形抗原決定基視抗原或抗原複合物之三維結構(構形)而定。
恆定區 ： 免疫球蛋白恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列為此項技術中已知的。
情形偏向 ： 如本文所用，「情形偏向之抗體」係指一種構形抗體之類型，當抗原與相互作用蛋白質或其片段締合(亦即結合或附接)時，該等抗體以差異親和性結合抗原。因此，特異性結合前TGFβ1內抗原決定基的情形偏向之抗體可以差別親和性結合LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。舉例而言，若相較於對細胞締合之前TGFβ1複合物(例如，GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1)，抗體對基質締合之前TGFβ1複合物(例如，LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1)的親和性較高，則該抗體稱為「基質偏向的」。[基質締合之複合物]:[細胞締合之複合物]之相對親和性可藉由取前者之平均KD 值，取後者之平均KD 值，且計算兩者之比率來獲得，如本文中所例示。
非情形依賴性 ： 根據本發明，結合前TGFβ1之「非情形依賴性抗體」遍及四種已知呈遞分子-前TGFβ1複合物，亦即LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1具有相等親和性。本申請案中所揭示之非情形依賴性抗體亦可表徵為無偏向 的。通常，非情形依賴性抗體顯示相等(亦即，不超過五倍之偏向的)親和性，使得如藉由適合活體外結合分析，諸如表面電漿子共振、生物層干涉術(BLI)及/或溶液平衡滴定(例如，MSD-SET)所量測，基質締合之複合物與細胞締合之複合物之間的KD量測值之相對比率不超過5。
ECM 締合之 TGF β 1/ 前 TGF β 1 ：該術語係指TGFβ1或其信號傳遞複合物(例如，前/潛伏TGFβ1)，其為細胞外基質(例如，沈積至細胞外基質中)之組分。藉由LTBP1或LTBP3呈遞之TGFβ1為ECM締合之TGFβ1，亦即分別LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1。LTBP對於TGFβ在ECM中的適當沈積及後續生物可用性至關重要，其中咸信原纖維蛋白(Fbn)及纖維結合蛋白(FN)為負責LTBP與ECM締合之主要基質蛋白。此類基質締合之潛伏複合物在結締組織，以及某些疾病相關組織(諸如腫瘤基質及纖維性組織)中富集。呈遞分子或呈遞分子複合物之人類對應物可由蛋白質或蛋白質複合物之前的「h」指示，例如「hLTBP1」、「hLTBP1-前TGFβ1」、「hLTBP3」及「hLTBP3-前TGFβ1」。
有效量： 「有效量」(或治療有效量，或治療劑量)為在患者群中達成統計學上顯著之臨床效益(例如，功效)的劑量或給藥方案。舉例而言，已顯示Ab6在臨床前模型中在低至3 mg/kg及高達30 mg/kg之劑量下為有效的。因此，可稱Ab6之有效量在約3至30 mg/kg之間。
有效腫瘤控制： 術語「有效腫瘤控制」可用於指對治療起反應而達成之腫瘤消退之程度，其中舉例而言，腫瘤消退呈指標腫瘤體積之限定百分率(諸如＜25%)。舉例而言，在特定模型中，若指標腫瘤體積設定為2,000 mm3，則腫瘤減小至小於500 mm3(假定臨限值＜25%)，達成有效腫瘤控制。因此，有效腫瘤控制涵蓋完全消退。
效應 T 細胞： 如本文所用，效應T細胞為對刺激，諸如協同刺激即刻積極反應之T淋巴球，且包括(但不限於)CD4+ T細胞(亦稱為T輔助細胞或Th細胞)及CD8+ T細胞(亦稱為細胞毒性T細胞)。Th細胞在免疫過程中輔助其他白血球，包括B細胞成熟為漿細胞及記憶B細胞以及細胞毒性T細胞及巨噬細胞之活化。由於此等細胞在其表面上表現CD4糖蛋白，因此其亦稱為CD4+ T細胞。當輔助T細胞藉由表現於抗原呈遞細胞(APC)之表面上的MHC II類分子呈現有肽抗原時，其變得活化。在活化後，其快速分裂且分泌調節或輔助活性免疫反應之稱為細胞介素的小型蛋白質。此等細胞可分化成若干次型，包括Th1、Th2、Th3、Th17、Th9或TFh，該等次型分泌不同細胞介素以促進不同類型之免疫反應。自APC進行之信號傳遞引導T細胞呈特定次型。細胞毒性(殺手)。另一方面，細胞毒性T細胞(TC細胞、CTL、T殺手細胞、殺手T細胞)會破壞經病毒感染之細胞及癌細胞，且亦涉及移植排斥。由於此等細胞在其表面處表現CD8糖蛋白，因此其亦稱為CD8+ T細胞。此等細胞藉由結合至與存在於所有成核細胞之表面上的MHC I類分子締合之抗原來識別其目標。細胞毒性效應細胞(例如，CD8+細胞)包括例如穿孔蛋白及顆粒酶B。
抗原決定基： 術語「抗原決定基」亦可稱為抗原決定子，其為可經結合劑、免疫球蛋白或T細胞受體特異性結合的分子決定子(例如，多肽決定子)。抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，其可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗體或抗體之抗原結合片段所識別之抗原決定基為與抗體或片段之CDR (例如，互補位點)相互作用的抗原之結構元件。抗原決定基可藉由來自若干胺基酸殘基之作用形成，該等胺基酸殘基與抗體之CDR相互作用以產生特異性。抗原片段可含有多於一個抗原決定基。在某些實施例中，在蛋白質及/或大分子之複合混合物中，當抗體識別其目標抗原時，該抗體特異性結合抗原。舉例而言，若抗體交叉競爭(一個抗體阻止另一抗體之結合或調節效應)，則抗體稱為「結合至相同抗原決定基」。
相等親和性 ：在本發明之上下文中，術語「相等親和性」欲意謂：i)如藉由適合活體外結合分析，諸如溶液平衡滴定(諸如MSD-SET)、生物層干涉術(諸如Octet®)或表面電漿子共振(諸如Biacore系統)所量測，抗體以小於五倍之親和性偏向結合基質締合之前TGFb1複合物及細胞締合之前TGFb1複合物；及/或ii)抗體對四種複合物之相對親和性係均一的，其中：抗體在四種抗原複合物中顯示之最低親和性(最高KD數值)不比由其餘三個親和性計算之平均值低超過五倍；或，抗體在四種抗原複合物中顯示之最高親和性(最低KD數值)不比由其餘三個親和性計算之平均值高超過五倍。具有相等親和性之抗體可達成較均一的抑制效應，而無關於與前TGFβ1複合物締合之特定呈遞分子(因此「非情形依賴性」)。在尤佳實施例中，在基質締合之複合物與細胞締合之複合物之間觀測到的平均親和性之偏向不超過三倍。
延伸型潛伏套索 ：如本文所用，術語「延伸型潛伏套索」係指包含潛伏套索及α-2螺旋(例如，LASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTR (SEQ ID NO: 154))之前域的一部分。在一些實施例中，延伸型潛伏套索進一步包含α-1螺旋之一部分，例如，LVKRKRIEA (SEQ ID NO: 159)或其部分。
纖維化： 術語「纖維化」或「纖維性病狀/病症」係指特徵為組織或器官中之細胞外基質(ECM)組分(諸如膠原蛋白)病理性積聚的過程或表現。
纖維性微環境 ： 術語「纖維性微環境」係指組織中的局部疾病生態棲位，其中活體內存在纖維化。纖維性微環境可包含疾病相關分子特徵(一組趨化因子、細胞介素等)、疾病相關細胞群(諸如活化巨噬細胞、MDSC等)以及疾病相關ECM環境(ECM組分及/或結構有變化)。纖維性微環境被認為會支持纖維母細胞以TGFβ依賴性方式轉化成α-平滑肌肌動蛋白陽性肌纖維母細胞。纖維性微環境之進一步特徵可為浸潤特定免疫細胞(諸如巨噬細胞及MDSC)。
( TGF β 1 生長因子之 ) 指 - 1 ：如本文所用，「指-1」為TGFβ1生長因子域內之域。在其未突變形式中，人類前TGFβ1之指-1含有以下胺基酸序列：CVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFC (SEQ ID NO: 151)。在3D結構中，指-1域(部分如圖18及圖19中之區「5a」所示)非常接近於潛伏套索。
( TGF β 1 生長因子之 ) 指 -2 ：如本文所用，「指-2」為TGFβ1生長因子域內之域。在其未突變形式中，人類前TGFβ1之指-2含有以下胺基酸序列：CVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (SEQ ID NO: 152). 指-2包括圖18及圖19中所描繪之「結合區6」(亦即，「6a」及「6b」)，其在空間上非常接近於潛伏套索。
GARP- 前 TGF β 1 複合物： 如本文所使用，術語「GARP-TGFβ1複合物」係指包含轉型生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白之前蛋白形式或潛伏形式及以糖蛋白-A重複序列為主型蛋白(GARP)或其片段或變異體的蛋白質複合物。在一些實施例中，TGFβ1蛋白之前蛋白形式或潛伏形式可稱為「前TGFβ1蛋白/潛伏TGFβ1蛋白」。在一些實施例中，GARP-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前TGFβ1/潛伏TGFβ1共價連接之GARP。本質上，此類共價鍵由接近於前TGFβ1二聚體複合物之N端(例如，胺基酸位置4)存在的半胱胺酸殘基形成。在其他實施例中，GARP-TGFβ1複合物包含與前TGFβ1/潛伏TGFβ1非共價連接之GARP。在一些實施例中，GARP-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之GARP-TGFβ1複合物。術語「hGARP」表示人類GARP。
高親和性 ：如本文所用，如在「高親和性前TGFβ1抗體」中之術語「高親和性」係指KD 值≤ 5 nM，更佳≤ 1 nM之活體外結合活性。因此，由本文中本發明涵蓋之高親和性、非情形依賴性前TGFβ1抗體對以下抗原複合物中之每一者具有≤ 5 nM，更佳≤ 1 nM之KD 值：LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。
人類抗體： 如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可包括例如CDR，且尤其CDR3中非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由活體外無規或定點突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所用，術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系之CDR序列已移植於人類構架序列上的抗體。
人類化抗體： 術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列但該VH及/或VL序列之至少一部分已變成較「類人類(human-like)」，亦即，更類似於人類生殖系可變序列。一種人類化抗體類型為其中人類CDR序列引入非人類VH及VL序列中以置換對應非人類CDR序列的CDR移植抗體。「人類化抗體」亦為免疫特異性地結合至相關抗原，且包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列的FR區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列的CDR區的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本文所用，術語「實質上」在CDR之情形下係指CDR之胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性。人類化抗體實質上包含所有至少一個且通常兩個可變域(Fab、Fab'、F(ab')2 、FabC、Fv)，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即，供體抗體)之CDR區且所有或實質上所有FR區係具有人類免疫球蛋白共同序列之FR區。在一實施例中，人類化抗體亦包含免疫球蛋白Fc區之至少一部分，通常人類免疫球蛋白之Fc區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含輕鏈及/或人類化重鏈之人類化可變域。
氫 / 氘交換質譜 ( HDX - MS ) ： HDX-MS為用於藉由量測溶劑可接近性之程度來查詢蛋白質確認及溶液中的蛋白質-蛋白質相互作用的熟知技術。參見例如，Wei等人, (2014) Drug Discov Today 19(1): 95-102. 「Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications」。HDX-MS技術可用於測定經抗體結合之一或多個區(亦即，「結合區」)。因此，此類結合區可含有或形成抗原決定基。
免疫排除或免疫排除腫瘤 ：如本文所用，表徵為「免疫排除」之腫瘤不含或實質上不含瘤內抗腫瘤淋巴球。舉例而言，具有不良浸潤T細胞之腫瘤可具有包圍腫瘤，例如腫瘤塊之外部周邊及/或接近腫瘤之血管附近(「血管周」)之T細胞，儘管如此，其未能有效地湧入腫瘤中以施加針對癌細胞之細胞毒性功能。在其他情況下，腫瘤未能激起強免疫反應(所謂的「冷」或「免疫沙漠(immune desert)」腫瘤)，使得極少T細胞接近或在腫瘤環境中存在。與免疫排除腫瘤相比，經抗腫瘤淋巴球浸潤之腫瘤有時表徵為「熱」或「發炎」腫瘤；此類腫瘤往往會對免疫檢查點阻斷療法(「CBT」)更具反應性，且因此為該等療法之目標。然而，通常，歸因於使腫瘤對CBT具有抗性之免疫排除，僅一部分患者對CBT起反應。
免疫抑制 ( Immunosuppression / immunosuppressive ) ： 該術語係指抑制免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞及B細胞之能力。用於評估免疫抑制功能之最高準則為抑制T細胞活性，其可包括抗原特異性抑制及非特異性抑制。調節T細胞(Treg)及MDSC可視為免疫抑制細胞。M2極化巨噬細胞(例如，疾病局部巨噬細胞，諸如TAM及FAM)亦可表徵為免疫抑制的。
免疫記憶 ：免疫記憶係指免疫系統快速且特異性識別身體先前已遇到之抗原，且起始對應免疫反應的能力。一般而言，此等為對相同抗原之二級、三級及其他後續免疫反應。免疫記憶產生免疫系統之調適性組分，特殊T細胞及B細胞，所謂的記憶T細胞及B細胞。在遇到專職抗原呈遞細胞(例如樹突狀細胞)表面上MHC分子之環境內的同源抗原後，未接觸抗原之T細胞擴增且分化成記憶及效應T細胞。所有記憶T細胞次型之單一統一主題為其長期存活，且可在再暴露於其同源抗原後快速擴增至大數目的效應T細胞。藉由此機制，其為免疫系統提供針對先前所遇到之病原體的「記憶」。記憶T細胞可為CD4+或CD8+，且通常表現CD45RO。在臨床前背景中，免疫記憶可在腫瘤再攻擊範例中測試。
異構體特異性 ： 術語「異構體特異性」係指藥劑判別一種異構體與其他結構相關異構體之能力(亦即，選擇性)。異構體特異性TGFβ抑制劑在給定濃度下對TGFβ之一種異構體，而非對TGFβ之其他異構體施加其抑制活性。舉例而言，異構體特異性TGFβ1抗體選擇性地結合TGFβ1。相對於TGFβ2或TGFβ3，TGFβ1特異性抑制劑(抗體)以實質上較高親和性優先靶向(結合，藉此抑制)TGFβ1異構體。舉例而言，此情形下之選擇性可指如藉由活體外結合分析，諸如Octet®及Biacor所量測，各別親和力相差至少500至1000倍。在一些實施例中，選擇性使得當以一定劑量使用時，抑制劑會有效地活體內抑制TGFβ1，而不抑制TGFβ2及TGFβ3。為了使此類抑制劑適用作達成期望效應之治療性劑量(例如，治療有效量)，其必須處於以下窗內，在該窗內抑制劑可有效地抑制TGFβ1異構體而不抑制TGFβ2或TGFβ3。
分離： 如本文所用，「分離」抗體係指實質上不含具有不同抗原特異性的其他抗體之抗體。在一些實施例中，分離抗體實質上不含其他非預期細胞物質及/或化學物質。
大型潛伏複合物 ：在本發明之上下文中，術語「大型潛伏複合物」(「LLC」)係指包含結合至所謂的呈遞分子之前TGFβ1二聚體的複合物。因此，大型潛伏複合物為呈遞分子-前TGFβ1複合物，諸如LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。此類複合物可使用能夠形成複合物之重組、經純化組分活體外形成。出於篩選目的，用於形成此類LLC之呈遞分子不必為全長多肽；然而，通常需要能夠與前TGFβ1二聚體複合物經接近於其N端區之半胱胺酸殘基形成二硫鍵的蛋白質之部分。
潛伏相關肽 ( LAP ) ：LAP為所謂的前TGFβ1「前域」。如本文中更詳細地描述，LAP包含「約束衣(Straight Jacket)」域及「臂」域。拘束衣自身進一步分成α-1螺旋及潛伏套索域。
潛伏套索：如本文所用，「潛伏套索」，有時亦稱作潛伏環，為前TGFb1前域內由α-1螺旋及臂側接之域。在未突變形式中，人類前TGFβ1之潛伏套索包含胺基酸序列：LASPPSQGEVPPGPL (SEQ ID NO: 153)，且實質上對應於圖18A中所示之區「2a」及「2b」，且由圖19A中所鑑別之1區跨越。如本文所用，術語「延伸型潛伏套索區」係指潛伏套索連同其被稱作前域之α-2螺旋(α2-螺旋)之最接近的C端基元。潛伏套索之C端處的脯胺酸殘基提供如「彎管(elbow)」之垂直「圈」，其將套索環連接至α2-螺旋。延伸型潛伏套索包含如圖18及圖19中「2a」、「2b」及「2c」所示之區。某些高親和性TGFβ1活化抑制劑至少部分結合至潛伏套索或其部分，以賦予抑制性效力(例如，阻斷活化之能力)。
局部： 在本發明之情形下，術語「局部」(如在「局部腫瘤」、「疾病局部」等中)係指解剖學上分離或可分離之異常，諸如實體惡性疾病，其與全身性疾病相對。某些白血病，例如可具有針對疾病的局部組分(例如骨髓)及全身性組分(例如循環血細胞)。
LRRC33- 前 TGF β 1 複合物： 如本文所用，術語「LRRC33-TGFβ1複合物」係指轉型生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白質之前蛋白質形式或潛伏形式與含富白胺酸重複序列之蛋白質33 (LRRC33；亦稱為活性含氧物之負調控劑或NRROS)或其片段或變異體之間的複合物。在一些實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前TGFβ1/潛伏TGFβ1共價連接之LRRC33。本質上，此類共價鍵由接近於前TGFβ1二聚體複合物之N端(例如，胺基酸位置4)存在的半胱胺酸殘基形成。在其他實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物包含與前TGFβ1/潛伏TGFβ1非共價連接之LRRC33。在一些實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之LRRC33-TGFβ1複合物。術語「hLRRC33」表示人類LRRC33。在活體內，細胞表面上之含LRRC33及LRRC33複合物可內化。LRRC33在一小類骨髓細胞上表現，該等骨髓細胞包括M2極化巨噬細胞(諸如TAM)及MDSC。
LTBP1- 前 TGF β 1 複合物： 如本文所用，術語「LTBP1-TGFβ1複合物」係指包含轉型生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白質之前蛋白質形式或潛伏形式與潛伏TGF-β結合蛋白1 (LTBP1)或其片段或變異體的蛋白質複合物。在一些實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前TGFβ1/潛伏TGFβ1共價連接之LTBP1。本質上，此類共價鍵由接近於前TGFβ1二聚體複合物之N端(例如，胺基酸位置4)存在的半胱胺酸殘基形成。在其他實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物包含與前TGFβ1/潛伏TGFβ1非共價連接之LTBP1。在一些實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之LTBP1-TGFβ1複合物。術語「hLTBP1」表示人類LTBP1。
LTBP3- 前 TGF β 1 複合物： 如本文所用，術語「LTBP3-TGFβ1複合物」係指包含轉型生長因子-β1 (TGFβ1)蛋白質之前蛋白質形式或潛伏形式與潛伏TGF-β結合蛋白3 (LTBP3)或其片段或變異體的蛋白質複合物。在一些實施例中，LTBP3-TGFβ1複合物包含經由一或多個二硫鍵與前TGFβ1/潛伏TGFβ1共價連接之LTBP3。本質上，此類共價鍵由接近於前TGFβ1二聚體複合物之N端(例如，胺基酸位置4)存在的半胱胺酸殘基形成。在其他實施例中，LTBP3-TGFβ1複合物包含與前TGFβ1/潛伏TGFβ1非共價連接之LTBP1。在一些實施例中，LTBP3-TGFβ1複合物為天然存在之複合物，例如細胞中之LTBP3-TGFβ1複合物。術語「hLTBP3」表示人類LTBP3。
M2 或類 M2 巨噬細胞 ：M2巨噬細胞表示一小類活化或極化巨噬細胞，且包括纖維性及腫瘤微環境中的疾病相關之巨噬細胞。M2極化巨噬細胞之細胞表面標記物通常包括CD206及CD163 (亦即，CD206+/CD163+)。M2極化巨噬細胞亦可表現細胞表面LRRC33。M2巨噬細胞之活化主要由IL-4、IL-13、IL-10及TGFβ促進；其分泌活化該等巨噬細胞之相同細胞介素(IL-4、IL-13、IL-10及TGFβ)。此等細胞具有較高吞噬細胞能力且產生ECM組分、血管生成及趨化性因子。由巨噬細胞釋放TGFβ可維持疾病組織，諸如纖維性組織及腫瘤基質中的肌纖維母細胞活化、EMT及EndMT誘導。舉例而言，M2巨噬細胞對於TGFβ驅動肺纖維化必不可少且富集於數種腫瘤中。
基質締合之前 TGFβ1 ：LTBP1及LTBP3為呈細胞外基質(ECM)之組分的呈遞分子。LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1可統稱為「ECM締合之」(或「基質締合之」)前TGFβ1複合物，其介導ECM締合之TGFβ1活化/信號傳遞。
最大耐受劑量 ( MTD ) ：在安全性/毒理學考慮因素之情形下，術語MTD通常係指評估有無觀測到的不良反應量(NOAEL)的測試製品(諸如TGFβ1抑制劑)之最高量。舉例而言，基於四週毒理學研究，大鼠中的Ab6之NOAEL為所評估之最高劑量(100 mg/kg)，其表明Ab6之MTD ＞ 100 mg/kg。在非人類靈長類動物中，Ab6之NOAEL為所評估之最高劑量(300 mg/kg)，表明基於四週毒理學研究，非人類靈長類動物中Ab6之MTD ＞300 mg/kg。
Meso-Scale Discovery: 「Meso-Scale Discovery」或「MSD」為一種採用電化學發光(ECL)作為偵測技術的免疫分析之類型。通常，使用高結合碳電極來捕獲蛋白質(例如，抗體)。抗體可與特定抗原一起培育，可用與電化學發光標記結合之二級抗體偵測其結合。出現電信號後，可量測光強度以對樣本中之分析物進行定量。
骨髓纖維化 ：「骨髓纖維化」，亦稱作骨性骨髓纖維化(osteomyelofibrosis)，為相對罕見的骨髓增生性病症(例如，癌症)，其屬於稱作骨髓增生病之疾病類別。骨髓纖維化劃分在骨髓增生性贅瘤之費城染色體(Philadelphia chromosome)陰性(-)分支中。骨髓纖維化之特徵為骨髓及其他位點中異常純系之造血幹細胞增殖導致纖維化，或骨髓經瘢痕組織替代。術語骨髓纖維化涵蓋原發性骨髓纖維化(PMF)，其亦稱作慢性特發性骨髓纖維化(cIMF) (術語特發性及原發性意謂在此等情況下，疾病具有未知或自發起源)，以及繼發性類型之骨髓纖維化，諸如繼發於真性紅血球增多症(PV)或原發性血小板增多症(ET)之骨髓纖維化。骨髓纖維化為一種骨髓細胞化生之形式，其係指骨髓之造血組織中的細胞類型發生變化，且通常兩種術語以同義使用。術語原因不明性骨髓細胞化生及伴隨骨髓細胞化生之骨髓纖維化(MMM)亦用以指原發性骨髓纖維化。骨髓纖維化之特徵為導致下游JAK路徑上調或過度活化之突變。
骨髓細胞 ：在造血中，骨髓細胞為產生於顆粒球、單核球、紅血球或血小板之祖細胞(共同骨髓祖細胞，亦即，CMP或CFU-GEMM)的血細胞，或按亦通常使用之狹義，特定而言產生於骨髓母細胞(骨髓細胞、單核球及其裂變產物類型)譜系的血細胞，骨髓母細胞區別於來自產生B細胞及T細胞之共同淋巴祖細胞的淋巴細胞(亦即，淋巴球)。小鼠及人類兩者中某些骨髓細胞類型、其一般形態、典型細胞表面標記物及其免疫抑制能力在以下概述。
Figure 108124516-A0304-0001
骨髓衍生之抑制細胞 ： 骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)為多種病理性病狀期間產生的異質細胞群，且認為其表示單核細胞之活化之病理狀態及相對較不成熟之嗜中性白血球。MDSC包括至少兩類細胞，其稱為i) 「顆粒球性」(G-MDSC)或多形核(PMN-MDSC)，其在表型及形態上與嗜中性白血球相似；及ii)單核球性(M-MDSC)，其在表型及形態上與單核球相似。MDSC之特徵在於一組獨特的基因體及生物化學特徵，且可藉由特異性表面分子來區分。舉例而言，人類G-MDSC/PMN-MDSC通常表現細胞表面標記物CD11b、CD33、CD15及CD66。此外，人類G-MDSC/PMN-MDSC亦可表現HLA-DR及/或精胺酸酶。相比之下，人類M-MDSC通常表現細胞表面標記物CD11b、CD33及CD14。此外，人類M-MDSC亦可表現HLA-DR。除了此類細胞表面標記物之外，MDSC之特徵在於抑制免疫細胞，諸如T細胞、NK細胞及B細胞之能力。MDSC之免疫抑制功能可包括非抗原特異性功能之抑制及抗原特異性功能之抑制。MDSC可表現細胞表面LRRC33及/或LRRC33-前TGFβ1。
肌纖維母細胞： 肌纖維母細胞為具有纖維母細胞及平滑肌細胞之某些表型的細胞，且一般表現波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA；人類基因ACTA2)及帕拉丁蛋白(paladin)。在涉及細胞外基質調節異常(諸如基質硬度增加)的多種疾病病狀中，正常纖維母細胞以TGFβ依賴性方式變得去分化成肌纖維母細胞。TGFβ之異常過度表現在肌纖維母細胞驅動病變中為常見的。已知TGFβ會促成肌纖維母細胞分化、細胞增殖及基質產生。纖維性微環境中之肌纖維母細胞或類肌纖維母細胞細胞可稱為纖維化相關纖維母細胞(或「FAF」)，且腫瘤微環境中之肌纖維母細胞或類肌纖維母細胞細胞可稱為癌症相關纖維母細胞(或「CAF」)。
泛 TGFβ 抑制劑 / TGFβ 之泛抑制 ：術語「泛TGFβ抑制劑」係指能夠抑制或拮抗TGFβ之全部三種異構體的任何藥劑。此類抑制劑可為TGFβ異構體之小分子抑制劑，諸如此項技術中已知之彼等。該術語包括泛TGFβ抗體，其係指能夠結合至TGFβ異構體中之每一者，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3的任何抗體。在一些實施例中，泛TGFβ抗體結合且中和全部三種異構體，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之活性。抗體1D11 (或人類類似物福萊索單抗(Fresolimumab) (GC1008))為中和TGFβ之全部三種異構體的泛TGFβ抗體之熟知實例。小分子泛TGFβ抑制劑之實例包括高倫替布(galunisertib) (LY2157299單水合物)，其為介導所有三種TGFβ異構體之信號傳遞的TGFβ受體I激酶/ALK5的拮抗劑。
血管周 ( 浸潤 ) ：前綴「周 ( peri ) 」意謂「周圍」「圍繞」或「接近於」，因此「血管周」字面上翻譯為血管周圍。如本文在腫瘤細胞浸潤之情形下所用，術語「血管周浸潤」係指腫瘤浸潤免疫細胞(例如，淋巴球)經實體腫瘤之血管的進入模式。
效能： 如本文所用，術語「效能」係指藥物，諸如具有抑制活性之抑制性抗體(或片段)相對於產生限定作用的該藥物之濃度或量之活性。舉例而言，能夠在給定劑量下產生某些作用的抗體要比為產生等效作用需要兩倍該量(劑量)之另一抗體強效。效能可在基於細胞之分析，諸如TGFβ活化/抑制分析中量測。通常，在能夠結合至抗原之相同或重疊結合區的抗體(例如，交叉阻斷抗體)中，具有較高親和性(較低KD 值)之抗體往往會顯示出比具有較低親和性(較高KD 值)之抗體要高的效能。
呈遞分子 ：在本發明之情形下，呈遞分子係指蛋白質，該等蛋白質與潛伏前蛋白(例如，前TGFβ1)形成共價鍵，且在細胞外生態棲位(諸如ECM或免疫細胞表面)中繫留(「呈遞」)非活性複合物，藉此在活化事件出現之前維持其潛伏。已知的前TGFβ1之呈遞分子包括：LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33，其各自可分別形成呈遞分子-前TGFβ1複合物，亦即，LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。LTBP1及LTBP3為細胞外基質(ECM)之組分；因此，LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1可統稱為「ECM締合之」(或「基質締合之」)前TGFβ1複合物，其介導ECM締合之TGFβ1信號傳遞/活性。另一方面，GARP及LRRC33為表現於某些細胞之細胞表面上之跨膜蛋白；因此，GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1可統稱為「細胞締合之」(或「細胞表面」)前TGFβ1複合物，其介導細胞締合之(例如，免疫細胞締合之) TGFβ1信號傳遞/活性。
保護 ( 避免 溶劑暴露 ) ：在蛋白質-蛋白質相互作用，諸如抗體-抗原結合的基於HDX-MS之評定之情形下，蛋白質(例如，含有抗原決定基的蛋白質之區域)暴露於溶劑，藉此使得質子交換發生的程度與結合/相互作用之程度逆相關。因此，當本文中所述之抗體結合至抗原之區域時，結合區「經保護」而避免暴露於溶劑，因為蛋白質-蛋白質相互作用會阻止結合區以避免可經周圍溶劑接近。因此，經保護之區域指示相互作用之位點。通常，適合溶劑為生理緩衝液。
前 TGF β 1 ： 如本文所用，術語「前TGFβ1」意欲涵蓋在複合物中包含TGFβ1之前域序列的非活性TGFβ1複合物之前驅體形式。因此，該術語可包括前TGFβ1形式以及潛伏TGFβ1形式。表述「前TGFβ1/潛伏TGFβ1」可互換使用。「前」TGFβ1形式在弗林蛋白酶位點處發生蛋白質裂解之前存在。裂解後，所得形式稱為TGFβ1之「潛伏」形式。「潛伏」複合物在觸發進一步活化，諸如整合素驅動活化事件之前保持非共價結合。前TGFβ1複合物係由與二硫鍵連接之二聚TGFβ1前蛋白多肽構成。潛伏二聚體複合物經由前TGFβ1多肽中之每一者之位置4處的半胱胺酸殘基(Cys4)共價連接至單一呈遞分子。形容詞「潛伏」可通常/廣義地用於描述經整合素介導或其他活化事件之前，TGFβ1之「非活性」狀態。前TGFβ1多肽含有前域(LAP)及生長因子域(SEQ ID NO: 146)。
消退 ( 腫瘤消退 ) ： 腫瘤或腫瘤生長之消退可用作活體內功效量度。舉例而言，在臨床前環境中，中值腫瘤體積(MTV)及消退反應治療功效之準則(Criteria for Regression Responses Treatment efficacy)可由在最後一天，研究中剩餘動物之腫瘤體積測定。治療功效亦可由在研究期間觀測到的消退反應之發生率及大小來測定。在動物中治療可使腫瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。對療法(例如，藥物之投與)起反應而達成之完全消退可稱為「完全反應」，且達成完全反應之個體可稱為「完全反應者」。因此，完全反應不包括自發完全消退。在臨床前腫瘤模型之一些實施例中，PR反應定義為對於研究過程期間的三次連續量測，腫瘤體積為其第1天體積之50%或更小，且對於此等三次量測中之一或多者而言，等於或大於13.5 mm3 。在一些實施例中，CR反應定義為對於研究過程期間的三次連續量測，腫瘤體積低於13.5 mm3 。在臨床前模型中，研究結束時具有CR反應之動物可另外歸類為無腫瘤存活者(TFS)。術語「有效腫瘤控制」可用於指對治療起反應而達成之腫瘤消退之程度，其中舉例而言，腫瘤體積縮小至小於對治療起反應之指標腫瘤體積之25%。舉例而言，在特定模型中，若指標腫瘤體積為2,000 mm3 ，則若腫瘤縮小至小於500 mm3 ，即達成有效腫瘤控制。因此，有效腫瘤控制涵蓋完全消退以及達至臨限縮小值之部分消退。
調節 T 細胞 ： 「調節T細胞」或Treg為藉由生物標記物CD4、FOXP3及CD25之表現表徵的免疫細胞之類型。Treg有時稱作抑制T細胞且表示調節免疫系統、維持對自身抗原之耐受性及預防自體免疫疾病的T細胞之亞群。Treg為免疫抑制的且一般抑制或下調效應T(Teff)細胞之誘導及增殖。Treg可在胸腺中產生(所謂CD4+ Foxp3+ 「天然」Treg)或自周邊中之初始CD4+ T細胞，例如在暴露於TGFβ或視黃酸之後分化。Treg可表現細胞表面GARP-前TGFβ1。
抗性 ( 針對療法 ) ： 對特定療法(諸如CBT)之抗性可歸因於諸如癌症之疾病的先天性特徵(「原發性抗性」)或歸因於治療之後隨時間推移產生的後天性表型(「後天抗性」)。未顯示對療法有治療反應之患者(例如，為無反應者或對療法之反應較差的患者)被稱為對療法具有原發性抗性。起初顯示對療法有治療反應，但隨後喪失效應(例如，儘管療法繼續，但仍出現進展或再發)之患者被稱為對療法具有後天抗性。
實體腫瘤中之反應評估準則 ( RECIST ) 及 iRECIST ： RECIST為界定癌症患者中之腫瘤在治療期間何時改善(「反應」)、保持原樣(「穩定」)或惡化(「進展」)的一組公開規則。該等準則由包括歐洲癌症研究及處理組織(European Organisation for Research and Treatment of Cancer；EORTC)、美國國家癌症研究所(National Cancer Institute of the United States)及加拿大國家癌症研究所臨床試驗組(National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group)之國際合作於2000年2月公佈。之後已普遍採用RECIST準則之修訂版(RECIST v 1.1)，(參見：Eisenhauera等人 (2009), 「New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (版本1.1)」 Eur J Cancer 45: 228-247，其併入本文中)。
反應準則如下：完全反應(CR)：所有目標病變消失；部分反應(PR)：以基線LD總和作為參考，目標病變之LD總和下降至少30%；穩定疾病(SD)：自開始治療起，以最小LD總和作為參考，既未足以縮小至符合PR，亦未足以增加至符合PD；進行性疾病(PD)：自開始治療或出現一或多個新型病變起，以所記錄之最小LD總和作為參考，目標病變之LD總和增加至少20%。
另一方面，iRECIST提供考慮免疫相關反應之經修改之一組準則(參見：www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5648544/，其內容以引用之方式併入本文中)。RECIST及iRECIST準則為標準化的，可隨著更多的資料變得可用進行不定期修訂，且在此項技術中得到較好理解。
實體腫瘤 ：術語「實體腫瘤」係指引起組織之異常生長或腫塊的增生性病症，該組織通常不含囊腫或液態區域。實體腫瘤可為良性(非癌性)或惡性(癌性)。實體腫瘤包括晚期惡性疾病之腫瘤，諸如局部晚期實體腫瘤及轉移癌。實體腫瘤通常由多種細胞類型構成，其包括(但不限於)癌性(惡性)細胞、基質細胞(諸如CAF)及浸潤白血球(諸如巨噬細胞、MDSC及淋巴細胞)。用TGFβ1之異構體選擇性抑制劑治療的實體腫瘤，諸如本文中所述之實體腫瘤通常為TGFβ1陽性(TGFβ1+)腫瘤，其可包括產生TGFβ1之多個細胞類型。在某些實施例中，TGFβ1+腫瘤亦可共表現TGFβ3 (亦即，TGFβ3陽性)。舉例而言，某些腫瘤為TGFβ1/3共顯性。在一些實施例中，此類腫瘤由上皮細胞癌症(例如，癌瘤)引起。
溶液平衡滴定 ( SET ) ：SET為一種以下分析：藉由該分析，兩種分子(諸如抗原及結合抗原之抗體)之間的結合可在溶液中在平衡下量測。舉例而言，基於Meso-Scale Discovery(「MSD」)之SET或MSD-SET為一種測定特別高親和性蛋白質-蛋白質相互作用，諸如結合至其抗原之皮莫耳親和性抗體，在平衡下之解離常數的適用模式(參見例如：Ducata等人(2015) J Biomolecular Screening 20(10): 1256-1267)。基於SET之分析尤其適用於測定具有次奈莫耳(例如，皮莫耳)親和性的抗體之KD 值。
特異性結合： 如本文所用，術語「特異性結合(specific binding/specifically binds)」意謂抗體或其抗原結合部分與抗原之相互作用視特定結構(例如，抗原決定子或抗原決定基)之存在而定。舉例而言，抗體或其抗原結合部分結合至特異性蛋白質而非以一般方式結合至蛋白質。在一些實施例中，若抗體對於目標之KD 為至少約10- 8 M、10- 9 M、10- 10 M、10- 11 M、10- 12 M或更小，則抗體或其抗原結合部分特異性結合至目標，例如TGFβ1。在一些實施例中，如本文所用，術語「特異性結合至前TGFβ1之抗原決定基(specific binding to an epitope of proTGFβ1/specifically binds to an epitope of proTGFβ1)」、「特異性結合至前TGFβ1 (specific binding to proTGFβ1/specifically binds to proTGFβ1)」係指如藉由適合活體外結合分析(諸如表面電漿子共振及生物層干涉術(BLI)所測定，抗體或其抗原結合部分結合至前TGFβ1且解離常數(KD )為1.0 × 10- 8 M或更小。在一個實施例中，抗體或其抗原結合部分可特異性結合至前TGFβ1之人類及非人類(例如，小鼠)直系同源物兩者。
個體： 在治療性應用之情形下，術語「個體」係指接受臨床照護或干預，諸如治療、診斷等的個體。適合個體包括脊椎動物，其包括(但不限於)哺乳動物(例如，人類及非人類哺乳動物)。在個體為人類個體之情況下，術語「患者」可互換使用。在臨床情形下，術語「患者群」或「患者亞群」用以指落入一組準則內之個體群組，諸如臨床準則(例如疾病表現、疾病期、對特定病狀之易感性、對療法之反應性等)、病史、健康狀況、性別、年齡群、遺傳準則(例如，特定突變、多形現象、基因複製、DNA序列重複序列等之攜帶者)及生活方式因素(例如，吸菸、飲酒、運動等)。
表面電漿子共振 ( SPR ) ：表面電漿子共振為使得能夠即時偵測未經標記相互作用物之光學現象。基於SPR之生物感測器，諸如可自Biacore商購之彼等，可用於量測生物分子相互作用，包括蛋白質-蛋白質相互作用，諸如抗原-抗體結合。該技術為此項技術中眾所周知的，且適用於測定諸如結合親和性、動力速率常數及熱動力學之參數。
TGF β 1 相關適應症 ：「TGFβ1相關適應症」為TGFβ1相關病症且意謂任何疾病或病症及/或病狀，其中發病機制及/或進展之至少部分可歸因於TGFβ1信號傳遞或其調節異常。某些TGFβ1相關病症主要由TGFβ1異構體驅動。患有TGFβ1相關適應症之個體可受益於抑制TGFβ1活性及/或含量。某些TGFβ1相關適應症主要由TGFβ1異構體驅動。TGFβ1相關適應症包括(但不限於)：纖維性病狀(諸如器官纖維化及涉及慢性發炎之組織的纖維化)；增生性病症(諸如癌症，例如實體腫瘤及骨髓纖維化)；與ECM調節異常相關之疾病(諸如涉及基質僵硬及重塑之病狀)；涉及間葉細胞轉化(例如，EndMT及/或EMT)之疾病；涉及蛋白酶之疾病；伴隨本文中所述之某些標記物之異常基因表現的疾病，該等適應症並不意欲相互排斥。
TGF β 抑制劑： 術語「TGFβ抑制劑」係指能夠拮抗TGFβ生長因子(例如，TGFβ1、TGFβ2及/或TGFβ3)之生物活性、信號傳遞或功能的任何藥劑。該術語並不意欲限制其作用機制，且包括例如TGFβ之中和抑制劑、受體拮抗劑、可溶性配位體捕獲劑及活化抑制劑。TGFβ抑制劑亦包括能夠例如藉由誘導經抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADPC)來降低可在生態棲位中活化的潛伏前TGFβ之可用性的抗體，以及引起包含潛伏前TGFβ之細胞表面複合物之內化，藉此在不耗損細胞本身的情況下自質膜移除前驅體的抗體。內化可為含LRRC33蛋白複合物(諸如人類LRRC33-前TGFβ1)之適合作用機制，其產生減少量之在細胞表面上表現含LRRC33蛋白複合物之細胞。
「TGFβ 家族 」為TGFβ超家族中之一類且在人類中含有三名結構相似之成員：TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3。已知三種生長因子經由相同受體進行信號傳遞。
TGF β 陽性癌症 / 腫瘤 ：如本文所用，該術語係指具有異常TGFβ1表現(過度表現)之癌症/腫瘤。許多人類癌症/腫瘤類型顯示TGFβ1異構體之主導性表現。在一些情況下，此類癌症/腫瘤可顯示另一異構體(諸如TGFβ3)之共顯性表現。數種上皮細胞癌症(例如，癌瘤)可共表現TGFβ1及TGFβ3。在TGFβ1陽性腫瘤之腫瘤環境內，TGFβ1可產生於多個來源，包括(例如)癌細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、癌症相關纖維母細胞(CAF)、調節T細胞(Treg)、骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)及周圍細胞外基質(ECM)。
治療窗 ：術語「治療窗」係指在個體中產生治療反應而不產生顯著/可觀測不良反應(例如，可接受或可耐受)不良反應的劑量範圍。治療窗可計算為最低有效濃度(MEC)與最低毒性濃度(MTC)之間的比率。為進行說明，在10 mg/kg下達成活體內功效且在100 mg/kg下顯示耐受性或可接受毒性的TGFβ1抑制劑至少提供10倍(例如，10×)治療窗。相比之下，在10 mg/kg下有效但在小於該有效劑量下引起不良反應的TGFβ之泛抑制劑被稱為具有「劑量限制性毒性 」。一般而言，最大耐受劑量(MTD)可設定治療窗之上限。
舉例而言，在大鼠或非人類靈長類動物中，顯示Ab6在介於約3至30毫克/公斤/週之間的劑量下為有效的，且亦顯示不含與至少100或300毫克/公斤/週持續4週劑量下之TGFβ之泛抑制相關的可觀測到之毒性。基於此，Ab6顯示最低3.3倍及至多100倍治療窗。
毒性： 如本文所用，術語「毒性(toxicity/toxicities)」係指個體(例如，患者)中的與向個體(例如，患者)投與之療法相關的不合需要之活體內作用，諸如不合需要之副作用及不良事件。「耐受性」係指與療法或治療方案相關的毒性之水準，其可經患者合理耐受，而不存在歸因於毒性而中斷療法。通常，在臨床研發之前在一或多個臨床前模型中進行毒性/毒理學研究以評定候選藥物(例如，單株抗體療法)之安全概況。毒性/毒理學研究可幫助測定測試物之「無觀測到之不良反應量 ( NOAEL ) 」及「最大耐受劑量 ( MTD ) 」，基於其可推斷治療窗。較佳地，應選擇顯示出對特定干預敏感之物種作為在其中待進行安全性/毒性研究之臨床前動物模型。在TGFβ抑制之情況下，適合物種包括大鼠、狗及食蟹獼猴。據報導，小鼠對TGFβ之藥理學抑制較不敏感，且其可能不會展現出對其他物種，包括人類有潛在危險的毒性，儘管某些研究報導在小鼠中伴隨TGFβ之泛抑制觀測到毒性。為在本發明之情形下進行說明，基於四週毒理學研究，大鼠中的Ab6之NOAEL為所評估之最高劑量(100 mg/kg)，其表明MTD ＞ 100 mg/kg。基於四週毒理學研究，在非人類靈長類動物中Ab6之MTD ＞300 mg/kg。
為確定NOAEL及MTD，較佳地，顯示為對特定干預敏感之物種應選為臨床前動物模型，安全性/毒理學研究將在該動物模型中進行。在TGFβ抑制之情況下，適合物種包括(但不限於)大鼠、狗及食蟹獼猴。據報導，小鼠對TGFβ之藥理學抑制較不敏感，且可能不顯示在包括人類之其他物種中潛在嚴重或危險的毒性。
治療 ( treat / treatment ) ： 術語「治療(treat/treatment)」包括治療性治療、預防性治療及其中降低個體將罹患病症之風險或降低其他風險因素的應用。因此，該術語意欲在廣義上意謂：藉由例如提高或強化身體之免疫力；降低或逆轉免疫抑制；降低、自身體移除或根除有害細胞或物質；降低疾病負擔(例如，腫瘤負荷)；預防再發或復發；延長不反應期及/或以其他方式改善存活期而在患者中引起治療性益處。該術語包括治療性治療、預防性治療及其中降低個體將罹患病症之風險或減少其他風險因素的應用。治療不需要完全治癒病症且涵蓋治療減少症狀或潛在風險因素之實施例。在組合療法之情形下，術語亦可指：i)第二治療劑降低第一治療劑之有效劑量以降低副作用且增加耐受性之能力；ii)第二療法使得患者對第一療法更具反應之能力；及/或iii)實現附加或協同臨床益處之能力。
腫瘤相關之巨噬細胞 ( TAM ) ： TAM為具有促腫瘤表型之極化/活化巨噬細胞(類M2巨噬細胞)。TAM可為募集至腫瘤位點的骨髓源單核球/巨噬細胞或源自紅系骨髓祖細胞。單核球/巨噬細胞分化成TAM會受多種因素影響，其包括局部化學信號，諸如細胞介素、趨化細胞素、生長因子及充當配位體之其他分子，以及生態棲位(腫瘤微環境)中所存在的單核球/巨噬細胞之間的細胞-細胞相互作用。通常，單核球/巨噬細胞可極化成所謂的「M1」或「M2」次型，後者更多地與促腫瘤表型相關。在實體腫瘤中，50%腫瘤塊可對應於巨噬細胞，其優先為M2極化的。在腫瘤相關單核球及骨髓細胞群中，M1巨噬細胞通常表現細胞表面HLA-DR、CD68及CD86，而M2巨噬細胞通常表現細胞表面HLA-DR、CD68、CD163及CD206。腫瘤相關的類M2巨噬細胞(諸如M2c及M2d次型)可表現細胞表面LRRC33及/或LRRC33-前TGFβ1。
腫瘤微環境 ： 術語「腫瘤微環境(TME)」係指局部疾病生態棲位，其中活體內駐留有腫瘤(例如，實體腫瘤)。TME可包含疾病相關分子標籤(一組趨化細胞素、細胞介素等)、疾病相關細胞群(諸如TAM、CAF、MDSC等)以及疾病相關ECM環境(ECM組分及/或結構變化)。
可變區： 術語「可變區」或「可變域」係指抗體之輕鏈及/或重鏈之一部分，其通常包括重鏈中的大約120至130個胺基端胺基酸及輕鏈中的約100至110個胺基端胺基酸。在某些實施例中，不同抗體之可變區在胺基酸序列方面有很廣泛地差異，甚至在相同物種之抗體中。抗體之可變區通常決定特定抗體對其目標之特異性。
應瞭解，除操作實例中或其中另有說明之外，本文中所用之表示成分之量或反應條件的所有數字可在所有情況下藉由術語「約」修飾。術語「約」當結合百分比使用時可意謂±1%。
除非明確相反指示，否則如在本文說明書及申請專利範圍中使用之不定冠詞「一(a/an)」應理解為意謂「至少一個」。
如本文在說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應理解為意謂如此結合之要素的「任一者或兩者」，亦即，在一些情況下結合地存在且在其他情況下未結合地存在的要素。除非明確相反指示，否則除由「及/或」條項具體標識之要素以外可視情況存在其他要素，不論與具體標識之彼等要素相關或不相關。因此，作為非限制性實例，在一個實施例中，當結合開放式語言，諸如「包含」使用時，提及「A及/或B」可指A而不存在B (視情況包括除B以外之要素)；在另一實施例中，指B而不存在A(視情況包括除A以外之要素)；在又另一實施例中，指A與B(視情況包括其他要素)；等。
如本說明書及申請專利範圍中所用，關於一系列一或多個要素之片語「至少一個」應理解為意謂由該系列要素中之要素之任何一或多個中選出的至少一個要素，但未必包括該系列要素內具體列出的各個及每個要素中之至少一者，且未必排除該系列要素中之要素的任何組合。此定義亦允許可視情況存在除片語「至少一個」所指的要素之清單內具體鑑別的要素以外的要素，而無論與具體鑑別的彼等要素相關抑或不相關。由此，作為非限制性實例，「至少一個A及B」(或等效地「至少一個A或B，」或，等效地「至少一個A及/或B」)可在一個實施例中指至少一個(視情況包括超過一個)A而不存在B (且視情況包括除B以外的要素)；在另一實施例中，指至少一個(視情況包括超過一個)B而不存在A (且視情況包括除A以外的要素)；在又一實施例中，指至少一個(視情況包括超過一個) A及至少一個(視情況包括超過一個) B (且視情況包括其他要素)；等。
在申請專利範圍中使用諸如「第一」、「第二」、「第三」等序數術語修飾請求項要素本身不意味著一個請求項要素相對於另一請求項要素的任何優先權、優先性或次序或執行方法動作之時間次序，而是僅用作標記以區分具有某一名稱之一個請求項要素與具有相同名稱(但使用序數術語)之另一要素以區分該等請求項要素。
本文所提供之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫。舉例而言，1至50之範圍應理解為包括來自由以下組成之群的任何數值、數值之組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，例如10至20、1至10、30至40等。轉型生長因子 - β (TGF β )
轉型生長因子-β (TGFβ)活性及可溶性生長因子之後續部分純化首先描述於20世紀70年代晚期至20世紀80年代早期，伴隨其TGFβ領域在約40年前已開始。到目前為止，已鑑別出構成大型TGFβ超家族之33種基因產物。TGFβ超家族可藉由結構相似性分類成至少三種子類：TGFβ、生長分化因子(GDF)及骨形態生成蛋白(BMP)。TGFβ子類由三種高度保守的異構體，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3構成，其在人類中由三種獨立基因編碼。
TGFβ被認為在諸如細胞增殖之抑制、細胞外基質(ECM)重塑及免疫內穩定之各種過程中起關鍵作用。TGFβ1對於T細胞內穩定之重要性係由TGFβ1-/-小鼠存活僅3至4週，由於大規模免疫活化而面臨多器官衰竭而證明(Kulkarni, A.B.等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): 第770-4頁；Shull, M.M.等人, Nature, 1992. 359(6397): 第693-9頁)。TGFβ2及TGFβ3之作用較不明確。儘管三種TGFβ異構體具有不同時間及空間表現型態，但其經由相同受體，TGFβRI及TGFβRII進行信號傳遞，儘管在一些情況下，例如對於TGFβ2信號傳遞，亦需要第III型受體，諸如β聚糖(betaglycan) (Feng, X.H.及R. Derynck, Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. 21: 第659-93頁；Massague, J., Annu Rev Biochem, 1998. 67: 第753-91頁)。TGFβRI/TGFβR II之經配位體誘導之寡聚會觸發SMAD轉錄因子之磷酸化，引起目標基因，諸如Col1a1、Col3a1、ACTA2及SERPINE1之轉錄(Massague, J., J. Seoane及D. Wotton, Genes Dev, 2005. 19(23): 第2783-810頁)。亦描述非SMAD依賴性TGFβ信號傳遞路徑，例如在癌症中或在馬凡氏(Marfan)小鼠之主動脈病變中(Derynck, R.及Y.E. Zhang, Nature, 2003. 425(6958): 第577-84頁; Holm, T.M.等人, Science, 2011. 332(6027): 第358-61頁)。
TGFβ路徑在人類中之生物重要性已藉由基因疾病驗證。卡-恩二氏病(Camurati-Engelman disease)由於TGFB1基因中的常染色體顯性突變引起骨發育不良，使得TGFβ1信號傳遞之組成性活化(Janssens, K.等人, J Med Genet, 2006. 43(1): 第1-11頁)。患有洛伊-迪茨症候群(Loeys/Dietz syndrome)之患者在TGFβ信號傳遞路徑之組分中攜帶常染色體顯性突變，其會引起主動脈瘤、器官過距(hypertelorism)及分岐懸壅垂(bifid uvula) (Van Laer, L., H. Dietz及B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: 第95-105頁)。由於TGFβ路徑調節異常涉及多重疾病，已研發靶向TGFβ路徑之若干藥物且在患者中進行測試，但成果有限。
TGFβ信號傳遞之調節異常與多種多樣的人類疾病相關。實際上，在多種疾病病狀中，此類調節異常可涉及TGFβ功能之多層面。患病組織，諸如纖維性及/或發炎組織及腫瘤可形成以下局部環境，在該局部環境中TGFβ活化會導致疾病惡化或進展，其可至少部分地由以自分泌及/或旁分泌方式活化的多個TGFβ反應性細胞以及在特定疾病環境中起一定作用的多種其他細胞介素、趨化細胞素及生長因子之間的相互作用介導。
舉例而言，除了癌症(亦即，惡性)細胞外，腫瘤微環境(TME)含有表現TGFβ1之多種細胞類型，諸如活化類肌纖維母細胞纖維母細胞、基質細胞、浸潤巨噬細胞、MDSC及其他免疫細胞。因此，TME表示表現TGFβ1及/或對TGFβ1起反應但在生態棲位中與多於一種類型之呈遞分子，例如LTBP1、LTBP3、LRRC33及GARP締合之異質細胞群。
免疫療法中之進展轉變了數目增長之癌症患者的有效治療前景。最突出的為檢查點阻斷療法(CBT)，目前其已變為數目增加之癌症之標準照護療法方案的一部分。儘管遍及數目增長之癌症類型已觀測到對CBT之深入且持久反應，但目前清楚相當大部分之腫瘤似乎甚至從治療一開始即難以用CBT治療，因此將原發抗性指向為對使許多患者之免疫系統能夠靶向且消除腫瘤細胞的主要挑戰。已為理解及解決賦予對CBT之原發抗性的根本機制作出努力，以便為更大數目之患者擴展治療功效。然而，此種熱情受到在將CBT與已知影響相同腫瘤類型或調節看起來相關的免疫系統組分之藥劑時黯淡的臨床試驗結果及失敗限制。可能的原因為給定組合之清楚的機理性基本原理通常不源自臨床衍生之資料，且由此導致意欲增強經批准之單劑療法的試驗中之不明確且混雜的結果。已清楚組合免疫療法之設計應源自與根本腫瘤及免疫系統生物學之相關性的科學證據。
最近，創造了被稱作「免疫排除」之現象以描述腫瘤環境，抗腫瘤效應T細胞(例如，CD8+ T細胞)由免疫抑制局部線索保持在該腫瘤環境外(因此「排除」)。最近，數個對臨床衍生之腫瘤的回溯性分析暗示介導對CBT之原發抗性中的TGFβ路徑活化。舉例而言，對治療前黑素瘤活檢體之轉錄譜研究及分析展現對抗PD-1 CBT不起反應之腫瘤中TGFβ相關路徑及生物過程的富集。在免疫排除腫瘤中，將另外能夠藉由識別細胞表面腫瘤抗原來攻擊癌細胞的效應細胞會阻止接近癌細胞之位點。以此方式，癌細胞避開宿主免疫力及利用且依賴於此類免疫力的免疫腫瘤學治療劑，諸如檢查點抑制劑。實際上，此類腫瘤顯示對檢查點抑制之抗性，諸如抗PD-1及抗PD-L1抗體，推測係因為目標T細胞被阻斷進入腫瘤，因此未能發揮抗癌作用。
數個對臨床衍生之腫瘤的回溯性分析在介導對CBT之原發抗性中指向TGFβ路徑活化。舉例而言，對治療前黑素瘤活檢體之轉錄譜研究及分析展現對抗PD-1 CBT不起反應之腫瘤中TGFβ相關路徑及生物過程的富集。最近，對來自轉移性尿道上皮癌患者之腫瘤的類似分析展現，缺少對利用阿特珠單抗(atezolizumab)之PD-L1阻斷的反應與TGFβ信號傳遞之轉錄特徵相關，尤其在CD8+ T細胞進入腫瘤似乎受排除之腫瘤中。TGFβ信號傳遞在介導產生抗PD-(L)1抗性之免疫排除中的關鍵作用已在乳癌EMT-6同基因型小鼠模型中得到證實。儘管EMT-6腫瘤對用抗PD-L1抗體進行之治療的反應性弱，但將此檢查點抑制劑與阻斷所有TGFβ異構體之活性的抗體1D11組合，產生當與用個別抑制劑進行之治療相比時，完全反應之頻率的深遠增加。提出協同抗腫瘤活性歸因於癌症相關纖維母細胞(CAF)表型改變及免疫排除表型分解，引起經活化CD8+ T細胞浸潤至腫瘤中。類似結果發現於使用抗PD-L1抗體與高倫替布之組合的結腸直腸癌及癌轉移鼠類模型中，高倫替布為I型TGFβ受體ALK5激酶之小分子抑制劑。集合地，此等研究結果表明，抑制CBT抗性腫瘤中之TGFβ路徑可為改良對CBT之臨床反應或增加對CBT之臨床反應之數目的有前景的方法。儘管最近的研究暗示TGFβ路徑活化與原發CBT抗性之間的關係，但TGFβ信號傳遞長期以來與癌症發病機制之特徵有關。作為強效免疫抑制因子，TGFβ阻止抗腫瘤T細胞活性且促進免疫抑制巨噬細胞。惡性細胞由於避開TGFβ生長及腫瘤抑制效應之機制通常變得對TGFβ信號傳遞具有抗性。TGFβ活化CAF，誘導細胞外基質產生及腫瘤進展促進。最後，TGFβ誘導EMT，由此支持組織侵入及腫瘤轉移。
哺乳動物具有編碼且表現三種TGFβ生長因子TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之相異基因，該等TGFβ生長因子經相同雜聚TGFβ受體複合物傳遞信號。儘管具有共同信號傳遞路徑，各TGFβ異構體似乎具有相異的生物功能，如由非重疊TGFβ基因剔除小鼠表型證明。所有三種TGFβ異構體表現為無活性前域-生長因子複合物，其中TGFβ前域，亦稱作潛伏相關肽(LAP)，環繞其生長因子且將生長因子保持在潛伏、非信號傳遞狀態。此外，潛伏TGFβ與潛伏TGFβ結合蛋白共表現，且經二硫鍵形成大型潛伏複合物(LLC)。潛伏TGFβ與潛伏TGFβ結合蛋白1 (LTBP1)或LTBP3之締合使得能夠繫留至細胞外基質，而締合至跨膜蛋白GARP或LRRC33使得能夠分別在Treg或巨噬細胞表面加工。在活體內，潛伏TGFβ1及潛伏TGFβ3由一小類αV整合素活化，該等αV整合素結合LAP上之共同RGD序列，觸發構形變化以釋放生長因子。潛伏TGFβ2之活化機制較不清楚，因為其缺少共同RGD基元。由LAP之蛋白水解裂解引起的TGFβ1釋放亦暗示為啟動機制，但其生物相關性較不清楚。
儘管在數種疾病病況中TGFβ活化之病原性作用係清楚的，但同樣清楚，歸因於由寬廣且持續路徑抑制引起之多效性效應，TGFβ路徑之治療性靶向已具有挑戰性。舉例而言，數個研究已顯示TGFβI型受體激酶ALK5 (TGFBR1)之小分子介導之抑制，或用高親和性抗體阻斷所有三種高度相關TGFβ生長因子導致小鼠、大鼠及狗的嚴重心臟瓣膜病。此等阻斷所有TGFβ信號傳遞之「泛」TGFβ方法因此具有極窄治療窗，其已證實為對具有極高未滿足之醫學需要之數種疾病相關過程進行治療的障礙。迄今為止無TGFβ靶向療法經批准，且此類模式之臨床試驗結果大部分為令人失望的，可能歸因於使用為顧及安全性問題而需要之證實為無功效的給藥方案。
隨寬廣TGFβ抑制出現之安全性問題，以及此路徑在多個疾病過程中之關鍵作用的有力證據，表明對一或多種TGFβ家族成員在疾病病理學中所起到之特定作用的較佳理解可產生治療性干預之可行途徑。就TGFβ及對CBT之反應而言，在本文中吾人觀測TGFβ1在許多人類腫瘤中之普遍表現，表明此家族成員可為此路徑對原發抗性之作用的關鍵驅動子。
如上文所提及，增加之證據表明TGFβ可為在疾病組織中產生及/或維持免疫抑制之主要參與者，包括免疫排除腫瘤環境。因此，TGFβ抑制可解除阻斷免疫抑制且使得效應T細胞(特定而言，細胞毒性CD8+ T細胞)能夠接近且殺死目標癌細胞。除了腫瘤浸潤之外，TGFβ抑制亦可促成CD8+ T細胞擴增。此類擴增可出現於淋巴結及/或腫瘤中(瘤內)。儘管強調此過程之確切機制尚待闡明，但預期免疫抑制係至少部分地由涉及調節T細胞及活化巨噬細胞的免疫細胞締合之TGFβ1活化介導。已報導，TGFβ直接促進CD4+ T細胞中的Foxp3表現，藉此將其轉化成調節(免疫抑制)表型(亦即，Treg)。另外，Treg抑制效應T細胞增殖(參見例如圖 26B )，藉此降低免疫反應。顯示此過程為TGFβ1依賴性的且有可能涉及GARP締合TGFβ1信號傳遞。人類及動物模型兩者中之觀測結果已表明，TME中Treg之增加係與多種類型之癌症中的不良預後相關。此外，申請者先前已顯示，暴露於諸如M-CSF之腫瘤衍生因子的M2極化巨噬細胞顯著地上調作為TGFβ1之呈遞分子的LRRC33之細胞表面表現(參見例如PCT/US2018/031759)。此等所謂的腫瘤相關巨噬細胞(或TAM)被認為會促成TME中的所觀測到之TGFβ1依賴性免疫抑制且促進腫瘤生長。
多種實體腫瘤之特徵在於具有富含肌纖維母細胞或類肌纖維母細胞細胞之腫瘤基質。此等細胞產生包圍或包覆腫瘤(諸如結締組織增生)之膠原基質，其至少部分地可由過度活化TGFβ1信號傳遞引起。預期TGFβ1活化係在腫瘤基質中經由ECM締合之呈遞分子，例如LTBP1及LTBP3介導。
申請人先前揭示在許多此等生物學背景下能夠抑制TGFβ1活化之抗體，其在活體外及活體內均顯示有前景的效應(參見例如PCT/US2018/012601)。然而，仍存在以下挑戰：i)產生改良抗體，其在對各種抗原複合物之親和性中顯示較少偏向，以便確保遍及不同生物學背景或疾病相關TGFβ1所駐存之生態棲位的均一抑制性效應，及ii)產生提供比先前所描述之對應物甚至更大效力之抗體。
對於本文所展示之研究，設想改良抗體應體現以下特徵中之全部或大部分：1)應維持對TGFβ1之選擇性以使與泛抑制相關之非所需毒性降至最低(「異構體選擇性 」) (參見例如PCT/US2017/021972)；2)應展現遍及各種生物學背景，或基質締合之類別及細胞締合之類別的寬廣結合活性(「非情形依賴性 」)；3)應達成遍及多個抗原複合物之較均勻或無偏向親和性(「均一性 」)；4)應顯示對抗原複合物中之每一者的強結合活性(「高親和性 」)；及5)應對每一情形具有穩健抑制活性(「效力 」)。此外，較佳作用機制為抑制活化步驟，因此抑制劑可靶向組織繫留、潛伏TGFβ1複合物，以使搶先阻止下游活化事件以達成持久效應，而非直接靶向可溶性/自由生長因子(「持久性 」)。如本文更詳細地揭示，本發明之新穎改良TGFβ1抑制劑為潛伏TGFβ1活化之高度有效且高選擇性抑制劑。本文所展示之資料展現尤其 此異構體特異性抑制機制足以解決同基因型小鼠模型中對抗PD-1之原發抗性，該等小鼠模型接近地再現人類癌症中所發現之對CBT之原發抗性的特徵中之一些。與此類抗體相比於「泛」TGFβ抑制劑之經改良臨床前安全概況一起，此等功效資料提供探究選擇性TGFβ1抑制之治療用途的基本原理，以擴展且增強對癌症免疫療法中檢查點阻斷之臨床反應，以及治療數種其他TGFβ1相關適應症。新穎、高親和性、非情形依賴性之 前 TGF β 1 抗體 一般特徵
本文揭示高親和性、經改良之TGFβ1抑制劑，其特徵在於，相比於先前揭示案之TGFβ1選擇性抑制劑，此等抗體具有增強之結合特性(包括對所有人類大型潛伏複合物，或「LLC」之均一高親和性)、提高之抑制效力，且保持期望安全概況及異構體選擇性。本發明之此等TGFβ1選擇性抑制劑為單株抗體(例如，免疫球蛋白、經工程改造之免疫球蛋白類分子、其抗原結合片段或部分)，其特異性結合潛伏前TGFβ1複合物之前域(有時稱作「LAP」)之至少一部分，且對TGFβ1具有異構體選擇性抑制活性(參見表1之「核心特性」)。
本發明之抗體的增強之結合特性包括在平衡下所量測之提高之親和性。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，抗體對人類LLC複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及/或hLRRC33-前TGFβ1)中之至少一者具有≤ 1 nM的KD。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之兩者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之三者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在較佳實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對以下之人類LLC複合物中之每一者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。根據本發明，在平衡下高親和性抗體對特定抗原(例如，抗原複合物)可具有1 nM或更小，例如，≤ 1 nM、≤ 0.5 nM、≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM及≤ 100 pM之KD值。
本發明亦包括抗體或其抗原結合片段，如藉由基於溶液平衡滴定之方法，諸如MSD-SET所量測，其能夠以≤ 10 nM (例如，≤ 10 nM、≤ 9 nM、≤ 8 nM、≤ 7 nM、≤ 6 nM、≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.5 nM及≤ 0.1 nM)之KD特異性結合人類LLC複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1)中之每一者。在一些實施例中，如藉由基於溶液平衡滴定之方法所量測，抗體以≤ 5 nM之KD結合前述LLC複合物中之每一者。在一些實施例中，如藉由基於溶液平衡滴定之方法所量測，抗體以≤ 1 nM之KD結合前述LLC複合物中之每一者。
對於治療涉及細胞外基質及免疫組分調節異常兩者之TGFβ1相關適應症的治療用途，宜選擇對ECM締合之前TGFβ1複合物(hLTBP1-前TGFβ1及/或hLTBP3-前TGFβ1)中之至少一者及額外地細胞締合之前TGFβ1複合物(hGARP-前TGFβ1及/或hLRRC33-前TGFβ1)中之至少一者具有高親和性(例如，≤ 1 nM之KD)的抗體，以便對兩種情形(例如，在ECM處及吸引至免疫細胞)均施加抑制效應。在一些實施例中，抗體對hLTBP1-前TGFβ1及hLTBP3-前TGFβ1兩者及額外地細胞締合之前TGFβ1複合物(hGARP-前TGFβ1或hLRRC33-前TGFβ1)中之至少一者具有高親和性(例如，≤ 1 nM之KD)。而在其他實施例中，抗體對前述複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1)中之每一者具有高親和性(例如，≤ 1 nM之KD)。在較佳實施例中，如藉由基於溶液平衡滴定之方法，諸如MSD-SET所量測，此類抗體對人類複合物中之每一者具有≤ 200 pM (例如，≤ 100 pM)之KD。
本發明之實施例包括高親和性非情形依賴性抗體。此類抗體能夠以相等親和性結合至四種已知呈遞分子-前TGFβ1複合物，亦即，LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。相等親和性可意謂抗體在四種抗原複合物中顯示之最低親和性(最高KD數值)不比由其餘三個親和性計算之平均值低超過五倍；或，抗體在四種抗原複合物中顯示之最高親和性(最低KD數值)不比由其餘三個親和性計算之平均值高超過五倍。在一些實施例中，當兩種ECM締合之複合物之平均KD值與兩種細胞締合之複合物之平均KD值的比率不超過三倍時，此類抗體可稱為具有相等親和性。
具有相等親和性之抗體可達成較均一(例如，無偏向)之抑制效應，而無關於與前TGFβ1複合物締合之特定呈遞分子(因此「非情形依賴性」)。在尤佳實施例中，抗體為高親和性、非情形依賴性抗體，此係因為如藉由基於溶液平衡滴定之方法所量測，對四種人類LLC中之每一者的親和性為1 nM或更小(例如，200 pM或更小)，且抗體對如上文所論述之所有四種人類LLC具有相等親和性。舉例而言，在基質締合之複合物與細胞締合之複合物之間平均親和性中所觀測到的偏向不超過三倍。
在一些實施例中，如藉由基於溶液平衡滴定之方法，諸如MSD-SET所量測，此類抗體以≤ 10 nM (例如，≤ 10 nM、≤ 9 nM、≤ 8 nM、≤ 7 nM、≤ 6 nM、≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 0.5 nM及≤ 0.1 nM)之KD特異性結合前述複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1)中之每一者。
在一些實施例中，此類抗體在包括前TGFβ1複合物之前域內之潛伏套索之至少一部分的結合區處結合前述大型潛伏複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1)中之每一者。此類結合區可以進一步包括生長因子域之至少一部分。在尤佳實施例中，在LLC複合物內包括潛伏套索之至少一部分及生長因子域之至少一部分的結合區處，此類抗體以≤ 200 pM (諸如≤ 150 pM及≤ 100 pM)之KD 結合至LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者。
在一些實施例中，無論活化模式如何，能夠選擇性抑制TGFβ1之高親和性、非情形依賴性抗體可抑制經活化TGFβ1。舉例而言，已知某些整合素直接結合LLC前域內之RGD基元，且以機械方式「拉開」籠狀前域結構，藉此使TGFβ1生長因子自潛伏複合物釋放。分別地，已顯示存在於細胞外環境中之某些蛋白酶以非整合素依賴性方式活化TGFβ1。直接靶向RGD基元，藉此干擾整合素結合之抗體可能不抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性活化。相反，直接靶向蛋白酶識別或裂解位點中之一或多者的抗體可能不抑制TGFβ1之整合素依賴性活化。相比之下，在本發明之較佳實施例中，高親和性、非情形依賴性抗體能夠抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及TGFβ1之蛋白酶依賴性活化。
儘管與目標人類蛋白之高親和性結合係抗體治療劑之必需特徵，但亦與其他物種對應物交叉反應之能力係有利的。特定而言，鑒於大部分臨床前藥理學模型在嚙齒動物中，與鼠類/大鼠蛋白之物種交叉反應性以替代抗體形式為臨床前研究提供合宜工具。因此，在一些實施例中，本發明之高親和性抗體有利地與其他哺乳動物對應物，諸如小鼠、大鼠及/或非人類靈長類動物交叉反應。
在由本發明涵蓋之新穎抗體中，尤佳類別之抗體及其特徵在下文分類且論述。 較佳特徵
在一些實施例中，除核心特性特徵以外，本文所揭示之較佳抗體進一步符合如本文表1中所列之類別1至5中之一或多者的抗體標準。
在一些實施例中，本發明抗體之其他必需標準由其結合特性，例如抗體對抗原之親和性界定。在此情形下之「抗原」包括至少四種蛋白質複合物，亦即，TGFβ1之人類大型潛伏複合物(LLC)，其被稱作hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物。根據本發明之發明，抗體能夠以通常按KD 值量測之一定親和性結合至此等複合物中之每一者。類別1及類別2抗體在此等實施例內。出於基於結合特性(例如，類別1及2)界定標準的目的，抗體之親和性在平衡下測定，而非藉由動力分析(諸如BLI)測定。
另外地或可替代地，本發明抗體之其他必需標準由其胺基酸序列界定。類別3及類別4抗體由抗體之CDR序列界定，而類別5抗體由其重鏈及輕鏈可變域序列界定。表 1 . 本發明之新穎、高親和性、 TGF β 1 選擇性抑制劑的較佳特徵
Figure 108124516-A0304-0002
該等類別中之每一者的非限制性實施例提供於下文中。 類別 1 抗體
本文所揭示之抗體為能夠特異性靶向人類TGFβ1潛伏大型複合物之高親和性、異構體選擇性抗體。
在一個態樣中，本發明提供以≤ 200 pM之KD特異性結合以下人類LLC中之每一者的抗體或其抗原結合片段：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物，其中親和性使用諸如基於溶液平衡滴定之分析的適合分析在平衡下量測。
如藉由溶液平衡滴定所量測，此類抗體或片段可以≤ 150 pM之KD結合hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者。更佳地，如藉由溶液平衡滴定所量測，此類抗體或片段可以≤ 100 pM之KD結合hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者。可採用能夠在平衡下測定抗體之KD值的任何適合之活體外親和性分析，包括(例如) MSD-SET，其更詳細地描述於本文別處。本文所揭示之符合類別1之較佳抗體之抗體標準之抗體的非限制性實例包括：Ab6、Ab22、Ab24、Ab26、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32及Ab33。
抗體亦可以高特異性及高親和性結合至其他物種之對應LLC。在較佳實施例中，抗體顯示與鼠類對應物之物種交叉反應性。 類別 2 抗體
本文所揭示之抗體為能夠特異性靶向人類TGFβ1潛伏大型複合物之高親和性、異構體選擇性抗體。
在另一態樣中，本發明提供以≤ 1 nM之KD特異性結合以下人類LLC中之每一者的抗體或其抗原結合片段：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物，其中親和性使用諸如基於溶液平衡滴定之分析的適合分析在平衡下量測，且其中抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。潛伏套索為形成前域之所謂的「約束衣」之一部分的蛋白質域。在天然形式中，人類前TGFβ1多肽之潛伏套索具有胺基酸序列LASPPSQGEVPPGPL (SEQ ID NO: 153)。可採用任何適合之技術來判定抗體是否在包括潛伏套索之至少部分的區處結合人類TGFβ1 LLC。舉例而言，可進行利用對應多肽之競爭分析。在一些實施例中，結合區可藉由HD-X或X射線結晶學測定。
在一些實施例中，如藉由溶液平衡滴定所量測，此類抗體或片段可以≤ 500 pM (視情況≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM或≤ 100 pM)之KD結合hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者，其中抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。本文所揭示之符合類別2之較佳抗體之抗體標準之抗體的非限制性實例包括：Ab5及Ab6。
在一些實施例中，此類抗體可在包含前TGFβ1複合物內生長因子域之至少一部分的額外結合區處進一步結合人類LLC。在一些實施例中，額外結合僅在潛伏複合物之情形下存在，使得抗體不特異性結合至不與前域複合物締合之自由生長因子。LLC之生長因子域內之額外結合區可包括被稱作「指-1」及/或「指-2」之蛋白域的至少部分。因此，此類抗體可結合組合性抗原決定基，其包含潛伏套索之至少一個胺基酸殘基及生長因子域之至少一個胺基酸殘基。
抗體亦可以高特異性及高親和性結合至其他物種之對應LLC。在較佳實施例中，抗體顯示與鼠類對應物之物種交叉反應性。 類別 3 抗體
本文所揭示之抗體為能夠特異性靶向人類TGFβ1潛伏大型複合物之高親和性、異構體選擇性抗體。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，其中CDR-H1具有由FTF(X1 )(X2 )(X3 )(X4 )M(X5 ) (SEQ ID NO: 143)表示之胺基酸序列。在一些實施例中，X1 可為S、G或A；X2 可為S或F；X3 可為F或Y；X4 可為S或A；且/或X5 可為之D、N或Y，呈任何組合。在H-CDR1含有至少一個胺基酸取代之一些實施例中，位置X1可經S置換；位置X2可經S置換；位置X3可經F置換；位置X4可經S置換；且/或位置X5可經D置換。
抗體之CDR-H2具有由YI(X1 )(X2 )(X3 )A(X4 )TIYYA(X5 )SVKG (SEQ ID NO: 144)表示之胺基酸序列。在一些實施例中，X1 可為S或H；X2 可為P或S；X3 可為S或D；X4 可為D或S；且/或X5 可為D或G，呈任何組合。在H-CDR2含有至少一個胺基酸取代之一些實施例中，位置X1可經S置換；位置X2可經P置換；位置X3可經D置換；位置X4可經S置換；且/或位置X5可經D置換。
抗體之CDR-H3具有由(X1 )R(X2 )(X3 )(X4 )D(X5 )GDML(X6 )P (SEQ ID NO: 145)表示之胺基酸序列。在一些實施例中，X1 可為A或V；X2 可為G或A；X3 可為V或T；X4 可為L或W；X5 可為Y或M；且/或X6 可為M或D，呈任何組合。在H-CDR3含有至少一個胺基酸取代之一些實施例中，位置X1可經A置換；位置X2可經G置換；位置X3可經V置換；位置X4可經L置換；位置X5可經Y置換；且/或位置X6可經D置換。
CDR-L1具有胺基酸序列QASQDITNYLN (SEQ ID NO: 105)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化。
CDR-L2具有胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 106)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化。
CDR-L3具有胺基酸序列QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化。
本文所揭示之符合類別3之較佳抗體之抗體標準之抗體的非限制性實例包括：Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32及 Ab34.
以下表2概述類別3抗體之CDR共同序列。在一些實施例中，CDR序列中之每一者可視情況含有以下列舉之胺基酸取代中之一或多者。表 2 . 重鏈及輕鏈共同 CDR 序列及較佳胺基酸取代
Figure 108124516-A0304-0003
在一些實施例中，類別3抗體或其抗原結合片段以≤ 1 nM之KD特異性結合以下人類LLC中之每一者：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物，其中親和性使用諸如基於溶液平衡滴定之分析的適合分析在平衡下量測。
在一些實施例中，抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。潛伏套索為形成前域之所謂的「約束衣」之一部分的蛋白質域。在天然形式中，人類前TGFβ1多肽之潛伏套索具有胺基酸序列LASPPSQGEVPPGPL (SEQ ID NO: 153)。可採用任何適合之技術來判定抗體是否在包括潛伏套索之至少部分的區處結合人類TGFβ1 LLC。舉例而言，可進行利用對應多肽之競爭分析。在一些實施例中，結合區可藉由HD-X或X射線結晶學測定。
在一些實施例中，如藉由溶液平衡滴定所量測，此類抗體或片段可以≤ 500 pM (視情況≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM或≤ 100 pM)之KD結合hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者，其中抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。
在一些實施例中，此類抗體可在包含前TGFβ1複合物內生長因子域之至少一部分的額外結合區處進一步結合人類LLC。在一些實施例中，額外結合僅在潛伏複合物之情形下存在，使得抗體不特異性結合至不與前域複合物締合之自由生長因子。LLC之生長因子域內之額外結合區可包括被稱作「指-1」及/或「指-2」之蛋白域的至少部分。因此，此類抗體可結合組合性抗原決定基，其包含潛伏套索之至少一個胺基酸殘基及生長因子域之至少一個胺基酸殘基。
抗體亦可以高特異性及高親和性結合至其他物種之對應LLC。在較佳實施例中，抗體顯示與鼠類對應物之物種交叉反應性。
本文包括交叉阻斷抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其片段交叉阻斷類別3抗體中之一者或與其交叉競爭，其中如藉由MSD-SET所量測，抗體對人類LLC複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及/或hLRRC33-前TGFβ1)中之至少一者具有≤ 1 nM之KD。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之兩者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之三者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在較佳實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對以下之人類LLC複合物中之每一者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。根據本發明，在平衡下高親和性抗體對特定抗原(例如，抗原複合物)可具有1 nM或更小，例如，≤ 1 nM、≤ 0.5 nM、≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM及≤ 100 pM之KD值。 類別 4 抗體
本文所揭示之抗體為能夠特異性靶向人類TGFβ1潛伏大型複合物之高親和性、異構體選擇性抗體。
在另一態樣中本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，其中：H-CDR1包含FTFSSFSMD (SEQ ID NO: 107)或FTFSSFSMN (SEQ ID NO: 114)，其中視情況各自可含有至多4個胺基酸變化(視情況至多4個、至多3個、至多2個或1個胺基酸變化)；H-CDR2包含YISPDASTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 111)，其中視情況H-CDR2可含有至多4個胺基酸變化(視情況至多4個、至多3個、至多2個或1個胺基酸變化)，H-CDR3包含ARGVLDYGDMLDP (SEQ ID NO: 110)，其中視情況H-CDR3可含有至多3個胺基酸變化(視情況至多3個、至多2個或1個胺基酸變化)；L-CDR1 QASQDITNYLN (SEQ ID NO: 105)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化；L-CDR2包含DASNLET (SEQ ID NO: 106)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化；且L-CDR3包含QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化。
本文所揭示之符合類別4之較佳抗體之抗體標準之抗體的非限制性實例包括：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33及Ab34。
以下表3概述類別4抗體之CDR序列。在一些實施例中，CDR序列中之每一者可視情況含有以下列舉之胺基酸取代中之一或多者。表 3 . CDR 序列及變異體
Figure 108124516-A0304-0004
在一些實施例中，類別4抗體或其抗原結合片段以≤ 1 nM之KD特異性結合以下人類LLC中之每一者：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物，其中親和性使用諸如基於溶液平衡滴定之分析的適合分析在平衡下量測。
在一些實施例中，抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。潛伏套索為形成前域之所謂的「約束衣」之一部分的蛋白質域。在天然形式中，人類前TGFβ1多肽之潛伏套索具有胺基酸序列LASPPSQGEVPPGPL (SEQ ID NO: 153)。可採用任何適合之技術來判定抗體是否在包括潛伏套索之至少部分的區處結合人類TGFβ1 LLC。舉例而言，可進行利用對應多肽之競爭分析。在一些實施例中，結合區可藉由HD-X或X射線結晶學測定。
在一些實施例中，如藉由溶液平衡滴定所量測，此類抗體或片段可以≤ 500 pM (視情況≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM或≤ 100 pM)之KD結合hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者，其中抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。
在一些實施例中，此類抗體可在包含前TGFβ1複合物內生長因子域之至少一部分的額外結合區處進一步結合人類LLC。在一些實施例中，額外結合僅在潛伏複合物之情形下存在，使得抗體不特異性結合至不與前域複合物締合之自由生長因子。LLC之生長因子域內之額外結合區可包括被稱作「指-1」及/或「指-2」之蛋白域的至少部分。因此，此類抗體可結合組合性抗原決定基，其包含潛伏套索之至少一個胺基酸殘基及生長因子域之至少一個胺基酸殘基。
抗體亦可以高特異性及高親和性結合至其他物種之對應LLC。在較佳實施例中，抗體顯示與鼠類對應物之物種交叉反應性。
本文包括交叉阻斷抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其片段交叉阻斷類別4抗體中之一者或與其交叉競爭，其中如藉由MSD-SET所量測，抗體對人類LLC複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及/或hLRRC33-前TGFβ1)中之至少一者具有≤ 1 nM之KD。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之兩者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之三者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在較佳實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對以下之人類LLC複合物中之每一者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。根據本發明，在平衡下高親和性抗體對特定抗原(例如，抗原複合物)可具有1 nM或更小，例如，≤ 1 nM、≤ 0.5 nM、≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM及≤ 100 pM之KD值。 類別 5 抗體
本文所揭示之抗體為能夠特異性靶向人類TGFβ1潛伏大型複合物之高親和性、異構體選擇性抗體。
在另一態樣中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含與以下具有至少90%序列一致性之重鏈可變域(VH )：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFSSFSMDWVRQAPGKGLEWVSYISPSADTIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGVLDYGDMLMPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13)；及，與以下具有至少90%序列一致性之輕鏈可變域(VL )：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQADNHPPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 15)。
在一些實施例中，抗體之重鏈可變域與SEQ ID NO: 13中所列舉之序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
在一些實施例中，抗體之重鏈可變域與以上VH序列具有至少95%一致性。
在一些實施例中，抗體之重鏈可變域與SEQ ID NO: 15中所列舉之VL序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
在一些實施例中，抗體之輕鏈可變域與以上VL序列具有至少95%一致性。
本文所揭示之符合類別5之較佳抗體之抗體標準之抗體的非限制性實例包括：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33及Ab34。
在一些實施例中，類別5抗體或其抗原結合片段以≤ 1 nM之KD特異性結合以下人類LLC中之每一者：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物，其中親和性使用諸如基於溶液平衡滴定之分析的適合分析在平衡下量測。
在一些實施例中，抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。潛伏套索為形成前域之所謂的「約束衣」之一部分的蛋白質域。在天然形式中，人類前TGFβ1多肽之潛伏套索具有胺基酸序列LASPPSQGEVPPGPL (SEQ ID NO: 153)。可採用任何適合之技術來判定抗體是否在包括潛伏套索之至少部分的區處結合人類TGFβ1 LLC。舉例而言，可進行利用對應多肽之競爭分析。在一些實施例中，結合區可藉由HD-X或X射線結晶學測定。
在一些實施例中，如藉由溶液平衡滴定所量測，此類抗體或片段可以≤ 500 pM (視情況≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM或≤ 100 pM)之KD結合hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者，其中抗體或片段在包含潛伏套索之至少一部分的結合區處結合人類LLC。
在一些實施例中，此類抗體可在包含前TGFβ1複合物內生長因子域之至少一部分的額外結合區處進一步結合人類LLC。在一些實施例中，額外結合僅在潛伏複合物之情形下存在，使得抗體不特異性結合至不與前域複合物締合之自由生長因子。LLC之生長因子域內之額外結合區可包括被稱作「指-1」及/或「指-2」之蛋白域的至少部分。因此，此類抗體可結合組合性抗原決定基，其包含潛伏套索之至少一個胺基酸殘基及生長因子域之至少一個胺基酸殘基。
抗體亦可以高特異性及高親和性結合至其他物種之對應LLC。在較佳實施例中，抗體顯示與鼠類對應物之物種交叉反應性。
本文包括交叉阻斷抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗體或其片段交叉阻斷類別5抗體中之一者或與其交叉競爭，其中如藉由MSD-SET所量測，抗體對人類LLC複合物(hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及/或hLRRC33-前TGFβ1)中之至少一者具有≤ 1 nM之KD。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之兩者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在一些實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對選自以下之人類LLC複合物中之三者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。在較佳實施例中，如藉由MSD-SET所量測，此類抗體對以下之人類LLC複合物中之每一者具有≤ 1 nM之KD：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。根據本發明，在平衡下高親和性抗體對特定抗原(例如，抗原複合物)可具有1 nM或更小，例如，≤ 1 nM、≤ 0.5 nM、≤ 400 pM、≤ 300 pM、≤ 200 pM及≤ 100 pM之KD值。 本發明之例示性抗體
例示性抗體及編碼適用於進行本發明之此類抗體的對應核酸序列包括表4及5中所示的CDR胺基酸序列中之一或多者。表5中所列之各組H-CDR (H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3)可與表5中提供之L-CDR (L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3)組合。
因此，本發明提供經分離之抗體或其抗原結合片段，其包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2及L-CDR3，其中，H-CDR1、H-CDR2及H-CDR3選自表4中所列之抗體的H-CDR，且其中L-CDR1包含QASQDITNYLN (SEQ ID NO: 105)，L-CDR2包含DASNLET (SEQ ID NO: 106)且L-CDR3包含QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)，其中視情況，H-CDR1可包含FTFSSFSMD (SEQ ID NO: 107)；H-CDR-2可包含YISPSADTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 103)；且/或H-CDR3可包含ARGVLDYGDMLMP (SEQ ID NO: 6)。在一些實施例中，抗體或片段包含具有胺基酸序列FTFSSFSMD (SEQ ID NO: 107)之H-CDR1、具有胺基酸序列YISPSADTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 103)之H-CDR2及具有胺基酸序列ARGVLDYGDMLMP (SEQ ID NO: 6)之H-CDR-3；具有胺基酸序列QASQDITNYLN (SEQ ID NO: 105)之L-CDR1、具有胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 106)之L-CDR2及具有胺基酸序列QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)之L-CDR3。表 4 . 如使用 Lu 等人中所描述之編號方案測定 ， 例示性抗體之重鏈的互補決定區
Figure 108124516-A0304-0005
 表 5 . 如使用 Kabat 編號方案或 Lu 等人之編號系統測定 ， 例示性抗體之輕鏈的互補決定區
Figure 108124516-A0304-0006
抗體內CDR序列之測定視所採用之特定編號方案而定。常用系統包括(但不限於)：Kabat編號系統、IMTG編號系統、Chothia編號系統及其他，諸如由Lu等人所描述之編號方案(Lu X等人, MAbs. 2019年1月;11(1):45-57)。為進行說明，如由三種編號系統所界定之Ab6的6個CDR序列在以下舉例說明。表 6 . 基於三種編號方案之例示性抗體的六個 CDR
Figure 108124516-A0304-0007
本發明之例示性抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域的胺基酸序列提供於表7中。表 7 . 例示性抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域
Figure 108124516-A0304-0008
因此，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變域及輕鏈可變域，其中，重鏈可變域與選自由以下組成之群的序列中之任一者具有至少90% (例如，至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及100%)序列一致性：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33及Ab34；且其中輕鏈可變域與選自Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33及Ab34之序列中之任一者具有至少90%一致性，其中，視情況，重鏈可變域可視情況具有至少95%序列一致性，且/或，輕鏈可變域可具有至少95% (例如，至少95%、96%、97%、98% 99%及100%)序列一致性。在一些實施例中，抗體或片段之重鏈可變域與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列一致性，且其中視情況，抗體或片段之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列一致性。在一些實施例中，抗體或片段之重鏈可變域與SEQ ID NO: 13具有至少95%序列一致性，且其中視情況，抗體或片段之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 15具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，抗體或片段之重鏈可變域與SEQ ID NO: 13具有至少98%序列一致性，且其中視情況，抗體或片段之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 15具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，抗體或片段之重鏈可變域與SEQ ID NO: 13具有100%序列一致性，且其中視情況，抗體或片段之輕鏈可變域與SEQ ID NO: 15具有100%序列一致性。
在一些實施例中，特異性結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分包含重鏈可變域胺基酸序列，其由與SEQ ID NO: 14中所列舉之核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸序列編碼；及輕鏈可變域胺基酸序列，其由與SEQ ID NO: 16中所列舉之核酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的核酸序列編碼。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分，包含由SEQ ID NO: 14中所列舉之核酸序列編碼的重鏈可變域胺基酸序列，及由SEQ ID NO: 16中所列舉之核酸序列編碼的輕鏈可變域胺基酸序列。
在一些實例中，特異性結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之本發明抗體中之任一者包括任何抗體(包括其抗原結合部分)，其具有實質上類似於CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及/或CDRL3之一或多個CDR (例如，CDRH或CDRL)序列。舉例而言，抗體可包括如表4中所示之一或多個CDR序列，其與以下中之任一者的對應CDR區相比，含有至多5、4、3、2或1個胺基酸殘基變化：SEQ ID NO: 6、12、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125及126。在一些實施例中，與表4中所提供之序列相比，六個CDR序列中之一或多者含有至多三(3)個胺基酸變化。每CDR包含至多3個胺基酸變化之此類抗體變異體由本發明涵蓋。在一些實施例中，此類變異體抗體由諸如親和性成熟之最佳化方法產生。表7中所列之抗體(例如，Ab6)之重鏈可變區及輕鏈可變區的完整胺基酸序列，以及編碼某些抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區的核酸序列提供於下： Ab3-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image001
Ab6-重鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image003
Ab6-輕鏈可變區胺基酸序列
Figure 02_image005
Ab6-重鏈胺基酸序列
Figure 02_image007
Ab6-重鏈核酸序列
Figure 02_image009
Ab6-輕鏈胺基酸序列
Figure 02_image011
Ab6-輕鏈核酸序列(人類κ)
Figure 02_image013
Figure 02_image015
在一些實施例中，使用如在Karlin及Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993中經修改的Karlin及Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990之演算法來測定兩個胺基酸序列之「百分比一致性」。此類演算法併入至Altschul等人 J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990之NBLAST及XBLAST程式(版本2.0)中。BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程式(評分=50，字長=3)進行以獲得與所關注蛋白質同源之胺基酸序列。當兩個序列之間存在間隙時，可如Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997中所述利用間隙式BLAST。在利用BLAST及間隙式BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
在本文中所述之抗體或抗原結合片段中之任一者中，可將一或多個保守突變引入至CDR或構架序列中的殘基不大可能參與抗體-抗原相互作用的位置處。在一些實施例中，此類一或多個保守突變可引入至CDR或構架序列中的，如基於晶體結構而判定的殘基不大可能參與與GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物相互作用的一或多個位置處。在一些實施例中，可由關於共有結構相似性之另一抗原的已知結構資訊推斷可能界面(例如，參與抗原-抗體相互作用之殘基)。
如本文所用，「保守胺基酸取代」係指其中進行胺基酸取代不會改變蛋白質之相對電荷或尺寸特徵的胺基酸取代。可根據一般熟習此項技術者已知的改變多肽序列之方法製備變異體，諸如見於彙編此類方法之參考文獻，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook等人編, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989或Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等人編, John Wiley & Sons, Inc., New York。胺基酸之保守取代包括在以下群組中的胺基酸中進行的取代：(a) M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c) K、R、H；(d) A、G；(e) S、T；(f) Q、N；及(g) E、D。
在一些實施例中，本文所提供之抗體包含賦予抗體期望特性之突變。舉例而言，為了避免因Fab-臂交換(已知其伴隨原生IgG4 mAb發生)所致之可能併發症本文所提供之抗體可包含穩定化『Adair』突變(Angal等人, 「A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody」, Mol Immunol 30, 105-108; 1993)，其中絲胺酸228 (EU編號；殘基241 (Kabat編號))轉化成脯胺酸，產生類IgG1 (CPPCP (SEQ ID NO: 54))鉸鏈序列。因此，抗體中之任一者可包括穩定化『Adair』突變或胺基酸序列CPPCP (SEQ ID NO: 54)。
本發明之異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可視情況包含抗體恆定區或其部分。舉例而言，VL域可在其C末端連接至輕鏈恆定域，如Cκ或Cλ。類似地，VH域或其部分可連接至如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM及任何同型子類別之重鏈之全部或部分。抗體可包括適合恆定區(參見例如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第91-3242期, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991))。因此，此範疇內之抗體可揭示包括VH及VL域，或其抗原結合部分，與任何適合恆定區之組合。
另外地或可替代地，此類抗體可或可不包括以下之抗體之構架區：SEQ ID NO: 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142及15。在一些實施例中，特異性結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物之抗體為鼠類抗體且包括鼠類構架區序列。
在一些實施例中，此類抗體以相對較高親和性，例如以低於10- 9 M、10- 10 M、10- 11 M或更低之KD，結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物。舉例而言，此類抗體可以在5 pM與1 nM之間，例如在10 pM與1 nM之間，例如在10 pM與100 pM之間的親和性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物。本發明亦包括抗體或抗原結合片段，其為結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物與本文所描述之抗體中之任一者競爭，且具有1 nM或更低(例如，1 nM或更低，500 pM或更低，100 pM或更低)之KD值。特異性結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體的親和性及結合動力學可使用任何適合之方法進行測試，方法包括(但不限於)基於生物感測器之技術(例如，OCTET®或BIACORE)及基於溶液平衡滴定之技術(例如，MSD-SET)。
在一些實施例中，根據本發明之細胞締合之TGFβ1 (例如，GARP呈遞之TGFβ1及LRRC33呈遞之TGFβ1)的抑制劑包括特異性結合此類複合物(例如，GARP-前TGFβ1/潛伏TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1/潛伏TGFβ1)，且觸發複合物內化之抗體或其片段。此作用模式引起無活性TGFβ1複合物(例如，GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1)自細胞表面(例如，Treg、巨噬細胞等)移除或耗乏，因此減少可用於活化之TGFβ1。在一些實施例中，此類抗體或其片段以pH依賴性方式結合目標複合物，使得在中性或生理pH下發生結合，但在酸性pH下抗體自其抗原解離；或在酸性pH下之解離速率比在中性pH下高。此類抗體或其片段可以再循環抗體形式起作用。與高親和性、異構體特異性、非情形依賴性之 TGF β 1 抑制性抗體競爭的抗體
本發明之態樣係關於與本文所提供之抗體中之任一者競爭或交叉競爭的抗體。如本文中關於抗體所使用，術語「競爭」意謂第一抗體以足夠類似於第二抗體之結合或與其重疊的方式結合至抗原決定基(例如，GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及LRRC33-前TGFβ1複合物之抗原決定基)，使得與無第二抗體存在下之第一抗體之結合相比，在第二抗體存在下第一抗體與其抗原決定基之結合結果可偵測地減少。替代方案可能但不必如此：在第一抗體存在下第二抗體與其抗原決定基之結合亦可偵測地減少。亦即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合，而第二抗體並不抑制第一抗體與其各別抗原決定基之結合。然而，當各抗體無論在相同、較大或較小的程度上可偵測地抑制另一抗體與其抗原決定基或配位體之結合時，該等抗體稱為彼此「交叉競爭」結合其各別抗原決定基。競爭與交叉競爭抗體兩者在本發明範疇內。無論該競爭或交叉競爭發生之機制(例如，位阻、構形變化或結合至共同抗原決定基或其部分)如何，熟習此項技術者將瞭解，此類競爭及/或交叉競爭抗體涵蓋於且可適用於本文所提供之方法及/或組合物中。術語「交叉阻斷」可互換地使用。
若結合位點在三維空間中足夠較遠相隔，使得各結合不干擾另一結合，則結合相同抗原之兩種不同的單株抗體(或抗原結合片段)可能能夠同時結合至抗原。相比之下，兩種不同的單株抗體可具有相同或重疊之抗原結合區，在此情況下，第一抗體之結合可使第二抗體不能結合抗原，或反之亦然。在後者情況下，兩種抗體稱為相對於相同抗原彼此「交叉阻斷 」。
抗體「分組」實驗適用於基於相對交叉阻斷活性，將針對相同抗原製得之多個抗體分類至各種「分組」中。各「分組」因此表示抗原之離散結合區。相同分組中之抗體按照定義彼此交叉阻斷。分組可藉由標準活體外結合分析(諸如Biacor或Octet®)，使用標準測試條件，例如根據製造商說明書來檢查(例如，在室溫，約20-25℃下進行結合分析)。
本發明之態樣係關於與如本文所提供之特異性抗體，或其抗原結合部分中之任一者競爭或交叉競爭的抗體。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與本文所提供之抗體中之任一者在相同抗原決定基處或接近於其結合。在一些實施例中，若抗體或其抗原結合部分在抗原決定基之15個或更少的氨基酸殘基內結合，則其接近於抗原決定基結合。在一些實施例中，如本文所提供之抗體或其抗原結合部分中之任一者，在由本文所提供之抗體中之任一者結合的抗原決定基之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸殘基內結合。
在另一實施例中，本文提供抗體或其抗原結合部分，為結合至本文所提供之抗原(例如，GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物)中之任一者競爭或交叉競爭，其中抗體與蛋白質之間的平衡解離常數KD 低於10- 8 M。在其他實施例中，抗體為結合至本文所提供之抗原中之任一者競爭或交叉競爭，其中KD 在10- 12 M至10- 9 M範圍內。在一些實施例中，本文提供為與本文所描述之抗體或其抗原結合部分結合競爭的抗TGFβ1抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，本文提供結合至與本文所描述之抗體或其抗原結合部分相同之抗原決定基的抗TGFβ1抗體或其抗原結合部分。
本文所提供之抗體中之任一者可使用任何適合之方法表徵。舉例而言，一種方法為鑑別抗原所結合之抗原決定基，或「抗原決定基定位」。存在許多對蛋白質上之抗原決定基位置進行定位及表徵的方法，包括求解抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽之分析，如例如Harlow及Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999之第11章中所描述。在另一實例中，抗原決定基定位可用於測定抗體所結合之序列。抗原決定基可為線性抗原決定基，亦即含於單區段胺基酸中，或藉由可不一定含於單區段(初級結構線性序列)中之胺基酸的三維相互作用形成的構形抗原決定基。在一些實施例中，當TGFβ1在GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物或LRRC33-前TGFβ1複合物中時，抗原決定基為僅可供由本文所描述之抗體或其抗原結合部分結合的TGFβ1抗原決定基。變化長度(例如，至少4至6個胺基酸長)之肽可經分離或合成(例如，以重組方式)，且用於與抗體之結合分析。在另一實例中，抗體所結合的抗原決定基可在系統性篩選中藉由使用來源於目標抗原序列之重疊肽且測定抗體之結合來確定。根據基因片段表現分析，編碼目標抗原的開放閱讀框架可隨機地或依據特定遺傳構造加以片段化且測定抗原之所表現片段與待測試之抗體的反應性。基因片段可例如藉由PCR產生，接著在放射性胺基酸存在下活體外轉錄且轉譯成蛋白質。隨後藉由免疫沈澱及凝膠電泳測定抗體與放射性標記之抗原片段的結合。某些抗原決定基亦可藉由使用噬菌體顆粒表面上所呈現之隨機肽序列之大型庫(噬菌體庫)來鑑別。可替代地，可在簡單結合分析中測試重疊肽片段之所定義庫與測試抗體的結合。在另一實例中，可進行抗原結合域之突變誘發、域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發以鑑別抗原決定基結合所需、足夠及/或需要的殘基。舉例而言，域交換實驗可使用目標抗原之突變體進行，在突變體中，GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及/或前LRRC33-TGFβ1複合物之各種片段已經來自緊密相關，但抗原相異的蛋白質(諸如TGFβ蛋白家族之另一成員(例如，GDF11))之序列置換(交換)。
可替代地，可使用已知結合至相同抗原之其他抗體進行競爭分析，以確定抗體是否結合至與其他抗體相同之抗原決定基。競爭分析已為熟習此項技術者所熟知。
在一些實施例中，本發明包括與類別1、類別2、類別3、類別4及/或類別5之抗體中之任一者交叉阻斷(交叉競爭)的抗體(例如，免疫球蛋白、抗原結合片段等)。因此，在一些實施例中，可藉由包含以下步驟之方法製得醫藥組合物：選擇與類別1抗體交叉競爭之抗體或其抗原結合片段；及將該抗體調配成醫藥組合物。
在一些實施例中，可藉由包含以下步驟之方法製得醫藥組合物：選擇與類別2抗體交叉競爭之抗體或其抗原結合片段；及將該抗體調配成醫藥組合物。
在一些實施例中，可藉由包含以下步驟之方法製得醫藥組合物：選擇與類別3抗體交叉競爭之抗體或其抗原結合片段；及將該抗體調配成醫藥組合物。
在一些實施例中，可藉由包含以下步驟之方法製得醫藥組合物：選擇與類別4抗體交叉競爭之抗體或其抗原結合片段；及將該抗體調配成醫藥組合物。
在一些實施例中，可藉由包含以下步驟之方法製得醫藥組合物：選擇與類別5抗體交叉競爭之抗體或其抗原結合片段；及將該抗體調配成醫藥組合物。
在一些實施例中，可藉由包含以下步驟之方法製得醫藥組合物：選擇與選自由以下組成之群的抗體交叉競爭之抗體或其抗原結合片段：Ab4、Ab5、Ab6、Ab21、Ab22、Ab23、Ab24、Ab25、Ab26、Ab27、Ab28、Ab29、Ab30、Ab31、Ab32、Ab33及Ab34；及調配成醫藥組合物。
根據本發明，此類交叉競爭抗體可用於治療TGFβ1相關適應症個體。抗體之各種修飾及變化
本發明所涵蓋的抗體或其抗原結合片段中之任一者的非限制性變化、變體及特徵簡要地論述於下文中。亦提供相關分析方法之實施例。
天然存在之抗體結構單元通常包含四聚體。各此類四聚體通常由多肽鏈之兩對相同多肽鏈構成，各對具有一個全長「輕」鏈(在某些實施例中，約25 kDa)及一個全長「重」鏈(在某些實施例中，約50至70 kDa)。各鏈之胺基端部分通常包括通常負責抗原識別之具有約100至110個或更多胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分通常界定可負責效應功能之恆定區。人類抗體輕鏈通常分為κ輕鏈及λ輕鏈。重鏈通常分為μ、δ、γ、α或ε，且界定抗體之同型。抗體可具有任何類型(例如，IgM、IgD、IgG、IgA、IgY及IgE)及類別(例如，IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgM1 、IgM2 、IgA1 及IgA2 )。在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區通常係由約12或更多個胺基酸之「J」區連接，同時重鏈亦包括約10更多胺基酸之「D」區(參見例如Fundamental Immunology, 第7章 (Paul, W.編, 第2版 Raven Press, N.Y. (1989)) (其以全文引用之方式併入))。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
可變區通常展現由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)連接之相對保守構架區(FR)之相同通用結構。來自各對之兩條鏈之CDR通常由構架區對準，其可實現與特異性抗原決定基結合。輕鏈及重鏈可變區之N端至C端均通常包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4域。胺基酸至各域之指配係通常根據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987與1991))或Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917；Chothia等人 (1989) Nature 342: 878-883之定義。輕鏈之CDR亦可稱作CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，且重鏈之CDR亦可稱作CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。在一些實施例中，抗體可包含少數胺基酸自重鏈之羧基端缺失。在一些實施例中，抗體包含在重鏈之羧基端處具有1至5個胺基酸缺失的重鏈。在某些實施例中，CDR之確定性描繪及包含抗體之結合位點之殘基的確認係藉由求解抗體之結構及/或求解抗體-配位體複合物之結構來實現。在某些實施例中，其可藉由熟習此項技術者已知的多種技術中任一者來實現，諸如X射線結晶法。在一些實施例中，可採用各種分析方法以鑑別或近似鑑別CDR區。此類方法之實例包括(但不限於) Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、由Lu等人所描述之定義(參見上文)及接觸定義(contact definition)。
「親和性成熟」抗體為在其一或多個CDR中具有一或多個改變，引起與不具有彼等改變之親本抗體相比抗體對抗原之親和性改良的抗體。例示性親和性成熟抗體將對目標抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳親和性(例如，約10- 9 M至10- 12 M範圍之KD )。藉由此項技術中已知的程序產生親和性成熟抗體。Marks等人 (1992) Bio/Technology 10: 779-783描述了藉由VH及VL域改組進行之親和性成熟。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發由Barbas等人 (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813；Schier等人 (1995) Gene 169: 147- 155；Yelton等人, (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004；Jackson等人 (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9；及Hawkins等人 (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896加以描述；且選擇性突變誘發位置、接觸或超突變位置處之伴隨活性提高之胺基酸殘基的選擇性突變描述於美國專利第6,914,128號中。通常，親本抗體及其親和性成熟後代(例如，衍生物)保留抗原內之相同結合區，儘管處於分子層級之某些相互作用可歸因於藉由親和性成熟引入的胺基酸殘基變更而改變。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一種物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有其中一或多個人類CDR(例如CDR3)已經鼠類CDR序列置換之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有連接至人類恆定區之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
如本文所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR剩餘之序列。由於CDR序列之精確界定可藉由不同系統確定，因此構架序列之含義相對應地需要不同解釋。六個CDR (輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區分成各鏈上四個子區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不將特定子區指定為FR1、FR2、FR3或FR4的情況下，如由其他方式提及之構架區代表單一、天然存在之免疫球蛋白鏈之可變區內的組合FR。如本文所用，FR表示四個子區中之一者，且FR表示構成構架區之四個子區中的兩者或更多者。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈構架區1 (H-FR1)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGG SLRLSCA ASG (SEQ ID NO: 174)。舉例而言，位置16處之Gly殘基可經Arg (R)置換；且/或，位置23處之Ala殘基可經Thr (T)置換。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈構架區2 (H-FR2)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 175)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈構架區3 (H-FR3)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 176)。舉例而言，位置12處之Ser殘基可經Thr (T)置換。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈構架區4 (H-FR4)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 177)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈構架區1 (L-FR1)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 178)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈構架區2 (L-FR2)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 179)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈構架區3 (L-FR3)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 180)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含輕鏈構架區4 (L-FR4)，其具有含視情況存在之1、2或3個胺基酸變化的以下胺基酸序列：FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 181)。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含以下之重鏈免疫球蛋白恆定域：人類IgM恆定域、人類IgG恆定域、人類IgG1恆定域、人類IgG2恆定域、人類IgG2A恆定域、人類IgG2B恆定域、人類IgG2恆定域、人類IgG3恆定域、人類IgG3恆定域、人類IgG4恆定域、人類IgA恆定域、人類IgA1恆定域、人類IgA2恆定域、人類IgD恆定域或人類IgE恆定域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含人類IgG1恆定域或人類IgG4恆定域之重鏈免疫球蛋白恆定域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含人類IgG4恆定域之重鏈免疫球蛋白恆定域。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分包含人類IgG4恆定域之重鏈免疫球蛋白恆定域，該恆定域具有Ser至Pro之主鏈取代，該主鏈取代產生類IgG1鉸鏈且准許鏈間二硫鍵形成。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分進一步包含輕鏈免疫球蛋白恆定域，其包含人類Ig λ恆定域或人類Ig κ恆定域。
在一些實施例中，抗體為具有為兩條重鏈及兩條輕鏈之四條多肽鏈的IgG。
在一些實施例中，其中抗體為人類化抗體、雙功能抗體或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體為人類化抗體。在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗體包含具有人類生殖系胺基酸序列之構架。
在一些實施例中，抗原結合部分為Fab片段、F(ab')2片段、scFab片段或scFv片段。
如本文所用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷引起基因重組及突變以供特定免疫球蛋白表現之成熟過程的非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列(參見例如，Shapiro等人 (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200；Marchalonis等人 (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30)。本發明之多個實施例所提供之優點中之一者源自認識到，生殖系抗體基因比成熟抗體基因更有可能保留物種中的個體的必需胺基酸序列結構特徵，因此當治療上用於該物種時，不大可能識別為來自外源。
如本文所用，術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合至抗原時，抵消抗原(例如目標蛋白質)之生物活性。在一個實施例中，中和結合蛋白結合至抗原/目標，例如細胞介素、激酶、生長因子、細胞表面蛋白、可溶性蛋白、磷酸酶或受體配位體，且使其生物學活性降低至少約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%、96%、97%。98%、99%或更多。在一些實施例中，針對生長因子之中和抗體特異性結合已自潛伏複合物釋放之成熟、可溶性生長因子，藉此阻止該生長因子結合其受體以誘發下游信號傳遞之能力。在一些實施例中，成熟生長因子為TGFβ1或TGFβ3。
如本文所用，術語「結合蛋白」包括特異性結合至抗原(例如，TGFβ1)之任何多肽，包括(但不限於)抗體或其抗原結合部分、DVD-IgTM、TVD-Ig、RAb-Ig、雙特異性抗體及雙重特異性抗體。
當用於包含「單株抗體」或「mAb」之組合物之情形下時，該術語「單株抗體」或「mAb」可指由實質上均質之抗體之群獲得的抗體製備物，亦即包含該群之獨立抗體除可以少量存在的可能的天然存在之突變之外為相同的。單株抗體針對單一抗原具有高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製備物相反，各mAb係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」不應解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。
如本文所用，術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離的所有人類抗體，諸如使用轉染於宿主細胞中之重組表現載體表現的抗體(進一步描述於下文章節II C)；自重組、組合人類抗體庫分離之抗體(Hoogenboom, H.R. (1997) TIB Tech. 15: 62-70；Azzazy, H.及Highsmith, W.E. (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445；Gavilondo, J.V.及Larrick, J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145；Hoogenboom, H.及Chames, P. (2000) Immunol. Today 21: 371-378，以引用之方式併入本文中)；自動物(例如，小鼠)分離的對於人類免疫球蛋白基因為轉殖基因的抗體(參見Taylor, L. D.等人 (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295；Kellermann, S-A.及Green, L.L. (2002) Cur. Opin. in Biotechnol. 13: 593-597；Little, M.等人 (2000) Immunol. Today 21: 364-370)；或藉由涉及人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體經歷活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列雖然衍生自且關於人類生殖系VH及VL序列，但該等胺基酸序列為可不活體內天然存在於人類抗體生殖系抗體庫內之序列。
如本文所用，「雙可變域免疫球蛋白」或「DVD-IgTM」及其類似者包括包含配對重鏈DVD多肽及輕鏈DVD多肽之結合蛋白，其中各配對重鏈及輕鏈提供兩個抗原結合位點。各結合位點包括每個抗原結合位點總共6個參與抗原結合的CDR。DVD-IgTM通常具有至少部分地藉由CH3域之二聚彼此結合的兩個臂，其中DVD之各臂為雙特異性的，提供具有四個結合位點之免疫球蛋白。DVD-IgTM提供於美國專利公開案第2010/0260668號及第2009/0304693號中，其各自以引用之方式併入本文中，包括序列表。
如本文所用，「三重可變域免疫球蛋白」或「TVD-Ig」及其類似者為包含配對重鏈TVD結合蛋白多肽及輕鏈TVD結合蛋白多肽之結合蛋白，其中各配對重鏈及輕鏈提供三個抗原結合位點。各結合位點包括每個抗原結合位點總共6個參與抗原結合的CDR。TVD結合蛋白可具有至少部分地藉由CH3域之二聚彼此結合的兩個臂，其中TVD結合蛋白之各臂為三特異性的，提供具有六個結合位點之結合蛋白。
如本文所用，「受體-抗體免疫球蛋白」或「RAb-Ig」及其類似者為包含重鏈RAb多肽及輕鏈RAb多肽之結合蛋白，該重鏈RAb多肽及該輕鏈RAb多肽一起形成總共三個抗原結合位點。一個抗原結合位點係藉由以下形成：重鏈RAb多肽及輕鏈RAb多肽中之每一者中所存在的重及輕抗體可變域進行配對以形成具有總共6個CDR之單一結合位點，提供第一抗原結合位點。各重鏈RAb多肽及輕鏈RAb多肽包括受體序列，其獨立地結合配位體，提供第二及第三「抗原」結合位點。RAb-Ig通常具有至少部分地藉由CH3域之二聚彼此結合的兩個臂，其中RAb-Ig之各臂為三特異性的，提供具有六個結合位點之免疫球蛋白。RAb-Ig描述於美國專利申請公開案第2002/0127231號中，其全部內容，包括序列表係以引用之方式併入本文中)。
如本文所用且如與「雙特異性半Ig結合蛋白」或「雙特異性(半Ig)結合蛋白」區分，術語「雙特異性抗體」係指藉由以下產生之全長抗體：四源雜交瘤(quadroma)技術(參見Milstein, C.及Cuello, A.C. (1983) Nature 305(5934): 第537-540頁)；兩種不同單株抗體之化學結合(參見Staerz, U.D.等人 (1985) Nature 314(6012): 628-631)；或杵臼或類似方法，其將突變引入Fc區中，其不會抑制CH3-CH3二聚(參見Holliger, P.等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(14): 6444-6448)，產生多種不同免疫球蛋白物種，其中僅一者為功能性雙特異性抗體。藉由分子功能，雙特異性抗體在其兩個結合臂中之一者(一對HC/LC)上結合一個抗原(或抗原決定基)，且在其第二臂(不同的HC/LC對)上結合不同抗原(或抗原決定基)。藉由此定義，雙特異性抗體具有兩個不同抗原結合臂(在特異性及CDR序列兩者方面)，且對於其所結合之各抗原呈單價。
如本文所用且如與雙特異性半-Ig結合蛋白或雙特異性結合蛋白區分，術語「雙重特異性抗體」係指可在其兩個結合臂中之每一者(一對HC/LC)處結合兩個不同抗原(或抗原決定基)的全長抗體(參見PCT公開案第WO 02/02773號)。因此，雙重特異性結合蛋白具有兩個相同抗原結合臂，伴隨相同特異性及相同CDR序列，且對於其所結合之各抗原呈二價。
如本文所用，術語「Kon」意欲指代結合蛋白(例如，抗體)締合至抗原以形成例如如此項技術中已知的抗體/抗原複合物的締合速率常數。如在本文中可互換使用，「Kon」亦由術語「締合速率常數」或「ka」已知。指示抗體至其目標抗原之結合速率或在抗體與抗原之間形成複合物之速率的此值亦由以下方程式所示：抗體(「Ab」) + 抗原(「Ag」)→Ab-Ag。
如本文所用，術語「Koff」意欲指代自例如如此項技術中已知的抗體/抗原複合物解離結合蛋白(例如，抗體抗體)的解離速率常數。如在本文中可互換使用，「Koff」亦由術語「解離速率常數」或「kd」已知。此值指示抗體自其目標抗原解離或Ab-Ag複合物隨時間分離成游離抗體及抗原之速率，如由以下方程式所示： Ab + Ag←Ab-Ag。
如在本文中可互換使用，術語「平衡解離常數」或「KD 」係指在平衡下之滴定量測中或藉由解離速率常數(Koff )除以締合速率常數(Kon )獲得的值。締合速率常數、解離速率常數及平衡解離常數用於表示結合蛋白(例如抗體)與抗原之結合親和性。測定締合及解離速率常數之方法在此項技術中所熟知。使用基於螢光之技術提供高敏感度及檢查在平衡下之生理緩衝液中之樣品的能力。可使用其他實驗方法及儀器，諸如BIAcore®(生物分子相互作用分析)分析(例如可購自BIAcore International AB (一家GE Healthcare公司)，Uppsala, Sweden之儀器)。另外，亦可使用可購自Sapidyne Instruments(Boise, Idaho)之KinExA®(動力排除分析)分析。
如本文所用，術語「晶體」及「結晶的」係指以晶體形式存在的結合蛋白(例如，抗體)或其抗原結合部分。晶體為物質之一種固態形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體係由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子集合體(例如抗原/抗體複合物)之規則、重複、三維陣列構成。此等三維陣列係根據本領域中充分瞭解之特定數學關係排列。在晶體中重複之基本單元或建構嵌段稱為不對稱單元。以符合給定之經良好定義的晶體學對稱性之排列重複不對稱單元提供晶體之「單位晶胞」。所有三個維度上單位晶胞藉由規則變換進行重複提供晶體。參見Giege, R.及Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach，第2版，第201-16頁，Oxford University Press, New York, New York, (1999)。術語「連接子」用於表示包含藉由肽鍵連接的兩個或更多個胺基酸殘基之多肽，且用於連接一或多個抗原結合部分。此類連接子多肽為此項技術中熟知(參見例如，Holliger, P.等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448；Poljak, R.J.等人 (1994) Structure 2:1121-1123)。例示性連接子包括(但不限於)：ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 55)；ASTKGP (SEQ ID NO: 56)；TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 57)；TVAAP (SEQ ID NO: 58)；AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 59)；AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 60)；AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 61)；SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 62)；SAKTTP (SEQ ID NO: 63)；RADAAP (SEQ ID NO: 64)；RADAAPTVS (SEQ ID NO: 65)；RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 66)；RADAAAA(G4S)4 (SEQ ID NO: 67)；SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 68)；ADAAP (SEQ ID NO: 69)；ADAAPTVSIFPP (SEQ ID NO: 70)；QPKAAP (SEQ ID NO: 71)；QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 72)；AKTTPP (SEQ ID NO: 73)；AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 74)；AKTTAP (SEQ ID NO: 75)；AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 76)； GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 77)；GENKVEYAPALMALS (SEQ ID NO: 78)；GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 79)；GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 80)；TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 81)；及ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 82)。
「標記」及「可偵測標記」或「可偵測部分」意謂附接至特異性結合搭配物，諸如抗體或分析物以使特異性結合對之成員，諸如可偵測之抗體及分析物與特異性結合搭配物，例如抗體或分析物之間發生反應的部分，因此經標記(labeled)稱為「可偵測地標記(detectably labeled)」。因此，如本文所用，術語「經標記之結合蛋白」係指併入有標記以便鑑別結合蛋白之蛋白質。在一實施例中，標記為可產生可藉由目視或儀器方式偵測的信號之可偵測標記物，例如併入放射性標記之胺基酸或將可藉由經標記之抗生蛋白(例如，含有可藉由光學或比色方法偵測之螢光標記物或酶促活性的抗生蛋白鏈菌素)偵測之生物素基部分連接至多肽。多肽之標記之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如18 F、11 C、13 N、15 O、68 Ga、18 F、89 Zr、3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho及153 Sm)；色素原；螢光標記(例如FITC、若丹明及鑭系磷光體)；酶標記(例如辣根過氧化酶、螢光素酶及鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；藉由二級報導體識別之預先確定的多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域及抗原決定基標籤)；及磁性劑，諸如釓螯合物。通常用於免疫分析之標記之代表性實例包括產生光之部分(例如，吖錠化合物)及產生螢光之部分(例如，螢光素)。其他標記描述於本文中。就此而言，部分自身可能不為可偵測標記的但可在與又一部分反應之後變得可偵測。「可偵測標記」之使用意欲涵蓋可偵測標記之後一類型。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與抗原(例如，蛋白質複合物)，諸如呈遞分子-前TGFβ1複合物之結合親和性係使用Octet分析測定。在一些實施例中，Octet分析為一種測定指示抗體與抗原之間的結合的一或多個動力學參數的分析。在一些實施例中，使用Octet®系統(ForteBio, Menlo Park, CA)來測定抗體或其抗原結合部分與呈遞分子-前TGFβ1複合物之結合親和性。舉例而言，抗體之結合親和性可使用fortéBio Octet QKe dip and read無標記分析系統，利用生物層干涉術來測定。在一些實施例中，將抗原固定至生物感測器(例如，經抗生蛋白鏈菌素塗佈之生物感測器)，且抗體及複合物(例如，經生物素標記之呈遞分子-前TGFβ1複合物)以高濃度(50 µg/mL)存在於溶液中以量測結合相互作用。在一些實施例中，抗體或其抗原結合部分與呈遞分子-前TGFβ1複合物之結合親和性係使用本文中所概述之方案測定。新穎、高親和性、非情形依賴性之 前 TGF β 1 抗體的特徵化 結合概況
本文所揭示之抗體具有增強之結合活性。因此，本文揭示一類能夠選擇性抑制TGFβ1活化之高親和性、非情形依賴性抗體。應注意，相較於先前較一般使用情況，術語「非情形依賴性 」在本文中以較高嚴格度使用。根據本發明，該術語賦予抗體可對不同抗原複合物施加之相對親和性之均一水準(亦即，無偏向)。因此，本發明之非情形依賴性抗體能夠靶向多個類型之TGFβ1前驅體複合物(例如，呈遞分子-前TGFβ1複合物)，且能夠以相等親和性(亦即，遍及複合物之相對親和性相差不超過三倍)結合至每一此類複合物，其中如藉由例如MSD-SET所量測，KD 值低於10 nM，較佳低於5 nM，更佳低於1 nM，甚至更佳低於100 pM。如以下展示，由本發明涵蓋之許多抗體具有亞奈莫耳範圍內之KD 值。
因此，抗體能夠特異性結合至呈遞分子-前TGFβ1複合物(有時稱作「大型潛伏複合物」，其為由偶合至單一呈遞分子之前TGFβ1二聚體構成的三元複合物)中之每一者，亦即，LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。通常，使用重組產生的純化蛋白質複合物作為抗原(例如，抗原複合物)以在適合活體外結合分析中評估或確認抗體結合抗原之能力。此類分析為此項技術中所熟知，且包括(但不限於)基於生物層干涉術(BLI)之分析(諸如Octet®)及基於溶液平衡滴定之分析(諸如MSD-SET)。
基於BLI之結合分析普遍用於此項技術中以量測抗體對抗原之親和性及動力學。其為其中基於光學干涉分析生物分子相互作用的無標記技術。蛋白質中之一者，例如所測試抗體可固定於生物感測器端部上。當溶液中之另一蛋白質，例如抗原變得結合至固定抗體時，其引起干擾圖案變化，其可得到即時量測。此實現監測結合特異性、締合及解離速率以及濃度依賴性。因此，BLI為顯示系統動力學之動力學 措施。當用作初始篩選方法以在篩選過程中鑑別及分離一組「結合子」與一組「非結合子」或「弱結合子」時，歸因於其易用性及快速結果，基於BLI之分析，諸如Octet®系統(購自ForteBio/Molecular Devices, Fremont California)為尤其適宜的。
基於BLI之結合分析顯示，當藉由Octet®量測結合親和性時，新穎抗體表徵為「情形平衡/非情形依賴性」抗體。如在彙總抗體之非限制性實例的基於BLI之結合概況的表8中可見，此等抗體在四種靶向複合物中顯示在次奈莫耳範圍內之相對較均一KD值，伴隨相對較低基質-細胞差異(不超過五倍偏向)(參見行(H))。此可與以參考抗體形式提供之先前鑑別之抗體Ab3形成對比，其顯示比細胞締合之複合物明顯較高的對基質締合複合物之相對親和性(27+倍偏向)。
下表 8 提供本發明所涵蓋之高親和性、非情形依賴性前TGFβ1抗體之非限制性實例。該表提供來自活體外結合分析，如藉由Octet®所量測之代表性結果。亦藉由基於SPR之技術(Biacore系統)獲得相似結果。
表之行(A)列舉具有離散胺基酸序列之單株抗體。Ab3(以粗體示出)為先前鑑別之參考抗體，其在基於細胞之分析中顯示為強效的；在多種動物模型中為有效的；且伴有清晰毒理學概況(揭示於PCT/US2018/012601中)。行(B)、(D)、(E)及(F)提供所列抗體中之每一者之親和性，其以KD 量測。行(B)顯示抗體中之每一者對重組人類LTBP1-前TGFβ1複合物之親和性；行(C)顯示對重組人類LTBP3-前TGFβ1複合物之親和性；(E)顯示對重組人類GARP-前TGFβ1複合物之親和性；且(F)顯示對重組人類LRRC33-前TGFβ1複合物之親和性。(B)及(C)之平均KD 值顯示於相應行(D)中，其共同表示抗體對ECM締合或基質締合之前TGFβ1複合物之親和性。同樣，(E)及(F)之平均KD 值顯示於相應行(G)中，其共同表示抗體對細胞表面或細胞締合之前TGFβ1複合物之親和性。最後，來自行(D)及(G)之平均KD 值之間的相對比率表示為行(H)中的「倍數偏向」。因此，當對抗體對基質締合之複合物的結合偏好與細胞表面複合物比較時，行(H)之數目愈大，對特定抗體存在之偏向愈大。此為定量地呈現及比較抗體對其靶向複合物之內在偏向的一種方式。此類分析可適用於引導針對用於特定治療用途之候選抗體的選擇過程。表 8 . 非情形依賴性 TGF β 1 抗體之非限制性實例及藉由 BLI 量測之 KD 值
Figure 108124516-A0304-0009
本發明提供一類高親和性、非情形依賴性抗體，其中之每一者能夠以相等親和性結合至四種已知呈遞分子-前TGFβ1複合物中之每一者，亦即，LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。在一些實施例中，與先前所描述之參考抗體Ab3相比，抗體以相等或更高親和性結合呈遞分子-前TGFβ1複合物中之每一者。根據本發明，如藉由適合活體外結合分析，諸如生物層干涉術及表面電漿子共振所量測，此類抗體以≤ 5 nM之親和性(由KD 確定)特異性結合前述複合物中之每一者。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 5 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合人類LTBP1-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 5 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合人類LTBP3-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 5 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合人類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合人類LRRC33-前TGFβ1複合物。
在較佳實施例中，此類抗體具有人類及鼠類交叉反應性。因此，在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM、≤ 5 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合鼠類LTBP1-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合鼠類LTBP3-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合鼠類GARP-前TGFβ1複合物。在一些實施例中，抗體或片段以≤ 5 nM、≤ 4 nM、≤ 3 nM、≤ 2 nM、≤ 1 nM或≤ 0.5 nM之親和性結合鼠類LRRC33-前TGFβ1複合物。
如所示，本發明之前TGFβ1抗體對基質締合之前TGFβ1複合物具有尤其高的親和性。在一些實施例中，基質締合之複合物(亦即，LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1)之平均KD 值為≤ 1 nM或≤ 0.5 nM。
如所示，本發明之前TGFβ1抗體對細胞締合之前TGFβ1複合物具有高親和性。在一些實施例中，細胞締合之複合物(亦即，GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1)之平均KD 值為≤ 2 nM或≤ 1 nM。
本發明之高親和性前TGFβ1抗體的特徵為其對所有四種抗原複合物之均一(無偏向)親和性(例如，與Ab3相比)。在本文所描述之四種已知呈遞分子-前TGFβ1複合物中，沒有一種抗原複合物之KD 顯著偏離。換言之，相對於先前所描述之前TGFβ1抗體(包括Ab3)，已藉由本發明達成較均一結合活性，此係因為每一此類抗體顯示遍及四種抗原複合物之相等親和性。在一些實施例中，抗體或片段顯示無偏向或均一結合概況，其特徵為抗體或片段遍及四種前TGFβ1抗原複合物之親和性差異(或範圍)在最低與最高KD 值之間不超過五倍。在一些實施例中，親和性之相對差異(或範圍)不超過三倍。
「均一性」或不具有偏向之概念在表8中進一步說明。兩種基質締合之複合物及細胞締合之複合物之間的平均KD 值分別計算(參見欄(D)及(G))。此等平均KD 值接著可用於研究結合活性之偏向是否存在於與基質締合之複合物與與細胞表面(例如，免疫細胞)締合之複合物之間。如表8中所示出，偏向可表現為平均KD 值之「差異倍數」。相比於先前所描述之抗體Ab3，由本發明涵蓋之高親和性、非情形依賴性前TGFβ1抗體明顯無偏向，此係因為許多抗體顯示基質締合之複合物與細胞締合之複合物之間平均KD 值相差不超過三倍(將此與Ab3之25倍以上的偏向進行比較)。
因此，提供一類非情形依賴性單株抗體或片段，其中之每一者能夠以相等親和性結合至以下呈遞分子-前TGFβ1複合物中之每一者，其中如藉由生物層干涉術或表面電漿子共振所量測，親和性≤ 1 nM：LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。如藉由生物層干涉術或表面電漿子共振所量測，此類抗體以≤ 5 nM之親和性特異性結合前述複合物中之每一者，其中單株抗體或片段顯示對以上複合物中之任一者相對於其他複合物的親和性不超過三倍之偏向，且其中單株抗體或片段抑制成熟TGFβ1生長因子自前TGFβ1複合物中之每一者而非自前TGFβ2或前TGFβ3複合物釋放。
儘管可獲自基於BLI之分析的結合概況之動力學(例如，「締合」及「解離」速率)提供適用資訊，但本發明申請者預期，基於本文所揭示之活化抑制劑，亦即，藉由結合至繫留(例如，組織定位)非活性(例如，潛伏)目標，藉此防止其變活化而起作用之抗體的作用機制，在平衡 下量測之結合特性可較為準確地反映其活體內行為及效能。以此觀點來看，作為一個實例，具有快速「締合」速率(「Kon 」)的，將在藉由BLI獲得之結合量測中得到反映的抗體可提供評估中和 抗體(例如，直接靶向且必須快速隔絕活性、可溶性生長因子本身，以便其作為有效抑制劑起作用之抗體)的相關參數。然而，此可能未必適用於充當活化抑制劑 之抗體，諸如本文所揭示之彼等抗體。如所描述，本發明之新穎TGFβ1抑制劑的作用機制係經由對活化步驟之抑制，與隔絕可溶性、活化後生長因子相反，該抑制藉由靶向組織/細胞繫留潛伏複合物來達成。此係因為TGFβ1之活化抑制劑 靶向局部化至各別組織(例如，ECM內、免疫細胞表面等)之無活性前驅體，藉此搶先阻止成熟生長因子自複合物釋放。認為此作用機制允許抑制劑達成活體內目標飽和度(例如，平衡)，而不需要習知中和抑制劑所需之與內源性受體快速競爭暫時生長因子分子。
將作用機制中的此差異考慮在內，藉由使用允許在平衡下 測定親和性的活體外結合分析之另一模式來進行結合特性之進一步評估。
鑒於此，預期在平衡下量測此類抗體之結合親和性之分析可較精確表示活體內目標接合之模式。因此，如以下表9中例示，可進行基於MSD-SET之結合分析(或其他適合之分析)。
溶液平衡滴定(「SET」)為一種以下分析，藉由其可在平衡下在溶液中量測兩個分子(諸如抗原與結合該抗原之抗體)之間的結合。舉例而言，基於Meso-Scale Discovery(「MSD」)之SET或MSD-SET為尤其針對平衡下之高親和性蛋白質-蛋白質相互作用測定解離常數之適用模式(參見例如：Ducata等人 (2015) J Biomolecular Screening 20(10): 1256-1267)。基於SET之分析尤其適用於測定具有次奈莫耳(例如，皮莫耳)親和性的抗體之KD值。表 9 . 高親和性非情形依賴性 TGF β 1 抗體之非限制性實例 ( hIgG4 ) 及藉由 MSD - SET 量測之 KD 值 ( 「 h 」表示人類複合物 )
Figure 108124516-A0304-0010
表9亦包括三種先前所描述之TGFβ1選擇性抗體(C1、C2及Ab3)作為參考抗體。C1及C2首先揭示於公開為WO 2017/156500之PCT/US2017/021972中，且Ab3描述於公開為WO 2018/129329之PCT/US2018/012601中。
如自表9中所提供之親和性資料可見，本發明之新穎抗體的結合活性顯著高於先前所鑑別之參考抗體。此外，新穎TGFβ1抗體為「非情形依賴性」的，此係因為其以相等親和性(例如，約亞奈莫耳範圍，例如以＜ 1 nM之KD)結合至人類LLC複合物中之每一者。高親和性、非情形依賴性結合概況表明，此等抗體可有利於在涉及ECM相關及免疫組分兩者調節異常之TGFβ1相關適應症(諸如癌症)治療中使用。
對於基於溶液平衡滴定之結合分析，包含諸如以上所示之彼等呈遞分子中之一者的蛋白質複合物可用作抗原(呈遞分子-TGFβ1複合物，或LLC)。允許測試抗體在溶液中形成抗原-抗體複合物。培育抗原-抗體反應混合物以允許到達平衡；分析反應中所存在之抗原-抗體複合物之量可藉由此項技術中眾所周知的適合手段量測。相比於基於BLI之分析，基於SET之分析受抗原-抗體複合物之締合/解離速率影響較少，允許靈敏偵測極高親和性相互作用。如表 9 中所示，在本發明中，如藉由基於SET之分析所測定，較佳高親和性TGFβ1抑制劑顯示遍及所測試之所有大型潛伏複合物，亞奈莫耳(例如，皮莫耳)範圍的親和性。
因此，提供一類非情形依賴性單株抗體或片段，其中之每一者能夠以相等親和性結合至以下人類呈遞分子-前TGFβ1複合物中之每一者，其中如藉由溶液平衡滴定分析，諸如MSD-SET所量測，KD ≤ 1 nM：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1。如藉由MSD-SET所量測，此類抗體以≤ 1 nM之KD 特異性結合前述複合物中之每一者，且其中單株抗體或片段抑制成熟TGFβ1生長因子自前TGFβ1複合物中之每一者而非自前TGFβ2或前TGFβ3複合物釋放。在較佳實施例中，此類抗體或片段以500 pM或更小(亦即，≤ 500 pM)、250 pM或更小(亦即，≤ 250 pM)或200 pM或更小(亦即，≤ 200 pM)之KD 結合前述複合物中之每一者。甚至更佳地，此類抗體或片段以100 pM或更小(亦即，≤ 100 pM)之KD 結合前述複合物中之每一者。在一些實施例中，抗體或片段不結合至未與前域複合物締合之自由TGFβ1生長因子。此可藉由此項技術中已知的適合活體外結合分析，諸如生物層干涉術測試或證實。
在其他較佳實施例中，此類抗體或片段亦與鼠類(例如，大鼠及/或小鼠)及/或非人類靈長類動物(例如，食蟹獼猴)對應物交叉反應。僅給出一個實例，Ab6能夠以高親和性結合至包括以下之多個物種的大型潛伏複合物中之每一者：人類、鼠類、大鼠及食蟹獼猴，如以下表10及實例9中所例示。表 10 . 如藉由 MSD - SET 所量測 ， 具有跨物種反應性之高親和性非情形依賴性 TGF β 1 抗體之非限制性實例 ( 「 h 」表示人類 ； 「 m 」表示鼠類 )
Figure 108124516-A0304-0011
 功效
本文所揭示之抗體可出於其抑制TGFβ1信號傳遞之能力在廣義上表徵為「功能性抗體」。如本文所用，「功能性抗體」藉助於其以調節目標蛋白(例如，抗原)之功能的方式結合該目標蛋白之能力賦予一或多種生物活性。功能性抗體因此在廣義上包括能夠調節目標分子(亦即，抗原)之活性/功能。此類調節抗體包括抑制 抗體(或抑制性 抗體)及活化 抗體。本發明牽涉可抑制與多種TGFβ1情形相關的由TGFβ1信號傳遞介導之生物過程的抗體。當以治療有效劑量(在可接受毒性量內達成足夠功效所處的劑量)投與時，用於進行本發明之抑制性藥劑，諸如本文中所述之抗體意欲為TGFβ1選擇性的，且並不靶向或干擾TGFβ2及TGFβ3。相較於先前鑑別之TGFβ1之活化抑制劑，本發明之新穎抗體具有增強之抑制活性(效能)。
在一些實施例中，可在適合的基於細胞之分析，諸如本文中所述之CAGA報導體細胞分析中量測抑制性抗體之效能。通常，培養細胞，諸如異質細胞及初級細胞可用於進行基於細胞之效能分析。可使用表現內源性TGFβ1及/或相關呈遞分子，諸如LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33之細胞。或者，編碼一或多種相關蛋白質，諸如TGFβ1及/或相關呈遞分子，諸如LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33之外源性核酸可例如藉由轉染(例如，穩定轉染或瞬時轉染)或藉由基於病毒載體之感染引入至此類細胞中進行表現。在一些實施例中，將LN229細胞用於該分析。使表現TGFβ1及相關呈遞分子(例如，LTBP1、LTBP3、GARP或LRRC33)之細胞在培養物中生長，該等細胞在細胞表面(當與GARP或LRRC33相關時)上「存在」大型潛伏複合物或沈積於ECM中(當與LTBP相關時)。TGFβ1之活化可藉由表現於另一細胞表面上的整合素觸發。表現整合素之細胞可為共表現大型潛伏複合物之相同細胞或獨立細胞類型。將報導體細胞添加至分析系統，其併入有TGFβ反應性元件。以此方式，可藉由在TGFβ活化後，偵測來自報導體細胞(例如，TGFβ反應性報導體基因，諸如偶合至TGFβ反應性啟動子元件的螢光素酶)的信號來量測TGFβ活化之程度。使用此類基於細胞之分析系統，可藉由量測在存在或不存在測試抗體下，報導體基因信號(例如，如藉由螢光讀取結果所量測的螢光素酶活性)之變化(減少)或差異來測定抗體之抑制活性。此類分析在本文實例2中所例示。
因此，在一些實施例中，針對hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者所量測，根據基於細胞之報導體分析(諸如本文別處所描述之LN229細胞分析)計算之本發明之新穎抗體的抑制效力(IC50)可為5 nM或更小， 在一些實施例中，針對LLC中之每一者所量測，抗體之IC50為2 nM或更小(亦即，≤ 2 nM)。在較佳實施例中，針對LLC複合物中之每一者所量測之抗體的IC50為1 nM或更小。在一些實施例中，抗體針對hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1複合物中之每一者具有小於1 nM之IC50。表 11 . 如藉由報導體細胞分析所量測之所選抗體的抑制效力 ( 以 IC50 計 )
Figure 108124516-A0304-0012
TGFβ1之活化可藉由整合素依賴性機制或蛋白酶依賴性機制觸發。本發明之抗體的抑制活性(例如，效力)可針對阻斷藉由活化模式中之一者或兩者誘導之TGFβ1活化的能力來評估。上文所描述之報導體細胞分析經設計以量測抗體阻斷或抑制TGFβ1活化之整合素依賴性活化的能力。抑制性效力亦可藉由量測抗體阻斷TGFβ1之蛋白酶誘導活化的能力來評定。本發明之實例3提供此類分析之非限制性實施例。結果概述於圖5A及圖5B中。因此，在本發明之一些實施例中，本發明之異構體選擇性抑制劑能夠抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及TGFβ1之蛋白酶依賴性活化。此類抑制劑可用於治療特徵為涉及蛋白酶活性之EDM調節異常的TGFβ1相關適應症。舉例而言，此類TGFβ1相關適應症可能與以下相關：肌纖維母細胞升高、ECM硬度增大、過量或異常膠原沈積或其任何組合。此類病狀包括(例如)纖維性病症及癌症，其包含實體腫瘤(諸如轉移性癌瘤)或骨髓纖維化。
在一些實施例中，可在適合活體內模型中評估效能作為功效及/或藥效學作用之量度。舉例而言，若第一抗體在活體內模型中在特定濃度下為有效的，且第二抗體在同一活體內模型中在比第一抗體要低的濃度下等效，則第二抗體可稱為比第一抗體更有效。可使用此項技術中已知的任何適合疾病模式來評定TGFβ1抑制劑之相對效能，其視相關特定適應症，例如癌症模型及纖維化模型而定。較佳地，各測試抗體之多個劑量或濃度包括於此類研究中。
同樣，可量測藥效學(PD)作用以測定抑制性抗體之相對效能。TGFβ信號傳遞路徑之常用PD量度包括(但不限於)SMAD2/3之磷酸化及後續效應基因之表現，其轉錄對TGFβ活化敏感，諸如伴隨TGFβ反應性啟動子元件(例如Smad結合元件)之基因。在一些實施例中，當以3 mg/kg或更小之劑量投與動物時，本發明之抗體能夠在臨床前纖維化模型中完全阻斷疾病誘導之SMAD2/3磷酸化。在一些實施例中，當在腎臟纖維化之UUO模型中以10 mg/kg或更小之劑量投與動物時，本發明之抗體能夠顯著抑制包括Acta2、Col1a1、Col3a1、Fn1、Itga11、Lox、Loxl2之一組標記基因的經纖維化誘導之表現。 結合區
在本發明之情形下，抗原之「結合區」提供抗體-抗原相互作用之結構基礎。如本文所用，「結合區」係指抗體與抗原之間界面之區域，使得當在生理溶液中結合至前TGFβ1複合物(「抗原」)時，抗體或片段保護結合區避免溶劑暴露，如藉由適合技術，諸如氫-氘交換質譜(HDX-MS)所測定。鑑別結合區適用於獲得對深入特定抗體之抗原-抗體相互作用及作用機制的洞察。能夠實現抗原決定基分組之交叉阻斷實驗可有助於鑑別具有類似或重疊結合區之額外抗體。視情況，可使用X射線結晶學以鑑別介導抗原-抗體相互作用之抗原決定基的準確氨基酸殘基。
HDX-MS對於此項技術為熟悉的，其為用於探究蛋白質構形或溶液中蛋白質-蛋白質相互作用的普遍使用之技術。此方法依賴於蛋白質主鏈醯胺中的氫與溶液中所存在之氘交換。藉由量測氫-氘交換速率，吾人可獲得關於蛋白質動力學及構形之資訊(綜述於：Wei等人 (2014) 「Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications.」 Drug Disco Today. 19(1): 95-102；其以引用之方式併入)。此技術之應用係基於以下假定，當抗體-抗原複合物形成時，結合搭配物之間的界面可封閉溶劑，藉此歸因於溶劑之空間排阻而降低或阻止交換速率。
本發明包括在包含潛伏套索或其部分之區(「結合區」)處結合人類LLC的抗體或其抗原結合片段。潛伏套索為前域內之蛋白質模組。預期許多強效活化抑制劑可結合前TGFβ1複合物之此區，其方式為使得抗體結合將「鎖定」生長因子，藉此阻止其釋放。引起關注地，此為複合物之部分，其中生長因子之蝶狀延長區(例如，對應於例如指-1及指-2)與前域之籠狀結構緊密相互作用。
如圖 18B 中所描繪，潛伏套索包括標記為2a及2b之一部分的區，該等區為前域之一部分。注意緊鄰潛伏套索，標記為5a之區對應於生長因子域內所謂的指-1，且在對置側周圍標記為6b之區為生長因子域內指-2的一部分。基於此，不難設想緊緊環繞此等區之抗體可有效地阻止前TGFβ1複合物脫離，藉此阻斷活化。
使用HDX-MS技術，可測定前TGFβ1之結合區。在一些實施例中，前TGFβ1上鑑別為對結合抗體或片段重要之部分包括前域之至少一部分及生長因子域之至少一部分。結合包含潛伏套索之至少一部分之第一結合區(圖 19A 中之「1區」)的抗體或片段係較佳的。更佳地，此類抗體或片段進一步結合第二結合區(圖 19A 中之「2區」)，該第二結合區包含生長因子域之指-1處之生長因子域的至少一部分。此類抗體或片段可進一步結合第三結合區(圖 19A 中之「3區」)，該第三結合區包含生長因子域之指-2的至少一部分。
前TGFβ1內之其他區亦可直接或間接地促進本文所揭示之此等抗體的高親和性相互作用。視為對介導抗體與前TGFβ1複合物之高親和性結合重要的區(參見圖18A)可包括(但不限於)：LVKRKRIEA (SEQ ID NO: 159)；LASPPSQGEVP (SEQ ID NO: 160)；PGPLPEAV (SEQ ID NO: 161)；LALYNSTR (SEQ ID NO: 162)；REAVPEPVL (SEQ ID NO: 163)；YQKYSNNSWR (SEQ ID NO: 164)；RKDLGWKWIHEPKGYHANF (SEQ ID NO: 165)；LGPCPYIWS (SEQ ID NO: 166)；ALEPLPIV (SEQ ID NO: 167)；及VGRKPKVEQL (SEQ ID NO: 168) (基於人類前TGFβ1之天然序列)。
在一些實施例中，在可促進抗體-抗原相互作用之區中，本發明之高親和性抗體可結合抗原決定基，其包含胺基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (「1區」) (SEQ ID NO: 169)之至少一個殘基。
在一些實施例中，本發明之高親和性抗體可結合抗原決定基，其包含胺基酸序列RKDLGWKWIHEPKGYHANF (「2區」) (SEQ ID NO: 165)之至少一個殘基。
在一些實施例中，本發明之高親和性抗體可結合抗原決定基，其包含胺基酸序列VGRKPKVEQL (「3區」) (SEQ ID NO: 168)之至少一個殘基。
在一些實施例中，本發明之高親和性抗體可結合抗原決定基，其包含胺基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (「1區」) (SEQ ID NO: 169)之至少一個殘基及胺基酸序列RKDLGWKWIHEPKGYHANF (「2區」) (SEQ ID NO: 165)之至少一個殘基。
在一些實施例中，本發明之高親和性抗體可結合抗原決定基，其包含胺基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (「1區」) (SEQ ID NO: 169)之至少一個殘基及胺基酸序列VGRKPKVEQL (「3區」) (SEQ ID NO: 168)之至少一個殘基。
在一些實施例中，本發明之高親和性抗體可結合抗原決定基，其包含胺基酸序列KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (「1區」) (SEQ ID NO: 169)之至少一個殘基、胺基酸序列RKDLGWKWIHEPKGYHANF (「2區」) (SEQ ID NO: 165)之至少一個殘基及胺基酸序列VGRKPKVEQL (「3區」) (SEQ ID NO: 168)之至少一個殘基。
除來自1區、2區及/或3區之貢獻以外，此類抗原決定基可進一步包括來自選自由以下組成之群的序列之至少一個胺基酸殘基：LVKRKRIEA (SEQ ID NO: 159)；LASPPSQGEVP (SEQ ID NO: 160)；PGPLPEAV (SEQ ID NO: 161)；LALYNSTR (SEQ ID NO: 162)；REAVPEPVL (SEQ ID NO: 163)；YQKYSNNSWR (SEQ ID NO: 164)；RKDLGWKWIHEPKGYHANF (SEQ ID NO: 165)；LGPCPYIWS (SEQ ID NO: 166)；ALEPLPIV (SEQ ID NO: 167)；及VGRKPKVEQL (SEQ ID NO: 168)。
如先前所描述(WO 2014/182676)之人類前TGFβ1之蛋白域或基元之非限制性實例提供於表12中。表 12 . 人類 TGF β 1 相關多肽之所選蛋白域 / 基元
Figure AA1
 安全性 / 毒理學
習知TGFβ泛抑制劑能夠拮抗已知會引起數種毒性之多個異構體，該等毒性包括(例如)遍及包括狗及大鼠之多個物種報導的心血管毒性(心肌病變，最值得注意地瓣膜病)。此等包括主動脈瓣、右AV瓣及左AV瓣增生；主動脈瓣、左AV瓣及升主動脈發炎；升主動脈、主動脈瓣及左AV瓣出血；升主動脈結締組織變性(參見例如Strauber等人(2014)「Nonclinical safety evaluation of a Transforming Growth Factor β receptor I kinase inhibitor in Fischer 344 rats and beagle dogs」J. Clin. Pract 4(3): 1000196)。亦參見圖21A。
另外，已將結合所有三種TGFβ異構體之中和抗體與遍及多個物種所觀測到之某些上皮細胞毒性相關聯，該等毒性中之一些在以下概述。表 13 . 與 TGF β 泛抑制劑相關之上皮細胞毒性
Figure 108124516-A0304-0014
在本發明申請人早先認識(參見PCT/US2017/021972)，亦即習知TGFβ拮抗劑缺少異構體特異性可為與TGFβ抑制相關毒性之來源的基礎上進行建構，發明人試圖進一步達成對治療表現多層面TGFβ1調節異常之各種疾病的廣譜TGFβ1抑制，同時保持異構體選擇性抑制劑之安全性/耐受性態樣。
在臨床環境中，僅在藥物(例如，單株抗體)之最小有效濃度(MEC)低於藥物之最小毒性濃度(MTC)時達成治療益處。在大部分(若並非全部)習知TGFβ泛抑制劑之情況下未達成此治療益處，該等泛抑制劑事實上似乎導致劑量限制性毒性。申請人之先前研究描述TGFβ1之異構體選擇性抑制劑，相比於習知泛抑制劑(諸如小分子受體拮抗劑及中和抗體)，其顯示明顯改良之安全概況。WO 2017/156500揭示異構體選擇性TGFβ1活化抑制劑，其在大鼠中以每週至多100 mg/kg之劑量投與4週時，未觀測到測試品相關毒性，將抗體之NOAEL確定為所測試之最高劑量，亦即，100 mg/kg。申請人之後續研究亦顯示具有增強之功能的抗體亦顯示相等安全概況。此處，目標之一為鑑別具有甚至更高親和性及效力，但具有至少相同或相等安全性級別之抗體。
來自四週大鼠毒理學研究之結果提供於圖21B及圖21C中。兩種異構體選擇性TGFβ1抑制劑(Ab3及Ab6)與作為對照之小分子ALK5抑制劑及單株中和抗體一起在獨立研究中測試。在異構體選擇性抗體中之任一者之情況下，未注意到測試品相關毒性，而與公開研究一致，非選擇性抑制劑如所預期引起多種不良事件。此外，當每週投配一次，持續4週時，在食蟹獼猴中在高達300 mg/kg之劑量下Ab6顯示為安全的(例如，未觀測到不良事件)。由於Ab6已顯示為在數種活體內模型中在低至3 mg/kg之劑量下有效，因此此提供至多100倍之治療窗。重要地，此展現高效力不一定必須意謂更大毒性之風險。在不希望受特定理論束縛之情況下，預期本文所揭示之抗體的高選擇性性質可能係缺少所觀測到之毒性的原因。
因此，在一些實施例中，當每週投配一次持續至少4週時，根據本發明之新穎抗體具有＞100 mg/kg之最大耐受劑量(MTD)。在一些實施例中，當每週投配一次持續至少4週時，根據本發明之新穎抗體具有至多100 mg/kg之無觀測到的不良反應量(NOAEL)。用於進行TGFβ抑制劑及TGFβ1抑制劑之安全性/毒理學研究的適合動物模型包括(但不限於)：大鼠、狗、食蟹獼猴及小鼠。在較佳實施例中，基於適合臨床前功效研究的抗體之最低有效量低於NOAEL。更佳地，抗體之最低有效量為NOAEL之約三分之一或更小。在尤其較佳實施例中，抗體之最低有效量為NOAEL之約六分之一或更小。在一些實施例中，抗體之最低有效量為NOAEL之約十分之一或更小。
在一些實施例中，本發明涵蓋能夠抑制TGFβ1信號傳遞之異構體選擇性抗體，其在可有效治療TGFβ1相關適應症之劑量下向個體投與時，不導致心血管或已知上皮細胞毒性。在一些實施例中，抗體之最小有效量為約3-10 mg/kg，每週一次、兩週一次或每月投與。較佳地，抗體在至少六倍最小有效量之劑量下未導致最小毒性(例如，六倍治療窗)。更佳地，抗體在至少十倍最小有效量之劑量下未導致最小毒性(例如，十倍治療窗)。 作用機制
適用作治療劑之本發明抗體為TGFβ1之抑制性抗體。此外，抗體為活化抑制劑，亦即，抗體阻斷TGFβ1之活化步驟，而非直接追趕已經活化之生長因子。
在廣泛意義上，術語「抑制抗體」係指拮抗或中和目標功能(例如，生長因子活性)之抗體。有利地，本發明之較佳抑制性抗體能夠抑制成熟生長因子自潛伏複合物釋放，藉此減少生長因子信號傳遞。抑制抗體包括靶向當與此類抗體締合時，減少生長因子釋放或降低活性之任何抗原決定基的抗體。此類抗原決定基可處於TGFβ蛋白(例如TGFβ1)之前域、生長因子或當與抗體結合時引起降低之生長因子活性的其他抗原決定基。本發明之抑制抗體包括(但不限於) TGFβ1抑制性抗體。在一些實施例中，本發明之抑制性抗體特異性結合組合抗原決定基，亦即藉由抗原或抗原複合物之兩種或更多種組分/部分形成的抗原決定基。舉例而言，組合抗原決定基可藉由來自單一蛋白質之多個部分，亦即來自同一蛋白質之多於一個非相鄰區段的胺基酸殘基之作用而形成。或者，組合抗原決定基可藉由來自抗原複合物之多種蛋白質組分的作用而形成。在一些實施例中，本發明之抑制性抗體特異性結合構形抗原決定基(或構形特異性抗原決定基)，例如對抗原或抗原複合物之三維結構(亦即，構形)敏感的抗原決定基。
拮抗TGFβ信號傳遞之傳統方法為i)在成熟生長因子已變為活性之後直接中和該成熟生長因子，以便耗乏可用於受體結合之自由配位體(例如，自其潛伏前驅複合物釋放)；ii)使用能夠隔離自由配位體之可溶性受體片段(例如，所謂的配位體陷阱)；或，iii)靶向其細胞表面受體以阻斷配位體-受體相互作用。此等習知方法中之每一者需要拮抗劑與內源性對應物競爭。此外，以上前兩種方法(i及ii)靶向活性配位體，活性配位體為瞬變物種。因此，此類拮抗劑必須能夠在短暫時間窗期間，在動力學上之競爭力超過內源性受體。相比而言，第三種方法可提供較持久效果，但無意中導致非所需抑制效應(因此可能的毒性)，此係因為許多生長因子(例如，高達約20種)經相同受體傳遞信號。
為提供對此等缺點之解決方案，及進一步實現更大選擇性及局部化作用，突出抑制性抗體，諸如本文所述之抑制性抗體的較佳作用機制在TGFβ1活化及配位體-受體相互作用上游起作用。因此，預期適於進行本發明之高親和性、異構體特異性、非情形依賴性TGFβ1抑制劑應較佳在無活性(例如，潛伏)前驅TGFβ1複合物(例如，包含前TGFβ1/潛伏TGFβ1之複合物)活化之間靶向該複合物，以便在其來源處(諸如在疾病微環境，例如TME中)阻斷活化步驟。根據本發明之較佳實施例，此類抑制劑以相等親和性靶向ECM締合及細胞表面繫留之前TGFβ1/潛伏TGFβ1複合物兩者，而非暫時可用於受體結合之自由配體。
相對於可溶性活性物質(亦即，在自來源釋放後之成熟生長因子)，局部靶向來源處之組織/細胞繫留之複合物的優點進一步得到最近研究支持。Ishihara等人(Sci. Transl. Med. 11, eaau3259 (2019)「Targeted antibody and cytokine cancer immunotherapies through collagen affinity」)報導當全身性投與之藥物藉由與膠原蛋白結合部分結合靶向腫瘤位點時，相比於非靶向對應物，該等藥物能夠增強抗腫瘤免疫且降低治療相關毒性。
由本發明之抗體達成的作用機制可進一步促成效果之增強持久性，以及整體上更大之效力及安全性。
引起關注地，此等抗體可對細胞締合之TGFβ1 (LRRC33-前TGFβ1及GARP-前TGFβ1)施加額外抑制活性。申請人發現結合LRRC33之抗體往往會在結合至細胞表面LRRC33後內化。內化是否藉由抗體結合主動地誘導，或可替代地，此現象是否來自巨噬細胞之天然(例如，被動)內吞活性之結果係不明確的。然而，高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑Ab6能夠在經轉染LRRC33及前TGFβ1之細胞中快速內化，且利用Ab6達成之內化速率顯著高於利用識別細胞表面LRRC33之參考抗體所達成之內化速率(圖6)。類似結果自初代人類巨噬細胞獲得。此等觀測結果提高以下可能性：Ab6可在結合至其目標LRRC33-前TGFβ1後誘導內化，藉此自細胞表面移除含LRRC33複合物。在疾病位點處，此可降低可活化潛伏LRRC33-前TGFβ1含量之可用性。因此，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可經由兩個並行的作用機制抑制TGFβ1之LRRC33臂：i)阻斷成熟生長因子自潛伏複合物釋放；及，ii)將LRRC33-前TGFβ1複合物經由內化自細胞表面移除。有可能類似抑制性作用機制可適用於GARP-前TGFβ1。抗原複合物及組分
本發明之新穎抗體特異性結合四種已知的人類大型潛伏複合物(例如，hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1)中之每一者，選擇性地抑制TGFβ1活化。較佳抗體進一步符合表1中所闡述之第1至5類中之一或多者的準則。
此類抗體之篩選(例如，鑑別及選擇)涉及使用適合抗原複合物，其通常經重組產生。提供可包含此類抗原複合物之適用蛋白質組分，其包括TGFβ異構體及相關多肽、片段及變異體、呈遞分子(例如，LTBP、GARP、LRRC33)及相關多肽、片段及變異體。此等組分可經表現、純化且使其形成蛋白質複合物(諸如大型潛伏複合物)，其可用於抗體篩選之過程中。篩選可包括陽性選擇，其中期望結合子係選自結合子及非結合子之池或庫；及陰性選擇，其中不合需要之結合子自該池移除。通常，包括至少一種基質締合之複合物(例如，LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP1-前TGFβ1)及至少一種細胞締合之複合物(例如，GARP-前TGFβ1及/或LRRC33-前TGFβ1)用於陽性篩選，以確保所選擇的結合子對兩種此類生物學背景均具有親和性。
在一些實施例中，TGFβ1包含天然存在之哺乳動物胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβ1包含天然存在之人類胺基酸序列。在一些實施例中，TGFβ1包含人類、猴、大鼠或小鼠胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合部分並非特異性結合至TGFβ2。在一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合部分並非特異性結合至TGFβ3。在一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合部分並非特異性結合至TGFβ2或TGFβ3。在一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合部分特異性結合至包含SEQ ID NO: 34中所示之胺基酸序列的TGFβ1。TGFβ2之胺基酸序列及TGFβ3胺基酸序列分別示於SEQ ID NO: 38及SEQ ID NO: 32中。在一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合部分特異性結合至包含非天然存在之胺基酸序列的TGFβ1 (或者，在本文中稱為非天然存在之TGFβ1)。舉例而言，非天然存在之TGFβ1可包含相對於天然存在之TGFβ1胺基酸序列的一或多個經重組生成之突變。在一些實施例中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3胺基酸序列包含如SEQ ID NO: 24-35中所示之胺基酸序列，如表14中所示。在一些實施例中，TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3胺基酸序列包含如SEQ ID NO: 36-43中所示之胺基酸序列，如表15中所示。
TGFβ1 (前域+ 生長因子域 )
Figure 02_image017
TGFβ2 (前域+ 生長因子域 )
Figure 02_image019
TGFβ3 (前域+ 生長因子域 )
Figure 02_image021
表 14. 例示性 TGF β 1 、 TGF β 2 及 TGF β 3 胺基酸序列
Figure AA2
Figure AA3
 表 15. 例示性非人類胺基酸序列
Figure AA4
Figure AA5
Figure AA6
在一些實施例中，抗原蛋白質複合物(例如，LTBP-TGFβ1複合物)可包含一或多種呈遞分子，諸如LTBP蛋白(例如，LTBP1、LTBP2、LTBP3及LTBP4)、GARP蛋白、LRRC33蛋白或其片段。通常，適用於進行本文所揭示之實施例的最小所需片段包括呈遞分子蛋白質之至少50個胺基酸、較佳至少100個胺基酸，該呈遞分子蛋白質包含能夠形成與前TGFβ1複合物的二硫鍵的至少兩個半胱胺酸殘基。具體言之，此等Cys殘基形成共價鍵，其中半胱胺酸駐留接近於前TGFβ1複合物之各單體之N端存在。
如本文所述之抗體或其抗原結合部分能夠結合至LTBP1-TGFβ1複合物。在一些實施例中，LTBP1蛋白質為天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，LTBP1蛋白質為非天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，LTBP1蛋白質為重組蛋白。此類重組LTBP1蛋白質可包含LTBP1，或者其剪接變異體及/或其片段。重組LTBP1蛋白亦可經修飾以包含一或多個可偵測標記。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含前導序列(例如，天然或非天然前導序列)。在一些實施例中，LTBP1蛋白不包含前導序列(亦即，該前導序列已加工或裂解)。此類可偵測標記可包括(但不限於)生物素標籤、聚組胺酸標籤、myc標籤、HA標籤及/或螢光標籤。在一些實施例中，LTBP1蛋白質為哺乳動物LTBP1蛋白。在一些實施例中，LTBP1蛋白為人類、猴、小鼠或大鼠LTBP1蛋白。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含如表15中的SEQ ID NO: 46及SEQ ID NO: 47中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含如表17中的SEQ ID NO: 50中所示之胺基酸序列。
如本文所述之抗體或其抗原結合部分能夠結合至LTBP3-TGFβ1複合物。在一些實施例中，LTBP3蛋白為天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，LTBP3蛋白為非天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，LTBP3蛋白為重組蛋白。此類重組LTBP3蛋白可包含LTBP3，其替代性地剪接變異體及/或其片段。在一些實施例中，LTBP3蛋白包含前導序列(例如，天然或非天然前導序列)。在一些實施例中，LTBP3蛋白不包含前導序列(亦即，該前導序列已加工或裂解)。重組LTBP3蛋白亦可經修飾以包含一或多個可偵測標記。此類可偵測標記可包括(但不限於)生物素標籤、聚組胺酸標籤、myc標籤、HA標籤及/或螢光標籤。在一些實施例中，LTBP3蛋白為哺乳動物LTBP3蛋白。在一些實施例中，LTBP3蛋白為人類、猴、小鼠或大鼠LTBP3蛋白。在一些實施例中，LTBP3蛋白包含如表15中的SEQ ID NO: 44及SEQ ID NO: 45中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，LTBP1蛋白包含如表17中的SEQ ID NO: 51中所示之胺基酸序列。
如本文所述之抗體或其抗原結合部分能夠結合至GARP-TGFβ1複合物。在一些實施例中，GARP蛋白為天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，GARP蛋白為非天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，GARP蛋白為重組蛋白。此類GARP可為重組的，在本文中稱為重組GARP。相較於野生型GARP，一些重組GARP可包含一或多種修飾、截短及/或突變。重組GARP可經修飾而具有可溶性。在一些實施例中，GARP蛋白包含前導序列(例如，天然或非天然前導序列)。在一些實施例中，GARP蛋白不包含前導序列(亦即，該前導序列已加工或裂解)。在其他實施例中，重組GARP經修飾以包含一或多個可偵測標記。在其他實施例中，此類可偵測標記可包括(但不限於)生物素標記、聚組胺酸標籤、flag標籤、myc標籤、HA標籤及/或螢光標籤。在一些實施例中，GARP蛋白為哺乳動物GARP蛋白。在一些實施例中，GARP蛋白為人類、猴、小鼠或大鼠GARP蛋白。在一些實施例中，GARP蛋白包含如表15中的SEQ ID NO: 48至SEQ ID NO: 49中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，GARP蛋白包含如表18中的SEQ ID NO: 52及SEQ ID NO: 53中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，本文中所述之抗體或其抗原結合部分不以情形依賴性方式結合至TGFβ1，例如僅當TGFβ1分子與特異性呈遞分子，諸如GARP複合時才將出現結合至TGFβ1。替代地，抗體及其抗原結合部分以非情形依賴性方式結合至TGFβ1。換言之，當結合至任何呈遞分子：GARP、LTBP1、LTBP3及/或LRCC33時，抗體或其抗原結合部分結合至TGFβ1。
如本文所述之抗體或其抗原結合部分能夠結合至LRRC33-TGFβ1複合物。在一些實施例中，LRRC33蛋白為天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，LRRC33蛋白為非天然存在之蛋白質或其片段。在一些實施例中，LRRC33蛋白為重組蛋白。此類LRRC33可為重組的，在本文中稱為重組LRRC33。相較於野生型LRRC33，一些重組LRRC33蛋白可包含一或多種修飾、截短及/或突變。重組LRRC33蛋白可經修飾而具有可溶性。舉例而言，在一些實施例中，LRRC33之胞外域可經C端His標籤表現以便表現可溶性LRRC33蛋白(sLRRC33；參見例如SEQ ID NO: 84)。在一些實施例中，LRRC33蛋白包含前導序列(例如，天然或非天然前導序列)。在一些實施例中，LRRC33蛋白不包含前導序列(亦即，該前導序列已加工或裂解)。在其他實施例中，重組LRRC33蛋白經修飾以包含一或多個可偵測標記。在其他實施例中，此類可偵測標記可包括(但不限於)生物素標記、聚組胺酸標籤、flag標籤、myc標籤、HA標籤及/或螢光標籤。在一些實施例中，LRRC33蛋白為哺乳動物LRRC33蛋白。在一些實施例中，LRRC33蛋白為人類、猴、小鼠或大鼠LRRC33蛋白。在一些實施例中，LRRC33蛋白包含如表18中的SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84及SEQ ID NO: 101中所示之胺基酸序列。表 17. 例示性 LTBP 胺基酸序列
Figure AA7
 表 18. 例示性 GARP 及 LRRC33 胺基酸序列
Figure AA8
Figure AA9
 醫藥組合物及調配物
本發明進一步提供醫藥組合物，其用作適用於在人類及非人類個體中投藥之藥劑。本發明所涵蓋之一或多種高親和性、非情形依賴性抗體可與醫藥學上可接受之載劑(賦形劑)，包括例如緩衝劑調配或混合以形成醫藥組合物。此類調配物可用於治療涉及TGFβ信號傳遞之疾病或病症。在尤其較佳實施例中，此類調配物可用於免疫-腫瘤學應用。
可向患者投與本發明之醫藥組成物以緩解TGFβ相關適應症(例如，纖維化、免疫病症及/或癌症)。「可接受」意謂載劑與組合物之活性成分相容(且更佳能夠穩定活性成分)，且對所治療之個體無不利作用。醫藥學上可接受之賦形劑(載劑)之實例(包括緩衝劑)將對熟習此項技術者顯而易見，且先前已有描述。參見例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版 (2000) Lippincott Williams and Wilkins, K. E. Hoover編。在一個實例中，本文中所述之醫藥組合物含有多於一種特異性結合GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及LRRC33-前TGFβ1複合物的抗體，其中抗體識別複合物之不同抗原決定基/殘基。
本發明方法中所用之醫藥組合物可包含呈凍乾調配物或水溶液形式的醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 第20版 (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。可接受載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒性，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，其包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。本文中將進一步描述醫藥學上可接受之賦形劑。
本發明亦包括包含根據本發明之抗體或其片段及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
因此，包含此類抗體之抗原結合片段的抗體或分子可調配於適用於人類投藥之醫藥組合物中。
醫藥調配物可包括一或多種賦形劑。在一些實施例中，賦形劑可選自以下中所提供之清單： https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm?event=browseByLetter.page&Letter=A
醫藥組合物通常調配至在約2 mg/mL與約200 mg/mL之間的活性生物(例如，單株抗體、包含抗原結合片段中經工程改造之結合分子等)的最終濃度。舉例而言，調配物之最終濃度(wt/vol)可在介於以下之間的範圍內：約2至200、2至180、2至160、2至150、2至120、2至100、2至80、2至70、2至60、2至50、2至40、5至200、5至180、5至160、5至150、5至120、5至100、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、10至200、10至180、10至160、10至150、10至120、10至100、10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、20至200、20至180、20至160、20至150、20至120、20至100、20至80、20至70、20至60、20至50、20至40、30至200、30至180、30至160、30至150、30至120、30至100、30至80、30至70、30至60、30至50、30至40、40至200、40至180、40至160、40至150、40至120、40至100、40至80、40至70、40至60、40至50、50至200、50至180、50至160、50至150、50至120、50至100、50至80、50至70、50至60、60至200、60至180、60至160、60至150、60至120、60至100、60至80、60至70、70至200、70至180、70至160、70至150、70至120、70至100、70至80 mg/mL。在一些實施例中，調配物中的生物製劑之最終濃度為約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200 mg/mL。
本發明之醫藥組合物較佳調配有適合緩衝劑。適合緩衝劑包括(但不限於)：磷酸鹽緩衝劑、檸檬酸緩衝劑及組胺酸緩衝劑。
調配物之最終pH通常在pH 5.0與8.0之間。舉例而言，醫藥組合物之pH可為約5.0、5.2、5.5、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.5、7.6或7.8。
本發明之醫藥組合物可包含批准用於醫藥調配物中的界面活性劑，諸如非離子型清潔劑。此類界面活性劑包括例如聚山梨醇酯，諸如聚山梨醇酯20 (Tween-20)、聚山梨醇酯80 (Tween-80)及NP-40。
本發明之醫藥組合物可包含穩定劑。對於液蛋白製備，可藉由選擇緩衝pH鹽增強穩定性，且通常亦可使用胺基酸。其通常在液/空氣界面或液/固界面相互作用(伴隨封裝)，引起聚集，隨後吸附及解摺疊蛋白質。適合穩定劑包括(但不限於)：蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇以及某些胺基酸，諸如組胺酸、甘胺酸、甲硫胺酸及精胺酸。
本發明之醫藥組合物可含有以下賦形劑中之一者或任何組合：磷酸鈉、精胺酸、蔗糖、氯化鈉、緩血酸胺、甘露糖醇、苯甲醇、組胺酸、蔗糖、聚山梨醇酯80、檸檬酸鈉、甘胺酸、聚山梨醇酯20、海藻糖、泊洛沙姆(Poloxamer) 188、甲硫胺酸、海藻糖、rh-玻尿酸酶(rhHyaluronidase)、丁二酸鈉、磷酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、麥芽糖、乙酸組胺酸、山梨糖醇、噴替酸、人類血清白蛋白、噴替酸。
在一些實施例中，本發明之醫藥組合物可含有防腐劑。
本發明之醫藥組合物通常以液體或凍乾形式存在。通常，產物可存在於小瓶(例如，玻璃瓶)中。可用於注射器、筆或自動注射器之產物可以預填充液體形式存在於此等容器/封閉系統中。
在一些實例中，本文中所述之醫藥組合物包含脂質體，其含有特異性結合GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及LRRC33-前TGFβ1複合物的抗體，該脂質體可藉由任何適合方法，諸如Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中所述之方法製備。具有延長之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。特別適用之脂質體可藉由逆相蒸發法用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生化之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物產生。脂質體經具有界定孔徑之過濾器擠出以產生具有所要直徑之脂質體。
在一些實施例中，選擇具有靶向特性之脂質體以將醫藥組合物優先遞送或定位至某些組織或細胞類型。舉例而言，可採用具有靶向骨髓特性之某些奈米粒子類載劑，例如基於脂質之奈米粒子或脂質體。參見例如Sou (2012) 「Advanced drug carriers targeting bone marrow」, ResearchGate公開案232725109。
在一些實施例中，本發明之醫藥組成物可包含或可結合佐劑使用。預期特定佐劑可增加個體對例如腫瘤抗原之免疫反應，且促進T效應功能、自單核球分化DC、經增強之抗原吸收及藉由APC之呈遞等。適合佐劑包括(但不限於)視黃酸類佐劑及其衍生物、水包油乳液類佐劑(諸如MF59)及其他含角鯊烯佐劑、Toll樣受體(TRL)配位體(例如CpG)、α-生育酚(維生素E)及其衍生物。
本文中所述之抗體亦可包覆於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊，例如分別在膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微粒、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或在巨乳液中之羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊。例示性技術先前已有描述，參見例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版 Mack Publishing (2000)。
在其他實施例中，本文中所述之醫藥組合物可以持續釋放形式調配。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT™)(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德(leuprolide acetate)構成之可注射微球體)、蔗糖乙酸酯異丁酸鹽及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於活體內投藥之醫藥組合物必須為無菌的。此易於藉由例如經由無菌過濾膜過濾來實現。治療抗體組合物一般置放於具有無菌接取口之容器中，例如具有可用皮下注射針頭刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
本文中所述之醫藥組合物可呈單位劑型，諸如錠劑、丸劑、膠囊、散劑、顆粒、溶液或懸浮液或栓劑，以用於經口、非經腸或經直腸投與或藉由吸入或吹入投與。
適合表面活性劑尤其包括非離子劑，諸如聚氧化乙烯脫水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他脫水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑之組合物宜將包含0.05%與5%之間的表面活性劑，且可在0.1%與2.5%之間。應瞭解必要時可添加其他成分，例如甘露醇，或其他醫藥學上可接受之媒劑。
適合的乳液可使用市售脂肪乳液，諸如IntralipidTM 、LiposynTM 、InfonutrolTM 、LipofundinTM 及LipiphysanTM 製備。活性成分可溶解於預混乳液組合物中，或者其可溶解於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)及在與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合時形成的乳液中。應瞭解，可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳液張力。適合的乳液將通常含有至多20%油，例如5%與20%之間。
乳液組合物可為藉由混合本發明之抗體與Intralipid™或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)製備之彼等乳液組合物。用於偵測、監測或緩解 TGF β 相關適應症之套組
本發明亦提供供用於緩解與TGFβ相關適應症相關之疾病/病症中的套組。此類套組可包括一或多個容器，其包含抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分特異性結合至GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物，例如本文所述之彼等中之任一者。
在一些實施例中，套組可包含根據本文所述之任一方法的使用說明書。所包括之說明書可包含投與特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分，治療、延遲發作或緩解目標疾病，如本文中所述之彼等疾病的描述。套組可進一步包含基於鑑別個體是否患有靶向疾病來選擇適用於治療之個體的描述。在再其他實施例中，說明書包含向處於目標疾病之風險下的個體投與抗體或其抗原結合部分的描述。
與特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分之使用相關的說明書通常包括關於預期治療之劑量、給藥時程及給藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如，多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之套組中供應之說明書為通常在標籤或藥品說明書(例如套組中包括之紙片)上之書面說明書，但機器可讀說明書(例如磁化或光學儲存盤上載有的說明書)亦為可接受的。
標籤或藥品說明書指示組合物用於治療、延遲發作及/或緩解與TGFβ相關適應症相關之疾病或病症。說明書可提供用於實踐本文所述之任一方法。
本發明之套組呈適合包裝形式。適合的包裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似者。亦涵蓋用於與特定裝置，諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如，霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合之包裝。套組可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物，如本文所述之彼等。
套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相聯之標籤或藥品說明書。在一些實施例中，本發明提供包含上文所述的套組之內含物的製品。篩選、鑑別及製造異構體特異性、高親和性、非情形依賴性之 TGF β 1 抑制劑之方法
本發明涵蓋以下的篩選/選擇方法、生產方法及製程：能夠以相等親和性結合以下中之每一者的抗體或其片段：GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及LRRC33-前TGFβ1複合物，及包含該等抗體或其片段之醫藥組合物及相關套組。出於篩選目的，較佳包括LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1複合物中之至少一者，及GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1複合物中之至少一者，以使鑑別對ECM締合之複合物及細胞締合之複合物兩者具有寬廣結合特異性之期望抗體的機會達到最大。
可使用多種方法來獲得本發明之抗體或其抗原結合片段。舉例而言，可使用重組DNA法產生抗體。亦可藉由根據已知方法生成融合瘤來產生單株抗體(參見例如，Kohler及Milstein (1975) Nature, 256: 495-499)。隨後使用標準方法，諸如酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)及表面電漿子共振(例如，OCTET®或BIACORE)分析篩選以此方式形成之融合瘤，以鑑別產生特異性結合至指定抗原之抗體的一或多種融合瘤。指定抗原之任何形式可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在之形式、任何變異體或其片段以及其抗原肽(例如，作為線性抗原決定基或處於骨架內的作為構形抗原決定基的本文中所述之抗原決定基中之任一者)。製造抗體之一種例示性方法包括篩選表現抗體或其片段(例如，scFv)之蛋白質表現庫，例如噬菌體或核糖體展示庫。噬菌體展示描述於例如Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Smith (1985) Science 228:1315-1317；Clackson等人 (1991) Nature, 352: 624-628；Marks等人 (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；及WO 90/02809。
除了使用展示庫外，指定抗原(例如，呈遞分子-TGFβ1複合物)可用於免疫接種非人類宿主，例如兔、天竺鼠、大鼠、小鼠、倉鼠、綿羊、山羊、雞、駱駝以及諸如鯊魚之非哺乳動物宿主。在一個實施例中，非人類動物為小鼠。
可使用純化重組蛋白複合物(諸如具有或不具有與其締合之呈遞分子(或其片段)的前TGFβ1)作為免疫原，進行對非人類宿主之免疫接種。此等複合物包括(但不限於)：LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。締合呈遞分子不必為全長對應物，但較佳包括與前TGFβ1二聚體複合物形成共價鍵的兩個半胱胺酸殘基。
可替代地，可使用基於細胞之抗原進行對非人類宿主之免疫接種。術語基於細胞之抗原係指表現前TGFβ1蛋白複合物之細胞(例如，異源細胞)。此可藉由過度表現前TGFβ1，視情況伴隨共表現較佳呈遞分子來達成。在一些實施例中，內源性對應物可用作基於細胞之抗原。形成含前TGFβ1蛋白複合物之蛋白質的細胞表面表現可藉由諸如FACS之熟知方法證實。在用此類細胞(基於細胞之抗原)對宿主進行免疫接種後，在宿主中引發對抗原之免疫反應，允許抗體產生及後續篩選。在一些實施例中，使用適合之基因剔除動物以促進對抗原之較強免疫反應。可替代地，不同物種中之結構性差異可能足以在宿主中觸發抗體產生。
在另一實施例中，單株抗體係由非人類動物獲得，且隨後使用適合重組DNA技術加以修飾，例如嵌合。已描述多種用於製造嵌合抗體之方法。參見例如，Morrison等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985；Takeda等人, Nature 314:452, 1985；Cabilly等人, 美國專利第4,816,567號；Boss等人, 美國專利第4,816,397號；Tanaguchi 等人, 歐洲專利公開案EP171496；歐洲專利公開案0173494；英國專利GB 2177096B。
對於另外的抗體產生技術，參見Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow等人編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988。本發明不必限制於抗體之任何特定來源、製造方法或其他特殊特徵。
本發明之一些態樣係關於經聚核苷酸或載體轉化之宿主細胞。宿主細胞可為原核或真核生物細胞。存在於宿主細胞中的聚核苷酸或載體可整合至宿主細胞之基因組中或其可維持在染色體外。該宿主細胞可為任何原核或真核生物細胞，諸如細菌細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞或人類細胞。在一些實施例中，真菌細胞為例如酵母菌屬之真菌細胞，尤其釀酒酵母物種之真菌細胞。術語「原核(prokaryotic)」包括可經DNA或RNA分子轉化或轉染以表現抗體或相應免疫球蛋白鏈的所有細菌。原核宿主可包括革蘭氏陰性以及革蘭氏陽性細菌，諸如大腸桿菌(E . coli )、鼠傷寒沙門桿菌(S . typhimurium )、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens )及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )。術語「真核」包括酵母、高級植物、昆蟲及脊椎動物細胞，例如哺乳動物細胞，諸如NSO及CHO細胞。視重組製造程序中所用之宿主而定，由聚核苷酸編碼之抗體或免疫球蛋白鏈可糖基化或可非糖基化。抗體或相應免疫球蛋白鏈亦可包括初始甲硫胺酸胺基酸殘基。
在一些實施例中，在載體已併入至合適宿主中後，宿主可維持在適用於核苷酸序列之高度表現的條件下，且視需要，之後可進行免疫球蛋白輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二聚體或完整抗體、抗原結合片段或其他免疫球蛋白形式之收集及純化；參見Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)。因此，將聚核苷酸或載體引入至細胞中，其反過來產生抗體或抗原結合片段。此外，包含前述宿主細胞之轉殖基因動物，較佳哺乳動物，可用於大規模製造抗體或抗體片段。
轉型宿主細胞可在醱酵槽中生長且使用任何適合技術培養為達成最佳細胞生長。得到表現後，可根據此項技術之標準程序，包括硫酸銨沈澱、親和管柱、管柱層析、凝膠電泳及其類似者來純化完整抗體、其二聚體、個別輕鏈及重鏈、其他免疫球蛋白形式或抗原結合片段；參見Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)。抗體或抗原結合片段可隨後自生長培養基、細胞溶胞物或細胞膜部分分離。可藉由任何習知手段，諸如製備型層析分離及免疫分離，諸如涉及使用針對例如抗體之恆定區的單株或多株抗體的彼等分離，對例如經微生物表現之抗體或抗原結合片段進行分離及純化。
本發明之態樣係關於融合瘤，其提供單株抗體之無限期來源。作為直接自融合瘤之培養物獲得免疫球蛋白的替代方案，可使用永生化融合瘤細胞作為用於後續表現及/或基因操控的重排重鏈及輕鏈基因座之來源。重排抗體基因可自合適mRNA反轉錄以產生cDNA。在一些實施例中，重鏈恆定區可與不同同型之重鏈恆定區交換或一起消除。可變區可經連接以編碼單鏈Fv區。多個Fv區可經連接以賦予與多於一種目標結合之能力，或可採用嵌合重鏈及輕鏈組合。可使用任何合適方法來選殖抗體可變區且生成重組抗體。
在一些實施例中，獲得編碼重鏈及/或輕鏈之可變區的合適核酸，且將其插入至可轉染至標準重組宿主細胞中的表現載體。可使用多種此類宿主細胞。在一些實施例中，哺乳動物宿主細胞可有利於高效加工及製造。適用於此目的之典型哺乳動物細胞株包括CHO細胞、293細胞或NSO細胞。可藉由在適合於宿主細胞之生長及表現編碼序列之培養條件下培養經修飾之重組宿主來進行抗體或抗原結合片段之製造。抗體或抗原結合片段可藉由自培養物分離來回收。表現系統可經設計以包括信號肽，以使得所得抗體分泌於培養基中；然而亦可進行胞內製造。
本發明亦包括編碼本文中所述之抗體之免疫球蛋白鏈的至少一個可變區的聚核苷酸。在一些實施例中，由聚核苷酸編碼之可變區包含由上述融合瘤中之任一者產生的抗體之可變區之VH及/或VL的至少一個互補決定區(CDR)。
編碼抗體或抗原結合片段之聚核苷酸可為例如DNA、cDNA、RNA或經合成產生之DNA或RNA或經重組產生之嵌合核酸分子，其包含單獨或組合形式之彼等聚核苷酸中之任一者。在一些實施例中，聚核苷酸為載體之一部分。此類載體可包含其他基因，諸如標記基因，其使得可在適合宿主細胞中且在適合條件下選擇載體。
在一些實施例中，聚核苷酸以可操作方式連接於允許在原核或真核細胞中表現的表現控制序列。聚核苷酸之表現包含將聚核苷酸轉錄成可轉譯mRNA。確保在真核細胞(較佳為哺乳動物細胞)中達成表現的調節元件已為熟習此項技術者熟知。其可包括促進轉錄開始之調節序列及視情況選用之促進轉錄結束及轉錄物之穩定的聚-A (poly-A)信號。其他調節元件可包括轉錄以及轉譯增強子，及/或天然相關的或異質啟動子區域。准許原核宿主細胞中之表現的可能調控元件包括例如大腸桿菌中的PL、Lac、Trp或Tac啟動子，且准許真核宿主細胞中之表現的調節元件之實例為酵母中的AOX1或GAL1啟動子，或哺乳動物及其他動物細胞中的CMV啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子(勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))、CMV強化子、SV40強化子或血球蛋白內含子。
除負責轉錄起始之元件之外，此類調節元件亦可在聚核苷酸之下游包括轉錄終止信號，諸如SV40-聚-A位點或tk-聚-A位點。此外，視所用表現系統而定，能夠將多肽導引至細胞區室或將其分泌於培養基中的前導序列可添加至聚核苷酸之編碼序列，且先前已有描述。前導序列，且較佳地，能夠引導轉譯之蛋白質之分泌的前導序列或其一部分係在適當階段與轉譯、起始及終止序列一起組裝於細胞外介質中。視情況地，可使用異質聚核苷酸序列，其編碼包括C或N端鑑別肽之融合蛋白，該肽賦予所需特徵，例如經表現之重組產物的穩定或簡化純化。
在一些實施例中，至少編碼輕鏈及/或重鏈之可變域的聚核苷酸可編碼兩個免疫球蛋白鏈或僅一者之可變域。同樣，聚核苷酸可處於同一啟動子控制下或可單獨地受控以供表現。此外，一些態樣係關於基因工程改造中所習知使用的載體，特定而言，質體、黏質體、病毒及噬菌體，其包含編碼抗體或抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之可變域的聚核苷酸；其視情況與編碼抗體之另一免疫球蛋白鏈之可變域的聚核苷酸組合。
在一些實施例中，表現控制序列提供為載體中能夠轉型或轉染真核宿主細胞的真核啟動子系統，但亦可使用原核宿主之控制序列。可使用源自諸如反轉錄病毒、痘瘡病毒、腺相關病毒、疱疹病毒或牛乳頭狀瘤病毒之病毒的表現載體來將聚核苷酸或載體遞送至目標細胞群中(例如，以對細胞進行工程改造來表現抗體或抗原結合片段)。可使用多種合適方法來構築重組病毒載體。在一些實施例中，聚核苷酸及載體可重建於脂質體中以遞送至目標細胞。含有聚核苷酸(例如，免疫球蛋白鏈編碼序列及表現控制序列的一或多個重鏈及/或輕鏈可變域)之載體可藉由適合方法轉移至宿主細胞中，其視細胞宿主類型而變化。
篩選方法可包括評估或確認抗體或其片段之所需活性的步驟。在一些實施例中，該步驟包含選擇抑制目標功能，例如抑制成熟/可溶性生長因子(例如，TGFβ1)自潛伏複合物之釋放的能力。在較佳實施例中，該步驟包含基於細胞之效能分析，其中當前TGFβ複合物表現在細胞表面上時，藉由量測活化後培養基(例如，分析溶液)中所釋放的生長因子之量來分析一或多種測試抗體之抑制活性。釋放於培養基/溶液中的生長因子之量可藉由例如量測TGFβ活性來分析。適用的基於細胞之效能分析之非限制性實例描述於本文中之實例2中。
在一些實施例中，篩選期望抗體或片段之步驟包含選擇促進抗體-抗原複合物內化及後續自細胞表面移除的抗體或其片段。在一些實施例中，該步驟包含選擇誘導ADCC之抗體或其片段。在一些實施例中，該步驟包含選擇積聚至活體內所需位點(例如，細胞類型、組織或器官)的抗體或其片段。在一些實施例中，該步驟包含選擇能夠穿過血腦屏障的抗體或其片段。該方法可視情況包括以下步驟：最佳化一或多個抗體或其片段，以得到具有如藉由諸如以下之標準所測定的期望概況之變異對應物：穩定性、結合親和性、功能性(例如，抑制活性、Fc功能等)、免疫原性、pH敏感性及可發展性(例如，高溶解度、低自結合等)。
用於製備包含根據本發明之抗體或片段之組合物的製程可包括使鑑別為具有期望結合及功能(例如，抑制性)特性之一或多種抗體最佳化。最佳化可包含使抗體或其片段之親和性成熟。可進行其他最佳化步驟以提供有利於治療性組合物之物理化學特性。此類步驟可包括(但不限於)突變誘發或工程改造，以提供經改良溶解性、缺少自聚集、穩定性、pH敏感性、Fc功能等等。所得經最佳化抗體較佳為適於人類投與之完全人類抗體或人類化抗體。
包含此類抗體或其片段之醫藥組合物的製程可包含以下步驟：純化、調配、無菌過濾、包裝等。某些步驟(諸如無菌過濾)例如根據由相關管理機構(諸如FDA)給出之準則進行。此類組合物可以一次性容器(諸如預填充注射器)或多次劑量容器(諸如小瓶)形式提供。修飾
本發明之抗體或其抗原結合部分可經可偵測標記或可偵測部分修飾，其包括(但不限於)酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、發射正電子金屬、非放射性的順磁性金屬離子及親和性標籤，以供偵測及分離GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及/或LRRC33-前TGFβ1複合物。可偵測物質或部分可直接偶合或結合至本發明之多肽，或間接地經由中間物(諸如例如連接子(例如，可裂解連接子))，使用適合技術來偶合或結合至本發明之多肽。適合酶之非限制性實例包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基複合物之非限制性實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生蛋白/生物素；適合螢光材料之非限制性實例包括生物素、傘酮、螢光素、螢光素異硫氰酸鹽、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料之實例包括魯米諾(luminol)；生物發光材料之非限制性實例包括螢光素酶、螢光素及水母發光蛋白；且適合放射性材料之實例包括放射性金屬離子，例如α發射體或其他放射性同位素，諸如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115mIn、113mIn、112In、111In)及鎝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、Lu (177Lu)、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、86R、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、鋯(89 Zr)及錫(113Sn、117Sn)。在一些實施例中，放射性標記可選自由以下組成之群：11 C、13 N、15 O、68 Ga、177 Lu、18 F及89 Zr。在一些實施例中，適用之標記為發射正電子之同位素，其可藉由正電子發射斷層攝影術偵測。可偵測物質可直接，或使用適合技術經中間體(諸如，例如連接子)間接偶聯或結合至特異性結合至GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及/或LRRC33-前TGFβ1複合物之本發明抗體。與可偵測物質結合的本文所提供之抗體中之任一者可用於任何適合診斷分析，諸如本文中所述之分析。
此外，本發明之抗體或其抗原結合部分亦可經藥物修飾。藥物可直接偶合或結合至本發明之多肽，或間接地經由中間物(諸如連接子(例如，可裂解連接子))，使用適合技術來偶合或結合至本發明之多肽。靶向劑
在一些實施例中，本發明之方法包含出於調節自GARP-前TGFβ1複合物、LTBP1-前TGFβ1複合物、LTBP3-前TGFβ1複合物及/或LRRC33-前TGFβ1複合物釋放成熟TGFβ之目的，使用一或多種靶向劑將如本文所揭示之抗體或其抗原結合部分靶向至個體中之特定位點。舉例而言，LTBP1-前TGFβ1複合物及LTBP3-前TGFβ1複合物通常定位至細胞外基質。因此，在一些實施例中，出於將抗體定位至LTBP締合之TGFβ1複合物所駐留之位點的目的，本文所揭示之抗體可與細胞外基質靶向劑結合。在此類實施例中，抗體之選擇性靶向引起LTBP1-前TGFβ1複合物及LTBP3-前TGFβ1複合物之選擇性調節。在一些實施例中，細胞外基質靶向劑包括肝素結合劑、基質金屬蛋白酶結合劑、離胺醯氧化酶結合域、原纖維蛋白結合劑、玻尿酸結合劑及其他靶向劑。
類似地，GARP-前TGFβ1複合物及LRRC33-前TGFβ1複合物通常定位且錨定至細胞表面。前者表現於活化FOXP3+調節T細胞(Treg)上，而後者表現於某些骨髓細胞及一些癌細胞(諸如AML)上。因此，在一些實施例中，出於將抗體定位至此等細胞締合之前TGFβ1複合物所駐留之位點的目的，本文所揭示之抗體可與免疫細胞(例如，Treg細胞、活化巨噬細胞等)結合劑結合。在此類實施例中，抗體之選擇性靶向引起選擇性抑制細胞締合之前TGFβ1複合物(舉例而言，例如在癌症治療中，出於免疫調節之目的，選擇性抑制成熟TGFβ1之釋放)。在此類實施例中，免疫細胞靶向劑可包括例如CCL22及CXCL12蛋白質或其片段。
在一些實施例中，可使用雙特異性抗體，其具有選擇性地結合前TGFβ1複合物之第一部分及選擇性地結合目標位點之組分，例如ECM之組分(例如，原纖維蛋白)或Treg細胞之組分(例如，CTLA-4)的第二部分。
如本文中進一步詳述，本發明預期異構體選擇性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑可用於促進或修復骨髓中之造血。因此，在一些實施例中，包含此類抑制劑(例如，高親和性的異構體選擇性TGFβ1抑制劑)的組合物可靶向至骨髓。達成骨髓靶向之一個模式為使用優先靶向骨髓定位或積聚之某些載劑。舉例而言，可採用具有靶向骨髓特性之某些奈米粒子類載劑，例如基於脂質之奈米粒子或脂質體。參見例如Sou (2012) 「Advanced drug carriers targeting bone marrow」, ResearchGate公開案232725109。
在一些實施例中，靶向劑包括免疫增強劑，諸如包含角鯊烯及/或α-生育酚之佐劑，及包含TLR配位體/促效劑(諸如TLR3配位體/促效劑)之佐劑。舉例而言，含角鯊烯之佐劑可優先靶向某些免疫細胞，諸如單核球、巨噬細胞及抗原呈遞細胞，以增強預致敏(priming)、抗原加工及/或免疫細胞分化，從而增強宿主免疫。在一些實施例中，此類佐劑可刺激宿主對新抗原決定基之免疫反應，以便進行T細胞活化。治療目標及活體內作用機制
因此，此類醫藥組合物及調配物用於活體內靶向可經抑制劑接近之含TGFβ潛伏複合物。因此，本發明之抗體目標為在疾病位點(例如，TME)處靶向以下複合物，在該疾病位點處，該抗體搶先結合潛伏複合物，藉此阻止生長因子釋放：i)由GARP呈遞之前TGFβ1；ii)由LRRC33呈遞之前TGFβ1；iii)由LTBP1呈遞之前TGFβ1；及由LTBP3呈遞之前TGFβ1。通常，以上複合物(i)及(ii)存在於細胞表面上，因為GARP及LRRC33兩者均為能夠將潛伏前TGFβ1錨定或繫留於表現LRRC33之細胞的細胞外表面上的跨膜蛋白，而複合物(iii)及(iv)為細胞外基質之組分。以此方式，本文中實施之抑制劑不必與內源性高親和性受體完全結合來發揮抑制性作用。另外，靶向配位體/受體相互作用之上游可實現較持久作用，因為目標可接近性之窗較長，且相比僅在其自潛伏複合物釋放之後靶向暫時性可溶性生長因子之習知抑制劑，更多地定位至相關組織。因此，相比於習知中和抗體，靶向繫留至某些生態棲位之潛伏複合物可促進活體內經改良目標接合，習知中和抗體必須在生長因子自潛伏複合物釋放後，呈可溶性(自由)生長因子形式之短半衰期(例如，約兩分鐘)期間，競爭與內源性受體之結合。
多種研究已闡明TGFβ1活化之機制。已證明三種整合素，αVβ6、αVβ8及αVβ1為潛伏TGFβ1之主要活化劑(Reed, N.I.等人, Sci Transl Med, 2015. 7(288): 第288ra79頁；Travis, M.A.及D. Sheppard, Annu Rev Immunol, 2014. 32: 第51-82頁；Munger, J.S.等人, Cell, 1999. 96(3): 第319-28頁)。αV整合素以高親和性結合TGFβ1及TGFβ1 LAP中所存在之RGD序列(Dong, X.等人, Nat Struct Mol Biol, 2014. 21(12): 第1091-6頁)。在TGFβ1 RGD位點處具有阻止整合素結合，而非分泌之突變的轉殖基因小鼠表型複製TGFβ1-/-小鼠(Yang, Z.等人, J Cell Biol, 2007. 176(6): 第787-93頁)。缺乏β6及β8整合素兩者之小鼠重演TGFβ1及TGFβ3基因剔除小鼠之所有基本表型，包括多器官發炎及裂齶，證實此等兩種整合素對於發育及內穩定中的TGFβ1活化的基本作用(Aluwihare, P.等人, J Cell Sci, 2009. 122(Pt 2): 第227-32頁)。潛伏TGFβ1之整合素依賴性活化的關鍵在於共價繫留至呈遞分子；突變誘發所致的GARP與TGFβ1 LAP之間的二硫鍵之中斷不會損害複合物形成，但完全破壞利用αVβ6之TGFβ1活化(Wang, R.等人, Mol Biol Cell, 2012. 23(6): 第1129-39頁)。潛伏TGFβ1之最新結構研究闡明整合素如何實現活性TGFβ1自潛伏複合物釋放：潛伏TGFβ1共價連接至其呈遞分子將潛伏TGFβ1經由LTBP錨定至ECM或經由GARP或LRRC33錨定至細胞骨架。整合素結合至RGD序列引起LAP之結構發生力依賴性變化，使得活性TGFβ1釋放且結合鄰近受體(Shi, M.等人, Nature, 2011. 474(7351): 第343-9頁)。疾病中整合素依賴性TGFβ1活化之重要性亦已得到良好驗證。αVβ1之小分子抑制劑預防經博萊黴素(bleomycin)誘導之肺纖維化及經四氯化碳誘導之肝纖維化(Reed, N.I.等人, Sci Transl Med, 2015. 7(288): 第288ra79頁)，且經抗體阻斷αVβ6或整合素β6表現之喪失抑制經博萊黴素誘導之肺纖維化及放射線誘發之纖維化(Munger, J.S.等人, Cell, 1999. 96(3): 第319-28頁；Horan, G.S.等人, Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(1): 第56-65頁)。除了整合素外，亦已表明TGFβ1活化之其他機制，包括凝血栓蛋白-1及利用蛋白酶，諸如纖維蛋白溶酶、基質金屬蛋白酶(MMP，例如MMP2、MMP9及MMP12)、組織蛋白酶D、激肽釋放酶及ADAM家族鋅蛋白酶(例如，ADAM10、ADAM12及ADAM17)活化。凝血栓蛋白-1之基因剔除在一些組織中重演TGFβ1-/-表型之一些態樣，但在經博萊黴素誘導之肺纖維化方面並不具有保護性，已知為TGFβ依賴性的(Ezzie, M.E.等人, Am J Respir Cell Mol Biol, 2011. 44(4): 第556-61頁)。另外，候選蛋白酶之基因剔除並未產生TGFβ1表型(Worthington, J.J.，J.E. Klementowicz及M.A. Travis, Trends Biochem Sci, 2011. 36(1): 第47-54頁)。此可藉由冗餘或藉由此等機制在特定疾病而不是發育及內穩定方面至關重要來解釋。
因此，本文所述之異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑包括藉由阻止TGFβ1活化之步驟起作用的抑制劑。在一些實施例中，此類抑制劑可抑制TGFβ1之整合素依賴性(例如，機械或力驅動)活化。在一些實施例中，此類抑制劑可抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性或經蛋白酶誘導之活化。後者包括以非整合素依賴性方式抑制TGFβ1活化步驟之抑制劑。在一些實施例中，此類抑制劑可無關於活化模式抑制TGFβ1活化，例如抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及蛋白酶依賴性活化兩者。可活化TGFβ1之蛋白酶之非限制性實例包括絲胺酸蛋白酶，諸如激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶以及鋅金屬蛋白酶(MMP家族) (諸如MMP-2、MMP-9及MMP-13)。激肽釋放酶包括血漿-激肽釋放酶及組織激肽釋放酶，諸如KLK1、KLK2、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK9、KLK10、KLK11、KLK12、KLK13、KLK14及KLK15。本文中呈現之資料證明異構體特異性TGFβ1抑制劑之實例能夠活體外抑制TGFβ1之激肽釋放酶依賴性活化。在一些實施例中，本發明之抑制劑阻止活性(成熟) TGFβ1生長因子自潛伏複合物釋放或解離。在一些實施例中，此類抑制劑可藉由使複合物之無活性(例如，潛伏)構形穩定而起作用。資料進一步展現高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑(Ab6)亦可抑制纖維蛋白溶酶依賴性TGFβ1活化。然而，出人意料地，情形偏向之TGFβ1抑制劑(Ab3)未能抑制此過程。Ab3及Ab6兩者對基質締合之前TGFβ1複合物具有類似親和性。然而，Ab3對細胞締合之前TGFβ1複合物具有顯著較弱結合親和性。兩種類別之間的相對差異超過20倍(「偏向」)。相比之下，Ab6顯示對兩種類別抗原複合物之相等高親和性。一種可能的解釋為所觀測到之功能差異可源於Ab3之偏向特徵。另一可能的解釋為該差異由抗原決定基或結合區之差異介導。
本發明尤其適用於與不限於TGFβ1功能之單一情形之TGFβ1信號傳遞之多個生物作用相關的某些疾病的治療用途。在此等情況下，遍及多個情形抑制TGFβ1效應可為有益的。因此，本發明提供用於以異構體特異性方式，而非情形特異性方式靶向且抑制TGFβ1之方法。此類藥劑可稱作「異構體特異性、非情形依賴性」TGFβ1調節劑。
高親和性、異構體特異性TGFβ1抑制劑(無論與哪一呈遞分子締合，其靶向且抑制TGFβ1功能)提供異構體特異性，同時允許遍及多個TGFβ1活性之抑制效應的較寬覆蓋範圍。
有大量證據支持多種疾病顯現TGFβ信號傳遞之複雜干擾的觀點，其可能涉及賦予TGFβ功能之不同作用的異質細胞類型之參與，其係由TGFβ與所謂的呈遞分子之相互作用介導。已鑑別出至少四種此類呈遞分子，其可在細胞外生態棲位處「呈遞」多個TGFβ以實現其對局部刺激起反應而活化。在一種類別中，TGFβ沈積至與諸如LTBP1及LTBP3之ECM締合之呈遞分子締合之ECM中，該等呈遞分子介導ECM締合之TGFβ活性。在另一類別中，TGFβ經由諸如GARP及LRRC33之呈遞分子繫留於免疫細胞之表面上，該等呈遞分子介導特定免疫功能。此等呈遞分子在不同組織及細胞類型中顯示差異表現、定位及/或功能，表明觸發事件及TGFβ活化之結果將有所變化，其視微環境而定。基於多種TGFβ效應可相互作用且促成疾病進展之觀點，可拮抗多方面TGFβ功能之治療劑可提供較高功效。
作為治療某些疾病(如本文中更詳細地描述)之治療劑，非情形依賴性 TGFβ1抑制劑優於情形偏向之 TGFβ1抑制劑之有利用途的基本原理包括以下：
本文所揭示之研究證實疾病環境中涉及異源TGFβ1複合物，且延伸對突出機制之理解，提供對深入數種疾病之改良治療方法的洞察。
已認識到，多種疾病涉及作為TGFβ1之來源的異質細胞群，其共同促成疾病之發病機制及/或進展。多於一種類型之含TGFβ1複合物(「情形」)可能共存於同一疾病微環境中。特定而言，此類疾病可涉及TGFβ1信號傳遞之ECM(或「基質」)組分及TGFβ1信號傳遞之免疫組分。在此等情況下，僅選擇性靶向單一TGFβ1情形(例如，與一種特定類型之呈遞分子締合之TGFβ1)可提供有限緩解。因此，廣泛抑制性TGFβ1拮抗劑為治療用途所期望的。廣泛靶向多個TGFβ1潛伏複合物之先前所描述的抑制性抗體展現目標複合物中之偏斜結合概況。發明人因此開始鑑別無關於所連接之特定呈遞分子，選擇性抑制TGFβ1活化的較均一抑制性抗體。據推論，尤其對於免疫腫瘤學應用，有效力地抑制基質締合之TGFβ1及免疫細胞締合之TGFβ1兩者係有利的。
第二，在腫瘤基質及纖維性組織之間觀測到組織/細胞特徵之顯著類似性，突顯突出各種適應症之共同機制。表明在以下之間及當中具有串擾：i) TGFβ1依賴性促纖維變性表型；ii) TGFβ1依賴性促腫瘤表型；及，iii) TGFβ依賴性免疫抑制表型，其在數種病理病狀中觀測到。因此，使用以相等效力廣泛作用於許多此等組分之非情形依賴性抑制劑可提供遍及多樣類型之疾病病狀的最佳治療效果。舉例而言，原發性骨髓纖維化之臨床表現包括某些細胞群之異常增殖及骨髓中之纖維化。
第三，一系列證據提高了以下可能性：TGFβ 1可為造成在許多類型癌症(癌症患者)中觀測到之對抗癌療法(諸如免疫檢查點抑制劑、癌症疫苗、經工程改造之免疫細胞療法、化學療法、放射療法等)之抗藥性的至少部分原因。在一些情況下，此類抗性似乎為特定癌症/腫瘤類型針對患者之背景所固有的(通常稱作先天抗性、原發抗性、固有抗性或內在抗性；此等術語在本文中可互換使用)。此類抗性可呈現於一小組對諸如免疫檢查點抑制劑之癌症療法反應不佳之患者中，且可能反映免疫排除環境。此可能至少部分藉由TGFβ1依賴性路徑介導。因此，本文所描述之異構體選擇性抑制劑可使抗藥性癌症對此類療法更具反應性。特定而言，在對療法之抗性與疾病位點(諸如腫瘤)處之免疫排除相關的情況下，TGFβ1抑制可解除對免疫抑制之阻斷且允許效應細胞接近其目標(例如，癌細胞)。相同作用機制可適用於數種治療範例中，其中療法之效果必須與待治療之疾病或受保組織接觸。認為本發明之高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑藉由經TGFβ1功能之多個臂(例如，抑制Treg、調節巨噬細胞及調控ECM)起作用來促進此過程，藉此克服抗藥性。
可替代地，抗性可隨時間推移發展，使得顯示對治療之物質臨床反應性的患者隨時間推移變得反應性不佳(亦即，適應性或後天抗性)。舉例而言，已報導PD-1療法會引起與其他T細胞抗原(例如，TCR組分)上調相關之適應性抗性，表明癌細胞演變，以經由另一機制避開PD-1阻斷。隨後，靶向不同T細胞受體組分(諸如TIM3)之第二檢查點抑制劑可恢復對免疫療法之反應性。此等觀測結果表明，阻斷多個路徑以對抗癌細胞之適應性反應可降低癌細胞避開宿主免疫之能力的或然性。能夠靶向多個TGFβ1情形之非情形依賴性TGFβ1抑制劑藉由在TGFβ1功能之多個點處提供阻斷，可有利地規避後天抗藥性。
及最後，基於各種呈遞分子之表現可例如回應於局部線索(例如，細胞介素、趨化介素、ECM環境等)及/或伴隨疾病微環境變化而隨時間推移改變的觀點，據推論，諸如本文所述之異構體選擇性TGFβ1抑制劑可用於耐受此類可塑性，且提供寬廣、持久抑制效應，即使係在呈遞分子表現中出現異常變化時。
在此等情境中之任一者中，非情形依賴性TGFβ1抑制劑有利地旨在靶向與各種呈遞分子締合之前/潛伏形式TGFβ1，該等形式或其不同組合皆存在於疾病微環境中。更具體地說，在一種模式中，抑制劑靶向ECM締合之TGFβ1 (LTBP1/3-TGFβ1複合物)。在另一模式中，抑制劑靶向免疫細胞締合之TGFβ1。此包括GARP呈遞之TGFβ1，諸如在Treg細胞上表現之GARP-TGFβ1複合物，及在巨噬細胞及其他骨髓/淋巴細胞以及某些癌細胞上表現之LRRC33-TGFβ1 複合物。
此類抗體包括異構體特異性TGFβ1抑制劑，其以非情形依賴性方式結合成熟TGFβ1生長因子且阻止其自前TGFβ1/潛伏TGFβ1複合物活化(或釋放)，使得抗體可抑制與多個類型之呈遞分子締合之TGFβ1的活化(或釋放)。特定而言，本發明提供能夠阻斷ECM締合之TGFβ1 (LTBP呈遞之複合物及LTBP3呈遞之複合物)及細胞締合之TGFβ1 (GARP呈遞之複合物及LRRC33呈遞之複合物)。
已表明多種疾病病狀涉及作為促成因素之TGFβ信號傳遞之調節異常。實際上，某些人類病狀之發病機制及/或進展似乎主要由TGFβ1活性驅動或與其相關。特定而言，許多此類疾病及病症涉及TGFβ1功能之ECM組分及免疫組分兩者，表明涉及多個情形下之TGFβ1活化(例如，由多於一種類型之呈遞分子介導)。另外，預期在TGFβ1反應性細胞中存在串擾。在一些情況下，TGFβ1軸之多層面活性之間的相互作用可觸發一系列事件，其會導致疾病進展、惡化及/或宿主對抗疾病之能力的抑制。舉例而言，某些疾病微環境，諸如腫瘤微環境(TME)及纖維性微環境(FME)可能與藉由多種不同呈遞分子呈遞之TGFβ1，例如LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1、LRRC33-前TGFβ1及其任何組合相關。一種情形之TGFβ1活性可反過來調節或影響另一情形之TGFβ1活性，提高當調節異常時，此可引起疾病病狀之惡化的可能性。因此，期望在TGFβ1功能之多種模式(亦即，多種情形)中廣泛地抑制，同時選擇性地限制對TGFβ1異構體之此類抑制性作用。並不旨在干擾由其他異構體，包括TGFβ3介導之內穩TGFβ信號傳遞，其在傷口癒合方面其重要作用。
TGFβ1活性之免疫組分主要由細胞締合之TGFβ1 (例如，GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1)介導。TGFβ1功能之GARP及LRRC33臂兩者與促成許多疾病進展之免疫抑制特徵相關。
作為目標之 GARP - 前 TGFβ1 ：調節T細胞(Treg)表示CD4陽性T淋巴球之小子集，且起到在抑制免疫反應中充當「中斷(break)」以維持內穩定的重要作用。在疾病病狀(諸如癌症)中，報導升高含量之Treg，且此與較不良預後相關。自供體之周邊血細胞分離的人類Treg可藉由CD3/CD28刺激而活化。Treg活化顯示為誘導GARP-前TGFβ1細胞表面表現明顯增加(圖26A)。如先前所報導，Treg施加免疫抑制活性，其包括對效應T細胞(Teff)增殖之強力抑制。如本文(圖26B)所示，在大部分Teff經歷細胞分裂之標準實驗條件下，共培養Treg將此減至僅一部分。且可藉由用異構體選擇性TGFβ1抑制劑處理Teff及Treg之共培養物有效地解決Treg對Teff增殖之此抑制(亦即，抑制解除)，表明本文所揭示之異構體選擇性TGFβ1有效抑制TGFβ1功能之GARP臂。在疾病環境(諸如腫瘤微環境及纖維性環境)中，此將轉變為此等抑制劑阻斷Treg介導之免疫抑制的能力。此應繼而引起效應T細胞增強之增殖，以增強免疫。異構體選擇性TGFβ1抑制劑之GARP臂可靶向TGFβ1功能之此方面。
作為目標之 LRRC33 - 前 TGFβ1 ：骨髓細胞之子集表現細胞表面LRRC33，包括M2極化巨噬細胞及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)，其均具有免疫抑制表型且在疾病環境(例如，TME及FME)處富集。骨髓衍生之循環單核球似乎不表現細胞表面LRRC33。LRRC33之限制性表現使此變為尤其吸引人的治療目標。儘管文獻中可獲得的研究大部分聚焦於癌症中之效應T細胞生物學(例如，CD8+細胞毒性細胞)，但逐漸增加的證據(諸如本文中所展示之資料)指向抑制性骨髓細胞群在疾病中之重要作用。重要地，本文所揭示之高選擇性TGFβ1抑制性抗體，能夠活體內靶向TGFβ1功能之此臂。更具體言之，在本文中所展示之資料顯示腫瘤相關M2巨噬細胞及MDSC以與疾病進展之強相關度表現細胞表面LRRC33。本文所揭示之高親和性、TGFβ1選擇性抗體能夠在多個藥理學模型中克服腫瘤對檢查點阻斷療法(CBT)之原發抗性。實際上，抗腫瘤功效與腫瘤相關巨噬細胞及MDSC含量顯著降低一致，表明靶向TGFβ1功能之此方面可促成治療有利效果。此可能適用於此等免疫抑制細胞富集之其他疾病。數種纖維性病狀亦與此等細胞群之升高局部頻率相關。因此，預期高親和性、TGFβ1選擇性抗體在此類適應症中施加類似活體內效應。
作為 目標之 LTBP1 / 3 - 前 TGFβ1 ： 細胞外基質為安排細胞、組織、器官及全身層級之複合物信號傳遞事件的位點。在數種病理中觀測到ECM調節異常。TGFβ1生長因子貯主以潛伏前TGFβ1複合物形式存在於ECM中。潛伏前TGFβ1複合物經由與ECM組分LTBP1及/或LTBP3之共價相互作用錨定至基質。咸信其他ECM蛋白質，諸如纖維結合蛋白及原纖維蛋白(例如，原纖維蛋白1)對介導ECM沈積及LTBP局部化很重要。LLC靶向至ECM為TGFβ1活化過程中之必需步驟。因為大部分(若並非全部) TGFβ1相關適應症可能涉及ECM功能之一些TGFβ1依賴性態樣，所以視為治療劑之TGFβ抑制劑應能夠靶向此TGFβ1信號傳遞庫係必要的。實際上，本發明之高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑顯示對人類LTBP1/3-前TGFβ1複合物之明顯高親和性及效力。因為此等抗體直接靶向呈活化前狀態之ECM局部化複合物，所以此作用機制將消除與內源性高親和性受體競爭配位體結合的必要。此外，因為此等抗體之抑制活性在與TGFβ1活化增加相關之疾病位點(例如，ECM內之調節異常生態棲位)處局部化，所以據設想，此等抗體應達成增強之功效，同時限制副作用。
因此，本文所提供之高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑使得能夠強效抑制TGFβ1功能之生物學背景中之每一者，亦即，GARP臂、LRRC33臂及LTBP1/3臂。治療適應症及 / 或可能對包含 TGF β 1 選擇性、高親和性、廣泛抑制劑之療法起反應之個體的選擇
可進行三次詢問以鑑別/篩選/選擇適合適應症及/或患者群，針對其，如本文中所述之彼等的異構體特異性、高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可能具有有利治療益處：i)相對於其他異構體，人類中之疾病是否主要由TGFβ1異構體驅動或依賴於其(或至少共顯性)；ii)病狀(或患病組織)是否與免疫抑制表型相關；及，iii)疾病是否涉及基質締合及細胞締合之TGFβ1功能。
已在多種組織中的正常(健康；內穩)條件以及疾病病狀下觀測到三種已知TGFβ異構體，亦即TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3的差異表現。然而，異構體選擇性之概念既未得到充分利用，亦未經促進TGFβ在多種異構體中之泛抑制的習知方法達成。另外，異構體之表現譜可加以差異調節，不僅在正常(內穩)對比異常(病理學)條件下，且亦在患者之不同亞群中。由於大多數臨床前研究係在可能或可能未再現人類病狀之有限數目之動物模型中進行，因此伴隨使用此類模型獲得的資料可能具有偏向性，導致資料之錯誤解譯或關於出於開發治療劑之目的之可譯性的誤導性結論。
因此，本發明包括以下認識，在預測特定候選藥物(例如，TGFβ1抑制劑)之有效性方面以及解譯關於在人類病狀中之可譯性的臨床前資料之方面，應將臨床前動物模型中的TGFβ異構體之差異表現考慮在內。
對人類腫瘤樣品之先前分析暗示TGFβ信號傳遞為對疾病進展及治療反應，包括用於各種類型之惡性疾病的檢查點阻斷療法(「CBT」)之原發抗性的重要貢獻因素。文獻中所報導之研究顯示TGFB基因表現可能與治療抗性尤其相關，表明在此等疾病中此異構體之活性可驅動TGFβ信號傳遞。如實例11中詳述，遍及癌症基因組圖譜(TCGA)中所分析之大部分人類腫瘤類型，TGFB1表現似乎為最普遍的，表明選擇較接近再現TGFβ異構體之人類疾病表現模式的臨床前模型可為有益的。
如本文中所例示，TGFβ1及TGFβ3在臨床前研究中普遍使用的某些鼠類同基因型癌症模型(例如，EMT-6及4T1)中呈共顯性(在類似量下共表現) (參見圖 20D )。相比之下，多種其他癌症模型(例如，S91、B16及MBT-2)幾乎完全表現TGFβ1，與多種人類腫瘤中所觀測到之結果相似，其中TGFβ1相對於TGFβ2/TGFβ3更通常呈現為顯性異構體(參見圖 20B 及圖 20C )。此外，在內穩條件下主要表現之TGFβ異構體可能並非疾病相關異構體。舉例而言，在健康大鼠中的正常肺臟組織中，呈現強直TGFβ信號傳遞主要由TGFβ3介導。然而，在疾病病狀，諸如肺臟纖維化中，TGFβ1呈現變得受到顯著上調。綜合而言，儘管不為先決條件，但測試或確認臨床樣品中TGFβ異構體之相對表現可為有益的，以便選擇患者可能有反應的適合療法。在一些實施例中，可在治療後進行相對異構體表現測定。在此類環境中，患者回應於TGFβ1抑制療法之反應性(例如，臨床反應/益處)可與TGFβ異構體之相對表現量相關。在一些實施例中，事後回溯 ( ex post facto ) 顯示之TGFβ1異構體之過度表現與對治療的更大反應性相關。
如本文所述，異構體選擇性TGFβ1抑制劑尤其有利於治療其中相對於其他異構體主要表現TGFβ1異構體(例如，稱作TGFβ1顯性)的疾病。例如，具有TGFB1 (左 )、TGFB2(中 )及TGFB3(右 )之相對表現量的人類癌症臨床樣品之非限制性清單提供於圖 20B 及圖 20C 中。三種異構體中的各水平線表示單一患者。如可看出，在多種腫瘤/癌症類型中，總TGFβ1表現(TGFB1)在大多數此等人類腫瘤/癌症中要明顯高於其他兩種異構體，表明TGFβ1選擇性抑制在此等疾病類型中可為有益的。綜合而言，此等證據支持選擇性抑制TGFβ1活性可解決對CBT之原發抗性的觀點。產生高選擇性TGFβ1抑制劑亦將使得能夠評估此類方法是否將解決在泛TGFβ抑制之情況下所觀測到的關鍵安全性問題，其對評定該等抑制劑之治療效用將為重要的。
然而，應注意某些例外狀況。首先，此類傾向並不始終適用於疾病類型中的某些個體患者。亦即，甚至在相對於總體TGFβ2/TGFβ3顯示幾乎 均一TGFβ1顯性的癌症類型中，仍存在並未遵循此一般規則之數名個體，如圖 20C 中所表示。處於少數亞群中的患者因此可能不會以對於大部分患者起作用之方式對TGFβ1異構體特異性抑制劑療法起反應。第二，存在其中TGFβ1與另一異構體呈共顯性 或其中TGFβ2及/或TGFβ3表現明顯高於TGFβ1的若干癌症類型。在此等情況中，單獨使用TGFβ1選擇性抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑不大可能有效。確切而言，可結合採用靶向其他一或多種異構體之一或多種額外適合抑制劑(參見例如WO 2016/201282)。然而，為了處理可能存在之嚴重毒性，應避免用泛TGFβ抑制劑以及拮抗TGFβ2及TGFβ3兩者之抑制劑。
舉例而言，在其中TGFβ1與TGFβ3呈共顯性(例如，在類似量下共表現) (例如，如藉由活檢分析所示)的疾病(諸如某些類型之癌瘤及肉瘤)或個體患者中，適合治療方案可包括TGFβ1抑制劑及TGFβ3抑制劑兩者。較佳地，該等抑制劑中之每一者為異構體選擇性抑制劑，以避免與所有TGFβ異構體之泛抑制相關的不合需要之副作用或毒性。在一些實施例中，異構體選擇性抑制劑中之一或兩者抑制TGFβ異構體(例如，TGFβ1及/或TGFβ3)之活化步驟。在較佳實施例中，異構體選擇性TGFβ1抑制劑為高親和性、非情形依賴性活化抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑。在一些實施例中，異構體選擇性TGFβ3抑制劑為TGFβ3之非情形依賴性活化抑制劑，其係藉由包含選擇特異性結合前TGFβ3複合物之抗體或抗原結合片段之步驟的方法得到。通常，此類方法進一步包括針對結合多種抗原複合物，例如LTBP1-前TGFβ3、LTBP3-前TGFβ3、GARP-前TGFβ3及/或LRRC33-前TGFβ3之能力來選擇或確認抗體或片段。較佳地，該方法進一步包括針對抑制生長因子(TGFβ3)自潛伏複合物釋放(亦即，活化抑制)之能力來選擇或確認抗體或片段。
當適合治療方案包括兩種異構體選擇性TGFβ抑制劑，諸如TGFβ1及TGFβ3(如上文實例中)時，該療法可包含包括TGFβ1及TGFβ3抑制劑兩者的單一調配物。此類調配物可含有例如10至50 mg/ml之各抑制劑及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
或者，該療法可包含使用兩種獨立調配物，其各自包含用於投與患者或患者群之單一抑制劑。此在調整待向患者或患者群投與的兩種抑制劑劑量之比率方面提供附加靈活性，其視顯示存在於自患者或患者群收集的一或多個生物樣品中的兩種TGFβ異構體之相對表現量(超出健康量)而定(且針對其定製)。舉例而言，對於在TGFβ1陽性、TGFβ3陽性癌症/腫瘤(諸如乳癌)之治療(其中相對於後者，前者為顯性疾病相關異構體)中之使用，可以較高劑量及/或較長持續時間使用TGFβ1抑制劑作為治療方案之一部分。
因此，測試或確認自個體患者收集之臨床樣品中的三種TGFβ異構體(亦即，TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)之相對表現量為有益的。此類資訊可提供關於特定療法在個體患者或患者群中之有效性的較好預測，其可幫助確保合適治療方案(例如，個別化/個性化治療)之選擇以便增加臨床反應之可能性。
最近，本申請案之發明人得到出人意料的發現，亦即高親和性、TGFβ1選擇性抑制劑(例如，Ab6)與檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)結合使用，能夠引起EMT-6模型中之顯著腫瘤消退，已知該模型以類似量表現TGFβ1及TGFβ3兩者。共顯性已藉由RNA量測及ELISA分析兩者證實(參見圖 35 )。此觀測結果出人意料，因為先前已假設，為了在檢查點阻斷情形下在TGFβ1陽性、TGFβ3陽性腫瘤中達成物質功效，兩種共顯性異構體將必須經特異性抑制。然而，出乎意料地，在不存在TGFβ3選擇性抑制劑之情況下，單獨的TGFβ1選擇性抑制劑(與抗PD-1結合)足以解決對CBT之原發抗性，且達成減小腫瘤體積及提高存活益處之活體內功效(參見實例18)。在不受特定理論束縛之情況下，此可歸因於儘管TGF3在腫瘤中共表現，但TGFβ1係真正驅動疾病之異構體。另一可能性為TGFβ1之抑制引起下游TGFβ3下調。亦有可能兩種異構體經受差異性時間及/或空間調控。舉例而言，兩種異構體可局部化至離散細胞或組織區室。另外地或可替代地，仍有可能TGFβ1之強效抑制劑，與檢查點抑制劑結合使用，可足以解決免疫抑制臨限。因此，本發明包括TGFβ1抑制劑用於促進腫瘤消退之用途，其中腫瘤為TGFβ1+/TGFβ3+。此類腫瘤可包括例如上皮來源癌症，亦即，癌瘤(例如，基底細胞癌、鱗狀細胞癌、腎細胞癌、乳腺管原位癌(DCIS)、侵襲性乳腺管癌及腺癌)。在一些實施例中，TGFβ1為主要疾病相關異構體，而TGFβ3支持諸如上皮之組織中之恆穩功能。
某些腫瘤，諸如各種癌瘤，可表徵為低突變負擔腫瘤(MBT)。此類腫瘤通常免疫原性不佳且未能誘發足夠的T細胞反應。包括化學療法、放射療法、癌症疫苗及/或溶瘤病毒之癌症療法可能對在此類腫瘤中誘發T細胞免疫有幫助。因此，本文詳述之TGFβ1抑制療法可結合此等癌症療法中之一或多者使用，以提高抗腫瘤效應。基本上，此類組合療法旨在藉由增加新抗原及促進效應細胞攻擊腫瘤，將「冷」腫瘤(例如，免疫原性不佳之腫瘤)轉化成「熱」腫瘤。此類腫瘤之實例包括乳癌、卵巢癌及胰臟癌，例如，胰管腺癌(PDAC)。因此，本文所描述之抗體或其片段中之任何一或多者可用於治療經旨在促進T細胞免疫之癌症療法敏化之免疫原性不佳的腫瘤(「冷腫瘤」)。
在效應T細胞被保持遠離腫瘤位點(因此「排除」)之免疫排除腫瘤中，免疫抑制腫瘤環境可以TGFβ1依賴性方式介導。此等為典型免疫原性腫瘤；然而，歸因於免疫受抑制之環境，T細胞無法充分浸潤、增生及誘發其細胞毒性效應。通常，此類腫瘤對諸如CBT之癌症療法反應不佳。如本文所提供之資料暗示，包含TGFβ1抑制劑之佐劑療法可克服免疫抑制表型，允許T細胞浸潤、增殖及抗腫瘤功能，藉此使此類腫瘤對諸如CBT之癌症療法更具反應性。
因此，第二查詢涉及鑑別或選擇患有免疫抑制腫瘤，可能受益於TGFβ1抑制劑療法之患者。腫瘤中之效應T細胞的存在或頻率程度指示抗腫瘤免疫。因此，偵測腫瘤中諸如CD8+細胞之抗腫瘤細胞為評估患者是否可受益於CBT及/或TGFβ1抑制劑療法提供有用資訊。
可藉由已知方法，諸如對腫瘤活檢體樣品之免疫組織化學分析來進行偵測。最近，正在開發非侵入成像方法，其將允許活體內偵測所關注細胞(例如，細胞毒性T細胞)。參見例如，http://www.imaginab.com/technology/; Tavare等人(2014) PNAS, 111(3): 1108-1113; Tavare等人(2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264; Rashidian等人(2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255; Beckford Vera等人(2018) PLoS ONE 13(3): e0193832; 及Tavare等人(2015) Cancer Res 76(1): 73-82，其中之每一者以引用之方式併入本文中。通常，可將經工程改造有偵測部分(例如，放射性標記)之抗體或類抗體分子輸注於患者中，其隨後將分佈且定位至特定標記物(例如CD8+)之位點。以此方式，有可能判定腫瘤是否具有免疫排除表型。若腫瘤判定為具有免疫排除表型，則單獨的癌症療法(諸如CBT)可能並不有效，因為腫瘤在腫瘤環境中缺乏足夠的細胞毒性細胞。利用TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑的附加療法可減少免疫抑制，藉此使癌症療法抗性腫瘤對癌症療法更具反應性。
可出於以下目的在多種適合方法中應用無創活體內成像技術：診斷患者；選擇或鑑別有可能受益於TGFβ1抑制劑療法之患者；及/或監測患者治療後之治療反應。具有已知細胞表面標記物之任何細胞可藉助於採用特異性結合至該細胞標記物之抗體或相似分子來偵測/定位。通常，藉由使用此類技術偵測之細胞為免疫細胞，諸如細胞毒性T淋巴球、調節T細胞、MDSC、腫瘤相關巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞及嗜中性白血球。識別此類標記物的抗體或經工程改造之類抗體分子可偶合至偵測部分。
適合免疫細胞標記物之非限制性實例包括單核球標記物、巨噬細胞標記物(例如，M1及/或M2巨噬細胞標記物)、CTL標記物、抑制免疫細胞標記物、MDSC標記物(例如，G-MDSC及/或M-MDSC之標記物)，其包括(但不限於)：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD206、CD68、CD14、CD15、CD66、CD34、CD25及CD47。
在一些實施例中，活體內成像包含T細胞追蹤，諸如細胞毒性CD8陽性T細胞。因此，本發明之高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑中之任一者可用於治療患有實體腫瘤之個體的癌症，其中治療包含：i)進行活體內成像分析以偵測該個體之T細胞，其中視情況T細胞為CD8+ T細胞，且若基於步驟(i)之活體內成像分析，將實體腫瘤判定為免疫排除實體腫瘤，則隨後向個體投與治療有效量之高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑。在一些實施例中，個體已接受CBT，其中視情況實體腫瘤對CBT具有抗性。在一些實施例中，個體投與呈組合療法形式之CBT與TGFβ1抑制劑之結合。組合可包含投與包含檢查點抑制劑及TGFβ1抑制劑兩者之單一調配物。可替代地，組合療法可包含投與包含檢查點抑制劑之第一調配物，及包含TGFβ1抑制劑之第二調配物。
在一些實施例中，活體內成像包含MDSC追蹤，諸如G-MDSC (亦稱作PMN-MDSC)及M-MDSC。舉例而言，MDSC可在基線下富集在疾病位點(諸如纖維性組織及實體腫瘤)。在療法(例如，TGFβ1抑制劑療法)後，如藉由降低之標記(諸如放射性同位素及螢光)之強度所量測，可觀測到較少MDSC，其指示治療效果。
在一些實施例中，活體內成像包含追蹤或定位LRRC33陽性細胞。LRRC33陽性細胞包括例如MDSC及活化類M2巨噬細胞(例如，與纖維性組織相關之TAM及活化巨噬細胞)。舉例而言，LRRC33陽性細胞可在基線下富集在疾病位點(諸如纖維性組織及實體腫瘤)。在療法(例如，TGFβ1抑制劑療法)後，如藉由降低之標記(諸如放射性同位素及螢光)之強度所量測，可觀測到較少表現細胞表面LRRC33之細胞，其指示治療效果。
在一些實施例中，活體內成像包含使用PET-SPECT、MRI及/或光學螢光/生物發光，以便偵測所關注的目標(例如，可由經標記試劑結合之分子或實體，諸如表現適當標記物之細胞及組織)。
在一些實施例中，用偵測部分標記抗體或類抗體分子可包含直接標記或間接標記。
在一些實施例中，偵測部分可為追蹤劑。在一些實施例中，追蹤劑可為放射性同位素，其中視情況地，放射性同位素可為發射正電子同位素。在一些實施例中，放射性同位素選自由以下組成之群：18 F、11 C、13 N、15 O、68 Ga、177 Lu、18 F及89 Zr。
因此，此類方法可用於在免疫-PET中伴隨使用標記抗體來進行活體內成像。
在一些實施例中，進行此類活體內成像以便監測個體中對TGFβ1抑制療法之治療反應。舉例而言，治療反應可包含免疫排除腫瘤轉化成發炎腫瘤，其與免疫細胞向腫瘤中浸潤增加相關。此可由瘤內免疫細胞頻率提高或偵測信號(諸如放射性標記及螢光)之量增加而顯現。
因此，本發明包括一種治療癌症之方法，其可包含以下步驟：i)選擇診斷患有包含實體腫瘤之癌症的患者，其中實體腫瘤為或疑似為免疫排除腫瘤；及，ii)向患者投與呈可有效治療癌症之量的本文所涵蓋之抗體或片段。較佳地，患者已接受癌症療法，或為接受癌症療法之候選者，該癌症療法諸如免疫檢查點抑制療法(例如，PD-(L)1抗體)、化學療法、放射療法、經工程改造之免疫細胞療法及癌症疫苗療法。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含偵測免疫細胞或其一或多個標記物,其中視情況地，偵測包含腫瘤活檢分析、血清標記物分析及/或活體內成像。
上文所描述之活體內成像技術可用於偵測、定位及/或追蹤診斷患有TGFβ1相關疾病(諸如癌症及纖維化)之患者體內的某些MDSC。健康個體在循環中不會出現或較少出現MDSC。隨著此種疾病之發作或進展，可偵測到升高含量之循環及/或疾病局部化MDSC。舉例而言，已報導CCR2陽性M-MDSC積聚至發炎組織且可引起組織中纖維化(諸如肺纖維化)之進展，且此顯示與TGFβ1表現相關。同樣，MDSC富集於多種實體腫瘤(包括三陰性乳癌)中，且部分程度上促成TME之免疫抑制表型。因此，對根據本發明之TGFβ1抑制療法的治療反應可藉由定位或追蹤MDSC來監測。可偵測之MDSC的減少或較少出現通常指示治療益處或較好預後。
因此，高親和性、非情形依賴性之TGFβ1活化抑制劑可用於治療個體之癌症，其中該癌症之特徵在於免疫抑制，其中癌症視情況包含TGFβ1陽性且TGFβ3陽性之實體腫瘤。此類個體可診斷患有癌瘤。在一些實施例中，癌瘤為乳房癌，其中視情況乳房癌為三陰性乳癌(TNBC)。此類治療可進一步包含癌症療法，其包括(但不限於)化學療法、放射療法、癌症疫苗、經工程改造之免疫細胞療法(諸如CAR-T)及免疫檢查點阻斷療法(諸如抗PD(L)-1抗體)。
在一些實施例中，鑑別出冷腫瘤，其中存在很少效應細胞，或已知為表徵為免疫原性不佳之一類癌症。患有此類腫瘤之個體/患者經免疫敏化癌症療法，諸如化學療法、放射療法、溶瘤病毒療法及癌症疫苗治療，以便誘發對腫瘤抗原(例如，新抗原)之較強T細胞反應。此步驟可將冷腫瘤轉化成「免疫排除」腫瘤。個體視情況進一步接受CBT，諸如抗PD-(L)1。個體進一步經諸如本文所揭示之抗體的TGFβ1抑制劑治療。此可將冷或免疫排除腫瘤轉化成「發炎」或「熱」腫瘤，其賦予對免疫療法之反應性。免疫原性不佳之癌症之非限制性實例包括乳癌(諸如TNBC)、前列腺癌(諸如去勢抵抗性前列腺癌(CRPC))及胰臟癌(諸如胰臟腺癌(PDAC))。
如圖 5B 中所示，本發明之高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑，諸如Ab6，可抑制TGFβ1之纖維蛋白溶酶誘導活化。纖維蛋白溶酶-纖維蛋白溶酶原軸牽涉到各種癌症類型，尤其癌瘤(諸如乳癌)之某些腫瘤形成、侵入及/或轉移。因此，有可能高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可經由此機制在涉及上皮細胞之腫瘤或腫瘤模型(諸如EMT6)中施加抑制效應。實際上，上皮細胞之纖維蛋白溶酶依賴性破壞或改造可促成涉及上皮細胞損傷之病狀的發病機制及癌瘤侵入/擴散。後者可藉由上皮細胞向間葉細胞轉化(「EMT」)觸發。已報導纖維蛋白溶酶原活化及纖維蛋白溶酶原依賴性侵入在類上皮細胞中較顯著，且部分藉由表現S100A10及PAI-1決定(Bydoun等人(2018) Scientific Reports, 8:14091)。
因此，本發明包括一種用於選擇可能對包含異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑之療法起反應的患者群或個體的方法。該方法可包含以下步驟：提供自個體收集之生物樣品(例如，臨床樣品)；測定(例如，量測或分析)樣品中的TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之相對量；且若相對於TGFβ2及TGFβ3，TGFβ1為顯性異構體；及/或若相較於對照，TGFβ1明顯過度表現或上調，則向個體投與包含異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑之組合物。在一些實施例中，此類方法包含以下步驟：獲得關於先前測定之TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之相對表現量的資訊；鑑別個體患有TGFβ1陽性，較佳TGFβ1顯性疾病；且向個體投與異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑。在一些實施例中，該個體患有對療法(諸如癌症療法)具有抗性之疾病(諸如癌症)。在一些實施例中，該個體顯示對療法之不耐受，且因此必須或可能要中斷療法。將TGFβ1抑制劑添加至治療方案中可使得第一療法之劑量降低且仍達成組合臨床益處。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑可延緩或減少對手術之需求。
可藉由此項技術中熟知的RNA類分析及/或蛋白質類分析測定異構體之相對量。在一些實施例中，投藥步驟亦可包括另一療法，諸如免疫檢查點抑制劑或本文中其他處所提供之其他藥劑。此類方法可視情況包括藉由在兩個或更多個時間點監測TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之相對量的變化來評估治療反應之步驟。在一些實施例中，在投藥之前及之後收集臨床樣品(諸如活檢體)。在一些實施例中，在治療後多次收集臨床樣品(諸如活檢體)以評定隨時間推移之活體內作用。
除了以上詢問外，第三次詢問詢問涉及特定疾病之TGFβ1功能的廣度。此可由TGFβ1情形 ，亦即何種呈遞分子介導疾病相關TGFβ1功能之數目來表示。TGFβ1特異性廣情形抑制劑，諸如非情形依賴性抑制劑有利於治療涉及TGFβ1功能之ECM組分及免疫組分兩者的疾病。此類疾病可能與ECM中之調節異常以及免疫細胞功能或免疫反應之擾動相關。因此，本文所描述之TGFβ1抑制劑能夠靶向ECM締合之TGFβ1 (例如，由LTBP1或LTBP3呈遞)以及免疫細胞締合之TGFβ1 (例如，由GARP或LRRC33呈遞)。此類抑制劑抑制全部四種治療目標(例如，「非情形依賴性」抑制劑)：GARP締合之前TGFβ1/潛伏TGFβ1；LRRC33締合之前TGFβ1/潛伏TGFβ1；LTBP1締合之前TGFβ1/潛伏TGFβ1；及，LTBP3締合之前TGFβ1/潛伏TGFβ1，以便在此等情形下廣泛抑制TGFβ1功能。
無論患者之特定病狀是否涉及TGFβ1功能之多種態樣或由其驅動，其可藉由在自患者收集之臨床樣品中評估呈遞分子之表現譜來評定。多種分析為此項技術中已知的，包括基於RNA之分析及基於蛋白質之分析，可進行其來獲得表現圖譜。一或多個樣品中的LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33之相對表現量(及/或其變化/改變)可指示與病狀相關的TGFβ1活性之來源及/或情形。舉例而言，取自實體腫瘤之活檢體樣品可展現所有四種呈遞分子之高表現。舉例而言，LTBP1及LTBP3可高度表現於腫瘤基質中的CAF中，而GARP及LRRC33可分別藉由腫瘤相關免疫細胞，諸如Treg及白血球浸潤物高度表現。
因此，本發明包括一種用於測定(例如，測試或確認)相對於TGFβ2及TGFβ3，疾病中涉及TGFβ1之方法。在一些實施例中，該方法進一步包含以下步驟：鑑別疾病相關之TGFβ1的來源(或情形)。在一些實施例中，藉由測定自患者獲取之臨床樣品中的TGFβ呈遞分子，例如LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33之表現來評定來源/情形。在一些實施例中，此類方法以事後回溯之方式 進行。
就LRRC33陽性細胞而言，本發明申請人已認識到在LRRC33之RNA表現與蛋白質表現之間可存在顯著不一致。特定而言，儘管所選細胞類型似乎在RNA層級表現LRRC33，但僅一小類之此類細胞在細胞表面上表現LRRC33蛋白。預期LRRC33表現可經由蛋白質遷移/局部化高度調控，例如，就質膜插入及快速內化而言。因此，在較佳實施例中，LRRC33蛋白表現可用作與富集有例如經活化/類M2巨噬細胞及MDSC之病變組織(諸如腫瘤及纖維性組織)相關的標記物。TGF β 1 相關適應症 TGF β 1 相關適應症之一般特徵
異構體選擇性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑，可用於治療人類個體中與TGFβ1調節異常相關之多種疾病、病症及/或病狀(亦即，TGFβ1 相關適應症 )，如本文所用，「與TGFβ1調節異常相關之疾病(病症或病狀)」或「TGFβ1相關適應症」意謂與TGFβ1之表現、活性及/或代謝相關的任何疾病、病症及/或病狀；或可受益於TGFβ1活性及/或量之抑制的任何疾病、病症及/或病狀。
因此，本發明包括異構體特異性、非情形依賴性TGFβ1抑制劑在用於治療人類個體之TGFβ1相關適應症之方法中的用途。此類抑制劑典型地調配成醫藥組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。有利地，抑制劑活體內靶向ECM締合之TGFβ1及免疫細胞締合之TGFβ1兩者，但不靶向TGFβ2或TGFβ3。在一些實施例中，抑制劑抑制TGFβ1之活化步驟。疾病之特徵可為以下屬性中之至少兩者中的調節異常或缺陷：a)調節T細胞(Treg)；b)效應T細胞(Teff)增殖或功能；c)骨髓細胞增生或分化；d)單核球募集或分化；e)巨噬細胞功能；f)上皮細胞向間葉細胞轉化(EMT)及/或內皮細胞向間葉細胞轉化(EndMT)；g)在選自由以下組成之群的標記基因中之一或多者中之基因表現：PAI-1、ACTA2、CCL2、Col1a1、Col3a1、FN-1、CTGF及TGFβ1；h) ECM組分或功能；i)纖維母細胞分化。向患有或診斷患有疾病之個體投與治療有效量之此類抑制劑。
在一些實施例中，涉及ECM組分或功能調節異常或缺陷之疾病包含顯示膠原蛋白I沈積增加的疾病。
在一些實施例中，纖維母細胞分化之調節異常或損傷包含增加之肌纖維母細胞或類肌纖維母細胞細胞。在一些實施例中，肌纖維母細胞或類肌纖維母細胞細胞為癌症相關纖維母細胞(CAF)。在一些實施例中，CAF係與腫瘤基質相關且可產生CCL2/MCP-1及/或CXCL12/SDF-1。
在一些實施例中，調節T細胞之調節異常或損傷包含增加之Treg活性。
在一些實施例中，效應T細胞(Teff)增殖或功能之調節異常或損傷包含抑制CD4+/CD8+細胞增殖。
在一些實施例中，骨髓細胞增殖或分化之調節異常或損傷包含增加之骨髓祖細胞增殖。增加之骨髓細胞增殖可發生在骨髓中，
在一些實施例中，單核球分化之調節異常或損傷包含疾病位點(諸如纖維性組織及/或實體腫瘤)處骨髓衍生及/或組織駐留單核球分化成巨噬細胞有所增加。
在一些實施例中，單核球募集之調節異常或損傷包含骨髓衍生單核球募集於諸如TME之疾病位點處有所增加，引起增加之巨噬細胞分化及M2極化，繼之以增加之TAM。
在一些實施例中，巨噬細胞功能之調節異常或損傷包含巨噬細胞極化成M2表型有所增加。
在一些實施例中，骨髓細胞增殖或分化之調節異常或損傷包含增加之Treg、MDSC及/或TAN數目。
TGFβ相關適應症可包括包含免疫排除疾病微環境，諸如藉由排除效應免疫細胞(例如，CD4+及/或CD8+ T細胞)部分抑制人體正常防衛機制/免疫力的腫瘤或癌組織之病狀。在一些實施例中，此類免疫排除病狀係與對治療(例如，癌症療法)之反應性較差相關。患者反應不佳之癌症療法之非限制性實例包括(但不限於)：檢查點抑制劑療法、癌症疫苗、化學療法及放射療法。在不意欲受特定理論束縛之情況下，預期TGFβ抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑，可藉由修復免疫細胞進入，例如T細胞(例如，CD8+細胞)及巨噬細胞(例如，F4/80+細胞、M1極化巨噬細胞)進入來幫助對抗腫瘤避開或排除抗癌免疫力之能力，該修復藉由促進T細胞擴增及/或浸潤於腫瘤中來進行。
因此，TGFβ抑制可藉由解阻及修復效應T細胞進入及細胞毒性效應功能來克服免疫排除疾病環境(諸如TME)中的治療抗性(例如，免疫檢查點抗性、癌症疫苗抗性、CAR-T抗性、化學療法抗性、放射療法抗性等)。TGFβ抑制之此類作用可進一步提供例如藉由CD8+ T細胞介導的持久免疫記憶。
在一些實施例中，腫瘤免疫原性不佳(例如，「冷」腫瘤)。患者可受益於觸發新抗原或促進免疫反應之癌症療法。此類療法包括(但不限於)化學療法、放射療法、溶瘤病毒療法、溶瘤肽、酪胺酸激酶抑制劑、新抗原決定基疫苗、抗CTLA4、不穩定性誘導劑、DDR劑、NK細胞活化劑及諸如TLR配位體/促效劑之各種佐劑。可結合使用TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，以提昇癌症療法之效果。TGFβ1抑制劑之一種作用模式可為使MHC表現正常化或復原，藉此促進T細胞免疫。
TGFβ相關適應症之非限制性實例包括：纖維化，其包括器官纖維化(例如，腎纖維化、肝纖維化、心臟/心血管纖維化、肌肉纖維化、皮膚纖維化、子宮纖維化/子宮內膜異位及肺纖維化)；硬皮病；奧爾波特症候群(Alport syndrome)；癌症(包括(但不限於)：血癌，諸如白血病、骨髓纖維化、多發性骨髓瘤、結腸癌、腎癌、乳癌、惡性黑素瘤、神經膠母細胞瘤)；與實體腫瘤相關之纖維化(例如，癌變結締組織增生，諸如結締組織增生性黑素瘤、胰臟癌相關結締組織增生及乳房癌結締組織增生)；基質纖維化(例如，乳房之基質纖維化)；放射線誘發之纖維化(例如，放射性纖維化症候群)；化學療法後快速造血加快(facilitation of rapid hematopoiesis following chemotherapy)；骨癒合；創傷癒合；癡呆；骨髓纖維化；骨髓發育不良(例如，骨髓發育不良症候群或MDS)；腎病(例如，末期腎病或ESRD)；單側輸尿管阻塞(UUO)；牙齒缺失及/或退化；內皮增生症候群；哮喘及過敏；胃腸道病症；老年貧血；主動脈瘤；孤兒適應症(諸如馬凡症候群(Marfan's syndrome)及卡-恩二氏病)；肥胖症；糖尿病；關節炎；多發性硬化；肌肉萎縮症；骨病症；肌肉萎縮性側索硬化(ALS)；帕金森氏病；骨質疏鬆症；骨關節炎；骨質減少；代謝症候群；營養病症；器官萎縮；慢性阻塞性肺病(COPD)及食慾不振。
證據表明，胞外核苷酸酶CD39及CD73可至少部分促成疾病病狀中之升高含量的腺苷。值得注意地，CD39/CD73-TGFβ軸可在牽涉到TGFβ信號傳遞之免疫細胞，包括Treg及MDSC的調節中起作用。調節T細胞(Treg)及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)兩者一般展現免疫抑制表型。在許多病理病狀(例如，癌症、纖維化)中，此等細胞在疾病位點處富集，且可促成產生及/或維持免疫抑制環境。此可至少部分由胞外核苷酸酶CD39及CD73介導，其共同參與將ATP分解成核苷腺苷，導致在疾病環境(諸如腫瘤微環境及纖維性環境)中腺苷之局部濃度升高。腺苷可結合至在諸如T細胞及NK細胞之目標細胞上表現的腺苷受體，其繼而抑制此等目標細胞之抗腫瘤功能。 具有異常基因表現之疾病；生物標記物
已觀測到，多種疾病病狀中的TGFβ1信號轉導路徑之異常活化係與多種標記物之變化的基因表現相關。此等基因表現標記物(例如，如藉由mRNA所量測)包括(但不限於)：絲胺酸蛋白酶抑制劑1 (Serpine 1) (編碼PAI-1)、MCP-1(亦稱為CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、ACTA2(編碼α-SMA)、SNAI1 (藉由下調E-鈣黏素(Cdh1)驅動纖維化及癌轉移中的EMT)、MMP2 (與EMT相關之基質金屬蛋白酶)、MMP9 (與EMT相關之基質金屬蛋白酶)、TIMP1 (與EMT相關之基質金屬蛋白酶)、FOXP3 (Treg誘導之標記物)、CDH1 (經TGFβ下調之E鈣黏素(上皮細胞之標記物))及CDH2 (經TGFβ上調之N鈣黏素(間葉細胞之標記物))。引起關注地是，多種此等基因涉及在各類疾病病狀，包括各種類型之器官纖維化，以及在包括骨髓纖維化之多種癌症中起一定作用。實際上，已表明纖維性病狀及異常細胞增殖、腫瘤發生及癌轉移之間的病理生理學聯繫。參見例如Cox及Erler (2014) Clinical Cancer Research 20(14): 3637-43 「Molecular pathways: connecting fibrosis and solid tumor metastasis」；Shiga等人 (2015) Cancers 7:2443-2458 「Cancer-associated fibroblasts: their characteristics and their roles in tumor growth」；Wynn及Barron (2010) Semin. Liver Dis. 30(3): 245-257 「Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis」, 該等文獻之內容以引用之方式併入本文中。在不希望受特定理論束縛之情況下，本發明之發明人預期TGFβ1信號傳遞路徑實際上可為此等廣泛病變之間的關鍵環節。
趨化性細胞介素(或趨化細胞素)介導白血球(例如，單核球/巨噬細胞)募集至受傷或疾病組織的能力在疾病進展中具有至關重要後果。此過程涉及C-C趨化細胞素家族之成員，諸如單核球化學引誘劑蛋白1 (MCP-1) (亦稱為CCL2)、巨噬細胞發炎蛋白1-α (MIP-1α) (亦稱為CCL3)及MIP-1β (亦稱為CCL4)及MIP-2α (亦稱為CXCL2)。
舉例而言，認為MCP-1/CCL2在纖維化及癌症兩者中起一定作用。MCP-1/CCL2表徵為促纖維變性趨化細胞素且為單核球化學引誘劑，且有證據表明其可能涉及癌症之開始及進展。在纖維化中，已顯示MCP-1/CCL2在纖維化之發炎階段中起重要作用。舉例而言，MCP-1之中和引起腎小球新月體形成及I型膠原蛋白之沈積顯著降低。同樣，顯示使用抗MCP-1或抗MIP-1α抗體之被動免疫療法顯著減少經博萊黴素攻擊之小鼠中的單核吞噬細胞積聚，表明MIP-1α及MCP-1在肺發炎反應期間促成白血球之募集(Smith, Biol Signals. 1996 年7月至8月;5(4):223-31, 「Chemotactic cytokines mediate leukocyte recruitment in fibrotic lung disease」)。已報導患有囊腫性纖維化及多發性骨髓瘤之患者中的MIP-1α量升高(參見例如：Mrugacz等人, J Interferon Cytokine Res. 2007年6月;27(6):491-5)，支持了MIP-1α與局部或全身性發炎反應相關的觀點。
一系列證據指出腫瘤進展/轉移中涉及C-C趨化細胞素。舉例而言，腫瘤衍生MCP-1/CCL2可在巨噬細胞中促進「促癌」表型。舉例而言，在肺癌中，已顯示MCP-1/CCL2由基質細胞產生且促進癌轉移。在人類胰臟癌中，腫瘤分泌CCL2且免疫抑制CCR2陽性巨噬細胞浸潤此等腫瘤。展現高CCL2表現/低CD8 T細胞浸潤物的患有腫瘤之患者具有明顯降低之存活期。在不希望受特定理論束縛之情況下，預期募集至受傷或患病組織環境的單核球可隨後對局部線索起反應(諸如對腫瘤衍生細胞介素起反應)變得極化，藉此進一步促成疾病進展。此等類M2巨噬細胞有可能藉由抑制效應細胞，諸如CD4+及CD8+ T細胞促成免疫逃避。在一些實施例中，此過程由活化巨噬細胞所表現之LRRC33-TGFβ1部分介導。在一些實施例中，此過程由Treg所表現之GARP-TGFβ1部分介導。
類似地，在某些癌瘤，諸如乳癌(例如，三陰性乳癌)中，已顯示CXCL2/CCL22介導之MDSC募集促進血管生成及轉移(參見例如Kumar等人(2018) J Clin Invest 128(11): 5095-5109)。因此預期此過程至少部分由TGFβ1，諸如LRRC33-TGFβ1介導。此外，因為諸如MMP9之蛋白酶牽涉到促成腫瘤侵襲及轉移之基質改造過程，所以相同或重疊信號傳遞路徑亦可在纖維化中起作用。
PAI-1/絲胺酸蛋白酶抑制劑1參與牽涉到多種纖維性病狀、癌症、血管生成、發炎以及神經退化性疾病(例如，阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease))。在多種癌症，諸如乳癌及膀胱癌(例如，移行細胞癌)以及骨髓纖維化中，腫瘤及/或血清中之升高的PAI-1表現與不良預後(例如，較短存活期、增加之癌轉移)相關。在纖維性病狀之情形下，PAI-1已被公認為經TGFβ1誘導之纖維化的重要下游效應子，且已在多種形式之組織纖維化，包括肺纖維化(諸如IPF)、腎纖維化、肝纖維化及硬皮病中觀測到增加之PAI-1表現。在一些實施例中，此過程例如經由LTBP1-前TGFβ1及/或LTBP3前TGFβ1，由ECM締合之TGFβ1部分介導。
在一些實施例中，TGFβ1抑制劑療法之活體內作用可藉由量測適合基因標記物之表現量變化來評定。適合標記物包括TGFβ (例如，TGFB1、TGFB2及TGFB3)。適合標記物亦可包括一或多種TGFβ (例如，TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)之呈遞分子，諸如LTBP1、LTBP3、GARP (或LRRC32)及LRRC33。在一些實施例中，適合標記物包括間葉細胞轉化基因(例如，AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN及/或FAP)、免疫抑制基因(例如，IL10、VEGFA、VEGFC)、單核球及巨噬細胞趨化性基因(例如，CCL2、CCL3、CCL4、CCL7、CCL8、CCL13及CCL22)及/或本文所論述之多種纖維性標記物。較佳標記物為血漿/血清標記物。
如本文中之實例中所示，本文中所述之異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可用於在包括機理性動物模型(諸如UUO)之適合臨床前模型中降低多種此等標記物之表現量，已顯示其為TGFβ1依賴性的。因此，此類抑制劑可用於治療藉由疾病之基因表現標記物中之一或多者的異常表現(例如，過度表現/上調或表現不足/下調)表徵的疾病或病症。
因此，在一些實施例中，異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑用於治療與以下中之一或多者之過度表現相關的疾病：PAI-1 (由絲胺酸蛋白酶抑制劑1編碼)、MCP-1 (亦稱為CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、α-SMA、ITGA11及ACTA2，其中該治療包含以有效地治療該疾病之量向患有疾病之個體投與抑制劑。在一些實施例中，抑制劑用於治療與PAI-1、MCP-1/CCL2、CTGF及/或α-SMA之過度表現相關的疾病。在一些實施例中，疾病為骨髓纖維化。在一些實施例中，疾病為癌症，舉例而言，癌症包含實體腫瘤。在一些實施例中，疾病為器官纖維化，例如，肝臟(例如，與NASH相關)、腎臟、肺、肌肉、皮膚及/或心肌或心血管組織纖維化。
控制ECM及免疫組分兩者之關鍵方面中TGFβ1路徑的參與可解釋以下觀測結果：遍及諸如增生性病症及纖維性病症之廣泛範圍之病變共用顯著數目之調節異常基因。此支持以下觀點：涉及TGFβ1信號傳遞之基因中的異常表現模式可能為普遍適用現象。此等標記基因可分類為數種類別，諸如：涉及間葉細胞轉化(例如，EndMT及EMT)之基因；涉及血管生成之基因；涉及低氧症之基因；涉及傷口癒合之基因；及涉及組織損傷觸發之發炎性反應的基因。
由Hugo等人進行之全面研究(Cell, 165(1): 35-44)優雅地展現轉移性黑素瘤中此等類別標記物之差異性基因表現模式與對檢查點阻斷療法(CBT)之反應性之間的相關性。作者發現創造為「IPRES特徵」之一組基因的共富集界定不僅黑素瘤內，而且所分析之所有主要常見人類惡性疾病內之轉錄組亞群。實際上，該研究將腫瘤細胞表型可塑性(亦即，間葉細胞轉化)及對微環境之所得影響(例如，免疫抑制傷口癒合之ECM改造、細胞黏附及血管生成特徵)與CBT抗性聯繫在一起。
認識到此等IPRES基因類別中之每一者牽涉到涉及TGFβ調節異常之疾病，申請人先前設想尤其TGFβ1異構體可在疾病病狀中介導此等過程(參見例如WO 2017/156500)。本文所揭示之研究進一步支持此觀點(例如，實例11；圖37A)，進一步證實選擇性靶向TGFβ1 (相對於非選擇性替代方案)之療法可提供就功效及安全性兩者而言的優點。
因此，本發明包括以下方法/過程：選擇或鑑別可能對TGFβ1抑制療法起反應之候選患者或患者群，及向患者投與有效量之高親和性異構體選擇性之TGFβ1抑制劑。患者缺少對CBT之反應性(例如，抗性)的觀測結果可表明患者為本文所描述之TGFβ1抑制療法的候選者。因此，諸如本文所揭示之彼等的高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑可用於治療個體之癌症，其中個體對CBT反應不佳。個體可患有晚期癌症，諸如局部晚期實體腫瘤或轉移癌。當在預期足以顯示特定療法之有意義治療效果的持續時間之後，不存在或幾乎不存在所達成之有意義治療效果(例如，基於標準準則，諸如RECIST及iRECIST，不滿足部分反應或競爭反應標準)時，將患者稱為「反應不佳」。通常，在存在或不存在諸如化學療法之額外療法的情況下，CBT之此類持續時間為至少約3個月治療。此類患者可稱作「無反應者」。在此類患者對初始CBT反應不佳時，患者可稱作「原生無反應者」。此類別中之癌症(或患有此類癌症之患者)可表徵為對CBT具有「原發抗性」。在一些實施例中，在接受至少約3個月CBT治療之後，其中視情況，在至少約4個月CBT治療之後，個體為原生無反應者。在一些實施例中，個體亦接受與CBT組合之額外療法，諸如化學療法。
在將個體鑑別為CBT之無反應者後，高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑可結合CBT向個體投與，該CBT可包含或可不包含與個體未能對其產生反應之第一CBT相同的檢查點抑制劑。可使用任何適合之免疫檢查點抑制劑，例如，經批准之檢查點抑制劑。在一些實施例中，高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑結合包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體之CBT向個體投與。高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑旨在藉由使癌症對CBT較敏感來克服抗性。
選擇或鑑別可能對TGFβ1抑制療法起反應之候選患者或患者群的方法可包含以下步驟：針對本文所論述之標記物中之一或多者的表現來測試自患者(或患者群)收集之生物樣品，諸如活檢體樣品。同樣，此類遺傳標記物可用於監測患者對療法之反應性的目的。監測可包括例如在投與療法之前及之後、在治療方案隨時間推移之過程期間測試自患者收集之兩個或更多個生物樣品，以評估標記物中之一或多者之基因表現量的變化，其指示治療反應或有效性。在一些實施例中，可使用液態活檢體。
在一些實施例中，選擇可能對TGFβ1抑制療法起反應的候選患者或患者群之方法可包含以下步驟：鑑別先前針對遺傳標記物，諸如本文中所述之遺傳標記物測試的顯示其異常表現的患者或患者群。此等相同方法亦適用於隨後證實患者對療法之反應或與其相關。
在一些實施例中，異常標記物表現包括以下中之至少一者的升高含量：TGFβ1、LRRC33、GARP、LTBP1、LTBP3、CCL2、CCL3、PAI-1/絲胺酸蛋白酶抑制劑1。在一些實施例中，患者或患者群(例如，自其所收集之生物樣品)顯示升高之TGFβ1活化、磷酸化Smad2/3或其組合。在一些實施例中，患者或患者群(例如，自其收集之生物樣品)顯示升高之MDSC。在一些實施例中，此類患者或患者群患有癌症，其可包含TGFβ1陽性之實體腫瘤。實體腫瘤可為TGFβ1顯性腫瘤，其中相對於其他異構體，TGFβ1為腫瘤中所表現之主導異構體。在一些實施例中，實體腫瘤可為TGFβ1共顯性腫瘤，其中TGFβ1為腫瘤中所表現之共顯性異構體，例如，TGFβ1+/ TGFβ3+。在一些實施例中，此類患者或患者群展現對癌症療法之抗性，諸如化學療法、放射療法及/或免疫檢查點療法，例如抗PD-1 (例如，派姆單抗及納武單抗)、抗PD-L1 (例如，阿特珠單抗)、抗CTLA4(例如，伊匹單抗)、經工程改造之免疫細胞療法(例如，CAR-T)及癌症疫苗等。根據本發明，諸如本文所揭示之彼等的高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，藉由解除對免疫抑制之阻斷，以允許效應細胞能夠接近癌細胞來克服抗性，藉此達成抗腫瘤效應。TGFβ1抑制劑療法可因此促進效應細胞在腫瘤中之浸潤及/或擴增。另外，TGFβ1抑制劑療法可降低腫瘤中免疫抑制免疫細胞，諸如Treg及MDSC之頻率。
在一些實施例中，異常標記物表現包括一或多組基因：間葉細胞轉化標記物(例如，AXL、ROR2、WNT5A、LOXL2、TWIST2、TAGLN、FAP)；免疫抑制基因(例如，IL10、VEGFA、VEGFC)；單核球及巨噬細胞趨化性基因(例如，CCL2、CCL7、CCL8、CCL13)；涉及血管生成及傷口癒合(例如，T細胞抑制)之基因；細胞黏附標記物；ECM改造；骨骼系統及骨發育標記物；及涉及組織損傷觸發之發炎性反應的基因。
在一些實施例中，MHC表現(諸如MHC種類1)之缺少或下調可充當TGFβ1相關病狀之生物標記，由本發明涵蓋之抗體或抗原結合片段可用作該等病狀的療法。降低之MHC含量可預示免疫逃避，其可與患者對諸如CBT之免疫療法的較差反應性相關。因此TGFβ1之選擇性抑制可至少部分恢復效應細胞功能。 涉及間葉細胞轉化之疾病
間葉細胞轉化為諸如上皮細胞及內皮細胞之細胞向間葉細胞表型(諸如肌纖維母細胞)進行表型轉化的過程。指示間葉細胞轉化之遺傳標記物的實例包括AXL、ROR2、WNT5、LOXL2、TWIST2、TAGLN及FAP。舉例而言，在癌症中，間葉細胞轉化(例如，增加之EndMT及EMT特徵)指示腫瘤細胞表型可塑性。因此，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可用於治療由間葉細胞轉化(諸如EMT及EndMT)起始或驅動之疾病。
EMT (上皮細胞向間葉細胞轉化)為以下過程，藉由該過程具有緊密連接(tight junction)之上皮細胞轉換呈間葉細胞特性(表型)，諸如疏鬆細胞-細胞接觸。該過程會在多種正常生物過程以及病理性情況，包括胚胎發生、創傷癒合、癌轉移及纖維化中觀測到(綜述於例如Shiga等人 (2015) 「Cancer-Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth.」 Cancers, 7: 2443-2458中)。通常，咸信EMT信號主要由TGFβ誘導。舉例而言，許多類型之癌症似乎涉及細胞向間葉細胞表型(諸如肌纖維母細胞及CAF)之轉分化，其與較不良預後相關。因此，異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可用於治療由EMT起始或驅動之疾病。實際上，本文所例示之資料(例如，圖7至圖9)顯示此類抑制劑能夠活體內抑制肌纖維母細胞/CAF標記物之表現，該等標記物諸如α-SMA、LOXL2、Col1 (I型膠原蛋白)及FN (纖維結合蛋白)。因此，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可用於治療特徵為EMT之疾病。抑制劑之治療有效量可為足以減少標記物表現之量，該等標記物諸如α-SMA/ACTA2、LOXL2Col1 (I型膠原蛋白)及FN (纖維結合蛋白)。在一些實施例中，疾病為纖維性病症。在一些實施例中，疾病為增生性病症，諸如癌症。
類似地，TGFβ亦為在正常發育(諸如心臟形成)中所觀測到之內皮細胞向間葉細胞轉化(EndMT)的關鍵調節子。然而，相同或類似現象亦見於許多疾病相關組織，諸如癌基質及纖維性位點中。在一些疾病過程中，諸如CD31之內皮細胞標記物在TGFβ1暴露後下調，且實際上間葉細胞標記物，諸如FSP-1、α-SMA/ACTA2及纖維結合蛋白之表現受誘導。實際上，基質CAF可為衍生自血管內皮細胞。因此，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可用於治療特徵為EndMT之疾病。抑制劑之治療有效量可為足以減少標記物表現之量，該等標記物諸如FSP-1、α-SMA/ACTA2及纖維結合蛋白。在一些實施例中，疾病為纖維性病症。在一些實施例中，疾病為增生性病症，諸如癌症。 涉及基質硬化及改造之疾病
各種TGFβ1相關適應症，諸如纖維性病狀及癌症之進展，涉及沈積至ECM中之基質組分含量增加及/或ECM之維護/改造。已報導，諸如膠原蛋白之ECM組分的沈積增加可改變ECM之機械物理特性(例如，基質/基底之硬度)，且此現象與TGFβ1信號傳遞相關。申請人先前使用經前TGFβ1及LTBP1轉染，且生長於具有確定硬度(例如，5 kPa、15 kPa或100 kPa)之矽基基板上的初代纖維母細胞，展現基質硬度對TGFβ之整合素依賴性活化的作用。如WO 2018/129329所揭示，具有較大硬度之基質增強TGFβ1活化，且此可由異構體特異性TGFβ1抑制劑抑制。此等觀測結果表明，TGFβ1影響ECM特性(諸如硬度)，ECM特性繼而可進一步誘導TGFβ1活化，反映疾病進展。
因此，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可用於阻斷此過程以對抗涉及ECM改變之疾病進展，諸如纖維化、腫瘤生長、侵入、轉移及結締組織增生。此類抑制劑之LTBP臂可直接阻斷由LTBP1及/或LTBP3呈遞之ECM締合之前TGFβ1/潛伏TGFβ1複合物，藉此在疾病生態棲位中阻止生長因子活化/自複合物釋放。在一些實施例中，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑可使ECM硬度正常，以治療涉及整合素依賴性信號傳遞之疾病。在一些實施例中，整合素包含α11鏈、β1鏈或兩者。ECM之架構，例如，ECM組分及組織，亦可由基質相關蛋白酶改變。
如Lampi及Reinhart-King (Science Translational Medicine, 10(422): eaao0475, 「Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease : From molecular mechanisms to clinical trials 」)中所評述，在癌症、纖維化及心血管疾病之病理性進展期間，存在組織ECM之硬度增大。與該過程相關之機械特性涉及表型轉化之肌纖維母細胞、TGFβ及基質交聯。在癌症及纖維性疾病期間ECM硬度增大之主要原因為由去分化成肌纖維母細胞(例如，CAF及FAF)之經活化纖維母細胞引起的調節異常基質合成及改造。腫瘤基質改造及器官纖維化展現與傷口癒合反應驚人的類似性，其例外之處在於在病理狀態中，反應持續。肌纖維母細胞為異質細胞群，其中病理特異性前驅細胞源自多個細胞來源，諸如骨髓衍生之細胞及組織固有細胞。常用肌纖維母細胞標記物包括α-平滑肌肌蛋白(α-SMA)。如本文所示，在活體內研究中，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑能夠減少ACTA2表現(其編碼α-SMA)、膠原蛋白以及FN (纖維結合蛋白)。纖維結合蛋白對將LTBP締合之前TGFβ1複合物錨定至基質結構上很重要。
TGFβ路徑在ECM調控中之重要性得到公認。因為TGFβ1 (及TGFβ3)可藉由某些整合素(例如，αv整合素)機械活化，所以整合素-TGFβ1相互作用已成為治療目標。舉例而言，針對αvβ6之單株抗體經研究用於特發性肺纖維化。然而，此類方法亦可干擾共用相同整合素結合基元RGD之TGFβ3信號傳遞，且此外，此類抗體將不會對阻斷經由其他模式(諸如蛋白酶誘導活化)活化之TGFβ1有效。相比而言，高親和性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑可阻斷TGFβ1之蛋白酶依賴性活化(圖5A及5B)，以及TGFβ1之整合素依賴性活化(圖1至圖4及圖33B)。因此，高親和性異構體選擇性之TGFβ1抑制劑可提供優良屬性。本文所展示之資料，連同申請人之先前研究，支持高親和性異構體選擇性之TGFβ1抑制劑可有效治療與ECM硬化相關之疾病。
因此，本發明包括高親和性異構體選擇性之TGFβ1抑制劑在治療個體與基質硬化相關之疾病中，或在用於降低個體之基質硬度之方法中的治療用途。此類用途包含投與治療有效量之高親和性異構體選擇性之TGFβ1抑制劑。 涉及蛋白酶之疾病
TGFβ自其之潛伏複合物活化可藉由整合素以力依賴性方式觸發及/或藉由蛋白酶觸發。證據表明某些類別之蛋白酶可在該過程中涉及，包括但不限於Ser/Thr蛋白酶，諸如激肽釋放酶、胰凝乳酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶；以及MMP家族之鋅金屬蛋白酶，諸如MMP-2、MMP-9及MMP-13；及Adam家族之蛋白酶，諸如Adam10及Adam17。MMP-2降解基底膜之最豐富組分，膠原蛋白IV，提高其可在ECM締合之TGFβ1調控中起作用的可能性。已暗示MMP-9在腫瘤進展、血管生成、基質改造及轉移中，包括在諸如乳癌之癌瘤中起中心作用。因此，ECM中的TGFβ1之蛋白酶依賴性活化對於治療癌症可為至關重要的。
激肽釋放酶(KLK)為胰蛋白酶或類胰凝乳蛋白酶絲胺酸蛋白酶，其包括血漿激肽釋放酶及組織激肽釋放酶。ECM在組織內穩定中起一定作用，充當抑制惡性生長之結構性及信號傳遞架構及障壁。KLK可在下調ECM蛋白及可促進腫瘤擴增及侵襲之其他組分中起一定作用。舉例而言，KLK1在某些乳癌中高度上調且可活化前MMP-2及前MMP-9。KLK2活化潛伏TGFβ1，使得鄰近於纖維母細胞之前列腺癌容許癌症生長。KLK3已作為前列腺癌(PSA)之診斷標記物得到普遍研究。KLK3可藉由將纖維蛋白溶酶原加工成以蛋白分解方式裂解LAP之纖維蛋白溶酶來直接活化TGFβ1，藉此引起TGFβ1生長因子自潛伏複合物釋放。KLK6可為阿茲海默氏病之潛在標記物。
此外，實例8中所提供之資料表明此類蛋白酶可為激肽釋放酶。因此，本發明涵蓋異構體特異性、非情形依賴性TGFβ1抑制劑在用於治療與激肽釋放酶或類激肽釋放酶蛋白酶相關之疾病之方法中的用途。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑為Ab3、Ab6或其衍生物。
諸如纖維蛋白溶酶、TSP-1及αVβ6整合素的TGFβ1之已知活化劑均與LAP直接相互作用。假定LAP之蛋白水解裂解可使LAP-TGFβ相互作用不穩定，藉此釋放活性TGFβ1。已表明，含有54-LSKLRL-59之區域對於維持TGFβ1潛伏至關重要。因此，穩定相互作用或阻斷LAP之蛋白水解裂解的藥劑(例如，抗體)可防止TGFβ1活化。
與病理性病狀(例如，癌症)相關之多種此等蛋白酶中經由不同作用機制起作用。因此，特定蛋白酶或蛋白酶之組合之靶向抑制可為涉及蛋白酶-TGFβ軸之病狀的治療提供治療益處。因此，預期選擇性地抑制TGFβ1之經蛋白酶誘導之活化的抑制劑(例如，TGFβ1抗體)在此類疾病(例如，癌症)之治療中可為有利的。同樣，相對於另一蛋白酶選擇性抑制藉由一種蛋白酶進行的TGFβ1活化亦可為較佳的，其視所治療之病狀而定。
纖維蛋白溶酶為經產生呈稱作纖維蛋白溶酶原之前驅體形式的絲胺酸蛋白酶。釋放後，纖維蛋白溶酶進入循環且因此會在血清中偵測到。升高之血清纖維蛋白溶酶量似乎與癌症進展相關，可能經由涉及細胞外基質(例如，基底膜及基質障壁)之中斷的機制，該細胞外基質促進腫瘤細胞活動力、侵襲及癌轉移。纖維蛋白溶酶亦可影響黏附、增殖、細胞凋亡、癌症營養、供氧、血管形成及VEGF之活化(Didiasova等人,Int . J . Mol . Sci , 2014, 15, 21229-21252)。此外，纖維蛋白溶酶可促進巨噬細胞遷移至腫瘤微環境中(Philips等人,Cancer Res . 2011年11月1日;71(21):6676-83及Choong等人,Clin . Orthop . Relat . Res . 2003,415S , S46-S58)。實際上，經由其促進腫瘤生長、侵襲、癌轉移及血管生成之能力，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)為腫瘤形成之良好表徵驅動子。
纖維蛋白溶酶活性主要與ECM之中斷相關。然而，愈來愈多之證據表明纖維蛋白溶酶亦調節下游MMP及TGFβ活化。具體言之，已表明纖維蛋白溶酶會經由源自TGFβ基因產物之N端區的潛伏相關肽(Latency Associated Peptide；LAP)之蛋白水解裂解來引起TGFβ活化(Horiguchi等人,J Biochem . 2012年10月; 152(4):321-9)，引起活性生長因子釋放。由於TGFβ1可促進癌症進展，因此此會提高TGFβ之經纖維蛋白溶酶誘導之活化可至少部分地介導此過程的可能性。
亦顯示TGFβ1調節uPA之表現，該uPA為纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶中的關鍵參與者(Santibanez, Juan F.,ISRN Dermatology , 2013: 597927)。已獨立地顯示uPA藉由結合至其細胞表面受體(uPAR)且促進纖維蛋白溶酶原轉化成纖維蛋白溶酶來促進癌症進展(例如，黏附、增殖及遷移)。另外，研究顯示，uPA及/或纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)之表現為結腸直腸癌(D. Q. Seetoo等人,Journal of Surgical Oncology , 第82卷, 第3期, 第184-193頁, 2003)、乳癌(N. Harbeck等人,Clinical Breast Cancer , 第5卷, 第5期, 第348-352頁, 2004)及皮膚癌(Santibanez, Juan F.,ISRN Dermatology , 2013: 597927)中之不良預後之預測子。因此，在不希望受特定理論束縛之情況下，纖維蛋白溶酶、TGFβ1及uPA之間的相互作用可形成針對促進癌症進展之正反饋迴路。因此，選擇性地抑制纖維蛋白溶酶依賴性TGFβ1活化的抑制劑可尤其適用於治療依賴纖維蛋白溶酶/TGFβ1信號傳遞軸之癌症。
在本發明之一個態樣中，本文中所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑包括可抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性活化的抑制劑。在一些實施例中，抑制劑可以非整合素依賴性方式抑制蛋白酶依賴性TGFβ1活化。在一些實施例中，此類抑制劑可無關於活化模式抑制TGFβ1活化，例如抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及蛋白酶依賴性活化兩者。在一些實施例中，蛋白酶係選自由以下組成之群：絲胺酸蛋白酶，諸如激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶以及鋅金屬蛋白酶(MMP家族) (諸如MMP-2、MMP-9及MMP-13)。
在一些實施例中，抑制劑可抑制TGFβ1之經纖維蛋白溶酶誘導之活化。在一些實施例中，抑制劑可抑制經纖維蛋白溶酶及經整合素誘導之TGFβ1活化。在一些實施例中，抗體為特異性結合前TGFβ1之單株抗體。在一些實施例中，抗體結合潛伏前TGFβ1，藉此抑制成熟生長因子自潛伏複合物釋放。在一些實施例中，適用於抑制TGFβ1之纖維蛋白溶酶依賴性活化之方法的高親和性、非情形依賴性之TGFβ1活化抑制劑為Ab6或其衍生物或變異體。
在一些實施例中，抑制劑(例如，TGFβ1抗體)抑制癌細胞遷移。在一些實施例中，抑制劑抑制巨噬細胞遷移。在一些實施例中，抑制劑抑制TAM積聚。
在另一態樣中，本文提供一種治療有需要之個體中的癌症之方法，該方法包含向個體投與有效量之TGFβ1抑制劑(例如，TGFβ1抗體)，其中該抑制劑抑制TGFβ1之經蛋白酶(例如，纖維蛋白溶酶)誘導之活化，藉此治療個體中之癌症。
在另一態樣中，本文提供一種降低有需要之個體中的腫瘤生長之方法，該方法包含向個體投與有效量之TGFβ1抑制劑(例如，TGFβ1抗體)，其中該抑制劑抑制TGFβ1之經蛋白酶(例如，纖維蛋白溶酶)誘導之活化，藉此降低個體中之腫瘤生長。 癌症 / 惡性疾病
多種癌症涉及TGFβ1活性且可經本發明之抗體及/或組合物治療。如本文所用，術語「癌症」係指與TGFβ1陽性細胞相關之各種惡性贅瘤中之任一者。此類惡性贅瘤之特徵為往往會侵入外圍組織，且轉移至新身體位點之多形性細胞的增殖，且亦係指特徵為此類惡性贅生性生長的病理病狀。TGFβ1之來源可以不同且可包括惡性(癌症)細胞本身，以及其周圍或支持細胞/組織，包括(例如)細胞外基質、各種免疫細胞及其任何組合。
對於進行本文所描述之治療方法，將癌症肯定地鑑別為「TGFβ1陽性」並非必需。通常，某些癌症類型已知或基於可信證據疑似與TGFβ1信號傳遞相關。
癌症可為局部(例如，實體腫瘤)或全身性的。在本發明之情形下，術語「局部」(如在「局部腫瘤」中)係指相較於全身性疾病(例如，所謂液態腫瘤或血癌)，解剖學上分離或可解剖學上分離之異常/病變，諸如實體惡性疾病。舉例而言，某些癌症，諸如某些類型之白血病(例如，骨髓纖維化)及多發性骨髓瘤可具有針對疾病之局部組分(例如，骨髓)及全身性組分(例如，循環血細胞)。在一些實施例中，癌症可為全身性的，諸如血液惡性病。可根據本發明治療之癌症呈TGFβ1陽性且包括(但不限於)所有類型之淋巴瘤/白血病、癌瘤及肉瘤，諸如以下中存在的彼等癌症或腫瘤：肛門、膀胱、膽管、骨、腦、乳房、子宮頸、結腸/直腸、子宮內膜、食道、眼部、膽囊、頭頸、肝臟、腎臟、喉、肺臟、縱隔(胸腔)、口腔、卵巢、胰臟、陰莖、前列腺、皮膚、小腸、胃、脊髓、尾骨、睾丸、甲狀腺及子宮。在一些實施例中，癌症可為晚期癌症，諸如局部晚期實體腫瘤及轉移癌。
由本發明涵蓋之抗體或其抗原結合片段可用於治療癌症，包括(但不限於)：骨髓纖維化、黑素瘤、輔助黑素瘤、腎細胞癌(RCC)、膀胱癌、結腸直腸癌(CRC)、結腸癌、直腸癌、肛門癌、乳癌、三陰性乳癌(TNBC)、HER2陰性乳癌、BRCA突變乳癌、血液科惡性疾病、非小細胞癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、擴散期小細胞肺癌(ES-SCLC)、淋巴瘤(典型霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBCL)、T細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、組織細胞肉瘤、濾泡樹突狀細胞肉瘤、嚙合樹突狀細胞肉瘤、骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性骨髓白血病(AML)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、頭頸癌、尿道上皮癌、梅克爾細胞癌(merkel cell carcinoma)、梅克爾細胞皮膚癌、具有高微衛星不穩定度(MSI-H)之癌症、具有錯配修復缺陷(dMMR)之癌症、間皮瘤、胃癌、胃食管結合癌(GEJ)、胃腺癌、神經內分泌腫瘤、胃腸道基質腫瘤(GIST)、胃賁門腺癌、腎癌、膽癌、膽管癌、胰臟癌、前列腺癌、腺癌、鱗狀細胞癌、非鱗狀細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌(CSCC)、卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵管癌、子宮頸癌、腹膜癌、胃癌、腦癌、惡性膠質瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質肉瘤、神經母細胞瘤、甲狀腺癌、腎上腺皮質癌、口腔上皮內贅瘤、食道癌、鼻腔及副鼻竇鱗狀細胞癌、鼻咽癌、唾液腺癌、肝癌及肝細胞癌(HCC)。然而，如藉由例如活檢體所測定，TGFβ1過度表現或為至少一主導異構體之任何癌症(例如，患有此類癌症之患者)可經根據本發明之異構體選擇性TGFβ1抑制劑治療。
在癌症中，TGFβ (例如，TGFβ1)可呈生長促進性或生長抑制性。例如，在胰臟癌中，SMAD4野生型腫瘤可經歷反應於TGFβ之經抑制之生長，但隨著疾病進展，通常存在經組成性活化之第II型受體。另外，存在SMAD4剔除式胰臟癌。在一些實施例中，本發明之抗體、其抗原結合部分及/或組合物經設計以選擇性地靶向在一或多種癌症形式中起獨特作用的TGFβ信號傳遞路徑之組分。白血病或特徵在於白血細胞(亦即白血球)異常增殖的血液或骨髓癌症可劃分成四大類，包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性骨髓白血病或急性骨髓白血病(AML) (染色體10與染色體11之間出現易位[t(10, 11)]、染色體8與染色體21之間出現易位[t(8;21)]、染色體15與染色體17之間出現易位[t(15;17)]及染色體16中出現倒位[inv(16)]的AML；伴隨多譜系發育不良之AML，其包括先前患有骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓增生性疾病，其轉變成AML之患者；療法相關AML及骨髓發育不良症候群(MDS)，該類別包括先前經歷化學療法及/或放射且之後罹患AML或MDS之患者；d)未另外歸類之AML，其包括不屬於以上類別的AML之次型；及e)不明確譜系之急性白血病，其在白血病細胞無法歸類為骨髓或淋巴細胞或兩種類型之細胞均存在時出現)；及慢性骨髓性白血病(CML)。
在一些實施例中，上文所提及之TGFβ1陽性癌症中之任一者亦可為TGFβ3陽性。在一些實施例中，既為TGFβ1陽性亦為TGFβ3陽性之腫瘤可為TGFβ1/TGFβ3共顯性。在一些實施例中，此類癌症為包含實體腫瘤之癌瘤。在一些實施例中，此類腫瘤為乳房癌。在一些實施例中，乳房癌可具有三陰性基因型(三陰性乳癌)。在一些實施例中，患有TGFβ1陽性癌症之個體具有升高含量之MDSC。舉例而言，此類腫瘤可包含募集至腫瘤位點之MDSC，導致MDSC浸潤數目增加。在一些實施例中，患有乳癌之個體顯示升高含量之C反應蛋白(CRP)，其為與復發及不良預後相關之發炎標記物。在一些實施例中，患有乳癌之個體顯示升高含量之IL-6。
本發明之異構體選擇性TGFβ1抑制劑可用於治療患有慢性骨髓白血病之患者，該慢性骨髓白血病為幹細胞疾病，其中BCR/ABL癌蛋白視為對贅生性細胞之異常生長及積聚必不可少的。伊馬替尼(imatinib)為治療此病狀之經批准之療法；然而，大部分骨髓白血病患者顯示伊馬替尼抗性。藉由抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑來達成之TGFβ1抑制可增強對抗經BCR/ABL驅動之贅生性細胞之異常生長及積聚的再生/擴增，藉此提供臨床益處。
異構體特異性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑可用於治療多發性骨髓瘤。多發性骨髓瘤為在骨髓中產生且擴增的B淋巴球(例如，漿細胞、漿母細胞、記憶B細胞)之癌症，其引起破壞性骨病變(亦即，溶骨病變)。通常，該疾病表現經增強之破骨骨骼再吸收、抑制成骨細胞分化(例如，分化停滯)及減弱骨形成，其部分特徵在於溶骨病變、骨質減少、骨質疏鬆症、高鈣血症以及漿細胞瘤、血小板減少、嗜中性白血球減少症及神經病變。本文所描述之TGFβ1選擇性、非情形依賴性之抑制劑療法可有效改善患者之一或多種此類臨床表現或症狀。可向接受一或多種治療多發性骨髓瘤之額外療法，包括本文中其他地方列舉之療法的患者投與TGFβ1抑制劑。在一些實施例中，多發性骨髓瘤可經TGFβ1抑制劑(諸如異構體特異性非情形依賴性抑制劑)與肌肉抑制素抑制劑或IL-6抑制劑之組合治療。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑可與傳統多發性骨髓瘤療法，諸如硼替佐米(bortezomib)、來那度胺(lenalidomide)、卡非佐米(carfilzomib)、泊利度胺(pomalidomide)、沙立度胺(thalidomide)、小紅莓(doxorubicin)、皮質類固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)及潑尼松(prednisone))、化學療法(例如，美法侖(melphalan))、放射療法、幹細胞移植、普替德新(plitidepsin)、埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)、依薩佐米(Ixazomib)、馬賽替尼(Masitinib)及/或帕比諾他(Panobinostat)組合使用。
可藉由本發明方法治療的癌瘤類型包括(但不限於)乳頭狀瘤/癌瘤、絨毛膜癌、內胚層竇瘤、畸胎瘤、腺瘤/腺癌、黑素瘤、纖維瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、橫紋肌瘤、間皮瘤、血管瘤、骨瘤、軟骨瘤、神經膠質瘤、淋巴瘤/白血病、鱗狀細胞癌、小細胞癌瘤、大細胞未分化癌瘤、基底細胞癌及鼻腔鼻竇未分化性瘤。
肉瘤類型包括(但不限於)軟組織肉瘤，諸如軟組織肺泡狀肉瘤、血管肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤腫瘤、結締組織增生性小型圓形細胞腫瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、滑膜肉瘤、及阿斯金腫瘤(Askin's tumor)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma) (原始神經外胚層瘤)、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤及軟骨肉瘤。
異構體選擇性、非情形依賴性之TGFβ1活化抑制劑，諸如本文所述之抑制劑，可適於治療涉及神經脊來源之細胞的惡性疾病。神經脊譜系癌症(亦即，神經脊衍生腫瘤)包括(但不限於)：黑素瘤(黑色素細胞之癌症)、神經母細胞瘤(交感腎上腺前驅體之癌症)、神經節細胞瘤(周邊神經系統神經節之癌症)、甲狀腺髓樣癌(甲狀腺C細胞之癌症)、嗜鉻細胞瘤(腎上腺髓質之嗜鉻細胞之癌症)及MPNST(神經鞘細胞之癌症)。在一些實施例中，可用於治療一或多種類型之癌症或癌症相關病狀的本發明之抗體及方法可包括(但不限於)結腸癌、腎癌、乳癌、惡性黑素瘤及神經膠母細胞瘤(Schlingensiepen等人, 2008；Ouhtit等人, 2013)。
在正常條件下，調節T細胞(Treg)表示一小組整體上CD4陽性之淋巴球群體，且對維持免疫系統內穩定起關鍵作用。然而，在幾乎所有癌症中，Treg之數目明顯增加。儘管Treg在抑制健康個體中之免疫反應中起重要作用，但癌症中升高數目之Treg與不良預後相關。癌症中之較高Treg可減弱宿主之抗癌免疫，且可促成腫瘤進展、轉移、腫瘤復發及/或治療抗性。舉例而言，人類卵巢癌腹水經Foxp3+ GARP+ Treg浸潤(Downs-Canner等人, Nat Commun. 2017, 8: 14649)。同樣，Treg與晚期肝細胞癌中的較具免疫抑制及較具侵襲性之表型正相關(Kalathil等人, Cancer Res. 2013, 73(8): 2435-44)。Treg可抑制效應T細胞增殖(圖 26B )。另外，Treg經由TGFβ1之產生施加免疫細胞(例如，初始CD4+ T細胞)之接觸依賴性抑制(參見例如圖 26A )。因此，為了對抗腫瘤，抑制Treg為有利的，以使足夠效應T細胞可可用於發揮抗腫瘤活性。
一系列增加之證據表明巨噬細胞在腫瘤/癌症進展中之作用。本發明涵蓋此由疾病環境，諸如TME中的TGFβ1活化部分介導的觀點。反應於腫瘤衍生之細胞介素/趨化細胞素(諸如CCL2、CCL3及CCL4)，骨髓衍生之單核球(例如，CD11b+)募集至腫瘤位點，其中單核球經歷分化及極化以獲得促癌表型(例如，M2偏向或類M2巨噬細胞、TAM)。如前所展現(WO 2018/129329)，可誘導自人類PBMC分離之單核球以極化成巨噬細胞之不同次型，例如，M1 (促纖維變性，抗癌)及M2 (促癌)。多種腫瘤中之大部分TAM為M2偏向的。在類M2巨噬細胞中，發現M2c及M2d次型(並非M1)在細胞表面上表現升高之LRRC33。此外，巨噬細胞可藉由某些細胞介素暴露(諸如M-CSF)進一步偏斜或活化，導致LRRC33表現明顯增加，其與TGFβ1表現一致。亦觀測到患有骨髓增生疾病(例如，骨髓纖維化)之患者體內循環M-CSF含量(亦即，血清M-CSF濃度)增加。通常，具有高巨噬細胞(TAM)及/或MDSC浸潤物之腫瘤與不良預後相關。同樣，升高之M-CSF量亦指示不良預後。因此，諸如本文所涵蓋之彼等的高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑可用於治療癌症，該癌症之特徵為促癌巨噬細胞及/或MDSC之含量升高。抑制劑之LRRC33臂可至少部分介導其針對疾病相關免疫抑制骨髓細胞，例如M2巨噬細胞及MDSC之抑制效應。
腫瘤相關類M2巨噬細胞之高盛行率概括於本文所描述之鼠類同基因型腫瘤模型中。舉例而言，在MBT-2腫瘤中，自已建立之腫瘤分離的CD45陽性細胞中之幾乎40%為M2巨噬細胞(圖 28B )。此在經高親和性、異構體選擇性之TGFβ1與抗PD-1之組合治療的動物中減少一半。相比之下，在相同動物中未觀測到腫瘤相關M1巨噬細胞之數目的顯著變化。類似於M2巨噬細胞，腫瘤相關MDSC在已建立之腫瘤中亦升高(CD45+細胞之約10-12%)，且藉由抑制PD-1及TGFβ1兩者，在經治療動物中明顯減少(至可忽略的含量) (圖 28B )。如本文所揭示，大部分腫瘤浸潤M2巨噬細胞及MDSC表現細胞表面LRRC33及/或LRRC33-前TGFβ1複合物(圖 28C 及圖 28D )。引起關注地，LRRC33 (或LRRC33-前TGFβ1複合物)之細胞表面表現似乎高度受調控。高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑Ab6能夠在表現LRRC33及前TGFβ1之細胞中快速內化，且利用Ab6達成之內化速率顯著高於利用識別細胞表面LRRC33之參考抗體所達成之內化速率(圖 6 )。類似結果自初代人類巨噬細胞獲得。此等觀測結果顯示Ab6可在結合至其目標LRRC33-前TGFβ1後促進內化，藉此自細胞表面移除含LRRC33複合物。因此，由高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑(諸如Ab6)進行之目標接合可誘導目標蛋白(例如，細胞締合之前TGFβ1複合物)的抗體依賴性下調。在疾病位點處，此可降低可活化潛伏LRRC33-前TGFβ1含量之可用性。因此，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可經由雙重作用機制抑制TGFβ1之LRRC33臂：i)阻斷成熟生長因子自潛伏複合物釋放；及，ii)將LRRC33-前TGFβ1複合物經由內化自細胞表面移除。在腫瘤微環境中，抗體可靶向細胞締合之潛伏前TGFβ1複合物，加強對目標細胞之抑制效應，目標細胞諸如M2巨噬細胞(例如，TAM)、MDSC及Treg。在表現型上，此等為免疫抑制細胞，促成免疫抑制腫瘤微環境，該微環境至少部分由TGFβ1路徑介導。鑒於許多腫瘤富集有此等細胞，能夠靶向TGFβ1功能之多個臂的抗體應提供功能優勢。
已知相較於健康對照，多種人類癌症會引起患者中MDSC量升高(例如Elliott等人(2017) 「Human tumor-infiltrating myeloid cells: phenotypic and functional diversity 」 Frontiers in Immunology, 第8卷, 章節86所綜述)。此等人類癌症包括(但不限於)：膀胱癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌、黑素瘤、NSCL、卵巢癌、胰臟癌及腎細胞癌。升高之MDSC量可在生物樣品，諸如外周血單核細胞(PBMC)及組織樣品(例如，腫瘤活檢體)中偵測。舉例而言，MDSC之數目的出現率或變化可使用適合細胞表面標記物(表型)量測為：總PBMC之百分比(%)、CD14+細胞之百分比(%)、CD45+細胞之百分比(%)、單核細胞之百分比(%)、總細胞之百分比(%)、CD11b+細胞之百分比(%)、單核球之百分比(%)、非淋巴球性MNC之百分比(%)、KLA-DR細胞之百分比(%)。
另一方面，浸潤至腫瘤中之巨噬細胞亦可表示療法之有效性。如圖 23 、圖 24 及圖 27B 中所例示，在用檢查點抑制劑與非情形依賴性TGFβ1抑制劑之組合進行治療之後，腫瘤由效應T細胞(例如，CD8+ T細胞)有效穿透。瘤內效應T細胞會引起清除細胞碎片之吞噬細胞單核球/巨噬細胞的募集。
如自圖 23 清楚可見，相比於單獨的抗PD-1治療，抗PD-1與TGFβ1抑制劑之組合引起在整個腫瘤中之穩健的CD8T細胞流入/擴增。相對應地，CD8效應子基因之穩健增加可藉由組合治療來達成。
另外，觀測到腫瘤由F4/80陽性巨噬細胞之廣泛浸潤/擴增(參見圖 24 )。此可指示清除由細胞毒性細胞產生之癌細胞碎片的M1 (抗腫瘤)巨噬細胞，且推測起來為TGFβ1抑制之直接結果。如本文實例中更詳細地描述，此等腫瘤浸潤巨噬細胞由於缺少CD163表現，主要鑑別為非M2巨噬細胞，表明在檢查點抑制劑及TGFβ1抑制劑治療後，循環單核球募集至腫瘤位點且分化成M1巨噬細胞，且此觀測結果伴隨CD8+ T細胞向腫瘤位點中之明顯流入。
最近，檢查點阻斷療法(CBT)已成為治療數種癌症類型之標準照護療法(參見例如圖 20B )。儘管在癌症免疫療法中取得深入進展，對CBT之原發抗性仍為患者之主要未滿足的需求；患者癌症之大部分仍未能對PD-(L)1抑制起反應。對尿道上皮癌及黑素瘤腫瘤之回溯性分析最近將TGFβ活化暗示為原發抗性之潛在驅動子，很可能經由多個機制作用，包括將細胞毒性T細胞自腫瘤排除以及對其在腫瘤微環境內之擴增的排除(免疫排除)。此等觀測結果及後續臨床前驗證已指出TGFβ路徑抑制為克服對CBT之原發抗性之有前景的途徑。然而，最可能歸因於來自一或多種TGFβ異構體之對信號傳遞的抑制，對TGFβ路徑之治療性靶向已由劑量限制性臨床前心臟毒性阻礙。
許多腫瘤缺少對CBT之原發反應。在此情境下，CD8+ T細胞通常自腫瘤實質排除，表明腫瘤可徵用(co-opt) TGFβ信號傳遞之免疫調節功能，以產生免疫抑制微環境。來自回溯性臨床腫瘤樣品分析之此等洞察為研究TGFβ信號傳遞在對CBT之原發抗性中之作用提供理論基礎。
基於來自當前研究之結果可得出數個關鍵結論。第一，對TCGA資料之基因表現分析指示TGFβ1為大部分人類腫瘤類型中最普遍的異構體，且因此為此等腫瘤中TGFβ信號傳遞之最可能的驅動子，因此為驅動對CBT之原發抗性的免疫抑制元兇(culprit)。
第二，對TGFβ1活化之選擇性抑制似乎足以克服對CBT之原發抗性。藉由靶向潛伏TGFβ1之前域，高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑在所有已知分子情形下達成敏銳的異構體特異性且抑制潛伏TGFβ1活化。在同基因型腫瘤模型中對一種此類抗體之藥理學評估展現用此抗體進行之治療足以使抗PD-1抗性腫瘤對檢查點阻斷療法敏感。重要地，抗PD-1/TGFβ1抑制劑組合之抗腫瘤功效顯示於三種不同腫瘤類型中，包括TGFβ1並非係腫瘤中所存在之唯一TGFβ異構體的一個模型。此表明，在腫瘤微環境內，TGFβ1可能經定位以起免疫調節作用，而其他異構體可能不與此生物學相關。此觀測結果開拓以下可能性：無關於其他TGFβ異構體之表現，選擇性TGFβ1抑制可具有克服遍及廣譜癌症之對CBT之原發抗性的治療潛力。
第三，對TGFβ1驅動之路徑活性的選擇性抑制引起與對所有異構體活性之寬廣抑制相對的顯著改良臨床前安全性。與寬廣TGFβ路徑抑制相關之多效性效應已阻礙TGFβ路徑之治療性靶向。迄今為止大部分實驗性治療劑(例如，高倫替布、LY3200882福萊索單抗(fresolimumab))缺少對單一TGFβ異構體之選擇性，潛在地促成非臨床及臨床研究中所觀測到之劑量限制性毒性。來自基因剔除小鼠TGFβ2或TGFβ3基因中之人類功能損失型突變之遺傳學資料及表明，在非特異性TGFβ抑制劑之情況下所觀測到之心肌毒性可歸因於對TGFβ2或TGFβ3的抑制。本發明教示用此類抗體選擇性抑制TGFβ1活化具有經改良安全概況，且當與PD-1阻斷組合時足以誘發穩健抗腫瘤反應，使得能夠在臨床易控制劑量下評估TGFβ1抑制劑功效。
為仔細分析在TGFβ1抑制劑/抗PD-1組合治療期間與抗腫瘤免疫相關之免疫過程，對MBT-2膀胱癌模型中之反應進行更詳細分析。對PD-1及TGFβ1活性之同時阻斷誘導瘤內免疫組織中之深遠變化，其主要由CD8+ T細胞之10倍增加驅動。此等CD8+ T細胞可能以關鍵溶胞基因、穿孔蛋白及顆粒酶B形式參與細胞殺滅，亦藉由組合治療在腫瘤中上調。值得注意地，鑒於TGFβ信號傳遞對周邊Treg維護之重要性，藉由用抗PD-1/TGFβ1抑制劑進行之組合治療引起的Treg細胞顯著富集有些出人意料。然而，因為Treg細胞募集至發炎位點，所有其數值增加可解釋為穩健免疫反應之標記物。儘管如此，不管Treg細胞數目之增加如何，CD8+ T細胞能夠採用經活化表型且誘發強抗腫瘤反應。可能的解釋可為Treg細胞並不顯著促成免疫抑制MBT-2腫瘤微環境，且其他抑制性免疫細胞群(例如骨髓細胞)起更重要的作用。可替代地，且與此可能性不互斥，鑒於TGFβ1為Treg驅動之免疫抑制的關鍵介體，不管Treg數目之增加如何，TGFβ1抑制劑之存在亦可消除此活性。
本文所提供之出人意料的發現包括CD8+ T細胞與CD31+腫瘤血管之緊密締合的組織學觀測結果。此富集模式支持以下假設：T細胞進入腫瘤之關鍵途徑係經腫瘤血管，且一旦其自腫瘤血管滲出，則細胞開始徑向朝外遷移至腫瘤中。Mariathasan等人發現，在EMT-6乳癌模型中，CD8+ T細胞似乎沿腫瘤之前邊緣處的膠原基質及富纖維母細胞層累積，產生此基質促成T細胞排除之推測。與此觀測結果形成對比，不可能持續地偵測到接近於MBT-2腫瘤之前邊緣的密集纖維母細胞區域。申請人對非常接近於血管之T細胞富集(例如，血管周富集)的觀測結果表明，除癌症相關纖維母細胞層以外，免疫排除亦可由TGFβ1反應性血管內皮細胞或由非常接近於內皮之其他細胞施加。與TGFβ1信號傳遞可影響內皮細胞功能之可能性一致，申請人之觀測結果包括在似乎為腫瘤血管內皮細胞之細胞內的細胞核中，對照腫瘤中之磷酸化SMAD3染色最強。此染色對選擇性TGFβ1抑制敏感，表明此等細胞對TGFβ1有反應且可為強制執行免疫排除的關鍵，其可能經由藉由調節血管障壁完整性之效能而影響T細胞滲出來作用。此外，腫瘤相關巨噬細胞已描述為非常接近於腫瘤血管，且可藉由活化TGFβ1抑或藉由在血管處或接近於血管釋放其他免疫抑制表面蛋白或分泌因子，涉及產生免疫排除腫瘤微環境。用於T細胞進入腫瘤之多個途徑起作用係可能的，且對此等機制之較佳理解將幫助鑑別新穎治療目標或獲悉可能的腫瘤抗性機制。
除對腫瘤內細胞毒性T細胞之安置的預期及所觀測影響以外，TGFβ1抑制劑/抗PD-1組合治療亦有益地影響免疫抑制骨髓區室。CD11b+骨髓細胞包括未經治療MBT-2腫瘤中之免疫浸潤的幾乎80%，但在組合治療後，其圖示減少至小於40%。此全部藉由類M2免疫抑制巨噬細胞之損失及MDSC之甚至更深遠的減少驅動，而促炎性類M1巨噬細胞群在圖示中保持未改變。組合治療驅動免疫抑制骨髓細胞之特異性減少的機制不明確，在腫瘤微環境中TGFβ1信號傳遞對此等細胞之募集、發育或維護的作用亦如此。眾所周知，除其他因子以外，TGFβ信號傳遞將巨噬細胞極化成類M2。另外，有證據表明，TGFβ為引起MDSC發育及獲取抑制性功能之部分原因。此外，分泌IFNγ之T細胞的流入與經改變腫瘤微環境配對促成免疫抑制骨髓細胞之再極化及遷移減少兩者。無論根本機制如何，減少瘤內免疫抑制骨髓細胞作為腫瘤免疫療法方法之一部分將為高度期望的，因為此細胞群之存在與不良患者預後及對檢查點阻斷療法之抗性相關。因此，包括靶向此等重要免疫抑制細胞類型之治療策略可具有比靶向腫瘤微環境中之單一免疫抑制細胞類型(亦即，僅Treg細胞)更大的效果。
如先前所提及，值得注意地，在腫瘤微環境中TGFβ1可能由多個細胞類型表現，包括Treg細胞、抑制性骨髓細胞、纖維母細胞以及腫瘤細胞。此等細胞來源中之每一者產生不同LLC中之TGFβ1：經活化Treg細胞在其表面上表現GARP LLC；抑制性骨髓細胞在其表面上表現LRRC33 LLC；且纖維母細胞可能將LTBP LLC表現且沈積至周圍細胞外基質中。可能「可活化」TGFβ1之此等來源中之每一者可在促進腫瘤中之免疫排除及免疫抑制中起作用，且每一來源之相對作用遍及不同腫瘤類型可改變。引起關注地，此等研究中所使用之對MBT-2及EMT6腫瘤的mRNA譜分析表明LRRC33及LTBP1為最高度表現之LLC組分，且Cloudman S91腫瘤似乎排他地表現LRRC33 (圖 20H )。如此，此等模型中TGFβ1選擇性抑制劑/抗PD-1組合之深遠抗腫瘤效應，連同本文所揭示之TGFβ1抑制劑所展現之在所有已知LLC情形下有效力地阻斷TGFβ1活化的能力，強有力地表明在一些腫瘤中，對特定LLC (例如，Treg細胞上之GARP)的選擇性抑制對於產生最大抗腫瘤反應而言可能並非足夠。
因此，本文中呈現之臨床前研究及結果展現，對於TGFβ1活化之高度特異性抑制使得宿主免疫系統能夠克服對檢查點阻斷療法之原發抗性的關鍵機制，同時避免已為臨床應用之關鍵限制的先前識別之較寬TGFβ抑制的毒性。本文所揭示之結果表明，用高親和性TGFβ1抑制劑進行之治療可有意義地擴增可受益於檢查點阻斷療法之患者的數目。
因此，如本文實例中所展現，高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑可用於抵消對CBT之原發抗性，藉此使腫瘤/癌症對CBT較敏感。此類效應可適用於治療廣譜惡性疾病類型，其中癌症/腫瘤為TGFβ1陽性。在一些實施例中，此類腫瘤/癌症可進一步表現額外異構體，諸如TGFβ3。後者之非限制性實例可包括某些類型之癌，諸如乳癌。
因此，本發明提供鑑別或選擇患者或患者群/亞群之較佳選擇標準，對於該患者或該等患者群/亞群，高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可能達成臨床益處。在一些實施例中，人類腫瘤之適合表型包括：i)子集顯示為對CBT (例如，PD-(L)1軸阻斷)起反應；ii)免疫排除之證據；及/或，iii)TGFB1表現及/或TGFβ信號傳遞之證據。多種癌症類型符合該概況，包括(例如)黑素瘤及膀胱癌。
如上文所提及，TGFβ1活化之非情形依賴性抑制劑可用於治療黑素瘤。可用此類抑制劑治療的黑素瘤之類型包括(但不限於)：惡性雀斑樣痣；惡性雀斑樣痣黑素瘤；淺表擴散性黑素瘤；肢端雀斑痣性黑色素瘤；黏膜黑素瘤；結節性黑素瘤；息肉樣黑素瘤及結締組織增生性黑素瘤。在一些實施例中，黑素瘤為轉移性黑素瘤。
近年來，免疫檢查點抑制劑已用於有效地治療晚期黑素瘤患者。詳言之，抗計劃性死亡(PD)-1抗體(例如，納武單抗及派姆單抗)現已變成某些類型之癌症，諸如晚期黑素瘤的標準照護療法，其已展示顯著活性及伴隨可管理之毒性概況的持久反應。然而，PD-1拮抗劑之有效臨床應用受到了高速先天性抗性(約60-70%)阻礙(參見Hugo等人(2016) Cell 165: 35-44)，展現出持續性挑戰仍在繼續，包括患者選擇問題及反應及抗性之預測物以及最佳化組合策略(Perrot等人 (2013) Ann Dermatol 25(2): 135-144)。另外，研究表明大約25%之起初對抗PD-1療法有反應的黑素瘤患者最終出現後天抗性(Ribas等人 (2016) JAMA 315: 1600-9)。
表現PD-1及/或CTLA-4之腫瘤浸潤CD8+ T細胞之數目呈現為檢查點抑制成功之主要指示物，且PD-1及CTLA-4阻斷均可增加浸潤T細胞。然而，在伴隨較高腫瘤相關巨噬細胞存在量的患者中，CD8細胞之抗癌作用可能受到抑制。
預期表現LRRC33之細胞，諸如骨髓細胞，包括骨髓前驅體、MDSC及TAM，可藉由抑制T細胞(例如，T細胞耗竭)，諸如CD4及/或CD8 T細胞形成或支持免疫抑制環境(諸如TME及骨髓纖維性骨髓)，該等T細胞可至少部分地強調某些患者群中的所觀測到之抗PD-1抗性。實際上，有證據表明對抗PD-1單一療法之抗性係藉由未能積聚CD8+細胞毒性T細胞及Teff/Treg比率縮小來標記。值得注意地，本發明人已認識到，在某些癌症患者，諸如黑素瘤患者群中在LRRC33表現量方面存在分叉：一個組展現高LRRC33表現(LRRC33高 )，而另一組展現相對較低LRRC33表現(LRRC33低 )。因此，本發明包括以下觀點：LRRC33高 患者群可表示對免疫檢查點抑制劑療法反應不佳或對其具有抗性的患者群。因此抑制LRRC33之藥劑，諸如本文中所述之藥劑可尤其有益於治療對檢查點抑制劑療法(例如，抗PD-1)具有抗性的癌症，諸如黑素瘤、淋巴瘤及骨髓增生病。
在一些實施例中，癌症/腫瘤對免疫檢查點抑制劑具有固有抗性或對其無反應(例如，原發抗性)。僅給出一個實例，某些淋巴瘤呈現對免疫檢查點抑制，諸如抗PD-1療法反應不佳。同樣，已知一小類黑素瘤患者群顯示對免疫檢查點抑制劑之抗性。在不意欲受特定理論束縛之情況下，本發明之發明人預期此可至少部分地歸因於TGFβ1信號傳遞路徑之上調，其可形成其中檢查點抑制劑無法發揮其作用的免疫抑制微環境。TGFβ1抑制可使得此類癌症對檢查點抑制劑療法較具反應。可受益於免疫檢查點抑制劑與TGFβ1抑制劑之組合之癌症類型的非限制性實例包括：骨髓纖維化、黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、結腸癌、血液科惡性疾病、非小細胞癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、淋巴瘤(典型霍奇金氏及非霍奇金氏)、頭頸癌、尿道上皮癌、具有高微衛星不穩定度之癌症、具有錯配修復缺陷之癌症、胃癌、腎癌及肝細胞癌。然而，如藉由例如活檢體所測定，其中TGFβ1過度表現或相對於TGFβ2/TGFβ3為顯性異構體的任何癌症(例如，患有該癌症之患者)可用根據本發明之異構體選擇性TGFβ1抑制劑治療。
在一些實施例中，癌症/腫瘤隨時間推移變得有抗性。此現象被稱作「後天抗性」。類似於原發抗性，在一些實施例中，後天抗性至少部分由TGFβ1依賴性路徑介導，在此等情況下，本文所描述之異構體特異性TGFβ1抑制劑可有效恢復抗癌免疫。
在一些實施例中，包含免疫檢查點抑制劑及LRRC33抑制劑(諸如本文所述之彼等)之組合療法可有效治療此類癌症。另外，腫瘤中之高LRRC33陽性細胞浸潤，或另外具有異常細胞增生之位點/組織，可充當宿主免疫抑制及免疫檢查點抗性之生物標記物。同樣，效應T細胞可自免疫抑制生態棲位受到阻止，該生態棲位限制人體對抗癌症之能力。另外，如下文實例章節中所示，表現經GARP呈遞之TGFβ1的Treg抑制效應T細胞增殖。總之，TGFβ1可能為產生及維持免疫抑制疾病微環境(諸如TME)的主要驅動子，且多種TGFβ1呈遞情形係與腫瘤相關。在一些實施例中，組合療法可達成較有利Teff/Treg比率。
在一些實施例中，如本文所述，特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分，可用於治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與該抗體或其抗原結合部分，使得癌症得到治療。在某些實施例中，癌症為結腸癌。
在一些實施例中，如本文所述，特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分可用於治療實體腫瘤的方法。在一些實施例中，實體腫瘤可為結締組織增生腫瘤，其對於治療劑分子通常緻密且堅硬而無法滲透。藉由靶向此類腫瘤之ECM組分，此類抗體可「疏鬆」緻密腫瘤組織以發生崩解，促進治療劑進入以發揮其抗癌作用。因此，可組合使用額外療法，諸如任何已知的抗腫瘤藥物。
另外地或可替代地，能夠抑制TGFβ1活化之異構體特異性、非情形依賴性抗體或其片段，諸如本文所揭示之彼等，可結合嵌合抗原受體T細胞(「CAR-T」)技術用作基於細胞之免疫療法，諸如用於抗擊癌症之癌症免疫療法。
在一些實施例中，如本文所述，特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分，可用於抑制或減少患有實體腫瘤之個體內實體腫瘤生長的方法，該方法包含向該個體投與該抗體或其抗原結合部分，使得實體腫瘤生長受抑制或減少。在某些實施例中，實體腫瘤為結腸癌腫瘤。在一些實施例中，適用於治療癌症之抗體或其抗原結合部分為異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1活化抑制劑。在一些實施例中，此類抗體靶向GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物。在一些實施例中，此類抗體靶向GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物及LTBP3-TGFβ1複合物。在一些實施例中，此類抗體靶向LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物。在一些實施例中，此類抗體靶向GARP-TGFβ1複合物及LRRC33-TGFβ1複合物。
本發明包括非情形依賴性、異構體特異性之TGFβ1抑制劑在治療個體之包含實體腫瘤之癌症中的用途。在一些實施例中，此類非情形依賴性、異構體特異性之抑制劑可抑制TGFβ1之活化。在較佳實施例中，此類活化抑制劑為結合前TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分。結合可在複合物與呈遞分子(例如，LTBP1、LTBP3、GARP或LRRC33)中之任一者締合時發生，藉此抑制成熟TGFβ1生長因子自複合物釋放。在一些實施例中，實體腫瘤之特徵在於具有富集有CD8+ T細胞之基質，使得直接接觸CAF及膠原蛋白纖維。此類腫瘤可形成免疫抑制環境，其防止抗腫瘤免疫細胞(例如，效應T細胞)有效地浸潤腫瘤，限制人體對抗癌症之能力。替代地，此類細胞可積聚在腫瘤基質內或接近於其。此等特徵可使得此類腫瘤對免疫檢查點抑制劑療法反應不佳。如在下文較詳細論述，本文所揭示之TGFβ1抑制劑可結合免疫檢查點抑制劑使用來解除抑制阻斷，以允許效應細胞達至且殺滅癌細胞。
預期TGFβ1在腫瘤微環境中起多層面作用，包括腫瘤生長、宿主免疫抑制、惡性細胞增殖、血管分佈、血管生成、遷移、侵襲、癌轉移及化學抗性。環境中的TGFβ1呈遞之各「情形」可因此參與疾病進展之調節(或調節異常)。舉例而言，GARP軸在Treg反應中尤為重要，該Treg反應調節用於介導宿主免疫反應對抗癌細胞的效應T細胞反應。LTBP1/LTBP3軸可調節ECM，包括基質，在其中癌症相關纖維母細胞(CAF)在癌症之發病機制及進展中起一定作用。LRRC33軸可在循環單核球募集至腫瘤微環境、後續分化成腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、浸潤於腫瘤組織中及疾病惡化中起至關重要作用。
在一些實施例中，表現TGFβ1之細胞浸潤腫瘤，產生或促成免疫抑制局部環境。觀測到此類浸潤之程度可與較差預後相關。在一些實施例中，較高浸潤指示對另一癌症療法，諸如免疫檢查點抑制劑之較差治療反應。在一些實施例中，腫瘤微環境中表現TGFβ1之細胞包含免疫抑制免疫細胞，諸如Treg及/或骨髓細胞。在一些實施例中，骨髓細胞包括(但不限於)：巨噬細胞、單核球(組織駐留或骨髓衍生)及MDSC。
在一些實施例中，TME中表現LRRC33之細胞為骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。MDSC浸潤(例如，實體腫瘤浸潤)可藉由產生宿主之抗腫瘤免疫細胞變得排除在外之免疫抑制生態棲位來強調至少一種免疫逃避機制。有跡象表明，MDSC係藉由發炎相關信號，諸如腫瘤相關發炎因子移動，移動後，MDSC可藉由損害疾病對抗細胞，諸如CD8+ T細胞及NK細胞來影響免疫抑制作用。此外，MDSC可藉由分泌TGFβ及IL-10誘導Treg分化，進一步增加免疫抑制作用。因此，可向具有免疫逃避(例如，受損免疫監視)之患者投與異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之彼等抑制劑來恢復或增加人體對抗疾病(諸如腫瘤)之能力。如本文中較詳細地描述，此可進一步促進(例如，恢復或強化)人體對另一療法，諸如癌症療法之反應性或敏感性。
在一些實施例中，患者中循環MDSC之出現(例如，數目)升高被預測對檢查點阻斷療法，諸如PD-1拮抗劑及PD-L1拮抗劑有較差反應性。舉例而言，生物標記物研究顯示，循環治療前HLA-DR lo/CD14+/CD11b+骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)係與進展及較差OS相關(p = 0.0001及0.0009)。此外，發炎頭頸癌(HNC)中對PD-1檢查點阻斷之抗性與GM-CSF之表現及骨髓衍生抑制細胞(MDSC)標記物相關。此觀測結果表明，消耗MDSC之策略，諸如化學療法應考慮與抗PD-1組合或與抗PD-1依次進行。LRRC33或LRRC33-TGFβ複合物歸因於在免疫抑制骨髓細胞上之選擇性表現而代表癌症免疫療法之一種新穎目標。因此，在不意欲受特定理論束縛之情況下，靶向此複合物可提高標準照護檢查點抑制劑療法在患者群中之有效性。
本發明因此提供本文所描述之高親和性異構體特異性之TGFβ1抑制劑用於治療包含實體腫瘤之癌症的用途。此類治療包含向診斷患有包括至少一個局部化腫瘤(實體腫瘤)之癌症的個體投與呈可有效治療癌症之量的TGFβ1抑制劑。較佳地，個體進一步經癌症療法治療，癌症療法諸如CBT、化學療法及/或放射療法。
有證據表明，癌症進展(例如，腫瘤增殖/生長、侵襲、血管生成及癌轉移)可至少部分地由腫瘤-基質相互作用驅動。詳言之，CAF可藉由分泌多種細胞介素及生長因子以及ECM重塑來促成此過程。參與該過程之因子包括(但不限於)基質-細胞衍生因子1 (SCD-1)、MMP2、MMP9、MMP3、MMP-13、TNF-α、TGFβ1、VEGF、IL-6、M-CSF。此外，CAF可藉由分泌因子，諸如CCL2/MCP-1及SDF-1/CXCL12至腫瘤位點來募集TAM；之後，產生TAM優先附著之前TAM生態棲位(例如，玻尿酸富集基質區)。由於已表明TGFβ1促進正常纖維母細胞活化成類肌纖維母細胞CAF，因此投與異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之彼等抑制劑可有效地對抗CAF之促進癌症之活性。實際上，本文展現之資料表明，阻斷TGFβ1活化之異構體特異性非情形依賴性之抗體可抑制亦涉及多種癌症的諸如CCL2/MCP-1、α-SMA、FN1及Col1之標記基因的經UUO誘導之上調。
在某些實施例中，單獨或與額外藥劑，例如抗PD-1抗體(例如，抗PD-1拮抗劑)組合，向患有癌症或腫瘤之個體投與如本文所述之抗體或其抗原結合部分，該等抗體或其抗原結合部分特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物。包括於本發明中之其他組合療法為投與本文中所述之抗體或其抗原結合部分以及放射(放射療法)或化學治療劑(化學療法)。例示性額外藥劑包括(但不限於) PD-1拮抗劑、PDL1拮抗劑、PD-L1或PDL2融合蛋白、CTLA4拮抗劑、GITR促效劑、抗ICOS抗體、抗ICOSL抗體、抗B7H3抗體、抗B7H4抗體、抗TIM3抗體、抗LAG3抗體、抗OX40抗體(OX40促效劑)、抗CD27抗體、抗CD70抗體、抗CD47抗體、抗41BB抗體、抗PD-1抗體、抗CD20抗體、CDK抑制劑、溶瘤病毒及PARP抑制劑。適用之溶瘤病毒之實例包括腺病毒、呼腸孤病毒(reovirus)、麻疹、單純疱疹、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)、塞尼卡病毒(senecavirus)、腸病毒及痘瘡。在較佳實施例中，溶瘤病毒經工程改造以便獲得腫瘤選擇性。
在一些實施例中，判定或選擇適用特定癌症類型或患者群的組合療法之治療性方法可涉及以下：a)關於可利用標準照護療法之癌症類型(例如，批准用於免疫療法之適應症)的考慮因素；b)關於耐治療性亞群(例如，免疫排除/冷腫瘤)之考慮因素；及c)關於呈或大體上疑似呈「TGFβ1路徑活性」或另外至少部分TGFβ1依賴性(例如，對TGFβ1抑制敏感)之癌症/腫瘤的考慮因素。舉例而言，多種癌症樣品藉由例如TCGA RNAseq分析顯示，TGFβ1為主要異構體。在一些實施例中，來自各腫瘤類型的樣品有超過50%(例如，超過50%、60%、70%、80%及90%)對TGFβ1異構體表現呈陽性。在一些實施例中，呈「TGFβ1路徑活性」或另外至少部分TGFβ1依賴性(例如，對TGFβ1抑制敏感)之癌症/腫瘤含有至少一種Ras突變，諸如K-ras、N-ras及/或H-ras突變。在一些實施例中，癌症/腫瘤包含至少一種K-Ras突變。
確認自患者收集之臨床樣品(諸如活檢體樣品)中之TGFβ1表現並非為TGFβ1抑制療法之先決條件，其中特定病狀一般已知或疑似涉及TGFβ路徑。
在一些實施例中，向診斷患有批准使用一或多種檢查點抑制劑療法或該等療法顯示有效的癌症的患者投與異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑以及檢查點抑制性療法。此等癌症包括(但不限於)：膀胱尿道上皮癌、鱗狀細胞癌(諸如頭部及頸部)、腎透明細胞癌、腎臟乳頭狀細胞癌、肝臟肝細胞癌、肺腺癌、皮膚黑素瘤及胃腺癌。在較佳實施例中，此類患者對檢查點抑制劑療法反應不佳或對其不起反應。在一些實施例中，較差反應性係歸因於原發抗性。在一些實施例中，對檢查點阻斷具有抗性之癌症顯示TCF7表現下調。在一些實施例中，抗檢查點抑制腫瘤中的TCF7下調可能與瘤內CD8+ T細胞之較低數目相關。
異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可用於治療抗化學療法或放射線療法癌症中。因此，在一些實施例中，向診斷患有患者針對其接受或已接受化學療法及/或放射療法之癌症的患者投與異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑。詳言之，在癌症(患者)對此類療法具有抗性之情況下，使用TGFβ1抑制劑為有利的。在一些實施例中，此類癌症包含靜止腫瘤繁殖癌細胞(TPC)，其中TGFβ信號傳遞控制其可逆地進入生長停滯狀態，保護TPC不受化學療法或放射療法影響。預期對TGFβ1進行藥理學抑制後，受損TPC未能進入靜態，且因此呈現易受化學療法及/或放射療法影響。此類癌症包括多種癌瘤，例如鱗狀細胞癌。參見例如，Brown等人 (2017) 「TGF-β-Induced Quiescence Mediates Chemoresistance of Tumor-Propagating Cells in Squamous Cell Carcinoma.」 Cell Stem Cell. 21(5):650-664。
在一些實施例中，待用TGFβ1抑制劑治療之TGFβ1陽性癌症亦為TGFβ3陽性的(亦即，TGFβ1+/TGFβ3+癌症)，其特徵在於疾病組織(例如，腫瘤)共表現兩種異構體。在一些實施例中，此類腫瘤對TGFβ1及TGFβ3異構體兩者有共顯性。因此，本發明包括異構體選擇性TGFβ1抑制劑以及異構體選擇性TGFβ3抑制劑在治療此類病狀中之用途。TGFβ1+/TGFβ3+癌症之非限制性實例包括(但不限於)：乳房癌(例如，乳房侵襲性癌)、膽管癌、多形性神經膠母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、腎臟透明細胞癌瘤、肺鱗狀細胞癌、間皮瘤、胰臟腺癌、前列腺癌、肉瘤、胸腺瘤及子宮癌肉瘤。 骨髓增生病症 / 骨髓纖維化
本發明提供諸如本文所揭示之彼等的高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑在治療骨髓增生病中之治療用途。此等步驟包括(例如)骨髓發育不良症候群(MDS)及骨髓纖維化(例如，原發性骨髓纖維化及繼發性骨髓纖維化)。
骨髓纖維化，亦稱為骨性骨髓纖維化，為相對罕見的骨髓增生性病症(癌症)，其屬於稱作骨髓增生病之疾病類別。骨髓纖維化劃分在骨髓增生性贅瘤之費城染色體陰性(-)分支中。骨髓纖維化的特徵在於純系骨髓增生、異常細胞介素產量、髓外造血及骨髓纖維化。骨髓及其他部位處的造血幹細胞之異常純系之增殖引起纖維化或骨髓經疤痕組織替代。除非另外規定，否則術語骨髓纖維化係指原發性骨髓纖維化(PMF)。此亦可稱作慢性特發性骨髓纖維化(cIMF) (術語特發性及原發性意謂在此等情況下疾病具有未知或自發源)。此與繼發於真性多紅血球症或原發性血小板增多症形成的骨髓纖維化形成對比。骨髓纖維化為一種骨髓細胞化生之形式，其係指骨髓之造血組織中的細胞類型發生變化，且通常兩種術語以同義使用。術語原因不明性骨髓細胞化生及伴隨骨髓細胞化生之骨髓纖維化(MMM)亦用以指原發性骨髓纖維化。在一些實施例中，可根據本發明治療之血液科增生性病症包括骨髓增生病，諸如骨髓纖維化。所謂的BCR-ABL (Ph)陰性慢性骨髓增生病之「經典」類別包括原發性血小板增多症(ET)、真性多紅血球症(PV)及原發性骨髓纖維化(PMF)。
骨髓纖維化干擾身體血細胞之正常產生。結果為骨髓中有大量疤痕，引起嚴重貧血、無力、疲勞且通常引起脾臟增大。藉由異常造血細胞純系(尤其藉由巨核細胞)產生諸如纖維母細胞生長因子之細胞介素會引起骨髓之造血組織經由膠原蛋白纖維化由結締組織替代。造血組織之減少會削弱患者產生新血細胞之能力，引起進行性全部血球減少症(所有血球類型不足)。然而，認為纖維母細胞之增殖及膠原蛋白之沈積為繼發性現象，且纖維母細胞本身可能並非異常細胞純系之一部分。
骨髓纖維化可由骨髓中之異常血液幹細胞引起。異常幹細胞產生成熟及低分化細胞，其快速生長且接收骨髓，引起纖維化(疤痕組織形成)及慢性發炎。
原發性骨髓纖維化係與傑納斯激酶2 (JAK2)、血小板生成素受體(MPL)及鈣網蛋白(CALR)之突變相關，其會引起骨髓之JAK-STAT路徑的組成性活化、進行性疤痕或纖維化發生。患者可罹患髓外造血，亦即在除骨髓外之部位出現血球形成，因為造血細胞被迫轉移至其他區域，特定而言，肝臟及脾臟。此引起此等器官增大。在肝臟中，異常大小稱作肝腫大。脾臟增大稱作脾腫大，其亦有助於引起全部血球減少症，尤其血小板減少及貧血。髓外造血之另一併發症為異形紅血球症(poikilocytosis)或存在形狀異常之紅血球。
骨髓纖維化中髓外造血的主要部位為脾臟，其在患有骨髓纖維化之患者中通常顯著地增大。由於脾臟之大規模增大，在脾臟中通常會發生多囊下梗塞，其意謂歸因於對脾臟之供氧中斷，部分或整個組織發生死亡。關於細胞量，脾臟含有紅血球前驅體、粒細胞前驅體及巨核細胞，其中巨核細胞在其數目且在其異常形狀方面突出。巨核細胞可涉及引起此病狀中所見之繼發性纖維化。
已表明，TGFβ可涉及骨髓纖維化之發病機制之纖維性態樣中(參見例如Agarwal等人, 「Bone marrow fibrosis in primary myelofibrosis: pathogenic mechanisms and the role of TGFβ」 (2016) Stem Cell Investig 3:5)。原發性骨髓纖維化中之骨髓病理學的特徵在於纖維化、新血管生成及骨硬化，且纖維化係與ECM中沈積的膠原蛋白之產量增加相關。
已描述多種生物標記物，其改變指示疾病或與其相關。在一些實施例中，生物標記物為細胞標記物。此類疾病相關生物標記物適用於診斷及/或監測疾病進展以及療法之有效性(例如，患者對療法之反應性)。此等生物標記物包括多種纖維性標記物以及細胞標記物。據報導，在肺癌中，舉例而言，相較於患有良性疾病之患者，患有肺癌之患者中的支氣管肺泡灌洗(BAL)流體中之TGFβ1濃度明顯較高(約2+倍增加)，其亦可充當用於診斷及/或監測肺癌之進展或治療作用的生物標記物。
由於骨髓纖維化係與異常巨核細胞產生相關，因此巨核細胞以及其幹細胞譜系之祖細胞的某些細胞標記物可充當診斷及/或監測疾病進展以及療法之有效性的標記物。在一些實施例中，適用標記物包括(但不限於)：分化巨核細胞之細胞標記物(例如，CD41、CD42及Tpo R)、巨核細胞-紅血球系祖細胞之細胞標記物(例如，CD34、CD38、及CD45RA-)、共同骨髓祖細胞之細胞標記物(例如，IL-3α/CD127、CD34、SCF R/c-kit及Flt-3/Flk-2)及造血幹細胞之細胞標記物(例如，CD34、CD38-、Flt-3/Flk-2)。在一些實施例中，適用生物標記物包括纖維性標記物。此等包括(但不限於)：TGFβ1、PAI-1 (亦稱為絲胺酸蛋白酶抑制劑1)、MCP-1 (亦稱為CCL2)、Col1a1、Col3a1、FN1、CTGF、α-SMA、ACTA2、Timp1、Mmp8及Mmp9。在一些實施例中，適用生物標記物為血清標記物(例如，血清樣品中存在及偵測到的蛋白質或片段)。
基於TGFβ為白血病骨髓生態棲位之組分的發現，預期用TGFβ抑制劑靶向骨髓微環境可為減少表現呈遞分子之白血病細胞的有前景之方法，該等呈遞分子調節受影響組織中的局部TGFβ可獲得性。
實際上，歸因於表現骨髓增殖性及纖維性態樣(如術語「骨髓纖維化 」本身所表明)中之TGFβ依賴性調節異常的病理學之多層面性質，異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑可為患有骨髓纖維化之患者提供尤其有利之治療作用。預期此類抑制劑之LTBP臂可靶向骨髓中之ECM締合之TGFβ1複合物，而抑制劑之LRRC33臂可阻斷骨髓細胞締合之TGFβ1。此外，與骨髓纖維化相關之異常巨核細胞生物學可涉及經GARP及經LTBP介導之TGFβ1活性。異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑能夠靶向此類複合物，藉此抑制生態棲位中活性TGFβ1之釋放。
因此，此類TGFβ1抑制劑適用於治療患有原發性及繼發性骨髓纖維化之患者，其對諸如羥基脲及JAK抑制劑之其他(或標準照護)治療反應不充分或不耐受。此類抑制劑亦適用於治療患有中度或高風險骨髓纖維化(MF)，包括原發性MF、真性多紅血球症後MF及原發性血小板增多症後MF的患者。
因此，本發明之一態樣係關於用於治療原發性骨髓纖維化之方法。該方法包含向患有原發性骨髓纖維化之患者投與治療有效量之包含引起TGFβ可獲得性降低之TGFβ抑制劑的組合物。在一些實施例中，向患有骨髓纖維化之患者投與TGFβ1活化之異構體特異性、非情形依賴性單株抗體抑制劑。此類抗體可以範圍在0.1與100 mg/kg之間，諸如在1與30 mg之間，例如，1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg等之劑量投與。舉例而言，適合之給藥方案包括1至30 mg/kg之間，每週投與一次。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑以每週約10 mg/kg投配。視情況，投與頻率可在初始階段之後調節，例如，約一週一次(在初始階段期間)至一月一次(在維持階段期間)。
醫藥組合物之較佳給藥途徑包含靜脈內或皮下投與抗體。當靜脈內投與組合物時，可歷時適合之持續時間給與患者治療劑，持續時間例如每次治療大約30至120分鐘(例如，30分鐘、60分鐘、75分鐘、90分鐘及120分鐘)，且隨後每隔數週重複，例如3週、4週、6週等，持續總共數個週期，例如4個週期、6個週期、8個週期、10個週期、12個週期等。在一些實施例中，患者經由每28天(4週)靜脈內投與，持續6個週期或12個週期，經包含1至10 mg/kg之劑量(例如，每次給藥1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 mg/kg)之抑制性抗體的組合物治療。在一些實施例中，以慢性(長期)療法(例如，無限期地持續，只要認為有益即可)代替在固定週期之投藥之後中斷來投與此類治療。
儘管骨髓纖維化視為一種白血病之類型，但其亦藉由纖維化之表現表徵。由於已知TGFβ調節ECM內穩定之態樣，其調節異常會引起組織纖維化，因此期望抑制與ECM相關之TGFβ活性。因此，本發明涵蓋結合且抑制由LTBP (諸如LTBP1及LTBP3)呈遞之前TGFβ的抗體或其片段。在一些實施例中，適於治療骨髓纖維化之抗體或其片段為「非情形依賴性」的，此係因為其可結合前TGFβ複合物之多個情形，諸如與LRRC33、GARP、LTBP1、LTBP3或其任何組合締合之彼等。在一些實施例中，此類抗體為非情形依賴性之TGFβ活化抑制劑，其特徵為抗體可結合且抑制以下潛伏複合物中之任一者：LTBP1-前TGFβ、LTBP3-前TGFβ、GARP-前TGFβ及LRRC33-前TGFβ。在一些實施例中，此類抗體為異構體特異性抗體，其結合且抑制包含一種而非另一種TGFβ異構體之潛伏複合物。此等步驟包括(例如)LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。在一些實施例中，此類抗體為優先以高親和性結合且抑制TGFβ1信號傳遞之異構體選擇性抗體。
早期活體內資料指示，異構體選擇性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑可用於在原發性骨髓纖維化之可轉譯鼠類模型中治療骨髓纖維化。不同於JAK2抑制劑之當前標準照護療法(其僅提供症狀緩解但不提供臨床或存活益處)，異構體選擇性非情形依賴性之TGFβ1抑制劑在患病小鼠之骨髓中達成顯著抗纖維性作用，且亦可延長存活期，其支持了TGFβ1抑制劑可有效地治療人類患者中之骨髓增生病的觀點。
可經本文所述之組成物及方法治療之適合骨髓增生性贅瘤患者群可包括但不限於：a)費城(+)患者群；b)費城(-)患者群；c)歸類為「典型」(PV、ET及PMF)之患者群；d)帶有突變JAK2V617F(+)之患者群；e)帶有JAK2V617F之患者群(-)；f)具有JAK2外顯子12(+)之患者群；g)具有MPL(+)之患者群；及h)具有CALR(+)之患者群。
在一些實施例中，患者群包括患有中度-2或高風險骨髓纖維化之患者。在一些實施例中，患者群包含患有難以用可用療法治療的骨髓纖維化或並非可用療法之候選者的個體。在一些實施例中，個體之血小板計數在100至200 × 109 /L。在一些實施例中，在接受治療之前，個體之血小板計數＞200 × 109 /L。
在一些實施例中，接受異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑療法(及可自接受其受益)的個體診斷患有中度-1或更高原發性骨髓纖維化(PMF)或真性紅血球增多症/原發性血小板增多症後骨髓纖維化(PV/ET後MF)。在一些實施例中，個體在治療之前患有經記載之骨髓纖維化。在一些實施例中，在治療之前，個體患有如藉由歐洲共識定級評分所評定，MF-2或更高MF及如藉由改進型鮑爾邁斯特評分(Bauermeister scale)所評定，3級或更高MF。在一些實施例中，在治療之前，個體具有呈1之ECOG效能狀態。在一些實施例中，在治療之前，個體之白血球計數(109 /L)介於5與120之間。在一些實施例中，個體之JAK2V617F 對偶基因負荷介於10%至100%之間。
在一些實施例中，接受異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑療法(及可自接受其受益)的個體呈輸血依賴性(治療之前)，其特徵在於針對與臨床上明顯出血不相關的低於8.5 g/dL之血色素量，該個體在最近一個月內有至少兩個單位之紅血球輸血史。
在一些實施例中，接受異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑療法(及可自接受其受益)的個體先前已接受治療骨髓纖維化之療法。在一些實施例中，個體已用包括(但不限於)以下之療法中之一或多者治療：AZD1480、帕比諾他、EPO、IFNα、羥基脲、聚乙二醇化干擾素、沙立度胺、潑尼松及JAK2抑制劑(例如，來他替尼(Lestaurtinib)、CEP-701)。
在一些實施例中，患者患有髓外造血。在一些實施例中，髓外造血處於肝臟、肺臟、脾臟、及/或淋巴結處。在一些實施例中，本發明之醫藥組合物局部投與至疾病表現之定位部位中之一或多者。
以有效治療骨髓纖維化之量向患者投與異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑。治療有效量為足以緩解患者中的骨髓纖維化之一種或多種症狀及/或併發症的量，該等症狀及/或併發症包括(但不限於)：骨髓基質中之ECM過量沈積(骨髓纖維化)、血管新生、骨硬化、脾腫大、肝腫大、貧血、出血、骨痛及其他骨相關發病、髓外造血、血小板增多、白血球減少症、惡病質、感染、栓塞及死亡。因此，包含本發明之抗體或抗原結合片段的TGFβ1抑制療法可達成臨床益處，其包括尤其抗纖維性效應及/或使血球計數正常。此類療法可延長存活期且/或減少對骨髓移植之需求。
在一些實施例中，該量有效地減少患者中的(諸如巨核細胞之)TGFβ1表現及/或分泌。該抑制劑可因此減少所治療患者中的TGFβ1 mRNA量。在一些實施例中，該抑制劑減少骨髓中，諸如單核細胞中的TGFβ1 mRNA量。PMF患者通常顯示超過約2,500 pg/mL，例如超過3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000及10,000 pg/mL (對比約600至2,000 pg/mL之正常範圍，如藉由ELISA所量測)之血漿TGFβ1量(參見例如Mascaremhas等人 (Leukemia & Lymphoma, 2014, 55(2): 450-452))。Zingariello ((Blood, 2013, 121(17): 3345-3363)對PMF患者及對照個體之血漿中的生物活性及總TGFβ1含量進行了定量。根據此參考文獻，PMF患者中的中值生物活性TGFβ1為43 ng/mL(介於4至218 ng/mL之間)且總TGFβ1為153 ng/mL (32至1000 ng/mL)，而在對照對應物中，值分別為18 (0.05至144) 與52 (8至860)。因此，基於此等報告，相較於對照或健康血漿樣品，PMF患者中之血漿TGFβ1含量升高數倍，例如2倍、3倍、4倍、5倍等。本文所述之用抑制劑進行之治療，例如，在0.1至100 mg/kg，例如1至30 mg/kg單株抗體)之劑量下，4至12個投與週期(例如，2、4、6、8、10、12個週期)或慢性或長期治療(例如每4週)之後，可將血漿TGFβ1含量相對於對應基線(治療前)減少至少10%，例如，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%及50%。
治療開始之後，例如1週、2週、3週、4週、5週或6週之後，可相對較快地觀測到治療作用中之一些。舉例而言，在1至8週內抑制劑可有效地增加用抑制劑治療之患者的骨髓中的幹細胞及/或前驅細胞之數目。此等包括造血幹細胞及血液前驅細胞。可進行骨髓活檢以評定骨髓細胞頻率/數目之變化。相應地，患者可顯示經改善之症狀，諸如骨痛及疲勞。
患有骨髓增生病(例如，骨髓纖維化)之個體可表現升高量之白血球計數(例如，白血病)。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑之治療有效量為可有效使血球計數正常的量。在一些實施例中，相比於治療前，該量可有效減少個體之總白細胞計數。在一些實施例中，相比於治療前，該量可有效減少個體之總血小板計數。在一些實施例中，相比於治療前，該量可有效提高個體之血紅蛋白含量(例如，使其正常或復原)。在一些實施例中，相比於治療前，該量可有效提高個體之血容比量(例如，使其正常或復原)。
骨髓纖維化之形態標誌中之一者為骨髓(例如，骨髓基質)中出現纖維化，其特徵部分在於存在異常ECM。在一些實施例中，量可有效減少纖維化，其特徵在於例如由間質基質細胞引起之過度膠原蛋白沈積。在一些實施例中，相比於未接受治療之對照個體，抑制劑可有效減少所治療個體中CD41陽性細胞(例如，巨核細胞)之數目。在一些實施例中，如利用隨機選擇之切片測定，PMF骨髓中巨核細胞之基線頻率範圍可在每平方毫米(mm2 ) 200至700個細胞之間，且在PMF脾臟中在每平方毫米(mm2 ) 40至300個巨核細胞之間。對比而言，正常供體之骨髓及脾臟中之巨核細胞頻率分別為低於140及低於10。用抑制劑進行之治療可減少骨髓及/或脾臟中巨核細胞之數目(例如，頻率)。在一些實施例中，用抑制劑進行之治療會引起降低量之下游效應子信號傳遞，諸如SMAD2/3之磷酸化。在一些實施例中，抑制劑可有效減少諸如本文所述之彼等的纖維性標記物之表現量。
患有骨髓纖維化之患者可罹患脾臟增大。因此，可監測脾臟大小變化來評估治療劑之臨床作用。可藉由已知技術，諸如藉由觸診評定脾臟長度及/或藉由超音波評定脾臟體積來檢查脾臟大小。在一些實施例中，如藉由觸診評定，待用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑治療之個體之基線脾長度(在治療之前)為5 cm或以上，例如範圍在5與30 cm之間。在一些實施例中，如藉由超音波評定，待用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑治療之個體之基線脾體積(在治療之前)為300 mL或更大，例如範圍在300至1500 mL之間。本文所述之用抑制劑進行之治療，例如，在0.1至30 mg/kg單株抗體)之劑量下，4至12個投與週期(例如，2、4、6、8、10、12個週期)，例如每4週之後，可減小個體之脾臟大小。在一些實施例中，相對於相應基線值，有效量之抑制劑足以使接受抑制劑治療之患者群中的脾臟大小減小至少10%、20%、30%、35%、40%、50%及60%。舉例而言，在12至24週內，如藉由MRI或CT掃描所量測，相較於安慰劑對照，治療有效地達成脾臟體積自基線縮小≥35%。在一些實施例中，在24至48週內，如藉由MRI或CT掃描所量測，相較於最佳可用療法對照，治療有效地達成脾臟體積自基線縮小≥35%。最佳可用療法可包括羥基脲、糖皮質激素以及無藥療、阿那格雷(anagrelide)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、沙立度胺、來那度胺、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、達那唑(danazol)、聚乙二醇化干擾素α-2a、干擾素-α、美法侖、乙醯水楊酸、阿糖胞苷及秋水仙鹼。
在一些實施例中，用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑治療之患者群顯示統計學上經改善之，如藉由例如骨髓纖維化研究及治療國際工作組(International Working Group for Myelofibrosis Research and Treatment；IWG-MRT)準則所評定的治療反應；治療(例如，4、6、8或12個週期)後，統計學上經改善之，藉由改進型鮑爾邁斯特評分及歐洲共識定級系統量測之骨髓纖維化級別的變化程度；統計學上經改善之，使用骨髓增生性腫瘤症狀評定表(Myeloproliferative Neoplasm Symptom Assessment Form；MPN-SAF)的症狀反應。
在一些實施例中，用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑進行之治療達成如藉由例如改進型骨髓纖維化症狀評定表(Myelofibrosis Symptom Assessment Form；MFSAF)所評定，統計學上經改善之治療反應，其中症狀係藉由MFSAF工具(諸如版本2.0)(採集骨髓纖維化之虛弱症狀(腹部不適、早飽腹感、左肋下疼痛、搔癢、盜汗及骨/肌肉痛)的daukt日記)，使用0至10之評分(其中0為無痛且10為最不能想像之疼痛)量測。在一些實施例中，治療有效地達成在例如12至24週內，總MFSAF評分自基線減小≥50%。在一些實施例中，相較於服用安慰劑之患者，大部分接受療法之患者的總症狀評分達成≥ 50%改善。舉例而言，達成≥ 50%改善的患者池之百分率可超過40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%。
在一些實施例中，抑制劑之治療有效量為如藉由貧血反應所評定，足以實現臨床改善之量。舉例而言，經改善之貧血反應可包括治療4至12個週期，例如6個週期之後，較長持續時間之非輸注依賴性，例如8週或較長。
在一些實施例中，抑制劑之治療有效量為足以在例如6週、8週、12週、六個月等之持續時間內維持穩定疾病之量。在一些實施例中，可藉由總骨髓細胞含量之變化、網硬蛋白或膠原蛋白纖維化之量及/或JAK2V617F 對偶基因負荷之變化來評估疾病之進展。
在一些實施例中，相較於不接受治療之對照群，用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑治療的患者群顯示統計學上經改善(延長)之存活期。舉例而言，在對照組中，PMF患者之中值存活期為大約六年(高風險患者中，呈大約16個月)，且預期低於20%之患者在診斷後存活10年或更長。用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑進行之治療可使存活時間延長至少6個月、12個月、18個月、24個月、30個月、36個月或48個月。在一些實施例中，相較於接受安慰劑之患者，治療在26週、52週、78週、104週、130週、144週或156週下有效達成經改善之總存活率。
療法之臨床益處，諸如上文例示之益處，可見於存在或不存在新發貧血之患者中。
異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑之有利特徵中之一者為，相較於不具有選擇性之習知TGFβ拮抗劑，其維持異構體選擇性所實現之經改良之安全概況。因此，預期在此類事件之出現率及/或嚴重程度方面，與用習知TGFβ拮抗劑治療之相等患者群相比，用異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑進行之治療可減少患者群中之不良事件。因此，異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可提供關於治療劑量及/或持續時間之較大治療窗。
不良事件可藉由此項技術中公認的適合方法，諸如通用不良事件術語準則(Common Terminology Criteria for Adverse Events；CTCAE)版本4。接受TGFβ拮抗劑，諸如GC1008的人類患者中的先前報導之不良事件包括：白血球增多症(3級)、疲勞(3級)、低氧(3級)、心收縮不全(5級)、白血球減少症(1級)、復發性短暫性嫩紅斑性、結節性皮膚病變、化膿性皮膚炎及帶狀疱疹。
在骨髓纖維化患者中，在例如貧血、血小板減少症、嗜中性白血球減少症、高膽固醇血症、升高之丙胺酸轉胺酶(ALT)、升高之天冬胺酸轉胺酶(AST)、淤血、眩暈及頭痛方面，相較於JAK抑制劑療法，異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑療法可引起較不常見及/或較不嚴重不良事件(副作用)，由此提供安全治療選擇。
預期TGFβ1信號傳遞之抑制劑可與用於治療骨髓纖維化之一或多種治療劑結合以組合(例如，「附加」)療法形式使用。在一些實施例中，向患有骨髓纖維化，已接受JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑或為接受該等抑制劑之候選者的患者投與本文中所述之TGFβ1活化之抑制劑。在一些實施例中，此類患者對JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑療法起反應，而在其他實施例中，此類患者對JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑療法反應不佳或不起反應。在一些實施例中，使用本文中所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑可使得對JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑療法反應不佳或不起反應之彼等者較具反應。在一些實施例中，使用本文中所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑可允許減少劑量之JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑，其仍在患者中產生等效或有意義臨床功效或益處，但產生較少或較小程度的藥物相關毒性或不良事件(諸如上文所列之彼等不良事件)。在一些實施例中，結合JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑療法使用的用本文中所述之TGFβ1活化之抑制劑進行之治療可在患者中產生協同或附加治療作用。在一些實施例中，用本文中所述之TGFβ1活化之抑制劑進行之治療可增加為治療骨髓纖維化給與的JAK1抑制劑、JAK2抑制劑或JAK1/JAK2抑制劑或其他療法之益處。在一些實施例中，患者可額外接受治療劑以解決與骨髓纖維化相關之貧血。 纖維性病狀
回應於物理損傷/外傷、有毒物質及/或感染所致之組織損傷，開始天然修復過程，其涉及若干細胞類型，包括纖維母細胞、若干不同類型的免疫細胞及駐留上皮及內皮細胞。然而，若不進行檢查，此過程會引起細胞外基質(ECM)之過度積聚及纖維化，其反過來會引起組織功能之進行性喪失及器官衰竭 (Caja等人,Int. J. Mol. Sci . 2018, 19, 1294)。
纖維化可發生於數種器官中，包括肺臟、腎臟、肝臟、心臟及皮膚。無關於器官，纖維性反應的特徵在於發炎、變化之上皮-間葉細胞相互作用及纖維母細胞增殖。纖維化之標誌中之一者為纖維母細胞分化成肌纖維母細胞，其在很大程度上促成ECM之調節異常。然而亦已提出肌纖維母細胞來自其他細胞來源(例如，內皮細胞、上皮細胞及間葉幹細胞) (Kim, K.K.等人, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2017; Okabe, H. Histol. Histophathol., 2016, 31, 141-148; 及Li, C等人, Nat Commun., 2016, 7, 11455 及)。另外，免疫細胞藉由分泌促進肌纖維母細胞之分化、刺激ECM沈積及將其他免疫細胞募集至受損組織的細胞介素及趨化細胞素而在該過程中起重要作用 (Caja等人,Int. J. Mol. Sci . 2018, 19, 1294)。
與纖維性組織相似，癌症相關纖維母細胞之活化可發生在腫瘤環境中，其產生過量ECM。ECM提供用於其他細胞(例如，促致瘤免疫細胞)之浸潤的骨架及用於細胞遷移之底物。在其他情況下，過量ECM可充當抗致瘤免疫細胞之障壁。
TGFβ識別為纖維性反應之中央協調器。TGFβ可促進肌纖維母細胞分化、募集免疫細胞且影響上皮及內皮細胞分化。特定而言，TGFβ上調ECM及基底膜蛋白，諸如纖維結合蛋白、膠原蛋白、層黏連蛋白、骨橋蛋白、肌腱蛋白、彈性蛋白、核心蛋白聚糖的產量。TGFβ誘導之肌纖維母細胞分化會引起ECM蛋白之額外沈積、基質金屬蛋白酶(MMP)之分泌及肌纖維母細胞增殖 (Fabregat等人,FEBS J. 2016, 283, 2219-2232; Meng等人,Nat. Rev. Nephrol. 2016, 12, 325-338; 及Kulkarni等人,Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2016, 54, 751-760)。另外，TGFβ介導影響血管平滑肌細胞(VSCM)中的收縮性蛋白及膠原蛋白I的表型變化，且可活化肌纖維母細胞及其他基質細胞以促進膠原蛋白交聯蛋白，諸如基質重塑酶之離胺醯氧化酶(LOX)家族的合成(Busnadiego等人,Mol . Cell . Biol . 2013, 33, 2388-2401)。此外，已顯示TGFβ調節EMT及EndMT兩者，其促成促纖維變性細胞類型，諸如肌纖維母細胞及CAF之分化。此外，已顯示TGFβ誘導上皮細胞凋亡，其可促進肺及肝纖維化以及其他組織 (Barbas-Filho等人,J. Clin. Pathol. 2001, 54, 132-138; 及Wang等人,Dev. Dyn. 2017, 247, 492-508)。
無論先天性或經募集，巨噬細胞在對組織損傷及修復之反應中起重要作用。然而，在特定信號後，其可變得促纖維變性。亦顯示TGFβ以及其他細胞介素會活化M2巨噬細胞，其為促炎性的。活化後，此等巨噬細胞分泌其自身細胞介素，包括TGFβ、ECM組分、血管生成因子及趨化性因子。已顯示M2巨噬細胞對於TGFβ驅動肺纖維化必不可少 (Murray等人,Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, 43, 154-162)。
因此，根據本發明，將異構體特異性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑用於個體中之纖維化(例如，纖維性適應症、纖維性病狀)的治療中。進行本發明之適合抑制劑包括根據本發明之抗體及/或組合物，其可適用於改變或改善纖維化。更具體言之，此類抗體及/或組合物為能夠靶向由各種類型之呈遞分子呈遞的TGFβ1的TGFβ1之選擇性拮抗劑。
靶向TGFβ之抗體降低多種臨床前模型中的纖維化。此類抗體及/或基於抗體之化合物包括LY2382770 (Eli Lilly, Indianapolis, IN)。亦包括美國專利第US 6,492,497號、第US 7,151,169號、第US 7,723,486號及美國專利申請公開案第2011/0008364號中所述之彼等，其中每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。先前技術TGFβ拮抗劑包括例如靶向且阻斷TGFβ之整合素依賴性活化的藥劑。
然而，有證據表明此類先前技術藥劑可能並不介導異構體特異性抑制，且藉由無意阻斷TGFβ2及/或TGFβ3之正常功能而可能引起不合需要之作用。實際上，申請人先前注意到正常(未患病)肺臟組織含有相對較低但可量測量之TGFβ2及TGFβ3，但顯著較少TGFβ1。相比之下，在諸如纖維化之某些疾病病狀中，TGFβ1相對於其他異構體變得優先上調(WO 2018/129329)。較佳地，供用於此類病狀之治療中的TGFβ拮抗劑僅對疾病誘導或疾病相關異構體發揮其抑制性活性，同時保留其他異構體經正常表現以介導組織中之強直信號傳遞的功能。顯示先前技術抑制劑(LY2109761(一種小分子TGFβ受體拮抗劑)及靶向αVβ6整合素之單株抗體)兩者抑制未患病大鼠BAL中的TGFβ下游強直信號傳遞，提高此等抑制劑可引起不合需要之副作用的可能性。或者或另外，靶向及阻斷TGFβ之整合素依賴性活化的藥劑可能夠在由多種細胞類型表現且在發病機制中起一定作用的多種整合素類型中，僅阻斷負責疾病相關TGFβ1活化之一小類整合素。此外，即使在此類拮抗劑可選擇性地阻斷TGFβ1異構體之經整合素介導之活化的情況下，其在阻斷藉由諸如蛋白酶依賴性活化之其他模式觸發的TGFβ1活化方面可為無效的。相比之下，異構體特異性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑旨在無關於特定活化模式防止發生TGFβ1之活化步驟，同時維持異構體選擇性。
進一步預期異構體特異性TGFβ3抑制劑可在特定疾病病況中提供治療效益。舉例而言，待用TGFβ1抑制劑治療之某些纖維性疾病亦可呈TGFβ3陽性(亦即，TGFβ1+/TGFβ3+纖維性組織)，其特徵在於疾病組織(例如，纖維性組織)表現該等異構體兩者。因此，本發明包括異構體選擇性TGFβ1抑制劑以及異構體選擇性TGFβ3抑制劑在治療此類病狀中之用途。此類TGFβ3抑制劑可為非情形依賴性或情形偏向的。
可在治療上使用本發明之抗體及/或組合物的纖維性適應症包括(但不限於)肺臟適應症(例如特發性肺纖維化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、過敏性哮喘、急性肺損傷、嗜酸性食道炎、肺動脈高血壓及化學氣體損傷)、腎臟適應症(例如，糖尿病性腎小球硬化、局部區段性腎小球硬化(FSGS)、慢性腎病(CKD)、與腎臟移植及慢性排斥反應相關之纖維化、IgA腎病變及溶血性尿毒症候群)、肝纖維化(例如，與非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、慢性病毒性肝炎、寄生蟲血症、先天性代謝缺陷、經毒素介導之纖維化(諸如酒精纖維化)、非酒精性脂肪變性肝炎-肝細胞癌(NASH-HCC)、原發性膽汁性肝硬化症及硬化性膽管炎相關或由其所引起)、心血管纖維化(例如，心肌病、肥厚性心肌症、動脈粥樣硬化及再狹窄)、全身性硬化症、皮膚纖維化(例如全身性硬化症、彌漫性皮膚全身性硬化症、硬皮病、病理性皮膚疤痕、瘢痕瘤、手術後疤痕、疤痕修復手術、輻射誘發之疤痕及慢性創傷中的皮膚纖維化)中的視網膜下纖維化、眼部相關病狀(諸如視網膜下纖維化、葡萄膜炎症候群、與特發性腹膜後纖維化相關之葡萄膜炎、細胞外肌肉纖維化、與主要組織相容複合體(MHC I類)或組織相容抗原相關之眼病、黃斑變性(例如，老年性黃斑變性)中的視網膜下纖維化及癌症或繼發性纖維化(例如骨髓纖維化、頭頸癌、M7急性巨核母細胞白血病及黏膜炎)。可使用本發明之化合物及/或組合物治療的與纖維化(包括退化性病症)相關的其他疾病、病症或病狀包括(但不限於)子宮腺肌症、子宮內膜異位、馬凡症候群、僵直皮膚症候群、硬皮病、類風濕性關節炎、骨髓纖維化、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑性狼瘡症、肌肉萎縮症(諸如DMD)、帕金森病、ALS、杜普宜特朗氏攣縮(Dupuytren's ontracture)、卡-恩二氏病、神經疤痕、癡呆、增生性玻璃體視網膜病變、角膜損傷、青光眼引流手術後之併發症及多發性硬化(MS)。
多種纖維性適應症亦與受影響組織之發炎相關，表明涉及免疫組分。此類發炎可伴有異常免疫細胞群，諸如增加之Th17細胞數，減少之Treg細胞數及/或兩者。在各情況下，受影響患者可展現增加之Th17/Treg細胞比率。異構體選擇性抗體之GARP及/或LRRC33靶向活性可提供對此等情形之抑制效應。
在一些實施例中，可用本文所述之組合物及/或方法治療之纖維性適應症包括器官纖維化，諸如肺臟纖維化(例如，IPF)、腎臟纖維化(例如，與CKD相關之纖維化)、肝臟纖維化(例如，與NASH相關或NASH所致)、心臟或心臟組織之纖維化、皮膚纖維化(例如，硬皮病)、子宮(例如，子宮內膜、子宮肌層)纖維化、肌肉(例如，骨胳肌肉)纖維化及骨髓纖維化。在一些實施例中，此類療法可在患者中減少或延遲對器官移植之需求。在一些實施例中，此類療法可延長患者之存活期。
為了治療IPF，可受益於該治療之患者包括患有家族性IPF之患者及患有偶發性IPF之患者。投與治療有效量之異構體特異性TGFβ1抑制劑可減少肌纖維母細胞在肺臟組織中之積聚、減少膠原蛋白沈積物、減少IPF症狀、改善或維持肺臟功能且延長存活期。在一些實施例中，抑制劑阻斷IPF之纖維性環境中的ECM締合之TGFβ1之活化(例如，LTBP1/LTBP3所呈遞之前TGFβ1/潛伏TGFβ1)。抑制劑可視情況進一步阻斷巨噬細胞(例如肺泡巨噬細胞)締合之TGFβ1 (例如，LRRC33所呈遞之前TGFβ1/潛伏TGFβ1)之活化。因此，抑制劑可抑制纖維結合蛋白釋放及其他纖維化相關因子。在一些實施例中，抑制劑阻斷肝星狀細胞活化。
公認肝星狀細胞(HSC)之活化為肝臟損傷中的纖維化之主要驅動因素。在此過程中，靜息的儲存維生素A之細胞轉分化成增殖性纖維生成肌纖維母細胞(細胞外基質(ECM)蛋白積聚之主要來源)。然而已顯示此過程由多種不同路徑介導，其包括自噬、內質網應激、氧化應激、視黃醇及膽固醇代謝、後生學及受體介導之信號。另外，亦顯示包括巨噬細胞、肝細胞、肝竇狀內皮細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、血小板及B細胞之發炎細胞調節HSC活化(Tsuchida及Friedman, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 第14卷, 第397-411頁 (2017))。在僅一個特定實例中，Seki等人證明了TLR4 (其識別細菌所呈現之LPS)活化引起趨化細胞素分泌上調且誘導庫弗細胞之趨化性，且亦使HSC對經TGFβ誘導之信號敏感，且允許庫弗細胞不受限制地活化(Seki等人 Nature Medicine 第13卷, 第1324-1332頁 (2007))。
眾所周知，發炎在肝纖維化罹患及進展中起關鍵作用。具體言之，肝臟損傷引起發炎及單核球/巨噬細胞(以及淋巴細胞、嗜伊紅血球及漿細胞)募集，其會產生促纖維變性因子，包括TGFβ。另外，研究表明，駐留肝組織之巨噬細胞(庫弗細胞)及骨髓衍生的經募集之巨噬細胞在肝纖維化之進展中其重要作用，且TGFβ路徑可在肝纖維化期間促進巨噬細胞之極化及促纖維變性功能。實際上，已顯示庫弗細胞及經募集之巨噬細胞均可藉由旁分泌機制(包括TGFβ)活化HSC且誘導其轉分化成肌纖維母細胞。肌纖維母細胞反過來產生且沈積ECM組分，引起纖維化(Fabregat及Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357)。
然而，肌纖維母細胞亦可來源於其他來源，包括門靜脈及駐留纖維母細胞、骨髓衍生之纖維細胞、經歷EMT之肝臟上皮細胞、經歷EndMT之內皮細胞及血管平滑肌細胞以及外被細胞。實際上，亦已顯示TGFβ調節引起肌纖維母細胞增加之EndMT及EMT兩者，其推進肝纖維化。(Pardali等人, Int J Mol Sci. 2017年10月; 18(10): 2157)。因此，靶向TGFβ已成為治療纖維性病狀之引人注目之治療目標。
已顯示TGFβ在肝纖維化及疾病進展中起多種作用。舉例而言，已顯示TGFβ負責將HSC活化成肌纖維母細胞。亦已顯示TGFβ介導肝細胞中之上皮-間葉細胞轉化(EMT)，其可促成增加肌纖維母細胞群。另外，已顯示TGFβ誘導腫瘤細胞可塑性之變化 (Fabregat及Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357)。
儘管TGFβ可存在於纖維性及/或腫瘤微環境中的多種不同細胞來源上，由此表明藉由多種不同呈遞分子(例如，LTBP1、LTBP3、GARP及/或LRRC33)進行TGFb呈遞，但在某些情況下，相對於其他靶向TGFβ之特定來源可為有益的。舉例而言，Henderson等人顯示刪除HSC中之αv整合素保護小鼠免於經CCL4 誘導之肝纖維化(Henderson等人,Nat . Med . 2013, 19, 1617-16-24)。由於整合素為經LTBP呈遞之TGFβ的主要活化劑，因此此結果表明，靶向經LTBP呈遞之TGFβ可足以治療某些情況下之纖維化。然而，由於免疫細胞在纖維性反應中起重要作用，因此靶向由大多數或所有呈遞分子-TGFβ複合物所呈遞之TGFβ的TGFβ抑制劑可為有益的。
近年來，歸因於世界各地肝纖維化之發病率有所增加，肝纖維化之治療已變成受提高關注之領域。舉例而言，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)係與代謝異常，諸如肥胖症、胰島素抗性、空腹高血糖症、血脂異常及變化之脂肪細胞因子概況相關。NAFLD之特徵在於肝細胞中過量脂質積聚，且為自肝脂肪變性(肝細胞中脂質/脂肪滴積聚)進展成非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝纖維化且在最嚴重情況下最終進展成肝硬化的一系列疾病。伴隨纖維化或硬化之NASH增加罹患肝細胞癌(HCC)之風險(Starley BQ等人 Hepatology 2010; 51: 1820-1832)。已提出藉由『多命中物(multiple-hit)』模型調節脂肪變性進展成NASH，其中第一命中物為胰島素抗性及代謝紊亂，其引起肝脂肪變性、繼之以氧化應激、促炎性細胞介素介導之肝細胞損傷、由游離脂肪酸介導的變化之脂質分配及肝臟毒性、異常肝內膽固醇負荷、高胰島素血症、高瘦體素血症(hyperleptinaemia)及低脂締素血症(hypoadiponectinaemia) (Tilg H, Moschen AR, Hepatology 2010; 52: 1836-1846；及Yilmaz Y., Aliment Pharmacol Ther 2012; 36: 815-823)。
儘管已開發出多種動物模型以用於研究肝纖維化，但可採用任何適合之臨床前模型。舉例而言，已顯示小鼠中之高脂飲食來模仿人類NAFLD之組織病理學及發病機制。另外，一些基因模型亦顯示人類代謝症候群及NAFLD之特徵，諸如db / db 及ob / ob 小鼠模型。亦存在用於研究NASH之動物模型、其主要由多種飲食誘導之模型組成，包括(但不限於)甲硫胺酸及膽鹼缺乏飲食(MCD)、高膽固醇飲食(HCD)、膽鹼缺乏高脂飲食(CDHFD)、膽鹼缺乏L-胺基酸缺乏飲食、膽鹼缺乏L-胺基酸缺乏飲食+四氯化碳、高脂飲食+鏈佐黴素、高脂+高膽固醇飲食(HFHC)、高果糖飲食(HFD)及高果糖高脂飲食(HFHF)。用於研究NASH之基因小鼠模型包括(但不限於)foz/foz小鼠、肝細胞特異性PTEN缺乏小鼠、Db/db小鼠+二乙基亞硝胺(DEN)及db / db 小鼠+ MCD。所有此等模型之詳情，包括各者之利弊，概述於Jennie Ka Ching Lau等人, J Pathol 2017;241 : 36-44中；其內容以引用之方式併入本文中。
適用於測試異構體特異性TGFβ抑制劑在肝纖維化中之功效的另一模型包括四氯化碳(CCL4 )模型。適用於測試異構體特異性TGFβ抑制劑在肝纖維化中之功效的另一模型包括膽管結紮(BDL)模型(參見例如Tag等人,J Vis Exp . 2015; (96): 52438)。
異構體特異性TGFβ1抑制劑，諸如本文所提供之彼等抑制劑，可用於治療肝臟之纖維性病狀，諸如脂肪肝(例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)及非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)。脂肪肝可或可不為發炎的。脂肪肝(亦即，脂肪變性肝炎)所致的肝臟之發炎可發展成疤痕(纖維化)，其隨後通常發展成肝硬化(使肝臟結構變形且損害其功能的疤痕)。可因此使用抑制劑來治療此類病狀。在一些實施例中，抑制劑阻斷肝臟之纖維性環境中的ECM締合之TGFβ1 例如，LTBP1/LTBP3所呈遞之前TGFβ1/潛伏TGFβ1)之活化。抑制劑可視情況進一步阻斷巨噬細胞(例如庫弗細胞(亦稱為星狀巨噬細胞)以及浸潤單核球衍生之巨噬細胞及MDSC)締合之TGFβ1 (例如，LRRC33所呈遞之前TGFβ1/潛伏TGFβ1)之活化。因此，抑制劑可抑制纖維化相關因子(例如，本文中所述之纖維性標記物)。在患有此類病狀之個體中投與抑制劑可減少一種或多種症狀、預防或延緩疾病之進展、減少肝中之脂肪堆積物或使其穩定、減少疾病相關生物標記物(諸如血清膠原蛋白片段)、減少肝臟疤痕、減少肝臟僵硬及/或相較於未用該抑制劑治療之對照群，在用抑制劑治療之患者群中另外產生有臨床意義之結果。在一些實施例中，有效量之抑制劑可在NASH患者中達成減少之肝臟脂肪及減少之纖維化(例如，疤痕)。在一些實施例中，有效量之抑制劑可藉由至少一個分期未出現惡化之脂肪變性肝炎而在NASH患者中達成改善纖維化。在一些實施例中，有效量之抑制劑可在NASH患者中減少肝功能衰竭及/或肝癌之出現率。
在一些實施例中，有效量之抑制劑可相較於對照，標準化如在療法開始後，在例如12至36週所評定的多種發炎或纖維性血清生物標記物的量。在一些實施例中，發炎或纖維性生物標記物可用於評定NAFLD之嚴重程度(藉由量測肝脂肪變性之程度)、選擇治療患者及/或監測疾病進展或治療反應。舉例而言，血液生物標記物及組可包括(但不限於)： i) 脂肪肝指數(BMI、腰圍、血清三酸甘油酯及γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)； ii) 肝脂肪變性指數(血清天冬胺酸胺基轉移酶(AST):丙胺酸轉胺酶(ALT)比率\BMI\性別及糖尿病之存在)； i) 該NAFLD肝臟脂肪評分(血清ALT、HDL膽固醇、三酸甘油酯、血紅素A1c 及白血球計數)； ii) SteatoTest (BioPredictive) (總膽紅素之血清量、GGT、α2-巨球蛋白、結合球蛋白、ALT、脂蛋白元AI、總膽固醇、三酸甘油酯、葡萄糖(針對年齡及性別加以調整)及BMI)；及 iii) NAFLD嶺評分(ALT之血清量、HDL膽固醇、三酸甘油酯、血紅素A1c 、白血球計數及共同罹病率資料(及高血壓之存在))。
在一些實施例中，成像生物標記物可用於評定肝脂肪變性之程度。舉例而言，成像生物標記物可包括(但不限於)：超音波檢查術、受控衰減參數(CAP)、經MRI估計之質子密度脂肪分數(MRI-estimated proton density fat fraction；MRI-PDFF)及磁共振光譜分析(MRS)。
肝臟活檢體為用於診斷NASH之當前標準，然而，病理學家中的變化性限制了此類診斷方法之有效性。因此，脂肪肝進展抑制(Fatty Liver Inhibition of Progression；FLIP)演算法(包含組織學脂肪變性、活性及纖維化評分)之使用可用於改良利用活檢體進行的NASH診斷之一致性。另外，多種非侵襲性生物標記物亦可適用於診斷及監測疾病。因此，在一些實施例中，發炎或纖維性生物標記物可用於評定NASH之嚴重程度、選擇治療患者及/或監測疾病進展或治療反應。血液生物標記物可包括： i) 細胞凋亡標記物，諸如CK18片段、總細胞角蛋白及sFAS； ii) 發炎標記物，諸如CRP、TNF、IL-8及CXCL10； iii) 脂質氧化產物，諸如11-HETE、9-HODE、13-HODE、12-側氧基-ODE、LA-13-HODE (oxNASHscore)、及11,12-diHETrE； iv) 溶酶體酶，諸如組織蛋白酶D；及 v) 組合小組，諸如NASHTest (BioPredictive)及NASH診斷小組(包含糖尿病之存在、性別、BMI及三酸甘油酯之血清量、CK18片段及總CK18)。
在一些實施例中，生物標記物及相關小組可適用於診斷纖維化及/或硬化之程度、選擇治療患者及/或監測疾病進展或治療反應。舉例而言，肝纖維化及肝硬化之非侵襲性測試包括(但不限於)：AST:ALT比率、AST:血小板比率指數、纖維化-4指數(年齡、AST、ALT及血小板計數)、NAFLD纖維化評分(年齡、BMI、空腹葡萄糖異常及/或糖尿病、AST ALT、血小板計數及白蛋白)、BARD評分(AST、ALT、BMI及糖尿病)。
特定纖維化標記物及小組亦可適用，且包括(但不限於)：玻尿酸；PIIPNP；Pro-C3；TIMP1；層黏連蛋白；增強型肝纖維化(ELF)小組(PIINP、玻尿酸、TIMP1)；FibroTest (GGT、總膽紅素、α2 m、脂蛋白元AI及結合球蛋白)；及FibroMeter NAFLD (體重、凝血酶原指數、ALT、AST、鐵蛋白及空腹葡萄糖)。肝纖維化之成像生物標記物可包括(但不限於)：肝纖維化掃描(FibroScan) (TE)、點剪切波彈性成像(pSWE) (亦稱為聲輻射力脈衝(ARFI))、2D-3D SWE、磁共振彈性成像(MRE)及多參數MRI。
在一些實施例中，基因及基因體生物標記物可適用於評定NAFLD風險及嚴重程度，其包括評定多種SNP、無細胞ncRNA及miRNA。已知基因及基因體生物標記物以及以上論述之血液生物標記物、小組、成像生物標記物及測試的綜述概述於VWS Wong等人, Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2018年8月;15(8):461-478；其內容以引用之方式併入本文中。
在NASH患者中之一些實施例中，可在接受一或多種額外療法之患者中投與異構體特異性TGFβ1抑制劑，該等額外療法包括(但不限於)肌肉抑制素抑制劑，其一般可促進具有代謝症候群(包括NASH及NAFLD)之臨床表現的患者中之代謝調節。
在一些實施例中，額外療法可包含TGFβ3抑制劑。在一些實施例中，TGFβ3抑制劑為異構體特異性TGFβ3抑制劑。在一些實施例中，TGFβ3抑制劑為非情形依賴性或情形偏向之TGFβ3抑制劑。在一些實施例中，NASH患者具有TGFβ1陽性及TGFβ3陽性纖維性組織。在一些實施例中，測定或已測定NASH患者對TGFβ1抑制劑療法起部分反應。
在NASH患者中之一些實施例中，可在接受乙醯CoA羧酶抑制劑(ACCi) (例如，firsocostat(GS-0976)或PF-05221304)之患者中投與異構體特異性TGFβ1抑制劑。可適用於與經改良之本文中所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑組合的其他療法包括(但不限於)：GLP-1受體促效劑或類似物(例如，索馬魯肽(semaglutide))；法尼醇X受體(FXR)促效劑(例如，GS-9674；亦稱為Cilofexor)；ASK1抑制劑(例如，司隆色替(selonsertib))；奧貝膽酸；PPAR促效劑(例如，GFT505；亦稱為elafibranor)；硝唑尼特(nitazoxanide)；己酮糖激酶(KHK)抑制劑(例如，PF-06835919)；及/或二醯甘油鄰醯基轉移酶2 (DGAT2)抑制劑(例如，PF-06865571)。在一些實施例中，上述療法中之任何一或多者可用於與本發明之異構體特異性TGFβ1抑制劑組合，舉例而言，異構體特異性TGFβ1抑制劑與FXR促效劑、ACC抑制劑及/或GLP-1類似物組合。在一些實施例中，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可與肌肉抑制素抑制劑組合使用，肌肉抑制素抑制劑諸如肌肉抑制素活化抑制劑(例如，SRK-015，例如，WO 2016/073853及WO 2017/049011)。在一些實施例中，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可與GDF11抑制劑，諸如GDF11活化抑制劑(例如，WO 2017/015622)組合使用。
在一些實施例中，如藉由MRI-PDFF所量測，用單獨或與一或多種額外療法組合的異構體特異性TGFβ1抑制劑進行之治療會減少肝脂肪。在一些實施例中，肝脂肪減少至少20%，例如≥ 20%、≥25%、≥30%、≥35%、≥40%、≥45%或≥50%。在一些實施例中，用單獨或與一或多種額外療法組合的異構體特異性TGFβ1抑制劑進行之治療會使血清ALT及/或GGT減少至少20%，例如≥ 20%、≥25%、≥30%、≥35%、≥40%、≥45%或≥50%。在一些實施例中，用單獨或與一或多種額外療法組合的異構體特異性TGFβ1抑制劑進行之治療會減少膽汁酸合成。
在一些實施例中，NASH患者可能具有晚期肝纖維化(F3/F4期)。在一些實施例中，此類患者具有F3期晚期肝纖維化。在一些實施例中，此類患者患有F4期肝纖維化，其特徵在於肝硬化。在一些實施例中，NASH患者罹患或處於罹患肝細胞癌及/或食道靜脈曲張之風險下。
根據源於精性脂肪變性肝炎臨床研究網路病理學委員會(Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network Pathology Committee)的分類法的非酒精性脂肪肝病之纖維化分期提供於下文中：
Figure 108124516-A0304-0019
為了實現對療法期間的多種組織學特徵進行評定且涵蓋整個NAFLD系列，NASH臨床研究網路(CRN)病理學委員會針對NASH中觀測到不同組織學特徵與根據病理學委員會之NASH診斷之間的相關性進行了一項徹底的單變量及多變量分析。結果為NASH活性(等級)及膠原蛋白沈積外加架構重塑(分期)之評分系統。定級系統，NASH活性評分(NAS)為三種組織學組分之未加權總和：脂肪變性(0-3)、小葉發炎(0-3)及氣脹變性(0-2)。其範圍為0至8。NAS包括可能可逆的活性損傷之特徵。另外，進一步研發出Brunt等人之纖維化分期系統。在NASH CRN系統中，1期之纖維化評分細分成精密(1A)及緻密(1B)竇周纖維化，而1C期界定為未附隨竇周纖維化之門靜脈纖維化((Stål, World J Gastroenterol. 2015年10月21日; 21(39): 11077-11087所綜述，以引用之方式併入本文中)。
異構體特異性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所提供之彼等抑制劑，可用於治療腎臟之纖維化病狀，例如特徵為細胞外基質積聚之疾病(IgA腎病變、局部及區段性腎小球硬化、新月體性型絲球體腎炎(crescentic glomerulonephritis)、狼瘡性腎炎及糖尿病性腎病變)，其中已在腎小球及腎小管間質中觀測到明顯增加之TGFβ表現。儘管由TGFβ、纖維結合蛋白EDA+及PAI-1誘導的兩種基質組分之腎小球及腎小管間質沈積在具有基質積聚之所有疾病中明顯升高，但相關分析已顯示主要與TGFβ1異構體之密切關係。因此，異構體特異性TGFβ1抑制劑適用作其中TGFβ與細胞外基質之病理性積聚相關的一系列人類腎小球病症之治療劑。
在一些實施例中，腎臟之纖維性病狀與慢性腎病(CKD)相關。CKD主要由高血壓或糖尿病造成且每年會奪去超過一百萬條生命。CKD患者需要介於嚴格飲食與藥療範圍內的終身醫療照護以透析及移植。在一些實施例中，本文中所述之TGFβ1抑制劑療法可減少或延遲對滲析及/或移植之需求。在一些實施例中，此類療法可減少其他治療需求(例如，劑量、頻率)。在一些實施例中，可在接受一或多種額外療法之患者中投與異構體特異性TGFβ1抑制劑，該等額外療法包括(但不限於)肌肉抑制素抑制劑，其一般可促進患有CKD之患者中的代謝調節。
可用本發明之TGFβ1抑制劑治療的纖維性病狀包括涉及纖維化及/或慢性發炎之病狀。此類病狀可為神經肌肉病症，其包括(但不限於)杜氏肌營養不良(DMD)及其他遺傳病症，諸如多發性硬化(MS)及囊腫性纖維化(CF)。經由ECM締合之及免疫細胞締合之TGFβ1臂兩者之抑制，認為TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之彼等抑制劑會抑制纖維性進展且恢復M1/M2巨噬細胞極化。
適用於研究CKD及腎纖維化之模型包括(但不限於) NZB/W、MRL/lpr 及BXSB小鼠品系；抗GBM模型；抗Thy1模型；5/6腎切除、放射性腎病變、嘌呤黴素胺基核苷腎病(PAN)及阿德力黴素腎病變(adriamycin 腎病變)、葉酸腎病變、CyA腎病變、DOCA-鹽腎病變、HIV相關性腎病變(HIVAN)轉殖基因小鼠模型；自發性高血壓大鼠(SHR)；布法羅(Buffalo)/mna大鼠；慕尼黑維斯塔弗洛特(Munich Wistar Frömter；MWF)大鼠；單側輸尿管阻塞(UUO)、Col4A基因剔除小鼠(奧爾波特症候群)(參見Yang等人 Drug Discov Today Dis Models. 2010; 7(1-2): 13-19；其內容以引用之方式併入本文中)。
可用本文所提供之方法治療的器官纖維化包括心臟(例如，心血管)纖維化。在一些實施例中，心臟纖維化與心臟衰竭，例如慢性心臟衰竭(CHF)相關。在一些實施例中，心臟衰竭可能與心肌疾病及/或代謝疾病相關。在一些實施例中，可在接受一或多種額外療法之患者中投與異構體特異性TGFβ1抑制劑，該等額外療法包括(但不限於)患有涉及心臟纖維化及代謝病症之心臟功能障礙的患者中的肌肉抑制素抑制劑。
適用於研究心臟纖維化之基因模型包括(但不限於)心肌細胞特異性FAK-KO小鼠、經遺傳修飾之SR-BI/apoE雙KO (dKO)小鼠、多配體蛋白聚糖-1剔除式小鼠、EC-SOD過度表現小鼠、PKC-δ基因剔除小鼠。適用於研究心臟纖維化之手術小鼠模型包括(但不限於)冠狀動脈結紮、缺血再灌注模型(開放及閉合胸腔)、慢性局部缺血模型、伴隨缺血性預適應之局部缺血再灌注模型、Langendorff模型、橫向主動脈縮窄(TAC)、升主動脈縮窄、腹主動脈縮窄、肺動脈狹窄術、伴隨遠端左前冠狀動脈結紮之TAC、主動脈腔靜脈瘺(aortocaval fistula；ACF)模型及主動脈功能不全模型(參見Rai等人, Mol Cell Biochem. 2017年1月; 424(1-2): 123-145；其內容以引用之方式併入本文中)。
在一些實施例中，可用本文所述之組合物及/或方法治療之纖維性病狀包括結締組織增生。結締組織增生可發生在贅瘤周圍，引起腫瘤周圍緻密纖維化(例如，結締組織增生性基質)或腹部手術之後腹內有疤痕組織。在一些實施例中，結締組織增生與惡性腫瘤相關。歸因於其圍繞惡性疾病之緻密形成，習知抗癌療法(例如，化學療法)可能不會有效地滲透而達至針對臨床作用之癌細胞。異構體特異性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之彼等抑制劑，可用於破壞結締組織增生，使得纖維性形成物可鬆散以輔助抗癌療法之作用。在一些實施例中，異構體特異性TGFβ1抑制劑可用作單一療法(詳情見下文)。
在一些實施例中，患者患有纖維性實體腫瘤(例如，結締組織增生)且自或已自手術候選池排除，使得纖維性實體腫瘤視為不可切除或不可手術。此類患者可為接受本發明之TGFβ1抑制療法的候選者。本發明之TGFβ1抑制劑可使腫瘤在投藥之後變得可切除或可手術，以使得患者可變成手術切除術之候選者。
為了治療患有纖維性病狀之患者，以有效治療纖維化之量向個體投與異構體特異性TGFβ1抑制劑。此類抗體之有效量為在個體中有效地達成治療功效及臨床安全性兩者的量。在一些實施例中，抑制劑為可阻斷定位(例如，繫留)於ECM中的經LTBP介導之TGFβ1，及定位於免疫細胞中(例如，繫留於其上)之經GARP介導之TGFβ1的活化的抗體。在一些實施例中，抗體為可阻斷定位於ECM中的經LTBP介導之TGFβ1，及定位於單核球/巨噬細胞中(例如，繫留於其上)之經LRRC33介導之TGFβ1的活化的抗體。在一些實施例中，LTBP為LTBP1及/或LTBP3。在一些實施例中，靶向及抑制纖維性微環境中的促纖維變性類M2巨噬細胞上的由LRRC33呈遞之TGFβ1可為有益的。
適用於針對纖維化之變化測定本發明之抗體及/或組合物之功效的分析包括(但不限於)此項技術中已知的用於對纖維母細胞進行計數之組織學分析及基礎免疫組織化學分析。
在一些實施例中，循環LAP片段可用作纖維生成之血清標記物。特異性識別此類片段之裂解端的抗體可用於自血清樣品偵測LAP片段。參見例如美國專利8,198,412，其內容以引用之方式併入本文中。 TGF β 在糖尿病中之作用
胰臟中分泌胰島素之β細胞的損失為第2型糖尿病之主要機制。近期研究提出TGFβ家族配位體在調節β細胞功能及葡萄糖內穩定中之作用。此等配位體可影響β細胞增生及/或新β細胞自成體之祖細胞之併入。據報導，經由胰島素啟動子引起TGF-β之基因轉殖過度表現的基因操控導致胰臟外分泌及胰島發育減少，葡萄糖控制之維持減弱。類似地，據報導，經由胰高血糖素啟動子引起之TGF-β基因轉殖過度表現導致B細胞發育不全、胰島素分泌減少、葡萄糖耐受性異常(評述於例如Trends Endocrinol Metab. 2010年7月; 21(7): 441-448中)。胰臟β細胞之擴增及更新對胰臟之正常發育及成體胰島之功能維持兩者至關重要。最近，數種研究已鑑別出TGFβ信號傳遞在胰臟發育中之關鍵作用中之一些。具體而言，TGFβ信號傳遞促進祖細胞之內分泌提交及其後續成熟作用。過度表現TGFβ II型受體Tulachan等之顯性陰性形式的小鼠在受體層級抑制TGFβ信號傳遞，且發現內分泌前驅體之數目增加，以及內分泌細胞增生。在成體胰島中，所有三種TGFβ異構體在內分泌細胞中以彌漫性模式表現。然而，在胰島素陽性細胞中TGFβ2及TGFβ3之強度較高。在胰臟外分泌中，大部分腺泡細胞對TGFβ1呈陽性，而所有三種配位體似乎在導管細胞中相等地表現。成體β細胞具有極低更新及低增生率。諸如本文所涵蓋之彼等的異構體選擇性TGFβ1抑制劑可用於在糖尿病及/或葡萄糖失耐之治療或預防中促進胰臟β細胞複製。因為β細胞之複製為回應於改變的胰島素需求，維持及擴增β細胞塊之主要機制，且此類適應性擴增之失效會導致糖尿病(參見例如Dhawan等人, Diabetes. 2016年5月; 65(5): 1208-1218)，所以異構體選擇性TGFβ1抑制劑可有利地用於改善糖尿病，而不造成與對TGFβ信號傳遞之泛抑制相關的非所需副作用。在一些實施例中，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可與肌肉抑制素選擇性抑制劑(例如，選擇性結合前/潛伏肌肉抑制素/GDH8，藉此抑制肌肉抑制素之活化的抗體)結合使用，如例如PCT/US2015/059468及PCT/US2016/052014中所描述，用於治療或預防糖尿病或葡萄糖失耐。在一些實施例中，糖尿病為第2型糖尿病。
與糖尿病相關之病狀包括糖尿病性腎病變(DN)，其亦稱作糖尿病性腎病。糖尿病性腎病變為第1型糖尿病及第2型糖尿病之嚴重腎臟相關併發症。高達40%之患糖尿病人群最終罹患腎病。隨時間推移，DN會導致肺水腫、心血管疾病及末期腎臟階段，為了存活，其最終需要透析或腎臟移植。
人類DN之主要臨床特徵包括白蛋白尿、GFR之進行性減少及高血壓，及心血管疾病之風險增加。DN發病機制與腎小球血管生成及超微過濾相關。另外，在患有DN之患者中觀測到腎小球基底膜增厚、腎小球膜細胞(mesangial cell)擴增、腎小球硬化症及小管間質性纖維化。TGFβ1及其受體在實驗及人類糖尿病性腎病變兩者中均上調。據報導，回應於腎小球細胞中之高葡萄糖，發生增強之TGFβ1受體表現、TGFβ1生物活性及對外源性TGFβ1之反應性，且暗示細胞外腺苷在此過程中起作用(參見例如Roa等人, (2009)「Adenosine mediates transforming growth factor - beta 1 release in kidney glomeruli of diabetic rats 」 FEBS Let 583(19): 3192-3198)。在一些實施例中，DN包含腺苷生物合成或信號傳遞之調節異常。在一些實施例中，調節異常涉及CD39及/或CD73。 TGFβ 在肌肉骨胳病狀中之作用
在包含骨胳之骨、肌肉、軟骨、肌腱、韌帶、關節及支持組織及器官且將其結合在一起的其他結締組織肌肉骨胳系統中，TGFβ起多種作用，包括抑制增生及分化、誘導萎縮及產生纖維化。TGFβ減少衛星細胞增生且阻止分化(經由抑制MyoD及成肌素) (Allen, R.E.及L.K. J Cell Physiol, 1987. 133(3): 第567-72頁; Brennan, T.J.等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(9): 第3822-6頁; Massague, J.等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): 第8206-10頁; Olson, E.N.等人, J Cell Biol, 1986. 103(5): 第1799-805頁)。在此等早期論文中，TGFβ之異構體(亦即，TGFβ1、2或3)未指定，但假定為TGFβ1。TGFβ亦促成肌肉纖維化；直接注射重組TGFβ1導致骨胳肌肉纖維化，且泛TGFβ抑制減少急性及慢性受損肌肉中之纖維化(Li, Y.等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁; Mendias, C.L.等人, Muscle Nerve, 2012. 45(1): 第55-9頁; Nelson, C.A.等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁)。TGFβ1由骨胳肌肉內之肌纖維、巨噬細胞、調節T細胞、纖維母細胞及纖維細胞表現(Li, Y.等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁; Lemos, D.R.等人, Nat Med, 2015. 21(7): 第786-94頁; Villalta, S.A.等人, Sci Transl Med, 2014. 6(258): 第258ra142頁; Wang, X.等人, J Immunol, 2016. 197(12): 第4750-4761頁)；且表現在損傷後及疾病中增加(Li, Y.等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁; Nelson, C.A.等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁; Bernasconi, P.等人, J Clin Invest, 1995. 96(2): 第1137-44頁; Ishitobi, M.等人, Neuroreport, 2000. 11(18): 第4033-5頁)。在mdx肌肉中，TGFβ2及TGFβ3亦上調(在mRNA層級)，儘管程度比TGFβ1低(Nelson, C.A.等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁; Zhou, L.等人, Neuromuscul Disord, 2006. 16(1): 第32-8頁)。Pessina等人最近使用譜系追蹤實驗來顯示營養不良肌肉內多個來源之細胞經由TGFβ依賴性路徑採用纖維發生之結局(Pessina, P.等人, Stem Cell Reports, 2015. 4(6): 第1046-60頁)。
骨為體內TGFβ之最大倉庫。實際上，認為TGFβ路徑至少部分藉由調節成骨細胞分化及/或破骨再吸收，在骨內穩定及改造中起重要作用。此過程在正常及異常情境中涉及，其在調節異常時會導致或加重疾病，諸如骨相關病狀及癌症。因此，諸如本文所述之彼等的TGFβ1選擇性抑制劑可用於治療此類病狀。在一些實施例中，投與此類抑制劑可有效地使骨形成-再吸收平衡復原或正常。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑與另一療法(諸如肌肉抑制素抑制劑及/或骨增強劑)結合，以組合療法形式向個體投與。
骨病狀(例如，骨骼疾病)包括骨質疏鬆、發育不良、成骨不全及骨癌。除在骨中發源之原發性骨癌以外，已知許多惡性疾病轉移至骨；此等包括(但不限於)：乳癌、肺癌(例如，鱗狀細胞癌)、甲狀腺癌、睾丸癌、腎細胞癌、前列腺癌及多發性骨髓瘤。
在骨相關病狀中，成骨不全為一種遺傳病狀，其通常由影響I型膠原蛋白編碼基因之突變引起，且造成脆性骨極容易斷裂。當前，存在很少治療選項，其中雙膦酸鹽藥物仍為標準照護療法。選擇性抑制TGFβ1活化之抗原或抗原結合片段可用於以單一療法形式單獨，或與旨在治療該疾病之另一療法結合治療成骨不全。
諸如本文所述之彼等的TGFβ1抑制劑之治療效果可使用適合生物標記物監測，生物標記物諸如骨形成(鹼性磷酸酶活性)或再吸收(酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶)之血清標記物。
在一些實施例中，此類病狀與肌無力相關。
在一些實施例中，肌肉骨胳病狀涉及與肌肉骨胳系統相關之肌原性及非肌原性幹細胞/祖細胞(諸如衛星細胞)的調節異常。異構體選擇性TGFβ1抑制劑可用於促進肌原性及非肌原性幹細胞/祖細胞之擴增/分化。
TGFβ1可在纖維性病狀中起作用，該等纖維性病狀伴隨患病組織之慢性發炎，諸如人類肌肉營養不良。杜氏肌營養不良(DMD)為由缺失肌肉萎縮蛋白(dystrophin)引起之嚴重、進行性且最終致死性疾病(Bushby, K.等人, Lancet Neurol, 2010. 9(1): 第77-93頁)。缺少肌肉萎縮蛋白導致對收縮誘導之損傷的易感性增加，引起持續不斷的肌肉退化(Petrof, B.J.等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(8): 第3710-4頁; Dellorusso, C.等人, J Muscle Res Cell Motil, 2001. 22(5): 第467-75頁; Pratt, S.J.等人, Cell Mol Life Sci, 2015. 72(1): 第153-64頁)。重複數輪修復促成慢性發炎、纖維化、衛星細胞池耗竭、活動能力最終損失及死亡(Bushby, K.等人, Lancet Neurol, 2010. 9(1): 第77-93頁; McDonald, C.M.等人, Muscle Nerve, 2013. 48(3): 第343-56頁)。TGFβ1之表現在患有DMD之患者中顯著增加，且與此等患者中所觀測到之纖維化程度相關(Bernasconi, P.等人, J Clin Invest, 1995. 96(2): 第1137-44頁; Chen, Y.W.等人, Neurology, 2005. 65(6): 第826-34頁)。過度的ECM沈積對肌肉之收縮特性具有不利影響，且可限制對營養之獲取，此係由於肌纖維與其血液供應分離(Klingler, W.等人, Acta Myol, 2012. 31(3): 第184-95頁)。最近，額外資料進一步將TGFβ1牽涉於肌肉營養不良中。已發現LTBP4之變異體改變小鼠及人類中之疾病嚴重程度。在小鼠中，LTBP4之變異體在缺少肌肉萎縮蛋白或γ肌聚糖之小鼠中起保護作用(Coley, W.D.等人, Hum Mol Genet, 2016. 25(1): 第130-45頁; Heydemann, A.等人, J Clin Invest, 2009. 119(12): 第3703-12頁)。在人類中，兩組獨立地將LTBP4之變異體鑑別為在DMD中起保護作用，使步行能力損失延緩數年(Flanigan, K.M.等人, Ann Neurol, 2013. 73(4): 第481-8頁; van den Bergen, J.C.等人, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2015. 86(10): 第1060-5頁)。儘管小鼠及人類中之遺傳變異體的性質不同，但在兩種物種中保護性變異體均引起TGFβ信號傳遞減少(Heydemann, A.等人, J Clin Invest, 2009. 119(12): 第3703-12頁); Ceco, E.等人, Sci Transl Med, 2014. 6(259): 第259ra144頁)。已根據實驗推斷出TGFβ1在骨胳肌肉生物學中之許多功能，在該等實驗中，經純化活性生長因子注射至動物中或添加至培養物中之細胞(Massague, J.等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(21): 第8206-10頁; Li, Y.等人, Am J Pathol, 2004. 164(3): 第1007-19頁; Mendias, C.L.等人, Muscle Nerve, 2012. 45(1): 第55-9頁)。鑒於細胞情形對TGFβ1之特定功能的重要性(參見例如Hinck等人, Cold Spring Harb. Perspect. Biol, 2016. 8(12))，此等實驗中所觀測到之效應中之一些有可能並不反映活體內細胞介素之內源性作用。舉例而言，用重組TGFβ1、肌肉抑制素或GDF11治療人類真皮纖維母細胞引起此等細胞之基因表現的幾乎一致變化，儘管活體內此等蛋白質之作用非常不同(Tanner, J.W., Khalil, A., Hill, J., Franti, M., MacDonnell, S.M., Growth Differentiation Factor 11 Potentiates Myofibroblast Activation, 在Fibrosis: From Basic Mechanisms to Targeted therapies中. 2016: Keystone, CO)。
多名研究人員已使用TGFβ抑制劑來闡明活體內生長因子之作用。用泛TGFβ中和抗體1D11治療mdx小鼠顯然引起纖維化減少(藉由組織學及羥脯胺酸含量得出)、肌肉損害減少(減少之血清肌酸激酶及較大肌纖維密度)及肌肉功能改善(藉由體積描記法、經分離EDL肌肉之力產生及增加的前肢握力得出) (Nelson, C.A.等人, Am J Pathol, 2011. 178(6): 第2611-21頁; Andreetta, F.等人, J Neuroimmunol, 2006. 175(1-2): 第77-86頁; Gumucio, J.P.等人, J Appl Physiol (1985), 2013. 115(4): 第539-45頁)。另外，顯性陰性TGFβ II型受體之肌纖維特異性表現防止在心臟毒素傷害之後及δ肌聚糖-/-小鼠中之肌肉損害(Accornero, F.等人, Hum Mol Genet, 2014. 23(25): 第6903-15頁)。在骨胳肌肉中含量豐富且抑制TGFβ活性之蛋白聚糖飾膠原蛋白，在mdx小鼠中及在裂傷之後減少肌肉纖維化(Li, Y.等人, Mol Ther, 2007. 15(9): 第1616-22頁; Gosselin, L.E.等人, Muscle Nerve, 2004. 30(5): 第645-53頁)。具有TGFβ抑制活性之其他分子，諸如蘇拉明(suramin) (抗腫瘤劑)及氯沙坦(losartan) (血管收縮素受體阻斷劑)，已在損傷、馬凡氏症候群及肌肉萎縮症之小鼠模型中有效改善肌肉病理及減少纖維化(Spurney, C.F.等人, J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2011. 16(1): 第87-95頁; Taniguti, A.P.等人, Muscle Nerve, 2011. 43(1): 第82-7頁; Bedair, H.S.等人, Am J Sports Med, 2008. 36(8): 第1548-54頁; Cohn, R.D.等人, Nat Med, 2007. 13(2): 第204-10頁)。儘管上文所描述之所有治療劑確實抑制TGFβ1或其信號傳遞，但其中無一者對TGFβ1異構體具有特異性。舉例而言，1D11結合至TGFβ1、2及3異構體且對其進行抑制(Dasch, J.R.等人, J Immunol, 1989. 142(5): 第1536-41頁)。蘇拉明抑制除TGFβ1以外，多個生長因子結合至其受體之能力，包括PDGF、FGF及EGF (Hosang, M., J Cell Biochem, 1985. 29(3): 第265-73頁; Olivier, S.等人, Eur J Cancer, 1990. 26(8): 第867-71頁; Scher, H.I.及W.D. Heston, Cancer Treat Res, 1992. 59: 第131-51頁)。飾膠原蛋白亦藉由直接結合及經由上調肌肉抑制素抑制劑卵泡抑素兩者，抑制肌肉抑制素活性(Miura, T.等人, Biochem Biophys Res Commun, 2006. 340(2): 第675-80頁; Brandan, E., C. Cabello-Verrugio及C. Vial, Matrix Biol, 2008. 27(8): 第700-8頁; Zhu, J.等人, J Biol Chem, 2007. 282(35): 第25852-63頁)。氯沙坦經由其對腎素-血管收縮素-醛固酮系統之效應影響額外信號傳遞路徑，包括IGF-1/AKT/mTOR路徑(Burks, T.N.等人, Sci Transl Med, 2011. 3(82): 第82ra37頁; Sabharwal, R.及M.W. Chapleau, Exp Physiol, 2014. 99(4): 第627-31頁; McIntyre, M.等人, Pharmacol Ther, 1997. 74(2): 第181-94頁)。因此，所有此等療法抑制額外分子，其可促成該等療法之治療效果以及毒性。
考慮到TGFβ在肌肉內穩定、修復及再生中之假定作用，選擇性調節TGFβ1信號傳遞之藥劑，諸如本文所述之單株抗體，可諸如在慢性/遺傳性肌肉營養不良及急性肌肉損傷中對治療受損肌纖維有效，而不具有與迄今為止所開發之較廣泛作用之TGFβ抑制劑相關的毒性。
因此，本發明提供用於治療受損肌纖維之方法，其使用在活體內優先調節TGFβ效應之子集而非全部的藥劑。此類藥劑可選擇性調節TGFβ1信號傳遞(「異構體特異性調節」)。 慢性肌肉疾病中之肌肉纖維修復
本發明涵蓋藉由限制纖維化及促成肌肉形態及功能之正常化，改善DMD患者之肌肉品質及功能的方法。由於TGFβ1亦抑制肌生成，因此TGFβ1阻斷可促進營養不良的肌肉中之再生，添加另外的治療益處。TGFβ1抑制劑可與肌肉萎縮蛋白上調療法，諸如Exondys 51 (伊特普森(Eteplirsen))組合使用。鑒於TGFβ1抑制在肌肉萎縮症中之潛在治療益處，以下係至關重要的：(1)將TGFβ1之作用與TGFβ2及TGFβ3之作用進行區分，及(2)闡明在哪一分子情形下TGFβ1抑制將為最有益的。如上文所提及，泛TGFβ抑制劑已與顯著毒性相關，限制此等化合物之臨床用途(Anderton, M.J.等人, Toxicol Pathol, 2011. 39(6): 第916-24頁; Stauber, A.等人, Clinical Toxicology, 2014. 4(3): 第1-10頁)。不清楚哪種(些) TGFβ異構體造成此等毒性。所描述之毒性中之一些可歸因於免疫系統中的TGFβ1抑制。舉例而言，儘管1D11顯著降低隔膜中之纖維化水準，但治療亦使肌肉中CD4+及CD8+ T細胞之數目增加，表明在泛TGFβ抑制後增加之發炎性反應，其在長期治療之情況下可能不利(Andreetta, F.等人, J Neuroimmunol, 2006. 175(1-2): 第77-86頁)。實際上，自肌肉耗乏T細胞改善mdx小鼠之肌肉病理，表明T細胞介導之發炎性反應對營養不良的肌肉不利(Spencer, M.J.等人, Clin Immunol, 2001. 98(2): 第235-43頁)。1D11投與後T細胞數目之增加可能歸因於TGFβ1對調節T (Treg)細胞之影響。Treg經GARP在其細胞表面上呈遞TGFβ1，且TGFβ1自此複合物之釋放增強Treg抑制活性，由此限制T細胞介導之發炎(Wang, R.等人, Mol Biol Cell, 2012. 23(6): 第1129-39頁; Edwards, J.P., A.M. Thornton及E.M. Shevach, J Immunol, 2014. 193(6): 第2843-9頁; Nakamura, K.等人, J Immunol, 2004. 172(2): 第834-42頁; Nakamura, K., A. Kitani及W. Strober, J Exp Med, 2001. 194(5): 第629-44頁)。實際上，使用PC61抗體耗乏Treg導致mdx小鼠之隔膜中增加之發炎及肌肉損害，而擴增Treg數目及增強其活性減少肌肉損害(Villalta, S.A.等人, Sci Transl Med, 2014. 6(258): 第258ra142頁)。引起關注地，最近鑑別出免疫抑制T細胞之另外群體，Tr1細胞。此等細胞產生大量TGFβ3，其對該等細胞之抑制活性而言係必需的(Gagliani, N.等人, Nat Med, 2013. 19(6): 第739-46頁; Okamura, T.等人, Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(33): 第13974-9頁; Okamura, T.等人, Nat Commun, 2015. 6: 第6329頁)。儘管Tr1細胞在骨胳肌肉中之作用係未知的，但存在以下可能性：藉由1D11對TGFβ1及TGFβ3兩者進行抑制可藉由抑制Treg及Tr1細胞兩者，具有附加促發炎效應。
上文所描述之關於TGFβ1潛伏及活化之結構性洞察允許藥物發現之新穎方法，其特異性靶向TGFβ1之活化(Shi, M.等人, Nature, 2011. 474(7351): 第343-9頁)。在三種成熟TGFβ生長因子之間共有的高度序列一致性不由潛伏複合物共有，允許發現對前TGFβ1極具特異性之抗體。使用抗體發現之專用方法，本發明之發明人已鑑別出特異性結合至前TGFβ1之抗體(Ab1、Ab2及Ab3)。使用活體外共培養系統，展現出此等抗體抑制整合素介導之TGFβ1的釋放。在此系統中，來源於人類皮膚或小鼠骨骼肌肉之纖維母細胞為潛伏TGFβ1之來源，表現αVβ6之細胞株允許活性TGFβ1之釋放，其隨後使用表現SMAD2/3反應性螢光素酶報導體之第三細胞株來量測(圖 12 )。此等抗體中之一者，Ab1，已經活體內測試且顯示在腎臟纖維化之UUO (單側輸尿管阻塞)小鼠模型中的功效。在此模型中，用9 毫克/公斤/週Ab1治療小鼠(n=10)阻止TGFβ1反應性基因之上調，且降低損傷之後的纖維化程度(藉由天狼星紅(picrosirius red)染色)。與泛TGFβ抑制劑相比，TGFβ1特異性療法可具有改良功效及安全概況，其為將如在DMD群體中長期使用之治療劑的關鍵態樣。TGFβ1抑制性抗體可用於判定特異性TGFβ1抑制是否具有作為DMD或其他肌肉疾病之治療劑的潛力，及闡明TGFβ1在骨胳肌肉再生中之作用。 慢性肌纖維損傷對急性肌纖維損傷及最佳治療劑之選擇
在急性損傷(諸如對原本健康肌肉或運動神經元之創傷性損傷)之後，在正常但再生之肌肉中，咸信需要發炎性巨噬細胞之初始浸潤，以清除出受損組織且分泌衛星細胞活化所必需的因子(例如，細胞介素)。隨後，此等細胞切換至M2表型以驅動傷口消退。
相比之下，在慢性病狀(諸如包括DMD之疾病)中，促炎性巨噬細胞在所有時間占主導，且並未發生向M2之切換(或至少不足夠有效)，且促炎性巨噬細胞繼續驅動發炎及肌肉損害。在DMD中，NFkB路徑具有持久活性，導致組成性發炎。因此，在一些實施例中，可向DMD患者投與NFkB抑制劑以便減少慢性發炎。
因此，在諸如DMD之慢性病狀中，相對於肌肉再生，治療焦點可處於肌肉修復上。此係因為DMD肌纖維係有缺陷的而非損壞的，其由膜中之撕裂、鈣瞬變之調節異常及來自巨噬細胞之ROS損害而受損。相比而言，在對健康肌肉之損傷之情況下，治療焦點可處於再生上。舉例而言，在心臟毒素模型中，肌纖維被殺死且必須經再生。此模擬在創傷性損傷，諸如壓傷之後的恢復過程。
證據表明，LRRC33在巰乙酸鹽誘導之腹膜巨噬細胞中表現，該等巨噬細胞具有類M2表型(特徵為其表現高含量之精氨酸酶，無iNOS，及高含量之CD206)。
在LRRC33主要在M2細胞上表現，且其對TGFβ1之呈遞(「情形」)對此等細胞之促傷口癒合效應重要之情境中，活化LRRC33介導之TGFβ1以促進修復及/或肌生成可為有益的。另一方面，在LRRC33亦在促發炎M1細胞上表現之情境中，則鑒於尤其在營養不良之背景(諸如DMD)下，發炎驅動纖維化，抑制LRRC33介導之TGFβ1可為有益的。因此，鑑別疾病相關TGFβ1之來源/情形可為選擇TGFβ信號傳遞之合宜調節劑中之重要步驟，其將告知應考慮何種水準之選擇性(例如，異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1調節劑，或情形特異性TGFβ1調節劑；TGFβ1抑制劑或活化劑等)。
除慢性發炎之外，DMD之特點為過度且進行性纖維化。在晚期疾病中，纖維化如此嚴重以致其可實際上將個別肌纖維與肌纖維之血液供應分離。其亦改變肌肉之收縮特性。在人類患者中，在TGFβ1上調之程度與纖維化之間存在強相關度，且在纖維化程度與負面活動能力結果之間存在強關聯。因此，在一些實施例中，可向營養不良之患者投與LTBP-前TGFβ1抑制劑以便預防及/或減少纖維化，以選擇性靶向疾病中ECM締合之TGFβ1的效應。在一些實施例中，可採用本文所描述之各種異構體及/或情形選擇性藥劑以達成對TGFβ1信號傳遞之抑制，以預防纖維化且促進肌生成，而不具有對免疫系統之非所需影響(例如，經由GARP或LRRC33)。 涉及 MHC 下調或突變之病狀
TGFβ相關適應症亦可包括I類主要組織相容複合體(MHC)缺失或不足(例如，下調)之病狀。此類病狀包括MHC介導之信號傳遞之一或多種組分受損的遺傳病症，以及MHC表現由其他因素(諸如癌症、感染、纖維化及藥劑)改變之病狀。
舉例而言，腫瘤中之MHC I下調與腫瘤逃避免疫監視相關。實際上，免疫逃避策略旨在避免T細胞識別，包括腫瘤I類MHC表現之損失，通常在惡性細胞中發現。已觀測到腫瘤免疫逃避對癌症免疫療法，包括用阻斷免疫檢查點分子之抗體進行之治療的臨床結果具有負面影響(評述於例如：Garrido等人(2017) Curr Opin Immunol 39: 44-51. 「The urgent need to recover MHC class I in cancers for effective immunotherapy」，其以引用之方式併入本文中)。因此，由本發明涵蓋之異構體選擇性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可以單一療法形式或與另一療法(諸如檢查點抑制劑、化學療法、放射療法等)結合投與，以釋放或增強抗癌免疫，及/或增強對另一療法之反應性或另一療法之有效性。
I類MHC蛋白之下調亦與某些感染性疾病，包括諸如HIV之病毒感染相關。參見例如Cohen等人(1999) Immunity 10(6): 661-671. 「The selective downregulation of class I major histocompatibility complex proteins by HIV-1 protects HIV-infected cells from NK Cells」，其以引用之方式併入本文中。因此，由本發明涵蓋之異構體選擇性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑可以單一療法形式或與另一療法(諸如抗病毒療法、蛋白酶抑制劑療法等)結合投與，以釋放或增強抗癌免疫，及/或增強對另一療法之反應性或另一療法之有效性。 涉及幹細胞自體更新、組織再生及幹細胞再生之病狀
有證據表明，TGFβ1在調節多種幹細胞群之內穩定及其在組織中的分化/再生方面起一定作用。在內穩定期間，組織特異性幹細胞主要保持靜止，但在特定應激後觸發進入細胞循環。TGFβ1被認為在嚴格調節幹細胞分化及重建過程中充當「中斷物(break)」，且觸發進入細胞循環之應激與移除「中斷物」之TGFβ1抑制一致。因此，預期異構體選擇性TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之彼等抑制劑可用於偏移或校正細胞循環及幹細胞/祖細胞G0進入特定組織之決定。
因此，本發明之發明人考慮在以下條件下使用異構體選擇性TGFβ1抑制劑，其中：i)幹細胞/祖細胞分化/重建歸因於疾病而停止或擾亂或誘發為療法/介導之副作用；ii)患者處於導致健康細胞被殺死或耗竭之療法或介導中；iii)患者可受益於增加之幹細胞/母細胞分化/重建；iv)疾病與異常幹細胞分化或重建相關。
在自體更新組織，諸如骨髓(血細胞產生)及表皮中，增生及分化過程之間的平衡受嚴格調控以確保在生命期間對幹細胞群之維護。評述於D'Arcangel等人(2017) Int. J Mol Sci. 18(7): 1591.中。TGFβ1部分經由誘導週期蛋白依賴型激酶抑制因子p15/INK4b、p21及p57，充當細胞循環之強效負調節子及腫瘤抑制因子。證據表明，TGFβ1促成誘導p16/INK4a及p19/ARF以在某些細胞類型中介導生長遏止及老化。因此，在一些實施例中，高親和性異構體選擇性之TGFβ1活化抑制劑，諸如本文所述之彼等，用於在各種幹細胞群中調節p16/INK4a依賴性細胞老化及幹細胞動力學。
舉例而言，間葉細胞基質/幹細胞(MSC)為一小群存在於大多數成人結締組織，諸如骨髓、脂肪組織及臍帶血中的基質細胞。MSC在活體內維持呈相對靜止狀態，但對多種生理及病理性刺激起反應，能夠增殖隨後分化成骨母細胞、軟骨細胞、脂肪細胞或其他中胚層型譜系，如平滑肌細胞(SMC)及心肌細胞。多個信號傳遞網路協調MSC分化成功能性間葉細胞譜系，在該過程中TGF-β1成為主要參與者(例如由Zhao及Hantash(2011. Vitam Horm 87:127-41)綜述)。
同樣，終身血球製造需要造血幹細胞來防止耗竭，大部分造血幹細胞在穩態造血期間保持靜止。然而，在血液學應激期間，此等細胞快速募集於細胞循環中且經歷大規模自體更新及分化以滿足增加之造血需求。TGFβ1可充當「開關(switch)」來控制靜止-再殖轉化/平衡。
因此，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可用於涉及造血幹細胞缺陷及骨髓衰竭之病狀的治療中。在一些實施例中，造血幹細胞儲集物之耗竭或損傷會導致造血障礙或血液科惡性疾病。在一些實施例中，此類病狀為DNA修復病症，其特徵在於進行性骨髓衰竭。在一些實施例中，此類病狀係由幹細胞及祖細胞耗損引起。在一些實施例中，此類病狀係與貧血相關。在一些實施例中，此類病狀為范康尼氏貧血(Fanconi Anemia；FA)。在一些實施例中，此類病狀之特徵在於活性過高TGFβ路徑，其在DNA受損後抑制某些細胞類型之存活。因此，預期異構體選擇性TGFβ1抑制劑可用於在患有FA之個體中挽救FA造血幹細胞之增殖缺陷及/或骨髓衰竭。參見例如， zhang等人 (2016), Cell Stem Cell, 18: 668-681, 「TGF-β inhibition rescues hematopoietic stem cell defects and bone marrow failure in Fanconi Anemia」。 涉及治療誘發之造血調節異常的病狀
應認識到，經設計以治療多種疾病病狀之某些藥物通常會誘發或加重所治療患者中之貧血(例如，治療或藥物誘發之貧血，諸如化學療法誘發貧血及放射療法誘發貧血)。在一些實施例中，用骨髓抑制藥物治療患者，其可能會引起包括貧血之副作用。此類患者可受益於藥理學TGFβ1抑制以便增加造血。在一些實施例中，TGFβ1抑制劑可藉由防止進入靜態而促進患者中之造血。在一些實施例中，患者可接受G-CSF療法(例如，非格司亭(Filgrastim))。
因此，本發明包括異構體選擇性TGFβ1抑制劑，諸如本文所揭示之彼等抑制劑投與接收骨髓抑制療法(例如，具有包括骨髓抑制作用之副作用的療法)的患者的用途。骨髓抑制療法之實例包括(但不限於)：聚乙二醇化干擾素α-2a、干擾素α-n3、聚乙二醇化干擾素α-2b、阿地介白素、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、干擾素alfacon-1、利妥昔單抗(rituximab)、替伊莫單抗替克西坦(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗(tositumomab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、L-苯丙胺酸、硼替佐米、克拉屈濱(cladribine)、卡莫司汀(carmustine)、安吖啶、氯芥苯丁酸、雷替曲塞(raltitrexed)、絲裂黴素、貝瑟羅汀(bexarotene)、長春地辛、氟尿苷、硫鳥嘌呤、長春瑞濱(vinorelbine)、右雷佐生(dexrazoxane)、索拉非尼(sorafenib)、鏈脲黴素、吉西他濱(gemcitabine)、替尼泊甙(teniposide)、表柔比星(epirubicin)、氯黴素、來那度胺、六甲蜜胺(altretamine)、齊多夫定(zidovudine)、順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)、環磷醯胺、氟尿嘧啶、丙硫氧嘧啶(propylthiouracil)、噴司他汀(pentostatin)、甲胺喋呤(methotrexate)、卡馬西平(carbamazepine)、長春鹼、利奈唑胺(linezolid)、伊馬替尼(imatinib)、氯法拉濱(clofarabine)、培美曲塞(pemetrexed)、道諾黴素(daunorubicin)、伊立替康(irinotecan)、甲巰基咪唑、依託泊苷(etoposide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、二氯甲基二乙胺、阿紮胞苷(azacitidine)、卡鉑、放線菌素D、阿糖胞苷、小紅莓、羥基脲、白消安(busulfan)、拓朴替康(topotecan)、巰基嘌呤、沙立度胺、美法侖(melphalan)、氟達拉濱(fludarabine)、氟胞嘧啶(flucytosine)、卡培他濱(capecitabine)、丙卡巴肼(procarbazine)、三氧化二砷、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺、米托蒽醌(mitoxantrone)、洛莫司汀(lomustine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、達沙替尼(dasatinib)、地西他濱(decitabine)、奈拉濱(nelarabine)、依維莫司(everolimus)、伏立諾他(vorinostat)、噻替派(thiotepa)、伊沙匹隆(ixabepilone)、尼羅替尼(nilotinib)、貝林諾他(belinostat)、曲貝替定(trabectedin)、曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)、替西羅莫司(temsirolimus)、伯舒替尼(bosutinib)、苯達莫司汀(bendamustine)、卡巴他賽(cabazitaxel)、艾日布林(eribulin)、盧佐替尼(ruxolitinib)、卡非佐米、托法替尼(tofacitinib)、普納替尼(ponatinib)、泊利度胺(pomalidomide)、奧比珠單抗(obinutuzumab)、特地唑胺磷酸鹽(tedizolid phosphate)、布林莫單抗(blinatumomab)、依魯替尼(ibrutinib)、帕博希布(palbociclib)、奧拉帕尼(olaparib)、迪奴圖單抗(dinutuximab)及秋水仙鹼。
額外TGFβ相關適應症可包括美國公開案第2013/0122007號、美國專利第8,415,459號或國際公開案第WO 2011/151432號中所揭示之彼等適應症中之任一者，該等專利中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。
在較佳實施例中，本發明之抗體、其抗原結合部分及組合物可用於治療與TGFβ1信號傳遞相關的多種疾病、病症及/或病狀。在一些實施例中，目標組織/細胞相對於另一異構體優先表現TGFβ1異構體。因此，本發明包括使用包含本文中所述之抗體或其抗原結合部分的醫藥組合物來治療與TGFβ1表現(例如，TGFβ1信號傳遞調節異常及/或TGFβ1表現上調)相關之此類病狀的方法。
在一些實施例中，疾病涉及與多種細胞來源相關(例如，存在於其上或自其沈積)之TGFβ1。在一些實施例中，此類疾病涉及TGFβ1功能之免疫組分及ECM組分。在一些實施例中，此類疾病涉及：i) ECM之調節異常(例如，ECM組分，諸如膠原蛋白及蛋白酶之過度產生/沈積；ECM基質之僵硬變化；諸如肌纖維母細胞、纖維細胞及CAF之纖維母細胞的異常或病理性活化或分化)；ii) Treg增加及/或抑制之效應T細胞(Teff)所致之免疫抑制，例如Treg/Teff比率升高；引起CD4及/或CD8 T細胞之抑制的增加之白血球浸潤(例如，巨噬細胞及MDSC)；及/或iii)骨髓細胞之異常或病理性活化、分化及/或募集，諸如巨噬細胞(例如，骨髓衍生單核球性/巨噬細胞及組織駐留巨噬細胞)、單核球、骨髓衍生抑制細胞(MDSC)、嗜中性白血球、樹突狀細胞及NK細胞。
在一些實施例中，病狀涉及藉由多於一種類型之呈遞分子(例如，以下中之兩者或更多者：GARP、LRRC33、LTBP1及/或LTBP3)呈遞之TGFβ1。在一些實施例中，受影響組織/器官/細胞包括來自多個細胞來源之TGFβ1。僅給出一個實例，實體腫瘤(其亦可包括涉及骨髓之增生性疾病，例如骨髓纖維化及多發性骨髓瘤)可包括來自多個來源之TGFβ1，諸如癌細胞、基質細胞、周圍健康細胞及/或浸潤免疫細胞(例如，CD45+白血球)，其涉及不同類型之呈遞分子。相關免疫細胞包括(但不限於)骨髓細胞及淋巴細胞，舉例而言，嗜中性白血球、嗜伊紅血球、嗜鹼性血球、淋巴細胞(例如，B細胞、T細胞及NK細胞)及單核球。非情形依賴性TGFβ1抑制劑可能適用於治療此類病狀。
可經異構體特異性非情形依賴性之TGFβ1抑制劑，諸如本文所述之抗體或其片段治療之病狀或病症的非限制性實例提供於下文中。治療方案、投藥
為實施本文所揭示之方法，有效量之上文所述之醫藥組合物可經由適合途徑(諸如靜脈內投藥(例如快速注射或連續輸注一段時間)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、吸入或表面途徑)投與需要治療之個體(例如人類)。包括噴嘴式噴霧器及超音波噴霧器之供液體調配物用之市售噴霧器適用於投與。液體調配物可直接霧化，且凍乾粉末可在復原後霧化。或者，特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體或其抗原結合部分可使用碳氟化合物調配物及定劑量吸入器氣溶膠化或以凍乾及研磨粉形式吸入。
藉由本文所述之方法治療的個體可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括(但不限於)農畜、運動型動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。需要治療之人類個體可為患有TGFβ相關適應症，諸如上述彼等適應症、處於其風險下或疑似患有其之人類患者。患有TGFβ相關適應症之個體可藉由常規醫學檢查，例如實驗室測試、器官功能測試、CT掃描或超音波來鑑別。疑似患有此類適應症中之任一者的個體可顯示該適應症之一或多種症狀。處於適應症風險下之個體可為具有適應症之風險因素中之一或多者的個體。
如本文所用，術語「有效量」及「有效劑量」係指足以滿足其預期一或多個目的，亦即可接受效益/風險比下的組織或個體中的所需生物或醫學反應的化合物或組合物之任何量或劑量。舉例而言，在本發明之某些實施例中預期目的可為抑制TGFβ-1活體內活化，達成與TGFβ-1抑制相關的有臨床意義的結果。如熟習此項技術者所認知，有效量可有所變化，其視以下而定：所治療之特定病狀、病狀嚴重程度、個體患者參數(包括年齡、身體狀況、體型、性別及體重)、治療持續時間、並行療法(若存在)之性質、特定投藥途徑，及健康從業者之知識及專長範圍內的類似因素。此等因素已為一般技術者熟知且可僅用常規實驗便可解決。通常較佳使用個別組分或其組合之最大劑量，亦即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。然而一般技術者應瞭解，患者因醫療原因、心理原因或實際上任何其他原因可堅持較低劑量或可耐受劑量。
經驗考慮因素，諸如半衰期一般將促進劑量之測定。舉例而言，與人類免疫系統相容之抗體，諸如人類化抗體或完全人類抗體可用於延長抗體半衰期且防止抗體受宿主之免疫系統攻擊。投藥頻率可加以確定且在治療過程中加以調整，且通常(但不一定)基於TGFβ相關適應症之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲。或者，特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體的持久連續釋放調配物可為合適的。用於達成持續釋放之多種調配物及裝置對熟習此項技術者將為顯而易知的且在本發明之範疇內。
在一個實例中，如本文所述抗體之劑量用於已給與一或多次抗體投藥之個體的劑量可憑經驗確定。給與個體遞增劑量之拮抗劑。為評定功效，可根據TGFβ相關適應症之指示物。舉例而言，用於量測肌纖維損傷、肌纖維修復、肌肉中發炎程度及/或肌肉中纖維化程度的方法對一般熟習此項技術者為熟知的。
本發明涵蓋以下認識，當用作藥劑時，能夠以異構體特異性方式調節TGFβ之活化級的藥劑可提供經改善之安全概況。因此，本發明包括抗體和其抗原結合片段，其特異性結合TGFβ1，而非TGFβ2或TGFβ3且抑制其活化，藉此賦予TGFβ1活體內信號傳遞之特異性抑制，同時將不合需要之副作用降至最低以避免影響TGFβ2及/或TGFβ3信號傳遞。
在一些實施例中，當向個體投與時，如本文所述之抗體或其抗原結合部分沒有毒性。在一些實施例中，當向個體投與時，相較於特異性結合至TGFβ1及TGFβ2兩者之抗體，如本文所述之抗體或其抗原結合部分展現降低之毒性。在一些實施例中，當向個體投與時，相較於特異性結合至TGFβ1及TGFβ3兩者之抗體，如本文所述之抗體或其抗原結合部分展現降低之毒性。在一些實施例中，當向個體投與時，相較於特異性結合至TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3之抗體，如本文所述之抗體或其抗原結合部分展現降低之毒性。
通常，對於本文中所述之抗體中之任一者之投藥，初始候選劑量可為每次投藥(例如每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次等)約1至20 mg/kg。舉例而言，患者可每1週、每2週、每3週或每4週等接受約1至10 mg/kg之注射液，其呈有效地治療疾病(例如，癌症)之量，其中量得到良好耐受(在可接受毒性或不良事件內)。
出於本發明目的，典型劑量(每次投藥，諸如注射及輸注)可在約0.1 mg/kg至30 mg/kg範圍內，其視上述因素而定。對於歷經數天或更長時間之重複投藥，視病狀而定，持續治療直至出現所需症狀抑制或直至達成足夠治療量以緩解TGFβ相關適應症或其症狀。舉例而言，適用於Ab6之有效劑量可在1 mg/kg與30 mg/kg之間(例如，1至10 mg/kg、1至15 mg/kg、3至20 mg/kg、5至30 mg/kg等)，一週投配兩次、一週投配一次、每兩週投配、每4週投配或一月投配一次。適用於Ab6之有效劑量包括約1 mg/kg、約3 mg/kg、約5 mg/kg、約10 mg/kg，例如每週投配一次。
例示性給藥方案包含投與初始劑量，繼之以一或多個維持劑量。舉例而言，初始劑量可在約1與30 mg/kg之間，例如一週一次或一週兩次。其後，維持劑量可遵循例如在約0.1與20 mg/kg之間，例如一週一次、每隔一週、一月一次等。然而，其他劑量方案亦可能適用，視醫師希望達成之藥物動力學衰變模式而定。藥物動力學實驗已顯示，本文所揭示之抗體(例如，Ab3)之血清濃度在向臨床前動物模型(例如，小鼠模型)投與之後保持穩定持續至少7天。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，此投藥後穩定性可為有利的，因為抗體可能以更低頻率投與，同時維持抗體所投與之個體(例如，人類個體)中之臨床上有效的血清濃度。在一些實施例中，給藥頻率為每週、每2週、每4週、每5週、每6週、每7週、每8週、每9週或每10週一次；或每月、每2個月或每3個月或更長時間一次。此療法之進程易於藉由習知技術及分析來監測。給藥方案(包括所用抗體)可隨時間改變。
在一些實施例中，對於正常體重之成人患者而言，可投與介於約0.3至5.00 mg/kg範圍內之劑量。特定給藥方案，例如劑量、時間安排及重複，將視特定個體及個體病史，以及個別藥劑之特性(諸如藥劑之半衰期及其他相關考慮因素)而定。
出於本發明之目的，特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體的適當劑量將取決於所採用之特異性抗體(或其組合物)、適應症之類型及嚴重程度、抗體係出於預防目的抑或治療目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對拮抗劑之反應及主治醫師的判斷。在一些實施例中，臨床醫師將投與特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體，直至到達達成所要結果之劑量。特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體的投與可為連續性或間歇性的，取決於例如接受者之生理條件、投與之目的為治療性抑或預防性的及熟練醫師已知的其他因素。特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體的投與可在預選定時段內基本上連續，或可呈一系列間隔劑量形式，例如，在罹患TGFβ相關適應症之前、期間或之後。
如本文所用，術語「治療」係指向患有TGFβ相關適應症、該適應症之症狀或適應症之傾向性的個體施加或投與包括一或多個活性劑之組合物，以便治癒、癒合、緩解、降低、改變、補救、減輕、改善或影響該適應症、該適應症之症狀或適應症之傾向性。
用特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體緩解TGFβ相關適應症包括延緩該適應症之發展或進展，或降低適應症之嚴重程度。緩解該適應症未必需要治癒性結果。如其中所用，「延遲」與TGFβ相關適應症相關的適應症之發展意謂推遲、阻止、減緩、延緩、穩定或推遲該適應症之進展。此延遲可具有不同時間長度，視所治療適應症及/或個體之病史而定。「延遲」或緩解適應症發展或延遲適應症發作的方法為，與不使用該方法相比，在指定時間範圍內使出現適應症之一或多種症狀的機率降低及/或在指定時間範圍內降低症狀程度的方法。此類比較通常係基於臨床研究，使用足以產生統計學上顯著之結果的多名個體。
DBA2/J小鼠在LTBP4對偶基因中具有40 bp缺失。與潛伏TGFb1相關聯之ECM的調節異常可暴露與Ab1結合之抗原決定基。可存在與Ab1結合之抗原決定基變得暴露之疾病，且若指定TGFb1抑制，則彼等疾病可為Ab1之治療機會。組合療法
本發明進一步涵蓋用作治療可受益於TGFβ活體內抑制之個體的組合療法的醫藥組合物及相關方法。在此等實施例中之任一者中，此類個體可接收組合療法，其包括包含至少一種TGFβ抑制劑，例如本文中所述之抗體或其抗原結合部分的第一組合物；以及包含至少一種意欲治療相同或重疊疾病或臨床病狀的額外治療劑的第二組合物。第一及第二組合物可均對相同細胞目標或對離散細胞目標起作用。在一些實施例中，第一及第二組合物可治療或緩解相同或重疊疾病或臨床病狀之症狀或態樣組。在一些實施例中，第一及第二組合物可可治療或緩解單獨的疾病或臨床病狀之症狀或態樣組。僅給出一個實例，第一組合物可治療與TGFβ信號傳遞相關之疾病或病狀，而第二組合物可治療與同一疾病相關之發炎或纖維化等。此類組合療法可結合彼此投與。在組合療法之情形下，片語「結合」意謂在接受組合療法之個體中，第一療法之治療作用暫時及/或在空間上與第二療法之治療作用重疊。因此，組合療法可調配為用於療法之同時投與之單一調配物或用於療法之連續投與的獨立調配物。
在較佳實施例中，組合療法在疾病治療中產生協同效應。術語「協同」係指總體上大於各單一療法之累加效應(例如，較高功效)的效應。
在一些實施例中，包含本文中所述之醫藥組合物的組合療法產生總體上等效於由另一療法(諸如第二藥劑之單一療法)產生之功效，但相較於第二藥劑之單一療法，伴隨有較少與第二藥劑相關的不合需要之不良作用或較少嚴重毒性的功效。在一些實施例中，此類組合療法容許較低劑量之第二藥劑但維持總體功效。此類組合療法可尤其適用於確定進行長期治療及/或涉及小兒患者之患者群。
因此，本發明提供供用於減少TGFβ1蛋白活化且治療或預防與TGFβ1信號傳遞相關之疾病或病狀的組合療法中的醫藥組合物及方法，如本文所述。因此，方法或醫藥組合物進一步包含第二治療劑。在一些實施例中，第二治療劑可適用於治療或預防與TGFβ1信號傳遞相關之疾病或病狀。第二治療劑可減輕或治療與靶向疾病相關之至少一種症狀。第一及第二治療劑可藉由相似或不相關作用機制發揮其生物效應；或第一及第二治療劑中之任一者或兩者可藉由多重作用機制發揮其生物效應。
應理解，本文中所述之醫藥組合物可具有處於同一醫藥學上可接受之載劑中或針對各所述實施例的不同的醫藥學上可接受之載劑中的第一及第二治療劑。應進一步理解，在所述實施例中，第一及第二治療劑可同時或依次投與。
本發明之一或多種抗TGFβ抗體或其抗原結合部分可與額外治療劑中之一或多者組合使用。可與本發明之抗TGFβ抗體一起使用的額外治療劑之實例包括(但不限於)：癌症疫苗；經工程改造之免疫細胞療法；化學療法；放射療法；TGFβ超家族之成員之調節劑，諸如肌肉抑制素抑制劑及GDF11抑制劑；VEGF促效劑；IGF1促效劑；FXR促效劑；CCR2抑制劑；CCR5抑制劑；雙重CCR2/CCR5抑制劑；CCR4抑制劑，類離胺醯氧化酶2抑制劑；ASK1抑制劑；乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑；p38激酶抑制劑；吡非尼酮(Pirfenidone)；尼達尼布(Nintedanib)；M-CSF抑制劑(例如，M-CSF受體拮抗劑及M-CSF中和劑)；MAPK抑制劑(例如，Erk抑制劑)、免疫檢查點促效劑或拮抗劑；IL-11拮抗劑；及IL-6拮抗劑；及其類似者。可與TGFβ抑制劑一起使用之額外治療劑之其他實例包括(但不限於)吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、Ser/Thr激酶抑制劑、雙重特異性激酶抑制劑。在一些實施例中，此類藥劑可為PI3K抑制劑、PKC抑制劑或JAK抑制劑。
在一些實施例中，額外藥劑為檢查點抑制劑。在一些實施例中，額外藥劑係選自由以下組成之群：PD-1拮抗劑、PDL1拮抗劑、PD-L1或PDL2融合蛋白、CTLA4拮抗劑、GITR促效劑、抗ICOS抗體、抗ICOSL抗體、抗B7H3抗體、抗B7H4抗體、抗TIM3抗體、抗LAG3抗體、抗OX40抗體(OX40促效劑)、抗CD27抗體、抗CD70抗體、抗CD47抗體、抗41BB抗體、抗PD-1抗體、溶瘤病毒及PARP抑制劑。在一些實施例中，本文所揭示的高親和性、非情形依賴性之TGFβ1活化抑制劑用於為檢查點抑制療法之較差反應者或無反應者的個體中之癌症(諸如本文中所列出之彼等者)的治療中。
在一些實施例中，額外藥劑結合T細胞共刺激分子，諸如抑制性共刺激分子及活化共刺激分子。在一些實施例中，額外藥劑係選自由以下組成之群：抗CD40抗體、抗CD38抗體、抗KIR抗體、抗CD33抗體、抗CD137抗體及抗CD74抗體。
在一些實施例中，額外療法為放射。在一些實施例中，額外藥劑為化學治療劑。在一些實施例中，化學治療劑為紫杉醇(Taxol)。在一些實施例中，額外藥劑為消炎劑。在一些實施例中，額外藥劑抑制單核球/巨噬細胞募集及/或組織浸潤之過程。在一些實施例中，額外藥劑為肝星狀細胞活化之抑制劑。在一些實施例中，額外藥劑為趨化細胞素受體拮抗劑，例如CCR2拮抗劑及CCR5拮抗劑。在一些實施例中，此類趨化細胞素受體拮抗劑為雙重特異性拮抗劑，諸如CCR2/CCR5拮抗劑。待以組合療法形式投與之額外藥劑為或包含生長因子之TGFβ超家族之成員或其調控劑。在一些實施例中，此類藥劑係選自GDF8/肌肉抑制素及GDF11之調節劑(例如，抑制劑及活化劑)。在一些實施例中，此類藥劑為GDF8/肌肉抑制素信號傳遞之抑制劑。在一些實施例中，此類藥劑為特異性結合前肌肉抑制素/潛伏肌肉抑制素複合物且阻斷肌肉抑制素之活化的單株抗體。在一些實施例中，特異性結合前肌肉抑制素/潛伏肌肉抑制素複合物且阻斷肌肉抑制素之活化的單株抗體不結合游離成熟肌肉抑制素。
在一些實施例中，額外療法包含細胞療法，諸如CAR-T療法。
在一些實施例中，額外療法為癌症疫苗。測試基於肽之癌症疫苗的多種臨床試驗具有經靶向之血液惡性病(血液癌症)、黑素瘤(皮膚癌)、乳癌、頭頸癌、胃食道癌、肺癌、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌及結腸直腸癌。抗原包括來自HER2、端粒酶(TERT)、存活素(BIRC5)及威爾姆斯氏腫瘤1 (Wilms' tumor 1；WT1)之肽。若干試驗亦使用12至15種不同肽之「個性化」混合物。亦即，其含有來自患者之腫瘤的肽之混合物，該患者針對該腫瘤展現免疫反應。一些試驗靶向實體腫瘤、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤、黑素瘤、及乳癌、頸椎癌、卵巢癌、結腸直腸癌及非小肺細胞癌，且包括來自MUC1、IDO1 (吲哚胺2,3-雙加氧酶)、CTAG1B及兩種VEGF受體(FLT1及KDR)的抗原。值得注意地，在患有黑素瘤之患者中與免疫檢查點抑制劑伊匹單抗及BRAF(基因)抑制劑維羅非尼(vemurafenib)組合來測試IDO1疫苗。
適用作癌症疫苗的腫瘤抗原之非限制性實例包括：NY-ESO-1、HER2、HPV16 E7 (乳頭瘤病毒(Papillomaviridae) #E7)、癌胚抗原(CEA)、WT1、MART-1、gp100、酪胺酸酶、URLC10、VEGFR1、VEGFR2、存活抗原(surviving)、MUC1及MUC2。
然而，藉由此類癌症疫苗預致敏之活化免疫細胞可在某種程度上經由TGFβ1依賴性機制自TME排除。為了克服免疫抑制，可考慮使用本發明之高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑以釋放疫苗之潛力。
本文中所涵蓋之組合療法可有利地利用較低之所投與之治療劑的劑量，從而避免與各種單藥療法相關之可能的毒性或併發症。在一些實施例中，使用本文中所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑可使得對療法(例如，標準照護療法)反應不佳或無反應之彼等者較具反應性。在一些實施例中，使用本文中所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑可允許降低之療法(例如，標準照護療法)劑量，其仍在患者中產生等效臨床功效，但產生較低或較小程度之藥物相關毒性或不良事件。
在一些實施例中，本文所涵蓋之異構體選擇性TGFβ1抑制劑可與異構體選擇性TGFβ3抑制劑結合使用(例如，組合療法、附加療法等)。此類使用可進一步包含額外療法，諸如癌症療法，例如免疫檢查點抑制劑、癌症疫苗、放射療法及/或化學療法。
在一些實施例中，本文所涵蓋之異構體選擇性TGFβ1抑制劑可與肌肉抑制素(GDF8)之選擇性抑制劑結合使用(例如，組合療法、附加療法等)。診斷、患者選擇、監測
傳統上活檢為用於診斷及監測多種疾病，諸如纖維化(例如，器官纖維化)及增生性病症(例如，癌症)之標準。然而，已知活檢具有併發情況。舉例而言，除了侵襲性之外，活檢體亦受觀測者內及觀測者外變化影響，且易於出現取樣誤差及程序相關併發情況。因此，較少侵襲性，較不易於出錯之替代方案可為較佳的。舉例而言，多種無創活體內成像技術可用於診斷、監測及選擇治療患者。因此，本發明包括使用活體內成像技術診斷及/或監測患者或個體之疾病。在一些實施例中，患者或個體接受如本文所述之異構體特異性TGFβ1抑制劑。在其他實施例中，活體內成像技術可用於選擇用異構體特異性TGFβ1抑制劑進行之處理的患者。
用於診斷及監測患者之例示性活體內成像技術包括(但不限於)X射線放射照相術、磁共振成像(MRI)、醫學超音波檢查術或超音波、內窺鏡檢查、彈性成像、觸覺成像、熱成像、醫學攝影術。其他成像技術包括核子醫學功能成像，例如正電子發射斷層攝影術(PET)及單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)。通常，此等活體內成像技術藉由無創手段產生資料。舉例而言，在醫學超音波檢查術之情況下，超音波壓力波及回波用於顯示內部結構。在投影放射照相術之情況下，使用X射線放射來產生影像，該X射線輻射以不同速率經不同組織類型，諸如骨、肌肉及脂肪吸收。用於進行此等技術及分析結果之方法為此項技術中已知的。
常用於診斷及監測纖維化之無創成像技術包括(但不限於)：超音波(例如，習知或超音顯影超音波)、超音波彈性成像(例如，瞬時彈性成像、點剪切波彈性成像及2D剪切波彈性成像)、CT掃描(例如，習知CT或CT灌注成像)、磁共振成像(MRI) (例如，習知MRI、磁共振彈性成像、擴散加權磁共振成像、釓塞酸二鈉及磁共振灌注成像)。
在一些實施例中，使用無創成像技術來評定肝纖維化或肝脂肪變性之程度。舉例而言，尤其適用於評定肝纖維化之成像技術可包括(但不限於)：肝纖維化掃描(瞬時彈性成像；TE)、點剪切波彈性成像(pSWE；亦稱為聲輻射力脈衝(ARFI))、2D-3D SWE、磁共振彈性成像(MRE)及多參數MRI。尤其適用於評定肝脂肪變性之成像技術可包括(但不限於)：超音波檢查術、受控衰減參數(CAP)彈性成像、經MRI評估之質子密度脂肪分數(MRI-estimated proton density fat fraction；MRI-PDFF)及磁共振光譜分析(MRS)。在一些實施例中，活體內成像技術用於評定肝硬化。在一些實施例中，活體內成像技術用於偵測及評定肝內三酸甘油酯量。在一些實施例中，活體內成像技術用於評定肝臟表面結節 (LSN；亦稱為「肝臟評分」)、肝硬化及/或肝段體積比(LSVR)，其在肝纖維化之分期及分期肝硬化中均為有利的。用於進行此等技術及分析結果之方法為此項技術中已知的。
常用於診斷及監測癌症之無創成像技術包括(但不限於)：磁共振成像(MRI)、電腦斷層攝影術(CT)、超音波、正電子發射斷層攝影術(PET)、單光子發射電腦斷層攝影術(SPECT)、螢光反射成像(FRI)及螢光介導之斷層攝影術(FMT)。亦可使用混合成像平台來診斷及監測癌症。舉例而言，混合成像平台包括(但不限於)：PET-CT、FMT-CT、FMT-MRI及PET-MRI。動態顯影增強MRI (DCE-MRI)為常用於偵測乳癌之另一成像技術。用於進行此等技術及分析結果之方法為此項技術中已知的。
近年來，正在研發將允許活體內偵測相關細胞(例如，細胞毒性T細胞、巨噬細胞及癌細胞)的無創成像方法。參見例如，www.imaginab.com/technology/；Tavare等人 (2014) PNAS, 111(3): 1108-1113；Tavare等人 (2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264；Rashidian等人 (2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255；Beckford Vera等人 (2018) PLoS ONE 13(3): e0193832；及Tavare等人 (2015) Cancer Res 76(1): 73-82，其中之每一者以引用之方式併入本文中。預期可使用相似技術來診斷及監測其他疾病，例如纖維化。通常，可將經工程改造有偵測部分(例如，放射性標記)之抗體或類抗體分子輸注於患者中，其隨後將分佈且定位至特定標記物(例如CD8+)之位點。
可出於以下目的在多種適合方法中應用無創活體內成像技術：診斷患者；選擇或鑑別有可能受益於TGFβ1抑制劑療法之患者；及/或監測患者治療後之治療反應。具有已知細胞表面標記物之任何細胞可藉助於採用特異性結合至該細胞標記物之抗體或相似分子來偵測/定位。通常，藉由使用此類技術偵測之細胞為免疫細胞，諸如細胞毒性T淋巴球、調節T細胞、MDSC、腫瘤相關巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞及嗜中性白血球。然而，預期此類技術亦可用於偵測及監測纖維化相關細胞標記物，例如巨噬細胞(駐留或浸潤)及/或肌纖維母細胞。識別此類標記物的抗體或經工程改造之類抗體分子可偶合至偵測部分。
適合免疫細胞標記物之非限制性實例包括單核球標記物、巨噬細胞標記物(例如，M1及/或M2巨噬細胞標記物)、CTL標記物、抑制免疫細胞標記物、MDSC標記物(例如，G-MDSC及/或M-MDSC之標記物)，其包括(但不限於)：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD206、CD68、CD14、CD15、CD66、CD34、CD25及CD47。
上文所描述之活體內成像技術可用於偵測、定位及/或追蹤診斷患有TGFβ1相關疾病(諸如癌症及纖維化)之患者體內的某些MDSC。健康個體在循環中不會出現或較少出現MDSC。伴隨此類疾病發作或進展，可偵測到升高之循環水準及/或疾病相關MDSC量。舉例而言，已報導CCR2陽性M-MDSC積聚至發炎組織且可引起組織中纖維化(諸如肺纖維化)之進展，且此顯示與TGFβ1表現相關。同樣，MDSC富集於多種實體腫瘤(包括三陰性乳癌)中，且部分程度上促成TME之免疫抑制表型。因此，對根據本發明之TGFβ1抑制療法的治療反應可藉由定位或追蹤MDSC來監測。可偵測之MDSC的減少或較少出現通常指示治療益處或較好預後。
已知相較於健康對照，多種人類癌症會引起患者中MDSC量升高(例如Elliott等人(2017) 「Human tumor-infiltrating myeloid cells: phenotypic and functional diversity」 Frontiers in Immunology, 第8卷, 章節86所綜述)。此等人類癌症包括(但不限於)：膀胱癌、結腸直腸癌、前列腺癌、乳癌、神經膠母細胞瘤、肝細胞癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌、黑素瘤、NSCL、卵巢癌、胰臟癌及腎細胞癌。升高之MDSC量可在生物樣品，諸如外周血單核細胞(PBMC)及組織樣品(例如，腫瘤活檢體)中偵測。舉例而言，MDSC之數目的出現率或變化可使用適合細胞表面標記物(表型)量測為：總PBMC之百分比(%)、CD14+細胞之百分比(%)、CD45+細胞之百分比(%)、單核細胞之百分比(%)、總細胞之百分比(%)、CD11b+細胞之百分比(%)、單核球之百分比(%)、非淋巴球性MNC之百分比(%)、KLA-DR細胞之百分比(%)。
若腫瘤判定為具有免疫排除表型，則單獨的癌症療法(諸如CBT)可能並不有效，因為腫瘤在腫瘤環境中缺乏足夠的細胞毒性細胞。因此，使用TGFβ1抑制劑，諸如本文中所述之抑制劑的附加療法可降低免疫抑制，藉此使得抗癌症療法腫瘤對癌症療法較具反應。預期在纖維性情形下，亦可使用免疫標記物來追蹤免疫細胞，及/或判定纖維性組織之免疫細胞組成(例如，以追蹤巨噬細胞及/或肌纖維母細胞之存在)。另外，在癌症之情況下，使用免疫細胞標記物可判定腫瘤是否具有免疫排除表型。
因此，本發明亦包括一種用於治療TGFβ1相關之疾病或病狀之方法，其可包含以下步驟：i)選擇診斷患有TGFβ1相關之疾病或病狀的患者；及ii)以有效治療該疾病或病狀之量向患者投與本文中所涵蓋之抗體或片段。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含偵測疾病標記物(例如，如本文所述之纖維化或癌症標記物)，其中視情況地，該偵測包含活檢分析、血清標記分析及/或活體內成像。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含如本文所述之活體內成像技術。
在一些實施例中，TGFβ1相關之疾病或病狀為纖維性病狀。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含偵測肌纖維母細胞或其一或多個標記物。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含偵測肝脂肪變性、肝三酸甘油酯、免疫細胞及/或肌纖維母細胞。在一些實施例中，偵測包含活檢分析、血清標記分析及/或活體內成像。在一些實施例中，活體內成像包含超音波、超音波彈性成像、CT掃描、MRI、PET-SPECT、光學螢光/生物發光肝纖維化掃描(TE)、pSWE、2D-3D SWE、MRE、超音波檢查術、CAP、MRI-PDFF及/或MRS。在一些實施例中，活體內成像包含直接或間接標記免疫細胞或結合免疫細胞之細胞表面標記物之抗體。在一些實施例中，活體內成像包含使用追蹤劑。
在一些實施例中，活體內成像技術量測肝脂肪變性、肝三酸甘油酯、免疫細胞(例如，如下文所述)及/或肌纖維母細胞。在一些實施例中，治療降低患病組織中的三酸甘油酯、脂肪變性、肝臟表面結節、發炎及/或巨噬細胞。在一些實施例中，治療將肝內三酸甘油酯含量降低至≤ 5.5%。在一些實施例中，治療減少患病組織中的MDSC。在一些實施例中，治療減少患病組織中的巨噬細胞。在一些實施例中，有效量為0.1 mg/kg至30 mg/kg，視情況3 mg/kg至30 mg/kg。在一些實施例中，該方法進一步包含監測個體之如本文所述之治療反應(例如，降低三酸甘油酯、減少脂肪變性、減少肝臟表面結節、減少發炎、減少巨噬細胞及/或降低肝臟評分)。
本發明亦包括一種治療癌症之方法，其可包含以下步驟：i)選擇診斷患有包含實體腫瘤之癌症的患者，其中實體腫瘤為或疑似為免疫排除腫瘤；及ii)以有效治療該癌症之量向患者投與本文中所涵蓋之抗體或片段。較佳地，患者已接受癌症療法，或為接受癌症療法之候選者，該癌症療法諸如免疫檢查點抑制療法(例如，PD-(L)1抗體)、化學療法、放射療法、經工程改造之免疫細胞療法及癌症疫苗療法。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含偵測免疫細胞或其一或多個標記物，其中視情況地，偵測包含腫瘤活檢分析、血清標記物分析及/或活體內成像。在一些實施例中，選擇步驟(i)包含如此處所述之活體內成像技術。在一些實施例中，該方法進一步包含監測如本文所述之治療反應。
在一些實施例中，進行活體內成像以監測個體中對TGFβ1抑制療法之治療反應。活體內成像可包含本文中所述之成像技術中之任一者，且量測本文中所述之標記物及/或參數中之任一者。舉例而言，在肝纖維化之情況下，治療反應可包含減少肝脂肪變性、降低三酸甘油酯含量、減少ECM沈積/纖維化、減少肝硬化及/或減少疾病進展。在一些實施例中，如藉由MRI所量測，用如本文所述之異構體特異性TGFB1抑制劑治療會將肝內三酸甘油酯含量降低至≤ 5.5%之量。在癌症之情況下，治療反應可包含將免疫排除腫瘤轉化成發炎腫瘤(其與增加之免疫細胞浸潤至腫瘤中相關)、降低之腫瘤尺寸及/或減少之疾病進展。增加之免疫細胞浸潤可藉由瘤內免疫細胞出現或偵測信號，諸如放射性標記及螢光之程度增加來觀測。
在一些實施例中，用於診斷、選擇、治療或監測患者之活體內成像包含MDSC追蹤，諸如G-MDSC (亦稱為PMN-MDSC)及M-MDSC。舉例而言，MDSC可在基線下富集在疾病位點(諸如纖維性組織及實體腫瘤)。在療法(例如，TGFβ1抑制劑療法)後，如藉由降低之標記(諸如放射性同位素及螢光)之強度所量測，可觀測到較少MDSC，其指示治療效果。
在一些實施例中，活體內成像包含追蹤或定位LRRC33陽性細胞。LRRC33陽性細胞包括例如MDSC及活化類M2巨噬細胞(例如，與纖維性組織相關之TAM及活化巨噬細胞)。舉例而言，LRRC33陽性細胞可在基線下富集在疾病位點(諸如纖維性組織及實體腫瘤)。在療法(例如，TGFβ1抑制劑療法)後，如藉由降低之標記(諸如放射性同位素及螢光)之強度所量測，可觀測到較少表現細胞表面LRRC33之細胞，其指示治療效果。
在一些實施例中，本文中所述之活體內成像技術可包含使用PET-SPECT、MRI及/或光學螢光/生物發光以便偵測相關細胞。
在一些實施例中，用偵測部分標記抗體或類抗體分子可包含直接標記或間接標記。
在一些實施例中，偵測部分可為追蹤劑。在一些實施例中，追蹤劑可為放射性同位素，其中視情況地，放射性同位素可為發射正電子同位素。在一些實施例中，放射性同位素係選自由以下組成之群：18F、11C、13N、15O、68Ga、177Lu、18F及89Zr。
因此，此類方法可用於在免疫-PET中伴隨使用標記抗體來進行活體內成像。TGF β 1 活性之抑制
本發明方法包括抑制一或多個生物系統中的TGFβ1生長因子活性之方法。此類方法可包括使一或多個生物系統與本發明之抗體及/或組合物接觸。在一些情況下，此等方法包括調整生物系統中(例如細胞生態棲位或個體中)的游離生長因子之量。根據此類方法之抗體及/或組合物可包括(但不限於)生物分子，其包括(但不限於)本文中所述之重組蛋白、蛋白質複合物及/或抗體或其抗原部分。
在一些實施例中，本發明方法可用於降低或消除生長因子活性，在本文中稱為「抑制方法」。一些此類方法可包含在TGFβ複合物(例如，與GARP、LTBP1、LTBP3及/或LRRC33複合之TGFβ1)中保留成熟生長因子及/或促進生長因子重締合於TGFβ複合物中。在一些情況下，抑制方法可包含使用特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體。根據一些抑制方法，提供一或多種抑制抗體。
在一些實施例中，本發明之抗體、其抗原結合部分及組合物可用於抑制TGFβ1活化。在一些實施例中，本文提供一種用於抑制TGFβ1活化之方法，其包含將GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物暴露至本文中所述之抗體、其抗原結合部分或醫藥組合物。在一些實施例中，抗體、其抗原結合部分或醫藥組合物抑制成熟TGFβ1自GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物釋放。在一個實施例中，該方法活體外進行。在一些實施例中，該方法活體內進行。在一些實施例中，該方法離體進行。
在一些實施例中，GARP-TGFβ1複合物或LRRC33-TGFβ1複合物存在於細胞之外表面處。
在一些實施例中，表現GARP-TGFβ1複合物或LRRC33-TGFβ1複合物之細胞為纖維母細胞、肌纖維母細胞、巨噬細胞、T細胞、單核球、樹突狀細胞、抗原呈遞細胞、嗜中性白血球、骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)、淋巴球、肥大細胞或微神經膠質細胞。T細胞可為調節T細胞(例如，免疫抑制T細胞)。嗜中性白血球可為活化嗜中性白血球。巨噬細胞可為活化(例如，極化)巨噬細胞,包括促纖維變性及/或腫瘤相關巨噬細胞(TAM)，例如M2c次型及M2d次型巨噬細胞。在一些實施例中，巨噬細胞暴露於腫瘤衍生因子(例如，細胞介素、生長因子等)，其可進一步在巨噬細胞中誘導促癌表型。在一些實施例中，此類腫瘤衍生因子為CSF-1/M-CSF。
在一些實施例中，表現GARP-TGFβ1複合物或LRRC33-TGFβ1複合物之細胞為癌細胞，例如循環癌細胞及腫瘤細胞。
在一些實施例中，LTBP1-TGFβ1複合物或LTBP3-TGFβ1複合物結合至細胞外基質(亦即，ECM之組分)。在一些實施例中，細胞外基質包含原纖維蛋白及/或纖維結合蛋白。在一些實施例中，細胞外基質包含含有RGD基元之蛋白質。
LRRC33表現於選擇性細胞類型中，詳言之，髓系之彼等細胞類型，包括單核球及巨噬細胞。單核球來源於骨髓中之祖細胞，且在血流中循環且達至周邊組織。循環單核球可隨後轉移至組織中，在該等組織中，其變得暴露於局部環境(例如，組織特異性的、疾病相關的局部環境等)，該局部環境包括一組多種因子，諸如細胞介素及趨化細胞素，觸發單核球分化成巨噬細胞、樹突狀細胞等。此等細胞包括(例如)肺臟中之肺泡巨噬細胞、骨髓中之蝕骨細胞、CNS中之微神經膠質細胞、結締組織中之組織細胞、肝臟中之庫弗細胞及棕色脂肪組織中之棕色脂肪組織巨噬細胞。在實體腫瘤中，浸潤巨噬細胞可為腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、腫瘤相關嗜中性白血球(TAN)及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)等。此類巨噬細胞可活化及/或與諸如癌瘤相關(或癌症相關)纖維母細胞(CAF)之活化纖維母細胞及/或基質締合。因此，本文中所述的抑制成熟TGFβ1自含LRRC33之複合物釋放的TGFβ1活化之抑制劑可靶向表現細胞表面上之LRRC33-前TGFβ1的此等細胞中之任一者。
在一些實施例中，LRRC33-TGFβ1複合物存在於促纖維變性(類M2)巨噬細胞之外表面處。在一些實施例中，促纖維變性(類M2)巨噬細胞存在於纖維性微環境中。在一些實施例中，相較於僅靶向LTBP1-TGFβ1及/或LTBP1-TGFβ1複合物，靶向促纖維變性(類M2)巨噬細胞之外表面處的LRRC33-TGFβ1複合物提供優良效應。在一些實施例中，類M2巨噬細胞進一步極化成具有差異表型之多種次型，諸如類M2c及M2d TAM巨噬細胞。在一些實施例中，巨噬細胞可藉由腫瘤微環境中所存在之多種因子(例如，生長因子、趨化細胞素、細胞介素及ECM重塑分子)變得活化，其包括(但不限於) TGFβ1、CCL2 (MCP-1)、CCL22、SDF-1/CXCL12、M-CSF (CSF-1)、IL-6、IL-8、IL-10、IL-11、CXCR4、VEGF、PDGF、前列腺素調節劑(諸如花生四烯酸及環加氧酶-2 (COX-2))、副甲狀腺激素相關蛋白(PTHrP)、RUNX2、HIF1α及金屬蛋白酶。暴露於此類因子中之一或多者可進一步使單核球/巨噬細胞衍生成促腫瘤表型。僅給出一個實例，已顯示腫瘤中之CCL2及VEGF共表現與增加之TAM及診斷困難相關。反過來，活化腫瘤相關細胞亦可促進其他細胞募集及/或分化成促腫瘤細胞，例如CAF、TAN、MDSC及其類似者。基質細胞亦可對巨噬細胞活化起反應，且影響ECM重塑，且最終影響血管形成、侵襲及癌轉移。舉例而言，CCL2不僅充當單核球引誘物，且亦藉由上調活化內皮中所表現的作為ICAM-1之受體的MAC-1來促進細胞黏附。此會引起CCL2依賴性動脈生成及癌症進展。本文中所述之TGFβ1抑制劑可用於藉由干擾CCL2信號傳遞軸來抑制動脈生成之方法中。
在一些實施例中，GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物結合至細胞外基質。在一些實施例中，細胞外基質包含原纖維蛋白。在一些實施例中，細胞外基質包含含有RGD基元之蛋白質。
在一些實施例中，本文提供一種用於減少個體中之TGFβ1蛋白質活化之方法，其包含向個體投與本文中所述之抗體、其抗原結合部分或醫藥組合物，藉此減少個體中之TGFβ1蛋白質活化。在一些實施例中，個體患有或處於患有纖維化之風險下。在一些實施例中，個體患有或處於患有癌症之風險下。在一些實施例中，個體患有或處於患有癡呆之風險下。
在一些實施例中，如本文所述之抗體或其抗原結合部分降低調節T細胞(Treg)之抑制活性。用於偵測大型潛伏複合物 ( LLC ) 之分析
在一些實施例中，本文所提供之方法及組成物與用於在獲自個體之樣品中偵測GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之方法相關。如本文所用，「個體」係指個別生物體，例如個別哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為非人類哺乳動物。在一些實施例中，個體為非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為嚙齒動物。在一些實施例中，個體為綿羊、山羊、牛、家禽、貓或狗。在一些實施例中，個體為脊椎動物、兩棲動物、爬蟲動物、魚類、昆蟲、蠅或線蟲。在一些實施例中，個體為研究動物。在一些實施例中，個體經基因工程改造，例如經基因工程改造之非人類個體。個體可為任一性別且可處於任何發育階段。在一些實施例中，個體為患者或健康志願者。
在一些實施例中，用於在獲自個體之樣品中偵測GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之方法涉及(a)若樣品中存在抗原，則在適於將抗體結合至抗原之條件下，將樣品與特異性結合GARP-TGFβ1複合物、LTBP1-TGFβ1複合物、LTBP3-TGFβ1複合物及/或LRRC33-TGFβ1複合物之抗體接觸，藉此形成結合複合物；及(b)測定結合至抗原之抗體的量(例如，測定結合複合物之含量)。
在一個實施例中，利用固定至表面上之經生物素標記之潛伏TGFβ1複合物的篩選分析，其允許藉由提供繫留，由整合素活化潛伏TGFβ。其他非整合素活化劑亦可在該系統中測試。可經由報導體細胞或其他TGFβ依賴性細胞反應讀取。 用於量測 TGF β 活化的基於細胞之分析
TGFβ之活化(及藉由TGFβ測試抑制劑，諸如抗體進行的其抑制)可藉由此項技術中已知的任何適合方法量測。舉例而言，TGFβ之經整合素介導之活化可用於基於細胞之分析，諸如「CAGA12」報導體(例如，螢光素酶)分析中，其較詳細地描述於本文中。如所示，此類分析系統可包含以下組分：i)TGFβ之來源(重組、內源性或經轉染)；ii)活化因子，諸如整合素之來源(重組、內源性或經轉染)；及iii)對TGFβ活化起反應之報導體系統，諸如表現能夠對TGFβ起反應且將信號轉譯成可讀輸出(例如，CAGA12細胞中之螢光素酶活性或其他報導體細胞株)的TGFβ受體之細胞。在一些實施例中，報導體細胞株包含處於TGFβ反應性啟動子(例如，PAI-1啟動子)之控制下的報導體基因(例如，螢光素酶基因)。在一些實施例中，賦予敏感性之某些啟動子元件可併入至報導體系統中。在一些實施例中，此類啟動子元件為CAGA12元件。可用於分析中之報導體細胞株已描述於例如Abe等人 (1994) Anal Biochem. 216(2): 276-84中，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，自同一來源(例如，同一細胞)提供前述分析組分中之每一者。在一些實施例中，自同一來源提供前述分析組分中之兩者，且自不同來源提供第三分析組分。在一些實施例中，自不同來源提供所有三種分析組分。舉例而言，在一些實施例中，自同一來源(例如，同一經轉染之細胞株)為分析提供整合素及潛伏TGFβ複合物(前TGFβ及呈遞分子)。在一些實施例中，自獨立來源(例如，兩種不同細胞株，純化整合素及經轉染之細胞之組合)為分析提供整合素及TGF。當細胞用作分析組分中之一或多者之來源時，此類分析組分對細胞可為內源性的、穩定地表現於細胞中、經瞬時轉染或其任何組合。來自用於量測TGFβ活化的基於細胞之分析的一非限制性例示性實施例的結果抑制揭示於本文中，其證明使用抗體Ab1及Ab2抑制GARP-前TGFβ1複合物或LRRC33-前TGFβ1複合物。在此例示性分析中，Ab1對GARP-TGFβ1複合物之IC50 (μg/mL)為0.445，且Ab1對LRRC33-TGFβ1複合物之IC50 (μg/mL)為1.325。
熟習此項技術者可容易使此類分析適於各種適合組態。舉例而言，可考慮TGFβ之多種來源。在一些實施例中，TGFβ之來源為表現及沈積TGFβ之細胞(例如，初級細胞、繁殖細胞、永生化細胞或細胞株等)。在一些實施例中，TGFβ之來源為使用適合手段固定於分析系統中的純化及/或重組TGFβ。在一些實施例中，固定於分析系統中的TGFβ存在於分析盤上的細胞外基質(ECM)組合物中，其經或不經脫細胞化，模擬源於纖維母細胞之TGFβ。在一些實施例中，TGFβ存在於分析中所用的細胞之細胞表面上。另外，選定呈遞分子可包括於分析系統中，以提供適合的潛伏TGFβ複合物。一般熟習此項技術者可容易判定何種呈遞分子可存在或表現於某些細胞或細胞類型中。使用此類分析系統，在存在或不存在測試劑(諸如抗體)下的TGFβ活化之相對變化可容易量測，以評估測試劑對TGFβ活體外活化之影響。來自例示性基於細胞之分析的資料提供於以下實例章節中。
此類基於細胞之分析可以多種方式加以修改或調整，其視所研究之TGFβ異構體、潛伏複合物(例如，呈遞分子)之類型及其類似者而定。在一些實施例中，已知的表現能夠活化TGFβ之整合素的細胞可用作分析中的整合素之來源。此類細胞包括SW480/β6細胞(例如，純系1E7)。在一些實施例中，表現整合素之細胞可與編碼相關呈遞分子(諸如GARP、LRRC33、LTBP(例如，LTBP1或LTBP3)等)之質體及編碼相關TGFβ異構體之前形式(諸如前TGFβ1)之質體共轉染。轉染之後，培育細胞持續足夠時間以使得可表現經轉染之基因(例如，約24小時)，洗滌細胞，且與測試劑(例如，抗體)之連續稀釋液一起培育。隨後，將報導體細胞株(例如，CAGA12細胞)添加至分析系統中，繼之以適當保溫時間以允許TGFβ信號傳遞。在培育時段(例如，約18至20小時)之後，隨後添加測試劑，使用適合手段(例如，對於表現螢光素酶之報導體細胞株，可使用Bright-Glo試劑(Promega))偵測信號/讀出(例如，螢光素酶活性)。在一些實施例中，可使用BioTek (Synergy H1)盤讀取器，在自動增益設置(autogain setting)下偵測螢光素酶螢光。
資料證明，本發明之例示性抗體能夠以非情形依賴性方式選擇性地抑制TGFβ1之活化。核酸
在一些實施例中，本發明之抗體、其抗原結合部分及/或組合物可由核酸分子編碼。此類核酸分子包括(但不限於) DNA分子、RNA分子、聚核苷酸、寡核苷酸、mRNA分子、載體、質體及其類似者。在一些實施例中，本發明可包含經計劃或產生以表現編碼本發明之化合物及/或組合物之核酸分子的細胞。在一些情況下，本發明之核酸包括密碼子優化核酸。產生密碼子優化核酸之方法為此項技術中已知的，且可包括(但不限於)美國專利第5,786,464號及第6,114,148號中所述之方法，其中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。某些實施例之清單
本發明之非限制性實施例列於以下： 1. 一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，以≤ 10 nM，視情況≤ 5 nM之KD結合以下抗原複合物中之每一者： i) hLTBP1-前TGFβ1； ii) hLTBP3-前TGFβ1； iii) hGARP-前TGFβ1；及， iv) hLRRC33-前TGFβ1； 其中抗體或其片段為完全人類或人類化抗體或其片段。 2. 如實施例1之抗體或抗原結合片段，其如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，以≤ 5 nM之KD結合以下中之每一者：i) hLTBP1-前TGFβ1複合物及ii) hLTBP3-前TGFβ1複合物，其中視情況，如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，抗體或片段以≤ 1 nM之KD結合複合物中之每一者。 3. 一種抗體或其抗原結合片段，其如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，以≤ 200 pM，視情況≤ 100 pM之KD結合以下抗原複合物中之每一者： i) hLTBP1-前TGFβ1； ii) hLTBP3-前TGFβ1； iii) hGARP-前TGFβ1；及， iv) hLRRC33-前TGFβ1； 其中抗體或其片段為完全人類或人類化抗體或其片段。 4. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中： CDR-H1具有由FTF(X1 )(X2 )(X3 )(X4 )M(X5 )表示之胺基酸序列，其中視情況，X1 為S、G或A；X2 為S或F；X3 為F或Y；X4 為S或A；且/或，X5 為D、N或Y (SEQ ID NO: 143)； CDR-H2具有由YI(X1 )(X2 )(X3 )A(X4 )TIYYA(X5 )SVKG表示之胺基酸序列，其中視情況，X1 為S或H；X2 為P或S；X3 為S或D；X4 為D或S；且/或，X5 為D或G (SEQ ID NO: 144)； CDR-H3具有由(X1 )R(X2 )(X3 )(X4 )D(X5 )GDML(X6 )P表示之胺基酸序列，其中視情況，X1 為A或V；X2 為G或A；X3 為V或T；X4 為L或W；X5 為Y或M；且/或，X6 為M或D (SEQ ID NO: 145)； CDR-L1具有胺基酸序列QASQDITNYLN (SEQ ID NO: 105)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化； CDR-L2具有胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 106)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化；且， CDR-L3具有胺基酸序列QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化。 5. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中： CDR-H1具有胺基酸序列FTFSSFSMD (SEQ ID NO: 107)，其中視情況存在至多4個胺基酸變化，或至多2個胺基酸變化； CDR-H2具有胺基酸序列YISPSADTIYYADSVKG (SEQ ID NO: 103)，其中視情況存在至多4個胺基酸變化； CDR-H3具有胺基酸序列ARGVLDYGDMLMP (SEQ ID NO: 6)，其中視情況存在至多3個胺基酸變化； CDR-L1具有胺基酸序列QASQDITNYLN (SEQ ID NO: 105)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化； CDR-L2具有胺基酸序列DASNLET (SEQ ID NO: 106)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化；且， CDR-L3具有胺基酸序列QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)，其中視情況存在1或2個胺基酸變化。 6. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中CDR-H1包含GFTFSSFS (SEQ ID NO: 2)；CDR-H2包含ISPSADTI (SEQ ID NO: 4)；CDR-H3包含ARGVLDYGDMLMP (SEQ ID NO: 6)；CDR-L1包含QDITNY (SEQ ID NO: 8)；CDR-L2包含DAS (SEQ ID NO: 10)；且，CDR-L3包含QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)。 7. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其結合包括潛伏套索之一或多個胺基酸殘基的抗原決定基，其中視情況抗原決定基為組合性抗原決定基，其中進一步視情況，組合性抗原決定基包含生長因子域之指-1及/或指-2的一或多個胺基酸殘基。 8. 如實施例7之抗體或抗原結合片段，其中抗原決定基包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (SEQ ID NO: 169)之一或多個胺基酸殘基，且其中視情況抗原決定基進一步包含RKDLGWKWIHEPKGYHANF (SEQ ID NO: 165)及/或VGRKPKVEQL (SEQ ID NO: 168)之一或多個胺基酸殘基。 9. 如實施例8之抗體或抗原結合片段，其中抗原決定基包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (SEQ ID NO: 169)之一或多個胺基酸殘基，及RKDLGWKWIHEPKGYHANF (SEQ ID NO: 165)之一或多個胺基酸殘基。 10. 如實施例8之抗體或抗原結合片段，其中抗原決定基包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (SEQ ID NO: 169)之一或多個胺基酸殘基及VGRKPKVEQL (SEQ ID NO: 168)之一或多個胺基酸殘基。 11. 如實施例7之抗體或抗原結合片段，其中抗原決定基包含KLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVL (SEQ ID NO: 169)之一或多個胺基酸殘基、RKDLGWKWIHEPKGYHANF (SEQ ID NO: 165)之一或多個胺基酸殘基及VGRKPKVEQL (SEQ ID NO: 168)之一或多個胺基酸殘基。 12. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段為完全人類或人類化抗體或抗原結合片段。 13. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段與人類及小鼠前TGFβ1複合物交叉反應。 14. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段為人類IgG4或IgG1次型。 15. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段包含Ser至Pro之主鏈取代，其產生類IgG1鉸鏈。 16. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其如藉由基於細胞之報導體分析所量測，對以下複合物中之每一者具有≤ 2 nM之IC50。 i) hLTBP1-前TGFβ1； ii) hLTBP3-前TGFβ1； iii) hGARP-前TGFβ1；及， iv) hLRRC33-前TGFβ1。 17. 一種經分離單株抗體或其片段，其如藉由生物層干涉術或表面電漿子共振所量測，以≤ 1 nM之親和性特異性結合以下抗原中之每一者： a)人類LTBP1-前TGFβ1複合物； b)人類LTBP3-前TGFβ1複合物； c)人類GARP-前TGFβ1複合物；及， d)人類LRRC33-前TGFβ1複合物； 其中單株抗體顯示對以上複合物中之任一者相對於其他複合物的親和性不超過三倍之偏向，且， 其中單株抗體抑制成熟TGFβ1生長因子自前TGFβ1複合物中之每一者而非自前TGFβ2或前TGFβ3複合物釋放。 18. 一種經分離單株抗體或其片段，其在具有胺基酸序列PGPLPEAV (SEQ ID NO: 161)或其部分之結合區處特異性結合前TGFβ1複合物， 其特徵在於如藉由氫-氘交換質譜(HDX-MS)所測定，當在溶液中結合至前TGFβ1複合物時，抗體或片段保護結合區免受溶劑暴露；且， 其中如藉由生物層干涉術或表面電漿子共振所量測，抗體或片段以≤ 5 nM之親和性特異性結合以下複合物中之每一者：LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。 19. 一種經分離單株抗體或其片段，其在具有胺基酸序列LVKRKRIEA (SEQ ID NO: 159)或其部分之結合區處特異性結合前TGFβ1複合物， 其特徵在於如藉由氫-氘交換質譜(HDX-MS)所測定，當在溶液中結合至前TGFβ1複合物時，抗體或片段保護結合區免受溶劑暴露；且， 其中如藉由生物層干涉術或表面電漿子共振所量測，抗體或片段以≤ 5 nM之親和性特異性結合以下複合物中之每一者：LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1。 20. 一種經分離單株抗體或其片段，其在以下位置特異性結合前TGFβ1複合物： i)第一結合區，其包含潛伏套索(SEQ ID NO: 153)之至少一部分；及 ii)第二結合區，其包含指-1 (SEQ ID NO: 151)之至少一部分； 其特徵在於如藉由氫-氘交換質譜(HDX-MS)所測定，當在溶液中結合至前TGFβ1複合物時，抗體或片段保護結合區免受溶劑暴露。 21. 如請求項45之抗體或片段，其中第一結合區包含PGPLPEAV (SEQ ID NO: 161)或其部分，且第二結合區包含RKDLGWKW (SEQ ID NO: 170)或其部分。 22. 如前述實施例中任一項之抗體或片段，其中抗體為非情形依賴性抗體，使得其如藉由生物層干涉術或表面電漿子共振所量測，以小於五倍之親和性偏向結合基質締合之前TGFb1複合物及細胞締合之前TGFb1複合物。 23. 如請求項43至47中任一項之抗體或片段，其以≤ 1 nM之親和性特異性結合以下複合物中之每一者：mLTBP1-前TGFβ1、mLTBP3-前TGFβ1、mGARP-前TGFβ1及mLRRC33-前TGFβ1。 24. 如前述實施例中任一項之抗體或片段，其在以下結合區或其部分中之一或多者處結合前TGFβ1複合物： LVKRKRIEA (SEQ ID NO: 159)； LASPPSQGEVPPGP (SEQ ID NO: 160)； PGPLPEAV (SEQ ID NO: 161)； LALYNSTR (SEQ ID NO: 162)； REAVPEPVL (SEQ ID NO: 163)； YQKYSNNSWR (SEQ ID NO: 164)； RKDLGWKWIHE (SEQ ID NO: 171)； HEPKGYHANF (SEQ ID NO: 172)； LGPCPYIWS (SEQ ID NO: 166)； ALEPLPIV (SEQ ID NO: 167)；及， VGRKPKVEQL (SEQ ID NO: 168)。 25. 如前述實施例中任一項之抗體或片段，其具有選自由以下組成之群的CDR序列： GFTFSSFS (SEQ ID NO: 2) ISPSADTI (SEQ ID NO: 4) ARGVLDYGDMLMP (SEQ ID NO: 6) QDITNY (SEQ ID NO: 8) DAS及(SEQ ID NO: 10) QQADNHPPWT (SEQ ID NO: 12)。 26. 如實施例25之抗體，其包含CDR中之全部。 27. 一種抗體或其抗原結合片段，其結合以下抗原中之每一者： hLTBP1-前TGFβ1 hLTBP3-前TGFβ1 hGARP-前TGFβ1；及， hLRRC33-前TGFβ1； 其中如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，抗體或片段以≤ 1 nM之KD結合hLTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1中之每一者； 其中抗體或片段結合抗原決定基，其包含LRLASPPSQGEVPPGPLPEAV (SEQ ID NO: 173)之一或多個胺基酸殘基，且視情況抗原決定基進一步包含RKDLGWKWIHEPKGYHANF (SEQ ID NO: 165)之一或多個胺基酸殘基。 28. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段， 其中抗體或片段以≤ 1 nM之親和性結合LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1中之每一者；且 其中抗體或片段以比細胞締合之前TGFβ1複合物高至少10倍之親和性結合基質締合之前TGFβ1複合物。 29. 如前述實施例之抗體或抗原結合片段，其中IC50 ≤ 1 nM。 30. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段能夠抑制TGFβ1之整合素依賴性活化。 31. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段能夠抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性活化。 32. 如前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段能夠抑制TGFβ1之整合素依賴性活化及TGFβ1之蛋白酶依賴性活化。 33. 如前述實施例中任一項之抗體或其片段，其不特異性結合前TGFβ2或前TGFβ3。 34. 如前述實施例中任一項之抗體或其片段，其不特異性結合不與前TGFβ1複合物締合之自由TGFβ1生長因子。 35. 一種抗體或其抗原結合片段，其交叉阻斷如前述實施例中任一項之抗體或片段。 36. 一種套組，其包含如前述實施例中任一項之抗體或片段。 37. 一種組合物，其包含如前述實施例中任一項之抗體或片段，及醫藥學上可接受之賦形劑。 38. 如實施例37之組合物，其用於治療個體之TGFβ相關適應症之療法。 39. 如實施例38所使用之組合物，其中TGFβ相關適應症為癌症、骨髓纖維化、幹細胞病症及/或纖維性病症。 40. 如實施例38所使用之組合物，其中TGFβ相關適應症選自以下： i) TGFβ1過度表現或TGFβ1信號傳遞調節異常之疾病； ii)與異常幹細胞分化或再殖相關之疾病，其視情況為： a)幹細胞/祖細胞分化/重構歸因於疾病被停止或擾亂，或作為療法/介導之副作用受誘導； b)患者正接受造成健康細胞經殺滅或耗乏之療法或介導； c)患者可受益於增加之幹細胞/祖細胞分化/重構； d)疾病與異常幹細胞分化或重構相關 iii)涉及造血調節異常之病狀，諸如治療誘導之造血調節異常； iv)具有選自由以下組成之群的一或多種基因之異常基因表現的疾病：絲胺酸蛋白酶抑制劑1 (編碼PAI-1)、MCP-1 (亦稱作CCL2)、CCL3、Col1a1、Col3a1、FN1、TGFβ1、CTGF、ACTA2 (編碼α-SMA)、ITGA11、SNAI1、MMP2、MMP9、TIMP1、FOXP3、CDH1 (E鈣黏蛋白)及CDH2； v)涉及蛋白酶之疾病 vi)涉及上皮細胞向間葉細胞轉化(EMT)之疾病； vii)涉及內皮細胞向間葉細胞轉化(EndMT)之疾病； viii)涉及基質硬化及改造之疾病；視情況包含ECM僵硬； ix)器官纖維化，視情況晚期器官纖維化 x)原發性及繼發性骨髓纖維化 xi)惡性疾病/癌症 a)實體腫瘤，視情況晚期實體腫瘤或轉移性腫瘤； b)血癌。 41. 如實施例40所使用之組合物，其中癌症包含實體腫瘤，或其中癌症為血癌。 42. 如實施例41所使用之組合物，其中實體腫瘤對癌症療法反應不佳，其中視情況癌症療法為檢查點抑制劑療法、癌症疫苗、化學療法、放射療法、溶瘤病毒療法、IDO抑制劑療法及/或經工程改造之免疫細胞療法。 43. 如實施例41所使用之組合物，其中實體腫瘤為免疫排除腫瘤。 44. 如實施例41所使用之組合物，其中實體腫瘤包含Treg、瘤內M2巨噬細胞及/或MDSC。 45. 如實施例41所使用之組合物，其中實體腫瘤包含富集有CAF及/或肌纖維母細胞之基質。 46. 如實施例41所使用之組合物，其中個體正在接受癌症療法，或為接受癌症療法之候選者，該癌症療法選自由以下組成之群：化學療法、放射療法、CAR-T、癌症疫苗、溶瘤病毒療法及檢查點抑制劑療法。 47. 如實施例41所使用之組合物，其中癌症之特徵在於對癌症療法之後天抗性或原發抗性。 48. 如實施例38至47中任一項所使用之組合物，其中癌症之治療包含投與治療有效量之組合物以減少實體腫瘤之生長，其中視情況組合物之投與延長存活。 49. 如實施例38至48中任一項所使用之組合物，其中治療包含以範圍在1至30 mg/kg之間的劑量投與組合物。 50. 一種用於選擇可能對TGFβ1抑制療法起反應之個體之方法，該方法包含以下步驟： 鑑別診斷患有癌症之個體，其中，i)癌症為已知容易對癌症療法具有抗性之類型的癌症，且/或ii)個體對癌症療法具有抗性，其中視情況個體為癌症療法之原生無反應者； 其中視情況癌症療法為化學療法、放射療法及/或免疫檢查點抑制療法；及， 將個體選擇為TGFβ1抑制療法之候選者。 51. 一種用於治療癌症之方法，該方法包含以下步驟： i) 選擇診斷患有包含實體腫瘤之癌症的患者，其中實體腫瘤為或疑似為免疫排除腫瘤； ii) 向患者投與呈可有效治療癌症之量的如請求項1至10中任一項之抗體或片段， 其中患者已接受癌症療法，或為接受癌症療法之候選者，該癌症療法選自由以下組成之群：免疫檢查點抑制療法、化學療法、放射療法、經工程改造之免疫細胞療法及癌症疫苗療法。 52. 如請求項25之方法，其中免疫檢查點抑制劑為PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑。 53. 如請求項26之方法，其中選擇步驟(i)包含偵測免疫細胞或其一或多種標記物。 54. 如請求項27之方法，其中偵測包含腫瘤活檢體分析、血清標記物分析及/或活體內成像。 55. 如請求項27或28之方法，其中免疫細胞選自由以下組成之群：細胞毒性T淋巴球、調節T細胞、MDSC、腫瘤相關巨噬細胞、NK細胞、樹突狀細胞及嗜中性白血球。 56. 如請求項27至29中任一項之方法，其中免疫細胞標記物選自由以下組成之群：CD8、CD3、CD4、CD11b、CD163、CD68、CD14、CD34、CD25、CD47。 57. 如請求項28之方法，其中活體內成像包含T細胞追蹤。 58. 如請求項28或31之方法，其中活體內成像包含使用PET-SPECT、MRI及/或光學螢光/生物發光。 59. 如請求項31或32之方法，其中活體內成像包含對免疫細胞或結合免疫細胞之細胞表面標記物之抗體進行直接或間接標記。 60. 如請求項28至33中任一項之方法，其中活體內成像包含使用追蹤劑。 61. 如請求項34之方法，其中追蹤劑為放射性同位素。 62. 如請求項35之方法，其中放射性同位素為發射正電子之同位素。 63. 如請求項36之方法，其中放射性同位素選自由以下組成之群：18 F、11 C、13 N、15 O、68 Ga、177 Lu、18 F及89 Zr。 64. 如請求項28至37中任一項之方法，其中活體內成像包含在免疫PET中使用經標記抗體。 65. 如請求項28至38中任一項之方法，其中進行活體內成像以便在個體中監測對TGFβ1抑制療法之治療反應。 66. 如請求項39之方法，其中治療反應包含免疫排除腫瘤向發炎腫瘤之轉化。 67. 一種鑑別用於治療用途之異構體選擇性TGFβ1活化抑制劑之方法，該方法包含以下步驟： i)選擇一組如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，能夠以≤ 10 nM之KD活體外結合以下中之每一者的抗體或抗原結合片段：hLTBP1-前TGFβ1；hLTBP3-前TGFβ1；hGARP-前TGFβ1；及，hLRRC33-前TGFβ1； ii)選擇一組視情況在基於細胞之分析中能夠抑制TGFβ活化之抗體或抗原結合片段； iii)在活體內功效研究中,測試來自步驟i)及ii)之一或多種抗體或其抗原結合片段； iv)在活體內毒理學/安全性研究中，測試來自步驟i)至iii)之一或多種抗體或其抗原結合片段；及， v)鑑別來自步驟i)至iv)之一或多種抗體或抗原結合片段，其中抗體或片段顯示低於活體內毒理學/安全性研究中所測定之NOAEL的活體內功效研究中所測定之有效劑量。 68. 一種如實施例1至35中任一項之抗體或片段之用途，其用於製造用於治療TGFβ1適應症之藥劑。 69. 如實施例68之用途，其進一步包含對包含抗體或片段之調配物進行無菌過濾的步驟。 70. 如實施例68或69之用途，其進一步包含填充及/或包裝至小瓶或注射器中之步驟。 71. 一種用於製備包含異構體選擇性TGFβ1抑制劑之醫藥組合物之方法，該方法包含： i)提供能夠以1 nM或更小之KD結合以下中之每一者的抗體：hLTBP1-前TGFβ1、hLTBP3-前TGFβ1、hGARP-前TGFβ1及hLRRC33-前TGFβ1， ii)進行活體內功效研究，其中向臨床前模型投與步驟(i)之抗體以測定有效量， iii)使用已知對TGFβ抑制敏感之動物模型進行毒理學研究，以測定觀測到非所要毒性時之量； iv)基於步驟(ii)及(iii)確定或證實足夠的治療窗；及， v)製造包含抗體之醫藥組合物。 72. 一種製造如實施例1至35中任一項之抗體或片段之方法，該方法包含以下步驟： i)提供包含前TGFβ1複合物之抗原，該複合物視情況包含以下中之至少兩者：LTBP1、LTBP3、GARP、LRRC33或其片段， ii)針對結合步驟(i)之抗原的能力選擇一組抗體或片段； iii)視情況自組中移除顯示非所要結合概況之抗體或片段； iv)針對抑制TGFβ1之能力選擇一組選自步驟(ii)及/或(iii)之抗體或片段； v)視情況產生完全人類或人類化抗體或抗體之片段，抗體或片段選自步驟(iv)，從而提供人類或人類化抑制劑； vi)進行活體外結合分析，以測定對LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1之親和性， vii)進行功能分析，以測定或證實抑制劑對TGFβ1及視情況TGFβ2及/或TGFβ3之活性。 73. 如實施例72之方法，其進一步包含在臨床前動物模型中，在活體內功效研究及活體內毒理學研究中評估候選抗體或其片段之步驟，藉此確定顯示為既有效亦安全或可耐受之有效量。 74. 如實施例72或73之方法，其進一步包含調配成醫藥組合物之步驟。 75. 如實施例74之組合物，其用於在治療人類個體之纖維化中的治療用途。 76. 如實施例74之組合物，其用於在治療人類個體之骨髓纖維化中的治療用途。 77. 如實施例74之組合物，其用於在治療人類個體之癌症中的治療用途。 78. 如實施例77所使用之組合物，其中癌症包含實體腫瘤。 79. 如實施例78所使用之組合物，其中實體腫瘤為局部晚期實體腫瘤。 80. 如實施例77至79中任一項所使用之組合物，其中癌症對癌症療法反應不佳，其中視情況癌症療法為檢查點抑制劑療法、癌症疫苗、化學療法、放射療法、IDO抑制劑療法及/或經工程改造之免疫細胞療法。 81. 如實施例80所使用之組合物，其中癌症之特徵在於後天抗性或原發抗性。 82. 如實施例81所使用之組合物，其中腫瘤之特徵在於免疫排除。 83. 如實施例78至82中任一項所使用之組合物，其中腫瘤包含瘤內M2巨噬細胞及/或MDSC。 84. 如實施例78至82中任一項所使用之組合物，其中腫瘤包含富集有CAF之基質。 85. 如實施例80所使用之組合物，其中個體接受癌症療法，或為接受癌症療法之候選者，該癌症療法選自由以下組成之群：化學療法、放射療法、CAR-T、癌症疫苗、溶瘤病毒療法及檢查點抑制劑療法。 86. 如實施例中任一項所使用之組合物，其中個體進一步經TGFβ3抑制劑治療。 87. 如實施例70所使用之組合物，其中個體患有TGFβ1陽性且TGFβ3陽性癌症，且其中個體已接受、正在接受檢查點抑制劑療法，或為接受檢查點抑制劑療法之候選者。 88. 如實施例77至84中任一項所使用之組合物，其中個體不為進行腫瘤手術切除之候選者。 89. 如實施例37之組合物，其用於增強人類個體之宿主免疫， 其中個體患有癌症，且 其中免疫反應包含抗癌免疫。 90. 如實施例89所使用之組合物，其中增強宿主免疫包括減少來自腫瘤之免疫排除或促進免疫細胞向腫瘤中之浸潤。 91. 如實施例89所使用之組合物，其中增強宿主免疫包括抑制TGFβ1之纖維蛋白溶酶依賴性活化。 92. 如實施例37所使用之組合物，其中個體具有罹患細胞介素風暴(cytokine storm)之風險。 93. 如實施例37所使用之組合物，其中個體正在接受經工程改造之免疫細胞療法，或為接受經工程改造之免疫細胞療法的候選者。 94. 如實施例37所使用之組合物，其中個體正在接受癌症疫苗，或為接受癌症疫苗之候選者。 95. 如實施例76至94中任一項所使用之組合物，其中個體正在接受免疫檢查點抑制劑療法，或為接受免疫檢查點抑制劑療法之候選者，其中視情況個體對免疫檢查點抑制劑療法反應不佳。 96. 如實施例37之組合物，其用於預防人類個體之細胞介素釋放症候群(例如，細胞介素風暴或敗血症)，其中視情況個體患有感染或MS。 97. 如請求項37之組合物，其用於抑制個體內TGFβ1之纖維蛋白溶酶依賴性活化之方法中。 98. 一種用於治療個體之TGFβ1適應症之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之異構體選擇性TGFβ1抑制劑以治療該適應症之步驟，其中，異構體選擇性TGFβ1抑制劑為單株抗體，其如藉由溶液平衡滴定所量測，以≤ 10 nM之KD特異性結合以下中之每一者：hLTBP1-前TGFβ1；hLTBP3-前TGFβ1；hGARP-前TGFβ1；及hLRRC33-前TGFβ1。 99. 如實施例98之方法，其中抗體如藉由溶液平衡滴定所量測，以≤ 1 nM之KD結合hLTBP1-前TGFβ1及hLTBP3-前TGFβ1中之每一者，其中視情況，抗體以≤ 1 nM之KD結合以下中之每一者：hLTBP1-前TGFβ1；hLTBP3-前TGFβ1；hGARP-前TGFβ1；及hLRRC33-前TGFβ1。 100. 如實施例98或99之方法，其中抗體結合潛伏套索或其部分。 101. 如實施例100之方法，其中抗體進一步結合指-1、指-2或其部分。 102. 如實施例98至101中任一項之方法，其中TGFβ1適應症為選自癌症及骨髓增生病之增生性病症。 103. 如實施例102之方法，其中個體為癌症療法之較差反應者，其中視情況癌症療法包含檢查點抑制療法、化學療法及/或放射療法。 104. 如實施例102之方法，其中個體進一步經癌症療法與異構體選擇性TGFβ1抑制劑結合治療。
本發明進一步藉由以下實例說明，該等實例不應理解為具限制性。實例 實例 1 ：活體外結合概況 1 ) 基於 BLI 之分析 ：
Ab4、Ab5、Ab6及Ab3之親和性係在人類前TGFβ1細胞上藉由Octet®分析量測，而活性係藉由測試人類前TGFβ1抑制之CAGA12報導體細胞量測。本文提供的用於量測抗體與複合物之親和性的方案概述於下表19中，且本發明之例示性抗體之親和性概況的彙總清單提供於本文中之表 8 中。表 19 . 用於進行 Octet ® 結合分析之例示性方案
Figure 108124516-A0304-0020
作為一實例，Ab6與TGFβ抗原之結合使用聚苯乙烯96孔黑色半區域培養盤(Greiner Bio-One)，在FortéBio Octet Red384上藉由生物層干涉術量測。根據製造商說明書，在使用胺反應性第二代(AR2G)試劑套組(FortéBio)，將抗原與胺反應性第二代(AR2G)生物感測器(FortéBio)偶聯之後，完成Ab6與人類成熟TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3生長因子以及人類潛伏TGFβ1之結合。在實驗起始之前，首先使AR2G生物感測器在水中離線水合至少10分鐘。在實驗起始後，將AR2G尖端在水中平衡1分鐘。隨後，將尖端移動至新製備之活化溶液(18份水、1份400 mM EDC (1-乙基-3-[3-二甲胺基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽)及1份200 mM 磺基-NHS (N-羥基磺基丁二醯亞胺))，持續5分鐘。將重組TGFβ蛋白(10 ug/mL於pH 5之10 mM乙酸鈉緩衝液中)偶聯至活化尖端，持續3分鐘，隨後用pH 8.5之乙醇胺猝滅15分鐘。在將偶聯尖端在補充有2% BSA (Sigma)、0.5 M NaCl及0.09% Tween-20 (Sigma)之EKB緩衝液(動力學緩衝液(FortéBio))中培育20分鐘之情況下，測定基線。隨後使尖端在Ab6於EKB之15 ug/mL溶液中締合10分鐘，隨後在EKB中解離10分鐘。在將Ab6固定至抗人類Fc捕獲生物感測器(FortéBio) (1 ug/mL於EKB中)之表面持續5分鐘之後，量測Ab6與人類大型潛伏複合物之結合。隨後進行額外1分鐘基線，隨後將LTBP1-前TGFβ1、LTBP1-前TGFβ2或LTBP1-前TGFβ3 (100 nM於EKB中)締合十分鐘。最後，進行十分鐘解離。2 ) 基於溶液平衡滴定之分析 ：
MSD-SET為可用於測定溶液相平衡KD 之充分表徵技術。基於溶液平衡之分析，諸如MSD-SET，係基於動力排除之原理，其中量測在平衡下而非即時締合及解離速率下之自由配位體結合，以測定親和性。
進行MSD-SET分析以量測抗體在平衡下之親和性。簡言之，將每一測試抗體稀釋3至5倍，且在48孔盤中將樣品與經生物素標記之抗原混合。使SET樣品在室溫下平衡20至24小時。同時，將捕獲培養盤用IgG (20 nM)塗佈且在4℃下培育隔夜或在室溫下培育30分鐘，隨後用5% BSA進行阻斷步驟。在將捕獲培養盤洗滌三次之後，添加SET樣品且培育150秒。將培養盤洗滌一次以去除未結合複合物。添加250 ng/ml SA-Sulfotag，隨後洗滌3次。添加2×讀取緩衝液，且使用QuickPlex™ SQ 120儀器讀取來自經標記結合複合物之信號。
如藉由MSD-SET所量測之本發明之例示性抗體之親和性概況的概述清單提供於本文表 9 及10 中。
作為一實例，將MSD標準品培養盤(MSD)用單株抗體於PBS之20 nM溶液塗佈，在室溫下持續30分鐘或在4℃下隔夜。隨後將用於塗佈之提高濃度之相同單株抗體與經生物素標記之抗原混合(對於與Ab6結合，在50與400 pM之間；對於與Ab4結合，在0.8與1.6 nM之間)，在不振盪之情況下在室溫下隔夜。在20至24小時平衡之後，在室溫下將經抗體塗佈之培養盤用填充緩衝液A (MSD)阻斷30分鐘，且用洗滌緩衝液(PBS、0.1% BSA、0.05% Tween-20)洗滌，隨後將平衡抗體-抗原複合物添加至培養盤，持續恰好2.5分鐘。將培養盤再用洗滌緩衝液洗滌，隨後添加於含0.1%BSA之PBS中之250 ng/ml經磺基-TAG標記之抗生蛋白鏈菌素二級試劑(MSD)。在用洗滌緩衝液洗滌之後，使用MESO QuickPlex SQ 120 (MSD)在MSD讀取緩衝液(MSD)中讀取培養盤。藉由Prism 7軟體(Graphpad)中之非線性曲線擬合處理結合資料，以計算平衡結合KD值。 實例 2 ： 量測對潛伏 TGF β 1 活化之抑制的功能分析
新穎情形依賴性基於細胞之TGFβ1活化之效力分析的開發描述於WO 2019/023661中，其以全文引用之方式併入本文中。先前分析格式無法在由內源性呈遞分子呈遞之前TGFβ1的活化與由外源性LTBP呈遞之前TGFβ1的活化之間進行區分。藉由直接轉染表現整合素之細胞，揭示於WO 2019/023661中且在本文中使用之新穎分析，在內源性呈遞子(presenter)-前TGFβ1活性與外源性LTBP-前TGFβ1活性之間建立窗。由於LTBP-前TGFβ1複合物嵌入於細胞外基質中，因此分析盤塗佈亦為分析之重要組分。經ECM蛋白纖維結合蛋白塗佈之高結合(high binding)培養盤的使用使LTBP分析更穩健。
為確定Ab4、Ab5、Ab6及Ab3抗體是否為功能性的(例如，具有抑制效力)，開發基於細胞之分析，其中量測TGFβ1生長因子自大型潛伏複合物(LLC)之αVβ整合素依賴性釋放。各分析對包含LTBP1、LTBP3、GARP或LRRC33之LLC中之每一者具有特異性。經由分析開發及最佳化之過程，確定纖維結合蛋白為對於LTBP呈遞之前TGFβ1之整合素依賴性活體外 活化至關重要的ECM蛋白。分析 I . 沈積於 ECM 中之潛伏 TGF β 1 的活化
對於圖 1 及圖 2 中所描繪之分析，開發以下方案。此分析最佳用於量測TGFβ1自ECM締合之潛伏前TGFβ1複合物(LTBP1-前TGFβ1或LTBP3-前TGFβ1)之整合素依賴性釋放。
材料： • MvLu1-CAGA12細胞(純系4A4) • SW480/β6細胞(純系1E7) (αV次單元以較高量內源性表現；β6次單元穩定地過度表現) • LN229細胞株(較高量之內源性αVβ8整合素) • Costar白壁經TC處理之96孔分析盤#3903 • Greiner Bio-One高結合白色uclear 96孔分析盤#655094 • 人類纖維結合蛋白(Corning #354008) • P200多注式吸液管 • 各具有無菌過濾嘴之P20、P200及P1000吸液管 • 無菌微量離心管及擱架 • 無菌試劑儲集器 • 0.4%錐蟲藍(trypan blue) • 2 mL、5 mL、10 mL及25 mL無菌吸液管 • 經組織培養物處理之100 mm或150 mm培養盤 • 70%乙醇 • Opti-MEM還原型血清培養基(Life Tech #31985-070) • Lipofectamine 3000 (Life Tech #L3000015) • Bright-Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E2620) • 0.25%胰蛋白酶+0.53 mM EDTA • 前TGFβ1表現質體，人類 • LTBP1S表現質體，人類 • LTBP3表現質體，人類 • LRRC32 (GARP)表現質體，人類 • LRRC33表現質體，人類
設備： • BioTek Synergy H1盤讀取器 • TC罩 • 桌上型離心機 • CO2 培育箱37℃，5% CO2 • 37℃水/珠粒浴 • 平台振盪器 • 顯微鏡 • 血球計/countess
定義： • CAGA12 4A4細胞：MvLu1細胞(貂肺臟上皮細胞)之衍生物，其經CAGA12合成啟動子穩定地轉染，驅動螢光素酶基因表現 • DMEM-0.1%BSA：分析培養基；基礎培養基為DMEM (Gibco目錄號11995-065)，培養基亦含有稀釋至0.1% w/v之BSA、青黴素/鏈黴素及4 mM麩醯胺酸 • D10：DMEM 10% FBS、P/S、4 mM麩醯胺酸、1% NEAA、1× GlutaMAX (Gibco目錄號35050061) • SW480/β6培養基：D10 + 1000 ug/mL G-418 • CAGA12 (4A4)培養基：D10 + 0.75 ug/mL嘌呤黴素
程序：
在第0天，接種細胞用於轉染。用胰蛋白酶及集結粒(在200×g下自旋5分鐘)分離SW480/β6 (純系1E7)細胞。將細胞集結粒再懸浮於D10培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。以5.0 × 106 個細胞/12 ml/100 mm組織培養盤來接種細胞。對於CAGA12細胞，以每T75燒瓶1.0百萬之密度對細胞進行繼代，以用於在第3天之分析。在37℃及5% CO2 下培育培養物。
在第1天，轉染表現整合素之細胞。遵循用Lipofectamine® 3000試劑轉染的製造商方案。簡言之，將以下稀釋於OptiMEM™ I中，每孔125 µl：7.5 µg DNA (呈遞分子) + 7.5 µg DNA (前TGFβ1)、30 ul P3000且直至與OptiMEM I達125 µl。藉由用吸液管將DNA移在一起混合孔，隨後添加OptiMEM。添加P3000，且藉由吸液混合所有物。製得Lipofectamine3000之預混液，以添加至DNA混合物中：對於LTBP1分析：15 µl Lipofectamine3000，直至在OptiMEM I中達每孔125 µl；對於LTBP3分析：45 µl Lipofectamine3000，直至在OptiMEM I中達每孔125 ul。將經稀釋之Lipofectamine3000添加至DNA中，藉由吸液混合孔，且在室溫下培育15分鐘。在培育之後，藉由吸液混合溶液數次，且隨後每盤逐滴添加250 µl DNA:Lipofectamine3000 (2 × 125 µl)。輕輕地旋動各盤以加以混合，且將盤返回至組織培養恆溫箱持續約24小時。
在第1天至第2天，用人類纖維結合蛋白塗佈分析盤。具體言之，將凍乾纖維結合蛋白在超純蒸餾水(無菌)中稀釋至1 mg/ml。將1 mg/ml儲備溶液在PBS (無菌)中稀釋至19.2 μg/ml。將50微升/孔添加至分析盤(高結合)中，且在組織培養恆溫箱(37℃及5% CO2 )培育隔夜。最終濃度為3.0 μg/cm2 。
在第2天，塗鋪經轉染之細胞以供分析且添加抑制劑。首先，藉由將200微升/孔PBS添加至分析盤中已有的纖維結合蛋白溶液中來洗滌纖維結合蛋白塗層。用多注式吸液管手動地移除洗液。重複洗滌，總共洗滌兩次。在添加細胞之前，拿掉蓋子，使盤在室溫下乾燥。隨後藉由用胰蛋白酶及集結粒(在200×g下自旋5分鐘)分離來塗鋪細胞。將集結粒再懸浮於分析培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。對於LTBP1分析，將細胞稀釋至0.10 × 106 個細胞/毫升，且每孔接種50 µl (每孔5,000個細胞)。對於LTBP3分析，將細胞稀釋至0.05 × 106 個細胞/毫升，且每孔接種50 µl (每孔2,500個細胞)。為了製備功能性抗體稀釋液，將抗體在媒劑中預稀釋至恆定操作濃度。將儲備抗體連續稀釋於媒劑(PBS為最佳的，避免檸檬酸鈉緩衝液)中。針對抗體之4×最終濃度，將連續稀釋液之各點稀釋於分析培養基中。每孔添加25 µl之4×抗體，且在37℃及5% CO2 下培育培養物持續約24小時。
在第3天，添加TGFβ報導體細胞。用胰蛋白酶及集結粒(在200×g下自旋5分鐘)分離供分析用之CAGA12 (純系4A4)細胞。將集結粒再懸浮於分析培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞稀釋至0.4 × 106 個細胞/毫升，且每孔接種50 µl (每孔20,000個細胞)。將細胞返回至培育箱。
在第4天，讀取分析(添加抗體及/或報導體細胞之後16至20小時)。在讀取之前，使Bright-Glo™試劑及測試盤達至室溫。使用TMLC_std方案設定BioTek® Synergy™ H1上之讀取設置，此方法具有自動增益設置。選擇陽性對照孔以供自動調整(高)。每孔添加100 μl Bright-Glo試劑。在室溫下在振盪下培育2分鐘，保護盤避光。在BioTek Synergy H1上讀取盤。
在LN229報導體分析中量測由Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或對照IgG對LTBP1-前TGBβ1活化之抑制(圖 1 )。
在LN229報導體分析中量測由Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、或對照IgG對LTBP3-前TGBβ1活化之抑制(圖 2 )。分析 II . 在 細胞表面上呈遞之潛伏 TGF β 1 的活化
對於圖 3 及圖 4 中所描繪之分析，開發以下方案。此分析，或「直接轉染」方案，最佳用於量測TGFβ1自細胞締合之潛伏前TGBβ1複合物(GARP-前TGBβ1或LRRC33-前TGBβ1)之整合素依賴性釋放(活化)。
材料： • MvLu1-CAGA12細胞(純系4A4) • SW480/β6細胞(純系1E7) (αV次單元以較高量內源性表現；β6次單元穩定地過度表現) • LN229細胞株(較高量之內源性αVβ8整合素) • Costar白壁經TC處理之96孔分析盤#3903 • Greiner Bio-One高結合白色uclear 96孔分析盤#655094 • 人類纖維結合蛋白(Corning #354008) • P200多注式吸液管 • 各具有無菌過濾嘴之P20、P200及P1000吸液管 • 無菌微量離心管及擱架 • 無菌試劑儲集器 • 0.4%錐蟲藍 • 2 mL、5 mL、10 mL及25 mL無菌吸液管 • 經組織培養物處理之100 mm或150 mm培養盤 • 70%乙醇 • Opti-MEM還原型血清培養基(Life Tech #31985-070) • Lipofectamine 3000 (Life Tech #L3000015) • Bright-Glo螢光素酶分析試劑(Promega #E2620) • 0.25%胰蛋白酶+0.53 mM EDTA • 前TGFβ1表現質體，人類 • LTBP1S表現質體，人類 • LTBP3表現質體，人類 • LRRC32 (GARP)表現質體，人類 • LRRC33表現質體，人類
設備： • BioTek Synergy H1盤讀取器 • 組織培養罩 • 桌上型離心機 • CO2 培育箱，37℃，5% CO2 • 37℃水/珠粒浴 • 平台振盪器 • 顯微鏡 • 血球計/countess
定義： • CAGA12 4A4細胞：MvLu1細胞(貂肺臟上皮細胞)之衍生物，其經CAGA12合成啟動子穩定地轉染，驅動螢光素酶基因表現 • DMEM-0.1%BSA：分析培養基；基礎培養基為DMEM (Gibco目錄號11995-065)，培養基亦含有稀釋至0.1% w/v之BSA、青黴素/鏈黴素及4 mM麩醯胺酸 • D10：DMEM 10% FBS、P/S、4 mM麩醯胺酸、1% NEAA、1× GlutaMAX (Gibco目錄號35050061) • SW480/β6培養基：D10 + 1000 ug/mL G-418 • CAGA12 (4A4)培養基：D10 + 0.75 ug/mL嘌呤黴素
方法：
在第0天，接種表現整合素之細胞用於轉染。將細胞用胰蛋白酶分離且集結(在200×g下自旋5分鐘)。將細胞集結粒再懸浮於D10培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞稀釋至0.1e6 個細胞/毫升，且在分析盤中每孔接種100 ul (每孔10,000個細胞)。對於CAGA12細胞，以每T75燒瓶1.5百萬之密度進行繼代，以用於在第2天之分析。在37℃及5% CO2 下培育培養物。
在第1天，轉染細胞。遵循用Lipofectamine 3000試劑轉染的製造商方案。簡言之，將以下稀釋於OptiMEM I中，每孔5 ul：0.1 ug DNA (呈遞分子) + 0.1 ug DNA (前TGFβ1)、0.4 ul P3000且直至與OptiMEM I達5 ul。藉由用吸液管將DNA移在一起混合孔，隨後添加OptiMEM。添加P3000，且藉由吸液混合所有物。用Lipofectamine3000製得預混液，以添加至DNA混合物中：0.2 ul Lipofectamine3000，直至在OptiMEM I中達每孔5 ul。將經稀釋之Lipofectamine3000添加至DNA中，藉由吸液混合孔，且在室溫下培育15分鐘。在培育之後，藉由吸液混合溶液數次，且隨後添加每孔10 ul DNA:Lipofectamine3000 (2 × 5 ul)。將細胞培養盤返回至組織培養恆溫箱持續約24小時。
在第2天，添加抗體及TGFβ報導體細胞。為了製備功能性抗體稀釋液，將儲備抗體在媒劑(PBS為最佳的)中連續稀釋。隨後針對抗體之2×最終濃度，將各點稀釋於分析培養基中。在製備抗體之後，藉由抽吸(真空吸引器(aspirator))將細胞培養盤用分析培養基洗滌兩次，隨後添加每孔100 ul分析培養基。在第二洗滌之後，將分析培養基用每孔50 ul 2×抗體置換。將細胞培養盤返回至培育箱持續約15至20分鐘。
為了製備供分析用之CAGA12 (純系4A4)細胞，將細胞用胰蛋白酶分離且集結(在200×g下自旋5分鐘)。將集結粒再懸浮於分析培養基中，且對每ml之活細胞進行計數。將細胞稀釋至0.3e6 個細胞/毫升，且每孔接種50 ul (每孔15,000個細胞)。將細胞返回至培育箱。
在第3天，在抗體及/或報導體細胞添加之後約16至20小時讀取分析。在讀取之前，使Bright-Glo™試劑及測試盤達至室溫。將BioTek® Synergy™ H1上之讀取設置設定成使用TMLC_std方案，此方法具有自動增益設置。設定陽性對照孔以供自動調整(高)。每孔添加100 uL Bright-Glo試劑。在室溫下在振盪下培育2分鐘，保護盤避光。在BioTek Synergy H1上讀取盤。
在SW480β6分析中量測由Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或IgG對照對GARP-前TGFβ1活化之抑制(圖 3 )。
在SW480β6分析中量測由Ab3、Ab4、Ab5、Ab6或IgG對照對LRRC33-前TGFβ1活化之抑制(圖 4 )。
用於獲得提供於圖33B中之活體外效力資料的基於細胞之報導體分析如下：
在分析之前兩天，將每孔12,500個LN229細胞塗鋪至白壁96孔組織培養物處理之分析盤中。次日，使用Lipofectamine 3000用質體轉染LN229細胞，該等質體編碼前TGFβ1 (LTBP分析)、前TGFβ1外加GARP (GARP分析)，或前TGFβ1外加LRRC33 (LRRC33胞外域與GARP跨膜及細胞質域融合之嵌合構築體)。作為TGFβ1異構體特異性之對照，將LN229細胞用前TGFβ3轉染，前TGFβ3歸因於在其前域中存在RGD序列，亦由αV整合素活化。約24小時後，將Ab6連續稀釋且與懸浮於DMEM+0.1% BSA中之CAGA12報導體細胞一起添加至轉染體中(每孔15,000個細胞)。在建立共培養物之後約16至20小時，將分析使用BrightGlo試劑顯色2分鐘，且在盤讀取器上讀出發光。在抗體媒劑存在下之螢光素酶活性確定100%活性，且在167 nM (25 µg/ml)高親和性泛TGFβ抗體存在下之信號12.7設定為0%活性。
使用Prism 7及最佳擬合IC50計算值，將劑量-反應活性非線性地擬合至三參數對數抑制劑對反應模型。
為了測試對蛋白分解TGFβ1活化之抑制，將CAGA12報導體細胞接種至白壁96孔螢光分析盤中(每孔12,500個細胞)。二十四小時後，將細胞用分析培養基(DMEM+0.1% BSA)洗滌，且Ab6 (2.5 µg/ml)及小潛伏複合物前TGFβ1 C4S (1.5 ng/ml)在分析培養基中添加至CAGA細胞中。將此混合物在37℃下培育4小時以使抗體結合。在此培育之後，以500 ng/ml最終濃度添加重組人類血漿激肽釋放酶蛋白酶(EMD Millipore)。將分析混合物與CAGA細胞一起培育大約18小時，其後如上文所描述藉由生物發光讀出TGFβ1活化。 實例 3 ： TGF β 1 特異性、非情形依賴性抗體對 TGF β 1 之蛋白酶誘導活化的活體外影響
先前，申請人展示Ab3 (異構體選擇性、情形偏向之TGFβ1抑制劑)能夠在活體外及基於細胞/CAGA分析中抑制TGFβ1之整合素依賴性及激肽釋放酶依賴性活化兩者。
為了測試Ab6 (異構體選擇性、高親和性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑)抑制TGFβ1之蛋白酶依賴性活化的能力，且進一步比較Ab3與Ab6之效果，建立兩個基於細胞/CAGA分析：i)激肽釋放酶依賴性TGFβ1活化及Ab3與Ab6之效果；及ii)纖維蛋白溶酶依賴性TGFβ1活化及Ab3與Ab6之效果。
簡言之，在分析開始之前24小時接種CAGA報導體細胞。將前TGFβ1-C4S滴定至CAGA細胞上。以所指定之固定濃度添加蛋白酶(血漿-KLK或纖維蛋白溶酶)。將分析混合物培育大約18小時。藉由螢光素酶分析量測TGFβ活化。
在第一研究中，在KLK之存在下，前TGFβ1經活化(陽性對照)。藉由添加Ab3，此TGFβ活化被有效地抑制，證實先前結果。類似地，Ab6亦抑制TGFβ1之激肽釋放酶誘導活化。此等結果表明，除TGFβ1之整合素依賴性活化以外，異構體特異性、非情形依賴性之抑制性抗體(偏向及無偏向兩者)可活體外阻斷TGFβ1之KLK依賴性活化(圖 5A )。
在第二研究中，在重組人類纖維蛋白溶酶之存在下，前TGFβ1經活化(陽性對照)。出人意料地，此TGFβ活化僅由AB6，而非由Ab3有效抑制。此等結果顯示情形偏向之抑制劑(Ab3)與情形無偏向之抑制劑(Ab6)之間出人意料的功能性差異(圖 5B )。 實例 4 ： 急性腎臟纖維化之單側輸尿管阻塞 ( UUO ) 模型 中 抗 TGFβ1 抗體 Ab3 及 Ab6 對 急性纖維化之抑制
在急性腎臟纖維化之單側輸尿管阻塞(UUO)模型中測試抗TGFβ1抗體對急性纖維化之抑制。在此模型中，藉由在研究第0天在雄性小鼠中對左輸尿管進行永久手術結紮來誘發纖維化。經歷手術但並未使其輸尿管阻塞的假處理之小鼠作為健康對照包括在此等實驗中。
藉由在研究第1天及第4天腹膜內(i.p.)注射而向小鼠投與對照(IgG)或測試抗體(Ab3、Ab6)。在研究結束時、在手術後第5天收集腎臟，且自此等組織收集RNA。之後針對一組纖維化相關基因藉由定量聚合酶鏈反應(qPCR)評定纖維化誘導之程度，包括膠原蛋白I (Col1a1 )、膠原蛋白III (Col3a1 )、纖維結合蛋白1 (Fn1 )、離胺醯氧化酶(Lox )、類離胺醯氧化酶2 (Loxl2 )、平滑肌肌動蛋白(Acta2 )、基質金屬蛋白酶(Mmp2 )及整合素α11 (Itga11 ) (Rolfe, Irvine, Grobbelaar, & Linge, 2007)(Tamaki等人, 1994)(Bansal等人, 2017)(Leaf & Duffield, 2016)。Ab3 或 Ab6 處理對 膠原蛋白基因表現之影響
Col1a1 及Col3a1 為纖維化之主要驅動基因。Col1a1 在經阻塞腎臟中被誘導了10至40倍，且Col3a1 上調5至25倍(P ＜ 0.005，對假+IgG處理之小鼠與UUO + IgG組進行比較)。如圖 7 中所示，與UUO + IgG相比，用3、10或30毫克/公斤/週之Ab3處理之UUO小鼠顯示兩種膠原蛋白基因之表現均有所減少(P ＜ 0.05)。用3或10毫克/公斤/週之Ab6進行之處理亦抑制UUO所致之纖維性基因誘導(P ＜ 0.05，與UUO + IgG相比)。綜合而言，此等資料表明，伴隨Ab3或Ab6任一者之TGFβ1抑制有力地改善與UUO相關之膠原蛋白誘導。Ab3 或 Ab6 處理對 纖維結合蛋白及類離胺醯氧化酶 2 基因表現之影響
Fn1 及Loxl2 編碼在纖維化中的細胞外基質之沈積及僵硬中起作用之蛋白。如圖 8 中所示，來自UUO + IgG組之樣品中的兩種基因均有所上調(P ＜ 0.005，相對於假+IgG)，但兩種基因之基因表現的增加倍數，且尤其對於Loxl2 ，要比膠原蛋白基因小。用3、10或30毫克/公斤/週之Ab3處理之樣品中，吾人注意到Fn1 及Loxl2 減少之趨勢(相對於UUO + IgG)，但此處理作用僅對於Loxl2 表現呈統計學上顯著的，且僅在3毫克/公斤/週劑量下(10毫克/公斤/週劑量下之Fn1 接近統計顯著性，伴隨P = 0.07)。然而，用3或10毫克/公斤/週Ab6進行之處理引起Fn1 及Loxl2 兩者之抑制(P ＜ 0.05，相對於UUO + IgG)。
圖 9 彙總UUO模型中基因表現(相對於UUO + IgG)在處理後之變化的統計顯著性。Ab3顯示在所測試之所有劑量下，Col1a1 及Col3a1 均有所減少。亦在Itga11 及Loxl2 中觀測到統計學上顯著之變化(相對於UUO + IgG，兩者量均有所減少)，但僅在3毫克/公斤/週劑量下。相比之下，除Acta2 之外的所檢查之所有基因均在用10毫克/公斤/週Ab6處理後顯示表現之統計學上顯著之變化(相對於UUO + IgG，所有量均有所減少)。此外，除Acta2 及Lox 之外的所檢查之所有基因亦顯示在經3毫克/公斤/週Ab6治療之小鼠中的統計學上顯著減少。 實例 5 ： 在 Cloudman S91 黑素瘤模型中 Ab3 及 Ab6 與抗 PD - 1 抗體之組合對腫瘤進展的影響
基於許多人類腫瘤之特徵在於以下表型的認識：i)對PD-(L)1軸阻斷起反應之子集；ii)免疫排除之證據；及，iii)TGFB1表現及TGFβ信號傳遞之證據，且進一步基於常用同基因型免疫腫瘤學小鼠模型不再現TGFβ1偏向或抗PD-(L)1抗性之觀測結果，諸位發明人試圖專門選擇展現與人類腫瘤類似概況之活體內臨床前模型，以得到改良可譯性 (參見實例11)。考慮此等因素，選擇適合活體內模型以便進行功效研究，該等模型包括此等研究中所描述之Cloudman S91黑素瘤模型。
為評估Ab3及Ab6與抗PD-1抗體之組合對減少黑素瘤腫瘤進展之效果，使用Cloudman S91小鼠黑素瘤模型。腫瘤細胞培養
純系M3[CloudmanS91黑素瘤] (ATCC® CCL-53.1™)細胞係由美國典型培養物保藏中心(ATCC)獲得，且作為凱恩改進型漢姆氏F12培養基中的指數生長懸浮培養物維持在CR Discovery Services，該培養基補充有2.5%胎牛血清、15%馬血清、2 mM麩醯胺酸、100單位/毫升青黴素G鈉、100 μg/mL硫酸鏈黴素及25 μg/mL慶大黴素。使腫瘤細胞在37℃下在5% CO2 及95%空氣之氛圍中的含濕氣培育箱中之組織培養瓶中生長。活體內植入及腫瘤生長
在腫瘤植入當天，用於50%基質膠中的5 × 106 個Cloudman S91細胞皮下注射各雌性DBA/2測試小鼠之側腹，且監測腫瘤生長。當腫瘤達至125至175 mm3 之體積時，將小鼠隨機分為具有相同平均腫瘤體積之12隻小鼠的組，且開始投藥。使用測徑規以二維量測腫瘤，且使用下式計算體積： 腫瘤體積(mm3 ) =w 2 ×l / 2 其中w =腫瘤寬度且l =腫瘤長度，以mm為單位。腫瘤重量可用1 mg等效於1 mm3 腫瘤體積的假設估計。處理
簡言之，在第1天用呈10 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab3；呈30 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab3；呈10 mg/kg，投藥體積為3 mL/kg之Ab6；或呈10 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab6腹膜內(i.p.)一週一次投與帶有皮下C91腫瘤(125至175 mm3 )的小鼠(n=12)持續60天。在10 mg/kg下，以10 mL/kg之投藥體積一週兩次i.p.投與大鼠抗小鼠PD-1抗體(RMP1-14-rIgG2a，BioXCel)持續60天。
第1組僅接受抗PD-1抗體。第2組接受Ab3 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第3組接受Ab3 (30 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第4組接受Ab6 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第5組接受Ab6 (30 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。使用未處理對照，資料未示。指標及腫瘤生長延遲 ( TGD ) 分析
使用測徑規每週量測腫瘤兩次，且當腫瘤達至2,000 mm3 之指標體積時或在研究(第60天)結束時(無論哪個較早發生)，將各動物安樂死。針對腫瘤體積指標退出研究的小鼠記錄為出於腫瘤進展(TP)安樂死，伴隨安樂死日期。根據WO 2018/129329中所述之方法計算供分析用之各小鼠之達至指標之時間(TTE)。
腫瘤生長延遲百分比(%TGD)定義為與未處理對照相比，處理組中達至指標之中值時間的增量，表示為達至對照之指標之中值時間(TTE)的百分比： T=處理組之中值TTE C=對照之中值TTE %TGD = ((T-C)/C)*100
與同型對照處理相比，抗PD1處理引起25%TGD。抗PD1/10 mg/kg下之Ab3具有14%TGD，而抗PD1/30 mg/kg下之Ab3具有92%TGD。與單獨的抗PD1處理中之29.8天相比，對於抗PD1/30 mg/kg下之Ab3，達至指標之中值時間為45.8天。
在第二Cloudman S91研究中，與同型對照處理相比，抗PD-1處理引起48%TGD。抗PD-1/10 mg/kg下之Ab3具有122% TGD，而抗PD-1/30 mg/kg下之Ab3具有217% TGD。抗PD-1/10 mg/kg及30 mg/kg兩者下之Ab6均具有217% TGD。對於抗PD-1，達至指標之中值時間為34.6天，抗PD-1/10 mg/kg下之Ab3為51.7天，且在30 mg/kg下為直至在第74天研究結束。抗PD-1/10 mg/kg及30 mg/kg兩者下之Ab6下在第74天研究結束時均未達至中值存活。
來自研究之結果顯示投與30 mg/kg下之Ab3與抗PD-1之組合，延長經處理小鼠之存活。如圖 10 中所示，為達至50%存活，經抗PD-1/30 mg/kg下之Ab3處理之小鼠花費約45天，而經10 mg/kg下之Ab3及單獨的PD-1處理之小鼠在少於30天內達至50%存活，表明同時抑制PD-1及TGFβ1引起存活益處。
如圖 11A 中所示，投與10 mg/kg及30 mg/kg下之Ab3或Ab6與抗PD1之組合，延遲腫瘤生長。8隻經單獨的PD-1處理之小鼠達至2000 mm3 之腫瘤體積(如由點線指示)，而僅有6隻經抗PD-1及10 mg/kg下之Ab3處理之小鼠及4隻經抗PD-1及30 mg/kg下之Ab3處理之小鼠達至2000 mm3 之腫瘤體積。僅有3隻經抗PD-1及10 mg/kg下之Ab6處理之小鼠及5隻經抗PD-1及30 mg/kg下之Ab6處理之小鼠達至2000 mm3 之腫瘤體積。圖11B顯示在用Ab3或Ab6與抗PD-1抗體之組合處理後的中值腫瘤進展。
進行獨立S91研究以評估藉由抗PD-1抗體與Ab6 (在3、10及30 mg/kg下)之組合來達成的有效腫瘤控制。為了對抗腫瘤反應進行定量，將回應於處理之「有效腫瘤控制」定義為各測試組內在研究結束時達成小於2,000 mm3 存活臨限(例如，指標腫瘤體積)之25%之腫瘤體積的動物百分比。結果概述於以下(參見圖 11C 、圖 11E 及圖 11F )。表 20 . Cloudman S91 功效概述
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如圖 11C 中所示，儘管Cloudman S91模型識別為對呈單一療法形式之PD-1阻斷反應不佳，但接受所有三種劑量之組合處理的大部分動物(分別83%、78%及73%)達成有效腫瘤控制(例如，腫瘤體積減少至500 mm3 或更小)，表明Ab6之穩健協同效應。因此，在反映對檢查點阻斷療法(諸如抗PD-(L)1)之人類原發抗性的同基因型小鼠腫瘤模型中，用Ab6進行之處理使Cloudman S91 (黑素瘤)腫瘤易受抗PD1療法影響。用Ab6 (低至每週3 mg/kg)與抗PD1抗體進行之組合處理引起顯著腫瘤消退或有效腫瘤控制。此處所達成之協同腫瘤生長延遲表明，異構體選擇性TGFβ1抑制劑可與檢查點阻斷療法結合用於處理患有對檢查點抑制具有抗性之TGFβ1陽性腫瘤的個體。在組合處理組中，所測試之所有劑量之Ab6 (呈淺藍色之3 mg/kg；呈深藍色之10 mg/kg及呈紫色之30 mg/kg)，與抗PD-1結合，達成顯著腫瘤控制(分別9/12、4/9及8/11)。集合地，超過65%之此等動物達成小於指標腫瘤體積之25%的腫瘤體積減少。結果亦顯示為中值腫瘤體積(圖11E)。所有組合處理組(3、10或30 mg/kg下之Ab6)在所測試之劑量下顯示類似抗腫瘤效應，表明在此模型中Ab6在低至3 mg/kg下有效。此亦反映於存活益處中(參見圖 11F )。
藉由在上文所描述之功效研究結束時停止處理，且延長時間以監測達成顯著腫瘤控制之彼等動物中腫瘤體積的變化，檢查TGFβ1與PD-1之組合抑制的持久抗腫瘤效應。在不投藥之情況下跟蹤來自圖 11C 之經歷CloudmanS91腫瘤之反應者，持續六週(灰色方框)。如圖 11D 中所示，在Ab6/抗PD-1組合之情況下達成延長腫瘤控制。所報導之數目為在研究結束時具有受控制腫瘤之動物的數目。
此外，在經抗PD1處理之動物中評估Ab6 (在每劑量3 mgk、10 mgk、或30 mgk下)之進行中的S91腫瘤模型研究中，組合處理引起顯著存活益處，如圖 11F 中所示。在第38天，接受抗PD1/Ab6 (30 mgk)組合之所有動物存活(例如，在30 mgk劑量組中，在第38天100%存活)，且組合組(3、10及30 mgk)中之動物中無一者已達至中值存活(進行中的研究)。在研究結束時，組合處理組中之動物中的90%存活。此等資料表明，諸如Ab6之異構體選擇性抑制劑TGFβ1可用於處理接受檢查點阻斷療法之個體中的檢查點抑制抗性腫瘤，以達成存活益處。對於圖 11C 至圖 11F ：綠色 = IgG對照(30 mg/kg每週一次)；橙色 = Ab6 (30 mg/kg每週一次)；紅色 = 抗PD1 (5 mg/kg每週兩次)；淺藍色 = 抗PD1 + Ab6 (3 mg/kg)；深藍色 = 抗PD1 + Ab6 (10 mg/kg)；紫色 = 抗PD1 + Ab6 (30 mg/kg)。 實例 6 ： 在 MBT2 同基因型膀胱癌模型中由 Ab3 及 Ab5 與抗 PD - 1 之組合對 TGF β 磷酸化 SMAD2 / 3 路徑的抑制
將MBT-2尿道上皮癌模型選為TGFβ1占主導之腫瘤，以測試TGFβ1特異性抑制與檢查點抑制劑之組合。在藥效動力學研究中，在MBT-2模型中評估Ab3或Ab5與抗PD1之組合對下游TGFβ信號傳遞之影響。根據製造商說明書，藉由ELISA (細胞信號傳遞技術)進行磷酸化SMAD2/3分析。活體內植入及腫瘤生長
在腫瘤植入當天，用5 × 105 個MBT2細胞皮下注射各雌性C3H/HeN測試小鼠之側腹，且監測腫瘤生長。當腫瘤達至40至80 mm3 之體積時，將小鼠隨機分為具有相同平均腫瘤體積之10隻小鼠的組，且開始投藥。使用測徑規以二維量測腫瘤，且使用下式計算體積： 腫瘤體積(mm3 ) =w 2 ×l / 2 其中w =腫瘤寬度且l =腫瘤長度，以mm為單位。腫瘤重量可用1 mg等效於1 mm3 腫瘤體積的假設估計。處理
簡言之，在第1天用呈3 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab5；呈10 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab5；呈10 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab3；或呈30 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab3腹膜內(i.p.)投與帶有皮下MBT2腫瘤(40至80 mm3 )的小鼠(n=10)，在第1天及第8天投與。在10 mg/kg下，以10 mL/kg之投藥體積在第1、4及8天i.p.投與大鼠抗小鼠PD-1抗體(RMP1-14-rIgG2a，BioXCel)。
第1組僅接受抗PD-1抗體。第2組接受Ab5 (3 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第3組接受Ab5 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第4組接受Ab3 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第5組接受Ab3 (30 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。使用未處理對照，未顯示。SMAD 2 / 3 信號傳遞之抑制
在第8天最後一次劑量後8小時處死動物且移除腫瘤，且急驟冷凍。將腫瘤在乾冰上粉碎，且在所添加之摻加磷酸酶抑制劑之情況下產生蛋白質溶解產物。
由磷酸化與總SMAD2/3之比率評定結果。如圖 12 中所示，張力性SMAD2/3信號傳遞在用Ab3或Ab5兩者與抗PD-1之組合處理的動物中受顯著抑制，其中Ab5 (10 mg/kg)顯示最高有效抑制。此等資料展現TGFβ1活化抑制劑之有效目標接合，引起對下游信號傳遞之抑制。 實例 7 ： 在 MBT2 同基因型膀胱癌小鼠模型中 Ab3 及 Ab6 與抗 PD - 1 抗體之組合對腫瘤進展的影響
為了評估Ab3及Ab6與抗PD-1抗體之組合對減弱膀胱癌腫瘤進展之能力，使用MBT2同基因型膀胱癌小鼠模型。此為極具侵襲性且快速增長之腫瘤模型，且極難以用藥物治療解決腫瘤進展。腫瘤細胞培養
MBT2為源自雌性C3H/He小鼠中可移植的經N-[4-(5-硝基-2-呋喃基)-2-噻唑基]甲醯胺誘發之膀胱癌的低分化鼠類膀胱癌細胞株。在37℃下在5% CO2 氛圍下將細胞培養於具有10%胎牛血清及100 µg/ml鏈黴素洛斯維·帕克紀念研究所(RPMI)-1600培養基中。每隔一天替換培養基，且當細胞匯合達至90%時，進行繼代培養。藉由胰蛋白酶消化自亞匯合培養物收集細胞，且在無血清培養基中洗滌。藉由錐蟲藍排除法測定具有＞90%細胞存活率之單細胞懸浮液。在注入之前將細胞再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。活體內植入及腫瘤生長
在對數期生長期間收集用於植入的MBT2細胞且將其再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。在腫瘤植入當天，用5 × 105 個細胞(0.1 mL細胞懸浮液)皮下注射各測試小鼠之側腹，且監測腫瘤生長。當時腫瘤達至平均40至80 mm3 之間時，將小鼠隨機分為15隻小鼠的組。
使用測徑規以二維量測腫瘤，且使用下式計算體積： 腫瘤體積(mm3 ) = w 2 × l / 2 其中w =腫瘤寬度且l =腫瘤長度，以mm為單位。腫瘤重量可用1 mg等效於1 mm3 腫瘤體積的假設估計。處理
簡言之，在第1天用呈10 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab3；呈30 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab3；呈3 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab6；或呈10 mg/kg，投藥體積為10 mL/kg之Ab6腹膜內(i.p.)一週一次投與帶有皮下MBT2腫瘤(40至80 mm3 )的小鼠(n=15)持續29天。在10 mg/kg下，以10 mL/kg之投藥體積一週兩次i.p.投與大鼠抗小鼠PD-1抗體(RMP1-14-rIgG2a，BioXCel)持續29天。
第1組僅接受抗PD-1抗體。第2組接受Ab3 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第3組接受Ab3 (30 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第4組接受Ab6 (3 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。第5組接受Ab6 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。使用未處理對照，未顯示。指標及腫瘤生長延遲 ( TGD ) 分析
用測徑規每週量測腫瘤兩次，且在各動物之腫瘤到達1,200 mm3 之指標體積時或在研究結束時將其安樂死。針對腫瘤體積指標退出研究的小鼠記錄為出於腫瘤進展(TP)安樂死，伴隨安樂死日期。根據WO 2018/129329中所述之方法計算供分析用之各小鼠之達至指標之時間(TTE)。
抗PD1/10 mg/kg下之Ab3具有191% TGD，且在30 mg/kg下為196% TGD。抗PD1/3 mg/kg下之Ab6係68% TGD，且在10 mg/mk下為196% TGD。歸因於處理之部分反應(PR)定義為對於研究過程期間的三次連續量測，腫瘤體積為其第1天體積之50%或更小，且對於此等三次量測中之一或多者而言，等於或大於13.5 mm3 。在完全反應(CR)中，對於研究過程期間的三次連續量測，腫瘤體積小於13.5 mm3 。抗PD-1/10 mg/kg下之Ab3在研究結束時具有0個PR及4個CR。抗PD-1/30 mg/kg下之Ab3在研究結束時具有1個PR及1個CR。抗PD-1/3 mg/kg下之Ab6具有0個PR及3個CR。抗PD-1/10 mg/kg下之Ab6具有0個PR及5個CR。
如圖 13A 及圖 13B 中所示，投與10 mg/kg及30 mg/kg兩者劑量下之Ab3與抗PD-1之組合延遲腫瘤生長。一些動物顯示腫瘤完全消退。此外，投與3 mg/kg及10 mg/kg兩者劑量下之Ab6與抗PD-1之組合延遲腫瘤生長。一些動物顯示腫瘤完全消退。大部分經單獨的PD-1處理之小鼠在約第8天與第14天之間達至1024 mm3 之腫瘤體積(如由點線指示)，而經10 mg/kg下之Ab3、30 mg/kg下之Ab3、3 mg/kg下之Ab6或10 mg/kg下之Ab6處理之小鼠花費至多多達28天以達至1024 mm3 之腫瘤體積。圖 13C 顯示用Ab3 (左上方 )或Ab6 (右上方 )與抗PD-1抗體之組合處理後的中值腫瘤進展。下部圖概述在投與Ab3或Ab6與抗PD-1之組合的小鼠中在第15天時之中值腫瘤體積(mm3 )。在經Ab3 (10 mg/kg)、Ab3 (30 mg/kg)或Ab6 (10 mg/kg)與抗PD-1之組合處理之小鼠中，在第15天時之中值腫瘤體積為約500 mm3 或更小，而在經單獨的抗PD-1處理之小鼠中，在第15天時之中值腫瘤體積為1000 mm3 或更大(下部圖 )。
圖 13D 突出顯示Ab6在MBT2中之功效。顯示來自五個處理組之小鼠中之腫瘤進展。接受對照IgG、單獨的Ab6或單獨的抗PD-1之動物中無一者達成有效腫瘤控制，有效腫瘤控制定義為腫瘤體積減少至終點體積之25%或更小(分別伴隨下部及上部點線顯示)。相比之下，接受Ab6/抗PD-1組合處理之經合併之28隻動物中的12隻(約43%)達成有效腫瘤控制，表明同時抑制PD-1及TGFβ1路徑可顯著減少(例如，延遲或消退)腫瘤生長。
此外，相比於單獨的抗PD-1，在所有三種處理組中，組合處理可有效延長存活。如圖 14 中所示，為達至50%存活，經10 mg/kg下之Ab3或10 mg/kg下之Ab6處理的小鼠花費超過28天，而經單獨的PD-1處理之小鼠在約16天內達至50%存活。集合地，此等結果展現組合療法之存活益處。結果之概述及論述
Ab6 - 抗 PD - 1 對腫瘤生長之協同效應 ：Ab6之發現使得能夠直接評估以下假設，亦即對TGFβ1活化之選擇性抑制將足以克服腫瘤對CBT之原發抗性。對於臨床前測試，吾人試圖鑑別鼠類同基因型腫瘤模型，其再現對CBT展現原發抗性之人類腫瘤的關鍵特徵中之一些。模型選擇之標準包括1)對在其他同基因型腫瘤模型顯示為有效之劑量下的抗PD-(L)1單劑處理幾乎不反應至不反應，2)免疫排除之證據，伴隨浸潤CD3+ T細胞之缺乏，3)活性TGFβ信號傳遞之證據，及4)TGFβ1異構體表現之證據。
對腫瘤反應及腫瘤譜分析資料，包括公開可用的全部腫瘤源性RNA之RNAseq資料集之探索，使得選擇符合此等標準之3個腫瘤模型：MBT-2膀胱癌模型(MBT-2)、CloudmanS91 (S91)黑素瘤模型及EMT-6乳癌模型(EMT-6)。對全部腫瘤RNAseq資料之分析展現TGFβ反應基因之上調指示TGFβ路徑活化，及效應T細胞基因之低表現，與免疫排除表型一致(圖20F)。為了探測總TGFβ異構體蛋白表現，藉由ELISA對全部腫瘤溶解產物進行分析，發現TGFβ1生長因子在所有三種模型中普遍。
為了在小鼠同基因型模型中評估Ab6，吾人以嵌合抗體形式表現Ab6，其中Ab6之人類V域融合至小鼠IgG1/κ恆定域以使免疫原性降至最低。Ab6-mIgG1與完全人類Ab6具有類似抑制活性。吾人證實帶有MBT-2腫瘤之動物對在以治療性含量投配時之抗PD-1 (RMP1-14)，以及單獨的Ab6-mIgG1具有抗性。然而，以組合形式，抗PD-1及以每週3 mg/kg或每週10 mg/kg投配之Ab6-mIgG1引起腫瘤負荷顯著降低，分別包括21%及36%無腫瘤存活者，以及在各研究持續時間內之顯著存活益處(圖13D及圖14)。總計，4/14之動物對抗PD-1/Ab6-mIgG1 (每週3 mg/kg)起反應且8/14對抗PD-1/Ab6-mIgG (每週10 mg/kg)起反應，其與接受單獨的抗PD-1之0/13形成比較。吾人在輕度抗PD-1反應性CloudmanS91黑素瘤模型中觀測到類似反應。同樣，抗PD-1/Ab6-mIgG1組合處理引起深遠的腫瘤抑制，伴隨至多75%反應率及在所有劑量下之顯著存活優點(參見實例 5 )。
吾人接下來在無MBT-2腫瘤存活者中評定抗腫瘤反應之持久性。中斷處理且跟蹤動物，持續7週。吾人未在任何動物中觀測到可偵測之腫瘤復發(參見實例 8 )。
TGFβ信號傳遞驅動免疫排除以損害CBT功效之來源於臨床的假設，以及泛TGFβ抑制可使得免疫系統能夠克服此抗性機制且提昇CBT功效之先前報導的臨床前論證，部分促使吾人檢查在本發明抗體之情況下所發現之顯著腫瘤反應及存活益處是否可對應於腫瘤免疫組織中之相關變化。
為研究呈單劑或組合形式之抗PD-1或AB6-mIgG1處理之免疫效應，在處理起始後10天自小鼠收集MBT-2腫瘤，且隨後對其進行所選免疫細胞標記物之免疫組織化學及流式細胞量測術分析。儘管流式細胞量測術分析展現CD45+免疫區室之整體百分比並不隨處理變化，但相對於同型對照抗體處理，抗PD-1與Ab6-mIgG1之組合引起此區室內CD8+ T細胞圖示增加十倍(分別平均34%對3.5% (圖 27B )。值得注意地，用抗PD-1進行之單劑處理似乎實現CD8+細胞圖示之適當增加，但在此研究中所觀測到的增加未達至顯著性。另外，對來源於此等腫瘤之RNA的分析顯示，細胞毒性T細胞活化之標記物的增加與CD8+細胞數目增加一致，且指示此等細胞之活性效應功能(圖 32D )。值得注意的是，在組合處理之情況下亦觀測到CD4+FoxP3+ Treg細胞之圖示的顯著增加。鑒於在組合處理之情況下所觀測到之顯著抗腫瘤效應，Treg細胞之此增加的相關性不明確。然而，Treg:CD8之比率未回應於組合處理而改變。引起關注地，抗PD-1/Ab6-mIgG1組合處理亦誘導MBT-2腫瘤內整體CD11b+細胞圖示的顯著減少。此似乎歸因於CD11b+CD206+及CD11b+Gr1+亞群之選擇性減少，其分別對應於免疫抑制類M2巨噬細胞及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)。集合地，在組合處理之後，此等兩個細胞群之圖示自平均CD45+細胞群之47%降低至14% (圖 28B )。類M1巨噬細胞亞群(CD11b+CD206-)似乎不隨處理變化，表明PD-1/TGFβ1阻斷對腫瘤內之免疫抑制背景具有選擇性但寬廣影響，有益地影響淋巴及骨髓區室兩者。
組合PD-1及TGFβ1抑制引起顯著CD8+ T細胞進入及/或擴增至腫瘤微環境中的特定機制不清楚。如此，吾人進行更詳細之組織學分析，以便搜集對深入TGFβ路徑活性與免疫排除之間關係的額外洞察。首先，吾人藉由免疫組織化學分析證實在整個對照組MBT-2腫瘤中CD8+染色之顯著增加，與流式細胞量測術資料一致(圖 30 )。接下來，吾人對介導TGFβ反應性基因之活化的轉錄因子，磷酸化Smad3 (pSmad3)進行免疫組織化學分析，以試圖確定腫瘤微環境中之哪些細胞可對經活化TGFβ1有反應。
出人意料地，在來自經抗PD-1處理及對照小鼠之腫瘤中，pSmad3染色呈現主要約束於腫瘤血管內皮之細胞核，且此信號在用Ab6-mIgG處理後大大減弱。(圖 30F )
為進一步探究血管周TGFβ信號傳遞之相關性，吾人將CD8+ T細胞及CD31+血管內皮共同染色。CD8+ T細胞呈現富集於與CD31+腫瘤血管相鄰之區域中(圖 30F 及圖 30G )。此觀測結果提昇腫瘤血管可充當T細胞進入之途徑的可能性。儘管其他人已報導TGFβ信號傳遞與形成T細胞進入腫瘤之障壁之富纖維母細胞瘤周基質的存在相關，但吾人之初步觀測結果表明，額外TGFβ1依賴性血管障壁亦可對阻止CD8+ T細胞進入腫瘤起突出作用。 實例 8 ： 在 MBT - 2 、 Cloudman S91 及 EMT - 6 腫瘤中抗 PD1 / Ab3 及抗 PD1 / Ab6 完全反應者中之持久、抗腫瘤適應性免疫記憶反應的發展 1 . MBT - 2 腫瘤中之抗腫瘤記憶
為確定在先前已清除MBT2腫瘤之完全反應者中是否產生強效且持久適應性免疫反應，進行腫瘤再攻擊實驗。方法
用5×105 個MBT2腫瘤細胞皮下植入8至12週齡雌性C3H/HeN小鼠之側腹。當腫瘤達至40至80 mm3 平均尺寸時，將動物隨機分入處理組以開始處理。起始平均腫瘤體積遍及各組相同。抗PD1 (RMP1-14)以10 mg/kg一週i.p.投配兩次；Ab3以10 mg/kg或30 mg/kg一週投配一次且Ab6投配3 mg/kg或10 mg/kg，持續5週。在5週之後，在所有抗PD1/Ab3及抗PD1/Ab6中，對於至少3次連續量測，腫瘤體積小於13.5 mm3 之的動物視為「完全反應者(CR)」。每週進行兩次量測。在接受單獨的抗PD1之小鼠中，不存在此類完全反應者。對於再攻擊實驗，完全反應動物不具有任何可量測腫瘤(例如，0 mm3 )。在不投藥之情況下跟蹤(例如，「靜置」)此等完全反應者7週(「清除」時段)，以允許清除先前投配之化合物。在7週結束時，用5×105 個MBT2腫瘤細胞皮下注射完全反應者及年齡匹配之初始對照動物的對側側腹。跟蹤動物25天或直至腫瘤體積超過1200 mm3 (無論哪個先發生)。指標定義為1200 mm3 之腫瘤體積。在達至指標後，處死動物。結果
當用MBT-2細胞皮下再植入於來自功效研究之完全反應者之初始植入之對側側腹，而不進行進一步處理時，在完全反應小鼠中未觀測到可偵測腫瘤生長，而對照、年齡匹配、未經歷腫瘤之小鼠組中之所有小鼠在植入三週內罹患可量測腫瘤(圖 15 )。
更具體言之，腫瘤再攻擊模型為展現針對癌轉移或腫瘤復發之免疫記憶及監測的手段。在此等實例中，用腫瘤細胞再植入完全反應者(回應於處理達成完全腫瘤消退之動物)，且將生長與年齡匹配之初始小鼠進行比較。截至第25天，初始動物中之腫瘤出現為100% (12/12) (圖 15 )，其中數個動物達至指標標準。如上文所描述，經MBT2細胞再攻擊之來自圖 13A 及圖 13B 中之研究的完全反應者，截至研究結束不具有可偵測腫瘤(0/9合併之完全反應者)，顯示完全反應者之100%保留對MBT2腫瘤再攻擊之穩健免疫記憶。此等結果指示在經歷腫瘤之動物中產生對腫瘤抗原之持久且強效記憶反應，且表明初始暴露中之腫瘤清除與適應性免疫反應相關。此適應性免疫反應足以破壞腫瘤細胞，阻止腫瘤建立且將表明此等動物中對癌轉移或腫瘤復發之持續抑制。此外，其展現初級免疫反應期間之TGFβ1抑制不干擾記憶淋巴球群體之發育。
來自MBT-2腫瘤模型之此等再攻擊結果表明，對TGFβ1及PD-1之組合抑制足以在此等動物中建立持久且強效抗腫瘤免疫記憶。2 . CloudmanS91 中之持久抗腫瘤效應
值得注意地，儘管抗PD-1/Ab6組合組中之數個帶有CloudmanS91腫瘤之小鼠經歷完全反應，但一些動物在剩餘治療期內負載較小但穩定之殘餘腫瘤塊。吾人試圖在此模型中再現如吾人在MBT-2中具有之腫瘤再攻擊資料。然而，在此模型中腫瘤攜帶率可變，使得此分析更具有挑戰性。實際上，吾人選擇停止處理且跟蹤動物數週。
處理停止後六週，在處理停止時不具有可量測腫瘤之小鼠保持無腫瘤。投藥停止時可量測腫瘤具有混合反應，其中許多已清除，但少數保持穩定或過度生長(圖 11D )。此等資料強調保持處理直至達成完全腫瘤清除的重要性(亦參見實例 5 )。3 . EMT - 6 中之 持久抗腫瘤效應
引人注目地，吾人在EMT-6乳房癌模型中觀測到對抗PD-1/Ab6-mIgG1組合之類似反應，伴隨組合處理後50%完全反應率，及優於抗PD-1之顯著存活優點(圖 34A 及圖 34C )。與其中TGFβ1為主要表現之異構體的MBT-2及CloudmanS91相比，EMT6在RNA及蛋白質層級均表現類似含量之TGFβ1及TGFβ3。此處理組合比抗PD-1/泛TGFβ抑制更有效，表明甚至在多個TGFβ異構體存在下，TGFβ1為免疫排除及因此原發抗性之主要驅動子。在此模型中，吾人停止處理且再次發現，投藥停止後六週，完全反應者保持無腫瘤，再次表明反應之持久性(圖 34C ，右 )。 實例 9 ：抗體篩選、選擇方法及表徵
考慮到成熟TGFβ1生長因子與其緊密相關家族成員TGFβ2及TGFβ3之間的高序列及結構相似度，吾人推論，產生靶向TGFβ1生長因子之此活性形式之基於選擇性及足夠高親和性抗體的抑制劑將證明具有挑戰性。最近報導之經由與某些整合素之相互作用對深入潛伏TGFβ1結構及其活化之機械態樣的洞察，已指向旨在阻止潛伏複合物活化作為作用機制之靶向潛伏TGFβ1複合物中之前域的可能性。
在結合及活化抑制兩者中達成異構體選擇性將利用家族成員前域之間的較低序列類似性，該等前域約束各別生長因子均二聚體且使其無活性。鑑別TGFβ1活化之選擇性抑制劑的另一關鍵考慮因素為以下事實，潛伏TGFβ1組裝成二硫鍵連接的大型潛伏複合物(LLC)，其允許無活性生長因子複合物沈積至胞外基質上或其在細胞表面上之加工物上。考慮到似乎有可能多個TGFβ1 LLC可在腫瘤微環境中表現，對來自TCGA之RNAseq資料進行分析。基本上所有腫瘤類型顯示表現四種前TGFβ1呈遞分子LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33之證據(圖 20E )。吾人因此試圖鑑別將在所有此等局部情形下結合且抑制潛伏TGFβ1活化之特異性抗體。
對於經仔細設計之基於酵母菌之初始人類抗體呈現庫之篩選中之陽性選擇步驟，對各TGFβ1 LLC之可溶性鼠類及人類形式進行設計、表現、純化、表徵及使用。為確保對選擇性潛伏TGFβ1結合子之鑑別，亦在陰性選擇步驟中使用非複合LLC呈遞分子。
使用人類及鼠類形式之TGFβ1 LLC (LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1及GARP-前TGFβ1)作為陽性選擇抗原，且對人類及鼠類LLC呈遞分子(LTBP1、LTBP3及GARP)進行反選擇(counter-selecting)，經由基於酵母菌之初始完全人類IgG抗體文之選擇，鑑別親本抗體。選擇為多輪過程，其包括兩輪磁珠輔助之細胞分選(MACS)及數個後續輪之螢光活化細胞分選(FACS)。MACS輪包括預清除(以移除非特異性結合子)、與經生物素標記之抗原一起培育、洗滌、溶離及酵母菌擴增。FACS選擇輪包括與經生物素標記之抗原一起培育、洗滌及藉由流式細胞量測術選擇結合(對於陽性選擇)或非結合(對於陰性或去選擇)群體，隨後藉由在適當酵母菌生長培養基中生長，擴增所選擇酵母菌。在在溶液相中進行所有選擇。
數百獨特抗體以全長人類IgG1agly (去糖基化Fc)單株抗體形式表現。隨後將此等抗體藉由生物層干涉術表徵，以測定其結合人類及鼠類LTBP1-前TGFβ1、LTBP3-前TGFβ1及GARP-前TGFβ1之能力。在基於細胞之效力篩選分析(LTBP-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1分析)中對結合至此等TGFβ1 LLC之抗體進行測試及分級排序。抑制性抗體以與人類IgG4sdk Fc重組方式表現(鉸鏈藉由S228P突變穩定化；Angal, 1993)，且其抑制活性在整合素介導之TGFβ1活化分析(LTBP-前TGFβ1、GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1分析；參見實例 2 )中測試。在報導體細胞分析中，數種抗體能夠顯著抑制前TGFβ1。基於抗體Ab4結合人類及小鼠前TGFβ1複合物且抑制所有人類及小鼠前TGFβ1 LLC之整合素介導之活化的能力，將該抗體選為用於親和性成熟之主導抗體。
使用兩種不同抗體工程改造策略，以兩個階段完成Ab4之親和性成熟。在第一階段中，產生抗體分子庫，其中親本CDRH3與具有CDRH1及CDRH2變異體之預製抗體文庫組合(H1/H2混洗)。針對與人類及小鼠前TGFβ1複合物之結合選擇此庫。隨後將來自親和性成熟操作之此階段的最強結合子向前移動至親和性成熟之第二階段，其中使用引子二聚體步移方法使親本分子之重鏈CDR3經受突變誘發(H3寡核苷酸突變)，且針對與人類及小鼠前TGFβ1複合物之結合選擇所產生之變異體庫。
針對潛伏TGFβ1 LLC之抗原結合及抑制，再對代表來自兩個親和性成熟階段之主導抗體Ab4之親和性最佳化後代的總共14種抗體進行測試。選擇Ab6，此係由於其對所有四種潛伏TGFβ1 LLC具有高親和性，對小鼠、大鼠及食蟹獼猴蛋白質具有交叉反應性，且在基於細胞之分析中具有提高的效力。
為進一步表徵Ab6之結合特性，在MSD-SET分析中量測活體外結合活性。證實Ab6對潛伏TGFβ1複合物具有選擇性(參見圖 33A )；未偵測到與潛伏TGFβ2或潛伏TGFβ3複合物之有意義結合。類似地，未偵測到與未與前域締合之活性(成熟) TGFβ1生長因子自身的結合。如下文所示，Ab6以高親和性結合至所有大型潛伏TGFβ1複合物(亦即，呈遞分子+前TGFβ1)。此外，顯示Ab6具有期望物種交叉反應性；該抗體識別大鼠及食蟹獼猴對應物且以高親和性與其結合。表 21. Ab6 跨物種特異性
Figure 108124516-A0304-0022
為了測試Ab6抑制潛伏TGFβ1藉由整合素活化之能力，開發一系列基於細胞之活化分析，其對應於實現TGFβ1呈遞及活化之LLC情形中之每一者。人類LN229神經膠母細胞瘤細胞表現αVβ8整合素，其可活化潛伏TGFβ1複合物。此等細胞亦內源性表現LTBP1及LTBP3 (如藉由qPCR)所量測，其在經編碼TGFβ1之質體轉染時，使得能夠產生此等TGFβ1 LLC (LTBP1-前TGFβ1及LTBP3-前TGFβ1)且將此等沈積至細胞外基質中。為了產生含細胞締合之GARP或LRRC33之TGFβ1 LLC (GARP-前TGFβ1及LRRC33-前TGFβ1)，將LN229細胞(藉由qPCR量測，其並不表現此等基因)與編碼此等呈遞分子中之一者的表現構築體以及TGFβ1表現構築體共轉染。一旦沈積至細胞外基質中或在LN229細胞之細胞表面上加工，則TGFβ1 LLC接著可藉由由相同細胞表現之αVβ8整合素變為經活化的。藉由整合素活化自潛伏複合物釋放之成熟(活性) TGFβ1生長因子隨後自由接合在共培養細胞上之其同源受體，該等細胞經使得能夠量測生長因子活性之CAGA12-螢光素酶啟動子報導體工程改造。
在上文所提及之分析條件下，所有TGFβ1 LLC容易地活化。GARP或LRRC33共轉染至表現潛伏TGFβ1之LN229細胞引起顯著較高TGFβ信號，與TGFβ1 LLC在細胞表面上之形成及活化一致，且競爭力超過內源性LTBP。Ab6以濃度依賴性方式抑制所有複合物之活化，其中IC50值在1.15與1.42 nM之間。對小鼠TGFβ1複合物之抑制效力類似，符合Ab6之物種交叉反應性。與缺少Ab6與LTBP1-TGFβ3複合物之顯著結合一致，在經相同設計之分析中觀測到對整合素介導之LTBP-TGFβ3 LLC活化複合物之極少抑制至無抑制，由此表明對TGFβ1活化之抑制的選擇性(圖 33B )。
值得注意地，Ab6亦抑制潛伏TGFβ1由人類血漿激肽釋放酶及纖維蛋白溶酶之活化(參見圖 5A 及圖 5B )，表明多個推定活化機制可受此抗體抑制。
為進一步評估Ab6抑制TGFβ1活化之生物相關結果的能力，吾人評定此抗體抑制初代人類Treg細胞之關鍵抑制活性的能力。經分選CD4+CD25hi CD127lo Treg細胞在T細胞受體刺激後上調TGFβ1-GARP LLC之表面表現(圖 26A )。此等經活化Treg細胞抑制自體效應CD4 T細胞之增生，且Ab6在低至1 µg/ml之濃度下阻斷此抑制Treg活性(圖 26B )。此等結果與Treg細胞利用TGFβ信號傳遞抑制T細胞之先前觀測結果一致。 實例 10 . 確定 Ab5 、 Ab6 及 Ab3 結合於 前 TGF β 複合物中何處之抗原決定基定位
為獲得深入TGFβ1活化之異構體選擇性抑制劑之抑制性作用機制的初始洞察，吾人進行氫-氘交換質譜(H/DX-MS)分析以鑑別潛伏TGFβ1與抗體相互作用之可能位點。氫/氘交換質譜(HDX-MS)為在溶液中探究蛋白質構形之廣泛使用之技術。HDX-MS方法描述於Wei等人, Drug Discov Today. 2014年1月; 19(1): 95-102中，其以全文引用之方式併入本文中。簡言之，HDX-MS依賴於蛋白質主鏈醯胺氫與溶液中之氘交換。弱氫鍵中所涉及或位於蛋白質表面處之主鏈醯胺氫可快速交換，而埋藏於內部中之彼等氫或穩定化氫鍵中所涉及之彼等氫較緩慢地交換。藉由量測主鏈醯胺氫之HDX速率，吾人可獲得關於蛋白質動力學及構形之資訊。
在樣品緩衝液(20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.5)中製備潛伏TGFβ1 (15 µM)及前TGFβ1/Ab Fab (1:3莫耳比)。在非氘化實驗中，在室溫下將各樣品與樣品緩衝液(1:15，v/v)混合，隨後在0℃與1:1 (v/v)猝滅緩衝液(100 mM磷酸鈉，4 M胍HCl，0.5 M TCEP)混合。緊接著利用HDX技術將猝滅樣品注入至nanoACQUITY UPLC™系統(Waters Corp., Milford, MA, USA)中，以便進行柱上胃蛋白酶消化。將溶離液導向至SYNAPT® G2 HDMS質譜儀(Waters Corp., Milford, MA, USA)中，以便以MSE模式分析。對於H/D交換實驗，在25℃下將各樣品與標記緩衝液(於氧化氘中之20 mM HEPES，150 mM NaCl，pD 7.5) (1:15, v/v)混合，以起始標記反應。在不同時間間隔標記各樣品之五個等分試樣：10 s、1 min、10 min、1 h及2 h。在各標記時間點結束時，藉由添加1:1 (v/v)猝滅緩衝液猝滅反應，且將猝滅樣品注入至Waters H/DX-MS系統中以供分析。在各樣品運行之間，藉由將胃蛋白酶洗滌緩衝液(1.5 M胍HCl，4%乙腈，0.8%甲酸)注入至H/DX-MS系統運行清潔空白組(clean blank)。
使用非資料依賴性採集模式(MSE)中之準確質量及碰撞誘導之解離及ProteinLynx Global Server (PLGS) 3.0軟體(Waters Corp., Milford, MA)，在用於H/DX-MS實驗之相同UPLC-ESI-QToF系統上所分析之非氘化蛋白質樣品中的胃蛋白酶肽。將由PLGS產生之胃蛋白酶肽導入至DynamX 3.0 (Waters Corp., Milford, MA)，其中MS1信號強度之肽品質臨限≥1000，且最大質量誤差為1 ppm。手動檢驗自動化結果，以確保各種電荷狀態下之對應m/z及同位素分佈正確地歸屬於適當胃蛋白酶肽。使用DynamX 3.0以產生各胃蛋白酶肽之相對氘併入曲線及H/DX熱圖。藉由自各標記時間點處氘標記樣品之同位素分佈的重量平均質心質量，減去非氘化對照樣品之同位素分佈的重量平均質心質量，測定各肽之相對氘併入。在相同實驗條件下進行所有比較，由此在氘併入測定中消除對反交換校正之需求。因此，H/D交換量以相對值形式報導。藉由將各胃蛋白酶肽之相對氘吸收除以其理論最大吸收來計算相對氘吸收分率。所有H/DX-MS實驗重複進行兩次，且如所描述計算平均氘吸收之不確定度的98%置信界限。未結合與Fab結合之潛伏TGFβ1之間超過0.5 Da之氘吸收差異視為顯著。
進行HDX-MS以確定Ab5及Ab6結合於前TGFβ複合物中何處。在HDX-MS中，與抗體緊密結合之抗原的區歸因於蛋白質-蛋白質相互作用，受保護免於質子交換，而暴露於溶劑之區可容易地經歷質子交換。基於此，鑑別出抗原之結合區。
熱圖顯示Ab5 Fab結合引起前TGFβ1之區(1區及2區)中的HDX保護(圖 16 )。圖 17 描繪前TGFβ1複合物之結構，其上覆有由Ab5結合之HDX保護區。值得注意地，HDX-MS顯示Ab5潛在結合至前TGFβ1之LAP/生長因子區中之獨特抗原決定基。
進行類似HDX研究以鑑別Ab6與前TGFβ1之結合中所涉及的結合區。達成約90%之極佳肽覆蓋率。該分析展現潛伏TGFβ1上之三個區藉由Ab6 Fab結合而受保護免於氘交換。圖 18A 中所提供之熱圖顯示前TGFβ1之受Ab6與抗原之相互作用影響的某些區。抗原之此等區域由圖中所示的紅色方框標示。圖 18B 顯示前TGFβ1複合物之結構，且圖 18A 中所鑑別之區經相應標記，以顯示前TGFβ1複合物內此等區域之空間關係。
如圖 18A 中所示，發現用星號(*)標記的受保護區與針對Ab5所鑑別之1區相同。發現用雙星號(**)標記的受保護區為針對Ab5所鑑別之2區的子集。此等資料表明，顯示有利抑制活性之較佳抗體可結合包括潛伏複合物之潛伏套索(潛伏環)之一部分的抗原決定基。資料亦表明，此類抗原決定基可為由潛伏套索之一部分及生長因子域之一部分形成的組合性抗原決定基，其可以鎖定狀態有效地「夾持」生長因子，藉此阻止生長因子之釋放。
統計分析展現前TGFβ1上之三個結合區藉由Ab6 Fab結合受強力保護免於氘交換(圖 19A )。1區在潛伏TGFβ1前域內，而2區及3區定位至TGFβ1生長因子。引起關注地，1區在很大程度上跨越潛伏套索，且含有纖維蛋白溶酶及激肽釋放酶蛋白酶兩者之蛋白水解裂解位點；對此區之保護與Ab6抑制潛伏TGFβ1之激肽釋放酶及纖維蛋白溶酶介導之活化的吾人之觀測結果一致(圖 5A 及圖 5B )。重申Ab6不結合至呈自由形式(例如，不與前域締合)之三種TGFβ生長因子二聚體中之任一者亦為重要的，其暗示與生長因子域上位點之任何潛在相互作用依賴於前域相互作用。此外，Ab6及整合素αVβ6可同時結合至潛伏TGFβ1。此觀測結果表明整合素依賴性TGFβ1活化之異位抑制機制，此係由於抗體結合區處於帶有整合素識別位點之TGFβ1前域中之觸發環的遠端(RGD；圖 19B )。另外，對推定抗原決定基區1至3 (尤其1區及2區)之序列比對展現遍及三種TGFβ異構體之顯著序列分異度，其有可能解釋相對於前TGFβ2及前TGFβ3複合物，Ab6對前TGFβ1之所觀測到的選擇性(圖 19B )。 實例 11 ： 對 TGFB1 、 TGFB2 及 TGFB3 之相對表現的生物資訊學分析
對人類腫瘤樣品之先前分析將TGFβ信號傳遞暗示為對CBT之原發抗性的重要貢獻因素(Hugo等人2016)。此等研究中之一者展現，尿道上皮癌中之TGFΒ1基因表現為與抗PD-L1處理無反應者相關之評分最高的TGFβ路徑基因之一，表明此異構體之活性可驅動TGFβ信號傳遞。
為評估癌性腫瘤中之TGFβ異構體表現，檢查來自公開可用的資料集之基因表現(RNAseq)資料。使用公開可用的線上介面工具(Firebrowse)以檢查癌症基因組圖譜(TCGA)中TGFβ異構體(TGFB1、TGFB2及TGFB3)之表現，首先檢測在正常及癌組織兩者中編碼TGFβ異構體之RNA的差異性表現。遍及人類癌症類型群體以及在個別腫瘤內評估TGFB1、TGFB2及TGFB3 mRNA表現。選擇存在正常組織比較物的TCGA資料庫中的所有腫瘤RNAseq資料集，且檢查TGFB1、TGFB2及TGFB3基因之表現(圖 20A )。來自Firebrowse介面之資料表示為百萬中每千鹼基讀數(RPKM)之log2。
此等資料表明，在大多數腫瘤類型(灰色)中，TGFB1為最充分表現之TGFβ異構體之轉錄物，伴隨log2(RPKM)值一般在4至6範圍內，對比之下，TGFB2呈0至2，且TGFB3呈2至4。亦請注意，在若干腫瘤類型中，TGFB1及TGFB3兩者表現之平均量相對於正常比較物樣品(黑色)有所升高，其表明此等TGFβ異構體表現之增加可能與癌細胞相關。此係因為TGFβ信號傳遞在癌症微環境中抑制宿主免疫系統之潛在作用，吾人感興趣地注意到，TGFB1轉錄物在批准抗PD-1或抗PDL1療法之癌症類型中升高，此等適應症在圖 20A 上以灰色標記。
應注意，儘管RPKM ＞ 1一般被視為與生物學相關基因表現相關的最小值(Hebenstreit等人, 2011；Wagner等人, 2013)，然而對於後續分析，使用＞ 10或＞ 30之較嚴格RPKM(或相關量度FPKM(參見Conesa等人，2016))截止值以避免假陽性。出於比較，所有三個彼等臨限值均指示在圖 20A 上。
圖 20A 中之大四分位距指示個體患者中TGFβ異構體表現的顯著變化。為了鑑別其中患者群之至少一子集患有對TGFβ1異構體有不同表現的腫瘤，分析來自TCGA資料集中之個體腫瘤樣品的RNAseq資料，計算百萬中每千鹼基片段之數目(FPKM)。RPKM與FPKM大致相等，但FPKM對同一轉錄物之相對端處的重複計數讀數進行校正(Conesa等人，2016)。若轉錄物FPKM值＞ 30，則腫瘤樣品評估為對TGFβ1、TGFβ2或TGFβ3表現呈陽性，且計算表現各TGFβ異構體之各癌症類型之患者的百分率(表示為%)(圖 20B )。
對來自癌症基因組圖譜(TCGA)之RNAseq資料的比較性分析展現，在三種家族成員中，TGFB1表現似乎遍及大部分腫瘤類型最普遍。值得注意的例外為乳癌、間皮瘤及前列腺癌，其中與TGFB1相比，其他家族成員，尤其TGFB3之表現至少同樣普遍。如圖 20B 中所示，大部分腫瘤類型顯示顯著百分比之呈TGFβ1陽性個別樣品，其中一些癌症類型，包括急性骨髓白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤及頭頸部鱗狀細胞癌，在所有腫瘤樣品之超過80%中表現TGFβ1。與圖 20A 中之資料一致，較少癌症類型對TGFβ2或TGFβ3呈陽性，但若干癌症顯示呈TGFβ3陽性之相同或更高百分比之腫瘤樣品，包括乳房侵襲性癌、間皮瘤及肉瘤。此等資料表明，可針對TGFβ異構體表現對癌症類型分級，且此類分級可適用於鑑別作為用TGFβ異構體特異性抑制劑進行之處理的候選者的患者。
為進一步研究此假設，對來自一小類個別腫瘤樣品之log2(FPKM) RNAseq資料進行分析且將其繪製於熱圖中(圖20C)，設定色彩臨限以將FPKM ＞ 30反映為評為TGFβ異構體陽性之最低轉錄物含量。在七種CBT批准腫瘤類型中對個別腫瘤樣品中之TGFB1 mRNA表現進行分級排序證實，與TGFB2及TGFB3相比，較高且較頻繁之TGFB1 mRNA之表現，同樣伴隨乳房癌之值得注意的例外。此等及尿道上皮癌中之先前所公開之觀測結果表明，在大部分人類腫瘤中，TGFβ路徑活性可能由TGFβ1活化驅動。
各樣品在熱圖表示為單列，且藉由TGFβ1表現量(頂部處為最高表現量)排列樣品。與圖 20B 中之分析一致，各癌症類型中有大量樣品對TGFB1表現呈陽性。然而，此圖示亦強調以下事實，多種腫瘤僅表現TGFB1轉錄物，尤其在食道癌、膀胱尿道上皮癌、肺腺癌及皮膚黑素瘤癌症類型中。引起關注地是，此類TGFB1偏斜並非所有癌症之特徵，因為來自乳房侵襲性癌之樣品顯示呈TGFB3陽性之樣本數目要比TGFB1陽性多得多。然而，此分析指示β1異構體占主要，且在大部分情況下，為來自大量癌症患者之腫瘤中所存在之唯一TGFβ家族成員。結合資料表明，TGFβ信號傳遞在癌症微環境中的免疫抑制中起重要作用，此等結果亦指出TGFβ1特異性抑制在此等腫瘤之治療中的實用性。
為了鑑別其中測試TGFβ1特異性抑制作為癌症療法之功效的小鼠模型，分析來自小鼠同基因型腫瘤模型中所用的多種細胞株的RNAseq資料中之TGFβ異構體表現。對於此分析，生成兩個資料圖示。首先，吾人生成來源於各細胞株之腫瘤之log2(FPKM)值的熱圖(圖 20D ，左 )。因為進行此分析以鑑別將再現人類腫瘤(主要TGFB1)之同基因型模型，所以吾人主要關注避免假陰性，且吾人將吾人之「陽性」臨限設置在FPKM＞1下，遠低於圖 20B 及圖 20C 中之圖示中。
如圖 20D (左 )中之資料圖示清楚示出，數種同基因型腫瘤，包括MC-38、4T-1及EMT6，通常表現顯著量之TGFβ1及TGFβ3兩者。相比之下，A20及EL4模型幾乎完全表現TGFβ1，且S91及P815腫瘤顯示對TGFB1表現之強烈偏向。
為了進一步評估TGFB1相對於TGFB2及/或TGFB3之差異表現，計算minΔTGFB1，其定義為log2(FPKMTGFB1 ) - log2(FPKMTGFB2 )或log2(FPKMTGFB1 ) - log2(FPKMTGFB3 )之較小值。各模型之minΔTGFB1如圖 20D (右 )中之熱圖所示，且強調來自圖 20D (左 )之以下結論，來自A20、EL4、S91及/或P815細胞株之同基因型腫瘤可表示測試TGFβ1特異性抑制劑之功效的極佳模型。
為進一步證實相比於TGFβ2或TGFβ3，TGFβ1表現與對CBT之原發抗性的關聯，吾人使異構體表現與先天抗PD-1抗性特徵(「IPRES」)相互關聯(Hugo等人, Cell. 2016年3月24日;165(1):35-44)。簡言之，IPRES為26種轉錄組特徵之集合，其共同指示腫瘤對抗PD-1療法之抗性。IPRES特徵指示間葉細胞轉化、細胞黏附、ECM改造、血管生成及傷口癒合之調控中所涉及的基因表現增加。遍及七種CBT批准腫瘤類型，吾人較一致地發現與其他兩種TGFβ異構體相比，TGFB1 mRNA含量與IPRES評分之間正向且顯著相關性(圖 37A )。綜合而言，此等資料表明對TGFβ1活性之選擇性抑制可克服對CBT之原發抗性。
在CBT批准療法之情況下，對遍及TCGA定義之腫瘤類型之IPRES (先天抗PD-1抗性)轉錄特徵的基因組變異分析(GSVA)，與TGFβ1 RNA豐度最強烈且顯著相關(皮爾森(Pearson)係數)，對於存在表現，FPKM截止值≥ 30。綜合而言，此等資料表明對TGFβ1活性之選擇性抑制可克服對CBT之原發抗性。
在CBT批准療法之情況下，對遍及TCGA定義之腫瘤類型之IPRES (先天抗PD-1抗性)轉錄特徵的基因組變異分析(GSVA)，與TGFβ1 RNA豐度最強烈且顯著相關(皮爾森係數)，對於存在表現，FPKM截止值≥ 30。
為評估進一步與對CBT之抗性的相關TGFβ1表現，在CDT批准療法之情況下，遍及TCGA定義之腫瘤類型，將TGFβ1 RNA豐度與Plasari TGFβ路徑(先天抗PD-1抗性)轉錄特徵之基因組變異分析(GSVA)相比。plasari基因組獲自mSigDB入口網站(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)且基因組評分計算值使用R中之GSVA包確定(Hanzelmann等人,BMC Bioinformatics 201314:7, 2013; 及Liberzon等人,Bioinformatics . 2011年6月15日; 27(12): 1739-1740)。如圖 37B 中所示，GSVA與TGFβ1 RNA豐度最強烈且顯著相關(皮爾森係數)，對於存在表現，FPKM截止值≥ 30。
此等資料表明在大部分人類腫瘤中，TGFβ路徑活性可能由TGFβ1活化驅動。
以下資源用於上文所描述之生物資訊學分析： TGFβ異構體TCGA表現資料自UCSC Xena Browser資料集資源(https://xenabrowser.net/datapages/)下載。確定高表現之表現截止值藉由檢查TGFβ異構體資料之FPKM值的分佈來確定。使用GraphPad Prism生成熱圖及散佈圖。plasari基因組獲自mSigDB入口網站(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)且基因組評分計算值使用R中之GSVA包確定。 實例 12 ： 在安全性 / 毒理學研究中 ， 相較於 ALK5 激酶抑制劑 LY2109761 及泛 TGFβ 抗體 ， TGF β 1 選擇性抑制劑展現減小之毒性
為了評估相較於小分子TGF-β I型受體(ALK5)激酶抑制劑LY2109761及泛TGFβ抗體(hIgG4；中和)，Ab3及Ab6之潛在活體內毒性，在大鼠中進行安全性/毒理學研究。選擇大鼠作為此安全性研究之物種選擇係基於前述報告稱，相較於小鼠，大鼠對TGFβ抑制較敏感。大鼠中觀測到之相似毒性亦已在其他哺乳動物物種，諸如狗、非人類靈長類動物以及人類中觀測到。
簡言之，用呈3 mg/kg (第1組，n=5)、30 mg/kg (第1組，n=5)或100 mg/kg (第1組，n=5)之Ab3；呈10 mg/kg (第1組，n=5)、30 mg/kg (第1組，n=5)或100 mg/kg (第1組，n=5)之Ab6；呈3 mg/kg (第1組，n=5)、30 mg/kg (第1組，n=5)或100 mg/kg (第1組，n=5)之泛TGFβ抗體；呈200 mg/kg (第1組，n=5)或300 mg/kg (第1組，n=5)之LY2109761；或PBS (pH 7.4)媒劑對照(第1組，n=5)來投與雌性費雪(Fisher) 344大鼠(圖 21A 及圖 21B )或史泊格多利(Sprague Dawly)大鼠(圖 21C )。
在10 mL/kg之體積下靜脈內投配接受泛TGFβ抗體之動物一次(在第1天)，且在第8天處死且進行屍體剖檢。在10 mL/kg之體積下每週一次靜脈內投配接受Ab3或Ab6任一者之動物持續4週(在第1、8、15及22)天。藉由經口管飼每日一次投配接受LY2109761之動物持續五或七天。在第29天處死動物且進行屍體剖檢。
每日進行兩次對動物之一般臨床觀測，且給藥後進行籠邊觀測以評估急性毒性。進行其他觀測，包括每週一次之食物消耗評定及體重量測。此等亦包括臨床病理學(血液學、血清化學及凝血)及解剖病理學(總體及顯微)評估。在屍體剖檢時收集組織之全面集合以供顯微評估。將組織保藏於10%中性緩衝福馬林中，修整、常規加工且包埋於石蠟中。用切片機對石蠟塊進行切片且切片藉由蘇木素及伊紅(H&E)染色。特定而言，藉由沿垂直於肺動脈之平面縱向等分修整心臟，以暴露右房室瓣、左房室瓣及主動脈瓣。提供兩個半邊以供包埋。將各心臟半切片包埋於石蠟中，其中切割表面向下。對塊體進行切片以獲得至少三個心臟瓣膜。由美國獸醫病理學家學會(American College of Veterinary Pathologists；ACVP)之委員會認證成員藉由光學顯微術檢查組織切片。
如表20及圖 21 中所示，投與≥ 3 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物展現與投與LY2109761之動物中所述之心臟瓣膜結果(亦即，瓣膜病)相似的結果。投與≥ 30 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物展現與投與LY2109761之動物之心房結果相似的心房結果。投與100 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物展現與投與LY2109761之動物中所述之心肌結果相似的心肌結果，且投與30 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物出現心肌出血。投與100 mg/kg之泛TGFβ抗體的一隻動物在冠狀動脈中出現中度壁內壞死及出血，其與輕度血管周混合發炎細胞浸潤相關。投與泛TGFβ抗體及LY2109761之動物中的骨結果由肉眼可見的異常形狀之胸骨以及胸骨之終板及股骨及脛骨之生長板中的肥大區厚度出現微觀增加組成；與泛TGFβ抗體相比，在投與LY2109761之動物中此等結果具有較高發生率及/或嚴重程度。表 22 . 接受泛 TGF β 抗體之動物中的微觀心臟結果
Figure 108124516-A0304-0023
如圖 21A 中所示，投與泛TGFβ抗體之動物展現與投與LY2109761之動物中所述之毒性相似的毒性，如PCT/US2018/012601中所述，其以全文引用之方式併入本文中。具體言之，投與≥ 3 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物展現與投與LY2109761之動物中所述之心臟瓣膜結果(例如瓣膜病)相似的結果。投與≥ 30 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物展現與投與LY2109761之動物中所述之心房結果相似的心房結果。投與100 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物展現與投與LY2109761之動物中所述之心肌結果相似的心肌結果，且投與30 mg/kg之泛TGFβ抗體的動物出現心肌出血。投與100 mg/kg之泛TGFβ抗體的一隻動物在冠狀動脈中出現中度壁內壞死及出血，其與輕度血管周混合發炎細胞浸潤相關。投與泛TGFβ抗體及LY2109761之動物中的骨結果由肉眼可見的異常形狀之胸骨以及胸骨之終板及股骨及脛骨之生長板中的肥大區厚度出現微觀增加組成。如圖 21B 及圖 21C 中所示的伴隨LY2109761及泛TGFβ之後續研究亦證明相似毒性。在經TGFβ之泛抑制劑處理之動物中，特徵在於歸因於出血、內皮增生、混合發炎性細胞浸潤及/或基質增生，心臟瓣膜增厚的所觀測到之心臟瓣膜病與先前所報導之結果一致。
相比之下，不同於經泛TGFβ抗體或LY2109761處理之動物，經TGFβ1選擇性抑制劑，亦即Ab3或Ab6投與之大鼠，在此等研究中Ab6及Ab3兩者之無觀測到的不良反應量(NOAEL)為100 mg/kg週劑量，其為所測試之最高劑量。如圖 21B 中所示，僅在少數經Ab3處理之動物中出現微小或輕度心臟瓣膜結果，且歸因於低發生率(動物及動物內之心臟瓣膜數)、缺少與其之劑量反應或相關度及/或缺少並行骨結果，此等結果視為不大可能為測試品相關的。另外，在經Ab6處理之動物中未出現結果(圖 21C )。
藥物動力學分析顯示，在以100 mg/kg投配4週之動物中，Ab6之血清濃度達至2,300 μg/ml。對於100 mg/kg之最高評估劑量，研究終止時(在第29天)之平均Ab6血清濃度達至2.3 mg/ml。此等結果表明，在多個活體內模型中，在超過所觀測到之療效所必需之劑量的劑量下，對TGFβ1活化之選擇性抑制似乎避免關鍵劑量限制性毒性。
總體而言，在大鼠(已知對TGFβ抑制敏感之物種)中歷經4週時段用所測試之所有劑量(3 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg)下的Ab3或Ab6處理之動物，在以下參數中之任一者方面相對於背景未展現毒性作用：心肌退化或壞死；心房出血；心肌出血；瓣膜出血；瓣膜內皮增生；瓣膜基質增生；心臟瓣膜中混合發炎細胞浸潤；礦化；冠狀動脈中出現壞死，伴隨出血；主動脈根部壞死，伴隨發炎；心肌細胞中壞死或發炎細胞浸潤；及瓣膜病。因此，用TGFβ1活化之異構體特異性抑制劑進行之處理出人意料地產生相較於泛TGFβ抑制劑處理(例如，ALK5激酶抑制劑LY2109761或泛TGFβ抗體)，明顯改善之安全概況，例如降低之死亡率、降低之心臟毒性及減少之骨結果。
亦在非人類靈長類動物(食蟹獼猴)中進行GLP毒理學研究以評估高親和性、TGFβ1選擇性之抑制劑Ab6的安全概況。方案涉及每週30、100及300 mg/kg下之4週重複劑量，之後為4週恢復。
Ab6在30、100及300毫克/公斤/週下良好耐受。在主要組及恢復組中均未注意到不良的Ab6相關結果。在為泛TGFβ抑制劑之情況下所觀測到之毒性位點的目標器官中，未注意到Ab6相關結果(例如：無心臟毒性、增生及發炎、牙及牙齦結果)。
在300 mg/kg之5週劑量之後，Ab6血清濃度達至15,600 µg/mL。在恢復時間結束時，Ab6血清濃度水準保持較高，處於約2,000至3,000 µg/mL。
基於此等資料，食蟹獼猴中Ab6之NOAEL為300毫克/公斤/週，其為所測試之最高劑量。 實例 13 ： 抗 PD - 1 / Ab3 組合對瘤內免疫細胞之影響
先前報告在臨床前動物模型中檢查效應T細胞自免疫抑制腫瘤之排除。
然而，此等報導未提供對巨噬細胞之洞察。為評估該情形下免疫抑制同基因型腫瘤模型中之巨噬細胞浸潤與TGFβ1抑制效應的關係，對來自以上實例7之經抗PD1及30 mg/kg下之Ab3處理的CloudmanS91腫瘤樣品進行免疫組織化學。(參見圖 24A 至圖 24D )。
在來自未接受抗PD1/Ab3組合之動物的對照腫瘤切片中，偵測到一些F4/80陽性細胞，表明腫瘤含有一些巨噬細胞，其可能為M2型，所謂的腫瘤相關巨噬細胞，或TAM。相比而言，在由經抗PD1/Ab3組合處理之動物製備的切片中，在腫瘤內觀測到F4/80陽性細胞之數目的明顯增加(參見圖 24A 至圖 24C )。相比於單獨的抗PD1，在經抗PD-1/Ab3處理之動物中，腫瘤由F4/80陽性巨噬細胞之此廣泛浸潤表明組合處理，而非單獨的抗PD1，誘導細胞之大量流入，其推測起來係由於浸潤腫瘤之循環單核球的募集。為鑑別此等巨噬細胞之表型，將抗CD163用作M2巨噬細胞標記物。如圖 24D 中所示，顯示大部分此等細胞為CD163陰性，表明回應於抗PD1/Ab3組合處理募集至腫瘤之巨噬細胞可能為M1型，由此抗腫瘤次型。此可指示清除由細胞毒性細胞產生之癌細胞碎片的巨噬細胞，且推測起來為TGFβ1抑制之直接結果。 實例 14 . 在 MBT2 腫瘤中 TGF β 1 抑制劑對細胞毒性細胞之影響
顆粒胞外分泌為細胞毒性T細胞接合且殺滅常駐腫瘤細胞所利用之一種機制。在活化後，顆粒與漿膜融合且釋放顆粒之內含物，包括細胞毒素，諸如穿孔蛋白及顆粒酶B，其引起腫瘤細胞消除。另外，CD8抗原 (CD8a)為在大部分細胞毒性T細胞上發現之細胞表面糖蛋白，其充當T細胞受體之共同受體。因此，在經Ab3或Ab6各自與抗PD-1之組合處理的腫瘤中量測CD8a、穿孔蛋白及顆粒酶B含量，以評定效應T細胞活性。方法
用5×105 個MBT2腫瘤細胞植入8至12週齡C3H/HeN雌性小鼠之側腹。將動物隨機分入給藥組，其中在處理起始之前平均腫瘤尺寸為40至80 mm3 。抗PD1 (RMP1-14)以10 mg/kg一週投配兩次。Ab3以30 mg/kg一週投配一次。在8天投藥之後，在最後一劑(總共三次劑量抗PD1，總共兩次劑量Ab3)後8小時處死動物且切除腫瘤。對於Ab6，在處理後第10天或第13天時分析免疫組織。抗PD-1以10 mkg每週投配兩次。Ab6以10 mkg每週投配。將腫瘤在液氮中急驟冷凍，使用cryoPREP衝擊器在Covaris包中粉碎且使用Trizol/氯仿提取RNA。使用Taqman Fast Advanced Master Mix產生cDNA，且利用針對所關注基因之引子及探針將cDNA負載至定製Taqman Array Card中。在Viia7熱循環儀上運行qPCR。將CTL基因之表現按各樣品以HPRT標準化，且相對於單獨的抗PD1，在抗PD1/Ab3或抗PD1/Ab6中表現倍數變化。結果
在腫瘤內，相比於單獨的抗PD1，抗PD1/Ab3之組合誘導與抗腫瘤反應相關之CTL基因的強效上調(參見圖 25 )。在MBT2腫瘤模型中，單獨的抗PD1提供對腫瘤生長之極少抑制及極少抗腫瘤免疫。因此，此等結果表明添加抗TGFβ抗體實現效應CD8 T細胞之完全活化及浸潤。 實例 15 ： Ab3 及 Ab6 對 Treg 活性之活體外影響 方法
利用聚蔗糖將人類PBMC自健康供體膚色血球層(buffycoat)分離。經由磁性選擇來選擇CD4細胞，且隨後使用Biorad S3E將CD25+ CD127lo Treg分選，純系BC96(ThermoFisher)用於CD25hi且純系HIL 7Rm21 (BD Bioscience)用於CD127lo。在TexMacs培養基(Miltenyi)中，將經分選Treg用培養盤包被抗CD3 (純系OKT3，Biolegend)及可溶性抗CD28 (純系28.2，Biolegend)刺激1週。在一些研究中，另外添加IL2以上調GARP及前TGFβ表現。將Treg與經Cell Trace Violet 9invitrogen)染色之自體CD4 T細胞1:1共培養，且再用抗CD3/抗CD28刺激五天。5天後，細胞分裂藉由流式細胞量測術(Attune流式細胞儀，ThermoFisher Scientific)量測，對Cell Trace Violet染料之稀釋閘控，且用FlowJo (BD Bioscience)分析。結果
在培養物中歷時5天，80%之效應CD4 T細胞(Teff)已分裂。Treg 1:1添加將Teff分裂抑制至幾乎15%，且進一步添加10 ug/ml下之Ab3完全抑制Treg介導之對T效應子分裂的抑制(參見圖 26A )。1 μg/ml Ab3較不強效地抑制Treg抑制。1 μg/ml及10 μg/ml兩者之Ab6同等地抑制Treg衍生之TGFβ。因此，Ab6似乎為Treg上GARP-前TGFβ1複合物之TGFβ1活化的較強效抑制劑。 實例 16 ： Ab6 / 抗 PD - 1 組合處理對 MBT2 腫瘤中之瘤內免疫細胞群 / 組織的影響
為開始闡明可介導在經抗PD-1與Ab6之組合處理之小鼠中所觀測到之腫瘤消退效應的各種免疫細胞群，將MBT2腫瘤模型用於FACS研究。研究設計概述於以下。表 23 . MBT2 腫瘤免疫組織研究設計
Figure 108124516-A0304-0024
各研究組含有患如本文所述之MBT2腫瘤的12隻小鼠。Ab6處理組在第1天及第8天以10 mg/kg每週接受該抗體一次。抗PD1處理組在第1、4、8及11天以每次注射10 mg/kg每週處理兩次，每週總共20 mg/kg。各對照IgG組經相應處理以匹配抗PD1及Ab6之IgG次型。如上文所示，在第13天，自小鼠收集腫瘤。
流式細胞量測分析 ：亦藉由腫瘤流式細胞量測術在MBT-2腫瘤中分析腫瘤相關免疫細胞子集。簡言之，將腫瘤切除且稱量，隨後使用用於gentleMACS之Tumor Dissociation Kit (Miltenyi)解離。將樣品經由70 µm細胞過濾器過濾以移除任何聚集物。用FAC緩衝液洗滌Lve單態細胞，隨後施加含有以下之染色混合液：MuTruStain FCX (Biolegend)、抗FcyRIV (Biolegend)、Live/Dead (Thermofisher)、CD45-AF700純系30-F11 (Biolegend)、CD3-PE純系17A2 (Biolegend)、CD4-BUV395純系GK1.5 (BD Biosciences)、CD8-APC-H7純系53-6.7 (BD Biosciences)、CD11b-PerCP-Cy5.5純系M1/70 (Biolegend)、GR-1-FITC純系RB6-8C5 (Biolegend)、FoxP3-APC純系FJK-16s (ThermoFisher)、F4/80-PE-Dazzle純系BM8 (Biolegend)、CD206-BV421純系C068C2 (Biolegend)。在Attune NxT (ThermoFisher)上進行流式細胞量測術且利用FlowJo (BD Bioscience)進行分析。
闡明MBT2腫瘤中T細胞亞群之閘控策略提供於圖 27A 中。結果概述於圖 27B 中，其在處理開始後第13天所收集之腫瘤中量測。如所展現，與抗PD1結合使用之Ab6藉由使得CD8+ T細胞能夠在腫瘤中浸潤及擴增，能夠克服免疫排除。具體而言，抗PD1/Ab6組合誘導瘤內CD8+ T細胞之數目(頻率)的顯著增加，同時遍及處理組未觀測到總活細胞之CD45+細胞%之變化。抗PD1/Ab6組合引起Treg之顯著增加；然而，相對於抗PD1處理，CD8+:Treg比率未顯著改變。
闡明骨髓細胞亞群之閘控策略提供於圖 28A 中。結果概述於圖 28B 中，其在處理開始後第13天所收集之腫瘤中量測。第13天骨髓浸潤物顯示遍及處理組，總免疫細胞(例如，CD45+)之數目保持穩定。總骨髓細胞(例如，CD11b+、F4/80lo - hi )之數目藉由抗PD1/Ab6處理顯著改變。具體而言，在對照組中，骨髓分率構成腫瘤中巨噬細胞群之幾乎75%。此分率在組合處理組中減少至小於一半，其與此組中M2型促腫瘤巨噬細胞之數目(頻率)的明顯減少以及MDSC分率之幾乎完全消除一致，而M1型巨噬細胞保持相對不變。
在細胞之骨髓亞群中，MBT-2腫瘤相關M2巨噬細胞顯示LRRC33之高細胞表面表現(圖 28C )。MDSC亞群亦顯示強LRRC33表現。自MBT-2腫瘤分離之G-MDSC次型的大部分(67.8%)表現細胞表面LRRC，而自MBT-2腫瘤分離之M-MDSC次型的約三分之一表現細胞表面LRRC33 (圖 28D )。
此外，在抗PD1/Ab6處理組中所觀測到之CD8+ T細胞:M2巨噬細胞之比率存在顯著提高(參見圖 29C )。綜合而言，資料展現在與檢查點阻斷療法結合使用時，TGFβ1之異構體選擇性抑制劑可用於克服腫瘤免疫排除。此可至少部分藉由在腫瘤環境中促進CD8+ T細胞浸潤及擴增，同時減少促腫瘤巨噬細胞(M2)及免疫抑制MDSC而介導。有可能此等效應可藉由TGFβ1之GARP臂及LRRC33臂分別介導。
對於免疫組織化學分析，將來自六隻動物之腫瘤切成一半且固定。製備切片以便進行IHC且將切片用各種免疫細胞標記物染色。圖 30 提供第10天或第13天時之代表性影像。如所示，在抗PD1/Ab6組合處理組中觀測到腫瘤內CD8+ T細胞頻率之明顯提高(圖 30D )。資料表明Ab6可結合檢查點阻斷療法使用，以藉由誘導細胞毒性T細胞之浸潤及擴增，克服免疫排除。圖 30E 提供IHC資料之定量，其顯示為總核之CD8陽性細胞%。在此腫瘤模型中，存在很少基線CD8+細胞(例如，「冷」腫瘤)。在經單獨的Ab6或單獨的抗PD-1處理之組中，觀測到CD8+百分比之微小增加(各自約10%)。相比之下，在組合處理組中，達成腫瘤內CD8+細胞頻率之顯著提高，表明TGFβ1抑制與檢查點抑制之組合可藉由克服免疫排除，協同誘發抗腫瘤效應。資料表明組合可將「免疫排除」腫瘤有效轉化成「發炎/熱」腫瘤。
為證實與MBT2腫瘤中所觀測到之免疫反應相關的基因表現變化，進行RNA表現分析。對來自第13天MBT2腫瘤之RNA製品進行基於qPCR之基因表現分析。由每組5至6隻動物製備之RNA用於研究。分析包括用作指定標記物之以下基因的表現量：tprc (CD45)；Cd8a (CD8 T細胞)；Cd8b1 (CD8 T細胞)；Cd4 (CD4 T細胞)；Cd3e (T細胞)；Foxp3 (Treg)；Ifng (Th1免疫)；Prf1 (CTL蛋白)；Gzmb (CTL蛋白)；Gzma (CTL蛋白)；Klrk1 (NK/CTL)；Adgre1 (F4/80巨噬細胞)；Mrc1 (M2巨噬細胞)；Cd163 (M2巨噬細胞)；Cd80 (APC共刺激/M1巨噬細胞)；Ptger2 (腫瘤血管生成)；Nrros (LRRC33)；Tgfb1 (免疫耐受)；18S (管家)； 及Ppib (管家)。
圖 31A 至圖 31D 提供分別Ptprc、CD8a、CD4及Foxp3之免疫反應基因表現的變化。抗PD1/Ab6組合處理誘導MBT2腫瘤中此等轉錄物之含量的顯著增加。此等觀測結果證實抗PD1/Ab6處理誘發CD8+ T細胞之大規模流入，該等細胞裝備有諸如穿孔蛋白及顆粒酶之細胞毒性效應蛋白。
圖 32 提供在第10天或第13天時免疫標記物Ifng、Gzmb、Prf1及Klrk1之基因表現變化。如所示，對此等標記基因之pPCR分析展現，抗PD-1與TGFβ1抑制劑之組合處理誘導腫瘤中溶胞蛋白(顆粒酶B及穿孔蛋白)、Th1免疫(IFNγ)標記物及CTL/NK細胞標記物(Klrk1)之基因表現。此等資料提供支持介導抗腫瘤效應之檢查點抑制與TGFβ1抑制之協同效應的另外證據。
總體而言，此等結果共同顯示藉由檢查點阻斷及TGFβ1抑制誘發之抗腫瘤免疫的穩健動員。具體而言，儘管總體腫瘤浸潤免疫細胞分率遍及處理組保持恆定，但抗PD-1/Ab6組合引起a)瘤內CD8+ T細胞之顯著增加(相比於抗PD-1組，* P＜0.05，雙側T測試)；Treg之顯著增加(* P＜0.05)，然而，CD8+:Treg比率未改變(相比於抗PD-1，n.s.，不顯著)；及c)由免疫抑制M2巨噬細胞及骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)群之減少驅動的與任何其他組相比骨髓細胞之顯著減少(相比於抗PD-1組，* P＜0.05，雙側T測試)。對整個腫瘤溶解產物之定量PCR分析證實CD8效應基因之穩健增加。類似地，抗PD-1與Ab6之組合誘導腫瘤塊內CD8+ T細胞頻率之明顯提高，克服免疫排除。
為證實對TGFβ1下游信號傳遞之影響，在MBT2腫瘤中進行額外免疫組織化學分析以偵測且定位磷酸化SMAD3。如圖 30F 中所示，在經抗PD-1處理之腫瘤內發現磷酸化SMAD3接近於血管內皮富集。用Ab6處理消除此信號，支持以下觀點，TGFβ1抑制可促進瘤內免疫細胞浸潤，藉此將免疫排除腫瘤轉化成對檢查點阻斷起反應之發炎腫瘤。
經抗PD-1處理之動物顯示與腫瘤血管緊密締合之一些浸潤CD8+ T細胞(CD31染色；內皮細胞標記物)。組合處理支持進一步T細胞浸潤。CD8+ T細胞接近血管內皮表明T細胞可自瘤內血管浸潤腫瘤。腫瘤之CD8陽性區域與距CD31陽性血管之距離之間的關係顯示於圖 30G 中。直方圖展現組合處理(TGFβ1抑制及檢查點阻斷)尤其在遠離血管之區域中提高CD8+區域之分率，表明TGFβ1抑制促進CD8+細胞經血管浸潤至腫瘤中，有效地克服或逆轉免疫抑制。 實例 17 ： 異構體選擇性非情形依賴性之 TGF β 1 抑制劑對骨髓增生病之 MPL 模型的影響
先前已描述骨髓纖維化之臨床前MPLW515L模型(參見例如Wen等人, Nature Medicine第21卷, 第1473-1480頁 (2015))。簡言之，接受小鼠經致命輻射，且隨後移植有經具有在W515L處之活化突變之人類血小板生成素受體MPL (MPLW515L)轉導的供體骨髓細胞。此模型中之接受小鼠將在2至3週內罹患白血球增多症、紅血球增多症及血小板增多症。
為評估TGFβ1選擇性抑制在骨髓纖維化之鼠類模型中的影響，在MPLW515L 模型中測試高親和性、異構體特異性、非情形依賴性之TGFβ1抑制劑(Ab6)。簡言之，將五十萬個MPL+ ckit+細胞移植至8至10週齡雌性BALB/c小鼠中。3週後，接受小鼠接受10或30毫克/公斤/週之Ab6或陰性對照IgG (30毫克/公斤/週)每週一次i.p.注射，持續4週(總共5次劑量)。在最後一次劑量後24小時處死小鼠。
進行骨髓之組織病理學以評估Ab6之抗纖維性效果，其如藉由網硬蛋白染色評定。初步資料表明獲自經Ab6處理之動物的骨髓切片顯示抗纖維性效果。自代表性骨髓切片之網硬蛋白染色收集之影像提供於圖 36A 中。在每週接受一次10及30 mg/kg下之Ab6的小鼠中觀測到網硬蛋白纖維(大部分膠原蛋白III)之明顯減少。亦在所測試之第二TGFβ1選擇性抑制劑抗體之情況下觀測到類似但較低程度的抗纖維性效果(資料未顯示)。
對於基於病理學家所進行之骨髓切片之纖維化評分的定量分析，使用由WHO公開之分類系統(Thiele J, Kvasnicka HM, Tefferi A等人Primary myelofibrosis In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL等人(編). WHO Classifications of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues 第4版IARC Press: Lyon, France, 2008, 第44-47頁)對網硬蛋白染色進行評分。簡言之，使用四階層系統(MF-0、MF-1、MF-2及MF-3)對組織學切片進行評分。MF-0之評分指示不具有交叉點(交叉)之分散線性網硬蛋白，對應於正常骨髓。MF-1之評分指示尤其在血管周區域中具有許多交叉點之網硬蛋白的鬆散網狀物。MF-2之評分指示網硬蛋白之彌漫性且密集增加，伴隨大量交叉點，間或伴隨膠原蛋白之病灶性集束及/或病灶性骨硬化。MF-3之評分指示網硬蛋白之彌漫性且密集增加，伴隨大量交叉點，及膠原蛋白之粗集束，其通常與骨硬化相關。
纖維化評分提供於圖 36B 中，表明相比於接受對照IgG之動物，Ab6之劑量依賴型抗纖維化作用。
亦針對各種血液參數，例如骨髓移植後之全血球計數(CBC) (包括白血球(WBC)、血小板(Plt)、血紅蛋白(HB)及血容比(HCT))，使用標準技術評估動物(圖 36C 及圖 36D )。不出人意料地，在處理起始4週後，經IgG對照處理之MPL小鼠似乎表現骨髓纖維化之血液異常特徵，包括增加的WBC及Plt含量。相比於對照IgG動物，經Ab6處理之動物顯示朝向WBC、Plt及HB濃度正常化之劑量依賴型趨勢，以及相比於基線之變化。另外，相比於對照IgG動物，經Ab6處理之動物顯示HCT濃度之統計學上顯著之正常化，以及相比於基線之變化，其中Hct含量似乎截至4週恢復至基線。 實例 18 ： 高親和性 TGF β 1 抑制劑對 EMT - 6 同基因型乳房癌模型之影響
乳癌為美國女性中最常見之癌症且為癌症死亡之第四大主要原因。如圖 20D (左 )及圖 35 中所示，不同於主要表現TGFβ1之許多腫瘤，EMT6腫瘤表現顯著量之TGFβ1及TGFβ3兩者(例如，TGFβ1及TGFβ3共顯性)。此等腫瘤中TGFβ3對免疫排除及CBT抗性之貢獻不明確。
先前，顯示Ab3 (異構體選擇性、情形偏向之TGFβ1抑制劑)在此模型中顯示對腫瘤生長及存活之部分影響，如WO 2018/129329中所描述。
在此等研究中，在EMT6模型中評估異構體選擇性TGFβ1抑制劑及異構體選擇性TGFβ3抑制劑之組合與免疫檢查點抑制劑結合的影響。推論因為此腫瘤與TGFβ1及TGFβ3異構體兩者共顯性，所以此類組合療法可顯示腫瘤消退之功效，同時假設單獨的異構體選擇性抑制劑(TGFβ1或TGFβ3)與檢查點抑制劑結合應產生抑制腫瘤生長之部分效果。
皮下植入EMT6腫瘤。當EMT6腫瘤達至30至80 mm3 時開始處理。抗PD-1以10 mkg每週投配兩次。Ab6以10 mkg每週投配一次。抗TGFβ3中和抗體以30 mkg每週投配一次。
反應者被定義為在研究結束時達成＜ 25%指標體積之腫瘤尺寸的彼等。
出人意料地，Ab6，高親和性、異構體選擇性之TGFβ1抑制劑與抗PD-1抗體組合使用，足以在EMT6中克服檢查點抑制抗性。圖 34A 顯示Ab6及/或抗PD-1對腫瘤生長之影響。在單獨使用時，兩種抗體均未達成顯著腫瘤消退。然而，以組合形式，經處理動物之50% (5/10)達成顯著腫瘤消退(減少至指標腫瘤體積之25%或更小)。此等資料顯示組合療法組中之協同抗腫瘤功效，如藉由完全反應者或腫瘤生長延遲所證明。出乎意料地，添加TGFβ3之異構體選擇性抑制劑未產生附加效果。利用Ab6對TGFβ1異構體進行抑制甚至在瘤內TGFβ3存在下，足以使腫瘤對抗PD-1敏感之觀測結果，支持TGFβ1為驅動疾病相關TGFβ信號傳遞、免疫排除及對CBT之原發抗性的異構體。
相對應地，相比於單獨的抗PD-1，組合療法(TGFβ1+抗PD-1)在經處理動物中達成顯著存活益處(***，P＜0.001對數等級檢定) (參見圖 34B )。處理起始後56天，組合組中60%之動物存活，而在另外處理組中，截至第28天，所有動物已死亡或需要安樂死。
獨立研究(研究2)亦顯示在經Ab6與抗PD-1之組合處理之患有TGFβ1/3陽性EMT6腫瘤的動物中，而非在單獨的任一抗體之情況下的動物中，存活顯著改善(圖34C)。在此模型中，吾人停止處理且在不投藥之情況下跟蹤無EMT-6腫瘤存活者6週(灰色方框)。投藥停止後六週，完全反應者保持無腫瘤，再次表明反應之持久性(圖 34C ，右 )。所報導之數目為在研究結束時不具有可量測腫瘤之動物的數目。相比於經單獨的抗PD-1處理之動物，觀測到組合處理(Ab6+抗PD-1)之顯著存活益處(圖 34D )。 實例 19 ：重組蛋白表現
在經含有所關注cDNA之pTT5質體(NRC Canada)短暫轉染的Expi293F™細胞(Thermo Fisher)中表現重組蛋白。大型潛伏TGFβ複合物藉由將Expi293F™細胞用編碼前TGFβ1、前TGFβ2或前TGFβ3之質體及編碼LLC呈遞蛋白之質體共轉染而產生。相比於全長LTBP (對於人類LTBP1 E873至I1507；對於人類LTBP3 D866至E1039)，所使用含有結合TGFβ之TB3域及側接類EGF域之LTBP片段以提高產率及蛋白質品質。LTBP片段具有C端His標籤以便於純化。製得表現C端加His標籤之GARP或 LRRC33胞外域的穩定Expi293細胞株。將此等穩定細胞用編碼前TGFβ1之質體短暫轉染，以產生具有潛伏TGFβ1之GARP或LRRC33複合物。表現小潛伏TGFβ複合物，其中N端His標籤及形成大型潛伏複合物之半胱胺酸突變成絲胺酸(TGFβ1中之C4S、TGFβ2中之C5S及TGFβ3前域中之C7S)。活性TGFβ生長因子購自R&D Systems。將轉染體在Expi293™ Expression培養基(Thermo Fisher)中培養5天，隨後收集經調節上清液。重組蛋白藉由Ni2+親和性層析法接著尺寸排阻層析法純化(SEC)。蛋白質品質及二硫鍵連接之複合物的形成藉由SDS PAGE及分析SEC證實。抗體藉由Expi293F™細胞經編碼所關注重鏈及輕鏈之pTT5質體共轉染表現。人類IgG4及小鼠IgG1抗體藉由蛋白A捕獲接著SEC純化。藉由質譜分析證實動物模型中所使用之抗體的一致性。 實例 20 ：同基因型小鼠模型
在Morrisville, NC之Charles River Discovery Labs根據IACUC進行鼠類模型。對於MBT-2模型，將8至12週齡C3H/HeN (Charles River)雌性小鼠用異氟醚麻醉，以在側腹皮下植入5×105 個MBT-2腫瘤細胞。將動物分配至平均腫瘤體積為40至80 mm3 之組中，使得所有組具有相同起始體積均值及範圍。對於CloudmanS91模型，將8至12週齡DBA/2 (Charles River)雌性小鼠用異氟醚麻醉，以在側腹皮下植入於50%基質膠中之5×105 個CloudmanS91腫瘤細胞。當平均腫瘤體積達至125至175 mm3 時，將動物分配至組中，使得所有組具有相同起始體積均值及範圍。對於EMT-6模型，將8至12週齡雌性BALB/c小鼠(Charles River)在側腹皮下植入5×106 個EMT-6腫瘤細胞。將動物分配至平均起始體積在30至60mm3 之間的組中，使得所有組具有相同起始體積均值及範圍。對照HuNeg- rIgG1或抗PD-1 (RMP1-14；BioXCell)以10 mg/kg一週投配兩次。Ab6-mIgG1或對照抗體HuNeg-mIgG1以指定劑量一週投配一次。所有抗體腹膜內投配。一週量測兩次腫瘤體積，且當腫瘤達至1,200 mm3 (MBT-2、EMT6)或2,000 mm3 (CloudmanS91)時或潰爛後，藉由CO2 窒息處死動物。腫瘤體積按mm3 = (w2 × l)/2計算。反應者或反應率被定義為處於或低於該模型之指標體積之25%的腫瘤體積。完全反應分類為對於三次或更多次連續量測，腫瘤小於13.5 mm3 。無腫瘤存活者在研究結束時不具有可觸的腫瘤。根據IACUC，歸因於壞死而處死之動物自分析完全移除。
針對選擇再現人類臨床資料之臨床前藥理學模型，考慮三種TGFβ異構體及呈遞分子之相對表現。在MBT-2、S91及EMT6中三種異構體之相對蛋白質表現的ELISA分析提供於圖20G中。在MBT-2及S91腫瘤兩者中，TGFβ1顯性異構體，反映大部分人類癌症。EMT-6仍顯示主導性TGFβ1表現，但亦共表現(儘管較低程度) TGFβ3，其較類似於某些人類癌中所觀測到之情形。
在MBT-2、S91及EMT-6腫瘤中，所有四種呈遞分子(LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33)由RNA表現(圖 20H )。 實例 21 ： LRRC33 - 前 TGF β 1 之抗體誘導之內化
吾人觀測到在表現LRRC33 RNA之細胞類型中，僅一子集似乎在細胞表面上表現LRRC33蛋白。吾人假設LRRC33可在漿膜處由蛋白質運輸調控。未評定此可能性，吾人設計內化分析。
產生Expi293細胞株，其表現細胞表面LRRC33-前TGFβ1。使用Incucyte系統，量測在Ab6結合至細胞表面LRRC33-前TGFβ1後，LRRC33之內化。簡言之，Incycyte系統採用當目標內化至具有酸性pH之細胞內區室(例如，溶酶體)時，可偵測到之pH敏感偵測標籤。在表現LRRC33及前TGFβ1之細胞中觀測到在Ab6結合後，LRRC33-前TGFβ1之快速內化(圖 6 )，而非在Expi293親本細胞株中觀測到(資料未展示)。此處所觀測到之內化類似於初代人類巨噬細胞上之內化。
LRRC33-前TGFβ1內化不為FcR介導的，此係因為Expi293細胞不具有Fc受體(資料未展示)。此等結果表明Ab6接合可促進目標下調。此可藉由在諸如TME及FME之疾病位點處降低可用的前TGFβ1量，提供活體內TGFβ1抑制之額外或替代機制。
視需要，以上個別章節中所提及之本發明之各種特徵及實施例，細節上作必要修改後，適用於其他章節。因此在一個章節中所指定之特徵視需要可與其他章節中所指定之特徵組合。
熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所述的本發明之具體實施例之許多等效方案。此類等效方案意欲由以下申請專利範圍涵蓋。
圖 1 為顯示LN229分析中LTBP1-前TGFβ活化抑制之圖。
圖 2 為顯示LN229分析中前TGFβ1複合物活化抑制之圖。
圖 3 為顯示SW480β6分析中GARP-前TGFβ1活化抑制之圖。
圖 4 為顯示SW480β6分析中LRRC33-前TGFβ1活化抑制之圖。
圖 5A 顯示Ab3及Ab6對TGFβ1之激肽釋放酶誘導活化的活體外抑制效應。
圖 5B 顯示Ab3及Ab6對TGFβ1之纖維蛋白溶酶誘導活化的活體外抑制效應。
圖 6 提供顯示在Ab6結合於經LRRC33及前TGFβ1轉染之異源細胞中後，LRRC33-前TGFb1之快速內化的圖。
圖 7 提供顯示Ab6或Ab3對UUO小鼠中膠原蛋白基因(Col1a1及Col3a1)表現之影響的兩張圖。小鼠經3、10或30毫克/公斤/週之Ab3或3或10毫克/公斤/週之Ab6處理。單獨的IgG用作對照。
圖 8 提供顯示Ab3或Ab6對UUO小鼠中Fn1及Loxl2基因表現之影響的兩張圖。小鼠經3、10或30毫克/公斤/週之Ab3或3或10毫克/公斤/週之Ab6處理。單獨的IgG用作對照。
圖 9 彙總UUO模型中基因表現(相對於UUO + IgG)在處理後之變化的統計顯著性。
圖 10 為顯示在投與30 mg/kg或10 mg/kg Ab3與抗PD-1之組合之後，Cloudman S91黑素瘤模型中隨時間(天數)推移之存活百分比的圖。單獨的抗PD-1、抗SR-AB3及用作對照。
圖 11A 提供顯示在投與30 mg/kg或10 mg/kg Ab3或Ab6各自與抗PD-1之組合之後，隨時間(天數)推移量測之Cloudman S91黑素瘤模型中表現為中值腫瘤進展之腫瘤生長(腫瘤體積mm3 )變化的五張圖。單獨的抗PD-1用作對照。虛線表示歸因於腫瘤潰爛，在到達2000 mm3 指標標準之前必須處死的動物。
圖 11B 提供顯示在投與30mg/kg或10 mg/kg Ab3 (左)或Ab6 (右)與抗PD-1之組合之後，Cloudman S91中值腫瘤體積隨時間變化的兩張圖。單獨的抗PD-1、單獨的Ab3、單獨的Ab6及單獨的IgG用作對照。
圖 11C 提供顯示經以下處理之小鼠中S91腫瘤體積隨時間之變化的六張圖：(1)對照IgG；(2)僅Ab6；(3)僅抗PD1；(4)抗PD1/Ab6 (3 mg/kg)；(5)抗PD1/Ab6 (10 mg/kg)；及(6)抗PD1/Ab6 (30 mg/kg)。2,000 mm3 之指標腫瘤體積在上部點線中指示；且500 mm3 之25%臨限體積在下部點線中顯示。反應者被定義為達成小於指標體積之25%之腫瘤尺寸的彼等。
圖 11D 提供顯示經抗PD-1與3種劑量濃度(3、10及30 mg/kg) Ab6之組合處理的小鼠中S91腫瘤體積隨時間之變化的三張圖。在處理後顯示持久抗腫瘤效應。
圖 11E 提供概述來自圖11C之表現為中值腫瘤體積之資料的圖。
圖 11F 提供顯示來自圖11C之每一處理組中動物隨時間推移之存活的圖。
圖 12 為顯示MBT2膀胱癌模型中磷酸化與總SMAD2/3比率(pSMAD/SMAD)之圖。動物如下處理：(1)僅抗PD-1抗體；(2) Ab5 (3 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合；(3) Ab5 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合；(4) Ab3 (10 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合；(5) Ab3 (30 mg/kg)與抗PD-1抗體之組合。
圖 13A 及圖 13B 提供兩組顯示在投與30mg/kg或10 mg/kg Ab3，或3 mg/kg或10 mg/kg Ab6與抗PD-1之組合之後，隨時間(天數)推移量測之MBT2腫瘤生長(腫瘤體積mm3 )之變化的五張圖。單獨的抗PD-1用作對照。腫瘤體積隨時間之變化以對數標度(圖 13A )及線性標度(圖 13B )表示。虛線表示歸因於腫瘤潰爛，在到達1200 mm3 指標標準之前必須處死的動物。
圖 13C 提供顯示在MBT2同基因型膀胱癌模型中，在投與30 mg/kg或10 mg/kg Ab3 (左上方)，或10 mg/kg或3 mg/kg Ab6 (右上方)與抗PD-1之組合之後，隨時間變化之中值腫瘤體積的圖。單獨的抗PD-1、單獨的Ab3、單獨的Ab6及單獨的IgG用作對照。第15天時之中值腫瘤體積概述於下部圖中。
圖 13D 提供顯示在MBT2同基因型膀胱癌模型中，Ab6與抗PD-1之組合之效果的五張圖。反應者被定義為在研究結束時達成小於指標體積之25%之腫瘤尺寸的彼等。
圖 14 為顯示在MBT2同基因型膀胱癌模型中，在投與10 mg/kg Ab3或3 mg/kg或10 mg/kg Ab6與抗PD-1之組合之後，隨時間(天數)推移之存活百分比的圖。單獨的抗PD-1用作對照。
圖 15 提供顯示在腫瘤再攻擊研究中，隨時間(天數)推移量測之腫瘤生長(腫瘤體積mm3 )之變化的一組圖。先前經抗PD-1/Ab3或抗PD-1/Ab6處理，腫瘤已清除之動物(達成完全消退之完全反應者)經MBT2腫瘤細胞再攻擊。初始未經處理之動物用作對照。虛線表示歸因於腫瘤潰爛，在到達1200 mm3 指標標準之前必須處死的動物。
圖 16 為顯示前TGFβ1之區(1區及2區)中HDX保護之Ab5 Fab結合結果的熱圖。
圖 17 示出在Ab5結合後，如藉由HDX (參見圖16)所量測之經保護免於溶劑交換之前TGFβ1複合物的區。
圖 18A 為顯示Ab6 Fab與前TGFβ1 (C4S)結合之保護效應的熱圖。受抗體-抗原相互作用影響之區由紅色方框(1、2a、2b、2c、3、4、5a、5b、6a及6b)指示。
圖 18B 提供TGFβ1之晶體結構上覆的HDX資料。顯示圖18A中所鑑別之區。
圖 19A 示出在統計分析之後三個結合區(1區、2區及3區)的鑑別。1區與前TGFβ1之前域內所謂的「潛伏套索」重疊，而2區及3區在生長因子域內。
圖 19B 描繪相對於Ab6結合中所涉及之三個結合區，前TGFβ1的各種域及基元。亦提供在三個異構體間的序列比對。
圖 20A 至圖 20D 顯示各種組織及細胞中TGFβ異構體之相對RNA表現。圖 20A 顯示各種人類癌症組織對正常比較物中之TGFβ異構體表現(按癌症類型計)。圖 20B 顯示基於來自33種腫瘤類型之超過10,000個樣品的分析，由人類癌症類型進行之TGFβ異構體表現的頻率。圖 20C 顯示個別腫瘤樣品中按癌症類型計之TGFβ異構體表現。圖 20D 顯示小鼠同基因型癌細胞模型株系中之TGFβ異構體表現。
圖 20E 提供顯示在大部分人類癌症類型中高度表現之所有呈遞分子(LTBP1、LTBP3、GARP及LRRC33)的4個基因表現圖。
圖 20F 提供來自同基因型小鼠腫瘤模型Cloudman S91、MBT-2及EMT-6之TGFβ及相關信號傳遞路徑基因的表現分析。
圖 20G 提供藉由ELISA將Cloudman S91、MBT-2及EMT-6腫瘤模型中之3種TGFβ異構體之蛋白質表現進行比較的三張圖。
圖 20H 提供藉由全腫瘤溶解產物qPCR將Cloudman S91、MBT-2及EMT-6腫瘤模型中之呈遞分子之RNA表現量進行比較的圖。
圖 21A 描繪根據1週毒理學研究，來自泛TGFβ抗體的顯微心臟研究結果。圖 21B 描繪根據4週大鼠毒理學研究，與ALK5抑制劑或泛TGFβ抗體相比，來自Ab3的顯微心臟研究結果。圖 21C 描繪根據4週大鼠毒理學研究，與ALK5抑制劑或泛TGFβ抗體相比，來自Ab6的顯微研究結果。
圖 22 提供顯示隨時間變化之S91中值腫瘤體積的圖。組合組表示處於兩個劑量之四種不同異構體選擇性、非情形依賴性TGFβ1抑制劑各自與抗PD-1處理之組合。
圖 23A 至 23B 提供經CD8+細胞標記物染色之S91腫瘤的代表性免疫組織化學切片。圖 23A 為來自經單獨的抗PD-1處理之動物的腫瘤切片。圖 23B 為來自經抗PD-1及代表性非情形依賴性TGFβ1抑制劑兩者處理之動物的腫瘤切片。
圖 24A 至圖 24D 提供經巨噬細胞標記物染色之S91腫瘤的代表性免疫組織化學切片。圖 24A 為來自經單獨的抗PD-1處理之動物的腫瘤切片。圖 24B 為來自經抗PD-1及代表性非情形依賴性TGFβ1抑制劑兩者處理之動物的腫瘤切片。圖 24C 為使用抗F4/80作為巨噬細胞標記物，來自經抗PD-1及Ab3 (30 mg/kg)處理之動物的腫瘤切片。圖 24D 為使用抗CD163作為M2巨噬細胞標記物之切片，其顯示大部分細胞為CD163陰性。
圖 25 為顯示相比於單獨的抗PD-1所處理之動物，在經用抗PD-1/Ab3進行之1週處理後，MBT2腫瘤中CD8+ T淋巴球基因(CD8α、穿孔蛋白及顆粒酶B)之log2倍數變化的圖。
圖 26A 提供顯示周邊人類調節T細胞中GARP之CD3/CD28誘導上調的FACS資料。
圖 26B 為顯示Ab3或Ab6對Teff增殖之Treg介導之抑制之影響的圖。IgG用作對照。
圖 27A 顯示用於在MBT2腫瘤中對T細胞亞群進行分選之閘控策略。
圖 27B 提供顯示在第13天時之表現為CD45+細胞百分比之T細胞亞群的一組圖。
圖 28A 提供用於在MBT2腫瘤中對骨髓亞群進行分選之閘控策略。
圖 28B 提供顯示在第13天時之骨髓細胞亞群的一組圖。
圖 28C 提供顯示MBT-2表現細胞表面LRRC33中之腫瘤相關巨噬細胞的FACS資料。
圖 28D 顯示MBT-2腫瘤浸潤MDSC表現細胞表面LRRC33。
圖 29A 至圖 29C 提供額外FACS資料分析，其顯示MBT2腫瘤中Ab6及抗PD-1處理之效果。
圖 30A 至圖 30D 提供顯示瘤內CD8陽性T細胞之代表性MBT2腫瘤切片的IHC影像。
圖 30E 提供來自圖30A至圖30D之IHC資料的定量，其表現為每一處理組中CD8陽性細胞之分率。切片之壞死區自分析排除。
圖 30F 提供對在MBT2腫瘤中Ab6及抗PD-1處理之效果的免疫組織化學分析。在來自如所示之三個處理組的動物中，腫瘤切片針對磷酸化SMAD3 (上圖)或CD8及CD31 (下圖)可視化。
圖 30G 提供表明Ab6與抗PD-1之組合似乎觸發CD8+ T細胞動員且自CD31+血管浸潤至MBT2腫瘤中的資料。
圖 31A 至圖 31D 提供自來自如所示之4個處理組之MBT2腫瘤收集的以下免疫反應標記物之基因表現：Ptprc (圖 31A )；CD8a (圖 31B )；CD4 (圖 31C )；及Foxp3 (圖 31D )。
圖 32A 至圖 32C 提供如所指示，在第10天及/或第13天時，以下效應功能標記物之基因表現：Ifng (圖 32A )；Gzmb (圖 32B )；及Prf1 (圖 32C )。
圖 32D 提供顯示在第10天時，如藉由qPCR所量測之MBT2腫瘤樣品中四種基因標記物(顆粒酶B、穿孔蛋白、IFNγ及Klrk1)之表現的一組圖。每一圖提供三個處理組中之表現的倍數變化：單獨的抗PD-1 (左)；單獨的Ab6 (中)；及抗PD-1與Ab6之組合(右)。
圖 33A 顯示如藉由基於溶液平衡滴定之分析(MSD-SET)所量測，Ab6對如所示之四種大型潛伏複合物的活體外結合。所量測之KD 值(以皮莫耳為單位)在右側顯示。
圖 33B 示出基於LN229細胞之效力分析且提供顯示Ab6對如所指示之四種大型潛伏複合物之濃度依賴性效力的圖。亦顯示Ab6不抑制前TGFβ3。
圖 34A 提供顯示在EMT6 (研究1)中與或不與抗PD1及/或抗TGFβ3組合之Ab6隨時間推移對腫瘤生長/消退之影響的一組九張圖。每一圖內之上部點線表示2,000 mm3 之指標腫瘤體積，而每一圖內之下部點線表示指標體積之25% (亦即，500 mm3 )。
圖 34B 提供顯示EMT6 (研究1)中隨時間(處理起始後天數)推移之存活百分比的圖。與單獨的抗PD-1相比，包括抗PD-1及Ab6兩者之處理組顯示顯著存活益處。
圖 34C 提供顯示EMT6 (研究2)中隨時間(處理起始後天數)推移之存活百分比的資料。與單獨的抗PD-1相比，包括抗PD-1及Ab6兩者之處理組顯示顯著存活益處，且處理結束後抗腫瘤效應持久。
圖 34D 提供在EMT6乳癌模型中抗PD-1與Ab6組合對存活之影響。
圖 35 提供顯示如按mRNA含量(左)及蛋白質含量(右)量測，EMT6腫瘤中三種TGFβ異構體之相對表現的兩張圖。
圖 36A 提供在顯示鼠類骨髓增生病模型中，銀染網硬蛋白作為骨髓之纖維性表型之標記物的一組組織學影像。
圖 36B 提供顯示具有高疾病負擔之MPLW515L 小鼠中，對骨髓纖維化及TGFβ1抑制之效果之定量分析的圖。
圖 36C 提供顯示經Ab6或對照IgG處理之MPLW515L 小鼠中之血液參數的一組圖。
圖 36D 提供顯示經Ab6或對照IgG處理之MPLW515L 小鼠中之額外血液參數的一組圖。
圖 37A 提供顯示TGFβ異構體表現與IPRES基因組之間相關度的基因組變異分析(GSVA)。
圖 37B 提供顯示TGFβ異構體表現與Plasari基因組之間相關度的基因組變異分析(GSVA)。TGFb1異構體表現與TGFβ路徑活化相關。TGFβ反應性基因之Plasari基因組與之TGFb1 RNA異構體表現遍及許多TCGA標註腫瘤類型顯著且強烈相關。TGFB1 mRNA與TGFβ信號傳遞特徵之相關度。
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Claims (14)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段如藉由基於溶液平衡滴定之分析所量測，係以≤ 10 nM之KD結合以下抗原複合物中之每一者： i) 人類LTBP1-前TGFβ1； ii) 人類LTBP3-前TGFβ1； iii) 人類GARP-前TGFβ1；及， iv) 人類LRRC33-前TGFβ1； 其中該抗體或其該片段係完全人類或人類化抗體或其片段，其中視情況地，該抗體或該片段以≤ 1 nM之KD結合。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其結合該等複合物之潛伏套索，其中視情況地，該抗體或其該抗原結合片段進一步結合生長因子域之一部分。
  3. 如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其具有人類IgG4或IgG1次型。
  4. 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，及賦形劑。
  5. 如請求項1至3中任一項之抗體或其抗原結合片段，或如請求項4之組合物，其用於治療個體之TGFβ1適應症。
  6. 如請求項5所使用之抗體或其抗原結合片段，或組合物，其中該TGFβ1適應症係癌症。
  7. 如請求項5所使用之抗體或其抗原結合片段，或組合物，其中該TGFβ1適應症係骨髓纖維化。
  8. 如請求項6所使用之抗體或其抗原結合片段，或組合物，其中該個體對癌症療法反應不佳，其中視情況該癌症療法係檢查點抑制療法、化學療法及/或放射療法。
  9. 如請求項8所使用之抗體或其抗原結合片段，或組合物，其中該治療包含投與如請求項4之組合物及選自由以下組成之群的額外癌症療法之組合：檢查點抑制劑、化學療法及放射療法及/或癌症疫苗。
  10. 一種用於篩選適於治療用途之異構體選擇性TGFβ1抑制劑之方法，該方法包含： i) 提供以≤ 1 nM之KD特異性結合以下中之每一者之抗體：人類LTBP1-前TGFβ1、人類LTBP3-前TGFβ1、人類GARP-前TGFβ1及人類LRRC33-前TGFβ1複合物， ii) 進行活體內功效研究，以確定在包含TGFβ1偏向表現之臨床前模型中有效達成功效之該抗體的量； iii) 在已知對TGFβ抑制敏感之臨床前模型中進行毒理學研究，以確定該抗體之最大耐受量及/或最小毒性量；及， iv) 基於步驟(iii)及步驟(iv)，若獲得足夠的治療窗，則將該抗體選擇為治療候選物。
  11. 如請求項10之方法，其中步驟(ii)之該有效達成功效的量係在約1 mg/kg與30 mg/kg之間。
  12. 如請求項10之方法，其中步驟(iii)之該最大耐受量或最小毒性量係至少100 mg/kg。
  13. 如請求項10至12中任一項之方法，其中該治療窗係至少六倍。
  14. 一種用於製造醫藥組合物之方法，該方法包含： i) 提供藉由如請求項10至13中任一項之方法選擇的抗體； ii) 將該抗體調配成包含異構體選擇性TGFβ1抑制劑之醫藥組合物。
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