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TW201923076A - 分離核酸之方法 - Google Patents

分離核酸之方法 Download PDF

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TW201923076A
TW201923076A TW107125897A TW107125897A TW201923076A TW 201923076 A TW201923076 A TW 201923076A TW 107125897 A TW107125897 A TW 107125897A TW 107125897 A TW107125897 A TW 107125897A TW 201923076 A TW201923076 A TW 201923076A
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nucleic acid
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matrix
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TW107125897A
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尤金 Ｊ Ｈ 衛
威爾 安德森
雅德畢爾 辛 格雷沃
馬特 崔奧
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澳大利亞商行科技有限公司
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Abstract

本文揭示一種自含有核酸之樣品分離核酸之方法，該方法包含(a)在允許該樣品中之核酸可逆地結合至熱塑性聚合物基質之條件下將該樣品暴露於該基質；(b)在優先移除結合至該基質之非核酸雜質之條件下洗滌(a)之核酸結合基質；及(c)將(b)之經洗滌核酸結合基質暴露於溶離緩衝液，藉此自該基質回收該核酸。

Description

分離核酸之方法
本發明大體上係關於一種分離核酸之方法，詳言之，一種自諸如細胞溶解物之生物材料分離核酸之方法。
核酸(NA)分離為有意義的，因為任何DNA/RNA檢定之效能依賴於NA輸入之品質。8 在定點照護(POC)應用中，NA分離方法由於現場資源之可供使用性的限制而進一步複雜化。舉例而言，最常規基於實驗室之NA分離方案(基於博姆法(Boom method)9 )通常需要使用離心機(例如基於二氧化矽吸附管柱之方法9 , 10 )。然而，在偏遠地區或基於家庭之NA檢定中，接近離心機可為不可能的。出於此原因，已提出各種策略以避開此類資源限制。一個實例為固相可逆固定(SPRI)11 法，其最近受歡迎。11 - 15 SPRI通常基於將NA沈澱至表面(例如微米粒子)上，其可隨後在酒精洗滌之後再懸浮相容緩衝液中。SPRI需要極小設備且因此更適合於POC應用。然而，習知SPRI受多個樣品/液體操縱之需求限制。此後已開發使SPRI自動化之各種策略，16 但大部分POC調適方法仍需要一些形式之微設備13 , 17 - 19 ，其可能不適合於低資源環境。其他當代NA分離方法20 包括使用電脈衝來操縱細胞溶解、NA分離及濃縮。然而，此等方法在很大程度上仍為概念驗證及/或需要極專用設備。
在SPRI之一些迭代中，已研究各種形式之微粒表面修飾。此等包括羧酸、11 纖維素、14 , 15 二氧化矽(博姆法之擴展)及聚葡萄胺糖。13 大體上，具有帶正電(陽離子)官能基之生物相容性基質適用於NA分離。另外，藉由DNA使塑膠表面功能化之一些策略包括非特異性物理吸附。21 然而，NA之物理吸附通常在NA檢定中適得其反，因為其降低用於生物分析之標靶之可供使用性。
本發明藉由提供與低資源及/或POC應用相容之更簡單的核酸固相可逆固定方法而解決或至少部分緩解此等問題。
在本文揭示之一態樣中，提供一種自含有核酸之樣品分離核酸的方法，該方法包含：(a)在允許樣品中之核酸可逆地結合至熱塑性聚合物基質之條件下將樣品暴露於基質； (b)在優先移除結合至該基質之非核酸雜質之條件下洗滌(a)之核酸結合基質；及 (c)將(b)之經洗滌核酸結合基質暴露於溶離緩衝液，藉此自基質回收核酸； 其中熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
在另一態樣中，提供包含藉由本文所揭示之方法回收之核酸的組合物。
在另一態樣中，提供一種自含有核酸之樣品分離核酸之套組，該套組包含： (a)如本文所述之熱塑性聚合物基質； (b)如本文所述之溶離緩衝液；及 (c)視情況存在之如本文所述之細胞溶解緩衝液； 其中熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
在另一態樣中，提供如本文所述之熱塑性聚合物基質，其用於根據本文所揭示之方法自含有核酸之樣品分離核酸，其中熱塑性聚合物基質在暴露於樣品時具有淨負電荷。
在本說明書通篇中，除非本文另有規定，否則字語「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變型應理解為暗示包含所陳述之要素或整數或要素或整數之群，但不排除任何其他要素或整數或要素或整數之群。
本說明書中對任何先前公開案(或來源於其之資訊)或對已知之任何事項的提及不視為且不應視為認可、承認或以任何形式表明先前公開案(或來源於其之資訊)或已知事項形成本說明書相關研究領域中之公共常識的一部分。
應注意，除非上下文另外明確規定，否則如在本說明書中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個態樣。舉例而言，提及之「核酸」包括單一核酸分子，以及兩個或大於兩個核酸分子。
本發明至少部分以如下出人意料的發現為基礎：核酸分子能夠可逆地結合至熱塑性聚合物基質，諸如用於3D列印之彼等，且此特性可用於與包括靶核酸序列擴增及偵測之下游分析相容的簡單及快速核酸分離。
因此，在本文揭示之一態樣中，提供一種自含有核酸之樣品分離核酸的方法，該方法包含：(a)在允許樣品中之核酸可逆地結合至熱塑性聚合物基質之條件下將樣品暴露於基質； (b)在優先移除結合至該基質之非核酸雜質之條件下洗滌(a)之核酸結合基質；及 (c)將(b)之經洗滌核酸結合基質暴露於溶離緩衝液，藉此自基質回收核酸； 其中熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。熱塑性聚合物基質
術語「熱塑性聚合物基質」理解為意謂在高於特定溫度時變得柔韌且在冷卻後固化之熱軟性塑膠材料。熟習此項技術者將熟悉適合之熱塑性聚合物基質，其說明性實例包括用於3D列印之彼等，諸如聚醯胺(例如耐綸)、聚乳酸(PLA)、聚苯乙烯(例如丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS))及其複合物或摻合物。適合之熱塑性聚合物基質之其他說明性實例包括用於射出成形及真空成形之彼等。
適合之熱塑性聚合物基質為市售的，其說明性實例包括PLA Bilby 3D (天然)、PLA ColorFab (白色)、ABS Esun (白色)、Nylon Taulman 910、PLA Bilby 3D Cherry Wood、PLA ColorFab Copper、PLA Bilby 3D Copper、PLA Bilby 3D Aluminium、PLA ProtoPasta Carbon Fibre及PLA ProtoPasta Conductive。
在本文揭示之一個實施例中，熱塑性聚合物基質選自由以下組成之群：聚醯胺、聚乳酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯及前述任一者之複合物或摻合物。熟習此項技術者將熟悉適合之熱塑性聚合物基質之複合物及摻合物。在一實施例中，複合物或摻合物包含聚乳酸。在一實施例中，熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及金屬之摻合物。熟習此項技術者將熟悉用於熱塑性聚合物摻合物之適合之金屬，其說明性實例包括銅、鋁及鈦。在一實施例中，金屬選自由銅及鋁組成之群。
熟習此項技術者亦將熟悉熱塑性聚合物基質之適合之複合物，其說明性實例包括包含聚乳酸及導電材料(諸如碳)之複合物。在一實施例中，熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及碳之複合物。
如本文中其他地方所指出，熱塑性聚合物基質將適當地在溶液中具有淨負電荷。在一實施例中，熱塑性聚合物基質將顯示跨越一定pH值範圍的負流動(澤塔；ζ)電位。在一實施例中，熱塑性聚合物基質將顯示跨越約5至約11之pH範圍的負流動電位。在一實施例中，熱塑性聚合物基質藉由暴露於鹽溶液時之淨負電荷表徵。如本文中其他地方所指出，熱塑性聚合物基質將適當地在暴露於1 mM NaCl之溶液時具有淨負電荷。然而，應注意，使得熱塑性聚合物基質根據本文所揭示之方法適用之一或多種特性不限於將基質暴露於包含1 mM NaCl之含核酸樣品。如本文中其他地方所描述，熱塑性聚合物基質將能夠自包含除NaCl以外的鹽及除1 mM以外的鹽濃度之含核酸溶液分離核酸。在一實施例中，熱塑性聚合物基質將在包含離液鹽(例如鹽酸胍)之溶液中具有淨負電荷，如本文中其他地方所描述。
如本文中其他地方所指出，熱塑性聚合物具有允許基質形成為幾乎任何適合之尺寸及形狀的優勢。熱塑性聚合物基質之尺寸及形狀將通常取決於預期用途。舉例而言，當細胞裂解物包含於0.5 mL微量離心管(Eppendorf tube)中時，基質可形成為細長形狀，該細長形狀具有(i)能夠延伸至管中且與其中之細胞溶解物接觸之長度，及(ii)小於或等於管在其基底處之直徑的平均直徑，使得細長基質能夠插入至管中且與細胞裂解物材料接觸。
在一實施例中，熱塑性聚合物基質具有細長結構，其平均直徑為約1 mm至約3 mm。在一實施例中，熱塑性聚合物基質具有細長結構，其中長度為約1至約30 mm，較佳長度為約10 mm至約15 mm。
應理解，熱塑性聚合物基質不必具有均一細長形狀。舉例而言，如本文中其他地方所描述，基質可具有第一部分及第二部分，其中第一部分之平均直徑大於第二部分之平均直徑。具有兩個不同尺寸部分之基質之說明性實例顯示於圖1中(在本文中亦稱為「DipStix」)。
在另一實施例中，熱塑性聚合物基質具有基本圓柱形結構或組態，諸如通道或管(例如毛細管)。此類組態可適合於微流體應用，藉此含核酸樣品可導引穿過微流體陣列中之管或通道，接著穿過洗滌溶液且接著穿過溶離緩衝液以回收結合至基質之核酸。在另一實施例中，熱塑性聚合物基質組態為管且施加至抽吸裝置(諸如注射器)之尖端。管狀基質可附接至抽吸裝置之尖端或其可一體成型至裝置之尖端上。管狀基質可隨後插入至含核酸樣品中且樣品藉由抽吸作用抽吸穿過管狀基質，藉以使樣品中之核酸結合至管狀基質之內表面。管狀基質可隨後插入至洗滌溶液中，其接著藉由抽吸作用抽吸穿過管狀基質，藉此洗滌基質以移除非核酸雜質。管狀基質可隨後插入至溶離緩衝液中，其藉由抽吸作用抽吸穿過管狀基質，藉此自基質溶離核酸且將溶離之核酸回收至收集腔室中。或者，管狀基質可在洗滌步驟之後無限期地儲存以用於後續溶離結合核酸。熱塑性聚合物基質可具有明顯平滑表面，或其可具有不均勻或紋理化表面，說明性實例包括凹陷圖案(如例如高爾夫球表面上所見)、十字號圖案、魚鱗圖案及薔薇輪蚧(palm scale)圖案。
在另一實施例中，熱塑性聚合物基質具有平面結構(例如薄片)，其長度及寬度大於其厚度。平面結構可形成為固體薄片或熱塑性聚合物材料的編織股薄片。在一些實施例中，由編織熱塑性聚合物股形成的基質具有柔韌特徵；亦即，其保留允許其模塑為一或多種所需形狀的塑性。在一些實施例中，熱塑性聚合物基質包含多孔結構，例如藉由併入允許液體通過之孔隙。或者或另外，多孔基質包含經編織以產生網狀結構的熱塑性聚合物材料股。在一實施例中，熱塑性聚合物基質具有可用作過濾器之多孔結構。舉例而言，含有核酸之樣品(例如細胞溶解物)、洗液及溶離緩衝液可穿過多孔熱塑性聚合物基質，藉此樣品中之核酸結合至基質且隨後根據本文所揭示之方法藉由溶離緩衝液回收。
在另一實施例中，熱塑性聚合物基質包含一或多個用於攜載溶液之容器。適合之容器之說明性實例包括管及孔。在一實施例中，熱塑性聚合物基質具有多孔組態(例如96孔盤)。此類組態允許根據本文所描述之方法同時或連續處理多個樣品。當熱塑性聚合物基質為容器時，含核酸樣品可持續允許核酸結合至基質之時段置於容器中。樣品接著自容器移除(例如藉由抽吸)且洗滌容器以自基質移除非核酸雜質。溶離緩衝液可隨後置於容器中，藉此自基質溶離核酸。含有溶離核酸之溶離緩衝液可隨後自容器回收以進行後續儲存或分析(例如靶核酸擴增)。或者，溶離緩衝液可保持於容器中以進行儲存及/或後續分析。舉例而言，靶核酸擴增可在熱塑性聚合物容器中進行。此具有使樣品自一個容器轉移至另一容器之情況下之交叉污染之風險最小化的優勢。含有核酸之樣品
如本文所用，術語「樣品」理解為意謂任何包含核酸之溶液。術語「核酸」理解為意謂核糖核酸(RNA)及去氧核糖核酸(DNA)，其說明性實例包括信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉移RNA cDNA及基因組DNA，且包括真核及原核核酸、線粒體DNA、葉綠體DNA(cpDNA)、循環游離DNA(cfDNA)及循環腫瘤DNA(ctDNA)。術語「核酸」亦包括人工核酸類似物、肽核酸、N-嗎啉基-及鎖核酸、二醇核酸、及異赤藻糖核酸，其通常藉由對核酸分子主鏈進行之修飾而區別於天然存在之核酸。
在一實施例中，樣品為生物樣品。生物樣品之說明性實例包括血液、血清、血漿、尿液、精液、羊膜液、細支氣管灌洗液(BAL)、痰液及脊髓液。樣品可為不經進一步處理的獲自生物體(例如原核生物或真核生物)之天然存在之生物樣品(例如尿液、精液、脊髓液、羊膜液)，或其可為獲自生物體且經歷處理步驟，諸如純化以移除至少一些雜質的生物樣品。在一實施例中，樣品含有小於20重量%(w/w)核酸。「小於20% w/w」意謂19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%等。
在一實施例中，樣品為細胞溶解物。應理解，細胞溶解物係藉由破壞一或多個細胞之細胞膜及核膜以釋放細胞之內含物，詳言之細胞之核酸內含物而形成。熟習此項技術者將熟悉製備細胞溶解物之適合之方法，其說明性實例包括滲壓衝擊溶解、藉由離液鹽(例如GuHCl)溶解、酶消化、洗滌劑溶解(例如非離子界面活性劑，諸如Triton X100)及機械均質化。在一實施例中，細胞溶解物係藉由將細胞懸浮於溶解緩衝液中製備。熟習此項技術者將熟悉適合之溶解緩衝液，其說明性實例包括NP-40溶解緩衝液、放射免疫沈澱檢定(RIPA)溶解緩衝液及基於非離子型界面活性劑之溶解緩衝液。
在一實施例中，樣品包含離液鹽。熟習此項技術者將熟悉適合之離液鹽，其說明性實例包括鹽酸胍、異硫氰酸胍、脲及過氯酸鋰。在一實施例中，離液鹽為氯化胍(GuHCl)。如本文中其他地方所指出，熱塑性聚合物基質能夠跨越一系列溶解緩衝液鹽濃度結合及自含有核酸之樣品回收核酸。因此，在一實施例中，樣品包含約375 mM至約6 M(例如375 mM、400 mM、500 mM、600 mM、700 mM、800 mM、900 mM、1.0 M、1.5 M、2 M、2.5 M、3 M、3.5 M、4 M、4.5 M、5 M、5.5 M及6 M)之鹽濃度。在一實施例中，樣品包含約375 mM至約3 M之鹽濃度。在一實施例中，樣品包含約375 mM至約1.5 M之鹽濃度。在一實施例中，樣品包含約1.5 M之鹽濃度。
如本文中其他地方所指出，本發明人已出人意料地發現核酸將幾乎立即結合至熱塑性聚合物基質；舉例而言，在基質僅浸漬至含有核酸之溶液中不超過1秒之時段的情況下。此外，暴露較長時段(例如達至5分鐘)不導致自溶液回收之核酸的數量可辨別地增加。此等資料顯示將樣品暴露於熱塑性聚合物基質極短時段足以允許樣品中之核酸結合至基質以進行後續回收。在一實施例中，步驟(a)包含持續約0.5秒至約5分鐘之時段，較佳持續約0.5秒至約1分鐘之時段，更佳持續約0.5秒至約30秒之時段，甚至更佳持續約0.5秒至約1秒之時段將樣品暴露於熱塑性聚合物基質。在一實施例中，將細胞溶解物暴露於熱塑性聚合物基質包含將熱塑性聚合物基質浸漬至樣品中；舉例而言，將基質的至少一部分浸入樣品中且接著立即自樣品移除基質。在另一實施例中，含有核酸之樣品(例如細胞溶解物)可施加至基質；例如藉由將樣品滴至基質上且使樣品自基質表面流出。洗滌
如本文中其他地方所指出，步驟(b)包含在優先移除結合至基質之非核酸雜質之條件下洗滌(a)之核酸結合基質。熟習此項技術者將熟悉優先移除結合至固體基質之非核酸雜質之適合之條件，其說明性實例包括緩衝溶液(例如參緩衝生理鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水)、鹽溶液(例如NaCl、氯化胍)及低EDTA TE緩衝液、0.5% Tween溶液、0.5% triton溶液、70%乙醇及水。在一些實施例中，(a)之核酸結合基質可藉由用於製備在步驟(a)中暴露於基質之細胞溶解物的溶解緩衝液洗滌。
在一實施例中，步驟(b)包含於水中洗滌核酸結合基質。如本文中其他地方所指出，本發明人已出人意料地發現持續0.1至約5分鐘之間的時段於水中洗滌核酸結合基質足以移除非所需的非核酸雜質，諸如將另外抑制後續靶序列擴增之彼等。本發明人亦出人意料地發現使藉由水洗滌之步驟最小化至小於約5分鐘之時段對於核酸回收及後續靶序列擴增最佳。因此，在一實施例中，步驟(b)包含持續約5秒至約5分鐘之時段洗滌核酸結合基質。在另一實施例中，步驟(b)包含持續約5秒至約1分鐘之時段洗滌核酸結合基質。在另一實施例中，步驟(b)包含將核酸結合基質浸漬至洗滌溶液中；例如將核酸結合基質的至少一部分浸入洗滌溶液(例如水)中，且接著立即自洗滌溶液移除基質。在一較佳實施例中，步驟(b)包含將核酸結合基質浸漬至洗滌溶液中超過一次，較佳兩次至約5次。在其他實施例中，步驟(b)包含將核酸結合基質連續浸漬至超過一種洗滌溶液中。舉例而言，核酸結合基質浸漬至包含洗滌溶液之第一容器中，接著浸漬至包含相同或不同洗滌溶液之第二容器中，接著浸漬至包含與第一及/或第二容器之洗滌溶液相同或不同之洗滌溶液的第三容器中，諸如此類。
在另一實施例中，核酸結合基質可藉由將洗滌溶液施加至核酸結合之基質的表面而洗滌；例如藉由使大量洗滌溶液(例如水)流經核酸結合之基質的表面。溶離
如本文所用，術語「溶離緩衝液」理解為意謂能夠在洗滌步驟(b)之後使核酸自核酸結合之基質溶離(亦即解離)之溶液。熟習此項技術者將熟悉適合之溶離緩衝液，其說明性實例包括PCR緩衝液及TE緩衝液。在一實施例中，溶離緩衝液為PCR緩衝液。熟習此項技術者將熟悉適合之PCR緩衝液，其說明性實例包括Kapa2GTM Buffer A或Kapa2GTM Buffer M (Sigma-Aldrich)。
如本文中其他地方所指出，本發明人已出人意料地發現核酸可幾乎立即自基質溶離；舉例而言，在核酸結合基質僅浸漬至含有核酸之溶液中不超過1秒之時段的情況下。此外，暴露較長時段(例如達至120分鐘)不導致自基質回收之核酸的數量可辯別地增加。此等資料顯示將核酸結合基質暴露於溶離緩衝液極短時段足以允許核酸自基質溶離且於溶離緩衝液中回收。
在一實施例中，步驟(c)包含持續約0.5秒至約5分鐘之時段，較佳持續約0.5秒至約1分鐘之時段，更佳持續約0.5秒至約1秒之時段將洗滌之核酸結合基質暴露於溶離緩衝液。在一實施例中，將洗滌之核酸結合基質暴露於溶離緩衝液包含將洗滌之核酸結合基質浸漬至溶離緩衝液中；舉例而言，將(b)之洗滌之核酸結合基質的至少一部分浸入溶離緩衝液中且接著立即自溶離緩衝液移除基質。
在另一實施例中，核酸可藉由將溶離緩衝液施加至核酸結合之基質之表面上而自洗滌之核酸結合基質溶離及回收；例如藉由將大量溶離緩衝液滴至核酸結合之基質之表面上且接著收集溶離緩衝液。
在一實施例中，溶離緩衝液包含一或多種用於進行核酸擴增之組分及/或試劑。熟習此項技術者將熟悉用於進行核酸擴增之適合之組分及/或試劑，其說明性實例包括特異性雜交至所關注之靶核酸序列之引物及/或探針；適合於擴增核酸之酶，包括各種聚合酶(例如逆轉錄酶、Taq 、SequenaseTM DNA接合酶等，視所用核酸擴增技術而定)；提供擴增所需之反應混合物之去氧核苷酸及緩衝液；及經可偵測部分(例如螢光部分)標記之捕獲探針。包含一或多種用於進行核酸擴增之組分及/或試劑之溶離緩衝液的優勢為核酸擴增可緊隨著核酸溶離進行，且因此不需要向溶離緩衝液添加其他組分及/或試劑，因此使交叉污染及非特異性核酸擴增之風險降至最低。此方法之實例說明於圖1中。
在另一態樣中，提供包含藉由本文所揭示之方法回收之核酸的組合物。靶核酸擴增
如本文中其他地方所描述，本發明人已出人意料地發現熱塑性聚合物基質能夠可逆地結合核酸分子，同時允許優先移除諸如核酸擴增抑制劑之非核酸雜質。因此，熱塑性聚合物基質可用於分離核酸分子與將另外抑制後續核酸擴增及/或分析的可存在於樣品中之非核酸雜質。因此，在一實施例中，本文所述之方法進一步包含自步驟(c)中回收之核酸擴增靶核酸序列。熟習此項技術者將熟悉用於擴增核酸之適合之方法，其說明性實例包括Green及Sambrook, (2012; 「 Molecular cloning : a laboratory manual 」 ; 第四版 ; Cold Spring Harbor, N.Y.)及Ausubel等人, (2003; 「Current Protocols in Molecular Biology 」; John Wiley & Sons, Inc)中所揭示之彼等。當靶核酸序列為RNA時，可能需要將RNA轉化為互補DNA。在一些實施例中，核酸係藉由模板依賴性核酸擴增技術擴增。多種模板依賴性方法可用於擴增靶序列。例示性核酸擴增技術為聚合酶鏈反應(PCR)，其詳細描述於美國專利第4,683,195號、第4,683,202號及第4,800,159號，Ausubel等人 (見上文)，及Innis等人, (「PCR Protocols」, Academic Press, Inc., San Diego Calif., 1990)中。可進行逆轉錄酶PCR擴增程序以定量擴增之mRNA的量。將RNA逆轉錄為cDNA之方法已為所熟知且描述於Sambrook等人, 2012, 見上文。逆轉錄之替代方法利用熱穩定、RNA依賴性DNA聚合酶。此等方法描述於WO 90/07641中。聚合酶鏈反應方法為此項技術中熟知的。
在一實施例中，模板依賴性擴增涉及即時定量轉錄物。舉例而言，RNA或DNA可使用即時PCR技術(Higuchi, 1992,等人,Biotechnology 10 : 413-417)定量。藉由測定已完成相同數目之循環且在線性範圍內之PCR反應中之靶DNA之擴增產物之濃度，有可能測定原始DNA混合物中之特定靶序列之相對濃度。若DNA混合物為由分離自不同組織或細胞之RNA合成的cDNA，則可針對各別組織或細胞測定衍生靶序列之特定mRNA之相對豐度。PCR產物之濃度與相對mRNA豐度之間的此正比例通常在PCR反應之線性範圍內成立。曲線之平線區中之靶DNA之最終濃度係藉由試劑於反應混合物中之可供使用性測定且獨立於靶DNA之原始濃度。在其他實施例中，可採用多重、串聯PCR (MT-PCR)，其使用兩步法自少量RNA或DNA進行基因表現剖析，如例如在美國專利申請公開案第20070190540號中所述。在第一步中，將RNA轉化為cDNA且使用多重基因特異性引物擴增。在第二步中，藉由即時PCR定量各個別基因。
在一些實施例中，靶核酸可使用墨點技術定量，其已為熟習此項技術者所熟知。南方墨點法(Southern blotting)涉及使用DNA作為標靶，而北方墨點法(Northern blotting)涉及使用RNA作為標靶。各提供不同類型的資訊，儘管cDNA墨點在許多態樣中類似於墨點或RNA物種。簡言之，探針用於靶向已固定於適合之基質(通常為硝化纖維素濾器)上之DNA或RNA物種。不同物種應在空間上分離以便於分析。此通常藉由對核酸物種進行凝膠電泳，接著「吸墨」至過濾器上而實現。隨後，吸墨之標靶在促進變性及重雜化之條件下與探針(通常經標記)一起培育。由於探針經設計以與標靶鹼基配對，探針將在複性條件下結合靶序列之一部分。接著移除非結合探針，且如上文所述地實現偵測。在偵測/定量之後，可比較給定個體中可見之結果與對照反應或如本文中所定義之對照個體之統計顯著參考組或群體。以此方式，有可能使偵測之生物標記物核酸的量與個體處於癌症進展風險下之可能性相關。
本文中亦涵蓋基於生物晶片之技術，諸如由Hacia等人(1996,Nature Genetics 14: 441-447)及Shoemaker等人(1996, Nature Genetics 14: 450-456)描述之彼等。簡言之，此等技術涉及用於快速且精確地分析大量基因之定量方法。藉由用寡核苷酸標記基因或使用固定探針陣列，吾人可採用生物晶片技術以高密度陣列形式分離靶分子且基於雜交篩選此等分子。亦參見Pease等人 (1994,Proc . Natl . Acad . Sci . U . S . A . 91: 5022-5026)；Fodor等人 (1991,Science 251: 767-773)。簡言之，製得用於靶序列之核酸探針且連接至待用於篩選及診斷方法之生物晶片，如本文中所概述。連接至生物晶片之核酸探針經設計以與特異性表現之靶序列實質上互補，例如在夾心檢定中，使得出現靶序列及本發明探針之雜交。此互補性不必完全；可存在任何數目的鹼基對失配，其將干擾靶序列與本發明之核酸探針之間的雜交。然而，若失配數目大至無雜交可在甚至最不嚴格的雜交條件下發生，則序列不為互補靶序列。在某些實施例中，每序列使用超過一個探針，使重疊探針或探針針對正使用之標靶之不同部分。亦即，兩個、三個、四個或大於四個探針(其中三個為所需的)用於建立用於特定標靶之冗餘。探針可重疊(亦即具有一些共同序列)，或分離。
在說明性生物晶片分析中，生物晶片上之寡核苷酸探針在有利於特異性雜交之條件下暴露於疑似含有一或多種生物標記物聚核苷酸之核酸樣品或與其接觸。
一旦藉由本文所揭示之方法分離，核酸可例如藉由音波處理或藉由用限制性核酸內切酶處理而片段化。適當地，cDNA可經片段化以使得所得DNA片段之長度大於固定寡核苷酸探針之長度，但足夠小以允許在適合之雜交條件下快速與其接近。或者，cDNA之片段可使用如例如在上文所述之適合之核苷酸擴增技術選擇及擴增，該技術涉及適當隨機或特異性引物。
可擴增核酸之方法之其他說明性實例包括環介導等溫擴增(LAMP)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、滾環擴增及引物產生-滾環擴增(PG-RCA)。
在一實施例中，靶核酸在熱塑性聚合物基質存在下在反應容器中擴增。套組
在另一態樣中，提供用於自細胞溶解物分離核酸之套組，該套組包含： (a)如本文所述之熱塑性聚合物基質； (b)如本文所述之溶離緩衝液；及 (c)視情況存在之如本文所述之細胞溶解緩衝液； 其中熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
在一實施例中，套組可包含一或多種用於進行本文所揭示之方法之組分及/或試劑及/或裝置。套組可含有用於分析靶核酸序列於藉由本文所揭示之方法回收之核酸中之表現的組分及/或試劑。
用於進行本發明方法之套組亦可在適合之容器構件中包括(i)一或多種用於偵測一或多個靶核酸序列之試劑，(ii)一或多種特異性結合於靶核酸序列之核酸引物及/或探針，(iii)一或多種能夠偵測及/或量測一或多種靶序列之表現的探針，(iv)一或多種用於偵測探針之存在的標籤，及/或(iv)關於如何量測一或多個靶序列之表現量的說明書。亦可包括適合於擴增核酸之酶，包括各種聚合酶(逆轉錄酶、Taq 、SequenaseTM DNA接合酶等，視所用核酸擴增技術而定)，及提供擴增所需之反應混合物的去氧核苷酸及緩衝液。此類套組亦可針對個別組分及/或試劑，以及針對各引物及/或探針在適合之構件中包含相異的容器。套組亦可具有用於進行本文所描述之方法中之任一者之各種裝置(例如一或多種)；及/或關於使用套組偵測及/或定量一或多種靶核酸序列之表現的印刷說明書。套組之容器構件一般將包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器及/或將置放一或多種試劑或將其適當等分之其他容器。在提供第二及/或第三及/或額外組分時，套組亦將一般含有第二、第三及/或其他的額外容器，此組分可置於其中。或者，容器可視需要含有超過一種試劑之混合物。套組亦可包括含有緊密限制的一或多種試劑(例如引物或探針)以用於商業銷售之構件。此類容器可包括保持所需小瓶之射出模製或吹塑模製塑膠容器。
套組可進一步包含陽性及陰性對照，包括參考樣品，以及關於根據本文所揭示之方法使用其中所含之套組組件之說明書。
套組亦可視情況包括用於偵測標籤之適當試劑、陽性及陰性對照、洗滌溶液、印跡膜、微量滴定盤、稀釋緩衝液及其類似物。
在一實施例中，套組包含： (a)如本文所述之熱塑性聚合物基質； (b)如本文所述之溶離緩衝液；及 (c)如本文所述之細胞溶解緩衝液； 其中熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
在一實施例中，熱塑性聚合物基質選自由以下組成之群：聚醯胺、聚乳酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯及包含前述任一者之摻合物或複合物。在一實施例中，摻合物或複合物包含聚乳酸。在一實施例中，熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及金屬之摻合物。在一實施例中，金屬選自由銅及鋁組成之群。在一實施例中，熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及碳之複合物。
在一實施例中，熱塑性聚合物基質具有細長結構，其平均直徑為約1 mm至約3 mm。在一實施例中，熱塑性聚合物基質具有細長結構，其中長度為約1至約30 mm，較佳約10 mm至約15 mm。
在一實施例中，細胞溶解緩衝液包含離液鹽。在一實施例中，細胞溶解緩衝液包含約375 mM至約6 M之量，較佳約1.5 M之量的離液鹽。在一實施例中，離液鹽為氯化胍。
在一實施例中，溶離緩衝液為PCR緩衝液。
在一實施例中，套組進一步包含關於根據本文所述之方法使用套組組件自細胞溶解物分離核酸之說明書。
在另一態樣中，提供如本文所述之熱塑性聚合物基質，其用於根據本文所述之方法自細胞溶解物分離核酸，其中熱塑性聚合物基質在暴露於細胞溶解物時具有淨負電荷。
在另一態樣中，提供如本文所述之熱塑性聚合物基質，當用於根據本文所述之方法自細胞溶解物分離核酸時，其中熱塑性聚合物基質在暴露於細胞溶解物時具有淨負電荷。
在另一態樣中，提供如本文所述之熱塑性聚合物基質之用途，其用於製造根據本文所揭示之方法自含有核酸之樣品分離核酸之裝置，其中熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。實例 材料及方法 A. 3D 列印的「 DipStix 」
DipStix使用熔融沈積建模方法3D列印。3D列印主要對具有0.4 mm列印噴嘴的開源Makerfarm i3v (美國)平台進行，然而，適當的Up Plus 2 (中國)及Up Mini (中國)平台亦用於成功地列印DipStix。使用Simplify3D軟體(美國)進行用於在Maskerfarm i3v上進行3D列印之DipStix3D模型的切分。Simplify 3D內之3D列印參數，包括列印速度、溫度、回縮設定等係針對不同3D長絲材料優化以使得在各材料之間保持類似列印品質。 B . 一般核酸 ( NA ) 分離方案
簡言之，對於表徵研究，100 µL離液溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8.0，1.5 M鹽酸胍及1% v/v Triton-X. Sigma Aldrich)含有100 ng純化HeLa細胞gDNA (New England Biolabs)或100 ng純化BT474細胞gDNA及10 µg BSA，以模擬粗生物溶解物。對於複合樣品，將100 µL溶解緩衝液添加至50 µL細胞懸浮液(約106 個細胞)、單一5 mm葉盤切割物、100 µL全血或100 µL牛奶。除非另行說明，否則DipStix接著留在粗溶解物中5 min。此後為五次浸入水中1秒之洗滌步驟。DipStix接著轉移至含有重組酶聚合酶擴增(RPA)22 或用於NA擴增之定量聚合酶鏈反應(qPCR)反應物之管。對於RPA，桿段自手柄折斷且留在反應物中。對於qPCR，DipStix在20 µL的1× PCR緩衝液(2× GoTaq Clear，5 mM MgCl2 ，0.1 mM dNTP，4 μM SYTO-9 (50 μM)，0.05 U/μL Hot Start)中培育且接著由於干擾螢光獲取之不透明結構而移除。5µL含有DNA聚合酶、dNTP、引物及嵌入染料之1×PCR緩衝液隨後在熱循環之前添加。除非另外陳述，否則經Bilby 3D天然PLA列印為2 mm直徑型式的DipStix用於所有實驗。 C . DNA 偵測
對於等溫RPA，如製造商所推薦使用TwistAmp Basic套組(TwistDx)，伴以少量修改。簡言之，在37℃下在12.5 µL反應物中持續15 min進行RPA，所用反應物補充有250 nM之各引物及14 mM MgAc (乙酸鎂)。
所有qPCR實驗在ABI 7500 qPCR平台(Life Technologies)上進行。對於DNA之qPCR定量，如製造商所指導地使用Kapa2G Robust HotStart套組(Kapa Biosystems)，伴以少量修飾。簡言之，各25 µL反應物包括緩衝液A (緩衝液A為Kapa2G Robust HotStart套組之一部分且包含1.5 mM MgCl2 ；Sigma-Aldrich)、250 nM之各引物、25 µg BSA (New England Biolabs)及100 nM Syto9 (Life Technologies)。熱循環方案為95℃持續2 min、40個循環之95℃持續15 s、57℃持續15 s、72℃持續30 s。 D . RNA 偵測
對於mRNA及miRNA實驗，miScript逆轉錄套組(Qiagen)用於如製造商所指導地產生cDNA。miScript系統之益處為基於polyA/oligo dT方法自所有RNA物種產生cDNA。簡言之，攜帶來自ZR75-1乳房細胞溶解物之RNA的DipStix浸漬至25 µL之1× miScript HiFlex緩衝液中5 min且隨後移除。接著，將5 µL含有逆轉錄酶及所需核酸之1× HiFlex緩衝液添加至反應物。逆轉錄在37℃下進行60 min，接著在95℃下進行5 min直至不活化。cDNA接著用100 µL無RNA酶之水稀釋且將0.5 µL添加至各qPCR實驗。Her3及肌動蛋白mRNA之引物序列提供於下表1中。對於miRNA，使用miScript miR200a、miR15a及RNU6b檢定。表 1 ：
亦如製造商所推薦地使用基於TRIzol試劑(Invitrogen)之總RNA提取物作為與DipStix方法之比較。此處，100 ng純化RNA接著用於如上文所述之miScript系統。 E. 螢光成像
使用Nikon Eclipse Ni螢光顯微鏡在4×放大率下進行Cy5標記之短寡核苷酸於黑色PLA/碳纖維DipStix上之螢光及亮場成像。 F . 掃描電子顯微術
為了製備用於掃描電子顯微術(SEM)之DipStix，樣品在45℃下培育隔夜以移除任何污染物，且接著使用25 mm碳導電突片貼附至25 mm SEM標本安裝件上且接著使用Evactron型號25電漿清潔器(XIE Instruments)進一步去污。DipStix樣品之邊緣用碳塗料蘸塗以提高導電性。樣品接著使用Baltek Med 020樣品塗佈機經20 nm鉑塗佈且接著儲存於真空乾燥器中直至使用。緊鄰在分析之前，樣品再次使用Evactron型號25電漿清潔器去污。Jeol JSM-7001F場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)用於在8 kV或5 kV下以次級電子偵測模式檢查樣品之表面細節。 G . 流動電位
使用Anton Paar SurPASS流動電位計(德國)在NaCl溶液(1 mM)中於3D列印的熱塑性材料薄膜上進行流動電位量測。使用NaOH溶液(1 M)進行pH滴定。使用Fairbrother-Mastin法26 分析量測結果。實例 1 ：使用熱塑性材料分離核酸
經由意外發現，出人意料地發現3D列印材料可分離與下游擴增方案相容之DNA。為了確定此現象是否為其他消費者3D列印基質之共同特徵，簡單工具經設計以用於方便的實驗(圖1A)。在本文中稱為「DipStix」之此概念驗證3D列印工具經設計以正好放入0.2 mL管中且由連接至方形固持器之3 mm直徑的1.5 cm延伸部(桿)組成。簡言之，將DipStix浸入粗細胞溶解物溶液中，移除且藉由將其快速浸入水中5次而洗滌。DipStix接著置於核酸擴增反應混合物中。DipStix工具之特徵為可容易地折斷窄「桿」部分且將尖端密封於反應管中，藉此降低在使用期間交叉污染之風險。DipStix設計強調3D印刷機對於快速原型設計以及對於藉由便於設備定製而輔助研究之通用性。實例 2 ：作為用於核酸分離之基質的 3D 列印熱塑性聚合物
DipStix用各種3D列印基質列印以測試其對於自藉由常用溶解緩衝液製備之細胞溶解物分離核酸及對於後續擴增之有效性(圖1B)。此研究中測試之材料包括各種基於PLA、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)及耐綸之熱塑性聚合物基質。
圖1B中之資料顯示所有測試基質能夠自細胞溶解物(含有約1 ng/µL之DNA)分離足夠量的DNA以藉由等溫RPA進行後續核酸擴增。RPA由於其用於定點照護(POC)應用之潛力而在此初始研究中經選擇。因此，熱塑性聚合物基質為RPA及用於核酸分離及擴增之其他基於等溫系統之應用之理想伴侶。
在10種測試材料中，含木材之PLA基質導致最差擴增效率。儘管需要其他研究，但此結果可至少部分歸因於可藉由RPA抑制核酸擴增之來自木材之殘餘酚化合物。最後，由於擴增出現於所有使用DipStix之情況下且不出現於離液溶解緩衝液對照中之DNA，資料指示該方法可藉由RPA移除核酸擴增抑制劑。
此等資料顯示熱塑性聚合物基質適合於基於實驗室之NA分離。另外，由於僅需要洗滌用水容器，DipStix策略尤其適合於POC應用。
除非另外陳述，否則出於簡潔之目的，使用PLA基質「PLA Bilby 3D (天然)」進行以下研究。實例 3 ：低樣品要求
進行此實驗以測定獲得NA之可偵測擴增所需之樣品的量。簡言之，在來自包含100 ng至1 pg細胞株源性DNA之30 µL細胞溶解物材料之DipStix分離之DNA上採用qPCR。高拷貝基因(LINE1 )及低拷貝基因(BRAF )用於此研究。如圖2A中所示，需要少至1 pg之DNA以偵測LINE1 ，而BRAF 之偵測極限為10 pg。資料亦表明該方法自細胞溶解物移除足夠量的任何核酸擴增抑制劑，使得吾人可具有接近單一基因組複本(假設1個人類基因組複本為大致3 pg)之敏感度。經DipStix分離之DNA的量亦跨越用於已知DNA濃度之樣品的7個個別DipStix一致(參見圖2B)，如由類似qPCR循環臨限值(Ct)指示。此指示該方法為高度可再現的(CV=3.1%，N=7)。實例 4 ：潛在 DipStix 應用
DipStix方法延伸至介於研究至診斷應用範圍內的潛在基於NA之應用反應以展示其作為NA分離工具之可行性。為此目的，分別使用RPA及qPCR自粗哺乳動物細胞株溶解物成功地分離及擴增DNA(參見圖2C)、mRNA及miRNA (參見圖2D)。DNA成功地藉由RPA自頰部拭子及全血分離及偵測(參見圖2E)，且DNA成功地藉由PCR自粗植物提取物分離及偵測(參見圖2F)。此等資料展示用於一系列NA應用之潛力及與各種常用NA擴增方案之相容性。實例 5 ：快速 NA 捕獲及釋放
進行實驗以確定向熱塑性聚合物基質之DNA結合及後續釋放之動力學(參見圖3A-C)。簡言之，DipStix持續介於快速浸入細胞溶解物中(0秒)至浸沒5分鐘範圍內之時段暴露於細胞溶解物材料，接著為RPA。如圖3A中所示，跨越所有時間點觀測到類似擴增產率，表明所有可擴增DNA快速結合至熱塑性聚合物基質，至少在研究之時間標度內。
同樣，DNA可立即或經一段時間釋放至擴增緩衝液中且釋放之DNA的量將由擴增產率反映。在此實驗中，使用qPCR，因為RPA不適合於經預期之研究時間範圍進行定性量測。簡言之，將DNA負載之DipStix持續介於快速浸沒(0秒)至浸沒120分鐘範圍內之時段浸入qPCR緩衝液中以允許結合至基質之DNA溶離至緩衝液中。此後接著為qPCR。亦包括已知量之DNA標準品以估計可用於PCR之DNA的量。表示存在之DNA的量之Ct值用於評估擴增產率。如圖3B中所示，跨越所有時間點觀測到類似Ct值，表明所有可擴增DNA自熱塑性聚合物基質快速溶離，至少在研究之時間標度內。自1 ng/µL樣品釋放之可擴增DNA的量經估計為約0.28±0.04 ng。
接著考慮洗滌步驟以確定緩衝液之類型(H2 O或PCR緩衝液)及洗滌長度是否可影響後續NA擴增。如圖3C中所示，藉由水或PCR緩衝液洗滌熱塑性聚合物基質對後續NA擴增具有極小影響，因為觀測到類似Ct值。然而，在0.1與≥5 min洗滌長度之間，觀測到7.8 Ct之平均增加，表明DNA之快速及大量損失，與圖3B中可見之快速解吸附一致。另外，在進行大於5分鐘洗滌之情況下可見類似Ct值，表明在緩衝液中之DNA損失與結合之間達到平衡。資料亦指示甚至在60分鐘洗滌之後，仍可自熱塑性聚合物基質回收足夠DNA以用於後續擴增及偵測。實例 6 ：部分靜電驅動之 DNA 結合
進行此實驗以確定熱塑性聚合物基質之表面電荷是否歸因於其自細胞溶解物分離DNA之能力。在基於PLA之熱塑性聚合物基質上進行流動電位量測。出人意料地，發現基於PLA之熱塑性聚合物基質帶負電(參見圖5)，因此排除直接表面電荷相互作用。此假設由含DNA之水可結合至DipStix且導致陽性PCR擴增(參見圖3C及D)之觀測結果部分支持，其表明至少部分依賴於熱塑性聚合物基質之實體結構。此外，經分離之DNA的量亦隨著氯化胍(GuHCl)之濃度增加而增加(如由較低Ct值指示)(參見圖3D)，表明與博姆法9 類似之鹽橋/篩選現象可至少部分導致DNA分離。實例 7 ：核酸分離有效性隨表面積而變
考慮結合至熱塑性聚合物基質表面之NA的量是否隨基質之表面積而變。此係藉由操縱暴露於含有DNA之細胞溶解物材料之DipStix之長度及直徑來評估。如圖3E中所示，出人意料地發現隨著浸沒長度及直徑減小(亦即隨著表面積減小)，RPA擴增產率增加(其他條件不變)。亦發現增加列印解析度至200 µm(其增加表面積)降低擴增產率(參見圖3F)。然而，在100 µm 3D列印解析度處，Ct值提高，表明擴增產率增加。不受理論或特定應用模式束縛，在微觀層次在視覺上更平滑之100 µm解析度處之有效表面積可與300 µm解析度列印基質之有效表面積類似。
此等觀測結果為違反直覺的，因為將預期隨著表面積增加，DNA將更多且因此擴增產率將更大。然而，觀測到逆效果。此觀測結果可至少部分歸因於更多殘餘NA擴增抑制劑(例如離液鹽)結合至更大表面積，導致後續酶擴增之效率降低，儘管存在更多結合至基質之DNA。實例 8 ：核酸分離有效性依賴於宏觀粗糙度
基於以上實例7中之列印解析度資料，考慮更改熱塑性聚合物基質之表面粗糙度是否將影響其自細胞溶解物分離NA之能力。簡言之，基於PLA之熱塑性聚合物基質(PLA Bilby 3D，天然)用有機溶劑二氯甲烷(DCM)處理以使另外由逐層3D列印產生之凹槽變平滑(參見圖3G)。在掃描電子顯微術(SEM)下，DCM處理之基質在視覺上更平滑(參見圖3G；左側圖)。然而，在較高放大率下，相比於在顯微鏡下更平滑的未處理基質，DCM處理之基質在視覺上為多孔的(參見圖3G；右側圖)。在列印層之間更仔細檢查時(參見圖3H)，觀測到介於1-10微米範圍內之孔隙。DCM處理基質及未處理基質之效能之間的後續比較(參見圖3I)顯示多孔DCM處理基質(具有較高表面積)之表現或多或少地比未處理基質更差，與顯示於圖3E-F中之資料一致。排除藉由DCM之潛在酶抑制，因為DCM處理基質留在真空中隔夜以蒸發出任何殘餘DCM。因此，此等資料表明藉由逐層列印熱塑性聚合物基質引入之宏觀粗糙度促進NA分離。
亦評估藉由使用兩種不同模型之3D列印機製備之熱塑性聚合物基質之效能，但未觀測到顯著差異(參見圖3I)。實例 9 ：定位於列印層之間的凹槽的核酸
DNA與熱塑性聚合物基質表面之間的相互作用係藉由將DipStix尖端置於含有10 µM Cy5螢光團標記之短寡核苷酸的溶解緩衝溶液中而可視化(參見圖3J-K)。黑色PLA/碳纖維熱塑性聚合物基質用於此實驗以避免自體螢光效應。僅僅在列印層之間觀測到螢光，指示DNA優先定位於凹槽之間(參見圖3J)。
由於螢光DNA標記之DipStix經受NA分離方案，DipStix如下地成像：(1)緊接在自溶解緩衝液移除之後；(2)緊接在於水中洗滌之步驟之後；以及(3)緊接在浸沒於PCR緩衝液中5 min之後(參見圖3K)。如所預期，緊接在自含DNA之細胞溶解物移除之後在DipStix之尖端可見強螢光，指示DNA結合至基質。螢光水準在洗滌步驟之後顯著減小，指示移除過量DNA。在仔細檢查後，洗滌步驟之後剩餘的結合DNA幾乎完全發現於列印層與熱塑性聚合物基質之間的凹槽中。最後，在將DipStix留在PCR緩衝液中之後，可見最小螢光，指示幾乎所有剩餘的DNA溶離至PCR緩衝液中且可用於後續擴增。此與qPCR資料一致(參見圖3B)，其中幾乎所有可擴增DNA幾乎立即溶離至PCR緩衝液中。
進行另一研究以確定溶解緩衝液如何與DipStix相互作用。使用補充有食品著色劑之溶解緩衝液或水，觀測到染色溶解緩衝液在DipStix軸上快速芯吸(參見圖3L)。相比之下，染色水定位於與溶液接觸之DipStix的表面。染色溶解緩衝液之快速芯吸可能歸因於溶解緩衝液中存在界面活性劑(1% Tween 20)，其可至少部分促進增強NA捕獲。實例 10 ：熱塑性聚合物基質之流動電位
進行此研究以量測若干熱塑性聚合物基質之流動(澤塔；ζ)電位。使用Anton Paar SurPASS流動電位計(德國)在1 mM NaCl溶液中於1 mm熱塑性聚合物基質膜上進行該方法。使用1 M NaOH溶液進行pH滴定且使用Fairbrother-Mastin法分析量測結果。如圖5中所示之流動電位資料展示基於PLA之基質(PLA Bilby 3D (天然)、PLA ColorFab Copper及PLA ProtoPasta Conductive)、基於苯乙烯之基質(ABS Esun (白色))及基於耐綸之基質(Nylon Taulman 910)全部跨越大pH值範圍帶負電。本發明人觀測到鹽濃度不將熱塑性聚合物基質之淨電荷自負性變為正性。鹽濃度之變化僅改變影響電荷量測結果之強度(例如弱負性至強負性，且反之亦然)。本發明人未在測試之pH範圍內在基質上觀測到任何正電荷：如由Kirby及Hasselbrink Jr (2014,Electrophoresis , 25(2), 187-202)在開創性論文中所概述，相比於此實驗中採用之較低離子濃度(1 mM NaCl)，預期測試之熱塑性聚合物基質之ζ電位(有效表面電荷)在比用於本文揭示之實驗中之溶解緩衝液中將存在更高之離子濃度下保留淨負電荷。不受理論或特定應用模式束縛，此可歸因於預期單價離子(鹽酸胍及Tris-HCl)不吸收至表面，且因此不影響熱塑性聚合物基質之表面電荷密度。可影響ζ電位之符號的因素為溶液之pH，其將指示熱塑性聚合物之質子化/去質子化程度。由於此處測試之溶解緩衝液在pH 5與pH 11之間的範圍內且所有熱塑性聚合物跨越此pH範圍產生負ζ電位值，可易於推斷本文揭示之更早實驗之溶解緩衝液中之熱塑性聚合物基質之ζ電位由於離子篩選效應亦保留淨負電荷。實例 11 ：溶解緩衝液及洗液對 NA 分離及後續 PCR 擴增之影響
進行實驗以確定不同溶解緩衝液對使用熱塑性聚合物基質進行核酸分離及經分離DNA之後續PCR擴增之影響。進行此研究，因為已知某些溶解緩衝液干擾PCR擴增。簡言之，使用三種不同溶解緩衝液溶解BT474人類乳癌細胞：(i)包含50 mM Tris-HCl pH 8.0、1.5 M鹽酸胍及1% v/v Triton-X之基於GuHCl之溶解緩衝液.Sigma Aldrich，(ii)包含20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、0.5% (w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)及800單位/毫升蛋白酶K之SDS萃取緩衝液，及(iii)包含50 mM Tris-cl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA pH 8.0、1% Triton X 100、1%鈉鹽去氧膽酸及0.1% SDS之RIPA緩衝液。如圖6-14中所示，GuHCl及RIPA溶解緩衝液對靶DNA之後續PCR擴增無可辨別的抑制作用，而SDS萃取緩衝液抑制靶DNA之PCR擴增。
對於GuHCl及RIPA溶解緩衝液兩者，背景產物之非特異性擴增顯而易見，如由「無DNA」陰性對照樣品中存在擴增子所示。然而，資料顯示陰性對照樣品中之擴增子僅在自陽性對照樣品產生擴增子之後的10個或大於10個循環變得顯而易見。因此，小於30個循環之截止值可用於排除背景擴增，但仍允許靶核酸擴增。實例 12 ：鹽濃度對 Na 分離及後續 PCR 擴增之影響
進行實驗以確定細胞溶解物中之鹽濃度之變化對核酸分離及後續PCR擴增是否具有任何影響。如圖13-14中所示，較低鹽濃度更好地起作用，表明DNA擴增之循環時間(CT)隨著溶解緩衝液中之鹽濃度減小而減少。較高鹽濃度(例如6 M)仍起作用，但CT值因此增加。CT之此增加可不利地影響DNA擴增之下限。應注意，污染物發現於高於30 CT處。此外，相比於較高鹽濃度，較低鹽濃度被視為對於DNA擴增最佳，儘管擴增子產生於所有測試鹽濃度下。資料亦顯示在自溶解緩衝液移除熱塑性聚合物基質之後用水洗滌熱塑性聚合物基質降低鹽對qPCR擴增之任何抑制作用。論述
不受理論或特定應用模式束縛，來自此等研究之資料表明使用熱塑性聚合物基質促進核酸(NA)自細胞溶解物材料分離之可能的作用機制，如在圖4中圖解說明。在適合之鹽條件下，NA及核酸擴增抑制劑快速結合至熱塑性聚合物基質表面(參見圖3A)，包括可在熱塑性聚合物基質層之間形成的任何凹槽(參見圖3J-K)。結合至熱塑性聚合物基質之NA的量有可能由於溶解緩衝液中存在界面活性劑而可藉由快速芯吸增加(參見圖3L)。NA及核酸擴增抑制劑似乎均結合至熱塑性聚合物基質，如由表面積與擴增產率之間的倒數關係證明(參見圖3E及F)。NA結合至熱塑性聚合物基質上似乎幾乎立即發生，如由經各種暴露時間之類似擴增產率證明(參見圖3A)。在低鹽洗滌期間，充分地移除過量NA及核酸擴增抑制劑以允許擴增NA(參見圖1B及3K)。此外，由於NA似乎優先定位於DipStix之熱塑性聚合物基質層之間的凹槽(參見圖3J及K)，有可能一些NA可「截留」於熱塑性聚合物基質之孔隙內(參見圖3G及H)，如由延長洗滌時段之後的一致DNA回收所證明(參見圖3C)。最後，當NA結合之熱塑性聚合物基質置於NA擴增緩衝液中(有利於NA溶合(溶離))時，其餘的NA在其可用於NA擴增時快速進入溶液(參見圖3B、C及K)。
此等資料強調藉由使用熱塑性聚合物基質，諸如3D列印聚合物基質進行簡單及快速NA分離之新方法。由於本文所揭示之方法之速度及簡單性，熱塑性聚合物基質提供習知NA分離方案之有利替代方案。此外，隨著消費級熱塑性聚合物基質變得更可獲取，可易於定製的平台，諸如本文揭示之DipStix實例將更廣泛地應用於需要NA分離之實驗室應用及基於POC之應用兩者中。
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圖 1A 顯示使用基於PLA之3D列印DipStix自溶解物材料分離核酸(DNA)之一般方法及步驟。圖 1B 為藉由HeLa細胞基因組DNA (LINE1靶序列)之等溫重組酶聚合酶擴增(RPA)製備之DNA擴增產物(擴增子)之凝膠影像，其顯示能夠自溶解物材料分離DNA以進行後續DNA擴增之不同熱塑性3D列印基質。所用熱塑性3D列印基質之類型及其製造商沿圖B頂部提供。(+)：陽性樣品。(-)：無DNA對照。DNA帶尺寸為如所指示。
圖 2 顯示DipStix於複合樣品中之效能及應用。(A)使用BRAF 及LINE1 引物隨DNA濃度而變的qPCR Ct值。BRAF 擴增子(DNA擴增產物)由頂線表示，而LINE1 擴增子由底線表示；誤差條指示SD(n=2)。(B)自7個具有10 ng/µL調用溶解物之獨立DipStix分離之DNA的可再現qPCR Ct值；誤差條指示SD(n=7)。(C)藉由RPA自粗細胞溶解物擴增之LINE1 及BRAF 序列之凝膠影像。(D)相比於Trizol提取之總RNA，來自粗細胞溶解物之miRNA及mRNA標靶之RT-qPCR概況；自左至右：miR200a、miR15a、RNU6b、肌動蛋白及Her3。(E)藉由RPA自來自頰部拭子及全血之粗細胞溶解物擴增之LINE1序列之凝膠影像(NoT=無標靶對照)。(F)比較經DipStix分離之DNA與直接添加至PCR反應之1 µL粗植物溶解物之間的PCR效能之凝膠影像。使用芥菜及番茄葉。
圖 3A 顯示在Dipstix暴露於含DNA之溶解緩衝液1秒至5分鐘之時段之後產生之RPA擴增子之代表性凝膠影像。圖 3B 顯示在Dipstix持續5分鐘之時段暴露於含DNA之溶解緩衝液、五次浸漬1秒而於水中洗滌及持續快速(瞬時)浸漬(t=-0)至120分鐘之時段溶離至PCR緩衝液中之後產生之RPA擴增子之平均Ct值(右側圖)；包括已知量之DNA標準品以估計可用於PCR之DNA的量(參見左側圖)。圖 3C 顯示在Dipstix暴露於含DNA之溶解緩衝液5分鐘、持續約0.1分鐘至60分鐘之時段於水(左條形圖)或PCR緩衝液(右條形圖)中洗滌且隨後溶離至PCR緩衝液中5分鐘之後產生之RPA擴增子之平均Ct值。圖 3D 顯示在Dipstix暴露於含有增加濃度之氯化胍(GuHCl)之含DNA之溶解緩衝液之後產生的RPA擴增子之平均Ct值。圖 3E 顯示隨表面積而變的向熱塑性聚合物基質之DNA結合之有效性，其藉由使用浸沒至含DNA之溶液中之列印為1、2、3 mm直徑之DipStix產生之RPA擴增子之代表性凝膠圖像(左側圖)及2 mm平均直徑之DipStix浸沒至含DNA之溶液中5、2.5及1.25 mm時產生之RPA擴增子之代表性凝膠圖像。圖 3F 顯示在將熱塑性聚合物基質之列印解析度增加至400 µm之後產生之RPA擴增子之平均Ct值，表明增加列印解析度增加熱塑性聚合物基質之表面積。圖 3G 顯示經二氯甲烷(DCM)處理及未處理之DipStix在60×(上圖)及5000×(下圖)放大率下之掃描電子顯微鏡(SEM)影像；比例尺為如所示。圖 3H 為來自圖3G中所示之白框(參見未處理、60×放大率；上圖)之放大SEM影像，其顯示列印層之間的結構。圖 3I 顯示使用藉由兩種不同3D列印機(Print1、Print2)製造之經DCM處理及未處理DipStix自含DNA之溶解物分離之DNA之RPA擴增子之代表性凝膠影像；DNA標記物顯示於最左側且陰性對照(無DNA)顯示於最右側。圖 3J 顯示位於熱塑性聚合物基質之列印層之間的Cy5-寡核苷酸(oligo)之螢光成像。(H)圖 3K 顯示在以下DNA分離步驟期間Dipstix之螢光成像：(i)在浸沒至具有Cy5-寡核苷酸之含DNA之溶解緩衝液中之後，(ii)在用水洗滌之後，及(iii)在浸沒至PCR溶離緩衝液中之後。(I)圖 3L 為浸沒於水(左側)或包含藍色染料之溶解緩衝液(右側)中之DipStix之相片，顯示溶液沿DipStix之芯吸。
圖 4 為可使核酸結合至熱塑性聚合物基質之提議機制之圖形表示，顯示由改變萃取(分離)、洗滌及溶離階段期間之緩衝條件所致之核酸分子(曲線)及抑制劑(點)之締合及解離常數(κ )。
圖 5 顯示若干熱塑性聚合物基質之流動(澤塔；ζ)電位：自左側開始且自頂部至底部：PLA Bilby 3D (天然)、ABS Esun (白色)、Nylon Taulman 910、PLA ColorFab Copper及PLA ProtoPasta Conductive。資料顯示所有測試之熱塑性聚合物基質跨越大pH值範圍在鹽溶液中帶負電。使用Anton Paar SurPASS流動電位計(德國)在1 mM NaCl溶液中於1 mm熱塑性聚合物基質材料膜上進行量測。使用1 M NaOH溶液進行pH滴定。使用Fairbrother-Mastin法分析量測結果。
圖 6 顯示自DNA產生之擴增子之定量PCR (qPCR)曲線，所述DNA藉由Dipstix自包含GuHCl及100 ng BT474源性DNA (靶向LINE1序列)之細胞溶解物分離。細胞溶解物係藉由使BT474人類乳癌細胞暴露於溶解物緩衝液而製備。檢查於水中洗滌DipStix之效應以確定是否可自DipStix有效地移除鹽溶解緩衝液以免干擾藉由qPCR擴增DNA。此等資料展示洗滌有效地移除任何PCR抑制量的GuHCl且未能洗滌導致PCR擴增抑制。
圖 8 顯示自DNA產生之擴增子之熔融分析，所述DNA藉由Dipstix自包含GuHCl之溶解緩衝液及100 ng BT474源性DNA之細胞溶解物分離。DNA擴增在自如下DipStix分離之DNA之情況下最佳：在浸漬至含DNA之溶解緩衝液中之後且在置於PCR擴增緩衝液中之前用水洗滌。
圖 9 顯示自DNA產生之擴增子之qPCR曲線，所述DNA藉由Dipstix自包含Tris-HCl、EDTA、SDS、蛋白酶K及100 ng BT474源性DNA之細胞溶解物分離。細胞溶解物係藉由使BT474人類乳癌細胞暴露於溶解緩衝液而製備。檢查於水中洗滌DipStix之效應以確定是否可自DipStix有效地移除基於Tris之溶解緩衝液以免干擾藉由qPCR擴增DNA。基於Tris之溶解緩衝液似乎抑制DNA之PCR擴增，可能歸因於水洗滌不足以移除均已知干擾PCR擴增之SDS及蛋白酶K。
圖 10 顯示自DNA產生之擴增子之熔融分析，所述DNA藉由Dipstix自包含Tris-HCl溶解緩衝液、EDTA、SDS、蛋白酶K及100 ng BT474源性DNA之細胞溶解物分離。資料顯示未在樣品中之任一者中產生擴增子，除了陽性對照(250 ng DNA)。
圖 11 顯示自DNA產生之擴增子之qPCR曲線，所述DNA藉由Dipstix自包含RIPA溶解緩衝液及100 ng BT474源性DNA之細胞溶解物分離。細胞溶解物係藉由使BT474人類乳癌細胞暴露於RIPA緩衝液而製備。檢查於水中洗滌DipStix之效應以確定是否可自DipStix有效地移除鹽溶解緩衝液以免干擾藉由qPCR擴增DNA。此等資料展示洗滌有效地移除任何PCR抑制量的RIPA緩衝液且未能洗滌導致PCR擴增抑制。
圖 12 顯示自DNA產生之擴增子之熔融分析，所述DNA藉由Dipstix自包含RIPA溶解緩衝液及100 ng BT474源性DNA之細胞溶解物分離。DNA擴增在自如下DipStix分離之DNA之情況下最佳：在浸漬至含DNA之溶解緩衝液中之後且在置於PCR擴增緩衝液中之前用水洗滌。未洗滌樣品產生不同熔融曲線，其表明洗滌對移除RIPA重要。
圖 13 顯示自DNA產生之擴增子之qPCR曲線，所述DNA藉由Dipstix自包含100 ng BT474源性DNA及在375 mM至6 M範圍內之不同GuHCl鹽濃度之溶解緩衝液之細胞溶解物分離。此等資料展示較低鹽濃度更好地起作用，表明DNA擴增之循環時間(CT)隨著鹽濃度減小而減少。較高鹽濃度(例如6 M)仍起作用，但CT值因此增加。CT之此增加可不利地影響DNA擴增之下限。
圖 14 顯示自DNA產生之擴增子之熔融分析，所述DNA藉由Dipstix自包含100 ng BT474源性DNA及在介於6 M至375 mM範圍內之不同GuHCl鹽濃度之溶解緩衝液之細胞溶解物分離。發現相比於較高鹽濃度，較低鹽濃度對於DNA擴增最佳，儘管在所有鹽濃度下均產生擴增子。此等資料亦顯示用水洗滌DipStix消除鹽對qPCR擴增之抑制作用。

Claims (53)

  1. 一種自含有核酸之樣品分離核酸之方法，該方法包含： (a)在允許該樣品中之核酸可逆地結合至熱塑性聚合物基質之條件下將該樣品暴露於該基質； (b)在優先移除結合至該基質之非核酸雜質之條件下洗滌(a)之核酸結合基質；及 (c)將(b)之經洗滌核酸結合基質暴露於溶離緩衝液，藉此自該基質回收該核酸； 其中該熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
  2. 如請求項1之方法，其中該熱塑性聚合物基質選自由以下組成之群：聚醯胺、聚乳酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯及前述任一者之複合物或摻合物。
  3. 如請求項2之方法，其中該複合物或摻合物包含聚乳酸。
  4. 如請求項3之方法，其中熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及金屬之摻合物。
  5. 如請求項4之方法，其中該金屬選自由銅及鋁組成之群。
  6. 如請求項3之方法，其中熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及碳之複合物。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該樣品為生物樣品。
  8. 如請求項7之方法，其中該生物樣品選自由以下組成之群：血液、血清、血漿、尿液、精液、羊膜液及脊髓液。
  9. 如請求項7之方法，其中該生物樣品為細胞溶解物。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該樣品包含離液鹽。
  11. 如請求項10之方法，其中該樣品包含約375 mM至約6 M之量的離液鹽。
  12. 如請求項11之方法，其中(a)之細胞溶解物包含約1.5 M之量的離液鹽。
  13. 如請求項10至12中任一項之方法，其中該離液鹽為氯化胍。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該熱塑性聚合物基質具有細長結構，其平均直徑為約1 mm至約3 mm。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中該熱塑性聚合物基質具有細長結構，其長度為約1至約30 mm。
  16. 如請求項15之方法，其中該熱塑性聚合物基質之長度為約10 mm至約15 mm。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中步驟(a)包含持續約0.5秒至約5分鐘之時段將該樣品暴露於該熱塑性聚合物基質。
  18. 如請求項17之方法，其中步驟(a)包含持續約0.5秒至約1分鐘之時段將該樣品暴露於該熱塑性聚合物基質。
  19. 如請求項17之方法，其中步驟(a)包含持續約0.5秒至約30秒之時段將該樣品暴露於該熱塑性聚合物基質。
  20. 如請求項17之方法，其中步驟(a)包含持續約0.5秒至約1秒之時段將該樣品暴露於該熱塑性聚合物基質。
  21. 如請求項17至20中任一項之方法，其中將該樣品暴露於該熱塑性聚合物基質包含將該熱塑性聚合物基質浸漬至該樣品中。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中步驟(b)包含於水中洗滌該核酸結合基質。
  23. 如請求項22之方法，其中步驟(b)包含持續約5秒至約1分鐘之時段於水中洗滌該核酸結合基質。
  24. 如請求項22之方法，其中步驟(b)包含將該核酸結合基質浸漬至水中。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該溶離緩衝液為PCR緩衝液。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中步驟(c)包含持續約0.5秒至約5分鐘之時段將洗滌之核酸結合基質暴露於該溶離緩衝液。
  27. 如請求項26之方法，其中步驟(c)包含持續約0.5秒至約1分鐘之時段將該洗滌之核酸結合基質暴露於該溶離緩衝液。
  28. 如請求項26之方法，其中步驟(c)包含持續約0.5秒至約1秒之時段將該洗滌之核酸結合基質暴露於該溶離緩衝液。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中將該洗滌之核酸結合基質暴露於溶離緩衝液細胞包含將該洗滌之核酸結合基質浸漬至該溶離緩衝液中。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其進一步包含自步驟(c)中回收之該核酸擴增靶核酸序列。
  31. 如請求項30之方法，其中該靶核酸係在熱塑性聚合物基質存在下在反應容器中擴增。
  32. 一種組合物，其包含藉由如請求項1至29中任一項之方法回收之核酸。
  33. 一種自細胞溶解物分離核酸之套組，該套組包含： (a)熱塑性聚合物基質； (b)溶離緩衝液；以及 (c)視情況存在之細胞溶解緩衝液； 其中該熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
  34. 如請求項33之套組，其中該熱塑性聚合物基質選自由以下組成之群：聚醯胺、聚乳酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯及前述任一者之複合物或摻合物。
  35. 如請求項34之套組，其中該複合物或摻合物包含聚乳酸。
  36. 如請求項35之套組，其中該熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及金屬之摻合物。
  37. 如請求項36之套組，其中該金屬選自由銅及鋁組成之群。
  38. 如請求項35之套組，其中該熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及碳之複合物。
  39. 如請求項33至38中任一項之套組，其中該套組包含細胞溶解緩衝液。
  40. 如請求項39之套組，其中該細胞溶解緩衝液包含離液鹽。
  41. 如請求項40之套組，其中該細胞溶解緩衝液包含約375 mM至約6 M之量的離液鹽。
  42. 如請求項41之套組，其中該細胞溶解緩衝液包含約1.5 M之量的離液鹽。
  43. 如請求項39至42中任一項之套組，其中該離液鹽為氯化胍。
  44. 如請求項33至43中任一項之套組，其中該熱塑性聚合物基質具有細長結構，其平均直徑為約1 mm至約3 mm。
  45. 如請求項33至44中任一項之套組，其中該熱塑性聚合物基質具有細長結構，其長度為約1至約30 mm。
  46. 如請求項45之套組，其中該熱塑性聚合物基質之長度為約10 mm至約15 mm。
  47. 如請求項33至46中任一項之套組，其中該溶離緩衝液為PCR緩衝液。
  48. 一種根據如請求項1至29中任一項之方法自含有核酸之樣品分離核酸之熱塑性聚合物基質，其中該熱塑性聚合物基質在溶液中具有淨負電荷。
  49. 如請求項48之熱塑性聚合物基質，其中該熱塑性聚合物基質選自由以下組成之群：聚醯胺、聚乳酸、丙烯腈丁二烯苯乙烯及前述任一者之複合物或摻合物。
  50. 如請求項49之熱塑性聚合物基質，其中該複合物或摻合物包含聚乳酸。
  51. 如請求項50之熱塑性聚合物基質，其中該熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及金屬之摻合物。
  52. 如請求項51之熱塑性聚合物基質，其中該金屬選自由銅及鋁組成之群。
  53. 如請求項49之基質，其中該熱塑性聚合物基質為包含聚乳酸及碳之複合物。
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