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TW201929870A - 包含二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸 - Google Patents

包含二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸 Download PDF

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TW201929870A
TW201929870A TW107146565A TW107146565A TW201929870A TW 201929870 A TW201929870 A TW 201929870A TW 107146565 A TW107146565 A TW 107146565A TW 107146565 A TW107146565 A TW 107146565A TW 201929870 A TW201929870 A TW 201929870A
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亨利 福瑞丹朗德 韓森
卓爾斯 蔻克
賈斯柏 渥姆
愛德蘭 史查布林
艾瑞克 方德
喬治 杜查梅爾
拉斯 喬恩森
李美玲
馬汀那 布里吉特 杜查梅爾
吳勇
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丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司
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Abstract

本發明係關於一種寡核苷酸，其包含至少一個如本說明書及技術方案中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。

本發明之寡核苷酸可用作藥物。

Description

包含二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸
近幾十年來，使用合成寡核苷酸作為治療劑取得了顯著進展，從而導致藉由不同機制起作用的分子之發展，該等機制包括RNase H活化間隙子(gapmer)、剪接切換寡核苷酸、微RNA抑制劑、siRNA或適體(S. T. Crooke,Antisense drug technology: principles, strategies, and applications , 第2版, Boca Raton, FL: CRC出版社,2008 )。然而，寡核苷酸在生物系統中對於核分解降解本質上係不穩定的。另外，其展示出高度不利的藥物動力學行為。為了改進此等缺點，近幾十年來已研究廣泛多種化學修飾。可認為最成功修飾中之一者為引入硫代磷酸酯連結，其中非橋接磷酸酯氧原子中之一者經硫原子替代(F. Eckstein,Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009 ,10 , 117-121)。此類硫代磷酸酯寡去氧核苷酸展示出增加的蛋白質結合以及明顯較高的核分解降解穩定性，且因此相比於其未經修飾之磷酸二酯類似物，其在血漿、組織及細胞中的半衰期實質上更長。此等關鍵特徵使第一代寡核苷酸療法之發展成為可能以及為其經由後代修飾(諸如鎖核酸(LNA))而進一步改良提供機會。然而，用硫代磷酸酯置換磷酸二酯連結在磷原子處產生對掌性中心。因此，所有經批准硫代磷酸酯寡核苷酸療法係用作大量非對映異構化合物之混合物，其皆潛在地具有不同(及可能相反的)生理化學及藥理學特性。
雖然單立體化學定義之硫代磷酸酯寡核苷酸的立體特異性合成現在係可能的(N. Oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada,J. Am. Chem. Soc. 2008 ,130 , 16031-16037)，但在大量可能的非對映異構體內識別具有最佳特性之立體異構體仍存在挑戰。在此上下文中，藉由使用非對掌性硫代磷酸酯連結來降低非對映異構複雜性極受關注。舉例而言，其中磷酸酯連結內的兩個非橋接氧原子經硫置換之對稱的非橋接二硫代酸酯修飾(參見例如W. T. Wiesler, M. H. Caruthers,J. Org. Chem. 1996 ,61 , 4272-4281)已應用於免疫刺激寡核苷酸(A. M. Krieg, S. Matson, E. Fisher,Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996 ,6 , 133-139)、siRNA (例如X. Yang, M. Sierant, M. Janicka, L. Peczek, C. Martinez, T. Hassell, N. Li, X. Li, T. Wang, B. Nawrot,ACS Chem. Biol. 2012 ,7 , 1214-1220)及適體(例如X. Yang, S. Fennewald, B. A. Luxon, J. Aronson, N. K. Herzog, D. G. Gorenstein,Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999 ,9 , 3357-3362)。引起關注地，迄今為止嘗試在反義寡核苷酸之上下文中利用此非對掌性修飾已取得有限成效(參見例如M. K. Ghosh, K. Ghosh, O. Dahl, J. S. Cohen,Nucleic Acids Res. 1993 ,21 , 5761-5766.及J. P. Vaughn, J. Stekler, S. Demirdji, J. K. Mills, M. H. Caruthers, J. D. Iglehart, J. R. Marks,Nucleic Acids Res. 1996 ,24 , 4558-4564)。
出人意料地，吾等已發現可將非橋接的二硫代磷酸酯引入至寡核苷酸中，尤其係通常引入至寡核苷酸間隙子或混合子(mixmer)中，且特別係LNA-DNA-LNA間隙子或LNA/DNA混合子中。修飾具有良好耐受性，且所得分子展示出治療劑應用之極大潛力，而每個非橋接之二硫代磷酸酯修飾使可能的非對映異構體之整體庫之大小減小50%。當將修飾置放於間隙子之LNA側接中時，證明所得寡核苷酸通常比對應的所有硫代磷酸酯親本更具效力。一般而言，修飾在間隙區內另外具有良好耐受性，且當適當安置時，甚至更出人意料地亦會引起改良的效力。
因此吾等出人意料地發現，本發明提供具有改良之生理化學及藥理學特性，包括(例如)改良之效力的寡核苷酸。在一些態樣中，本發明之寡核苷酸保持活性或功效，且可與相同化合物同樣強效或更強效，在相同化合物中，式(IA或IB)之二硫代磷酸酯連結經習知的立體無規之硫代磷酸酯連結(硫代磷酸酯參考化合物)置換。非橋接之二硫代磷酸酯修飾的每一引入移除磷處對掌性中心中之一者，且藉此使化合物之非對映異構複雜性減小50%。另外，不論何時引入二硫代酸酯修飾，寡核苷酸似乎被顯著更好地吸收至細胞中，特別係 (例如)吸收至肝細胞、肌肉細胞、心臟細胞中。
將非橋接之二硫代酸酯修飾引入至間隙子之LNA側接中似乎尤其有益，從而導致分子顯示出較高靶標減少及實質上更好的吸收行為、更高穩定性及良好安全特徵。
寡核苷酸中之非橋接之二硫代磷酸酯連結之化學合成最好藉由使用適當的硫代亞磷醯胺建構嵌段之固相寡核苷酸合成技術來達成。已對常規DNA (X. Yang,Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2016 ,66 , 4.71.71-74.71.14.)以及RNA (X. Yang,Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2017 ,70 , 4.77.71-74.77.13.)之此類硫代亞磷醯胺的成功應用有所描述且所要建構嵌段可自商業源獲得。引起關注地，尚未報導對應LNA硫代亞磷醯胺之更具挑戰的合成。在本申請案內，吾等亦報導所有四種LNA硫代亞磷醯胺及將其併入寡核苷酸中之成功合成。
本發明係關於一種寡核苷酸，其包含式(I)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結

其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子，且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷且其中R為氫或磷酸酯保護基。本發明進一步係關於(尤其係關於)包含式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之間隙子寡核苷酸。本發明亦係關於一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，且係關於一種用於(尤其用於)製造根據本發明之寡核苷酸之LNA核苷單體。
本發明係關於一種寡核苷酸，其包含式(IA)或(IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子，且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子。
換言之，M為金屬，諸如鹼金屬，諸如Na或K；或M為NH4 。
本發明提供一種反義寡核苷酸，其包含如本文中所描述之式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結。本發明之寡核苷酸較佳為單股反義寡核苷酸，其包含一或多個2'糖修飾之核苷，諸如一或多個LNA核苷或一或多個2' MOE核苷。本發明之反義寡核苷酸能夠活體內或活體外調節諸如靶標前mRNA或靶標微RNA之靶標核苷酸在表現靶標RNA之細胞中之表現。在一些實施例中，單股反義寡核苷酸進一步包含硫代磷酸酯核苷間連結。單股反義寡核苷酸可例如，可呈間隙子寡核苷酸、混合子寡核苷酸或總子(totalmer)寡核苷酸形式。單股反義寡核苷酸混合子可用於調節靶標前mRNA中之剪接事件。單股反義寡核苷酸混合子可用於抑制靶標微RNA之表現。
本發明進一步係指使用本發明之寡核苷酸，諸如單股反義寡核苷酸作為治療劑。
本發明進一步係關於(尤其係關於)包含式(IA或IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結之混合子寡核苷酸。本發明進一步係關於(尤其係關於)包含式(IA或IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結之總子寡核苷酸。
本發明亦係關於一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，且係關於一種用於(尤其用於)製造根據本發明之寡核苷酸之LNA核苷單體。
本發明亦係關於一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，且係關於一種用於(尤其用於)製造根據本發明之寡核苷酸之MOE核苷單體。
本發明進一步提供可用於製造根據本發明之寡核苷酸之新穎的MOE及LNA單體。
在寡核苷酸合成期間，通常使用保護性R基團之用途。在寡核苷酸合成之後，諸如當寡核苷酸呈鹽形式時，保護基通常用於交換氫原子或陽離子(如鹼金屬或銨陽離子)。鹽通常含有陽離子，諸如金屬陽離子，例如鈉或鉀陽離子或銨陽離子。關於反義寡核苷酸，較佳R為氫，或反義寡核苷酸呈鹽形式(如IB中所展示)。
式(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結可例如選自由以下組成之群：

其中M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子。本發明之寡核苷酸可因此呈寡核苷酸鹽、鹼金屬鹽之形式，諸如鈉鹽、鉀鹽或銨鹽。
可替代地表示，本發明之寡核苷酸可包含式IA'或IB'之二硫代磷酸酯核苷間連結
。
本發明進一步係關於(尤其係關於)一種包含式(I) (例如式IA或IB、或式IA'或式IB')之二硫代磷酸酯核苷間連結之間隙子寡核苷酸。
本發明進一步係關於(尤其係關於)一種包含式(I) (例如式IA或IB、或式IA'或式IB')之二硫代磷酸酯核苷間連結之混合子寡核苷酸。
本發明進一步係關於(尤其係關於)一種包含式(I) (例如式IA或IB、或式IA'或式IB')之二硫代磷酸酯核苷間連結之總子寡核苷酸。
在本發明之寡核苷酸之較佳實施例中，兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷。
在本發明之寡核苷酸之較佳實施例中，兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'-O-MOE核苷。
在本發明之寡核苷酸之較佳實施例中，寡核苷酸為單股反義寡核苷酸，兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷。
在本發明之寡核苷酸之較佳實施例中，寡核苷酸為單股反義寡核苷酸，且兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'-O-MOE核苷。
本發明提供一種用於抑制細胞中之靶標RNA之反義寡核苷酸，其中反義間隙子寡核苷酸包含式(IA)或(IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結
(IA)(IB)
其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中反義寡核苷酸為或包含反義間隙子寡核苷酸(在本文中被稱作間隙子或間隙子寡核苷酸)。
本發明之反義寡核苷酸可因此包含間隙子或由間隙子組成。
本發明提供一種包含式IA或IB之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中A2 為寡核苷酸之3'末端核苷。
本發明提供一種包含式(IA或IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中A1 為寡核苷酸之5'末端核苷。
本發明提供一種包含式(IA或IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2-O-MOE核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中A2 為寡核苷酸之3'末端核苷。
本發明提供一種包含式(IA或IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2-O-MOE核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中A1 為寡核苷酸之5'端核苷。
本發明提供一種包含至少一個式(IA或IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中A2 為寡核苷酸之3'端核苷。
本發明提供一種包含式(IA或IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，其中A1 為寡核苷酸之5'端核苷。
2'糖修飾之核苷可獨立地選自由以下組成之群：2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA及LNA核苷。
本發明提供一種包式(IA)或(IB)之至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結之單股反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股寡核苷酸進一步包含至少一個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，(Sp, S)或(Rp, R)

其中N1 及N2 為核苷。
本發明亦提供一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中R為氫或磷酸酯保護基。
本發明亦提供一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子；且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股反義寡核苷酸用於調節前mRNA靶標RNA之剪接。
本發明亦提供一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子；且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股反義寡核苷酸用於抑制長非編碼RNA之表現。對於可經本發明之化合物靶向之lncRNA的實例，參見WO 2012/065143。
本發明亦提供一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子；且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股反義寡核苷酸用於抑制人類mRNA或前mRNA靶標之表現。
本發明亦提供一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子；且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股反義寡核苷酸用於抑制病毒RNA靶標之表現。舉例而言，合適之病毒RNA靶標可為HCV或HBV。
本發明亦提供一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為7至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子；且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股反義寡核苷酸用於抑制微RNA之表現。
對於靶向RNA靶標，例如前mRNA靶標、mRNA靶標、病毒RNA靶標、微RNA或長非編碼RNA靶標，本發明之寡核苷酸能夠適當抑制靶標RNA之表現。此藉由反義寡核苷酸與靶標RNA之間的互補性來達成。對RNA靶標之抑制可藉由降低RNA靶標之含量或藉由阻斷RNA靶標之功能來達成。RNA靶標之RNA抑制可經由募集諸如RNase H之細胞RNA酶，例如經由間隙子使用來適當地達成，或可經由非核酸酶介導之機制，諸如空間阻斷機制(諸如用於微RNA抑制、用於剪接調節前mRNA或用於阻斷長非編碼RNA與染色質之間的相互作用)達成。
本發明亦係關於一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，且係關於一種用於(尤其用於)製造根據本發明之寡核苷酸之LNA或MOE核苷單體。
本發明提供一種根據本發明之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽或其共軛物，特別係鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
本發明提供一種共軛物，其包含寡核苷酸或其醫藥學上可接受之鹽，及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
本發明提供一種醫藥組合物，其包含根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑。
本發明提供一種根據任何本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物用作治療上活性物質。
本發明提供一種用於調節表現該RNA之細胞中之靶標RNA之方法，該方法包含以下步驟：將有效量之根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽、共軛物或組合物投與至細胞，其中寡核苷酸與靶標RNA互補。
本發明提供一種調節表現該靶標前mRNA之細胞中之靶標前RNA之剪接的方法，該方法包含以下步驟：將有效量之根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽、共軛物或組合物投與至細胞，其中寡核苷酸與靶標RNA互補且能夠調節前mRNA中之剪接事件。
本發明提供本發明之寡核苷酸、醫藥學上之鹽、共軛物或組合物之用途，其用於抑制細胞(諸如人類細胞)中之前mRNA、mRNA或長非編碼RNA。
上述方法或用途可為活體外方法或活體內方法。
本發明提供本發明之寡核苷酸、醫藥學上之鹽、共軛物或組合物在藥物製造中之用途。
本發明提供式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結之用途，其用於增強單股硫代磷酸酯反義寡核苷酸之活體外或活體內穩定性。
本發明提供式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結之用途，其用於提高單股硫代磷酸酯反義寡核苷酸之活體外或活體內作用持續時間。
本發明提供式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結之用途，其用於增強單股硫代磷酸酯反義寡核苷酸之細胞吸收或組織分佈。
本發明提供式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結之用途，其用於增強單股硫代磷酸酯反義寡核苷酸吸收至組織中，該組織選自由以下組成之群：骨骼肌、心臟、上皮細胞(包括視網膜上皮細胞(例如，靶向化合物之Htra1))、肝臟、腎臟或脾臟。
對於活體內使用，單股硫代磷酸酯反義寡核苷酸可為治療性寡核苷酸。
定義
在本說明書中，單獨或組合形式之術語「烷基(alkyl)」表示具有1至8個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，特別係具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，且更特別係具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。直鏈及分支鏈C1 -C8 烷基之實例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、異構戊基、異構己基、異構庚基及異構辛基，特別係甲基、乙基、丙基、丁基及戊基。烷基之特定實例為甲基、乙基及丙基。
單獨或組合形式之術語「環烷基」表示具有3至8個碳原子之環烷基環，且特別係具有3至6個碳原子之環烷基環。環烷基之實例為環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基，更特別係環丙基及環丁基。「環烷基」之特定實例為環丙基。
單獨或組合形式之術語「烷氧基」表示式烷基-O-之基團(其中術語「烷基」具有先前給出之意義)，諸如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基及第三丁氧基。特定「烷氧基」為甲氧基及乙氧基。甲氧基乙氧基為「烷氧基烷氧基」之特定實例。
單獨或組合形式之術語「氧基」表示-O-基團。
單獨或組合形式之術語「烯基」表示包含烯鍵及至多8個，較佳至多6個，尤佳至多4個碳原子之直鏈或分支鏈烴殘基。烯基之實例為乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基及異丁烯基。
單獨或組合形式之術語「炔基」表示包含參鍵及至多8個，特別係2個碳原子之直鏈或分支鏈烴殘基。
單獨或組合形式之術語「鹵素」或「鹵基」表示氟、氯、溴或碘，且特別係氟、氯或溴，更特別係氟。與另一基團組合之術語「鹵基」表示該基團經至少一個鹵素取代，特別係經一至五個鹵素取代，特別係經一至四個鹵素(亦即，一個、兩個、三個或四個鹵素)取代。
單獨或組合形式之術語「鹵烷基」表示經至少一個鹵素取代，特別係經一至五個鹵素、特別係一至三個鹵素取代之烷基。鹵烷基之實例包括一氟甲基、二氟甲基或三氟甲基、一氟乙基、二氟乙基或三氟乙基或一氟丙基、二氟丙基或三氟丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。氟甲基、二氟甲基及三氟甲基為特定「鹵烷基」。
單獨或組合形式之術語「鹵環烷基」表示如上文所定義之經至少一個鹵素取代，特別係經一個至五個鹵素、特別係一個至三個鹵素取代之環烷基。「鹵環烷基」之特定實例為鹵環丙基，特別係氟環丙基、二氟環丙基及三氟環丙基。
單獨或組合形式之術語「羥基(hydroxyl/hydroxy)」表示-OH基團。
單獨或組合形式之術語「硫羥基(thiohydroxyl/thiohydroxy)」表示-SH基團。
單獨或組合形式之術語「羰基」表示-C(O)-基團。
單獨或組合形式之術語「羧基(carboxy/carboxyl)」表示-COOH基團。
單獨或組合形式之術語「胺基」表示一級胺基(-NH2 )、二級胺基(-NH-)或三級胺基(-N-)。
單獨或組合形式之術語「烷基胺基」表示如上文所定義之經一個或兩個如上文所定義之烷基取代的胺基。
單獨或組合形式之術語「磺醯基」意謂-SO2 基團。
單獨或組合形式之術語「亞磺醯基」表示-SO-基團。
單獨或組合形式之術語「硫基」表示-S-基團。
單獨或組合形式之術語「氰基」表示-CN基團。
單獨或組合形式之術語「疊氮基」表示-N3 基團。
單獨或組合形式之術語「硝基」表示NO2 基團。
單獨或組合形式之術語「甲醯基」表示-C(O)H基團。
單獨或組合形式之術語「胺甲醯基」表示-C(O)NH2 基團。
單獨或組合形式之術語「胺甲醯胺基(cabamido)」表示-NH-C(O)-NH2 基團。
單獨或組合形式之術語「芳基」表示包含6至10個碳環原子之單價芳族碳環單環或雙環之環系統，其視情況經1至3個獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基及甲醯基。芳基之實例包括苯基及萘基，特別係苯基。
單獨或組合形式之術語「雜芳基」表示5至12個環原子的單價芳族雜環單環或雙環之環系統，其包含選自N、O及S之1、2、3或4個雜原子其餘環原子為碳，該環系統視情況經1至3個獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基及甲醯基。雜芳基之實例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、噠嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮呯基、二氮呯基、異噁唑基、苯并呋喃基、異噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚基、異苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、喹喏啉基、咔唑基或吖啶基。
單獨或組合形式之術語「雜環基」表示4至12個，特別係4至9個環原子的單價飽和或部分不飽和單環或雙環之環系統，其包含選自N、O及S之1、2、3或4個環雜原子，其餘環原子為碳，該環系統視情況經1至3個獨立地選自以下之取代基取代：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基及甲醯基。單環飽和雜環基之實例為氮雜環丁基、吡咯啶基、四氫呋喃基、四氫-噻吩基、吡唑啶基、咪唑啶基、噁唑啶基、異噁唑啶基、噻唑啶基、哌啶基、四氫哌喃基、四氫硫代哌喃基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、1,1-二側氧基-硫代嗎啉-4-基、氮雜環庚烷基、二氮雜環庚烷基、高哌嗪基或氧氮雜環庚烷基。雙環飽和雜環烷基之實例為8-氮雜-雙環[3.2.1]辛基、奎寧環基、8-氧雜-3-氮雜-雙環[3.2.1]辛基、9-氮雜-雙環[3.3.1]壬基、3-氧雜-9-氮雜-雙環[3.3.1]壬基或3-硫雜-9-氮雜-雙環[3.3.1]壬基。部分不飽和雜環烷基之實例為二氫呋喃基、咪唑啉基、二氫-噁唑基、四氫-吡啶基或二氫哌喃基。
術語「醫藥學上可接受之鹽」係指保留游離鹼或游離酸(其合乎生物學上或其他方面需要)之生物有效性及特性之彼等鹽。該等鹽用以下各者形成：無機酸，諸如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，特別係鹽酸；及有機酸，諸如，乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、順丁烯二酸、丙二酸、丁二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、N-乙醯基半胱胺酸。另外，此等鹽可藉由將無機鹼或有機鹼添加至游離酸中而製備。衍生自無機鹼之鹽包括(但不限於)鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽。自有機鹼衍生之鹽包括(但不限於)以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺；經取代之胺，包括天然存在之經取代胺；環胺及鹼性離子交換樹脂，諸如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、離胺酸、精胺酸、N-乙基哌啶、哌啶、多元胺樹脂。本發明之寡核苷酸亦可以兩性離子形式存在。本發明之尤佳醫藥學上可接受之鹽為鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽及三烷基銨鹽。
單獨或組合形式之術語「保護基」表示選擇性地阻斷多官能性化合物之反應位點以使得化學反應可在另一無保護反應位點處選擇性地進行之基團。保護基可移除。例示性保護基為胺基保護基、羧基保護基或羥基保護基。
「磷酸酯保護基」為磷酸基之保護基。磷酸酯保護基之實例為2-氰基乙基及甲基。磷酸酯保護基之特定實例為2-氰基乙基。
「羥基保護基」為羥基之保護基且亦用於保護硫醇基。羥基保護基之實例為乙醯基(Ac)、苄醯基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或雙-(4-甲氧基苯基)苯基甲基) (DMT)、三甲氧基三苯甲基(或參-(4-甲氧基苯基)苯基甲基) (TMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯甲基](MMT)、對甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、特戊醯基(Piv)、四氫哌喃基(THP)、四氫呋喃(THF)、三苯甲基(trityl/triphenylmethyl) (Tr)、矽烷基醚(例如三甲基矽烷基(TMS)、第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、三-異丙基矽烷氧基甲基(TOM)及三異丙基矽烷基(TIPS)醚)、甲基醚及乙氧基乙基醚(EE)。羥基保護基之特定實例為DMT及TMT，特別係DMT。
「硫羥基保護基」為硫羥基之保護基。硫羥基保護基之實例為「羥基保護基」之彼等實例。
若本發明之起始物質或化合物中之一者含有在一或多個反應步驟之反應條件下並不穩定或具反應性之一或多個官能基，則可在應用此項技術中熟知之方法的關鍵步驟之前引入適當保護基(如例如T. W. Greene及P. G. M. Wuts之「Protective Groups in Organic Chemistry」, 第3版, 1999, Wiley, New York中所描述)。可使用文獻中所描述之標準方法在合成後期移除此類保護基。保護基之實例為第三丁氧羰基(Boc)、9-茀甲基胺基甲酸酯基(Fmoc)、2-三甲基矽烷基乙基胺基甲酸酯基(Teoc)、苯甲氧羰基(Cbz)及對甲氧基苯甲氧羰基(Moz)。
本文中所描述之化合物可含有若干不對稱中心且可以光學純對映異構體、對映異構體(諸如，外消旋體)之混合物、非對映異構體之混合物、非對映異構外消旋體或非對映異構外消旋體之混合物的形式存在。
寡核苷酸
如本文所用之術語「寡核苷酸」定義為熟習此項技術者一般所理解之包含兩個或多於兩個共價連接之核苷之分子。此類共價鍵結核苷亦可稱為核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在實驗室中藉由固相化學合成隨後純化而製得。當提及寡核苷酸之序列時，參照共價連接之核苷酸或核苷之核鹼基部分或其修飾的序列或順序。本發明之寡核苷酸係人造的，且係化學合成的，且通常經純化或分離。本發明之寡核苷酸可包含一或多種經修飾之核苷或核苷酸。
反義寡核苷酸
如本文所用之術語「反義寡核苷酸」定義為能夠藉由雜交至靶標核酸、尤其雜交至靶標核酸上之連續序列而調節靶標基因之表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸基本上不為雙股，且因此不為siRNA或shRNA。較佳地，本發明之反義寡核苷酸為單股。應理解，本發明之單股寡核苷酸可形成髮夾(hairpins)結構或分子間雙螺旋結構(同一寡核苷酸之兩個分子之間的雙螺旋)，只要寡核苷酸之全長內之序列內或序列間自身互補程度小於50%。
調節表現
如本文所用之術語「調節表現」應理解為寡核苷酸改變靶標核酸之表現或改變靶標核酸之含量的能力之整體術語。調節表現可藉由在投與寡核苷酸之前與靶標核酸之表現或含量進行比較而測定，或調節表現可藉由參考不投與本發明之寡核苷酸的對照實驗而測定。通常應理解為對照物為用鹽水組合物處理之個體或靶標細胞，或用非靶向寡核苷酸(偽處理)處理之個體或靶標細胞。
一種類型之調節為寡核苷酸能夠例如藉由降解靶標核酸(例如，經由RNaseH1介導之降解)或阻斷轉錄而抑制、下調、減少、遏制、移除、停止、阻斷、阻止、減輕、降低、避免或終止靶標核酸之表現。另一類型之調節為寡核苷酸能夠恢復、增加或增強靶標RNA之表現，例如在靶標前mRNA上或經由阻斷諸如mRNA之微RNA壓製的抑制機制而調節剪接事件。
連續核苷酸序列
術語「連續核苷酸序列」係指寡核苷酸與靶標核酸互補(諸如與靶標核酸完全互補)之區。該術語在本文中可與術語「連續核鹼基序列」及術語「寡核苷酸基元序列」互換使用。在一些實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸構成連續核苷酸序列。在一些實施例中，寡核苷酸包含連續核苷酸序列，諸如F-G-F'間隙子區，且可視情況包含另外一或多種核苷酸，例如可用於將官能基連接至連續核苷酸序列之核苷酸連接子區，例如區D或D'。核苷酸連接子區可或可能不與靶標核酸互補。本文中所提及之反義寡核苷酸混合子可包含連續核苷酸序列或可由其組成。
核苷酸
核苷酸係寡核苷酸及聚核苷酸之構築嵌段，且出於本發明之目的包括天然存在及非天然存在之核苷酸兩者。在本質上，核苷酸(諸如DNA及RNA核苷酸)包含核糖部分、核鹼基部分及一或多個磷酸酯基(其不存在於核苷中)。核苷及核苷酸亦可互換地稱作「單元」或「單體」。
經修飾之核苷
如本文所用之術語「經修飾之核苷」或「核苷修飾」係指相較於DNA或RNA核苷，藉由引入一或多個糖部分或(核)鹼基部分之修飾而經修飾的核苷。在一較佳實施例中，經修飾之核苷包含經修飾之糖部分。術語經修飾之核苷亦可在本文中與術語「核苷類似物」或經修飾之「單元」或經修飾之「單體」互換使用。具有未經修飾之DNA或RNA糖部分之核苷在本文中稱為DNA或RNA核苷。若DNA或RNA核苷之鹼基區中具有修飾的核苷允許Watson Crick鹼基配對，則其通常仍稱為DNA或RNA。
經修飾之核苷間連結
如熟習此項技術者通常理解，術語「經修飾之核苷間連結」定義為除磷酸二酯(PO)連結以外之連結，其將兩個核苷共價地偶合在一起。本發明之寡核苷酸可因此包含經修飾之核苷間連結。在一些實施例中，相較於磷酸二酯連結，經修飾核苷間連結提高寡核苷酸之核酸酶抗性。對於天然存在之寡核苷酸，核苷間連結包括在相鄰核苷之間產生磷酸二酯鍵之磷酸酯基。經修飾之核苷間連結尤其適用於使活體內使用之寡核苷酸穩定，且可用以在本發明之寡核苷酸中之DNA或RNA核苷區處，例如在間隙子寡核苷酸之間隙區內，以及在經修飾之核苷區，諸如區F及F'中防止核酸酶裂解。
在一實施例中，寡核苷酸包含一或多個經天然磷酸二酯修飾之核苷間連結，諸如例如更能抵抗核酸酶攻擊之一或多個經修飾之核苷間連結。核酸酶抗性可藉由在血清中培育寡核苷酸，或藉由使用核酸酶抗性分析(例如蛇毒液磷酸二酯酶(snake venom phosphodiesterase，SVPD))測定，兩者皆為此項技術中所熟知的。能夠增強寡核苷酸之核酸酶抗性之核苷間連結被稱為抗核酸酶核苷間連結。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%核苷間連結經修飾，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%或諸如至少90%核苷間連結為抗核酸酶核苷間連結。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之所有核苷間連結為抗核酸酶核苷間連結。將認識到，在一些實施例中，將本發明之寡核苷酸連接至非核苷酸官能基(諸如共軛物)之核苷可為磷酸二酯。
用於本發明之寡核苷酸中的較佳經修飾之核苷間連結為硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷間連結由於核酸酶耐性、有益之藥代動力學及製造簡易性而尤其適用。在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中至少50%核苷間連結為硫代磷酸酯，寡核苷酸或其連續核苷酸序列中諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%或諸如至少90%核苷間連結為硫代磷酸酯。在一些實施例中，除二硫代磷酸酯核苷間連結以外，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之全部核苷間連結為硫代磷酸酯。在一些實施例中，除了二硫代磷酸酯連結以外，本發明之寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷間連結及至少一個磷酸二酯連結(諸如2、3或4個磷酸二酯連結)兩者。在間隙子寡核苷酸中，磷酸二酯連結(若存在)適宜不位於間隙區G中之連續DNA核苷之間。
諸如硫代磷酸酯連結之抗核酸酶連結尤其適用於能夠在用靶標核酸形成雙螺旋時募集核酸酶之寡核苷酸區，諸如用於間隙子之區G。然而，硫代磷酸酯連結亦可適用於非核酸酶募集區及/或親和力增強區，諸如用於間隙子之區F及F'。在一些實施例中，間隙子寡核苷酸可包含區F或F'或區F及F'兩者中之一或多個磷酸二酯連結，其中區G中之核苷間連結可完全為硫代磷酸酯。
有利地，寡核苷酸之連續核苷酸序列中之全部核苷間連結或寡核苷酸之全部核苷間連結為硫代磷酸酯連結。
應認識到，如EP 2 742 135中所揭示，反義寡核苷酸可包含其他核苷間連結(除磷酸二酯及硫代磷酸酯以外之核苷間連結)，例如膦酸烷酯/膦酸甲酯核苷間，其根據EP 2 742 135可例如在另外DNA硫代磷酸酯中耐受間隙區。
立體無規硫代磷酸酯連結
硫代磷酸酯連結為核苷間磷酸酯連結，其中非橋接氧中之一者已經硫取代。經硫取代非橋接氧中之一者引入對掌性中心，且因此在單個硫代磷酸酯寡核苷酸內，各硫代磷酸酯核苷間連結將呈S (Sp)或R (Rp)立體異構形式。此類核苷間連結被稱為「對掌性核苷間連結」。藉由比較，磷酸二酯核苷間連結由於其具有兩個非末端氧原子而為非對掌性的。
立體中心之對掌性名稱藉由標準Cahn-Ingold-Prelog規則(CIP優先規則)確定，該等規則首次公佈於Cahn, R.S.；Ingold, C.K.；Prelog, V. (1966). 「Specification of Molecular Chirality」. Angewandte Chemie International Edition. 5 (4): 385-415. doi:10.1002/anie.196603851中。
在標準寡核苷酸合成期間，偶合及後續硫化之立體選擇性不可控。出於此原因，各硫代磷酸酯核苷間連結之立體化學隨機為Sp或Rp，且因此，由傳統寡核苷酸合成產生之硫代磷酸酯寡核苷酸實際上可以多達2X 種不同硫代磷酸酯非對映異構體之形式存在，其中X為硫代磷酸酯核苷間連結之數目。此類寡核苷酸在本文中被稱為立體無規硫代磷酸酯寡核苷酸，且不含有任何立體限定核苷間連結。因此，立體無規硫代磷酸酯寡核苷酸為來源於非立體限定合成之個別非對映異構體之混合物。在此上下文中，混合物定義為至多2X 種不同硫代磷酸酯非對映異構體。
立體限定核苷間連結
立體限定核苷間連結為對其兩個非對映異構形式Rp或Sp中之一者而言具有非對映異構體過量之對掌性核苷間連結。
應認識到，此項技術中所用之立體選擇性寡核苷酸合成方法通常在各對掌性核苷間連結處提供至少約90%或至少約95%非對映立體選擇性，且因此高達約10%，諸如約5%之寡核苷酸分子可具有可替代非對映異構形式。
在一些實施例中，各立體限定對掌性核苷間連結之非對映異構比率為至少約90:10。在一些實施例中，各對掌性核苷間連結之非對映異構比率為至少約95:5。
立體限定硫代磷酸酯連結為立體限定核苷間連結之特定實例。
立體限定硫代磷酸酯連結
立體限定硫代磷酸酯連結為對其兩個非對映異構體形式Rp或Sp中之一者而言具有非對映異構體過量之硫代磷酸酯連結。
硫代磷酸酯核苷間連結之Rp及Sp組態呈現於下方

其中3' R基團表示相鄰核苷(5'核苷)之3'位置，且5' R基團表示相鄰核苷(3'核苷)之5'位置。
在本文中，Rp核苷間連結亦可表示為srP，且Sp核苷間連結可表示為ssP。
在一特定實施例中，各立體限定硫代磷酸酯連結之非對映異構體比率為至少約90:10或至少95:5。
在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯連結之非對映異構比率為至少約97:3。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯連結之非對映異構比率為至少約98:2。在一些實施例中，各立體限定硫代磷酸酯連結之非對映異構比率為至少約99:1。
在一些實施例中，立體限定核苷間連結以存在於寡核苷酸分子群中之至少97%，諸如至少98%，諸如至少99%，或(基本上)全部寡核苷酸分子呈相同非對映異構形式(Rp或Sp)。
非對映異構純度可在僅具有非對掌性主鏈(亦即磷酸二酯)之模型系統中量測。有可能藉由例如使具有立體限定核苷間連結之單體偶合至以下模型系統「5' t-po-t-po-t-po 3'」來量測各單體之非對映異構純度。此偶合之結果隨後將得到：5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3'或5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'，可使用HPLC對其進行分離。非對映異構純度藉由整合來自兩個可能的非對映異構體之UV信號且得到此等非對映異構體之比率(例如98:2、99:1或＞99:1)來測定。
將理解，特定單一非對映異構體(單一立體限定寡核苷酸分子)之非對映異構純度將取決於各核苷間位置處之經限定立體中心之偶合選擇性以及將引入的立體限定核苷間連結之數目。藉助於實例，若各位置處之偶合選擇性為97%，則具有15種立體限定核苷間連結之立體限定寡核苷酸之所得純度將為0.9715 ，亦即，相比於37%的其他非對映異構體之63%的所要非對映異構體。經限定非對映異構體之純度可在合成後藉由純化改良，例如藉由HPLC，諸如離子交換層析法或逆相層析法改良。
在一些實施例中，立體限定寡核苷酸係指如下寡核苷酸群，其中該群中之至少約40%，諸如至少約50%屬於所要非對映異構體。
換言之，在一些實施例中，立體限定寡核苷酸係指如下寡核苷酸群，其中該群中之至少約40%，諸如至少約50%由所要(特定)立體限定核苷間連結基元(亦稱為立體限定基元)組成。
對於包含立體無規及立體限定核苷間對掌性中心兩者之立體限定寡核苷酸，參考保留所要立體限定核苷間連結基元之寡核苷酸群%來測定立體限定寡核苷酸之純度，在計算時忽略立體無規連結。
核鹼基
術語核鹼基包括存在於核苷及核苷酸中之嘌呤(例如腺嘌呤及鳥嘌呤)及嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸雜交時形成氫鍵。在本發明之上下文中，術語核鹼基亦涵蓋經修飾之核鹼基，其可不同於天然存在之核鹼基，但在核酸雜交期間具有功能性。在此上下文中，「核鹼基」係指天然存在之核鹼基(諸如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤)以及非天然存在之變體兩者。此類變體例如描述於Hirao等人(2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1中。
在一些實施例中，核鹼基部分藉由將嘌呤或嘧啶改變成經修飾之嘌呤或嘧啶而經修飾，經修飾之嘌呤或嘧啶諸如經取代的嘌呤或經取代之嘧啶，諸如選自以下之核鹼基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫基-尿嘧啶、2'硫基-胸腺嘧啶、肌苷、二胺基嘌呤、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤。
核鹼基部分可由各對應核鹼基之字母代碼指示，例如A、T、G、C或U，其中各字母可視情況包括具有等效功能之經修飾之核鹼基。舉例而言，在例示性寡核苷酸中，核鹼基部分選自A、T、G、C及5-甲基胞嘧啶。視情況，對於LNA間隙子，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
經修飾之寡核苷酸
術語經修飾之寡核苷酸描述包含一或多個糖經修飾之核苷及/或經修飾之核苷間連結之寡核苷酸。術語「嵌合」寡核苷酸係已在文獻中用以描述具有經修飾之核苷之寡核苷酸的術語。
立體限定寡核苷酸
立體限定寡核苷酸為如下寡核苷酸，其中核苷間連結中之至少一者為立體限定核苷間連結。
立體限定硫代磷酸酯寡核苷酸為如下寡核苷酸，其中核苷間連結中之至少一者為立體限定的硫代磷酸酯核苷間連結。
互補性
術語「互補性」描述核苷/核苷酸之Watson-Crick鹼基配對之能力。Watson-Crick鹼基對係鳥嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。將理解，寡核苷酸可包含具有經修飾核鹼基之核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶替代胞嘧啶，且因此術語互補性涵蓋未經修飾與經修飾核鹼基之間的Watson Crick鹼基配對(參看例如Hirao 等人 (2012) Accounts of Chemical Research 第45卷第2055頁及Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 增刊37 1.4.1)。
如本文所用之術語「互補%」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如靶標核酸)之給定位置處之連續核苷酸序列互補(亦即與其形成Watson Crick鹼基對)的核苷酸比例。藉由如下方式計算該百分比：(當與靶標序列5'-3'及寡核苷酸序列3'-5'比對時)對兩個序列之間形成對的經對準鹼基之數目進行計數，將其除以寡核苷酸中核苷酸的總數目並乘以100。在此類比較中，未對準(形成鹼基對)之核鹼基/核苷酸稱為失配。較佳地，在計算連續核苷酸序列之互補%時不允許插入及刪除。
術語「完全互補」係指100%互補。
一致性
如本文所用之術語「一致性」係指核酸分子(例如寡核苷酸)中給定位置處連續核苷酸序列與獨立核酸分子(例如靶標核酸)之給定位置處之連續核苷酸序列一致(即其與用互補核苷形成Watson Crick鹼基對之能力一致)的核苷酸數目的百分比。藉由如下方式計算該百分比：對在兩個序列之間一致的經對準鹼基之數目進行計數，將其除以寡核苷酸中核苷酸之總數目並乘以100。一致性百分比= (匹配× 100)/經對準區之長度。較佳地，在計算連續核苷酸序列之互補%時不允許插入及刪除。
雜交
如本文所用之術語「雜交(hybridizing/hybridize)」應理解為兩個核酸股(例如，寡核苷酸及靶標核酸)在相對股上之鹼基對之間形成氫鍵由此形成雙螺旋。兩個核酸股之間的結合親和力為雜交強度。就熔融溫度(Tm )而言，通常描述定義為一半寡核苷酸與靶標核酸成雙螺旋時之溫度。在生理條件下，Tm 不與親和力嚴格成比例(Mergny及Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準狀態吉布斯(Gibbs)自由能ΔG°係結合親和力之更精確表示，且經由ΔG° = -RTln(Kd )與反應之解離常數(Kd )相關，其中R為氣體常數且T為絕對溫度。因此，寡核苷酸與靶標核酸之間的反應的極低ΔG°反映寡核苷酸與靶標核酸之間的強雜交。ΔG°為與水性濃度為1 M、pH為7且溫度為37℃之反應相關聯之能量。寡核苷酸雜交至靶標核酸係自發反應，且對於自發反應，ΔG°小於零。ΔG°可以實驗方式量測，例如藉由使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry；ITC)量測，如Hansen 等人, 1965,Chem. Comm. 36-38及Holdgate 等人, 2005,Drug Discov Today 中所描述。熟習此項技術者將知曉商業設備可供用於ΔG°量測。ΔG°亦可藉由使用如SantaLucia, 1998,Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465所描述之最近鄰模型，使用由Sugimoto 等人, 1995,Biochemistry 34:11211-11216及McTigue 等人, 2004,Biochemistry 43:5388-5405描述之恰當導出的熱力學參數而估計數值。為了具有藉由雜交調節本發明之寡核苷酸既定核酸靶標的可能性，本發明之寡核苷酸針對10-30個核苷酸長度之寡核苷酸雜交至ΔG°估計值低於-10 kcal之靶標核酸。在一些實施例中，雜交程度或雜交強度藉由標準狀態吉布斯自由能ΔG°量測。針對8-30個核苷酸長度之寡核苷酸，寡核苷酸可雜交至ΔG°估計值低於-10 kcal範圍，諸如低於-15 kcal、諸如低於-20 kcal及諸如低於-25 kcal之靶標核酸。在一些實施例中，寡核苷酸雜交至ΔG°估計值為-10至-60 kcal，諸如-12至-40、諸如-15至-30 kcal或-16至-27 kcal，諸如-18至-25 kcal的靶標核酸。
糖修飾
本發明之寡聚物可包含在與DNA及RNA中發現的核糖部分進行比較時具有經修飾之糖部分(亦即糖部分之修飾)的一或多個核苷。
已製備眾多具有核糖部分之修飾之核苷，其首要目的在於改良寡核苷酸之某些特性，諸如親和力及/或核酸酶抗性。
此類修飾包括其中核糖環結構例如藉由經以下置換而經修飾之彼等修飾：己醣環(HNA)；或雙環，其通常在核糖環(LNA)上之C2與C4碳原子之間具有雙基團(biradical)橋；或非連鎖核糖環，其通常缺乏C2與C3碳原子之間的鍵(例如UNA)。其他糖修飾之核苷包括例如雙環己醣核酸(WO 2011/017521)或三環核酸(WO 2013/154798)。經修飾核苷亦包括其中糖部分經非糖部分替代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或N-嗎啉基核酸之情形下。
糖修飾亦包括經由將核糖環上之取代基改變成除氫以外之基團，或DNA及RNA核苷中天然發現之2'-OH基團而進行的修飾。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置處引入。
2' 糖修飾之核苷
2'糖經修飾之核苷為具有除2'位置處之H或-OH以外的取代基(2'經取代核苷)或包含能夠在核糖環中之2'碳與第二碳之間形成橋鍵的2'連接雙基團的核苷，諸如LNA (2'-4'雙基團橋接)核苷。
實際上，大量焦點已聚集在形成2'經取代核苷上，且已發現許多2'經取代核苷在併入寡核苷酸中時具有有益特性。舉例而言，2'經修飾糖可向寡核苷酸提供增強之結合親和力及/或增加之核酸酶抗性。2'經取代修飾之核苷之實例為2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。其他實例可見於例如Freier及Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213，以及Deleavey及Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937中。下方為一些2'經取代修飾核苷之圖示。

關於本發明，2'經取代者不包括如LNA之2'橋接分子。
鎖定核酸核苷 (LNA 核苷 )
「LNA核苷」為2'經修飾核苷，其包含連接該核苷之核糖環之C2'及C4'的雙基團(亦稱為「2'-4'橋鍵」)，其限定或鎖定核糖環之構形。此等核苷在文獻中亦稱為橋接核酸或雙環核酸(BNA)。當LNA併入互補RNA或DNA分子之寡核苷酸中時，核糖之構形鎖定與增加的雜交親和力(雙螺旋體穩定)相關聯。此可常規地藉由量測寡核苷酸/補體雙螺旋之熔融溫度而測定。
非限制性的例示性LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁及Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238中。
2'-4'橋鍵包含2至4個橋接原子且特別係具有式-X-Y-，X連接至C4'且Y連接至C2'，
其中
X為氧、硫、-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(=CRa Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-O-NRa -、-NRa -O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -；
Y為氧、硫、-(CRa Rb )n -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -；
其限制條件為-X-Y-不為-O-O-、Si(Ra )2 -Si(Ra )2 -、-SO2 -SO2 -、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=N-C(Ra )=N-、-C(Ra )=N-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=N-或-Se-Se-；
J為氧、硫、=CH2 或=N(Ra )；
Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、羥基、氰基、硫羥基、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、芳基、雜環基、胺基、烷基胺基、胺甲醯基、烷基胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、烷基羰基胺基、胺甲醯胺基、烷醯基氧基、磺醯基、烷基磺醯氧基、硝基、疊氮基、硫代羥基硫醚烷基硫烷基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、-OC(=Xa )Rc 、-OC(=Xa )NRc Rd 及-NRe C(=Xa )NRc Rd ；
或兩個成對的Ra 及Rb 一起形成視情況經取代之亞甲基；
或兩個成對的Ra 及Rb 連同其所連接之碳原子一起形成具有僅-X-Y-之一個碳原子的環烷基或鹵環烷基；
其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之烷氧基及經取代之亞甲基為經1至3個取代基取代的烷基、烯基、炔基及亞甲基，該等取代基獨立地選自：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、雜環基、芳基及雜芳基；
Xa 為氧、硫或-NRc ；
Rc 、Rd 及Re 獨立地選自氫及烷基；且
n為1、2或3。
在本發明之另一特定實施例中，X為氧、硫、-NRa -、-CRa Rb -或-C(=CRa Rb )-，特別係氧、硫、-NH-、-CH2 -或-C(=CH2 )-，更特別係氧。
在本發明之另一特定實施例中，Y為-CRa Rb -、-CRa Rb -CRa Rb -或-CRa Rb- CRa Rb- CRa Rb -，特別係-CH2 -CHCH3 -、-CHCH3 -CH2 -、-CH2 -CH2 -或-CH2 -CH2 -CH2 -。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-(CRa Rb )n -、-S-CRa Rb -、-N(Ra )CRa Rb -、-CRa Rb -CRa Rb -、-O-CRa Rb -O-CRa Rb -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(=CRa Rb )-CRa Rb -、-N(Ra )CRa Rb -、-O-N(Ra )-CRa Rb -或-N(Ra )-O-CRa Rb -。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、羥基、烷基及烷氧基烷基，特別係氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基。
在本發明之另一實施例中，Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、氟、羥基、甲基及-CH2 -O-CH3 ，特別係氫、氟、甲基及-CH2 -O-CH3 。
有利地，-X-Y-之Ra 及Rb 中之一者如上文所定義且其他者全部同時為氫。
在本發明之另一特定實施例中，Ra 為氫或烷基，特別係氫或甲基。
在本發明之另一特定實施例中，Rb 為氫或烷基，特別係氫或甲基。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。
在本發明之另一實施例中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。
在本發明之一特定實施例中，Ra 及Rb 兩者同時為甲基。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -、-S-CH2 -、-S-CH(CH3 )-、-NH-CH2 -、-O-CH2 CH2 -、-O-CH(CH2 -O-CH3 )-、-O-CH(CH2 CH3 )-、-O-CH(CH3 )-、-O-CH2- O-CH2 -、-O-CH2 -O-CH2 -、-CH2 -O-CH2 -、-C(=CH2 )CH2 -、-C(=CH2 )CH(CH3 )-、-N(OCH3 )CH2 -或-N(CH3 )CH2 -；
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基及烷氧基烷基，特別係氫、甲基及-CH2 -O-CH3 。
在一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -或-O-CH(CH3 )-，特別係-O-CH2 -。
2'-4'橋鍵可如式(A)及式(B)中分別說明般定位於核糖環之平面下方(β-D-組態)或該環之平面上方(α-L-組態)。
根據本發明之LNA核苷特別係具有式(B1)或(B2)
(B1)；；
其中
W為氧、硫、-N(Ra )-或-CRa Rb -，特別係氧；
B為核鹼基或經修飾之核鹼基；
Z為針對相鄰核苷或5'末端基之核苷間連結；
Z*為針對相鄰核苷或3'末端基之核苷間連結；
R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自氫、鹵素、烷基、鹵烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基、烷氧基烷基、疊氮基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基及芳基；且
X、Y、Ra 及Rb 如上文所定義。
在一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 為氫或烷基，特別係氫或甲基。在另一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Rb 為氫或烷基，特別係氫或甲基。在另一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。在一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。在一個特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。在一特定實施例中，在-X-Y-之定義中，Ra 及Rb 兩者同時為甲基。
在另一特定實施例中，在X之定義中，Ra 為氫或烷基，特別係氫或甲基。在另一特定實施例中，在X之定義中，Rb 為氫或烷基，特別係氫或甲基。在一特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。在一特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。在一個特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。在一特定實施例中，在X之定義中，Ra 及Rb 兩者同時為甲基。
在另一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 為氫或烷基，特別係氫或甲基。在另一特定實施例中，在Y之定義中，Rb 為氫或烷基，特別係氫或甲基。在一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 中之一者或兩者為氫。在一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 中僅一者為氫。在一個特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 中之一者為甲基且另一者為氫。在一特定實施例中，在Y之定義中，Ra 及Rb 兩者同時為甲基。
在本發明之一特定實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 獨立地選自氫及烷基，特別係氫及甲基。
在本發明之另一特定有利實施例中，R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。
在本發明之另一特定實施例中，R1 、R2 、R3 全部同時為氫，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者如上文所定義，特別係為烷基，更特別係為甲基。
在本發明之一特定實施例中，R5 及R5* 獨立地選自氫、鹵素、烷基、烷氧基烷基及疊氮基，特別係選自氫、氟、甲基、甲氧基乙基及疊氮基。在本發明之特定有利實施例中，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者為烷基(特別係甲基)、鹵素(特別係氟)、烷氧基烷基(特別係甲氧基乙基)或疊氮基；或R5 及R5* 兩者同時為氫或鹵素，特別係兩者同時為氫或氟。在此類特定實施例中，W可有利地為氧，且-X-Y-有利地為-O-CH2 -。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類LNA核苷揭示於WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352及WO 2004/046160中，其均以引用之方式併入本文中，且包括此項技術中通常已知為β-D-氧基LNA及α-L-氧基LNA核苷之該等LNA核苷。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-S-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類硫基LNA核苷揭示於WO 99/014226及WO 2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-NH-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類胺基LNA核苷揭示於WO 99/014226及WO 2004/046160中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 CH2 -或-OCH2 CH2 CH2 -，W為氧，且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類LNA核苷揭示於WO 00/047599及Morita等人, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76中，其以引用之方式併入本文中，且包括此項技術中通常已知為2'-O-4'C-乙烯橋接核酸(ENA)之該等LNA核苷。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -，W為氧，R1 、R2 、R3 全部同時為氫，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者不為氫，諸如為烷基，例如甲基。此類5'經取代LNA核苷揭示於WO 2007/134181中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 及Rb 中之一者或兩者不為氫，特別係為烷基，諸如甲基，W為氧，R1 、R2 、R3 全部同時為氫，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者不為氫，特別係為烷基，例如甲基。此類經雙修飾LNA核苷揭示於WO 2010/077578中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CHRa -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類6'經取代LNA核苷揭示於WO 2010/036698及WO 2007/090071中，其皆以引用之方式併入本文中。在此類6'經取代LNA核苷中，Ra 特別係為C1 -C6 烷基，諸如甲基。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH2 -O-CH3 )- (「2' O-甲氧基乙基雙環核酸」，Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁)。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH2 CH3 )-。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH2 -O-CH3 )-，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類LNA核苷在此項技術中亦稱為環狀MOE (cMOE)且揭示於WO 2007/090071中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH3 )- (「2' O-乙基雙環核酸」，Seth等人 J. Org. Chem. 2010, 第75(5)卷第1569-81頁)。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH2 -O-CH2 - (Seth等人, J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CH(CH3 )-，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類6'甲基LNA核苷在此項技術中亦稱為cET核苷，且可為(S)-cET或(R)-cET非對映異構體，如WO 2007/090071 (β-D)及WO 2010/036698 (α-L)中所揭示，其皆以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -，其中Ra 或Rb 兩者中無一為氫，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。在一特定實施例中，Ra 及Rb 兩者同時為烷基，特別係兩者同時為甲基。此類6'經雙取代LNA核苷揭示於WO 2009/006478中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之另一特定實施例中，-X-Y-為-S-CHRa -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。此類6'經取代硫基LNA核苷揭示於WO 2011/156202中，其以引用之方式併入本文中。在此類6'經取代硫基LNA之一特定實施例中，Ra 為烷基，特別係甲基。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-C(=CH2 )C(Ra Rb )-、-C(=CHF)C(Ra Rb )-或-C(=CF2 )C(Ra Rb )-，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。有利地，Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特別係氫、甲基、氟及甲氧基甲基。Ra 及Rb 兩者特別係同時為氫或甲基，或Ra 及Rb 中之一者為氫且另一者為甲基。此類乙烯基碳LNA核苷揭示於WO 2008/154401及WO 2009/067647中，其皆以引用之方式併入本文中。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-N(ORa )-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。在一特定實施例中，Ra 為烷基，諸如甲基。此類LNA核苷亦稱為N經取代LNA，且揭示於WO 2008/150729中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-N(Ra )-、-N(Ra )-O-、-NRa -CRa Rb -CRa Rb -或-NRa -CRa Rb -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。有利地，Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特別係氫、甲基、氟及甲氧基甲基。在一特定實施例中，Ra 為烷基，諸如甲基，Rb 為氫或甲基，特別係氫。(Seth 等人, J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-N(CH3 )- (Seth等人, J. Org. Chem 2010 op. cit.)。
在本發明之一特定實施例中，R5 及R5* 兩者同時為氫。在本發明之另一特定實施例中，R5 及R5* 中之一者為氫且另一者為烷基，諸如甲基。在此類實施例中，R1 、R2 及R3 可為(特別係)氫，且-X-Y-可為(特別係)-O-CH2 -或-O-CHC(Ra )3 -，諸如-O-CH(CH3 )-。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-CRa Rb -O-CRa Rb ，諸如-CH2 -O-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。在此類特定實施例中，Ra 可為(特別係)烷基，諸如甲基，Rb 可為氫或甲基，特別係氫。此類LNA核苷亦稱為構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide；CRN)且揭示於WO 2013/036868中，其以引用之方式併入本文中。
在本發明之一特定實施例中，-X-Y-為-O-CRa Rb -O-CRa Rb ，諸如-O-CH2 -O-CH2 -，W為氧且R1 、R2 、R3 、R5 及R5* 全部同時為氫。有利地，Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、烷基及烷氧基烷基，特別係氫、甲基、氟及甲氧基甲基。在此類特定實施例中，Ra 可為(特別係)烷基，諸如甲基，Rb 可為氫或甲基，特別係氫。此類LNA核苷亦稱為COC核苷酸且揭示於Mitsuoka等人, Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238中，其以引用之方式併入本文中。
將認識到，除非指定，否則LNA核苷可呈β-D或α-L立體異構形式。
本發明之LNA核苷之特定實例呈現於流程1 (其中B如上文所定義)中。
流程 1




特定LNA核苷為β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D氧基LNA，諸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)，及ENA。
MOE 核苷
術語「MOE」代表「甲氧基-乙基」且藉助於縮寫係指如呈現於下方在2'位置中經甲氧基-乙氧基取代之核苷。
上述核苷可由此命名為「MOE」或「2'-O-MOE核苷」。
RNase H 活性及募集
反義寡核苷酸之RNase H活性係指當與互補RNA分子成雙螺旋體時，反義寡核苷酸募集RNase H之能力。WO01/23613提供用於測定RNase H活性之活體外方法，其可用於測定募集RNase H之能力。通常認為若寡核苷酸在具有互補靶標核酸序列時具有如以pmol/l/min為單位量測之至少5%之初始速率，則寡核苷酸能夠募集RNase H，該初始速率為諸如在使用具有與正經測試之經修飾寡核苷酸相同的鹼基序列但僅含有在寡核苷酸中之所有單體之間具有硫代磷酸酯連結的DNA單體之寡核苷酸，及使用由WO01/23613 (以引用之方式併入本文中)之實例91-95提供之方法時所測定的初始速率之至少10%或超過20%。用於測定RHase H活性之重組人類RNase H1可購自Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerland。
間隙子
本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可為間隙子。反義間隙子通常用於經由RNase H介導之降解來抑制靶標核酸。間隙子寡核苷酸包含至少三個相異結構區，5'-側接序列、間隙及3'-側接序列，F-G-F'，呈「5 -＞ 3」定向。「間隙」區(G)包含使得寡核苷酸能夠募集RNase H的一段連續DNA核苷酸。間隙區藉由包含一或多個糖修飾核苷(宜為高親和力糖修飾核苷)之5'側接區(F)且藉由包含一或多個糖修飾核苷(宜為高親和力糖修飾核苷)之3'側接區(F')側接。區F及F'中之一或多個糖修飾核苷增強寡核苷酸對靶標核酸之親和力(亦即，為親和力增強糖修飾核苷)。在一些實施例中，區F及F'中之一或多個糖修飾核苷為2'糖修飾核苷，諸如高親和力2'糖修飾，諸如獨立地選自LNA及2'-MOE。
在間隙子設計中，間隙區之5'及3'最末核苷為DNA核苷，且分別與5' (F)或3' (F')區之糖修飾核苷相鄰定位。側接序列可藉由使至少一個糖修飾核苷位於距間隙區最遠的末端處，亦即位於5'側接序列之5'端及3'側接序列之3'端處而進一步經限定。
區F-G-F'形成連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列可包含具有式F-G-F'的間隙子區。
間隙子設計F-G-F'之總體長度可為例如12至32個核苷，諸如13至24、諸如14至22個核苷，諸如14至17、諸如16至18個核苷。
藉助於實例，本發明之間隙子寡核苷酸可由下式表示：
F1-8 -G5-16 -F'1-8 ，諸如
F1-8 -G7-16 -F'2-8
其限制條件為間隙子區F-G-F'之總體長度為至少12個，諸如至少14個核苷酸長度。
區F、G及F'在下文進一步加以定義，且可併入F-G-F'式中。
間隙子區 G
間隙子之區G (間隙區)為使得寡核苷酸能夠募集RNaseH (諸如人類RNase H1)之核苷區，通常為DNA核苷。RNaseH為識別DNA與RNA之間的雙螺旋體且酶促裂解RNA分子之細胞酶。適合的間隙子可具有長度為至少5或6個連續DNA核苷、諸如5至16個連續DNA核苷、諸如6至15個連續DNA核苷、諸如7至14個連續DNA核苷、諸如8至12個連續DNA核苷酸、諸如8至12個連續DNA核苷酸的間隙區(G)。在一些實施例中，間隙區G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續DNA核苷組成。在一些情況下，間隙區中之胞嘧啶(C) DNA經甲基化，此類殘基標註為5-甲基-胞嘧啶(me C，或用e代替c)。當間隙中存在cg二核苷酸以降低潛在毒性時，間隙中之胞嘧啶DNA之甲基化為有利的，修飾不會對寡核苷酸之功效產生顯著影響。
在一些實施例中，間隙區G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個連續的硫代磷酸酯連結DNA核苷組成。在一些實施例中，間隙中之所有核苷間連結為硫代磷酸酯連結。
儘管傳統間隙子具有DNA間隙區，但存在用於間隙區內時允許RNaseH募集的經修飾核苷之諸多實例。已報導在包括於間隙區內時能夠募集RNaseH的經修飾核苷包括例如α-L-LNA、C4'烷基化DNA (如PCT/EP2009/050349及Vester等人, Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300中所描述，兩者皆以引用之方式併入本文中)、阿拉伯糖衍生之核苷類ANA及2'F-ANA (Mangos等人 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (未鎖定核酸) (如Fluiter等人, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039中所描述，其以引用之方式併入本文中)。UNA為未鎖定核酸，通常其中核糖之C2與C3之間的鍵已移除，從而形成未鎖定的「糖」殘基。此類間隙子中所使用之經修飾核苷在引入間隙區中時可為採用2'內型(DNA樣)結構(亦即允許RNaseH募集之修飾)之核苷。在一些實施例中，本文中所描述之DNA間隙區(G)可視情況含有1至3個在引入間隙區中時採用2'內型(DNA樣)結構之糖修飾核苷。
區 G-- 「間隙阻斷子」
替代地，存在許多將賦予3'內型構形之經修飾核苷插入至間隙子之間隙區中但保留一定RNaseH活性的報導。具有包含一或多個3'內型經修飾核苷的間隙區之此類間隙子被稱為「間隙阻斷子」或「間隙中斷」間隙子，參見例如WO2013/022984。間隙阻斷子寡核苷酸在間隙區內保留足夠的DNA核苷區，以允許RNaseH募集。間隙阻斷子寡核苷酸設計募集RNaseH之能力通常具有序列或甚至化合物特異性，參見Rukov等人 2015 Nucl. Acids Res. 第43卷第8476-8487頁，其揭示募集RNaseH之「間隙阻斷子」寡核苷酸，該等寡核苷酸在一些情況下提供靶標RNA之更特異性裂解。間隙阻斷子寡核苷酸的間隙區內所使用的經修飾核苷可例如為賦予3'內型構形之經修飾核苷，諸如2'-O-甲基(OMe)或2'-O-MOE (MOE)核苷，或β-D LNA核苷(核苷之核糖環之C2'與C4'之間的橋鍵呈β構形)，諸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
如同上文所描述之含有區G的間隙子一樣，間隙阻斷子或間隙中斷間隙子的間隙區在間隙之5'端(鄰近於區F之3'核苷)處具有DNA核苷，且在間隙之3'端(鄰近於區F'之5'核苷)處具有DNA核苷。包含中斷間隙的間隙子通常在間隙區之5'端或3'端處保留至少3或4個連續DNA核苷之區。
間隙阻斷子寡核苷酸之例示性設計包括
F1-8 -[D3-4 -E1 - D3-4 ]-F'1-8
F1-8 - [D1-4 -E1 - D3-4 ]-F'1-8
F1-8 - [D3-4 -E1 - D1-4 ]-F'1-8
其中區G在方括號[Dn -Er - Dm ]內，D為DNA核苷之連續序列，E為經修飾核苷(間隙阻斷子或間隙中斷核苷)，且F及F'為如本文中所定義之側接區，且限制條件為間隙子區F-G-F'之總體長度為至少12個、諸如至少14個核苷酸長度。
在一些實施例中，間隙中斷間隙子之區G包含至少6個DNA核苷，諸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個DNA核苷。如上文所描述，DNA核苷可為連續的，或可視情況穿插有一或多個經修飾核苷，其限制條件為間隙區G能夠介導RNaseH募集。
間隙子 -- 側接區 F 及 F'
區F緊鄰區G之5' DNA核苷安置。區F之3'最末核苷為糖修飾核苷，諸如高親和力糖修飾核苷，例如2'經取代核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區F緊鄰區G之3' DNA核苷安置。區F之5'最末核苷為糖修飾核苷，諸如高親和力糖修飾核苷，例如2'經取代核苷，諸如MOE核苷或LNA核苷。
區F之長度為1至8個連續核苷酸，諸如2至6個、諸如3至4個連續核苷酸。有利地，區F之5'最末核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區F之兩個5'最末核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區F之5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F之兩個5'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F之兩個5'最末核苷為2'經取代核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區F之5'最末核苷為2'經取代核苷，諸如MOE核苷。
區F'之長度為2至8個連續核苷酸，諸如3至6個、諸如4至5個連續核苷酸。有利地，在一些實施例中，區F'之3'最末核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區F'之兩個3'最末核苷為糖修飾核苷。在一些實施例中，區F'之兩個3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F'之3'最末核苷為LNA核苷。在一些實施例中，區F'之兩個3'最末核苷為2'經取代核苷，諸如兩個3' MOE核苷。在一些實施例中，區F'之3'最末核苷為2'經取代核苷，諸如MOE核苷。
應注意，當區F或F'之長度為一時，其有利地為LNA核苷。
在一些實施例中，區F及F'獨立地由以下組成或包含以下：糖修飾核苷之連續序列。在一些實施例中，區F之糖修飾核苷可獨立地選自2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、LNA單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元。
在一些實施例中，區F及F'獨立地包含LNA及2'經取代修飾核苷兩者(混合翼設計)。
在一些實施例中，區F及F'僅由一種類型之糖修飾核苷組成，諸如僅由MOE或僅由β-D-氧基LNA或僅由ScET組成。此類設計亦被稱為均一側接序列或均一間隙子設計。
在一些實施例中，區F或F'或者F及F'中之所有核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些實施例中，區F由1至5個、諸如2至4個、諸如3至4個，諸如1、2、3、4或5個連續LNA核苷組成。在一些實施例中，區F及F'中之所有核苷為β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，區F或F'或者F及F'中之所有核苷為2'經取代核苷，諸如OMe或MOE核苷。在一些實施例中，區F由1、2、3、4、5、6、7或8個連續OMe或MOE核苷組成。在一些實施例中，側接區中僅一者可由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成。在一些實施例中，5' (F)側接區2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而3' (F')側接區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些實施例中，3' (F)側接區由2'經取代核苷(諸如OMe或MOE核苷)組成，而5' (F')側接區包含至少一個LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些實施例中，區F及F'中之所有經修飾核苷為LNA核苷，諸如獨立地選自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中區F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側接序列，更多細節參見此等者之定義)。在一些實施例中，區F及F'中之所有經修飾核苷為β-D-氧基LNA核苷，其中區F或F'或者F及F'可視情況包含DNA核苷(交替型側接序列，更多細節參見此等者之定義)。
在一些實施例中，區F及F'之5'最末及3'最末核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些實施例中，區F與區G之間的核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結。在一些實施例中，區F'與區G之間的核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結。在一些實施例中，區F或F'或者F及F'之核苷之間的核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結。
其他間隙子設計揭示於WO 2004/046160、WO 2007/146511及WO 2008/113832中，該等文獻以引用之方式併入本文中。
LNA 間隙子
LNA間隙子為如下間隙子，其中區F及F'中之任一者或兩者包含以下或由以下組成：LNA核苷。β-D-氧基間隙子為如下間隙子，其中區F及F'中之任一者或兩者包含以下或由以下組成：β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，LNA間隙子具有下式：[LNA]1-5 -[區G]-[LNA]1-5 ，其中區G如間隙子區G定義中所定義。
MOE 間隙子
MOE間隙子為如下間隙子，其中區F及F'由MOE核苷組成。在一些實施例中，MOE間隙子具有設計[MOE]1-8 -[區G]-[MOE]1-8 ，諸如[MOE]2-7 -[區G]5-16 -[MOE]2-7 ，諸如[MOE]3-6 -[區G]-[MOE]3-6 ，其中區G如間隙子定義中所定義。具有5-10-5設計之MOE間隙子(MOE-DNA-MOE)已廣泛用於此項技術中。
混合翼間隙子
混合翼間隙子為如下LNA間隙子，其中區F及F'中之一者或兩者包含2'經取代核苷，諸如獨立地選自由2'-O-烷基-RNA單元、2'-O-甲基-RNA、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、2'-烷氧基-RNA、MOE單元、阿拉伯糖核酸(ANA)單元及2'-氟-ANA單元組成之群的2'經取代核苷，諸如MOE核苷。在區F及F'中之至少一者或區F及F'兩者包含至少一個LNA核苷的一些實施例中，區F及F'中之其餘核苷獨立地選自由MOE及LNA組成之群。在區F及F'中之至少一者或區F及F'兩者包含至少兩個LNA核苷的一些實施例中，區F及F'中之其餘核苷獨立地選自由MOE及LNA組成之群。在一些混合翼實施例中，區F及F'中之一者或兩者可進一步包含一或多個DNA核苷。
混合翼間隙子設計揭示於WO 2008/049085及WO 2012/109395中，該兩者以引用之方式併入本文中。
交替型側接間隙子
側接區可包含LNA及DNA核苷兩者且被稱為「交替型側接序列」，因為其包含LNA-DNA-LNA核苷之交替型基元。包含此類交替型側接序列的間隙子被稱為「交替型側接間隙子」。「可替代側接間隙子」由此為如下LNA間隙子寡核苷酸，其中側接序列中之至少一者(F或F')包含除LNA核苷以外的DNA。在一些實施例中，區F或F'中之至少一者或區F及F'兩者包含LNA核苷及DNA核苷兩者。在此類實施例中，側接區F或F'或者F及F'兩者包含至少三個核苷，其中F及/或F'區之5'及3'最末核苷為LNA核苷。
交替型側接LNA間隙子揭示於WO 2016/127002中。
交替型側接區可包含至多3個連續DNA核苷，諸如1至2個或者1或2或3個連續DNA核苷。
交替型側接序列可標註為表示LNA核苷(L)之數目接著表示DNA核苷(D)之數目的一系列整數，例如
[L]1-3 -[D]1-4 -[L]1-3
[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2
在寡核苷酸設計中，此等者將通常表示為如下數目，使得2-2-1表示5' [L]2 -[D]2 -[L] 3'，且1-1-1-1-1表示5' [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3'。具有交替型側接序列的寡核苷酸中之側接序列(區F及F')之長度可獨立地為3至10個核苷，諸如4至8個、諸如5至6個核苷，諸如4、5、6或7個經修飾核苷。在一些實施例中，間隙子寡核苷酸中之側接序列中僅一者為交替的，而另一者由LNA核苷酸構成。可為有利的係，在3'側接(F')之3'端處具有至少兩個LNA核苷以賦予額外核酸外切酶抗性。具有交替型側接序列之寡核苷酸的一些實例為：
[L]1-5 -[D]1-4 -[L]1-3 -[G]5-16 -[L]2-6
[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[D]1-2 -[L]1-2 -[G]5-16 -[L]1-2 -[D]1-3 -[L]2-4
[L]1-5 -[G]5-16 -[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
其限制條件為間隙子之總體長度為至少12個、諸如至少14個核苷酸長度。
寡核苷酸中之區 D' 或 D"
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含以下或由以下組成：與靶標核酸互補的寡核苷酸之連續核苷酸序列，諸如間隙子F-G-F'，及其他5'及/或3'核苷。該等其他5'及/或3'核苷可或可不與靶標核酸完全互補。此類其他5'及/或3'核苷在本文中可被稱為區D'及D"。
可出於將連續核苷酸序列(諸如間隙子)接合至共軛物部分或另一官能基之目的而添加區D'或D"。當用於連接連續核苷酸序列與結合物部分時，其可充當生物可裂解連接子。替代地，其可用於提供核酸外切酶保護或提供合成或製造簡易性。
區D'及D"可連接至區F之5'端或區F'之3'端，分別產生下式之設計：D'-F-G-F'、F-G-F'-D"或D'-F-G-F'-D"。在此情況下，F-G-F'為寡核苷酸之間隙子部分，且區D'或D"構成寡核苷酸之獨立部分。
區D'或D"可獨立地包含以下或由以下組成：1、2、3、4或5個其他核苷酸，該等核苷酸可與靶標核酸互補或不互補。鄰近於F或F'區之核苷酸不為糖修飾核苷酸，諸如DNA或RNA或此等者之鹼基經修飾型式。D'或D''區可充當對核酸酶敏感的生物可裂解連接子(參見連接子之定義)。在一些實施例中，其他5'及/或3'端核苷酸與磷酸二酯連結連接，且為DNA或RNA。適用作區D'或D"之核苷酸類生物可裂解連接子揭示於WO 2014/076195中，藉助於實例，該等連接子包括磷酸二酯連接之DNA二核苷酸。生物可裂解連接子於聚寡核苷酸構築體中之用途揭示於WO 2015/113922中，其中該等連接子用於連接單一寡核苷酸內的多個反義構築體(例如，間隙子區)。
在一個實施例中，除構成間隙子之連續核苷酸序列以外，本發明之寡核苷酸亦包含區D'及/或D"。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸可由下式表示：
F-G-F'；特別係F1-8 -G5-16 -F'2-8
D'-F-G-F'，特別係D'1-3 -F1-8 -G5-16 -F'2-8
F-G-F'-D"，特別係F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D"1-3
D'-F-G-F'-D"，特別係D'1-3 - F1-8 -G5-16 -F'2-8 -D"1-3 。
在一些實施例中，定位於區D'與區F之間的核苷間連結為磷酸二酯連結。在一些實施例中，定位於區F'與區D"之間的核苷間連結為磷酸二酯連結。
總子
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之全部核苷為糖修飾核苷。此類寡核苷酸在本文中被稱為總子。
在一些實施例中，總子之全部糖修飾核苷包含相同糖修飾，例如其可全部為LNA核苷，或可全部為2'O-MOE核苷。在一些實施例中，總子之糖修飾核苷可獨立地選自LNA核苷及2'經取代核苷，諸如選自由以下組成之群的2'經取代核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'經取代核苷兩者，諸如選自由以下組成之群的2'經取代核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷及2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，寡核苷酸之各核苷單元為2'經取代核苷。在一些實施例中，寡核苷酸之各核苷單元為2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，寡核苷酸或其連續核苷酸序列之全部核苷為LNA核苷，諸如β-D-氧基-LNA核苷及/或(S)cET核苷。在一些實施例中，此類LNA總子寡核苷酸長度在7與12個核苷之間(參見例如WO 2009/043353)。此類較短完全LNA寡核苷酸在抑制微RNA方面特別有效。
各種總子化合物特別在靶向微RNA (antimiR)時作為治療性寡聚物或作為剪接轉換(switching)寡聚物(SSO)高度有效。
在一些實施例中，總子包含以下或由以下組成：至少一個XYX或YXY序列基元，諸如重複序列XYX或YXY，其中X為LNA且Y為可替代(亦即非LNA)核苷酸類似物，諸如2'-OMe RNA單元及2'-氟DNA單元。在一些實施例中，上述序列基元可為例如XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些實施例中，總子可包含以下或由以下組成：具有在7與24個核苷酸之間，諸如7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸的連續核苷酸序列。
在一些實施例中，總子之連續核苷酸序列包含至少30%，諸如至少40%、諸如至少50%、諸如至少60%、諸如至少70%、諸如至少80%、諸如至少90%、諸如95%、諸如100% LNA單元。對於完全LNA化合物，有利為其長度小於12個核苷酸，諸如7-10個核苷酸。
其餘單元可選自本文中所提及之非LNA核苷酸類似物，諸如選自由以下組成之群：2'-O-烷基-RNA單元、2'-OMe-RNA單元、2'-胺基-DNA單元、2'-氟-DNA單元、LNA單元、PNA單元、HNA單元、INA單元、及2'MOE RNA單元，或基團2'-OMe RNA單元及2'-氟DNA單元。
混合子
術語「混合子」係指包含DNA核苷及糖修飾核苷兩者之寡聚物，其中存在不足長度之連續DNA核苷以募集RNaseH。適合的混合子可包含多至3個或多至4個連續DNA核苷。在一些實施例中，混合子或其連續核苷酸序列包含糖修飾核苷之交替區及DNA核苷。藉由糖修飾核苷之交替區在併入具有DNA核苷短區的寡核苷酸中時形成RNA類似(3'內型)構形，可產生非RNaseH募集寡核苷酸。有利地，該糖修飾核苷為親和力增強的糖修飾核苷。
寡核苷酸混合子通常用於提供基於佔據之靶標基因之調節，諸如剪接調節劑或微RNA抑制劑。
在一些實施例中，混合子或其連續核苷酸序列中之糖修飾核苷包含或全部為LNA核苷，諸如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。
在一些實施例中，混合子之全部糖修飾核苷包含相同糖修飾，例如其可全部為LNA核苷，或可全部為2'O-MOE核苷。在一些實施例中，混合子之糖修飾核苷可獨立地選自LNA核苷及2'經取代核苷，諸如選自由以下組成之群的2'經取代核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'經取代核苷兩者，諸如選自由以下組成之群的2'經取代核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA (MOE)、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含LNA核苷及2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，混合子或其連續僅包含LNA及DNA核苷，諸如長度可例如在8與24個核苷之間的LNA混合子寡核苷酸(參見例如WO2007112754，其揭示微RNA之LNA antmiR抑制劑)。
各種混合子化合物特別係在靶向微RNA (antimiR)時作為治療性寡聚物或作為剪接轉換寡聚物(SSO)高度有效。
在一些實施例中，混合子包含基元
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
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其中L表示糖修飾核苷，諸如LNA或2'經取代核苷(例如，2'-O-MOE)，D表示DNA核苷，且其中各m獨立地選自1至6，且各n獨立地選自1、2、3及4，諸如1至3。在一些實施例中，各L為LNA核苷。在一些實施例中，至少一個L為LNA核苷且至少一個L為2'-O-MOE核苷。在一些實施例中，各L獨立地選自LNA及2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，混合子可包含以下或由以下組成：具有在10與24個核苷酸之間，諸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸的連續核苷酸序列。
在一些實施例中，混合子之連續核苷酸序列包含至少30%，諸如至少40%、諸如至少50% LNA單元。
在一些實施例中，混合子包含以下或由以下組成：核苷酸類似物及天然產生之核苷酸，或一種類型之核苷酸類似物及第二類型之核苷酸類似物的重複模式之連續核苷酸序列。舉例而言，重複模式可為：每兩個或每三個核苷酸為核苷酸類似物，諸如LNA，且其餘核苷酸為天然產生之核苷酸，諸如DNA，或為2'經取代核苷酸類似物，諸如如本文中所提及之2'氟類似物的2'MOE，或在一些實施例中選自本文中所提及之核苷酸類似物之群組。應認識到，核苷酸類似物(諸如LNA單元)之重複模式可在固定位置處(例如在5'或3'末端處)與核苷酸類似物組合。
在一些實施例中，寡聚物中自3'端計數之第一個核苷酸為核苷酸類似物，諸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。
在可能相同或不同的一些實施例中，寡聚物中自3'端計數之第二個核苷酸為核苷酸類似物，諸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。
在可能相同或不同的一些實施例中，寡聚物之5'末端為核苷酸類似物，諸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。
在一些實施例中，混合子包含至少一個區，該區包含至少兩個連續核苷酸類似物單元，諸如至少兩個連續LNA單元。
在一些實施例中，混合子包含至少一個區，該區包含至少三個連續核苷酸類似物單元，諸如至少三個連續LNA單元。
胞外體
胞外體為通常在30至500 nm範圍內之天然生物微型小泡，其經由功能上活性負荷(諸如miRNA、mRNA、DNA及蛋白)參與細胞-細胞通信。
胞外體藉由全部類型之細胞分泌且亦大量發現於體液(諸如：唾液、血液、尿液及乳汁)中。胞外體之主要作用為藉由在特異性細胞之間遞送不同效應子或信號傳導分子而攜載資訊(Acta Pol Pharm. 2014年7月-8月;71(4):537-43.)。此類效應子或信號傳導分子可例如為蛋白、miRNA或mRNA。胞外體目前作為用於不同藥物分子(包括RNA治療分子)之遞送媒劑正經研究，以擴展此類分子之治療及診斷應用。此項技術中揭示負載有合成分子(諸如siRNA、反義寡核苷酸及小分子)之胞外體，其表明或展示與游離藥物分子相比此類分子在遞送及功效方面的優勢(參見例如Andaloussi等人 2013 Advanced Drug Delivery Reviews 65: 391-397, WO2014/168548, WO2016/172598, WO2017/173034及WO 2018/102397)。
胞外體可自生物來源分離，生物來源諸如乳汁(乳汁胞外體)，特別係牛乳為用於分離牛乳胞外體之充足來源。參見例如Manca等人, Scientific Reports (2018) 8:11321。
在本發明之一些實施例中，單股寡核苷酸囊封於胞外體(胞外體調配物)中，負載具有單股反義寡核苷酸之胞外體的實例描述於EP申請案第18192614.8號中。在本發明之方法中，可以胞外體調配物形式向細胞或向個體投與反義寡核苷酸，特別係已設想經口投與胞外體調配物。
在一些實施例中，反義寡核苷酸可例如與諸如膽固醇之親脂性共軛物共軛，該親脂性共軛物可經由生物可裂解連接子(例如，磷酸二酯鍵聯DNA核苷酸之區)共價連接至反義寡核苷酸。此類親脂性共軛物可有助於將反義寡核苷酸調配成胞外體且可進一步增強靶標細胞之遞送。
共軛物
如本文所用之術語共軛物係指共價連接至非核苷酸部分(共軛部分或區C或第三區)之寡核苷酸。
本發明之寡核苷酸與一或多個非核苷酸部分之共軛可例如藉由影響寡核苷酸之活性、細胞分佈、細胞吸收或穩定性而改良寡核苷酸之藥理學。在一些實施例中，共軛物部分藉由改良寡核苷酸之細胞分佈、生物利用率、代謝、分泌、滲透性及/或細胞吸收而調節或增強寡核苷酸之藥物動力學特性。特別係，共軛物可使寡核苷酸靶向特定器官、組織或細胞類型，且藉此增強寡核苷酸在該器官、組織或細胞類型中之效力。同時，共軛物可用於降低寡核苷酸在非靶標細胞類型、組織或器官中之活性，例如在非靶標細胞類型、組織或器官中之脫靶活性或活性。
WO 93/07883及WO 2013/033230提供合適的共軛物部分，該等文獻以引用之方式併入本文中。其他合適的共軛物部分為能夠結合至去唾液酸醣蛋白受體(ASGPR)之彼等共軛物部分。特別係，三價的N-乙醯基半乳胺糖共軛物部分適合於結合至ASGPR，參見例如WO 2014/076196、WO 2014/207232及WO 2014/179620 (以引用之方式併入本文中)。此類共軛物用於增強肝臟對寡核苷酸之吸收，同時降低其在腎臟中之存在度，由此與相同寡核苷酸之非共軛型式相比，增加經共軛寡核苷酸之肝臟/腎臟比率。
寡核苷酸共軛物及其合成亦已報導於Manoharan在Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001中及Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103之全面綜述中，其各者以全文引用之方式併入本文中。
在一實施例中，非核苷酸部分(共軛物部分)選自由以下組成之群：碳水化合物、細胞表面受體配體、藥物物質、激素、親脂性物質、聚合物、蛋白質、肽、毒素(例如，細菌毒素)、維生素、病毒蛋白(例如，衣殼蛋白(capsids))或其組合。
連接子
連結或連接子係兩個原子之間的連接，該連接經由一或多個共價鍵將相關之一個化學基團或片段連接至相關之另一個化學基團或片段。共軛物部分可直接或經由連接部分(例如連接子或繫栓)連接至寡核苷酸。連接子用於將第三區，例如共軛物部分(區C)共價連接至第一區，例如與靶標核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列(區A)。
在本發明之一些實施例中，本發明之共軛物或寡核苷酸共軛物可視情況包含連接子區 (第二區或區B及/或區Y)，其定位於與靶標核酸互補之寡核苷酸或連續核苷酸序列(區A或第一區)與共軛物部分(區C或第三區)之間。
區B係指包含或由生理學上不穩定鍵組成的生物組成的可裂解連接子，該生理學上不穩定鍵在哺乳動物身體內通常遇到的條件或類似於哺乳動物身體內遇到的條件下可裂解。生理學上不穩定連接子進行化學轉化(例如裂解)之條件包括化學條件，諸如pH、溫度、氧化或還原條件或試劑，及哺乳動物細胞中發現的鹽濃度或類似於哺乳動物細胞中遇到的鹽濃度。哺乳動物細胞內條件亦包括通常存在於哺乳動物細胞中(諸如來自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)之酶活性之現狀。在一個實施例中，生物可裂解連接子對S1核酸酶裂解敏感。在一較佳實施例中，對核酸酶敏感的連接子包含1與10個之間核苷，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷，更佳2與6個之間核苷且最佳2與4個之間連接核苷，該等核苷包含至少兩個連續磷酸二酯連結，諸如至少3或4或5個連續磷酸二酯連結。較佳地核苷為DNA或RNA。含有生物可裂解連接子之磷酸二酯更詳細地描述於WO 2014/076195 (以引用之方式併入本文中)中。
區Y係指未必生物可裂解但主要用於將共軛物部分(區C或第三區)共價連接至寡核苷酸(區A或第一區)之連接子。區Y連接子可包含鏈結構或重複單元之寡聚物，諸如乙二醇、胺基酸單元或胺基烷基。本發明之寡核苷酸共軛物可由以下區性要素構成：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些實施例中，連接子(區Y)為胺基烷基，諸如C2-C36胺基烷基，包括例如C6至C12胺基烷基。在一較佳實施例中，連接子(區Y)為C6胺基烷基。
投與
本發明之寡核苷酸或醫藥組合物可局部(諸如，至皮膚、吸入、眼內或經耳)、或經腸(諸如，經口或經由胃腸道)或非經腸(諸如，靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內)投與。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸或醫藥組合物藉由非經腸途徑投與，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸液、鞘內或顱內(例如腦內或室內)、玻璃體內投與。在一個實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經靜脈內投與。在另一實施例中，活性寡核苷酸或寡核苷酸共軛物經皮下投與。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸、寡核苷酸共軛物或醫藥組合物以0.1-15 mg/kg，諸如0.2-10 mg/kg，諸如0.25-5 mg/kg之劑量進行投與。投與可為一週一次、每兩週一次、每三週一次或每月或每兩個月一次。
本發明亦提供如針對藥物製造所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物的用途，其中藥物為用於眼內(諸如玻璃體內)注射之劑型。在一些實施例中，用於眼內靶標之寡核苷酸為Htra-1。
本發明亦提供如針對藥物製造所描述之本發明之寡核苷酸或寡核苷酸共軛物的用途，其中藥物為用於靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內投與(例如，注射)之劑型。
說明性優勢
如本文中所說明，用於本發明化合物中之非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結使得可降低非立體限定硫代磷酸酯寡核苷酸之複雜性，同時保持寡核苷酸之活性、功效或效能。
實際上，如本文中所說明，本發明所用之化合物與立體限定硫代磷酸酯組合提供獨特益處，提供進一步降低硫代磷酸酯寡核苷酸之複雜性的機會，同時保持或改良寡核苷酸之活性、功效或效能。
如本文中所說明，用於本發明化合物中之非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結使得可改良活體外或活體內細胞吸收。
如本文中所說明，用於本發明化合物中之非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結使得可改變或改良活體外生物分佈(量測為組織或細胞含量或靶標組織中之活性/效能)。值得注意地，吾人已發現骨胳肌肉、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、纖維母細胞、上皮細胞中組織吸收、含量及/或效能之改良。
在混合子寡核苷酸之上下文中，發明人已確認在該一或多個DNA核苷之間或與一或多個DNA核苷相鄰併入二硫代磷酸酯連結(如IA或IB中所示)提供諸如增強之穩定性及/或改良之效能的改良。在間隙子寡核苷酸之上下文中，本發明人已發現在側接區之核苷之間(諸如在2'糖修飾核苷之間)併入二硫代磷酸酯連結(如IA或IB中所示)亦提供諸如增強之穩定性及/或改良之效能的改良。
如本文中所說明，用於本發明化合物中之非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結使得可改良寡核苷酸穩定性。將非對掌性二硫代磷酸酯核苷間併入本發明化合物中提供對血清及細胞核酸外切酶(特別係3'核酸外切酶以及5'核酸外切酶)之增強的抗性，且本發明化合物之顯著穩定性進一步指示併入非對掌性二硫代磷酸酯連結之化合物對核酸內切酶之抗性。寡核苷酸之穩定在減少或阻止毒性降解產物之積聚以及延長反義寡核苷酸之作用持續時間方面特別重要。如實例中所說明，大鼠血清穩定性可用於分析改良之穩定性。對於細胞穩定性之評估，可使用組織(例如肝臟)勻漿提取物--例如參見WO2014076195 (其提供此類方法)。用於量測寡核苷酸穩定性之其他分析包括蛇毒液磷酸二酯酶穩定性分析及S1核酸酶穩定性。
所主張之寡核苷酸之降低的毒性風險測試活體外肝毒性分析(例如，如WO 2017/067970中所揭示)或活體外腎毒性分析(例如，如WO 2017/216340中所揭示)，或活體外神經毒性分析(例如，如WO2016127000中所揭示)。替代地，可在活體內，例如小鼠或大鼠中分析毒性。
增強的穩定性可有益於本發明之寡核苷酸之作用持續時間，其在投與途徑具侵襲性(例如非經腸投與，諸如靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、眼內、腦室內或鞘內投與)時特別有益。
間隙子實施例
1. 一種用於抑制細胞中之靶標RNA之反義間隙子寡核苷酸，其中反義間隙子寡核苷酸包含至少一個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結
(IA)(IB)
其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子。
2. 如實施例1之反義間隙子寡核苷酸，其中至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結具有式(IA)，且R為氫；或至少一個二硫代磷酸酯核苷間連結具有式(IB)，且M+為Na+、K+或銨離子。
3. 如實施例1或2之間隙子寡核苷酸，其中式(I)之該至少一個核苷間連結之兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一核苷(A2 )之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷。
4. 如實施例1至3中任一項之間隙子寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為2'糖修飾之核苷且另一者為DNA核苷。
5. 如實施例1至3中任一項之間隙子寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者同時為2'修飾之核苷。
6. 如實施例1至3中任一項之間隙子寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者同時為DNA核苷。
7. 如實施例1至6中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含式5'-F-G-F'-3'之連續核苷酸序列，其中G為能夠募集RNase H之5至18個核苷區，且該區G分別藉由側接區F及F'側接5'及3'，其中區F及F'獨立地包含或由1至7個2'糖修飾之核苷酸組成，其中鄰近於區G之區F的核苷為2'糖修飾之核苷，且其中鄰近於區G之區F'的核苷為2'糖修飾之核苷。
8. 如實施例1至7中任一項之間隙子寡核苷酸，其中2'糖修飾之核苷獨立地選自2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA及LNA核苷。
9. 如實施例8之間隙子寡核苷酸，其中2'-烷氧基烷氧基-RNA為2'-甲氧基乙氧基-RNA (2'-O-MOE)。
10. 如實施例7至8中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F及區F'包含或由2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷酸組成。
11. 如實施例7至10中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'或區F及F'兩者中之2'糖修飾之核苷中之至少一者或所有為LNA核苷。
12. 如實施例7至11中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'或區F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個DNA核苷。
13. 如實施例7至12中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'或區F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA之2'糖修飾之核苷，諸如至少一個2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷。
14. 如實施例1至13中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙區包含5至16個，特別係8至16個，更特別係8、9、10、11、12、13或14個連續DNA核苷。
15. 如實施例1至14中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F及區F'長度獨立地為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷。
16. 如實施例1至15中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F及區F'各自獨立地包含1、2、3或4個LNA核苷。
17. 如實施例8至16中任一項之間隙子寡核苷酸，其中LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
18. 如實施例8至18之間隙子寡核苷酸，其中LNA核苷為β-D-氧基LNA。
19. 如實施例1至18中任一項之間隙子寡核苷酸，其中寡核苷酸或其連續核苷酸序列(F-G-F')長度為10至30個核苷酸，特別係12至22個，更特別係長度為14至20個寡核苷酸。
20. 如實施例1至19中任一項之間隙子寡核苷酸，其中側接區(諸如區F及F')中之至少一者包含式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯連結，如實施例1至19中之任一項中所定義。
21. 如實施例1至19中任一項之間隙子寡核苷酸，其中兩個側接區(諸如區F及F')包含式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯連結，如實施例1至19中之任一項中所定義。
22. 如實施例1至21中任一項之間隙子寡核苷酸，其中側接區(諸如F或F')中之至少一者包含至少兩個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯連結，如實施例1至19中之任一項中所定義。
23. 如實施例1至21中任一項之間隙子寡核苷酸，其中兩個側接區(F及F')包含至少兩個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯連結，如實施例1至19中之任一項中所定義。
24. 如實施例1至23中任一項之間隙子寡核苷酸，其中側接區中之一者或兩者各自包含具有將LNA連接至3'核苷之式(IA)或(IB)的二硫代磷酸酯連結之LNA核苷。
25. 如實施例1至24中任一項之間隙子寡核苷酸，其中一個或兩個側接區各自包含兩個或更多個相鄰LNA核苷，該等核苷由將LNA連接至3'核苷之式(IA)或(IB)的二硫代磷酸酯連結來連接。
26. 如實施例1至25中任一項之間隙子寡核苷酸，其中一個或兩個側接區各自包含具有將MOE連接至3'核苷之式(IA)或(IB)的二硫代磷酸酯連結之MOE核苷。
27. 如實施例1至26中任一項之間隙子寡核苷酸，其中一個或兩個側接區各自包含兩個或更多個相鄰MOE核苷，該等核苷由將MOE連接至3'核苷之式(IA)或(IB)的二硫代磷酸酯連結來連接。
28. 如實施例1至27中任一項之間隙子寡核苷酸，其中側接區(F及F')一起包含1、2、3、4或5個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中視情況，區F之3'最末核苷與區G之5'最末核苷之間的核苷間連結亦為式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
29. 如實施例1至28中任一項之間隙子寡核苷酸，其包含l個位於區F或區F'中之相鄰核苷之間、位於區F與區G之間或位於區G與區F'之間的式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
30. 如實施例1至29中任一項中之間隙子區，其中間隙區包含1、2、3或4個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結，其中其餘的核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結。
31. 如實施例1至30中任一項之間隙子，其中間隙區包含至少5個連續DNA核苷酸區，諸如6至18個DNA連續核苷酸區或8至14個連續DNA核苷酸區。
32. 如實施例1至31中任一項之間隙子，其進一步包含一或多個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結(Sp, S)或(Rp, R)

其中N1 及N2 為核苷。
33. 如實施例32之間隙子，其中間隙子包含兩個DNA核苷之間，諸如間隙區中之兩個DNA核苷之間的至少一個立體限定之核苷間連結(Sp, S)或(Rp, R)。
34. 如實施例32或33之間隙子寡核苷酸，其中間隙區包含2、3、4、5、6、7或8個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，該等連接獨立地選自Rp及Sp核苷間連結。
35. 如實施例32至33中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區G進一步包含至少2、3或4個式IB之核苷間連結。
34. 如實施例32至35之間隙子寡核苷酸，其中(i)區G (亦即，區G中之核苷之間)內之所有其餘核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，該等連接獨立地選自Rp及Sp核苷間連結，或(ii)區G之所有核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，該等連接獨立地選自Rp及Sp核苷間連結。
35. 如實施例1至34中任一項之間隙子寡核苷酸，其中側接區內之所有核苷間連結為式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結，其中視情況區F之3'最末核苷與區G之5'最末核苷之間的核苷間連結亦為式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G之3'最末核苷與區F'之5'最末核苷之間的核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
36. 如實施例6至35中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結及如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
37. 如實施例7至36中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，特別係0個式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
38. 如實施例1至37中任一項之間隙子寡核苷酸，其中其餘的核苷間連結獨立地選自由以下組成之群：硫代磷酸酯、磷酸二酯及如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
39. 如實施例7至38中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區F之核苷之間的核苷間連結及區F'之核苷之間的核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯及如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
40. 如實施例7至39中任一項之間隙子寡核苷酸，其中各側接區F及F'獨立地包含1、2、3、4、5、6或7個如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
41. 如實施例7至40中任一項之間隙子寡核苷酸，其中側接區F及/或F'的所有核苷間連結為如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
42. 如實施例1至41中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含至少一個立體限定之核苷間連結，諸如至少一個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
43. 如實施例1至42中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙區包含1、2、3、4或5個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
44. 如實施例1至43中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙區之核苷之間的所有核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
45. 如實施例7至44中任一項之間隙子寡核苷酸，其中至少一個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F之核苷之間、或位於區F'之核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'內、區F與區G之間及區G與區F'之間的其餘核苷間連結獨立地選自立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結、立體無規之核苷間連結、式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結及磷酸二酯核苷間連結。
46. 如實施例45之間隙子寡核苷酸，其中區F內、區F'內或區F及區F'兩者內之其餘核苷間連結全部為式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
47. 如實施例6至33中任一項之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如實施例1中所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結獨立地選自立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結、立體無規之核苷間連結及磷酸二酯核苷間連結。
48. 如實施例1至47中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之3'末端核苷為LNA核苷或2'-O-MOE核苷。
49. 如實施例1至48中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之5'末端核苷為LNA核苷或2'-O-MOE核苷。
50. 如實施例1至49中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個3'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
51. 如實施例1至50中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個5'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
52. 如實施例1至51中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之三個3'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
53. 如實施例1至52中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之三個5'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
54. 如實施例1至53中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個3'最末端核苷為LNA核苷。
55. 如實施例1至54中任一項之間隙子寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個5'最末端核苷為LNA核苷。
56. 如實施例1至55中任一項之間隙子寡核苷酸，其中式(IA)或(IB)之核苷(A2 )為寡核苷酸之3'末端核苷。
57. 如實施例1至56中任一項之間隙子寡核苷酸，其中式(IA)或(IB)之核苷(A1 )為寡核苷酸之5'末端核苷。
58. 如實施例7至57中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含式5'-D'-F-G-F'-D"-3'之連續核苷酸序列，其中F、G及F'如實施例7至45中之任一項中所定義，且其中區D'及D"各自獨立地由0至5個核苷酸，特別係2、3或4個核苷酸，特別係DNA核苷酸，諸如磷酸二酯連接之DNA核苷[一種包含間隙子寡核苷酸之寡核苷酸及側接序列]組成。
59. 如實施例1至58中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸能夠募集人類RNase H1。
60. 如實施例1至59中任一項之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸用於活體外或活體內抑制哺乳動物，諸如人類之mRNA或前mRNA靶標、或病毒靶標或長的非編碼RNA。
61. 一種如實施例1至60中任一項之間隙子寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽。
62. 一種共軛物，其包含如實施例1至61中任一項中之間隙子寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由 連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
63. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至62中任一項中之間隙子寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑。
64. 如實施例1至63中任一項之間隙子寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質。
反義寡核苷酸實施例
本發明係關於一種寡核苷酸，其包含至少一個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子，且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子。
換言之，M為金屬，諸如鹼金屬，諸如Na或K；或M為NH4 。
寡核苷酸可例如係能夠調節靶標核酸(諸如靶標微RNA)之表現或能夠調節靶標前mRNA之剪接的單股反義寡核苷酸。該單股反義寡核苷酸包含連續核苷酸序列。本發明之反義寡核苷酸包含與靶標核酸互補之連續核苷酸序列，且能夠與靶標核酸雜交及調節靶標核酸之表現。在一較佳實施例中，反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列為混合子寡核苷酸，其中(A1 )或(A2 )為DNA核苷，或(A1 )及(A2 )均為DNA核苷。
在本發明之上下文中，反義寡核苷酸為與核酸靶標(諸如靶標RNA)互補之單股寡核苷酸，且能夠調節(例如，前mRNA靶標之剪接調節)或抑制核酸靶標(例如，mRNA靶標、前mRNA靶標、病毒RNA靶標或長的非編碼RNA靶標)之表現。取決於靶標，寡核苷酸之長度或與其互補(亦即，反義較佳互補區與靶標完全互補)之區的長度可為7至30個核苷酸(被稱作連續核苷酸序列之區)。舉例而言，微RNA之LNA核苷酸抑制劑可與7個連續互補之核苷酸(且可長至30個核苷酸)一樣短，募集寡核苷酸之RNase H長度通常為至少12個連續互補之核苷酸，諸如長度為12至26個核苷酸。剪接調節反義寡核苷酸通常具有10至30個互補核苷酸之連續核苷酸區。
亦被稱作剪接切換寡核苷酸(SSO)之剪接調節寡核苷酸係短的合成之反義、經修飾之核酸，其與前mRNA進行鹼基配對且藉由阻斷剪接機構之組分與前mRNA之間發生的RNA-RNA鹼基配對或蛋白質RNA結合相互作用來破壞轉錄之正常剪接基因譜。前mRNA之剪接係絕大部分蛋白質編碼基因之正確表現所要的，且因此，靶向該過程提供了操控基因之蛋白質產生的方法。剪接調節在由導致正常剪接之破壞之突變所引起的疾病或當干擾基因轉錄物之正常剪接過程可為治療劑時之情況下特別有價值。SSO提供有效且特定之方式來以治療方式靶向且改變剪接。參見Haven's及Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563。SSO可與靶標前mRNA中之外顯子/內含子邊界互補，或可靶向調節前mRNA之剪接的前mRNA內之剪接增強或沉默元件(統稱為順式作用剪接元件)。剪接調節可導致外顯子跳躍或外顯子內含，且藉此調製前mRNA之可變剪接。SSO藉由非核酸酶介導之靶標前mRNA之調節起作用，且因此不能募集RNase H，其通常係完全修飾之寡核苷酸(亦即每一核苷包含修飾之糖部分，諸如2'糖取代之糖部分(例如，基於硫代磷酸酯主鏈，長度為例如15至25個核苷酸，長度通常為18至22個或20個核苷酸之完整的2'-O-MOE寡核苷酸))或LNA混合子寡核苷酸(寡核苷酸長度為10至30個核苷酸)，其包含DNA及LNA核苷及視情況其他2'糖修飾之核苷，諸如2'-O-MOE。亦設想LNA寡核苷酸不包含DNA核苷，但包含LNA及其他2'糖修飾之核苷，諸如2'-O-MOE核苷。Haven's及Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563 (以引用之方式併入本文中)之表1說明一系列SSO靶標及所使用之寡核苷酸之化學性質，已報導該等化學性質活體內之活性，且在下表A中再現：
表A
在本發明之一些實施例中，反義寡核苷酸係與前mRNA互補之剪接調節寡核苷酸，該前mRNA選自由以下組成之群：HBB、FKTN、LMNA、CEP290、CLCN1、USH1C、BTK、LRP8、CTLA4、BCL2L1、ERBB4、MDM4、STAT3、IL1RAP、TNFRSF1B、FLT1、KDR、SMN2、MYBPC3、TTN、DMD、NBN、IL10、HTT、APOB、MSTN、GYS2及ATXN3。可在靶標上藉由靶標基礎用本發明之SSO治療之例示性疾病提供於表A中。
以下實施例大體習慣於本發明之單股反義寡核苷酸，且特別係剪接調節反義寡核苷酸(SSO)：
1. 一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含一或多個2'糖修飾之核苷，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結

其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中R為氫或磷酸酯保護基。
2. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷。
3. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )為2'糖修飾之核苷。
4. 如實施例1至3中任一項之反義寡核苷酸，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者或核苷(A1 )及(A2 )兩者為DNA核苷。
5. 如實施例1至4中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷或獨立地選自以下之核苷：2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷。
6. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷。
7. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者均為LNA核苷。
8. 如實施例1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'-O-甲氧基乙基核苷。
9. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者均為2'-O-甲氧基乙基核苷。
10. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸，其中LNA核苷選自由以下組成之群：β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
11. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸，其中LNA核苷為β-D-氧基LNA。
12. 如實施例1至11中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含一或多個其他2'糖修飾之核苷，諸如一或多個其他2'糖修飾之核苷，該等核苷選自由以下組成之群：2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷。
13. 如實施例1至12中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含LNA核苷及DNA核苷兩者。
14. 如實施例1至12中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含LNA核苷及2'-O-甲氧基乙基核苷兩者。
15. 如實施例1至13中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含LNA核苷及2'氟RNA核苷兩者。
16. 如實施例1至13中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含：
(i) 僅LNA及DNA核苷
(ii) 僅LNA及2'-O-甲氧基乙基核苷
(iii) 僅LNA、DNA及2'-O-甲氧基乙基核苷
(iv) 僅LNA、2'氟RNA及2'-O-甲氧基乙基核苷
(v) 僅LNA、DNA、2'氟RNA及2'-O-甲氧基乙基核苷或僅LNA、2'氟RNA及2'-O-甲氧基乙基核苷
(vi) 僅2'-O-甲氧基乙基核苷。
17. 如實施例1至16中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列不包含4個或更多個連續DNA核苷之序列，或不包含三個或更多個連續DNA核苷之序列。
18. 如實施例1至17中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列為混合子寡核苷酸或總子寡核苷酸。
19. 如實施例1至18中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸不能募集人類RNase H1。
20. 如實施例1至19中任一項之反義寡核苷酸，其中核苷(A2 )為連續核苷酸序列或寡核苷酸之3'末端核苷。
21. 如實施例1至20中任一項之反義寡核苷酸，其中核苷(A1 )為連續核苷酸序列或寡核苷酸之5'末端核苷。
22. 如實施例1至21中任一項之反義寡核苷酸，其包含至少兩個式I之二硫代磷酸酯核苷間連結，諸如2、3、4、5或6個式I之二硫代磷酸酯核苷間連結。
23. 如實施例1至22中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列之2 3'最末核苷之間的核苷間連結為式I之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中連續核苷酸序列之2 5'最末核苷之間的核苷間連結為式I之二硫代磷酸酯核苷間連結。
24. 如實施例1至23中任一項之反義寡核苷酸，其進一步包含硫代磷酸酯核苷間連結。
25. 如實施例1至24中任一項之反義寡核苷酸，其進一步包含立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
26. 如實施例1至25中任一項之反義寡核苷酸，其中其餘核苷間連結獨立地選自由以下組成之群：二硫代磷酸酯核苷間連結、硫代磷酸酯核苷間連結及磷酸二酯核苷間連結。
27. 如實施例1至26中任一項之反義寡核苷酸，其中其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結。
28. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與哺乳動物前mRNA、哺乳動物成熟mRNA靶標、病毒RNA靶標或哺乳動物長非編碼RNA互補，諸如100%互補。
29. 如實施例28之反義寡核苷酸，其中RNA靶標為人類RNA靶標。
30. 如實施例1至29中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸調製哺乳動物(諸如人類前mRNA靶標)之剪接，例如為剪接跳躍或剪接調節反義寡核苷酸。
31. 如實施例1至30中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸與人類前mRNA之內含子/外顯子剪接位點或人類前mRNA之剪接調節區互補，諸如100%互補。
32. 如實施例1至30中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與人類前mRNA序列互補，諸如完全互補，該人類前mRNA序列選自由以下組成之群：TNFR2、HBB、FKTN、LMNA、CEP290、CLCN1、USH1C、BTK、LRP8、CTLA4、BCL2L1、ERBB4、MDM4、STAT3、IL1RAP、TNFRSF1B、FLT1、KDR、SMN2、MYBPC3、TTN、DMD、NBN、IL10、HTT、APOB、MSTN、GYS2及ATXN3。
33. 如實施例1至32中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸由連續核苷酸序列組成或包含連續核苷酸序列，該核苷酸序列選自由SSO#1 - SSO#25組成之群。
34. 如實施例1至33中任一項之反義寡核苷酸，其中細胞為人類細胞。
35. 如實施例1至34中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之長度為10至30個核苷酸。
36. 如實施例1至34中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之長度為12至24個核苷酸。
37. 如實施例1至36中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之3'末端核苷為LNA核苷或2-O-甲氧基乙基核苷。
38. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之5'末端核苷為LNA核苷或2-O-甲氧基乙基核苷。
39. 如實施例1至38中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之5'末端核苷及3'末端核苷兩者均為LNA核苷。
40. 如實施例1至39中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含兩個或三個LNA連續核苷酸之至少一個區及/或兩個或三個連續的2'-O-甲氧基乙基連續核苷酸之至少一個區。
41. 一種如實施例1至40中任一項之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
42. 一種共軛物，其包含如實施例1至41中任一項中之寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由 連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
43. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至42中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑。
44. 如實施例1至43中任一項之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質。
45. 一種用於調節表現該RNA之細胞中之靶標RNA之方法，該方法包含以下步驟：將有效量之如實施例1至44中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽、共軛物或組合物投與至細胞。
46. 一種用於調節表現該靶標前mRNA之細胞中之靶標前RNA的剪接之方法，該方法包含以下步驟：將有效量之如實施例1至44中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽、共軛物或組合物投與至細胞。
47. 如實施例45或46之方法，其中該方法為活體外方法或活體內方法。
48. 一種如實施例1至44中任一項之寡核苷酸、醫藥學上之鹽、共軛物或組合物之用途，其用於抑制細胞(諸如人類細胞)中之RNA，其中該用途為活體外或活體內。
某些混合子實施例
1. 一種用於調節細胞中之RNA靶標之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含或由長度為10至30個核苷酸之連續核苷酸序列組成，其中連續核苷酸序列包含2'糖修飾之核苷的交替區，其中具有連續核苷酸序列之連續DNA核苷的最大長度為3或4，且其中存在於連續核苷酸序列之核苷之間的核苷間連結中之至少一者為式IA或IB之二硫代磷酸酯連結

其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中R為氫或磷酸酯保護基。
2. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷。
3. 如實施例1之反義寡核苷酸，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )為2'糖修飾之核苷。
4. 如實施例1至3中任一項之反義寡核苷酸，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者或核苷(A1 )及(A2 )兩者為DNA核苷。
5. 如實施例1至4中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷或獨立地選自以下之核苷：2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷。
6. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷。
7. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者均為LNA核苷。
8. 如實施例1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'-O-甲氧基乙基核苷。
9. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者均為2'-O-甲氧基乙基核苷。
10. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸，其中LNA核苷選自由以下組成之群：β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
11. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸，其中LNA核苷為β-D-氧基LNA。
12. 如實施例1至11中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含一或多個其他2'糖修飾之核苷，諸如選自由以下組成之群之一或多個其他2'糖修飾之核苷：2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷。
13. 如實施例1至12中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含LNA核苷及DNA核苷兩者。
14. 如實施例1至12中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含LNA核苷及2'-O-甲氧基乙基核苷兩者。
15. 如實施例1至13中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含LNA核苷及2'氟RNA核苷兩者。
16. 如實施例1至13中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含：
(i) LNA及DNA核苷
(ii) LNA、DNA及2'-O-甲氧基乙基核苷或
(iii) LNA、DNA、2'氟RNA及2'-O-甲氧基乙基核苷。
17. 如實施例1至16中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列不包含3個或更多個連續DNA核苷之序列，或不包含2個或更多個連續DNA核苷之序列。
18. 如實施例1至17中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列為混合子寡核苷酸，諸如剪接調節寡核苷酸或微RNA抑制劑寡核苷酸。
19. 如實施例21之反義寡核苷酸，其中混合子由以下交替區基元組成或包含以下交替區基元：
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m或
[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m，
其中L表示2'糖修飾之核苷，D表示DNA核苷，且其中各m獨立地選自1至6，且各n獨立地選自1、2、3及4，諸如1至3。
20. 如實施例19之反義寡核苷酸，其中各L核苷獨立地選自由以下組成之群：LNA、2'-O-MOE或2'氟核苷，或各L獨立地為LNA或2'-O-MOE。
21. 如實施例20之反義寡核苷酸，其中各L為LNA。
22. 如實施例1至21中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸不能募集人類RNase H1。
23. 如實施例1至22中任一項之反義寡核苷酸，其中核苷(A2 )為連續核苷酸序列或寡核苷酸之3'末端核苷。
24. 如實施例1至23中任一項之反義寡核苷酸，其中核苷(A1 )為連續核苷酸序列或寡核苷酸之5'末端核苷。
25. 如實施例1至24中任一項之反義寡核苷酸，其包含至少兩個式I之二硫代磷酸酯核苷間連結，諸如2、3、4、5或6個式I之二硫代磷酸酯核苷間連結。
26. 如實施例1至25中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含兩個連續DNA核苷酸，其中兩個連續DNA核苷酸之間的核苷連接為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結，亦即，P2S連接之DNA核苷酸對。
27. 如實施例1至26中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含大於一個P2S連接之DNA核苷酸對。
28. 如實施例1至26中任一項之反義寡核苷酸，其中存在於連續核苷酸序列中之兩個連續DNA核苷酸之間的所有核苷連接為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結。
29. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中2'糖修飾之核苷與DNA核苷之間的至少一個核苷間連結為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結。
30. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中2'糖修飾之核苷與DNA核苷之間大於一個核苷間連結為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結。
31. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中2'糖修飾之核苷與DNA核苷之間的所有核苷間連結為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結。
32. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中兩個2'糖修飾之核苷之間的核苷間連結中之至少一者不為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結，諸如為硫代磷酸酯核苷間連結。
33. 如實施例1至27中任一項之反義寡核苷酸，其中兩個2'糖修飾之核苷之間的所有核苷間連結不為式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結，諸如為硫代磷酸酯核苷間連結。
34. 如實施例1至33中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列之2 3'最末核苷之間的核苷間連結為式I之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中連續核苷酸序列之2 5'最末核苷之間的核苷間連結為式I之二硫代磷酸酯核苷間連結。
35. 如實施例1至34中任一項之反義寡核苷酸，其進一步包含硫代磷酸酯核苷間連結。
36. 如實施例1至35中任一項之反義寡核苷酸，其進一步包含立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
37. 如實施例1至35中任一項之反義寡核苷酸，其中其餘核苷間連結獨立地選自由以下組成之群：二硫代磷酸酯核苷間連結、硫代磷酸酯核苷間連結及磷酸二酯核苷間連結。
38. 如實施例1至36中任一項之反義寡核苷酸，其中其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結。
39. 如實施例1至37中任一項之反義寡核苷酸，其中該連續核苷酸序列與哺乳動物(諸如人類前mRNA)互補，諸如100%互補。
40. 如實施例1至38中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸調節哺乳動物(諸如人類前mRNA靶標)之剪接，例如為剪接跳躍或剪接調節反義寡核苷酸。
41. 如實施例1至39中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸與人類前mRNA之內含子/外顯子剪接位點或人類前mRNA之剪接調節區互補，諸如100%互補。
42. 如實施例1至41中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列與人類前mRNA序列互補，諸如完全互補，該人類前mRNA序列選自由以下組成之群：TNFR2、HBB、FKTN、LMNA、CEP290、CLCN1、USH1C、BTK、LRP8、CTLA4、BCL2L1、ERBB4、MDM4、STAT3、IL1RAP、TNFRSF1B、FLT1、KDR、SMN2、MYBPC3、TTN、DMD、NBN、IL10、HTT、APOB、MSTN、GYS2及ATXN3。
43. 如實施例1至42中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸由連續核苷酸序列組成或包含連續核苷酸序列，該核苷酸序列選自由SSO#1 - SSO#25組成之群。
44. 如實施例1至43中任一項之反義寡核苷酸，其中細胞為哺乳動物細胞。
45. 如實施例1至44中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之長度為10至30個核苷酸。
46. 如實施例1至44中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之長度為12至24個核苷酸。
47. 如實施例1至46中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之3'末端核苷為LNA核苷或2-O-甲氧基乙基核苷。
48. 如實施例1至47中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之5'末端核苷為LNA核苷或2-O-甲氧基乙基核苷。
49. 如實施例1至48中任一項之反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸或其連續核苷酸序列之5'末端核苷及3'末端核苷均為LNA核苷。
50. 如實施例1至49中任一項之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸序列包含兩個或三個LNA連續核苷酸之至少一個區及/或兩個或三個連續的2'-O-甲氧基乙基連續核苷酸之至少一個區。
51. 一種如實施例1至50中任一項之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
52. 一種共軛物，其包含如實施例1至51中任一項中之寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
53. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至52中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑。
54. 如實施例1至53中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質。
55. 一種用於調節表現該RNA之細胞中之靶標RNA之方法，該方法包含以下步驟：將有效量之如實施例1至54中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽、共軛物或組合物投與至細胞。
56. 一種用於調節表現該靶標前mRNA之細胞中之靶標前RNA的剪接之方法，該方法包含以下步驟：將有效量之如實施例1至54中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽、共軛物或組合物投與至細胞。
57. 如實施例55或56之方法，其中該方法為活體外方法或活體內方法。
58. 一種如實施例1至54中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上之鹽、共軛物或組合物之用途，其用於抑制細胞，諸如哺乳動物細胞中之RNA，其中該用途為活體外或活體內用途。
與3'端保護相關之某些實施例
1. 一種包含至少一個式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結之單股反義寡核苷酸
(IA)(IB)
其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子，且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷，諸如LNA核苷或2'-O-MOE核苷，且其中R為氫或磷酸酯保護基，其中A2 為寡核苷酸之3'末端核苷。
2. 如實施例1之單股反義，其中(A2 )為LNA核苷，或(A1 )及(A2 )兩者均為LNA核苷。
3. 如實施例1之單股反義，其中(A2 )為LNA核苷且(A1 )為糖修飾之核苷酸。
4. 如實施例1之單股反義，其中(A2 )為LNA核苷且(A1 )為DNA核苷酸。
5. 如實施例1之單股反義，其中(A1 )為LNA核苷且(A2 )為糖修飾之核苷酸。
6. 如實施例1之單股反義，其中(A1 )為LNA核苷且(A2 )為DNA核苷酸。
7. 如實施例3或5中任一項之單股反義，其中該糖修飾之核苷為2'糖修飾之核苷。
8. 如實施例7之單股反義，其中該2'糖修飾之核苷為2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷。
9. 如實施例7或8之單股反義，其中該2'糖修飾之核苷為2'-O-甲氧基乙基核苷。
10. 如實施例1至9中任一項之單股反義，其中LNA核苷或核苷酸呈β-D構形。
11. 如實施例1至10中任一項之單股反義，其中LNA核苷獨立地選自：β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
12. 如實施例1至11中任一項之單股反義，其中LNA為β-D-氧基LNA。
13. 如實施例1至12中任一項之單股反義，其中單股反義由7至30個連續核苷酸組成或包含7至30個連續核苷酸，該等連續核苷酸與靶標核酸互補，諸如選自由以下組成之群之靶標核酸：前mRNA及mRNA、微RNA、病毒RNA及長非編碼RNA [被稱作單股反義之連續核苷酸序列]。
14. 如實施例1至13中任一項之單股反義，其中連續核苷酸序列包含式5'-F-G-F'-3'之間隙子區，其中G為能夠募集RNase H之5至18個核苷區，且該區G個別地藉由側接區F及F'側接5'及3'，其中區F及F'獨立地包含或由1至7個2'糖修飾之核苷酸組成，其中鄰近於區G之區F的核苷為2'糖修飾之核苷，且其中鄰近於區G之區F'的核苷為2'糖修飾之核苷。
14. 如實施例1至13中任一項之單股反義，其中連續核苷酸序列為混合子寡核苷酸，其中混合子寡核苷酸包含LNA核苷及DNA核苷兩者及視情況2'糖修飾之核苷[諸如實施例8至9之彼等核苷]，其中單股反義不包含4個或更多個連續DNA核苷區。
15. 如實施例1至13中任一項之單股反義，其中連續核苷酸序列僅包含糖修飾之核苷。
16. 如實施例14或15之寡核苷酸，其中寡核苷酸為剪接調節寡核苷酸[能夠調節前mRNA剪接事件之剪接]。
17. 如實施例14或15之寡核苷酸，其中寡核苷酸與微RNA互補，諸如為微RNA抑制劑。
18. 如實施例1至17中任一項之寡核苷酸，其包含獨立地選自以下之其他核苷間連結：磷酸二酯核苷間連結、硫代磷酸酯核苷間連結及二硫代磷酸酯核苷間連結；或其中寡核苷酸或其連續核苷酸序列內之其他核苷間連結獨立地選自：硫代磷酸酯核苷間連結及二硫代磷酸酯核苷間連結。
18. 如實施例1至18中任一項之寡核苷酸，其中寡核苷酸或其連續核苷酸序列之其他核苷間連結全部為硫代磷酸酯核苷間連結。
19. 如實施例1至18中任一項之寡核苷酸，其中寡核苷酸包含連續核苷酸序列之5'區位置5'，其中5'核苷區包含至少一個磷酸二酯連結。
20. 如實施例19之寡核苷酸，其中5'區包含1至5個磷酸二酯連接之DNA核苷，且視情況可將寡核苷酸或其連續核苷酸序列連接至共軛物部分。
21. 如實施例1至20中任一項之寡核苷酸，其中一或多個核苷為核鹼基修飾之核苷。
22. 如實施例1至21中任一項之寡核苷酸，其中一或多個核苷為5-甲基胞嘧啶，諸如LNA 5-甲基胞嘧啶或DNA 5-甲基胞嘧啶。
23. 一種如實施例1至22中任一項之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
24. 一種共軛物，其包含如實施例1至23中任一項中之寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由 連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
25. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至24中任一項之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑。
26. 如實施例1至25中任一項中之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質。
27. 如實施例1至24中任一項之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用於治療中，用於經由非經腸投與而投與至個體，該非經腸投與諸如靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內投與。
與具有非對掌性二硫代磷酸酯及立體限定之硫代磷酸酯連結的寡核苷酸相關之實施例
1. 一種包含至少一個式IA或IB之二硫代磷酸酯核苷間連結之單股反義寡核苷酸

其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子，且其中單股寡核苷酸進一步包含至少一個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，(Sp, S)或(Rp, R)

其中N1 及N2 為核苷。(註解：在一些非限制性實施例中，N1 及/或N2 為DNA核苷酸)。
2. 如實施例1之單股反義寡核苷酸，其中A2 為寡核苷酸之3'末端核苷。
3. 如實施例1之單股反義寡核苷酸，其中A1 為寡核苷酸之5'末端核苷。
4. 如實施例1至3中任一項之單股反義寡核苷酸，其中該單股寡核苷酸包含1、2、3、4、5或6個式IB之核苷間連結。
5. 如實施例1至4中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之5'最末核苷間連結及反義寡核苷酸之3'最末核苷間連結兩者均為式IB之核苷間連結。
6. 如實施例1至5中任一項之單股反義寡核苷酸，其中在式IB之核苷間連結中之至少一者中，兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'糖修飾之核苷，諸如選自由以下組成之群之2'糖修飾之核苷：2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA及LNA核苷。
7. 如實施例1至6中任一項之單股反義寡核苷酸，其中在式IB之核苷間連結中之至少一者中，兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷。
8. 如實施例1至6中任一項之單股反義寡核苷酸，其中在式IB之核苷間連結中之至少一者中，兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為2'-O-MOE核苷。
9. 如實施例1至8中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之3'末端核苷為LNA核苷或2'-O-MOE核苷。
10. 如實施例1至9中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之5'末端核苷為LNA核苷或2'-O-MOE核苷。
11. 如實施例1至10中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個3'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
12. 如實施例1至11中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個5'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
13. 如實施例1至12中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之三個3'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
14. 如實施例1至13中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之三個5'最末端核苷獨立地選自LNA核苷及2'-O-MOE核苷。
15. 如實施例1至14中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個3'最末端核苷為LNA核苷。
16. 如實施例1至15中任一項之單股寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之兩個5'最末端核苷為LNA核苷。
17. 如實施例1至16中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸進一步包含2至16個DNA核苷酸區，其中DNA核苷酸之間的核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
18. 如實施例1至17中任一項之單股反義寡核苷酸，其中LNA核苷獨立地選自：β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
19. 如實施例1至17中任一項之單股反義寡核苷酸，其中LNA核苷為β-D-氧基LNA。
20. 如實施例1至19中任一項之單股反義寡核苷酸，其中寡核苷酸由7至30個連續核苷酸組成或包含7至30個連續核苷酸，該等連續核苷酸與靶標核酸互補，諸如完全互補，諸如選自由以下組成之群之靶標核酸：前mRNA及mRNA、微RNA、病毒RNA及長非編碼RNA [反義寡核苷酸]。
21. 如實施例1至20中任一項之單股反義寡核苷酸，其中單股寡核苷酸能夠調節RNA靶標。
22. 如實施例1至20中任一項之單股反義寡核苷酸，其中單股反義寡核苷酸能夠抑制RNA靶標，諸如經由 RNAse H1募集。
23. 如實施例1至22中任一項之單股反義寡核苷酸，其中寡核苷酸之連續核苷酸序列包含式5'-F-G-F'-3'之間隙子區，其中G為能夠募集RNase H1之5至18個核苷區，且該區G分別藉由側接區F及F'而側接5'及3'，其中區F及F'獨立地包含或由1至7個2'糖修飾之核苷酸組成，其中鄰近於區G之區F的核苷為2'糖修飾之核苷，且其中鄰近於區G之區F'的核苷為2'糖修飾之核苷。
24. 如實施例23之單股反義寡核苷酸，區F或區F'包含如實施例1至19中任一項中之式IB之核苷間連結。
25. 如實施例24之單股反義寡核苷酸，其中區F及F'兩者包含如實施例1至19中任一項中之式IB之核苷間連結。
26. 如實施例23至25之單股反義寡核苷酸，其中區F及/或F'內之所有核苷間連結為如實施例1至19中任一項中之式IB之核苷間連結。
27. 如實施例23至26之單股反義寡核苷酸，其中區F及F'均包含或由LNA核苷組成。
28. 如實施例23至27之單股反義寡核苷酸，其中區F及F'均包含或由MOE核苷組成。
29. 如實施例23至28之單股反義寡核苷酸，其中區F包含LNA核苷且F'包含或由MOE核苷組成。
30. 如實施例23至29之單股反義寡核苷酸，其中區G進一步包含位於區F之3'最末核苷與區G之5'最末核苷之間的至少一個式IB之核苷間連結。
31. 如實施例23至30之單股反義寡核苷酸，其中區G包含位於兩個DNA核苷之間的至少一個立體限定之硫代磷酸酯連結。
32. 如實施例23至31之單股反義寡核苷酸，其中區G包含位於兩個DNA核苷之間的至少一個式IB之核苷間連結。
33. 如實施例23至32之單股反義寡核苷酸，其中區G進一步包含至少2、3或4個式IB之核苷間連結。
34. 如實施例23至31之單股反義寡核苷酸，其中區G內之所有其餘核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，該等連接獨立地選自Rp及Sp核苷間連結。
35. 如實施例23至31之單股反義寡核苷酸，其中區G內之所有核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，其獨立地選自Rp及Sp核苷間連結，視情況除區F之3'最末核苷與區G之5'最末核苷之間的核苷間連結除外。
36. 如實施例1至22中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含小於4個連續DNA核苷酸。
37. 如實施例1至22或36中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸為混合子或總子寡核苷酸。
38. 如實施例37之單股寡核苷酸，其中混合子寡核苷酸包含LNA核苷及DNA核苷兩者，及視情況2'糖修飾之核苷(例如，參見實施例6中之清單)，諸如2'-O-MOE核苷。
39. 如實施例1至38中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸包含3個或更多個連續MOE核苷之區，且視情況其中寡核苷酸之所有核苷為2'MOE核苷。
40. 如實施例1至39中任一項之單股反義寡核苷酸，其中靶標為mRNA或前mRNA靶標。
41. 如實施例1至40中任一項之單股反義寡核苷酸，其中寡核苷酸靶向前mRNA剪接位點或前mRNA區，該前mRNA區調節前mRNA剪接位點處之剪接事件。
42. 如實施例1至41中任一項之單股反義寡核苷酸，其為能夠調節前mRNA靶標之剪接的剪接調節寡核苷酸。
43. 如實施例1至42中任一項之單股反義寡核苷酸，其中靶標為微RNA。
44. 如實施例1至42中任一項之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸長度為10至20個核苷酸，諸如長度為12至24個核苷酸。
45. 如實施例43之單股反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸之長度為7至30個，諸如長度為8至12個或12至23個核苷酸。
46. 一種包含如實施例1至45中任一項之反義寡核苷酸之單股反義寡核苷酸，其中寡核苷酸進一步包含之5'區位置5'，其中5'核苷區包含至少一個磷酸二酯連結。
47. 如實施例46之單股反義寡核苷酸，其中5'區包含1至5個磷酸二酯連接之DNA核苷，且視情況可將寡核苷酸或其連續核苷酸序列連接至共軛物部分。
48. 如實施例1至47中任一項之單股反義寡核苷酸，其中一或多個核苷為核鹼基修飾之核苷。
49. 如實施例1至48中任一項之單股反義寡核苷酸，其中一或多個核苷為5-甲基胞嘧啶，諸如LNA 5-甲基胞嘧啶或DNA 5-甲基胞嘧啶。
50. 一種如實施例1至49中任一項之單股反義寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
51. 一種共軛物，其包含如實施例1至49中任一項中之單股反義寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
52. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至51中任一項中之單股反義寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑。
53. 如實施例1至52中任一項之單股反義寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質。
54. 如實施例1至53中任一項之單股反義寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用於治療中，用於經由非經腸投與而投與至個體，諸如靜脈內、皮下、肌肉內、腦內、腦室內或鞘內投與。
55. 如前述實施例中任一項之單股反義寡核苷酸、鹽或組合物之活體外用途，其用於抑制細胞中之靶標RNA，其中單股反義寡核苷酸與靶標RNA互補，諸如完全互補。
56. 一種用於抑制表現該靶標RNA之細胞中之靶標RNA之活體內或活體外方法，該方法包含將有效量之如前述實施例中任一項之反義寡核苷酸、鹽、共軛物或組合物投與至細胞，以便抑制靶標RNA。
57. 如前述實施例中任一項之單股反義寡核苷酸、鹽或組合物之活體外或活體內用途，其用於調節細胞中之靶標前mRNA的剪接。
58. 一種用於調節表現該靶標前RNA之細胞中之靶標前RNA的剪接之活體內或活體外方法，該方法包含將有效量之如前述實施例中任一項之反義寡核苷酸、鹽、共軛物或組合物投與至細胞，以便調節靶標RNA之剪接。
本發明之 Htra-1 靶向反義寡核苷酸
在一些實施例中，本發明之反義寡核苷酸與編碼人類高溫要求A1絲胺酸蛋白酶(human high temperature requirement A1 Serine protease ，Htra1)之mRNA或前mRNA互補-參見例如WO 2018/002105。使用靶向Htra1 mRNa或前mRNA的本發明之反義寡核苷酸抑制Htra1表現有益於治療一系列醫學病症，諸如黃斑變性，例如年齡相關之黃斑部變性(地圖狀萎縮)。人類Htra1前mRNA及mRNA靶標序列可如下使用：
靶向Htra-1之本發明之化合物在實例中列舉為Htra1#1 - 38。
1. 一種本發明之反義寡核苷酸，其長度為10至30個核苷酸，其中該反義寡核苷酸靶向人類HTRA1 mRNA或前mRNA，其中該反義寡核苷酸包含與WO 2018/002105之SEQ ID NO 1或2至少90% (諸如100%)互補之10至22個核苷酸之連續核苷酸區，SEQ ID NO 1或2於序列表中揭示為SEQ ID NO 9及10，其中該反義寡核苷酸包含至少一個式IA或式IB之二硫代磷酸酯核苷間連結。
2. 如實施例1或2之反義寡核苷酸，其中連續核苷酸區與存在於選自由以下組成之群的序列之序列具有一致性：SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17及18：
SEQ ID NO 11: CAAATATTTACCTGGTTG
SEQ ID NO 12: TTTACCTGGTTGTTGG
SEQ ID NO 13: CCAAATATTTACCTGGTT
SEQ ID NO 14: CCAAATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 15: ATATTTACCTGGTTGTTG
SEQ ID NO 16: TATTTACCTGGTTGTT
SEQ ID NO 17: ATATTTACCTGGTTGT
SEQ ID NO 18: ATATTTACCTGGTTGTT。
3. 如實施例1至3中任一項之反股寡核苷酸，其中連續核苷酸區包含序列SEQ ID NO 146：
SEQ ID NO 19: TTTACCTGGTT。
4. 如實施例1至4中任一項之反義寡核苷酸，其中寡核苷酸之連續核苷酸區由以下組成或包含選自以下中之任一者之序列：SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17及18。
5. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中寡核苷酸之連續核苷酸區包含一或多個2'糖修飾之核苷，諸如獨立地選自由以下組成之群的一或多個2'糖修飾之核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟基-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟基-ANA及LNA核苷。
6. 如實施例1至5中任一項之反義寡核苷酸，其中寡核苷酸之連續核苷酸區包含至少一個經修飾之核苷間連結，諸如一或多個硫代磷酸酯核苷間連結，或諸如連續核苷酸區內之所有核苷間連結係硫代磷酸酯核苷間連結。
7. 如實施例1至6中任一項之反義寡核苷酸，其中寡核苷酸或其連續核苷酸序列係或包含間隙子，諸如式5'-F-G-F'-3'之間隙子，其中區F及F'獨立地包含1至7個糖修飾之核苷且G為6至16個核苷之區，該區能夠募集RNase H，其中鄰近於區G之區F及F'的核苷為糖修飾之核苷。
8. 如實施例7之反義寡核苷酸，其中區F及F'中之至少一者或兩者各自包含至少一個LNA核苷。
9. 如實施例1至8中任一項之反義寡核苷酸，其自選自以下之群中選出：Htra1#1 - 38，其中大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷單元，小寫字母表示DNA核苷單元，下標s表示硫代磷酸酯核苷間連結，其中所有LNA胞嘧啶係5-甲基胞嘧啶，P表示式IB之二硫代磷酸酯核苷間連結，S表示Sp立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，R表示Rp立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結且X表示立體無規之硫代磷酸酯連結。
10. 如前述實施例中任一項之反義寡核苷酸，其呈鹽形式，諸如鈉鹽、鉀鹽或銨鹽(例如，醫藥學上可接受之鹽)。
11. 一種共軛物，其包含如實施例1至10中任一項之寡核苷酸，及共價連接於該寡核苷酸或其鹽之至少一個共軛物部分。
12. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至10之寡核苷酸或如實施例11之共軛物及醫藥學上可接受之稀釋劑、溶劑、載劑、鹽及/或佐劑。
13. 一種用於調節表現HTRA1之靶細胞中之HTRA1表現之活體內或活體外方法，該方法包含將如實施例1至10中任一項之寡核苷酸或如實施例11之共軛物或如實施例12之醫藥組合物以有效量投與至該細胞。
14. 一種用於治療或預防疾病之方法，其包含將治療上或預防有效量之如實施例1至10中任一項之寡核苷酸或如實施例11之共軛物或如實施例12之醫藥組合物投與至患有或易患疾病之個體。
15. 如實施例1至10中任一項之寡核苷酸或如實施例11之共軛物或如實施例12之醫藥組合物，其用於藥物。
16. 如實施例1至10中任一項之寡核苷酸或如實施例11之共軛物或如實施例12之醫藥組合物，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏(Parkinson’s)病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。
17. 一種如實施例1至10中任一項之寡核苷酸或如實施例11之共軛物或如實施例12之醫藥組合物的用途，其用於製備用以治療或預防選自由以下組成之群的疾病之藥物：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏病、阿茲海默氏病、杜興氏肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。
18. 如前述實施例中任一項之寡核苷酸、共軛物、鹽或組合物或用途，其用於治療地圖狀萎縮。
本發明之其他實施例
因此，本發明尤其係關於：
一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸為能夠調節表現該靶標RNA之細胞中的靶標RNA之表現之反義寡核苷酸；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸為能夠抑制表現該靶標RNA之細胞中的靶標RNA之表現之反義寡核苷酸；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為DNA核苷、RNA核苷或糖修飾之核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為DNA核苷或糖修飾之核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為DNA核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為糖修飾之核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中該糖修飾之核苷係2'糖修飾之核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中該2'糖修飾之核苷為2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中該2'糖修飾之核苷為LNA核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中LNA核苷均為β-D-氧基LNA；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中該2'糖修飾之核苷為2'-烷氧基烷氧基-RNA；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中2'-烷氧基-RNA為2'-甲氧基-RNA；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中2'-烷氧基烷氧基-RNA為2'-甲氧基乙氧基-RNA；
一種根據本發明之寡核苷酸，其包含1與15個之間，特別係1與5之間，更特別係特別係1、2、3、4或5個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之寡核苷酸，其包含其他核苷間連結，該等核苷間連結獨立地選自磷酸二酯核苷間連結、硫代磷酸酯核苷間連結及如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中其他核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結及如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
一種根據本發明之寡核苷酸，其中其他核苷間連結均為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中其他核苷間連結均為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸為間隙子，特別係LNA間隙子、混合翼形間隙子、交替側接間隙子、剪接切換寡聚物、混合子或總子；
一種根據本發明之寡核苷酸，其為間隙子且其中至少一個式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結包含於間隙區中及/或間隙子之一或多個側接區中；
一種根據本發明之連續核苷酸序列(諸如間隙子區F-G-F')由側接區D'或D''或D'及D''側接之寡核苷酸，其包含經由磷酸二酯核苷間連結連接至寡核苷酸的其餘部分之一或多個DNA核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其為間隙子，其中側接區F及F'中之一者或兩者，尤其一者由磷酸二酯連接之DNA核苷，特別係1至5個磷酸二酯連接之DNA核苷(區D'及D'')進一步側接；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸長度為7至30個核苷酸。
當本發明之寡核苷酸係間隙子時，長度為12至26個核苷酸係有利地。16個核苷酸對於間隙子寡核苷酸長度係特別有利的。
當寡核苷酸為完整的LNA寡核苷酸時，長度為7至10個核苷酸係有利地。
當寡核苷酸係混合子寡核苷酸時，長度為8至30個核苷酸係有利地。
本發明尤其係關於：
一種根據本發明之寡核苷酸，其中一或多個核苷為核鹼基修飾之核苷；
一種根據本發明之寡核苷酸，其中寡核苷酸為反義寡核苷酸、siRNA、微RNA模擬物或核糖核酸酶(ribozyme)；
一種根據本發明之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽；
一種共軛物，其包含根據本發明之寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由 連接子部共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽；
一種醫藥組合物，其包含根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑；
一種根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質；及
一種根據本發明之寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物之用途，其用作藥物。
在一些實施例中，相較於對應的完全硫代磷酸酯連結之寡核苷酸，本發明之寡核苷酸在調節其靶標核酸方面具有較高活性。在一些實施例中，本發明提供具有增強活性、增強效力、增強特定活性或增強細胞吸收之寡核苷酸。在一些實施例中，本發明提供具有改變活體外或活體內作用持續時間，諸如延長活體外或活體內作用持續時間之寡核苷酸。在一些實施例中，在活體外或活體內在表現靶標核酸之細胞中測得調節靶標核酸之較高活性。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸具有改變的藥理學性質，諸如減少毒性，例如減少腎毒性、減少肝毒性或減少免疫刺激。肝毒性可例如在活體內或藉由使用揭示於WO 2017/067970中之活體外分析 (以引用之方式併入本文中)測定。腎毒性可例如在活體外或藉由使用揭示於PCT/EP2017/064770中之分析(以引用之方式併入本文中)測定。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸包含5' CG 3'二核苷酸，諸如DNA 5' CG 3'二核苷酸，其中C與G之間的核苷間連結為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸具有改良之核酸酶抗性，諸如改良之血清中生物穩定性。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸之3'端核苷具有A或G鹼基，諸如3'端LNA-A或LNA-G核苷。適當地，該寡核苷酸之兩個3'最末核苷之間的核苷間連結可為如上文所定義之根據式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
在一些實施例中，本發明之寡核苷酸具有增強的生物可用性。在一些實施例中，本發明之寡核苷酸具有較大血液暴露，諸如在血液中滯留時間較長。
非橋接之二硫代磷酸酯修飾係藉由使用亞磷醯胺方法之固相合成引入寡核苷酸中。使用裝配有通用連接子之受控孔徑玻璃(CPG) 作為支撐物執行合成。在此固體支撐物上，寡核苷酸通常以3'至5'方向藉由5'O-DMT保護之核苷亞磷醯胺建構嵌段之偶合，隨後(硫基)氧化、封端及DMT基團去保護組成之連續循環建構。非橋接二硫代磷酸酯之引入係使用適當的硫代亞磷醯胺建構嵌段，隨後一級中間物之硫氧化達成。
雖然相應DNA硫代亞磷醯胺可商購，但各別LNA建構嵌段之前尚未經描述。其可由5'-O-DMT保護之核苷3'-醇，例如藉由與單苯甲醯基保護之乙二硫醇及三吡咯烷-1-基磷反應來製備。
因此，根據本發明之寡核苷酸可例如根據流程2製造，其中R1 、R2a 、R2b 、R4a 、R4b 、R5 、Rx 、Ry 及V如下文所定義。
流程 2

因此，本發明亦係關於一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，其包含以下步驟：
(a) 使硫代亞磷醯胺核苷偶合至核苷酸或寡核苷酸之該末端5'氧原子，以產生硫代亞磷酸三酯中間物；
(b) 硫氧化步驟(a)中所獲得之硫代亞磷酸三酯中間物；及
(c) 視情況進一步延長該寡核苷酸。
本發明係關於(尤其係關於)一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，其包含以下步驟：
(a1) 使式(A)化合物偶合
(A)
至式(B)之核苷酸或寡核苷酸之5'氧原子
(B)；
(b1) 硫氧化步驟(a1)中所獲得之硫代亞磷酸三酯中間物；及
(c1) 視情況進一步延長寡核苷酸；
其中
R2a 及R4a 一起形成如上文所定義之-X-Y-；或
R4a 為 氫且R2a 選自：烷氧基，特別係甲氧基；鹵素，特別係氟；烷氧基烷氧基，特別係甲氧基乙氧基；烯基氧基，特別係烯丙氧基；及胺基烷氧基，特別係胺基乙氧基；
R2b 及R4b 一起形成如上文所定義之-X-Y-；或
R2b 及R4b 兩者同時為氫；或
R4b 為 氫且R2b 選自：烷氧基，特別係甲氧基；鹵素，特別係氟；烷氧基烷氧基，特別係甲氧基乙氧基；烯基氧基，特別係烯丙氧基；及胺基烷氧基，特別係胺基乙氧基；
V為 氧或硫；及
其中R5 、Rx 、Ry 及Nu如下文所定義。
本發明係關於(尤其係關於)一種用於製造根據本發明之寡核苷酸之方法，其包含以下步驟：
(a2) 使式(II)化合物偶合
(A1)
至式(IV)之核苷酸或寡核苷酸之5'氧原子
(B1)；
(b2) 硫氧化步驟(a2)中所獲得之硫代亞磷酸三酯中間物；及
(c2) 視情況進一步延長寡核苷酸；
其中
R2b 及R4b 一起形成如上文所定義之-X-Y-；或
R2b 及R4b 兩者同時為氫；或
R4b 為 氫且R2b 選自：烷氧基，特別係甲氧基；鹵素，特別係氟；烷氧基烷氧基，特別係甲氧基乙氧基；烯基氧基，特別係烯丙氧基；及胺基烷氧基，特別係胺基乙氧基；及
其中R5 、Rx 、Ry 及Nu如下文所定義。
本發明亦係關於一種根據本發明之方法製造之寡核苷酸。
本發明進一步係關於：
一種間隙子寡核苷酸，其包含至少一個式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結
(I)
其中R為氫或磷酸酯保護基；
一種如上文所定義之間隙子寡核苷酸，其中寡核苷酸為能夠調節表現該靶標RNA之細胞中的靶標RNA之表現之反義寡核苷酸；
一種如上文所定義之間隙子寡核苷酸，其中寡核苷酸為能夠抑制表現該靶標RNA之細胞中的靶標RNA之表現之反義寡核苷酸；
一種如上文所定義之間隙子寡核苷酸，其能夠募集RNase H，諸如人類RNase H1；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中該至少一個式(I)之核苷間連結之兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一核苷(A2)之5'碳原子，其中兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者係2'糖修飾之核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為2'糖修飾之核苷且另一者為DNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者同時為2'修飾之核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )兩者同時為DNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含式5'-F-G-F'-3'之連續核苷酸序列，其中G係能夠募集RNase H之5至18個核苷之區，且該區G分別藉由側接區F及F'來側接5'及3'，其中區F及F'獨立地包含或由1至7個2'糖修飾之核苷酸組成，其中鄰近於區G之區F之核苷係2'糖修飾之核苷，且其中鄰近於區G之區F'之核苷為2'糖修飾之核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中2'糖修飾之核苷獨立地選自2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA及LNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中2'-烷氧基烷氧基-RNA為2'-甲氧基乙氧基-RNA (2'-O-MOE)；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F及區F'包含或由2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷酸組成；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F及F'兩者均由2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷酸組成，諸如包含式[MOE]3-8 [DNA]8-16 [MOE]3-8 之F-G-F'，例如[MOE]5 [DNA]10 [MOE]5 之間隙子-亦即其中區F及F'各自由五個2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷酸組成，且區G由10個DNA核苷酸組成；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'或區F及F'兩者中之2'糖修飾之核苷中之至少一者或所有為LNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'或區F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個DNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'或區F及F'兩者包含至少一個LNA核苷及至少一個非LNA之2'糖修飾之核苷，諸如至少一個2'-甲氧基乙氧基-RNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙區包含5至16個，特別係8至16個，更特別係8、9、10、11、12、13或14個連續DNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F及區F'長度獨立地為1、2、3、4、5、6、7或8個核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F及區F'各自獨立地包含1、2、3或4個LNA核苷；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中LNA核苷為β-D-氧基LNA；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中寡核苷酸或其連續核苷酸序列(F-G-F')長度為10至30個核苷酸，特別係長度為12至22個，更特別係長度為14至20個寡核苷酸；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含式5'-D'-F-G-F'-D''-3'之連續核苷酸序列，其中F、G及F'如技術方案4至17中之任一項中所定義，且其中區D'及D''各自獨立地由0至5個核苷酸，特別係2、3或4個核苷酸，特別係DNA核苷酸，諸如磷酸二酯連接之DNA核苷組成；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸能夠募集人類RNase H1；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中該至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F或區F'中之相鄰核苷之間，位於區F與區G之間或位於區G與區F'之間；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其進一步包含硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結及如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中G區之核苷之間的核苷間連結包含如上文所定義之式(I)之0、1、2或3個二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中其餘核苷間連結獨立地選自由以下組成之群：硫代磷酸酯、磷酸二酯及如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F之核苷之間的核苷間連結及區F'之核苷之間的核苷間連結獨立地選自：硫代磷酸酯及如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中各側接區F及F'獨立地包含1、2、3、4、5、6或7個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中側接區F及F'一起或獨立地包含1、2、3、4、5或6個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，或區F及/或區F'中之所有核苷間連結係如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中側接區F及F'一起包含1、2、3或4個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中側接區F及F'各自包含2個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中側接區F及/或F'之所有核苷間連結為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙子寡核苷酸包含至少一個立體限定之核苷間連結，諸如至少一個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙區包含1、2、3、4或5個立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中間隙區之核苷之間的所有核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F之核苷之間、或位於區F'之核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'內、區F與區G之間及區G與區F'之間的其餘核苷間連結獨立地選自立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結、立體無規之核苷間連結、式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結及磷酸二酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F之至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F'之兩個相鄰核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'之核苷酸之間的其餘核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結、式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結及磷酸二酯核苷連接。區F及F'之硫代磷酸酯核苷間連結可為立體無規或立體限定，或可獨立地選自立體無規及立體限定；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F之至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F'之至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'之核苷酸之間的其餘核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結及式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結。區F及F'之硫代磷酸酯核苷間連結可為立體無規或立體限定，或可獨立地選自立體無規及立體限定；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F的至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F'的至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'之核苷酸之間、區F與區G之間及區G與區F'之間的其餘核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結及式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；區F及F'之硫代磷酸酯核苷間連結可為立體無規或立體限定，或可獨立地選自立體無規及立體限定；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F的至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F'的至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'之核苷酸之間及區F與區G之間及區G與區F'之間的其餘核苷間連結獨立地選自立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結及式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結位於區F的至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F'的至少兩個相鄰核苷之間、或位於區F與區G之間、或位於區G與區F'之間，且區F及F'內、區F與區G之間及區G與區F'之間的其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，其皆可為立體無規之硫代磷酸酯核苷間連結、立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，或可獨立地選自立體無規及立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F內、區F'內或區F及區F'兩者內之其餘核苷間連結均為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結獨立地選自立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結及立體無規之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結中之至少一者或區G內之所有其餘核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，諸如立體無規之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或F'中之至少一者包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之所有核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，諸如立體無規之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或F'中之至少一者包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之所有核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，其中區G內之硫代磷酸酯核苷間連結中之至少一者為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或F'中之至少一者包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之所有核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F與G之間的核苷間連結、或區G與F'之間的核苷間連結、或區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結均為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中在區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結中之僅一者為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之情況下，區F與G之間或區G與F'之間的另一核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或F'中之至少一者包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，其中區F與G之間的核苷間連結、或區G與F'之間的核苷間連結、或區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結均為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中在區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結中之僅一者為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之情況下，區F與G之間或區G與F'之間的另一核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，其中區F與G之間的核苷間連結、或區G與F'之間的核苷間連結、或區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結均為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中在區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結中之僅一者為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之情況下，區F與G之間或區G與F'之間的另一核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或F'中之至少一者包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，其中區G之核苷之間的核苷間連結包含0、1、2或3個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，其中區F與G之間的核苷間連結、或區G與F'之間的核苷間連結、或區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結均為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且其中在區F與G之間及區G與F'之間的核苷間連結中之僅一者為如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之情況下，區F與G之間或區G與F'之間的另一核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，或其中區F與區G之間、或區G與區F'之間的核苷間連結包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，區G包含1、2或3個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，或其中區F與區G之間、或區G與區F'之間的核苷間連結包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，區G內之所有核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，且其中區G內之硫代磷酸酯核苷間連結中之至少一者為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或區F'包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，或其中區F與區G之間、或區G與區F'之間的核苷間連結包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，區G內之所有核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結，且其中區G內之所有硫代磷酸酯核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中除至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之外，間隙子區F-G-F'內之所有其餘核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中區F或F'中之至少一者包含至少一個如上文所定義之式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結，且區G內之所有核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其中除至少一個式(I)之二硫代磷酸酯核苷間連結之外，間隙子區F-G-F'內之所有其餘核苷間連結為立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸，其係LNA間隙子、混合翼形間隙子、交替側接間隙子或間隙阻斷間隙子。
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸的醫藥學上可接受之鹽，特別係鈉鹽或鉀鹽；
一種共軛物，其包含根據本發明之間隙子寡核苷酸或醫藥學上可接受之鹽及視情況經由 連接子部分，特別係經由 生物可裂解連接子，尤其經由 2至4個磷酸二酯連接之DNA核苷(例如，區D'或D'')共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽的至少一個共軛物部分；
一種醫藥組合物，其包含根據本發明之間隙子寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物及治療上惰性載劑；
一種根據本發明之間隙子寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物，其用作治療上活性物質；
一種間隙子寡核苷酸、醫藥學上可接受之鹽或共軛物之用途，其用作藥物；
一種調節細胞中之靶標RNA的表現之方法，其包含將根據本發明之寡核苷酸或間隙子寡核苷酸投與至表現該靶標RNA之細胞，以便調節該靶標RNA之表現；
一種抑制細胞中之靶標RNA的表現之方法，該方法包含將根據本發明之寡核苷酸或間隙子寡核苷酸投與至表現該靶標RNA之細胞，以便抑制該靶標RNA之表現；及
一種調節或抑制細胞中之靶標RNA之活體外方法，該方法包含將根據本發明之寡核苷酸或間隙子寡核苷酸投與至表現該靶標RNA之細胞，以便調節或抑制該細胞中之該靶標RNA。
靶標RNA可例如係哺乳動物mRNA (諸如前mRNA或成熟mRNA)、人類mRNA、病毒RNA或非編碼RNA，諸如微RNA或長非編碼RNA。
在一些實施例中，調節係導致靶標前mRNA之剪接模式變化的前mRNA之剪接調節。
在一些實施例中，調節係可經由靶標降解(例如，經由RNase H (諸如RNase H1或RISC)之募集)發生之抑制，或係可經由抑制靶標RNA (例如，微RNA之混合子或總子抑制或長非編碼RNA)之正常生物功能之佔用介導機制發生的抑制。
人類mRNA可為成熟RNA或前mRNA。
本發明亦進一步係關於式(II)化合物
(II)
其中
X為氧、硫、-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(=CRa Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-O-NRa -、-NRa -O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -；
Y為 氧、硫、-(CRa Rb )n -、-CRa Rb -O-CRa Rb -、-C(Ra )=C(Rb )-、-C(Ra )=N-、-Si(Ra )2 -、-SO2 -、-NRa -、-C(=J)-、Se、-O-NRa -、-NRa -CRa Rb -、-N(Ra )-O-或-O-CRa Rb -；
其限制條件為-X-Y-非-O-O-、Si(Ra )2 -Si(Ra )2 -、-SO2 -SO2 -、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=N-C(Ra )=N-、-C(Ra )=N-C(Ra )=C(Rb )、-C(Ra )=C(Rb )-C(Ra )=N-或-Se-Se-；
J為 氧、硫、=CH2 或=N(Ra )；
Ra 及Rb 獨立地選自氫、鹵素、羥基、氰基、硫羥基、烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、烷氧基、經取代之烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、芳基、雜環基、胺基、烷基胺基、胺甲醯基、烷基胺基羰基、胺基烷基胺基羰基、烷基胺基烷基胺基羰基、烷基羰基胺基、胺甲醯胺基、烷醯基氧基、磺醯基、烷基磺醯氧基、硝基、疊氮基、硫代羥基硫醚烷基硫烷基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、雜芳基、雜芳氧基羰基、雜芳氧基、雜芳基羰基、-OC(=Xa )Rc 、-OC(=Xa )NRc Rd 及-NRe C(=Xa )NRc Rd ；
或兩個成對的Ra 及Rb 一起形成視情況經取代之亞甲基；
或兩個成對的Ra 及Rb 連同其所連接之碳原子一起形成具有僅-X-Y-之一個碳原子的環烷基或鹵環烷基；
其中經取代之烷基、經取代之烯基、經取代之炔基、經取代之烷氧基及經取代之亞甲基為經1至3個取代基取代的烷基、烯基、炔基及亞甲基，該等取代基獨立地選自：鹵素、羥基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷氧基烷基、烯基氧基、羧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、雜環基、芳基及雜芳基；
Xa 為 氧、硫、或-NRc ；
Rc 、Rd 及Re 獨立地選自氫及烷基；
N為 1、2或3。
R5 為 羥基保護基；
Rx 為 苯基、硝苯基、苯基烷基、鹵代苯基烷基、氰基烷基、苯基羰基硫基烷基、鹵代苯基羰基硫基烷基、烷基羰基硫基烷基或烷基羰基羰基硫基烷基；
Ry 為 二烷胺基或吡咯啶基；及
Nu係核鹼基或受保護之核鹼基。
本發明進一步係關於：
一種式(II)化合物，其中-X-Y-為-CH2 -O-、-CH(CH3 )-O-或-CH2 CH2 -O-；
本發明進一步提供一種式(IIb)化合物
(IIb)
其中R5 為羥基保護基，
Rx 為苯基、硝苯基、苯基烷基、鹵代苯基烷基、氰基烷基、苯基羰基硫基烷基、鹵代苯基羰基硫基烷基、烷基羰基硫基烷基或烷基羰基羰基硫基烷基；
Ry 為 二烷胺基或吡咯啶基；及
Nu為核鹼基或受保護之核鹼基；
一種式(II)化合物，其具有式(III)或(IV)
(III)；(IV)；
其中R5 、Rx 、Ry 及Nu如上；
一種式(II)、(IIb)、(III)或(IV)化合物，其中Rx 為苯基、硝苯基、苯基甲基、二氯苯基甲基、氰基乙基、甲基羰基硫基乙基、乙基羰基硫基乙基、第三丁基羰基硫基乙基、甲基羰基羰基硫基乙基或二氟苯基羰基硫基乙基；
一種式(II)、(IIb)、(III)或(IV)化合物，其中Rx 為苯基、4-硝基苯基、2,4-二氯苯基甲基、氰基乙基、甲基羰基硫基乙基、乙基羰基硫基乙基、異丙基羰基硫基乙基、第三丁基羰基硫基乙基、甲基羰基羰基硫基乙基或2,4-二氟苯基羰基硫基乙基；
一種式(II)、(IIb)、(III)或(IV)化合物，其中Rx 為苯基羰基硫基甲基；
一種式(II)、(IIb)、(III)或(IV)化合物，其中Rx 為苯基羰基硫基乙基；
一種式(II)、(IIb)、(III)或(IV)化合物，其中Ry 為二異丙胺基或吡咯啶基；
一種式(II)、(IIb)、(III)或(IV)化合物，其中Ry 為吡咯啶基；
一種式(II)化合物，其具有式(V)
(V)
其中R5 及Nu如上文所定義；
一種式(IIb)化合物，其具有式(Vb)
(Vb)
其中R5 及Nu如上文所定義；
一種式(II)、(IIb)、(III)、(IV)或(V)或(Vb)化合物，其中Nu為胸(腺)嘧啶、受保護之胸(腺)嘧啶、腺苷、受保護之腺苷、胞嘧啶、受保護之胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保護之5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、受保護之鳥嘌呤、尿嘧啶基或受保護之尿嘧啶基；
一種式(IIb)化合物，其中Nu為胸(腺)嘧啶、受保護之胸(腺)嘧啶、腺苷、受保護之腺苷、胞嘧啶、受保護之胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保護之5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、受保護之鳥嘌呤、尿嘧啶基或受保護之尿嘧啶基；
一種式(Vb)化合物，其中Nu為胸(腺)嘧啶、受保護之胸(腺)嘧啶、腺苷、受保護之腺苷、胞嘧啶、受保護之胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保護之5-甲基胞嘧啶、鳥嘌呤、受保護之鳥嘌呤、尿嘧啶基或受保護之尿嘧啶基；
一種式(II)化合物，其選自以下：

。
一種式(IIb)化合物，其選自以下：

。
式(II)及(IIb)化合物中之雜質的存在在製造寡核苷酸期間產生副產物且妨礙合成之成效。另外，在雜質存在之情況下，式(II)或(IIb)化合物在儲存時不穩定。
其中，式(X1)、(X2)、X(11)及(X21)之化合物
(X1)、(X2)、
(X11)、(X21)；
為此類雜質之實例。
因此，需要足夠純形式之式(II)或(IIb)化合物用於儲存及寡核苷酸製造目的。
因此，本發明亦係關於一種式(II)、(IIb)之化合物，其具有至少98%，尤其99%，更特別係100%之純度。
因此，本發明係關於(尤其係關於)一種式(II)化合物，其包含小於1%，尤其0%之作為雜質的式(X1)化合物及/或式(X2)化合物。
本發明進一步係關於一種用於製造如上文所定義之式(II)化合物之方法，其包含在酸性偶合劑及矽烷化試劑存在下，使5'保護之LNA核苷與膦及單保護之二硫醇反應。
本發明進一步係關於一種用於製造如上文所定義之式(IIb)化合物之方法，其包含在酸性偶合劑及矽烷化試劑存在下，使5'保護之MOE核苷與膦及單保護之二硫醇反應。
本發明係關於一種用於製造式(II)化合物之方法，其包含在酸性偶合劑及矽烷化試劑存在下，使式(C)化合物
(C)
與式P(Ry )3 化合物及式HSRx 化合物反應，其中X、Y、R5 、Nu、Rx 及Ry 如上文所定義。
本發明進一步係關於一種用於製造式(II)化合物之方法，其包含在酸性偶合劑及矽烷化試劑存在下，使式(C1)化合物
(C1)
與式P(Ry )3 化合物及式HSRx 化合物反應，其中R5 、Nu、Rx 及Ry 如上文所定義。
本發明亦係關於一種用於製造式(IIb)化合物之方法，其包含在酸性偶合劑及矽烷化試劑存在下，使式(Cb)化合物
(Cb)
與式P(Ry )3 化合物及式HSRx 化合物反應，其中R5 、Nu、Rx 及Ry 如上文所定義。
酸性偶合劑(亦被稱作酸性活化劑)之實例為基於唑之活化劑，如四唑、5-硝苯基-1H-四唑(NPT)、5-乙硫基-1H-四唑(ETT)、5-苯甲硫基-1H-四唑(BTT)、5-甲硫基-1H-四唑(MTT)、5-氫硫基-四唑(MCT)、5-(3,5-雙(三氟甲基)苯基)-1H-四唑及4,5-二氰基咪唑(DCI)；或酸式鹽，如吡啶鎓鹽酸鹽、咪唑鎓三氟甲磺酸鹽、苯并咪唑鎓三氟甲磺酸鹽、5-硝基苯咪唑鎓三氟甲磺酸鹽；或弱酸，諸如2,4-二硝基苯甲酸或2,4-二硝基酚。四唑為特定酸式偶合劑。
矽烷化藥劑(亦被稱作羥基)之實例為雙(二甲胺基)二甲基矽烷、N,O-雙(三甲基矽烷基)乙醯胺(BSA)、N,O-雙(三甲基矽烷基)胺基甲酸鹽(BSC)、N,N-雙(三甲基矽烷基)甲胺、N,O-雙(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(BSTFA)、N,N'-雙(三甲基矽烷基)脲(BSU)、溴三甲基矽烷(TMBS)、N-第三丁基二甲基矽烷基-N-甲基三氟乙醯胺(MTBSTFA)、氯二甲基(五氟苯基)矽烷、三乙基氯矽烷(TESCI)、氯三甲基矽烷(TMCS)、1,3-二甲基-1,1,3,3-四苯基二矽氮烷(TPDMDS)、N,N-二甲基三甲基矽烷胺(TMSDMA)、六甲基二矽氮烷(HMDS)、六甲基二矽氧烷(HMDSO)、N-甲基-N-三甲基矽烷乙醯胺(MSA)、N-甲基-N-三甲基矽烷七氟丁醯胺(MSHFA)、N-甲基-N-(三甲基矽烷基)三氟乙醯胺(MSTFA)、1,1,3,3-四甲基-1,3-二苯基二矽氮烷(DPTMDS)、4-(三甲基矽烷氧基)-3-戊烯-2-酮(TMS acac)、1-(三甲基矽烷基)咪唑(TMSI)或三甲基矽烷基-甲基烯丙基亞磺酸鹽(SILMAS-TMS)。1-(三甲基矽烷基)咪唑為特定矽烷化試劑。
本發明進一步係關於一種用於製造式(II)、(IIb)或(III)之化合物之方法，其中式(II)或(IIb)之粗化合物藉由製備型HPLC純化。
本發明進一步係關於一種用於製造式(II)、(IIb)或(III)之化合物之方法，其中式(II)、(IIb)或(III)之粗化合物藉由製備型HPLC且用乙腈對比氫氧化銨於水中之梯度溶離來純化。
水中氫氧化銨之含量為尤其至少大約0.05% v/v，特別係在大約0.05% v/v與1% v/v之間，更特別係在大約0.05% v/v與0.5% v/v之間，更特別係大約0.05% v/v。
乙腈之梯度尤其在0%與25%的乙腈之間至75%與100%的乙腈之間，特別係在20 min至120 min內；更特別係在10%與20%的乙腈之間至75%與90%的乙腈之間，特別係在25 min至60 min內；更特別係大約25%至75%的乙腈，特別係在30 min內。
本發明亦係關於式(II)、(IIb)或(III)之化合物在製造寡核苷酸，特別係根據本發明之寡核苷酸或間隙子寡核苷酸中之用途。
現將藉由以下不具有限制性質之實例來說明本發明。
實例
實例 1 ：單體合成
1.1 ： 苯硫代甲酸 S-(2- 硫基乙基 ) 酯
向1,2-乙二硫醇(133.57 mL，1592 mmol，1 eq)及吡啶(64.4 mL，796 mmol，0.5 eq)於氯仿(200 mL)中之溶液中逐滴添加含苯甲醯氯(92.4 mL，796 mmol，0.5 eq)之氯仿(200 mL)保持1小時，且在0℃下攪拌反應物1小時。用水(300 mL)及鹽水(300 mL)洗滌混合物。有機相經Na2 SO4 乾燥且濃縮至黃色油狀物。蒸餾(135至145℃)油狀物以獲得呈無色油狀物之苯硫代甲酸S-(2-硫基乙基)酯(40 g，202 mmol，13%產率)。1 H NMR (400 MHz, CDCl3 ) δ 7.97 (d,J =7.34 Hz, 2H), 7.53-7.64 (m, 1H), 7.47 (t,J =7.58 Hz, 2H), 3.31 (t,J =7.34 Hz, 2H), 2.77-2.86 (m, 2H), 1.70 (t,J =8.56 Hz, 1H)。
1.2 ： 苯硫代甲酸 S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基 - 甲氧基 ] 甲基 ]-3-(5- 甲基 -2,4- 二側氧基 - 嘧啶 -1- 基 )-2,5- 二氧雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 - 吡咯啶 -1- 基 - 磷烷基 ] 硫基乙基 ] 酯
將1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雙環[2.2.1]庚-6-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(2.29 g，4.00 mmol，1.0 eq)溶解於其中添加有一刮刀(spatula)之3Å分子篩之60 mL無水二氯甲烷中。經由注射器添加三吡咯烷-1-基膦(960 mg，3.98 mmol，0.99 eq)，隨後以2 min時間間隔添加七個0.1 mmol等分試樣之四唑(儲存於3Å分子篩上的7*0.4 mL 0.5 M無水乙腈溶液)。接著添將N-三甲基矽烷基咪唑(56.0 mg，0.400 mmol，0.1 eq)添加至反應物中。5 min之後，添加四唑(21.6 mL 0.5 M無水乙腈溶液)，緊接著添加苯硫代甲酸S-(2-硫基乙基)酯(1.04 g，5.24 mmol，1.31 eq)。使反應進行120 sec。將四個相同批次的反應結合，且藉由將溶液傾倒至含有40 mL三乙胺之600 mL二氯甲烷中來淬滅。緊接著用飽和碳酸氫鈉(800 mL)，隨後10%碳酸鈉(2 * 800 mL)及鹽水(800 mL)洗滌混合物。有機層經Na2 SO4 乾燥。10至15 min之後，藉由過濾移除乾燥劑。將三乙胺(40 mL)添加至使用旋轉蒸發器濃縮至糊漿之溶液中。將糊漿溶解於甲苯(200 mL)及三乙胺(40 mL)中，且將此溶液吸移至4500 mL劇烈攪拌之庚烷中，以使蓬鬆白色產物沈澱。在傾析出大部分庚烷之後，藉由經由中等燒結玻璃漏斗過濾收集白色沈澱物且隨後在真空下乾燥，以獲得白色固體。固體藉由製備型HPLC (Phenomenex Gemini C18，250×50mm，10 mm管柱，含0.05%氫氧化銨之水/CH3 CN)純化且凍乾，以獲得4.58 g呈白色固體之目標化合物。31 P NMR (162 MHz, CD3 CN) δ 167.6, 164.2。1 H NMR (400 MHz, CD3 CN) δ 9.16 (br s, 1H), 7.93 (t,J =7.41 Hz, 2H), 7.60-7.71 (m, 1H), 7.45-7.57 (m, 4H), 7.24-7.45 (m, 7H), 6.90 (d,J =8.93 Hz, 4H), 5.53-5.63 (m, 1H), 4.41-4.64 (m, 2H), 3.74-3.88 (m, 8H), 3.39-3.63 (m, 2H), 3.03-3.32 (m, 5H), 2.77-2.94 (m, 2H), 1.66-1.84 (m, 4H), 1.54-1.66 (m, 3H)。
1.3 ： 苯硫代甲酸 S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(6- 苯甲醯胺基嘌呤 -9- 基 )-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基 - 甲氧基 ] 甲基 ]-2,5- 二氧雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 - 吡咯啶 -1- 基 - 磷烷基 ] 硫基乙基 ] 酯
將N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雙環[2.2.1]庚-6-基]嘌呤-6-基]苯甲醯胺(2.74 g，4.00 mmol，1.0 eq)溶解於其中添加有一刮刀之3 Å分子篩之60 mL無水二氯甲烷中。經由注射器添加三吡咯烷-1-基膦(960 mg，3.98 mmol，0.99 eq)，隨後以2 min時間間隔添加七個0.1 mmol等分試樣之四唑(儲存於3Å分子篩上的7*0.4 mL 0.5 M無水乙腈溶液)。接著將1-(三甲基矽烷基)-1H-咪唑(56.0 mg，0.400 mmol，0.1 eq)添加至反應物中。5 min之後，添加四唑(21.6 mL 0.5 M無水乙腈溶液)，緊接著添加苯硫代甲酸S-(2-硫基乙基)酯(1.04 g，5.24 mmol，1.31 eq)。使反應進行120 s。
將四個相同批次的反應結合，且藉由將溶液傾倒至含有40 mL三乙胺之600 mL二氯甲烷中來淬滅。緊接著用飽和碳酸氫鈉(800 mL)，隨後10%碳酸鈉(2 * 800 mL)及鹽水(800 mL)洗滌混合物。有機層經Na2 SO4 乾燥。10至15 min之後，藉由過濾移除乾燥劑。將三乙胺(10 mL)添加至使用旋轉蒸發器濃縮至糊漿之溶液中。將糊漿溶解於甲苯(100 mL)及三乙胺(20 mL)中，且將此溶液吸移至4500 mL劇烈攪拌之庚烷中，以使蓬鬆白色產物沈澱。在傾析出大部分庚烷之後，藉由經由中等燒結玻璃漏斗過濾收集白色沈澱物且隨後在真空下乾燥，以獲得白色固體。固體藉由製備型HPLC (Phenomenex Gemini C18，250×50mm，10 mm管柱，含0.05%氫氧化銨之水/CH3 CN)純化且凍乾，以獲得5.26 g呈白色固體之目標化合物。31 P NMR (162 MHz, CD3 CN) d 165.6, 164.7。1 H NMR (400 MHz, CD3 CN) δ 8.56 (d,J =10.76 Hz, 1H), 8.24 (d,J =10.27 Hz, 1H), 7.82-7.93 (m, 2H), 7.71-7.80 (m, 2H), 6.92-7.54 (m, 14H), 6.68-6.83 (m, 4H), 6.03 (d,J =6.48 Hz, 1H), 4.70-4.90 (m, 2H), 3.81-3.98 (m, 2H), 3.59-3.68 (m, 7H), 3.25-3.47 (m, 2H), 2.81-3.02 (m, 6H), 2.56-2.81 (m, 2H), 1.44-1.72 (m, 4H)。
1.4 ： 苯硫代甲酸 S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(4- 苯甲醯胺基 -5- 甲基 -2- 側氧基 - 嘧啶 -1- 基 )-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基 - 甲氧基 ] 甲基 ]-2,5- 二氧雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 - 吡咯啶 -1- 基 - 磷烷基 ] 硫基乙基 ] 酯
將N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雙環[2.2.1]庚-6-基]-5-甲基-2-側氧基-嘧啶-4-基]苯甲醯胺(2.70 g，4.00 mmol，1.0 eq)溶解於其中添加有一刮刀之3 Å分子篩之60 mL無水二氯甲烷中。經由注射器添加三吡咯烷-1-基膦(965 mg，4.00 mmol，1.0 eq)，隨後以2 min時間間隔添加七個0.1 mmol等分試樣之四唑(儲存於3 Å分子篩上的7*0.4 mL 0.5 M無水乙腈溶液)。接著將1-(三甲基矽烷基)-1H-咪唑(56.0 mg，0.400 mmol，0.1 eq)添加至反應物中。5 min之後，添加四唑(21.6 mL 0.5 M無水乙腈溶液)，緊接著添加苯硫代甲酸S-(2-硫基乙基)酯(1.04 g，5.24 mmol，1.31 eq)。使反應進行120 sec。將四個相同批次的反應淬滅，且藉由將溶液傾倒至含有40 mL三乙胺之600 mL二氯甲烷中進行結合。緊接著用飽和碳酸氫鈉(800 mL)，隨後10%碳酸鈉(2 * 800 mL)及鹽水(800 mL)洗滌混合物。有機層經Na2 SO4 乾燥。10至15 min之後，藉由過濾移除乾燥劑。將三乙胺(40 mL)添加至使用旋轉蒸發器濃縮至糊漿之溶液中。將糊漿溶解於甲苯(100 mL)及三乙胺(30 mL)中，且將此溶液吸移至4500 mL劇烈攪拌之庚烷中，以使蓬鬆白色產物沈澱。在傾析出大部分庚烷之後，藉由經由中等燒結玻璃漏斗過濾收集白色沈澱物且隨後在真空下乾燥，以獲得白色固體。固體藉由製備型HPLC (Phenomenex Gemini C18，250×50mm，10 mm管柱，含0.05%氫氧化銨之水/CH3 CN)純化且凍乾，以獲得2.05 g呈白色固體之目標化合物。31 P NMR (162 MHz, CD3 CN) δ 171.2, 167.4。1 H NMR (400 MHz, CD3 CN) δ 8.18-8.32 (m, 2H), 7.81-7.93 (m, 3H), 7.35-7.60 (m, 14H), 7.17-7.35 (m, 2H), 6.93 (d,J =8.93 Hz, 4H), 5.65 (d,J =15.04 Hz, 1H), 4.56-4.72 (m, 2H), 3.69-3.90 (m, 8H), 3.45-3.61 (m, 2H), 3.03-3.26 (m, 6H), 2.76-3.02 (m, 2H), 1.65-1.93 (m, 7H)。
1.5 ： 苯硫代甲酸 S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[ 雙 (4- 甲氧基苯基 )- 苯基 - 甲氧基 ] 甲基 ]-3-[2-[(E)- 二甲基胺基亞甲胺基 ]-6- 側氧基 -1H- 嘌呤 -9- 基 ]-2,5- 二氧雙環 [2.2.1] 庚 -7- 基 ] 氧基 - 吡咯啶 -1- 基 - 磷烷基 ] 硫基乙基 ] 酯
將N'-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[雙(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羥基-2,5-二氧雙環[2.2.1]庚-6-基]-6-側氧基-1H-嘌呤-2-基]-N,N-二甲基-甲脒(2.62 mg，4.00 mmol，1.0 eq)溶解於其中添加有一刮刀之3 Å分子篩之200 mL無水二氯甲烷中。經由注射器添加三吡咯烷-1-基膦(965 mg，4.00 mmol，1.0 eq)，隨後以2 min時間間隔添加七個0.1 mmol等分試樣之四唑(儲存於3 Å分子篩上的7*0.4 mL 0.5 M無水乙腈溶液)。接著將1-(三甲基矽烷基)-1H-咪唑(56.0 mg，0.400 mmol，0.1 eq)添加至反應物中。5 min之後，添加四唑(21.6 mL 0.5 M無水乙腈溶液)，緊接著添加苯硫代甲酸S-(2-硫基乙基)酯(1.04 g，5.24 mmol，1.31 eq)。使反應進行180s。
將四個相同的批次結合，且藉由將溶液傾倒至含有40 mL三乙胺之600 mL二氯甲烷中來淬滅。緊接著用飽和碳酸氫鈉(800 mL)，隨後10%碳酸鈉(2 * 800 mL)及鹽水(800 mL)洗滌混合物。有機層經Na2 SO4 乾燥。10至15 min之後，藉由過濾移除乾燥劑。將三乙胺(40 mL)添加至使用旋轉蒸發器濃縮至糊漿之溶液中。將糊漿溶解於甲苯(100 mL)及三乙胺(30 mL)中，且將此溶液吸移至4500 mL劇烈攪拌之庚烷中，以使蓬鬆白色產物沈澱。在傾析出大部分庚烷之後，藉由經由中等燒結玻璃漏斗過濾收集白色沈澱物且隨後在真空下乾燥，以獲得白色固體。固體藉由製備型HPLC (Phenomenex Gemini C18，250×50mm，10 mm管柱，含0.05%氫氧化銨之水/CH3 CN)純化且凍乾，以獲得3.82 g呈黃色固體之目標化合物。31 P NMR (162 MHz, CD3 CN) δ 167.1, 162.2。1 H NMR (400 MHz, CD3 CN) δ 9.36 (br s, 1H), 8.63 (d,J =16.51 Hz, 1H), 7.78-8.00 (m, 3H), 7.66 (t,J =7.62 Hz, 1H), 7.42-7.57 (m, 4H), 7.24-7.40 (m, 7H), 6.89 (d,J =8.68 Hz, 4H), 5.92-5.98 (m, 1H), 4.72-4.97 (m, 2H), 3.86-4.05 (m, 2H), 3.78 (2s, 6H), 3.27-3.70 (m, 3H), 2.87-3.20 (m, 12H), 2.67-2.82 (m, 2H), 1.54-1.79 (m, 4H)。
實例 2 ：寡核苷酸合成
寡核苷酸係使用之MerMade 12自動化DNA合成儀合成。合成係使用含有通用連接子之受控孔徑玻璃支撐物(500Å)以1 µmol規模進行。
在用於偶合DNA及LNA亞磷醯胺之標準循環步驟中，DMT去保護用含3% (w/v)三氯乙酸之CH2 Cl2 在三次200 µL應用中執行30 sec。將各別亞磷醯胺與100 µL 0.1 M乙腈溶液 (或用於LNA-Me C建構嵌段之乙腈/CH2 Cl2 1:1)及110 µL作為活化劑之含0.1 M 5-(3,5-雙(三氟甲基苯基))-1H-四唑溶液之乙腈偶合三次且偶合時間為180 sec。對於硫氧化，使用含0.1m 3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮溶液之乙腈/吡啶1:1 (3×190 µL，55 sec)。使用THF/二甲基吡啶/Ac2 O 8:1:1 (CapA，75 µmol)及THF/N-甲基咪唑8:2 (CapB，75 µmol)執行封端55 sec。
用於引入硫代亞磷醯胺之合成循環包括使用含3% (w/v)三氯乙酸之CH2 Cl2 在三次200 µL應用中進行DMT去保護30 sec。使可商購之DNA硫代亞磷醯胺或新製備的LNA硫代亞磷醯胺與作為活化劑之100 µL含0.15 M的10% (v/v) CH2 Cl2 溶液之乙腈及110 µL含0.1 M 5-(3,5-雙(三氟甲基苯基))-1H-四唑溶液之乙腈偶合三次，且各偶合時間為600 sec。使用含0.1 M 3-胺基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮溶液之乙腈/吡啶在三次應用中執行硫氧化55 sec。使用THF/二甲基吡啶/Ac2 O 8:1:1 (CapA，75 µmol)及THF/N-甲基咪唑8:2 (CapB，75 µmol)執行封端55 sec。
在完成自動合成後，自固體支撐物移除核鹼基保護基且裂解係在55℃下使用氨水(32%):含有20 mM DTT之乙醇(3:1，v:v)混合物執行15至16h。
寡核苷酸上的粗DMT使用固相萃取筒純化，且用離子交換層析法或藉由使用C18管柱之RP-HPLC純化來再純化，隨後用80%乙酸溶液及乙醇沈澱移除DMT。
在以下實例中，吾等使用以下硫基連接化學物質：
在以下實例中，除非另外規定，否則非對掌性二硫代磷酸酯連結(亦被稱作P2S)為非橋接之二硫代酸酯(如式(IA)或(IB)所說明)，且標記為*。實例中所使用之化合物包括具有以下核鹼基序列之化合物：
SEQ ID NO 1: GCATTGGTATTCA
SEQ ID NO 2: TCTCCCAGCGTGCGCCAT
SEQ ID NO 3: GAGTTACTTGCCAACT
SEQ ID NO 4: TATTTACCTGGTTGTT
SEQ ID NO 5: CAATCAGTCCTAG
已根據上述步驟製備以下分子。
*相鄰核苷酸之間的二硫代酸酯修飾
A、G、m C、T表示LNA核苷酸
a、g、c、t表示DNA核苷酸
所有其他連接經製備為硫代磷酸酯
實例 3 ：活體外功效及細胞吸收實驗
將原代大鼠肝細胞接種於96孔盤中且在含有10% FCS而不具有抗生素之威廉姆斯培養基E (Williams Medium E)中進行處理。在全細胞培養基中用所指示濃度之LNA溶液處理細胞。在分別培育24及72小時之後，細胞用含有Ca2+ 及Mg2+ 之PBS洗滌3次且用165 uL PureLink Pro裂解緩衝液裂解。根據製造商說明書使用來自Thermo Fisher之PureLink PRO 96 RNA套組分離總RNA，且使用具有RnApoB (Invitrogen)之引物探測組的光循環儀多重RNA病毒母體(Roche)執行RT-qPCR。將所獲得資料正規化為Ribogreen。
LNA寡核苷酸之胞內濃度係使用基於用於各種化合物之ELISA分析的雜交來測定。所有資料點以一式三份執行，且資料以其平均值給出。
結果展示於圖1至圖4中。
實例 4 ： 雜化成 RNA 及 DNA 之含有二硫代磷酸酯核苷間連結的寡核苷酸之熱熔點 (Tm)
已製備以下寡核苷酸。硫代磷酸酯連結由S下標指示；根據本發明之二硫代磷酸酯連結由PS2下標指示。
化合物1至6具有序列基元SEQ ID NO 1。
雜化成RNA及DNA之化合物1 至 6 的熱熔點(Tm)係根據以下步驟量測。
將等莫耳量之RNA或DNA及LNA寡核苷酸(1.5 µM)於緩衝液(100 mM NaCl，0.1 mM EDTA，10 mM Na2 HPO4 ，pH 7)中之溶液加熱至90℃持續1 min且接著使其冷卻至室溫。在260 nm處之UV吸光率使用Cary系列UV-Vis光譜光度計來記錄(加熱速率1℃/分鐘；每分鐘讀取一個速率)。針對溫度對吸光率進行作圖，且Tm值係藉由獲取每條曲線之一階導數來計算。
結果概括於下表及圖5中。
Td：解離(變性)溫度；Ta：締合(複性)溫度
根據本發明之化合物保留對對照之RNA及DNA的高親和力。
實例 5 ：含有硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸的血清穩定性
來自雄性Sprague-Dawling大鼠之血清中的寡核苷酸1 至 6 之穩定性係根據以下步驟量測。
在37℃下培育與核酸酶緩衝液(30 mM乙酸鈉，1 mM硫酸鋅，300 mM NaCl，pH 4、6) 3:1混合之含25 µM寡核苷酸溶液的大鼠血清0、5、25、52或74小時。注射樣本2 µL用於在裝配有水性BEH C18 ，1.7 µm管柱之水性UPLC上進行UPLC-MS分析。使用不同降解長度之擴展常數補償的在260 nm處量測之類似峰面積用以確定未裂解寡核苷酸之%。
UPLC溶離劑：A：2.5% MeOH，0.2 M HEP，16.3 mM TEA B：60% MeOH，0.2 M HEP，16.3 mM TEA
結果概括於圖6中。
具有至少一個根據本發明之二硫代磷酸酯核苷間連結之化合物比具有僅硫代磷酸酯核苷間連結之化合物具有優越的核酸酶抗性。
發現化合物1 至 6 中5小時之後所觀察到的初始寡核苷酸降解係由硫代單酯雜質之存在所引起。
實例 7 ： 二硫代酸酯修飾之間隙子 ： 探索 LNA 間隙子之間隙區中之二硫代酸酯。
所測試化合物
實驗 ： 使用自主吸收在原代大鼠肝細胞中測試之靶向ApoB mRNA的上述化合物培育72小時，化合物濃度為2 µM。接著使用RT-PCR量測靶標mRNA含量。結果顯示於圖7中。
展示於圖7中之結果說明單個及多個非對掌性二硫代磷酸酯均容納於間隙及側接區中。相比於在側接區中使用多個非對掌性二硫代磷酸酯，在間隙中使用大於3或4個非對掌性二硫代磷酸酯可傾向於降低效力。
實例 8 ： 對活動設計最佳化之位置依賴性
所測試化合物
實驗 ： 使用自主吸收在原代大鼠肝細胞中測試之靶向ApoB mRNA的上述化合物培育72小時，化合物濃度為2 µM。接著使用RT-PCR量測靶標mRNA含量。結果展示於圖8中。
實例 9 ： 非對掌性二硫代磷酸酯間隙子之細胞吸收
所測試化合物
化合物#1至#16及參考具有展示於SEQ ID NO 1中之序列基元。
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結
實驗 ： 使用自主吸收在原代大鼠肝細胞中測試之靶向ApoB mRNA的上述化合物培育72小時，化合物濃度為2 µM。寡核苷酸含量使用基於雜交之ELISA分析來測定。結果展示於圖9A及圖9B中。
毫無例外，非對掌性二硫代磷酸酯之包含提供了增強的細胞吸收。然而，視非對掌性二硫代磷酸酯連結之位置而定，吸收改良存在多樣性。
實例 10 ： 增加間隙子之側接區中之非對掌性二硫代磷酸酯負載量
所測試化合物(序列基元 = SEQ ID NO 1)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結
實驗 ： 使用自主吸收在原代大鼠肝細胞中測試之靶向ApoB mRNA的上述化合物培育72小時，化合物濃度為2 µM。接著使用RT-PCR量測靶標mRNA含量。結果展示於圖10A及圖10B中。
在間隙子之側接區中引入非對掌性二硫代磷酸酯修飾，無一例外地提供了效力之明顯增加，IC50降低3至7倍。引起關注地，側接中之對掌性二硫代磷酸酯修飾之數目的增加導致IC50降低。
實例11：活體外，非對掌性二硫代磷酸酯連結在不同細胞類型中之作用
所測試化合物(序列基元 = SEQ ID NO 3)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結
在三種活體外細胞系統：人類原代骨骼肌、人類原代支氣管上皮細胞及小鼠纖維母細胞(LTK細胞)中，使用自主吸收72小時，在濃度範圍內測試靶向Malat-1之上述化合物，以測定化合物效力(IC50)。
LTK細胞之濃度範圍：50 µM，½對數稀釋，8個濃度。
Malat1之RNA含量使用qPCR定量 (正規化為GAPDH含量)且測定IC50值。
IC50結果展示於圖11中。非對掌性二硫代磷酸酯之引入在骨骼肌細胞中提供可靠的增強效力，且通常提供對小鼠纖維母細胞之改良的效力。在人類支氣管上皮細胞中之作用更具化合物特異性，然而，在一些化合物(#5)中，其明顯地比參考化合物更具效力。
圖 12 ： 受5'及3'端保護之LNA寡核苷酸之活體外大鼠血清穩定性。
所測試化合物(序列基元 = SEQ ID NO 1)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結
實驗-參見實例5。
結果展示於圖12中。吾等已確定LNA硫代磷酸酯寡核苷酸之3'端比先前所認為的更易受血清核酸酶影響，且此似乎與寡核苷酸之3'端處的硫代磷酸酯連結之對掌性相關-如藉由50%親本寡核苷酸#1之快速裂解所說明。具有非對掌性二硫代磷酸酯之5'端保護提供了改良的保護。具有非對掌性二硫代磷酸酯之3'端保護為大鼠血清外切核酸酶提供完全保護-化合物#4至#8之輕微減少與硫代酸單酯雜質相關。
因此，具有非對掌性硫代磷酸酯連結之反義寡核苷酸的5'及/或3'端保護被視為對立體無規及立體限定之硫代磷酸酯的主要不穩定性問題提供了解決方案。
實例 13 ：側接中具有非對掌性二硫代磷酸酯連結之間隙子的活體內評估。
所測試化合物(序列基元 = SEQ ID NO 1)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結。注意帶下劃線的粗體核苷在3'位置處藉由立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結來連接。化合物#7在SSRSSRSR (S = Sp，R = Rp)之間隙區中具有立體限定之基元。化合物#9之主鏈基元 = RRSPRSSPSPSS，其中S = Sp，R = Rp且P = 非對掌性PS2連接(*)。
實驗：使用1 mg/kg單次靜脈內劑量將靶向ApoB之上述化合物投與至雌性C57BL/6JBom小鼠，且在第7天處死，n=5。肝中mRNA減少量使用RT-PCR量測且結果展示於圖13中。
結果表明，通常非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結的引入提供改良的效力，值得注意地，在側接區中具有非對掌性二硫代磷酸酯連結之所有化合物展示出改良的效力。如活體外實驗中所說明，允許在間隙區(#8)中使用多個二硫代磷酸酯連結，而不具有顯著的效力損耗。尤其受關注的係間隙子設計與間隙區中立體限定之硫代磷酸酯連結之組合效應在側接中具有非對掌性二硫代磷酸酯連結，說明將此等連接技術與反義寡核苷酸組合之協同作用。
實例 14 ： 具有經修飾之側接及間隙區之非對掌性二硫代磷酸酯的間隙子在肝中之活體內組織含量。
化合物及實驗-參見實例13。組織含量(藉由基於雜交之ELISA測定以量測來自處死動物之肝及腎樣本中之含量)之結果展示於圖14A及圖14B中。應注意，化合物#1存在實驗誤差-參見圖14B資料。
結果：圖14A。相比於參考化合物，含有非對掌性二硫代磷酸酯連結之所有反義寡核苷酸具有較高組織吸收/含量。圖14B展示非對掌性二硫代磷酸酯連結之引入增強了所測試的所有化合物之生物分佈(如藉由肝/腎比率所判定)。
實例 15 ： 來自活體內實驗之代謝物分析
化合物及實驗-參見實例13。代謝物分析使用揭示於C.Husser等人, Anal. Chem. 2017, 89, 6821中之方法執行。
結果展示於圖15A及圖15B中。二硫代磷酸酯修飾有效防止3'-外切核酸活體內降解。仍有一些核酸內切酶裂解(注意，所測試之化合物#1-6均具有DNA硫代磷酸酯間隙區，因此此係預期的)。鑒於顯著的外切核酸酶保護，考慮在反義寡核苷酸內使用非對掌性二硫代磷酸酯連結可用於防止或限制核酸內切酶裂解。預期非對掌性二硫代磷酸酯之增強的核酸酶抗性提供顯著的藥理學益處，諸如增強的活性及延長的作用持續時間，且可避免毒性降解產物。
實例 16 ： 活體內-長期肝活動(ApoB)
所測試化合物(序列基元 = SEQ ID NO 1):
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結。注意帶下劃線的粗體核苷在3'位置處藉由立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結來連接。化合物#3在SSRSSRSR (S = Sp，R = Rp)之間隙區中具有立體限定之基元。化合物#2之主鏈基元= RRSSRSSRSRSS，其中S = Sp，R = Rp且P = 非對掌性PS2連接(*)。
實驗：如同實例13，然而，在第7天或第21天執行處死。
結果展示於圖16中。相比於硫代磷酸酯參考化合物，非對掌性二硫代磷酸酯之引入提供了在肝中延長的作用持續時間，且此與第21天時較高組織含量相關。值得注意地，二硫代磷酸酯連結側接區與間隙區中立體限定之硫代磷酸酯連結之組合關於延長的效力及作用持續時間提供了進一步的益處，再者強調了將非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結與反義寡核苷酸中立體限定之硫代磷酸酯連結組合之顯著協同作用。
實例 17 ： 使用 Malat-1 靶向之非對掌性二硫代磷酸酯修飾之間隙子活體內研究。
所測試化合物(序列基元 = SEQ ID NO 3)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
* = 非對掌性二硫代磷酸酯修飾之連接；所有其他硫代磷酸酯連結。
實驗：
活體外：小鼠LTK細胞用以測定活體外濃度劑量反應曲線-量測MALAT-1 mRNA抑制。
活體內 ： 在第1、2及3天，以三個劑量對小鼠(C57/BL6)皮下投與15 mg/kg劑量之寡核苷酸(n=5)。小鼠在第8天被處死，且MALAT-1 RNA減少且量測肝、心臟、腎、脾及肺之組織含量。母體化合物以兩個劑量3*15 mg/kg及3*30 mg/kg進行投與。
結果 ： 活體外結果展示於圖17中-發現側接中具有1、2、3及4個非對掌性二硫代磷酸酯的化合物活體外係高度強效的。發現側接中具有5個非對掌性二硫代磷酸酯之化合物#7比側接中具有1至4個非對掌性二硫代磷酸酯之彼等化合物具有較低效力。選擇最強效之化合物#1、#2及#6用於活體內研究。活體內結果展示於圖17B中(心臟)-其說明非對掌性二硫代磷酸酯化合物在阻斷心臟中之MALAT-1之基因表現中的強效為參考化合物的約兩倍。值得注意地，反義寡核苷酸之兩個3'末端核苷之間的非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結的使用提供相對於等效物5'端保護之寡核苷酸的顯著改進。
圖17C展示來自活體內研究之組織含量分析的結果。含有非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結之所有三個寡核苷酸在肝中具有較高組織含量。二硫代酸酯在心臟及肝中產生類似或較高含量，且在腎中產生較低含量，再次說明優於PS修飾之反義寡核苷酸。值得注意地，對於化合物1，心臟中組織含量僅較高，指示增強的活體內效力可不係組織含量之結果，而係由於較高特定活性。
實例 18 ： 所測試之非對掌性單硫代磷酸酯修飾不提供非對掌性二硫代磷酸酯連結之攜帶型益處。
所測試化合物 (序列基元 = SEQ ID NO 1)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
n = 3'-S硫代磷酸酯連結，所有其他連接為硫代磷酸酯。† = 5'-S硫代磷酸酯連結，所有其他連接為硫代磷酸酯。
在此研究中，吾等合成一系列靶向ApoB之3'或5' S修飾之硫代磷酸酯寡核苷酸間隙子-硫在主鏈連接中之定位產生非對掌性核苷間連結。對於合成方法，參見WO2018/019799。
化合物如先前描述經活體外測試-例如，參見實例8。
結果展示於圖18A中：結果表明，儘管通常非對掌性單硫代磷酸對化合物之效力有害，但在一些情況下化合物保留了效力。此似乎與細胞含量相關(圖18B)。
實例 19 ： 對掌性二硫代磷酸酯修飾可對反義寡核苷酸間隙子提供益處。
所測試化合物 (序列基元 = SEQ ID NO 1)
大寫字母：β-D-氧基LNA核苷；小寫字母DNA核苷；
♦ = 對掌性二硫代磷酸酯連結，所有其他連接為硫代磷酸酯。
在此研究中，吾等合成一系列靶向ApoB之立體無規的對掌性二硫代磷酸酯寡核苷酸間隙子-硫在主鏈連接中之定位產生對掌性核苷間連結。
化合物如先前描述經活體外測試-例如，參見實例8。
結果展示於圖19A中：結果表明，在一些位置中，對掌性二硫代磷酸酯化合物與參考化合物一樣強效，指示對掌性二硫代磷酸酯與反義功能不相容-然而，益處係具有化合物特異性(亦即，看起來非攜帶型)。儘管關於細胞吸收(圖19B)，可見類似圖像，但反義活性與細胞吸收之間似乎不具有相關性。
實例 20 ： 使用靶向非對掌性二硫代磷酸酯修飾之間隙子的 Htra-1 之活體內研究。
所測試化合物
所有化合物具有序列：TATttacctggtTGTT (SEQ ID NO 4)，其中大寫字母為β-D-氧基LNA核苷，小寫字母為DNA核苷。在下表中，主鏈基元表示自5'二核苷酸之間的連接處開始及以3'二核苷酸之間的核苷間連結結束(左至右)之每個核苷間連結的主鏈修飾模式。X = 立體無規之硫代磷酸酯核苷間連結，P = 非對掌性二硫代磷酸酯(*)，S = Sp立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結，R = Rp立體限定之硫代磷酸酯核苷間連結。
實驗：
人類神經膠母細胞瘤U251細胞株購自ECACC且如由供應商所推薦保持於37℃下具有5% CO2 之含濕氣培育箱中。針對分析，在饑餓培養基(培養基由供應商推薦，除了1% FBS而非10%以外)中在96多孔盤中接種15000個U251細胞/孔。細胞培育24小時，隨後添加溶解於PBS中之寡核苷酸。寡核苷酸之濃度：5、1及0.2 µM。在添加寡核苷酸4天之後，收集細胞。RNA使用PureLink Pro 96 RNA純化套組(Ambion，根據製造商說明)提取。cDNA隨後使用M-MLT逆轉錄酶、無規十聚體(decamer) RETROscript、核糖核酸酶抑制劑(Ambion，根據製造商說明)及100mM dNTP組PCR級(Invitrogen)以及無脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶之水(Gibco)來合成。對於基因表現分析，qPCR使用TagMan Fast Advanced Master Mix (2×) (Ambion)在doublex設置中進行。針對qPCR使用以下TaqMan引子分析：HTRA1，Hs01016151_m1 (FAM-MGB)及管家基因，TBP，Hs4326322E (VIC-MGB)來自Life Technologies。 EC50判定在Graph Pad Prism6中進行。表中之相對Htra1 Mrna表現含量展示為對照(PBS處理之細胞)之%。
結果：
實例 21 ： 在針對靶向 TNFRSF1B 外顯子 7 跳躍之 LNA 混合子上遍歷的 PS2
吾等先前確定，使用混合子(13'寡聚物) SSO#26之TNFRSF1B外顯子7的跳躍在靶向TNFRSF1B之內含子6-外顯子7之3'剪接位點中高度有效(參見背景資訊WO2008131807 & WO2007058894)。
已建立此實驗來判定不論式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯連結(PS2)存在與否，在進一步增強剪接切換寡核苷酸之剪接調節活性中皆可為有用的。為判定效果，吾等在親本寡核苷酸SSO#26之不同位置中引入式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯連結且合成以下化合物(下表)。
所測試化合物：親本寡核苷酸(SSO#26)之二硫代酸酯修飾之寡核苷酸。在用*標記的位置中引入將式((IA)或(IB))之二硫代磷酸酯核苷間連結，所有其他核苷間連結為硫代磷酸酯核苷間連結(立體無規)，大寫字母表示β-D-氧基LNA核苷，且LNA C為5-甲基-胞嘧啶，小寫字母表示DNA核苷。
實驗：
寡核苷酸吸收及Colo 205細胞(人類結腸直腸腺癌)中跳躍的外顯子藉由以兩種不同濃度(5 µM及25 µM)自主吸收進行分析。將細胞接種在96孔盤中(25,000個細胞/孔)且添加寡核苷酸。在添加寡核苷酸三天之後，使用Qiagen裝置將總RNA與96孔盤分離。剪接切換之百分比藉由具有FAM標記之探針跨越外顯子6-8連接(外顯子7跳躍)的液滴式數位PCR(BioRad)分析，且TNFRSF1B (野生型及外顯子7跳躍)之總量用HEX-標記之探針及來自IDT跨越外顯子2-3之引子分析。二硫代磷酸酯連結之存在對寡核苷酸引入外顯子跳躍之能力具有作用(圖20)。在5 µM處，最強效PS2寡核苷酸增加外顯子跳躍大於兩倍，其中親本(SSO#26)展示了大約10%的外顯子跳躍，SSO#25展示了大於20%的外顯子7跳躍。在25 µM處，最強效寡核苷酸達到大於60%的外顯子跳躍(SSO#7)，再次比親本好大於2倍。寡核苷酸SSO#22，其中所有DNA核苷酸具有二硫代酸酯修飾(PS2)而非硫代磷酸酯修飾(PS)，相比於親本展示出增加的活性，且在5 µM處係第三最強效寡核苷酸，且在25 µM處係第二最強效的剪接切換寡核苷酸(圖20)。然而，相比於親本寡核苷酸，在LNA核苷與PS2連接(SSO#16)之間的交換所有連接減少了剪接切換之效力(圖20)。另外，顯而易見的是，在某些位置處引入PS2可能對外顯子跳躍活性不利，且在5 µM處，SSO#1、SSO#9、SSO#11、SSO#12及SSO#14在較低濃度下未展示出顯著剪接切換活性，但在較高濃度下其皆有效(圖20)。此實例說明PS2連接與剪接調節寡核苷酸相容，且進一步強調鄰近於DNA核苷、或在相鄰DNA核苷之間、在混合子寡核苷酸(諸如LNA混合寡聚物)內引入PS2連接具有明顯益處-此等設計在調節剪接中尤其更有效。
材料及方法
藉由液滴式數位PCR偵測TNFRSF1B外顯子7跳躍之分析
正向序列：CAACTCCAGAACCCAGCACT (SEQ ID NO 6)
反向序列：CTTATCGGCAGGCAAGTGAG (SEQ ID NO 7)
探針序列：GCACAAGGGCTTCTCAACTGGAAGAG (SEQ ID NO 8)
螢光團：FAM
偵測TNFRSF1B 總量之分析
IDT分析Hs.PT.58.40638488 跨越外顯子 2-3
實例 22 ： 含有二硫代磷酸酯修飾之混合子寡核苷酸之穩定性
使用S1核酸酶(表2)選擇三個親本之二硫代酸酯修飾之寡核苷酸(SSO#26 )用於穩定性分析。根據製造商的說明(Invitrogen，目錄第18001-016號)，將所選擇的寡核苷酸在37℃下，在25 µM處，在100 µL含有1×S1核酸酶緩衝液及10U S1核酸酶之反應緩衝液中培育30 min或2h。S1核酸酶反應藉由將2 µL 500 mM EDTA溶液添加至100 µL反應混合物中停止。2.5 µL反應混合物於NovexTM TBE-脲2×樣本緩衝液(LC6876 Invitrogen)中進行稀釋且經加料於NovexTM 15%TBE-脲凝膠(EC6885BOX，Invitrogen)中。以180 V執行凝膠大約1小時，隨後用SYBR金沾染(S11494，Invitrogen)及ChemiDocTM 觸摸成像系統(BIO-RAD)獲取凝膠圖像。
含有寡核苷酸之PS2的穩定性用S1核酸酶培育30及120分鐘進行測試。PS2連接之位置影響穩定性，且DNA核苷酸(SSO#14)之PS2 3'的存在具有最大影響(圖21)。與S1核酸酶一起培育30分鐘後，親本寡核苷酸幾乎降解，而PS2修飾之寡核苷酸展示出表示13'聚合物的強帶。另外，甚至在由S1核酸酶初始裂解之後，SSO#14展示出表示指示其餘寡核苷酸之穩定性的降解產物之較強帶(圖21，色帶5+9)。
此等資料說明當引入至寡核苷酸(諸如混合子寡核苷酸)中時，二硫代磷酸酯之存在對核算內切酶活性提供保護-且出人意料地，此在維持寡核苷酸之功效的同時實現，實際上如本發明實驗中所展示，剪接調節活性可經顯著改良。考慮到鄰近於DNA核苷、或DNA核苷之間、混合子寡核苷酸(本文中由包含LNA及DNA核苷之混合子所說明)中之PS2連接增強了核酸內切酶穩定性。用於反義寡核苷酸，諸如混合子(例如SSO或antimiR)，因此將使用連續DNA核苷之間的PS2連接視為有益的。此類益處亦可藉由使用鄰近於DNA核苷之5'或3' PS2連接提供，該DNA核苷藉由2'糖修飾之核苷(諸如LNA或MOE)分別側接5'或3'。
因此，本發明進一步提供改良之反義寡核苷酸，其用於基於佔用之機制，諸如剪接調節或微RNA抑制中。
圖1至圖4展示在投與根據本發明之寡核苷酸24及74小時之後原代大鼠肝細胞中的靶標mRNA含量。
圖1展示在投與間隙中具有根據本發明之單個二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸間隙子24及74小時之後原代大鼠肝細胞中的標靶mRNA含量。
圖2展示在投與間隙中具有多個根據本發明之二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸間隙子24及74小時之後原代大鼠肝細胞中的靶標mRNA含量。
圖3展示在投與間隙中具有多個根據本發明之二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸間隙子24及74小時之後原代大鼠肝細胞中的靶標mRNA含量。
圖4展示在投與側面中具有根據本發明之在二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸間隙子24及74小時之後原代大鼠肝細胞中的靶標mRNA含量。
圖5展示雜化成RNA及DNA之根據本發明之含有二硫代磷酸酯核苷間連結的寡核苷酸之熱熔點(Tm)。
圖6展示根據本發明之含有二硫代磷酸酯核苷間連結之寡核苷酸在大鼠血清中之穩定性。
圖7：探究在治療原代大鼠肝細胞後間隙子的間隙及側接區中之非對掌性二硫代磷酸酯--殘餘mRNA含量。
圖8：探究在治療原代大鼠肝細胞之後在間隙子之間隙區中之非對掌性二硫代磷酸酯--殘餘mRNA含量的位置依賴性及最佳化。
圖9A至圖9B：探究間隙子的間隙區中之非對掌性二硫代磷酸酯--對細胞吸收之影響。
圖10A至圖10B：將非對掌性二硫代磷酸酯引入間隙子之側接區中提供增加之效能，其在硫代磷酸酯負載之間與增加之效能具有相關性(在側接序列中4個連結＞ 3個連結＞ 2個連結＞ 1個連結＞無二硫代磷酸酯連結)。
圖11：不同細胞類型之IC50值。
圖12： 3'端受保護之LNA寡核苷酸之活體外大鼠血清穩定性。
圖13：在側接及間隙區中含有非對掌性二硫代磷酸酯連結的間隙子之活體內評估--靶標抑制。
圖14A：在側接及間隙區中含有非對掌性二硫代磷酸酯連結的間隙子之活體內評估--組織吸收。
圖14B：在側接及間隙區中含有非對掌性二硫代磷酸酯連結的間隙子之活體內評估--肝臟/腎臟比率。
圖15A及圖15B：在側接及間隙區中含有非對掌性二硫代磷酸酯連結的間隙子之活體內評估--代謝物分析。
圖16：用包含非對掌性二硫代磷酸酯核苷間連結之反義寡核苷酸延長之作用持續時間可藉由與立體限定硫代磷酸酯核苷間連結組合來進一步增加。
圖17A：靶向MALAT-1之非對掌性二硫代磷酸酯間隙子的活體外EC50測定。
圖17B：靶向MALAT-1之非對掌性二硫代磷酸酯間隙子的活體內效能。
圖17C：靶向MALAT-1之非對掌性二硫代磷酸酯間隙子的活體內研究--組織含量
圖18A：靶向ApoB之非對掌性單硫代磷酸酯經改性間隙子寡核苷酸的活體外研究。活性資料。
圖18B：靶向ApoB之非對掌性單硫代磷酸酯經修飾之間隙子寡核苷酸的活體外研究。細胞含量資料。
圖19A：靶向ApoB之對掌性二硫代磷酸酯修飾之間隙子寡核苷酸的活體外研究。活性資料。
圖19B：靶向ApoB之對掌性二硫代磷酸酯修飾之間隙子寡核苷酸的活體外研究。細胞含量資料。
圖20：存在於靶向TNFRSF1B之3'剪接位點之剪接轉換寡核苷酸中的非對掌性二硫代磷酸酯(P2S)核苷間連結之效應。人類Colo 205細胞經接種於96孔盤中且分別接收5 µM (A)及25 µM(B)之寡聚物。外顯子7跳躍之百分比使用靶向外顯子6-8接合點之探針藉由液滴式數位PCR分析，且藉由靶向外顯子2-3之分析與TNFRSF1B總量進行比較。SSO#26為親本寡聚物，且SSO#27為並不靶向TNFRSF1B之陰性對照。
圖21：使用S1核酸酶之穩定性分析。含有二硫代酸酯之寡核苷酸與S1核酸酶一起分別培育30及120分鐘。寡核苷酸在15% TBE-脲凝膠上可視化。完整寡核苷酸(SSO#14)之遷移之標記物包括在內而不接受S1核酸酶。

Claims (27)

  1. 一種寡核苷酸，其包含至少一個式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結(IA)(IB) 其中兩個氧原子中之一者連接至相鄰核苷(A1 )之3'碳原子且另一者連接至另一相鄰核苷(A2 )之5'碳原子，其中該兩個核苷(A1 )及(A2 )中之至少一者為LNA核苷，且其中在(IA)中，R為氫或磷酸酯保護基，且在(IB)中，M+為陽離子，諸如金屬陽離子，諸如鹼金屬陽離子，諸如Na+或K+陽離子；或M+為銨陽離子。
  2. 如請求項1之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為DNA核苷、RNA核苷或糖修飾之核苷。
  3. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為DNA核苷或糖修飾之核苷。
  4. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為DNA核苷。
  5. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中(A1 )及(A2 )中之一者為LNA核苷且另一者為糖修飾之核苷。
  6. 如請求項2之寡核苷酸，其中該糖修飾之核苷為2'-糖修飾之核苷。
  7. 如請求項6之寡核苷酸，其中該2'-糖修飾之核苷為2'-烷氧基-RNA、2'-烷氧基烷氧基-RNA、2'-胺基-DNA、2'-氟-RNA、2'-氟-ANA或LNA核苷。
  8. 如請求項6之寡核苷酸，其中該2'-糖修飾之核苷為LNA核苷。
  9. 如請求項1之寡核苷酸，其中該等LNA核苷獨立地選自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA及ENA。
  10. 如請求項8或9之寡核苷酸，其中該等LNA核苷均為β-D-氧基LNA。
  11. 如請求項6或7之寡核苷酸，其中該2'-糖修飾之核苷為2'-烷氧基烷氧基-RNA。
  12. 如請求項9之寡核苷酸，其中2'-烷氧基-RNA為2'-甲氧基-RNA。
  13. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中2'-烷氧基烷氧基-RNA為2'-甲氧基乙氧基-RNA。
  14. 如請求項1或2之寡核苷酸，其包含1與15個之間，特別是1與5個之間，更特別是1、2、3、4或5個如請求項1之式(IA)或(IB)的二硫代磷酸酯核苷間連結。
  15. 如請求項1之寡核苷酸，其包含其他核苷間連結，該等核苷間連結獨立地選自磷酸二酯核苷間連結、硫代磷酸酯核苷間連結及如請求項1之式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
  16. 如請求項15之寡核苷酸，其中該等其他核苷間連結獨立地選自硫代磷酸酯核苷間連結及如請求項1之式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
  17. 如請求項15或16之寡核苷酸，其中該等其他核苷間連結均為硫代磷酸酯核苷間連結。
  18. 如請求項15至16之寡核苷酸，其中該等其他核苷間連結均為如請求項1之式(IA)或(IB)之二硫代磷酸酯核苷間連結。
  19. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該寡核苷酸長度為7至30個核苷酸。
  20. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中一或多個核苷為核鹼基經修飾之核苷。
  21. 如請求項1或2之寡核苷酸，其中該寡核苷酸為反義寡核苷酸、siRNA、微RNA模擬物或核糖核酸酶。
  22. 一種如請求項1至21中任一項之寡核苷酸之醫藥學上可接受之鹽，特別是鈉鹽或鉀鹽或銨鹽。
  23. 一種共軛物，其包含如請求項1至21中任一項之寡核苷酸或如請求項22之醫藥學上可接受之鹽及至少一個共軛物部分，該至少一個共軛物部分視情況經由連接子部分共價連接於該寡核苷酸或該醫藥學上可接受之鹽。
  24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至21中任一項之寡核苷酸、如請求項22之醫藥學上可接受之鹽或如請求項23之共軛物及治療上惰性載劑。
  25. 一種如請求項1至21中任一項之寡核苷酸、如請求項22之醫藥學上可接受之鹽或如請求項23之共軛物的用途，其用於製備用以治療或預防選自由以下組成之群的疾病之藥物：黃斑變性(諸如濕性AMD、乾性AMD、地圖狀萎縮、中期dAMD、糖尿病性視網膜病變)、帕金森氏(Parkinson’s)病、阿茲海默氏(Alzhiemer’s)病、杜興氏(Duchenne)肌肉萎縮症、關節炎(諸如骨關節炎)及家族性缺血性大腦小血管疾病。
  26. 一種用於製造如請求項1至23中任一項之寡核苷酸之方法，其包含以下步驟： (a)使硫代亞磷醯胺(thiophosphoramidite)核苷偶合至核苷酸或寡核苷酸之末端5'氧原子，以產生硫代亞磷酸三酯中間物； (b)硫氧化(Thiooxidizing)步驟a)中所獲得之硫代亞磷酸三酯中間物；及 (c)視情況進一步延長該寡核苷酸。
  27. 一種寡核苷酸，其係如請求項26之方法製造。
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