TW201902935A - 蛋白質結合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供精胺酸脫亞胺酶(ADI)與腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體之結合物，及其相關組合物及使用方法。亦提供六聚多肽與三聚多肽之結合物、第一與第二三聚多肽之結合物，及其相關組合物及使用方法。

Description

蛋白質結合物

本發明部分地係關於精胺酸脫亞胺酶(ADI)與腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體之結合物，及其相關組合物及使用方法。本發明亦係關於六聚多肽與三聚多肽之結合物、第一與第二三聚多肽之結合物，及其相關組合物及使用方法。

精胺酸耗竭療法可為某些形式之癌症以及其他疾病的有效治療。舉例而言，精胺酸脫亞胺酶可用於藉由將精胺酸轉化為瓜胺酸及氨氣來耗盡精胺酸之血流供應。ADI-PEG 20為在對缺乏關鍵酶精胺基丁二酸鹽合成酶-1 (ASS1)之腫瘤的臨床中所探究的例示性ADI-PEG，該ASS1參與瓜胺酸向精胺酸之轉化。ADI-PEG 20耐受一直良好且展示臨床研究中之前景(參見例如Qiu等人，Cancer Lett. 2015年8月1日；364(1):1-7；Phillips等人，Cancer Res Treat. 2013年12月；45(4):251-62；Feun等人，Curr Pharm Des. 2008;14(11):1049-57；Feun及Savaraj, Expert Opin Investig Drugs. 2006年7月；15(7):815-22；Feun等人，Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2015年1月；18(1):78-82)。

藉由適當配位體使腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族之細胞表面死亡受體活化代表一種有吸引力的藉由在癌細胞中進行細胞凋亡來誘導細胞死亡之治療策略(參見例如Palacios等人，Curr Pharm Des. 2014;20(17):2819-33)。作為一個實例，TNF相關細胞凋亡誘導性配位體(TRAIL，亦稱為Apo2L)具有在癌細胞中選擇性地誘導細胞凋亡之能力，且已在多種臨床前研究中展現穩固抗癌活性。

然而，仍需要使此等藥劑及其他藥劑之藥物動力學及/或生物活性最佳化。本發明提供此等益處及其他。

本發明之實施例包括結合物，其包含精胺酸脫亞胺酶(ADI)共價連接於腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體。

在一些實施例中，ADI包含與選自表 A1 之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，ADI為六聚ADI多肽，例如同源六聚多肽。在一些實施例中，六聚或同源六聚ADI包含與SEQ ID NO: 9、37、38、50或57-68至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。

在一些實施例中，TNF超家族配位體係選自表 T1 。在一些實施例中，超家族配位體係選自TNF相關細胞凋亡誘導性配位體(TRAIL)、TNF-α及FasL。在一些實施例中，TNF超家族配位體包含與選自表 T2 之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。在一些實施例中，TNF超家族配位體為三聚或同源三聚多肽。

在一些實施例中，ADI及TNF超家族配位體由連接子，視情況由生理學上穩定之連接子分隔開。在一些實施例中，連接子為肽連接子，視情況為柔性肽連接子或剛性肽連接子。在一些實施例中，肽連接子之長度為約1-100個胺基酸、約1-90個胺基酸、約1-80個胺基酸、約1-70個胺基酸、約1-80個胺基酸、約1-50個胺基酸、約1-40個胺基酸、約1-30個胺基酸、約1-20個胺基酸、約1-10個胺基酸或約1-5個胺基酸，或其長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 ,17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子係選自表 L1 。

在一些實施例中，結合物為融合多肽。在一些實施例中，ADI融合於TNF超家族配位體之N端，視情況由連接子分隔開。在一些實施例中，ADI融合於TNF超家族配位體之C端，視情況由連接子分隔開。

在一些實施例中，連接子為非肽連接子。

在一些實施例中，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之藥物動力學、物理及/或生物特性改善，其視情況選自以下中之一或多者：穩定性增加、血清半衰期增加、生物可用性增加、生物活性增加、暴露增加及清除率降低。

在一些實施例中，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之穩定性及/或血清半衰期增加，視情況其中結合物之相對穩定性及/或血清半衰期相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。

在一些實施例中，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之生物活性增加，視情況其中結合物之生物活性相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%，或視情況其中生物活性相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時協同地增加。在一些實施例中，生物活性為在癌細胞中誘導細胞死亡或細胞凋亡，其視情況相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時協同地增加。

在一些實施例中，癌細胞為ADI敏感性細胞，其視情況選自以下中之一或多者：乳癌細胞、肝細胞癌細胞、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)細胞、結腸癌細胞、神經膠母細胞瘤癌細胞、白血病細胞、黑素瘤癌細胞、非小肺細胞癌(NSCLC)細胞、卵巢癌細胞、胰臟癌細胞、前列腺癌細胞及腎癌細胞。

在一些實施例中，癌細胞為ADI非敏感性細胞，其視情況選自乳癌細胞、結腸癌細胞及NSCLC細胞中之一或多者。

在一些實施例中，ADI使TNF超家族配位體在癌細胞中誘導細胞死亡或細胞凋亡之能力增加，視情況相對於TNF超家族配位體單獨時增加約至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%。

在一些實施例中，ADI上調死亡受體5 (DR5)在癌細胞上之表現。

在一些實施例中，ADI多肽經由連接基團共價鍵結於至少一個聚乙二醇(PEG)分子，視情況其中TNF超家族配位體不共價鍵結於PEG分子。

亦包括結合物，其包含(a)六聚多肽共價連接於三聚多肽，或(b)第一三聚多肽共價連接於與該第一三聚多肽不同之第二三聚多肽。

在一些實施例中，六聚多肽為同源六聚多肽。在一些實施例中，六聚多肽係選自視情況如本文所描述之精胺酸脫亞胺酶，及脂聯素或其類膠原蛋白結構域。

在一些實施例中，三聚多肽為同源三聚多肽。

在一些實施例中，(b)之第一三聚多肽係選自脂聯素或其類膠原蛋白結構域、T4纖維蛋白(fibritin)或其三聚化結構域(foldon)、膠原蛋白之C-原肽、界面活性蛋白A (SP -A)及甘露糖結合蛋白A (MBP-A)。

在一些實施例中，(a)之三聚多肽或(b)之第二三聚多肽係選自視情況如本文所描述之腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體。在一些實施例中，對於(a)，六聚多肽共價連接於三聚多肽之N端，或對於(b)，第一三聚多肽共價連接於第二三聚多肽之N端。在一些實施例中，對於(a)，六聚多肽共價連接於三聚多肽之C端，或其中對於(b)，第一三聚多肽共價連接於第二三聚多肽之C端。在一些實施例中，對於(a)，六聚多肽及三聚多肽由連接子分隔開，或對於(b)，第一及第二三聚多肽由連接子分隔開，其中該連接子視情況為生理學上穩定之連接子。

在一些實施例中，結合物為融合多肽。

在一些實施例中，相對於六聚及/或三聚多肽單獨時，結合物之物理、藥物動力學及/或生物特性增加。在一些實施例中，對於(a)，與六聚多肽結合使三聚多肽之穩定性及/或血清半衰期增加，視情況相對於三聚多肽單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%，或對於(b)，與第一三聚多肽結合使第二三聚多肽之穩定性及/或血清半衰期增加，視情況相對於第二三聚多肽單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。

某些實施例係關於編碼本文所描述之結合物的經分離之聚核苷酸，其中該結合物為融合蛋白質。亦包括包含該經分離之聚核苷酸的表現載體，及包含該經分離之聚核苷酸或該表現載體的宿主細胞。

亦包括治療性組合物，其包含本文所描述之結合物及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在特定實施例中，結合物形成六個ADI-TRAIL及/或TRAIL-ADI結合物之六聚複合物，視情況形成為融合蛋白質(參見例如圖4)。在一些實施例中，結合物或組合物為至少約95%純且少於約5%聚集的，且大體上無內毒素。

亦包括在有需要之個體中治療癌症、改善其症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與如本文所描述之結合物或治療性組合物。

在一些實施例中，癌症係選自以下中之一或多者：肝細胞癌(HCC)、黑素瘤、轉移性黑素瘤、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓性白血病、復發性急性骨髓性白血病、B細胞惡性病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤(例如星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤或脈絡叢乳頭瘤)、多形性膠質母細胞瘤(例如巨細胞膠質母細胞瘤或神經膠質肉瘤)、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原發性CNS淋巴瘤、原始神經外胚層瘤(神經管母細胞瘤)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睪丸癌及胃癌。

相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年3月29日提交之美國臨時申請案第62/478,398號的優先權，其以全文引用之方式併入。

關於序列表之陳述 以文本格式代替紙本拷貝提供與本申請案相關之序列表，並且藉此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之正文檔案的名稱為TDWG_007_01TW_ST25.txt。

定義 除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。雖然在本發明之主題的實踐或測試中可使用與本文所描述之方法、物質、組合物、試劑、細胞相似或同等相似或同等的任何方法、物質、組合物、試劑、細胞，但描述較佳方法及物質。本說明書中所引用之所有公開案及參考文獻，包括(但不限於)專利及專利申請案，均以全文引用之方式併入本文中，如同各個別公開案或參考文獻具體且單獨地指示為以引用之方式併入本文中，完整闡述一般。本申請案主張優先權之任何專利申請案亦依據上文對公開案及參考文獻所描述之方式以全文引用之方式併入本文中。

除非確切表明相反，否則本發明之實踐將採用此項技術之技能內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學及重組型DNA技術之習知方法，其中許多出於說明之目的而描述於下文中。此類技術在文獻中充分解釋。參見例如Current Protocols in Protein Science 、Current Protocols in Molecular Biology 或Current Protocols in Immunology , John Wiley & Sons, New York, N.Y. (2009)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology , 第3版, Wiley & Sons, 1995；Sambrook及Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版, 2001)；Maniatis等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)；DNA Cloning: A Practical Approach , 第I及II卷(D. Glover編)；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait編, 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. Hames及S. Higgins編, 1985)；Transcription and Translation (B. Hames及S. Higgins編, 1984)；Animal Cell Culture (R. Freshney編, 1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)及其他類似參考文獻。

對重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型可使用標準技術(例如電穿孔、脂質體轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述來執行。此等技術及程序以及相關技術及程序一般而言可根據此項技術中熟知之習知方法及如在本說明書通篇中所引用及論述之各種通用及更具體參考文獻中所描述來執行。除非提供具體界定，否則本文所描述的與分子生物學、分析化學、合成有機化學、及醫學及醫藥化學結合利用之命名法、及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之彼等。標準技術可用於重組技術、分子生物學、微生物學、化學合成、化學分析、醫藥之製備、調配及輸送、以及患者治療。

出於本發明之目的，以下術語定義如下。

冠詞「一(a及an)」在本文中用以指該冠詞之一個或超過一個(亦即指至少一個)文法賓語。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或超過一個要素。

「約」意謂相對於參考之數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度，數量、含量、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化至多30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。

「拮抗劑」係指干擾或以其他方式減少另一藥劑或分子之生理作用的生物結構或化學藥劑。在一些情況下，拮抗劑特異性結合於另一藥劑或分子。包括完全及部分拮抗劑。

「促效劑」係指增加或增強另一藥劑或分子之生理作用的生物結構或化學藥劑。在一些情況下，促效劑特異性結合於另一藥劑或分子。包括完全及部分促效劑。

如本文所使用，術語「胺基酸」欲意謂天然存在及非天然存在之胺基酸以及胺基酸類似物及模擬物。舉例而言，天然存在之胺基酸包括在蛋白質生物合成期間所用之20種(L)-胺基酸以及其他胺基酸，諸如4-羥基脯胺酸、羥基離胺酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、高半胱胺酸、瓜胺酸及鳥胺酸。非天然存在之胺基酸包括例如(D)-胺基酸、正白胺酸、正纈胺酸、對氟苯丙胺酸、乙硫胺酸及其類似物，其為熟習此項技術者所已知。胺基酸類似物包括天然及非天然存在之胺基酸的經修飾形式。此類修飾可包括例如胺基酸上化學基團及部分之取代或置換或藉由胺基酸衍生。胺基酸模擬物包括例如展現參考胺基酸所特有之功能相似特性，諸如電荷及電荷間距的有機結構。舉例而言，模擬精胺酸(Arg或R)之有機結構將具有位於相似分子空間中且移動性程度與天然存在之Arg胺基酸的側鏈之e胺基相同的正電荷部分。模擬物亦包括受限之結構，以便維持胺基酸或胺基酸官能基之最佳間距及電荷相互作用。熟習此項技術者已知或可確定何種結構構成功能上等效之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。

「生物相容性」係指物質或化合物一般對生物學功能無害，且不產生任何程度的不可接受之毒性(包括過敏原性及疾病病況)。

「編碼序列」意謂影響基因之多肽產物之編碼的任何核酸序列。相比之下，術語「非編碼序列」係指不直接影響基因之多肽產物之編碼的任何核酸序列。

除非上下文另有要求，否則在本發明通篇中，詞語「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」應理解為暗示包括所陳述步驟或要素或一組步驟或要素，但不排除任何其他步驟或要素或其他組步驟或要素。

「由……組成」意欲包括且限於在片語「由……組成」中間的任何事物。因此，片語「由……組成」指示所列要素為所需或必選的，且不可存在其他要素。「基本上由……組成」意欲包括該片語中間所列之任何要素，且限於不干擾或促進所列要素在本揭示案中所指定之活性或作用的其他要素。因此，片語「基本上由……組成」指示所列要素為所需或必選的，但其他要素視情況選用且視其是否實質上影響所列要素之活性或作用而定，可或可不存在。

術語「結合物」係指由於如本文所描述之至少兩個各別多肽(例如第一多肽及第二多肽)共價或非共價附接或連接而形成的實體。結合物多肽之一個實例為「融合蛋白質」或「融合多肽」，其為經由將原先對各別多肽進行編碼之兩個或超過兩個編碼序列接合而產生的多肽；轉譯經接合之編碼序列產生通常具有來源於該等各別多肽中之每一者之功能特性的單個融合多肽。

術語「無內毒素」或「大體上無內毒素」一般係關於含有至多痕量(例如對個體無臨床上不利之生理作用的量)之內毒素且較佳地不可偵測之量之內毒素的組合物、溶劑及/或容器。內毒素為與某些微生物，諸如細菌，通常革蘭氏陰性細菌相關之毒素，不過在諸如單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes )之革蘭氏陽性細菌中可發現內毒素。最普遍之內毒素為在各種革蘭氏陰性細菌之外膜中發現的脂多醣(LPS)或脂寡醣(LOS)，且其代表使得此等細菌能夠致病之重要病原性特徵。少量內毒素可在人類中引起發熱，降低血壓且活化發炎及凝血以及其他不利生理作用。

因此，在醫藥生產中，常常期望自藥品及/或藥物容器移除大部分或所有痕量內毒素，因為即使少量亦可能在人類中引起不利作用。去除熱原烘箱可用於此目的，此係因為通常需要超過300℃之溫度來使大部分內毒素分解。舉例而言，基於諸如注射器或小瓶之主要包裝材料，250℃之玻璃溫度與30分鐘之保持時間的組合常足以達成內毒素含量下降3 log。涵蓋其他移除內毒素之方法，包括例如，如本文所描述及此項技術中已知之層析法及過濾法。

可使用此項技術中已知之常規技術偵測內毒素。舉例而言，鱟(Limulus)變形細胞溶胞物分析利用來自鱟(horseshoe crab)之血液，其為一種非常靈敏的用於偵測內毒素之存在的分析。在此測試中，極低含量之LPS可引起鱟溶胞物之可偵測凝集，此係因為將此反應放大之強大的酶級聯。內毒素亦可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)來定量。為了實現大體上無內毒素，每毫克活性化合物之內毒素含量可少於約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10 EU。通常，1 ng脂多醣(LPS)對應於約1-10 EU。

結合物或多肽之「半衰期」可指相對於投與至生物體之血清或組織中時之藥理活性、生理活性或其他活性，或相對於任何其他界定之時間點，結合物或多肽喪失其此類活性一半所耗費之時間。「半衰期」亦可指相對於投與至生物體之血清或組織中時的結合物或多肽之量或濃度，或相對於任何其他界定之時間點，此類量或濃度減少達投與至生物體之血清或組織中之起始量的一半時所耗費的時間。半衰期可在血清及/或任何一或多個所選組織中量測。

術語「調節」及「改變」包括相對於對照物，以通常統計學上顯著或生理學上顯著之量或程度進行的「增加」、「增強」或「刺激」以及「降低」或「減少」。「增加」、「刺激」或「增強」之量通常為「統計學上顯著」之量，且可包括由無組合物(例如不存在藥劑)或對照組合物產生之量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或超過30倍(例如500、1000倍) (包括兩者之間的所有整數及範圍，例如1.5、1.6、1.7、1.8倍等)增加。「降低」或「減少」之量通常為「統計學上顯著」之量，且可包括由無組合物(例如不存在藥劑)或對照組合物產生之量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18% 、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%降低(包括兩者之間的所有整數及範圍。本文描述比較及「統計學上顯著」之量的實例。

術語「多肽」、「蛋白質」及「肽」可互換使用，且意謂不限於任何特定長度之胺基酸聚合物。術語「酶」包括多肽或蛋白質催化劑，且關於ADI可與蛋白質、多肽或肽互換使用。術語包括修飾，諸如豆蔻醯化、硫酸化、糖基化、磷酸化、及信號序列之添加或缺失。術語「多肽」或「蛋白質」意謂一或多個胺基酸鏈，其中各鏈包含藉由肽鍵共價連接之胺基酸，且其中該多肽或蛋白質可包含複數個由肽鍵非共價及/或共價連接之鏈，該等鏈具有原生蛋白質(亦即藉由天然存在之細胞且特定言之非重組細胞產生的蛋白質)或經基因工程改造之細胞或重組細胞產生之蛋白質的序列，且該多肽或蛋白質包含具有原生蛋白質之胺基酸序列的分子、或其中對原生序列之一或多個胺基酸進行缺失、添加及/或取代的分子。具體言之，術語「多肽」及「蛋白質」涵蓋本文所描述之ADI酶/蛋白質，或其中對該ADI蛋白質之一或多個胺基酸進行缺失、添加及/或取代的序列。在某些實施例中，多肽為「重組」多肽，該多肽由包含一或多個重組DNA分子之重組細胞產生，該等重組DNA分子通常由在其他情況下將不見於細胞中的異源聚核苷酸序列或聚核苷酸序列之組合製成。

本文所提及之術語「經分離」之多肽或蛋白質意謂標的蛋白質(1)不含至少一些通常將與該蛋白質一起見於自然中之其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%的在自然中與該蛋白質相關之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)不與在自然中與該「經分離之蛋白質」締合的蛋白質之部分締合(藉由共價或非共價相互作用)，(6)與在自然中不與該蛋白質締合之多肽可操作地締合(藉由共價或非共價相互作用)，或(7)不在自然中存在。此類經分離之蛋白質可由基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼，可為合成來源，或其任何組合。在某些實施例中，經分離之蛋白質大體上不含見於其天然環境中的將干擾其用途(治療、診斷、預防、研究或其他)的蛋白質或多肽或其他污染物。

在某些實施例中，組合物中任何給定藥劑(例如結合物)之「純度」均可具體界定。舉例而言，如藉由例如(而決不限於)高效液相層析(HPLC)所量測，某些組合物可包含至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%純(包括兩者之間的所有數值及範圍)之結合物，該HPLC為在生物化學和分析化學中常用於對化合物進行分離、鑑別及定量之熟知管柱層析形式。在一些情況下，組合物之純度藉由聚集程度來加以表徵。舉例而言，結合物(例如融合蛋白質)之聚集程度可藉由基於大小分離粒子之尺寸排阻層析(SEC)來加以測定。其為一般公認的用於確定經純化蛋白質之三級結構及四級結構的方法。SEC主要用於分析大分子，諸如蛋白質或聚合物。SEC藉由將此等較小分子截留在粒子孔隙中來起作用 。較大分子由於其太大，無法進入孔隙而僅繞過該等孔隙。因此，較大分子比較小分子更快地流動通過管柱，亦即，分子愈小，滯留時間愈長。某些組合物亦大體上不含聚集物(藉由SEC HPLC得到，大於約95%呈現為單峰)。某些實施例不含聚集物，其中藉由SEC HPLC得到，大於約96%、約97%、約98%或約99%呈現為單峰。

術語「參考序列」一般係指與另一序列進行比較之核酸編碼序列或胺基酸序列。以參考序列之形式包括本文所描述之所有多肽及聚核苷酸序列，包括藉由名稱所描述之彼等序列及描述於表及序列表中之彼等序列。

如本文所使用，術語「序列一致性」或例如包含「序列50%一致」係指在比較窗內以核苷酸-核苷酸計或以胺基酸-胺基酸計的序列一致之程度。因此，「序列一致性百分比」可藉由以下來計算：在比較窗內比較兩個最佳比對序列，確定在兩個序列中出現一致核酸鹼基(例如A、T、C、G、I)或一致胺基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys及Met)的位置數以得到匹配位置數，用匹配位置數除以比較窗中之位置總數(亦即窗大小)，及將結果乘以100以得到序列一致性百分比。用於比對比較窗之最佳序列比對可藉由電腦化實施演算法(Wisconsin Genetics套裝軟體7.0版中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA)或藉由進行檢驗及由所選各種方法中之任一者產生之最佳比對(亦即在比較窗上產生最高同源性百分比)來進行。亦可參考BLAST程式族，如例如由Altschul等人，Nucl. Acids Res. 25:3389, 1997所揭示。

術語「溶解度」係指本文所描述之藥劑(例如結合物)溶解於液體溶劑中且形成均勻溶液的特性。溶解度通常表示為濃度，以每單位體積溶劑之溶質質量(每千克溶劑之溶質公克數、g/dL(100 mL)、mg/mL等)、莫耳濃度、重量莫耳濃度、莫耳分數或濃度之其他相似描述計。在包括溫度、壓力、pH值及溶劑性質之規定條件下，每份量之溶劑可溶解之溶質的最大平衡量為該溶質在該溶劑中之溶解度。在某些實施例中，在生理pH值或其他pH值下，例如在pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH 7.4、pH 7.6、pH 7.8或pH 8.0 (例如約pH 5-8)下量測溶解度。在某些實施例中，在水或諸如PBS或NaCl (在存在或不存在NaP的情況下)之生理緩衝液中量測溶解度。在具體實施例中，在相對較低pH值(例如pH 6.0)及相對較高濃度鹽(例如500 mM NaCl及10 mM NaP)下量測溶解度。在某些實施例中，在諸如血液或血清之生物流體(溶劑)中量測溶解度。在某些實施例中，溫度可為約室溫(例如約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃)或約體溫(37℃)。在某些實施例中，藥劑在室溫下或在37℃下之溶解度為至少約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100 mg/mL。

「個體」或「有需要之個體」或「患者」或「有需要之患者」包括哺乳動物個體，諸如人類個體。

「大體上」或「基本上」意謂幾乎全部或完全，例如一些給出量之95%、96%、97%、98%、99%或超過99%。

「在統計學上顯著」意謂結果不太可能偶然發生。統計顯著性可藉由此項技術中已知之任何方法來加以確定。顯著性之常用度量包括p值，其為若虛無假設為真則所觀測事件將發生之頻率或機率。若所獲得之p值小於顯著性水準，則駁回虛無假設。在簡單情況下，顯著性水準界定為p值為0.05或小於0.05。

「治療反應」係指基於投與一或多種治療劑(例如結合物)的症狀改善(不論是否持續)。

如本文所使用，個體(例如哺乳動物，諸如人類)或細胞之「治療」為用於試圖改變個體或細胞之天然過程的任何類型之干預。治療包括(但不限於)投與醫藥組合物，且可以預防性執行或在病理性事件之初始或接觸病原性劑之後執行。亦包括「預防性」治療，其可針對降低所治療疾病或病狀之進展速率，延緩疾病或病狀之發作或降低其發作之嚴重性。「治療」或「預防」不一定指示疾病或病狀或其相關症狀之完全根除、治癒或預防。

術語「野生型」係指最常在群體中最常觀測到且因此任意指定為該基因之「普通」或「野生型」形式的基因或基因產物(例如多肽)。

除非另外明確說明，否則本說明書中之各實施例在加以必要修正後應用於其他每一實施例。

結合物 本發明之實施例部分地係關於以下出人意料之發現：精胺酸脫亞胺酶(ADI)與腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體(例如TRAIL)之結合(例如融合)使結合物之藥物動力學及/或生物活性相對於組件中之一或兩者單獨時改善，且在許多情況下協同地改善。亦相關的為以下發現：六聚或同源六聚多肽與三聚或同源三聚多肽之結合使結合物之藥物動力學及/或生物活性相對於組件中之一或兩者單獨時改善。亦相關的為以下發現：第一三聚多肽與第二三聚多肽(其與該第一三聚多肽不同)之結合使結合物之生物活性藥物動力學及/或生物活性相對於組件中之一或兩者單獨時改善。在一些情況下，結合物之各組件增強(例如協同地增強)另一組件之藥物動力學及/或生物活性。

因此，某些實施例係關於結合物，其包含精胺酸脫亞胺酶ADI共價連接於TNF超家族配位體(例如TRAIL)，其中之每一者均更詳細地描述於本文中。在一些實施例中，ADI與TNF超家族配位體之N端結合。在一些實施例中，ADI與TNF超家族配位體之C端結合。

亦包括結合物，其包含(a)六聚多肽共價連接於三聚多肽，或(b)第一三聚多肽共價連接於與該第一三聚多肽不同之第二三聚多肽。在一些情況下，六聚多肽為同源六聚多肽。(a)之六聚或同源六聚多肽的實例包括例如某些ADI，諸如來自鴿黴漿菌(Mycoplasma columbinum )、惰性黴漿菌(M. iners )、雞黴漿菌(M. gallinarum )及火雞黴漿菌(M. meleagridis )之原生ADI (例如分別為SEQ ID NO: 9、37、38、50)、來自表 A1 之嵌合ADI (例如SEQ ID NO: 57-68)及脂聯素或其類膠原蛋白結構域，其更詳細地描述於本文中。脂聯素為由胺基端信號肽、N端類膠原蛋白結構域及C端球狀結構域構成的244個胺基酸之蛋白質。脂聯素自身締合為更大結構，舉例而言，脂聯素分子經由類膠原蛋白結構域結合在一起以形成同源三聚物，且在一些情況下，該等三聚物繼續自身締合且形成六聚物。

在一些情況下，三聚多肽為同源三聚多肽。(b)之第一三聚或同源三聚多肽的實例包括脂聯素或其類膠原蛋白結構域、T4纖維蛋白或其三聚化結構域(foldon)、原膠原之C-原肽、界面活性蛋白A (SP -A)及甘露糖結合蛋白A (MBP-A)。如上文所指出，在一些情況下，脂聯素或其類膠原蛋白結構域自身締合為三聚物。噬菌體T4纖維蛋白為三股平行之多節段α-螺旋捲曲螺旋蛋白質。T4纖維蛋白之C端球狀結構域(foldon)對蛋白質之正確三聚化及摺疊至關重要，然而，foldon能夠在無纖維蛋白之捲曲螺旋部分存在下三聚化(參見Letarov等人，Biochemistry (Mosc). 64(7):817-23, 1999)。原纖原膠原之C-原肽藉由控制原膠原分子之細胞內組裝及膠原蛋白纖絲之細胞外組裝來在組織生長及修復中起關鍵作用，且負責選擇性形成各種原膠原之間的同源三聚物及某些異源三聚物(參見例如Bourhis等人，Nat Struct Mol Biol. 19(10):1031-1036, 2012)。界面活性蛋白A (SP-A)為與肺界面活性子相關之四種蛋白質中的一者，其以高親和力結合於肺泡磷脂膜，從而將該蛋白質定位在針對吸入病原體之第一道防線處。SP-A展現鈣依賴性碳水化合物結合、膠原凝集素家族之特徵及與脂膜組分之特異性相互作用。SP-A之碳水化合物識別結構域(CRD)與頸部結構域形成三聚結構(參見例如J. Biol Chem. 278(44):43254-60, 2003)。甘露糖結合蛋白(MBP)為見於血清中的C型(Ca(2+)依賴性)動物凝集素。其識別病原菌及真菌所特有之細胞表面寡醣結構，且觸發對此等生物體之中和。MBP之碳水化合物識別結構域(CRD)及將羧基端CRD連接於完整分子之類膠原蛋白部分的頸部結構域形成三聚結構(參見例如Weis及Drickamer, Structure. 2(12):1227-40, 1994)。因此，前述三聚多肽或其三聚片段/結構域中之任一者均可用作(b)之第一三聚多肽。

在一些實施例中，(a)之三聚或同源三聚多肽或(b)之第二三聚或同源三聚多肽為TNF超家族配位體或受體，其更詳細地描述於本文中。

在一些實施例中，對於(a)，六聚多肽共價連接於三聚多肽之N端，或對於(b)，第一三聚多肽共價連接於第二三聚多肽之N端。在一些實施例中，對於(a)，六聚多肽共價連接於三聚多肽之C端，或對於(b)，第一三聚多肽共價連接於第二三聚多肽之C端。

在一些情況下，結合物為融合蛋白質，舉例而言，其中該結合物之兩個組件之間的共價鍵完全由肽鍵構成。在一些情況下，結合物為非融合蛋白質，舉例而言，其中該結合物之組件之間的共價鍵包含至少一個非肽鍵，或其中在已分開地產生(例如以重組方式產生)該結合物之各多肽且視情況對其進行純化之後使共價鍵進行化學反應。

在一些實施例中，結合物在該結合物之各組件之間包含連接子，例如生理學上穩定之連接子。連接子之通用實例包括肽連接子(例如柔性及剛性肽連接子及非肽連接子。例示性連接子更詳細地描述於本文中。

在一些情況下，如上文所指出，結合物之至少一個組件改善該結合物之另一組件的一或多個特性，且在一些情況下，結合物協同地改善。在一些情況下，各組件改善結合物之另一組件的一或多個特性。在一些情況下，相對於該等組件中之一或兩者單獨時，結合物之一或多個特性改善。例示性特性包括物理及/或藥物動力學特性，諸如蛋白質穩定性、溶解度、血清半衰期、生物可用性、暴露及清除率。亦包括生物特性或活性。

在一些情況下，相對於一或兩個組件單獨時，結合物之生物活性增加。在一些情況下，相對於各組件單獨時，結合物對生物活性具有「相加」效應。「相加性」係指結合物活性增加約等於各組件單獨之活性組合相加。在一些情況下，相對於各組件單獨時，結合物對生物活性具有「協同」效應。「協同性」或「協同作用」係指結合物活性增加大於各組件單獨之活性組合相加。在一些情況下，結合物之一個組件「增強」另一組件的生物活性(舉例而言，在一些情況下，ADI增強TRAIL之活性)。「增強」係指在其中僅一個組件單獨具有活性或具有顯著活性的情況下結合物活性增加。在一些情況下，在結合物之組件之間存在「聯合作用(coalism)」，其係指在其中兩個組件本身均無活性的情況下之結合物活性。

在具體實施例中，結合物包含ADI共價連接於TNF超家族成員配位體(例如TRAIL、TNF-α、FasL)，且相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之藥物動力學、物理及/或生物特性改善。如上文所指出，例示性藥物動力學及物理特性包括穩定性增加、血清半衰期增加、生物可用性增加、暴露增加及清除率降低。在一些情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之穩定性及/或血清半衰期增加。在特定情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之穩定性及/或血清半衰期增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。

在一些情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之生物活性增加。在特定情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物之生物活性增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。在一些情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，生物活性之增加為協同性增加。在一些情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，生物活性增加為相加性增加。在特定實施例中，生物活性為在癌細胞中誘導細胞死亡或細胞凋亡及/或上調TNF超家族受體表現，例如死亡受體5 (DR5)。在具體情況下，結合物之ADI組件藉由例如上調癌細胞上DR5之表現來使TNF超家族配位體在癌細胞中誘導細胞死亡或細胞凋亡的能力相對於TNF超家族配位體單獨時增加例如約至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%。

在具體情況下，相對於ADI單獨及/或TNF超家族配位體單獨時，結合物的殺死腫瘤細胞及/或誘導細胞凋亡之活性增加(例如增加約至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%)或協同地增加。在一些情況下，癌細胞為ADI敏感性癌細胞，或表現較低或不可偵測之含量之精胺基丁二酸鹽合成酶-1 (ASS1)的癌細胞。在特定情況下，癌細胞(例如ADI敏感性癌細胞)係選自以下中之一或多者：乳癌細胞、肝細胞癌細胞、伯基特氏淋巴瘤細胞、結腸癌細胞、神經膠母細胞瘤癌細胞、白血病細胞、黑素瘤癌細胞、非小肺細胞癌(NSCLC)細胞、卵巢癌細胞、胰臟癌細胞、前列腺癌細胞及腎癌細胞。在一些情況下，癌細胞為ADI非敏感性或耐ADI性癌細胞，或表現相對較高含量之ASS1的癌細胞。在特定情況下，癌細胞(例如ADI非敏感性癌細胞)係選自乳癌細胞、結腸癌細胞及NSCLC細胞中之一或多者。

在一些實施例中，結合物包含六聚(例如同源六聚)多肽共價連接於三聚(例如同源三聚)多肽，且在一些情況下，與六聚多肽結合使三聚多肽之物理、藥物動力學及/或生物特性相對於該三聚多肽單獨時改善，且/或反之亦然。在一些實施例中，結合物包含第一三聚(例如同源三聚)多肽共價連接於第二三聚(例如同源三聚)多肽，且在一些情況下，與第一三聚多肽結合使第二三聚多肽之物理、藥物動力學及/或生物特性相對於該第二三聚多肽單獨時改善，且/或反之亦然。在一些情況下，相對於該等組件中之一或兩者單獨時，結合物之物理、藥物動力學及/或生物特性增加。在具體情況下，相對於一或兩個組件單獨時，結合物之穩定性及/或血清半衰期增加，舉例而言，其中結合物之穩定性及/或血清半衰期相對於一或兩個組件單獨時增加約至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。在一些情況下，相對於一或兩個組件單獨時，結合物之生物活性增加，舉例而言，其中結合物之生物活性相對於一或兩個組件單獨時增加約至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。

結合物之個別組件更詳細地描述於下文中。

精胺酸脫亞胺酶(ADI)。某些結合物包含一或多種精胺酸脫亞胺酶(ADI)，亦稱為ADI多肽或ADI酶。在一些實施例中，ADI多肽來自人類黴漿菌(M. hominis )、精胺酸黴漿菌(M. arginini )、 關節炎黴漿菌(M. arthritidis )、海豹腦黴漿菌(M. phocicerebrale )、貓黴漿菌(M. gateae )、 海豹黴漿菌(M. phocidae )、 鴿黴漿菌(M. columbinum )、 愛阿華黴漿菌(M. iowae )、 鱷魚黴漿菌(M. crocodyli )、 短吻鱷黴漿菌(M. alligatoris )、 奧氏嗜熱鹽絲菌(H. orenii )或牛黴漿菌(M. bovis )。在一些實施例中，ADI多肽來自唾液黴漿菌(Mycoplasma salivarium )、起泡黴漿菌(Mycoplasma spumans )、加拿大黴漿菌(Mycoplasma canadense )、耳黴漿菌(Mycoplasma auris )、豬關節液黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae )、泄殖腔黴漿菌(Mycoplasma cloacale )、鵝黴漿菌(Mycoplasma anseris )、產鹼黴漿菌(Mycoplasma alkalescens )、口腔黴漿菌(Mycoplasma orale )、惰性黴漿菌(Mycoplasma iners )、火雞黴漿菌(Mycoplasma meleagridis )、腸黴漿菌(Mycoplasma alvi )、穿透性黴漿菌(Mycoplasma penetrans )、雞黴漿菌(Mycoplasma gallinarum )、梨形黴漿菌(Mycoplasma pirum )、靈長類黴漿菌(Mycoplasma primatum )、醱酵黴漿菌(Mycoplasma fermentans )、產脂黴漿菌(Mycoplasma lipofaciens )、貓喉黴漿菌(Mycoplasma felifaucium )、模擬黴漿菌(Mycoplasma imitans )、乳光黴漿菌(Mycoplasma opalescens )、毛氏黴漿菌(Mycoplasma moatsii )、象黴漿菌(Mycoplasma elephantis )、肺炎黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae )、龜黴漿菌(Mycoplasma testudinis )、黴漿菌CAG:877 或黴漿菌CAG:472 。

說明性ADI多肽之胺基酸序列提供於下表 A1 中。

因此，在一些實施例中，結合物之ADI組件包含選自表 A1 之胺基酸序列(SEQ ID NO: 1-68)或其活性變異體或片段，由其組成或基本上由其組成。活性變異體及片段之特定實例包含與選自表 A1 之序列至少80%、95%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。多肽「變異體」及「片段」之額外實例描述於本文中其他地方。

在某些實施例中，ADI具有「ADI活性」或將精胺酸轉化或代謝為瓜胺酸及氨氣之能力。ADI活性可根據此項技術中之常規技術來加以量測。舉例而言，L-瓜胺酸之量可藉由比色終點分析(參見例如Knipp及Vasak, Analytical Biochem. 286:257-264, 2000)來加以偵測，且將其與已知量之L-瓜胺酸的標準曲線相比以便計算ADI之比活性，其可表示為每毫克蛋白質之IU。在一些實施例中，1 IU之ADI酶活性定義為在所測試之pH值及溫度下每分鐘產生1 µmol瓜胺酸的酶之量。

在一些實施例中，ADI為六聚或同源六聚ADI，舉例而言，ADI在其自然狀態下及/或在與結合物之TNF超家族配位體組件結合後能夠形成六聚或同源六聚結構。在不受任一理論束縛的情況下，假設結合物之ADI組件的六聚或同源六聚結構可使結合物之TNF超家族配位體組件穩定，尤其在該TNF超家族配位體組件在其自然狀態下及/或在與結合物之ADI組件結合後能夠形成三聚或同源三聚結構時穩定。六聚或同源六聚ADI之特定實例包括來源於鴿黴漿菌、惰性黴漿菌、雞黴漿菌及火雞黴漿菌之原生ADI (例如分別為SEQ ID NO: 9、37、38、50)、及來自表 A1 之嵌合ADI (例如SEQ ID NO: 57-68)，包括其活性變異體及片段。

本文所描述之任何一或多種ADI多肽均可與本文所描述之任何一或多種TNF超家族配位體或三聚(例如同源三聚)多肽組合以形成結合物，例如融合蛋白質。

TNF超家族配位體。某些結合物包含一或多種腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體，亦稱為TNF超家族配位體多肽。腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)為特徵在於經由細胞外富含半胱胺酸之結構域結合腫瘤壞死因子(TNF)之能力的細胞介素受體的蛋白質超家族。除神經生長因子(NGF)之外，所有TNF均與原型TNF-α同源。TNF受體主要參與細胞凋亡及炎症，但亦調節其他信號轉導路徑，諸如細胞增殖、存活及分化。術語死亡受體係指TNF受體超家族中含有死亡結構域之彼等成員，其實例包括TNFR1、Fas受體、死亡受體4 (DR4)及死亡受體5 (DR5)。

TNF超家族受體及其相對應配位體之說明性列表提供於下表 T1 中。

因此，在某些實施例中，結合物之TNF超家族配位體組件係選自表 T1 中之配位體多肽。在某些實施例中，TNF超家族配位體為選自表 T1 之人類多肽配位體。

在一些實施例中，TNF超家族配位體為三聚或同源三聚多肽。如上文所指出，根據一種非限制性理論，結合物之ADI組件的六聚或同源六聚結構可使該結合物之三聚或同源三聚TNF超家族配位體組件穩定。在某些實施例中，TNF超家族配位體為選自表 T1 之三聚或同源三聚多肽配位體。

在一些實施例中，TNF超家族配位體在癌細胞中誘導細胞凋亡，例如藉由結合於TNF超家族受體之死亡結構域或死亡受體來誘導。因此，在一些實施例中，TNF超家族配位體(例如三聚或同源三聚配位體)結合於至少一個TNF死亡受體或含有至少一個死亡結構域之TNF超家族受體。TNF超家族死亡受體之實例包括TNFR1、Fas受體、DR4及DR5。死亡受體配位體之特定實例包括TRAIL、TNF-α及FasL。因此，在某些實施例中，結合物之TNF超家族配位體組件係選自TRAIL、TNF-α及FasL中之一或多者，視情況選自人類TRAIL、人類TNF-α或人類FasL。

人類TRAIL、人類TNF-α及人類FasL之胺基酸序列提供於下表 T2 中。

在一些實施例中，結合物之TNF超家族配位體組件包含選自表 T2 之胺基酸序列(SEQ ID NO: 69-72)或其活性變異體或片段，由其組成或基本上由其組成。變異體及片段之特定實例包含與選自表 T2 之序列至少80%、95%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。活性多肽「變異體」及「片段」之額外實例描述於本文中其他地方。

在具體實施例中，結合物之TNF超家族配位體組件為人類TNF相關細胞凋亡誘導性配位體(TRAIL)多肽或其變異體或片段。TRAIL為由大部分正常組織細胞產生及分泌之細胞介素。其在腫瘤細胞中引起細胞凋亡，例如藉由結合於某些死亡受體而引起細胞凋亡。所預測281個胺基酸之TRAIL蛋白質具有II型膜蛋白質之特徵結構，其具有單個內部疏水性結構域而無信號序列。TRAIL之細胞外C端結構域與其他TNF家族成員之C端結構域共有22%至28%一致性。在TRAIL與其信號傳導受體DR4及DR5之間形成複合物藉由誘導細胞內死亡結構域之寡聚來觸發細胞凋亡。

在某些實施例中，結合物之TRAIL組件包含來自表 T2 之TRAIL序列(SEQ ID NO: 69及70)或其變異體或片段，由其組成或基本上由其組成。TRAIL變異體之具體實例包括具有以下取代中之任何一或多者的彼等變異體；S96C、S101C、S111C、R170C及K179C。在一些實施例中，TRAIL變異體在選自以下中之一或多者的殘基位置處具有一組胺基酸取代：Y189Q、R191K、Q193R；H264R、I266L、D267Q；Y189Q、R191K、Q193R；及Y189Q、R191K、Q193R、I266L (參見美國申請案第2013/0165383號；及第2012/0165267號，其以引用之方式併入)。TRAIL片段之特定實例包括全長序列(SEQ ID NO: 69)之殘基114-281 (細胞外結構域)、殘基95-281、殘基92-281、殘基91-281、殘基41-281、殘基39-281、殘基15-281、殘基119-281及殘基1-281。多肽「變異體」及「片段」之額外實例描述於本文中其他地方。

本文所描述之TNF超家族配位體中的任何一或多者均可與本文所描述之ADI多肽或六聚(例如同源六聚)多肽中的任何一或多者組合以形成結合物，例如融合蛋白質。

連接子。某些結合物包含一或多個連接基團。術語「連接」、「連接子」、「連接部分」或「L」在本文中用以指可用於將結合物之一個多肽組件與另一多肽組件分隔開，例如將ADI多肽與TNF超家族配位體分隔開或將六聚多肽與三聚多肽分隔開的連接子。連接子可為生理學上穩定的，或可包含可釋放連接子，諸如不穩定連接子或可酶促分解之連接子(例如可蛋白水解裂解之連接子)。在某些態樣中，連接子為肽連接子。在一些態樣中，連接子為非肽連接子或非蛋白質連接子。

某些實施例包含一或多個肽連接子。此類肽連接子序列可使用此項技術中之標準技術來併入結合物(例如融合多肽)中。

某些肽連接子序列可基於以下例示性因素來加以選擇：(1)其能採用柔性延伸構形；(2)其不能採用可能與第一及第二多肽上之功能性抗原決定基相互作用的二級結構；(3)其生理學穩定性；及(4)缺乏可能與多肽功能性抗原決定基反應之疏水性或帶電殘基，或其他特徵。參見例如George及Heringa, J Protein Eng. 15:871-879, 2002。在一些實施例中，肽連接子為剛性連接子。在一些實施例中，肽連接子為柔性連接子。在特定實施例中，柔性連接子可使用能夠對肽本身進行模型化之電腦程式(Desjarlais & Berg, PNAS. 90:2256-2260, 1993；及PNAS. 91:11099-11103, 1994)或藉由噬菌體呈現方法來加以合理設計。

在一些實施例中，肽連接子序列之長度為1至約200個胺基酸。例示性連接子之總胺基酸長度可為約1-200個胺基酸、1-150個胺基酸、1-100個胺基酸、1-90個胺基酸、1-80個胺基酸、1-70個胺基酸、1-60個胺基酸、1-50個胺基酸、1-40個胺基酸、1-30個胺基酸、1-20個胺基酸、1-10個胺基酸、1-5個胺基酸、1-4個胺基酸、1-3個胺基酸，或約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200或超過200個胺基酸。

肽連接子可採用如本文中其他地方所描述及此項技術中已知之任何一或多種天然存在之胺基酸、非天然存在之胺基酸、胺基酸類似物及/或胺基酸模擬物。可適用作連接子之某些胺基酸序列包括Maratea等人，Gene 40:39-46, 1985；Murphy等人，PNAS USA. 83:8258-8262, 1986；美國專利第4,935,233號及美國專利第4,751,180號中所揭示之彼等胺基酸序列。特定肽連接子序列含有Gly、Ser及/或Asn殘基。必要時亦可在肽連接子序列中採用其他近中性胺基酸，諸如Thr及Ala。

某些例示性肽連接子提供於下表 L1 中。

因此，在某些實施例中，結合物(例如融合多肽)包含一或多個選自表 P1 之肽連接子。

在一些實施例中，舉例而言，在非融合物或化學連接之結合物中，連接子為非肽連接子。舉例而言，在一些實施例中，連接子為經構築以含有烷基或芳基主鏈之有機部分，且含有醯胺、醚、酯、腙、二硫鍵或其任何組合。含有胺基酸、醚及醯胺結合之組件的連接在生理pH值(在血清中通常7.4)之條件下穩定。亦包括含有酯或腙且在血清pH值下穩定的鍵。

在一些情況下，連接子包括增加兩個接合原子之間距離的間隔子。間隔子可進一步增加連接子之柔性及/或長度。間隔子可包括(但不限於)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其中之每一者均可含有一或多個雜原子、雜環、胺基酸、核苷酸及醣類。

在一些實施例中，連接子之長度為約1至約30個原子，或長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個原子(包括兩者之間的所有範圍)。在某些實施例中，連接子之長度為約1至30個原子，其中碳鏈原子可由獨立地選自由O、N或S組成之群的雜原子取代。在一些實施例中，1-4個或5至15個C原子經獨立地選自O、N、S之雜原子取代。

在某些實施例中，連接子包含選自以下之結構或由其組成：-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-O-CH₂ -、-CH₂ -O-、-O-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -O-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -O-、-O-CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -O-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -O-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -O-、-O-CH₂ -CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -O-CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -O-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -O-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -CH₂ -O-、-C(O)-NH-CH₂ -、-C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH -、-NH-C(O)-CH₂ -、-CH₂ -NH-C(O)-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -NH-C(O)-CH₂ -、-NH-C(O)-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -NH-C(O)-CH₂ -CH₂ 、-CH₂ -CH₂ -NH-C(O)-CH₂ -CH₂ 、-C(O)-NH-CH₂ -、-C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -、-O-C(O)-NH-CH₂ -、-O-C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -、-NH-CH₂ -、-NH-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -NH-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -NH-CH₂ -、-C(O)-CH₂ -、-C(O)-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -C(O)-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -C(O)-CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -C(O)-CH₂ -CH₂ -、-CH₂ -CH₂ -C(O)-、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -NH-、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -NH-C(O)-、-CH₂ -CH₂ -CH₂ -C(O)-NH-CH₂ -CH₂ -NH-C(O)-CH₂ -、二價環烷基、-N(R⁶ )-，R⁶ 為H或選自由以下組成之群的有機基團：烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基及經取代之芳基。

在一些實施例中，連接子為穩定連接子。在一些實施例中，穩定連接子係選自由以下組成之群：丁二醯亞胺、丙酸、羧甲基化連接、醚、胺基甲酸酯、醯胺、胺、脲、醯亞胺、脂肪族C-C鍵及硫醚。在一些實施例中，舉例而言，連接基團為親水性的，以增強結合物在體液中之溶解度。

在一些實施例中，連接子包含諸如聚乙二醇或聚丙二醇之聚合物，或由其組成。如本文所使用，術語「PEG」、「聚乙二醇」及「聚(乙二醇)」可互換，且意欲涵蓋任何水溶性聚(環氧乙烷)衍生物。PEG為在許多水性及有機溶劑中具有良好溶解度之熟知聚合物，其展現低毒性、缺乏免疫原性，且為透明、無色、無氣味且穩定的。如本文所描述，相似產物可用其他水溶性聚合物來獲得，該等水溶性聚合物包括(但不限於)聚乙烯醇；其他聚(環氧烷)，諸如聚(丙二醇)及其類似物；聚(氧乙基化多元醇)，諸如聚(氧乙基化甘油)及其類似物；羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐及聚胺基酸。熟習此項技術者將能夠基於所需劑量、循環時間、耐蛋白水解性及其他考慮因素來選擇所要聚合物。

通常，根據本文所描述之結合物使用的PEG包含以下結構「-(OCH2CH2)n-」，其中(n)為約1至4000、約20至1400或約20-800。在特定實施例中，視末端氧是否已經置換而定，PEG亦包括「-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-」及「-(OCH2CH2)n-O-」。術語「PEG」包括具有各種末端或「封端」基團之結構。術語「PEG」亦包括含有大部分(換言之，超過50%) -OCH2CH2-重複子單元的聚合物。關於具體形式，PEG可呈現任何數目之多種分子量以及結構或幾何形狀，諸如「支化」、「線性」、「分叉」、「多官能性」PEG分子。

用於使此類聚合物與活性部分結合之代表性聚合試劑及方法描述於Harris, J.M.及Zalipsky, S.編, Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS, Washington, 1997；Veronese, F.及J.M. Harris編, Peptide and Protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews, 54(4); 453-609 (2002)；Zalipsky, S.等人，「Use of Functionalized Poly Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides」 Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris編, Plenus Press, New York (1992)；Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16:157-182；及Roberts等人，Adv. Drug Delivery Reviews, 54, 459-476 (2002)中。

多種PEG衍生物均可商購，且適合用於製備本發明PEG-結合物。舉例而言，NOF Corp.之SUNBRIGHT®系列提供許多用於藉由各種方法與多肽及聚核苷酸偶合的PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇及經活化之PEG衍生物，諸如丁二醯亞胺酯、甲氧基-PEG胺、順丁烯二醯亞胺及羧酸，且Nektar Therapeutics之Advanced PEGylation亦供應不同PEG偶合技術以提昇治療劑之安全性及功效。用於形成結合物之額外PEG包括可購自Polypure (挪威)、QuantaBioDesign LTD (俄亥俄州)、JenKem Technology、Nanocs Corporation及Sunbio, Inc (南韓)之彼等PEG。適合用於形成結合物之其他PEG試劑及結合方法描述於例如Pasut等人，Expert Opin. Ther. Patents. 14(6) 859-893, 2004中。

製備線性或支化PEG聚合物及其衍生物或結合物描述於例如美國專利第4,904,584號；第5,428,128號；第5,621,039號；第5,622,986號；第5,643,575號；第5,728,560號；第5,730,990號；第5,738,846號；第5,811,076號；第5,824,701號；第5,840,900號；第5,880,131號；第5,900,402號；第5,902,588號；第5,919,455號；第5,951,974號；第5,965,119號；第5,965,566號；第5,969,040號；第5,981,709號；第6,011,042號；第6,042,822號；第6,113,906號；第6,127,355號；第6,132,713號；第6,177,087號；第6,180,095號；第6,448,369號；第6,495,659號；第6.602,498號；第6,858,736號；第6,828,401號；第7,026,440號；第7,608,678號；第7,655,747號；第7,786,221號；第7,872,072號；及第7,910,661號中，其中之每一者均以全文引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，前述連接子為視情況選用的。

多肽變異體。某些實施例包括本文所描述之參考序列的「變異體」及「片段」，不論是藉由名稱還是參考表或序列識別符來描述。實例包括本文所描述之ADI多肽、TNF超家族配位體多肽及融合多肽中之任一者。「變異」序列係指與參考序列相差一或多個取代、缺失(例如截短)、添加及/或插入的多肽或聚核苷酸序列。變異多肽具有生物活性，亦即其繼續具有參考多肽之酶或結合活性。此類變異體可由例如遺傳多形現象及/或由人類操縱產生。

在許多情況下，生物活性變異體將含有一或多個保守取代。「保守取代」為其中一個胺基酸經取代為另一個具有相似特性之胺基酸，以使得熟習肽化學技術者將預期多肽之二級結構及親水性質大體上不變的一種取代。如上文所描述，修飾可在本發明之聚核苷酸及多肽的結構中進行，且仍獲得編碼具有所期望特徵之變異或衍生多肽的功能性分子。當需要改變多肽之胺基酸序列以產生等效或甚至改善的本文所描述之多肽的變異體或部分時，熟習此項技術者將通常改變編碼用DNA序列之一或多個密碼子。

舉例而言，某些胺基酸可經取代為呈相互作用結合能力無明顯損失之蛋白質結構形式的其他胺基酸。由於蛋白質之相互作用能力及性質界定該蛋白質之生物學功能活性，故可在蛋白質序列及當然其基礎DNA編碼序列中進行某些胺基酸序列取代，且仍然獲得具有類似特性之蛋白質。因此，預期可在所揭示之組合物的肽序列或編碼該等肽之相應DNA序列中進行各種變化，而其效用無明顯損失。

在進行此類變化時，可考慮胺基酸之親水指數。在此項技術中一般理解胺基酸親水指數在賦予蛋白質相互作用生物功能中之重要性(Kyte及Doolittle, 1982，其以引用之方式併入本文中)。公認胺基酸之相對親水特徵促成所得蛋白質之二級結構，該二級結構隨後界定蛋白質與其他分子(例如酶、受質、受體、DNA、抗體、抗原及其類似物)之相互作用。各胺基酸已基於其疏水性及電荷特徵而指定親水指數(Kyte及Doolittle, 1982)。此等值為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。此項技術中已知某些胺基酸可由具有相似親水指數或得分之其他胺基酸取代，而仍產生具有相似生物活性之蛋白質，亦即仍獲得生物學功能上等效之蛋白質。在進行此類變化時，用親水指數在±2內之胺基酸取代較佳，用親水指數在±1內之彼等胺基酸取代尤其較佳，且用親水指數在±0.5內之彼等胺基酸取代甚至更尤其較佳。

在此項技術中亦應理解，可基於親水性有效地進行類似胺基酸之取代。美國專利4,554,101 (具體地以全文引用之方式併入本文中)陳述蛋白質之最大局部平均親水性(如由其鄰接胺基酸之親水性所調節)與該蛋白質之生物學特性相關。如在美國專利4,554,101中所詳述，已對胺基酸殘基指定以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0 ± 1)；麩胺酸(+3.0 ± 1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5 ± 1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸 (-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)；色胺酸(-3.4)。應理解，一個胺基酸可經取代為另一個具有相似親水性值之胺基酸，而仍獲得生物學上等效且尤其免疫學上等效之蛋白質。在此類變化中，用親水性值在±2內之胺基酸取代較佳，用親水性值在±1內之彼等胺基酸取代尤其較佳，且用親水性值在±0.5內之彼等胺基酸取代甚至更尤其較佳。

如上文所概述，胺基酸取代因此一般係基於胺基酸側鏈取代基之相對相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小及其類似性質。將各種前述特徵考慮在內之例示性取代為熟習此項技術者所熟知的，且包括：精胺酸及離胺酸；麩胺酸及天冬胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；麩醯胺及天冬醯胺；以及纈胺酸、白胺酸及異白胺酸。

胺基酸取代可進一步基於殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩親性中的相似性來進行。舉例而言，帶負電之胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸；帶正電之胺基酸包括離胺酸及精胺酸；而具有親水性值相似之不帶電極性頭基的胺基酸包括白胺酸、異白胺酸及纈胺酸；甘胺酸及丙胺酸；天冬醯胺及麩醯胺；以及絲胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸及酪胺酸。可代表保守變化之其他組胺基酸包括：(1) ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2) cys、ser、tyr、thr；(3) val、ile、leu、met、ala、phe；(4) lys、arg、his；及(5) phe、tyr、trp、his。

變異體亦可(或可替代地)含有非保守變化。在一個較佳實施例中，變異多肽與原生或參考序列相差少於約10、9、8、7、6、5、4、3、2個胺基酸或甚至1個胺基酸之取代、缺失或添加。變異體亦可(或可替代地)藉由例如缺失或添加胺基酸來加以修飾，該等胺基酸對多肽之免疫原性、二級結構、酶活性及/或親水性質影響最小。

在某些實施例中，多肽序列之長度為約、至少約或至多約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或超過1000個連續胺基酸(包括兩者之間的所有整數)，且其可包含參考序列(參見例如表或序列表)之全部或一部分。

在一些實施例中，多肽序列由約或不超過約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800. 800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或超過1000個連續胺基酸組成(包括兩者之間的所有整數)，且其可包含參考序列(參見例如表或序列表)之全部或一部分。

在某些實施例中，多肽序列為約10-1000、10-900、10-800、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-20、20-1000、20-900、20-800、20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、50-1000、50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-1000、100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400或200-300個連續胺基酸(包括兩者之間的所有範圍)，且其包含參考序列之全部或一部分。在某些實施例中，任何參考多肽之C端或N端區均可截短約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800或超過800個胺基酸，或截短約10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800或超過800個胺基酸(包括兩者之間的所有整數及範圍) (例如101、102、103、104、105)，只要經截短之多肽保留參考多肽之結合特性及/或活性即可。通常，生物活性片段之活性不低於其所來源於之生物活性參考多肽之活性的約1%、約5%、約10%、約25%或約50%。

在某些情況下，變異體將顯示與參考多肽序列之至少約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%相似性或序列一致性或序列同源性。此外，涵蓋與原生或母體序列相差約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個胺基酸(包括兩者之間的所有整數及範圍)的添加(例如C端添加、N端添加、兩者)、缺失、截短、插入或取代(例如保守取代)但保留母體或參考多肽序列之特性或活性的序列。

在一些實施例中，變異多肽與參考序列相差至少一個但少於50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個胺基酸殘基。在某些實施例中，變異多肽與參考序列相差至少1%但少於20%、15%、10%或5%之殘基。(若此比較需要比對，則序列應為了最大相似性來進行比對。來自缺失或插入之「環狀(Looped)」外序列或錯配視為差異。)

對序列之間的序列相似性或序列一致性(該等術語在本文中可互換使用)之計算如下執行。為了確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比，出於最佳比較目的來比對序列(例如可將間隙引入至第一及第二胺基酸或核酸序列中之一或兩者中用於最佳比對，且出於比較目的可忽略非同源序列)。在某些實施例中，出於比較目的比對之參考序列長度為參考序列長度之至少30%、較佳至少40%、更佳至少50%、60%且甚至更佳至少70%、80%、90%、100%。隨後比較相對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。當第一序列中之位置由與第二序列中之相對應位置處相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則分子在該位置處一致。

在考慮到需要引入以供用於最佳比對兩個序列的間隙之數目及各間隙之長度的情況下，該兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有之一致位置之數目的函數。

可使用數學演算法來實現序列比較及兩個序列之間一致性百分比的確定。在一個較佳實施例中，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比使用已併入GCG套裝軟體之GAP程序中之Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453, 1970)演算法，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來加以確定。在另一較佳實施例中，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比使用GCG套裝軟體中之GAP程序，使用NWSgapdn CMP矩陣以及40、50、60、70或80之間隙權數及1、2、3、4、5或6之長度權數來加以確定。一組尤其較佳之參數(及應使用者，除非另外說明)為Blossum 62計分矩陣，其使用間隙罰分12、間隙擴展罰分4及讀框轉移間隙罰分5。

兩個胺基酸或核苷酸序列之間的一致性百分比可使用E. Meyers及W. Miller (Cabios. 4:11-17, 1989)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權數殘基表、間隙長度罰分12及間隙罰分4來加以確定。

本文所描述之核酸及蛋白質序列可作為「查詢序列」用於對照公共資料庫執行搜尋，以例如鑑別其他家族成員或相關序列。此類搜尋可使用Altschul等人，(1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10)之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)來執行。BLAST核苷酸搜尋可用NBLAST程式(得分=100，字長=12)來執行，以獲得與本文所描述之核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜尋可用XBLAST程序(得分=50，字長=3)來執行，以獲得與本文所描述之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得間隙式比對以達成比較目的，可如Altschul等人，(Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997)中所描述利用間隙式BLAST。當利用BLAST及間隙式BLAST程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。

在一個實施例中，如上文所指出，可使用BLAST比對工具來評估聚核苷酸及/或多肽。局部比對僅由一對序列節段組成，其中一個來自所比較序列中之一者。Smith-Waterman或Sellers演算法之改良將發現所有不可藉由擴展或削減而提昇得分之節段對，稱為高分節段對(high-scoring segment pair，HSP)。BLAST比對結果包括統計量測以指出BLAST得分可單獨自機率預期之可能性。

原始得分S自與各比對序列相關之間隙及取代數目計算，其中較高相似性得分指示較顯著比對。取代得分由查找表(參見PAM、BLOSUM)給出。

間隙得分通常以間隙開放罰分G及間隙擴展罰分L之總和計算。對於長度n之間隙，間隙成本應為G+Ln。間隙成本、G及L之選擇為經驗的，但習慣選擇高G值(10-15，例如11)及低L值(1-2，例如1)。

位得分S'來源於原始比對得分S，其中已考慮所用計分系統之統計特性。位得分根據計分系統標準化，因此其可用於比較來自不同搜尋之比對得分。術語「位得分」及「相似性得分」可互換使用。位得分給出比對良好程度之指示；得分愈高，比對愈佳。

E值或期望值描述具有相似得分之序列將偶然出現於資料庫中之可能性。其為對預期偶然出現於資料庫搜尋中的得分相當於或比S較佳之不同比對數目之預測。E值愈小，比對愈顯著。舉例而言，比對之E值為e^-117 意謂具有相似得分之序列不太可能僅偶然出現。另外，比對無規胺基酸對之預期得分需要為負，否則長比對將傾向於具有獨立於不論比對之片段是否相關之高分。另外，BLAST演算法使用適當取代矩陣、核苷酸或胺基酸且間隙式比對使用間隙形成及擴展罰分。舉例而言，BLAST比對及多肽序列之比較通常使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11及間隙擴展罰分1來進行。

在一些實施例中，自使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11及間隙擴展罰分1進行之BLAST分析報導序列相似性得分。

在一個特定實施例中，本文所提供之序列一致性/相似性得分係指使用GAP 10版(GCG, Accelrys, San Diego, Calif.)，使用以下參數所獲得之值：針對核苷酸序列之一致性%及相似性%使用間隙權數50及長度權數3以及nwsgapdna.cmp計分矩陣；針對胺基酸序列之一致性%及相似性%使用間隙權數8及長度權數2以及BLOSUM62計分矩陣(Henikoff及Henikoff,PNAS USA . 89:10915-10919, 1992)。GAP使用Needleman及Wunsch (J Mol Biol . 48:443-453, 1970)之演算法以發現使匹配數目最大且間隙數目最小的兩個完整序列之比對。

在特定實施例中，變異多肽包含可與參考多肽序列(參見例如序列表)最佳對齊以產生BLAST位得分或序列相似性得分為50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或超過1000 (包括兩者之間的所有整數及範圍)的胺基酸序列，其中BLAST比對使用BLOSUM62矩陣、間隙存在罰分11及間隙擴展罰分1。

如上文所指出，參考多肽可以多種方式改變，包括胺基酸取代、缺失、截短、添加及插入。此類操控方法一般為此項技術中已知的。舉例而言，可藉由DNA中之突變製備參考多肽之胺基酸序列變異體。突變誘發及核苷酸序列改變之方法為在此項技術中熟知的。參見例如Kunkel (PNAS USA. 82: 488-492, 1985)；Kunkel等人，(Methods in Enzymol. 154: 367-382, 1987)，美國專利第4,873,192號，Watson, J. D.等人，(「Molecular Biology of the Gene」, 第四版, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)，且該等參考文獻引用於本文中。關於不影響所關注蛋白質之生物活性的適當胺基酸取代之指導可見於Dayhoff等人，(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)之模型中。

篩選由此類修飾製造之組合庫之基因產物及篩選用於具有所選擇特性之基因產物之cDNA庫的方法為此項技術中已知的。此類方法適合於快速篩選由參考多肽之組合突變誘發產生之基因庫。作為一個實例，一種增強庫中功能突變體頻率之技術，遞歸集合突變誘發(recursive ensemble mutagenesis，REM)可與篩選分析組合使用以鑑別多肽變異體(Arkin及Yourvan, PNAS USA 89: 7811-7815, 1992；Delgrave等人，Protein Engineering. 6: 327-331, 1993)。

多肽修飾。某些實施例包括包含至少一種「修飾劑」之結合物，該修飾劑之實例包括(但不限於)大分子聚合物、蛋白質、肽、多醣及其他化合物。在一些情況下，修飾劑附接至結合物之ADI組件、結合物之TNF超家族配位體組件或兩者上。在一些實施例中，修飾劑僅附接至結合物之ADI組件上，亦即，修飾劑不附接至結合物之TNF超家族配位體(例如TRAIL)組件上。結合物及修飾劑可藉由共價鍵或非共價相互作用連接以形成穩定結合物或穩定組合物以達成所要作用。在某些實施例中，經修飾之結合物保留相對應未經修飾之結合物(例如相同或相似序列)的生物活性，且比相對應未經修飾之結合物的活體內半衰期更長且抗原性更低。在某些實施例中，經修飾之結合物保留相對應未經修飾之結合物的30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%生物活性。一般而言，經修飾之結合物保留足以用於治療用途之生物活性。

在一些實施例中，修飾劑為具有生物相容性且增加結合物在血液中之半衰期的聚合物或蛋白質或其片段。修飾劑可與結合物或其組件化學偶合，或適用時，經由融合蛋白質表現連接於結合物或其組件。

大分子聚合物可包括非肽大分子聚合物，其在某些實施例中可具有其自身生物活性。適合之聚合物包括(但不限於)聚烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯啶酮、聚胺基酸、二乙烯醚與順丁烯二酸酐之共聚物、N-(2-羥基丙基)-甲基丙烯醯胺、多醣、聚氧乙烯化之多元醇、肝素或其片段、聚烷基乙二醇及其衍生物、聚烷基乙二醇與其衍生物之共聚物、聚(乙烯基乙基醚)、a,P-聚[(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺]、聚羧酸酯、聚氧乙烯-氧甲烯、聚丙烯醯嗎啉、胺基化合物與氧化烯烴之共聚物、聚玻尿酸、聚環氧乙烷、乙二酸與丙二酸之共聚物、聚(1,3-二氧雜環戊烷)、乙烯與順丁烯二醯肼共聚物、聚唾液酸、環糊精等。在某些實施例中，聚合物為聚乙二醇。

如本文所使用之聚烯醇化合物包括(但不限於)聚乙二醇(包括單甲氧基聚乙二醇、單羥基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙醇、聚丁烯醇及其類似物，及其衍生物(諸如脂質)。

聚醚化合物包括(但不限於)聚烷二醇(HO((CH2)_x O)_n H)、聚丙二醇、聚氧乙烯(HO((CH₂ )₂ O)_n H)、聚乙烯醇((CH₂ CHOH)_n )。

聚胺基酸包括(但不限於)一種類型之胺基酸的聚合物或兩種或超過兩種類型之胺基酸的共聚物，例如聚丙胺酸或聚離胺酸、或其嵌段共聚物。

多醣包括(但不限於)聚葡萄糖及其衍生物(例如硫酸葡聚糖)、纖維素及其衍生物(包括甲基纖維素及羧甲基纖維素)、澱粉及其衍生物、聚蔗糖等。

在特定實施例中，修飾劑為PEG分子。「聚乙二醇」或「PEG」係指環氧乙烷與水之縮合聚合物(呈支化或直鏈形式)的混合物，由通式H(OCH₂ CH₂ )_n OH表示，其中n為至少4。在一些情況下，PEG附接至結合物之ADI組件、結合物之TNF超家族配位體組件或兩者上。在一些實施例中，PEG僅附接至結合物之ADI組件上，亦即，PEG不附接至結合物之TNF超家族配位體(例如TRAIL)組件上。

「聚乙二醇」或「PEG」與數字後綴組合使用以指示其大致重量平均分子量。舉例而言，PEG5,000係指總重量平均分子量為約5,000之PEG；PEG12,000係指總重量平均分子量為約12,000之PEG；而PEG20,000係指總重量平均分子量為約20,000之PEG。

在一些實施例中，PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000；約3,000至約40,000；約5,000至約30,000；約8,000至約30,000；約11,000至約30,000；約12,000至約28,000；約16,000至約24,000；約18,000至約22,000；或約19,000至約21,000。在一些實施例中，PEG之總重量平均分子量為約1,000至約50,000；約3,000至約30,000；約3,000至約20,000；約4,000至約12,000；約4,000至約10,000；約4,000至約8,000；約4,000至約6,000；或約5,000。在具體實施例中，PEG之總重量平均分子量為約20,000。一般而言，分子量為30,000或超過30,000之PEG難以溶解，且調配產品之產量可能減少。PEG可為支化或直鏈。PEG可為支化或直鏈，且在某些實施例中為直鏈。具有本文所描述之分子量的PEG可與結合物或其組件，且視情況與生物相容性連接子結合使用。

某些實施例採用硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG。在一些實施例中，硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG附接至一或多個天然存在之半胱胺酸殘基、一或多個引入之半胱胺酸殘基(例如，用半胱胺酸殘基取代一或多個野生型殘基，插入一或多個半胱胺酸殘基)或其任何組合上(參見例如Doherty等人，Bioconjug Chem. 16:1291-98, 2005)。在具體實施例中，結合物之ADI組件具有K192C及/或K287C取代中之一或兩者以用於附接至半胱胺酸反應性PEG上。在某些實施例中，結合物之再一個野生型半胱胺酸殘基經另一種胺基酸取代以防止PEG聚合物附接至野生型半胱胺酸上，例如防止PEG破壞在其他情況下所期望之生物活性。一些實施例採用一或多種非天然半胱胺酸衍生物(例如高半胱胺酸)代替半胱胺酸。

硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG之非限制性實例包括甲氧基PEG順丁烯二醯亞胺(M-PEG-MAL) (例如MW 2000、MW 5000、MW 10000、MW 20000、MW 30000、MW 40000)。M-PEG-MAL與蛋白質及肽中半胱胺酸側鏈上之硫醇基反應以產生穩定3-硫代丁二醯亞胺基醚鍵。此反應具有高選擇性，且可在溫和條件下在約pH 5.0-6.5下在其他官能基存在下進行。因此，在某些實施例中，結合物或其組件與本文所描述之硫醇、硫氫基或半胱胺酸反應性PEG分子中的任何一或多者結合。

結合物或其組件可在存在或不存在連接子的情況下共價鍵結於修飾劑，諸如PEG。在一些情況下，結合物或其組件可與修飾劑(諸如PEG)直接偶合(亦即，無連接子)，例如經由胺基、硫氫基、羥基、羧基或其他基團直接偶合。

用於將結合物或其組件共價附接至修飾劑(例如PEG)上之連接子可為任何生物相容性連接子。「生物相容性」指示化合物或基團無毒性，且可活體外或活體內使用而不造成損傷、噁心、疾病或死亡。修飾劑(諸如PEG)可鍵結於連接子，例如經由醚鍵、硫醇鍵、醯胺鍵或其他鍵而鍵結。

在一些實施例中，舉例而言，適合之連接子的整體鏈長可為約1-100個原子、1-80個原子、1-60個原子、1-40個原子、1-30個原子、1-20個原子、或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個原子，其中該鏈中之該等原子包含C、S、N、P及/或O。在一些情況下，連接基團包括例如丁二醯基、醯胺基、醯亞胺基、胺基甲酸酯基、酯基、環氧基、羧基、羥基、碳水化合物、酪胺酸基、半胱胺酸基、組胺酸基、亞甲基及其組合。穩定連接子之特定實例包括丁二醯亞胺、丙酸、羧甲基化連接、醚、胺基甲酸酯、醯胺、胺、脲、醯亞胺、脂肪族C-C鍵及硫醚。在某些實施例中，生物相容性連接子一種丁二酸丁二醯亞胺酯(succinimidyl succinate；SS)基團。

其他適合之連接子包括氧基羰基咪唑基(包括例如羰基咪唑(CDI))、硝基苯基(包括例如碳酸硝基苯酯(NCP)或碳酸三氯苯酯(TCP))、三氟乙磺酸酯基(trysylate group)、醛基、異氰酸酯基、乙烯基碸基、或一級胺。在某些實施例中，連接子衍生自SS、SPA、SCM或NHS；在某些實施例中，使用SS、SPA或NHS，而在一些實施例中，使用SS或SPA。因此，在某些實施例中，潛在連接子可由以下形成：甲氧基-PEG丁二酸丁二醯亞胺酯(SS)、甲氧基-PEG戊二酸丁二醯亞胺酯(SG)、甲氧基-PEG碳酸丁二醯亞胺酯(SC)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺乙酸酯(succinimidyl carboxymethyl ester，SCM)、甲氧基-PEG2 N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、甲氧基-PEG丁酸丁二醯亞胺酯(SBA)、甲氧基-PEG丙酸丁二醯亞胺酯(SPA)、甲氧基-PEG丁二醯亞胺基戊二醯胺、及甲氧基-PEG丁二醯亞胺基丁二醯胺。

連接子之額外實例包括(但不限於)以下中之一或多者：-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH -、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二價環烷基、-N(R6)-，R6為H或選自由以下組成之群的有機基團：烷基、經取代之烷基、烯基、經取代之烯基、炔基、經取代之炔基、芳基及經取代之芳基。另外，本文所描述之連接子部分中的任一者可進一步包括包含1至20個環氧乙烷單體單元之環氧乙烷寡聚物鏈[亦即，-(CH₂ CH₂ O)_1-20 -]。亦即，環氧乙烷寡聚物鏈可存在於連接子之前或之後，且視情況在包含兩個或超過兩個原子之連接部分的任何兩個原子之間。此外，若寡聚物與聚合物節段相鄰且僅表示聚合物節段之延伸，則該寡聚物鏈將不視為連接部分之一部分。

具體例示性PEG分子及連接子描述於下表 P1 中。

在某些實施例中，結合物或其組件包含一或多個如本文(例如在表 P1 中)所描述之PEG分子及/或連接子。

1至約30個PEG分子可共價鍵結於結合物或其組件。在某些實施例中，結合物或其組件經一個PEG分子修飾(亦即，包含一個PEG分子)。在一些實施例中，結合物或其組件經超過一個PEG分子修飾。在特定實施例中，結合物或其組件經約1至約10、或約7至約15個PEG分子、或約2至約8或約9至約12個PEG分子修飾。在一些實施例中，結合物或其組件經約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個PEG分子修飾。在具體實施例中，結合物或其組件經每結合物4.5-5.5個PEG分子修飾。在一些實施例中，結合物或其組件經5 ± 1.5個PEG分子修飾。

在某些實施例中，結合物或其組件中約15%至約70%之一級胺基經PEG修飾，在一些實施例中精胺酸脫亞胺酶中約20%至約65%、約25%至約60%，或在某些實施例中約30%至約55%、或45%至約50%，或在一些實施例中約50%之一級胺基經PEG修飾。

附接至結合物上之PEG可為直鏈，如用SS-PEG、SPA-PEG及SC-PEG，或可使用分支鏈PEG，如用PEG2-NHS。

在一些實施例中，舉例而言，如上文所指出，胺基酸取代採用非天然胺基酸與PEG或其他修飾劑結合(參見例如de Graaf等人，Bioconjug Chem. 20:1281-95, 2009)。因此，某些實施例包括經由一或多個非天然胺基酸與一或多個PEG結合之結合物或其組件。在一些實施例中，非天然胺基酸包含具有選自由以下組成之群之官能基的側鏈：烷基、芳基、芳基鹵化物、乙烯基鹵化物、烷基鹵化物、乙醯基、酮、氮丙啶(aziridine)、腈、硝基、鹵化物、醯基、酮基、疊氮基、羥基、肼、氰基、鹵基、醯肼、烯基、炔基、醚、硫醚、環氧化物、碸、酸、酸酯、硼烷、苯基酸、硫醇、硒基、磺醯基、硼酸酯、酸酯、磷酸、膦酸基、膦、雜環、吡啶基、萘基、二苯甲酮、受限環(諸如環辛炔)、硫酯、烯酮、亞胺、醛、酯、硫代酸、羥胺、胺基、羧酸、α-酮基羧酸、α或β不飽和酸及醯胺、乙醛醯胺及有機矽烷基。在一些實施例中，非天然胺基酸係選自由以下組成之群：對乙醯基-L-苯丙胺酸、O-甲基-L-酪胺酸、L-3-(2-萘基)丙胺酸、3-甲基-苯丙胺酸、O-4-烯丙基-L-酪胺酸、高半胱胺酸、4-丙基-L-酪胺酸、三-O-乙醯基-GlcNAcβ-絲胺酸、β-O-GlcNAc-L-絲胺酸、三-O-乙醯基-GalNAc-α-蘇胺酸、α-GalNAc-L-蘇胺酸、L-多巴、氟化苯丙胺酸、異丙基-L-苯丙胺酸、對疊氮基-L-苯丙胺酸、對醯基-L-苯丙胺酸、對苯甲醯基-L-苯丙胺酸、L-磷酸絲胺酸、磷醯基絲胺酸、磷醯基酪胺酸、對碘-苯丙胺酸、對溴苯丙胺酸、對胺基-L-苯丙胺酸及異丙基-L-苯丙胺酸。

聚核苷酸、表現載體及宿主細胞。某些實施例係關於編碼如本文所描述之結合物，例如融合多肽的聚核苷酸。亦包括編碼本文所描述之個別ADI或六聚多肽中之任何一或多者的聚核苷酸單獨或與編碼本文所描述之個別TNF超家族配位體或三聚多肽中之任何一或多者的聚核苷酸組合。因此，某些實施例包括編碼以下之聚核苷酸：在表 A1 中之個別ADI多肽中的任何一或多者、在表 T1 或表 T2 中之個別TNF超家族配位體中的任何一或多者、或本文所描述之融合多肽，例如包含表 A1 之ADI多肽中之任何一或多者融合於表 T1 或表 T2 中之TNF超家族配位體中之任何一或多者的融合多肽。

在其他用途當中，此等實施例及相關實施例可用於在宿主細胞中以重組方式產生融合多肽或其個別組件(ADI、TNF超家族配位體、六聚多肽、三聚多肽)。一般熟習此項技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併，存在許多編碼本文所描述之多肽的核苷酸序列。一些此等聚核苷酸可與任何原生基因之核苷酸序列攜帶最小同源性。但是，具體涵蓋由於密碼子使用差異而變化之聚核苷酸，例如對人類、酵母或細菌密碼子選擇進行最佳化之聚核苷酸。

如熟習此項技術者將認識到的，聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA (基因組、cDNA或合成)或RNA分子。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於根據本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但未必)連接於其他分子及/或支撐材料。

聚核苷酸可包含原生序列(亦即編碼融合多肽或其組件之內源性序列)，或可包含此類序列之變異體或生物學功能等效物。聚核苷酸變異體可含有如本文所描述之一或多個取代、添加、缺失及/或插入，較佳地使得相對於未經修飾之多肽，變異體多肽之活性未明顯減弱。

額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但未必)連接於其他分子及/或支撐材料。因此，不論編碼序列本身之長度如何，聚核苷酸可與其他DNA或RNA序列，諸如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外限制酶位點、多個選殖位點、其他編碼節段及其類似物組合，以使得其總長度可顯著變化。

聚核苷酸序列亦可為混合基因組、cDNA、RNA序列及合成來源之序列。舉例而言，編碼前導肽之基因組或cDNA序列可接合於編碼多肽之基因組或cDNA序列，其後DNA或RNA序列可藉由來在位點處加以修飾：根據熟知程序插入編碼用於同源重組之所要胺基酸序列的合成寡核苷酸，或較佳地藉由PCR使用適合之寡核苷酸生成所要序列。在一些實施例中，信號序列可包括於編碼序列之前。此序列編碼編碼序列N端之信號肽，其與宿主細胞通信以將多肽導引至細胞表面或將多肽分泌至介質中。通常，在蛋白質離開宿主細胞之前，由該細胞夾斷信號肽。信號肽可見於原核生物及真核生物中之多種蛋白質中。

一或多個聚核苷酸可編碼本文所描述之ADI、TNF超家族配位體、六聚、三聚及/或融合多肽。此外，可出於各種原因操控聚核苷酸序列。實例包括(但不限於)併入較佳密碼子以增強聚核苷酸在各種生物體中之表現(一般參見Nakamura等人，Nuc. Acid. Res. 28:292, 2000)。另外，可為併入緘默突變以便引入或消除限制位點、降低CpG二核苷酸基元之密度(參見例如Kameda等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 349:1269-1277, 2006)或減弱單股序列形成莖-環結構之能力：(參見例如Zuker M., Nucl. Acid Res. 31:3406-3415, 2003)。另外，哺乳動物表現可藉由在起始密碼子處包括Kozak共同序列(亦即(a/g)cc(a/g)ccATGg) (SEQ ID NO:95)來加以進一步最佳化。適用於此目的之Kozak共同序列為此項技術中已知的(Mantyh等人，PNAS 92: 2662-2666, 1995；Mantyh等人. Prot. Exp. & Purif. 6:124, 1995)。

亦包括包含該等聚核苷酸之表現載體，及包含該等聚核苷酸及/或表現載體之宿主細胞。多肽及結合物(例如融合多肽)可藉由在適合之宿主細胞中藉由熟知技術表現編碼該多肽之DNA或RNA序列來產生。術語「宿主細胞」用於指以下細胞，向其中已引入或能夠向其中引入編碼本文所描述之一或多種多肽的核酸序列，且其進一步表現或能夠表現所關注之多肽，諸如編碼任何本文所描述之多肽的聚核苷酸。該術語包括母細胞之子代，而不管子代在形態或遺傳構成方面是否與原始母細胞一致，只要存在所選基因即可。宿主細胞可針對某些特徵來加以選擇，舉例而言，表現將硫酸酯酶基元內之半胱胺酸或絲胺酸殘基轉化為甲醯基甘胺酸(FGly)殘基的甲醯基甘胺酸生成酶(FGE)，或表現可將非天然胺基酸併入多肽中的胺基醯基tRNA合成酶，該等非天然胺基酸包括具有疊氮化物側鏈、炔烴側鏈或其他所要側鏈之非天然胺基酸，以便促進化學結合或修飾。

在一些情況下，聚核苷酸或表現載體包含額外非編碼序列。舉例而言，存在於表現載體中之「控制元件」或「調節序列」為載體之彼等非轉譯區，包括增強子、啟動子、5'及3'非轉譯區，其與宿主細胞蛋白質相互作用以進行轉錄及轉譯。此類元件可在其強度及特異性中變化。視所利用之載體系統及宿主而定，可使用任何數目的適合之轉錄及轉譯元件，包括組成性及誘導性啟動子。舉例而言，當在細菌系統中選殖時，可使用誘導性啟動子，諸如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene, La Jolla, Calif.)或PSPORT1質體(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)之混雜lacZ啟動子及其類似啟動子。在哺乳動物細胞系統中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒之啟動子一般較佳。若需要產生含有編碼多肽之序列之多個複本的細胞株，則基於SV40或EBV之載體可有利地與適當可選標記一起使用。

已知多種表現載體/宿主系統，且可用以含有及表現聚核苷酸序列。此等系統包括(但不限於)經表現載體(例如重組噬菌體、質體或黏質體DNA表現載體)轉型之微生物，諸如細菌；經酵母表現載體轉型之酵母；經病毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；經病毒表現載體(例如花椰菜嵌紋病毒，CaMV；菸草嵌紋病毒，TMV)或經細菌表現載體(例如Ti或pBR322質體)轉型之植物細胞；或經病毒、質體、游離、整合或其他表現載體轉型之動物細胞系統，包括哺乳動物細胞，且更具體言之，人類細胞系統。因此，某些實施例包括表現載體，其包含編碼本文所描述之多肽(例如融合多肽)的聚核苷酸序列。亦包括包含聚核苷酸及/或表現載體之宿主細胞。

某些實施例可採用基於大腸桿菌(E. coli)之表現系統(參見例如Structural Genomics Consortium等人，Nature Methods. 5:135-146, 2008)。此等實施例及相關實施例可部分或全部依賴於非接合依賴型選殖(LIC)，以產生適合之表現載體。在具體實施例中，蛋白質表現可受T7 RNA聚合酶(例如pET載體系列)或經替代性啟動子(包括例如TAC啟動子)修飾之pET載體控制。此等實施例及相關實施例可利用表現宿主菌株BL21 (DE3)，即支持T7介導之表現且缺乏提昇靶蛋白穩定性之lon及ompT蛋白酶的BL21之λDE3溶源。亦包括攜載編碼很少用於大腸桿菌之tRNA之質體的表現宿主菌株，諸如ROSETTA^™ (DE3)及Rosetta 2 (DE3)菌株。在一些實施例中，可利用大腸桿菌菌株，包括其他大腸桿菌K-12菌株，諸如W3110 (F^- λ^- IN(rrnD-rrnE)1 rph-1)及UT5600 (F、araC14、leuB6(Am)、secA206(aziR)、lacY1、proC14、tsx67、Δ(ompTfepC)266、entA403、glnX44(AS)、λ^- 、trpE38、rfbC1、rpsL109(strR)、xylA5、mtl-1、thiE1)，其在醱酵期間可能引起轉譯後修飾含量減少。細胞溶解及樣品處理亦可使用以商標BENZONASE®核酸酶及BUGBUSTER®蛋白質萃取試劑出售之試劑來加以改良。對於細胞培養，自體誘導培養基可提昇許多表現系統之效率，包括高產量表現系統。此類型之培養基(例如OVERNIGHT EXPRESS^TM 自體誘導系統)經由不添加人造誘導劑(諸如IPTG)之代謝轉移而逐漸引發蛋白質表現。

特定實施例採用六組胺酸標籤(諸如以商標HIS•TAG®融合物出售之諸如標籤)，後接固定金屬親和性層析(IMAC)純化，或相關技術。然而，在某些態樣中，臨床級蛋白質可使用或不使用親和標籤自大腸桿菌包涵體分離(參見例如Shimp等人，Protein Expr Purif. 50:58-67, 2006)。作為另一實例，某些實施例可採用冷震誘導之大腸桿菌高產率產生系統，因為低溫下大腸桿菌中蛋白質之過度表現提昇其溶解度及穩定性(參見例如Qing等人，Nature Biotechnology. 22:877-882, 2004)。

亦包括高密度細菌醱酵系統。舉例而言，富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)之高細胞密度培育允許以超過150 g/L之細胞密度產生蛋白質，及以超出10 g/L之效價表現重組蛋白。在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用含有諸如α因子、醇氧化酶及PGH之組成性或誘導性啟動子的多種載體。綜述參見Ausubel等人 (同前文獻)及Grant等人，Methods Enzymol. 153:516-544, 1987。亦包括巴斯德氏畢赤酵母(Pichia pandoris)表現系統(參見例如Li等人，Nature Biotechnology. 24, 210-215, 2006；及Hamilton等人，Science, 301:1244, 2003)。某些實施例包括經工程改造以選擇性地使蛋白質糖基化之酵母系統，尤其包括具有人類化N-糖基化路徑之酵母(參見例如Hamilton等人，Science. 313:1441-1443, 2006；Wildt等人，Nature Reviews Microbiol. 3:119-28, 2005；及Gerngross等人，Nature-Biotechnology. 22:1409 -1414, 2004；美國專利第7,629,163號；第7,326,681號；及第7,029,872號)。僅舉例而言，重組酵母培養物尤其可生長於馮巴赫燒瓶(Fernbach Flask)或15L、50L、100L及200L醱酵器中。

在其中使用植物表現載體之情況下，編碼多肽之序列的表現可由多種啟動子中之任一者驅動。舉例而言，諸如CaMV之35S及19S啟動子的病毒啟動子可單獨或與來自TMV之ω前導序列組合使用(Takamatsu, EMBO J. 6:307-311,1987)。或者，可使用植物啟動子，諸如RUBISCO或熱休克啟動子之小子單元(Coruzzi等人，EMBO J. 3:1671-1680, 1984；Broglie等人，Science. 224:838-843, 1984；及Winter等人，Results Probl. Cell Differ. 17:85-105, 1991)。可藉由直接DNA轉型或病原體介導之轉染將此等構築體引入至植物細胞中。此類技術描述於多個通常可獲得之綜述中(參見例如Hobbs, McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, 第191-196頁, 1992)。

昆蟲系統亦可用於表現所關注之多肽。舉例而言，在一個此類系統中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)細胞核多角體病毒(AcNPV)用作載體以於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)細胞中表現外源基因。可將編碼多肽之序列選殖至病毒之非必需區，諸如多角體蛋白基因，且置放於多角體蛋白啟動子之控制下。成功插入多肽編碼序列將使得多角體蛋白基因無活性且產生缺乏鞘蛋白之重組病毒。重組病毒可隨後用於感染例如其中可表現所關注之多肽的草地黏蟲細胞或粉紋夜蛾細胞(Engelhard等人，PNAS USA. 91:3224-3227, 1994)。亦包括桿狀病毒表現系統，包括利用SF9、SF21及T. ni細胞之彼等表現系統(參見例如Murphy及Piwnica-Worms, Curr Protoc Protein Sci. 第5章:第5.4單元, 2001)。昆蟲系統可提供與哺乳動物系統相似之轉譯後修飾。

在哺乳動物宿主細胞中，多種表現系統為在此項技術中所熟知的且可商購。例示性哺乳動物載體系統包括例如，來自Invitrogen之pCEP4、pREP4及pREP7，來自Crucell之PerC6系統，及來自Invitrogen的基於慢病毒之系統(諸如pLP1)，及其他系統。舉例而言，在其中腺病毒用作表現載體之情況下，編碼所關注多肽之序列可接合至由晚期啟動子及三聯前導序列組成之腺病毒轉錄/轉譯複合物。在病毒基因組之非必需E1或E3區中插入可用於獲得能夠在經感染之宿主細胞中表現多肽的可存活病毒(Logan及Shenk, PNAS USA. 81:3655-3659, 1984)。另外，轉錄增強子，諸如勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)增強子可用於增加哺乳動物宿主細胞中之表現。

適用哺乳動物宿主細胞株之實例包括由SV40轉型之獼猴腎CV1株系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎株系(用於在懸浮培養液中生長之293或次選殖293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59, 1977)；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠塞特利氏細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68, 1982)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝腫瘤株系(Hep G2)。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，PNAS USA. 77:4216, 1980)；及骨髓瘤細胞株，諸如NSO及Sp2/0。適合於產生蛋白質之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, N.J., 2003), 第255-268頁。某些較佳哺乳動物細胞表現系統包括基於CHO及HEK293細胞之表現系統。在此項技術中之已知者中，哺乳動物表現系統尤其可利用例如T燒瓶、輥瓶或細胞廠中之附著細胞株；或例如1L及5L旋轉器，5L、14L、40L、100L及200L攪拌槽生物反應器或20/50L及100/200L WAVE生物反應器中之懸浮培養物。

此外，宿主細胞菌株可針對其調節插入序列之表現或以所要方式加工所表現蛋白質之能力來加以選擇。多肽之此類修飾包括(但不限於)轉譯後修飾，諸如乙醯化、羧化、糖基化、磷酸化、脂質化及醯化，或插入非天然存在之胺基酸(一般參見美國專利第7,939,496號；第7,816,320號；第7,947,473號；第7,883,866號；第7,838,265號；第7,829,310號；第7,820,766號；第7,820,766號；第7,7737,226, 7,736,872號；第7,638,299號；第7,632,924號；及第7,230,068號)。使蛋白質「前原」形式裂解之轉譯後加工亦可用於促成正確插入、摺疊及/或功能。除細菌細胞以外，可選擇具有或甚至缺乏針對此類轉譯後活性之具體細胞機構及特徵機制的不同宿主細胞，諸如酵母、CHO、HeLa、MDCK、HEK293及W138，以確保外源蛋白質之正確修飾及加工。

例示性結合方法。第一多肽(例如ADI、六聚多肽)與第二多肽(例如TNF超家族配位體、三聚多肽)或其他之結合或偶合可使用標準化學、生化及/或分子技術來進行。將顯而易見的是，如何鑒於本發明使用可獲得的此項技術中公認之方法來製造結合物。在一些情況下，一般將較佳的是，當偶合時，該等技術所採用的結合物之主要組件及所得連接化學物質不明顯干擾該結合物之個別組件的所要功能性或活性。

在某些實施例中，結合物為融合多肽或融合蛋白質。在一些情況下，如本文所描述及此項技術中已知，融合多肽表現為表現系統中之重組多肽。融合多肽可含有以任何所要排列呈現的多肽序列之一或多個複本，且可含有所關注基於多肽之藥劑的一或多個複本。

對於融合蛋白質，編碼融合多肽組件且視情況編碼肽連接子組件之DNA序列可分開地組裝，且隨後接合至適當表現載體中。在存在或不存在肽連接子的情況下將編碼一個多肽組件之DNA序列的3'端接合至編碼另一多肽組件之DNA序列的5'端以使得該等序列之讀框同相。經接合之DNA序列可操作地連接於適合之轉錄或轉譯調節元件。負責表現DNA之調節元件僅位於編碼第一多肽之DNA序列的5'位。相似地，結束轉譯所需之終止密碼子(stop codon)及轉錄終止(termination)信號僅存在於編碼最C端多肽之DNA序列的3'位。此准許轉譯為保留兩種組件多肽之生物活性的單個融合多肽。

相似技術，主要即諸如啟動子、終止密碼子及轉錄終止信號之調節元件的排列可應用於重組產生非融合多肽，例如用於產生非融合結合物(例如化學偶合之結合物)的多肽。

本發明之聚核苷酸及融合聚核苷酸可含有編碼多肽序列之核酸的一或多個複本，且/或可含有編碼多肽藥劑之核酸的一或多個複本。

在一些實施例中，將編碼多肽及/或融合多肽之聚核苷酸直接引入至宿主細胞中，且將該細胞在足以誘導所編碼多肽之表現的條件下培育。本發明之多肽序列可使用熟習此項技術者熟知之標準技術來與本文所提供之多肽及核酸序列組合製備。

因此，根據某些實施例，提供包含編碼本文所描述之多肽或融合多肽之聚核苷酸或融合聚核苷酸的重組宿主細胞。多肽或融合多肽在宿主細胞中之表現可藉由在適當條件下培養含有聚核苷酸之重組宿主細胞來達成。在藉由表現產生後，多肽可使用任何適合之技術來加以分離及/或純化，且隨後視需要使用。例示性聚核苷酸、表現載體及宿主細胞描述於本文中其他地方。

由重組細胞產生之多肽(例如融合多肽)可根據此項技術中已知之多種技術來加以純化及表徵。用於進行蛋白質純化及分析蛋白質純度之例示性系統包括快速蛋白質液相層析(FPLC) (例如AKTA及Bio-Rad FPLC系統)、高效液相層析(HPLC) (例如Beckman及Waters HPLC)。在此項技術中之已知者中，用於純化之例示性化學反應尤其包括離子交換層析(例如Q、S)、尺寸排阻層析、鹽梯度、親和純化(例如Ni、Co、FLAG、麥芽糖、麩胱甘肽、蛋白質A/G)、凝膠過濾、逆相、陶瓷HYPERD®離子交換層析及疏水相互作用管柱(HIC)。

在一些實施例中，結合物為非融合多肽，例如藉由將第一多肽(例如ADI、六聚多肽)化學連接或偶合於第二多肽(例如TNF超家族配位體、三聚多肽)或其他而產生之結合物所採用之特定偶合化學視多肽結構、生物活性劑內潛在存在多個官能基、對保護/脫保護步驟之需求、試劑之化學穩定性及其類似因素而定，且將容易地由熟習此項技術者決定。適用於製備本發明結合物的說明性偶合化學可見於例如Wong (1991), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」, CRC Press, Boca Raton, Fla.；及Brinkley 「A Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates with Dyes, Haptens, and Crosslinking Reagents」, Bioconjug. Chem., 3:2013, 1992中。較佳地，結合物之結合能力及/或活性不因所採用之結合技術而明顯降低，例如不相對於非結合多肽明顯降低。

在某些實施例中，第一多肽(例如ADI、六聚多肽)直接地或間接地與第二多肽(例如TNF超家族配位體、三聚多肽)偶合。當兩個所關注多肽各自具有能夠與另一個反應之取代基時，在其之間的直接反應為可能的。舉例而言，在一者上之親核性基團(諸如胺基或硫氫基)可能夠與在另一者上之含羰基基團(諸如酐或醯鹵基)或與含有良好脫離基(例如鹵基)之烷基反應。

或者，可能期望使所關注之第一多肽(例如ADI、六聚多肽)及第二多肽(例如TNF超家族配位體、三聚多肽)經由如本文所描述之連接基團，包括如本文所描述之非肽連接子及肽連接子而間接偶合。連接基團亦可充當使第一與第二多肽分開一定距離之間隔子以便避免干擾結合能力、靶向能力或其他功能。連接基團亦可用以增加多肽上取代基之化學反應性，且因此增加偶合效率。化學反應性增加亦可促進使用在其他情況下將不可能使用的試劑或試劑上之官能基。連接基團之實例包括例如二硫基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩基團、肽酶不穩定基團及酯酶不穩定基團。在其他說明性實施例中，結合物包括諸如美國專利第5,208,020號或歐洲專利0 425 235 B1及Chari等人，Cancer Research. 52: 127-131, 1992中所揭示之彼等的連接基團。額外例示性連接子描述於本文中。

在某些例示性實施例中，在包含丁二醯亞胺酯官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成醯胺鍵；在包含氧基羰基咪唑之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成胺基甲酸酯鍵；在包含碳酸對硝基苯酯官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成胺基甲酸酯鍵；在包含碳酸三氯苯酯官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成胺基甲酸酯鍵；在包含硫酯官能基之多肽與包含N端胺基之多肽之間的反應形成醯胺鍵；在包含丙醛官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵。

在一些例示性實施例中，在包含丁醛官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；在包含縮醛官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；在包含哌啶酮官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；在包含甲基酮官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；在包含三氟乙磺酸酯官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；在包含順丁烯二醯亞胺官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；在包含醛官能基之多肽與包含胺基之多肽之間的反應形成二級胺鍵；且在包含肼官能基之多肽與包含羧酸基之多肽之間的反應形成二級胺鍵。

在特定例示性實施例中，在包含順丁烯二醯亞胺官能基之多肽與包含硫醇基之多肽之間的反應形成硫醚鍵；在包含乙烯基碸官能基之多肽與包含硫醇基之多肽之間的反應形成硫醚鍵；在包含硫醇官能基之多肽與包含硫醇基之多肽之間的反應形成二硫鍵；在包含鄰吡啶基二硫化物官能基之多肽與包含硫醇基之多肽之間的反應形成二硫鍵；且在包含碘乙醯胺官能基之多肽與包含硫醇基之多肽之間的反應形成硫醚鍵。

在一個具體實施例中，胺與硫氫基交聯劑用於製備結合物。在一個較佳實施例中，舉例而言，交聯劑為丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC) (Thermo Scientific)，其為在中等長度環己烷穩定化之間隔臂(8.3埃)的相對端處含有NHS酯及順丁烯二醯亞胺反應性基團的硫氫基交聯劑。SMCC為不可裂解且膜可滲透之交聯劑，其可用於產生用於與結合物之組件後續反應的經順丁烯二醯亞胺活化之硫氫基反應性藥劑(例如多肽)。NHS酯在pH 7-9下與一級胺反應以形成穩定醯胺鍵。順丁烯二醯亞胺在pH 6.5-7.5下與硫氫基反應以形成穩定硫醚鍵。因此，SMCC之胺反應性NHS酯與多肽之一級胺快速交聯，且所得硫氫基反應性順丁烯二醯亞胺基隨後可供用於與另一多肽之半胱胺酸殘基反應，以得到所關注之具體結合物。

在某些特定實施例中，多肽經修飾以含有暴露之硫氫基以便促進交聯，例如以便促進與經順丁烯二醯亞胺活化之多肽交聯。在一些具體實施例中，多肽經修飾一級胺之試劑修飾以添加受保護之硫醇硫氫基。在一些實施例中，試劑N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基硫基乙酸酯(SATA) (Thermo Scientific)用於產生硫醇化多肽。

在某些實施例中，使經順丁烯二醯亞胺活化之多肽在適合之條件下與硫醇化多肽反應以產生結合物。應理解，藉由在此等反應中操控SMCC、SATA、藥劑及多肽之比率，有可能產生具有不同化學計量、分子量及特性之結合物。

在一些說明性實施例中，使用雙官能性蛋白質偶合劑來製造結合物，該等雙官能性蛋白質偶合劑諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯、亞胺硫埬(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特定偶合劑包括N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP) (Carlsson等人，Biochem. J. 173:723-737 [1978])及N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)以提供二硫鍵。

本文所論述之具體交聯策略僅為可用於產生本文所描述之結合物的適合之結合策略的許多實例中的幾個。對熟習此項技術者將顯而易見的是，可採用具有均官能性及雜官能性之多種其他雙官能性或多官能性試劑(諸如Pierce Chemical Co., Rockford, IL之目錄中所描述的彼等試劑)作為連接基團。偶合可例如經由胺基、羧基、硫氫基或經氧化之碳水化合物殘基而受影響。存在描述此類方法之許多參考文獻，例如Rodwell等人之美國專利第4,671,958號。

結合物亦可藉由各種「點擊化學」技術來加以製備，包括模組化、範疇寬、得到極高產率、主要產生可藉由非層析方法移除且可具立體特異性但不一定具對映選擇性之無害副產物的反應(參見Kolb等人，Angew Chem Int Ed Engl. 40:2004-2021, 2001)。特定實例包括採用疊氮化物與炔烴之胡伊斯根1,3-偶極環加成(Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition)的結合技術，亦稱為「疊氮化物-炔烴環加成」反應(參見Hein等人，Pharm Res. 25:2216-2230, 2008)。疊氮化物-炔烴環加成反應之非限制性實例包括銅催化之疊氮化物-炔烴環加成(CuAAC)反應及釕催化之疊氮化物-炔烴環加成(RuAAC)反應。

CuAAC在寬溫度範圍內起作用，對水性條件及4至12內之pH值範圍不敏感，且耐受大量官能基(參見Himo等人，J Am Chem Soc. 127:210-216, 2005)。可例如使用抗壞血酸鈉作為還原劑由Cu(I)鹽或Cu(II)鹽產生活性Cu(I)催化劑。此反應形成1,4-取代之產物，使其具有區域特異性(參見Hein等人，同前文獻)。

RuAAC利用五甲基環戊二烯基氯化釕[Cp*RuCl]複合物，其能夠催化疊氮化物環加成為末端炔烴，區域選擇性地產生1,5-二取代之1,2,3-三唑(參見Rasmussen等人，Org. Lett. 9:5337-5339, 2007)。此外，且與CuAAC對比，RuAAC亦可與內部炔烴一起使用以提供經完全取代之1,2,3-三唑。

融合或非融合技術中之任何一或多者均可用於製備如本文所描述之結合物。

使用方法及組合物 亦包括使用本文所描述之結合物用於治療有需要之個體的方法，及包含該等結合物之組合物。舉例而言，某些實施例包括在有需要之個體中治療癌症、改善其症狀或抑制其進展的方法，包含向該個體投與本文所描述之結合物或包含該等結合物之組合物。

本文所描述之方法及組合物可用於治療任何多種癌症。在一些實施例中，癌症係選自以下中之一或多者：肝細胞癌(HCC)、黑素瘤、轉移性黑素瘤、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓性白血病、復發性急性骨髓性白血病、B細胞惡性病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤(例如星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤或脈絡叢乳頭瘤)、多形性膠質母細胞瘤(例如巨細胞膠質母細胞瘤或神經膠質肉瘤)、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原發性CNS淋巴瘤、原始神經外胚層瘤(神經管母細胞瘤)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睪丸癌及胃癌。

在一些實施例中，癌症展現精胺基丁二酸鹽合成酶-1 (ASS-1)之表現及/或活性降低，或在其他情況下缺乏精胺基丁二酸鹽合成酶-1。在此等實施例及相關實施例中之一些中，癌症為ADI敏感性或大體上ADI敏感性的。在一些情況下，ASS-1表現或活性降低為相對於適當對照樣品(例如正常細胞或組織)中之表現及/或活性，表現及/或活性降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或超過70%。在某些實施例中，相對於對照樣品中之表現或活性，ASS或ASL表現或活性降低至少二分之一。

在一些實施例中，癌症展現精胺基丁二酸鹽合成酶-1 (ASS-1)之表現及/或活性正常或增加。在此等實施例及相關實施例中之某些中，癌症為耐ADI性或大體上耐ADI性，或ADI非敏感性的。

ASS-1表現或活性可根據此項技術之常規技術來加以量測，包括例如定量PCR、免疫組織化學、西方墨點法、酶活性分析(例如ADI活性分析以量測瓜胺酸轉化為精胺基丁二酸鹽之轉化率或精胺基丁二酸鹽轉化為精胺酸及反丁烯二酸鹽之轉化率)及其類似技術。

在一些實施例中，本文所描述之方法或組合物使患者之存活時間中值增加4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、15週、20週、25週、30週、40週或長於40週。在某些實施例中，本文所描述之方法或組合物使患者之存活時間中值增加1年、2年、3年或長於3年。在一些實施例中，本文所描述之方法或組合物使無進展存活期增加2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週或長於10週。在某些實施例中，本文所描述之方法或組合物使無進展存活期增加1年、2年、3年或長於3年。

在某些實施例中，如由統計學上顯著的可存活腫瘤之量減少(例如腫瘤塊縮小至少10%、20%、30%、40%、50%或超過50%)所指示，或如由掃描尺寸改變(例如具有統計顯著性之縮小)所指示，所投與之組合物足以引起腫瘤消退。在某些實施例中，所投與之組合物足以引起疾病穩定。在某些實施例中，所投與之組合物足以引起熟練臨床醫師已知之特定疾病適應症之症狀的穩定或臨床相關減輕。

用於治療癌症之方法或組合物可與其他治療型式(modality)組合。舉例而言，本文所描述之組合物可在包括對症護理、化學療法、放射線療法、手術、移植、激素療法、光動力療法、抗生素療法或其任何組合之其他治療性干預之前、期間或之後向個體投與。對症護理包括投與皮質類固醇以減少腦水腫、頭痛、認知功能障礙及嘔吐，以及投與抗驚厥劑以減少癲癇。放射線療法包括全腦照射、分次放射線療法及放射外科手術，諸如立體定位放射外科手術，其可進一步與傳統手術組合。

用於鑑別患有本文所描述之一或多種疾病或病狀之個體的方法為此項技術中已知的。

對於活體內使用，例如對於人類疾病治療或測試，本文所描述之結合物一般在投藥之前併入一或多種醫藥或治療性組合物中。在一些情況下，醫藥或治療性組合物包含本文所描述之一或多種結合物與生理學上可接受之載劑或賦形劑組合。

為了製備醫藥或治療性組合物，將有效量或所要量之一或多種結合物與熟習此項技術者已知適合於特定結合物及/或投藥模式之任何醫藥載劑或賦形劑混合。醫藥載劑可為液體、半液體或固體。用於非經腸、皮內、皮下或局部施用之溶液或懸浮液可包括例如無菌稀釋劑(諸如水)、鹽水溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水；PBS)、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑(諸如苯甲醇及對羥基苯甲酸甲酯)；抗氧化劑(諸如抗壞血酸及亞硫酸氫鈉)及螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；緩衝劑(諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽及磷酸鹽)。若靜脈內投與(例如藉由IV輸注)，則適合之載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及含有增稠劑及增溶劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物)之溶液。

在某些態樣中，組合物之pH值接近生理pH值或約pH 7.4，包括約pH 6.5、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.5或其任何範圍。在具體實施例中，組合物具有以下純度測定中之一或多者：每毫克蛋白質少於約1 EU內毒素，每毫克蛋白質少於約100 ng宿主細胞蛋白質，每毫克蛋白質少於約10 pg宿主細胞DNA，及/或藉由SEC HPLC得到大於約95%單峰純度。

投藥可藉由多種不同途徑來達成，包括經口、非經腸、鼻內、靜脈內、皮內、肌肉內、鞘內、皮下、舌下、頰內、經直腸、經陰道及局部。較佳投藥模式視待治療或預防之病狀的性質而定。特定實施例包括藉由IV輸注來投與。

載劑可包括例如醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑，其在所採用之劑量及濃度下對暴露於其中之細胞或哺乳動物無毒性。通常，生理學上可接受之載劑為水性pH緩衝溶液。生理學上可接受之載劑的實例包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；及/或非離子界面活性劑，諸如聚山梨醇酯20 (TWEEN™)聚乙二醇(PEG)及泊洛沙姆(poloxamer) (PLURONICS™)及其類似物。

在一些實施例中，一或多種結合物可包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊，及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，包埋在膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中，或包埋在巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Oslo, A.編, (1980)中。粒子或脂質體可進一步包含其他治療劑或診斷劑。

因此，投與此等醫藥組合物及相關醫藥組合物之典型途徑包括(但不限於)經口、局部、經皮、吸入、非經腸、舌下、經頰、經直腸、經陰道及鼻內。如本文所使用之術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、胸骨內注射或輸注技術。某些醫藥或治療性組合物經調配以便使其中所含之活性成分在向患者投與該組合物時為生物可用的。將向個體或患者投與之組合物可採取一或多個劑量單元之形式，其中舉例而言，錠劑可為單個劑量單元，及可容納複數個劑量單元的呈氣霧劑形式之本文所描述結合物的容器。製備此類劑型之實際方法對熟習此項技術者為已知的或將為顯而易見的；舉例而言，參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第20版 (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)。待投與之組合物將通常含有治療有效量的本文所描述之結合物用於治療所關注之疾病或病狀。

醫藥或治療性組合物可呈固體或液體形式。在一個實施例中，載劑為顆粒狀，以使得組合物呈例如錠劑或散劑形式。載劑可為液體，同時組合物為例如口服油、可注射液體或適用於例如吸入投與之氣霧劑。當意欲用於經口投藥時，醫藥組合物較佳呈固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式包括在本文視為固體或液體之形式內。

作為用於經口投藥之固體組合物，醫藥組合物可調配為散劑、顆粒劑、壓縮錠劑、丸劑、膠囊、口嚼錠、粉片或其類似物。此類固體組合物將通常含有一或多種惰性稀釋劑或可食載劑。另外，可存在以下中之一或多者：黏合劑，諸如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠(tragacanth)或明膠；賦形劑，諸如澱粉、乳糖或糊精；崩解劑，諸如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米澱粉及其類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotex；助滑劑，諸如膠態二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或柑橘調味劑；及著色劑。當醫藥組合物呈膠囊(例如明膠膠囊)形式時，除以上類型之物質之外，其可含有諸如聚乙二醇或油之液體載劑。

醫藥或治療性組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。舉兩例而言，液體可用於經口投藥或用於藉由注射遞送。當意欲用於經口投藥時，較佳組合物除本發明之化合物之外亦含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及香味增強劑中之一或多者。在意欲藉由注射投與之組合物中，可包括界面活性劑、防腐劑、濕潤劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑及等張劑中之一或多者。

不論其為溶液、懸浮液或其他類似形式，液體醫藥或治療性組合物均可包括以下佐劑中之一或多者：無菌稀釋劑(諸如注射用水)、鹽水溶液(較佳為生理鹽水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉，可充當溶劑或懸浮介質之不揮發性油(諸如合成性單酸或二酸甘油酯)、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽及磷酸鹽；及用於調節張力之試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水為較佳佐劑。可注射醫藥組合物較佳為無菌的。

意欲用於非經腸或經口投與之液體醫藥或治療性組合物應含有將獲得適合劑量之量的結合物。通常，此量為組合物中所關注之結合物的至少0.01%。當意欲用於經口投藥時，此量可變化為介於組合物重量的0.1%與約70%之間。某些口服醫藥組合物含有介於約4%與約75%之間的所關注之結合物。在某些實施例中，製備醫藥組合物及製劑以使得非經腸劑量單元在稀釋之前含有介於0.01至10重量%之間的結合物。

醫藥組合物可意欲用於局部投藥，在此情況下載劑可適合地包含溶液、乳液、軟膏或凝膠基質。舉例而言，基質可包含以下中之一或多者：石蠟脂、羊毛蠟、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑(諸如水及醇)及乳化劑及穩定劑。增稠劑可存在於醫藥組合物中以用於局部投藥。若意欲用於經皮投藥，則組合物可包括經皮貼片或離子電滲療法(iontophoresis)裝置。

醫藥組合物可意欲用於以例如栓劑形式經直腸投藥，該栓劑將在直腸中熔融且釋放藥物。用於經直腸投藥之組合物可含有油性基質作為適合之無刺激性賦形劑。此類基質包括(但不限於)羊毛蠟、可可脂及聚乙二醇。

醫藥組合物可包括各種材料，該等材料調節固體或液體劑量單元之物理形式。舉例而言，組合物可包括圍繞活性成分形成包覆殼層之材料。形成包覆殼層之材料通常為惰性的，且可選自例如糖、蟲膠及其他腸溶包覆劑。或者，活性成分可裝入明膠膠囊中。呈固體或液體形式之醫藥組合物可包括結合於結合物且藉此幫助遞送該結合物之組分。可起此能力作用的適合之組分包括單株或多株抗體、一或多種蛋白質或一種脂質體。

醫藥組合物可基本上由可以氣霧劑形式投與之劑量單元組成。術語氣霧劑用於表示介於膠態性質之彼等系統至由加壓封裝組成之系統範圍內的多種系統。遞送可藉由液化或壓縮氣體或藉由分配活性成分的適合之泵系統來進行。氣霧劑可以單相、雙相或三相系統形式遞送以便遞送活性成分。氣霧劑之遞送包括必需容器、活化劑、閥門、次容器及其類似物，其在一起可形成套組。一般熟習此項技術者在不進行過度實驗的情況下即可確定較佳氣霧劑。

本文所描述之組合物可用保護結合物以免自體內快速消除之載劑製備，諸如延時釋放調配物或包衣。此類載劑包括控制釋放調配物，諸如(但不限於)植入物及微膠囊化遞送系統，及生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸及一般熟習此項技術者已知之其他載劑。

醫藥組合物可藉由醫藥技術中熟知之方法來製備。舉例而言，意欲藉由注射投與之醫藥組合物可包含鹽、緩衝劑及/或穩定劑中之一或多者，與無菌蒸餾水一起以便形成溶液。可添加界面活性劑以促進形成均勻溶液或懸浮液。界面活性劑為與結合物非共價相互作用以促進該結合物在水性遞送系統中之溶解或均勻懸浮的化合物。

組合物可以治療有效量投與，該治療有效量將視包括以下之多種因素而變化：所採用之特定化合物的活性；該化合物之代謝穩定性及作用持續時間；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食；投藥模式及時間；排泄速率；藥物組合；特定病症或病狀之嚴重性；及經歷療法之個體。

治療之精確劑量及持續時間隨所治療之疾病而變化，且可使用已知測試方案憑經驗確定，或藉由測試在此項技術中已知之模型系統中的組合物且自其推斷來確定。亦可執行對照臨床試驗。劑量亦可隨待緩解之病狀的嚴重性而變化。醫藥組合物一般經調配及投與以在使不合期望之副作用減至最小的同時發揮治療學上適用之作用。組合物可一次投與，或可分成多個較小劑量以一定時間間隔投與。對於任何特定個體，可根據個人需要隨時間調節具體劑量方案。

在一些實施例中，本文所描述之組合物的治療有效量或治療劑量為有效減緩腫瘤生長或使其穩定之量。在某些情況下，以較小劑量起始治療，該等劑量可以較小增量增加，直至達成該等情形下之最佳效果為止。在一些情況下，治療有效之日劑量為(對於70 kg哺乳動物)約0.001 mg/kg (亦即約0.07 mg)至約100 mg/kg(亦即，約7.0 g)；較佳地，治療有效之劑量為(對於70 kg哺乳動物)約0.01 mg/kg (亦即約0.7 mg)至約50 mg/kg(亦即，約3.5 g)；更佳地，治療有效之劑量為(對於70 kg哺乳動物)約1 mg/kg (亦即約70 mg)至約25 mg/kg(亦即，約1.75 g)。

在一些實施例中，約一日一次至約每兩或三週一次投與一定劑量。舉例而言，在某些實施例中，約每1、2、3、4、5、6或7天一次、或約一週一次、或約一週兩次、或約一週三次、或約每兩或三週一次投與一定劑量。

在一些實施例中，劑量為約0.1 mg/kg至約20 mg/kg、或至約10 mg/kg、或至約5 mg/kg、或至約3 mg/kg。在一些實施例中，劑量為約約0.10 mg/kg、0.15 mg/kg、0.20 mg/kg、0.25 mg/kg、0.30 mg/kg、0.35 mg/kg、0.40 mg/kg、0.45 mg/kg、0.50 mg/kg、0.55 mg/kg、0.60 mg/kg、0.65 mg/kg、0.70 mg/kg、0.75 mg/kg、0.80 mg/kg、0.85 mg/kg、0.90 mg/kg、0.95 mg/kg、1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg或 20 mg/kg，包括兩者之間的所有整數及範圍。在具體實施例中，劑量為以2 ml靜脈內注射形式一週一次，每次約1 mg/kg至每3天一次，每次約20 mg/kg。

亦包括患者護理套組，其包含一或多種本文所描述之結合物或組合物。某些套組亦包含一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑或溶劑，諸如水(例如無菌水)。在一些實施例中，結合物儲存在小瓶、藥筒、雙腔注射器及/或預填充之混合系統中。

本文中之套組亦可包括一或多種額外治療劑(例如結合物)或適合於所治療之適應症或所要診斷應用或為其所需的其他組分。本文中之套組亦可包括一或多種注射器或幫助所欲遞送模式所需或所要之其他組件(例如，支架、可植入儲槽等)。

本說明書中所引用之所有公開案、專利申請案及已頒予之專利均以引用之方式併入本文中，其引用程度如同各個別公開案、專利申請案或已頒予之專利具體地且個別地指示為以引用之方式併入一般。

儘管已出於清楚理解之目的藉助於說明及實例相當詳細地描述前述內容，但鑒於本發明之教示，對一般熟習此項技術者將容易地顯而易見的是，可在不背離隨附申請專利範圍之精神或範疇的情況下對其進行某些變化及修改。以下實例僅作為說明而非作為限制提供。熟習此項技術者將容易地認識到可經改變或修改以產生基本上相似之結果的多種非關鍵性參數。

實例 實例 1 ADI-PEG 20 與 TRAIL 之組合 藉由用ADI-PEG 20 (經K112E及P210S取代修飾的來自人類黴漿菌之聚乙二醇化精胺酸脫亞胺酶)、人類rhTRAIL或其組合處理各種癌細胞株來測試ADI增加TRAIL之抗癌活性的能力，且在一些情況下反過來測試。如實例1中所描述來執行細胞分析。

對於ADI敏感性(大部分具有較低或不可偵測之ASS1表現)癌細胞株的結果展示於下表 E1 中。

此等結果說明，在多種癌細胞株之細胞殺滅中，相對於ADI-PEG 20及/或rhTRAIL單獨時，在ADI-PEG 20與rhTRAIL組合之間具有協同或相加效應。此等結果亦說明，ADI-PEG 20增強rhTRAIL於在其他情況下對rhTRAIL具有耐性之癌細胞株中的活性。在多種癌細胞株中觀測到細胞殺滅活性顯著地或協同地增加，包括乳癌細胞、伯基特氏淋巴瘤細胞、結腸癌細胞、神經膠母細胞瘤癌細胞、白血病細胞、黑素瘤癌細胞、非小肺細胞癌症(NSCLC)細胞、卵巢癌細胞、胰臟癌細胞、前列腺癌細胞及腎癌細胞。

圖 1A-1D 進一步圖解說明相對於ADI-PEG 20及/或rhTRAIL單獨時，ADI-PEG 20與rhTRAIL組合對各種癌細胞株之相對存活率的協同效應。圖 1A 展示在HCT116結腸癌細胞株中之協同性，圖 1B 展示在Caki-1腎癌細胞株中之協同性，圖 1C 展示在ACHN腎癌細胞株中之協同性，且圖 1D 展示在A375黑素瘤細胞株中之協同性。

圖 2A-2C 展現在Raji伯基特氏淋巴瘤細胞株中，與各藥劑單獨時相比，ADI-PEG 20及rhTRAIL對半胱天冬酶3/7活化(圖 2A )、誘導細胞死亡(圖 2B )及未進入細胞凋亡之活細胞(其中半胱天冬酶3/7未活化之細胞；圖 2C )之百分比減少的協同效應。在用偵測活化半胱天冬酶3/7及死細胞之螢光試劑(來自ThermoFisher Scientific之CellEvent半胱天冬酶3/7套組)染色之後，藉由流式細胞量測分析來確定死細胞或具有及不具有活化半胱天冬酶3/7之細胞的百分比。

對於耐ADI性(相對較高之ASS1表現)癌細胞株的結果展示於下表 E2 中。

表E2 中之結果展示，在某些耐ADI性細胞株中(歸因於高ASS1)，ADI-PEG 20不一定增強rhTRAIL之癌細胞殺滅活性(或反之亦然)。然而，在一些耐ADI性癌細胞株(例如，其中ADI具有至少一些最小活性之MDA-MB-453及H1975)中，相對於ADI-PEG 20及/或TRAIL單獨時，ADI-PEG 20與rhTRAIL之組合展示癌細胞殺滅活性中之協同作用、增強及/或聯合作用。實例2及3展示很可能促進ADI與TRAIL一起出現增強或協同作用之能力的一些ADI生物活性。

實例 2 ADI-PEG 20 上調 DR5 受體 為了探索ADI增加或增強rhTRAIL之活性的潛在機制，在用ADI-PEG 20處理癌細胞株後藉由流式細胞量測術來量測DR4及DR5受體之表現。

實驗工作流由以下組成：細胞處理、採集、及在冰上用可固定之Live/Dead染色劑(ThermoFisher)染色且用抗體識別TRAIL受體持續30分鐘。此後接洗滌掉未併入之Live/Dead染料及未結合之抗體，及藉由多色流式細胞儀來分析。用在流式細胞儀之不同通道中偵測之獨特螢光團標記Live/dead染色劑及抗體，使用同型對照抗體來對非特異性結合進行評定及對照。在於單重態且存活之細胞上閘控的細胞群體中分析受體表現。

圖 3A-3D 展示在Panc-1、Jurkat、Raji、K562、O-786、ACHN、Caki-1、Caki-2、WM-115及HCT116細胞株中，ADI-PEG 20上調DR5受體之表現。DR4受體之表現在此等細胞株中較低或不可偵測，且不受ADI-PEG 20處理顯著影響。

實例 3 ADI-PEG 20 下調存活素 圖 4 展現在用ADI-PEG 20處理ADI敏感性細胞株之後，存活素蛋白質含量減少。已展示存活素妨礙TRAIL活性。因此，降低存活素含量(以及DR5上調)可促進ADI增強及/或增加TRAIL在癌細胞株中之凋亡活性的能力。

實例 4 ADI 與 TRAIL 之結合物 根據常規技術選殖、表現及純化在來自鴿黴漿菌之精胺酸脫亞胺酶(ADI)與人類TNF相關細胞凋亡誘導性配位體(TRAIL)之細胞外結構域(殘基114-281)之間的融合蛋白質，且隨後測試其抗癌活性。下表 E3 提供對所測試ADI-TRAIL融合蛋白質之概述。

另外，來自其他六聚物種之ADI以及其交換結構域用於使用GGGGS連接子(SEQ ID NO: 76)製造與人類TRAIL (aa 114-281)之融合蛋白質。下表 E4 提供對所產生之六聚ADI-TRAIL融合蛋白質以及作為該ADI-TRAIL融合蛋白質之部分的ADI六聚物之活性的概述。

為了評定融合蛋白質對癌細胞生長、存活率及細胞凋亡誘導之作用，將各種癌細胞株接種在96孔培養盤中且暴露於該等融合蛋白質中。在接種之後立即處理懸浮液細胞株，同時使黏附細胞附著隔夜，隨後向培養物中添加試驗用蛋白質治療劑。

相對細胞存活率藉由用來自測試樣品之細胞存活率信號除以未經處理之對照物的細胞存活率信號來計算。細胞存活率用偵測活細胞之試劑(諸如刃天青(resazurin)或CellTiter-Glo (Promega))來確定，且使用培養盤讀取器(比色、螢光或發光信號)來加以量測。對於細胞凋亡，半胱天冬酶3/7活化使用Promega之半胱天冬酶3/7 Glo試劑及藉由培養盤讀取器得到之發光讀數來加以評定。半胱天冬酶3/7活化及細胞存活率亦藉由對用偵測活化半胱天冬酶3/7之螢光試劑染色的細胞及死細胞進行流式細胞量測分析來加以評定(來自ThermoFisher Scientific之CellEvent半胱天冬酶3/7套組)

圖 5 描繪例示性ADI-TRAIL或TRAIL-ADI融合蛋白質示意圖。

圖 6A-6C 展示相對於rhTRAIL單獨、M.col.ADI單獨及rhTRAIL與M.col.ADI以各別多肽形式組合時，具有L1連接子之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(參見表 E3 )對在耐ADI性Colo 205癌細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 6A )及相對細胞存活率(圖 6B 及 6C )的作用。在此細胞株(高ASS1表現)中，ADI不具顯著活性，且癌細胞殺滅活性係歸因於ADI-TRAIL融合多肽之TRAIL組件。

圖 7A-7C 展示相對於rhTRAIL單獨、M.col.ADI單獨及rhTRAIL與M.col.ADI以各別多肽形式組合時，具有L1連接子之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(參見表 E3 )對在ADI敏感性HCT116腫瘤細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 7A )及相對細胞存活率(圖 7B 及 7C )的作用。

圖 8A-8B 展示相對於rhTRAIL單獨、M.col.ADI單獨及rhTRAIL與M.col.ADI以各別多肽形式組合時，具有L1連接子之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(參見表 E3 )對在ADI敏感性Jurkat腫瘤細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 8A )及相對細胞存活率(圖 8B )的作用。圖 9A-9D 展示來自表 E3 之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽對在耐ADI性Colo 205癌細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 9A 及 9B )及相對細胞存活率(圖 9C 及 9D )的作用。圖 10A-10C 展示來自表 E3 之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽對在ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 10A )及相對細胞存活率(圖 10B-10C )的作用。圖 11A-11B 展示來自表 E3 之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽對在ADI敏感性Jurkat細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 11A )及相對細胞存活率(圖 11B )的作用。

圖 9-11 展示來自表 E1 之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽在ADI敏感性及耐ADI性之三種不同細胞株中具有相似活性。

下表 E5 概述來自表 E4 之例示性ADI-TRAIL融合多肽對在耐ADI性Colo 205細胞株及ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導及相對細胞存活率降低的IC₅₀ 值。此等資料展示例示性ADI-TRAIL融合多肽具有相似活性。

圖 12A-12C 展示在M.col.ADI中具有點突變(K192C或K287C)之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(包括非聚乙二醇化之融合多肽對比用2K或20K PEG聚乙二醇化之融合多肽)對在耐ADI性Colo 205細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 12A )及相對細胞存活率(圖 12B-12C )的作用。圖 13A-13C 展示在M.col.ADI中具有點突變(K192C或K287C)之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(包括非聚乙二醇化之融合多肽對比用2K或20K PEG聚乙二醇化之融合多肽)對在ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 13A )及相對細胞存活率(圖 13B-13C )的作用。在上文所描述之聚乙二醇化構築體對比非聚乙二醇化構築體中，ADI酶活性相似。

圖 14A-14C 展示例示性TRAIL-M.col.ADI對比M.col.ADI -TRAIL融合多肽對在耐ADI性Colo 205細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 14A )及相對細胞存活率(圖 14B-14C )的作用。因為此Colo 205細胞株對ADI活性具有耐性，所觀測到之半胱天冬酶3/7活化及後續存活率降低係歸因於TRAIL部分之促凋亡活性。如圖 14A-14C 中所示，在TRAIL-M.col.ADI融合蛋白質對比M.col.ADI-TRAIL融合蛋白質中，TRAIL活性在某種程度上改善(大致2倍)。

圖 15A-15C 展示例示性TRAIL-M.col.ADI對比M.col.ADI -TRAIL融合多肽對在ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 15A )及相對細胞存活率(圖 15B-15C )的作用。在此細胞株中，兩種融合蛋白質誘導半胱天冬酶介導之細胞凋亡的效力相同。ADI及TRAIL在HCT116細胞株中具有協同性。由此實驗及其他實驗(資料未示出)得到，ADI似乎可使TRAIL作用增強至某一水準，且ADI與TRAIL之組合作用不受TRAIL部分之效力的較小變化顯著影響。換言之，已觀測到ADI與效力較小之TRAIL製劑的較強協同性，且組合之作用即使在使用最佳或次佳TRAIL製劑的情況下仍達到某一閾值。

圖 16A-16B 顯示在靜脈內投與單次劑量30 mg/kg之後，CD-1小鼠之血清中之M.col.ADI-TRAIL隨時間變化的PK概況。在單次注射融合蛋白質之後，在CD-1小鼠之血清中量測M.col.ADI-TRAIL蛋白質含量(圖 16A-16B )、精胺酸及瓜胺酸含量(圖 16A )以及針對融合蛋白質M.col.ADI-TRAIL及其組件M.col.ADI及rhTRAIL之抗體效價(圖 16B )。

藉由ELISA評定血清中之融合蛋白質濃度(圖 16A-16B )。亦評定在血清樣品中ADI及TRAIL部分之生物活性，且基於摻加至未經處理之血清中的標準品來確定生物活性蛋白質之濃度。生物活性蛋白質之濃度(基於ADI及TRAIL活性兩者)與藉由ELISA法確定之總ADI-TRAIL蛋白質極相似。

圖 17A-17F 展現M.col.ADI-TRAIL在HCT116異種移植模型中之功效。用HCT116細胞對雌性無胸腺裸小鼠進行皮下接種。在接種後第7天，將小鼠隨機分入處理組(在各組之間起始腫瘤體積相似)，且藉由靜脈內注射投與rhTRAIL、M.col.ADI、M.col.ADI-TRAIL融合蛋白質或媒劑對照(PBS緩衝液)。每日執行用rhTRAIL之治療持續5個連續日(腫瘤植入後第7-11天)。在腫瘤植入後第7及15天注射M.col.ADI及M.col.ADI-TRAIL融合蛋白質。融合蛋白質未引起任何顯著重量損失(圖 17A )，且能夠減緩腫瘤生長(圖 17B-17F )。* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001。藉由雙向ANOVA來評定融合蛋白質處理組中腫瘤縮小與媒劑處理對照組中相比的統計顯著性。

如圖 18A-18B 中所示，血清M.col.ADI-TRAIL與腫瘤體積反比相關。藉由ELISA (總蛋白質)及在生物學分析(活性蛋白質)中所量測的融合蛋白質之濃度彼此相似。在腫瘤植入後第21及28天，取得血清。所偵測之血清總融合蛋白質在兩個時間點之間相關。此等血清樣品中之精胺酸及瓜胺酸含量展示於圖 18D 中。與M.col.ADI-TRAIL組相比，M.col.ADI組中之血清瓜胺酸含量較高而精胺酸含量較低。此很可能係歸因於融合蛋白質由於其TRAIL部分而定位於腫瘤位點，藉此減少其血清含量。在腫瘤體積與血清M.col.ADI-TRAIL之間的反比相關性支持此假設。

圖 19 展現在用M.col.ADI-TRAIL處理之後，在HCT116異種移植模型中之劑量依賴型腫瘤生長減緩。用HCT116細胞對雌性無胸腺裸小鼠進行皮下接種。在接種後第9天，將小鼠隨機分入處理組(在各組之間起始腫瘤體積相似)，且藉由靜脈內注射投與M.col.ADI-TRAIL融合蛋白質或媒劑對照(PBS緩衝液)。M.col.ADI-TRAIL劑量組如下：90 mg/kg、30 mg/kg、10 mg/kg及5 mg/kg。前三組僅在腫瘤植入後第9天給藥，而5 mg/kg組在第9天及第12天給藥。

雙向ANOVA分析揭露在M.col.ADI-TRAIL處理之後腫瘤體積縮小的統計顯著性。處理組對比媒劑對照之P值如下： 第12天，對於10 mg/kg、30 mg/kg and 90 mg/kg組，p＜0.0001，對於5 mg/kg組，p=0.0001。 第14天，對於所有組，p＜0.0001 第16天，對於所有組，p＜0.0001。

在第16天(處理起始後第7天)，在較高與較低劑量組之間亦存在統計學上顯著之差異： ● 90 mg/kg組對比10 mg/kg組，p=0.0477 ● 90 mg/kg組對比5 mg/kg，p=0.0014 ● 30 mg/kg組對比5 mg/kg，p=0.0247。

圖 1A-1D 圖解說明與各藥劑單獨時相比，ADI-PEG 20及rhTRAIL對各種癌細胞株之相對存活率的協同效應。圖 2A-2C 展現在Raji伯基特氏淋巴瘤細胞株中，與各藥劑單獨時相比，ADI-PEG 20及rhTRAIL對半胱天冬酶(caspase) 3/7活化(圖 2A )、誘導細胞死亡(圖 2B )及未進入細胞凋亡之活細胞(其中半胱天冬酶3/7未活化之細胞；圖 2C )之百分比減少的協同效應。圖 3A-3D 展示在用ADI-PEG 20處理後，TRAIL受體DR5在各種癌細胞株中之表現上調。圖 4 展現在用ADI-PEG 20處理ADI敏感性細胞株之後，存活素蛋白質含量減少。已展示存活素妨礙TRAIL活性。因此，降低存活素含量(以及DR5上調)可促進ADI增強及/或增加TRAIL在癌細胞株中之凋亡活性的能力。圖 5 圖解說明由六個ADI-TRAIL及/或TRAIL-ADI結合物構成之六聚複合物，例如融合蛋白質。圖 6A-6C 展示相對於rhTRAIL單獨、M.col.ADI單獨及rhTRAIL與M.col.ADI以各別多肽形式組合時，具有L1連接子之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(參見表 E3 )對在耐ADI性Colo 205癌細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 6A )及相對細胞存活率(圖 6B 及 6C )的作用。圖 7A-7C 展示相對於rhTRAIL單獨、M.col.ADI單獨及rhTRAIL與M.col.ADI以各別多肽形式組合時，具有L1連接子之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(參見表 E3 )對在ADI敏感性HCT116腫瘤細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 7A )及相對細胞存活率(圖 7B 及 7C )的作用。圖 8A-8B 展示相對於rhTRAIL單獨、M.col.ADI單獨及rhTRAIL與M.col.ADI以各別多肽形式組合時，具有L1連接子之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(參見表 E3 )對在ADI敏感性Jurkat腫瘤細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 8A )及相對細胞存活率(圖 8B )的作用。圖 9A-9D 展示來自表 E1 之例示性ADI-TRAIL融合多肽對在耐ADI性Colo 205癌細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 9A 及 9B )及相對細胞存活率(圖 9C 及 9D )的作用。圖 10A-10C 展示例示性ADI-TRAIL融合多肽對在ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 10A )及相對細胞存活率(圖 10B-10C )的作用。圖 11A-11B 展示例示性ADI-TRAIL融合多肽對在ADI敏感性Jurkat細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 11A )及相對細胞存活率(圖 11B )的作用。圖 12A-12C 展示在M.col.ADI中具有點突變(K192C或K287C)之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(包括非聚乙二醇化之融合多肽對比用2K或20K PEG聚乙二醇化之融合多肽)對在耐ADI性Colo 205細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 12A )及相對細胞存活率(圖 12B-12C )的作用。圖 13A-13C 展示在M.col.ADI中具有點突變(K192C或K287C)之例示性M.col.ADI-TRAIL融合多肽(包括非聚乙二醇化之融合多肽對比用2K或20K PEG聚乙二醇化之融合多肽)對在ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 13A )及相對細胞存活率(圖 13B-13C )的作用。圖 14A-14C 展示例示性TRAIL-M.col.ADI對比M.col.ADI -TRAIL融合多肽對在耐ADI性Colo 205細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 14A )及相對細胞存活率(圖 14B-14C )的作用。圖 15A-15C 展示例示性TRAIL-M.col.ADI對比M.col.ADI -TRAIL融合多肽對在ADI敏感性HCT116細胞株中之半胱天冬酶3/7誘導(圖 15A )及相對細胞存活率(圖 15B-15C )的作用。圖 16A-16B 顯示在靜脈內投與單次劑量30 mg/kg之後，CD-1小鼠之血清中之M.col.ADI-TRAIL隨時間變化的藥物動力學(PK)。在單次注射融合蛋白質之後，在CD-1小鼠動物之血清中量測M.col.ADI-TRAIL蛋白質含量(圖 16A-16B )、精胺酸及瓜胺酸含量(圖 16A )以及針對融合蛋白質M.col.ADI-TRAIL、M.col.ADI及rhTRAIL之抗體效價(藉由ELISA來評定，圖 16B )。圖 17A-17F 展現M.col.ADI-TRAIL在HCT116異種移植模型中之功效。融合蛋白質未引起任何顯著重量損失(圖 17A )，且減緩腫瘤生長(圖 17B-17F )。* p＜0.05，** p＜0.01，*** p＜0.001。藉由雙向ANOVA來評定融合蛋白質處理組中腫瘤縮小與媒劑處理對照組中相比的統計顯著性。圖 18A-18D 展示血清ADI-TRAIL與腫瘤體積反比相關(圖 18B-18C )。藉由ELISA (總蛋白質)及在生物學分析(活性蛋白質)中所量測的融合蛋白質之濃度彼此相似。在腫瘤植入後第21及28天，自攜有腫瘤之小鼠取得血清。治療時程及腫瘤生長展示於圖 17A-17F 中。此等血清樣品中之精胺酸及瓜胺酸含量展示於圖 18D中。 圖19 展現在用M.col.ADI-TRAIL處理之後，在HCT116異種移植模型中之劑量依賴型腫瘤生長減緩。

Claims (43)

1. 一種結合物，其包含精胺酸脫亞胺酶(ADI)共價連接於腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體。
2. 如請求項1之結合物，其中該ADI包含與選自表 A1 之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。
3. 如請求項1或2之結合物，其中該ADI為六聚ADI多肽。
4. 如請求項3之結合物，其中該六聚ADI包含與SEQ ID NO: 9、37、38、50或57-68至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。
5. 如前述請求項中任一項之結合物，其中該TNF超家族配位體係選自表 T1 。
6. 如請求項5之結合物，其中該超家族配位體係選自TNF相關細胞凋亡誘導性配位體(TRAIL)、TNF-α及FasL。
7. 如請求項6之結合物，其中該TNF超家族配位體包含與選自表 T2 之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，由其組成或基本上由其組成。
8. 如前述中任一項之結合物，其中該TNF超家族配位體為三聚或同源三聚多肽。
9. 如前述請求項中任一項之結合物，其中該ADI及該TNF超家族配位體由連接子，視情況由生理學上穩定之連接子分隔開。
10. 如請求項9之結合物，其中該連接子為肽連接子，視情況為柔性肽連接子或剛性肽連接子。
11. 如請求項10之結合物，其中該肽連接子之長度為約1-100個胺基酸、約1-90個胺基酸、約1-80個胺基酸、約1-70個胺基酸、約1-80個胺基酸、約1-50個胺基酸、約1-40個胺基酸、約1-30個胺基酸、約1-20個胺基酸、約1-10個胺基酸或約1-5個胺基酸，或其長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100個胺基酸。
12. 如請求項9或10之結合物，其中該肽連接子係選自表 L1 。
13. 如前述請求項中任一項之結合物，其中該結合物為融合多肽。
14. 如請求項13之結合物，其中該ADI融合於該TNF超家族配位體之N端，視情況由連接子分隔開。
15. 如請求項13之結合物，其中該ADI融合於該TNF超家族配位體之C端，視情況由連接子分隔開。
16. 如請求項9之結合物，其中該連接子為非肽連接子。
17. 如前述請求項中任一項之結合物，其中相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時，該結合物之藥物動力學、物理及/或生物特性改善，其視情況選自以下中之一或多者：穩定性增加、血清半衰期增加、生物可用性增加、生物活性增加、暴露增加及清除率降低。
18. 如請求項17之結合物，其中相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時，該結合物之穩定性及/或血清半衰期增加，視情況其中該結合物之相對穩定性及/或血清半衰期相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。
19. 如請求項17之結合物，其中相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時，該結合物之生物活性增加，視情況其中該結合物之生物活性相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%，或視情況其中該生物活性相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時協同地增加。
20. 如請求項19之結合物，其中該生物活性為在癌細胞中誘導細胞死亡或細胞凋亡，其視情況相對於該ADI單獨及/或該TNF超家族配位體單獨時協同地增加。
21. 如請求項20之結合物，其中該癌細胞為ADI敏感性細胞，其視情況選自以下中之一或多者：乳癌細胞、肝細胞癌細胞、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)細胞、結腸癌細胞、神經膠母細胞瘤癌細胞、白血病細胞、黑素瘤癌細胞、非小肺細胞癌(NSCLC)細胞、卵巢癌細胞、胰臟癌細胞、前列腺癌細胞及腎癌細胞。
22. 如請求項20之結合物，其中該癌細胞為ADI非敏感性細胞，其視情況選自乳癌細胞、結腸癌細胞及NSCLC細胞中之一或多者。
23. 如請求項19至22中任一項之結合物，其中該ADI使該TNF超家族配位體在癌細胞中誘導細胞死亡或細胞凋亡之能力增加，視情況相對於該TNF超家族配位體單獨時增加約至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%。
24. 如請求項23之結合物，其中該ADI上調死亡受體5 (DR5)在該等癌細胞上之表現。
25. 如前述請求項中任一項之結合物，其中該ADI多肽經由連接基團共價鍵結於至少一個聚乙二醇(PEG)分子，視情況其中該TNF超家族配位體不共價鍵結於PEG分子。
26. 一種結合物，其包含(a)六聚多肽共價連接於三聚多肽，或(b)第一三聚多肽共價連接於與該第一三聚多肽不同之第二三聚多肽。
27. 如請求項26之結合物，其中該六聚多肽為同源六聚多肽。
28. 如請求項26或27之結合物，其中該六聚多肽係選自視情況如前述請求項中任一或多項所定義之精胺酸脫亞胺酶，及脂聯素或其類膠原蛋白結構域。
29. 如請求項26至28中任一項之結合物，其中該三聚多肽為同源三聚多肽。
30. 如請求項26至29中任一項之結合物，其中(b)之第一三聚多肽係選自脂聯素或其類膠原蛋白結構域、T4纖維蛋白(fibritin)或其三聚化結構域(foldon)、膠原蛋白之C-原肽、界面活性蛋白A (SP -A)及甘露糖結合蛋白A (MBP-A)。
31. 如請求項26至30中任一項之結合物，其中(a)之三聚多肽或(b)之第二三聚多肽係選自視情況如前述請求項中任一或多項所定義之腫瘤壞死因子(TNF)超家族配位體。
32. 如請求項26至31中任一項之結合物，其中對於(a)，該六聚多肽共價連接於該三聚多肽之N端，或其中對於(b)，該第一三聚多肽共價連接於該第二三聚多肽之N端。
33. 如請求項26至31中任一項之結合物，其中對於(a)，該六聚多肽共價連接於該三聚多肽之C端，或其中對於(b)，該第一三聚多肽共價連接於該第二三聚多肽之C端。
34. 如請求項26至33中任一項之結合物，其中對於(a)，該六聚多肽及該三聚多肽由連接子分隔開，或其中對於(b)，該第一及第二三聚多肽由連接子分隔開，其中該連接子視情況為生理學上穩定之連接子。
35. 如請求項26至34中任一項之結合物，其中該結合物為融合多肽。
36. 如請求項26至35中任一項之結合物，其中相對於該六聚及/或三聚多肽單獨時，該結合物之物理、藥物動力學及/或生物特性增加。
37. 如請求項36之結合物，其中對於(a)，與該六聚多肽結合使該三聚多肽之穩定性及/或血清半衰期增加，視情況相對於該三聚多肽單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%，或對於(b)，與該第一三聚多肽結合使該第二三聚多肽之穩定性及/或血清半衰期增加，視情況相對於該第二三聚多肽單獨時增加約或至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%或超過1000%。
38. 一種編碼如請求項1至37中任一項之結合物的經分離之聚核苷酸，其中該結合物為融合蛋白質，一種包含該經分離之聚核苷酸的表現載體，或一種包含該經分離之聚核苷酸或該表現載體的宿主細胞。
39. 一種治療性組合物，其包含如請求項1至37中任一項之結合物及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
40. 如請求項39之治療性組合物，其中該結合物形成六個ADI-TRAIL及/或TRAIL-ADI結合物之六聚複合物，視情況形成為融合蛋白質。
41. 如請求項39或40之治療性組合物，其中該結合物為至少約95%純且少於約5%聚集的，且其中該組合物大體上無內毒素。
42. 一種在有需要之個體中治療癌症、改善其症狀或減緩其進展的方法，其包含向該個體投與如請求項39至40中任一項之治療性組合物。
43. 如請求項42之方法，其中該癌症係選自以下中之一或多者：肝細胞癌(HCC)、黑素瘤、轉移性黑素瘤、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、間皮瘤、淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤、肝腫瘤、肉瘤、白血病、急性骨髓性白血病、復發性急性骨髓性白血病、B細胞惡性病、乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胃癌、神經膠質瘤(例如星形細胞瘤、寡樹突神經膠質瘤、室管膜瘤或脈絡叢乳頭瘤)、多形性膠質母細胞瘤(例如巨細胞膠質母細胞瘤或神經膠質肉瘤)、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原發性CNS淋巴瘤、原始神經外胚層瘤(神經管母細胞瘤)、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎癌、膀胱癌、子宮癌、食道癌、腦癌、頭頸癌、子宮頸癌、睪丸癌及胃癌。